JP2023535345A - 重鎖抗体を発現するトランスジェニック動物 - Google Patents
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Abstract
本開示は一般的に、重鎖抗体(HCAb)を発現するための、免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座における生殖系列改変を含むトランスジェニック動物、並びにそれを生成するための核酸構築物、細胞及び方法に関する。本開示は更に、該トランスジェニック動物により産生される重鎖抗体に由来する配列を含む結合剤に関する。
Description
技術分野
本開示は一般的に、重鎖抗体(HCAb)を発現するための、免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座における生殖系列改変(germline modification)を含むトランスジェニック動物、並びにそれを生成するための核酸構築物、細胞及び方法に関する。本開示は更に、該トランスジェニック動物により産生される重鎖抗体に由来する配列を含む結合剤に関する。
本開示は一般的に、重鎖抗体(HCAb)を発現するための、免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座における生殖系列改変(germline modification)を含むトランスジェニック動物、並びにそれを生成するための核酸構築物、細胞及び方法に関する。本開示は更に、該トランスジェニック動物により産生される重鎖抗体に由来する配列を含む結合剤に関する。
背景
ラクダ類及び軟骨魚類は、機能性ホモ二量体重鎖抗体(HCAb)からなる抗体を天然に産生する(Hamers-Castermanら、1993;MuyldermansとSmider、2016)。HCAbの重鎖は、第1の定常ドメイン(CH1)を欠き、且つ古典的抗体とは、軽鎖の対合に通常は関与するほんの数個のアミノ酸置換により異なる(Muyldermansら、1994;Vuら、1997)。それらの置換(Val37Phe/Tyr、Gly44Glu、Leu45Arg、及びTrp47Gly)は、フレームワーク領域2(FR2)内に存在する。HCAbの結合ドメインは、単一ドメイン抗体(sdAb)、VHH、又はnanobody(登録商標)と呼ばれる。sdAbは、およそ15kDaの分子量を有し、よって、組織浸透の上昇又は急速クリアランスを必要とする利用、例えば、放射線ベースイメージングに適用可能である。
ラクダ類及び軟骨魚類は、機能性ホモ二量体重鎖抗体(HCAb)からなる抗体を天然に産生する(Hamers-Castermanら、1993;MuyldermansとSmider、2016)。HCAbの重鎖は、第1の定常ドメイン(CH1)を欠き、且つ古典的抗体とは、軽鎖の対合に通常は関与するほんの数個のアミノ酸置換により異なる(Muyldermansら、1994;Vuら、1997)。それらの置換(Val37Phe/Tyr、Gly44Glu、Leu45Arg、及びTrp47Gly)は、フレームワーク領域2(FR2)内に存在する。HCAbの結合ドメインは、単一ドメイン抗体(sdAb)、VHH、又はnanobody(登録商標)と呼ばれる。sdAbは、およそ15kDaの分子量を有し、よって、組織浸透の上昇又は急速クリアランスを必要とする利用、例えば、放射線ベースイメージングに適用可能である。
ラクダHCAbの可変領域は、対応する古典的CDRと比べて長いCDRH1ループ及びCDRH3ループを有し、パラトープのサイズが大きくなっている。より長いCDRは、古典的抗体のエピトープよりも凹面であるエピトープに結合する。より長いCDRは同じく、触媒部位内のクレフトに侵入することにより酵素を阻害し得る(Sircarら、The Journal of Immunology、186、2011)。
単一ドメイン抗体は、現在、多重特異性及び多価のフォーマットを含む、様々な抗体様フォーマットにおいて、治療薬及び診断薬として活用されている。
ラクダ配列を含有する抗体は、ヒトでの免疫応答を誘導すると予想されるため、最近の取組みは主に、トランスジェニックマウスでのヒト単一ドメイン抗体の開発に集中した。それらのマウスモデルは、マウスIgH遺伝子座の一部を不活性化するか、又はマウスIgH遺伝子座の一部を、ヒトの可変(V)断片、多様(D)断片、及び連結(J)断片をコードするように置換することにより設計された(国際公開第2016/062990号、米国特許出願公開第2011/0145937号明細書を参照)。
単一ドメイン抗体は、ラクダ類の免疫化により取得され得るが、このアプローチは、時間がかかり、且つ高価である。更に、大量の免疫原が必要とされ、且つ得られる抗体のレパートリが限られている。
ラクダVHH、ラクダ/ヒトハイブリッドVH、又はヒトVHを含む単一ドメイン抗体を発現するトランスジェニックマウスが、再構成された(rearranged)又は未再構成(unrearranged)のミニ遺伝子座の、IgM欠損マウスのゲノムへのランダム組込みにより生成された(Zhouら、J. Immunol.、175(6):3369～79頁(2005);Janssensら、PNAS 103(41):15130～15135頁(2006);Drabekら、Front. Immunol. 7:619(2016)、米国特許第8,502,014号明細書)。これらのモデルは、低い発現を有し、且つ免疫化により生成されるHCAbのプールの不十分な多様性を提供するという制約が問題となっている。
Sircarら、The Journal of Immunology、186、2011
Zhouら、J. Immunol.、175(6):3369～79頁(2005)
Janssensら、PNAS 103(41):15130～15135頁(2006)
Drabekら、Front. Immunol. 7:619(2016)
Deyev、S.Mら(BioEssays 30:904～918頁、2008)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AM773729
概要
本出願人は、本明細書で、中でも、ラクダ単一ドメイン抗体を産生するための、免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座における生殖系列改変を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
本出願人は、本明細書で、中でも、ラクダ単一ドメイン抗体を産生するための、免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座における生殖系列改変を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
遺伝子改変(Genetically modified)動物は、ラクダ単一ドメイン抗体の産生を容易にするために本明細書で提供される。
本開示のいくつかの態様では、トランスジェニック動物を、様々なアイソタイプの、及び多様な遺伝的背景のHCAbの発現に使用する。
本開示の他の態様では、生成されるHCAbレパートリの多様性を増大させるために、トランスジェニック動物を提供する。
本明細書に開示されるトランスジェニック動物の免疫化に応じて生成される抗原特異的な重鎖のみの抗体(HCAb)のプールを解析し、HCAb候補を選択する。
いくつかの実施形態では、HCAbを、結合剤の作製に使用する。
いくつかの実施形態では、HCAbを、治療薬の作製に使用する。
いくつかの実施形態では、HCAbを、診断薬の作製に使用する。
いくつかの態様及び実施形態では、本開示は、免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座における生殖系列改変を含むトランスジェニック非ヒト動物に関する。
いくつかの実施形態では、すべての改変が、同じ対立遺伝子上に存在する。他の実施形態では、両対立遺伝子が同じであり得る。更に他の実施形態では、両対立遺伝子が異なり得る。
いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、例えば、以下からなる群:
a. 内在性非ヒト動物ガンマグロブリン遺伝子のCH1ドメインの欠失、又は;
b. 少なくとも1つの内在性非ヒト動物ガンマグロブリンのCH1ドメインの欠失と、少なくとも1つの他の内在性非ヒト動物ガンマグロブリン遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される生殖系列改変を含む。
a. 内在性非ヒト動物ガンマグロブリン遺伝子のCH1ドメインの欠失、又は;
b. 少なくとも1つの内在性非ヒト動物ガンマグロブリンのCH1ドメインの欠失と、少なくとも1つの他の内在性非ヒト動物ガンマグロブリン遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される生殖系列改変を含む。
他の実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、例えば、以下からなる群:
a. 内在性非ヒト動物ガンマグロブリン遺伝子のCH1ドメインの改変、又は;
b. 少なくとも1つの内在性非ヒト動物ガンマグロブリンのCH1ドメインの改変と、少なくとも1つの他の内在性非ヒト動物ガンマグロブリン遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される生殖系列改変を含む。
a. 内在性非ヒト動物ガンマグロブリン遺伝子のCH1ドメインの改変、又は;
b. 少なくとも1つの内在性非ヒト動物ガンマグロブリンのCH1ドメインの改変と、少なくとも1つの他の内在性非ヒト動物ガンマグロブリン遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される生殖系列改変を含む。
いくつかの実施形態では、CH1ドメインの改変が、非機能性CH1ドメインをもたらす。いくつかの実施形態では、該非機能性CH1ドメイン改変が、軽鎖と対合できない。
いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、例えば、以下からなる群:
a. 内在性マウスγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子のCH1ドメインの欠失、又は;
b. γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子のCH1ドメインの欠失と、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される生殖系列改変を含むマウスである。
a. 内在性マウスγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子のCH1ドメインの欠失、又は;
b. γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子のCH1ドメインの欠失と、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される生殖系列改変を含むマウスである。
他の実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、例えば、以下からなる群:
a. 内在性マウスγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子のCH1ドメインの改変、又は;
b. γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子のCH1ドメインの改変と、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される生殖系列改変を含むマウスである。
a. 内在性マウスγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子のCH1ドメインの改変、又は;
b. γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子のCH1ドメインの改変と、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される生殖系列改変を含むマウスである。
一例示的実施形態では、生殖系列改変が、内在性γ3遺伝子のCH1ドメインの欠失を含む。
一例示的実施形態では、生殖系列改変が、内在性γ1遺伝子のCH1ドメインの欠失を含む。
他の例示的実施形態では、生殖系列改変が、内在性γ2b遺伝子のCH1ドメインの欠失を含む。
他の例示的実施形態では、生殖系列改変が、内在性γ2a遺伝子のCH1ドメインの欠失を含む。
他の例示的実施形態では、生殖系列改変が、内在性γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及びγ2a遺伝子のCH1ドメインの欠失を含む。
更なる一例示的実施形態では、生殖系列改変が、内在性γ2a遺伝子のCH1ドメインの欠失、及び内在性γ2b遺伝子の欠失を含む。
他の例示的実施形態では、生殖系列改変が、内在性γ3遺伝子及びγ2a遺伝子のCH1ドメインの欠失、並びにγ2b遺伝子の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、内在性マウスV、D、及びJ断片、並びに少なくとも1つの、機能性CH1ドメインを欠く内在性マウスIgG定常領域を含むトランスジェニックマウスである。
いくつかの実施形態では、トランスジェニックマウスが、重鎖のみの抗体(HCAb)を発現することができるトランスジェニックマウスである。
いくつかの実施形態では、トランスジェニックマウスが、外来のV、D、又はJ断片を含まない。
いくつかの実施形態では、トランスジェニックマウスが、ラクダのV、D、又はJ断片を含まない。
いくつかの実施形態では、トランスジェニックマウスが、ラクダのV、D、及び/又はJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、37位、44位、45位及び/又は47位でのラクダ標準的フレームワーク変異(canonical framework mutations)を含むマウスVHポリペプチドを含む、重鎖のみの抗体(HCAb)を発現することができるトランスジェニックマウスである。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、哺乳動物由来の未再構成可変(V)、多様(D)、及び/又は結合(J)遺伝子断片を含むIgH遺伝子座を有する。
いくつかの実施形態では、未再構成ラクダV、D、及び/又はJ遺伝子断片が、VDJ再構成用の組換えシグナル配列(RSS)を含む関連イントロンを含む。
いくつかの実施形態では、未再構成ラクダV断片が、周辺の調節領域、イントロン配列、リーダー配列、及びRSSを含む。
いくつかの実施形態では、未再構成ラクダD断片が、周辺のラクダ調節領域、ラクダイントロン配列、ラクダリーダー配列、及びラクダRSSを含む。
いくつかの実施形態では、未再構成ラクダJ断片が、周辺のラクダ調節領域、ラクダイントロン配列、ラクダリーダー配列、及びラクダRSSを含む。
いくつかの実施形態では、V、D、及び/又はJ遺伝子断片が、2つ以上の哺乳動物種に由来する。
いくつかの実施形態では、哺乳動物がラクダである。いくつかの実施形態では、哺乳動物がヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物がげっ歯類である。いくつかの実施形態では、哺乳動物が非ヒト哺乳動物である。
いくつかの実施形態では、IgH遺伝子座が、トランスジェニック非ヒト動物の内在性V遺伝子断片を含む。他の実施形態では、すべてのV遺伝子断片が内在性である。
いくつかの実施形態では、IgH遺伝子座が、トランスジェニック非ヒト動物に対して外来のV遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、外来V遺伝子断片を、トランスジェニック非ヒト動物ゲノム(例えばIgH遺伝子座)に挿入する。他の実施形態では、外来V遺伝子断片が、トランスジェニック非ヒト動物の1つ又は複数の内在性V遺伝子断片を置換する。従って、いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、内在性V遺伝子断片、外来V遺伝子断片、及び内在性V遺伝子断片と外来V遺伝子断片との組合せを含む。他の実施形態では、外来V遺伝子断片が、トランスジェニック非ヒト動物のすべての内在性V遺伝子断片を置換する。
いくつかの実施形態では、IgH遺伝子座が、トランスジェニック非ヒト動物の内在性D遺伝子断片を含む。他の実施形態では、すべてのD遺伝子断片が内在性である。
いくつかの実施形態では、IgH遺伝子座が、トランスジェニック非ヒト動物に対して外来のD遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、外来D遺伝子断片を、トランスジェニック非ヒト動物ゲノム(例えばIgH遺伝子座)に挿入する。他の実施形態では、外来D遺伝子断片が、トランスジェニック非ヒト動物の1つ又は複数の内在性D遺伝子断片を置換する。従って、いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、内在性D遺伝子断片、外来D遺伝子断片、及び内在性D遺伝子断片と外来D遺伝子断片との組合せを含む。他の実施形態では、外来D遺伝子断片が、トランスジェニック非ヒト動物のすべての内在性D遺伝子断片を置換する。
いくつかの実施形態では、IgH遺伝子座が、トランスジェニック非ヒト動物の内在性J遺伝子断片を含む。他の実施形態では、すべてのJ遺伝子断片が内在性である。
いくつかの実施形態では、IgH遺伝子座が、トランスジェニック非ヒト動物に対して外来のJ遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、外来J遺伝子断片を、トランスジェニック非ヒト動物ゲノム(例えばIgH遺伝子座)に挿入する。他の実施形態では、外来J遺伝子断片が、トランスジェニック非ヒト動物の1つ又は複数の内在性J遺伝子断片を置換する。従って、いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、内在性J遺伝子断片、外来J遺伝子断片、及び内在性J遺伝子断片と外来J遺伝子断片との組合せを含む。他の実施形態では、外来J遺伝子断片が、トランスジェニック非ヒト動物のすべての内在性J遺伝子断片を置換する。
いくつかの実施形態では、V、D、及び/若しくはJ遺伝子断片の置換又は挿入が、天然のV、D、及び/又はJ遺伝子断片がそれぞれ位置する部位で起こる。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ラクダ由来又は他の哺乳動物由来の可変(V)、多様(D)、及び/又は結合(J)遺伝子断片を含む。
例えば、V、D、及び/又はJ断片は、ラクダ、ヒト、げっ歯類、又はそれらの組合せに由来し得る。
本明細書に開示される、CH1欠失を有するトランスジェニック非ヒト動物は、ラクダV、D、及び/又はJ遺伝子断片を含むように改変されていてもよい。その代わりに、本明細書に開示される、CH1欠失を有するトランスジェニック非ヒト動物は、ヒトV、D、及び/又はJ断片を含むように改変されていてもよい。更に、本明細書に開示される、CH1欠失を有するトランスジェニック非ヒト動物は、ラクダ及びヒトのV、D、及び/又はJ断片の組合せを含むように改変されていてもよい。同じく、本明細書に開示される、CH1欠失を有するトランスジェニック非ヒト動物は、ラクダ及びマウスのV、D、及び/又はJ断片の組合せを含むように改変されていてもよい。更に、本明細書に開示される、CH1欠失を有するトランスジェニック非ヒト動物は、ヒト及びマウスのV、D、及び/又はJ遺伝子断片の組合せを含むように改変されていてもよい。
ラクダV、D、及び/又はJ遺伝子断片は、特に考慮される。
いくつかの実施形態では、ラクダV、D、及び/又はJ部分が未再構成状態である。
いくつかの実施形態では、該未再構成ラクダV、D、及び/又はJ遺伝子断片が、VDJ再構成用の組換えシグナル配列を含む関連イントロンを含む。
いくつかの実施形態では、該未再構成ラクダV断片が、周辺の調節領域、イントロン配列、リーダー配列、及びRSSを含む。
いくつかの実施形態では、該未再構成ラクダD断片が、周辺のラクダ調節領域、ラクダイントロン配列、ラクダリーダー配列、及びラクダRSSを含む。
いくつかの実施形態では、該未再構成ラクダJ断片が、周辺のラクダ調節領域、ラクダイントロン配列、ラクダリーダー配列、及びラクダRSSを含む。
いくつかの実施形態では、ラクダが、ラマ属に由来する。
いくつかの実施形態では、ラクダが、ビクーニャ(Vicugna)属に由来する。
いくつかの実施形態では、ラクダが、ラクダ属に由来する。
いくつかの実施形態では、ラクダが、ラマ・グラマ(Lama glama)種に由来する。いくつかの実施形態では、ラクダが、ビクーニャ・パコス(Vicugna pacos)種に由来する。いくつかの実施形態では、ラクダが、ビクーニャ・ビクニア(Vicugna vicunia)種に由来する。いくつかの実施形態では、ラクダが、ラマ・グアニコエ(Lama guanicoe)種に由来する。いくつかの実施形態では、ラクダが、フタコブラクダ(Camelus Bactrianus(カメルス・バクトリアヌス))種に由来する。いくつかの実施形態では、ラクダが、ヒトコブラクダ(Camelus Dromedarius(カメルス・ドロメダリウス))種に由来する。
いくつかの実施形態では、一部又は全部の内在性V遺伝子断片が保存されるようなやり方で、ラクダV遺伝子断片を動物ゲノム内に挿入する。例示的実施形態では、すべての内在性V遺伝子断片が保存される。例示的実施形態では、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個の内在性V断片が、除去又は置換される。従って、いくつかの実施形態では、少なくとも1つの内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも2つの内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも3つの内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも4つの内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも5つの内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも6つの内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも7つの内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも8つの内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも9つの内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも10個の内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも15個の内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも20個の内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも25個の内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも30個の内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも40個の内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも50個の内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも60個の内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも70個の内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも80個の内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも90個の内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも100個の内在性V断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、100個超の内在性V断片が、除去又は置換される。例示的実施形態では、すべての内在性V断片が、除去又は置換される。
いくつかの実施形態では、一部又は全部の内在性D遺伝子断片が保存されるようなやり方で、ラクダD遺伝子断片を動物ゲノム内に挿入する。例示的実施形態では、すべての内在性D断片が保存される。例示的実施形態では、少なくとも1つの内在性D断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも2つの内在性D断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも3つの内在性D断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも4つの内在性D断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも5つの内在性D断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも6つの内在性D断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも7つの内在性D断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも8つの内在性D断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも9つの内在性D断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも10個の内在性D断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも11個の内在性D断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも12個の内在性D断片が、除去又は置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも13個の内在性D断片が、除去又は置換される。例示的実施形態では、すべての内在性D断片が、除去又は置換される。
いくつかの実施形態では、一部又は全部の内在性J遺伝子断片が保存されるようなやり方で、ラクダJ遺伝子断片を動物ゲノム内に挿入する。例示的実施形態では、すべての内在性J断片が保存される。例示的実施形態では、少なくとも1つの内在性J断片が、除去又は置換される。例示的実施形態では、少なくとも2つの内在性J断片が、除去又は置換される。例示的実施形態では、少なくとも3つの内在性J断片が、除去又は置換される。例示的実施形態では、少なくとも4つの内在性J断片が、除去又は置換される。例示的実施形態では、すべての内在性J断片が、除去又は置換される。
その代わりに、いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、a)ラクダD及び/又はJ遺伝子断片を含む、未再構成の重鎖可変(V)、多様(D)、及び結合(J)遺伝子断片、並びにb)少なくとも1つの、機能性CH1ドメインを欠くIgG定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む。
例えば、トランスジェニック非ヒト動物のIgH遺伝子座は、a)1つ又は複数の内在性非ヒトD及び/又はJ遺伝子断片の、1つ又は複数の未再構成ラクダD及び/又はJ遺伝子断片での置換、並びにb)少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインの部分欠失又は完全欠失により改変される。
その代わりに、トランスジェニック非ヒト動物のIgH遺伝子座は、a)1つ又は複数の未再構成ラクダD及び/又はJ遺伝子断片の挿入、並びにb)少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインの部分欠失又は完全欠失により改変される。
他の実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物のIgH遺伝子座が、a)1つ若しくは複数の内在性非ヒトD及び/若しくはJ遺伝子断片の、1つ若しくは複数の未再構成ラクダD及び/若しくはJ遺伝子断片での置換、又は1つ若しくは複数の未再構成ラクダD及び/若しくはJ遺伝子断片の挿入、並びにb)少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインの改変により改変される。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物のIgH遺伝子座が、すべての内在性非ヒトD及びJ断片の、非ヒト哺乳動物D及びJ遺伝子断片での置換により改変される。いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物のIgH遺伝子座が、すべての内在性非ヒトD及びJ断片の、未再構成非ヒト哺乳動物D及びJ遺伝子断片での置換により改変される。
他の実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物のIgH遺伝子座が、すべての内在性非ヒトD及びJ断片の、未再構成ラクダD及びJ遺伝子断片での置換により改変される。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つの内在性非ヒトD及び/又はJ断片が保存されていてもよい。
いくつかの実施形態では、すべての内在性非ヒトD及び/又はJ断片が保存されていてもよい。
一例示的実施形態では、ラクダD遺伝子断片が、単一のラクダ種に由来する。
他の例示的実施形態では、ラクダD遺伝子断片が、少なくとも2つのラクダ種に由来する。
他の例示的実施形態では、ラクダD遺伝子断片が、少なくとも3つのラクダ種に由来する。
他の例示的実施形態では、ラクダD遺伝子断片が、少なくとも4つのラクダ種に由来する。
他の例示的実施形態では、ラクダD遺伝子断片が、少なくとも5つのラクダ種に由来する。
一例示的実施形態では、ラクダJ遺伝子断片が、単一のラクダ種に由来する。
他の例示的実施形態では、ラクダJ遺伝子断片が、少なくとも2つのラクダ種に由来する。
他の例示的実施形態では、ラクダJ遺伝子断片が、少なくとも3つのラクダ種に由来する。
他の例示的実施形態では、ラクダJ遺伝子断片が、少なくとも4つのラクダ種に由来する。
他の例示的実施形態では、ラクダJ遺伝子断片が、少なくとも5つのラクダ種に由来する。
本開示に従って、ラクダD及びJ遺伝子断片は、単一のラクダ種に由来する。
同じく本開示に従って、ラクダD及びJ遺伝子断片は、少なくとも2つのラクダ種に由来する。
同じく本開示に従って、ラクダD及びJ遺伝子断片は、少なくとも3つのラクダ種に由来する。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物のIgH遺伝子座が、1つ又は複数の内在性非ヒトV遺伝子断片の、複数の哺乳動物種のV遺伝子断片での置換により改変される。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物のIgH遺伝子座が、複数の哺乳動物種のV遺伝子断片の挿入により改変される。
IgH遺伝子座の改変としては、例えば、1つ若しくは複数の内在性非ヒトV遺伝子断片の、1つ若しくは複数のラクダV遺伝子断片での置換、又はラクダV遺伝子断片の挿入が挙げられる。
いくつかの場合、すべての内在性非ヒトV断片を、ラクダV遺伝子断片に置換する。
そのような置換又は挿入は、通常、内在性V部位において、ラクダV遺伝子断片が、該内在性V断片と同じゲノム領域に位置するように行う。
いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、a)複数のラクダ種に由来するV、D及び/又はJ遺伝子断片を含む、未再構成の重鎖可変(V)、多様(D)、及び結合(J)遺伝子断片、並びにb)少なくとも1つの、機能性CH1ドメインを欠くIgG定常領域遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物のIgG定常領域遺伝子が、機能性CH1ドメインを欠く内在性IgG定常領域遺伝子である。しかしながら、他の実施形態では、機能性CH1ドメインを欠く非内在性IgG定常領域(例えば、ヒトIgG定常領域その他)遺伝子も使用可能である。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物のラクダV遺伝子断片が、単一のラクダ種に由来する。
その代わりに、いくつかの実施形態では、ラクダV遺伝子断片が、少なくとも2つ、少なくとも3つ、又は少なくとも4つのラクダ種に由来する。従って、いくつかの実施形態では、ラクダV遺伝子断片が、少なくとも2つのラクダ種に由来する。いくつかの実施形態では、ラクダV遺伝子断片が、少なくとも3つのラクダ種に由来する。いくつかの実施形態では、ラクダV遺伝子断片が、少なくとも4つのラクダ種に由来する。いくつかの実施形態では、ラクダV遺伝子断片が、少なくとも5つのラクダ種に由来する。
いくつかの実施形態では、V遺伝子断片が、VHポリペプチドをコードする。いくつかの特定の実施形態では、VHがラクダVHである。
他の実施形態では、V遺伝子断片が、VHHポリペプチドをコードする。いくつかの特定の実施形態では、VHHがラクダVHHである。
本開示の更に他の実施形態では、V遺伝子断片が、VH及びVHHポリペプチドをコードする。いくつかの特定の実施形態では、該VH及びVHHが、ラクダのVH及びVHHである。
いくつかの実施形態では、ラクダVH及び/又はVHHが、アルパカ、ラマ、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ビクニア、又はそれらの組合せに由来する。従って、いくつかの実施形態では、ラクダVH及び/又はVHHが、アルパカ由来のVH及び/又はVHHを含む。いくつかの実施形態では、ラクダVH及び/又はVHHが、ラマ由来のVH及び/又はVHHを含む。いくつかの実施形態では、ラクダVH及び/又はVHHが、フタコブラクダ由来のVH及び/又はVHHを含む。いくつかの実施形態では、ラクダVH及び/又はVHHが、ヒトコブラクダ由来のVH及び/又はVHHを含む。いくつかの実施形態では、ラクダVH及び/又はVHHが、ビクニア由来のVH及び/又はVHHを含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、例えば、アルパカ由来のV断片、フタコブラクダ由来のV断片、ラマ由来のV断片、及び/又はヒトコブラクダ、ビクニア由来のV断片、又はそれらの組合せを含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、アルパカ由来のラクダD遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、フタコブラクダ由来のラクダD遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ラマ由来のラクダD遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ヒトコブラクダ由来のラクダD遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ビクニア由来のラクダD遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、アルパカ由来のラクダJ遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、フタコブラクダ由来のラクダJ遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ラマ由来のラクダJ遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ヒトコブラクダ由来のラクダJ遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ビクニア由来のラクダJ遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、アルパカ由来のラクダD及びJ遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、フタコブラクダ由来のラクダD及びJ遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ラマ由来のラクダD及びJ遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ヒトコブラクダ由来のラクダD及び/又はJ遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ビクニア由来のラクダD及び/又はJ遺伝子断片を含む。
いくつかの例示的実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つから少なくとも7つ(1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つを含む)のアルパカD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つのアルパカD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、2つのアルパカD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、3つのアルパカD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、4つのアルパカD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、5つのアルパカD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、6つのアルパカD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つのアルパカD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つ超のアルパカD遺伝子断片を含む。
他の例示的実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つから少なくとも7つ(1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つを含む)のアルパカJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つのアルパカJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、2つのアルパカJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、3つのアルパカJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、4つのアルパカJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、5つのアルパカJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、6つのアルパカJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つのアルパカJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つ超のアルパカJ遺伝子断片を含む。
更に他の例示的実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つから少なくとも7つ(1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つを含む)のフタコブラクダD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つのフタコブラクダD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、2つのフタコブラクダD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、3つのフタコブラクダD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、4つのフタコブラクダD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、5つのフタコブラクダD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、6つのフタコブラクダD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つのフタコブラクダD遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つ超のフタコブラクダD遺伝子断片を含む。
いくつかの例示的実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つから少なくとも7つ(1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は7つ超を含む)のフタコブラクダJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つのフタコブラクダJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、2つのフタコブラクダJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、3つのフタコブラクダJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、4つのフタコブラクダJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、5つのフタコブラクダJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、6つのフタコブラクダJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つのフタコブラクダJ遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つ超のフタコブラクダJ遺伝子断片を含む。
他の例示的実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つから少なくとも7つ(1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は7つ超を含む)のアルパカV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つのアルパカV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、2つのアルパカV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、3つのアルパカV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、4つのアルパカV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、5つのアルパカV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、6つのアルパカV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つのアルパカV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つ超のアルパカV遺伝子断片を含む。
付加的な例示的実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つから少なくとも10個(1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個又は10個超を含む)のフタコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つのフタコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、2つのフタコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、3つのフタコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、4つのフタコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、5つのフタコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、6つのフタコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つのフタコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、8つのフタコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、9つのフタコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、10個のフタコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、10個超のフタコブラクダV遺伝子断片を含む。
他の例示的実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つから少なくとも10個(1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個又は10個超を含む)のラマV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つのラマV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、2つのラマV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、3つのラマV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、4つのラマV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、5つのラマV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、6つのラマV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つのラマV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、8つのラマV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、9つのラマV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、10個のラマV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、10個超のラマV遺伝子断片を含む。
いくつかの例示的実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つから少なくとも7つ(1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は7つ超を含む)のヒトコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つのヒトコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、2つのヒトコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、3つのヒトコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、4つのヒトコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、5つのヒトコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、6つのヒトコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つのヒトコブラクダV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つ超のヒトコブラクダV遺伝子断片を含む。
いくつかの例示的実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つから少なくとも7つ(1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は7つ超を含む)のビクニアV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、1つのビクニアV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、2つのビクニアV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、3つのビクニアV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、4つのビクニアV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、5つのビクニアV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、6つのビクニアV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つのビクニアV遺伝子断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、7つ超のビクニアV遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、V遺伝子断片、D遺伝子断片、及び/又はJ遺伝子断片が、天然配列をコードする。
他の実施形態では、V遺伝子断片、D遺伝子断片、及び/又はJ遺伝子断片が、変異配列又は非天然配列をコードする。
いくつかの例示的実施形態では、トランスジェニック動物のIgG定常領域遺伝子が、内在性非ヒトIgG定常領域遺伝子又はその一部である。
本開示に従って、機能性CH1ドメインを欠くIgG定常領域遺伝子は、マウスγ3定常領域遺伝子、マウスγ1定常領域遺伝子、マウスγ2b定常領域遺伝子、又はマウスγ2a定常領域遺伝子であり得る。
本開示に従って、機能性CH1ドメインを欠くIgG定常領域遺伝子は、ラットγ1定常領域遺伝子、ラットγ2b定常領域遺伝子、ラットγ2a定常領域遺伝子、又はラットγ2c定常領域遺伝子であり得る。
例えば、いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、一方の又は両方の対立遺伝子におけるCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3定常領域遺伝子を含む。
その代わりに、いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、一方の又は両方の対立遺伝子におけるCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ1定常領域遺伝子を含む。
更に、いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、一方の又は両方の対立遺伝子におけるCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2b定常領域遺伝子を含む。
同じく、いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、一方の又は両方の対立遺伝子におけるCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2a定常領域遺伝子を含む。
同じく、他の実施形態では、トランスジェニック動物のIgH遺伝子座が、一方の又は両方の対立遺伝子におけるCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2c定常領域遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物が、非トランスジェニック動物カウンターパートのガンマグロブリン遺伝子と同一である、少なくとも一部の内在性ガンマグロブリン遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、内在性ガンマグロブリン遺伝子の少なくとも1つ又はすべてが、HCAbの発現を可能にするように改変される。
いくつかの例示的実施形態では、トランスジェニック動物の少なくとも2つのIgG定常領域遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含む。
他の例示的実施形態では、トランスジェニック動物の少なくとも3つのIgG定常領域遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含む。
更なる例示的実施形態では、トランスジェニック動物のすべてのIgG定常領域遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含む。
他の例示的実施形態では、トランスジェニック動物の少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含み、且つ少なくとも1つの他のIgG定常領域遺伝子が、完全又は部分的に欠失している。
例えば、本開示のトランスジェニック非ヒト動物のゲノムは、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3定常領域遺伝子、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ1定常領域遺伝子、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2b定常領域遺伝子、及び/又はCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2a定常領域遺伝子、又はそれらの組合せを有する少なくとも1つの対立遺伝子を有し得る。
他の例示的実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの一方の対立遺伝子が、γ3及びγ2b定常領域遺伝子の部分欠失又は完全欠失を含み、γ1及びγ2a定常領域遺伝子は、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含む。
更に他の例示的実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの一方の対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2b定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む。
更に他の例示的実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの一方の対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3定常領域遺伝子、及び場合により、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2a定常領域遺伝子、及び/又はCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2b定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む。
IgH遺伝子座での改変は、一方の又は両方の対立遺伝子において起こり得る。そのため、いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの他方の対立遺伝子が、同一のIgH遺伝子座、又は同一のIgG定常領域遺伝子を含む。その代わりに、他の実施形態では、両対立遺伝子のIgH遺伝子座が異なる。いくつかの実施形態では、各対立遺伝子が、IgH遺伝子座又はIgG定常領域遺伝子において、異なる改変を有する。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの他方の対立遺伝子が、野生型IgH遺伝子座、又は野生型IgG定常領域遺伝子を含む。
そのため、いくつかの例示的実施形態では、他方の対立遺伝子が、野生型内在性γ3、γ1、γ2b、及びγ2a定常領域遺伝子を含む。
他の例示的実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの他方の対立遺伝子が、少なくとも1つ若しくはすべてのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失、少なくとも1つ若しくは他のすべてのIgG定常領域遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失、又はそれらの組合せから選択される改変を含むIgH遺伝子座を含む。
いくつかの例示的実施形態では、他方の対立遺伝子が、γ3、γ1及びγ2b定常領域遺伝子の完全欠失、並びにCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2a定常領域遺伝子を含む。
他の実施形態では、他方の対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3及びγ2a定常領域遺伝子、並びにγ2b定常領域遺伝子の部分欠失又は完全欠失を含む。
付加的な実施形態では、他方の対立遺伝子が、γ3、γ1及びγ2b定常領域遺伝子の部分欠失又は完全欠失、並びにCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2a定常領域遺伝子を含む。
他の実施形態では、他方の対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3定常領域遺伝子を含む。
更に他の実施形態では、他方の対立遺伝子が、γ3、γ1、及びγ2b定常領域遺伝子の部分欠失又は完全欠失を含む。
いくつかの実施形態では、他方の対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3及びγ2a定常領域遺伝子、並びにγ2b定常領域遺伝子の部分欠失又は完全欠失を含む。
他の例示的実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの両対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2b定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む。
更に他の例示的実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの両対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3及びγ2a定常領域遺伝子、並びにγ2b定常領域遺伝子の部分欠失又は完全欠失を含むIgH遺伝子座を含む。
更に付加的な一例示的実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの両対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3、γ1、γ2b、及びγ2a定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む。
他の例示的実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの両対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での完全欠失を含むγ3、γ1、γ2b、及びγ2a定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む。
他の態様及び実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物のIgH遺伝子座が、各対立遺伝子上に、少なくとも1つの異なるV遺伝子断片を含む。
同じく本開示に従って、トランスジェニック非ヒト動物のIgH遺伝子座は、その対立遺伝子の一方において少なくとも1つの1つの種のV遺伝子断片を含み、他方の対立遺伝子において少なくとも1つの別の種のV遺伝子断片を含む。
本開示の態様及び実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、IgM定常領域遺伝子の生殖系列改変を含む。該改変は、例えば、IgM CH1ドメインの、ラクダCH1ドメインでの置換を含む。
本開示の他の態様及び実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、IgA定常領域遺伝子の生殖系列改変を含む。該改変は、例えば、IgA CH1ドメインの、ラクダCH1ドメインでの置換を含む。
本開示の更に他の態様及び実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、IgE定常領域遺伝子の生殖系列改変を含む。該改変は、例えば、IgE CH1ドメインの、ラクダCH1ドメインでの置換を含む。
本開示の更なる態様及び実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、IgD定常領域遺伝子の生殖系列改変を含む。該改変は、例えば、IgD CH1ドメインの、ラクダCH1ドメインでの置換を含む。
本開示に従って、トランスジェニック非ヒト動物は、ラマ種、フタコブラクダ種、及び/又はアルパカ種のラクダV遺伝子断片の少なくとも約10kbを含む。
本開示に従って、トランスジェニック非ヒト動物は、ラマ種、フタコブラクダ種、及び/又はアルパカ種のラクダV遺伝子断片の少なくとも約20kbを含む。
本開示に従って、トランスジェニック非ヒト動物は、ラマ種、フタコブラクダ種、及び/又はアルパカ種のラクダV遺伝子断片の少なくとも約30kbを含む。
本開示に従って、トランスジェニック非ヒト動物は、ラマ種、フタコブラクダ種、及び/又はアルパカ種のラクダV遺伝子断片の少なくとも約40kbを含む。
本開示に従って、トランスジェニック非ヒト動物は、ラマ種、フタコブラクダ種、及び/又はアルパカ種のラクダV遺伝子断片の少なくとも約50kbを含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ラマ種、フタコブラクダ種、及び/又はアルパカ種のラクダV遺伝子断片の50kb未満を含む。
更に本開示に従って、V遺伝子断片、D遺伝子断片、及びJ遺伝子断片は、VDJ再構成可能である。例えば、内在性V遺伝子断片は、ラクダD及びJ断片と共に再構成し得る。その代わりに、ラクダV遺伝子断片が、ラクダD及びJ断片に合わせて再構成し得る。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物がヘテロ接合型である。
他の実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物がホモ接合型である。
例示的実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、トランスジェニックラットである。
他の例示的実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、トランスジェニックマウスである。
例示的実施形態本開示に従って、トランスジェニック非ヒト動物は、CH1ドメインを欠くマウスIgG1、マウスIgG2a、マウスIgG2b、又はマウスIgG3定常領域をコードするIgG定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を有するトランスジェニックマウスである。
一例示的実施形態では、トランスジェニックマウスが、IgG1遺伝子、IgG2a遺伝子、IgG2b遺伝子、又はIgG3遺伝子の定常領域から選択される、その、CH1ドメインを欠くIgG定常領域のうちの少なくとも2つを有する。
他の例示的実施形態では、トランスジェニックマウスが、IgG1遺伝子、IgG2a遺伝子、IgG2b遺伝子、又はIgG3遺伝子の定常領域から選択される、その、CH1ドメインを欠くIgG定常領域のうちの少なくとも3つを有する。
更に他の例示的実施形態では、トランスジェニックマウスのIgG1遺伝子、IgG2a遺伝子、IgG2b遺伝子、又はIgG3遺伝子の各々が、CH1ドメインを欠く。
他の例示的実施形態では、トランスジェニックマウスが、部分的又は完全に欠失している、そのIgG1遺伝子、IgG2a遺伝子、IgG2b遺伝子、又はIgG3遺伝子のうちの少なくとも1つを有する。
いくつかの例示的実施形態では、トランスジェニックマウスのすべての内在性マウスD及びJ遺伝子断片が、未再構成ラクダD及びJ遺伝子断片で置換される。
他の例示的実施形態では、トランスジェニックマウスのIgH遺伝子座が、1つ又は複数のマウスV遺伝子断片及び未再構成ラクダV遺伝子断片を含む。
更に他の例示的実施形態では、トランスジェニックマウスのすべての内在性マウスV遺伝子断片が、未再構成ラクダV遺伝子断片で置換される。
他の実施形態では、トランスジェニックマウスが、少なくとも1つの、機能性CH1ドメインを欠く内在性マウスIgG定常領域遺伝子を有する。
付加的な実施形態では、トランスジェニックマウスの一方の対立遺伝子のすべての内在性マウスIgG定常領域遺伝子が、機能性CH1ドメインを欠く。
他の実施形態では、トランスジェニックマウスの両対立遺伝子のすべての内在性マウスIgG定常領域遺伝子が、機能性CH1ドメインを欠く。
いくつかの例示的実施形態では、トランスジェニックマウスが、ヘテロ接合型であり、少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失、及び場合により、少なくとも1つの他のIgG定常領域遺伝子の完全欠失又は部分欠失を含む一方の対立遺伝子を有し、且つ他方の対立遺伝子は野生型である。
同じく他の例示的実施形態では、トランスジェニックマウスが、ヘテロ接合型であり、少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失、及び場合により、少なくとも1つ又は他のすべてのIgG定常領域遺伝子の完全欠失又は部分欠失を含む一方の対立遺伝子を有し、且つ他方の対立遺伝子は、場合により、少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失、又は少なくとも1つ若しくは他のすべてのIgG定常領域遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失、又はそれらの組合せを含む。
他の例示的実施形態では、トランスジェニックマウスがホモ接合型である。
更なる例示的実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、IgH遺伝子座において、a)内在性マウスD及びJ遺伝子断片の、未再構成ラクダD及びJ遺伝子断片での置換、a)内在性マウスV遺伝子断片の1つ若しくは複数の、1つ若しくは複数の未再構成ラクダV遺伝子断片での置換、又は1つ若しくは複数の未再構成ラクダV遺伝子断片の挿入、並びにc)内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、及びγ3遺伝子から発現するポリペプチドが機能性CH1ドメインを含まないような、前記内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、及びγ3遺伝子の少なくとも1つ若しくはすべてのCH1ドメインの欠失、を含む生殖系列改変を有するトランスジェニックマウスである。
他の例示的実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、IgH遺伝子座において、a)内在性マウスD及び/又はJ部位での、未再構成ラクダD及び/又はJ遺伝子断片の挿入、a)内在性マウスV遺伝子断片の1つ若しくは複数の、1つ若しくは複数の未再構成ラクダV遺伝子断片での置換、又は1つ若しくは複数の未再構成ラクダV遺伝子断片の挿入、並びにc)内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、及びγ3遺伝子から発現するポリペプチドが機能性CH1ドメインを含まないような、前記内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、及びγ3遺伝子の少なくとも1つ若しくはすべてのCH1ドメインの欠失、を含む生殖系列改変を有するトランスジェニックマウスである。
他の例示的実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、IgH遺伝子座において、a)内在性マウスD及びJ遺伝子断片の、未再構成ラクダD及びJ遺伝子断片での置換、a)内在性マウスV遺伝子断片の1つ若しくは複数の、1つ若しくは複数の未再構成ラクダV遺伝子断片での置換、又は1つ若しくは複数の未再構成ラクダV遺伝子断片の挿入、並びにc)内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、及びγ3遺伝子から発現するポリペプチドが機能性CH1ドメインを含まないような、前記内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、及びγ3遺伝子の少なくとも1つ若しくはすべてのCH1ドメインの改変、を含む生殖系列改変を有するトランスジェニックマウスである。
他の例示的実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座において生殖系列改変を含むトランスジェニックマウスであり、該改変は、内在性マウスγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及びγ2a遺伝子の各々のCH1ドメインの欠失、マウスD及びJ遺伝子断片の、未再構成ラクダD及びJ遺伝子断片での置換、複数のラクダ種に由来するラクダV遺伝子断片の挿入、並びに場合により、少なくとも1つ又はすべての内在性マウスV遺伝子断片の欠失、を含む。
いくつかの実施形態では、ラクダV断片が、ラクダVHポリペプチド及びラクダVHHポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、重鎖のみの抗体(HCAb)又はそれをコードする核酸を、抗原による免疫化の後に発現することができる。
いくつかの実施形態では、ラクダV断片が、アルパカ、フタコブラクダ、及びラマ由来のVH及び/又はVHHポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ラクダV断片が、アルパカ、フタコブラクダ、ラマ、及びヒトコブラクダ由来のVH及び/又はVHHポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ラクダV断片が、アルパカ、フタコブラクダ、ラマ、ビクニア、及びヒトコブラクダ由来のVH及び/又はVHHポリペプチドをコードする。
例示的実施形態では、トランスジェニックマウスが、H-2bとして特徴づけられるMHCハプロタイプを有する。
他の例示的実施形態では、トランスジェニックマウスが、C57BL/6マウス系統の遺伝的背景を有する。
いくつかの実施形態では、トランスジェニックマウスが、例えば、制限なしに、C3H、FVB、又は129/Svを含む近交系の遺伝的背景を有する。
いくつかの実施形態では、トランスジェニックマウスが、例えば、制限なしに、CD-1又はCF-1を含む非近交系の遺伝的背景を有する。
他の態様では、本開示は、重鎖のみの抗体(HCAb)又はHCAbの抗原結合ドメイン、HCAb、HCAbの抗原結合ドメイン若しくはその一部をコードする核酸を取得する方法に関する。
例示的実施形態では、本方法が、本明細書に開示されるトランスジェニック非ヒト動物を抗原で免疫化する工程を含む。
トランスジェニック非ヒト動物は、抗原による免疫化に応じて複数のHCAbを産生し得る。該複数のHCAbは、例えば、第1のラクダ種のV断片によりコードされるV部分を含む少なくとも1つのHCAb種、及び第2のラクダ種のV断片によりコードされるV部分を含む第2のHCAb種を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の方法が、トランスジェニック非ヒト動物から全RNA又はメッセンジャーRNAを回収する工程を含む。
いくつかの実施形態では、血清試料及び/又は脾臓組織を採取し、RNAを抽出して、可変重鎖(VH)の1つ又は複数のライブラリを構築する。
いくつかの実施形態では、HCAbを、抗原に対するその結合特性に基づいて選択する。
いくつかの実施形態では、本方法が、HCAb種の、1つ若しくは複数の相補性決定領域若しくは可変領域のアミノ酸配列又は核酸配列を決定する工程を含む。
一例示的実施形態では、本方法が、コンピュータベースであり、且つ所定パラメータに基づいて配列情報をクラスターに組織化するソフトウェアを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の本方法が、結合剤を作製するために、HCAbの1つ又は複数の配列を選択する工程を含む。
結合剤の例示的実施形態としては、例えば、制限なしに、抗体(二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体を含む)、単一ドメイン抗体、単鎖Fv、キメラ抗原受容体(CAR)、二重特異性T細胞エンゲージャ構築物(BiTE)、二重特異性キラー細胞エンゲージャ(BiKE)、三重特異性キラー細胞エンゲージャ(TriKE)、又はそれらの抗原結合フラグメントが挙げられる。
一例示的実施形態では、米国仮出願第62/951,701号明細書、及び国際公開第2021119832号で2021年6月24日に公開されたPCT/CA2020/051753において記載されるか、又はDeyev、S.Mら(BioEssays 30:904～918頁、2008)において記載される、フォーマットとしての結合剤であり、そのすべての全内容が、参照により本明細書に組み込まれている。
いくつかの実施形態では、結合剤が、例えば、内在性VH部分を含む。
いくつかの実施形態では、結合剤が、例えば、ラクダVHH部分を含む。
いくつかの実施形態では、結合剤が、例えば、ラクダVH部分を含む。
いくつかの実施形態では、結合剤が、例えば、ラクダD部分を含む。
いくつかの実施形態では、結合剤が、例えば、ラクダJ部分を含む。
いくつかの実施形態では、結合剤が、多価抗体及び/又は多重特異性抗体である。
同じく本開示に従って、本方法は、IgH遺伝子座におけるa)内在性マウスV遺伝子断片の1つ若しくは複数の、1つ若しくは複数の未再構成ラクダV遺伝子断片での置換、又は未再構成ラクダV遺伝子断片の挿入、b)内在性マウスD及びJ断片の少なくとも1つ又はすべての、ラクダD及びJ断片での置換、並びにc)内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、若しくはγ3遺伝子から発現するポリペプチドが機能性CH1ドメインを含まないような、前記内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、若しくはγ3遺伝子の少なくとも1つ若しくはすべてのCH1ドメインの欠失又は改変、を含む生殖系列改変を含むトランスジェニック非ヒト動物を用いて行われ得る。
結合剤を作製する方法も、本開示に含まれる。
いくつかの実施形態では、本方法が、本開示のトランスジェニック非ヒト動物を抗原で免疫化する工程、少なくとも1つのHCAb種の、1つ若しくは複数の相補性決定領域若しくは可変領域のアミノ酸配列又は核酸配列を取得する工程、及びアミノ酸配列を含む結合剤を生成する工程を含む。
一例示的実施形態では、複数のHCAb種の、1つ若しくは複数の相補性決定領域若しくは可変領域のアミノ酸配列又は核酸配列を取得し、最も代表的な又は共通の配列を含む結合剤を生成する。
他の例示的実施形態では、複数のHCAb種の、1つ若しくは複数の相補性決定領域若しくは可変領域のアミノ酸配列又は核酸配列を取得し、最も代表的でない(least represented)又は特有の配列を含む結合剤を生成する。
本開示は更に、本明細書に開示される方法により得られるか、又は本明細書に開示されるトランスジェニック非ヒト動物から単離若しくは取得されるアミノ酸配列を含むか、又は本明細書に開示される方法により得られるか、又は本明細書に開示されるトランスジェニック非ヒト動物から単離若しくは取得される核酸配列によりコードされる結合剤に関する。
本開示は更に、本明細書に開示されるトランスジェニック非ヒト動物を抗原で免疫化する工程により取得されるアミノ酸配列を含むか、又は本明細書に開示されるトランスジェニック非ヒト動物を抗原で免疫化する工程により取得される核酸配列によりコードされる結合剤に関する。
いくつかの実施形態では、該抗原が、ヒト細胞により発現される抗原である。
いくつかの実施形態では、該抗原が腫瘍抗原である。
いくつかの実施形態では、該抗原がチェックポイントタンパク質である。
いくつかの実施形態では、該抗原が、免疫細胞の表面で発現されるタンパク質である。
いくつかの実施形態では、該抗原が、病原体に由来し、例えば、制限なしに、細菌抗原、ウイルス抗原、寄生虫抗原を含む。
本開示は更に、IgH遺伝子座における、遺伝子断片の標的化置換用の核酸構築物に関する。
本開示は更に、IgH遺伝子座における、遺伝子断片の標的化挿入用の核酸構築物に関する。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物が、ゲノム非ヒトD及び/又はJ断片を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物が、ゲノムヒトD及び/又はJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物が、ゲノムラクダD及び/又はJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物が、ゲノム内在性マウスD及び/又はJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物が、ゲノム内在性マウスD及び/又はJ断片、並びにゲノムラクダD及び/又はJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物が、ゲノム非ヒトV、D、及び/又はJ断片を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物が、ゲノムヒトV、D、及び/又はJ断片を含む。
他の実施形態では、本開示の核酸構築物が、ゲノムラクダV、D、及び/又はJ断片を含む。
一実施形態では、核酸構築物がDNA構築物である。
本開示に従って、DNA構築物は、ゲノムラクダV断片、及びVDJ再構成用の組換えシグナル配列を含むイントロンを含む。
一例示的実施形態では、DNA構築物が、少なくとも1つの種に由来するラクダV断片を含む。
他の例示的実施形態では、DNA構築物が、少なくとも2つの種に由来するラクダV断片を含む。
更に他の例示的実施形態では、DNA構築物が、少なくとも3つの種に由来するラクダV断片を含む。
更に他の例示的実施形態では、DNA構築物が、少なくとも4つの種に由来するラクダV断片を含む。
更に他の例示的実施形態では、DNA構築物が、少なくとも5つの種に由来するラクダV断片を含む。
本開示に従って、ラクダV断片は、ラクダVH又はラクダVHHポリペプチドをコードする。
付加的な一例示的実施形態では、DNA構築物が、1つのラクダ種に由来するD及びJ断片を含む。
付加的な一例示的実施形態では、DNA構築物が、2つのラクダ種に由来するD及びJ断片を含む。
付加的な一例示的実施形態では、DNA構築物が、3つのラクダ種に由来するD及びJ断片を含む。
付加的な一例示的実施形態では、DNA構築物が、4つのラクダ種に由来するD及びJ断片を含む。
付加的な一例示的実施形態では、DNA構築物が、5つのラクダ種に由来するD及びJ断片を含む。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも7つの、アルパカのD遺伝子断片を含む。
他の例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも7つの、アルパカのJ遺伝子断片を含む。
他の例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも7つのフタコブラクダD遺伝子断片を含む。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも7つのフタコブラクダJ遺伝子断片を含む。
他の例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも7つのラマD遺伝子断片を含む。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも7つのラマJ遺伝子断片を含む。
他の例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも7つのヒトコブラクダD遺伝子断片を含む。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも7つのヒトコブラクダJ遺伝子断片を含む。
他の例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも7つのビクニアD遺伝子断片を含む。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも7つのビクニアJ遺伝子断片を含む。
その上に更なる一例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも10個のアルパカV遺伝子断片を含む。
付加的な一例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも10個のフタコブラクダV遺伝子断片を含む。
更に付加的な一例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも10個のラマV遺伝子断片を含む。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも10個のヒトコブラクダV遺伝子断片を含む。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物が、1つから少なくとも10個のビクニアV遺伝子断片を含む。
一例示的実施形態では、DNA構築物が、5'→3'に、マウスVH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む。
他の例示的実施形態では、DNA構築物が、5'→3'に、マウスVH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む。
他の例示的実施形態では、DNA構築物が、5'→3'に、マウスVH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む。
更なる例示的実施形態では、DNA構築物が、5'→3'に、マウスVH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む。
他の例示的実施形態では、DNA構築物が、5'→3'に、マウスVH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む。
更に他の例示的実施形態では、DNA構築物が、5'→3'に、マウスVH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、フタコブラクダD断片、フタコブラクダJ断片、並びにアルパカJ断片を含む。
一例示的実施形態では、DNA構築物が、5'→3'に、マウスVH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダD断片、並びにフタコブラクダJ断片を含む。
他の例示的実施形態では、DNA構築物が、5'→3'に、アルパカVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、ヒトコブラクダVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む。
更に他の例示的実施形態では、DNA構築物が、5'→3'に、アルパカVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、ヒトコブラクダVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む。
本開示に従って、DNA構築物は、人工染色体として準備される。例えば、いくつかの実施形態では、DNA構築物を、細菌人工染色体(BAC)として準備する。いくつかの実施形態では、DNA構築物を、酵母人工染色体(YAC)として準備する。いくつかの実施形態では、DNA構築物を、哺乳動物人工染色体(MAC)として準備する。
本開示は更に、非ヒト胚性幹細胞を改変するため、又はトランスジェニック非ヒト動物を作製するための、本明細書に開示されるDNA構築物の使用に関する。
本開示は更に、本明細書に開示されるDNA構築物によって改変された単離非ヒト胚性幹細胞に関する。
例示的実施形態では、本開示の単離非ヒト胚性幹細胞が、IgH遺伝子座において、a)ラクダD及び/又はJ遺伝子断片を含む、未再構成の重鎖可変(V)、多様(D)、及び結合(J)遺伝子断片、並びにb)少なくとも1つの、機能性CH1ドメインを欠くIgG定常領域遺伝子を含む生殖系列改変を含む。
該改変は、内在性IgG定常領域上で行う。
本明細書に開示される非ヒト胚性幹細胞は、トランスジェニック非ヒト動物の作製に使用され得る。
本開示は更に、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法が、本明細書に開示される非ヒト胚性幹細胞をマウス胚盤胞に注入する工程、該マウス胚盤胞又は胚を、偽妊娠マウスに移植する工程、及び生殖系列改変を有するマウス子孫を選択する工程を含む。
本開示は更に、本明細書に開示されるトランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞に関する。
いくつかの態様では、本明細書に記載される核酸構築物の使用を含む、トランスジェニック動物を作製する方法が提供される。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物を作製する方法が、核酸構築物を幹細胞に導入する工程を含み、核酸は、ゲノムラクダD及び/又はJ断片、並びに場合により、ゲノムラクダV断片を含み、該核酸構築物は、VDJ再構成用の組換えシグナル配列を含むイントロンを含む。
他の例示的実施形態では、トランスジェニック動物を作製する方法が、本明細書に開示される遺伝子改変胚性幹細胞を微量注入した胚盤胞を、偽妊娠マウスに移植する工程を含む。
他の例示的実施形態では、トランスジェニック動物を作製する方法が、本明細書に開示される核酸構築物を用いて遺伝子改変した胚性幹細胞を微量注入した胚盤胞を、偽妊娠マウスに移植する工程を含む。
いくつかの実施形態では、本方法が、同腹仔からキメラマウスを選択する工程を含み得る。
いくつかの実施形態では、本方法が、キメラマウスを野生型マウスと戻し交配することにより、F1ヘテロ接合型動物を生成する工程を含み得る。
いくつかの実施形態では、本方法が、F1動物の交配により、F2ホモ接合型動物を生成する工程を含み得る。
例えば、本明細書に開示される核酸構築物を用いて遺伝子改変した胚性幹細胞を微量注入した胚盤胞を、偽妊娠マウスに移植し、同腹仔からキメラマウスを選択し、場合により、キメラマウスを野生型マウスと戻し交配することにより、F1ヘテロ接合型動物を生成し、場合により、F1動物の交配により、F2ホモ接合型動物を生成する。
他の実施例では、本明細書に開示される胚性幹細胞を微量注入した胚盤胞を、偽妊娠マウスに移植し、同腹仔からキメラマウスを選択し、場合により、キメラマウスを野生型マウスと戻し交配することにより、F1ヘテロ接合型動物を生成し、場合により、F1動物の交配により、F2ホモ接合型動物を生成する。
いくつかの実施形態では、核酸が、少なくとも2つ、3つ、又は4つの異なる種に由来するV、D、及び/又はJ遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸が、少なくとも2つ、3つ、又は4つのラクダ種に由来するV、D、及び/又はJ遺伝子配列を含む。
図面の簡単な説明
図面の簡単な説明
詳細な説明
定義
異なる指定がない限り、二量化ドメインに対して示すアミノ酸ナンバリングは、EUナンバリングシステムに従う。
定義
異なる指定がない限り、二量化ドメインに対して示すアミノ酸ナンバリングは、EUナンバリングシステムに従う。
実施形態を記載する関連での(特に特許請求の範囲の関連での)用語「a」及び「an」及び「the」及び同様の指示対象の使用は、本明細書に異なる指定がないか、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数と同様に複数も網羅すると解釈されるべきである。
特に指定がないか、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する用語「or」は、包括的であると理解されるべきであり、「or」と同様に「and」も網羅する。
用語「及び/又は(and/or)」は、本明細書で使用する場合、指定された特徴又は成分の各々の、他方があってもなくてもよい具体的な開示と見なされるべきである。
用語「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」及び「含有する(containing)」は、特に記載のない限り、オープンエンドの用語(即ち「～を含むがこれに限定されない(including, but not limited to)」の意味)であると解釈されるべきである。用語「～からなる(consisting of)」は、クローズドエンドと解釈されるべきである。
本開示の目的での用語「処置(treatment)」は、治療処置及び予防措置又は防止措置の両方に関する。処置を必要とする者は、障害をすでに有する者、並びに障害を有しやすい者又は障害が防がれるべきである者を含む。
任意の値に関して、用語「約(about)」又は「およそ(approximately)」は、値の変動が意図されることを意味する。いくつかの実施形態では、用語「約(about)」又は「およそ(approximately)」は、一般的に、任意の値又は範囲の+/-20パーセント以内、+/-10パーセント以内、+/-5パーセント以内、+/-4パーセント以内、+/-3パーセント以内、+/-2パーセント以内、又は+/-1パーセント以内の範囲を意味するものとする。
任意の値に関して、用語「少なくとも(at least)」は、その値及び上位値を含むと意図されると本明細書では理解されるべきである。例えば、用語「少なくとも1つ」は、「少なくとも2つ」、「少なくとも3つ」、「少なくとも4つ」、「少なくとも5つ」、「少なくとも6つ」、「少なくとも7つ」、「少なくとも8つ」、「少なくとも9つ」、「少なくとも10個」等を含む。例えば、用語「少なくとも80%」は、「少なくとも81%」、「少なくとも82%」、「少なくとも83%」、「少なくとも84%」、「少なくとも85%」、「少なくとも86%」、「少なくとも87%」、「少なくとも88%」、「少なくとも89%」、「少なくとも90%」、「少なくとも91%」、「少なくとも92%」、「少なくとも93%」、「少なくとも94%」、「少なくとも95%」、「少なくとも96%」、「少なくとも97%」、「少なくとも98%」、「少なくとも99%」、「少なくとも99.1%」、「少なくとも99.2%」、「少なくとも99.3%」、「少なくとも99.4%」、「少なくとも99.5%」、「少なくとも99.6%」、「少なくとも99.7%」、「少なくとも99.8%」、「少なくとも99.9%」、及び「少なくとも100%」を含む。
本明細書で使用する用語「結合剤」は、抗体又はその抗原結合フラグメントの抗原結合ドメインを含む化合物に関する。
本明細書で使用する用語「抗原結合ドメイン」は、抗原との結合に関与する、抗体のドメインに関し、CDRH3、CDRH1とCDRH2とCDRH3との組合せ、又は抗体若しくはその抗原結合フラグメントの可変領域全体を含む。
本明細書で使用する用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、単一ドメイン抗体(例えば、VHH、VH、VL、ナノボディ、又はラクダ又はサメ等に由来する単一ドメイン抗体)等を含む。用語「抗体」は、天然型抗体(例えば、IgG、IgM、IgD、IgA、IgE、単一ドメイン抗体等)のフォーマットと同様のフォーマット、又は他のフォーマット、例えば、二重特異性抗体、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ等を有する分子を含む。
本明細書で使用する用語「導入遺伝子」は、宿主、例えば非ヒト動物のゲノムに導入されている遺伝子又はその一部に関する。
本明細書で使用する用語「トランスジェニック非ヒト動物」又は「トランスジェニック動物」は、1つ又は複数の導入遺伝子を有する非ヒト動物に関し、キメラ動物、ヘテロ接合型動物、及びホモ接合型動物を含む。
用語「VH」は、古典的抗体重鎖の可変領域に関する。
用語「VHH」は、重鎖のみの抗体の可変領域に関する。
用語VH断片は、古典的抗体重鎖のV断片に関する。
用語VHH断片は、重鎖のみの抗体のV断片に関する。
本明細書で使用する用語V断片は、VH断片又はVHH断片に関すると理解されるべきである。
用語VHポリペプチドは、VH断片によってコードされるアミノ酸配列に関する。
用語VHHポリペプチドは、VHH断片によってコードされるアミノ酸配列に関する。
遺伝子又は断片に関して、用語「内在性」は、動物ゲノムの天然の遺伝子又は断片に関する。
用語「内在性V部位」は、動物ゲノム中でV断片が位置する部位又は位置に関する。
用語「内在性D部位」は、動物ゲノム中でD断片が位置する部位又は位置に関する。
用語「内在性J部位」は、動物ゲノム中でJ断片が位置する部位又は位置に関する。
遺伝子又は断片に関して、用語「非内在性」は、外来の遺伝子又は断片に関する。
用語「野生型」は、改変されていない(即ち、非改変若しくは未改変)か、又は自然界に存在する配列に関する。
用語「機能性CH1ドメイン」は、軽鎖との対合を可能にするアミノ酸残基を含むCH1ドメインに関する。
用語「CH1ドメインの欠失」は、軽鎖との重鎖の対合を担う、CH1ドメインのアミノ酸残基の1つ若しくは複数の欠失、そのようなアミノ酸残基を含む部分の欠失(即ち、部分欠失と呼ばれる)、又はCH1ドメイン全体の欠失(完全欠失と呼ばれる)に関する。
用語「CH1ドメインの改変」は、軽鎖との重鎖の対合を妨げる、アミノ酸の変異又は置換に関する。
任意の遺伝子に関して、用語「完全欠失又は部分欠失」は、通常その遺伝子によってコードされる任意のタンパク質又はエクソンが発現されないようにする欠失に関する。
本開示では、動物のゲノムを、単一ドメイン抗体を発現するように改変する。本明細書に開示されるトランスジェニック動物のいくつかは、有利には、様々な遺伝的背景及びアイソタイプの単一ドメイン抗体を産生し得る。
本開示のトランスジェニック動物の生成は、所望の改変を含む核酸構築物を設計又は生成する工程、及び遺伝子改変された胚性幹細胞又は受精卵を取得する工程を含む。これらを、胚盤胞期胚に微量注入して、偽妊娠雌性マウスに移植する。導入遺伝子を含むキメラを、続く育種に向けて選択する。所望の遺伝子改変を有するヘテロ接合型動物又はホモ接合型動物を取得する。
本開示では、改変IgH遺伝子座を有するトランスジェニック動物を本明細書に開示する。
核酸構築物
従って、本明細書に開示される核酸構築物は、動物のIgH遺伝子座の改変を可能にする配列を含む。
従って、本明細書に開示される核酸構築物は、動物のIgH遺伝子座の改変を可能にする配列を含む。
例示的実施形態では、DNA構築物を、マウス又はマウス胚性幹細胞のIgH遺伝子座の改変を可能にするように設計する。
DNA構築物は、相同組換え用の配列、及び通常は抗生物質耐性遺伝子、又は導入遺伝子を組み込んだ細胞の選択を可能にするマーカーを含む。例えば、DNA構築物は、目的の遺伝子が動物のゲノム内の所望の位置において、例えば、マウスIgH遺伝子座において挿入されるように、loxP部位及びホモロジーアームを含み得る。
いくつかの場合、組込みを高めるために、DNA構築物を、内部相同配列を標的とするCRISPR構築物と同時注入する。
他の場合、DNA構築物は、遺伝子編集ツール、例えば、規則的な間隔をもってクラスター化された反復回文配列(CRISPR)-Cas9システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALENS)システム等による遺伝子ターゲティング用の配列を含む。
本開示のDNA構築物は、例えば、内在性マウスγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/又はγ2a遺伝子のCH1ドメインの欠失又は改変を有する遺伝子を含む。
CH1ドメインの欠失は、CH1ドメインの部分欠失又は完全欠失を含む。CH1ドメインの完全欠失が、特に予定される。
CH1ドメインの改変は、軽鎖との対合に関与するアミノ酸残基の変異を含み、対合の著しい低下又は欠如をもたらす。CH1ドメインでの他の改変は、CH1エクソンがメッセンジャーRNAへと組み込まれないようにする核酸変異を含む。
その代わりに、DNA構築物は、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子のCH1ドメインの欠失又は改変と、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子の完全欠失又は部分欠失との組合せを有する遺伝子を含む。
いくつかの場合、DNA構築物は更に、V、D、及び/又はJ遺伝子断片、例えば、未再構成V、D、及び/又はJ遺伝子断片、並びにVDJ再構成用の組換えシグナル配列を含む関連イントロンを含み得る。
DNA構築物は、複数のD及び/又はJ遺伝子断片を含み得る。いくつかの場合、複数のD及び/又はJ遺伝子断片はすべて、単一種に由来する。他の場合、複数のD及び/又はJ遺伝子断片は、少なくとも2つの種に由来する。更に他の場合、複数のD及び/又はJ遺伝子断片は、少なくとも3つの種(4つの種及び5つの種を含む)に由来する。
DNA構築物は、複数のV遺伝子断片を含み得る。いくつかの場合、複数のV遺伝子断片はすべて、単一種に由来する。他の場合、複数のV遺伝子断片は、少なくとも2つの種に由来する。更に他の場合、複数のV遺伝子断片は、少なくとも3つの種に由来する。他の場合、複数のV遺伝子断片は、少なくとも4つの種に由来する。更なる場合、複数のV遺伝子断片は、少なくとも5つの種に由来する。
従って、DNA構築物は、1つ又は複数の未再構成ラクダD及び/又はJ遺伝子断片と、少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインの部分欠失又は完全欠失又は改変を含む遺伝子とを含み得る。
その代わりに、DNA構築物は、1つ又は複数の未再構成ラクダV、D、及び/又はJ遺伝子断片と、少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインの部分欠失又は完全欠失又は改変を含む遺伝子とを含み得る。
いくつかの場合、DNA構築物に含まれる改変IgG定常領域遺伝子は、改変マウスIgG定常領域遺伝子である。
他の場合、DNA構築物に含まれる改変IgG定常領域遺伝子は、改変ヒトIgG定常領域遺伝子である。
DNA構築物は、本明細書に開示される改変免疫グロブリンガンマ遺伝子のいずれかを含み得る。
DNA構築物は、本明細書に開示される、V断片、D断片、及びJ断片のいずれかの組合せを含み得る。
遺伝子操作で現在のところ使用されているDNA構築物は、人工染色体、例えば、制限なしに、細菌人工染色体、酵母人工染色体、又は哺乳動物人工染色体を含む。
動物のゲノム内に組み込まれる配列は、導入遺伝子と同定され得る。
V、D、及びJ断片、並びに導入遺伝子
本明細書に開示されるように、トランスジェニック非ヒト動物は、ラクダ由来、又は他の哺乳動物、例えば、ヒト、若しくはげっ歯類、又はそれらの組合せに由来する未再構成V、D、及び/又はJ遺伝子断片を含む。
本明細書に開示されるように、トランスジェニック非ヒト動物は、ラクダ由来、又は他の哺乳動物、例えば、ヒト、若しくはげっ歯類、又はそれらの組合せに由来する未再構成V、D、及び/又はJ遺伝子断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ラクダ由来のV、D、及び/J遺伝子断片を含む。
従って、トランスジェニック非ヒト動物は、各々のV、D、及び/又はJ断片と関連するオリジナルラクダ調節配列を含むゲノムラクダV、D、及び/又はJ遺伝子断片を含む。
例えば、各ラクダV断片は、V断片のおよそ5kb上流及びおよそ5kb下流を含み、ラクダ調節配列、ラクダイントロン配列、ラクダリーダー配列、及びV断片を囲むラクダ組換えシグナル配列を含む。
従って、未再構成ラクダV断片は、周辺のラクダ調節領域、周辺のラクダイントロン配列、周辺のラクダリーダー配列、及び周辺のラクダRSSを含む。
いくつかの実施形態では、未再構成ラクダD断片が、周辺のラクダ調節領域、ラクダイントロン配列、ラクダリーダー配列、及びラクダRSSを含む。
例えば、各ラクダD断片は、ラクダ調節配列、ラクダイントロン配列、ラクダリーダー配列、及びD断片を囲むラクダ組換えシグナル配列を含む。
いくつかの実施形態では、未再構成ラクダJ断片が、周辺のラクダ調節領域、ラクダイントロン配列、ラクダリーダー配列、及びラクダRSSを含む。
例えば、各ラクダJ断片は、ラクダ調節配列、ラクダイントロン配列、ラクダリーダー配列、及びJ断片を囲むラクダ組換えシグナル配列を含む。
従って、DNA構築物、導入遺伝子、又はトランスジェニック非ヒト動物のラクダ調節配列、ラクダイントロン配列、ラクダリーダー配列、及び/又はラクダ組換えシグナル配列は、ゲノムラクダ調節配列、ゲノムラクダイントロン配列、ゲノムラクダリーダー配列、及び/又はゲノムラクダ組換えシグナル配列に相当する。
従って、未再構成ラクダV遺伝子断片は、VDJ再構成用の組換えシグナル配列を含む関連イントロンを含む。
各ラクダV遺伝子断片は、そのオリジナル調節配列を含む。
導入遺伝子は、ノックアウト/ノックイン技術により、動物のゲノム内のIgH遺伝子座において導入され得る。
重鎖のV断片は、フレームワーク1(FR1)と、CDRH1と、フレームワーク2(FR2)と、CDRH2と、フレームワーク3(FR3)と、CDR3の一部とを含む抗体可変領域の主要部をコードする。
D及びJ断片はCDR3の残部をコードし、J断片は更に、フレームワーク4(4)をコードする。
本開示のトランスジェニック非ヒト動物のいくつかは、ラクダD及び/又はJ断片を含む導入遺伝子を有する。いくつかの場合、すべてのラクダD及び/又はJ断片が、1つのラクダ種に由来する。他の場合、ラクダD及び/又はJ断片は、複数のラクダ種に由来する。例示的実施形態では、すべての内在性D及び/又はJ断片を、ラクダD及び/又はJ断片に置換する。他の例示的実施形態では、いくつかの内在性D及び/又はJ断片が保存され、ラクダD及び/又はJ断片が挿入される。更に他の例示的実施形態では、すべての内在性D及び/又はJ断片が保存され、ラクダD及び/又はJ断片が挿入される。
本開示のトランスジェニック非ヒト動物のいくつかは、複数種に由来するV遺伝子断片の組合せを有し得る。例えば、トランスジェニック非ヒト動物は、外来V遺伝子断片に加えて、内在性V遺伝子断片を含み得る。本開示のトランスジェニックマウスは、例えば、マウスV断片、並びにラクダV断片を含む。しかしながら、げっ歯類、ラクダ、又はヒトに由来するV断片の任意の組合せも本明細書に含まれる。
本開示のトランスジェニック非ヒト動物のいくつかは、ラクダV遺伝子断片を含む導入遺伝子を有する。いくつかの場合、V遺伝子断片はすべて、1つのラクダ種に由来する。他の場合、V遺伝子断片は、少なくとも2つのラクダ種に由来する。更に他の場合、V遺伝子断片は、少なくとも3つのラクダ種に由来する。付加的な場合、V遺伝子断片は、少なくとも4つのラクダ種に由来する。付加的な場合、V遺伝子断片は、少なくとも5つのラクダ種に由来する。
いくつかの例示的実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ラクダ由来のV、D、及び/J遺伝子断片を含む導入遺伝子を含む。更に他の例示的実施形態では、導入遺伝子が、ヒト由来のV、D、及びJ遺伝子断片を含む。付加的な例示的実施形態では、導入遺伝子が、げっ歯類由来のV、D、及びJ遺伝子断片を含む。
例示的実施形態では、V断片がげっ歯類に由来し、D及びJ断片がラクダに由来する。例示的実施形態では、V断片がげっ歯類に由来し、D及びJ断片が、げっ歯類及びラクダに由来する。例示的実施形態では、V断片が、げっ歯類及びラクダに由来し、D及びJ断片が、げっ歯類及びラクダに由来する。
例示的実施形態では、V、D、及び/又はJ遺伝子断片が、アルパカ、フタコブラクダ、ラマ、ビクニア、及び/又はヒトコブラクダ、又はそれらの組合せから選択される。
一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、5'→3'に、マウスVH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含むようなやり方で、V、D、及びJ断片を組み合わせる。
他の例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、5'→3'に、マウスVH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含むようなやり方で、V、D、及びJ断片を組み合わせる。
他の例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、5'→3'に、マウスVH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含むようなやり方で、V、D、及びJ断片を組み合わせる。
更に他の例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、5'→3'に、マウスVH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含むようなやり方で、V、D、及びJ断片を組み合わせる。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、5'→3'に、マウスVH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含むようなやり方で、V、D、及びJ断片を組み合わせる。
付加的な一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、5'→3'に、マウスVH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、フタコブラクダD断片、フタコブラクダJ断片、並びにアルパカJ断片を含むようなやり方で、V、D、及びJ断片を組み合わせる。
一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、5'→3'に、マウスVH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダD断片、並びにフタコブラクダJ断片を含むようなやり方で、V、D、及びJ断片を組み合わせる。
一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、5'→3'に、マウスVH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、ヒトコブラクダVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含むようなやり方で、V、D、及びJ断片を組み合わせる。
一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、5'→3'に、アルパカVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、ヒトコブラクダVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含むようなやり方で、V、D、及びJ断片を組み合わせる。
DNA構築物又は導入遺伝子は、例えば、1つから少なくとも7つの、アルパカのD遺伝子断片を含み得る。
その代わりに、DNA構築物又は導入遺伝子は、1つから少なくとも7つの、アルパカのJ遺伝子断片を含み得る。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、1つから少なくとも7つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は7つ超)のフタコブラクダD遺伝子断片を含み得る。
その上に更なる一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、1つから少なくとも7つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は7つ超)のフタコブラクダJ遺伝子断片を含み得る。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、1つから少なくとも7つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は7つ超)のヒトコブラクダD遺伝子断片を含み得る。
その上に更なる一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、1つから少なくとも7つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は7つ超)のヒトコブラクダJ遺伝子断片を含み得る。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、1つから少なくとも7つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は7つ超)のラマD遺伝子断片を含み得る。
その上に更なる一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、1つから少なくとも7つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は7つ超)のラマJ遺伝子断片を含み得る。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、1つから少なくとも7つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は7つ超)のビクニアD遺伝子断片を含み得る。
その上に更なる一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、1つから少なくとも7つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は7つ超)のビクニアJ遺伝子断片を含み得る。
他の例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、1つから少なくとも6つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は6つ超)のアルパカV遺伝子断片を含み得る。
他の例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、アルパカの全V遺伝子断片を含み得る。
更に他の例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、1つから少なくとも10個(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個又は10個超)のフタコブラクダV遺伝子断片を含み得る。
他の例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、フタコブラクダの全V遺伝子断片を含み得る。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、1つから少なくとも10個(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個、又は10個超)のラマV遺伝子断片を含み得る。
他の例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、ラマの全V遺伝子断片を含み得る。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、1つから少なくとも6つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は6つ超)のヒトコブラクダV遺伝子断片を含み得る。
他の例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、ヒトコブラクダの全V遺伝子断片を含み得る。
更なる一例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、1つから少なくとも6つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は6つ超)のビクニアV遺伝子断片を含み得る。
他の例示的実施形態では、DNA構築物又は導入遺伝子が、ビクニアの全V遺伝子断片を含み得る。
V、D、及び/又はJ断片によりコードされるラクダVH/VHH、D、及びJポリペプチドの例示的で非限定的な実施形態が、本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、DNA構築物、導入遺伝子、又はトランスジェニック動物が、Table 1(表1)に概説されるV、D、及びJ断片を含む(マウスVH、D、又はJも含まれ得る)。しかしながら、付加的な構成が可能である。Table 1(表1)中のV断片の順序及び数は異なり得る。Table 1(表1)中のD断片の順序及び数は異なり得る。Table 1(表1)中のJ断片の順序及び数は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ラクダV、D及び/又はJ断片が、特にフレームワーク領域において改変され得る。フレームワーク領域の改変は、ラクダフレームワーク領域の、天然配列と少なくとも80%同一である配列による置換を含む。他の改変は、ラクダCDRを有するヒト化HCAbを産生するために、ラクダフレームワーク領域の、ヒトフレームワーク領域に対して約80%から約100%(例えば、約80%、85%、90%、95%、99%、又は100%)同一であるフレームワーク領域での置換を含む。
胚性幹細胞
胚性幹細胞を、所望の動物種及び所望の遺伝的背景に基づいて選択する。
胚性幹細胞を、所望の動物種及び所望の遺伝的背景に基づいて選択する。
遺伝子改変胚性幹細胞は、改変遺伝子(modified gene)、並びに相同組換え及び選択用の配列を含むDNA構築物のエレクトロポレーションにより得られる。
いくつかの実施形態では、胚性幹細胞は、免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座において、a)内在性マウスV遺伝子断片の1つ若しくは複数の、1つ若しくは複数の未再構成ラクダV遺伝子断片での置換、又は未再構成ラクダV遺伝子断片の挿入、b)内在性マウスD及びJ断片の少なくとも1つ又はすべての、ラクダD及びJ断片での置換、並びにc)内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、及びγ3遺伝子から発現するポリペプチドが機能性CH1ドメインを含まないような、前記内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、及びγ3遺伝子の少なくとも1つ若しくはすべてのCH1ドメインの欠失又は改変、を含む生殖系列改変を含む単離非ヒト胚性幹細胞である。
いくつかの例示的実施形態では、胚性幹細胞が、免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座において生殖系列改変を含む単離非ヒト胚性幹細胞であり、該改変は、内在性γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及びγ2a遺伝子の各々のCH1ドメインの欠失、マウスD及びJ遺伝子断片の、未再構成ラクダD及びJ遺伝子断片での置換、複数のラクダ種に由来するラクダV遺伝子断片の挿入、並びに場合により、少なくとも1つ又はすべての内在性マウスV遺伝子断片の欠失、を含む。
その代わりに、胚性幹細胞は、遺伝子編集ツール、例えば、規則的な間隔をもってクラスター化された反復回文配列(CRISPR)-Cas9システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALENS)システム等により遺伝子改変され得る。
ES細胞ゲノム内での導入遺伝子の存在を、シーケンシングにより確認して、正しい配列を有するES細胞を、後続の使用に向けて増幅する。品質管理試験、例えば、核型分析も、通常は行う。
胚性幹細胞は、全能性、多能性(multipotent)、又は万能性(pluripotent)であり得る。しかしながら、トランスジェニック非ヒト動物を生成するために、通常は全能性胚性幹細胞を使用する。
本明細書に記載される遺伝子改変を含む胚性幹細胞が、本開示に含まれる。
胚性幹細胞は、本明細書に開示されるトランスジェニック動物のいずれかに由来し得る。
必要に応じて、すでに遺伝子改変されている(相同組換えによろうとトランスジェニック動物からの単離であろうと)胚性幹細胞を、更なる遺伝子改変に使用してもよい。
トランスジェニック非ヒト動物
本開示のトランスジェニック非ヒト動物は、遺伝子操作に適した小動物を含む。しかしながら、大型動物、例えば、ウシ、ヒツジ等も適切であり得る。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸構築物のいずれか1つ又は複数の使用を含む、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法が提供される。
本開示のトランスジェニック非ヒト動物は、遺伝子操作に適した小動物を含む。しかしながら、大型動物、例えば、ウシ、ヒツジ等も適切であり得る。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸構築物のいずれか1つ又は複数の使用を含む、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法が提供される。
本出願の目的には、げっ歯類、例えば、ラット及びマウスが特に選択される。しかしながら、他の小動物、例えば、ウサギ又はニワトリが適切であり得る。
抗体の発現用での小動物の選択は、いくつかの利点を伴う。例えば、小量の抗原が、免疫応答の生成に十分であり、且つ免疫化動物に由来する小量の血液が、完全な抗体レパートリを表すために十分であり得る。更に、本明細書に開示される、多つのラクダ種に由来するV、D、及び/又はJ断片を含むゲノムの改変は、産生される単一ドメイン抗体の多様性を増大させる。更に、小動物は、短い繁殖周期を特徴とする。
最後に、多数のラクダ種に由来する配列を含む単一ドメイン抗体の、トランスジェニック動物での産生は、ラクダでのその産生よりも有利である。なぜなら、抗体の同様の多様性の生成には、ラクダ種ごとの個別の免疫化が必要となるであろうからである。
本明細書に開示される様々な遺伝的背景のマウスでの単一ドメイン抗体の発現は更に、多様性を増大させると予想される。
トランスジェニック非ヒト動物を取得する様々な方法が利用可能である。
そのような方法の1つは、遺伝子改変胚性幹細胞の使用を含む。他の方法は、遺伝子改変受精卵の使用を含む。
遺伝子改変された胚性幹細胞又は受精卵を、胚盤胞期胚に微量注入してから、偽妊娠雌性マウスに移植する。生殖細胞中に導入遺伝子を含むキメラを、続く育種に向けて選択する。
本開示のトランスジェニック非ヒト動物は、免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座において生殖系列改変を含む。
いくつかの実施形態では、すべての改変を同じ対立遺伝子上に有する、トランスジェニック非ヒト動物を生成する。いくつかの実施形態では、両対立遺伝子上に改変を有するトランスジェニック非ヒト動物を生成する。いくつかの実施形態では、両対立遺伝子が同じであり得る。他の実施形態では、両対立遺伝子が異なる。
改変は、例えば、内在性免疫グロブリンガンマ遺伝子のCH1ドメインの欠失又は改変を含む。他の改変は、例えば、内在性免疫グロブリンガンマ遺伝子のCH1ドメインの欠失又は改変と、少なくとも1つの他の内在性免疫グロブリンガンマ遺伝子の部分欠失又は完全欠失又は改変との組合せを含む。
改変は、例えば、内在性非ヒト動物のγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/又はγ2a遺伝子のCH1ドメインの欠失又は改変を含む。
他の改変は、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/又はγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性非ヒト動物遺伝子のCH1ドメインの欠失又は改変と、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/又はγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性非ヒト動物遺伝子の完全欠失又は部分欠失との組合せを含む。
いくつかの場合、内在性免疫グロブリンガンマ遺伝子での改変は更に、可変領域での改変を伴う。
例えば、いくつかの改変は、a)1つ又は複数の内在性非ヒトD及び/又はJ遺伝子断片の、1つ又は複数の未再構成ラクダD及び/又はJ遺伝子断片での置換、並びにb)少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインの部分欠失又は完全欠失又は改変を含む。他の改変は、例えば、a)IgH遺伝子座における、1つ又は複数の未再構成ラクダD及び/又はJ遺伝子断片の挿入、並びにb)少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインの部分欠失又は完全欠失又は改変を含む。
他の改変は、a)1つ又は複数の内在性非ヒトV、D及び/又はJ遺伝子断片の、1つ又は複数の未再構成ラクダV、D及び/又はJ遺伝子断片での置換、並びにb)少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインの部分欠失又は完全欠失又は改変を含む。
再び、これらの改変は、同じく、少なくとも1つの内在性免疫グロブリンガンマ遺伝子の部分欠失又は完全欠失と組み合わせてもよい。
IgH遺伝子座での改変は、両対立遺伝子に存在してもよく、例えば、ホモ接合型動物の場合である。そのため、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの両対立遺伝子は、同一のIgH遺伝子座を含み得る。
その代わりに、IgH遺伝子座での改変は、単一対立遺伝子に存在してもよく、例えば、ヘテロ接合型動物の場合である。
いくつかの場合、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの一方の対立遺伝子は、改変IgH遺伝子座を含み得て、他方の対立遺伝子は、野生型であり得る。
他の場合、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの両対立遺伝子は、同一の定常領域遺伝子、並びに異なるV、D、及び/又はJ断片を含み得る。
更に他の場合、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの両対立遺伝子は、異なる定常領域遺伝子、並びに同一のV、D、及び/又はJ断片を含み得る。
更に他の場合、トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの両対立遺伝子は、異なる定常領域遺伝子、並びに異なる断片をV、D、及び/又はJ断片の中で含み得る。
本明細書に開示される定常領域での改変のいずれかを有する、並びに/又は本明細書に開示されるV、D、及び/若しくはJ断片若しくは導入遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物が、本開示に含まれる。
例示的実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、IgH遺伝子座において、以下からなる群:
a. 内在性マウスγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子のCH1ドメインの欠失、又は;
b. γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子のCH1ドメインの欠失と、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される生殖系列改変を含む。
a. 内在性マウスγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子のCH1ドメインの欠失、又は;
b. γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子のCH1ドメインの欠失と、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される生殖系列改変を含む。
他の例示的実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、IgH遺伝子座において、以下からなる群:
a. 内在性マウスγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子のCH1ドメインの改変、又は;
b. γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子のCH1ドメインの改変と、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される生殖系列改変を含む。
a. 内在性マウスγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子のCH1ドメインの改変、又は;
b. γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子のCH1ドメインの改変と、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性マウス遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される生殖系列改変を含む。
CH1ドメインが最終ポリペプチド配列から欠失している限り、又は欠失若しくは改変が、軽鎖と対合できない重鎖をもたらす限り、CH1ドメインの任意の欠失又は改変が、本開示に含まれると本明細書では理解されるべきである。
本開示のトランスジェニック非ヒト動物のいくつかは、例えば、ラクダのVH/VHH、D、及び/若しくはJポリペプチド、又はヒトのVH、D、及び/若しくはJポリペプチド、又はそれらの組合せを含む、様々な種に由来する重鎖可変領域を発現するように改変され得る。
本開示のトランスジェニック非ヒト動物のいくつかは、例えば、非天然若しくは改変されたラクダVH/VHH、D、及び/若しくはJポリペプチド、非天然若しくは改変されたヒトVH、D、及び/若しくはJポリペプチド、又は非天然若しくは改変されたげっ歯類由来VH、D、及び/若しくはJポリペプチドを含む、改変された重鎖可変領域を発現するように改変され得る。
いくつかの例示的実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、a)ラクダD及び/又はJ遺伝子断片を含む、未再構成の重鎖可変(V)、多様(D)、及び結合(J)遺伝子断片、並びにb)少なくとも1つの、機能性CH1ドメインを欠くIgG定常領域遺伝子を含む。
更に他の例示の実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、a)ラクダV、D及び/又はJ遺伝子断片を含む、未再構成の重鎖可変(V)、多様(D)、及び結合(J)遺伝子断片、並びにb)少なくとも1つの、機能性CH1ドメインを欠くIgG定常領域遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物のIgG定常領域遺伝子が、内在性IgG定常領域遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、以下:
a. CH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失を含むγ3定常領域遺伝子;
b. CH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失を含むγ1定常領域遺伝子;
c. CH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失を含むγ2b定常領域遺伝子;
d. CH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失を含むγ2a定常領域遺伝子、又は;
e. それらの組合せ
を含む。
a. CH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失を含むγ3定常領域遺伝子;
b. CH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失を含むγ1定常領域遺伝子;
c. CH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失を含むγ2b定常領域遺伝子;
d. CH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失を含むγ2a定常領域遺伝子、又は;
e. それらの組合せ
を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、γ3、γ1、γ2b、γ2a定常領域遺伝子のうちの少なくとも2つのCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、γ3、γ1、γ2b、γ2a定常領域遺伝子のうちの少なくとも3つのCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト動物が、γ3、γ1、γ2b、γ2a定常領域遺伝子の各々のCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物の内在性D及びJ断片が、未再構成ラクダD及びJ断片で置換される。他の実施形態では、ラクダD及びJ断片が、内在性D及びJ断片を欠失させることなしに挿入され得る結果、内在性D及びJ断片のうちの少なくとも一部又は全部が保存されることになる。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、アルパカ由来の未再構成D及びJ断片を含む。
他の実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、フタコブラクダ由来の未再構成D及びJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ラマ由来の未再構成D及びJ断片を含む。
他の実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ヒトコブラクダ由来の未再構成D及びJ断片を含む。
他の実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、ビクニア由来の未再構成D及びJ断片を含む。
他の実施形態では、内在性V断片が、未再構成ラクダV断片で置換される。しかしながら、未再構成ラクダV断片が、内在性V断片を欠失させることなしに挿入され得る結果、内在性V断片のうちの少なくとも一部又は全部が保存されることになる。
いくつかの実施形態では、未再構成V断片が、アルパカ由来の1つ又は複数のVH及び/又はVHHポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、未再構成V断片が、フタコブラクダ由来の1つ又は複数のVH及び/又はVHHポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、未再構成V断片が、ラマ由来の1つ又は複数のVH及び/又はVHHポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、未再構成V断片が、ヒトコブラクダ由来の1つ又は複数のVH及び/又はVHHポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、未再構成V断片が、ビクニア由来の1つ又は複数のVH及び/又はVHHポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、例えば、制限なしに、アルパカ、ラマ、フタコブラクダ、ビクニア、又はヒトコブラクダ由来を含む複数のラクダ種に由来する未再構成V、D、及び/又はJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、アルパカ及びフタコブラクダ由来の未再構成D及びJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、未再構成のアルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、未再構成のフタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、未再構成のラマVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、未再構成のラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、未再構成のフタコブラクダVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、未再構成のラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカ断片、フタコブラクダD断片、フタコブラクダJ断片、並びにアルパカJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、未再構成のラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダD断片、並びにフタコブラクダJ断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、1つ又は複数のマウスVHポリペプチドをコードする未再構成V断片を含む。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物が、1つ又は複数のヒトVHポリペプチドをコードする未再構成V断片を含む。
トランスジェニック非ヒト動物は更に、付加的な遺伝子改変を有し得る。例えば、トランスジェニック非ヒト動物は、免疫グロブリンカッパ及び/又は免疫グロブリンラムダ遺伝子座の部分欠失又は完全欠失を含み得る。
同じく、付加的なV、D、及び/又はJ断片が、本明細書に開示されるトランスジェニック非ヒト動物の更なる遺伝子改変により、挿入され得る。
重鎖のみの抗体(HCAb)
いくつかの態様では、標準的免疫化プロトコルを使用して、目的の抗原により、本開示のトランスジェニック動物を免疫化する。
いくつかの態様では、標準的免疫化プロトコルを使用して、目的の抗原により、本開示のトランスジェニック動物を免疫化する。
免疫化トランスジェニック動物から血液試料を採取し、1つ又は複数の抗体種のアミノ酸又は核酸配列を決定する。
いくつかの場合、1つ又は複数の相補性決定領域の配列を得る。例えば、CDRH3領域の配列を決定する。更に他の場合、CDRH1、CDRH2、及びCDRH3領域の配列を得る。更に他の場合、可変領域全体の配列を得る。他の場合、抗体全体の配列を得る。
コンピュータベースの技術を使用して、配列をクラスターに組織化する。クラスター内の代表的な抗体種の、抗体プールの一画分の、又は抗体プール全体の生物学的機能(例えば、結合、特異性、親和性、有効性その他)を決定する。いくつかの場合、生物学的機能のコンピュータベース予測モデルが確立される。
1つ又は複数の選択された単一ドメイン抗体の配列情報を、結合剤、例えば、制限なしに、抗体(二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体を含む)、単一ドメイン抗体、単鎖Fv、キメラ抗原受容体(CAR)、二重特異性T細胞エンゲージャ(BiTE)、二重特異性キラー細胞エンゲージャ(BiKE)、三重特異性キラー細胞エンゲージャ(TriKE)、米国仮出願第62/951,701号明細書(その全内容が、参照により本明細書に組み込まれている)に開示されるフォーマットを有する結合剤、又はそれらの抗原結合フラグメントを作製するために使用する。
従って、本開示は、他の態様及び実施形態において、本開示のトランスジェニック非ヒト動物により生成された少なくとも1つの単一ドメイン抗体から得られたアミノ酸配列を含む結合剤を提供する。
更なる実施形態、特徴、及び利点、並びに様々な実施形態の構造及び操作を、以下に、添付図面と関連して詳細に記載する。
実施例
(実施例1)
マウスIgH遺伝子座の標的改変用のDNA構築物の調製
BAC1は、マウスγ3、γ1、γ2b、及びγ2a定常領域全体を、CH1ドメイン(全4つのサブクラスに関してエクソン2)の欠失を含めて含有する、操作された細菌人工染色体(BAC)構築物である。BAC1構築物は、長さ92kbであり、5'→3'に、2つのloxP部位が隣接するネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子カセットでエクソン2(CH1ドメイン)が置換されたγ3定常領域、それに続く、CH1を欠失させたγ1及びγ2b遺伝子、並びに2つのloxP5171部位が隣接するハイグロマイシン耐性遺伝子カセットでエクソン2(CH1ドメイン)が置換されたγ2a定常領域を含む。
(実施例1)
マウスIgH遺伝子座の標的改変用のDNA構築物の調製
BAC1は、マウスγ3、γ1、γ2b、及びγ2a定常領域全体を、CH1ドメイン(全4つのサブクラスに関してエクソン2)の欠失を含めて含有する、操作された細菌人工染色体(BAC)構築物である。BAC1構築物は、長さ92kbであり、5'→3'に、2つのloxP部位が隣接するネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子カセットでエクソン2(CH1ドメイン)が置換されたγ3定常領域、それに続く、CH1を欠失させたγ1及びγ2b遺伝子、並びに2つのloxP5171部位が隣接するハイグロマイシン耐性遺伝子カセットでエクソン2(CH1ドメイン)が置換されたγ2a定常領域を含む。
BAC2は、アルパカ(ビクーニャ・パコス)のVHH3-1(IMGT遺伝子、IGHV3-3)、及びVH3-1(IMGT遺伝子、IGHV3-1)可変重鎖遺伝子断片、アルパカIGHD遺伝子断片全体(IMGT ID:IGHD1～IGHD8)、並びにアルパカIGHJ遺伝子断片(IMGT ID:IGHJ1～IGHJ7)を含有する、操作された細菌人工染色体構築物である。BAC2構築物は、長さ100kbであり、5'→3'に、マウスゲノムIGHV5-1及びIGHV2-1遺伝子を標的とする、5kbアームのマウス相同配列、それに続く、2つのFRT部位が隣接するネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子カセット、アルパカゲノムDNAフラグメントインサート、2つのFRT-F3部位が隣接するハイグロマイシン耐性遺伝子カセット、並びに5kbアームのマウス相同配列を含む。
BAC3aは、アルパカ及びフタコブラクダのVHH及びVH遺伝子断片を含む複数種構築物である。BAC3aは、BAC2構築物に基づく147kb構築物であり、ネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子カセットとアルパカゲノムDNAフラグメントとの間に47kbのフタコブラクダDNAフラグメントを挿入することにより改変した。フタコブラクダDNAフラグメントは、3つのVHH遺伝子断片(BctVhh_*1、BctVhh_*2、BctVhh_*3)及び3つのVH遺伝子断片(BctVh_*1、BctVh_*2、BctVh_*3)を含有する。
BAC3bは、アルパカ及びラマのVHH及びVH遺伝子断片を含む複数種構築物である。BAC3bは、BAC2構築物に基づく160kb構築物であり、ネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子カセットとアルパカゲノムDNAフラグメントとの間に60kbのラマDNAフラグメントを挿入することにより改変した。ラマDNAフラグメントは、2つのVHH遺伝子断片(LmVhh3_*3及びLmVhh3_*4)並びに2つのVH遺伝子断片(lmVh_*1、lmVh_*2)を含有する。
BAC4aは、アルパカ、フタコブラクダ、及びラマのVHH及びVH遺伝子断片を含む複数種構築物である。BAC4a構築物は、BAC3a構築物に基づく196kbであり、ネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子カセットとフタコブラクダDNAフラグメントとの間に49kbのラマDNAフラグメントを挿入することにより改変した。ラマDNAフラグメントは、2つのVHH遺伝子断片(LmVhh3_*3及びLmVhh3_*4)並びに2つのVH遺伝子断片(lmVh_*1、lmVh_*2)を含有する。
BAC4bは、アルパカ、フタコブラクダ、及びラマのVHH及びVH遺伝子断片を含む複数種構築物である。BAC4b構築物は、BAC3b構築物に基づく212kbであり、ネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子カセットとラマDNAフラグメントとの間に52kbのフタコブラクダDNAフラグメントを挿入することにより改変した。フタコブラクダDNAフラグメントは、3つのVHH遺伝子断片(BacVhh3_*10、BacVhh3_*11、及びBacVhh3_*12)並びに2つのVH遺伝子断片(BacVh_*4及びBacVh_*5)を含有する。
BAC5は、ラマ、ヒトコブラクダ、及びアルパカのVHH及びVH遺伝子断片を含む複数種構築物である。BAC5構築物は、長さ148kbであり、付加的なVHH及びVH遺伝子を導入するために、同定されたBac4a陽性ES細胞におけるBac4a構築物の5'上流を標的とする。42kbのラマDNAフラグメントは、2つのVHH遺伝子断片(LmVhh3_*1及びLmVhh3_*2)並びに1つのVH遺伝子断片(lmVh_*3)を含有する。54kbのヒトコブラクダDNAフラグメントは、3つのVHH遺伝子断片(DmdVhh3_*5、DmdVhh3_*6、及びDmdVhh3_*7)並びに1つのVH遺伝子断片(DmdVh_*1)を含有する。33kbのアルパカDNAフラグメントは、2つのVHH遺伝子断片(alVhh3_*1及びLalVhh3_*2)並びに2つのVH遺伝子断片(alVh_*1及びalVh_*2)を含有する。
BAC6は、公知のアルパカ及びヒトコブラクダのゲノム配列に対する配列アライメント解析に基づく、フタコブラクダIGHD遺伝子断片及びフタコブラクダIGHJ遺伝子断片の全体を含むDNAフラグメントを含有する、操作されたBAC構築物である。BAC6構築物は、長さ59kbであり、5'→3'に、アルパカD/J遺伝子断片の上流を標的とする、3kbアームの5'アルパカ相同配列、それに続く、2つのLoxp511部位が隣接するハイグロマイシン耐性遺伝子カセット、フタコブラクダゲノムDNAフラグメントインサート、3kbアームのマウス相同配列を含む。
BAC7は、アルパカ及びフタコブラクダのVHH及びVH遺伝子断片を含む複数種構築物である。BAC7構築物は、長さ129kbであり、付加的なVHH及びVH遺伝子を導入するために、同定されたBAC5陽性ES細胞におけるBac5構築物の5'上流を標的とする。48kbのアルパカDNAフラグメントは、2つのVHH遺伝子断片(alVhh3_*3及びalVhh3_*5)並びに2つのVH遺伝子断片(alVh_*3及びalVh_*4)を含有する。72kbのフタコブラクダDNAフラグメントは、3つのVHH遺伝子断片(BacVhh3_*9、BacVhh3_*4、及びBacVhh3_*5)並びに3つのVH遺伝子断片(BacVh_*6、BacVh_*7、及びBacVh_*8)を含有する。
(実施例2)
遺伝子改変されたES細胞及び受精卵の生成
遺伝子改変胚性幹細胞は、Cre/Loxp組換えを使用して、γ3、γ1、γ2b、及び/又はγ2a定常領域の各々のCH1エクソンの欠失を含むBAC1の、マウスIgH遺伝子座への標的化組込みにより得た(図1)。BAC1と、Cas9又は単一ガイドRNA(sgRNA)配列を発現する、マウス内部相同領域を標的とする2つの構築物とを、ES細胞内へとコエレクトロポレーションした。トランスフェクトしたES細胞を、ネオマイシン(G418)及びハイグロマイシン選択にさらした。計228個のクローンを単離して、5'及び3'のロングレンジPCRによりスクリーニングした。PCR陽性クローンを更に、内部プローブ及び外部プローブの両方を使用して、サザンブロット法により解析した。クローン(#183)が、正しい挿入を有すると確認された(図4のトランスジェニック1)。
遺伝子改変されたES細胞及び受精卵の生成
遺伝子改変胚性幹細胞は、Cre/Loxp組換えを使用して、γ3、γ1、γ2b、及び/又はγ2a定常領域の各々のCH1エクソンの欠失を含むBAC1の、マウスIgH遺伝子座への標的化組込みにより得た(図1)。BAC1と、Cas9又は単一ガイドRNA(sgRNA)配列を発現する、マウス内部相同領域を標的とする2つの構築物とを、ES細胞内へとコエレクトロポレーションした。トランスフェクトしたES細胞を、ネオマイシン(G418)及びハイグロマイシン選択にさらした。計228個のクローンを単離して、5'及び3'のロングレンジPCRによりスクリーニングした。PCR陽性クローンを更に、内部プローブ及び外部プローブの両方を使用して、サザンブロット法により解析した。クローン(#183)が、正しい挿入を有すると確認された(図4のトランスジェニック1)。
並行して、特異的CH1エクソンの、又は定常領域遺伝子全体のCRISPR標的化欠失を、胚性幹細胞又は受精胚において行った(図2及び図3)。簡単に言うと、γ3、γ1、γ2b、及び/又はγ2a定常領域の各々のCH1エクソンのフランキング領域を標的とするCas9及びsgRNA配列を発現する構築物を、ES細胞内へとコエレクトロポレーションするか、又はマウス受精胚の前核領域に注入した。PCRジェノタイピングにより、ES細胞クローン及び注入動物をスクリーニングした。ES細胞ターゲティングアプローチを使用して、挿入に成功したESクローン(13A10)(図4のトランスジェニック2)を同定した。胚ターゲティングアプローチを使用して、定常領域内に可変変異を有する4つのトランスジェニック系統を同定した(図4のトランスジェニック3、トランスジェニック4、トランスジェニック5、及びトランスジェニック6)。
(実施例3)
改変定常領域を有するトランスジェニックマウスの生成
ESクローン13A10を微量注入した胚盤胞の、偽妊娠マウスへの移植により、トランスジェニックマウスを得た。ESクローン13A10及び胚盤胞の両方とも、C57/B6遺伝的背景の影響下にある。キメラFOの生成は、PCRジェノタイピングにより確認された。キメラマウスを野生型C57/B6動物と戻し交配して、F1ヘテロ接合型動物を生成し、PCRジェノタイピングにより確認した。ホモ接合型F2動物を、F1ヘテロ接合型の交配により生成した。
改変定常領域を有するトランスジェニックマウスの生成
ESクローン13A10を微量注入した胚盤胞の、偽妊娠マウスへの移植により、トランスジェニックマウスを得た。ESクローン13A10及び胚盤胞の両方とも、C57/B6遺伝的背景の影響下にある。キメラFOの生成は、PCRジェノタイピングにより確認された。キメラマウスを野生型C57/B6動物と戻し交配して、F1ヘテロ接合型動物を生成し、PCRジェノタイピングにより確認した。ホモ接合型F2動物を、F1ヘテロ接合型の交配により生成した。
その代わりに、ESクローン#183を微量注入した胚盤胞の、偽妊娠マウスへの移植により、トランスジェニックマウスを得る。高度のキメラが生成され、野生型C57/B6動物と交配して、F1ヘテロ接合型動物を生成した。F1尾部生検試料を用いたPCRジェノタイピングにより、BAC1構築物が有する所望の変異の生殖細胞系列伝達を確認した。
実施例2及び実施例3に記載のアプローチを使用して、「トランスジェニック1」、「トランスジェニック2」、「トランスジェニック3」、「トランスジェニック4」、「トランスジェニック5」、若しくは「トランスジェニック6」のゲノム構築を有する、ヘテロ接合型ES細胞、ヘテロ接合型動物、又はホモ接合型動物を得る(図4)。特に、「トランスジェニック2」、「トランスジェニック3」、「トランスジェニック4」、「トランスジェニック5」、又は「トランスジェニック6」のゲノム構築を有するホモ接合型トランスジェニック動物が得られ、本明細書では、「トランスジェニック2動物」、「トランスジェニック3動物」、「トランスジェニック4動物」、「トランスジェニック5動物」、又は「トランスジェニック6動物」と呼ぶ。
(実施例4)
単一ドメイン抗体の発現
以下に例示する実験条件を使用して、ホモ接合型トランスジェニック動物に由来する、CH1ドメインを欠く重鎖又は単一ドメイン抗体の発現を、還元条件又は非還元条件下のウエスタンブロットにより検証した。
単一ドメイン抗体の発現
以下に例示する実験条件を使用して、ホモ接合型トランスジェニック動物に由来する、CH1ドメインを欠く重鎖又は単一ドメイン抗体の発現を、還元条件又は非還元条件下のウエスタンブロットにより検証した。
簡単に言うと、血清試料を、水中に1/50の比率で希釈して、希釈血清試料5μLを、還元条件下、ゲル(Bis-Tris 4～12%)上にロードした。検出には、HRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG2a(Abcam社、ab97245)、HRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG2b(Abcam社、ab97250)、及びHRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG3(Abcam社、ab97260)の二次抗体を1/20,000希釈で使用した。γ2bにCH1欠失を有するトランスジェニック4動物は、切断型(truncated)IgG2b重鎖の発現を示した(図5A)。γ3及びγ2aの両方にCH1欠失を有するトランスジェニック6動物は、切断型IgG3及びIgG2a重鎖の発現を示した(図5B)。
その代わりに、非還元条件下、血清試料を、水中に1/50の比率で希釈し、希釈血清試料12μLを、ゲル(Trisグリシン8%)上にロードした。検出には、HRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG2a(Abcam社、ab97245)、HRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG2b(Abcam社、ab97250)、及びHRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG3(Abcam社、ab97260)の二次抗体を1/10,000希釈で使用したか、又はHRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG軽鎖(Millipore社、AP200P)を1/10,000で使用した。γ2bにCH1欠失を有するトランスジェニック4動物は、単一ドメイン抗体IgG2bサブクラスの発現を示した(図6A)。γ3及びγ2aにCH1欠失を有するトランスジェニック6動物は、IgG3及びIgG2aサブクラスに由来する単一ドメイン抗体の発現を示した(図6B)。γ3、γ1、γ2b、及びγ2aにCH1欠失を有するトランスジェニック2動物は、IgG3、IgG1、IgG2b、及びIgG2aサブクラスに由来する単一ドメイン抗体の発現を示した(図6C)。
要約すると、免疫化前のトランスジェニック2動物、トランスジェニック4動物、又はトランスジェニック6動物から得られた血清試料を用いた我々のウエスタンブロット解析は、CH1ドメインを欠く重鎖の発現(図5、トランスジェニック4動物及びトランスジェニック6動物に対する還元条件)、並びにCH1ドメインを欠く、重鎖のみの抗体の発現(図6A～図6C、トランスジェニック4動物(図6A)、トランスジェニック6動物(図6B)、及びトランスジェニック2動物(図6C)に対する非還元条件)を示した。
最後に、免疫化前のトランスジェニック2動物、トランスジェニック4動物、又はトランスジェニック6動物から得た血清試料を用いたウエスタンブロット解析は、κ及びλ軽鎖に対する検出抗体を使用した場合、単一ドメイン抗体の発現を示さず、トランスジェニック2動物、トランスジェニック4動物、又はトランスジェニック6動物において発現した単一ドメイン抗体は、κ又はλ軽鎖と会合しないことを示す(図6D;トランスジェニック4動物及びトランスジェニック6動物に対する非還元条件、並びに図6E;トランスジェニック2動物に対する非還元条件)。
ELISA検出キットにより、抗体サブクラスの定量を行った。血清試料を、TBS中に250ng/μLの濃度で希釈し、希釈抗体50μLを、IgGサブクラスの各々に対して特異的である検出抗体と混合した(ラピッドELISAマウスmAbアイソタイピングキット、カタログ番号37503、Thermofisher社)。トランスジェニック2動物における各抗体サブクラスの発現を、野生型対照血清試料と比べた。図6F～図6Iに例証されるように、IgG3、IgG1、及びIgG2bサブクラス抗体の発現は、トランスジェニック2動物と野生型対照との間で同等であり;IgG2aサブクラス抗体の発現は、トランスジェニック2動物では、野生型対照と比べて低下した。
(実施例5)
CH1欠失を有するトランスジェニックマウスでの単一ドメイン抗体の発現
ヒト細胞において発現させた腫瘍特異的抗体(標的1)、免疫細胞上で発現させた対照抗体(CD3;標的2)、又はウイルス抗原(SARS-Cov-2スパイク;標的3)を用いてトランスジェニック動物を免疫化することにより、抗原特異的単一ドメイン抗体の発現を評価した。
CH1欠失を有するトランスジェニックマウスでの単一ドメイン抗体の発現
ヒト細胞において発現させた腫瘍特異的抗体(標的1)、免疫細胞上で発現させた対照抗体(CD3;標的2)、又はウイルス抗原(SARS-Cov-2スパイク;標的3)を用いてトランスジェニック動物を免疫化することにより、抗原特異的単一ドメイン抗体の発現を評価した。
簡単に言うと、5匹のホモ接合型トランスジェニック6動物(雌性8～12週齢)の一群を、ヒト標的(標的1)による免疫化実験に使用した。各々の免疫化前に、血液試料80～100μLを、尾採血により採取し、免疫化応答の力価を評価した。各々の免疫化には、乳化させたヒト組換えタンパク質100μLを、0.5μg/μLの濃度で腹腔内注射した。5週の経過中に、計4回の免疫化を行った。最後の注射から3日後に動物を殺処分した。骨髄及び脾臓組織を採取した。ファージミドライブラリを作製するために、免疫化動物から採取した骨髄及び脾臓組織から全RNAを抽出し、cDNA試料を作製した。cDNA鋳型を使用してsdAb可変配列を増幅するために、マウスVH特異的プライマーを使用した。次いで、全sdAbアンプリコンライブラリを、pMECS-GGベクターにサブクローニングして、大腸菌(E. coli)TGI細胞(Agilent社、200123)内にエレクトロポレーションして、ファージミドライブラリを作製した。
ファージミド免疫ライブラリを用いて、一連のパンニングを行った。簡単に言うと、最初の3ラウンドのパンニングは、ヒト組換え標的1タンパク質を、対照タンパク質と共に使用して行い、それに続いて、第4ラウンドのパンニングは、標的1陽性細胞株及び標的1陰性細胞株の対照を使用して行った。パンニングの完了後、ランダムクローニングピッキング及びNGS解析の両方を行った。
血清試料を採取し、1/100及び1/15000の希釈を使用して、ELISAにより、抗標的1単一ドメイン抗体の抗体力価を評価した。血清抗体を検出するために、ヤギ抗マウスIgG二次抗体(Jackson immunoresearch社、111-035-062)を使用した。IgG2a又はIgG3抗体サブクラスを検出するために、ウエスタンブロット実験を行った。ブロットを5%ミルク/PBS-Tween 0.1%でブロッキングしてから、ヤギ抗マウスIgG2a又はIgG3ポリクローナル抗体(ab97245、ab97260、Abcam社)で検査した。
図7Aに例証されるように、ELISA検出は、免疫化トランスジェニック動物から採取した血清試料に由来する、標的1に対する抗体の増加を示し、且つ力価は、第2の免疫化ブースト後、一定レベルに保たれた。抗体力価は、ELISAにより、血清の15000倍希釈後、依然として検出可能であった。標的1の免疫化前及び免疫化後に採取した血清試料を、sdAb発現の評価に使用した。図7Bに例証されるように、ウエスタンブロットにより、IgG2a及びIgG3サブクラスの両方に関して、免疫化後試料ではsdAb発現の上昇が認められた。
5匹のホモ接合型トランスジェニック6動物の一群を、抗原としてのCD3(標的2)による免疫化実験に使用した。簡単に言うと、各トランスジェニックマウスに、乳化させた、CD3ε及びδサブユニットのヒト組換えタンパク質100μLを、0.5μg/μLの濃度で腹腔内注射した。5週の経過中に、計4回の免疫化注射をした。最後の注射から3日後に動物を殺処分した。血清試料及び脾臓組織を採取し、RNAを抽出して、可変重鎖(VH)のライブラリを構築した。ファージディスプレイを使用して、組換えヒトCD3ε及びδサブユニットに対する、2ラウンドのパンニングを行った。DNA試料を回収して、NGS(Miseq、v600サイクル、2500万リード)により解析した。並行して、第2ラウンドのパンニングから、96ファージクローンをピッキングし、組換えヒトCD3タンパク質に対する結合をELISAにより、及びヒトPBMCに対する結合をフローサイトメトリーにより試験した。陽性結合体(binder)の核酸を取得し、抗体又は抗体様分子を生成するために使用した。血清試料を採取し、1/150及び1/12150の希釈を使用して、ELISAにより、抗CD3単一ドメイン抗体の抗体力価を評価した。
図7Cに例証されるように、トランスジェニック6動物から、抗CD3抗体が産生される。抗体力価は、第2の免疫化注射後、一定レベルに保たれた。抗体力価は、ELISAにより、血清の>12000倍希釈後、依然として検出可能であった。
5匹のホモ接合型トランスジェニック6動物の一群を、抗原としての野生型SARS-CoV-2スパイクタンパク質(UniProtKB登録番号:P0DTC2)(標的3)による免疫化実験に使用した。簡単に言うと、各トランスジェニックマウスに、乳化させたスパイクタンパク質100μLを、0.5μg/μLの濃度で腹腔内注射した。5週の経過中に、計4回の免疫化注射をした。最後の注射から3日後に動物を殺処分した。血清試料及び脾臓組織を採取し、RNAを抽出して、可変重鎖(VH)のライブラリを構築した。血清試料を採取し、1/100及び1/15000の希釈を使用して、ELISAにより、抗標的3単一ドメイン抗体の抗体力価を評価した。
図7Dに例証されるように、トランスジェニック6動物から、抗スパイク抗体が産生された。抗体力価は、第3の免疫化注射後、一定レベルに保たれた。抗体力価は、ELISAにより、血清の1/15000希釈において、依然として検出可能であった。
野生型SARS-CoV-2スパイクタンパク質で免疫化したトランスジェニック6動物から生成されたsdAbが、他のスパイクタンパク質バリアントと交差反応するかを評価するために、全5匹に由来する38日目の血清試料を、ELISAにより、スパイク糖タンパク質バリアントB.1.351(ベータ)(図7E)、及びスパイク糖タンパク質バリアントB.1.1.7(アルファ)(図7F)に対する結合に関して試験した。両試験において、マウス1、2、4、及び5に由来する血清試料は、両バリアントタンパク質に対して、低希釈及び高希釈(1:100及び1:4000)で結合を示した。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質の中和を評価するために、野生型SARS-CoV-2スパイクタンパク質で免疫化した、5匹のトランスジェニック6動物の38日目の血清を、ブロッキングバッファ中で1/350に希釈して、中和アッセイにより試験した(図7G)。簡単に言うと、血清試料を、HRPコンジュゲートスパイク糖タンパク質結合ドメイン(RBD)と、1:1の体積比でインキュベートしてから、その混合物を、hACE2プレコートしたプレートに添加して、15分間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを、洗浄バッファで4回洗浄した。ウェルを、15分間、室温でTMB溶液とインキュベートしてから、停止液を添加して反応をクエンチした。SpectraMax(商標)i3xマルチモードマイクロプレートリーダー(Molecular Devices社)で、プレートを直ちに読み取った。1日目のデータを、免疫化の異なる時点で採取した血清に対するベースラインとして使用して、パーセント阻害を計算した。38日目に採取したマウス1、2、及び3由来の血清は、RBD及びhACE2と競合し、>94%の阻害を示した。38日目に採取したマウス4及び5由来の血清は、RBD及びhACE2と競合し、>77%の阻害を示した。
4匹のホモ接合型トランスジェニック2動物の一群を、抗原としての野生型SARS-CoV-2スパイクタンパク質(標的3)による免疫化実験に使用した。簡単に言うと、各トランスジェニックマウスに、乳化させたスパイクタンパク質100μLを、0.5μg/μLの濃度で腹腔内注射した。5週の経過中に、計4回の免疫化注射をした。最後の注射から3日後に動物を殺処分した。血清試料及び脾臓組織を採取し、RNAを抽出して、可変重鎖(VH)のライブラリを構築した。血清試料を採取し、1/100及び1/15000の希釈を使用して、ELISAにより、抗標的3単一ドメイン抗体の抗体力価を評価した。
図7Hに例証されるように、トランスジェニック2動物から、抗スパイク抗体が産生された。抗体力価は、第3の免疫化注射後、一定レベルに保たれた。抗体力価は、ELISAにより、4匹のうちの2匹に関して、血清の1/15000希釈において、依然として検出可能であった。
野生型SARS-CoV-2スパイクタンパク質で免疫化したトランスジェニック2動物から生成されたsdAbが、他のSARS-CoV-2スパイクタンパク質バリアントと交差反応するかを評価するために、全4匹に由来する38日目の血清試料を、ELISAにより、スパイク糖タンパク質バリアントB.1.351(ベータ)(図7I)、及びスパイク糖タンパク質バリアントB.1.1.7(アルファ)(図7J)に対する結合に関して試験した。両試験において、マウス1に由来する血清試料は、両バリアントタンパク質に対して、低希釈及び高希釈(1:100及び1:4288)で結合を示し、マウス2、3、及び4に由来する血清試料は、両バリアントタンパク質に対して、低希釈(1:100)でのみ結合を示した。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質の中和を評価するために、野生型SARS-CoV-2スパイクタンパク質で免疫化した、4匹のトランスジェニック2動物の38日目の血清を、ブロッキングバッファ中で1/350に希釈して、中和アッセイにより試験する。血清を、HRPコンジュゲートスパイク糖タンパク質結合ドメイン(RBD)とインキュベートしてから、hACE2プレコートしたプレートに添加する。1日目のデータを使用して、パーセント阻害を計算する。
結論として、本明細書に開示される2つのHCAbトランスジェニック動物(トランスジェニック2及びトランスジェニック6)の、標的1、CD3(標的2)、又はSARS-CoV-2野生型スパイク(標的3)による免疫化は、標的特異的単一ドメイン抗体の効果的な発現をもたらした。
(実施例6)
CH1欠失を有するトランスジェニックマウスの免疫化により得られた抗体ライブラリの特徴づけ
標的1で免疫化した、トランスジェニック6動物(4匹のトランスジェニックマウスに由来する4つの免疫ライブラリ)及びアルパカ(2つのアルパカに由来する2つの免疫ライブラリ)から、アンプリコンベースのNGS解析(Miseq V3、600サイクル)により、DNA標本抽出を行った。NGSシーケンシングにより、計200万のペアリードが、2つのアルパカライブラリ試料から得られ、計470万のペアリードが、4つのトランスジェニック6ライブラリ試料から得られた。
CH1欠失を有するトランスジェニックマウスの免疫化により得られた抗体ライブラリの特徴づけ
標的1で免疫化した、トランスジェニック6動物(4匹のトランスジェニックマウスに由来する4つの免疫ライブラリ)及びアルパカ(2つのアルパカに由来する2つの免疫ライブラリ)から、アンプリコンベースのNGS解析(Miseq V3、600サイクル)により、DNA標本抽出を行った。NGSシーケンシングにより、計200万のペアリードが、2つのアルパカライブラリ試料から得られ、計470万のペアリードが、4つのトランスジェニック6ライブラリ試料から得られた。
図8Aに例証されるように、特有の配列の総数は、トランスジェニックマウス免疫ライブラリとアルパカ免疫ライブラリとの間で同等であった(アルパカでの723,000個に対してトランスジェニックマウスでの665,000個)。トランスジェニック6動物から得られた免疫ライブラリのサイズは、アルパカ免疫ライブラリと比べて小さかった(トランスジェニック6動物での4E+6に対してアルパカでの1E+8)。
図8Bに例証されるように、トランスジェニック6免疫ライブラリとアルパカ免疫ライブラリとの間ではごく少数の配列が重複する。100%の配列同一性を有する単に10個の配列のみが、両ライブラリ中に見出された。
この結果は、トランスジェニック動物に由来する抗体は、アルパカの抗体に対して配列の重複をほとんど示さないか、又はまったく示さないことを実証し、同じ抗原で免疫化されているにもかかわらず、標的1に対する特有の抗体レパートリを示唆する。トランスジェニック6動物からはサイズのより小さいライブラリが生成されたにもかかわらず、特有の配列の数(NGSによる非同一sdAb配列)は、2種間で同等であった。それは、標的1に対する、トランスジェニック動物の免疫応答のより高い複雑性を示唆する。
4つのトランスジェニック6免疫ライブラリに由来するすべての特有の配列を、37位、44位、45位、及び47位における4つのラクダVHHホールマーク変異(hallmark mutation)に関して評価した。百分率は、全4つのラクダVHH変異を有する配列の総数/特有の配列の総数として計算した。ラクダVHHの標準的フレームワーク変異(Table 2(表2))は、全4つのトランスジェニック6免疫ライブラリにおいて検出され得た。VHHホールマーク変異を全4つの位置で含有するsdAbは、0.03%～0.06%に及んだ。高い割合のsdAbが、それらの変異のうちの少なくとも1つを含有した。
ラクダVHHフレームワーク変異は、疎水性の低下に役立つため、sdAb構造の安定性の上昇に役立つ。NGSディープシーケンシングにより、トランスジェニック6動物は、抗体成熟中の変異イベントに起因する可能性がある標準的ラクダフレームワーク変異を有するsdAbを産生したことが実証された。
(実施例7)
CH1欠失を有するトランスジェニックマウスの免疫化により得られた、選択された単一ドメイン抗体種の特徴づけ
無作為にピッキングした10個のsdAbの可変領域を、ヒトIgG1 Fcと融合させた。結果として生じるホモ二量体結合剤(sdAb-Fc1～sdAb-Fc10)を産生させて、細胞から単離し、ELISAにより、標的1に対する結合特異性及び親和性を評価した。更に、異なる種に由来する組換えタンパク質(組換え標的1)を使用して、抗体交差反応性を評価した。すべての抗体を、357nMの単一濃度で試験してから、ヤギ抗ヒトIgG-Fc二次抗体(Jackson immune research社、カタログ番号109-035-098)を用いて1/5000希釈で検出した。
CH1欠失を有するトランスジェニックマウスの免疫化により得られた、選択された単一ドメイン抗体種の特徴づけ
無作為にピッキングした10個のsdAbの可変領域を、ヒトIgG1 Fcと融合させた。結果として生じるホモ二量体結合剤(sdAb-Fc1～sdAb-Fc10)を産生させて、細胞から単離し、ELISAにより、標的1に対する結合特異性及び親和性を評価した。更に、異なる種に由来する組換えタンパク質(組換え標的1)を使用して、抗体交差反応性を評価した。すべての抗体を、357nMの単一濃度で試験してから、ヤギ抗ヒトIgG-Fc二次抗体(Jackson immune research社、カタログ番号109-035-098)を用いて1/5000希釈で検出した。
図9Aに例証されるように、10個のsdAb-Fcはいずれも、ヒト標的1組換えタンパク質に結合する。10個のsdAb-Fcのうちの8つは、試験された全4つの種に由来する標的1に対して交差反応性を示した。
2つの標的1陽性細胞株及び1つの陰性細胞株を使用して、トランスジェニック6免疫ライブラリに由来する10個のsdAb-Fcすべての結合を評価した。各ウェル中、100,000細胞を使用して、sdAb-Fcと、714nMの濃度でインキュベートした。次いで、抗ヒトIgG Fc抗体(Biolegend社、カタログ番号409306)を、二次抗体として1/500希釈で使用した後、ヒト7AAD(Biolegend社、カタログ番号422302)とインキュベートしてからFACSを行った。
図9Bに例証されるように、10個のsdAb-Fcはいずれも、標的1陽性細胞株に対して特異的結合を示したが、陰性対照に対してはそうではなかった。
このデータは、トランスジェニック6免疫ライブラリに由来する可変領域配列は、標的1に対する結合剤の生成に使用可能であることを示す。
更に、NCGマウスでの確立されたトリプルネガティブ乳腺腫瘍モデル、MDA-MB-453を使用して、その抗がん効果を評価するために、10個の陽性結合体から4つのsdAb-Fcを選択した。各処置群は、6匹のNCGマウス(雌性、5～6週齢、Charles Rivers Laboratories社)を含有した。MDA-MB-453乳腺腫瘍細胞の500万個を、マウスに皮下注射した。腫瘍容積が少なくとも100mm3の大きさに達したら、ヒトPBMCの1000万個を、静脈内注射により接種した(1日前)。翌日(0日目)、マウスを2群に無作為に割り付け、各群に対して、抗体を8mg/kgの用量で、又はPBSを1週当たり2回、計4週間腹腔内注射した(処置スキームを図10Aに示す)。図10Bに例証されるように、4つのどのsdAb-Fc抗体でも、処置された動物において腫瘍退縮が認められた。
このデータは、トランスジェニック6動物免疫ライブラリに由来する可変領域配列は、標的1に対する機能活性結合剤の生成に使用可能であることを示す。なぜなら、4つのsdAb-Fcはいずれも腫瘍退縮を引き起こしたからである。
(実施例8)
アルパカ、フタコブラクダ、ラマ、及びヒトコブラクダIgH遺伝子座に由来する配列の選択(de novoシーケンシング)
アルパカ、フタコブラクダ、ラマ、及びヒトコブラクダの精巣組織からゲノムDNA(gDNA)を抽出した。精製したgDNA試料をHindIII酵素で消化(digest)した。4つの種すべてに関して、別個のBACライブラリを構築するために、100Kb超の消化フラグメントを使用した。各種のV断片、D断片、J断片、及びIgM定常領域のコンセンサス配列に基づいてプライマーを設計し、BACライブラリから陽性クローンをスクリーニングして単離するために使用した。各ライブラリに関して、D及びJ断片に対しては陰性であるがV断片に対する6つの陽性クローン、V、D、J断片及びIgM定常領域に対する2つの陽性クローン、並びにJ断片に対しては陰性であるがIgM定常領域に対する2つの陽性クローンを選択して、1分子リアルタイム(SMRT)シーケンシング(PacBio社)に付託した。このアプローチを使用して、以前に同定された223Kbフラグメント(GenBank ID AM773729.1、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AM773729)を含む部分アルパカIgHゲノム配列の445Kb;ラマ部分IgHゲノム配列の455kb、ヒトコブラクダ部分IgHゲノム配列の445kb、及びフタコブラクダ部分IgHゲノム配列の773Kb超を、それぞれ、SMRTシーケンシングにより同定した。本出願人の知る限り、これらの大きい、フタコブラクダ及びラマのゲノムIgH遺伝子座配列は、本出願人が初めて明らかにした。
アルパカ、フタコブラクダ、ラマ、及びヒトコブラクダIgH遺伝子座に由来する配列の選択(de novoシーケンシング)
アルパカ、フタコブラクダ、ラマ、及びヒトコブラクダの精巣組織からゲノムDNA(gDNA)を抽出した。精製したgDNA試料をHindIII酵素で消化(digest)した。4つの種すべてに関して、別個のBACライブラリを構築するために、100Kb超の消化フラグメントを使用した。各種のV断片、D断片、J断片、及びIgM定常領域のコンセンサス配列に基づいてプライマーを設計し、BACライブラリから陽性クローンをスクリーニングして単離するために使用した。各ライブラリに関して、D及びJ断片に対しては陰性であるがV断片に対する6つの陽性クローン、V、D、J断片及びIgM定常領域に対する2つの陽性クローン、並びにJ断片に対しては陰性であるがIgM定常領域に対する2つの陽性クローンを選択して、1分子リアルタイム(SMRT)シーケンシング(PacBio社)に付託した。このアプローチを使用して、以前に同定された223Kbフラグメント(GenBank ID AM773729.1、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AM773729)を含む部分アルパカIgHゲノム配列の445Kb;ラマ部分IgHゲノム配列の455kb、ヒトコブラクダ部分IgHゲノム配列の445kb、及びフタコブラクダ部分IgHゲノム配列の773Kb超を、それぞれ、SMRTシーケンシングにより同定した。本出願人の知る限り、これらの大きい、フタコブラクダ及びラマのゲノムIgH遺伝子座配列は、本出願人が初めて明らかにした。
各ラクダV断片は、V断片のおよそ5kb上流及び5kb下流を含み、従って、調節配列、イントロン配列、リーダー配列、及びV断片と関連する組換えシグナル配列を含む。従って、各ラクダV遺伝子断片は、ラクダゲノムDNA内の係るV断片と関連するオリジナル調節配列を含む。
ES細胞及びトランスジェニック動物の生成を目的に、VH及びVHHをコードするV断片を、細菌人工染色体へとクローニングした。
(実施例9)
改変可変領域を有する、ESクローン及びトランスジェニックマウスの生成
図12、図14、及び図15に例示する、所望のCH1欠失を有するES細胞への、細菌人工染色体(例えば、BAC2、BAC3a、BAC3b、BAC4a、BAC4b、BAC5、BAC6、BAC7)の単一又は連続の標的化組込みにより、ラクダVH、VHH、D、及びJ配列を発現するES細胞クローン及びトランスジェニックマウスを生成すると、図11B、図11C、及び図13に例示される導入遺伝子を有する、ES細胞クローン及びトランスジェニックマウスをもたらす。
改変可変領域を有する、ESクローン及びトランスジェニックマウスの生成
図12、図14、及び図15に例示する、所望のCH1欠失を有するES細胞への、細菌人工染色体(例えば、BAC2、BAC3a、BAC3b、BAC4a、BAC4b、BAC5、BAC6、BAC7)の単一又は連続の標的化組込みにより、ラクダVH、VHH、D、及びJ配列を発現するES細胞クローン及びトランスジェニックマウスを生成すると、図11B、図11C、及び図13に例示される導入遺伝子を有する、ES細胞クローン及びトランスジェニックマウスをもたらす。
例えば、γ3、γ1、γ2b、及びγ2a定常領域遺伝子の各々のCH1エクソンの欠失を有するマウスES細胞(図4のトランスジェニック2により例証)を、ラクダV、D、及び/又はJ断片を含むBAC構築物でトランスフェクトし、適切な組換えイベントを有するESクローン(図11B、図11C、又は図13に例示)を、キメラ動物の作製に使用する。選択したESクローンを微量注入した胚盤胞の、偽妊娠マウスへの移植により、キメラマウスを得る。キメラマウスを野生型C57/B6動物に対して戻し交配して、F1ヘテロ接合型動物を生成し、PCRジェノタイピングにより確認する。ホモ接合型F2動物を、F1ヘテロ接合型の交配により生成する。
特に、マウスIgH遺伝子座において、内在性マウスD及びJ遺伝子断片を標的としてアルパカD及びJ遺伝子断片で置換するために、BAC2構築物を使用した。BAC2構築物の標的化組込みは、PCRジェノタイピングにより確認した。図11Bに示すBAC2導入遺伝子を含むES細胞クローンを選択した。その構築物を、BaC3aを含む更なるBACを構築するための中間体として使用する。
IgH遺伝子座において、内在性マウスD及びJ遺伝子を標的として置換し、ラクダVH及びVHHを付加するために、BAC3a構築物を使用した。BAC3a構築物の標的化組込みは、PCRジェノタイピングにより確認した。図11Bに示すBAC3a導入遺伝子を含むES細胞クローンを選択した。その構築物を、BaC4aを含む更なるBACを構築するための中間体として使用する。
IgH遺伝子座において、内在性マウスD及びJ遺伝子を標的として置換し、ラクダVH及びVHHを付加するために、BAC3b構築物を使用した。BAC3b構築物の標的化組込みは、PCRジェノタイピングにより確認した。図11Bに示すBAC3b導入遺伝子を含むES細胞クローンを選択した。その構築物を、BaC4bを含む更なるBACを構築するための中間体として使用する。
BAC4a構築物と、マウス相同アームの内部領域を標的とするCas9又は単一ガイドRNA(sgRNA)配列を発現する構築物とを、ΔCH1 ES細胞クローン13A10(導入遺伝子2を有する)内へとコエレクトロポレーションした。トランスフェクトしたES細胞を、ネオマイシン(G418)にさらした。BAC4aは、IgH遺伝子座において、内在性マウスD及びJ遺伝子を標的として置換し、ラクダVH及びVHHを付加する。計228個のクローンを単離して、5'及び3'のロングレンジPCRによりスクリーニングした。BAC4a構築物の標的化組込みは、PCRジェノタイピングにより確認した。クローン1F4、3H5、及び1F10を含む、図11Bに示すBAC4a導入遺伝子を含むES細胞クローンを、胚盤胞注入用に選択した。54個/60個の生存胚盤胞が生じた。導入遺伝子の存在を確認するために、尾部生検試料を用いてPCRジェノタイピングを行った。
IgH遺伝子座において、内在性マウスD及びJ遺伝子を標的として置換し、ラクダVH及びVHHを付加するために、BAC4b構築物を、ΔCH1 ES細胞クローン13A10(導入遺伝子2を有する)内へとエレクトロポレーションした。PCRスクリーニング後、クローン1D4、5D10、及び5C4を含む、いくつかのBAC4b陽性ESクローン(>20個)を同定し、図11Cに示すBAC4b構築物の標的化組込みを確認した。クローン1D4、5D10、及び5C4を、胚盤胞注入用に選択した。15個/40個の生存胚盤胞が生じた。クローン5D10に由来する雄性キメラを野生型雌性とセットして、8匹の同腹仔をもたらした。8匹からの5匹が、BAC4b遺伝子を伝達し、尾部生検試料を用いたPCRジェノタイピングにより確認された。
マウスVH断片の標的化置換、及びアルパカ、ラマ、及びヒトコブラクダに由来する更なるVHHの挿入を目的に、BAC5構築物を、BAC4a陽性ES細胞クローン1F4、3H5、及び/又は1F10内へとエレクトロポレーションした。PCRスクリーニング後、BAC5陽性ESクローンを同定し、図11Cに示すBAC5構築物の標的化組込みを確認した。更なる実験のためにクローンを選択した。
フタコブラクダD/J断片でのアルパカD/J断片の標的化置換を目的に、BAC6構築物を、BAC4b陽性ES細胞クローン5D10内へとエレクトロポレーションした。PCRスクリーニング後、いくつかのBAC6陽性ESクローンを同定し、図11Cに示すBAC6構築物の標的化組込みを確認した。クローン1B10、1E6、及び1D5を、胚盤胞注入用に使用した。計24匹の子ネズミが生まれた。
全マウスVHの標的化除去、並びに更なるアルパカ及びフタコブラクダVHHの挿入を目的に、BAC7構築物を、BAC5陽性ES細胞クローン内へとエレクトロポレーションした。PCRスクリーニング後、陽性BAC7 ESクローンを同定し、図11Cに示すBAC7構築物の標的化組込みを確認した。更なる実験のために陽性クローンを選択した。
アルパカ、ラマ、フタコブラクダ、及びヒトコブラクダに由来する13個の新規VHH遺伝子を含有するBAC5及びBAC7構築物が、IgH遺伝子座上のマウス内在性VH遺伝子全体を置換する。BAC5構築物では、ラクダVHH遺伝子レパートリの多様性を増大させるために、第4のラクダ種であるヒトコブラクダに由来するVHHを導入した。BAC5及びBAC7は、マウスIgH遺伝子座を標的とするために、段階的に導入した。
まず、内在性ネオマイシン耐性マーカーをBAC4a陽性ES細胞クローンから除去するために、BAC5構築物を導入した。Bac5構築物は、Bac5陽性ES細胞クローンの選択を可能にするハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを含有する。次いで、BAC5陽性ESクローン上の内在性ネオマイシン耐性マーカーを標的化除去するために、BAC7構築物を、BAC5陽性ESクローン内へと導入した。Bac7構築物上のネオマイシン耐性遺伝子カセットを、Bac7陽性ES細胞クローンを選択するために使用した。胚盤胞注入に使用する陽性ES細胞クローンを確認するために、完全PCRスクリーニングを行った。
従って、CH1欠失(例えば導入遺伝子2)を有するES細胞クローン内への、BAC2、BAC3a、BAC3b、BAC4a、BAC4b、BAC5、BAC6、及び/又はBAC7構築物の組込みが、図11B、図11C、及び図13に示す導入遺伝子を含むES細胞クローンをもたらす(導入遺伝子2定常領域は、簡潔さのため図示せず)。所望の導入遺伝子に関して陽性のES細胞クローンを増殖させ、更なる実験用に保管した。
トランスジェニックマウスは、実施例3に記載のように取得する。抗原特異的単一ドメイン抗体を産生するために、トランスジェニックマウス(キメラ、ヘテロ接合型又はホモ接合型)を、所望の抗原で免疫化した。
(実施例10)
ラクダV、D、及び/又はJドメインを有する単一ドメイン抗体の発現
ラクダV、D、及びJ断片を有する、免疫化前の動物の血清試料を用いて、還元条件下又は非還元条件下、ウエスタンブロット実験を行った。簡単に言うと、還元条件下、血清試料を、水中に1/50の比率で希釈し、希釈血清試料5μLをゲル(Bis-Tris 4～12%)上にロードした。検出には、二次抗体、例えば、HRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG2a(Abcam社、ab97245)、ヤギpAb抗マウスIgG2b HRP(Abcam社、ab97250)、及びHRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG3(Abcam社、ab97260)を、1/20,000希釈で使用した。非還元条件下、血清試料を、水中に1/50の比率で希釈し、希釈血清試料12μLを、ゲル(Trisグリシン8%)上にロードした。検出には、二次抗体、例えば、HRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG2a(Abcam社、ab97245)、HRPコンジュゲートヤギpAb抗-マウスIgG2b(Abcam社、ab97250)、及びHRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG3(Abcam社、ab97260)を、1/10,000希釈で使用した。
ラクダV、D、及び/又はJドメインを有する単一ドメイン抗体の発現
ラクダV、D、及びJ断片を有する、免疫化前の動物の血清試料を用いて、還元条件下又は非還元条件下、ウエスタンブロット実験を行った。簡単に言うと、還元条件下、血清試料を、水中に1/50の比率で希釈し、希釈血清試料5μLをゲル(Bis-Tris 4～12%)上にロードした。検出には、二次抗体、例えば、HRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG2a(Abcam社、ab97245)、ヤギpAb抗マウスIgG2b HRP(Abcam社、ab97250)、及びHRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG3(Abcam社、ab97260)を、1/20,000希釈で使用した。非還元条件下、血清試料を、水中に1/50の比率で希釈し、希釈血清試料12μLを、ゲル(Trisグリシン8%)上にロードした。検出には、二次抗体、例えば、HRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG2a(Abcam社、ab97245)、HRPコンジュゲートヤギpAb抗-マウスIgG2b(Abcam社、ab97250)、及びHRPコンジュゲートヤギpAb抗マウスIgG3(Abcam社、ab97260)を、1/10,000希釈で使用した。
ELISA又はフローサイトメトリーにより、抗体サブクラスの定量を行った。血清試料を、TBS中に250ng/μLの濃度で希釈し、希釈抗体50μLを、IgGサブクラスの各々に対して特異的である検出抗体と混合した(ラピッドELISAマウスmAbアイソタイピングキット、カタログ番号37503、Thermofisher社)。トランスジェニック動物での各サブクラス抗体の発現を、野生型対照血清試料に対して正規化した。
BAC4bキメラ動物でのラクダsdAbの発現を評価するために、前記のようにウエスタンブロット実験を行った。各マウス血清2μlを、非還元条件下に使用して、セミドライシステムを使用してニトロセルロース膜へと転写した。ブロットを5%ミルク/PBS-Tween 0.1%でブロッキングしてから、ウサギモノクローナル抗ラクダ抗体(A01861、Genscript社)に続いて、HRPコンジュゲートヤギ抗ウサギIgG(H+L)抗体(111-035-045、Jackson ImmunoResearch社)で検査した。
図16Aに示すように、免疫化前のBAC4bキメラに由来する4つの血清試料のうちの3つは、ラクダVHHが挿入されていないトランスジェニック2動物に由来する無発現と比べて、ラクダVHH発現を示した。
図16Bに示すように、初代(founder)に由来する5匹の、免疫化前のF1ヘテロ接合型の同腹仔からの血清試料を、ウエスタンブロット検出に使用した。5匹のうちの4匹は、ラクダVHHの発現を示した一方、トランスジェニック2動物又は野生型対照試料のいずれもVHH発現を示さなかった。
この結果は、BAC4bトランスジェニックマウスが、BAC4b挿入に由来するラクダVHH、D、及びJ遺伝子を、VDJ組換えにおいて効果的に使用することができ、sdAbを発現し、循環血液中に検出されることを示す。
ラクダV、D、及びJ断片を有するトランスジェニックマウスを、本明細書に記載される抗原、例えば、標的1、組換えヒトCD3ε及びδサブユニット、SARS-Cov-2スパイク、又は他の抗原で免疫化する。血清試料及び脾臓組織を採取し、可変重鎖(VHH)のライブラリを構築する。ファージディスプレイ技術を使用して、抗原に対する、2ラウンドのパンニングを行う。DNA試料を回収して、NGS(Miseq、v600サイクル、2500万リード)により解析する。並行して、第2ラウンドのパンニングから、96ファージクローンをピッキングし、組換えタンパク質に対する結合をELISAにより、及びヒトPBMCに対する結合をフローサイトメトリーにより試験する。陽性結合体の核酸を取得する。
(実施例11)
発現された可変領域及び単一ドメイン抗体の多様性の増大
抗原免疫化による抗体の多様性を増大させるために、異なるホモ接合型トランスジェニック動物を異種交配して、1つ又は複数の異なるV、D、及び/又はJ断片を含む異なるIgH対立遺伝子を有する異種動物を生成する。例えば、BAC4b導入遺伝子を有するホモ接合型動物を、BAC6導入遺伝子を有するホモ接合型動物と異種交配すると、両導入遺伝子を有するヘテロ接合型動物をもたらすため、免疫化により産生されるsdAbの多様性が増大する。
発現された可変領域及び単一ドメイン抗体の多様性の増大
抗原免疫化による抗体の多様性を増大させるために、異なるホモ接合型トランスジェニック動物を異種交配して、1つ又は複数の異なるV、D、及び/又はJ断片を含む異なるIgH対立遺伝子を有する異種動物を生成する。例えば、BAC4b導入遺伝子を有するホモ接合型動物を、BAC6導入遺伝子を有するホモ接合型動物と異種交配すると、両導入遺伝子を有するヘテロ接合型動物をもたらすため、免疫化により産生されるsdAbの多様性が増大する。
(実施例12)
単一特異性、多重特異性、及び多価の結合剤の生成
本明細書に記載されるように、選択された結合体の可変領域は、定常領域Fcを組み込むために、又は制限なしに、Deyev、S.Mら(BioEssays 30:904～918頁、2008)及び国際公開第2021119832号で2021年6月24日に公開されたPCT/CA2020/051753に開示されるフォーマットを含む他のフォーマットへとクローニングされ得る。
単一特異性、多重特異性、及び多価の結合剤の生成
本明細書に記載されるように、選択された結合体の可変領域は、定常領域Fcを組み込むために、又は制限なしに、Deyev、S.Mら(BioEssays 30:904～918頁、2008)及び国際公開第2021119832号で2021年6月24日に公開されたPCT/CA2020/051753に開示されるフォーマットを含む他のフォーマットへとクローニングされ得る。
従って、創生した結合剤を、結合特異性、親和性、及び/又は生物学的活性に関して試験する。
本発明は、本明細書に記載される特定の材料、方法、又は実験条件それ自体に限定されず、材料、方法、又は実験条件は異なり得る。本明細書に記載される実施形態及び実施例は、例証であり、請求される本開示の範囲を限定するとは意図されない。当業者は、慣例に過ぎない実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識するか、又は確認できるであろう。代替物、改変、組合せ、並べ替え、及び均等物を含む、実施形態の変形形態は、本開示に含まれると意図される。
本出願において引用したすべての文書、特許、雑誌論文、及び他の資料は、参照により本明細書に組み込まれている。
参考文献
本出願を通じて言及されるすべての特許、特許出願、及び刊行物の内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
本出願を通じて言及されるすべての特許、特許出願、及び刊行物の内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
Claims (167)
- 免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座において生殖系列改変を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、前記IgH遺伝子座が、a)未再構成の重鎖可変(V)、多様(D)、及び結合(J)遺伝子断片、並びにb)機能性CH1ドメインを欠く少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子を含み、前記D及び/又はJ遺伝子断片が、ラクダD及び/又はJ遺伝子断片を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、重鎖のみの抗体(HCAb)又はそれをコードする核酸を発現することができる、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記改変が、a)1つ又は複数の内在性非ヒトD及び/又はJ遺伝子断片の、1つ又は複数の未再構成ラクダD及び/又はJ遺伝子断片での置換、並びにb)少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインの部分欠失又は完全欠失を含む、請求項1又は2に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記改変が、a)1つ又は複数の未再構成ラクダD及び/又はJ遺伝子断片の挿入、並びにb)少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインの部分欠失又は完全欠失を含む、請求項1又は2に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記改変が、a)1つ若しくは複数の内在性非ヒトD及び/若しくはJ遺伝子断片の、1つ若しくは複数の未再構成ラクダD及び/若しくはJ遺伝子断片での置換、又は1つ若しくは複数の未再構成ラクダD及び/若しくはJ遺伝子断片の挿入、並びにb)少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインの改変を含む、請求項1又は2に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記改変が、すべての内在性非ヒトD及びJ断片の、未再構成ラクダD及びJ遺伝子断片での置換を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラクダD及び/又はJ遺伝子断片が、単一のラクダ種に由来する、請求項1から6のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラクダD及び/又はJ遺伝子断片が、少なくとも2つ、少なくとも3つ、又は少なくとも4つのラクダ種に由来する、請求項1から6のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記改変が、1つ若しくは複数の内在性非ヒトV遺伝子断片の、複数の哺乳動物種のV遺伝子断片での置換、又は複数の哺乳動物種のV遺伝子断片の挿入を更に含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記改変が、1つ若しくは複数の内在性非ヒトV遺伝子断片の、1つ若しくは複数のラクダV遺伝子断片での置換、又はラクダV遺伝子断片の挿入を更に含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記改変が、すべての内在性非ヒトV断片の、ラクダV遺伝子断片での置換を含む、請求項10に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記V遺伝子断片が、少なくとも2つの種に由来する、請求項1から11のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記V遺伝子断片が、少なくとも3つの種に由来する、請求項1から11のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記V遺伝子断片が、少なくとも4つの種に由来する、請求項1から11のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記V遺伝子断片が、VH又はVHHポリペプチドをコードする、請求項1から14のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記VH又はVHHポリペプチドが、ラクダVH又はラクダVHHポリペプチドである、請求項15に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラクダVHポリペプチドが、アルパカ、ラマ、フタコブラクダ、ビクーニャ、又はヒトコブラクダに由来する、請求項16に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラクダVHHポリペプチドが、アルパカ、ラマ、フタコブラクダ、ビクーニャ、又はヒトコブラクダに由来する、請求項16に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、アルパカ由来のV断片、フタコブラクダ由来のV断片、ラマ由来のV断片、ビクーニャ由来のV断片、及び/又はヒトコブラクダ由来のV断片を含む、請求項1から18のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラクダD及び/又はJ遺伝子断片が、アルパカに由来する、請求項1から19のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラクダD及び/又はJ遺伝子断片が、フタコブラクダに由来する、請求項1から20のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラクダD及び/又はJ遺伝子断片が、ラマに由来する、請求項1から21のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラクダD及び/又はJ遺伝子断片が、ヒトコブラクダに由来する、請求項1から22のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラクダD及び/又はJ遺伝子断片が、ビクーニャに由来する、請求項1から23のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記IgH遺伝子座が、1つから少なくとも7つの、アルパカのD遺伝子断片を含む、請求項1から24のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記IgH遺伝子座が、1つから少なくとも7つの、アルパカのJ遺伝子断片を含む、請求項1から25のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記IgH遺伝子座が、1つから少なくとも7つのフタコブラクダD遺伝子断片を含む、請求項1から26のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記IgH遺伝子座が、1つから少なくとも7つのフタコブラクダJ遺伝子断片を含む、請求項1から27のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、1つから少なくとも6つの、アルパカのV遺伝子断片を含む、請求項1から28のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、1つから少なくとも10個の、フタコブラクダのV遺伝子断片を含む、請求項1から29のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、1つから少なくとも10個の、ラマのV遺伝子断片を含む、請求項1から30のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、1つから少なくとも6つの、ヒトコブラクダのV遺伝子断片を含む、請求項1から31のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、1つから少なくとも6つの、ビクニアのV遺伝子断片を含む、請求項1から32のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記V遺伝子断片、D遺伝子断片、及び/又はJ遺伝子断片が、天然配列をコードする、請求項1から33のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記V遺伝子断片、D遺伝子断片、及び/又はJ遺伝子断片が、変異配列をコードする、請求項1から34のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記IgG定常領域遺伝子が、内在性非ヒトIgG定常領域遺伝子又はその一部である、請求項1から35のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記IgG定常領域遺伝子が、γ3定常領域遺伝子、γ1定常領域遺伝子、γ2b定常領域遺伝子、又はγ2a定常領域遺伝子である、請求項1から36のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 少なくとも2つのIgG定常領域遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含む、請求項1から37のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 少なくとも3つのIgG定常領域遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含む、請求項1から38のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- すべてのIgG定常領域遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含む、請求項1から39のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含み、少なくとも1つの他のIgG定常領域遺伝子が、完全又は部分的に欠失している、請求項1から40のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記IgH遺伝子座が、一方の又は両方の対立遺伝子における前記CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3定常領域遺伝子を含む、請求項1から41のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記IgH遺伝子座が、一方の又は両方の対立遺伝子における前記CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ1定常領域遺伝子を含む、請求項1から42のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記IgH遺伝子座が、一方の又は両方の対立遺伝子における前記CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2b定常領域遺伝子を含む、請求項1から43のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記IgH遺伝子座が、一方の又は両方の対立遺伝子における前記CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2a定常領域遺伝子を含む、請求項1から44のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの少なくとも1つの対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失を含むγ3定常領域遺伝子、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失を含むγ1定常領域遺伝子、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失を含むγ2b定常領域遺伝子、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失を含むγ2a定常領域遺伝子、又はそれらの組合せからなる群から選択されるIgG定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む、請求項1から45のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの一方の対立遺伝子が、γ3及びγ2b定常領域遺伝子の部分欠失又は完全欠失、並びにCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ1及びγ2a定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む、請求項1から46のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの一方の対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2b定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む、請求項1から47のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの一方の対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む、請求項1から48のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの一方の対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3定常領域遺伝子、並びにCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2a定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む、請求項1から49のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの一方の対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3定常領域遺伝子、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2a定常領域遺伝子、及びγ2b定常領域遺伝子の部分欠失又は完全欠失を含むIgH遺伝子座を含む、請求項1から50のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの一方の対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3定常領域遺伝子、及びCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2b定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む、請求項1から51のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの他方の対立遺伝子が、同一のIgH遺伝子座、又は同一のIgG定常領域遺伝子を含む、請求項46から52のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの他方の対立遺伝子が、野生型IgH遺伝子座、又は野生型IgG定常領域遺伝子を含む、請求項46から52のいずれ一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの他方の対立遺伝子が、少なくとも1つ若しくはすべてのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失、少なくとも1つ若しくは他のすべてのIgG定常領域遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失、又はそれらの組合せから選択される改変を含むIgH遺伝子座を含む、請求項46から52のいずれ一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 他方の対立遺伝子が、野生型非ヒトγ3、γ1、γ2b、及びγ2a定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む、請求項46から52のいずれ一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 他方の対立遺伝子が、γ3、γ1、及びγ2b定常領域遺伝子の部分欠失又は完全欠失、並びにCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2a定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む、請求項46から52のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 他方の対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3及びγ2a定常領域遺伝子、並びにγ2b定常領域遺伝子の部分欠失又は完全欠失を含むIgH遺伝子座を含む、請求項46から52のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 他方の対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む、請求項46から52のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 他方の対立遺伝子が、γ3、γ1、及びγ2b定常領域遺伝子の部分欠失又は完全欠失を含むIgH遺伝子座を含む、請求項46から52のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 他方の対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3及びγ2a定常領域遺伝子、並びにγ2b定常領域遺伝子の部分欠失又は完全欠失を含むIgH遺伝子座を含む、請求項46から52のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの両対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ2b定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む、請求項1から37のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの両対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3及びγ2a定常領域遺伝子、並びにγ2b定常領域遺伝子の部分欠失又は完全欠失を含むIgH遺伝子座を含む、請求項1から37のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの両対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失を含むγ3、γ1、γ2b、及びγ2a定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む、請求項1から37のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物ゲノムの両対立遺伝子が、CH1ドメインをコードする領域での完全欠失を含むγ3、γ1、γ2b、及びγ2a定常領域遺伝子を含むIgH遺伝子座を含む、請求項1から37のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記非ヒト動物ゲノムが、各対立遺伝子上に、少なくとも1つの異なるV遺伝子断片を含む、請求項1から65のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記非ヒト動物ゲノムが、その対立遺伝子の一方において少なくとも1つの1つの種のV遺伝子断片を含み、他方の対立遺伝子において少なくとも1つの別の種のV遺伝子断片を含む、請求項1から66のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、IgM定常領域遺伝子の生殖系列改変を更に含み、前記改変が、IgM CH1ドメインの、ラクダCH1ドメインでの置換を含む、請求項1から67のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記非ヒト動物が、ラマ種、フタコブラクダ種、及び/又はアルパカ種のラクダV遺伝子断片の少なくとも約10kb、少なくとも約20kb、少なくとも約30kb、少なくとも約40kb、又は少なくとも約50kbを含む、請求項1から68のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記V遺伝子断片、D遺伝子断片、及びJ遺伝子断片が、VDJ再構成可能である、請求項1から69のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座において生殖系列改変を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、前記改変が、以下からなる群:
a. 内在性非ヒト動物のγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子のCH1ドメインの欠失、又は
b. γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性非ヒト動物遺伝子のCH1ドメインの欠失と、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性非ヒト動物遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される、トランスジェニック非ヒト動物。 - 免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座において生殖系列改変を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、前記改変が、以下からなる群:
a. 内在性非ヒト動物のγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子のCH1ドメインの改変、又は
b. γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性非ヒト動物遺伝子のCH1ドメインの改変と、γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及び/若しくはγ2a遺伝子から選択される少なくとも1つの内在性非ヒト動物遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失との組合せ
から選択される、トランスジェニック非ヒト動物。 - 前記トランスジェニック非ヒト動物が、マウスV、D及び/若しくはJ、ラクダV、D及び/若しくはJ、又はヒトV、D及び/若しくはJ、又はそれらの組合せから選択されるV、D及び/又はJ断片を含む、請求項71又は72に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、ヘテロ接合型である、請求項1から73のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、ホモ接合型である、請求項1から73のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、トランスジェニックラットである、請求項1から75のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、トランスジェニックマウスである、請求項1から75のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記非ヒト動物が、CH1ドメインを欠くマウスIgG1、マウスIgG2a、マウスIgG2b、又はマウスIgG3定常領域をコードするIgG定常領域遺伝子を含むトランスジェニックマウスである、請求項1から77のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記マウスIgG1、マウスIgG2a、マウスIgG2b、又はマウスIgG3定常領域から選択される少なくとも2つのIgG定常領域遺伝子が、CH1ドメインを欠く、請求項78に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記マウスIgG1、マウスIgG2a、マウスIgG2b、又はマウスIgG3定常領域から選択される少なくとも3つのIgG定常領域遺伝子が、CH1ドメインを欠く、請求項78に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記マウスIgG1、マウスIgG2a、マウスIgG2b、及びマウスIgG3定常領域の各々が、CH1ドメインを欠く、請求項78に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記マウスIgG1、マウスIgG2a、マウスIgG2b、又はマウスIgG3のうちの少なくとも1つが、部分的又は完全に欠失している、請求項78から81のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、トランスジェニックマウスであり、すべての内在性マウスD及びJ遺伝子断片が、未再構成ラクダD及びJ遺伝子断片で置換される、請求項1から82のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、トランスジェニックマウスであり、前記トランスジェニックマウスのIgH遺伝子座が、1つ又は複数のマウスV遺伝子断片及び未再構成ラクダV遺伝子断片を含む、請求項1から83のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、トランスジェニックマウスであり、すべての内在性マウスV遺伝子断片が、未再構成ラクダV遺伝子断片で置換される、請求項1から84のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、機能性CH1ドメインを欠く少なくとも1つの内在性マウスIgG定常領域遺伝子を有するトランスジェニックマウスである、請求項1から85のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、一方の対立遺伝子のすべての内在性マウスIgG定常領域遺伝子が機能性CH1ドメインを欠くトランスジェニックマウスである、請求項1から86のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、両対立遺伝子のすべての内在性マウスIgG定常領域遺伝子が機能性CH1ドメインを欠くトランスジェニックマウスである、請求項1から87のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニックマウスが、ヘテロ接合型であり、前記マウスゲノムの一方の対立遺伝子が、少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失、及び場合により、少なくとも1つの他のIgG定常領域遺伝子の完全欠失又は部分欠失を含み、他方の対立遺伝子が、野生型である、請求項78から88のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニックマウスが、ヘテロ接合型であり、前記マウスゲノムの一方の対立遺伝子が、少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインをコードする領域での部分欠失又は完全欠失、及び場合により、少なくとも1つ又は他のすべてのIgG定常領域遺伝子の完全欠失又は部分欠失を含み、他方の対立遺伝子が、場合により、少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子のCH1ドメインをコードする領域での部分欠失若しくは完全欠失、又は少なくとも1つ若しくは他のすべてのIgG定常領域遺伝子の完全欠失若しくは部分欠失、又はそれらの組合せを含む、請求項78から88のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記改変が、内在性γ3遺伝子のCH1ドメインの欠失を含む、請求項1から90のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記改変が、内在性γ2b遺伝子のCH1ドメインの欠失を含む、請求項1から91のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記改変が、内在性γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及びγ2a遺伝子の各々のCH1ドメインの欠失を含む、請求項1から92のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記改変が、内在性γ2a遺伝子のCH1ドメインの欠失、及び内在性γ2b遺伝子の欠失を含む、請求項1から93のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記改変が、内在性γ3遺伝子及びγ2a遺伝子の各々のCH1ドメインの欠失、並びにγ2b遺伝子の欠失を含む、請求項1から94のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニックマウスが、ホモ接合型である、請求項78から95のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、トランスジェニックマウスであり、前記IgH遺伝子座における前記生殖系列改変が、a)内在性マウスD及びJ遺伝子断片の、未再構成ラクダD及びJ遺伝子断片での置換、a)内在性マウスV遺伝子断片の1つ若しくは複数の、1つ若しくは複数の未再構成ラクダV遺伝子断片での置換、又は1つ若しくは複数の未再構成ラクダV遺伝子断片の挿入、並びにc)内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、又はγ3遺伝子から発現されるポリペプチドが機能性CH1ドメインを含まないような、前記内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、又はγ3遺伝子の少なくとも1つ又はすべてのCH1ドメインの欠失又は改変、を含む、請求項1から96のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座において生殖系列改変を含むトランスジェニックマウスであり、前記改変が、内在性マウスγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及びγ2a遺伝子の各々のCH1ドメインの欠失、内在性マウスD及びJ遺伝子断片の、未再構成ラクダD及びJ遺伝子断片での置換、複数のラクダ種に由来するラクダV遺伝子断片の挿入、並びに場合により、少なくとも1つ又はすべての内在性マウスV遺伝子断片の欠失、を含む、請求項1から97のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記未再構成ラクダV遺伝子断片が、VDJ再構成用の組換えシグナル配列を含む関連イントロンを含む、請求項1から98のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラクダV断片が、VH及びVHHポリペプチドをコードする、請求項1から99のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、抗原による免疫化の後に、重鎖のみの抗体(HCAb)又はそれをコードする核酸を発現することができる、請求項1から100のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、37位、44位、45位及び/又は47位でのラクダ標準的フレームワーク変異を含むマウスVHポリペプチドを含む、重鎖のみの抗体(HCAb)を発現することができるトランスジェニックマウスである、請求項1から101のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラクダV断片が、アルパカ、フタコブラクダ、及びラマ由来のVH及び/又はVHHポリペプチドをコードする、請求項1から102のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ラクダV断片が、アルパカ、フタコブラクダ、ラマ、及びヒトコブラクダ由来のVH及び/又はVHHポリペプチドをコードする、請求項1から103のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記トランスジェニックマウスが、H-2bとして特徴づけられるMHCハプロタイプを有する、請求項78から104のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 内在性マウスV、D、及びJ断片、並びに機能性CH1ドメインを欠く少なくとも1つの内在性マウスIgG定常領域遺伝子を含むトランスジェニックマウスであって、前記トランスジェニックマウスが、重鎖のみの抗体(HCAb)を発現することができる、トランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、外来のV、D、又はJ断片を含まない、請求項106に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、ラクダのV、D、及び/又はJ断片を含む、請求項106に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、37位、44位、45位及び/又は47位でのラクダ標準的フレームワーク変異を含むマウスVHポリペプチドを含む、重鎖のみの抗体(HCAb)を発現することができる、請求項106から109のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
- 抗原特異的な重鎖のみの抗体(HCAb)又は前記HCAbの抗原結合ドメイン若しくはその一部をコードする核酸を取得する方法であって、前記方法が、請求項1から109のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物を抗原で免疫化する工程を含む、方法。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、前記抗原による免疫化により複数のHCAbを産生し、前記複数のHCAbが、第1の哺乳動物種のV断片によりコードされるV部分を含む少なくとも1つのHCAb種、及び第2の哺乳動物種のV断片によりコードされるV部分を含む第2のHCAb種を含む、請求項110に記載の方法。
- 前記方法が、前記トランスジェニック非ヒト動物のPBMCから全RNA又はメッセンジャーRNAを回収する工程を更に含む、請求項110又は111に記載の方法。
- 前記HCAb種の1つ又は複数の相補性決定領域又は可変領域のアミノ酸配列又は核酸配列を決定する工程を更に含む、請求項110から112のいずれか一項に記載の方法。
- 所定パラメータに基づいて配列情報をクラスターに組織化するためのコンピュータベースの方法又はソフトウェアを使用する工程を更に含む、請求項113に記載の方法。
- 結合剤を作製するために、1つ又は複数の配列を選択する工程を更に含む、請求項114に記載の方法。
- 前記結合剤が、抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項115に記載の方法。
- 前記結合剤が、VHHを含む、請求項115に記載の方法。
- 前記結合剤が、単一ドメイン抗体を含む、請求項115に記載の方法。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、IgH遺伝子座において、a)内在性マウスV遺伝子断片の1つ若しくは複数の、1つ若しくは複数の未再構成ラクダV遺伝子断片での置換、又は未再構成ラクダV遺伝子断片の挿入、b)内在性マウスD及びJ断片の少なくとも1つ又はすべての、ラクダD及びJ断片での置換、並びにc)内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、及びγ3遺伝子から発現されるポリペプチドが機能性CH1ドメインを含まないような、前記内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、及びγ3遺伝子の少なくとも1つ又はすべてのCH1ドメインの欠失又は改変、を含む生殖系列改変を含むトランスジェニックマウスである、請求項110から118のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座において生殖系列改変を含むトランスジェニックマウスであり、前記改変が、内在性マウスγ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及びγ2a遺伝子の各々のCH1ドメインの欠失、マウスD及びJ遺伝子断片の、未再構成ラクダD及びJ遺伝子断片での置換、複数のラクダ種に由来するラクダV遺伝子断片の挿入、並びに場合により、少なくとも1つ又はすべての内在性マウスV遺伝子断片の欠失、を含む、請求項110から119のいずれか一項に記載の方法。
- 結合剤を作製する方法であって、前記方法が、請求項1から109のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物を抗原で免疫化する工程、少なくとも1つのHCAb種の抗原結合ドメインのアミノ酸配列又は核酸配列を取得する工程、及び前記アミノ酸配列を含む結合剤を生成する工程を含む、方法。
- 前記抗原結合ドメインが、少なくとも1つのHCAb種の、1つ又は複数の相補性決定領域又は可変領域を含む、請求項121に記載の方法。
- 複数のHCAb種の、1つ又は複数の相補性決定領域又は可変領域のアミノ酸配列又は核酸配列が取得され、最も代表的な又は共通の配列を含む結合剤が生成される、請求項121又は122に記載の方法。
- 複数のHCAb種の、1つ又は複数の相補性決定領域又は可変領域のアミノ酸配列又は核酸配列が取得され、最も代表的でない又は特有の配列を含む結合剤が生成される、請求項121又は122に記載の方法。
- 請求項121から124のいずれか一項に記載の方法により取得されるアミノ酸配列を含むか、又は請求項121から124のいずれか一項に記載の方法により取得される核酸配列によりコードされる結合剤。
- 請求項1から105のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物を免疫化する工程により取得されるアミノ酸配列を含むか、又は請求項1から105のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物を免疫化する工程により取得される核酸配列によりコードされる結合剤。
- 非ヒト動物ゲノムD及び/若しくはJ断片の標的化置換、又はIgH遺伝子座におけるラクダD及び/若しくはJ断片の挿入用の核酸構築物であって、前記核酸構築物が、ゲノムラクダD及び/又はJ断片を含み、場合によりゲノムラクダV断片を含み、前記核酸構築物が、VDJ再構成用の組換えシグナル配列を含むイントロンを含む、核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、少なくとも1つの種に由来するゲノムラクダV断片を含む、請求項127に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、少なくとも2つの種に由来するラクダV断片を含む、請求項127に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、少なくとも3つの種に由来するラクダV断片を含む、請求項127に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、少なくとも4つの種に由来するラクダV断片を含む、請求項127に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、少なくとも1つのラクダ種に由来するD及びJ断片を含む、請求項127から131のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、少なくとも2つのラクダ種に由来するD及びJ断片を含む、請求項127から131のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、1つから少なくとも7つのアルパカD遺伝子断片を含む、請求項127から133のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、1つから少なくとも7つのアルパカJ遺伝子断片を含む、請求項127から134のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、1つから少なくとも7つのフタコブラクダD遺伝子断片を含む、請求項127から135のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、1つから少なくとも7つのフタコブラクダJ遺伝子断片を含む、請求項127から136のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、1つから少なくとも6つのアルパカV遺伝子断片を含む、請求項127から137のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、1つから少なくとも10個のフタコブラクダV遺伝子断片を含む、請求項127から138のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、1つから少なくとも10個のラマV遺伝子断片を含む、請求項127から139のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、1つから少なくとも6つのヒトコブラクダV遺伝子断片を含む、請求項127から140のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸が、5'→3'に、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む、請求項127から141のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸が、5'→3'に、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む、請求項127から142のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸が、5'→3'に、ラマVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む、請求項127から143のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸が、5'→3'に、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む、請求項127から144のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸が、5'→3'に、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む、請求項127から145のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸が、5'→3'に、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、フタコブラクダD断片、フタコブラクダJ断片、並びにアルパカJ断片を含む、請求項127から146のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸が、5'→3'に、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダD断片、並びにフタコブラクダJ断片を含む、請求項127から147のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸が、5'→3'に、アルパカVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、ヒトコブラクダVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む、請求項127から148のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸が、5'→3'に、アルパカVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、ヒトコブラクダVH及び/又はVHH断片、ラマVH及び/又はVHH断片、フタコブラクダVH及び/又はVHH断片、アルパカVH及び/又はVHH断片、アルパカD断片、並びにアルパカJ断片を含む、請求項127から149のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、5'末端又は3'末端にマウスVH断片を含む、請求項127から150のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、5'末端又は3'末端にマウスVH断片を含まない、請求項127から150のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、人工染色体である、請求項127から151のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 非ヒト胚性幹細胞を改変するため、又はトランスジェニック非ヒト動物を作製するための、請求項127から152のいずれか一項に記載の核酸構築物の使用。
- 請求項127から154のいずれか一項に記載の核酸構築物により改変された単離非ヒト胚性幹細胞。
- 請求項1から109のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞。
- 免疫グロブリン重鎖(IgH)遺伝子座において生殖系列改変を含む単離非ヒト胚性幹細胞であって、前記IgH遺伝子座が、a)未再構成の重鎖可変(V)、多様(D)、及び結合(J)遺伝子断片、並びにb)機能性CH1ドメインを欠く少なくとも1つのIgG定常領域遺伝子を含み、前記D及び/又はJ遺伝子断片が、ラクダD及び/又はJ遺伝子断片を含む、単離非ヒト胚性幹細胞。
- 単離非ヒト胚性幹細胞が、マウス胚性幹細胞であり、前記改変が、a)内在性マウスV遺伝子断片の1つ若しくは複数の、1つ若しくは複数の未再構成ラクダV遺伝子断片での置換、又は未再構成ラクダV遺伝子断片の挿入、b)内在性マウスD及びJ断片の少なくとも1つ又はすべての、ラクダD及びJ断片での置換、並びにc)内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、及びγ3遺伝子から発現するポリペプチドが機能性CH1ドメインを含まないような、前記内在性マウスγ1、γ2a、γ2b、及びγ3遺伝子の少なくとも1つ又はすべてのCH1ドメインの欠失又は改変、を含む、請求項157に記載の単離非ヒト胚性幹細胞。
- 単離非ヒト胚性幹細胞が、マウス胚性幹細胞であり、前記改変が、内在性γ3遺伝子、γ1遺伝子、γ2b遺伝子、及びγ2a遺伝子の各々のCH1ドメインの欠失、内在性マウスD及びJ遺伝子断片の、未再構成ラクダD及びJ遺伝子断片での置換、複数のラクダ種に由来するラクダV遺伝子断片の挿入、並びに場合により、少なくとも1つ又はすべての内在性マウスV遺伝子断片の欠失、を含む、請求項157に記載の単離非ヒト胚性幹細胞。
- トランスジェニック非ヒト動物の作製における、請求項155又は157から159のいずれか一項に記載の非ヒト胚性幹細胞の使用。
- トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、前記方法が、請求項155又は157から159のいずれか一項に記載の非ヒト胚性幹細胞をマウス胚盤胞に注入する工程、マウス胚を、偽妊娠マウスに移植する工程、及び生殖系列改変を有するマウス子孫を選択する工程を含む、方法。
- 請求項127から153のいずれか一項に記載の核酸構築物の使用を含む、トランスジェニック動物を作製する方法。
- 核酸構築物を幹細胞に導入する工程を含むトランスジェニック動物を作製する方法であって、前記核酸が、ゲノムラクダD及び/又はJ断片を含み、並びに場合により、ゲノムラクダV断片を含み、前記核酸構築物が、VDJ再構成用の組換えシグナル配列を含むイントロンを含む、方法。
- 前記核酸が、少なくとも2つ、3つ、又は4つの異なる種に由来するV、D、及び/又はJ遺伝子配列を含む、請求項163に記載の方法。
- 前記核酸が、少なくとも2つ、3つ、又は4つのラクダ種に由来するV、D、及び/又はJ遺伝子配列を含む、請求項163に記載の方法。
- 請求項127から153のいずれか一項に記載の核酸構築物を用いて遺伝子改変した胚性幹細胞を微量注入した胚盤胞を、偽妊娠マウスに移植する工程、同腹仔からキメラマウスを選択する工程、及び場合により、キメラマウスを野生型マウスと戻し交配することにより、F1ヘテロ接合型動物を生成する工程、及び場合により、F1動物を交配することにより、F2ホモ接合型動物を生成する工程を含む、トランスジェニックマウスを作製する方法。
- 請求項154又は157から159のいずれか一項に記載の胚性幹細胞を微量注入した胚盤胞を移植する工程、同腹仔からキメラマウスを選択する工程、及び場合により、キメラマウスを野生型動物と戻し交配することにより、F1ヘテロ接合型動物を生成する工程、及び場合により、F1動物を交配することにより、F2ホモ接合型動物を生成する工程を含む、トランスジェニックマウスを作製する方法。
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