JP2023528978A - 悪性膠芽腫のような癌の治療及び予防方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、神経膠芽腫のような癌の治療及び予後に関する。ここで、本発明者らは、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）に罹患している患者のサンプルにおけるｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐにおけるＮ６－アデノシンメチル化の存在の影響についての研究に集中した。彼らの研究は、ＸＩＡＰの発現に対するｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ及びそのアデノシンメチル化の影響に特に焦点を当てた。ＸＩＡＰは、カスパーゼ－３及び－７の活性化の阻害を介して抗アポトーシスタンパク質として作用し、高いＸＩＡＰ発現は、幾つかの固形腫瘍における低い生存率に関連する。したがって、ＸＩＡＰ ｍＲＮＡ発現のｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ媒介抑制は、カスパーゼ－３及び－７の活性及びアポトーシスを支配する機構として現れる。理論的には、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの存在下では、ＸＩＡＰ ｍＲＮＡ発現が抑制され、カスパーゼ－３及び－７が活性化されてアポトーシスを促進することができる。したがって、本発明は、癌に罹患している患者の生存期間の予後を決定するためのインビトロ方法であって、ｉ）前記患者からのサンプルにおけるｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ及び／又はＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）の発現量を決定することから成るステップを含む方法、並びに、癌の治療を必要とする被験体における癌の治療に使用するためのＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）に関する。

Description

本発明は、癌に罹患している患者の生存期間の予後を決定するためのインビトロ方法であって、ｉ）前記患者からのサンプルにおけるｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ及び／又はＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）の発現量を決定することから成るステップを含む方法、並びに、癌の治療を必要とする被験体における癌の治療に使用するためのＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）に関する。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、翻訳リプレッサーの機能に向けてタンパク質発現を調節する短い非コードＲＮＡである。したがって、ｍｉＲＮＡは、増殖、アポトーシス、免疫原性、発生及び分化を含む多くの細胞プロセスの重要な調節因子である。ｍｉＲＮＡ生合成は、ｍｉＲＮＡ遺伝子のＤＮＡメチル化に対する生理学的状態及び病理学的状態の両方においてエピジェネティックに調節され得る。Wangらは、ｍｉＲＮＡ遺伝子の約５０％の発現が、ＣｐＧアイランドに関連するので、ＤＮＡメチル化によって推定的に調節されることを報告している［１］。様々なＤＮＡメチル化特異的メチルＣｐＧ結合ドメインタンパク質（ＭＢＤ）もまた、ｍｉＲＮＡ遺伝子を転写的に調節することが見出された［２］。最後に、Malumbresらは、ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現が、リジンメチル化及びアセチル化などのヒストン修飾によっても調節されることも報告している［３］。
幾つかの刊行物は、化学修飾がｍｉＲＮＡにおいて起こり得ること、及び、これらの修飾がｍｉＲＮＡのプロセシング又は機能性を調節することを報告している。これらの修飾のうちの幾つかは、ｍｉＲＮＡの５’末端におけるリン酸に影響を及ぼし得る。したがって、Xhemalce他（２０１２）は、ｍｉＲＮＡ（例えば、プレ－ｍｉＲ－１４５など）のＢＣＤＩＮ３Ｄ媒介性のホスホ－ジメチル化がｍｉＲＮＡ成熟を負に調節し、腫瘍形成性表現型に影響を及ぼすことを報告する［４］。ｍｉＲＮＡの他の化学修飾は、ｍｉＲＮＡの内部塩基に影響を及ぼす。Alarcornら（２０１５）及びBerulavaら（２０１５）は、ｍｉＲＮＡがアデノシンメチル化され得ること、及び、このメチル化の存在がｍｉＲＮＡ生合成の開始を促進し、アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡの安定性を増加させることをそれぞれ報告している［５］［６］。また、Konnoら（２０１９）は、ｍｉＲＮＡがアデノシンメチル化され得ることも報告している［７］。また、この報告では、ｍｉＲＮＡのアデノシンメチル化が早期癌の診断のためのバイオマーカーとして使用できるという考えを紹介した。Pandolfiniら（２０１９）は、ｍｉＲＮＡがグアノシンメチル化され得ること、及び、このメチル化がｍｉＲＮＡ成熟を阻害することを報告している［８］。最近、本発明者らの研究室は、ｍｉＲＮＡがシトシンメチル化され得ること、及び、このメチル化の存在がｍｉＲＮＡ機能を抑制することを発表した［９］。
幾つかの酵素がこれらの塩基修飾を触媒する。すなわち、ＭＥＴＴＬ１（メチルトランスフェラーゼ様タンパク質１、Uniprot Q9UBP6）及びＤＮＭＴ３Ａ（ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３ Ａ、Uniprot Q9Y6K1）は、ｍｉＲＮＡのグアノシン及びシトシンメチル化をそれぞれ促進すると定義されている［８］［９］。複合体ＭＥＴＴＬ３－ＷＴＡＰ－ＭＥＴＴＬ １４は、ｍｉＲＮＡアデノシンメチラーゼ又はライタとして記載されており、一方、ＦＴＯ（脂肪量及び肥満関連タンパク質、Uniprot Q9C0B1）及びＡＬＫＢＨ ５（アルキル化ＤＮＡ修復タンパク質ａｌｋＢホモログ５、Uniprot Q6P6C2）は、ｍｉＲＮＡアデノシンデメチラーゼ又は消去剤として記載されている［６］［１０］［１１］［１２］［５］［１３］。興味深いことに、これらの２つの酵素は、ｍｉＲＮＡのアデノシンメチル化がαＫＧの細胞内レベルによって調節され得ることを示唆するα－ケトグルタル酸依存性（αＫＧ）である。αＫＧはクレブスサイクル代謝産物である。それは、ＩＤＨタンパク質によって触媒される酸化的脱炭酸によってイソクエン酸から形成され、ＦＴＯ及びＡＬＫＢＨ５などの幾つかの酵素の共基質の役割を介して複数の代謝経路及び細胞経路において重要な役割を果たす［１４］。したがって、理論的には、高レベルのαＫＧは、ＦＴＯ活性を増加させるはずであり、ｍｉＲＮＡのアデノシンメチル化の減少を促進するはずである。
これらの否定できない進歩にもかかわらず、腫瘍におけるこれらの修飾によって果たされる役割の理解を高めるために、腫瘍状況におけるｍｉＲＮＡの化学修飾を支配する分子機構の更なる研究が必要とされる。
ここで、本発明者らは、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）に罹患している患者のサンプルにおけるｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐにおけるＮ６－アデノシンメチル化の存在の影響についての研究に集中した。彼らの研究は、ＸＩＡＰの発現に対するｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ及びそのアデノシンメチル化の影響に特に焦点を当てた（Ｘ結合型アポトーシスタンパク質阻害剤、Uniprot P98170)。ＸＩＡＰは、カスパーゼ－３及び－７の活性化の阻害を介して抗アポトーシスタンパク質として作用し、高いＸＩＡＰ発現は、幾つかの固形腫瘍における低い生存率に関連する［１５］［１６］。したがって、ＸＩＡＰ ｍＲＮＡ発現のｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ媒介抑制は、カスパーゼ－３及び－７の活性及びアポトーシスを支配する機構として現れる。理論的には、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの存在下では、ＸＩＡＰ ｍＲＮＡ発現が抑制され、カスパーゼ－３及び－７が活性化されてアポトーシスを促進することができる。しかしながら、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの非存在下又は不活性化下では、ＸＩＡＰが発現され、カスパーゼ－３及び－７の活性化を阻止し、したがって、アポトーシスを阻害する。これが、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ発現研究をその作用能力と組み合わせることが重要である理由である。
したがって、本発明は、癌に罹患している患者の生存期間の予後を決定するためのインビトロ方法であって、ｉ）前記患者からのサンプルにおけるｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ及び／又はＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）の発現量を決定することから成るステップと、ｉｉ）前記発現量を所定の基準値と比較することから成るステップと、ｉｉｉ）ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％未満であるとともにｍｉＲ－２００ｂ－３の発現量が所定の基準値よりも高い場合に良好な予後をもたらし、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％未満であるとともにｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの発現量が所定の基準値よりも低い場合又はｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％よりも高い場合に不良の予後をもたらすことから成るステップを含む方法に関する。また、本発明は、癌の治療を必要とする被験体における癌の治療において使用するためのＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）に関する。特に、本発明はその特許請求の範囲によって定義される。
発明の詳細な説明
予後決定方法
本発明の第１の態様は、癌に罹患している患者の生存期間の予後を決定するためのインビトロ方法であって、ｉ）前記患者からのサンプルにおけるｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ及び／又はＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）の発現量を決定することから成るステップと、ｉｉ）前記発現量を所定の基準値と比較することから成るステップと、ｉｉｉ）ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％未満であるとともにｍｉＲ－２００ｂ－３の発現量が所定の基準値よりも高い場合に良好な予後をもたらし、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％未満であるとともにｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの発現量が所定の基準値よりも低い場合又はｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％よりも高い場合に不良の予後をもたらすことから成るステップを含む方法に関する。
特に、本発明は、ｉ）前記患者からのサンプルにおける前記ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ及び前記Ｎ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）の発現量を決定することから成るステップと、ｉｉ）前記発現量を所定の基準値と比較することから成るステップと、ｉｉｉ）前記ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％未満であるとともに前記ｍｉＲ－２００ｂ－３の発現量が前記所定の基準値よりも高い場合に良好な予後をもたらし、前記ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％未満であるとともに前記ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの発現量が前記所定の基準値よりも低い場合に不良の予後をもたらすことから成るステップとを含む、癌に罹患している患者の生存期間の予後を決定するためのインビトロ方法に関する。
一実施形態において、癌は、任意の固体又は液体癌であってもよい。一般に、癌は、胆管癌（例えば、末梢癌、遠位胆管癌、肝内胆管癌）、膀胱癌、骨癌（例えば、骨芽腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨粘液様線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨の巨細胞腫、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳及び中枢神経系癌（例えば、髄膜腫、星細胞腫、乏突起膠腫、神経膠芽腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節細胞腫、シュワン細胞腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳癌（例えば、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、女性化乳房）、キャッスルマン病（例えば、巨大リンパ節過形成、血管濾胞性リンパ節過形成）、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌（例えば、子宮内膜腺癌、腺癌腫、乳頭状漿液性腺癌、明細胞）、食道癌、胆嚢癌（粘液性腺癌、小細胞癌）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば、絨毛癌、絨毛腺腫排出物）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌）、喉頭及び下咽頭癌、肝臓癌（例えば、血管腫、肝腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔及び副鼻腔癌（例えば、感覚神経芽細胞腫、正中線肉芽腫）、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔及び中咽頭癌、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば、胎児性横紋筋肉腫、肺胞横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、唾液腺癌、皮膚癌（例えば、黒色腫、非黒色腫皮膚癌）、胃癌、精巣癌（例えば、セミノーマ、非セミノーマ生殖細胞癌）、胸腺癌、甲状腺癌（例えば、濾胞性癌腫、未分化癌腫、低分化癌腫、甲状腺髄様癌腫、甲状腺リンパ腫）、膣癌、外陰癌及び子宮癌（例えば、子宮平滑筋肉腫）からなるグループから選択され得る。
特定の実施形態では、神経膠芽腫が多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）である。
一般に、本発明に係るサンプルは、血液、血漿、血清サンプル又は癌生検材料であってもよい。特定の実施形態では、前記サンプルが神経膠芽腫生検材料である。
本発明によれば、「患者」又は「患者」という用語は、癌、特にＧＢＭを有するヒトを表す。
本明細書中で使用される用語「ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ」（miRBaseデータベースＩＤ番号：ＭＩＭＡＴ００００３１８）は、腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡファミリーのメンバーであるｍｉＲ－２００を示す。
本明細書中で使用される用語「Ｎ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ」又は「ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ」とは、ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐにおける ３’の最後から２番目のアデノシンにおけるメチル化の存在を示す（下記の太字及び下線）。
ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ（配列番号１）の酸核酸配列は、ＵＡＡＵＡＣＵＧＣＣＵＧＧＵＡＡＵＧＡＵＧＡである
本明細書中で使用される用語「１０％より低いｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａのレベル」又は「１０％より高いｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａのレベル」は、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの全体と比較したｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａのパーセンテージを示す。したがって、例えば、１０％を超えるｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａのレベルは、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの１０％超がメチル化されていることを示す。
他の実施形態において、本発明は、癌に罹患している患者の全生存期間（ＯＳ）の予後を決定するためのインビトロ方法であって、ｉ）前記患者からのサンプルにおけるｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ及び／又はＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）の発現量を決定することから成るステップと、ｉｉ）前記発現量を所定の基準値と比較することから成るステップと、ｉｉｉ）ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％未満であるとともにｍｉＲ－２００ｂ－３の発現量が所定の基準値よりも高い場合に良好な予後をもたらし、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％未満であるとともにｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの発現量が所定の基準値よりも低い場合又はｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％よりも高い場合に不良の予後をもたらすことから成るステップを含む方法に関する。
本明細書で使用される「全生存期間（ＯＳ）」という用語は、（本発明に係る）癌などの疾患と診断されたか、又は疾患の治療を開始した後、一定期間生存している試験又は治療群の人々の割合を示す。
本明細書で使用される「良好な予後」という用語は、治療後の次の３年にわたって生存する可能性が５０％を超える患者を表す。
一実施形態において、本発明の方法によれば、本発明のｍｉＲの発現量の決定は、患者の治療の開始前又は開始後に決定され得る。
他の実施形態において、癌、特に神経膠芽腫に罹患した患者は、主に、最大外科切除術、放射線療法、及びテモゾロミドを用いた併用補助化学療法からなる標準的な治療で治療される。
上記で使用される「発現量を決定する」という用語は、対照を参照する又は参照しない定性的及び／又は定量的検出（測定レベル）を含む。一般に、本発明のｍｉＲの発現量は、例えば、ＲＮＡ免疫沈降、架橋免疫沈降、実施されるｑＲＴ－ＰＣＲ及びサンプルに対する全てのＲＮＡ配列決定法によって測定され得る。
「基準値」は、健康な被験体、すなわち癌、特に神経膠芽腫に罹患していない被験体であり得る。特に、前記対照は健康な被験体ではない。
本発明のｍｉＲを検出する場合、「ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ及び／又はＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）の発現量」という用語は、メチル化された又はメチル化されていないｍｉＲの量又は濃度を指す。一般に、ｍｉＲ発現量は、細胞あたりの転写物又は組織１マイクログラムあたりのナノグラムなどの単位で発現され得る。あるいは、相対単位を用いて発現量を表すことができる。
ｍｉＲの発現量の測定は、当技術分野で周知の様々な技術によって行うことができる。
ｍｉＲの量を決定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、サンプル（例えば、患者から調製された細胞又は組織）に含まれる核酸は、最初に標準的な方法に従って、例えば溶解酵素又は化学溶液を使用して抽出されるか、又は核酸結合樹脂によって製造業者の指示に従って抽出される。次いで、抽出されたｍｉＲは、ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）及び／又は増幅（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）によって検出される。
増幅の他の方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及び核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
少なくとも１０個のヌクレオチドを有し、本明細書において関心対象のｍｉＲに対して配列相補性又は相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとしての有用性を見出す。そのような核酸は、同一である必要はないが、一般に、同等のサイズの相同領域と少なくとも約８０％同一であり、より具体的には８５％同一であり、更により具体的には９０～９５％同一であることが理解される。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションを検出するために、検出可能な標識などの適切な手段と組み合わせて核酸を使用することが有利である。
一般に、核酸プローブは、例えば、開示されるプローブを用いた標的核酸分子の検出を可能にするために、１つ以上の標識を含む。インサイツハイブリダイゼーション手順などの様々な用途では、核酸プローブは標識（例えば、検出可能な標識）を含む。「検出可能な標識」は、サンプル中のプローブ（特に結合又はハイブリダイズしたプローブ）の存在又は濃度を示す検出可能なシグナルを生成するために使用することができる分子又は材料である。したがって、標識化された核酸分子は、サンプル中の標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）の存在又は濃度の指標を与える（標識化された固有に特異的な核酸分子が結合又はハイブリダイズする）。１つ以上の核酸分子（開示される方法によって生成されたプローブなど）に関連する標識は、直接的又は間接的に検出することができる。標識は、光子（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視周波数及び紫外線周波数の光子を含む）の吸収、発光及び／又は散乱を含む任意の公知の又は未だ発見されていない機構によって検出することができる。検出可能な標識としては、有色、蛍光、リン光及び発光分子及び材料、ある物質を別の物質に変換して検出可能な差（例えば、無色物質を着色物質に、又はその逆に変換することによって、又は沈殿物を生成することによって、又はサンプルの濁度を増加させることによって）を与える触媒（酵素など）、抗体結合相互作用によって検出することができるハプテン、並びに常磁性及び磁性分子又は材料が挙げられる。
検出可能な標識の特定の例としては、蛍光分子（又は蛍光色素）が挙げられる。多数の蛍光色素が当業者に公知であり、これらの蛍光色素は例えば、Life Technologies（以前はInvitrogen）から選択することができ、例えば、The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologiesを参照されたい）。核酸分子（ユニーク特異的結合領域など）に付着され（例えば、化学的にコンジュゲートされ）得る特定のフルオロフォアの例は、Nazarenkoらの米国特許第５，８６６，３６６号で提供され、例えば、４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２、２’ジスルホン酸、アクリジン及びアクリジン及びアクリジンイソチオシアネートなどの誘導体、５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４－アミノ－Ｎ－［３ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド－３、５－ジスルホネート（ＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌｌｏｗ ＶＳ）、Ｎ－（４－アニリノ－１－ナフチル）マレイミド、ａｎｔｌ １ラニルアミド、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン及びクマリン、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）などの誘導体、シアノシン；４’、６－ジアルニジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’、５’’ジブロモピロガロールスルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’－ジイソチオシアナトジヒドロ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸；４，４’－ジイソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホル酸；５－［ジメチルアミノ］ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４－（４’－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４－ジメチルアミノフェニルアゾフェニル－４’－イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及びエオシンイソチオシアネートなどのエオシン及び誘導体；エリスロシン及びエリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネートなどの誘導体；エチジウム；フルオレセイン及び５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５－（４，６ｄｉｃｌ１ロロトリアジン－２－ｙダーニノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’ジメトキシ－４’５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセイン イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＱＦＩＴＣ Ｑ（ＲＩＴＣ）などの誘導体；２’、７’－ジフルオロフルオレセイン（ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ（登録商標））；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４－メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロアニリン；フェノールレッド；Ｂ－フィコエリトリン；ｏ－フタルジアルデヒド；ピレン、酪酸ピレン及びスクシンイミジル１－酪酸ピレンなどの誘導体；リアクティブ レッド ４（シバクロン ブリリアント レッド ３Ｂ－Ａ）；ローダミン及び誘導体、例えば６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミングローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’、Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロソール酸及びテルビウムキレート誘導体である。他の適切なフルオロフォアとしては、約６１７mn（Heyduk and Heyduk, Analyt.Biochem.248:216-27, 1997; J.Biol.Chem.274:3315-22, 1999）で放出するチオール反応性ユーロピウムキレート、並びにＧＦＰ、リサミンＴＭ、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７－ジクロロローダミン及びキサンテン（Leeらによる米国特許第５，８００，９９６号明細書に記載されている）並びにそれらの誘導体が挙げられる。例えば、Life Technologies（インビトロジェン；モレキュラープローブ（Eugene,Oreg.））から入手可能であり、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）シリーズの色素（例えば、米国特許第５，６９６，１５７号、第６，１３０，１０１号、及び、第６，７１６，９７９号に記載される）、ＢＯＤＩＰＹシリーズの色素（例えば、米国特許第Ｎｏ．４，７７４，３３９号、第５，１８７，２８８号、第５，２４８，７８２号、第５，２７４，１１３号、第５，３３８，８５４号、第５，４５１，６６３号、及び、第５，４３３，８９６号に記載されるジピロメテンボロンジフルオリド色素）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（米国特許第５，１３２，４３２号に記載されているスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）及びＭａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（米国特許第５，８３０，９１２号）を含む、当業者に公知の他のフルオロフォアを使用することもできる。
上記の蛍光色素に加えて、蛍光標識は、半導体ナノ結晶、例えばＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴＴＭ（例えば、Life Technologies(QuantumDot Corp、Invitrogen Nanocrystal Technologies、Eugene、Oreg.）から入手される；米国特許第６，８１５，０６４号、第６，６８２，５９６号、及び、第６，６４９、１３８号も参照）などの蛍光ナノ粒子となり得る。半導体ナノ結晶は、サイズ依存の光学的及び／又は電気的特性を有する微細な粒子である。半導体ナノ結晶が一次エネルギー源で照射されると、半導体ナノ結晶に使用される半導体材料のハンドギャップに対応する周波数のエネルギーの二次放出が生じる。この発光は、特定の波長の有色光又は蛍光として検出することができる。異なるスペクトル特性を有する半導体ナノ結晶は、例えば、米国特許第６，６０２，６７１号に記載される。例えばBruchez et al.,Science281:20132016,1998;Chanら、Science281:2016-2018,1998；及び米国特許第第６，２７４，３２３号に記載される技術によって様々な生物学的分子（ｄＮＴＰ及び／又は核酸を含む）又は基質に結合され得る半導体ナノ結晶。様々な組成の半導体ナノ結晶の形成は、例えば、米国特許第６，９２７，０６９号、第６，９１４，２５６号、第６，８５５，２０２号、第６，７０９，９２９号、第６，６８９，３３８号、第６，５００，６２２号、第６，３０６，７３６号、第６，２２５，１９８号、第６，２０７，３９２号、第６，１１４，０３８号、第６，０４８，６１６号、第５，９９０，４７９号、第５，６９０，８０７号、第５，５７１，０１８号、第５，５０５，９２８号、第５，２６２，３５７号、及び、米国特許出願公開第２００３／０１６５９５１号並びにＰＣＴ公開第９９／２６２９９号（１９９９年５月２７日公開）に開示される。異なるスペクトル特性に基づいて識別可能な半導体ナノ結晶の別個の集合を生成することができる。例えば、半導体ナノ結晶は、それらの組成、サイズ又はサイズ及び組成上で濁った異なる色の光を発することができる。例えば、本明細書中に開示されるプローブにおける蛍光標識として好適であるサイズ（５６５mn、６５５mn、７０５mn、又は８００mn発光波長）に基づいて異なる波長で光を発する量子ドットは、Life Technologies（カリフォルニア州カールシャッド）から入手可能である。
更なる標識としては、例えば、放射性同位体（３ Ｈなど）、Ｇｄ３＋などの放射性又は常磁性金属イオンのＤＯＴＡ及びＤＰＴＡキレートなどの金属キレート、及びリポソームが挙げられる。
核酸分子と共に使用することができる検出可能な標識としては、酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ又はβ－ラクタマーゼも挙げられる。
あるいは、酵素を金属組織検出スキームで使用することができる。例えば、銀のインサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）手順は、ハイブリダイズしたゲノム標的核酸配列の同定及び局在化のための金属学的検出スキームを伴う。金属学的検出方法は、酵素の水溶性金属イオン及びレドックス不活性基質と組み合わせて、アルカリホスファターゼなどの酵素を使用することを含む。基質は酵素によってレドックス活性剤に変換され、レドックス活性剤は金属イオンを還元し、検出可能な沈殿物を形成させる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１００９７６号、ＰＣＴ公開第２００５／００３７７７号及び米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２号参照）。また、金属学的検出方法は、酸化還元酵素（セイヨウワサビペルオキシダーゼなど）を水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共に使用して、この場合も先と同様に検出可能な沈殿物を形成することを含む（例えば、米国特許第６，６７０，１１３号参照）。
開示される方法を使用して作製されたプローブは、ＩＳＨ手順（例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）及び銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ））又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）などの核酸検出に使用することができる。
インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、中期又は相間染色体調製物との関連で標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）を含有するサンプル（例えば、スライドに取り付けられた細胞又は組織サンプル）を、標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）に対して特異的にハイブリダイズ可能又は特異的な標識プローブと接触させることを含む。スライドは、例えば、均一なハイブリダイゼーションを妨害し得るパラフィン又は他の材料を除去するために、場合により前処理される。サンプル及びプローブの両方を、例えば、二本鎖核酸を変性させるための加熱によって処理する。プローブ（適切なハイブリダイゼーション緩衝液に製剤化されたもの）及びサンプルを、ハイブリダイゼーションが起こる（一般に平衡に達する）ことを可能にする条件下及び十分な時間にわたって組み合わせる。染色体調製物を洗浄して過剰なプローブを除去し、標準的な技術を用いて染色体標的の特異的標識の検出を行う。
例えば、ビオチン化プローブは、フルオレセイン標識アビジン又はアビジン－アルカリホスファターゼを用いて検出することができる。蛍光色素検出のために、蛍光色素を直接検出することができ、又はサンプルを、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートアビジンと共にインキュベートすることができる。ＦＩＴＣシグナルの増幅は、必要に応じて、ビオチン結合ヤギ抗アビジン抗体とのインキュベーション、洗浄及びＦＩＴＣ結合アビジンとの２回目のインキュベーションによって達成することができる。酵素活性による検出のために、サンプルを例えばストレプトアビジンとインキュベートし、洗浄し、ビオチン結合アルカリホスファターゼとインキュベートし、再び洗浄し、予備平衡化することができる（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）緩衝液中）。インサイツハイブリダイゼーション手順の一般的な説明については、例えば、米国特許第４，８８８，２７８号を参照されたい。
ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及びＳＩＳＨのための多数の手順が当技術分野で公知である。例えば、ＦＩＳＨを実施するための手順は、米国特許第５，４４７，８４１号、第５，４７２，８４２号、及び、第５，４２７，９３２号、例えば、Pir1kelら、Proc.Natl.Acad.Sci.83:2934-2938,1986;Pinkelら、Proc.Natl.Acad.Sci.85:9138-9142,1988、及びLichterら、Proc.Natl.Acad.Sci.85:9664-9668,1988に記載される。ＣＩＳＨは、例えば、Am.1.Pathol.157:1467-1472,2000及び米国特許第６，９４２，９７０号に記載される。更なる検出方法は、米国特許第６，２８０，９２９号で提供される。
感度、分解能、又は他の望ましい特性を改善するために、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及びＳＩＳＨ手順と共に多数の試薬及び検出スキームを使用することができる。前述のように、フルオロフォア（蛍光色素及びＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴＳ（登録商標）を含む）で標識化されたプローブは、ＦＩＳＨを行うときに直接光学的に検出することができる。あるいは、プローブは、ハプテン（例えば、以下の非限定的な例：ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ、及び様々なオキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノン、クマリン、クマリン系化合物、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン系化合物、及びそれらの組み合わせ）、リガンド又は他の間接的に検出可能な部分などの非蛍光分子で標識化することができる。次いで、そのような非蛍光分子（及びそれらが結合する標的核酸配列）で標識化されたプローブは、サンプル（例えば、プローブが結合している細胞又は組織サンプル）を、選択されたハプテン又はリガンドに特異的な抗体（又は受容体、又は他の特異的結合パートナー）などの標識検出試薬と接触させることによって検出することができる。検出試薬は、フルオロフォア（例えば、量子ドット（登録商標））又は別の間接的に検出可能な部分で標識化することができ、又はフルオロフォアで標識化することができる１つ以上の更なる特異的結合剤（例えば、二次抗体又は特異的抗体）と接触させることができる。
他の例では、プローブ又は特異的結合剤（例えば、抗体、例えば、一次抗体、受容体又は他の結合剤）は、蛍光発生又は発色組成物を検出可能な蛍光、着色又はそうでなければ検出可能なシグナル（例えば、ＳＩＳＨにおける検出可能な金属粒子の堆積の場合のように）に変換することができる酵素で標識化される。上記のように、酵素は、関連するプローブ又は検出試薬に直接又はリンカーを介して間接的に結合され得る。適切な試薬（例えば、結合試薬）及び化学物質（例えば、リンカー及び結合化学）の例は、米国特許出願公開第２００６／０２４６５２４号、第２００６／０２４６５２３号、及び第２００７／０１１７１５３号に記載される。
当業者であれば分かるように、標識プローブ特異的結合剤対を適切に選択することによって、多重検出スキームを作製して、単一のアッセイ（例えば、単一の細胞もしくは組織サンプル上、又は２つ以上の細胞もしくは組織サンプル上）で複数の標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）の検出を容易にすることができる。例えば、第１の標的配列に対応する第１のプローブは、ビオチンなどの第１のハプテンで標識化することができ、第２の標的配列に対応する第２のプローブは、ＤＮＰなどの第２のハプテンで標識化することができる。プローブへのサンプルの曝露後、結合したプローブは、サンプルを第１の特異的結合剤（この場合、第１のフルオロフォアで標識化されたアビジン、例えば、５８５mnで発光する第１のスペクトル的に異なるＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ（登録商標））及び第２の特異的結合剤（この場合、第２のフルオロフォアで標識化された抗ＤＮＰ抗体もしくは抗体フラグメント（例えば、７０５mnで発光する第２のスペクトル的に異なるＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ（登録商標））と接触させることによって検出することができる。更なるプローブ／結合剤対は、他のスペクトル的に異なるフルオロフォアを使用して多重検出スキームに追加することができる。直接的及び間接的な（１ステップ、２ステップ以上）の多数の変形を想定することができ、それらは全て、開示されるプローブ及びアッセイとの関連で適切である。
プローブは、一般に、１０～１０００ヌクレオチド長、例えば１０～８００、より具体的には１５～７００、一般に２０～５００の一本鎖核酸を含む。プライマーは、一般に、増幅される目的の核酸と完全に又はほぼ完全にマッチするように設計された、１０～２５ヌクレオチド長のより短い一本鎖核酸である。プローブ及びプライマーは、それらがハイブリダイズする核酸に「特異的」である、すなわち、それらは高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下（最高融解温度Ｔｍ、例えば、５０％ホルムアミド、５ｘ又は６ｘＳＣＣに対応する。ＳＣＣは、０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａである）で特にハイブリダイズする。
上記の増幅及び検出方法に用いられる核酸プライマー又はプローブは、キットとして組み立てられてもよい。そのようなキットは、コンセンサスプライマー及び分子プローブを含む。また、特定のキットは、増幅が起こったかどうかを決定するために必要な成分を含む。また、キットは、例えば、ＰＣＲ緩衝液及び酵素；陽性対照配列、反応対照プライマー；及び特定の配列を増幅及び検出するための命令をも含み得る。
特定の実施形態において、本発明の方法は、卵丘細胞から抽出された全ｍｉＲを用意するステップ、及び、ｍｉＲを、より具体的には定量的又は半定量的ＲＴ－ＰＣＲによって、増幅及び特異的プローブへのハイブリダイゼーションに供するステップを含む。
他の特定の実施形態では、発現量がＤＮＡチップ分析によって決定される。そのようなＤＮＡチップ又は核酸マイクロアレイは、マイクロチップ、ガラススライド又はマイクロスフェサイズビーズであり得る基質に化学的に結合された異なる核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカ又はシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、又はニトロセルロースで構成され得る。プローブは、約１０～約６０塩基対であり得るｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドなどの核酸を含む。発現量を決定するために、場合により最初に逆転写に供された被験体由来のサンプルを標識化し、ハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触させ、マイクロアレイ表面に結合したプローブ配列に相補的な標的核酸間の複合体の形成をもたらす。次いで、標識化されたハイブリダイズした複合体を検出し、定量化又は半定量化することができる。標識化は、様々な方法によって、例えば放射性標識又は蛍光標識を使用することによって達成され得る。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形が当業者に利用可能である（例えば、Hoheiselによる総説、Nature Reviews、Genetics、2006、7:200-210を参照）。
遺伝子の発現量は、絶対的な発現量又は正規化された発現量として表され得る。一般に、発現量は、患者の癌ステージの決定に関連しない遺伝子、例えば構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子の発現とその発現を比較することによって遺伝子の絶対発現量を補正することによって正規化される。正規化に適した遺伝子としては、ハウスキーピング遺伝子、例えばアクチン遺伝子ＡＣＴＢ、リボソーム１８ Ｓ遺伝子、ＧＵＳＢ、ＰＧＫ１及びＴＦＲＣが挙げられる。本発明によれば、使用したハウスキーピング遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＴＢＰ及びＡＢＬ１であった。この正規化により、１つのサンプル、例えば患者サンプル中、別のサンプル中、又は異なる供給源からのサンプル間での発現量の比較が可能になる。
一般に、「閾値」、「閾値レベル」、「基準値」、又は「カットオフ値」は、実験的、経験的、又は理論的に決定することができる。また、閾値は、当業者によって認識されるように、既存の実験条件及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択することができる。特に、当業者は、本発明の方法に従って得られた本発明のｍｉＲの発現量を、定義された閾値と比較し得る。
特に、前記閾値は、健康な個体の集団の本発明のｍｉＲの平均発現量である。本明細書で使用される場合、「健常個体」という用語は、健康であることが知られている、すなわち癌、特に神経膠芽腫に罹患しておらず、いかなる医療も必要としないヒトを表す。
一般に、当業者は、健康であるか又はそうでないことが知られている１００人の個体の生物学的サンプル、特に神経膠芽腫癌の生検物における本発明のｍｉＲの発現量を決定し得る。次いで、得られた発現量の平均値を、本発明のｍｉＲの平均発現量を得るために、周知の統計学的分析に従って決定する。次いで、前記値は、正常であるとみなされ、したがって閾値を構成する。本発明のｍｉＲの発現量をこの閾値と比較することによって、医師は癌を分類及び予後診断することができる。
したがって、医師は、癌に罹患している重篤かつ生命を脅かす状態にある患者の適切な医療に適応し、最適化することができる。前記予後の決定は、フォローアップケア及び臨床的意思決定に非常に適している。
また、本発明は、本発明のｍｉＲを検出するための手段を含む、本発明の方法に有用なキットに関する。
本発明によれば、本発明のキットは、抗ＤＮＭＴ３Ａタンパク質抗体及び抗ＩＳＧＦ３γ、及び、前記ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ抗体に結合するシグナル伝達系と結合される別の分子、又は、プローブのようなＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子のｍＲＮＡに結合する任意の分子を含むことができる。
一般に、抗体又は抗体の組み合わせは、すぐに使用できる溶液の形態である。一実施形態では、キットは、すぐに使用できる溶液を含む容器を備える。任意の他の形態が本発明に包含され、当業者は、その形態を免疫組織化学における使用に日常的に適合させることができる。
治療方法
本発明の第２の態様は、癌の治療を必要とする被験体における癌の治療において使用するためのＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）に関する。
本発明によれば、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａは、３’上の２番目の最後の核酸がメチル化された配列番号１の核酸配列を有する。
一実施形態では、本発明は、癌の治療を必要とする被験体における癌の治療に使用するためのプロドラッグとしてのｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａに関する。
本明細書中で使用される用語「治療」又は「治療する」とは、予防のための治療又は予防的治療、並びに治癒的治療又は疾患修飾治療の両方のことを指し、それには、疾患に罹患する危険性があるか、又は疾患に罹患した疑いがある被験体、並びに疾患又は病状に罹患しているか、又は疾患又は病状に罹患していると診断された被験体の治療が含まれ、臨床的再発の抑制が含まれる。治療は、疾患もしくは再発性疾患の１つ以上の症状を予防するため、治癒するため、その発症を遅延させるため、その重症度を低下させるため、もしくはその１つ以上の症状を改善するために、又はそのような治療の非存在下で予想される生存期間を超えて被験体の生存期間を延長するために、医学的障害を有するか、又は最終的にその障害を獲得し得る被験体に投与され得る。「治療レジメン」とは、病気の治療パターン、例えば治療中に使用される投与パターンを意味する。治療レジメンは、誘導レジメン及び維持レジメンを含み得る。「導入レジメン」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期治療に使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。誘導レジメンの一般的な目標は、治療レジメンの初期期間中に被験体に高レベルの薬物を提供することである。導入レジメンは、「負荷計画」を（部分的又は全体的に）使用することができ、これは、維持レジメン中に医師が使用するよりも多い用量の薬物を投与すること、維持レジメン中に医師が投与するよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含むことができる。「維持レジメン」又は「メンテナンス期間」という語句は、疾患の治療中に被験体を維持するために、例えば被験体を長期間（月又は年）寛解状態に保つために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、連続療法（例えば、定期的な間隔、例えば、毎週、毎月、毎年などで薬物を投与すること）又は間欠療法（例えば、中断された治療、断続的な治療、再発時の治療、又は特定の所定の基準［例えば、疾患症状など］の達成時の治療）を用いることができる。
また、本発明は、ｉ）本発明に係るｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ、及び、ｉｉ）癌の治療を必要とする被験体における癌の治療において使用するための同時、別個又は逐次のための併用調製として、癌を治療するために使用される従来の治療に関する。
本明細書で使用される場合、「癌を治療するために使用される従来の治療」という用語は、癌の治療に使用され得る任意の化合物、化合物の組み合わせ、化学療法治療と放射線療法剤の組み合わせ、及び化学療法治療と放射線の組み合わせを意味する。例えば、神経膠芽腫の治療の場合、従来の治療は、テモゾロミドと放射線との組み合わせの使用であり得る。
したがって、本発明は、ｉ）本発明に係るｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ、及び、ｉｉ）化学療法剤、並びに、ｉｉｉ）癌の治療を必要とする被験体における癌の治療において使用するための同時、別個又は逐次のための併用調製としての放射線療法又は放射線治療剤にも関連する。
本明細書で使用される場合、「放射線療法」は、ガンマ線、Ｘ線放射、電子もしくは光子、外部放射線療法又は治療からなり得る。
本明細書で使用される「放射線治療剤」という用語は、癌を治療又は改善するのに有効であることが当業者に知られている任意の放射線治療剤を指すことを意図しているが、これに限定されない。例えば、放射線治療剤は、近接照射療法又は放射性核種療法で投与されるものなどの薬剤であり得る。そのような方法は、場合により、化学療法及び／又は別の放射線療法などの１つ以上の更なる癌療法の投与を更に含むことができるが、これらに限定されない。
本発明によれば、化学療法剤は、テモゾロミド、５－アザ－２’－デオキシシチジン、テアフラビン３，３’－ジガレート、ゼブラリン、デシタビン、４－アミノ－Ｎ－（４－アミノフェニル）、キノリン系ＳＧＩ－１０２７（ＰＭＩＤ：２４６７８０２４又は２３２９４３０４）のベンズアミド類似体であり得る。
一実施形態において、本発明に係る癌は神経膠芽腫である。
一実施形態において、本発明は、ｉ）本発明に係るｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ、及び、ｉｉ）化学療法剤、並びに、ｉｉｉ）神経膠芽腫の治療を必要とする被験体における神経膠芽腫の治療において使用するための同時、別個又は逐次の併用調製としての放射線療法に関する。
特定の実施形態において、本発明は、ｉ）本発明に係るｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ、及び、ｉｉ）テモゾロミド、並びに、ｉｉｉ）神経膠芽腫の治療を必要とする被験体における神経膠芽腫の治療において使用するための同時、別個又は逐次の併用調製としての放射線療法に関する。
本発明によれば、「被験体」という用語は、げっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類などの哺乳動物を意味する。幾つかの態様では、被験体がヒトである。幾つかの実施形態では、被験体がヒト乳児である。特に、被験体は、癌、特にＧＢＭを伴うヒトを示す。
一実施形態では、治療方法によれば、癌は任意の固体又は液体癌であり得る。一般に、癌は、胆管癌（例えば、末梢癌、遠位胆管癌、肝内胆管癌）、膀胱癌、骨癌（例えば、骨芽腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨粘液様線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨の巨細胞腫、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳及び中枢神経系癌（例えば、髄膜腫、星細胞腫、乏突起膠腫、神経膠芽腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節細胞腫、シュワン細胞腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳癌（例えば、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、女性化乳房）、キャッスルマン病（例えば、巨大リンパ節過形成、血管濾胞性リンパ節過形成）、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌（例えば、子宮内膜腺癌、腺癌腫、乳頭状漿液性腺癌、明細胞）、食道癌、胆嚢癌（粘液性腺癌、小細胞癌）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば、絨毛癌、絨毛腺腫排出物）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌）、喉頭及び下咽頭癌、肝臓癌（例えば、血管腫、肝腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔及び副鼻腔癌（例えば、感覚神経芽細胞腫、正中線肉芽腫）、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔及び中咽頭癌、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば、胎児性横紋筋肉腫、肺胞横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、唾液腺癌、皮膚癌（例えば、黒色腫、非黒色腫皮膚癌）、胃癌、精巣癌（例えば、セミノーマ、非セミノーマ生殖細胞癌）、胸腺癌、甲状腺癌（例えば、濾胞性癌腫、未分化癌腫、低分化癌腫、甲状腺髄様癌腫、甲状腺リンパ腫）、膣癌、外陰癌、外陰癌及び子宮癌（例えば、子宮平滑筋肉腫）からなるグループから選択され得る。
特定の実施形態では、神経膠芽腫が多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）である。
特に、癌は、ＧＢＭと同様に酵素ＦＴＯ（脂肪量及び肥満関連タンパク質、Uniprot Q9C0B1）及びαＫＧ（アルキル化ＤＮＡ修復タンパク質ａｌｋＢホモログ５、Uniprot Q6P6C2）を発現する癌である。
特に、癌は、ＩＤＨ１（イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１）に変異がない癌である。
本発明の他の目的は、癌の治療を必要とする被験体に治療有効量のＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）を投与することを含む、癌を治療するための方法に関する。
治療用組成物
本発明の他の目的は、癌の治療を必要とする被験体における癌の治療において使用するための、本発明に係るＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）を含む治療用組成物に関する。
一実施形態では、本発明は、神経膠芽腫の治療を必要とする被験体における神経膠芽腫の治療に使用するための、本発明によるＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）を含む治療用組成物に関する。
本発明の任意の治療剤は、薬学的に許容される賦形剤、及び場合により徐放性マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて治療用組成物を形成することができる。
「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与した場合に有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、任意の種類の非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤補助剤を指す。
医薬組成物の形態、投与経路、投与量及びレジメンは、治療される状態、病気の重症度、患者の年齢、体重及び性別などに必然的に依存する。
本発明の医薬組成物は、局所、経口、鼻腔内、非経口、眼内、静脈内、筋肉内又は皮下投与などのために製剤化することができる。
特に、医薬組成物は、注射可能な製剤に対して薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に等張性の滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水又は生理食塩水を添加すると注射可能な溶液の構成を可能にする乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。
投与に使用される用量は、様々なパラメータ関数に応じて、特に使用される投与様式、関連する病態、又は所望の治療期間に応じて適合させることができる。
更に、他の薬学的に許容され得る形態としては、例えば、経口投与のための錠剤又は他の固体、時間放出カプセルを挙げることができ、また、現在、任意の他の形態を使用することができる。
本発明の医薬組成物は、更なる治療活性薬剤を含み得る。また、本発明は、本発明による化合物及び更なる治療活性剤を含むキットに関する。
一実施形態では、前記治療活性剤が抗癌剤であり得る。
抗癌剤は、メルファラン、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ）、エトポシド（ＶＰ－１６）、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、リポソームドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ）及びベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ）であり得る。
他の抗癌剤は、例えば、シタラビン、アントラサイクリン、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メトトレキサート、タキソール、タキソテール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソ尿素、白金錯体、例えばシスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン、エトポシド、テニポシド、カンパセシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、エピムビシン、５－フルオロウラシル、タキサン、例えばドセタキセル及びパクリタキセル、ロイコボリン、レバミソール、イリノテカン、エストラムスチン、エトポシド、マスタード窒素、ＢＣＮＵ、ニトロソ尿素、例えばカルムストム及びロムスチン、ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン、イマチムブメシラート、ヘキサメチルフネラミン、トポテカン、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、チロフォスチン、プロテアーゼ阻害剤、阻害剤ハービミムＡ、ゲニステイン、エルブスタチン及びラベンズスチンＡであってもよい。一実施形態では、更なる抗癌剤は、以下のクラスの薬剤、すなわち、アルキル化剤、植物アルカロイド、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、葉酸拮抗剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、ＤＮＡ代謝拮抗剤、タキサン、ポドフィロトキシン、ホルモン療法、レチノイド、光増感剤又は光線力学療法、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、イソプレニル化阻害剤、細胞周期阻害剤、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ＭＤＲ阻害剤及びＣａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤のうちの１つ又はその組み合わせから選択されてもよいが、これらに限定されない。
更なる抗癌剤は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、成長阻害因子、ホルモン、可溶性受容体、デコイ受容体、モノクローナル又はポリクローナル抗体、単特異的、二重特異的又は多重特異的抗体、モノボディ、ポリボディから選択され得るが、これらに限定されない。
更なる抗癌剤は、エリスロポエチン及びトロンボポエチンなどの成長因子又は造血因子、及びそれらの成長因子模倣物から選択されてもよいが、これらに限定されない。
癌を治療するための本方法において、更なる治療活性薬剤は制吐薬であり得る。適切な制吐薬としては、メトクロプロミド、ドンペリドン、プロクロルペラジン、プロメタジン、クロルプロマジン、トリメトベンズアミド、オンダンセトロン、グラニセトロン、ヒドロキシジン、アセチルロイシンモノメタノールアミン、アリザプリド、アザセトロン、ベンズキナミド、ビエタナウチン、ブロモプリド、ブクリジン、クレボプリド、シクリジン、デュネンヒドリナート、ジフェニドール、ドラセトロン、メクリズマブ、メタラート、メトピマジン、ナビロン、オキシペンジル、ピパマジン、スコポラミン、スルピリド、テトラヒドロカンナビノール、チオフィルペラジン、チオプロパジン及びトロピセトロンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、制吐薬がグラニセトロン又はオンダンセトロンである。
他の実施形態では、更なる治療活性薬剤は、造血コロニー刺激因子であり得る。適切な造血コロニー刺激因子としては、フィルグラスチム、サルグラモスチム、モルグラモスチム及びエポイエチンアルファが挙げられるが、これらに限定されない。
更に他の実施形態では、他の治療活性剤は、オピオイド又は非オピオイド鎮痛剤であり得る。適切なオピオイド鎮痛剤としては、モルヒネ、ヘロイン、ヒドロモルホン、ヒドロコドン、オキシモルホン、オキシコドン、メトポン、アポモルヒネ、ノミオフィン、エトイプビン、ブプレノルフィン、メペジン、ロペルミド、アニレジン、エトヘプタジン、ピミニジン、ベタプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、スフェンタニル、アルフェンタニル、レミフェンタニル、レボルファノール、デキストロメトルファン、フェナゾドン、ペマゾシン、シクラゾシン、メタドン、イソメタドン及びプロポキシフェンが挙げられるが、これらに限定されない。適切な非オピオイド鎮痛剤としては、アスピリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ジクロフィナク、ジフルシナール、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、インドメタシン、ケトロラック、メクロフェナメート、メファナム酸、ナブメトン、ナプロキセン、ピロキシカム及びスリンダクが挙げられるが、これらに限定されない。
更に他の実施形態では、更なる治療活性剤が抗不安剤であり得る。適切な抗不安薬としては、ブスピロン、並びにジアゼパム、ロラゼパム、オキサザパム、クロラゼペート、クロナゼパム、クロルジアゼポキシド及びアルプラゾラムなどのベンゾジアゼピンが挙げられるが、これらに限定されない。
更に他の実施形態において、更なる治療活性剤は、チェックポイント遮断癌免疫療法剤であり得る。
一般に、チェックポイント遮断癌免疫療法剤は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）及びプログラム細胞死１（ＰＤ－１として最もよく知られているＰＤＣＤ１）などの活性化Ｔリンパ球、又はキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリーの様々なメンバーのようなＮＫ細胞によって発現される免疫抑制受容体を遮断する薬剤、又はＰＤ－１リガンドＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１又はＢ７－Ｈ１として最もよく知られている）などのこれらの受容体の主要リガンドを遮断する薬剤である。
一般に、チェックポイント遮断癌免疫療法剤は抗体である。
幾つかの態様において、チェックポイント遮断癌免疫療法剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤＬ２抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＩＤＯ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、及び抗Ｂ７Ｈ６抗体からなるグループから選択される抗体である。
本発明を以下の図及び実施例によって更に説明する。しかしながら、これらの実施例及び図は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのＮ６－アデノシンメチル化は、抗アポトーシスプレイヤーに向けたその翻訳リプレッサー機能を制限し、ＧＢＭ患者において不良の予後を付与する。Ａ．示された３つの群を区別するために、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｅｘｐ及びｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａパラメータに従ってサンプルを層別化した。各ボックスはサンプル／患者を表す。各群について、ＸＩＡＰ発現の平均をHuman XIAP ELISA Kit（Abcam、フランス）で分析し、計算し、グラフに表した。Ｂ．ＧＢＭ患者についての生存曲線のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ表示であり、これらの腫瘍は、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｍ６Ａ＞１０％又はｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐｅｘｐ－ｌｏｗ、及びｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｍ６Ａ＜１０％及びｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐｅｘｐ－ｈｉｇｈを特徴とする。 ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのＮ６－アデノシンメチル化は、抗アポトーシスプレイヤーに向けたその翻訳リプレッサー機能を制限し、ＧＢＭ患者において不良の予後を付与する。Ａ．示された３つの群を区別するために、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｅｘｐ及びｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａパラメータに従ってサンプルを層別化した。各ボックスはサンプル／患者を表す。各群について、ＸＩＡＰ発現の平均をHuman XIAP ELISA Kit（Abcam、フランス）で分析し、計算し、グラフに表した。Ｂ．ＧＢＭ患者についての生存曲線のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ表示であり、これらの腫瘍は、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｍ６Ａ＞１０％又はｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐｅｘｐ－ｌｏｗ、及びｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｍ６Ａ＜１０％及びｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐｅｘｐ－ｈｉｇｈを特徴とする。 ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのＮ６－アデノシンメチル化は、癌細胞においてアポトーシスを選択的に誘導し、抗腫瘍成長効果を有する。Ａ．ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐは、癌性細胞及び非癌性細胞（ニューロンＲＮ３３ｂを除く）においてそれ自体で細胞死を促進し、一方、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｂは、Ｕ８７細胞においてのみそれ自体でアポトーシスを誘導した。ＬＤＨ－細胞傷害性アッセイキット（Abcam、フランス）を使用して、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｂのインキュベーションの２４時間後に細胞死を推定する。Ｂ．マウスモデルにおける腫瘍成長に対するｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのアデノシンメチル化型の影響。 ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのＮ６－アデノシンメチル化は、癌細胞においてアポトーシスを選択的に誘導し、抗腫瘍成長効果を有する。Ａ．ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐは、癌性細胞及び非癌性細胞（ニューロンＲＮ３３ｂを除く）においてそれ自体で細胞死を促進し、一方、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｂは、Ｕ８７細胞においてのみそれ自体でアポトーシスを誘導した。ＬＤＨ－細胞傷害性アッセイキット（Abcam、フランス）を使用して、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｂのインキュベーションの２４時間後に細胞死を推定する。Ｂ．マウスモデルにおける腫瘍成長に対するｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのアデノシンメチル化型の影響。 ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐは、他の癌型における治療ツールとしても使用され得る。ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐによりトランスフェクションされる細胞株において、細胞株がこのｍｉＲを脱メチル化することができる場合、細胞死が幾つかの癌細胞株タイプにおいて誘導される。
実施例：
材料及び方法
ｍｉＲＮＡ抽出
ｍｉＲＮＡ抽出を、NucleoSpin(R) miRNA kit（Macherey Nagel、フランス）を製造者の説明書に従って使用して行った。
ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡトランスフェクション
簡潔には、６×１０５個の細胞を４ウェルプレートの各ウェルに播種した。トランスフェクションは、製造業者の推奨に従って、HiPerFect Transfection Reagents（Qiagen、フランス）及び１０ngのｍｉＲ（Qiagen、フランス）又は１０nmのSilencer(R) siRNA（Thermo Fisher、フランス）を用いて行った。ｓｉＲＮＡ対照には、トランスフェクション対照（HiPerfect Transfection Reagentのみ）及び陰性対照（Silencer(R) Negative control#1 siRNA）を使用した。ｍｉＲ対照には、トランスフェクション対照（HiPerfect Transfection Reagentのみ）及びオリゴ（miScript Inhibitor Negative Control；Qiagen、フランス）を使用した。
無細胞ＭＥＴＴＬ３メチル化アッセイ
超音波処理及びＣＨＡＰＳ緩衝液（プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を補充した４０mM ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２０mM ＮａＣｌ、１％ ＣＨＡＰＳ、１mM ＥＤＴＡ）の使用後に得られた細胞溶解物から、ＭＥＴＴＬ３含有複合体を免疫沈降させた。免疫沈降は、Catch and Release v2.0Reversible Immunoprecipitation System（フランス、メルク）及び抗ＭＥＴＴＬ３（Abcam、フランス）を用いて行った。ＩｇＧ（Abcam、フランス）を対照として使用した。ＩＰからの溶出は、製造業者の指示に従って非変性溶出緩衝液を使用して行った。次いで、３０μLの溶出液をＭＥＴＴＬ３酵素アッセイで使用した。ＭＥＴＴＬ３酵素アッセイを、反応緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１mM ＤＴＴ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、４０Ｕ／１００ml緩衝液ＲＮａｓｅＯＵＴ）中で行った。反応混合物は、ビオチンタグ及びＳＡＭを有する非メチル化模倣体ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐを含んでいた。酵素アッセイ反応物をシェーカー上において室温で一晩インキュベートした。ストレプトアビジン単離後、ドットブロットによってＮ６－アデノシンメチル化の存在を決定した。次いで、ドットを抗ｍ６Ａ及び抗アデノシン（ローディングコントロールとして）抗体と一晩インキュベートした。シグナル検出のために、二次ＨＲＰ抗体を使用し、シグナルをChemiDoc MP（Bio-Rad、フランス）で検出した。
ｍｉＲＮＡのためのＲＮＡ免疫沈降
ＲＮＡの免疫沈降のために、５μgの抗ｍ６Ａ抗体（Abcam、フランス）及び５μgの低分子ＲＮＡを使用して２回行った。反応は、Berulavaら（２０１５）［６］によって記載されているような幾つかの改質（ThermoFisher Scientific、フランス）を加えたDynabeads Protein G Immunoprecipitation kitを使用して行った。対照として、抗ｍ６Ａ抗体の代わりにＩｇＧ（Abcam、フランス）を用いて免疫沈降を行った。ｍ６Ａ免疫沈降から得られたｍｉＲを、miRScript II RT kit（Qiagen、フランス）を使用して逆転写し、miScript miRNA PCR Array Human Cancer Pathway kit（Qiagen、フランス）を製造者の説明書に従って使用して分析した。次に、入力ｍｉＲ、ＩＰ－ＩｇＧ及びＩＰ－ｍ６Ａ及び２－ΔΔＣｔ式を用いて行われたＲＴ－ｑＰＣＲから得られたＣｔ値を用いて、倍濃縮を計算した。
架橋免疫沈降（ＣＬＩＰ）
製造業者の指示に従って、ＵＶ架橋細胞のサンプルあたり１０百万個（１５０mJ/cm2のＵＶＡ（３６５nm）からのRiboCluster Profiler RIP-Assay（CliniScience、フランス）を使用して、ＣＬＩＰを実施した。ＩＰを、１５μgの抗ＧＷ１８２（#RN033P、CliniScience、フランス）及び抗ＴＮＲＣ６Ｂ（#9913、Merck-Millipore、フランス）の存在下において４°Ｃで一晩行った。
ｍｉＲＮＡの定量的ＰＣＲ
ｍｉＲＮＡ発現分析及び抗ｍ６Ａ抗体を用いて行われるＲＩＰの産物からの検出のために、ＲＮＡを、miRScript II RT kitを使用して逆転写し、特定のhsa-miR miScript Primer Assays（Qiagen、フランス）を製造者の説明書に従って使用するmiScript SYBR Green PCR Kitを用いてｑＰＣＲによって分析した。
ＥＬＩＳＡ
タンパク質抽出物を、ＲＩＰＡ溶解抽出緩衝液（Thermo Scientific、フランス）を製造者の説明書に従って使用することによって得た。XIAP (Human) Cell-Based ELISA Kit（Abnova、台湾）、Alpha Ketoglutarate (alpha KG) Assay Kit (ab83431)（Abcam、フランス）Human FTO ELISA Kit (68ELH-FTO)（Tebu-Bio、フランス）Methyltransferase like 3(METTL3)、ELISA Kit(MBS9326769)（My BioSource社、米国）、CST - PathScan(R) Total Ezh2 Sandwich ELISA Kit（Ozyme、フランス）、EpiQuik Dnmt1 Assay Kit（EpiQuik Dnmt1 Assay Kit, Euromedex/EpiGentek、フランス）、Human Bcl-2 ELISA Kit（Abcam、フランス）、Caspase-2 ELISA Kit（Tebu-Bio、フランス）及びPathScan(R) Total PD-L1 Sandwich ELISA Kit（Ozyme、フランス）を製造者の説明書に従って実施した。
ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片
細胞をトリプシン処理によって回収し、洗浄し、生理食塩水緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液を１００μlの滅菌ＰＢＳ中の７～８週齢マウス（Janvier、フランス）の脇腹に皮下注射した。ノギス測定に基づく腫瘍体積は、修正楕円体式（腫瘍体積＝１／２（長さ×幅２））を使用して計算した。
動物を用いた実験手順は、Institutional Animal Care及びFrench National Committee of Ethicsのガイドラインに従った。更に、全ての実験は、「Institut de Recherche en Sante de l'Universite de Nantes (IRS-UN)」の「Plateforme Animalerie」において動物実験規則に従って行われ、フランス国家倫理委員会によって承認された。
細胞株
Ｕ８７、Ｕ８７ＩＤＨ１ｍｕｔ、ＲＮ３３ｂ及びＡ５４９細胞は、American Type Culture Collection（ATCC、Molsheim、フランス）から入手した。ＨＡＳＴＲ０４０／星状膠細胞をClonexpress（Gaithersburg、米国）から得た。ＯＥ２１細胞をSigma（フランス）から入手した。ＨＥＰ１０細胞は、ThermoFisher（フランス）から入手した。ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄ細胞は、Dr P.Juinの研究室によって提供された。ＳＫＯＶ３細胞はE.Scottet博士の研究室によって提供された。ＯＶ９０細胞はＲ．Spisek博士の研究室によって提供された。
結果
ｍ６ＡメチルトランスフェラーゼＭＥＴＴＬ３、ｍ６ＡデメチラーゼＦＴＯ及びα－ケトグルタル酸は、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのＮ６－アデノシンメチル化を調節する
文献では、ｍｉＲ－２００及び特にｍｉＲ－２００ｂ－３ｐがＧＢＭにおいて役割を果たすことが報告されている［１７］［１８］［１９］［２０］。Berulavaら（２０１５）は、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐなどの特定のｍｉＲＮＡにおけるｍ６Ａの存在を同定している［６］。これらの知見と一致して、本発明者らは、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐレベルの発現（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｅｘｐ）及び３２個のＧＢＭサンプルの集合におけるｍ６Ａを含有するｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐの割合（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａ）を調べた。ＲＴ－ｑＰＣＲ実験は、最大／分比が３７．６に等しいｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｅｘｐにおける高レベルの不均一性を示した（データは示さず）。抗ｍ６Ａ抗体を用いて実施したＲＮＡ免疫沈降とそれに続くｑＰＣＲ分析（ｍｉＲＩＰｍ６Ａ－ｑＰＣＲ）は、１０／３２の腫瘍がｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａ＞１０％を含有することを示した（データは示さず）。更に、本発明者らは、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６ＡとｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｅｘｐ（ｐ＝０．００２２）との間の相関を観察した（データは示さず）。
ＧＢＭ患者におけるｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのＮ６－アデノシンメチル化を支配する分子機構を同定するために、本発明者らは、まず、ＦＴＯが、アデノシン脱メチル化を触媒するためにα－ケトグルタル酸（αＫＧ）を必要とするアデノシンデメチラーゼであるので、ＦＴＯ及びαＫＧに分析を集中させた［１１］。３２個のＧＢＭの本発明者らのコレクションにおいて、ピアソンの相関試験は、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａとの有意な相関ＦＴＯ発現量の欠如（ｐ＝０．０８２４）（データ示さず）及びαＫＧとｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａとの間の有意な相関ＦＴＯ発現量の欠如（ｐ＝０．０６６８）（データ示さず）を示す。これらの２つのパラメータを考慮するために、本発明者らは、低いＦＴＯ発現量（中央値よりも低い）及び低いαＫＧレベル（中央値よりも低い）（ＦＴＯＬｏｗ／αＫＧＬｏｗ）を有するＧＢＭサンプルを他のＧＢＭサンプルから単離した（データは示さず）。この下位区分に基づいて、本発明者らは、ＦＴＯＬｏｗ／αＫＧＬｏｗを有するＧＢＭサンプルが他のＧＢＭサンプルよりもｍ６Ａ－メチル化が多いことに注目した（ｐ＝０．００４２）（データは示さず）。したがって、本発明者らは、ＦＴＯ及びαＫＧの両方がｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのｍ６Ａメチル化レベルに影響を及ぼし、ＦＴＯ及びαＫＧレベルがより低い場合、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのＮ６－アデノシンメチル化レベルが上昇すると結論する。ｍｉＲのＮ６－アデノシンメチル化におけるＦＴＯ及びαＫＧの関与はまた、ＦＴＯに対するｓｉＲＮＡがｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａを増加させ（データ示さず）、αＫＧ治療がｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａを減少させ（データ示さず）、メクロフェナム酸（ＭＡ、選択的ＦＴＯ阻害剤［２１］）がｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａを増加させた（データ示さず）という事実によっても裏付けられた。更に、本発明者らは、ＡＬＫＢＨ５（ＲＮＡアデノシンデメチラーゼ［１０］）のノックダウンがｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａを変化させなかったことに注目した（データは示さず）。したがって、これらの結果は全て、ＦＴＯ及びαＫＧが協調して作用してｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのアデノシンメチル化を減少させるという考えを裏付けている。
Alarcornら（２０１５）は、メチルトランスフェラーゼ様３（ＭＥＴＴＬ３）が哺乳動物細胞においてｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをメチル化することを同定し［５］、本発明者らは、ＭＥＴＴＬ３がｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのアデノシンメチル化に関与し得ると仮定した。この仮説を支持するために、本発明者らは最初に、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６ＡとＭＥＴＴＬ３発現量との間の有意な相関を観察した（ｐ＝０．００１０）（データは示さず）。第２に、無細胞実験は、ＭＥＴＴＬ３（すなわち、ＭＥＴＴＬ３含有複合体）の免疫沈降物がインビトロでｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐをメチル化することを示した（データは示さず）。第３に、ＭＥＴＴＬ３ノックダウン（ｓｉＲＮＡ法）は、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐにおけるｍ６Ａのレベルを低下させた（データ示さず）。結論として、これらの３つの異なる実験は、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのＮ６－アデノシンメチル化の書込因子としてＭＥＴＴＬ３を暗示している。
上記の全ての結果は、αＫＧ、ＦＴＯ及びＭＥＴＴＬ３がｍｉＲ－２００ｂ－３ｐにおけるｍ６Ａの存在に集合的に影響を及ぼすことを示唆している。ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐのアデノシンメチル化のレベルに対するこれらの３つのパラメータの影響を考慮するために、本発明者らはαＦＭスコアと呼ばれるものを計算した。各ＧＢＭサンプルについて、αＫＧ、ＦＴＯ及びＭＥＴＴＬ３の発現がＮ６－アデノシンメチル化を増加させると予測される場合、すなわちαＫＧ及びＦＴＯ発現が本発明者らのコホートの中央値以下である場合、並びにＭＥＴＴＬ３発現が本発明者らのコホートの中央値より高い場合、＋１が影響を受けた。αＫＧ、ＦＴＯ及びＭＥＴＴＬ３の発現がＮ６－アデノシン脱メチル化を減少させると予測される場合、すなわちαＫＧ及びＦＴＯ発現が本発明者らのコホートの中央値よりも高い場合、並びにＭＥＴＴＬ３発現が本発明者らのコホートの中央値以下である場合、－１が影響を受けた。例えば、高レベルのαＫＧ及びＦＴＯ及び低レベルのＭＥＴＴＬ３を有するＧＢＭは、＋１に等しいαＦＭスコアを有し、低レベルのαＫＧ及びＦＴＯ及び低レベルのＭＥＴＴＬ３を有する別のＧＢＭは、＋３に等しいαＦＭスコアを有する。したがって、本発明者らは、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐにおけるαＦＭスコア及びｍ６Ａの存在率が、本発明者らの３２個のＧＢＭのコレクションにおいて有意に相関していることに注目した（ｐ＝０．０００６）（データは示さず）。
まとめると、本発明者らのデータは、ＭＥＴＴＬ３、ＦＴＯ及びαＫＧがｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのＮ６－アデノシンメチル化の調節に関与しているという考えを裏付けている。
ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのＮ６－アデノシンメチル化は、その翻訳リプレッサー機能を抗アポトーシスプレイヤーに対して制限し、ＧＢＭ患者において不良の予後を与える
ＸＩＡＰｍＲＮＡはｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの標的として同定されており（miRTarBaseのウェブサイトによる）、本発明者らは次に、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｅｘｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａと、３２個のＧＢＭサンプルの本発明者らのコレクションにおけるＸＩＡＰ発現との間に関連があるかどうかを調べた。
本発明者らの研究は、全てのＧＢＭサンプルを考慮した場合（ｐ＝０．８８０３）、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｅｘｐとＸＩＡＰ発現とを相関させなかった（データは示さず）。
その後、本発明者らは、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのアデノシンメチル化率を考慮することによって、本発明者らのサンプルを３つの群に分けることによって、本発明者らの研究を拡大した（図１Ａ）。群＃１は、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａ＞１０％を有するサンプルを含んだ。群＃２には、パーセンテージがｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａ＜１０％であり、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｅｘｐが中央値より低い（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｅｘｐ－低）サンプルが含まれた。群＃３には、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａ＜１０及び中央値よりも優れたｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの発現量（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｅｘｐ－ｈｉｇｈ）を有するサンプルが含まれた。
ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａ＜１０を有する全てのサンプル（群＃２及び＃３）について、本発明者らは、ＸＩＡＰ発現がｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｅｘｐと逆相関することに注目した（図１Ａ）。このデータは、ｍｉＲＮＡが転写後リプレッサーであるという定説と一致している。
驚くべきことに、本発明者らは、群＃１のサンプルのＸＩＡＰ発現の平均が他の２つの群のものよりも高いことに注目した（図１Ａ）。これらの結果は、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐが、その配列がｍ６Ａを含まない場合（又は１０％より低いレベル）、ＸＩＡＰ発現を調節すること、及び、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐにおけるｍ６Ａの存在が、このｍｉＲＮＡの転写後リプレッサー機能を抑止し得ることを示唆する。
この仮説を調べるために、Ｕ２５１細胞を、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ模倣物又はｍ６Ａ修飾ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ模倣物で処理した。予想通り、本発明者らは、細胞を非特異的オリゴヌクレオチドで処理した場合、ＸＩＡＰ発現の変化を何ら認めなかったが、細胞をｍｉＲ－２００ｂ－３ｐｍｉｍｅｔｉｃで処理した場合、ＸＩＡＰ発現は強く低下した（データは示さず）。興味深いことに、本発明者らは、細胞を同じ量のｍ６Ａ修飾ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ模倣物で処理した場合、この減少があまり効率的でないことに注目した（データは示さず）。したがって、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐにおけるｍ６Ａの存在は、ＸＩＡＰｍＲＮＡに対するこのｍｉＲＮＡの転写後リプレッサー機能を抑止するようである。
次に、本発明者らは、架橋免疫沈降及びｑＰＣＲ（ＣＬＩＰ－ｑＰＣＲ）分析を行って、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのアデノシンメチル化が３’ＵＴＲ－ｍＲＮＡ－ＸＩＡＰ／ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ二重鎖の内因性形成に影響を及ぼすかどうかを決定した。本発明者らのアッセイでは、ＧＷ１８２及びＴＮＲＣ６Ｂに対する抗体（すなわち、ｍｉＲＮＡ媒介サイレンシングにおいて中心的役割を有するＲＩＳＣ複合体の２つのタンパク質）を介して免疫沈降を行い、ＧＷ１８２及びＴＮＲＣ６Ｂ媒介共免疫沈降産物におけるｍｉＲＮＡ及び３’ＵＴＲｍＲＮＡの濃縮／存在を検出するためにｑＰＣＲを行った。ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡのＧＷ１８２及びＴＮＲＣ６Ｂ媒介共免疫沈降に対するアデノシンメチル化の喪失の影響を推定するために、ＭＥＴＴＬ３のノックダウンを有するサンプルからＣＬＩＰ－ｑＰＣＲを行った。ｍｉＲ－１５０－５ｐ／３’ＵＴＲ－ｍＲＮＡ－ＥＰ３００二重鎖を対照とみなした。このコントロールの選択は、ｍｉＲ－１５０－５ｐがアデノシンメチル化されないという事実、及び、ｍｉＲ－１５０－５ｐが３’ＵＴＲ－ｍＲＮＡ－ＥＰ３００を標的とするという事実によって決定された。
本発明者らはまず、ｍｉＲ－１５０－５ｐ及び３’ＵＴＲ－ｍＲＮＡ－ＥＰ３００がＧＷ １８２及びＴＮＲＣ６Ｂ媒介共免疫沈降産物中に存在し、これはＭＥＴＴＬ３ノックダウンとは無関係であることに注目した（データは示さず）。第２に、本発明者らは、ＭＥＴＴＬ３ノックダウンがＧＷ１８２免疫沈降物及びＴＮＲＣ６Ｂ免疫沈降物におけるｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ及び３’ＵＴＲ－ＸＩＡＰの存在を増大させたことに注目した（データは示さず）。したがって、これらの最後の結果は、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのＭＥＴＴＬ３媒介性アデノシンメチル化状態が、３’ＵＴＲ－ｍＲＮＡ－ＸＩＡＰ／ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ二重鎖の内因性形成に影響を及ぼすことを示している。
アポトーシスプレイヤーであるＸＩＡＰの発現に影響を及ぼすことによって、本発明者らのデータは、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの発現量及びＮ６－アデノシンメチル化レベルが腫瘍の固有のアポトーシスレベルに影響を及ぼし得ることを示唆する。この仮説を調べるために、本発明者らは、腫瘍の固有のアポトーシスレベルのマーカーとしてカスパーゼ／ＤＥＶＤａｓｅ活性を分析した。本発明者らの研究は、ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐｅｘｐ－低シグネチャー又はｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａ＞１０％シグネチャーを有する腫瘍がより低い内因性アポトーシスレベルを有することを示す（データは示さず）。
最後に、本発明者らは、腫瘍がｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐｅｘｐ－低シグネチャー又はｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ％ｍ６Ａ＞１０％シグネチャーを有する患者が、他のＧＢＭ患者よりも低い生存転帰を有することを観察した（図１Ｂ）。
ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐは、抗ＧＢＭ療法における有望なツールであるようである
ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐが内因性アポトーシスレベルに影響を及ぼすという事実に基づいて、本発明者らは、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ及びｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐが治療ツールとして使用され得るかどうかを調べることによって本発明者らの研究を拡大した。この目的のために、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ及びｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐによって誘導される細胞死を、ヒト脳細胞（星状膠細胞（ＨＡＳＴ４０）、ニューロン（ＲＮ３３ｂ）及び星状膠細胞腫（Ｕ８７））を代表する細胞のパネルから測定した。ＩＤＨ１変異がＧＢＭで観察されるので、本発明者らはこのパネルにＵ８７ＩＤＨ１ｍｕｔ細胞を含めた。更に、本発明者らは、ＩＤＨ１変異の存在がαＫＧを減少させ、ＦＴＯ及びＭＥＴＴＬ３発現量が変化しない状況でｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのアデノシンメチル化を増加させることを観察した（データは示さず）。メクロフェマル酸もＦＴＯ阻害剤として使用した［２１］。末梢血は化学物質への曝露が起こる場所であるため、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）も本発明者らの研究に含めた。第１に、本発明者らのデータは、ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐが、ニューロンを除く全ての細胞（ＲＮ３３ｂ細胞株）において細胞死を誘導したことを示した（図２Ａ）。第２に、本発明者らは、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐがＵ８７細胞において細胞死を誘導したが、Ｕ８７ＩＤＨ１ｍｕｔ、Ｕ８７Ｍｅｃｌｏｆｅｍａｌｉｃ、ＰＢＭＣ、ニューロン及び星状膠細胞においては誘導しなかったことを観察した（図２Ａ）。換言すれば、これらのデータは、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐが細胞死を誘導する能力が、ＰＭＢＣ、ニューロン及び星状膠細胞のような非癌性細胞ではなく、癌細胞において生じることを示唆する。本発明者らの知識に基づいて、Ｕ８７ＩＤＨ１ｍｕｔにおける大量のｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ誘導性細胞死が存在しないことは、これらの細胞がより少ない量のαＫＧ、すなわち、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのアデノシン脱メチル化を触媒するより少ない量の酵素補因子（ＦＴＯ）を有するという事実に関連し得る。更に、メクロフェマル酸処理がＵ８７細胞におけるｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ誘導性細胞死を無効にしたという事実は、このプロセスにおけるＦＴＯの関与を確認した（図２Ａ）。
次いで、本発明者らは、ＧＢＭのインビボモデルにおけるｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの推定抗ＧＢＭ効果を調べた。この目的のために、Ｕ８７誘導ＧＢＭをマウスの異種移植によって作製した。Ｕ８７誘導ＧＢＭの体積が１００mm3に近かったとき、３匹のマウスを無作為に治療せず、テモゾロミド（ＴＭＺ）及び／又はｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐで治療した（データは示さず）。ＴＭＺを使用する選択肢は、このアルキル化剤がＧＢＭ治療における現在の標準治療プロトコルに含まれる化学療法剤であるという事実に起因する［２２］。
ＴＭＺ治療の効果をｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ治療の効果と比較することによって、本発明者らは、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ治療がＴＭＺ－２５mg/kg治療と同様の効率を有することを明確に認めることができた（図２Ｂ）。また、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ＋ＴＭＺ－２５mg/kg処理は、ＴＭＺ－５０mg/kg処理と同じ効率を有することにも留意した（図２Ｂ）。
ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐはまた、他の癌タイプにおける治療ツールとして使用され得るかもしれない
上記のデータは、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐによるＸＩＡＰ調節に焦点を当てているが、１つのｍｉＲＮＡが複数の標的を有することは周知である。その結果、本発明者らは次に、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのアデノシンメチル化が、その翻訳リプレッサー機能をＸＩＡＰ以外の他の推定タンパク質標的に対して無効にすることができるかどうかを調べた。（miRTarBaseウェブサイト［２３］による）ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの推定タンパク質標的の中で、本発明者らは、２つの他のアポトーシスプレイヤー（Ｂｃｌ－２（Ｂ細胞リンパ腫２、Uniprot#P10415）及びカスパーゼ－２（システイン依存性アスパラギン酸指向プロテアーゼ２、Uniprot#P42575））、２つのエピジェネティックプレイヤー（ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅホモログ２のエンハンサー、Uniprot#Q15910）及びＤＮＭＴ１（ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ１、Uniprot#P26358））及び陰性免疫チェックポイントＰＤ－Ｌ１（プログラム細胞死１リガンド１、Uniprot#Q2NZQ7）に研究を集中させた。本発明者らのデータは、ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐにおけるｍ６Ａの存在がまた、Ｂｃｌ－２及びＰＤ－Ｌ１に対するｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの翻訳リプレッサー機能を無効にしたことを示した（データは示さず）。
最後に、本発明者らは、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐが細胞死を誘導する能力がＵ８７細胞に特異的であるかどうかを調べた。この目的のために、幾つかの癌を代表する癌性細胞株をｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐでトランスフェクトした（神経膠芽腫についてはＵ２５１及びＴ９８Ｇ、肺についてはＡ５４９及びＨ１９７５、乳房についてはＭＣＦ７及びＴ４７Ｄ、食道についてはＯＥ２１、卵巣についてはＯＶ９０及びＳＫＯＶ３）。４つの非癌性細胞株も本発明者らの研究に含めた。細胞トランスフェクションの４時間後、本発明者らは、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ発現の増加の範囲が均一であった（１０～１３倍の誘導）ので、全ての細胞が同様の量のｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐでトランスフェクトされたことに注目した（図３）。次いで、本発明者らは、アデノシン－脱メチル化ｍｉＲ－２００ｂ－３ｂに対する能力を有する細胞、すなわちＵ２５１、Ａ５４９、Ｔ４７Ｄ及びＳＫＯＶ３において細胞死が起こったことに注目した（図３）。他の細胞株、特に非癌性細胞株における細胞死の非存在は、これらの細胞がアデノシン－メチル酸ｍｉＲ－２００ｂ－３ｂに対して不能であることによって説明された（ｍ６Ａ濃縮トランスフェクト／対照は１に等しい）（図３）。
まとめると、これらの最後の結果は全て、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐが抗ＧＢＭ療法における有望なツールとして現れるという事実と一致する。
結論：
ｍｉＲＮＡの塩基修飾の分子機構の記載に関する最近の研究は、ｍｉＲＮＡの生合成及び機能性の調節の理解において有意義な進歩をもたらした。したがって、Alarcornら（２０１５）、Berulavaら（２０１５）及びKonnoら（２０１９）の研究の後、本発明者らの研究は、抗ｍ６Ａ－抗体とのＲＮＡ免疫沈降、その後のＲＴ－ｑＰＣＲ［５］［６］［７］の実現を介したｍｉＲＮＡにおけるｍ６Ａの存在を報告する。これらの事後研究にもかかわらず、本発明者らの調査には幾つかの革新的な点がある。
第１に、本発明者らの研究は、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのアデノシンメチル化が、その推定される標的（例えば、ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ－２及びＰＤ－Ｌ１など）に対するその翻訳リプレッサー機能を抑止することを示している。Alarcornら（２０１５）及びBerulavaら（２０１５）によって発表された研究は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ（ＵＧＡＣ）及び成熟ｍｉＲＮＡ（ＡＤＲＡ）におけるｍ６Ａメチル化についての２つの異なるコンセンサス配列の存在を報告している［５］［６］。興味深いことに、本発明者らは、ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ配列がコンセンサスの１つと一致する配列を含むことに注目した。彼らはまた、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ配列が、Ping他（２０１４）によって定義されるＭＥＴＴＬ３／ＷＴＡＰによるコンセンサス配列結合と一致する配列を含有することに注目した［１２］。特定の観点から、この最後の点はまた、ｍｉＲＮＡのアデノシンメチル化におけるＭＥＴＴＬ３の役割を支持する議論を構成し得る。
Berulavaら（２０１５）の研究は、ＦＴＯがｍｉＲＮＡの脱メチル化において重要な役割を果たすことを示している［６］。本発明者らのデータは、αＫＧの存在がまた、ｍｉＲＮＡの脱メチル化において無視できない役割を果たすことを示すことによってこれを完成させる。
これらの２つの最初の報告に加えて、この研究は、ｍ６Ａの存在がｍｉＲＮＡの転写後リプレッサー機能の阻害剤として作用することを示す。機構的には、これらのデータは、ｍ６Ａの存在がｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ二重鎖の形成を制限することを示している。この研究はまた、癌患者のコホートを使用した臨床的な橋渡し研究の努力によって最初の２つの研究から区別される。実際、この研究は、ｍｉＲＮＡのＮ６－アデノシンメチル化のレベル（このｍｉＲＮＡの発現量に関連して）が、生存率が低いＧＢＭ患者を特徴付けるバイオマーカーとして作用することを最初に述べたものである。Konnoらは、ｍｉＲのアデノシンメチル化を、極めて高い感度及び特異性を有する初期膵臓癌患者を健康な対照と区別するためのツールとして考慮しているので、この研究はまた、Konnoら（２０１９）によって最近公開された研究とは異なる。一方、本発明者らの論文では、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのアデノシンメチル化は、ＧＢＭ患者に対する応答の予後値と関連しており［７］、治療機能を有し得る。
Berulavaら（２０１５）及びYuanら（２０１４）の研究は、ｍｉＲＮＡのアデノシンメチル化がそれらの安定性に及ぼす影響についての議論を紹介している［６］［２４］。ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐに注目するこれらのデータは、このｍｉＲＮＡのアデノシンメチル化がその発現に影響を及ぼさないことを示しているようである。実際に、ＦＴＯ及びＭＥＴＴＬ３に対するｓｉＲＮＡ又は化学成分を介したそのアデノシンメチル化レベルの調節は、その発現に影響を及ぼさない。しかしながら、この知見は１つのｍｉＲＮＡについて得られたものであり、アデノシンメチル化がｍｉＲＮＡの安定性に及ぼす影響についての規則を一般化することは不可能である。
アデノシンメチル化ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐがＲＩＳＣ複合体に動員されなかったことを観察することによって、これらのデータは、ｍｉＲＮＡのアデノシンメチル化が、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の二重鎖形成の調節を介してｍｉＲＮＡの機能性を支配する分子機構として現れるという考えを補強する。より一般的には、これらのデータは、Lockhartら（２０１９）によって報告されたように、ｍｉＲＮＡ又は３’ＵＴＲ－ｍＲＮＡにおいて生じるヌクレオチド修飾がｍｉＲ／３’ＵＴＲ－ｍＲＮＡ二重鎖の形成を変化させるという考えを支持する［２５］。
ｍｉＲＮＡのｍ６Ａメチル化が、生存率が低いＧＢＭ患者を特徴付けるバイオマーカーとして作用し得ることを報告することによって、本発明者らのデータは、このエピトランスクリプトームシグネチャー（本発明者らのデータによるＭＥＴＴＬ３）を書き込む分子アクターを、エピドラグの発症のための標的として使用し得るという考えを広げた。実際、ＭＥＴＴＬ３は癌遺伝子翻訳を促進するので、この観点は既に論じられている［２６］。
過去十年間に、ｍｉＲＮＡ模倣物及びｍｉＲＮＡ（抗ｍｉＲ）を標的とする分子は、前臨床開発において有望な結果を示した［２７］［２８］。４つの意見は、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのアデノシンメチル化型が有望な治療ツールとして使用され得るという考えを強く支持する。第１に、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐは、抗アポトーシスタンパク質であるＸＩＡＰの抑制を介して単独でアポトーシスを誘発する。第２に、これらのデータは、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐが、ニューロン、ＰＢＭＣ、星状膠細胞及び肝細胞などの非癌性細胞ではなく、Ｕ８７などの癌性細胞において（しかし、他の癌細胞株においても）細胞死を促進することを示している。第３に、本発明者らのインビボデータは、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐがＧＢＭのインビボモデルにおいて抗腫瘍成長効果を有することを示している。第４に、これらのインビボデータはまた、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ／ＴＭＺ－２５mg/kgの組み合わせが、ＴＭＺ－５０mg/kg治療の使用と同じ抗腫瘍成長効果を有するので、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ／ＴＭＺの組み合わせが、ＴＭＺの用量を制限することを可能にすることを示している。したがって、これらの議論は全て、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのアデノシンメチル化型を、このｍｉＲＮＡのプロドラッグ型として定義する。より興味深いことに、これらのデータは、活性形態下でのその変換が癌細胞で起こるが、非癌性細胞では起こらないことを示している。この観察結果は、癌性細胞のみがｍｉＲ－２００ｂ－３ｐのプロドラッグ形態を活性化するための「工具」（ＦＴＯ及びαＫＧ）を有するという事実などが翻訳され得るので、非常に有望である。したがって、ｍｉＲＮＡのアデノシンメチル化形態は、癌細胞に対するｍｉＲＮＡに基づく治療の対処が相対的に欠如していることに関連するｍｉＲＮＡ治療のオフターゲット効果を制限する様式などと考えることができる［２９］。これらのデータはまた、ＩＤＨ１変異を提示する細胞が低レベルのαＫＧを有するので、ＩＤＨ１変異の存在が、ｍｉＲＮＡのアデノシンメチル化型の使用を除外するバイオマーカーなどと考えられ得るという考えを導入する。具体的には、この着想の最初の読み取りは、例［３０］［３１］として、原発性ＧＢＭの１０％未満及びデノボＡＭＬの６～１０％におけるｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ治療の使用を除外し得る。しかしながら、この点は、ｍ６Ａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ治療が単一治療として想定される場合に利用可能である。これは、ＢＡＹ１４３６０３２（全変異型ＩＤＨ１阻害剤［３２］）とのその組み合わせが細胞死を促進するその能力を回復させたからである（データは示さず）。
結論として、本発明者らの結果は、ｍｉＲＮＡに関するエピジェネティック修飾の理解及び革新的なエピドラグの開発において新しい分野を開く。実際、数年前から、メッセンジャー及びｎｃＲＮＡ活性の制御における中心的な役割など、ＲＮＡ（すなわち、エピトランスクリプトーム）の化学修飾が定義されている［３３］。本発明者らのデータは、ｍｉＲＮＡのアデノシンメチル化がそれらの転写後抑制機能を無効にすることを示すことによってこの考えを強化する。アデノシン－メチル化ｍｉＲＮＡをプロドラッグとして使用することができるという考えを開始することによって、本発明者らの研究は、ｍｉＲＮＡを標的とする抗癌治療戦略の新しい経路の開発の基礎を提供する。したがって、将来において、ｍｉＲＮＡのエピジェネティックな調節に関与する機構の理解は、患者の層別化及び成功したｍｉＲＮＡに基づく治療戦略の開発を改善することができる。
参考文献
この出願を通して、様々な参考文献が、この発明が関係する技術水準を記載している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
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Claims (10)

  1. 癌に罹患している患者の生存期間の予後を決定するためのインビトロ方法であって、ｉ）前記患者からのサンプルにおけるｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ及び／又はＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）の発現量を決定することから成るステップと、ｉｉ）前記発現量を所定の基準値と比較することから成るステップと、ｉｉｉ）ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％未満であるとともにｍｉＲ－２００ｂ－３の発現量が所定の基準値よりも高い場合に良好な予後をもたらし、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％未満であるとともにｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの発現量が所定の基準値よりも低い場合又はｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％よりも高い場合に不良の予後をもたらすことから成るステップを含む方法。
  2. ｉ）前記患者からのサンプルにおける前記ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ及び前記Ｎ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）の発現量を決定することから成るステップと、ｉｉ）前記発現量を所定の基準値と比較することから成るステップと、ｉｉｉ）前記ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％未満であるとともに前記ｍｉＲ－２００ｂ－３の発現量が前記所定の基準値よりも高い場合に良好な予後をもたらし、前記ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａの発現量が１０％未満であるとともに前記ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐの発現量が前記所定の基準値よりも低い場合に不良の予後をもたらすことから成るステップとを含む、請求項１に記載の癌に罹患している患者の生存期間の予後を決定するためのインビトロ方法。
  3. 前記癌が、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）である、請求項１又は２に記載のインビトロ方法。
  4. 本発明に係るサンプルが、血液、血漿、血清サンプル又は癌生検材料である、請求項１から３のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
  5. 癌の治療を必要とする被験体における癌の治療において使用するためのＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）。
  6. 癌の治療を必要とする被験体における癌の治療において使用するためのプロドラッグとしてのＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）。
  7. 前記癌が、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）である、請求項５又は６に記載のＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ。
  8. 前記ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａが、配列番号１の核酸配列を有し、最後から２番目の核酸が３’上でメチル化されている、請求項５から７のいずれか一項に記載のＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ。
  9. 癌を治療するための方法であって、癌の治療を必要とする被験体に、治療有効量のＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）を投与することを含む方法。
  10. 癌の治療を必要とする被験体における癌の治療で用いるための本発明に係るＮ６－アデノシンメチル化ｍｉＲＮＡ－２００ｂ－３ｐ（ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ ｍ６Ａ）を含む治療用組成物。
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