JP2023531854A - ウイルス感染を予防または処置する方法 - Google Patents

Abstract

患者におけるウイルス感染（少なくとも一部が）により引き起こされるか関連する疾患または状態を処置または予防する方法であって、ある特定の実施形態では、６４Ｚｎ濃縮亜鉛を含む医薬組成物を、ウイルス感染により引き起こされる疾患または状態を治療または予防するための治療有効用量または予防有効用量で前述の患者に投与する工程を含む、方法。１つの態様では、本開示は、患者におけるウイルス感染（少なくとも一部が）により引き起こされるか関連する疾患または状態を処置または予防する方法であって、亜鉛を含む医薬組成物を、ウイルス感染により引き起こされる疾患または状態を治療または予防するための治療有効用量または予防有効用量で前述の患者に投与する工程を含む、方法を提供する。

Description

技術分野
本開示は、患者におけるウイルス感染（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染が挙げられる）の予防または治療に関する。

背景
ウイルス感染（コロナウイルスによる感染など）は、治療（またはその欠如）ならびに感染の拡大および患者が感染したことにより引き起こされる疾患の重症化の両方の観点から問題となりつつある。

概要
１つの態様では、本開示は、患者におけるウイルス感染（少なくとも一部が）により引き起こされるか関連する疾患または状態を処置または予防する方法であって、亜鉛を含む医薬組成物を、ウイルス感染により引き起こされる疾患または状態を治療または予防するための治療有効用量または予防有効用量で前述の患者に投与する工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、さらなる実施形態では、培養培地（例えば、ＲＰＭＩ－１６４０など）または重水素枯渇水のいずれかに溶解された亜鉛および／またはその同位体のアミノ酸との複合物を含むか、前述の複合物である。いくつかの実施形態では、組成物は、^６４Ｚｎ濃縮亜鉛（用語「^６４Ｚｎ_ｅ」は、本明細書中で、^６４Ｚｎ濃縮亜鉛を指すために使用される）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、天然のＺｎおよび／またはＺｎ－６４を含むか、これらを含む溶液である。

いくつかの実施形態では、^６４Ｚｎ濃縮亜鉛は、^６４Ｚｎｅ化合物または^６４Ｚｎ_ｅ塩の形態である。ある特定の実施形態では、開示の組成物は、少なくとも８０％の^６４Ｚｎ_ｅ、少なくとも９０％の^６４Ｚｎ_ｅ、少なくとも９５％の^６４Ｚｎ_ｅ、または少なくとも９９％の^６４Ｚｎ_ｅの亜鉛（例えば、８０％の^６４Ｚｎ_ｅ、８５％の^６４Ｚｎ_ｅ、９０％の^６４Ｚｎ_ｅ、９５％の^６４Ｚｎ_ｅ、９９％の^６４Ｚｎ_ｅ、または９９．９％の^６４Ｚｎ_ｅが存在する亜鉛）を含む。

被験体／患者は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（非ヒト霊長類または飼い犬もしくは飼い猫など）であり得る。

本発明のこれらの態様および他の態様にしたがって多数の他の態様が提供される。本発明の他の特徴および態様は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかとなるであろう。

図１Ａおよび１Ｂは、細胞単層の細胞破壊で明らかにされたＭＤＣＫ細胞に対するインフルエンザウイルスの細胞変性効果を示す。倍率：１０×４０

図２は、ヘルペスウイルス感染させたＶＮＫ細胞（シンプラスト）の培養物を示す。倍率：１０×４０

図３Ａおよび３Ｂは、ＭＤＢＫ細胞の単層の小さな細胞変性で明らかにされたＢＶＤＶの細胞変性効果を示す。倍率：１０×４０

図４は、亜鉛フィンガータンパク質のコンピュータモデルを示す。

詳細な説明
本明細書中で使用される場合、名詞の前の「ａ」または「複数」という用語は、１またはそれを超える特定の名詞を表す。

用語「例えば」、「など」、およびその文法的な等価物について、特に明記しない限り、句「制限されない」がその後に続くと理解される。本明細書中で使用される場合、用語「約」は、実験誤差に起因する変動を説明することを意味する。本明細書中に報告したすべての測定値は、特に明記しない限り、この用語が明確に使用されているか否かにかかわらず、用語「約」で修飾されていると理解される。文脈上別段の明確な指示がない限り、本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、複数形が含まれる。

用語「例えば」、「など」、およびその文法的な等価物について、特に明記しない限り、句「制限されない」がその後に続くと理解される。本明細書中で使用される場合、用語「約」は、実験誤差に起因する変動を説明することを意味する。本明細書中に報告したすべての測定値は、特に明記しない限り、この用語が明確に使用されているか否かにかかわらず、用語「約」で修飾されていると理解される。文脈上別段の明確な指示がない限り、本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、複数形が含まれる。

本明細書中に開示の全ての範囲は、その範囲に包括されるありとあらゆる部分範囲を包含すると理解されるものとする。例えば、記載の範囲「１．０～１０．０」は、１．０またはそれを超える最小値から始まり１０．０またはそれ未満の最大値で終わるありとあらゆる部分範囲（例えば、１．０～５．３、または４．７～１０．０、または３．６～７．９）が含まれると見なされるものとする。

また、本明細書中に開示の全ての範囲は、明示的に別段の定めをした場合を除き、範囲の終点が含まれると見なされるものとする。例えば、「５と１０との間」または「５から１０」または「５～１０」の範囲はは、終点５および１０が含まれると見なされるものとする。

本開示または関連する実施形態の性質によって明確に禁止されない限り、１つの実施形態の特徴を、他の実施形態で具体的に記載も例示もされていないにもかかわらず、一般にかかる他の実施形態に適用することができるとさらに理解すべきである。同様に、本明細書中に記載の組成物および方法は、本開示の目的と矛盾しない本明細書中に記載の特徴および／または工程の任意の組み合わせを含むことができる。本発明の対象を逸脱することなく、本明細書中に記載の組成物および方法の多数の修正および／または適合が当業者に明らかであろう。

「有効量」、「予防有効量」、または「治療有効量」は、被験体に有利な効果または好ましい結果をもたらす薬剤または組成物の量、あるいは、望ましいｉｎ ｖｉｖｏ活性またはｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示す薬剤または組成物の量を指す。「有効量」、「予防有効量」、または「治療有効量」は、望ましい生物学的結果、治療的結果、および／または予防的結果をもたらす薬剤または組成物の量を指す。この結果は、患者／被験体の疾患、障害、もしくは状態の１またはそれを超える兆候、徴候、もしくは原因の低減、回復、寛解、軽減、遅延、および／もしくは緩和、または生物システムの任意の他の望ましい変化であり得る。有効量を、１またはそれを超える回数で投与することができる。

「有効量」、「予防有効量」、または「治療有効量」は、細胞培養アッセイに従うか、動物モデル、典型的にはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、またはブタを使用して最初に推定され得る。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲および投与経路が決定され得る。次いで、かかる情報を使用して、ヒトに適切な用量および投与経路を決定することができる。ヒト等価用量を計算する場合、換算表（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ（米国保健社会福祉省、食品医薬品局、医薬品評価・研究センター（ＣＤＥＲ）、２００５年７月）で提供した換算表など）が使用され得る。当業者は、非ヒトデータに基づいてヒト治療投薬量を開発するためにも使用され得るさらなるガイダンスを承知している。有効用量は、一般に、０．０１ｍｇ／ｋｇ～２０００ｍｇ／ｋｇの活性薬剤、好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇの活性薬剤である。正確な有効用量は、疾患の重症度、患者の全体的な健康状態、年齢、体重および性別、栄養、投与の時間および頻度、医薬品の組み合わせ（複数可）、応答感度および投与に対する耐性／応答、ならびに当業者の知識に基づいて特定の患者についての投薬量および投与経路を決定するときに当業者によって考慮されるであろう他の要因に依存するであろう。かかる用量は、日常的な実験の実施および医師の裁量によって決定され得る。また、有効用量は、他の治療手順（他の薬剤の使用など）との併用の可能性に応じて変動するであろう。

本明細書中で使用される場合、「患者」および「被験体」は、交換可能な用語であり、ヒト患者／被験体、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類などを指し得る。

別段の定義がない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。本発明で用いる方法および材料を本明細書に記載している；当該分野で公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図しない。本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書を優先するものとする。

ウイルス感染

ウイルス感染は、動物の身体に病原性ウイルスが侵入し、感染性ウイルス粒子（ビリオン）が付着し、感受性細胞に入り込んだときに生じる。これらの感染は、種々の疾患／状態を引き起こす。いくつかの感染は、感染性が非常に高い（インフルエンザウイルス感染など）。他の感染は、致死性が非常に高い（エボラウイルス感染など）。新規のウイルス性疾患は、通常、動物ウイルス病原体がヒトに感染したときにある頻度で生じる。例としては、ＨＩＶ、エボラウイルスなどが挙げられる。細菌性疾患と異なり、ウイルス感染に起因する疾患の処置は、あまり容易に利用できない。

２０１９～２０２１年に、ウイルスにより引き起こされるパンデミックが人類に猛威を振るった。その疾患はＣＯＶＩＤ－１９と呼ばれ、以前は２０１９新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）と称されていた重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を原因とする。このウイルスは動物起源と考えられ、２０１９年１１月または１２月に中国の武漢においてヒトに最初に伝染したらしい。主な感染源は、まもなくヒトからヒトに伝染するようになった。主に咳およびくしゃみに由来する呼吸器からの液滴を介して、ヒトの間で拡大したらしい。

ウイルスが肺のＩＩ型肺胞細胞中に最も豊富な酵素ＡＣＥ２を介して宿主細胞に接近するので、肺はＣＯＶＩＤ－１９によってもっとも影響を受ける臓器である。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ（３ Ｍａｒｃｈ ２０２０）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００１３４－０２０－０５９８５－９。ＡＣＥのホモログとして発見されたアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は、生理学的な均衡を保つ物質として作用し、循環アンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）レベルを恒常性に制御する。ＡＣＥ２は、内皮細胞および他の細胞の表面上に細胞外酵素として配置された亜鉛金属酵素かつカルボキシペプチダーゼである。各組織中のＡＣＥ２の密度は、その組織における疾患の重症度と相関する。肺胞疾患が進行した場合、呼吸不全を発症し得、死に至り得る。また、ＡＣＥ２は、心臓を攻撃して急性心外傷を引き起こすウイルスの通路であり得る。心血管病態を罹患している患者は、罹患していない患者より予後が悪い。

亜鉛

亜鉛は、人体の適切な代謝状態を確保するために不可欠な微量元素に起因する。体内の２００を超える酵素が亜鉛に依存している。この元素は、以下の全ての酵素クラスを対象とする酵素の構成要素またはその活性の制御因子のいずれかである：トランスフェラーゼ（ＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、チミジンキナーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、および他のペプチダーゼ）、ヒドロラーゼ（アルカリホスファターゼ、５－ヌクレオチダーゼ、アミノペプチダーゼなど）、リアーゼ（アルドラーゼ、炭酸脱水酵素など）、オキシドレダクターゼ（アルコールデヒドロゲナーゼ、スーパーオキシドジムスターゼなど）、リガーゼ、およびイソメラーゼ。亜鉛が存在しないと、タンパク質、脂肪、または炭水化物は代謝できない。

また、亜鉛は、抗酸化剤の効果を媒介することが証明されている。亜鉛は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（高攻撃性スーパーオキシドアニオンラジカルの産生を触媒する酵素複合体）の阻害剤である。さらに、亜鉛は、連鎖反応の開始段階でフリーラジカルの酸化に直接影響を及ぼすことができる；亜鉛は、抗酸化防御系のいくつかの酵素の構成成分である（Ｃｕ／Ｚｎ含有スーパーオキシドジムスターゼが挙げられる）。タンパク質のチオール基の連結により、亜鉛は、タンパク質を活性酸素種による酸化から防御する。この微量元素は、メタロチオネイン（フリーラジカル消去剤として作用するシステイン－リッチタンパク質）の合成を誘導する。亜鉛は、反応性混合原子価金属酸化物の形成を抑制し、膜構造の安定化に関与する。

代謝および構造における亜鉛の重要性は、その生物学的活性が広範囲に及ぶことから明確である。したがって、亜鉛は、細胞の分裂および分化（成長、組織再生、精子形成など）に関連する過程の正常な稼働に必要であり、核酸の代謝およびタンパク質合成に能動的に関与する。この微量元素は、多価不飽和脂肪酸の代謝およびプロスタグランジン変換反応に重要である。亜鉛は、顕著な脂肪親和性活性を示し、肝臓保護性を有する。Ｈａａｓｅ Ｈ．，Ｒｉｎｋ Ｌ．Ｚｉｎｃ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｚｉｎｃ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ／／Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ：ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ．２０１１．２４３。

さらに、亜鉛は、食細胞およびリンパ球の活性の制御因子であり、好中球の走化性に影響を及ぼすので、免疫学的反応において極めて需要な役割を果たす。５－ヌクレオチダーゼ、亜鉛含有酵素は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の機能状態において非常に重要である。単離亜鉛の欠乏は、Ｔ細胞機能の種々のパラメーターを重篤に妨害する（胸腺の退化、細胞媒介性細胞傷害の阻害、および総リンパ球数の減少が挙げられる）。亜鉛は、下垂体ホルモン、副腎、膵臓、前立腺、および精巣の代謝および活性の刺激に関与する。亜鉛は、インスリンの合成、貯蔵、および分泌で役割を果たすことが明らかである。Ｈａａｓｅ Ｈ．，Ｒｉｎｋ Ｌ．Ｚｉｎｃ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｚｉｎｃ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ／／Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ：ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ．２０１１．２４３。

また、亜鉛は、多くの微量元素およびビタミン（鉄、銅、マグネシウム、ビタミンＡ、Ｅ、葉酸など）の吸収に対する共働薬／アンタゴニストとして作用し、その代謝に影響を及ぼす。

要するに、亜鉛は、人体における種々の生命の過程および機能に関与する。これらの機能のうちのいくつかについての詳細な研究は依然として完了しておらず、この微量元素の機序の多くは依然として完全に理解も認識もされていない。しかしながら、文献に示された実験研究および臨床研究では、亜鉛は重要元素の１つであり、体内での亜鉛レベルの低下がいくつかの最も流行した非流行性疾患の発症および新興に関連することを示している。体内での主な代謝過程が亜鉛含有酵素および亜鉛依存性酵素の積極的関与によって生じるので、その欠乏は多数の生命過程を妨害する。

亜鉛－亜鉛塩およびそのキレートの古典的な薬理学的形態を使用しても、この元素の生物学的利用能が低いので、亜鉛の欠乏を適切に埋め合わせる効果を発揮することが常に可能となるわけではない。

処置方法および組成物
１つの態様では、本開示は、患者におけるウイルス感染（少なくとも一部が）により引き起こされるか関連する疾患または状態を処置または予防する方法であって、亜鉛を含む医薬組成物を、ウイルス感染により引き起こされる疾患または状態を治療または予防するための治療有効用量または予防有効用量で前述の患者に投与する工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、培養培地（例えば、ＲＰＭＩ－１６４０など）または重水素枯渇水のいずれかに溶解された亜鉛および／またはその同位体のアミノ酸との複合物を含むか、前述の複合物である。いくつかの実施形態では、組成物は、^６４Ｚｎ濃縮亜鉛（用語「^６４Ｚｎ_ｅ」は、本明細書中で、^６４Ｚｎ濃縮亜鉛を指すために使用される）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、天然のＺｎおよび／またはＺｎ－６４を含むか、これらを含む溶液である。いくつかの実施形態では、組成物は、元素の形態またはその薬学的に許容され得る塩、化合物、もしくは複合体の形態で^６４Ｚｎ_ｅを含む。

被験体は、例えば、制限されないが、被験体がウイルスに感染した疑いがあるか、ウイルス感染の高リスク群にあるか、ウイルス感染率の高い地域にいる場合、予防する必要があり得る。

いくつかの実施形態では、天然のＺｎまたはＺｎ－６４を含む溶液は、シトラート溶液、グルタミン酸溶液、グリシン－メチオニン溶液、ＥＤＤＡ溶液、スルファート溶液、アスパラギン酸溶液、またはＴＢＰＤＡ溶液である。

いくつかの実施形態では、^６４Ｚｎ濃縮亜鉛は、^６４Ｚｎｅ化合物または^６４Ｚｎ_ｅ塩の形態である。ある特定の実施形態では、開示の組成物は、少なくとも８０％の^６４Ｚｎ_ｅ、少なくとも９０％の^６４Ｚｎ_ｅ、少なくとも９５％の^６４Ｚｎ_ｅ、または少なくとも９９％の^６４Ｚｎ_ｅの亜鉛（例えば、８０％の^６４Ｚｎ_ｅ、８５％の^６４Ｚｎ_ｅ、９０％の^６４Ｚｎ_ｅ、９５％の^６４Ｚｎ_ｅ、９９％の^６４Ｚｎ_ｅ、または９９．９％の^６４Ｚｎ_ｅが存在する亜鉛）を含む。

いくつかの実施形態では、^６４Ｚｎ_ｅは、アスパラギナート、スルファート、およびシトラートからなる群から選択される塩の形態である。さらなる実施形態では、^６４Ｚｎ_ｅアスパラギナートの化学式はＣ_４Ｈ_５Ｏ_４Ｎ^６４Ｚｎ_ｅであり、２個のアスパラギン酸分子を有する。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、亜鉛の重同位体を有する酵素ＡＣＥ２を介して宿主細胞に接近する。したがって、ＡＣＥ２活性を恒常性に修正することでＣＯＶＩＤ－１９患者を処置すべきである。

いくつかの実施形態では、ウイルス感染はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染であり、患者は、ヒトのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者であるか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のおそれがある（例えば、感染率の高い地域に滞在していた）。

いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、インフルエンザウイルス（Ａ型インフルエンザウイルスが挙げられる）、単純ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス２型が挙げられる）、肝炎ウイルス（Ｃ型肝炎ウイルスが挙げられる）、エプスタイン・バーウイルス、コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる）、エボラウイルス、またはＨＩＶの感染である。

用語「^６４Ｚｎ_ｅ」は、^６４Ｚｎ濃縮亜鉛を指すために本明細書中で使用される。すなわち、自然界における亜鉛の通常の百分率よりも^６４Ｚｎが濃縮されるように^６４Ｚｎが濃縮された亜鉛である。

軽同位体^６４Ｚｎ_ｅの形態の亜鉛は、天然に存在する亜鉛よりもはるかに体内に吸収される。ある特定の実施形態では、開示の組成物は、少なくとも８０％の^６４Ｚｎ_ｅ、少なくとも９０％の^６４Ｚｎ_ｅ、少なくとも９５％の^６４Ｚｎ_ｅ、または少なくとも９９％の^６４Ｚｎ_ｅの亜鉛（例えば、８０％の^６４Ｚｎ_ｅ、８５％の^６４Ｚｎ_ｅ、９０％の^６４Ｚｎ_ｅ、９５％の^６４Ｚｎ_ｅ、９９％の^６４Ｚｎ_ｅ、または９９．９％の^６４Ｚｎ_ｅが存在する亜鉛）を含む。

いくつかの実施形態では、組成物または溶液は、希釈剤または賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、希釈剤は水である。さらなる実施形態では、水希釈剤は重水素枯渇水である。

いくつかの実施形態では、^６４Ｚｎ_ｅ化合物またはその塩は、２０～１００％の間の^６４Ｚｎ_ｅが存在する。さらなる実施形態では、^６４Ｚｎ_ｅ化合物またはその塩は、少なくとも８０％の^６４Ｚｎ_ｅが存在する。さらなる実施形態では、^６４Ｚｎ_ｅ化合物またはその塩は、少なくとも９５％の^６４Ｚｎ_ｅが存在する。いくつかの実施形態では、組成物は、０．０５ｍｇと１１０ｍｇとの間の^６４Ｚｎ_ｅを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１ｍｇと１０ｍｇとの間の^６４Ｚｎ_ｅを含む。いくつかの実施形態では、^６４Ｚｎ_ｅ化合物またはその塩は、少なくとも９０％の^６４Ｚｎ_ｅが存在し、組成物は、^６４Ｚｎ_ｅが０．１ｍｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する水溶液である。いくつかの実施形態では、^６４Ｚｎ_ｅは、２個のアスパラギン酸分子を有するアスパラギナート（化学式－Ｃ_４Ｈ_５Ｏ_４Ｎ^６４Ｚｎ_ｅ）、スルファート、およびシトラートからなる群から選択される塩の形態である。

いくつかの実施形態では、組成物または溶液を、注射によって投与する。他の実施形態では、組成物または溶液を経口投与する。

組成物の製剤化および投与

開示の方法で用いる組成物は、任意の適切な投与様式、任意の適切な頻度、および任意の適切な有効投薬量で必要とする被験体に投与され得る。

いくつかの実施形態では、亜鉛の総投与量は、米国における１日あたりの亜鉛の推奨許容量または摂取量と同一である。いくつかの実施形態では、Ｚｎの総投与量は、米国における１日あたりの亜鉛の推奨許容量または摂取量の１／２、２倍、３倍、５倍、または１０倍である。いくつかの実施形態では、Ｚｎの総量は、米国における１日あたりの亜鉛の推奨許容量または摂取量の１／２と１０倍との間である。開示の方法で用いる組成物は、１日１回投与するように処方された１日量または１日あたり対応する回数で投与するように処方されたそのいくつかの分割量を含み得る。また、開示の方法で用いる組成物は、２日毎に１回、３日毎に１回、週１回、または任意の他の適切な頻度でのＺｎの投与量を含み得る。

開示の方法で用いる組成物は、任意の適切な形態であり得、任意の適切な送達手段のために製剤化され得る。いくつかの実施形態では、開示の方法で用いる組成物は、経口投与に適切な形態（錠剤、丸薬、ロゼンジ、カプセル、液体懸濁液、溶液、または任意の他の従来の経口投薬形態など）で提供される。経口投薬形態は、即放、遅延放出、徐放、または腸管放出され得、適切な場合、１またはそれを超えるコーティングを含む。いくつかの実施形態では、開示の組成物は、注射に適切な形態（皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、または任意の他の注射経路など）で提供される。いくつかの実施形態では、注射用組成物は、無菌および／または非発熱形態で提供され、防腐剤および／または他の適切な賦形剤（スクロース、リン酸水素二ナトリウム七水和物または他の適切な緩衝液など）、ｐＨ調整剤（塩酸または水酸化ナトリウムなど）、ならびにポリソルベート８０または他の適切な界面活性剤を含み得る。

溶液の形態で提供される場合、いくつかの実施形態では、開示の方法で用いる組成物は、ガラス製またはプラスチック製のボトル、バイアル、またはアンプルで提供され、そのうちのいずれかは、単回または複数回の使用に適切であり得る。開示の組成物を含むボトル、バイアル、またはアンプルは、１またはそれを超える適切なゲージの針および／または１またはそれを超えるシリンジと共にキットの形態で提供され得、その全てが無菌であることが好ましい。したがって、ある特定の実施形態では、適切なガラス製またはプラスチック製のボトル、バイアル、またはアンプル中にパッケージングされた上記の溶液を含むキットが提供され、キットは、１またはそれを超える針および／または１またはそれを超えるシリンジをさらに含み得る。キットは、使用説明書をさらに含み得る。

ある特定の実施形態では、Ｚｎの投薬量は、対応する元素の種々の信頼のおける１日摂取量のガイダンス（例えば、推奨栄養所要量（ＵＳＲＤＡ）、適正摂取量（ＡＩ）、推奨栄養摂取量（ＲＤＩ））に比例する。

いくつかの実施形態では、開示の方法で用いる組成物は、培養培地（ＲＰＭＩ－１６４０）または重水素枯渇水のいずれかに溶解された亜鉛および／またはその同位体のアミノ酸との複合物を含むか、前述の複合物である。

いくつかの実施形態では、Ｚｎ投薬量は、ガイダンスが示す量の約１／２倍と約２０倍との間、より好ましくは、ガイダンスが示す量の約１倍と約１０倍との間、さらにより好ましくは、ガイダンスが示す量の約１倍と約３倍との間である。したがって、ある特定の実施形態では、連日投与のための開示の方法で用いる組成物の単回用量は、これらの範囲内の量（ガイダンスが示す量の約１／２倍、約１倍、約３倍、約５倍、約１０倍、および約２０倍など）を含むように製剤化されるであろう。これらの量は、一般に、経口摂取または局所適用のための量である。いくつかの実施形態では、静脈内投薬量は、より少ない（ガイダンスが示す量の約１／１０～約１／２など）である。特定の元素または元素クラスに感受性の高い者（例えば、腎臓に問題のある者）については、これらの範囲の最低の用量が適切である。亜鉛について、ガイダンスが示す１日量は、乳児のための２ｍｇから９歳またはそれを超える年齢のための８～１１ｍｇ（性別に依存する）までの範囲である。本出願を通して考察された１日投薬量は、分割投薬量にさらに分割し、分割投薬量は、総１日投薬量が投与されるように、１日あたり適切な回数で投与され得る（例えば、１日用量の１／２を１日２回投与する、１日用量の１／３を１日３回投与するなど）。表１を参照のこと。

開示の方法で用いる組成物を、医薬品産業における一般的慣行にしたがって使用される方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；２１ｓｔ ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄ．（２０１１）（以後、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ」）に示された方法など）によって産生することができる。

いくつかの実施形態では、開示の方法で用いる組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容され得るビヒクルまたは賦形剤を含む。これらには、例えば、必要に応じて、希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、崩壊剤、溶解補助剤、分散剤、防腐剤、湿潤剤、防腐剤、安定剤、緩衝剤（例えば、ホスファート、シトラート、アセタート、タルトラート）、懸濁剤、乳化剤、および浸透促進剤（ＤＭＳＯなど）が挙げられる。また、組成物は、適切な補助剤、例えば、溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、および乳化剤を含むことができる。

ある特定の実施形態では、組成物は、適切な希釈剤、流動促進剤、潤滑剤、酸味料、安定剤、充填剤、結合剤、可塑剤、または放出助剤、および他の薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む。

薬学的に許容され得る賦形剤の完全な記述を、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．，Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）または他の標準的な薬科学テキスト（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｓｈｅｓｋｙ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，８ｔｈ ｅｄ．２０１７）など）に見出すことができる。

いくつかの実施形態では、開示の方法で用いる組成物を、胃内、経口、静脈内、腹腔内、または筋肉内に投与することができるが、他の投与経路も可能である。

組成物中の担体および希釈剤として水が使用され得る。水に加えて、または水の代わりに他の薬学的に許容され得る溶媒および希釈剤を使用することも許容され得る。ある特定の実施形態では、重水素枯渇水を、希釈剤として使用する。

また、代謝が遅い高分子（タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸のコポリマーなど）を、組成物の担体化合物として使用することができる。治療組成物中の薬学的に許容され得る担体は、液体（水、生理食塩液、グリセロール、またはエタノールなど）をさらに含み得る。さらに、前述の組成物は、賦形剤（湿潤剤または乳化剤、緩衝物質など）をさらに含み得る。かかる賦形剤としては、とりわけ、当該分野で慣習として認められた希釈剤および担体、ならびに／または細胞内への活性化合物の浸透を促進する物質（例えば、ＤＭＳＯ）、ならびに防腐剤および安定剤が挙げられる。

開示の方法で用いる組成物は、適用対象に応じて種々の投薬形態で提供され得る；特に、前述の組成物は、注射液として製剤化され得る。

開示の方法で用いる組成物は、全身投与され得る。適切な投与経路としては、例えば、経口または非経口投与（静脈内、腹腔内、胃内など）および飲料水を介した投与が挙げられる。しかしながら、投薬形態に応じて、開示の組成物は、他の経路によって投与され得る。

ある特定の実施形態では、Ｚｎを含む開示の方法で用いる組成物は、２．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で以内投与される。

いくつかの実施形態では、開示の方法で用いる組成物は約２ｍｌである。

いくつかの実施形態では、^６４Ｚｎ_ｅの濃縮レベルは、約９９％またはそれを超える。他のさらなる実施形態では、２ｍｌの組成物の^６４Ｚｎ_ｅは、２個のアスパラギン酸分子を有する亜鉛アスパラギナートを含むか、それからなる（化学式－Ｃ_４Ｈ_５Ｏ_４Ｎ^６４Ｚｎ_ｅ）。開示の方法で用いる組成物の用量は、処置される被験体、疾患の重症度、患者の状態、ならびに当該分野における当業者の知識に基づいて特定の患者のための投薬量および投与経路を決定する場合に当業者が考慮すると考えられる他の要因に応じて変動し得る。

軽同位体を購入してよい。必要な濃縮度の酸化Ｚｎ－６４を、例えば、Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ，ＴＮ，ＵＳＡから購入してよい。

いくつかの実施形態では、亜鉛アスパラギナートの化学式は－Ｃ_４Ｈ_５Ｏ_４Ｎ^６４Ｚｎ_ｅであり、２個のアスパラギン酸分子を有する。この亜鉛アスパラギナートの構造は、以下である。

ある特定の実施形態では、開示の方法で用いる組成物は、組成物の約２０％～約１００％が^６４Ｚｎ_ｅを含む。

開示の方法で使用する組成物を、別の適切な薬剤または治療薬と同時投与することができる。

ウイルス感染は、任意のウイルス感染であり得る。

実施例

本発明をより深く理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例証のみを目的とし、いかなる方法においても本発明の範囲を制限すると解釈されないものとする。

実施例１ 亜鉛－６４同位体ベースの物質を使用した抗ウイルス治療

亜鉛は、代謝で重要な役割を果たす最も重要な微量栄養素のうちの１つであり、多数の金属酵素および転写因子の構成要素である。Ｂａｒｂｏｓａ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．１９８９ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１４０４－１４０７。亜鉛は、２５０～３００種の酵素の一部であり、これらは全て６つの酵素クラスに属することが周知である。Ｂａｒｔｈｅｌ，Ａ．，Ｅ．Ａ．Ｅｔ ａｌ．，２００７．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４６３：１７５－１８２。１０％のヒトタンパク質が亜鉛を含む。Ｂｅｅｒｈｅｉｄｅ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９１：１２１１－１２２０．Ｂｅｓｓ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：８４０－８４７。亜鉛は、胸腺細胞および末梢Ｔ細胞数を増加させるので、免疫系を正常に機能させるために不可欠である。Ｂｏｙｌｅ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６４：５７３－５８４。

亜鉛は、骨組織の成長および発育に必要である。Ｂｒｉｇｇｓ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．２００１．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８０：１６９－１７５。炭水化物、脂質、タンパク質、および核酸の合成および／または分解に関与する亜鉛含有酵素は、全ての公知の酵素クラスを対象とする。Ｂｒｏｔｔｉｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１９３１－１９３８。亜鉛は、スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）（抗酸化防御系の重要部分である酵素）の構造成分である。Ｃｕｌｐ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：６４５０－６４５４；Ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２００３．Ｊ．Ｅｕｒ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．１７：３９４－３９８。

ＤＮＡに結合する亜鉛フィンガー－タンパク質の構造にＺｎ^＋２イオンが関与するので、この金属は細胞生物学において特別な位置にある。亜鉛は、最も重要な過程（細胞中の多数のタンパク質の合成および機能、シグナル伝達、タンパク質、および転写因子が挙げられる）に関与する微量元素として長く知られてきた。

細胞内の亜鉛ホメオスタシスにおけるこれらの分子の詳細を解明することで、予想外にウイルス学分野に新規の道が開かれ、宿主－ウイルス相互作用に新たな光が当てられた。Ｚｎ^＋２が細胞タンパク質だけでなく多数のウイルスタンパク質においても重要な補因子であることは長く認識されてきた。最近の研究では、遊離亜鉛のプールが極小かつかつ厳重に制御されている細胞環境自体が制限因子であり得ることを実証している。ウイルスは、細胞内に貯蔵した亜鉛イオンに依存しており、新規のタンパク質合成のために細胞Ｚｎ^＋２を使用する。したがって、亜鉛のバランスを制御する細胞系は、亜鉛の接近を制限し、それによりウイルスの複製を干渉する天然の防護壁を構成し得る。

これに関して、本研究の目的は、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスの再生に及ぼす天然の亜鉛およびその同位体（軽Ｚｎ－６４）の組成物の影響について研究することであった。

本研究の目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルスのモデルおよび肝炎ウイルスの代用モデル（ウシウイルス性下痢症ウイルス）に対する亜鉛同位体（Ｚｎ－６４）の細胞傷害性および抗ウイルス活性を研究することである。

材料と方法

検討物質
シトラート（クエン酸）、スルファート、アスパラギン酸およびグルタミン酸、グリシン－メチオニン、ＴＢＰＤＡ（ｎ－ｎ－トルエンスルホニル－ｎ－ベンゾイル－ｏ－フェニレンジアミン）およびＥＤＤＡ（エチレンジアミンジコハク酸）などの種々の溶媒中の亜鉛およびその軽同位体を、本研究で使用した。
４ シトラート溶液中のＺｎ－６４（０．９ｍｇ／ｍｌ）
４ｋ シトラート溶液中の天然のＺｎ（０．９ｍｇ／ｍｌ）
５ ＥＤＤＡ中のＺｎ－６４（３ｍｇ／ｍｌ）
５ｋ ＥＤＤＡ中の天然のＺｎ（３ｍｇ／ｍｌ）
６ スルファート溶液中のＺｎ－６４（３ｍｇ／ｍｌ）
６ｋ スルファート溶液中の天然のＺｎ（３ｍｇ／ｍｌ）
７ アスパラギン酸溶液中のＺｎ－６４（１．５ｍｇ／ｍｌ）
７ｋ アスパラギン酸溶液中の天然のＺｎ（１．５ｍｇ／ｍｌ）
８ グルタミン酸溶液中のＺｎ－６４（１．５ｍｇ／ｍｌ）
８ｋ グルタミン酸溶液中の天然のＺｎ（１．５ｍｇ／ｍｌ）
９－１ グリシン－メチオニン溶液中のＺｎ－６４（２ｍｇ／ｍｌ）
９－２ グリシン－メチオニン溶液中の天然のＺｎ（１．５ｍｇ／ｍｌ）
９－３ グリシン－メチオニン溶液
１０－１ ＴＢＰＤＡ溶液中のＺｎ６４（３ｍｇ／ｍｌ）
１０－２ ＴＢＰＤＡ溶液中の天然のＺｎ（０．９ｍｇ／ｍｌ）
１０－３ ＴＢＰＤＡ溶液（０．９ｍｇ／ｍｌ）
１１ ＴＢＰＤＡ溶液中のＺｎ６４－１４日間
９ａ 複合物７の溶液－アスパラギン酸－３．４１ｍｇ／ｍｌ
１０ａ 複合物８の溶液－グルタミン酸－４ｍｇ／ｍｌ
８ａ 複合物４の溶液－クエン酸－２．３ｍｇ／ｍｌ

参照薬物

Ｔｈｅ Ｗｅｌｃｏｍｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄによる活性物質からＫＲＫＡ，Ｓｌｏｖｅｎｉａによって製造されたＡｃｙｃｌｏｖｉｒ（有効成分として２５０ｍｇのナトリウム塩を含む凍結調製物）；Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ製造のＴａｍｉｆｌｕ。

細胞培養物

細胞培養物を、Ｍｕｓｅｕｍ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｄ．Ｉ．Ｉｖａｎｏｖｓｋｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ＲＡＭＳ，Ｍｏｓｃｏｗ）から入手した：
－ＭＤＣＫ、移植可能なイヌ腎臓細胞培養物
－ＶＮＫ、移植可能なハムスター胚腎臓上皮細胞
－ＭＤＢＫ、移植可能なウシ腎臓細胞培養物
－Ｂ ９５－８（マーモセット白血球）（エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）によって形質転換され、このウイルスを慢性的に産生し、ＥＢＶの供給源としての役割を果たす）
－Ｒａｊｉ、バーキットリンパ腫由来の未分化ヒトＢリンパ芽球様細胞

細胞培養物を、９０％ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）およびペニシリン抗生物質（１００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびＬ－グルタミン（２ｍＭ）からなる増殖培地中で生育させた。０．２５％Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を使用して、上皮細胞の単層を脱凝集させた。

細胞を、３７℃で５％ＣＯ_２のサーモスタット内のプラスチック製の組織培養フラスコ中、２４ウェルプレート中、および９６ウェルプレート中で生育させた。細胞の増殖活性を、光学倒立顕微鏡を使用して２日毎にチェックした。

ウイルス

インフルエンザウイルス：尿膜培養物中の感染価５．０～９．０ｌｇ ＥＩＤ_５０／０．２ｍｌおよび血球凝集素力価１：５１２ ＧＡＯ／０．２ｍｌのインフルエンザウイルスＡ／ＦＭ／１／４７（Ｈ１Ｎ１）株を、本研究で使用するために、Ｍｕｓｅｕｍ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ Ｄ．Ｉ．Ｉｖａｎｏｖｓｋｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ＲＡＭＳ，Ｍｏｓｃｏｗ）から入手した。

単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ－２）：ＢＨ株を、Ｍｕｓｅｕｍ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ Ｄ．Ｉ．Ｉｖａｎｏｖｓｋｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ＲＡＭＳ，Ｍｏｓｃｏｗ）から入手した。ウイルスを、ＢＮＫ細胞培養物中での連続継代によって維持した。細胞培養物中のＣＰＥについての感染価は、６．０～９．０ｌｇ ＴＣＤ_５０／０．１ｍｌであった。

ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）：第４継代のウイルス材料は、Ａ．Ｄｅｒｙａｂｉｎ氏（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＵＡＡＳの研究者）から提供を受けた。ＭＤＢＫ細胞培養における継代数１０後の感染性ウイルス力価は、５～９ｌｇ ＩＤ_５０であった。

エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を、Ｗａｌｔ，Ｃｒａｗｆｏｒｄ．Ｆｉｎｋｅｌ Ａ．，Ｃｚａｊｋｅ Ｄ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｏｘｉｄｅ ｏｎ ａｓｃｉｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｍｉｃｅ／／Ｅｄ．Ｆ．Ｎ．Ｆｕｒｎｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，１９６０．Ｐ．７５５－７６２の方法を使用して、ＥＢＶの供給源として一般的に使用されるＢ９５－８細胞（マーモセット内のＢリンパ球）のリンパ芽球様培養物から回収した。

薬物の細胞傷害濃度（ＣＣ_５０）の決定

異なる細胞培養物を使用して、各薬物のＣＣ_５０を決定した。細胞培養プレート中の少なくとも１０列のウェルを、栄養培地中の薬物の各々の希釈のために使用した。細胞培養物を含むプレートを、大気中３７℃および５％ＣＯ_２で５日間インキュベートした。試験培養物および対照培養物を毎日観察して、細胞変性効果（ＣＰＥ）の有無を決定した。

ＣＰＥ度を、＋から＋＋＋＋までの４プラスシステムを使用した細胞形態の変化（丸まり、細胞の縮み、変性変化を受けた細胞のウェル表面からの排除）によって決定した：

「－」－細胞変性が全く存在しない

「＋」－２５％以下の細胞単層が影響を受けている（抗ウイルス薬からの細胞単層の７５％防御）

「＋＋」－５０％以下の細胞単層が影響を受けている

「＋＋＋」－７５％以下の細胞単層が影響を受けている

「＋＋＋＋」－細胞単層の完全な変性

薬物のＣＣ_５０は、細胞変性を引き起こさなかったその最高濃度であった。

ＭＴＴ３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を使用した比色アッセイは、通常の条件下で、人工基質ＭＴＴを、分光光度的に計算することができるホルマザンに再処理する生細胞のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ系の機能の特徴に基づく。ＭＴＴのホルマザンへの変換は、細胞に有毒なウイルスまたは物質の作用下で細胞が死滅した場合に、用量依存性の様式で有意に減少する。

ＭＴＴ基質（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を、室温の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で濃度５ｍｇ／ｍｌに溶解した。体積２０μｌの濾過したＭＴＴ溶液を９６ウェルプレートのウェルに添加し、細胞と共に３７℃で２～４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、１５０μｌの９６度のエタノールを細胞に添加してホルマザン結晶を溶解した。溶液の光学密度を、Ｍｕｌｔｉｃａｎ ＦＣリーダー（「Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ」（ＵＳＡ））を波長５４０ｎｍで使用して分光光度的に決定した。対照と比較して細胞生存度を５０％（ＣＣ_５０）阻害する薬物濃度を、Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）Ｐｒｏのために作成したＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌにおいて線形回帰プログラムを使用して計算した。

有効濃度（ＥＣ_５０）の決定

ＥＣ_５０は、ウイルス特異的ＣＰＥの発生を５０％阻害する薬物の最小薬物濃度である。ＥＣ_５０を決定するために、細胞培養物に、試験ウイルスを１００ＴＣＤ_５０／０．１ｍｌの用量で感染させ、次いで、３７℃で６０分間（ｍｉｎ）インキュベートした。吸着後、非結合ウイルスを除去し、細胞を栄養培地で洗浄し、濃度の異なる薬物を、細胞を含む培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋２％胎児血清）に添加した。実験群（処置された培養物）におけるＣＰＥの欠如（対照群では存在していた）、ならびにウイルス対照と比較した処置された培養物での感染価の低下（対照群では感染価は存在）および実験群の感染価の相違によって、薬物のＥＣ_５０を決定することが可能になる。

薬物の選択指数（ＩＳ）の決定

薬物の選択指数（ＩＳ）を、ＣＣ_５０のＥＣ_５０に対する比として決定した。

細胞学的解析

細胞学的解析を、カバーガラス上のＳｈａｂａｄａｓｈ液（エチルアルコール中９部の硝酸銅＋１部のホルマリン）中で３０分間生育させた細胞の固定後に行った。細胞学的解析用の試料を、一般に受け入れられている手順にしたがってヘマトキシリンおよびエオシン染色を使用して染色した。

有糸分裂指数を、３０００～１００００個の観察した細胞を分析することによって計算し、ｐｐｍ（‰）（１０００個の細胞あたりの有糸分裂数）で表した。同時に、有糸分裂の病理学的形態の百分率を決定した。Ｖ．Ｎ．Ｂｌｙｕｍｋｉｎによって開発された病理学的有糸分裂の分析のための分類法を使用した。

細胞学的調製物の実験を、ＺｅｉｓｓのＳｔａｎｄａｒｄ２０顕微鏡において４０倍および１００倍のレンズ、１０倍の接眼レンズを用いて行った。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅

ＰＣＲ用の試薬セット（ＡｍｐｌｉＳｅｎｓ，Ｒｕｓｓｉａ）およびテンプレートとしてヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）遺伝子のコード配列を含むｐＵＣベクター２８に基づいたＤＮＡ組換えプラスミドを使用した標準的な手順にしたがって、ＰＣＲを行った。ＤＮＡ濃度は、１～２５μｇ／１００μｌ反応混合物であった。ＰＣＲ分析用のサーモスタット（「Ｔｅｒｚｉｋ」、ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｓｃｏｗ）においてＤＮＡを増幅させた。検討物質を、５～４０μｇ／ｍｌの濃度で試験した。

ＤＮＡウイルスを、製造者の説明書にしたがってｉｎｎｕＰＲＥＰ Ｖｉｒｕｓ ＤＮＡキット（Ａｎａｌｉｔｙｋ Ｊｅｎａ ＡＣ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＤＮＡ－ｓｏｒｂ－Ｂ ＤＮＡキット（ＡｍｐｌｉＳｅｎｓ，Ｒｕｓｓｉａ）を使用して、試料から単離した。ＤＮＡ濃度を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。エプスタイン・バーウイルスＤＮＡを、リアルタイム検出（ｑＴＯＷＥＲ ２．２増幅器、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造者の説明書にしたがってＡｍｐｌｉＳｅｎｓ（登録商標）ＥＢＶ－ＦＬキット（ＦＳＩＳ ＣＳＲＩ，Ｒｕｓｓｉａ）を使用して分析した。

結果

研究薬物の細胞傷害濃度（ＣＣ_５０）の決定

ＭＤＣＫ細胞、ＶＮＫ細胞、およびＭＤＢＫ細胞を使用して、各薬物のＣＣ_５０を決定した。細胞培養プレート中の少なくとも１０列のウェルを、栄養培地中の薬物の各々の希釈のために使用した。細胞培養物を含むプレートを、大気中３７℃および５％ＣＯ_２で５日間インキュベートした。試験培養物および対照培養物を毎日観察して、細胞変性効果（ＣＰＥ）の有無を決定した。ＣＰＥ度を、＋から＋＋＋＋までの４プラスシステムを使用した細胞形態の変化（丸まり、細胞の縮み、変性変化を受けた細胞のウェル表面からの排除）によって決定した。

薬物のＣＣ_５０は、細胞変性を引き起こさなかったその最高濃度であった。結果を表２に示す。

Ｒａｊｉリンパ芽球様細胞の培養物における物質の毒性分析において、毒性が最小の物質はグルタマートおよびグリシン－メチオニンベースの薬物であり、ＣＣ_５０値は４７０μｇ／ｍｌおよび２００μｇ／ｍｌ超であることを示す。

試験物質の細胞傷害効果の結果の分析において、天然のＺｎおよびＺｎの軽同位体の溶媒が検討されたＺｎ複合物より有毒であることを示す。したがって、クエン酸のＣＣ_５０は、１／１６０または０．０１４ｍｇ／ｍｌであり、クエン酸溶液中の複合物のＣＣ_５０は、Ｚｎ^６４については０．４５ｍｇ／ｍｌ、天然のＺｎについては０．１８ｍｇ／ｍｌであり、すなわち、その毒性は１／３～１／１０である。グルタミン酸溶液のＣＣ_５０は１：１６０または０．０２５ｍｇ／ｍｌであり、一方で、Ｚｎ^６４複合物では１／５－０．４ｍｇ／ｍｌであり、天然のＺｎでは０．００４６ｍｇ／ｍｌであり、すなわち、溶媒の毒性を、軽Ｚｎ－６４同位体は低下させ、天然のＺｎは増加させる；アスパラギン酸のＣＣ_５０は１／８０または０．０４２ｍｇ／ｍｌであり、軽Ｚｎ^６４複合物については１／１０または０．７５ｍｇ／ｍｌであり、天然のＺｎについては１／３２０－０．００４６ｍｇ／ｍｌであり、すなわち、同一のパターンが認められる。グリシンおよびメチオニン溶液のＣＣ_５０は１／１６０または０．０１８ｍｇ／ｍｌであり、軽Ｚｎ^６４同位体および天然の亜鉛の複合物ではそれぞれ１／１０または０．２および０．１５ｍｇ／ｍｌであり、すなわち軽Ｚｎ－６４同位体および天然の亜鉛の両方は、溶媒の毒性を１／１０に低下させる。

ＴＢＰＤＡ溶媒に関しては、異なる規則性が認められた：ＭＤＣＫ細胞について、軽同位体は溶媒の毒性を３０倍に増加させ、一方で、天然のＺｎはその毒性に影響を及ぼさなかった。

ＢＮＫ細胞およびＭＤＣＫ細胞の培養物において、ＭＤＣＫ細胞とほとんど同一のパターンが認められた。

天然の亜鉛および亜鉛同位体の抗ウイルス活性

抗インフルエンザ活性の査定

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物溶液の抗ウイルス活性を査定するために、毎日移植可能なＭＤＣＫ細胞培養物を使用した。３７℃およびＣＯ_２を含む大気のサーモスタットにおいて、１０％胎児血清（Ｎｕｎｃｌｏｎ，Ｓｕｒｆａｃｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を補足したＲＰＭＩ－１６４０培地を含むプレート中で細胞を培養した。細胞を、ウシ膵臓ＸＩＩＩ型由来のトリプシン（Ｓｉｇｍａカタログ番号８６４２，ＵＳＡ）で処理して、インフルエンザウイルス感染に対するその感度を増大させた。トリプシンの母液を、２ｍｇのトリプシンを１ｍｌのＤＭＥＭ培養培地に添加することによって調製した。

細胞を各ウェル中に５０μｌ添加することによって溶液で３回洗浄した；トリプシン濃度は、２μｇ／ｍｌであった。次いで、細胞増殖培地を除去し、１００ＴＣＤ_５０の用量（５０％組織細胞変性用量）のインフルエンザウイルスと置換し、その後に試験薬物を異なる濃度で添加した。

培養物を、顕微鏡を使用して毎日モニタリングしながらＣＯ_２インキュベーター中で３日間インキュベートした。

４８～７２時間のインキュベーション後、培養液を回収し、インフルエンザウイルスの感染価を、細胞培養の滴定によって決定した。

インフルエンザウイルスＡ／ＦＭ／１／４７（Ｈ１Ｎ１）株を、実験で使用した。ＭＤＣＫにおける感染価は３．０～９．０ｌｇ ＩＤ_５０であった。

物質の阻害効果を、対照と比較した試験物質の作用下でのウイルスの感染価の低下によって評価した。１．５～２．０ｌｇ ＴＣＤ_５０の減少は、特に化学療法指数が８またはそれを超える場合に、研究化合物の顕著な抗ウイルス活性を示す。

ＭＤＣＫ細胞培養物における天然のＺｎおよびそのＺｎ^６４同位体の溶液の高インフルエンザ活性（ＥＣ_５０）の査定結果を、表３に示す。図１Ａおよび図１Ｂも参照のこと。

シトラート溶液中のＺｎ－６４調製物および天然のＺｎ、グルタミン酸溶液およびグリシン－メチオニン溶液中のＺｎ－６４が抗インフルエンザ活性を示すと判断された。

抗ヘルペス活性の査定

亜鉛溶液、その同位体および溶媒の抗ヘルペス活性を研究するために、移植可能なＶＮＫ細胞培養物を使用した。３７℃およびＣＯ_２を含む大気のサーモスタットにおいて、１０％胎児血清（Ｎｕｎｃｌｏｎ，Ｓｕｒｆａｃｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を補足したＲＰＭＩ－１６４０培地を含むプレート中で細胞を培養した。

単純ヘルペスウイルス２型ＢＨ株を使用した。その感染価は、６．０～０．９ｌｇ ＩＤ_５０である。

ＶＮＫ細胞の１日培養物を、薬物の抗ウイルス活性を研究するために選択した。細胞増殖培地を除去し、試験調製物を異なる濃度で細胞単層に添加した。１時間の接触後、細胞にヘルペスウイルスを１００ＴＣＤ_５０の用量で感染させた。顕微鏡を使用して毎日モニタリングし、細胞単層がいかなるウイルスにも暴露されなかった対照培養物と比較したＶＮＫ細胞に対するＨＳＶの細胞病理学的効果によってウイルス再生を記録しながら、培養物をＣＯ_２インキュベーター中で５日間インキュベートした。

細胞に対するＨＳＶの細胞変性効果は、多核巨細胞の増殖および出現と組み合わせて、細胞自体がシンプラストの形成または丸まった細胞を形態学的に示す（図２）。

３日後、培養培地をプレートウェルから回収し、各薬物を各試料に添加した場合の各試料における感染力価を決定した。

ＶＮＫ細胞の培養物における天然のＺｎおよびそのＺｎ６４同位体の溶液の抗ヘルペス活性（ＥＣ_５０）の査定結果を、表４に示す。

ＥＤＤＡ中の天然のＺｎならびにグルタミン酸溶液中およびグリシン－メチオニン溶液中のＺｎ－６４は、抗ヘルペス活性を示した。

抗ＨＣＶ活性の査定

代用ＨＣＶであるウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）は、Ｃ型肝炎ウイルスの試験モデルであるので、この研究で使用した。

薬物の抗ウイルス活性を、異なる希釈度の薬物で処置し、次いで、ＢＶＤＶを１００ＴＣＤ_５０の用量で感染させたＭＤＢＫ細胞の培養物において研究した。培養物を、ウイルス対照において特異的な細胞変性（図３Ａおよび図３Ｂ）までサーモスタット中でインキュベートし、その後に感染性ウイルス力価を培養培地中で決定した。

代用ＨＣＶウイルスとしてのウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）モデルに対するＭＤＢＫ細胞培養物における天然のＺｎおよびそのＺｎ６４同位体の溶液の抗ウイルス活性（ＥＣ_５０）の査定結果を、表５に示す。

代用Ｃ型肝炎ウイルス（ＢＶＤＶ）に対する抗ウイルス活性は、シトラート溶液、ＥＤＤＡ、およびスルファート溶液中の天然のＺｎならびにグルタミン酸溶液中およびグリシン－メチオニン溶液中のＺｎ－６４によって示された。

異なる溶媒中の天然の亜鉛および軽亜鉛同位体の溶液の抗ウイルス活性の分析において、グルタミン酸溶液中およびグリシン－メチオニン溶液中の亜鉛の軽同位体が最も活性が高く、３つのウイルス感染の選択指数の値が高いことを示した。クエン酸溶液では、その抗ウイルス活性は、インフルエンザウイルスおよび代用Ｃ型肝炎ウイルス（ＢＶＤＶ）に対して顕著であり、天然のＺｎおよびその軽同位体の両方の活性はここでは等しかった。

ＥＤＤＡ、スルファート、およびアスパラギン酸の、軽亜鉛同位体および天然の亜鉛の塩は、インフルエンザウイルスおよびＢＶＤＶに対して抗ウイルス活性を有していた。ＴＢＦＤＡ溶媒中の軽Ｚｎ^６４同位体は、いかなる抗ウイルス活性も示さず、天然のＺｎは、インフルエンザ感染に対してのみ活性を示した。

抗ＥＢＶ活性の査定

エプスタイン・バーウイルス感染モデルに対するＲａｊｉ細胞の培養物中における天然のＺｎおよびそのＺｎ^６４同位体の溶液の抗ウイルス活性の査定結果を、表６に示す。

グルタミン酸溶液中およびグリシン－メチオニン溶液中の薬物が腫瘍学的エプスタイン・バーウイルスに対して最も活性が高く、選択指数は４７０および２００であった。

したがって、種々の溶媒中の天然の亜鉛およびその軽同位体の抗ウイルススクリーニングにおいて、グルタミン酸中およびグリシン－メチオニン中、ならびにクエン酸中の亜鉛化合物がＢＶＤＶに対して最も活性が高いことを示した。

細胞の有糸分裂の状況に対する研究化合物の有効性の研究

溶媒が細胞培養物に対して高い毒性を示すことを考慮して、細胞の有糸分裂の状況に対する異なる溶液中の亜鉛ベースの薬物の効果を調査した。種々の選択薬物で処置したＭＤＢＫ細胞の培養物に対して実験を行った。接触２４時間後に、細胞を固定し、標準的な技術を使用して細胞学的調製物を作製した。この実験から得られた結果を、表７および８に示す。

表７は、３つの薬物のみ－番号５（Ｚｎ６４のＥＤＤＡ溶液）、番号６（Ｚｎ６４のスルファート溶液）、および番号７（Ｚｎ６４のアスパラギン酸溶液）－が細胞の有糸分裂活性を有意に阻害し、有糸分裂の異常数が増加したことを示す。

表８は、３つの薬物－番号９－３のグリシン－メチオニン溶液および番号１０－２のＴＢＦＤＡ溶液中の天然のＺｎ－が細胞の有糸分裂活性を阻害し、有糸分裂の異常数が増加したことを示す。

無毒性濃度の天然のＺｎおよびその軽同位体に基づいた薬物の影響下でのＭＤＢＫ細胞の有糸分裂の状況についてのこの研究結果をさらに分析すると、ＥＤＤＡ溶液中のＺｎ^６４、スルファート溶液中のＺｎ^６４、ならびにアスパラギン酸溶液中のＺｎ^６４、ＴＢＦＤＡ溶液およびリシン－メチオニン溶媒中の天然のＺｎが細胞の有糸分裂の状況を有意に変化させた（すなわち、有糸分裂の異常数が増加した一方で、細胞の有糸分裂活性が有意に減少した）ことに留意すべきである。したがって、グルタミン酸中、グリシン－メチオニン中、およびクエン酸中の亜鉛の軽同位体および天然の亜鉛は、さらなる研究に有望であると見なすことができる。

したがって、薬物の細胞傷害性および抗ウイルス活性についてのこれらの研究は、Ｚｎ^６４シトラート、ＥＤＤＡ中のＺｎ^６４、Ｚｎ^６４アスパルタート、Ｚｎ^６４グルタマート、Ｚｎ^６４グリシン－メチオニンがＥＢＶに対する抗ウイルス剤として最も有望であることを示す。かかる選択は、溶媒が抗ウイルス活性を持たず、亜鉛複合物の一部として溶媒が細胞の有糸分裂の状況に影響を及ぼさず、グルタミン酸中およびグリシン－メチオニン中のＺｎ^６４複合物がインフルエンザウイルスおよびＢＶＤＶウイルスの再生を有効に阻害するという事実によって説明される。

「軽水」中の亜鉛グルタマートおよびその同位体の複合物の抗ウイルス活性の査定

水素同位体は、主に飲料水および食物と共に体内に入ることが公知である。水は体内に入ると種々の生化学過程に関与するようになり、その結果として、その原子は身体によって合成された種々の化合物の構造単位になることができる。どのようにして水の同位体組成物が身体によって合成されたタンパク質の同位体組成物で反映されるかについての明確な例は、Ｅｈｌｅｒｉｎｇｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００８，１０５．Ｐ．２７８８－２７９３に記載されている。著者は、ヒト毛髪（主にα－ケラチンタンパク質からなる）と飲料水との間の同位体組成物（Ｈ、Ｏ）が直接関係することを示している。

細胞では、水は、液体の水と氷との間の中間の特別な状態の構造をしている。有向水分子の層は、原形質中の全ての親水性高分子（タンパク質および核酸分子が挙げられる）を取り囲んでいる。

Ｄ_２Ｏ（重水）の強い抗有糸分裂作用が最初の実験で検出された。したがって、１９３８年に、Ｈ．Ｂａｒｂｏｕｒ ａｎｄ Ｅ．Ａｌｌｅｎ Ｂａｒｂｏｕｒ Ｈ．，Ａｌｌｅｎ Ｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９３８，３２．Ｐ．４４０－４４６には、飲料水として４０％Ｄ_２Ｏを与えられたマウスにおける移植されたリンパ肉腫および乳がんの成長遅滞および発達の逆行が記載されている。しかしながら、Ｄ_２Ｏ影響下の腫瘍罹患マウスの全寿命は、対照群より短かった。Ｂａｒｂｏｕｒ Ｈ．，Ａｌｌｅｎ Ｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９３８，３２．Ｐ．４４０－４４６。いくつかの他の研究において同一の問題が認められている。Ｆｉｎｋｅｌ Ａ．，Ｃｚａｊｋｅ Ｄ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｏｘｉｄｅ ｏｎ ａｓｃｉｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｍｉｃｅ／／Ｅｄ．Ｆ．Ｎ．Ｆｕｒｎｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，１９６０．Ｐ．７５５－７６２。Ｈｕｇｈｅｓ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｒｃｈ．Ｂｉｍｏｒｐｈ．Ａｃｔａ．１９５８，２８．Ｐ．５８－６１．Ｋａｔｚ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．１９５７，１８．Ｐ．６４１－６５９。最近の研究において、ＡｓＰＣ－１細胞、ＢｘＰＣ－３細胞 ＰＡＮＣ－１細胞の培養物における膵臓癌発生の活性が１０～３０％のＤ_２Ｏおよびゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｃｙｔｉｇｉｎｅ））の連続使用によって有意に減少することを示した研究は、特に注目に値する。同時に、著者は、１０～３０％Ｄ_２Ｏを含む水の消費が末梢血中の単核球レベルに有意に影響を及ぼさず、骨髄細胞に及ぼすＤ_２Ｏの有害作用が限定的であることを示している。Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００５，２５．Ｐ．３４０７－３４１１。他の研究では、対照的に、腫瘍学的疾患の処置における軽水（重水素枯渇水）の正の（伝統的な処置形態に追加された）効果が記述されている。

したがって、本研究の次の段階は、「軽水」（重水素枯渇水）に溶解した天然のＺｎおよびそのＺｎ－６４同位体の複合物の抗ウイルス活性の研究であった。

物質
・ 組成物：１２－１－Ｚｎ－６４グルタマート、重水素枯渇水中の濃度２．０ｍｇ／ｍｌ Ｚｎ
・ 組成物：１２－２－Ｚｎ－６４グルタマート、重水素枯渇水中の濃度１．５ｍｇ／ｍｌ Ｚｎ
・ 組成物：１２－３ Ｚｎグルタマート、重水素枯渇水中の濃度２．０ｍｇ／ｍｌ Ｚｎ
・ ４－蒸留重水素枯渇水（「軽水」）

細胞傷害性および抗ウイルス活性を、通常の蒸留水中の天然の亜鉛および亜鉛同位体の研究において上記と類似の手順にしたがって分析した。

結果を表９に示す。

「軽水」にＺｎ－６４グルタマート複合物を溶解すると、天然の亜鉛と比較して細胞培養物の同位体毒性が有意に増加すると判断した。

表９は、インフルエンザ、ヘルペス、および代用Ｃ型肝炎ウイルスの実験モデルに対する「軽水」に溶解したＺｎ－６４グルタマート複合物およびＺｎグルタマート複合物の抗ウイルス活性の研究結果を示す。結果は、「軽水」中の亜鉛調製物が全てのウイルスの再生を有意に阻害することを示す。しかしながら、「軽水」中の亜鉛調製物、特に亜鉛の軽同位体が有毒であるので、これらの調製物の選択指数は天然の亜鉛よりはるかに低かった。

細胞培養物に対する亜鉛複合物の毒性が高いことを考慮して、細胞の有糸分裂の状況に対する「軽水」中の亜鉛調製物の効果についての研究を行った。ＭＤＢＫ細胞培養物を、研究のために選択した。前述の細胞を、細胞に無毒の濃度の種々の選択薬物で処置した。接触２４時間後に、細胞を固定し、従来技術にしたがって細胞学的調製物を調製した。この実験から得られた結果を、表１０に示す。

表１０から認められるように、調製物１２－１および１２－３の有糸分裂活性は、対照群と僅かに異なっていた。これらの群内の異常な有糸分裂の数も、インタクトな細胞と僅かにことなっていた。

ｉｎ ｖｉｖｏでの亜鉛調製物の抗ウイルス活性

亜鉛調製物の抗ヘルペス活性を、０．０３ｍｌの用量での脳内投与を用いたＢＡＬＢ／ｃマウス（体重１８～２０ｇ）のヘルペスウイルス髄膜脳炎モデルにおいて研究した。全ての実験群において、薬物を０．１ｍｌの用量で腹腔内投与した。以下の亜鉛調製物を、実験で使用した。
１．４Ｂ－重水素枯渇水中のＺｎ－６４シトラート－３ｍｇ／ｍｌ
２．４Ｂ－２－重水素枯渇水中のＺｎシトラート－３ｍｇ／ｍｌ
３．８Ｂ－重水素枯渇水中のＺｎ－６４グルタマート－３ｍｇ／ｍｌ
４．８Ｂ－２－重水素枯渇水中のＺｎグルタマート－３ｍｇ／ｍｌ
５．９Ｂ－重水素枯渇水中のＺｎ－６４グリシン－メチオニン－１ｍｇ／ｍｌ
６．９Ｂ－２－重水素枯渇水中のＺｎグリシン－メチオニン－１ｍｇ／ｍｌ

薬物を、ヘルペスウイルスでの感染２４時間後に注射し、処置レジメンを観察した。

薬物活性を、実験群および対照群の致死性を比較することによって評価した。以下の要因を考慮した：
－動物の死亡率
－防御の多重度（ＭＰ）－対照群と比較した実験群におけるマウス死亡数の減少の多重度
－薬物の有効係数（ＥＩ）を、以下の式を使用して決定した。

処置レジメンの観察において、以下の動物群を実験で使用した。
１－以下を注射したマウス：ヘルペスウイルス＋薬物４Ｂ
２－ヘルペスウイルス＋薬物４Ｂ－２
３－ヘルペスウイルス＋薬物８Ｂ
４－ヘルペスウイルス＋薬物８Ｂ－２
５－ヘルペスウイルス＋薬物９Ｂ
６－ヘルペスウイルス＋薬物９Ｂ－２
７－Ｖｉｒｏｌｅｘ＋ヘルペスウイルス
８－通常の生理食塩液＋ヘルペスウイルス

結果を表１１に示す。

表１１に示したデータに基づいて、亜鉛の軽同位体および天然の亜鉛９Ｂ、特に９Ｂ－２に基づいた調製物が顕著な治療効果を有すると結論づけることができる。しかしながら、生存時間に関して、重水素枯渇水に溶解した天然の亜鉛およびグリシンメチオニンの複合物は、ここでの寿命が３０日間を超えるので、より有効であった。

亜鉛調製物の抗インフルエンザ活性についてのｉｎ ｖｉｖｏ研究

以下の亜鉛調製物を、実験で使用した：
１．４Ｂ－重水素枯渇水中のＺｎ－６４シトラート－３ｍｇ／ｍｌ
２．４Ｂ－２－重水素枯渇水中のＺｎシトラート－３ｍｇ／ｍｌ
３．７Ｂ－重水素枯渇水中のＺｎ－６４アスパラギナート－３ｍｇ／ｍｌ
４．７Ｂ－２－重水素枯渇水中のＺｎアスパラギナート－３ｍｇ／ｍｌ
５．８Ｂ－重水素枯渇水中のＺｎ－６４グルタマート－３ｍｇ／ｍｌ
６．８Ｂ－２－重水素枯渇水中のＺｎグルタマート－３ｍｇ／ｍｌ
７．９Ｂ－重水素枯渇水中のＺｎ－６４グリシン－メチオニン－１ｍｇ／ｍｌ
８．９Ｂ－２－重水素枯渇水中のＺｎグリシン－メチオニン－１ｍｇ／ｍｌ

ｉｎ ｖｉｖｏでの亜鉛調製物の抗インフルエンザ活性を決定するために、インフルエンザ肺炎のマウスモデルを使用した。

この目的のために、感染価５．０ｌｇ ＬＤ_５０の継代数１５で誘導されたインフルエンザウイルスのＢＡＬＢ／ｃマウス肺適応Ａ／ＦＭ／１／４７（Ｈ１Ｎ１）株を使用し、５日間のマウスの致死率は１００％であった。薬物の抗インフルエンザ活性についてのｉｎ ｖｉｖｏ研究を、処置レジメンにしたがって行った。インフルエンザウイルスを用いたマウスの鼻腔内感染２４時間後、マウスに、０．１ｍｌの亜鉛調製物溶液を腹腔内注射した。インフルエンザウイルスの対照および参照薬物Ｔａｍｉｆｌｕを準備した。薬物の有効性を、動物致死性阻害の有効性指数およびマウスの肺組織におけるインフルエンザウイルスの感染価によって決定した。研究の結果を、表１２に示す。

表１２に示したデータを分析すると、ＩＥおよび感染価の結果にしたがって、天然の亜鉛ならびに亜鉛の軽同位体４Ｂ、４Ｂ－２、および８Ｂ－２の調整物がマウスを致死性インフルエンザ感染から完全に防御することに留意すべきである。調製物８Ｂおよび７Ｂ－２は、マウスを致死性インフルエンザ感染から有効係数８０．０および６０．０で防御する。４Ｂ、４Ｂ－２、８Ｂ、および８Ｂ－２で処置したマウス群におけるインフルエンザウイルスを感染させた動物の生存期間も対照と比較して有意に増加したことに留意すべきである。

単純ヘルペスウイルスモデルに対する重水素枯渇水の抗ウイスル効果に言及したので、種々の用量で投与した薬物の効果を研究した。したがって、マウスあたり５０、１００、および２００μｌを感染した動物に投与した。

各々８匹のマウスからなる群を、実験に含めた。マウスに、１０ＬＤ５０の用量で脳内に注射した（３０μｌ／マウス）。２４時間後に最初の薬物投与を行った。感染後、１日おきに合計で４回注射した。３０μｌの通常の生理食塩液を脳内に注射した非感染マウスおよびＨＳＶを感染させたマウスは、対照としての役割を果たした。

したがって、単純ヘルペスウイルスモデルに対する重水素枯渇水の防御効果が示され、これは、医薬の成分としてのその性質を調査する見込みがあることを示す。

考察

この研究は、亜鉛およびその同位体の異なるアミノ酸との組成物および細胞培養培地または重水素枯渇水にさらに溶解した溶液の影響に充てられている。

亜鉛が細胞へのウイルスの感染過程に重要であるという十分な証拠がある。それにもかかわらず、ウイルスと細胞亜鉛との間のこの相互作用の分子基盤は依然としてあまり知られていない。この現象には２つの機序が存在する可能性がある。第１に、亜鉛イオンは、ウイルスの一部および細胞タンパク質の一部のウイルスの再生における公知の補因子であり、亜鉛イオンは、種々の転写補因子の活性を変化させることができ、したがって、細胞およびウイルスの遺伝子発現に影響を及ぼす。タンパク質補因子としての亜鉛の役割は、ウイルス間で非常に共通している。ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルス（レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、およびパピローマウイルスなど）の亜鉛結合タンパク質が記載されている。Ｇｏｓｗａｍｉ Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２，６６，ｐ．１７４６－１７５１。Ｔｕｒｋ Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７．ｐ－３６７１－３６７３。Ｅｒｋ Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３，７７．Ｐ３５９５－３６０１。Ｆｒａｅｆｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，６８．ｐ．３１－５４－３１６２。Ｇｒｏｓｓｍａｎ Ｓ．，Ｌａｉｍｉｎｓ Ｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９８９，４．ｐ．１０８９－１０９３。亜鉛を含むこれらのウイルスタンパク質は、細胞タンパク質の亜鉛フィンガーに類似している。亜鉛フィンガーは、ＤＮＡに結合する主なタンパク質群の１つである。これらは転写の制御因子であり、特徴的なドメインを含み、このドメインは、２個のシステイン残基および２個のヒスチジン残基を含む。これらのアミノ酸は亜鉛イオンと相互作用し、これらの間に配置されたポリペプチド鎖は指の形状のループを形成する。亜鉛フィンガーＣ_２Ｈ_２は、真核生物Ｃ_２Ｈ_２の転写因子で生じるＤＮＡ結合タンパク質ドメインの重要なファミリーを形成する。

タンパク質－タンパク質およびタンパク質－核相互作用に関与し得るウイルスおよび細胞の亜鉛フィンガーの両方は、非常に保存されており、タンパク質機能に極めて重要である。図４。ＨＩＶ感染およびパピローマウイルスの構造タンパク質における亜鉛フィンガーの役割について最も研究されている。亜鉛フィンガータンパク質の変異、すなわち、これらの化合物からの亜鉛の抽出により、細胞からのウイルスの放出機能が破壊され、これが、ウイルス感染処置におけるアプローチのうちの１つとして役立ち得る。他方では、細胞内でのウイルスの複製中に、細胞内で亜鉛の不均衡が認められ、細胞ホメオスタシスを正常化するために、細胞系への亜鉛の外因性導入ストラテジーを使用して、この不均衡を防止することができる。

基本的に、第２の概念、すなわち、亜鉛およびその同位体のアミノ酸との複合物の使用およびその後の培養培地（ＲＰＭＩ－１６４０）または重水素枯渇水での溶解を、本研究で使用した。

インフルエンザ、ヘルペス、およびＨＣＶ（ＢＶＤＶ）ウイルスの代用モデルの再生に対する亜鉛およびその軽同位体の異なるアミノ酸との複合物および溶液の効果についての一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究で得られた結果は、亜鉛およびその軽同位体の溶液がインフルエンザ、ヘルペス、およびＨＣＶ（ＢＶＤＶ）ウイルスの代用モデルの再生を有効に阻害することを示す。

クエン酸中のＺｎ－６４およびＺｎ溶液、グルタミン酸中のＺｎ－６４およびＺｎ、ならびにグリシン－メチオニン溶液中のＺｎ－６４およびＺｎが最も有望であった。以下によって確認する：
－インフルエンザおよびヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよび代用Ｃ型肝炎ウイルス（ＢＶＤＶ－ウシウイルス性下痢症ウイルス）の再生の阻害；
－細胞の有糸分裂の状況に対して影響がないこと；
－亜鉛の軽同位体およびＺｎグリシン－メチオニンのシトラートおよびグルタマートによるＲＮＡおよびＤＮＡの合成阻害

重水素枯渇水中の亜鉛グルタマートおよび亜鉛軽同位体グルタマート複合物は、インフルエンザ、ヘルペス、および代用Ｃ型肝炎ウイルスの再生を有効に阻害したが、重水素枯渇水中のＺｎの軽同位体のＣＣ_５０が遥かに高いので、全てのウイルス再生系における軽同位体の有効係数は、天然の亜鉛の数分の１であった。

無毒の濃度では、重水素枯渇水に溶解された天然のＺｎ複合物、亜鉛の軽同位体を含む複合物のいずれも細胞の有糸分裂の状況にいかなる影響も及ぼさなかった。

重水素枯渇水中のＺｎ－６４グルタマート複合物は、調製物１２－１（Ｚｎ－６４濃度は１．５ｍｇ／ｍｌである）および１２－２（Ｚｎ－６４濃度は１．５ｍｇ／ｍｌである）についてそれぞれ５０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌおよび１．１μｇ／ｍｌの濃度でＲＮＡおよびＤＮＡの合成を有効に阻害した。

以下のヘルペス髄膜脳炎およびインフルエンザ肺炎の実験モデルの例から、調製物の有効性が天然のＺｎおよびその同位体の複合物中の溶媒の相互作用に依存することが示された：
－天然のＺｎおよびその軽同位体のグリシン－メチオニン複合物は、感染価の阻害のその選択指数、寿命が参照薬物Ｖｉｒｏｌｅｘより顕著であることによって証明されるように、ヘルペス髄膜脳炎モデルに治癒効果をもたらした；
－クエン酸およびグルタミン酸を含む天然のＺｎおよびその軽同位体の複合物は、高い有効係数、感染価の阻害、および寿命が示すように、インフルエンザ肺炎モデルに対して顕著に治療効果があった。

単純ヘルペスウイルスモデルに対する重水素枯渇水の抗ウイスル効果を示す。

実施例２ エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に対するＺｎ^６４ベースの調製物の抗ウイルス活性の査定

この研究を、ＥＢＶを感染させたリンパ芽球様Ｒａｊｉ細胞を使用して行った。Ｒａｊｉ細胞は、細胞ＤＮＡ中に細胞あたり６３コピーのウイルスゲノムを含むが、ビリオンを全く産生しないＥＢＶ形質転換ヒトＢ－リンパ球である。細胞培養物を、２４ウェル懸濁培養プレート中の、９０％ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清、および抗生物質からなる増殖培地中にて３７℃および５％ＣＯ_２でインキュベートして生育させた。この細胞株は、エプスタイン・バーウイルスに対する物質の高ウイルス活性研究の良好なモデルである。

新規物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性を研究する場合、細胞培養物に対して高い毒性を示す薬物はその後の研究に望ましくないので、その細胞傷害性レベルを決定することが最初に必要である。決定すべき値は、細胞集団の生存度を５０％低下させる物質の細胞傷害性濃度（ＣＣ_５０）と定義する。

研究調製物の細胞傷害性を、ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２－５－ジフェニルテトラゾリウム（ｔｅｔｒｏｚｏｌｉｕｍ）ブロミド）アッセイ（一般に使用されている比色アッセイの１つ）（Ｓｉｇｍａ ＵＳＡ）を使用して査定した。このアッセイは、コハク酸デヒドロゲナーゼなどのミトコンドリア酵素の活性の測定によって細胞のミトコンドリア機能を決定することによって細胞生存度を決定した。このアッセイでは、ＭＴＴは、ＮＡＤＨによって紫色ホルマザンに還元され、これを分光光度法で定量することができる。ＭＴＴのホルマザンへの変換は、細胞に有毒なウイルスまたは物質の作用下で細胞が死滅した場合に用量依存性様式で顕著に減少する。紫色を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）リーダーを使用して５４０ｎｍの励起波長で測定した。

以下の表は、異なる用量の研究調製物で処置した細胞の生存度の検出結果を示す。

表１４から認められるように、グルタマートベースの調製物およびグリシン－メチオニンベースの調整物の毒性が最小である。試験物質のＣＣ_５０値は、４７０および２００超である。

したがって、研究調製物の細胞傷害性および抗ウイルス活性の査定結果の分析により、Ｚｎ^６４シトラート、Ｚｎ^６４ＥＤＤＡ、Ｚｎ^６４アスパルタート、Ｚｎ^６４グルタマート、およびグリシン－メチオニン中のＺｎ^６４が抗ＥＢＶ感染に最も有望な物質であることを示す。

実施例３ ＣＯＶＩＤ－１９の処置におけるＫＬＳ－１の使用

ＫＬＳ－１（^６４Ｚｎ_ｅアスパルタート）の作用機構は、新規の細胞に対する受容体－亜鉛金属酵素ＡＣＥ２によるウイルス侵入の予防および既に罹患している細胞のコロナウイルス再生の阻害に基づく。ホメオスタシス修復効果は、リボソームにおける細胞タンパク質産生の修正によって得られる。

ＫＬＳの合成およびＣｏｖｉｄ－１９患者に対する第Ｉ～ＩＩ相研究は、開始する用意がある。非常に多数の患者の処置に十分な量のＫＬＳ－１を、短期間で産生することができる。

ＫＬＳ－１は、Ｃｏｖｉｄ－１９コロナウイルスだけでなく、可能性のある任意の将来の変異誘導体にも打ち勝つのに重要な新規のプラットフォームを表す。

インフルエンザ、ヘルペス、およびＨＣＶ（ＢＶＤＶ）ウイルスの代用モデルの再生に対する亜鉛およびその軽同位体の異なるアミノ酸との複合物および溶液の効果についての一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究で得られた結果は、亜鉛およびその軽同位体の溶液がインフルエンザ、ヘルペス、およびＨＣＶ（ＢＶＤＶ）ウイルスの代用モデルの再生を有効に阻害することを示す。

クエン酸中のＺｎ－６４および天然のＺｎの溶液、グルタミン酸中のＺｎ－６４およびＺｎ、ならびにグリシン－メチオニン溶液中のＺｎ－６４およびＺｎが最も有望であった。以下によって確認する：

インフルエンザおよびヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ならびに代用Ｃ型肝炎ウイルス（ＢＶＤＶ－ウシウイルス性下痢症ウイルス）の再生阻害。

細胞の有糸分裂の状況への影響なし。

亜鉛－６４の安定な軽同位体およびＺｎ－６４グリシン－メチオニンのシトラートおよびグルタマートによるＲＮＡおよびＤＮＡの合成の阻害。

重水素枯渇水中のＺｉｎｃグルタマート複合物および亜鉛－６４軽同位体グルタマート複合物は、インフルエンザ、ヘルペス、および代用Ｃ型肝炎ウイルスの再生を有効に阻害したが、重水素枯渇水中のＺｎの軽同位体のＣＣ_５０が遥かに高いので、全てのウイルス再生系における軽同位体の有効係数は、天然の亜鉛の数分の１であった。

研究調製物の細胞傷害性および抗ウイルス活性の査定の結果は、Ｚｎ^６４シトラート、Ｚｎ^６４ ＥＤＤＡ、Ｚｎ^６４アスパルタート、Ｚｎ^６４グルタマート、およびグリシン－メチオニン中のＺｎ^６４が抗ＥＢＶ感染に最も有望な物質であることを示す。

抗炎症効果およびホメオスタシス効果

Ｚｎ－６４ベースのＫＬＳ－１の別の重要な特徴は、強力な全身性の抗炎症効果およびホメオスタシス効果である。データを、肥満（Ｃｏｖｉｄ－１９の重要な悪化因子でもある）、１型および２型糖尿病、パーキンソン病、およびアルツハイマー病の処置におけるＫＬＳ－１有効性の前臨床研究中に得た。

ＫＬＳ－１の抗炎症作用およびホメオスタシス作用の両方は、サイトカインストームを予防するかその強度を低下させるため、および免疫系の効率を犠牲にすることのない恒常的様式で炎症を軽減するためのＣｏｖｉｄ－１９患者の処置に極めて重要である。

脂肪組織は、身体のエネルギー貯蔵所であるだけでなく、多数の組織および臓器（視床下部、下垂体、膵臓、肝臓、骨格筋、腎臓、内皮、免疫系などが挙げられる）の応答を調整する内分泌、パラクリン、およびオートクリンのシグナルの複合体を介した代謝の制御に能動的に関与する臓器でもある。したがって、脂肪組織は、５０を超えるタンパク質因子、ホルモン、および成長因子（サイトカインが挙げられる）を分泌する。炎症促進性サイトカイン（ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γなど）および抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＧＦなど）が存在する。

脂肪細胞中での活性酸素種の過剰産生による結果の１つは、シグナル伝達カスケードの阻害であり、それにより、マクロファージによる炎症促進性サイトカインの産生が増加し、マクロファージが脂肪組織に浸潤することでその質量が増加する。かかる障害の結果は、肥満症を発症している患者の体内での全身性慢性炎症の形成である。活発に考察されている現代の概念によれば、これは脂肪組織の準臨床的慢性炎症であり、肥満および肥満関連疾患の病理発生における重要な関連事項の１つと考えるべきである。脂肪組織の慢性炎症は、細胞浸潤、線維症、微小循環の変化、アジポカイン分泌障害、および脂肪組織代謝障害、ならびにかかる非特異的炎症マーカー（Ｃ反応性タンパク質、フィブリノゲン、および白血球など）の血液レベルの増加を特徴とする。

脂肪組織中だけでなく、血清中の炎症促進性サイトカインレベルの増加は、脂肪組織に炎症過程を生じる結果となる。

内因性の生物学的に活性なメディエーターとしての、細胞間および系間の相互作用を制御するサイトカインは、細胞の生育、分化、機能的活動、およびアポトーシスを制御することによって細胞の生存に影響を及ぼす。サイトカインは、生理学的条件下で病理学的作用に応答して免疫、内分泌、および神経系の作用の協調を確実にする。サイトカインはリンパ球、単球、および組織マクロファージによって産生されると以前は考えられていた。しかしながら、最近の研究結果では、任意の炎症過程におおいて見られるような肥満では、好中球、Ｔリンパ球、およびその後の常在マクロファージの脂肪組織への浸潤が早期に生じ、最初の炎症機序が決定づけられることを示している。マクロファージが脂肪細胞の肥大に寄与し、この肥大には機能的活動の増加およびサイトカイン合成の増加を伴い、炎症応答がさらに強化されることが示されている。肥大した脂肪細胞は、ケモカインおよびその受容体を強力に分泌し、それにより新規の好中球、マクロファージ、およびリンパ球の流入を刺激し、したがって、肥大脂肪細胞のさらなる増加、炎症応答の保存および強化に寄与する。脂肪細胞は、マクロファージによるサイトカインの分泌を増加させ、マクロファージが脂肪細胞に作用して、脂肪組織細胞を肥大および活性化させる。肥大した脂肪細胞は、リンパ球およびマクロファージのように、サイトカインを産生し、補体を活性化させ、一連の炎症過程の連鎖を引き起こすことが見出されている。結果として、炎症が固定化し、全身に広がるようになる。さらに、脂質過酸化生成物（ｔｒａｎｓ－４－オキシ－２－ノネナールおよびマロニックジアルデヒドなど）は、単球およびマクロファージの化学誘引物質である。蓄積した脂肪組織中での脂質過酸化過程の強化は、肥満における脂肪組織へのマクロファージの誘引および浸潤に寄与し、したがって、炎症反応の開始に能動的に寄与する。

結果的に、脂肪組織質量が増加すると、脂肪細胞および脂肪組織に組み込まれたマクロファージの両方によって合成された炎症促進性サイトカインが常に供給され、それにより、炎症過程が慢性化し、体内の炎症が維持される。炎症過程の強度が低いと直接的な臨床症状は生じないが、それと同時に、この過程は事実上全身性となり、これは、広範な臓器および組織に影響を及ぼしてその代謝を変化させ、その機能および免疫系反応を害することを意味する。

上記を考慮して、次の段階は、アスパルタート形態中のＺｎ－６４安定同位体の投与が肥満動物におけるサイトカインプロフィールに影響を及ぼすかどうかを解明することである。この目的のために、実験動物における脂肪組織および血清中の主な炎症促進性サイトカイン（ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γ）および抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＴＧＦ）の濃度を決定し、それにより、本発明者らは、脂肪組織における炎症過程の強度についての結論を導き、かかる炎症過程が全身性であるかどうを査定することが可能である。

得られた結果によれば、肥満の発症は、高脂肪食を与えた動物の脂肪組織中の全ての分析した炎症促進性サイトカインレベルの増加を伴い（表１６）、これは炎症過程の活性化を示す。

さらに、炎症過程が延長すると、種々の合併症を発症し得る。炎症過程の強化および炎症性中間体の蓄積の増加は、組織の損傷および臓器機能不全を生じ得る。

＊－差は、動物の対照群に対して有意である；＃－差は、肥満の動物モデル群に対して有意である
注：Ｃ－対照；Ｃ＋亜鉛－アスパルタート形態のＺｎ－６４安定同位体が投与された対照；ＤＩＯ－食事誘導性肥満；ＤＩＯ＋亜鉛６４－アスパルタート形態のＺｎ－６４安定同位体が投与された食事誘導性肥満。

高レベルの炎症促進性サイトカイン（上記のサイトカインが挙げられる）がβ細胞のアポトーシスを引き起こすことができることが証明されている。高濃度のＩＬ－１２（その発現はＩＦＮ－γによって活性化される）は、ＣＤ８＋リンパ球を膵臓に浸潤させ、急性膵炎を発症させる。ＩＬ－１βは、これらの細胞の表面上の特異的受容体への結合を介して、ＮＦ－κＢ媒介アポトーシスを活性化し、それにより、ＤＮＡが断片化して細胞の機能的活動が喪失される。さらに、ＩＬ－１βはまた、末梢組織のインスリン抵抗性の発症に寄与する因子のうちの１つと見なされ得る。ＩＬ－１βは、インスリン受容体基質（ＩＲＳ）－１中のセリン残基のリン酸化によってインスリンシグナル伝達に影響を及ぼすＩκＢキナーゼ－βを活性化することが示されている。さらに、ＩＬ－１βは、肝臓内の脂肪生成を活性化し、脂肪細胞中のトリグリセリドおよび遊離脂肪酸のレベルの増加に寄与することによってインスリン作用への耐性を間接的に増加させることができる。

ＩＬ－６は、末梢血中の脂肪組織量の増加に正比例して蓄積されることが示されている。脂肪細胞は、免疫系に次ぐ二番目に大きなＩＬ－６の供給源である：３５％の循環ＩＬ－６は脂肪の細胞によって合成される。その血中濃度は、体型指数に正比例し、肥満で増加する。同時に、体重の減少に伴ってＩＬ－６の血液レベルが減少する。ＩＬ－６が過剰になると、インスリン受容体サブユニットのうちの１つの合成が抑制されることによってインスリン抵抗性が増悪する。内蔵脂肪組織中で脂肪分解が活性化されることにより、ＩＬ－６は脂肪肝臓症および全身アテローム性動脈硬化症の進行性の発症に寄与する。さらに、ＩＬ－６はＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（肥満に関連する別の因子）の産生増加を誘導する。

炎症促進性サイトカインのレベル、したがって、生物学的効果の制御機序の１つは、抗炎症性サイトカイン群によって実行される。これらのサイトカインは、特定の遺伝子の転写に影響を及ぼすことによって炎症促進性サイトカインの合成を阻害し、インターロイキンの受容体アンタゴニストＲＡＩＬの合成を誘導し、可溶性受容体の産生を増強し、細胞上の炎症促進性受容体の密度を低下させることができる。したがって、炎症促進性サイトカインのプロフィールに対するアスパルタート形態のＺｎ－６４安定同位体の効果の可能な機序を明確にするために、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、およびＴＧＦのレベルを決定した。

肥満動物における抗炎症性サイトカインレベルの減少がわずかであるという状況にもかかわらず、炎症促進性サイトカインレベルの変化が検出された。同時に、アスパルタート形態のＺｎ－６４安定同位体で処置された動物では、抗炎症性サイトカインレベルは、肥満の無処置モデルで高かっただけでなく、対照群由来の動物においても高かった。

試験物質で処置された対照群由来の動物に変化がなかったことは、アスパルタート形態のＺｎ－６４安定同位体の長期使用が安全であり、病的状態の発症に対してのみ治療効果を示すことができることを示唆することが強調されるべきである。

前述のように、肥満の病理発生には全身性慢性炎症過程が伴い、その強度を、炎症促進性および抗炎症性のサイトカインの血清レベルによって査定することができる。

肥満動物の血清中のサイトカインプロフィールの分析（表１７）により、炎症促進性サイトカインレベルが増加し、この増加は脂肪組織から入手したデータと比較するとさらに顕著であった。抗炎症性サイトカインＩＬ－４レベルは、統計的に有意に変化しなかった。肥満動物におけるＩＬ－１０の血清レベルのわずかな増加は、代謝障害に対する身体のある特定の代償性反応と見なすことができる。

Ｚｎ－６４ベースのＫＬＳ－１で処置した動物では、抗炎症性サイトカインレベルが増加し、対照群由来の動物よりはるかに高いという状況にもかかわらず、炎症促進性サイトカインレベルが減少した。

＊－差は、動物の対照群に対して有意である；＃－差は、肥満の動物モデル群に対して有意である
注：Ｃ－対照；Ｃ＋亜鉛－アスパルタート形態のＺｎ－６４安定同位体が投与された対照；ＤＩＯ－食事誘導性肥満；ＤＩＯ＋亜鉛－アスパルタート形態のＺｎ－６４安定同位体が投与された食事誘導性肥満。

サイトカインプロフィールに対する亜鉛の効果の基本機序の１つは、酸化ストレスに感受性を示す転写因子の阻害であり得る。また、亜鉛－６４は、炎症促進性サイトカイン（ＩＬ－６およびＩＬ－８など）をコードする遺伝子を部分的にブロックし得る。

Ｚｎ－６４アスパルタート（ＫＬＳ－１）の抗炎症効果は、炎症の病理発生に依存しない。これは、健康なホメオスタシスへの修復の結果である。

本発明をその詳細な説明と併せて記載しているが、前述の説明は、例示を意図し、本発明の範囲を制限せず、本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義されると理解すべきである。他の態様、利点、および修正形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。したがって、本発明のある特定の特徴のみを例示および記載しているが、当業者は多くの修正および変更を行えるであろう。したがって、添付のクレームが、本発明の真の意図の範囲にあるように全てのかかる修正および変更を対象とすることが意図されると理解すべきである。

本発明のこれらの態様および他の態様にしたがって多数の他の態様が提供される。本発明の他の特徴および態様は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかとなるであろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ウイルス感染により引き起こされる疾患または状態を処置または予防する方法であって、治療有効量または予防有効量のＺｎを含む組成物をそれを必要とする被験体に投与する工程を含み、ここで、前記組成物が、 ^６４ Ｚｎ _ｅ 化合物またはその塩を含み、ここで、前記 ^６４ Ｚｎ _ｅ 化合物またはその塩が少なくとも８０％の ^６４ Ｚｎ _ｅ であるか、または前記組成物が、天然のＺｎまたはＺｎ－６４を含む溶液を含む、方法。
（項目２）
前記組成物が、培養培地または重水素枯渇水に溶解された亜鉛および／またはその同位体のアミノ酸との複合物である亜鉛を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記組成物が、シトラート溶液、グルタミン酸溶液、グリシン－メチオニン溶液、ＥＤＤＡ溶液、スルファート溶液、アスパラギン酸溶液、またはＴＢＰＤＡ溶液である天然のＺｎまたはＺｎ－６４を含む溶液を含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ウイルス感染が、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス２型を含む単純ヘルペスウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスを含む肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むコロナウイルス、エボラウイルス、またはＨＩＶの感染である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記ウイルス感染が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２））の感染である、項目４に記載の方法。
（項目６）
希釈剤または賦形剤をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記希釈剤が重水素枯渇水である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記組成物が ^６４ Ｚｎ _ｅ 化合物またはその塩を含み、前記 ^６４ Ｚｎ _ｅ 化合物が少なくとも９５％の ^６４ Ｚｎ _ｅ である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記組成物が ^６４ Ｚｎ _ｅ 化合物またはその塩を含み、前記 ^６４ Ｚｎ _ｅ 化合物が少なくとも９９％の ^６４ Ｚｎ _ｅ である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
^６４ Ｚｎ _ｅ が、２個のアスパラギン酸分子を有するアスパラギナート（化学式－Ｃ _４ Ｈ _５ Ｏ _４ Ｎ ^６４ Ｚｎ _ｅ ）、スルファート、およびシトラートからなる群から選択される塩の形態である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記組成物が注射によって投与される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記組成物が経口投与される、項目１～１０のいずれかに記載の方法。

Claims (12)

1. ウイルス感染により引き起こされる疾患または状態を処置または予防する方法であって、治療有効量または予防有効量のＺｎを含む組成物をそれを必要とする被験体に投与する工程を含み、ここで、前記組成物が、^６４Ｚｎ_ｅ化合物またはその塩を含み、ここで、前記^６４Ｚｎ_ｅ化合物またはその塩が少なくとも８０％の^６４Ｚｎ_ｅであるか、または前記組成物が、天然のＺｎまたはＺｎ－６４を含む溶液を含む、方法。
2. 前記組成物が、培養培地または重水素枯渇水に溶解された亜鉛および／またはその同位体のアミノ酸との複合物である亜鉛を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記組成物が、シトラート溶液、グルタミン酸溶液、グリシン－メチオニン溶液、ＥＤＤＡ溶液、スルファート溶液、アスパラギン酸溶液、またはＴＢＰＤＡ溶液である天然のＺｎまたはＺｎ－６４を含む溶液を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記ウイルス感染が、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス２型を含む単純ヘルペスウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスを含む肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むコロナウイルス、エボラウイルス、またはＨＩＶの感染である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
5. 前記ウイルス感染が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２））の感染である、請求項４に記載の方法。
6. 希釈剤または賦形剤をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
7. 前記希釈剤が重水素枯渇水である、請求項６に記載の方法。
8. 前記組成物が^６４Ｚｎ_ｅ化合物またはその塩を含み、前記^６４Ｚｎ_ｅ化合物が少なくとも９５％の^６４Ｚｎ_ｅである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
9. 前記組成物が^６４Ｚｎ_ｅ化合物またはその塩を含み、前記^６４Ｚｎ_ｅ化合物が少なくとも９９％の^６４Ｚｎ_ｅである、請求項８に記載の方法。
10. ^６４Ｚｎ_ｅが、２個のアスパラギン酸分子を有するアスパラギナート（化学式－Ｃ_４Ｈ_５Ｏ_４Ｎ^６４Ｚｎ_ｅ）、スルファート、およびシトラートからなる群から選択される塩の形態である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
11. 前記組成物が注射によって投与される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
12. 前記組成物が経口投与される、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。

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