JP2023535183A - 脂質小胞の調製方法 - Google Patents

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Abstract

第１の液相を第２の液相に分散させることを含む、脂質小胞の調製方法を記載する。第１の液相は脂質相を含み、第２の液相は水相を含み；又は第１の液相は水相を含み、第２の液相は脂質相を含む。本方法は第１の流れ方向で複数の細孔を画成する膜に第１の液相を提供することを制御することと；複数の細孔を通って、第１の流れ方向と直交する流れで膜に第２の液相を提供することを制御して脂質小胞懸濁液を形成することとを含む。【選択図】なし

Description

本発明は新規の脂質小胞の調製方法に関する。
より具体的には、本発明は治療分野での使用のため、特に生物活性剤、例えば治療剤（薬物）、ｍＲＮＡ（ワクチン）などの送達のための脂質小胞の調製方法に関する。
リポソーム及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は構造が類似しているが、組成及び機能はわずかに異なる。どちらも脂質ナノ製剤であり、優れた薬物送達担体であり、脂質の保護外層内でペイロードを輸送する。
従来のリポソームは、水性コア又はポケットを囲む１つ又は複数の脂質二重層の環を含む。
ＬＮＰはリポソーム様構造であるが、すべてのＬＮＰが脂質小胞又はリポソームとされるであろう切れ目のない二重層を有するわけではない。一部のＬＮＰはミセル様構造を採っており、非水性コアにペイロード分子をカプセル化する。
ＬＮＰは幅広い核酸（ＲＮＡ及びＤＮＡ）のカプセル化に特に適合されており；従って、例えばワクチン送達で用いられる最も一般的な非ウイルス遺伝子送達システムである。
一般的に、ワクチンは低用量の特異的な抗原又は抗原剤を使用して宿主の抵抗性を高めるため、宿主はより高用量の抗原又は類似の抗原剤の効果に抵抗できる。
ワクチンで使用される抗原は、通常抗体の産生を誘発する生物全体又は変性毒素（トキソイド）の一部である。しかし、多くの場合、ワクチンで使用される抗原は標的と構造的に異なるため、産生される抗体の一部のみが標的生物又は毒素に結合する。
従来のワクチンは弱毒化及び不活化した病原体を使用している。しかし、最近では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ワクチンが、従来のワクチンの代案として開発されている。ｍＲＮＡの使用は、従来のワクチンと比べ、いくつかの有益な特徴を有する。ｍＲＮＡは非感染性のプラットホームであるため、感染の潜在的なリスクはなく；ｍＲＮＡは正常な細胞プロセスにより分解される。また、ｍＲＮＡワクチンは迅速、安価で拡大可能な製造の可能性を有する。ワクチンは一般的に治療的核酸、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、プラスミド、免疫刺激性核酸、アンタゴミル、アンチミル、模倣体、スーパーミル及びアプタマーを含む。しかし、生体システムにおける所望の応答に作用する核酸の送達には、多くの課題がある。核酸を用いた治療は非常に大きな可能性を有するが、この可能性を実現するために、細胞又は生物内の適当な部位に核酸をより効果的に送達する必要性がある。抗原の生物学的利用能は限られるため、ワクチン開発は制限される。
抗原剤の送達、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）ワクチン探索への関心が増している。ＭｃＫａｙらは、独自の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物内にカプセル化され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする自己増幅ＲＮＡを含むワクチンの研究を報告している。このＬＮＰは平均流体力学的径が約７５ｎｍ、多分散性指数が＜０．１であった。ＭｃＫａｙはこれを開発し、迅速に拡大できる必要性があると考えている。
ワクチン送達システムとしてのＬＮＰの重要な利点は、抗原をコードする遺伝物質を分解から保護する、遺伝物質の放出を制御する、細胞取込を高める、及び抗原特異的免疫応答を改善する能力である。
脂質小胞は、ＲＮＡ送達システムを含む抗癌薬物；抗生物質、遺伝子療法、麻酔薬及び抗炎症薬物など、治療剤の送達のため、製薬産業において関心がもたれている。大きさ、電荷、及び膜流動性など、脂質小胞の物理化学的性質は、ペイロードを良好に送達する能力を改善するように変更できる。
非経口薬物送達担体としてのリポソームは、現在製薬産業で利用されている。リポソームは、（他の状態のうち）癌、黄斑変性及び真菌感染症を治療する治療剤を送達するのに有用であることが証明されている。現在まで、これらの異なる用途に適合した様々なリポソーム型があり、遺伝子送達、ｓｉＲＮＡ送達、タンパク質／ペプチド送達及び小分子送達など、様々な種類の治療薬の送達を含む。用途及び標的に応じて、脂質型／組成など、リポソーム製剤に差異があり、大きさ、電荷、及び膜流動性など、リポソームの物理化学的性質に影響する。これらは所望の標的に到達し、ペイロードを送達する能力を改善するように変更できる。
一般的にリポソームは、両親媒性脂質がリン脂質及び水間の相互作用による結果として、自発的に二層小胞になるときに形成される。これらの脂質小胞は親油性及び親水性部分を有するため、リン脂質二重層（疎水性物質）又は水性部分（親水性物質）のどちらかにおいて、或いは二重層界面で異なる極性を有する物質を捕捉できる。これにより、リン脂質の物理化学的性質を変更でき、捕捉された化合物の生物活性を強化できる。
流体力学半径（大きさ）、ゼータ電位、脂質パッキング、カプセル化効率、及び（ポリマーコーティングなどの）外部修飾など、リポソームの性質は有効な薬物送達システムを作るのに重要である。リポソームのインビボ応用を考慮すると、リポソームの正確な大きさは、身体の異なる位置にリポソームを送達するために不可欠な性質の１つである。例えば、おおよその直径が＜１００ｎｍであるリポソームは、血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果の結果として癌部位に蓄積することが知られており、一方非常に小さなリポソーム又はより大きなリポソームは、それぞれ身体のどこかでろ過されるか、又は取り込まれる。
リポソームは大きさ及びラメラ状態により分類できる。
多層小胞（ＭＬＶ）：１～５μｍ
大型単層小胞（ＬＵＶ）：１００～２５０ｎｍ
小型単層小胞（ＳＵＶ）：２０～１００ｎｍ
一般的に、多層小胞（ＭＬＶ）は比較的予測できない、及び／又は無制御形態であり、コア体積が小さいために効果的な親水性薬物担体ではない。例えばワクチンなど、薬物送達に最も望ましいリポソームはＬＵＶ及びＳＵＶである。
リポソームの性質は製剤の加工条件に非常に依存し、これらの加工条件における任意の変更により最終製剤が異なる。従って、ユーザの要求に基づきリポソームを正確に、予測的に作製でき、拡大できる製造システムを開発することは重要である。上記でＭｃＫａｙにより考えられたように、迅速に拡大可能な抗原輸送リポソーム作製の必要性がある。
複数の技術がリポソーム調製に関する文献に報告されている。エタノール注入は、リポソームを作製するのに最も頻繁に使用される技術の１つである。エタノール注入技術において、脂質のエタノール溶液を針で水性媒体、通常緩衝システムに迅速に注入し、媒体にリン脂質を分散させる。水相にエタノールを即時に希釈すると、脂質分子が沈殿し、二層平面断片を形成し、更にリポソーム系に変形する。ある程度希釈されるが、これは適度に均質な小胞群を提供する穏やかな手順である。エタノール注入法は最初にＢａｔｚｒｉ及びＫｏｒｎ（Ｂａｔｚｒｉ Ｓら「Ｓｉｎｇｌｅ ｂｉｌａｙｅｒ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９７３；２９８（４）；１０１５－１０１９）により１９７０年代初期に報告された。
米国特許出願公開第２００４／００３２０３７号明細書（Ｐｏｌｙｍｕｎ）は、エタノール注入法を用いた脂質小胞の作製方法を記載している。前記特許出願に記載された方法において、保存容器からパイプシステムに極性（水性）相をポンプで供給する。パイプシステムは、保存容器と連結し、１つ又は複数のパイプを含む。極性相が通過し、保存容器から供給する各パイプは、所定の点で側面に配置された少なくとも１つの孔又は開口部を含み、これはパイプ壁を通り、外部で好適な溶媒に溶解された脂質相を圧力制御供給するための少なくとも１つのフィードパイプと連結される。ここに記載される方法は、機械的撹拌又は分散助剤の作用を使用することなく、狭い粒度分布を有する単層小胞を作り出す。
欧州特許出願公開第３７１１７４９号明細書（Ｐｏｌｙｍｕｎ）は平均直径が１００ｎｍ未満である脂質ナノ粒子の作製方法を記載しており、第１のＨＰＬＣポンプにより第１管を通して水性バッファ溶液をポンプで供給することと、第２のＨＰＬＣポンプにより第２管を通して有機脂質溶液をポンプで供給することとを含み、第２管は混合モジュール内において第１管と垂直に交差し、有機脂質溶液は混合モジュール内において乱流で水溶液と混合される。
中国特許出願公開第１０３６３７９９３号明細書は、膜乳化技術を使用した単分散でナノメートルの硫酸セフキノキシムリポソームの調製を記載している。
国際公開第２０１９／０９２４６１号は、第１の相を第２の相に膜を通して分散させることにより、懸濁液又は分散を作製するクロスフロー装置を記載している。
米国特許出願公開第２００４／００３２０３７号明細書 欧州特許出願公開第３７１１７４９号明細書 中国特許出願公開第１０３６３７９９３号明細書 国際公開第２０１９／０９２４６１号 国際公開第２０１２／０９４５９５号 米国特許第６，５０６，９０６号明細書
Ｂａｔｚｒｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ"Ｓｉｎｇｌｅ ｂｉｌａｙｅｒ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ"Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９７３；２９８（４）；１０１５－１０１９ Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３ｒｄ Ｅｄ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃ．ＮＹ（１９９７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）９：２２１５－２２３５
従って、リポソーム及びＬＮＰなどの脂質小胞を特に穏やかに作製する方法及び装置の必要性があり、この方法及び装置は拡大でき、任意に連続プロセスでよい。この方法は、再現可能な均一に分散したリポソーム小胞の調製を提供する。
このように、本発明はエタノール注入など、確立された方法を利用し、脂質小胞の拡大した及び／又は連続した作製を行う。
更に、驚くべきことに、管状膜を利用するクロスフロー膜乳化装置（ＡＸＦ）は、脂質小胞の作製に好適に使用できることが見出されている。
本発明の第１の態様によれば、第１の液相を第２の液相に分散させることを含む、脂質小胞の調製方法を提供する。
第１の液相は脂質相を含み、第２の液相は水相を含み；又は第１の液相は水相を含み、第２の液相は脂質相を含む。
本方法は、第１の流れ方向で複数の細孔を画成する膜に第１の液相を提供することを制御することと；複数の細孔により、第１の流れ方向と直交する流れで、膜に第２の液相を提供することを制御して脂質小胞懸濁液を形成することとを含む。
本発明の１つの態様において、第１の液相は脂質相を含み、第２の液相は水相を含む。
本発明の別の態様において、第１の液相は水相を含み、第２の液相は脂質相を含む。
本発明の方法により作製される脂質小胞は、リポソーム又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）でよい。本発明の１つの態様によれば、脂質小胞はリポソームである。本発明の別の態様によれば、脂質小胞はＬＮＰである。
本発明の更なる態様によれば、第１の液相を第２の液相に分散させることを含む、脂質小胞の調製方法を提供する。第１の液相は脂質相を含み；
本方法は、第１端部に第１入口；脂質小胞の出口；及び第１入口から遠く、第１入口に傾斜した第２入口を備えた外部管状スリーブと、
複数の細孔を備え、管状スリーブ内部に配置されるように適合された管状膜と、
任意に管状膜内部に位置するように適合されたインサートであって、入口端部及び出口端部を含み、入口端部及び出口端部のそれぞれは面取り領域を備え、面取り領域は複数の開口部及び分岐プレートを備えるインサートと、
を含むクロスフロー乳化装置（ＡＸＦ）を使用する。
本方法は、管状膜に第１の液相を提供することを制御することと、複数の細孔により、第２の液相を管状膜に提供することを制御して、脂質小胞懸濁液を形成することとを含む。
本発明の１つの態様において、第１の液相は脂質相を含み、第２の液相は水相を含む。
本発明の別の態様において、第１の液相は水相を含み、第２の液相は脂質相を含む。
本発明の本方法によれば、本発明の方法により作製される脂質小胞はリポソーム又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）でよい。本発明の１つの態様によれば、脂質小胞はリポソームである。本発明の別の態様によれば、脂質小胞はＬＮＰである。
本発明の更なる態様によれば、水相は１つ又は複数の活性剤を含んでよい。本発明の本態様において、脂質小胞の調製方法の生成物は、水性コアをカプセル化する脂質二重層を含む脂質小胞組成物である。水性コアは１つ又は複数の活性剤を含んでよいか、又は脂質小胞はアンローディング及びその後のローディング（アクティブローディング）により作製されてよい。活性剤のローディングは、活性剤が脂質小胞の形成中にカプセル化されるパッシブローディング；又は活性剤が脂質小胞の形成後にローディングされるアクティブローディングのどちらかにより達成できる。
このように、本発明の１つの態様によれば、脂質小胞はローディングで作製される（パッシブローディング）。
本発明の別の態様によれば、脂質小胞はアンローディング及びその後のローディングにより作製される（アクティブローディング）。
例えば、親水性活性剤は脂質小胞の内部及び外部の水相に均一に分散され；一方疎水性活性剤は小胞形成中に脂質小胞に直接組み合わせることが可能であり、取り込み及び保持の量は活性剤／脂質の相互作用により決定される。
アクティブローディングにおいて、膜内外の勾配を含む、つまり脂質小胞内部及び外部の相が異なる脂質小胞が生成される。続いて外相に溶解された活性剤が、脂質小胞壁を透過できる。膜内外の勾配はｐＨ勾配、濃度勾配、イオン勾配などでよい。イオン勾配を使用するアクティブローディングは、例えば硫酸アンモニウムを利用することにより、硫酸イオン勾配を含むことが多い。例えば透析又は限外ろ過により、脂質小胞が形成されている第１バッファを第２バッファで置き換えることでイオン勾配を達成できる。第１バッファが形成された脂質小胞の内部に依然として存在するため、第２バッファの添加、その後の懸濁液の濃縮により勾配を示す。
ローディング、つまりアクティブ又はパッシブローディングの選択は、水相バッファの選択に影響を及ぼし得る。
例えばクエン酸などの酸性バッファ（ｐＨ４）で系を実行し、このバッファを異なるｐＨ、例えばより高いｐＨの好適な水相バッファで置き換えることによりｐＨ勾配を達成できる。好適な水相バッファの例としては、限定されないがＭＥＳ（２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸）、クエン酸、リン酸、酢酸、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）及びＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）；並びにその組合せが挙げられる。
活性剤は、脂質小胞の脂質部分、又は脂質小胞の脂質部分の一部若しくはすべてにより覆われた水性空間でカプセル化されてよく、これにより例えば酵素分解から活性剤を保護する。
本発明の本態様によれば、本発明の方法により作製される脂質小胞は、リポソーム又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）でよい。本発明の１つの態様によれば、脂質小胞はリポソームである。本発明の別の態様によれば、脂質小胞はＬＮＰである。脂質小胞がリポソームである場合、溶媒相は水相を含んでよい。脂質小胞がＬＮＰを含む場合、溶媒相は非水性溶媒相を含んでよい。
１つ又は複数の活性剤が親水性である場合、溶媒相は水相を含んでよい。１つ又は複数の活性剤が疎水性である場合、疎水性活性剤は脂質相にあり、脂質は疎水性溶媒、例えば有機溶媒に溶解される。脂質小胞内部の水相は本質的に活性剤を有さない。
任意の従来公知の可溶性活性剤は、本発明の方法によりカプセル化されてよいことを当業者は理解するであろう。しかし、本発明の具体的な実施形態において、１つ又は複数の活性剤は治療剤（薬物）、ワクチンなどの生物活性剤である。本発明の１つの態様において、生物活性剤は治療的核酸、例えば抗原をコードするものでよい。治療的核酸としては、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、プラスミド、免疫刺激性核酸、アンタゴミル、アンチミル、模倣体、スーパーミル及びアプタマーが挙げられる。好適な抗原は、宿主生物で免疫応答を産生できる任意の化学物質である。抗原は、宿主生物で所望の免疫応答を産生できる好適な天然、非天然、組換又は変性タンパク質又はペプチド、或いはその断片でよい。宿主生物は好ましくは（哺乳動物を含む）動物であり、より好ましくはヒトである。抗原はウイルス、細菌、原生動物又は哺乳類由来のものでよい。抗原は、宿主生物で免疫応答を誘発させる任意の化学物質（典型的にタンパク質又は他のペプチド）であることが一般的に知られている。より具体的には、抗原が宿主生物に導入されると、宿主に抗体を産生させるＢ細胞で抗体に結合する。抗原及び免疫応答の一般的な考察については、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３ｒｄ Ｅｄ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃ．ＮＹ（１９９７）を参照のこと。
本発明の脂質小胞、例えばリポソーム又はＬＮＰは単一の脂質又は脂質の混合物から形成できる。
多くの従来の医薬品は、正電荷又は負電荷脂質；及びその任意の組合せと共に、中性脂質小胞を使用して送達できることが、当業者に理解されるであろう。このような中性構造脂質の例としては、限定されないがスフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）、Ｌ－α－水添ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）及び１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）など；並びにその組合せが挙げられる。
脂質小胞及びリポソーム粒子は通常、多層小胞（ＭＬＶ）；小型単層小胞（ＳＵＶ）；及び大型単層小胞（ＬＵＶ）の３つのグループに分けられる。ＭＬＶは各小胞に多数の二重層を有し、複数の分かれた水性区画を形成する。ＳＵＶ及びＬＵＶは水性コアをカプセル化する単一の二重層を有し；ＳＵＶは典型的に直径が１００≦ｎｍであり；ＬＵＶは直径が＞１００ｎｍである。
本発明の脂質小胞は、好ましくは直径が５０～２２０ｎｍの範囲であるＳＵＶ又はＬＵＶでよい。直径が異なるＳＵＶ又はＬＵＶ群を含む組成物について；（ｉ）少なくとも８０％が２０～２２０ｎｍの範囲の直径を有するべきである；（ｉｉ）その群の平均直径は４０～２２０ｎｍの範囲が理想である、及び／又は（ｉｉｉ）直径は多分散性指数（ＰＤＩ）が≦０．３、例えば約０．０２～約０．３、好ましくは０．０２～０．２であるべきである。脂質小胞は実質的に球状でよい。
様々な両親媒性脂質は水性環境で二重層を形成でき、例えば１つ又は複数の治療的核酸を含有する溶媒コアを有する脂質小胞をカプセル化する。これらの脂質はアニオン、カチオン、両性イオン又はイオン化可能（変動する電荷）な親水性頭部基を有することが可能である。核酸の送達のために本発明の方法により調製される脂質小胞は、ｐＫａが５．０～７．６の範囲である脂質を含んでよい。この範囲のｐＫａを有する脂質の一部は、第３級アミンを含んでよい。例えば、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン又は１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンを含んでよい。第３級アミンを有する別の好適な脂質は、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎジメチル－３－アミノプロパンである。核酸の送達のため、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）又はＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン）などのカチオン性脂質を好適に使用してよい。
特に有用な脂質小胞はリン脂質を使用し、脂質小胞製剤に非エステル化コレステロールを任意に含んでよい。非エステル化コレステロールは、脂質小胞を安定させるのに使用してよく、脂質小胞を安定させる任意の他の化合物によりコレステロールを置き換えてよい。他の脂質小胞を安定させる化合物は当業者に公知である。安定した脂質小胞の使用は、核酸と脂質小胞との間の静電気的結合を限定し得る。結果として、多くの核酸は、脂質小胞の内部で隔離され得る。
脂質小胞の調製に好ましく用いられるリン脂質は、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホコリン及びホスホイノシトールからなる群から選択される少なくとも１つの頭部基を有するものである。
本発明の１つの態様において、脂質小胞は脂質部分及びポリマー部分のどちらも含んでよく、例えばペグ化脂質小胞である。「ペグ化脂質」は、脂質部分及びポリエチレングリコール部分のどちらも含む脂質又は脂質小胞を具体的に指す。脂質及びポリエチレングリコール以外のポリマー部分を含む脂質小胞は、本発明の範囲内であることが当業者に理解されるであろう。ペグ化脂質としては、限定されないが１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ペグ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、例えば１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧスクシナートジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、例えば４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオアート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、ペグ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバマート、例えばω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバマート又は２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル－Ｎ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバマート又はジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）２０００］；及びその組合せが挙げられる。
脂質小胞を形成するのに使用する脂質の量は、使用される活性剤に依存するが、典型的に例えばワクチンの用量あたり約０．０１ｇ～約０．５ｇの範囲である。使用する脂質の量は用量あたり約０．１ｇでよい。非エステル化コレステロールが脂質小胞製剤で使用される場合も、コレステロール又はコレステロール以外の安定化化合物の好ましい量は、当業者により容易に決定できる。
好適な脂質小胞を調製する技術は、当技術分野で周知である。１つの方法は、脂質のエタノール溶液を活性剤の水溶液と混合することを含む。この技術は溶媒－水混和性に依存するため、他の水混和性溶媒、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノールなどのＣ１－Ｃ６アルカノールを好適に使用し得ることが当業者に理解されるであろう。
本発明の方法は、ナノスケール脂質小胞の製剤、特に脂質小胞の実質的に均一な粒度を含み、直径が約２２０ｎｍしかないものを大規模商業生産することに対応できる。例えば、９０％超（体積で重み付け、例えば動的光散乱法で測定する）の脂質小胞は約２２０ｎｍ未満；又は９９％超は約２２０ｎｍ未満である。このような大きさで分けられた粒子は業界で承認された臨床製造規格に従って容易にろ過滅菌できる。
このような均一に大きさで分けた脂質小胞の調製は、有機溶媒の濃度を制御することにより本発明に従って行うことが可能であり、濃度を基本的に脂質小胞の形成時及び形成後に一定に保つ。溶媒濃度を制御することにより、脂質溶液及び溶媒（脂質小胞形成に使用するのに好適な水性又は非水性溶媒）から形成される脂質小胞粒子の大きさを制御できる。混合／脂質相添加中に溶媒濃度を制御することにより、脂質小胞の大きさを制御できる。連続プロセスにおいて、これを流量比（ＦＲＲ）と呼ぶ場合がある。ＦＲＲは重要なプロセス属性である。高い溶媒濃度では、脂質小胞は柔軟性があり／変わりやすい場合があるため、脂質小胞の大きさを定めるために、希釈を使用して溶媒濃度を低下させてよい。これを希釈の使用と組み合わせ、ＲＮＡ種のアクティブローディング用のバッファシステムを変化させ得る。
一般的に、溶媒の極性低下により、つまりＦＲＲを低下させることで脂質小胞を大きくする。例えば、脂質小胞の調製プロセスは、水性：有機比約１：１で実施し得る。従って、エタノールなどの有機溶媒が多く、作製する溶媒：水混合系の全体の極性が低いほど、大きな脂質小胞が作られる。更に、溶媒の極性増加は、脂質を徐々に不溶性とし、自己集合させて平面脂質二重層とする。
本発明の方法において、クロスフロー膜乳化は連続相フローを使用しており、膜細孔を通過する分散相フローを押し流し、均一に混合する。これは、脂質小胞作製に乱流を使用する公知の従来技術のシステムと対照をなす。混合又はミクロ混合は相の制御した混合を含む。
脂質小胞の出口の位置は、分散相フローの方向、つまり膜内部から外部又は膜外部から内部に応じて変わり得る。分散相フローが膜の外部から内部であれば、脂質小胞の出口は一般的に管状スリーブの第２端部である。分散相フローが膜内部から外部であれば、脂質小胞の出口は側枝か、又は端部にあり得る。
本発明の１つの態様において、クロスフロー装置は本明細書に記載されるインサートを含み、第１入口は連続相の第１入口であり、第２入口は分散相の入口であり；従って分散相は管状膜の外部から内部に移動する。
本発明の別の態様において、クロスフロー装置はインサートを含まず、第１入口は分散相の第１入口であり、第２入口は連続相の入口であり；従って分散相は管状膜の内部から外部に移動する。
本発明の１つの態様において、分散相は脂質相であり、連続相は溶媒相である。溶媒相は任意に本明細書で定められるように１つ又は複数の活性剤を含んでよい。
本発明の別の態様において、分散相は溶媒相であり、連続相は脂質相である。溶媒相は任意に本明細書で定められるように１つ又は複数の活性剤を含んでよい。
インサートが存在し、管状膜が外部スリーブの内部に配置される場合、インサートと管状膜との間の間隔は所望の層流条件等に応じて変化し得る。一般的に、インサートは管状膜内で中央に位置し、インサート周囲の任意の点に、インサートと膜間との間隔が、等しい又は実質的に等しい寸法の環状部を含む。このように、間隔は例えば約０．０５～約１０ｍｍ（インサートの外壁と膜の内壁との間の距離）、約０．１～約１０ｍｍ、約０．２５～約１０ｍｍ、又は約０．５～約８ｍｍ、又は約０．５～約６ｍｍ、又は約０．５～約５ｍｍ、又は約０．５～約４ｍｍ、又は約０．５～約３ｍｍ、又は約０．５～約２ｍｍ、又は約０．５～約１ｍｍでよい。
管状膜が外部スリーブの内部に配置される場合、管状膜と外部スリーブとの間の間隔は変化し得る。一般的に、管状膜は外部スリーブ内で中央に位置し、管状膜周囲の任意の点に、膜とスリーブとの間の間隔が、等しい又は実質的に等しい寸法の環状部を含む。このように、間隔は例えば約０．５～約１０ｍｍ（膜の外壁とスリーブの内壁との間の距離）、又は約０．５～約８ｍｍ、又は約０．５～約６ｍｍ、又は約０．５～約５ｍｍ、又は約０．５～約４ｍｍ、又は約０．５～約３ｍｍ、又は約０．５～約２ｍｍ、又は約０．５～約１ｍｍでよい。
本発明の別の実施形態において、インサートは、インサートと管状膜との間の間隔が膜の長さに沿って広がるようにテーパ状である。間隔及び広がる量は、テーパ状のインサートの傾き、所望の層流条件／フロー速度、粒度分布等に応じて変わる。テーパの方向に応じて、インサートと管状膜との間の間隔は、膜の長さに沿って広がるか、又は細くなり得ることが、当業者に理解されるであろう。テーパ状のインサートの使用は、好適なテーパが特定の製法及び一連のフロー条件のために層流を一定に保ち得るのに都合がよい。このように、エタノール又は他の溶媒及び脂質濃度が、膜の長さに沿ってその経路を通って増加するため、粘度など流体特性の変化に起因する混合条件の変動を制御するのにテーパ状インサートを使用し得る。
本発明の別の実施形態において、クロスフロー装置は外部管状スリーブの内部に位置する１つ超の管状膜、つまり複数の管状膜を含んでよい。複数の管状膜が提供される場合、各膜はその内部に本明細書に記載されるインサートを任意に有してよい。複数の膜は、互いに平行に配置される膜のクラスタとしてグループ化されてよい。膜は互いに直接接触しないことが望ましい。膜の数は特に作製される材料の性質に応じて変化し得ることが理解されるであろう。このように、単なる例として、複数の管状膜が存在するとき、膜の数は２～１００でよい。
外部管状スリーブの傾斜した第２入口は、一般的に管状スリーブの分岐を含み、管状スリーブの長尺軸と垂直でよい。分岐又は第２入口の配置は変更でき、膜の平面に依存し得る。１つの実施形態において、第２入口の位置は変わり得ることが当業者に理解されるだろうが、分岐又は第２入口の配置に関し、入口及び出口から実質的に等距離である。１つ超の分岐入口を提供することも本発明の範囲内である。例えば、２つの分岐の使用は、好適にプライミングの間の連続相のブリーディング、又は洗浄のためのフラッシング、又は滅菌用排水／通気を可能にする。
外部スリーブの入口及び出口端部は、一般的にシールアセンブリを備える。外部スリーブの入口及び出口端部にあるシールアセンブリは同じ又は異なってよいが、好ましくは各シールアセンブリは同じである。通常のＯリングシールは、シールが必要とされる２面間に圧縮された様々な形状のＯリングを含む。市販のＯリングシールは、標準の寸法を有する異なる溝の選択肢を備えている。各シールアセンブリは、各端部にフランジを備えた管状フェルールを含む。外部スリーブに近接する端部に位置する第１のフランジ（連結する場合）は、Ｏリングシール用の台座として作用する円くぼみを備えてよい。Ｏリングシールが所定の場所にあるとき、Ｏリングシールは、（存在する場合）インサートの端部周辺、及び外部スリーブにおけるくぼみ内に位置するように適合され、クロスフロー装置の任意の要素内から漏れる流体を密封する。しかし、本発明で使用されるＯリングシールは、Ｏリングにより膜がスライドするように、隙間嵌めされるように設計される。この配置は、メンブレンチューブを設置する際の２つの潜在的な問題：
（１）設置中の薄いメンブレンチューブを粉砕する可能性；及び
（２）薄いメンブレンチューブがＯリングの曲面を切断する可能性
を回避するのに都合がよい。
本発明で使用されるＯリングシールを用いると、端部フェルールが外部スリーブに固定される場合、Ｏリングの側面を押しつぶして変形させ、管状膜の外表面及びスリーブの内表面を押し付けてシールを形成する。これは注意深い寸法記入及び許容差を必要とする。
しかし、シールを作製する他の手段を好適に使用し得ることが当業者に理解されるであろう。例えば、特定のトルクで締められたねじ込み型管継手を使用して精密公差の必要性を回避する；又は特定の力に部品を固定し、その後溶接する（プラスチッククロスフロー装置を使用する場合に特に好適であり得る）。
管状膜の内径は変わり得る。特に、管状膜の内径はインサートが存在するかどうかに応じて変わり得る。一般的に、管状膜の内径はかなり小さい。インサートが存在しない場合、管状膜の内径は約１ｍｍ～約１０ｍｍ、又は約２ｍｍ～約８ｍｍ、又は約４ｍｍ～約６ｍｍでよい。管状膜をインサートと共に使用する場合、管状膜の内径は約５ｍｍ～約５０ｍｍ、又は約１０ｍｍ～約５０ｍｍ、又は約２０ｍｍ～約４０ｍｍ、又は約２５ｍｍ～約３５ｍｍでよい。管状膜の内径が大きいほど、注入圧力を低くできる。管状膜の内径の上限は、シリンダが外部注入圧力に対処可能である必要があるため、特にメンブレンチューブの厚さ、及びその厚さを通して変わらない孔を開けられるかどうかに依存し得る。円筒型膜内部のチャンバは通常連続相の液体を含む。
振動膜を使用する膜乳化と対照的に、本発明において、膜、スリーブ及びインサートは全般的に固定されている。
本明細書に記載するように、従来技術において、国際公開第２０１２／０９４５９５号に記載されるものなど、膜は円錐又は凹面形状の膜に細孔を含む。１つの例としては、膜の細孔をレーザで開けることが可能である。レーザで開けた膜細孔又は貫通孔は、細孔直径、細孔形状及び細孔深さが実質的により一様である。細孔の断面は重要となり得、例えば、細孔の出口周辺の鋭く、よく画成された縁が好ましい。妨害物を最小限にし、供給圧力（機械的強度を参照）を低下させ、各細孔から一定の流量を保つために、回旋状のパス（焼結膜に起因するものなど）を避けることが望ましい場合がある。しかし、本明細書で検討するように、内部孔が非円形（例えば長方形溝）又は回旋状（例えば圧力低下を最小限にするためにテーパ状又は階段状の直径）である細孔を使用することは本発明の範囲内である。
膜において、細孔は均一に間隔をあけてよく、又は可変のピッチを有してよい。或いは、膜細孔は列又は周囲内に均一なピッチを有してよいが、別の方向に異なるピッチを有してよい。
膜の細孔は変わり得る。単なる例として、膜の細孔は約１μｍ～約２００μｍ、又は約１μｍ～約１００μｍ、又は約１０μｍ～約１００μｍ、又は約２０μｍ～約１００μｍ、又は約３０μｍ～約１００μｍ、又は約４０μｍ～約１００μｍ、又は約５０μｍ～約１００μｍ、又は約６０μｍ～約１００μｍ、又は約７０μｍ～約１００μｍ、又は約８０μｍ～約１００μｍ、又は約９０μｍ～約１００μｍの細孔直径を有してよい。本発明の更なる実施形態において、膜の細孔は約１μｍ～約４０μｍ、例えば約３μｍ、又は約５μｍ～約２０μｍ、又は約５μｍ～約１５μｍの細孔直径を有してよい。
膜における細孔の形状は実質的に管状でよい。しかし、均一なテーパ状の細孔を有する膜を提供することは、本発明の範囲内である。このように均一なテーパ状の細孔は、その使用により、膜の圧力降下を低下させ、処理量／流動を潜在的に増加させ得ることに都合がよい。直径は本質的に一定であるが、内部孔が非円形（例えば長方形溝）又は回旋状（例えば圧力降下を最小限にするためにテーパ状又は階段状の直径）である膜を提供し、高いアスペクト比を細孔に提供することも本発明の範囲内である。
細孔間距離又はピッチは、特に細孔サイズに応じて変わり；約１μｍ～約５，０００μｍ、又は約１μｍ～約１，０００μｍ、又は約２μｍ～約８００μｍ、又は約５μｍ～約６００μｍ、又は約１０μｍ～約５００μｍ、又は約２０μｍ～約４００μｍ、又は約３０μｍ～約３００μｍ、又は約４０μｍ～約２００μｍ、又は約５０μｍ～約１００μｍ、例えば約７５μｍでよい。
膜の表面空隙率は細孔サイズに依存し、膜の表面積の約０．００１％～約２０％；又は約０．０１％～約２０％、又は約０．１％～約２０％、又は約１％～約２０％、又は約２％～約２０％、又は約３％～約２０％、又は約４％～約２０％、又は約５％～約２０％、又は約５％～約１０％でよい。
細孔の配置は特に細孔サイズ、処理量等に応じて変わり得る。一般的に、細孔はパターン配置でよく、正方形、三角形、線状、円形、長方形又は他の配置でよい。１つの実施形態において、細孔は正方形の配置である。
本発明の装置、特に膜は、ガラス；セラミック；金属、例えばステンレス鋼又はニッケル；フルオロポリマーなどのポリマー／プラスチック；或いはシリコンなど、公知の材料を含んでよいことが理解されるであろう。ステンレス鋼又はニッケルなどの金属、或いはフルオロポリマーなどのポリマー／プラスチックの使用は、特に装置及び／又は膜に、必要に応じてガンマ線照射を含む当技術分野で公知の従来の滅菌技術を使用した滅菌を行うのに都合がよい。フルオロポリマーなどのポリマー／プラスチック材料の使用により、特に装置及び／又は膜は、当技術分野で公知の射出成形技術を使用して製造でき、都合がよい。
本明細書に記載するように、膜にインサートが含まれてよく、一様なフロー分布を促進する。しかし、インサートが存在しなくても、本発明のクロスフロー装置の範囲内である。インサートが存在する場合、連続相又は分散相のフローをいくつかの分岐に分割するように、分岐プレートを適合させてよい。分岐プレートが連続相を分割するか、分散相を分割するかは、連続相フローの方向、つまり連続相が第１入口を流れるか、第２入口を流れるかに依存する。分岐プレート数は変わり得るが、選択される数は一様なフロー分布を引き起こすのに好適であるべきであり、（脂質小胞出口端部に）過剰なせん断を有するべきでない。好ましくは、インサートが存在するとき、分岐プレートは２分岐プレート又は３分岐プレートであり、インサートと膜との間の環状領域内に均一な連続相フローを提供する。最も好ましくは、分岐プレートは３分岐プレートである。
インサートに提供される開口部数は、注入速度等に応じて変わり得る。一般的に、開口部数は２～６でよい。好ましくは、開口部数は３である。
インサート上の面取り領域は、膜内部の所定の位置に位置する場合、インサートを中心に置くことが可能であり、都合がよい。インサートの端部の外周は、管状膜の内径との許容誤差が最小である。これは、インサートを正確に中心に置くことが可能であり、これにより一貫した層流を引き起こす一貫した環状部を提供する。一般的に、面取り領域は浅い面取りを含み、これはフロー分布を均一にし、フローが単にインサートの軸に平行する開口部から入って達成できるよりも断面積が大きなインサートの開口部を使用でき、都合がよい。これは流体速度を低く保ち、従って、不必要な圧力損失、及び出口でのせん断を最小化する。開口部の開始点と管状膜上の多孔質領域の開始点との間の距離は、一様な速度分布を確立できる。環状の深さを提供するようにインサートの半径寸法を選択し、選択される流量に特定の層流を提供する。一般的に、環状領域及び入口／出口管領域よりも大きな総開口部領域を提供するように、軸寸法が設計される。
本明細書に記載するように、脂質小胞の調製における膜乳化技術の使用は、例えば撹拌による乱流の使用；又は層流の使用を含んでよい。本発明の具体的な態様において、膜乳化技術は層流の使用を含み、つまり一般的に任意の乱流を回避するか、又は最小化する。
本明細書に記載するように、脂質小胞の調製における膜乳化技術の使用は、１つ又は複数のポンプシステムの使用を含み得る。膜乳化と共に使用するための任意の従来公知のポンプシステムが好適に使用され得ることが理解されるであろう。しかし、本発明の具体的な態様において、ポンプシステムは歯車ポンプ又は蠕動ポンプ；及びその組合せを含んでよい。
このように得られる脂質小胞は、カプセル化率及び粒度分布（多分散性）のどちらも高い再現性を有する。脂質小胞は、多分散性指数が≦０．３、例えば約０．０５～約０．３でよい。
本発明の方法を使用して、化学条件及び機械力の分布を正確に制御することができ、脂質小胞と等しい長さスケールで一定である。従って、生じる脂質小胞群は粒度がより均一で、従って多分散性が低い。
多分散性は光子相関分光計にレーザ放射源を使用する「準弾性光散乱」技術により測定でき、脂質小胞群の粒度分布、並びにその多分散性を群の均質性の測定パラメータとして提供する。
本発明の１つの態様において、クロスフロー装置は本明細書に記載するようにインサートを含み、第１入口は連続相の第１入口であり、第２入口は分散相の入口であり；従って分散相は管状膜の外部から内部に移動する。
本発明の別の態様において、クロスフロー装置はインサートを含まず、第１入口は分散相の第１入口であり、第２入口は連続相の入口であり；従って分散相は管状膜の内部から外部に移動する。
脂質小胞の分離、精製及び／又は希釈は、任意の好適な方法で実施してもよい。好ましくは脂質小胞をろ過し、より好ましくは脂質小胞を滅菌フィルタによるろ過により分離又は精製する。アクティブローディング及び／又はＲＮＡローディング希釈について、溶媒濃度を低下させるため、又はバッファを置き換えるために、続いて限外ろ過による濃縮を行ってよい。
本発明の方法により調製される脂質小胞、例えばリポソーム及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）などの脂質小胞は、対象に様々な疾患に対する免疫を付与するための医薬組成物における成分として有用である。これらの組成物は典型的に脂質小胞に加えて薬学的に許容可能な担体を含む。
従って、本発明の更なる態様によれば、本明細書に記載の方法により調製される脂質小胞が提供される。本発明の１つの態様によれば、本明細書に記載される方法により調製される脂質小胞はリポソームである。本発明の別の態様によれば、本明細書に記載される方法により調製される脂質小胞はＬＮＰである。
本発明の本態様によれば、脂質小胞は活性剤を更に含んでよい。
本発明の更なる態様によれば、組成物が提供される。本発明の１つの態様によれば、組成物は本明細書に記載されるリポソーム、及び薬学的に許容可能な賦形剤、担体又は希釈剤を含む。本発明の別の態様によれば、組成物は本明細書に記載されるＬＮＰ、及び薬学的に許容可能な賦形剤、担体又は希釈剤を含む。
本明細書に記載するように、本明細書に記載される本発明の方法により調製される脂質小胞は、核酸、例えば抗原をコードするものを好適に含んでよい。従って、細胞によりポリペプチドの発現を調節する方法を更に提供し、本方法は細胞に本明細書に記載する核酸を含むリポソーム又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）などの脂質小胞を提供することを含む。
このように、本発明の特定の態様によれば、核酸は抗原をコードする核酸を含む。従って、本発明は本明細書に記載するように、脂質小胞と、疾患又は病原体に関連する抗原をコードする核酸とを含むワクチンを更に提供する。
単なる例として、本発明の脂質小胞で使用する活性剤は、限定されないが、生物活性剤、例えば薬学的活性剤、ワクチン及び殺虫剤を含む。生物活性化合物は、例えば植物栄養物質又は植物成長抑制剤を含んでもよい。或いは、活性剤は植物栄養物質、食品香味料、香料等の非生物活性剤でよい。
薬学的活性剤は、直接的又は間接的に１つ又は複数の物理、化学及び／又は生物学的効果をインビトロ及び／又はインビボで引き起こせる天然、合成又は半合成材料（例えば、化合物、発酵物、抽出物、細胞構造）を指す。このような活性剤は、例えば寄生生物を破壊することにより、或いは宿主又は寄生虫の生理機能を物質的に変化させることで疾患又は異常の作用を制限することにより、生体の異常な及び／又は病的状態を予防、緩和、治療及び／又は治すことが可能となり得る。このような活性剤は、生理的身体機能を維持、増加、減少、制限又は破壊することが可能となり得る。活性剤は、インビトロ及び／又はインビボ検査により生理的状態又は状態を診断することが可能となり得る。活性剤は動物又は微生物を引きつける、無力化する、阻害する、殺す、変化させる、撃退する及び／又は妨害することにより、環境又は生体を制御又は保護することが可能となり得る。活性剤は他には身体を処理する（臭気を取り除く、保護する、飾る、整えるなど）ことが可能となり得る。効果及び／又はその用途に応じて、活性剤は更に生物活性剤、（予防剤又は治療剤などの）医薬品、診断剤、栄養補助食品及び／又は化粧剤と呼ばれる場合があり、限定されないがプロドラッグ、アフィニティ分子、合成有機分子、ポリマー、分子量が（１．５ｋＤ以下又は１ｋＤ以下など）２ｋＤ以下である分子、高分子（分子量が２ｋＤ以上、好ましくは５ｋＤ以上のものなど）、タンパク性化合物、ペプチド、ビタミン、ステロイド、ステロイド類似体、核酸、炭水化物、これらの前駆体及びこれらの誘導体を含む。活性剤はイオン、非イオン、中性、正電荷、負電荷又は両性イオンでよく、単一で、又はその２つ以上を組み合わせて使用してよい。活性剤は非水溶性又は水溶性でよい。
本明細書で使用される「高分子」という用語は、三次元（例えば、三次及び／又は四次）構造を提供できる材料を指す。
多様な薬学的活性剤が本発明で利用され得る。このように、薬学的活性剤はポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、小有機活性剤、小無機活性剤及びその混合物の１つ又は複数を含んでよい。
ポリヌクレオチド活性剤は、オリゴヌクレオチド、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、組換ＤＮＡ構築物、発現ベクター、及びその混合物の１つ又は複数を含んでよい。本発明の脂質小胞送達システムは、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質などの活性剤のインビボ又はインビトロ送達に有用であり得る。ペプチドはホルモンなどのシグナル伝達分子、神経伝達物質又は神経修飾物質でよく、受容体、酵素又は核酸結合タンパク質などの大きな分子の活性断片でよい。タンパク質は酵素、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質又は転写因子などの核酸結合タンパク質でよい。
薬学的活性剤が小有機活性剤を含む場合、薬学的活性剤は治療剤又は診断剤を含んでよい。具体的な実施形態において、小有機活性剤は配列特異的ＤＮＡ結合オリゴマー、複素環ポリアミドのオリゴマー、例えば米国特許第６，５０６，９０６号明細書に開示されるものなどを含んでよい。この米国特許は本明細書に援用される。他の小有機活性剤はＤｅｒｖａｎによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）９：２２１５－２２３５」に開示されるものを含んでよく、これは本明細書に援用される。特定の実施形態において、オリゴマーはＮ－メチルイミダゾールカルボキサミド、Ｎ－メチルピロールカルボキサミド、ベータアラニン及びジメチルアミノプロピルアミドからなる群から選択される単量体サブユニットを含んでよい。
本発明の別の実施形態において、本発明の脂質小胞送達システムは無機活性剤、例えば水酸化アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム等の胃腸治療剤を含んでよい。
本発明の別の実施形態において、１種超のポリヌクレオチドが脂質小胞送達システム内に封入されてよい。このようなポリヌクレオチドは、制御下で多数の遺伝子産物を発現する能力を提供する。特定の実施形態において、少なくとも１つの発現可能な遺伝子産物は膜受容体などの膜タンパク質、最も好ましくはシグナル伝達分子の膜結合受容体である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの発現可能な遺伝子産物は分泌タンパク質などの可溶性タンパク質であり、例えばシグナル伝達タンパク質又はペプチドである。
また本発明は、個体に病原体に対する免疫を付与する方法を提供する。本方法は脂質小胞及び核酸組成物を含む送達システムである脂質ナノ粒子などの脂質小胞と、該個体の細胞を接触させる工程を含んでよい。これにより細胞にヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与し、ヌクレオチド配列は、抗原としての病原体に提示されるエピトープと同一であるか、又は実質的に類似する少なくとも１つのエピトープを含むペプチドをコードする。ヌクレオチド配列は制御配列に動作可能に連結され、核酸分子は個体の細胞で発現できる。別の実施形態において、本発明はトキソイドに対する免疫を産生する方法を提供し、脂質小胞及びトキソイドを含む脂質小胞送達システムを提供する工程と、食細胞を脂質小胞送達システムと接触させる工程と、脂質小胞送達システムの食作用を誘発する工程とを含む。食細胞はマクロファージ、パイエル板のＭ細胞、単球、好中球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、クッパー細胞、肺胞食細胞、腹腔マクロファージ、母乳マクロファージ、ミクログリア、好酸球、顆粒球、メサンギウム食細胞及び滑膜Ａ細胞の１つ又は複数でよい。
本発明の本態様による脂質小胞組成物は、限定されないが抗癌、抗菌及び抗炎症療法；並びに治療遺伝子を含む様々な臨床領域において活性剤の送達に好適であり得る。臨床的に利用可能な脂質小胞製剤は、ドキソルビシン（ドキシル（登録商標））、アムホテリシン（アムビゾーム（登録商標））及び徐放性モルヒネ（ＤｅｐｏＤｕｒ（商標））を含み、本明細書に記載の方法により調製できる。
以下、添付の実施例及び図を参照し、本発明を単なる例として記載する。
アンローディングリポソームの粒度に対する全流量（ＴＦＲ）の効果を示す。 １２０ｍＬ／分の流量におけるアンローディングリポソームの強度基準の粒度分布を示す。 ２６７ｍＬ／分の流量におけるアンローディングリポソームの強度基準の粒度分布を示す。 ５６７ｍＬ／分の流量におけるアンローディングリポソームの強度基準の粒度分布を示す。 アンローディングリポソームの粒度に対する膜細孔直径の効果を示す。 １０μｍの膜細孔直径におけるアンローディングリポソームの強度基準の粒度分布を示す。 ２０μｍの膜細孔直径におけるアンローディングリポソームの強度基準の粒度分布を示す。 ４０μｍの膜細孔直径におけるアンローディングリポソームの強度基準の粒度分布を示す。 それぞれ７ｍｍ、９ｍｍ及び９．５ｍｍのインサート直径におけるアンローディングリポソームの強度基準の粒度分布を示す。 ７ｍｍのインサート直径におけるアンローディングリポソームの強度基準の粒度分布を示す。 ９ｍｍのインサート直径におけるアンローディングリポソームの強度基準の粒度分布を示す。 ９．５ｍｍのインサート直径におけるアンローディングリポソームの強度基準の粒度分布を示す。 ペグ化リポソームの粒度に対する全流量（ＴＦＲ）の効果を示す。 １２０ｍＬ／分の流量におけるペグ化リポソームの強度基準の粒度分布を示す。 ２００ｍＬ／分の流量におけるペグ化リポソームの強度基準の粒度分布を示す。 １，０００ｍＬ／分の流量におけるペグ化リポソームの強度基準の粒度分布を示す。 １２５ｍＬ／分の脂質相流量でＲＮＡアナログを用いてローディングしたＬＮＰの粒度対多分散性指数（ＰＤＩ）を示す。 １２５ｍＬ／分の脂質相流量でＲＮＡアナログを用いてローディングしたＬＮＰの粒度対多分散性指数（ＰＤＩ）を示す。 それぞれ２００ｍＬ／分、３００ｍＬ／分及び５００ｍＬ／分の流量でＲＮＡアナログを用いてローディングしたＬＮＰの粒度対多分散性指数（ＰＤＩ）に対する流量の効果を示す。 それぞれ２００ｍＬ／分、３００ｍＬ／分及び５００ｍＬ／分の流量でＲＮＡアナログを用いてローディングしたＬＮＰの粒度対多分散性指数（ＰＤＩ）に対する流量の効果を示す。
実施例１
アンローディングリポソームの粒度に対する流量の効果
水性ＰＢＳバッファを含む容器を総濃度が２０ｍｇ／ｍＬである脂質及びコレステロールのエタノール溶液を含有する別の容器と共に調製した。
ＡＸＦミクロ混合機を、デバイス筐体、１０μｍの細孔及び正方格子で２００μｍの間隔を有する膜、直径９．５ｍｍのインサートから構成した。
タイゴンチューブ類を使用してどちらの相もポンプで供給するのに蠕動ポンプを使用した。水性バッファ相を９６、２１４及び４５４ｍＬ／分の速度でＡＸＦ膜ミクロ混合機の中心にポンプで供給した。脂質相を２４、５３及び１１３ｍＬ／分の速度でポンプにより装置の上面口に供給し、膜を通して、水相フローに供給した。すべての実験を通して水：有機相の比を４：１で維持した。
生じる２０％エタノール溶液を水性ＰＢＳバッファの添加により更に希釈し、得られる希薄溶液を限外ろ過により濃縮した。
得られる懸濁液を動的光散乱／準弾性光散乱（ＤＬＳ／ＱＥＬＳ）により分析し、強度、Ｚ平均、粒度及びＰＤＩ値を表１及び図１（ａ）～（ｄ）に記録、報告した。
Figure 2023535183000001
実施例２
アンローディングリポソームの粒度及び分布に対する膜細孔サイズの効果
水性ＰＢＳバッファを含有する容器を総濃度が２０ｍｇ／ｍＬである脂質及びコレステロールのエタノール溶液を含有する別の容器と共に調製した。
ＡＸＦミクロ混合機をデバイス筐体、膜及び直径９．５ｍｍのインサートから構成した。細孔直径が１０、２０及び４０μｍの３つの膜を使用した。すべてが正方格子で２００μｍの細孔間隔（ピッチ）を有していた。
タイゴンチューブ類を使用してどちらの相もポンプで供給するのに蠕動ポンプを使用した。水性バッファ相を２４０ｍＬ／分の速度でＡＸＦ膜ミクロ混合機の中心にポンプで供給した。脂質相を４０ｍＬ／分の速度でポンプにより装置の上面口に供給し、膜を通して、水相フローに供給した。水：有機相の比を６：１とした。
生じる約１４％エタノール溶液を水性ＰＢＳバッファの添加により更に希釈し、得られる希薄溶液を限外ろ過により濃縮した。
得られる懸濁液をＤＬＳ／ＱＥＬＳにより分析し、強度、Ｚ平均、粒度及びＰＤＩ値を表２及び図２（ａ）～（ｄ）に記録、報告した。
Figure 2023535183000002
実施例３
アンローディングリポソームの粒度及び分布に対するインサート直径の効果
水性ＰＢＳバッファを含有する容器を総濃度が２０ｍｇ／ｍＬである脂質及びコレステロールのエタノール溶液を含有する別の容器と共に調製した。
ＡＸＦミクロ混合機をデバイス筐体、１０μｍの細孔直径及び正方格子で２００μｍの細孔間隔（ピッチ）を有する膜、並びにインサートから構成した。直径が７．０ｍｍ、９．０ｍｍ及び９．５ｍｍの３つのインサートを使用した。
タイゴンチューブ類を使用してどちらの相もポンプで供給するのに蠕動ポンプを使用した。水性バッファ相を２４０ｍＬ／分の速度でＡＸＦ膜ミクロ混合機の中心にポンプで供給した。脂質相を４０ｍＬ／分の速度でポンプにより装置の上面口に供給し、膜を通して、水相フローに供給した。水：有機相の比を６：１とした。
生じる約１４％エタノール溶液を水性ＰＢＳバッファの添加により更に希釈し、得られる希薄溶液を限外ろ過により濃縮した。
得られる懸濁液をＤＬＳ／ＱＥＬＳにより分析し、強度、Ｚ平均、粒度及びＰＤＩ値を表３及び図３（ａ）～（ｄ）に記録、報告した。
Figure 2023535183000003
実施例４
ペグ化リポソームの作製
水性ＨＥＰＥバッファ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）を含有する容器を脂質及びコレステロールのエタノール溶液を含有する別の容器と共に調製した。脂質はＨＳＰＣ（Ｓ ＰＣ－３、Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍＢＨ）、ＤＳＰＣ－ｍＰＥＧ２０００（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍＢＨ）、及びコレステロール（シグマアルドリッチ）であり、ＨＳＰＣ／コレステロール／ペグ化脂質のモル比が５６．２／３８．５／５．３、総濃度が１０ｍｇ／ｍＬであった。
ＡＸＦミクロ混合機をデバイス筐体、１０μｍの細孔及び正方格子で２００μｍの間隔を有する膜、並びに９．５ｍｍのインサートから構成した。
タイゴンチューブ類を使用してどちらの相もポンプで供給するのに蠕動ポンプを使用した。両相とも脂質のＴｃを超えていた。水性バッファ相を９０ｍＬ／分、１５０ｍＬ／分及び７５０ｍＬ／分の速度でＡＸＦ膜ミクロ混合機の中心にポンプで供給した。脂質相を３０ｍＬ／分、５０ｍＬ／分及び２５０ｍＬ／分の速度でポンプにより装置の上面口に供給し、膜を通して、水相フローに供給した。水：有機相の比を３：１とした。
生じる２５％エタノール溶液を水性ＨＥＰＥバッファの即時添加により更に希釈し、得られる希薄溶液を限外ろ過により濃縮した。
得られる懸濁液をＤＬＳ／ＱＥＬＳにより分析し、強度、Ｚ平均、粒度及びＰＤＩ値を表３及び図４（ａ）～（ｄ）に記録、報告した。
Figure 2023535183000004
実施例５
ＲＮＡアナログを用いてローディングしたＬＮＰの作製における再現性
水性１００ｍＭクエン酸バッファシステム（ｐＨ６）及びＲＮＡアナログのポリＡを含有する容器を脂質のエタノール溶液を含有する別の容器と共に調製した。脂質はカチオン性脂質ＤＤＡＢ、構造脂質ＤＳＰＣ、ペグ化脂質ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００及びコレステロールであり、総脂質濃度が３ｍＭ、ＤＤＡＢ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００のモル比が４０／１０／４８／２であった。窒素とリン酸の比（Ｎ／Ｐ；カチオン性脂質由来の窒素及び核酸由来のリン酸）は６であった。
ＡＸＦミクロ混合機をデバイス筐体、１０μｍの細孔及び正方格子で２００μｍの間隔を有する膜、並びに直径が９．０ｍｍのインサートから構成した。
ＰＦＡ管類を使用してどちらの相もポンプで供給するのに歯車ポンプを使用した。水性バッファ相を３７５ｍＬ／分の速度でＡＸＦ膜ミクロ混合機の中心にポンプで供給した。脂質相を１２５ｍＬ／分の速度でポンプにより装置の上面口に供給し、膜を通して、水相フローに供給した。水：有機相の比は３：１とした。
生じる２５％エタノール溶液を水性バッファの添加により更に希釈し、得られる希薄溶液を限外ろ過により濃縮した。
実験を３回実施し、得られる懸濁液をＤＬＳ／ＱＥＬＳにより分析し、強度、Ｚ平均、粒度及びＰＤＩ値を記録した。核酸ローディングをＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイにより定量した。これらの値を表４及び図５（ａ）～（ｂ）に報告した。
Figure 2023535183000005
実施例６
ＲＮＡアナログを用いてローディングしたＬＮＰ作製における流量の効果
水性１００ｍＭクエン酸バッファシステム（ｐＨ６）及びＲＮＡアナログのポリＡを含有する容器を脂質のエタノール溶液を含有する別の容器と共に調製した。脂質はカチオン性脂質ＤＤＡＢ、構造脂質ＤＳＰＣ、ペグ化脂質ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００及びコレステロールであり、総脂質濃度が３ｍＭ、ＤＤＡＢ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００のモル比が４０／１０／４８／２であった。窒素とリン酸の比（Ｎ／Ｐ；カチオン性脂質由来の窒素及び核酸由来のリン酸）は６であった。
ＡＸＦミクロ混合機をデバイス筐体、１０μｍの細孔及び正方格子で２００μｍの間隔を有する膜、並びに直径９．０ｍｍのインサートから構成した。
ＰＦＡ管類を使用してどちらの相もポンプで供給するのに歯車ポンプを使用した。水性バッファ相をＡＸＦ膜ミクロ混合機の中心にポンプで供給した。脂質相をポンプで装置の上面口に供給し、膜を通して、水相フローに供給した。全流量は１００ｍＬ／分、２００ｍＬ／分、３００ｍＬ／分及び５００ｍＬ／分であった。すべての実施について水：有機相比を３：１に維持した。
生じる２５％エタノール溶液を水性バッファの添加により更に希釈し、得られる希薄溶液を限外ろ過により濃縮した。
実験を３回実施し、得られる懸濁液をＤＬＳ／ＱＥＬＳにより分析し、強度、Ｚ平均、粒度及びＰＤＩ値を記録した。核酸ローディング及びカプセル化効率（ＥＥ）をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイにより定量化した。すべての値を表５並びに図６（ａ）及び（ｂ）に報告した。
Figure 2023535183000006

Claims (99)

  1. 第１の液相を第２の液相に分散させることを含む、脂質小胞の調製方法であって、
    前記第１の液相は脂質相を含み、前記第２の液相は水相を含み、又は前記第１の液相は水相を含み、前記第２の液相は脂質相を含むことを特徴とし、
    第１の流れ方向で複数の細孔を画成する膜に前記第１の液相を提供することを制御することと、前記複数の細孔により、前記第１の流れ方向と直交する流れで前記膜に前記第２の液相を提供することを制御し、脂質小胞懸濁液を形成することとを含む、方法。
  2. 前記第１の液相は脂質相を含み、前記第２の液相は水相を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の液相は水相を含み、前記第２の液相は脂質相を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 前記脂質小胞は、リポソーム又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記脂質小胞はリポソームであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  6. 前記脂質小胞は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  7. 第１の液相を第２の液相に分散させることを含む、脂質小胞の調製方法であって、前記第１の液相は脂質相を含むことを特徴とし、
    前記方法は、第１端部の第１入口、脂質小胞懸濁液出口、及び前記第１入口から遠く、前記第１入口に傾斜した第２入口を備えた外部管状スリーブと、
    複数の細孔を備え、前記管状スリーブ内部に位置するように適合された管状膜と、
    任意に前記管状膜内部に位置するように適合されたインサートであって、入口端部及び出口端部を含み、前記入口端部及び出口端部のそれぞれは面取り領域を備え、前記面取り領域は複数の開口部及び分岐プレートを備えるインサートと、
    を含むクロスフロー乳化装置（ＡＸＦ）を使用することを特徴とし、
    前記方法は、前記管状膜に前記第１の液相を提供することを制御することと、前記複数の細孔により、第２の液相を前記管状膜に提供することを制御して、脂質小胞懸濁液を形成することとを含む、方法。
  8. 前記第１の液相は脂質相を含み、前記第２の液相は水相を含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  9. 前記第１の液相は水相を含み、前記第２の液相は脂質相を含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  10. 前記脂質小胞は、リポソーム又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であることを特徴とする、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記脂質小胞はリポソームであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記脂質小胞は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記水相は１つ又は複数の活性剤を含むことを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記水相はバッファ溶液を含むことを特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記水相バッファは、限定されないがＭＥＳ（２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸）、クエン酸、リン酸、酢酸、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）及びＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、並びにその組合せを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記１つ又は複数の活性剤が疎水性であるとき、前記１つ又は複数の活性剤は前記脂質相に含まれ得ることを特徴とする、請求項７～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記脂質相は１つ又は複数の活性剤を含むことを特徴とする、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記脂質小胞はアンローディング及びその後のローディングにより作製される（アクティブローディング）ことを特徴とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記脂質小胞はローディングにより作製される（パッシブローディング）ことを特徴とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記方法は、水性コアをカプセル化する脂質二重層を含む脂質小胞を作製し、前記水性コアは１つ又は複数の活性剤を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  21. 前記１つ又は複数の活性剤は生物活性剤、例えば治療剤（薬物）、ワクチンなどであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  22. 前記生物活性剤は治療的核酸、例えば抗原をコードするものであることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
  23. 治療的核酸は、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、プラスミド、免疫刺激性核酸、アンタゴミル、アンチミル、模倣体、スーパーミル及びアプタマーを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記治療的核酸は抗原をコードすることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記脂質小胞はＬＮＰであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記ＬＮＰは、イオン化可能な又はカチオン性ＬＮＰであることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記脂質小胞はＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）又はＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン）などのカチオン性脂質小胞を含み、好適に使用され得ることを特徴とする、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記脂質小胞は、任意に正又は負電荷脂質、及びその任意の組合せと共に、中性脂質小胞を含むことを特徴とする、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記中性脂質小胞はスフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）、Ｌ－α－水添ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）及び１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）など、並びにその組合せを含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記脂質小胞は、５．０～７．６の範囲のｐＫａを有する脂質を含むことを特徴とする、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記脂質は第３級アミンを含むことを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記脂質小胞は１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン又は１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンを含むことを特徴とし、第３級アミンを有する別の好適な脂質は１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎジメチル－３－アミノプロパンである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記脂質小胞は単一の脂質又は脂質の混合物から形成されることを特徴とする、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記脂質小胞は、５０～２２０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶを含むことを特徴とする、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記脂質小胞はリン脂質を含むことを特徴とする、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記脂質小胞はペグ化脂質を含むことを特徴とする、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記ペグ化脂質は、限定されないが１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ペグ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、例えば１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧスクシナートジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、例えば４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオアート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、ペグ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）、又はＰＥＧジアルコキシプロピルカルバマート、例えばω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバマート、２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル－Ｎ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバマート又はジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）２０００］、及びその組合せを含むことを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
  38. 脂質小胞を形成するのに使用される脂質の量は、例えばワクチンの用量あたり約０．０１ｇ～約０．５ｇの範囲であることを特徴とする、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. ９０％超の脂質小胞は約２２０ｎｍ未満であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
  40. 前記装置はインサートを含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  41. 前記装置はインサートを含まないことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  42. 前記脂質小胞の出口は、一般的に前記管状スリーブの第２端部にあることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  43. 前記脂質小胞の出口は、一般的に前記管状スリーブの側枝にあることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  44. 前記第１入口は連続相第１入口であり、前記第２入口は分散相入口であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  45. 前記第１入口は分散相第１入口であり、前記第２入口は連続相入口であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  46. 前記管状膜は前記外部スリーブ内で中央に位置し、前記管状膜周囲の任意の点に、前記膜と前記スリーブとの間の間隔が、等しい又は実質的に等しい寸法の環状部を含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  47. 前記間隔は約０．０５～約１０ｍｍであることを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記インサートはテーパ状であることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
  49. 前記管状膜は前記外部スリーブ内で中央に位置し、前記インサート周囲の任意の点に、前記膜と前記インサートとの間の間隔が、等しい又は実質的に等しい寸法の環状部を含むことを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
  50. 前記間隔は約０．０５～約１０ｍｍであることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記管状膜の内径は約１ｍｍ～約１０ｍｍであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  52. 前記クロスフロー装置は複数の管状膜を含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  53. 各膜はその内部に位置するインサートを有することを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
  54. 複数の膜は互いに平行に配置された膜のクラスタとしてグループ化されることを特徴とする、請求項５２又は５３に記載の方法。
  55. 前記外部スリーブの前記入口及び出口端部は、一般的にシールアセンブリを備えているであろうことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  56. 前記外部スリーブの前記入口及び出口端部における前記シールアセンブリは同じであることを特徴とする、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記シールアセンブリは各端部にフランジを備えた管状フェルールを含み、（連結時）前記外部スリーブに隣接する前記端部に位置する第１のフランジはＯリングシールの台座として作用する円くぼみを備え、前記Ｏリングシールは前記Ｏリングにより前記膜がスライドするように隙間嵌めされることを特徴とする、請求項５５又は５６に記載の方法。
  58. 前記Ｏリングシールは、前記インサートの前記端部の周囲、及び前記外部スリーブのくぼみ内に位置するように適合されることを特徴とする、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記膜細孔はレーザで開けられることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  60. 前記膜細孔は細孔直径、細孔形状及び細孔深さが実質的に同一であることを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記膜細孔は概して均一に間隔を有することを特徴とする、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記細孔は約１μｍ～約２００μｍの直径を有することを特徴とする、請求項５９又は６０に記載の方法。
  63. 前記細孔の形状は実質的に管状であることを特徴とする、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記細孔間距離は約１μｍ～約５，０００μｍであることを特徴とする、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記膜の表面空隙率は、前記膜の表面積の約０．００１％～約２０％でよいことを特徴とする、請求項５９～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記細孔はパターン化した配置であることを特徴とする、請求項５９～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記パターン化した配置は正方形、三角形、線状、円形又は長方形の配置であることを特徴とする、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記パターン化した配置は正方形の配置であることを特徴とする、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記膜はガラス、セラミック、金属、ポリマー／プラスチック又はシリコンから選択される材料を含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  70. 前記膜は金属を含むことを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記金属はステンレス鋼であることを特徴とする、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記分岐プレートは２分岐プレート又は３分岐プレートであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  73. 前記分岐プレートは３分岐プレートであることを特徴とする、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記インサートに与えられる開口部数は２～６であることを特徴とする、請求項７２又は７３に記載の方法。
  75. 前記インサートに与えられる開口部数は３であることを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記インサート上の前記面取り領域は浅い面取りを含むことを特徴とする、請求項７２～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記膜乳化技術は層流の使用を含むことを特徴とする、請求項７～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. このようにして得られた前記脂質小胞は、カプセル化率及び粒度分布（多分散性）の両方で高い再現性を有することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  79. 前記脂質小胞は多分散性指数が≦０．３であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  80. 前記装置は、ＰＤＩが約０．０２～約０．３である脂質小胞を調製するのに好適であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  81. 請求項１～８０のいずれか一項に記載の方法により調製される脂質小胞。
  82. 前記脂質小胞はリポソーム又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であることを特徴とする、請求項８１に記載の脂質小胞。
  83. 前記脂質小胞はリポソームであるであることを特徴とする、請求項８２に記載の脂質小胞。
  84. 前記脂質小胞は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であることを特徴とする、請求項８２に記載の脂質小胞。
  85. 前記脂質小胞は活性剤を含むことを特徴とする、請求項８１～８４のいずれか一項に記載の脂質小胞。
  86. 前記活性剤は核酸であることを特徴とする、請求項８５に記載の脂質小胞。
  87. 前記核酸は抗原をコードすることを特徴とする、請求項８６に記載の脂質小胞。
  88. 請求項８１～８７のいずれか一項に記載の脂質小胞及び薬学的に許容可能な賦形剤、担体又は希釈剤を含む組成物。
  89. 前記組成物は抗癌、抗菌及び抗炎症療法の送達に好適であることを特徴とする、請求項８８に記載の組成物。
  90. 前記組成物における前記活性剤はドキソルビシン（ドキシル（登録商標））、アムホテリシン（アムビゾーム（登録商標））及び徐放性モルヒネ（ＤｅｐｏＤｕｒ（商標））から選択されることを特徴とする、請求項８９に記載の組成物。
  91. 前記活性剤はドキソルビシン（ドキシル（登録商標））であることを特徴とする、請求項９０に記載の組成物。
  92. 前記活性剤はアムホテリシン（アムビゾーム（登録商標））であることを特徴とする、請求項９０に記載の組成物。
  93. 前記活性剤は徐放性モルヒネ（ＤｅｐｏＤｕｒ（商標））であることを特徴とする、請求項９０に記載の組成物。
  94. 細胞に請求項８１～８７に記載の脂質小胞を提供することを含む、細胞によりポリペプチドの発現を調節する方法。
  95. 請求項８１～８７のいずれか一項に記載の脂質小胞、及び疾患又は病原体に関連する抗原を含むワクチン。
  96. 前記脂質小胞はリポソーム又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であることを特徴とする、請求項９５に記載のワクチン。
  97. 前記脂質小胞はリポソームであることを特徴とする、請求項９６に記載のワクチン。
  98. 前記脂質小胞は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であることを特徴とする、請求項９６に記載のワクチン。
  99. 添付の説明を参照してここに記載される方法、脂質小胞、組成物又はワクチン。
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