JP2023527146A - 免疫応答を誘導するためのコンジュゲートポリペプチドおよびワクチン - Google Patents

免疫応答を誘導するためのコンジュゲートポリペプチドおよびワクチン Download PDF

Info

Publication number
JP2023527146A
JP2023527146A JP2022570449A JP2022570449A JP2023527146A JP 2023527146 A JP2023527146 A JP 2023527146A JP 2022570449 A JP2022570449 A JP 2022570449A JP 2022570449 A JP2022570449 A JP 2022570449A JP 2023527146 A JP2023527146 A JP 2023527146A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
vaccine
seq
conjugate polypeptide
polypeptide
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022570449A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021236841A5 (ja
Inventor
デニス ジェイ． ハーティガン－オコナー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of JP2023527146A publication Critical patent/JP2023527146A/ja
Publication of JPWO2021236841A5 publication Critical patent/JPWO2021236841A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

哺乳動物において1つまたは複数の抗原に対する免疫応答を誘導するための方法および組成物が開示される。TIFF2023527146000022.tif110170

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年5月19日に出願された米国仮出願第63/027,250号、および2020年7月29日に出願された米国仮出願第63/058,362号の優先権を主張し、それらの開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の下でなされた発明の権利に関する言明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号R01 AI118451の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
背景
これまで未知であった病原体に対する伝統的なワクチン開発には何年もかかるが、ヒトの健康を保全するには、数ヶ月規模でのより迅速な対応が必要となり得る（1）。しかしながら、新たに発生した病原体に対する適切な動物モデルの欠如;最適に満たない抗体応答が誘導されるときは常に起こり得る抗体依存性感染増強（ADEI）の危険（2）;サブユニットワクチン、弱毒化ワクチンまたはベクター化ワクチンのための新しい製造過程を開発することの困難さなどの複数の要因によって、迅速な開発は困難である。加えて、高力価中和抗体（nAb）の誘導は明白なアプローチであるように見えるが、nAbのどの力価が実際に保護的であるかは不明であり、この閾値が年齢の両極および併存症にわたってどのように変化するかも不明である。
SARS-CoV-2に関しては、ワクチン接種の成功の免疫的関連要因はほとんど明らかにされていない。現在開発中のほとんどのコロナウイルスワクチンは、スパイク糖タンパク質の最も可変な部分を標的とし、ワクチン中に存在するウイルスに対してのみ抗体応答を誘導する。SARS-CoV-1では、インビトロおよびマウス中の両方で、単一の抗受容体結合ドメイン（RBD）nAbまたは2つのnAbの組み合わせの存在下で、エスケープ変異体が発生する（2,3）。さらに、上記のように、専ら抗体を誘発するワクチンは、特に抗体レベルが低い場合、ADEIの可能性のために注意してさらにアプローチしなければならない（4）。実際、SARS-CoV-1に対する高濃度の抗血清はウイルス感染性を中和することが示されたのに対して、希釈された抗体はヒト前単球培養物においてADEIを引き起こし、細胞変性効果ならびにTNF-α、IL-4およびIL-6のレベルの増加をもたらした（5～7）。さらに、完全長SARS-CoV-1スパイクをベースとするワクチン候補は、非中和抗体を誘導することが実証され、免疫された動物は保護されなかった。代わりに、免疫された動物は、肝炎の増強、罹患率の増加、およびより強い炎症反応のような有害作用を経験した（8,9）。
CoVワクチンによって誘発されるT細胞応答もまた、保護および排除において重要な役割を果たす。MERS-CoV感染の排除は、T細胞欠損マウスでは不可能であったが、B細胞を欠くマウスでは達成された（10）。さらに、気道メモリーCD4＋T細胞は、SARS-CoV-1およびMERS-CoVに対する防御免疫を媒介することが示された（11）。しかしながら、ほとんどのワクチンタイプは、多数のメモリーCD4＋T細胞を誘発しない。
CMVベクター化ワクチンは、堅牢な抗体応答を誘発することができる。CMVワクチンは、異種プロモーターによって駆動されるいくつかの導入遺伝子に対する弱い抗体応答を誘発するが、CMV感染症およびワクチン接種は、内因性pp65bプロモーターの制御下で発現されるタンパク質に対する堅牢な抗体応答を誘発する。例えば、pp65bプロモーターの制御下でエボラウイルス糖タンパク質（GP）を運ぶCMVワクチンをワクチン接種したアカゲザルは、GP特異的抗体を産生できることが見出された（21）。
新たに出現した病原体に対して使用するためのCMVベクターの別の重要な特徴は、以前に曝露された個体への再投与能力である。この能力のために、長期にわたって出現する一連の脅威に対して保護するために、CMVベクター化ワクチンの反復使用を想定することができる。
しかしながら、CMVベクター化ワクチンの免疫学的利点にもかかわらず、これらのワクチンが生ウイルスとして送達される場合には、実際の障害によって、ヒト臨床使用のためにCMVワクチンを迅速に開発することが妨げられる。1つの障害は、増殖が遅く変異可能なベータヘルペスウイルスから均一な試験品を大規模に生産することが非常に困難であることである（29）。
したがって、SARS-CoV-2などの病原体に対する堅牢な抗体応答を提供し、T細胞応答を増強する可能性も秘めた、新規の、安全な、効果的な、かつ大規模化可能なワクチンおよびワクチン接種方法が必要とされている。本開示は、この必要性に対処し、他の利点も提供する。
簡単な概要
一局面において、本開示は、哺乳動物において病原体に対する免疫応答を誘導するためのワクチンであって、免疫細胞上に存在する表面タンパク質に特異的に結合するリガンドまたは抗体断片に連結された、該病原体由来の抗原を含むコンジュゲートポリペプチドを含む、ワクチンを提供する。
いくつかの態様において、表面タンパク質は、シグナル伝達および/または接着に関与する豊富なT細胞表面タンパク質である。いくつかの態様において、豊富なT細胞表面タンパク質は、CD2、CD3、CD4またはCD5である。いくつかの態様において、豊富なT細胞表面タンパク質は、CD2またはCD3である。いくつかの態様において、免疫細胞は、T細胞または抗原提示細胞（APC）である。いくつかの態様において、リガンドは細胞接着分子の外部ドメインである。いくつかの態様において、細胞接着分子はCD58である。いくつかの態様において、表面タンパク質は、T細胞によって優先的にまたは唯一発現される。いくつかの態様において、抗体断片は抗体由来のscFv鎖である。
いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドは、脂質アンカー、膜貫通セグメント、多量体化ドメインまたはこれらの要素の任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの態様において、脂質アンカーは、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーである。いくつかの態様において、脂質アンカーの付加はシグナル配列によって指示される。いくつかの態様において、シグナル配列はCD55に由来する。いくつかの態様において、膜貫通セグメントは、PDGF受容体、グリコホリンAまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質に由来する。いくつかの態様において、多量体化ドメインはT4フィブリチンに由来する。いくつかの態様において、多量体化ドメインはFcドメインである。いくつかの態様において、Fcドメインは、コンジュゲートポリペプチドのC末端に位置する。いくつかの態様において、FcドメインはヒトIgG1Fcドメインである。いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖内に抗原とリガンドまたは抗体断片とを含む融合タンパク質である。
いくつかの態様において、抗体断片は抗体由来のscFv鎖であり、該scFvのVHおよびVL領域は柔軟なリンカーによって隔てられている。いくつかの態様において、柔軟なリンカーは12アミノ酸長以上であり、コンジュゲートポリペプチドは単量体として表面タンパク質に優先的に結合する。いくつかの態様において、柔軟なリンカーは12アミノ酸長より短く、コンジュゲートポリペプチドは多量体として表面タンパク質に優先的に結合する。いくつかの態様において、多量体は、単量体単位間のジスルフィド結合によって安定化される。いくつかの態様において、柔軟なリンカーは5アミノ酸長である。いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドはtPAリーダー配列をさらに含む。いくつかの態様において、tPAリーダー配列は23アミノ酸長である。
いくつかの態様において、ワクチンは、病原体由来の第2の抗原をさらに含む。いくつかの態様において、病原体はウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスはSARS-CoV-2である。いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチド内に存在する抗原はSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質またはその断片を含む。いくつかの態様において、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の断片はS1ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む。いくつかの態様において、第2の抗原は、SARS-CoV-2E、M、N、nsp3、nsp4もしくはnsp6タンパク質、またはこれらのタンパク質の1つの断片を含む。いくつかの態様において、第2の抗原は、SARS-CoV-2EおよびMタンパク質を含む融合タンパク質、またはその断片を含む。いくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。いくつかの態様において、ワクチンは皮下注射用に製剤化される。いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25およびSEQ ID NO:27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
別の局面において、本開示は、哺乳動物において病原体に対する免疫応答を誘導するためのワクチンであって、免疫細胞上に存在する表面タンパク質に特異的に結合するリガンドまたは抗体断片に融合した、該病原体由来の抗原を含むコンジュゲートポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ワクチンを提供する。
ワクチンのいくつかの態様において、表面タンパク質は、シグナル伝達および/または接着に関与する豊富なT細胞表面タンパク質である。いくつかの態様において、豊富なT細胞表面タンパク質は、CD2、CD3、CD4またはCD5である。いくつかの態様において、豊富なT細胞表面タンパク質は、CD2またはCD3である。いくつかの態様において、免疫細胞は、T細胞または抗原提示細胞（APC）である。いくつかの態様において、リガンドは細胞接着分子の外部ドメインである。いくつかの態様において、細胞接着分子はCD58である。いくつかの態様において、表面タンパク質は、T細胞によって優先的に発現される。いくつかの態様において、抗体断片は抗体由来のscFv鎖である。いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドは、脂質アンカー、膜貫通セグメント、多量体化ドメインまたはこれらの要素の任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの態様において、脂質アンカーは、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーである。いくつかの態様において、脂質アンカーの付加はシグナル配列によって指示される。いくつかの態様において、シグナル配列はCD55に由来する。いくつかの態様において、膜貫通セグメントは、PDGF受容体、グリコホリンAまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質に由来する。いくつかの態様において、多量体化ドメインはT4フィブリチンに由来する。いくつかの態様において、多量体化ドメインはFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはコンジュゲートポリペプチドのC末端に位置する。いくつかの態様において、FcドメインはヒトIgG1Fcドメインである。
いくつかの態様において、scFvのVHおよびVL領域は、コンジュゲートポリペプチド内で柔軟なリンカーによって隔てられている。いくつかの態様において、柔軟なリンカーは12アミノ酸長以上であり、コンジュゲートポリペプチドは単量体として表面タンパク質に優先的に結合する。いくつかの態様において、柔軟なリンカーは12アミノ酸長より短く、コンジュゲートポリペプチドは多量体として表面タンパク質に優先的に結合する。いくつかの態様において、多量体は、ジスルフィド結合によって安定化される。いくつかの態様において、柔軟なリンカーは5アミノ酸長である。いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドはtPAリーダー配列を含む。いくつかの態様において、tPAリーダー配列は23アミノ酸長である。
いくつかの態様において、ワクチンは、病原体由来の第2の抗原をコードする第2のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの態様において、病原体はウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスはSARS-CoV-2である。いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチド内に存在する抗原はSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質またはその断片を含む。いくつかの態様において、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の断片はS1ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む。いくつかの態様において、第2の抗原は、SARS-CoV-2E、M、N、nsp3、nsp4もしくはnsp6タンパク質、またはそのタンパク質の1つの断片を含む。いくつかの態様において、第2の抗原は、SARS-CoV-2EおよびMタンパク質を含む融合タンパク質、またはその断片を含む。いくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。いくつかの態様において、ワクチンは、電気穿孔または皮下注射用に製剤化される。
いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび/または第2の抗原をコードする第2のポリヌクレオチドはコドン最適化されている。いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは第1の発現カセット内に存在し、該ポリヌクレオチドは第1のプロモーターに機能的に連結されており、かつ/または、第2の抗原をコードする第2のポリヌクレオチドは第2の発現カセット内に存在し、該第2のポリヌクレオチドは第2のプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの態様において、第2のプロモーターは哺乳動物プロモーターである。いくつかの態様において、哺乳動物プロモーターはEF-1αプロモーターである。いくつかの態様において、第1および/または第2の発現カセットはベクター内に存在する。いくつかの態様において、ベクターは裸のDNAとして投与される。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかのこのような態様において、ウイルスベクターはサイトメガロウイルス（CMV）、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの態様において、ワクチンは、インビボトランスフェクション試薬をさらに含む。いくつかのこのような態様において、インビボトランスフェクション試薬はin vivo-jetPEI（商標）である。いくつかの態様において、ワクチンは、皮下トランスフェクション用に製剤化される。
いくつかの態様において、ベクターは、（a）第1の発現カセット、または第1および第2の発現カセットを含有する、CMVゲノムまたはその一部と;（b）複製起点を含むバクテリア人工染色体（BAC）配列と;（c）少なくとも2つのウイルス直列反復配列を含む第1のターミナーゼ複合体認識座位（TCRL1）と;（d）少なくとも2つのウイルス直列反復配列を含む第2のターミナーゼ複合体認識座位（TCRL2）と、を含む環状CMVベクターであり、該CMVゲノムまたはその一部は、TCRL1およびTCRL2に隣接しており、それにより、TCRL1からTCRL2まで延びかつ該CMVゲノムまたはその一部を含む、該環状ベクターの第1の領域を画定し;該BAC配列は、TCRL1からTCRL2まで延びかつ該CMVゲノムまたはその一部を含まない、該環状ベクターの第2の領域中に位置する。
いくつかの態様において、ベクターは、（a）第1の発現カセット、または第1および第2の発現カセットを含有する、CMVゲノムまたはその一部と;（b）単細胞生物において機能する複製起点を含む配列と;（c）HVターミナーゼ複合体による切断を指示することができる、組換え的に導入されたポリヌクレオチド配列を含む1つまたは複数のターミナーゼ複合体認識座位（TCRL）と、を含む環状CMVベクターであり、該CMVゲノムまたはその一部は、該複製起点を含む配列からTCRLによって隔てられており;該CMVゲノムまたはその一部は、少なくとも一方の端においてTCRLに接しており;該複製起点を含む配列は、少なくとも一方の端においてTCRLに接している。
いくつかの態様において、1つまたは複数のターミナーゼ複合体認識座位は、Pac1部位およびPac2部位を含む。いくつかの態様において、ターミナーゼ複合体認識座位のすべては、Pac1部位およびPac2部位を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターはウイルスプロモーターである。いくつかの態様において、ウイルスプロモーターはpp65bプロモーターである。いくつかの態様において、ベクターはCMVベクターであり、該CMVはTowne HCMVである。いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
別の局面において、本開示は、免疫細胞上に存在する表面タンパク質に特異的に結合するリガンドまたは抗体断片に連結した、病原体由来の抗原を含むコンジュゲートポリペプチドを提供する。
コンジュゲートポリペプチドのいくつかの態様において、表面タンパク質はCD2、CD3、CD4またはCD5である。いくつかの態様において、表面タンパク質はCD2またはCD3である。いくつかの態様において、免疫細胞は、T細胞または抗原提示細胞（APC）である。いくつかの態様において、リガンドは細胞接着分子の外部ドメインである。いくつかの態様において、細胞接着分子はCD58である。いくつかの態様において、表面タンパク質は、シグナル伝達および/または接着に関与する豊富なT細胞表面タンパク質である。いくつかの態様において、リガンドまたは抗体断片は、T細胞によって優先的にまたは唯一発現される表面タンパク質に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体断片は抗体由来のscFv鎖である。
いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドは、脂質アンカー、膜貫通セグメント、多量体化ドメインまたはこれらの要素の任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの態様において、脂質アンカーは、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーである。いくつかの態様において、脂質アンカーの付加はシグナル配列によって指示される。いくつかの態様において、シグナル配列はCD55に由来する。いくつかの態様において、膜貫通セグメントは、PDGF受容体、グリコホリンAまたはSARS-CoV-2スパイクタンパク質に由来する。いくつかの態様において、多量体化ドメインはT4フィブリチンに由来する。いくつかの態様において、多量体化ドメインはFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはコンジュゲートポリペプチドのC末端に位置する。いくつかの態様において、FcドメインはヒトIgG1Fcドメインである。
いくつかの態様において、抗体断片は抗体由来のscFv鎖であり、該scFvのVHおよびVL領域は柔軟なリンカーによって隔てられている。いくつかの態様において、柔軟なリンカーは12アミノ酸長以上であり、コンジュゲートポリペプチドは単量体として表面タンパク質に優先的に結合する。いくつかの態様において、柔軟なリンカーは12アミノ酸長より短く、コンジュゲートポリペプチドは多量体として表面タンパク質に優先的に結合する。いくつかの態様において、多量体は、単量体単位間のジスルフィド結合によって安定化される。いくつかの態様において、柔軟なリンカーは5アミノ酸長である。いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドはtPAリーダー配列をさらに含む。いくつかの態様において、tPAリーダー配列は23アミノ酸長である。
いくつかの態様において、病原体はウイルスである。いくつかのこのような態様において、ウイルスはSARS-CoV-2である。いくつかの態様において、抗原はSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質またはその断片を含む。いくつかの態様において、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の断片はS1ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む。いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25およびSEQ ID NO:27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
別の局面において、本開示は、（i）組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）シグナル配列と;（ii）CD2、CD3またはCD4に特異的に結合する一本鎖可変断片（scFv）と;（iii）柔軟なリンカーと;（iv）SARS-CoV-2受容体結合ドメイン（RBD）とを含む、コンジュゲートポリペプチドを提供する。
いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドは、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID 25もしくはSEQ ID NO:27のアミノ酸配列を含む。
別の局面において、本開示は、本明細書に記載されるコンジュゲートポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドはコドン最適化されている。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28のヌクレオチド配列を含む。
別の局面において、本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含む発現カセットを提供する。いくつかの態様において、発現カセットは、SEQ ID NO:8のヌクレオチド配列を含む。
別の局面において、本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは発現カセットのいずれかを含むベクターを提供する。
いくつかの態様において、ベクターはプラスミドである。いくつかの態様において、ベクターはアデノウイルスベクターである。
別の局面において、本開示は、本明細書に記載されるダイアボディ、トリアボディ、テトラボディまたは二量体のいずれかを提供する。
別の局面において、本開示は、本明細書に記載されるコンジュゲートポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原、発現カセット、ベクター、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディまたは二量体のいずれかを含むワクチンを提供する。
別の局面において、本開示は、本明細書に記載されるワクチンのいずれかを哺乳動物に投与する工程を含む、該哺乳動物において病原体に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
いくつかの態様において、ワクチンは、皮下にまたは電気穿孔によって投与される。いくつかの態様において、前記方法は、コンジュゲートポリペプチド内に存在する抗原に対する、哺乳動物における中和抗体応答を誘導し、中和応答は、ワクチンによって哺乳動物において誘導される任意の抗体依存性感染増強（ADEI）よりも実質的に大きい。いくつかの態様において、ワクチンは、哺乳動物においてADEIを実質的に誘導しない。いくつかの態様において、前記方法は、第2の抗原に対するCD4＋およびCD8＋T細胞応答の両方を誘導する。
いくつかの態様において、本方法は、本明細書に記載されるコンジュゲートポリペプチドのいずれかをコードする本明細書に記載されるベクターのいずれか、例えば、プラスミドを含むDNA初回刺激の電気穿孔によって哺乳動物に投与し、その後、本明細書に記載される抗原のいずれか、例えばRBDをコードする本明細書に記載されるベクターのいずれか、例えばアデノウイルスベクターを用いて追加免疫する工程を含む。いくつかの態様において、追加免疫は約28日後に行われる。いくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。
組成物ならびに組成物の調製および投与のための方法を含む、本開示の多数の態様が本明細書に提示される。
図1は、SARS-CoV-2 S1ドメインに連結された抗CD3 scFvによるT細胞の刺激。左、刺激なしでの培養中のT細胞のインキュベーションは、細胞表面上での限定されたCD69発現および無視できるインターフェロン-ガンマ産生をもたらす。右、プレートに結合した抗CD3scFv-S1の存在下でのT細胞のインキュベーションは、増加したCD69およびインターフェロン産生をもたらし、抗CD3scFv-S1分子がCD3複合体に結合し、T細胞シグナル伝達を活性化することができることを示している。スケールは、x軸およびy軸の両方で-103から105まで延びる。 図2は、自己開始RhCMV BAC DNA構築物を示す模式図である。図示された構築物では、各ターミナーゼ複合体認識座位（TCRL）は2つのDR反復からなる。2つのTCRLは、原核生物の複製起点、oriSを含むBAC配列に隣接する。 図3A～3B。UL111Aを欠くCMVベクター化ワクチンは、粘膜表面で強いCD4＋およびCD8＋T細胞応答を誘発する。図3A:アデノウイルスベクター化対CMVベクター化免疫化後のCD4およびCD8応答のバランス。CMVワクチン（薄い実線は個々の追跡;濃い実線は中央値）は、同等のCD4およびCD8応答を誘発した（比＞1）のに対して、アデノウイルスベクターは、CD4応答のより低い相対頻度を誘発する（点線）。図3B:CMVベクター化免疫化後のバランスのとれたCD4＋およびCD8＋T細胞応答の例（上）、但しアデノウイルスベクター化免疫化では見られない（下）。免疫化の2週間後に、サイトカイン産生を伴ってワクチン抗原刺激に応答するCD4＋またはCD8＋細胞（それぞれ、左および右）が示されている。 図4。BAC複製起点を取り囲むターミナーゼ複合体認識座位（TCRL）の導入は、インビトロで、CMV BACゲノムDNAの複製ウイルスへの優れた変換を提供する。左、FuGene6を使用した1μgのCMV BACゲノムDNAのトランスフェクションは、従来のCMV BACゲノムDNA（TR3dIL10）を使用した場合には、わずか1つのプラークの産生をもたらすが、図2におけるようにBAC起点を取り囲むCMV TCRL（TR4dIL10）を有する自己開始構築物を使用した場合には20プラークの産生をもたらす。右、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションを使用した、入力DNA量の範囲にわたるプラーク形成の比較。BAC起点を取り囲むTCRLを有する自己開始ゲノムは、あらゆるDNA入力レベルにおいて優れている。 図5。抗CD3連結免疫原と反応性のB細胞は、無差別な補助を受ける。 図6。100μgのRhCMVdIL10ワクチンBAC DNAでの皮下によるワクチン接種は、免疫応答を誘発するのに十分である。早くも初回刺激の1週間後に見られるpRhCMV-MAGEA4に対する免疫応答が示されている。 図7。プロトコルの概要。 図8。発現カセットおよび実験の設計。上、SARS-CoV-2スパイクS1ドメイン（上、薄い灰色）、受容体結合ドメイン（中央、灰色）または抗CD3 scFv-RBD融合タンパク質（s3-RBD、黒色）をコードする発現カセットの設計。中央、ワクチン接種プロトコルの0日目に電気穿孔されたDNAとして、これらのカセットをアカゲザルに送達し、およそ28日目にアデノウイルス35型（Ad35）ベクターで動物を追加免疫した。下、初回刺激時にS1、RBDまたはs3-RBDを発現する1mgのDNAを、追加免疫時に1012個のAd35/S1またはAd35/RBD粒子を1群当たり3匹のマカクに与えた。 図9。エンドポイント希釈ELISAアッセイによって検出された結合抗体。個々のワクチン接種されたマカクの応答はより細い線で示されており、群ごとの幾何平均応答はより太い線で示されている（S1は黒い点線、RBD単独は灰色の破線、s3-RBDは黒い実線）。0週目のDNAおよび4週目のAd35によるワクチン接種は、RBDおよびs3-RBD構築物のすべてのレシピエントにおいて、0週目のバックグラウンドを上回る結合抗体応答をもたらす。s3-RBD初回刺激のレシピエントは、平均してより高く、かつ2/3の事例において、RBD群で発生した最高の応答より高い優れた応答を示す。s3-RBDに対する幾何平均応答は、ワクチン接種後24週までに、RBDに対する幾何平均応答より10倍高い。 図10。レポーターウイルス粒子（RVP/シュードウイルス）アッセイは、様々な希釈度の血清による、SARS-CoV-2スパイクを有する偽型化レンチウイルス粒子による感染の阻害を試験する。次いで、曲線を作成し、50％阻害を得るために必要とされる血清の希釈度として中和力価50（NT50）を読み取る。本実施例では、ワクチン接種は、初回刺激後5週目に開始する高い中和力価をもたらす。 図11。縦断的シュードウイルス中和アッセイの結果は、s3-RBDによる中和抗体の優れた誘導を実証する（黒い実線）。初回刺激ワクチン接種の5週後に、幾何平均力価（GMT）は、s3-RBD群において、RBD群におけるより少なくとも4倍高い（黒い実線対破線の灰色線）。s3-RBD群中の1匹の動物は、アッセイの上限を超える中和抗体価を生じたので、s3-RBDの真の優位性はより大きい。さらに、RBD単独のほとんどのレシピエントは、ワクチン接種後24週までに検出限界未満の中和抗体価を有するのに対して、すべてのs3-RBDレシピエントは、32週を通じて高い中和価を維持する。 図12。RBD単独、s2-RBD（すなわち、抗CD2-RBDコンジュゲートポリペプチド）またはeDis3-RBD（強化されたダイアボディ抗CD3-RBDコンジュゲートポリペプチド）を使用して初回刺激されたマカクにおけるエンドポイント希釈ELISAアッセイによって検出された結合抗体。個々のワクチン接種されたマカクの応答はより細い線で示されており、群ごとの幾何平均応答はより太い線で示されている（RBDは黒い点線、s2-RBDは灰色の破線、eDis3-RBDは黒い実線）。RBD単独と比較して、s2-RBDまたはeDis3-RBD初回刺激のいずれかのレシピエントは、より高いピークに達し、24週後により高いレベルで維持される優れた応答を示す。 図13A～13D。1dCD58-RBD（B.1.351）またはs3-RBD（B.1.351）-PDGFRtmで形質導入された宿主細胞は、免疫反応性RBDを産生する。このアッセイは、トランスフェクション後に産生される細胞内タンパク質との抗RBD抗体の結合を検出する。（図13A）プラスミドをトランスフェクションされていない陰性対照細胞は抗RBD抗体と反応しない。（図13B）RBD（B.1.351）のみのための発現カセットをトランスフェクションされた陽性対照細胞は、免疫反応性タンパク質を産生する。（図13C）1dCD58-RBD（B.1.351）のための発現カセットをトランスフェクションされた細胞は免疫反応性タンパク質を産生し、コンジュゲートポリペプチドの産生の成功およびワクチン接種後に免疫応答を生成する可能性を示す。（図13D）細胞膜中に挿入されることが予測されるs3-RBD（B.1.351）-PDGFRtmのための発現カセットをトランスフェクションされた細胞は、免疫反応性タンパク質を産生し、コンジュゲートポリペプチドの産生が成功したことを示す。
詳細な説明
1. 序論
本開示は、対象において免疫応答を誘導するための方法および組成物を提供する。本方法および組成物は、SARS-CoV-2などのウイルス由来の抗原などの抗原に対する強力な、有効な、安全な抗体および/またはT細胞応答を可能にする。本方法および組成物は、とりわけ、T細胞または抗原提示細胞（APC）などの免疫細胞上の表面タンパク質に結合するリガンドまたは抗体断片に連結されている抗原を含むコンジュゲートポリペプチドを含む。いくつかの態様において、コンジュゲート剤は、第2の抗原、例えばT細胞応答を誘発するように設計された第2の抗原とともに投与される。
2. 定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に指定されない限り、それらに割り当てられる意味を有する。
ゲノムの「実質的な部分」は、例えば、複製起点などのゲノムからの1つまたは少数の遺伝子またはエレメントを含有するのみの核酸とは異なり、ゲノムおよびゲノム中に含有される遺伝子の有意な割合、例えば、ゲノム全体の20％および/またはゲノム内の遺伝子の20％が保持されていることを示す。本ポリヌクレオチドにおいて、前記部分は、ゲノム（すなわち、全ヌクレオチドに関して）または野生型の完全長ゲノム内に存在する遺伝子の少なくとも、例えば、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％またはそれより多くを含む。
本明細書で使用される「1つの（a）」、「1つの（an）」、または「その（the）」という用語は、1つのメンバーを有する局面を含むだけでなく、1つより多くのメンバーを有する局面も含む。例えば、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明確に反対を表さなければ、複数表記を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」への言及は、複数のこのような細胞を含み、「作用物質（the agent）」への言及は、当業者に公知の1つまたは複数の作用物質への言及などを含む。
本明細書で使用される「約」および「およそ」という用語は、一般に、測定の性質または精度を考慮して、測定された量に対する誤差の許容可能な程度を意味するものとする。典型的には、例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の20パーセント（％）以内、好ましくは10％以内、より好ましくは5％以内である。「約X」への任意の言及は、少なくとも値X、0.8X、0.81X、0.82X、0.83X、0.84X、0.85X、0.86X、0.87X、0.88X、0.89X、0.9X、0.91X、0.92X、0.93X、0.94X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、1.05X、1.06X、1.07X、1.08X、1.09X、1.1X、1.11X、1.12X、1.13X、1.14X、1.15X、1.16X、1.17X、1.18X、1.19Xおよび1.2Xを具体的に示す。したがって、「約X」は、例えば、「0.98X」という請求する権利の限定に対する明細書のサポートを教示および提供することを意図している。
用語「抗原」は、（例えば、対象において）免疫応答を誘導することができる分子またはその一部を指す。多くの事例では、免疫応答は抗原を標的とするかまたは抗原に特異的に結合する抗体の産生を含むのに対して、本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗原を標的とする抗体の産生を特異的に含むもの以外の免疫応答、例えば、標的細胞の表面上に提示される抗原由来ペプチドを標的とするT細胞の拡大増殖を含む細胞媒介性免疫応答を誘導する分子も指す。特定の態様において、本開示の抗原は、対象の免疫応答が病原体に対する免疫防御を提供するように、病原体に由来する。特定の態様において、病原体は、SARS-CoV-2などのウイルスである。
「ペプチドをコードする核酸配列」という用語は、いくつかの態様において、ペプチド鎖（例えば、抗原または融合タンパク質）の産生に関与する遺伝子またはその一部であり得るDNAのセグメントを指す。遺伝子は、一般に、遺伝子産物の転写/翻訳および転写/翻訳の調節に関与するコード領域に先行するおよび後続する領域（リーダーおよびトレーラー）を含む。遺伝子はまた、個々のコードセグメント（エクソン）の間に介在配列（イントロン）を含むことができる。リーダー、トレーラーおよびイントロンは、遺伝子の転写および翻訳中に必要な調節エレメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、複製起点、マトリックス付着部位および座位調節領域など）を含むことができる。「遺伝子産物」は、特定の遺伝子から発現されるmRNAまたはタンパク質のいずれかを指すことができる。
「発現」および「発現される」という用語は、例えばタンパク質（例えば、抗原または融合タンパク質）をコードする核酸配列の転写産物および/または翻訳産物の産生を指す。いくつかの態様において、この用語は、遺伝子（例えば、抗原をコードする遺伝子）またはその一部によってコードされる転写産物および/または翻訳産物の産生を指す。細胞におけるDNA分子の発現のレベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量または細胞によって産生されるそのDNAによってコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて評価され得る。
「組換え」という用語は、例えばポリヌクレオチド、タンパク質、ベクターまたは細胞に関して使用される場合、ポリヌクレオチド、タンパク質、ベクターまたは細胞が異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の変化によって改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。例えば、組換えポリヌクレオチドは、天然の（非組換え）形態のポリヌクレオチド内には見出されない核酸配列を含有する。
「免疫応答」という用語は、病原体（例えば、ウイルスおよび細菌などの微生物）に対する免疫の誘導を含む、抗原によって（例えば、対象において）誘導される任意の応答を指す。本開示の系、組換えポリヌクレオチド、組成物および方法によって誘導される免疫応答は、典型的には、所望される、意図される、および/または防御的な免疫応答である。本用語は、抗原に対する抗体、例えば中和抗体の産生、ならびに免疫細胞（例えば、B細胞およびT細胞）の発達、成熟、分化および活性化を含む。いくつかの例では、免疫応答は、（例えば、対象において）MHCクラスEおよび/またはクラスII拘束性CD4＋および/またはCD8＋T細胞の数または活性化を増大させることを含む。本用語はまた、免疫機能の調節に関与するサイトカインの発現または活性を増加または減少させることを含む。別の非限定的な例として、免疫応答は、（例えば、対象において）インターフェロン-ガンマおよび/または腫瘍壊死因子-アルファの発現または活性を増大させることを含むことができる。
本開示の組換えポリヌクレオチド、組成物および方法に従って誘導することができる所望される、意図される、および/または防御的な免疫応答のさらなる例としては、クラスIa、クラスIbまたはクラスII拘束性CD4＋T細胞;クラスIa、クラスIbまたはクラスII拘束性CD8＋T細胞;サイトカイン産生T細胞（例えば、IFN-γ、TNF-α、IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-18またはIL-23を産生するT細胞）;CCR7-CD8＋T細胞（例えば、エフェクター-メモリー細胞）;CXCR5＋T細胞（すなわち、B細胞濾胞にホーミングするもの）;CD4＋制御性T細胞;CD8＋調節性T細胞;抗原特異的T濾胞性ヘルパー細胞;抗体産生;NK細胞;NKG2C＋NK細胞;CD57＋NK細胞;FcRγ陰性NK細胞;およびNK-CTL細胞、すなわち、NKG2AなどのNK細胞に典型的な分子を発現するCD8＋T細胞を伴うものが挙げられるが、これらに限定されない。
「サイトメガロウイルス」または「CMV」という用語は、（ヘルペスウイルス目、ヘルペスウイルス科、ベータヘルペスウイルス亜科内の）ウイルスのサイトメガロウイルス属のメンバーを含むウイルスを指す。本用語には、マカクに感染する、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV;ヒトヘルペスウイルス5（HHV-5）としても知られている）、サルサイトメガロウイルス（SCCMVまたはAGMCMV）、ヒヒサイトメガロウイルス（BaCMV）、ヨザルサイトメガロウイルス（OMCMV）、リスザルサイトメガロウイルス（SMCMV）およびアカゲザルサイトメガロウイルス（RhCMV）が含まれるが、これらに限定されない。
「抗原提示細胞」または「APC」という用語は、細胞の表面上に抗原またはその一部をディスプレイまたは提示する細胞を指す。典型的には、抗原は、主要組織適合抗原複合体（MHC）分子とともにディスプレイまたは提示される。ほとんどすべての細胞型がAPCとして機能することができ、APCは多数の異なる組織型中で見られる。樹状細胞、マクロファージおよびB細胞などのプロフェッショナルAPCは、T細胞の活性化およびその後の増殖を最も効率的にもたらす状況で抗原をT細胞に提示する。多くの細胞型は、細胞傷害性T細胞に抗原を提示する。
「免疫細胞」は、ヘルパーT細胞、CD4＋T細胞、CD8＋T細胞、TH1、TH2、TH17およびTreg細胞などのT細胞、抗原提示細胞（APC）、B細胞、好塩基球、好酸球および好中球を含む顆粒球、肥満細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびナチュラルキラー（NK）細胞を含む、免疫系の任意の細胞であり得る。
「感染性疾患抗原」とは、（例えば、対象において）免疫応答を誘導することができる感染性疾患原因生物に由来する任意の分子を指す。例えば、感染性疾患抗原は、ウイルス、細菌、真菌、原虫、蠕虫または寄生生物に由来し得、例えば、細菌壁タンパク質、ウイルスキャプシドもしくは構造タンパク質（例えば、HIVまたはSIV envタンパク質などのレトロウイルスエンベロープタンパク質）、またはその一部であり得る。いくつかの態様において、感染性疾患抗原は、SARS-CoV-2からのウイルス感染性疾患抗原である。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）およびこれらのポリマーを指す。本用語には、一本鎖、二本鎖または多本鎖のDNAまたはRNA、ゲノムDNA、cDNAおよびDNA-RNAハイブリッド、ならびにプリンおよび/またはピリミジン塩基または他の天然の、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然の、合成の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む他のポリマーが含まれるが、これらに限定されない。具体的に限定されない限り、本用語は、参照核酸と類似の結合特性を有する天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別段示されない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列のみならず、その保存的に改変された変異型（例えば、縮重コドン置換）、相同体および相補的配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081（1991）;Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608（1985）;およびRossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98（1994））。
「ベクター」および「発現ベクター」という用語は、宿主細胞または操作された細胞における（例えば、本明細書に記載されるような抗原および/または融合タンパク質をコードする）特定の核酸配列の転写を可能にする一連の指定された核酸要素を有する、組換え的または合成的に作製された核酸構築物を指す。いくつかの態様において、ベクターは、プロモーターに機能的に連結された転写されるべきポリヌクレオチドを含む。ベクター中に存在し得る他の要素としては、転写を増強するもの（例えば、エンハンサー）、転写を終結させるもの（例えば、ターミネーター）、ベクターから産生されたタンパク質（例えば、組換えタンパク質）にある種の結合親和性または抗原性を付与するもの、ならびにベクターの複製および（例えば、ウイルス粒子中への）そのパッケージングを可能にするものが挙げられる。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクター（すなわち、ウイルスゲノムまたはその一部）である。ベクターは、例えば、指向性を増加させ、および/または免疫機能を調節する核酸配列または変異を含有し得る。「発現カセット」は、プロモーターに機能的に連結されたコード配列を含み、任意でポリアデニル化配列を含んでもよい。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。3つの用語はすべて、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーのみならず、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本明細書で使用される場合、これらの用語は、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されている、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
「対象」、「個体」および「患者」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために本明細書で互換的に使用される。哺乳動物には、ネズミ科の動物、マウス、ラット、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物およびペットが含まれるが、これらに限定されない。インビボで得られたまたはインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫も包含される。
「リガンド」は、生体分子、例えば受容体タンパク質に結合し、生体分子、例えば受容体タンパク質と複合体を形成し、それによって生体分子の立体構造を変化させ、その結果、生体分子の機能状態を変化させる分子である。本開示の目的において、リガンドは、典型的には、抗原とともに、より大きなコンジュゲートポリペプチド内に存在するポリペプチドである。リガンドは、より大きな分子、例えば免疫細胞の表面上の別の細胞接着タンパク質と相互作用する細胞接着タンパク質の外部ドメインに由来し得る。本開示の目的におけるリガンドの例は、CD2に結合することができる、1dCD58と称されるCD58の第1の細胞外ドメイン（または外部ドメイン）である。本開示の目的において、リガンドは、モノクローナル抗体などの抗体ではない。
本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、対象への経口投与、局所接触、坐剤としての投与、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、腫瘍内、髄腔内、鼻腔内、骨内または皮下投与を含む。投与は、非経口および経粘膜（例えば、頬側、舌下、口蓋、歯肉、鼻、膣、直腸または経皮）を含む任意の経路によるものである。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、骨内および頭蓋内が含まれる。送達の他の様式には、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が含まれるが、これらに限定されない。
「処置する」という用語は、治療上の利益および/または予防上の利益を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。「治療上の利益」とは、処置されている1つまたは複数の疾患、症状または症候の任意の治療に関連する改善または効果を意味する。治療上の利益はまた、処置されている1つまたは複数の疾患、症状または症候の治癒をもたらすことも意味することができる。さらに、治療上の利益はまた、生存を増加させることを意味することができる。予防上の利益のために、組成物は、特定の疾患、症状もしくは症候を発症するリスクがある対象に、または疾患、症状もしくは症候がまだ存在しなくても、疾患の生理学的症候の1つまたは複数を報告している対象に投与され得る。
「治療有効量」または「十分な量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な本明細書に記載される系、組換えポリヌクレオチドまたは組成物の量を指す。治療有効量は、処置されている対象および疾患症状、対象の体重および年齢、疾患症状の重症度、対象の免疫状態、投与様式などのうちの1つまたは複数に応じて変動し得、これらは当業者によって容易に決定され得る。具体的な量は、選択される特定の作用物質、標的細胞の種類、対象における標的細胞の位置、従うべき投薬レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、およびそれがその中で運ばれる物理的送達系のうちの1つまたは複数に応じて異なり得る。
本明細書の目的において、有効量は、当技術分野で公知であり得る考慮事項によって決定される。この量は、感染性疾患または癌などの疾患に罹患している対象において所望の治療効果を達成するために有効でなければならない。所望の治療効果には、例えば、疾患に関連する望ましくない症候の改善、そのような症候が生じる前のそのような症候の発現の予防、疾患に関連する症候の進行の減速、疾患によって引き起こされる任意の不可逆的な損傷の減速もしくは制限、疾患の重症度の軽減もしくは治癒、または生存率の改善もしくは疾患からのより迅速な回復の提供が含まれ得る。さらに、予防的処置の文脈において、この量はまた、疾患の発症を予防するのに有効であり得る。
「薬学的に許容され得る担体」という用語は、活性因子の細胞、生物、または対象への投与を補助する物質を指す。「薬学的に許容され得る担体」はまた、本組成物に含めることができ、かつ患者に著しい有害毒性作用を引き起こさない担体または賦形剤を指す。薬学的に許容され得る担体の非限定的な例としては、水、塩化ナトリウム（NaCl）、生理食塩水溶液、乳酸加リンゲル、通常のスクロース、通常のグルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング、甘味料、香料および着色剤、リポソーム、分散媒、マイクロカプセル、カチオン性脂質担体、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。担体はまた、製剤に安定性、無菌性および等張性を提供するための（例えば、抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート剤および緩衝剤）、微生物の作用を防止するための（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの抗菌剤および抗真菌剤）、または製剤に食用香料などを提供するための物質も含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの例では、担体は、標的細胞または組織へのポリペプチド、融合タンパク質またはポリヌクレオチドの送達を促進する作用物質である。当業者は、他の薬学的担体も本方法および組成物において有用であることを認識するであろう。
「ワクチン」という用語は、対象に投与された場合に、対象において特定の病原体または疾患に対する獲得免疫を生成する能力を有する生物学的組成物を指す。典型的には、関心対象の病原体または疾患に関連する1つまたは複数の抗原、抗原の断片または抗原もしくは抗原の断片をコードするポリヌクレオチドが対象に投与される。ワクチンは、例えば、不活化または弱毒化された生物（例えば、細菌またはウイルス）、細胞、細胞からまたは細胞上で発現されるタンパク質（例えば、細胞（例えば、腫瘍細胞）によって産生される細胞表面タンパク質またはその他のタンパク質）、生物によって産生されるタンパク質（例えば、毒素）、または生物の一部（例えば、ウイルスエンベロープタンパク質または様々な抗原をコードするウイルス遺伝子）を含むことができる。いくつかの例では、ワクチンとして投与された場合に、細胞が、特定の細胞型に対する免疫を獲得する対象の能力を増強する（例えば、癌細胞に対する免疫を獲得する対象の能力を増強する）またはウイルス、細菌、真菌生物、原虫もしくは蠕虫などの感染性疾患を引き起こす生物に対する免疫を獲得する対象の能力を増強するように、細胞はタンパク質を発現するように操作される。本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、本開示の系および組換えポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載される系または組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子、宿主細胞および薬学的組成物を含むが、これらに限定されない。
「Pac1部位」および「Pac2部位」という用語は、パッケージングを開始し、単一の、単位長さのゲノムへのゲノムコンカテマーの切断を指示するためのキャプシド形成機構によって認識される、サイトメガロウイルスゲノムを含むヘルペスウイルスゲノムの直列末端反復中のシス作用性ポリヌクレオチド配列を指す（例えば、Fields Virology 6th edition,2013,Knipe and Howley,edsを参照）。
3. ワクチン
本開示は、任意の種類の病原体からの抗原に対する免疫応答を生成するためのワクチンを提供する。それに対する免疫応答が（例えば、対象において）生成される抗原は、それに対しての予防上および/または治療上の利益が求められる特定の疾患に依存する。いくつかの態様において、抗原は、ウイルス、細菌、原虫、蠕虫または真菌病原体などの感染性疾患抗原である。特定の態様において、抗原は、例えば、SARS-CoV-2などのコロナウイルス由来のウイルス抗原である。いくつかの態様において、抗原は腫瘍関連抗原である。
いくつかの態様において、ウイルス抗原（例えば、ウイルス感染性疾患抗原）に対して免疫応答（例えば対象における、例えば所望の、意図された、または防御的な免疫応答）が誘導される。いくつかの態様において、免疫応答は、細菌抗原（例えば、細菌感染性疾患抗原）に対して誘導される。いくつかの態様において、免疫応答は、真菌抗原（例えば、真菌感染性疾患抗原）に対して誘導される。いくつかの態様において、免疫応答は、原虫抗原（例えば、原虫感染性疾患抗原）に対して誘導される。いくつかの態様において、免疫応答は、蠕虫抗原（例えば、蠕虫感染性疾患抗原）に対して誘導される。いくつかの態様において、免疫応答は、腫瘍関連抗原に対して誘導される。いくつかの態様において、抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、原虫抗原、腫瘍関連抗原および/または蠕虫抗原である。特定の態様において、抗原は、コロナウイルス、例えばSARS-CoV-2由来のウイルス抗原である。
本発明のワクチンは、本明細書に記載される1つまたは複数の抗原をコードするRNAまたはDNAを含むタンパク質、ペプチドおよび核酸の投与を通じてなど、多数の形態のいずれかをとることができる。
免疫原性コンジュゲート
特定の態様において、ワクチンは、免疫細胞上に存在する表面タンパク質に結合するリガンドまたは抗体断片に連結された抗原を含む「免疫原性コンジュゲート」または「コンジュゲートポリペプチド」または「コンジュゲート剤」を含む。例えば、抗原は、T細胞の表面上に豊富に存在するタンパク質に特異的に結合する抗体断片に連結されることができる。いくつかの態様において、リガンドは細胞接着分子の外部ドメインである。ヘルパーT細胞などのT細胞を含む免疫細胞の表面上に豊富に存在する任意のタンパク質を、リガンドまたは抗体断片によって標的とすることができる。いくつかの態様において、リガンドまたは抗体断片によって結合されるタンパク質は、シグナル伝達および/または接着に関与する。部分によって結合され得る表面タンパク質の例としては、CD2（例えば、NCBI Gene ID 914またはUNIProt P06729参照）、任意のCD3サブユニット、すなわちCD3-イプシロン（例えば、NCBI Gene ID 916またはUNIProt P07766参照）、CD3-ガンマ（例えば、NCBI Gene ID 917またはUNIProt P09693参照、CD3-デルタ（例えば、NCBI Gene ID 915またはUNIProt P04234参照）またはCD3-ゼータ（CD247;例えば、NCBI Gene ID 919またはUNIProt P20963参照）を含むCD3、CD4（例えば、NCBI Gene ID 920またはUNIProt P01730参照）およびCD5（例えば、NCBI Gene ID 921またはUNIProt P06217参照）が挙げられる。以下の理論に拘束されるものではないが、いくつかの態様においては、このようなコンジュゲートポリペプチドは、抗原に特異的なB細胞を、B細胞の近傍のT細胞または他の免疫細胞と架橋し、それにより、抗原のみを使用したワクチン接種によって得られたものよりも強い抗体を誘発することができると考えられる。
抗原は、病原体由来の任意の免疫原性抗原、すなわち、B細胞（抗体）またはT細胞免疫応答を刺激することができ、対象中で抗体および/またはT細胞によって特異的に結合され得る1つまたは複数のエピトープを含有するものであり得る。特定の態様において、免疫原性コンジュゲート内に存在する抗原は、対象において堅牢な抗体応答を生成する。例えば、SARS-CoV-2などのコロナウイルスに対するワクチン接種の場合、抗原はスパイク糖タンパク質またはその断片を含むことができる。いくつかのこのような態様において、断片は、S1ドメイン、受容体結合ドメイン（RBD）またはその断片を含む（例えば、Ou et al.,（2020）Nat.Commun.11（1）:1620;Walls et al.（2020）Cell 181（2）:281-292;Lan et al.（2020）Nature doi:10.1038/s41586-020-2180-5;Yuan et al.（2020）Science doi:10.1126/science.abb7269;NCBI Accession Nos.QIG55857.1、6VYB_C、6VYB_B、6VYB_A、またはNCBIデータベース中のSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質エントリのいずれかを参照）。特定の態様において、抗原はSARS-CoV-2 RBDを含む。
抗原は、免疫細胞上に存在する表面タンパク質に結合することができるリガンドまたは抗体断片に連結される。いくつかの態様において、表面タンパク質は、シグナル伝達および/または接着に関与する、T細胞上の豊富な表面タンパク質である。いくつかの態様において、表面タンパク質は、T細胞または抗原提示細胞（APC）上に存在する。いくつかの態様において、表面タンパク質は、（例えば、他の免疫細胞と比較して）T細胞によって優先的に発現される。いくつかの態様において、表面タンパク質は、実質的に専らT細胞によって発現される（すなわち、T細胞によって発現され、他の免疫細胞によって著しく発現されない）。いくつかの態様において、リガンドは、免疫細胞上の表面タンパク質に天然に結合するタンパク質であり、例えば免疫細胞受容体に対する天然リガンドであるか、または天然リガンドの誘導体もしくは断片である。いくつかの態様において、リガンドは細胞外ドメイン（外部ドメイン）または細胞接着分子、例えばCD58である。例えば、いくつかの態様において、リガンドは、CD58の95残基の膜遠位N末端ドメイン（1dCD58）であり、これは専らCD2への接着に関与する。本開示の目的において、リガンドは抗体、例えばモノクローナル抗体を含まない。
いくつかの態様において、抗体断片はモノクローナル抗体の断片である。いくつかの態様において、抗体断片はキメラ抗体断片である。いくつかの態様において、抗体断片はヒト化抗体断片である。いくつかの態様において、抗体断片はヒト抗体断片である。いくつかの態様において、抗体断片は、F(ab')2、Fab'、Fab、scFvなどの抗原結合断片である。「抗体断片」という用語はまた、二重または多重抗原またはエピトープ特異性を有する多重特異性抗体およびハイブリッド抗体を包含することができる。いくつかの態様において、抗体断片は、単一の単量体可変抗体ドメイン、例えば単一のVHHドメインを含むナノボディまたは単一ドメイン抗体（sdAb）である。特定の態様において、抗体断片はscFv、例えば抗CD2、抗CD3または抗CD4scFvである。例えば、いくつかの態様において、断片は、LO-CD2aなどの抗CD2抗体に由来するscFvである。いくつかの態様において、断片は、SP34などの抗CD3抗体に由来するscFvである。いくつかの態様において、断片は、hu5A8などの抗CD4抗体に由来するscFvである。いくつかの態様において、scFvはヒト化抗体に由来する。
いくつかの態様において、例えば、抗体断片がscFvである場合、抗体のVHおよびVLドメインは柔軟なリンカーによって隔てられている。いくつかの態様において、柔軟なリンカーは、12アミノ酸以上、例えば15アミノ酸長である。そのような態様において、VHおよびVLドメインは、典型的には、適切に折り畳むことができ、コンジュゲートポリペプチドが単量体として作用する（例えば、表面タンパク質に結合する）ことを可能にする。他の態様において、柔軟なリンカーは、12アミノ酸未満の長さ、例えば、5、6、7、8、9、10または11アミノ酸の長さである。そのような態様において、VHおよびVL領域は、単量体として適切に折り畳まれるには不十分な長さを有することができ、多量体、例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディなどの形成を促進する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載されるscFv抗体断片間に形成されたダイアボディ、トリアボディまたはテトラボディを含む。いくつかの態様において、そのような多量体は、単量体単位間のジスルフィド結合によって安定化される。
表面タンパク質に結合する抗体断片を調製するために、当技術分野で公知の多くの技術を使用することができる。例えば、Kohler＆Milstein,Nature 256:495-497（1975）;Kozbor et al.,Immunology Today 4:72（1983）;Cole et al.,pp.77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.（1985）;Coligan,Current Protocols in Immunology（1991）;Harlow＆Lane,Antibodies,A Laboratory Manual（1988）;およびGoding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice（2nd ed.1986））を参照。いくつかの態様において、抗体は、抗体応答の誘導のために1匹の動物または複数の動物（マウス、ウサギ、またはラットなど）を抗原で免疫することによって調製される。モノクローナル抗体を作製するために、B細胞を骨髄腫細胞と融合し、その後、抗原特異性についてスクリーニングする。
関心対象の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、組換えモノクローナル抗体を産生するために使用することができ、そこから抗体断片を生成することができる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリは、ハイブリドーマまたは形質細胞から作製することもできる。さらに、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーのFab断片を同定するために、ファージまたは酵母ディスプレイ技術を使用することができる（例えば、McCafferty et al.,Nature 348:552-554（1990）;Marks et al.,Biotechnology 10:779-783（1992）;Lou et al.m PEDS 23:311（2010）;およびChao et al.,Nature Protocols,1:755-768（2006）を参照）。あるいは、抗体および抗体配列は、例えばXu et al.,Protein Eng Des Sel,2013,26:663-670;国際公開第2009/036379号;国際公開第2010/105256号;および国際公開第2012/009568号に開示されているものなどの酵母をベースとする抗体提示システムを使用して単離および/または同定され得る。重鎖および軽鎖遺伝子産物のランダムな組み合わせは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する（例えば、Kuby,Immunology（3rd ed.1997）を参照）。一本鎖抗体または組換え抗体を産生するための技術も（米国特許第4,946,778号、米国特許第4,816,567号）、抗体を産生するように適合させることができる。
いくつかの態様において、抗体断片（Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、ナノボディまたはダイアボディなど）が生成される。特定の態様において、抗体断片はscFv（一本鎖可変断片）である。scFvは、軽（VL）および重（VH）免疫グロブリン鎖の可変領域を含む組換えポリペプチドである。いくつかの態様において、VHおよびVL配列は、柔軟なリンカー配列によって連結される。例えば、Nelson（2010）MAbs.2（1）:77-83を参照のこと。完全な状態の抗体のタンパク質分解消化（例えば、Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Meth.,24:107-117（1992）;およびBrennan et al.,Science,229:81（1985）参照）および断片を生産するための組換え宿主細胞の使用など、抗体断片の生産のための様々な技術が開発されている。例えば、抗体断片は、抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいは、Fab'-SH断片を大腸菌（E.coli）細胞から直接回収し、F(ab')2断片を形成するために化学的に結合させることができる（例えば、Carter et al.,BioTechnology,10:163-167（1992）を参照）。別のアプローチによれば、組換え宿主細胞培養物からF(ab')2断片を直接単離することができる。抗体断片の生産のための他の技術は、当業者には明らかであろう。
結合親和性および結合速度論を測定するための方法は、当技術分野で公知である。これらの方法には、固相結合アッセイ（例えば、ELISAアッセイ）、免疫沈降、表面プラズモン共鳴（例えば、Biacore（商標）（GE Healthcare、Piscataway、NJ））、速度論的排除アッセイ（例えば、KinExA（登録商標））、フローサイトメトリ、蛍光活性化細胞選別（FACS）、BioLayer干渉法（例えば、Octet（商標）（ForteBio,Inc.,Menlo Park,CA））およびウエスタンブロット分析が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、親和性作用物質は、ペプチド、例えば、T細胞表面タンパク質に結合するペプチドである。いくつかの態様において、作用物質はペプチドアプタマーである。ペプチドアプタマーは、特定の標的分子に結合するように選択または操作された人工タンパク質である。典型的には、ペプチドは、タンパク質骨格によってディスプレイされる可変配列の1つまたは複数のペプチドループを含む。ペプチドアプタマーの選択は、酵母ツーハイブリッド系を含む異なる系を使用して行うことができる。ペプチドアプタマーは、ファージディスプレイおよび他の表面ディスプレイ技術、例えばmRNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイおよび酵母ディスプレイによって構築されたコンビナトリアルペプチドライブラリから選択することもできる。例えば、Reverdatto et al.,2015,Curr.Top.Med.Chem.15:1082-1101を参照。
いくつかの態様において、作用物質はアフィマーである。アフィマーは、抗体と類似の特異性および親和性でそれらの標的分子に結合する、典型的には約12～14kDaの分子量を有する小型の、非常に安定なタンパク質である。一般に、アフィマーは、モノクローナル抗体と同様の様式で、異なる標的タンパク質を高い親和性および特異性で結合するようにランダム化することができる2つのペプチドループおよびN末端配列をディスプレイする。タンパク質足場による2つのペプチドループの安定化は、ペプチドがとり得る可能な立体構造を制約し、遊離ペプチドのライブラリと比較して結合親和性および特異性を増加させる。アフィマーおよびアフィマーの作製方法は、当技術分野に記載されている。例えば、Tiede et al.,eLife,2017,6:e24903を参照されたい。アフィマーはまた、例えば、Avacta Life Sciencesから市販されている。
抗原およびリガンド/抗体断片は、多数の様式で互いに直接または間接的に連結することができる。例えば、いくつかの態様において、抗原およびリガンド/抗体断片は、例えば化学的リンカーを介して、または単一の融合タンパク質中に存在することによって、直接（共有結合的に）連結される。ポリペプチドを互いに連結するための、例えば抗原をリガンド/抗体断片に連結するための方法は当技術分野で公知であり、商業的供給業者から入手可能である、例えばTriLink BioTechnologies、Vector Laboratories、Kerafast、SydLabs、INTERCHIMのタンパク質-タンパク質コンジュゲーションキットなど。
特定の態様において、抗原およびリガンド/抗体断片は、単一の融合タンパク質内に存在する。例えば、特定の態様において、免疫原性コンジュゲートは、抗原および抗CD3 scFv抗体断片を含む融合タンパク質である。いくつかの態様において、融合タンパク質はまた、抗原とscFv配列を隔てる柔軟なリンカーを含む。融合タンパク質は、本明細書の他の箇所でより詳細に記載されるように、標準的な分子生物学および薬学的方法を使用してインビトロで発現され、精製され、製剤化され、タンパク質形態で投与されることができ、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして投与することができる。
いくつかの態様において、特に融合タンパク質が、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与を介して投与される場合、融合タンパク質は、tPAリーダー配列、例えば、23アミノ酸長のtPAリーダー配列を含む（例えば、UniProt P00750;Kou et al.（2017）Immunol.Lett.190:51-57;Wang et al.（2011）Appl.Microbiol.Biotech.91（3）:731-740;Delogu et al.（2002）Microbial Immun.Vacc.Doi:10.1128/IAI.70.1.292-302.2002）。いくつかのこのような態様において、tPAリーダー配列は、22P/A増強変異を含む（例えば、Wang et al.（2011）を参照）。
いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドまたは融合タンパク質内に存在する抗原およびリガンド/抗体断片は、柔軟なリンカーによって隔てられている。タンパク質ドメインを隔てるのに適したリンカーは当技術分野で公知であり、例えばグリシンおよびセリン残基、例えば2～20グリシンおよび/またはセリン残基を含むことができる。一態様において、柔軟なリンカーは、(Gly4Ser)nの柔軟なペプチドリンカー、例えば、配列
Figure 2023527146000002
を含む(Gly4Ser)3リンカーを含む。
いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドは、脂質アンカー、膜貫通セグメント、多量体化ドメイン、またはこれらのドメインの2つ以上の組み合わせなどのドメインを含む。脂質アンカーの例としては、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーが挙げられる。いくつかの態様において、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーなどの脂質アンカーの付加は、CD55に由来するシグナル配列などのシグナル配列によって指示される。適切な膜貫通セグメントの例には、PDGF受容体、グリコホリンA、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質に由来する膜貫通セグメントが含まれるが、これらに限定されない。多量体化ドメインの例としては、例えば、T4フィブリチンに由来するドメインおよびFcドメイン、例えばヒトIgGFcドメインが挙げられる。いくつかの態様において、本開示は、多量体化する、例えばT4フィブリチンまたはFcドメインを含む本コンジュゲートポリペプチド間に形成された二量体または他の多量体を含む。いくつかの態様において、多量体は、単量体単位間のジスルフィド結合によって安定化される。いくつかの態様において、Fcまたは他のドメインは、コンジュゲートポリペプチドのC末端に位置する。
ワクチンが融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドがCMVベクターなどのウイルスベクター内に存在するいくつかの態様において、融合タンパク質のコード配列は、後期プロモーター、例えばCMV pp65bプロモーターに機能的に連結されている。以下の理論に拘束されるものではないが、pp65bなどの強力な後期プロモーターを介して抗原、例えば免疫原性コンジュゲートを発現させることは、堅牢な抗体応答を惹起するが、弱いT細胞応答を惹起するに過ぎないと考えられる。
いくつかの態様においては、抗原およびリガンド/抗体断片（「親和性作用物質」とも呼ばれる）は間接的に連結されている、すなわち2つの実体を架橋する非共有結合相互作用を介して連結されている。例えば、抗原およびリガンド/抗体断片は、第2の「架橋」抗体またはその断片を介して連結することができる。いくつかの態様において、抗原はナノディスク中に埋め込まれた膜タンパク質であり、架橋抗体は、（i）抗原自体またはナノディスク内の膜足場タンパク質のいずれか、および（ii）T細胞表面タンパク質の両方に結合する二重特異性抗体断片である。ナノディスクは、膜足場タンパク質（MSP）と呼ばれる両親媒性タンパク質によって囲まれた脂質二重層を含む合成膜系である。apoA1由来のMSPなどの任意のMSPまたは両親媒性ペプチドを含む、任意のナノディスク系を本方法において使用することができる。いくつかの態様においては、合成ナノディスクが使用される。ナノディスクの調製および使用は当技術分野で公知であり、例えばBayburt et al.（2002）FEBS Letters 584（9）:1721-1727;Denisov et al.（2004）J.Am.Chem.Soc.126（11）:3477-3487;Grinkova et al.（2010）PEDS 23（11）:843-848;Midtgaard et al.（2016）Soft Matter 10（5）:738-752;Larsen et al.（2016）Soft Matter 12（27）:5937-5949;Kondo et al.（2016）Colloids and Surfaces B:Biointerfaces 146:423-430;Knowles et al.（2009）J.Am.Chem.Soc.131（22）:7484-7485;Oluwole et al.（2017）33（50）:14378-14388;Rouck et al.（2017）FEBS Lett.591（14）:2057-2088;Denisov＆Sligar（2016）Nat.Struct.Mol.Biol.23（6）:481-486に記載されており、これらの各々の開示全体が参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様において、コンジュゲートポリペプチドは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25もしくはSEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27と少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれを超える同一性を含むアミノ酸配列を含む。
追加の抗原
いくつかの態様において、ワクチンは、免疫原性コンジュゲートとともにまたはその代わりに存在することができる第2の抗原を含む。両方の抗原が存在する場合（すなわち、免疫原性コンジュゲートおよび第2の抗原）、抗原は一緒に、すなわち同じワクチン内で、または独立して、例えば別々に製剤化され、同時に、例えば単一の臨床訪問中に、もしくは異なる時間に、例えば異なる日に投与され得る。一方または両方の抗原は、タンパク質形態またはポリヌクレオチド形態（すなわち、2つの抗原をコードするポリヌクレオチドとして）で投与することができる。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド形態で投与される場合、免疫原性コンジュゲートのコード配列および第2の抗体のコード配列は、単一のベクター内に存在し、それらの各々はプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの態様において、第2の抗原は、構成的プロモーター、例えばEF-1αなどの哺乳動物プロモーターに機能的に連結された、抗原をコードするポリヌクレオチドとして投与される（例えば、Wang et al.（2017）J.Cell Mol.Med 21（11）:3044-3054;Edmonds et al.（1996）J.Cell Sci.109（11）:2705-2714;NCBI Gen ID 1915;これらの開示全体が参照により本明細書に組み入れられる）。以下の理論に拘束されるものではないが、細胞の細胞質区画中で第2の抗原を発現することは、堅牢なT細胞応答を惹起するが、付随する抗体応答は最小限であると考えられる。
いくつかの態様において、病原体がSARS-CoV-2などのコロナウイルスである場合、第2の抗原は、E（エンベロープタンパク質、例えば、NCBI Gene ID 43740570を参照）、M（膜糖タンパク質、例えば、NCBI Gene ID 43740571を参照）もしくはN（ヌクレオキャプシドホスホタンパク質、例えば、NCBI Gene ID 43740575を参照）またはその断片を含む。いくつかの態様において、第2の抗原は、SARS-CoV-2などのコロナウイルスのEおよびMタンパク質、またはEおよび/もしくはMタンパク質の断片を含む融合タンパク質を含む。他の適切なSARS-CoV-2抗原としては、nsp3、nsp4もしくはnsp6、またはその断片が挙げられる。特定の態様において、ワクチンは、Nタンパク質ならびに/またはSARS-CoV-2のEおよびMタンパク質を含む融合タンパク質（例えば、SEQ ID NO:3および4に示されるような）のコドン最適化されたコード配列を含む。
核酸ワクチン
いくつかの態様において、免疫原性コンジュゲートおよび/または第2の抗原を導入するために、核酸ワクチン、例えばDNAワクチンが使用される。したがって、いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載されるコンジュゲートポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、DNAワクチンは、DNAベクターまたはプラスミドとして調製される。いくつかの態様において、DNAワクチンは、例えば、外因性遺伝物質、例えば本明細書に記載される1つまたは複数の抗原をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを組み込むように親ウイルスを改変することによって、組換えウイルスとして調製される。本開示の目的のために使用することができる適切なウイルスの非限定的なリストには、レンチウイルス、（例えば、HIV、HIV-1、HIV-2、FIV、BIV、EIAV、MW、CAEV、SIV）、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、サイトメガロウイルス）、フラビウイルスおよびポックスウイルスが含まれる。適切なウイルスベクターの使用に関する方法および例については、例えば、米国特許第5,219,740号、同第7,250,299号、同第7,608,273号、同第6,465,634号、同第7,811,812号、同第5,744,140号、同第8,124,398号、同第5,173,414号、同第7,022,519号、同第7,125,705号、同第6,905,862号、同第7,989,425号、同第6,468,711号、同第7,015,024号、同第7,338,662号、同第5,871,742号および同第6,340,462号を参照されたい。そのような態様においては、ウイルスは典型的には組換えコンピテントである（すなわち、感染した宿主細胞中で複製することができる）。本発明のDNAワクチンを調製するためのこのようなウイルスおよびベクターまたはプラスミドの改変は、例えば、Sambrook et al.（1989）''Molecular Cloning:A Laboratory Manual''（2nd ed.Cold Spring Harbor Press）およびAusubel et al.（Eds.）（2000-2010）''Current Protocols in Molecular Biology''（John Wiley and Sons）に教示されているような、標準的な分子生物学技術を使用して達成することができる。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25もしくはSEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25もしくはSEQ ID NO:27と少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれを超える同一性を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26もしくはSEQ ID NO:28に示されるヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26もしくはSEQ ID NO:28と少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれを超える同一性を含むヌクレオチド配列を含む。
特定の態様において、DNAワクチンは、サイトメガロウイルス（CMV）ベクター、例えば、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられる2019年5月2日に出願された米国仮出願第62/842,419号に記載されているような自己開始CMV DNAベクター（SLCMV）を含む。自己開始CMVワクチンは、インビボでベクター化ワクチン複製を「開始」するCMVゲノムとして投与され、CMV感染に関連する特有の特徴を有する強い免疫応答をもたらす。SLCMVベクターは、（i）すべての年齢のヒトでの使用に安全であることが証明されているTowne HCMV株に基づいていること;（ii）CMVは重複感染およびCMVゲノムに対する独自の欠失が可能なために、CMV血清陽性および血清陰性個体において免疫応答を与えること;（iii）ワクチン抗原を「ペイント」する並外れた広さおよび強度のT細胞応答を提供すること;（iv）いずれの単一のエフェクター応答への依存もなく、またはいずれの単一のエフェクター応答の優位もなく、抗体、CD4＋T細胞、およびCD8＋T細胞を含むバランスのとれた応答を誘発する証明された能力を有し、エフェクター記憶表現型による応答性T細胞の粘膜表面への局在化を提供すること;（v）数週間～数ヶ月での新しいワクチン候補の操作を可能にすること;ならびに（vi）大腸菌中でのプラスミド産生に基づく単一の製造過程を提供すること、を含む多数の特徴のうちの1つまたは複数を含むことができる。
以下の実施例に示されるように、多数のメモリーCD4＋T細胞を誘発しないほとんどのワクチン型とは対照的に、本CMVベクター化ワクチンは誘発する。さらに、CMVベクター化ワクチンに応答するT細胞は、エフェクター部位の中でもとりわけ気道に局在し、例えば気管支肺胞洗浄によって回収することができる（12）。CMV応答性T細胞は、CXCR3発現、IFN-γ産生およびIL-10産生を含む、SARS-CoV-1に対して保護的であることが示されている細胞の他の必須の特徴を再現する（13）。
SLCMVベクターでは、ワクチン接種のためにそのDNA形態のCMVベクターを利用するには、インビボでリコンビナーゼまたはヌクレアーゼ発現なしでBAC骨格を切除することができるように、現在のCMV BAC構築物の変更が必要である。CMVは、単位長さのゲノムを正二十面体キャプシドにパッケージングする必要があるため、比較的厳しいパッケージング制約を有する。いくつかの態様において、CMV BACは、DNA構築物のBAC部分内に配置された内因性リコンビナーゼ遺伝子を利用する。哺乳動物細胞にトランスフェクションされると、リコンビナーゼは発現され、複製ゲノムからBAC複製機構を切除する。ヒトにおけるインビボ送達に適したBAC DNAベクターを作製するために、CMVゲノム末端は再編成されて、リコンビナーゼの発現を必要とせずにBACの切除を可能にする。特に、再構成されたBAC構築物は、CMV複製のパッケージング工程中に細菌の複製起点を除去するためにウイルスのターミナーゼ複合体を利用する。いくつかの態様において、BAC起点および複製機構の位置は、ウイルスの直列反復配列の間に位置する。
したがって、一態様において、本開示は、本明細書に記載される1つまたは複数の抗原（またはコンジュゲートポリペプチド）をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含み、（a）ヘルペスウイルス（HV）ゲノムまたはその実質的な部分と;（b）単細胞生物において機能する複製起点を含む配列と;（c）HVターミナーゼ複合体による切断を指示することができる、組換え的に導入されたポリヌクレオチド配列を含む1つまたは複数のターミナーゼ複合体認識座位（TCRL）であって、該HVゲノムまたはその一部は、該複製起点を含む配列からTCRLによって隔てられており;該HVゲノムまたはその一部は、少なくとも一方の端においてTCRLに接しており;該複製起点を含む配列は、少なくとも一方の端においてTCRLに接している、1つまたは複数のターミナーゼ複合体認識座位（TCRL）と;（d）プロモーターに機能的に連結された1つまたは複数の抗原をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドとを含む、自己開始HV（例えば、CMV）組換えポリヌクレオチドを提供する。一態様において、組換えポリヌクレオチドは、pp65bなどの後期プロモーターに機能的に連結された免疫原性コンジュゲート（例えば、豊富なT細胞表面タンパク質に特異的に結合するポリペプチドに融合した抗原）をコードするポリヌクレオチド、および/またはEF-1αなどの構成的プロモーターに機能的に連結された、抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、ゲノムまたはその一部などの、ベクター中の特定のゲノム領域または要素の「端」は、それを超えると異なる領域または要素（または核酸分子の端部）が存在する領域または要素のいずれかの端部を指す。例えば、環状ベクターでは、いくつかの態様において、HVゲノムの一方の端部（または端）は、第1のTCRL要素の第1の端部に直接隣接することができ、HVゲノムの他方の端部（または端）は、第2のTCRL要素の第1の端部に直接隣接することができる。同じ環状ベクターにおいて、起点を含有する領域の一方の端部（または端）は、第1のTCRL要素の第2の端部に直接隣接することができ、起点を含有する領域の他方の端部（または端）は、第2のTCRL要素の第2の端部に直接隣接することができる。いくつかの態様において、本明細書で使用されるCMVベクターは、ウイルスIL-10遺伝子を含まない。
ポリヌクレオチドは環状または直鎖であり得ること、およびさらなる要素が存在し得ること、例えば、HVゲノムまたはその実質的な部分と、BACまたはYAC複製起点を含む配列との間に存在し得ること（例えば、HVゲノムまたはその実質的な部分に隣接するTCRLと、単細胞生物において機能する（BACまたはYAC）複製起点との間に存在する遺伝子要素）が理解されよう。
抗原コード配列
本開示の組換えポリヌクレオチド、例えばウイルスベクターは、抗原、例えば本明細書に記載されるコンジュゲートポリペプチド、ならびに/または本明細書に記載されているような、スパイクタンパク質E、MもしくはNタンパク質もしくはこれらの組み合わせおよび/もしくは断片などのコロナウイルス抗原をコードする核酸配列を含む。様々なゲノムの研究における急速な進歩により、公知のヌクレオチド配列、例えば、抗原をコードする公知のヌクレオチド配列などと一定の割合の配列相同性を有する任意の遺伝子セグメントについてヒトまたは他のモデル生物のDNA配列データベースを検索することができるクローニングアプローチが可能になった。そのように同定された任意のDNA配列は、その後、化学合成および/またはオーバーラップ伸長法などのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術によって得ることができる。短い配列の場合、完全なデノボ合成が十分であり得るのに対して、より大きな遺伝子を得るために、合成プローブを使用してヒトまたは他のモデル生物のcDNAまたはゲノムライブラリから完全長コード配列をさらに単離することが必要であり得る。
あるいは、核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの標準的なクローニング技術を使用してcDNAまたはゲノムDNAライブラリ（例えば、ヒトもしくはげっ歯類のcDNAライブラアリまたはヒト、げっ歯類、細菌もしくはウイルスゲノムDNAライブラリ）から単離することができ、相同性をベースとしたプライマーは、しばしば公知の核酸配列に由来することができる。この目的のために一般的に使用される技術は、標準的なテキスト、例えば、前出のSambrookおよびRussellに記載されている。
cDNAライブラリは市販のものであり得、または構築することができる。mRNAを単離し、逆転写によってcDNAを作製し、cDNAを組換えベクターに連結し、増殖のために組換え宿主にトランスフェクションし、スクリーニングし、クローニングする一般的な方法は周知である（例えば、Gubler and Hoffman,Gene,25:263-269（1983）;Ausubel et al.,上記）。PCRによってヌクレオチド配列の増幅されたセグメントが得られたら、cDNAライブラリから関心対象のタンパク質をコードする完全長ポリヌクレオチド配列を単離するために、そのセグメントをプローブとしてさらに使用することができる。適切な手順の一般的な説明は、上記のSambrookおよびRussellに見出すことができる。
ヒトまたは他のモデル生物ゲノムライブラリから関心対象のタンパク質をコードする完全長配列を得るために、同様の手順に従うことができる。ゲノムライブラリは市販されているか、または当技術分野で認められた様々な方法に従って構築することができる。非限定的な例として、ゲノムライブラリを構築するために、まずDNAを生物の組織から抽出する。次いで、DNAを機械的に剪断するかまたは酵素的に消化して、長さ約12～20kbの断片を得る。その後、断片は、望ましくないサイズのポリヌクレオチド断片から勾配遠心分離によって分離され、バクテリオファージλベクター中に挿入される。これらのベクターおよびファージをインビトロでパッケージングする。Benton and Davis,Science,196:180-182（1977）に記載されているように、組換えファージをプラークハイブリダイゼーションによって分析する。コロニーハイブリダイゼーションは、Grunstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72:3961-3965（1975）によって記載されているように実施される。
特定の態様において、抗原（例えば、免疫原性コンジュゲートおよび/またはその他の抗原）をコードするポリヌクレオチドは、発現カセット内に存在する、すなわち、1つまたは複数のプロモーターに機能的に連結されている。誘導性および構成的プロモーターを含む、対象の1つまたは複数の細胞中でポリヌクレオチドの発現を駆動することができる任意のプロモーターを使用することができる。いくつかの態様において、CMVプロモーターが使用される。特定の態様においては、免疫原性コンジュゲートの発現を駆動するために、pp65bなどの後期ウイルスプロモーターが使用される。特定の態様において、本明細書に記載される第2の抗原の発現を駆動するために、EF1-アルファなどの構成的哺乳動物プロモーターが使用される。いくつかの態様において、EF1-αプロモーターは、EF1-α遺伝子の第1イントロンを含む。ベクターは、他の調節配列、例えばターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域などを含むことができる。このような要素の使用は当技術分野で周知である。
いくつかの態様において、本開示の組換えポリヌクレオチドは、選択可能なマーカーをコードする核酸配列を含有する。選択可能なマーカーは、例えば、本明細書中に記載されるようなポリヌクレオチドが組換えで修飾されている場合、特に、所望の修飾を組み込んだポリヌクレオチドについて、（例えば、細菌、酵母、植物または動物の細胞を使用して）修飾されたポリヌクレオチドの集団をスクリーニングすることが望ましい場合に有用である。ポリヌクレオチドが細胞（例えば、細菌細胞、例えば、Red/ET組換えを使用）内で組換えで修飾されるか、または組換えで修飾され、その後スクリーニングのために細胞（例えば、細菌、酵母、植物または動物細胞）中に導入されるかにかかわらず、いずれの細胞が関心対象の修飾を組み込んだポリヌクレオチドを含有するかを同定するために、選択可能なマーカーを使用することができる。抗生物質耐性遺伝子を選択可能なマーカーの例として挙げると、組換えポリヌクレオチドを含有する細胞を抗生物質で処理することにより、いずれの細胞が抗生物質耐性遺伝子を組み込んだ組換えポリヌクレオチドを含有するかが特定される（すなわち、抗生物質処理後に生存する細胞は、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでいるはずである）。所望であれば、所望の修飾が正しい位置でポリヌクレオチド中に組換え的に導入されたことを確認するために、組換えポリヌクレオチドをさらにスクリーニングする（例えば、細胞から精製し、増幅し、配列決定する）ことができる。
選択可能なマーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、遺伝子は、クロラムフェニコール、Zeocin、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、または当業者に公知の別の適切な抗生物質に対する耐性を付与することができる。いくつかの態様において、生物または生物の集団の色などの可視的な表現型をもたらす選択可能なマーカーが使用される。非限定的な例として、表現型は、表現型をもたらす条件下で生物（例えば、組換えポリヌクレオチドを含有する細胞または他の生物）および/またはそれらの子孫を成長させることによって検査することができ、表現型は通常の成長条件下では可視的でないことがあり得る。
いくつかの態様において、関心対象の修飾を含有するポリヌクレオチドを含有する細胞を同定するために使用される選択可能なマーカーは、蛍光タグが付加されたタンパク質、化学染色剤、化学指示薬またはこれらの組み合わせである。他の態様において、選択可能なマーカーは、刺激、生化学的物質または環境条件の変化に応答する。いくつかの例では、選択可能なマーカーは、代謝産物、タンパク質産物、薬物、関心対象の細胞表現型、関心対象の細胞産物またはこれらの組み合わせの濃度に応答する。
組換えポリヌクレオチドのサイズは、コードされている特定の抗原および他のタンパク質、調節配列および/または発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）の存在および選択、TCRLなどの異なる要素の選択および位置などに依存する。さらに、組換えポリヌクレオチドのサイズは、抗原および他のタンパク質をコードする核酸配列が同じ組換えポリヌクレオチド内または別個の組換えポリヌクレオチド内に存在するかどうかに依存する。
いくつかの態様において、組換えポリヌクレオチドは、約1キロベース～約300キロベース（例えば、約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7.1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、または300キロベース）の長さである。いくつかの態様において、組換えポリヌクレオチドは約300キロベースの長さを超える。
いくつかの態様において、本開示の系中に存在する組換えポリヌクレオチドは、約1キロベース～約300キロベース、約1キロベース～約250キロベース、約1キロベース～約200キロベース、約1キロベース～約150キロベース、約1キロベース～約100キロベース、約1キロベース～約50キロベース、約1キロベース～約40キロベース、約1キロベース～約30キロベース、約1キロベース～約20キロベース、約1キロベース～約10キロベース、約50キロベース～約300キロベース、約50キロベース～約250キロベース、約50キロベース～約200キロベース、約50キロベース～約150キロベース、約50キロベース～約100キロベース、約100キロベース～約300キロベース、約100キロベース～約250キロベース、約100キロベース～約200キロベース、約100キロベース～約150キロベース、約150キロベース～約300キロベース、約150キロベース～約250キロベース、約150キロベース～約200キロベース、約200キロベース～約300キロベースまたは約200キロベース～約250キロベースの長さである。
一般的な組換え技術
例えば、組換えベクターまたはプラスミドの調製、維持および培養のための、組換え遺伝学の分野における一般的な方法および技術を開示する基本的なテキストとしては、Sambrook and Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual（3rd ed.2001）;Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual（1990）;およびAusubel et al.,eds.,Current Protocols in Molecular Biology（1994）が挙げられる。
核酸の場合、サイズはキロベース（kb）または塩基対（bp）のいずれかで与えられる。いくつかの例では、これらは、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸、または公開されたDNA配列から得られた推定値である。タンパク質の場合、サイズはキロダルトン（kDa）またはアミノ酸残基数で与えられる。いくつかの例では、タンパク質サイズは、ゲル電気泳動、配列決定されたタンパク質、得られるアミノ酸配列、または公開されたタンパク質配列から推定される。
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Van Devanter et al.,Nucleic Acids Res.12:6159-6168（1984）に記載されている自動合成器を使用して、Beaucage＆Caruthers,Tetrahedron Lett.22:1859-1862（1981）によって最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、任意の当技術分野で認められた戦略、例えば、未変性アクリルアミドゲル電気泳動またはPearson＆Reanier,J.Chrom.255:137-149（1983）に記載されているような陰イオン交換HPLCを使用して行われる。
関心対象のタンパク質ドメインまたは遺伝子の配列は、例えば、Wallace et al.,Gene 16:21-26（1981）の二本鎖鋳型を配列決定するための連鎖停止法を使用して、クローニングまたはサブクローニング後に確認することができる。
配列相同性に基づいて、縮重オリゴヌクレオチドをプライマーセットとして設計することができ、cDNAまたはゲノムライブラリからヌクレオチド配列のセグメントを増幅するために、PCRを適切な条件下で実施することができる（例えば、White et al.,PCR Protocols:Current Methods and Applications,1993;Griffin and Griffin,PCR Technology,CRC Press Inc.1994参照）。増幅されたセグメントをプローブとして使用して、関心対象のタンパク質をコードする完全長核酸が得られる。
関心対象のタンパク質をコードする核酸配列を取得したら、野生型タンパク質に由来する変異体および変異型を含む、コード配列を生成するために、コード配列は、制限エンドヌクレアーゼ消化、PCRおよびPCR関連方法などの多数の周知の技術によってさらに修飾することができる。次いで、得られた構築物から組換えポリペプチドが産生され得るように、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をベクター、例えば発現ベクター中にサブクローニングすることができる。ポリペプチドの特徴を変化させるために、コード配列へのさらなる修飾、例えばヌクレオチド置換が、その後、行われ得る。
当技術分野では様々な変異生成プロトコルが確立され、記載されており、関心対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を修飾するために容易に使用することができる。例えば、Zhang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4504-4509（1997）;およびStemmer,Nature,370:389-391（1994）を参照されたい。手順は、核酸のセットの変異型、したがってコードされたポリペプチドの変異型を生成するために別々にまたは組み合わせて使用することができる。突然変異誘発、ライブラリ構築および他の多様性生成方法のためのキットが市販されている。
多様性を生じさせる突然変異法としては、例えば、部位特異的突然変異誘発（Botstein and Shortle,Science,229:1193-1201（1985））、ウラシル含有鋳型を用いた突然変異誘発（Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488-492（1985））、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発（Zoller and Smith,Nucl.Acids Res.,10:6487-6500（1982））、ホスホロチオエート修飾DNA突然変異誘発（Taylor et al.,Nucl.Acids Res.,13:8749-8787（1985））、およびギャップを導入した二重鎖DNAを用いた突然変異誘発（Kramer et al.,Nucl.Acids Res.,12:9441-9456（1984））が挙げられる。
変異を生成するための他の可能な方法としては、点ミスマッチ修復（Kramer et al.,Cell,38:879-887（1984））、修復欠損宿主株を使用した変異誘発（Carter et al.,Nucl.Acids Res.,13:4431-4443（1985））、欠失変異誘発（Eghtedarzadeh and Henikoff,Nucl.Acids Res.,14:5115（1986））、制限選択および制限精製（Wells et al.,Phil.Trans.R.Soc.Lond.A,317:415-423（1986））、全遺伝子合成による変異誘発（Nambiar et al.,Science,223:1299-1301（1984））、二本鎖切断修復（Mandecki,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181（1986））、ポリヌクレオチド鎖終結法による変異誘発（米国特許第5,965,408号）、およびエラープローンPCR（Leung et al.,Biotechniques,1:11-15（1989））が挙げられる。
コドン最適化
いくつかの態様において、関心対象のタンパク質（例えば、抗原またはその他のタンパク質）をコードする核酸配列は、コドン最適化されている。「コドン最適化」という用語は、コードされたアミノ酸配列を変更することなく、コドンバイアス（すなわち、種間で異なり得る特定のコドンの優先的使用）が低減されるかまたはバランスを取り直すように核酸配列を変更することを指す。いくつかの態様において、コドン最適化は、（例えば、抗原またはその他のタンパク質の）翻訳効率を増加させる。非限定的な例として、ロイシンは6つの異なるコドンによってコードされ、そのうちのいくつかは稀にしか使用されない。（例えば、読み枠内の）コドン使用のバランスを取り直すことによって、稀にしか使用されないコドンより、好ましいロイシンコドンが選択され得る。関心対象のタンパク質（例えば、抗原またはその他のタンパク質）をコードする核酸配列は、稀にしか使用されないコドンが好ましいコドンに変換されるように変更される。
稀少コドンは、例えば、宿主種、すなわちタンパク質（例えば、抗原）がその中において発現される種の配列決定されたゲノムに由来するコドン使用頻度表を使用することによって定義することができる。例えば、15％のカットオフ閾値でDNA2.0（www.dna20.com/）からのソフトウェア、例えば「Gene Designer 2.0」ソフトウェアと併せて使用される、Kazusa DNA Research Institute、Japan（www.kazusa.or.jp/codon/）から入手したコドン使用頻度表を参照のこと。
コドン最適化はまた、例えば、mRNA安定性を増加させるために、もしくは二次構造を減少させるために、GC含有量を調節するために使用され得、またはそうでなければ、関心対象のタンパク質（例えば、抗原またはその他のタンパク質）の発現を損なう配列の区間をもたらし得るコドンを最小化する。
4. 製剤化およびワクチン接種方法
対象
本方法および組成物は、感染、例えばSARS-CoV-2などのコロナウイルスによる感染に対する免疫応答の増強から利益を得ることができる任意の対象、例えばヒトまたは他の哺乳動物のワクチン接種のために使用することができる。いくつかの態様において、対象は男性/雄である。いくつかの態様において、対象は女性/雌である。いくつかの態様において、対象は成人/成体（例えば、成人男性/成体雄）である。いくつかの態様において、対象は青年である。いくつかの態様において、対象は子供である。いくつかの態様において、対象は、60、70または80歳を超える。
いくつかの態様において、対象は、病原体、例えばSARS-CoV-2に感染したことがなく、本方法および組成物は、将来の感染を防ぐために、病原体に対する対象の免疫防御を増強するために使用される。他の態様において、対象は既に病原体に感染しており、本方法は、元の感染を遅らせるかまたは潜在的に逆転させるために、病原体に対する対象の免疫応答を増強するために使用される。
薬学的組成物
本開示は、標的化剤（例えば、抗原または抗原を含む免疫原性コンジュゲート）に対する免疫を誘導することができる免疫原性成分（例えば、DNAワクチンまたは1つもしくは複数の免疫原性ポリペプチド）と、薬学的に許容され得る担体とを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、ワクチンは、1つまたは複数のアジュバントまたは化合物をさらに含む。したがって、本開示は、対象において免疫応答を誘導するための薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、1つまたは複数のタンパク質、例えばコロナウイルス抗原および/または免疫原性コンジュゲートをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドと、薬学的に許容され得る担体とを含む。いくつかの態様において、組成物は、1つまたは複数のポリペプチド抗原、例えば本明細書に記載される免疫原性コンジュゲート、および/または例えばスパイクタンパク質、E、MもしくはNタンパク質、その断片、またはこれらの組み合わせを含むコロナウイルス抗原と、薬学的に許容され得る担体とを含む。いくつかの態様において、組成物は、アジュバントをさらに含む。
組成物は、例えば、免疫原性成分への宿主細胞および組織の直接曝露を促進する、例えば、注射、吸入または局所投与用に製剤化され得る。いくつかの態様において、組成物、例えばDNAワクチンは、皮下注射用に製剤化される。いくつかの態様において、組成物、例えばDNAワクチンは、裸のDNAとして製剤化される（例えば、米国特許第6,265,387号、同第6,972,013号および同第7,922,709号を参照）。
特定の態様において、DNAワクチンは、DNAベクターまたはプラスミドとして調製される。いくつかの態様において、組成物、例えばDNAワクチンは、例えば、外因性遺伝物質、例えば本明細書に記載される1つまたは複数の抗原をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを組み込むように親ウイルスを改変することによって、組換えウイルスとして調製される。いくつかの態様において、ウイルスは、CMV、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）などのヘルペスウイルスである。自己開始CMV（SLCMV）ベクターは、例えば、ベクターを含む大腸菌を培養し、培養した細菌細胞を溶解し、エンドトキシンが存在しないかまたは発熱原性閾値（例えば、5エンドトキシン単位/kg体重）を下回ることを確実にしながらベクターを精製し、投与のためにベクターを製剤化することによって調製することができる。いくつかの態様において、本抗原をコードするタンパク質は、標準的な分子生物学技術を使用してインビトロで産生され、本明細書に記載されるワクチン製剤より前に精製される。
いくつかの態様において、核酸ワクチンは、例えばインビボでの分解から核酸を保護し、細胞への核酸の送達を容易にすることができる1つまたは複数の試薬を含むインビボトランスフェクション剤とともに製剤化される。このような作用物質の適切な例としては、限定されないが、in vivo-jet PEI（商標）（Polyplus）、TurboFect（商標）（Thermo Scientific）、LIPID（商標）（Altogen Biosystems）、GenJet（商標）PlusまたはPepJet（商標）Plus（SignaGen）、DogtorMag（商標）（OZ Biosciences）、Avalanche（商標）（EZ Biosystems）などが挙げられ、製造業者の指示に従って使用することができる。
本開示の薬学的組成物は、薬学的に許容され得る担体を含み得る。ある特定の局面において、薬学的に許容され得る担体は、投与される特定の組成物の他、組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、本方法および組成物における使用に適した薬学的組成物の多種多様な製剤が存在する（例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18TH ED.,Mack Publishing Co.,Easton,PA（1990）を参照）。
薬学的組成物は、多くの場合、1つまたは複数の緩衝剤（例えば、中性緩衝食塩水またはリン酸緩衝食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソールなど）、静菌剤、キレート剤、例えばEDTAまたはグルタチオン、製剤をレシピエントの血液と等張性、低張性または弱高張性にする溶質、懸濁化剤、増粘剤、防腐剤、香味剤、甘味剤および着色化合物を適宜さらに含む。
薬学的組成物は、投与製剤と適合する様式で、および治療的または予防的に有効であるような量で投与される。投与されるべき量は、例えば、個体の年齢、体重、身体活動、遺伝的特徴、全般的な健康状態、性別および食事、処置または予防されるべき症状または疾患、ならびに症状または疾患の病期または重症度を含む様々な因子に依存する。ある特定の態様において、用量のサイズはまた、特定の個体における治療剤または予防剤の投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質および程度によって決定され得る。任意の特定の患者に対する特定の用量レベルおよび投与の頻度に影響を及ぼし得る他の因子としては、使用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、投与の様式および時間、ならびに排泄速度が挙げられる。
いくつかの態様において、ワクチンは、アジュバント、すなわち抗原に対する免疫応答を増強するために抗原と併せて対象に投与される化合物を含む。アジュバントは、多くの態様のいずれかでワクチンの免疫原性を増加させることができ、塩、例えばアルミニウム塩などの無機化合物、ならびに抽出物および調製物、例えばフロイントの不完全アジュバント、スクアレン、MF59、モノホスホリルリピドA、QS-21を含む有機化合物および化合物の混合物を含むことができる。
一般に、治療または予防（例えばワクチン接種）目的で化合物（例えば、ワクチンまたはアジュバント）を投与するために、化合物は治療的または予防的に有効な用量で与えられる。特に、薬学的組成物の有効量は、例えば本明細書に記載されるパラメータもしくは指標のいずれかを考慮して、抗原もしくは抗原が由来する病原体に対する増強された免疫応答を得るのに十分な量、および/または病原体からの感染に対する、もしくは対象における既に存在する感染症の伝播に対する対象の免疫を増強するのに十分な量である。
ある特定の態様において、用量は、好ましくは正確な投与量の単純な投与に適した単位剤形での、例えば、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、停留浣腸剤、クリーム剤、軟膏、ローション剤、ゲル剤、エアロゾル剤、泡剤などの固体、半固体、凍結乾燥粉末または液体剤形の形態をとり得る。
本明細書で使用される場合、「単位剤形」という用語は、ヒトおよび他の哺乳動物用の単位投与量として適した物理的に分離した単位（例えば、アンプル）を指し、各単位は、適切な薬学的賦形剤と組み合わせて、所望の発症、耐容性および/または治療効果もしくは予防効果をもたらすように計算された所定量の治療剤または予防剤を含有する。さらに、その後そこからより希釈された単位剤形が製造され得るより濃縮された剤形が調製され得る。したがって、より濃縮された剤形は、治療的または予防的化合物の量を実質的に上回る、例えば、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍またはそれを超える量を含有する。
そのような剤形を調製するための方法は、当業者に公知である（例えば、上記のREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCESを参照）。剤形は、典型的には、従来の薬学的担体または賦形剤を含み、他の医薬品、担体、アジュバント、希釈剤、組織透過促進剤、可溶化剤などをさらに含み得る。適切な賦形剤は、当技術分野で周知の方法によって特定の剤形および投与経路に合わせることができる（例えば、上記のREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCESを参照）。
投与
いくつかの態様において、予防および/または処置は、本明細書に記載される組成物を対象に直接投与する工程を含む。非限定的な例として、（例えば、本明細書に記載されるワクチンおよび薬学的に許容され得る担体を含む）薬学的組成物を（例えば、局所注射または全身投与によって）対象に直接送達することができる。
本開示の組成物は、単回用量として、または複数回用量、例えば約1ヶ月、約2ヶ月、約3ヶ月、約6ヶ月または約12ヶ月の間隔で投与される2回用量として投与され得る。他の適切な投与スケジュールは、医療従事者によって決定することができる。
いくつかの態様において、さらなる化合物または薬物を対象に同時投与することができる。このような化合物または薬物は、処置されている疾患の徴候または症候を緩和し、免疫応答の誘導によって引き起こされる副作用を軽減するなどの目的で同時投与することができる。
本薬学的組成物は、対象に局所的または全身的に、例えば、腹腔内、筋肉内、動脈内、経口、静脈内、頭蓋内、髄腔内、髄腔内、病巣内、鼻腔内、皮下、脳室内、局所的に、および/または吸入によって投与することができる。特定の態様において、組成物は、電気穿孔（例えば、初回刺激DNAワクチンの場合）または皮下（例えば、追加免疫の場合）によって投与される。
本ワクチンは、任意の回数、例えば1、2、3、4、5回またはそれより多くの回数、および任意の数のワクチン接種レジメンの後、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週またはそれより多くの週ごとに投与することができる。特定の態様において、ワクチンは、例えば、本明細書に記載されるコンジュゲートポリペプチドをコードするプラスミドを用いてDNA初回刺激として投与され、続いて、例えば約4週間後に、例えば抗原をコードするアデノウイルスベクターを用いた追加免疫が行われる。DNAワクチンは、多数のレベルのいずれか、例えば、ワクチン接種あたり対象あたり4mgのプラスミドDNAベクター、またはワクチン接種あたり対象あたり1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mgもしくはそれを超えるプラスミドDNAベクター、またはワクチン接種あたり対象あたり1～10、1～20、1～8、1～7、2～6、3～5mgのプラスミドDNAベクターで投与することができる。
免疫応答の評価
本開示のワクチンを受けている対象の免疫応答は、多数の様式のいずれでも検出、特性評価または定量することができる。例えば、対象の細胞における本開示のポリヌクレオチドの存在を検出するために、本ワクチンに特異的な抗体もしくはT細胞を検出および特性評価するために、または病原体による感染に対してワクチンによって与えられる保護を評価するために、実施例のいずれかに記載されるアッセイのいずれをも使用することができる。いくつかの態様において、特に核酸ベクターが本抗原を送達するために使用される態様において、ベクター配列の存在およびレベルは、例えば、例えば対象からの血液または唾液試料からのqPCRを使用して配列を測定することによって評価することができる。核酸のレベルはまた、例えば生検からまたは粘膜組織の洗浄によって得られるような、対象の異なる組織から検出することもできる。
いくつかの態様において、対象の免疫応答は、免疫表現型解析によって、例えばT細胞メモリーエフェクターサブセット、適応特性を有するNK細胞（例えば、FcεRIylow「メモリー」NK細胞）、自然特性を有するT細胞（例えば、NKG2A＋細胞）、または抗原提示細胞（例えば、CD80/83/86を発現する単球）を評価することによって評価される。そのような細胞は、例えば、実施例に記載されるようなフローサイトメトリを使用して評価することができる。
対象の免疫応答はまた、対象からの抗原特異的T細胞応答を特性評価することによって評価することができる。例えば、実施例に記載されているように、任意でVL9ペプチドまたは抗HLA抗体などの阻害剤と組み合わせて、ワクチン由来の1つまたは複数の抗原で、PBMCまたはLNMC細胞を刺激することができる。適切な時間、例えば、16時間後、細胞は、例えば、CD3、CD4、CD8、CCR7、CD95、IL-2、IL-17、IFN-γおよび/またはTNF-αに対する抗体を用いて評価することができる。サイトカインを分泌するCD4＋および/またはCD8＋細胞は、例えばフローサイトメトリを使用して評価することができる。
いくつかの態様において、対象から得られた抗体は、例えばELISAを使用して抗原への結合を検出することによって評価することができる。いくつかの態様において、中和抗体または促進抗体が、RVP（レポーターウイルス粒子）アッセイを使用して試験される。特定の態様において、本ワクチンは、強い中和抗体応答および低いまたは存在しない増強応答を誘発する。いくつかの態様において、例えば、ワクチン接種戦略がモデル動物で試験される場合、実施例に記載されているように、病原体を使用する抗原刺激アッセイを使用することができる。
本明細書に記載されるワクチンの有効性を評価するために、実施例または本明細書の他の箇所に記載されているパラメータまたは効果のいずれをも（例えば、中和抗体産生、特異的T細胞応答、病原体に対する保護など）使用することができる。いくつかの態様において、本開示のワクチンは、対照値（例えば、本開示のワクチンを受けていない対象において観察される値）と比較して、本明細書に記載される任意のパラメータまたは効果の少なくとも約20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％またはそれを超える増加をもたらす。いくつかの態様において、本明細書に記載されるワクチンは、対象において抗体依存性感染増強（ADEI）を実質的に誘導しない。いくつかの態様において、ワクチンは、対象において誘導される任意のADEIよりも実質的に大きい中和抗体応答を対象において誘導する。
本組成物および/または方法を使用して、任意の数の疾患を予防および/または処置することができる。いくつかの態様において、感染性疾患が予防および/または処置される。いくつかの態様において、細菌感染性疾患が予防および/または処置される。いくつかの態様において、ウイルス感染性疾患が予防および/または処置される。いくつかの態様において、真菌感染性疾患が予防および/または処置される。いくつかの態様において、原虫感染性疾患が予防および/または処置される。いくつかの態様において、蠕虫感染性疾患が予防および/または処置される。いくつかの態様において、癌が予防および/または処置される。いくつかの態様において、細菌感染性疾患、ウイルス感染性疾患、真菌感染性疾患、原虫感染性疾患および/または蠕虫感染性疾患が予防および/または処置される。いくつかの態様において、コロナウイルス感染性疾患が予防および/または処置される。いくつかの態様において、COVID-19（すなわち、SARS-CoV-2感染によって引き起こされる疾患）が予防または処置される。
5. キット
別の局面において、キットが本明細書で提供される。いくつかの態様において、キットは、本開示のワクチン（例えば、本免疫原性コンジュゲートもしくは抗原の1つもしくは複数を含むか、または本開示の1つもしくは複数の抗原もしくは免疫原性コンジュゲートをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、任意で薬学的に許容され得る担体を含んでもよいワクチン）を含む。いくつかの態様において、キットはアジュバントを含む。いくつかの態様において、キットは、抗原、例えばコロナウイルススパイク、E、MもしくはNタンパク質、その断片、またはこれらの組み合わせに対する免疫応答を誘導するためのものである。他の態様において、キットは、疾患、例えばCOVID-19を予防または処置するためのものである。いくつかの態様において、キットは、1つまたは複数の抗原に対するB細胞（すなわち、抗体）応答を誘導するためのものである。いくつかの態様において、キットは、1つまたは複数の抗原に対するT細胞応答を誘導するためのものである。いくつかの態様において、キットは、1つの抗原（例えば、本明細書に記載される免疫原性コンジュゲート中に存在する抗原）に対するB細胞応答および第2の抗原（例えば、本明細書に記載される第2の抗原）に対するT細胞応答を誘導するためのものである。
本開示のキットは、（例えば、箱または蓋を有する他の容器内での）安全なまたは便利な保存または使用を可能にする様式で包装することができる。典型的には、本キットは1つまたは複数の容器を含み、各容器は試薬、対照試料などの特定のキット成分を保存する。容器の選択は、その内容物の特定の形態、例えば、液体形態、粉末形態などであるキット構成要素に依存する。さらに、容器は、キット構成要素の貯蔵寿命を最大化するように設計された材料で作製することができる。非限定的な例として、感光性のキット構成要素は、不透明な容器中に保存することができる。
いくつかの態様において、キットは、組成物（すなわち、本明細書に記載される薬学的組成物）を対象に投与するのに有用な1つまたは複数の要素、例えばシリンジを含有する。さらに他の態様において、キットは、例えば、本方法を実施するための指示（すなわち、プロトコル）を含む使用説明書（例えば、SARS-CoV-2などの病原体由来の抗原に対する対象における免疫応答を増強するためのキットを使用するための説明書）をさらに含む。説明資料は、典型的には、書面の資料または印刷された資料を含むが、これらに限定されない。このような説明書を保存し、このような説明書をエンドユーザに伝達することができる任意の媒体が、本開示によって企図される。このような媒体には、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、CD-ROM）などが含まれるが、これらに限定されない。このような媒体は、このような説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含み得る。
6. 実施例
具体例を挙げて、本開示をより詳細に説明する。以下の実施例は、例示のみを目的として提供されており、決して本開示を限定することを意図するものではない。当業者は、本質的に同じ結果をもたらすように変更または修正することができる様々な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。
実施例1. 抗CD3一本鎖可変断片に連結されたSARS-CoV-2 S1ドメインを含むコンジュゲートポリペプチドワクチン
本実施例は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質「S1」ドメインに反応性の表面受容体を有するB細胞および豊富なT細胞表面タンパク質CD3を有するT細胞の両方に結合することができるコンジュゲートポリペプチドを提供する。以下に記載されるものなどの抗SARS-CoV-2ワクチンレジメン中に含まれる場合、このコンジュゲートポリペプチドは、COVID-19に対する保護に寄与することができるS1ドメインに対する抗体応答を誘発する。
SARS-CoV-2は、受容体結合（S1）および膜融合（S2）領域を有するスパイクタンパク質（S）の活性を通じて細胞に入る。SARS-CoV-2スパイクは、融合ドメイン内の特徴的な7アミノ酸繰り返しの存在を含む、従来のクラスI融合タンパク質の多くの特徴を示す。S1ドメインに対する抗体は、スパイクタンパク質とその受容体であるACE2タンパク質との相互作用を遮断することによって、SARS-CoV-2による感染を阻止することができる。CD3は、T細胞受容体（TCR）と会合し、TCRからT細胞の内部への活性化シグナルの伝達において重要な役割を果たす4つのポリペプチド鎖（イプシロン、ガンマ、デルタおよびゼータ）から構成される多量体タンパク質複合体である。
以下のタンパク質要素:（細胞からのコンジュゲートポリペプチドの分泌を可能にするための）組織プラスミノーゲン活性化因子シグナル配列、マウス抗CD3抗体由来の抗CD3scFv、SP34（例えば、米国特許出願公開第2016/0068605号参照）;柔軟なリンカー;およびSARS-CoV-2 S1（コドン最適化された）に対するコード配列を融合することによって、本発明者らは、SARS-CoV-2スパイクのS1領域とCD3結合ポリペプチドとを含むコンジュゲートポリペプチド（例えば、図5参照）を作製した。得られたアミノ酸配列をSEQ ID NO.1として示す。このポリペプチドに対するコドン最適化された核酸配列（SEQ ID NO.2）を合成し、（その第1のイントロンを含む）EF1-αプロモーター配列の下流およびSV40ポリアデニル化配列の上流に、pUC19プラスミド中にクローニングした。
このコンジュゲートポリペプチドのCD3結合機能を試験するために、得られたプラスミドをリン酸カルシウム沈殿によって293細胞中にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞からの上清を組織培養プレートに適用して、分泌されたタンパク質をプレートの表面に結合させ、TCRに結合した場合にT細胞に活性化シグナルを送るはずであるこのような分泌されたタンパク質の固定化されたアレイを得た。本発明者らは、アカゲザル由来のT細胞をコーティングされたウェルまたは対照ウェルに適用した。蛍光抗体での染色およびフローサイトメータでのデータ収集により、固定されたコンジュゲートポリペプチドがT細胞を活性化し、細胞表面上のCD69上方制御および細胞内でのインターフェロン-ガンマ産生の両方をもたらすことが明らかになった（図1）。この結果により、T細胞表面上のCD3分子へのコンジュゲートポリペプチドの結合が確認された。
実施例2. SARS-CoV-2ワクチン候補の提供
本実施例は、（i）抗体依存性感染増強のリスクを最小限に抑えるために、T細胞および抗体応答を同時に誘発し;（ii）マカクにおいて有効であることが証明されているSARS-CoV-2ワクチン候補を提供し、（ii）は、ヒトにおける将来の第I相試験の準備ができている。このワクチンプラットフォームは、迅速な開発（DNA投与）と（CMVベクターによる）広範で堅牢なT細胞応答およびスパイクS1ドメインに対する中和抗体応答を兼ね備える。
これまで未知であった病原体に対する伝統的なワクチン開発には何年もかかるが、ヒトの健康を保全するには、数ヶ月規模でのより迅速な対応が必要となり得る（1）。しかしながら、新たに発生した病原体に対する適切な動物モデルの欠如;最適に満たない抗体応答が誘導されるときは常に起こり得る抗体依存性感染増強（ADEI）の危険（2）;サブユニットワクチン、弱毒化ワクチンまたはベクター化ワクチンのための新しい製造過程を開発することの困難さによって、迅速な開発は困難である。
自己開始CMV DNAプラットフォーム（SLCMV）は、これらの困難な問題を軽減または排除し、SARS-CoV-2によって脅かされている粘膜表面に局在化される並外れた広さおよび強さの免疫応答を誘発する新しいワクチンの迅速な開発を可能にする。ワクチンは、インビボでベクター化ワクチン複製を「開始」するサイトメガロウイルスゲノムとして投与され、CMV感染に関連する特有の特徴を有する強い免疫応答をもたらす。SLCMVの特徴としては、（i）すべての年齢のヒトでの使用に安全であることが証明されているTowne HCMV株に基づいていること;（ii）CMVは重複感染およびCMVゲノムに対する独自の欠失が可能なことによる、CMV血清陽性および血清陰性個体における免疫応答;（iii）ワクチン抗原を「ペイント」する並外れた広さおよび強度のT細胞応答;（iv）いずれの単一のエフェクター応答への依存もなく、またはいずれの単一のエフェクター応答の優位もなく、抗体、CD4＋T細胞、およびCD8＋T細胞を含むバランスのとれた応答を誘発する証明された能力、（v）エフェクターメモリー表現型による応答性T細胞の粘膜表面への局在化;（vi）数週間～数ヶ月での新しいワクチン候補の操作;ならびに（vii）大腸菌中でのプラスミド産生に基づく単一の製造過程が挙げられる。
開発中のほとんどのコロナウイルスワクチンは、抗体を誘発するように設計されている。このようなワクチン戦略は、特に抗体レベルが低い場合（2）、可能性のある抗体依存性感染増強（ADEI）のために注意して行わなければならない。SARS-CoV-1に対する高濃度の抗血清はウイルスを中和することが示されたのに対して、希釈された抗体はヒト前単球細胞培養物においてADEIを引き起こした。他方、T細胞応答は、高度に保存された内部タンパク質を標的とすることが多く、長く持続する。実際に、気道メモリーCD4＋T細胞は、SARS-CoV-1およびMERS-CoVに対する防御免疫を媒介することが示された。本発明者らは、SARS-CoV-2に対する自己開始CMV DNAワクチンが、粘膜表面に局在化される広範かつ防御的な適応免疫を提供することができると仮定する。
第1部: T細胞または抗体応答を誘発するように設計された自己開始CMV/SARS-CoV-2ワクチンに対するアカゲザルでの免疫応答を特性評価する。
構成的プロモーターによって駆動されるCMVベクター化ワクチン中の導入遺伝子は、堅牢なT細胞応答を誘発するが、付随する抗体応答はほとんどまたは全く誘発せず、pp65bなどの強力な後期プロモーターから発現される導入遺伝子は、堅牢な抗体応答および弱いT細胞応答を誘発する。これらの戦略を使用して、本発明者らは、SARS-CoV-2 E、MおよびNタンパク質に対する優位なT細胞応答およびスパイクS1ドメインに対する強力な中和抗体応答を誘発するように設計された候補SLCMV DNAワクチンを作製した。後者の候補は、修飾されていないか、または支援を提供することができるT細胞に抗S1抗体を産生するB細胞を物理的に連結する抗CD3scFvに連結されたスパイクS1ドメインを発現する。適応免疫応答は、全身的におよび粘膜表面において経時的に追跡される。中和抗体の産生と促進抗体の産生の比較は、レポーターウイルス粒子（RVP）アッセイを使用してモニターされる。
第2部: アカゲザルにおけるSARS-CoV-2のDavis分離株に対するSLCMV/SARS-CoV-2ワクチンの保護効果を評価する。
患者から単離されたSARS-CoV-2を増殖させ、特性評価し、サルにおいてウイルスの病態形成を評価する。本発明者らは、ワクチン接種された動物をSARS-CoV-2により抗原刺激することによって、第1部で作製されたT細胞およびB細胞ワクチンの保護効果を試験する。TおよびB細胞ワクチンを別々にまたは一緒に試験して、保護対疾患増強に対する適応免疫系の各アームの相対的寄与を試験する。
第3部: マカクにおける自己開始ヒトCMVベクター化ワクチンの試験安全性および潜在的有効性。
ヒトCMV（HCMV）ベクター化ワクチンがマカクにおいて強いエフェクター-メモリーT細胞応答を誘発することが最近示された。したがって、本発明者らは、将来のヒト臨床試験の候補としてHCMVベクター化ワクチンを作製し、生産のためにGMP過程を開発し、マカクにおける有効性についてSLHCMVレジメンを試験する。このインビボ実験のために使用されるHCMVベクター化ワクチンは、第2部のSLRhCMVを使用した保護研究の結果に基づいて選択される。
意義
新たに発生した感染症の脅威に対する迅速なワクチン開発は満たされていない要望である:以前には未知であった病原体に対する伝統的なワクチン開発は、容易には解決されない基本的な生物学的問題によって遅延する。最も重要なことには、高力価中和抗体（nAb）の誘導は明白なアプローチであるように見えるが、nAbのどの力価が実際に保護的であるかは不明であり、この閾値が年齢の両極および併存症にわたってどのように変化するかも不明である。いずれの新興の病原体についても、高齢者および若年者において特に可能性が高い不十分な抗体応答が、抗体依存性感染増強（ADEI）をもたらし得るかどうかは不明である。
SARS-CoV-2に対するワクチン接種成功の免疫的相関要因はあまり明らかにされていない:現在開発中のほとんどのコロナウイルスワクチンは、スパイク糖タンパク質の最も可変な部分を標的とし、ワクチン中に存在するウイルスに対してのみ抗体応答を誘導する。SARS-CoV-1エスケープ変異体が、インビトロおよびマウス中の両方で、単一の抗受容体結合ドメイン（RBD）nAbまたは2つのnAbの組み合わせの存在下で発生する（2,3）。専ら抗体を誘発するワクチンは、特に抗体レベルが低い場合、ADEIの可能性のために注意してさらにアプローチしなければならない（4）。SARS-CoV-1に対する高濃度の抗血清はウイルス感染性を中和することが示されたのに対して、希釈された抗体はヒト前単球培養物においてADEIを引き起こし、細胞変性効果ならびにTNF-α、IL-4およびIL-6のレベルの増加をもたらした（5～7）。完全長SARS-CoV-1スパイクをベースとするワクチン候補は、非中和抗体を誘導することが実証され、免疫された動物は保護されなかった。代わりに、免疫された動物は、肝炎の増強、罹患率の増加、およびより強い炎症反応のような有害作用を経験した（8,9）。
CoVワクチンによって誘発されるT細胞応答もまた、保護および排除において重要な役割を果たす。MERS-CoV感染の排除は、T細胞欠損マウスでは不可能であったが、B細胞を欠くマウスでは達成された（10）。さらに、気道メモリーCD4＋T細胞は、SARS-CoV-1およびMERS-CoVに対する防御免疫を媒介することが示された（11）。ほとんどのワクチンタイプは、大量のメモリーCD4＋T細胞を誘発しないが、以下に示すように、CMVベクター化ワクチンは誘発する。CMVベクター化ワクチンに応答するT細胞は、エフェクター部位の中でもとりわけ気道に局在し、気管支肺胞洗浄によって回収される（12）。CMV応答性T細胞は、CXCR3発現、IFN-γ産生およびIL-10産生を含む、SARS-CoV-1に対して保護的であることが示されている細胞の他の必須の特徴を再現する（13）。
CMVベクター化ワクチンは堅牢な抗体応答を誘発することができる:CMVワクチンは、異種プロモーターによって駆動されるいくつかの導入遺伝子に対する弱い抗体応答を誘発するが、CMV感染症およびワクチン接種は、内因性pp65bプロモーターの制御下で発現されるタンパク質に対する堅牢な抗体応答を誘発する。このプロモーターは、DNA複製後のCMV感染の後期において最も活性なプロモーターの1つである。例えば、pp65bプロモーターの制御下でエボラウイルス糖タンパク質（GP）を保有するCMVワクチンを接種された4匹のアカゲザルのうち4匹がGP特異的抗体を産生し、GP特異的抗体の産生は2回目のワクチン投与後に強化されることが見出されている（21）。RhCMV/EBOV-GPによって誘導される高レベルのGP抗体およびIgGクラススイッチングを受けるGP抗体の能力は、十分なCD4＋Tヘルパー機能の存在を示す。最も高い抗GP力価を有するこれら4匹のマカクのうち3匹は、致死的EBOVによる抗原刺激に対して保護された。
新たに出現した病原体に対して使用するためのCMVベクターの重要な特徴は、以前に曝露された個体への再投与能力である。この能力により、長期にわたって出現する一連の脅威に対して保護するために、CMVベクター化ワクチンの反復使用が可能になる。
新たに発生した病原体に対して使用するための従来のCMVワクチンの非実用性:CMVベクター化ワクチンの免疫学的利点にもかかわらず、これらのワクチンが生ウイルスとして送達される場合には、実際の障害によって、ヒト臨床使用のためにCMVワクチンを迅速に開発することが妨げられる。最も重要な問題は、増殖が遅く変異可能なベータヘルペスウイルスから均一な試験品を大規模に生産することが非常に困難であることである（29）。
技術革新
核酸形態でのCMVベクターによるワクチン接種:CMVゲノムDNAによるトランスフェクションは多くのインビトロ技術の基盤であり、他の研究者らは、サルモネラ生物内でプラスミドとしてヘルペスウイルスゲノムの送達を試みているが（26）、本発明者らの知る限り、ワクチンとしての裸のまたは化学的に複合体化されたCMVゲノムDNAの送達は試みられていない。本発明者らは、CMV BAC DNAの投与後に遺伝子発現、ゲノム複製、ウイルス血症および免疫応答が起こることを以下に実証する。
CMVターミナーゼ複合体によるBAC切除を可能にするためのCMVゲノム末端におけるBAC複製起点の配置:ワクチン接種のためにそのDNA形態のCMVベクターを利用するためには、インビボでリコンビナーゼまたはヌクレアーゼ発現なしでBAC骨格を切除することができるように、現在のCMV BAC構築物の変更が必要である。CMVは、単位長さのゲノムを正二十面体キャプシドにパッケージングする必要があるため、比較的厳しいパッケージング制約を有する。現在のCMV BACは、DNA構築物のBAC部分内に配置された内因性リコンビナーゼ遺伝子を利用する。哺乳動物細胞にトランスフェクションされると、リコンビナーゼは発現され、複製ゲノムからBAC複製機構を切除する。ヒトにおけるインビボ送達に適したBAC DNAベクターを作製するために、本発明者らは、CMVゲノム末端を再編成して、リコンビナーゼの発現を必要とせずにBACの切除を可能にした。本発明者らの再構成されたBAC構築物は、CMV複製のパッケージング工程中に細菌の複製起点を除去するためにウイルスのターミナーゼ複合体を利用する（図2）。本発明者らは、BAC起点および複製機構の位置を、その現在の位置（RhCMV US1/2）から、ウイルスの直列反復配列を含むターミナーゼ複合体認識座位（TCRL）の間に移動させた。本発明者らは、この配置が、インビボで宿主細胞への導入後にワクチンゲノムの効率的な複製およびパッケージングを可能にすることを以下に示す。
新規の改良されたRhCMV-SIVワクチン:第1世代RhCMV-SIVベクターは、宿主免疫応答を抑制する完全な状態の内因性ウイルスIL-10遺伝子を保有する（27～31）。本発明者らは、特有の免疫学的特徴を有し、第一世代ワクチンは保護しないwtRhCMV陰性乳児マカクを保護することができる第二世代RhCMVベクタープラットフォームであるウイルスIL-10欠損RhCMVまたはRhCMVdIL10を作製した（27）。
実施例3. CMVベクター化ワクチンは、CD4およびCD8区画において、類を見ない広範かつ強力なT細胞応答を誘発する。
Tエフェクター-メモリー（TEM）細胞は、粘膜エフェクター部位におけるT細胞の支配的な種類である（14）。CMV感染は、CMV病態に対して保護するが、CMV感染を排除しない、またはCMV重複感染を防止しない、エフェクター-メモリー区画における生涯にわたる高頻度のCD4＋およびCD8＋T細胞応答に関連する（15～19）。CMVベクター化ワクチンによって誘発されたTEM細胞は、さらに、クラスEおよびクラスII主要組織適合抗原複合体（MHC）分子によって拘束されたエピトープに対する優位な応答を含む、多様で珍しいエピトープを認識する（20）。CMVワクチンに応答するT細胞は、他のワクチン型に応答するT細胞の3倍を超える数のペプチドエピトープを認識し、その結果、ワクチン抗原を「ペイント」し、病原体のエスケープを防ぐはずである応答をもたらす（20）。多くの公開されている研究はCD8＋T細胞応答に焦点を当てているが、CMVワクチンは同等に強力なCD4＋T細胞応答を刺激し、これは他のベクター化ワクチンでは見られない特徴である（図3A）。重要なことに、ワクチン接種者の気道における応答性CD4＋T細胞の類を見ない豊富さ（図3B）は、SARS-CoV-1に対する保護について記載された要件に適合する（11）。
実施例4. DNAベースの自己開始CMVベクター化ワクチンは、新たに生じた脅威に対する広範な保護のために迅速に設計および製造することができる。
原核生物遺伝学を使用した操作を可能にするために、RhCMV-SIVワクチンは、部位特異的リコンビナーゼまたは制限酵素に対する認識シグナルに隣接して、BAC複製起点（ori）が埋め込まれたベクターゲノムDNAを含有する環状バクテリア人工染色体（BAC）として維持される。インビトロでのまたはトランスフェクション後の部位特異的組換えによるBAC起点の切除は、効率的な複製およびパッケージングのために必要とされる。本発明者らは、ウイルスゲノムの外側に、CMVターミナーゼ複合体認識座位に隣接してBAC起点を含有するようにこれらのベクターを再操作し、ベクターが複製を開始する際に、CMVターミナーゼによる自動的な切除を可能にした（図2）。したがって、この新しいベクターは、インビトロ消化またはCreリコンビナーゼ発現のいずれも必要とせず、安定な環状DNA分子としてワクチンレシピエントに送達される。レシピエントの細胞核に到達すると、これらのCMVワクチンゲノムはウイルス複製サイクルに入り、ビリオンとして送達されたCMVベクター化ワクチンによって誘発されるものと同一の防御免疫応答を引き起こすビリオンのカスケードを産生する。実際、その結果生じるワクチン応答はより早く起こり、ビリオンによって誘発される応答よりも強いことが多く、1万倍多くのワクチンゲノムの投与によるものである可能性が最も高い（図6）。
実施例5: T細胞または抗体応答を誘発するように設計された自己開始CMV/SARS-CoV-2ワクチンに対するアカゲザルでの免疫応答を特性評価する。
本発明者らは、自己開始RhCMVワクチンがビリオン形態で投与されるものと同程度に広いT細胞応答を生成すること、および抗CD3scFv断片へのSARS-CoV-2 S1免疫原の連結がNAb応答の速度および効力を増加させることを仮定する。
この仮説の理論的根拠は、本発明者らは、SLRhCMVワクチンが、投与後数週間血中に検出することができる複製ウイルスを開始されることを実証したこと、および本発明者らは、これらの形態が、従来のキャプシド化されたCMVによって誘発されるものと同程度に広いT細胞応答（B群において）を誘発すると予想していること（アデノウイルスベクターの12ペプチドと比較して、1000当たり約90ペプチド）である。
B細胞応答を誘発するように設計されたSLCMVワクチン（C～D群）に関して、本発明者らは、分泌型スパイクS1ドメインを、CD3に結合するscFv断片に連結された同一のタンパク質と比較する（図7）。その結果得られるのは、S1特異的B細胞とその近傍にある任意のT細胞を「架橋」することができる分子である。本発明者らの予備データは、二重特異性抗体中の抗CD3に連結されたイディオタイプが極めて強力な抗イディオタイプ抗体を迅速に誘発することを示す。したがって、本発明者らは、抗CD3 scFvに連結されたスパイクS1ドメインの送達が、S1単独よりも強い抗体を誘発すると予想する。
本発明者らは、3つの候補ワクチン成分に対する免疫応答を試験し、それらはすべて、抗原刺激の2週間前、8週間前および4週間前に投与される（図7）。T細胞成分は、SLRhCMV/NおよびSLRhCMV/EMワクチンの混合物を含有する。本発明者らは、保護の相関関係を後に調べるためのデータを提供するために、これらのワクチン（B群）に対するT細胞応答の強度および広さを評価する。2つの候補B細胞成分（C群およびD群）が存在し、より強い中和抗体応答の誘導および/または増強の低減のために、そのうちの1つを実施例6における有効性試験のために選択する。最後に、本発明者らは、T細胞ワクチンからなるレジメン（SLRhCMV/N＋EMおよび選択されたB細胞ワクチン、一緒に投与される）を試験する。
ワクチン構築
SLRhCMV/N、SLRhCMV/EM、SLRhCMV/S1、およびSLRhCMV/S1-抗CD3は、図2に示されるように、CMVターミナーゼ認識部位によって結合された自己開始BAC構築物として生成される。すべてのコード配列は、SARS-CoV-2中に見出されるコード配列のコドン最適化されたバージョンである。NおよびEM融合タンパク質カセットは、その第1のイントロンを含むEF-1αプロモーターの制御下で発現され、本発明者らが繰り返し使用し、支配的なT細胞応答を観察した場所であるRhCMVゲノムのRh213/214領域に組み換えられている。S1およびS1-抗CD3scFvカセットは、内因性後期RhCMV pp65bプロモーターの制御下で発現され、効率的な分泌を促進するために23アミノ酸のtPAリーダー配列が先行する。S1-抗CD3融合物は、本発明者らが二重特異性抗体の構築のために以前に使用したクローンである抗CD3クローンSP34に由来するヒト化scFv領域を使用する。
Triton X-114によるアルカリ溶解、その後2回の連続等密度遠心分離を用いて、大腸菌の培養物からエンドトキシンを含まないBAC（ワクチン）DNAを精製する。エンドトキシン濃度が発熱性閾値（5エンドトキシン単位/kg体重）未満であることを確保するために、カブトガニアメーバ様細胞溶解物（LAL）アッセイを用いてエンドトキシン濃度を測定する（32）。
ワクチン投与
本発明者らの予備データ（図6）は、100μgのRhCMVdIL10ワクチンBAC DNAによる皮下でのワクチン接種が免疫応答を誘発するのに十分であることを示す。BAC DNAは、製造業者の指示に従って、in vivo-jetPEI（Polyplus）を用いて製剤化される。簡潔には、100μgのDNA（RhCMVdIL10-SIVgagおよび-SIVenvの各々50μg）および16μLのin vivo-jetPEIを5％グルコース溶液（1ml）中に別々に希釈し、次いで混合し、15分間インキュベートする。
RhCMVベクターの複製および排出
本発明者らの公開したプロトコル（16,33）を使用して、qPCRによって、血液および唾液試料中でワクチン由来のRhCMV DNAを毎週測定する。これらの測定は、BAC DNAをコードするウイルスベクターの複製および拡散の評価を与える。様々な組織への拡散は、実施例6において、SARS-CoV-2による抗原刺激後の剖検で、qPCRによって評価される。
免疫表現型解析
最も興味深い免疫表現型は、RhCMVおよびRhCMV/SIVワクチンに応答する細胞の最も多い割合を含有するT細胞メモリー-エフェクターサブセット;適応特徴を有するNK細胞（すなわち、FcεRIγ低「メモリー」NK）;自然特徴を有するT細胞（NKG2A＋）;ならびにCD80/83/86を発現する抗原提示細胞、特に単球である。これらの細胞集団はすべて、野生型またはワクチン株RhCMV感染後に変化する。すべてが、抗原提示細胞、T細胞およびNK細胞を調べるための本発明者らの以前に発表された研究において使用された3つのフローサイトメトリパネルのセットを使用して評価される（34）。
抗原特異的T細胞応答
最大1MのPBMCまたはLNMC細胞を含有するアッセイウェルを、ビヒクル（DMSO毒性についての陰性対照）、重複するRBD、S1、E、Mおよび/またはNペプチド（Intavis）、またはPMA/イオノマイシン（陽性対照）で刺激する。刺激が始まる1時間前に、VL9ペプチドまたは抗HLA抗体などの阻害剤が適用され、ペプチド刺激とともに再び添加される。16時間後、固定可能な生死判別染色ならびにCD3、CD4、CD8、CCR7、CD95、IL-2、IL-17、IFN-γおよびTNF-αに対して反応性の抗体を使用して細胞を染色する。例えばBD FortessaまたはFACSymphonyでのサイトメトリによって、サイトカインを分泌するCD4＋およびCD8＋T細胞の割合を決定する。
抗体応答
本発明者らが公開したプロトコル（16）に従って、毎週の血漿試料に対して、ELISAによって、スパイクS1ドメインへの結合抗体の誘導を測定する。中和抗体または促進抗体をRVPアッセイによって試験する。
混合T細胞およびB細胞ワクチン（E群）
C～D群における結合抗体応答および中和抗体応答を十分に特性評価し、より優れた中和力価およびより低い増強を有するまたは増強を有しない群をSARS-CoV-2による抗原刺激のために選択する（実施例6を参照）。さらに、Nabの誘導のための最良の候補を選択した後、T/B混合ワクチン群（群E）を形成する。この群は、SLRhCMV/N、SLRhCMV/EM、および選択されたB細胞ワクチンとの併用ワクチン接種を受ける。
データの解釈
本発明者らは、DNAとして送達された本発明者らのSLRhCMVワクチンが堅牢なT細胞およびB細胞応答を誘発すること、ならびに後者の応答は抗CD3scFvに連結された抗原を用いた方が強いことを仮定する。それらの応答細胞が最も関連性の高い組織である肺に見出されるかどうかを決定するために、本発明者らは、気管支肺胞洗浄を実施し、気道から回収することができるT細胞をアッセイする。
SARS-CoV-1を含む、呼吸器感染を引き起こす他のRNAウイルスで以前に観察されたADEIに基づいて、一部の動物はワクチン接種後にRVPアッセイの増強を示し得る可能性がある。このような結果は、COVID-19の免疫病原性を理解するためにも、以下に記載される抗原刺激実験の結果を解釈するためにも重要であろう。
統計解析
ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定を使用して、単一の時点での要約指標またはアウトカムの群間差を検定する。縦断的結果、例えば、T細胞と抗体応答の間の関連性を検定するために、一般化線形混合モデル（GLMM）が解析フレームワークとして使用され、変量効果は、連続的測定によって引き起こされる動物内相関を補正する。
実施例6. アカゲザルにおけるSARS-CoV-2のDavis分離株に対するSLCMV/SARS-CoV-2ワクチンの保護効果を評価する。
本発明者らは、気道に局在する強力なT細胞応答がSARS-CoV-2に対して保護し、さらに抗体依存性感染増強に対して保護することを仮定する。この仮説の理論的根拠は、T細胞応答が細胞内寄生生物に対する身体の最も重要な防御であり、ウイルスの標的組織中に十分に高い頻度で存在すれば、SARS-CoV-2に対して保護すると予想されることである。実際、気道メモリーCD4＋T細胞がSARS-CoV-1およびMERS-CoVの両方に対する防御免疫を媒介することが以前に示されている（例えば、Zhao,Immunity 44:1379を参照）。さらに、ADEIは、細胞中へのウイルスの取り込みが増強されて、その結果、利用され、生産的複製を可能にすることによって起こると考えられるが、ADEIによって内部に取り込まれたウイルスは、T細胞による排除を受けやすいはずである。
本発明者らは、ウイルス学的、免疫学的および病理学的データの一貫したセットが実験全体にわたって活用され得るように、均一な抗原刺激およびモニタリングプロトコルを開発した。図に示されるようにワクチン接種されたマカク（図7のB～E群）は、初回刺激ワクチン接種の少なくとも8週間後に抗原刺激を受け、その後、反復した臨床評価;X線検査;（例えば、気管支肺胞洗浄、気管洗浄または鼻腔洗浄による）呼吸および粘膜分泌物の収集ならびに唾液、尿および便;採血;および組織収集を行った（例えば、www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.07.07.191007v1を参照）。
感染のためのウイルス
本発明者らがUC Davis患者から得たSARS CoV-2分離株を増殖させることによって作製したウイルスストックを動物接種のために使用し、2019-nCOV/USA-CA9/2020と命名する。そのウイルスの増殖が不十分である場合、本発明者らは、代わりに、SARS CoV-2分離株USA-WA1/2020（BEI Resources）を使用する。動物に感染させるために、5mlの0.9％無菌生理食塩水中で、麻酔をかけたサルの結膜、鼻孔および気管中に合計でおよそ6×106TCID50を滴下して、COVID-19の関連する伝播経路を再現する。
サンプリングおよびアッセイ
全体を通じて体温、体重および活動をモニターする。CBCおよび血清化学をすべての血液試料に対して得て、宿主応答および臓器機能をモニタリングする。サンプリングスケジュールは、ウイルスの排出、サイトカイン応答および適応免疫を包括的に性質決定して、これらのパラメータの変化が肺の病態をどのように反映するかを理解するように設計されている。サンプリングスケジュールおよび手順は、マカクにおけるA型インフルエンザ感染を性質決定するために本発明者らによって首尾よく使用されている。最初の週の集中的なサンプリングは、本発明者らが急性ウイルス学および宿主応答を研究することを可能にする。ACE2はアカゲザルおよびヒトの胃腸および泌尿生殖路で発現されるので、呼吸分泌物に加えて、本発明者らは、唾液、尿および糞便中のウイルス排出を評価する。剖検時（d28）に、PCR、分子組織学（IHC、ISH）およびサイトメトリによってウイルス局在化および免疫応答を評価するために、本発明者らは、唾液腺、肺、リンパ節、腎臓および腸を含むすべての関連組織を採取する。肉眼的病理、組織病理および組織vRNAレベルについて組織を評価する。検死は、委員会認定病理医によって行われる。
ThermoのMagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolationキットを（COVID-19に対してCDCによって推奨されるとおりに）使用して気道試料からウイルスRNAを回収し、SARS-CoV-2核タンパク質（N）遺伝子のセグメントの増幅によって定量する。これらの研究において使用される具体的なRT-PCRアッセイは評価中である。CNPRCチームは、CDC、UCD Health Clinical labs、Wisconsin NPRCおよび民間の業者からの検証されたRT-PCRアッセイの感度、特異性および再現性を比較している。本発明者らは、最も一貫したアッセイを選択する。免疫学的分析は、実施例5において上述したとおりに行う。
データの解釈
本発明者らの仮説が正しければ、B群動物は、ほとんどT細胞のみからなる免疫応答を開始したにもかかわらず、SARS-CoV-2ワクチン接種に対して保護される。C群またはD群の動物（実施例5において選択される方）も保護され得るが、本発明者らは、RVPアッセイにおいて増強することが示されているか否かにかかわらず、中等度の抗体力価を有する動物における増加したウイルス量、排出または病理学的所見によって示されるであろうADEIの可能性に注意する。
統計解析
要約的知見または個々の時点、例えば剖検時に評価される知見は、ベンジャミニおよびホッホバーグに従ってp値を調整して、ノンパラメトリック検定を使用して評価される。縦断的結果は、（必要であれば一般化を伴う）線形混合モデルを用いて評価され、変量効果は、連続的測定によって引き起こされる動物内依存性を受け入れる。
実施例7. マカクにおける自己開始ヒトCMVベクター化ワクチンの試験安全性および潜在的有効性。
本発明者らは、SLHCMVワクチンがGMP工程において10～20グラム規模で産生可能であり、マカクに安全に投与することができ、SARS-CoV-2による抗原刺激に対して保護することができることを仮定する。この仮説の理論的根拠は、驚くべきことに、弱毒化されたHCMVベクターがアカゲザルにおいて挿入された抗原に対するTエフェクター-メモリー応答を誘発および維持し得ることが最近示されたことである（例えば、Caposio Sci Rep 9:19236を参照）。したがって、アカゲザルモデルは、GMP条件下で製造された候補SLHCMVワクチンのSARS-CoV-2に対する有効性を試験するための設定を提供し得る。HCMVベクター化ワクチンがマカクにおいて安全かつ有効であることが証明できれば、HCMVベクター化ワクチンは後の臨床試験のための候補であろう。
実施例5においてB～D群のマカクに投与された4つのワクチンすべてのSLHCMVバージョンを操作する。さらに、B～E群の抗原刺激後、最適レジメンの一部を形成するSLHCMVワクチンのGMP産生が行われる。例えば、B群の動物が病態に対して最良に保護されれば、SLHCMV/NおよびSLHCMV/EMの産生が行われる。得られたGMP生成物は、マカクのワクチン接種およびSARS-CoV-2に対する有効性試験のためにUC Davisに送られる。
SLHCMVワクチンゲノム
操作されているHCMVワクチンゲノムは、Towneワクチン株の優れた安全性記録のためにTowneワクチン株を基礎としている。ワクチンは、Davisにおいて操作されたRhCMVゲノムに対してオルソロガスである。ウイルスのインターロイキン-10遺伝子は両事例において存在しない;T細胞応答を誘発するためにUS28付近の遺伝子間領域に配列を挿入する;代わりに、抗体応答の誘発のためにpp65bプロモーターの制御下に配置される。BACは、同じプロモーターによって駆動されるコドン最適化されたSARS-CoV-2配列を保有する。
使用されるプラスミド骨格配列は、（プラスミドを維持するためにoriSを使用するDH10B細胞において）およそ1コピーでのまたは（TrfA発現の誘導および代替のoriV起点とのTrfAの相互作用後の）約15～30コピーでのプラスミドの維持を可能にする。二重連続CsCl平衡勾配遠心分離、その後のPBS中への透析によって、BAC DNAを実験室規模で精製する。プラスミド調製物の完全性は、制限酵素フットプリンティング、発現カセットのPCR増幅、およびタグメンテーション後のディープシーケンシングによって確認される。
GMP産生は、CMOパートナーによって行われる。上流工程の開発は、試験品の最大均一性を確保するために、形質転換および培養条件を最適化することに焦点を合わせる。下流過程の開発（細胞増殖後の精製）は、実験室において使用されるCsCl依存性工程のイオジキサノールへの適合に焦点を合わせる。
マカク（F群）における最適なSLHCMVワクチンレジメンの試験
SLHCMVワクチンは、B～E群の1つで使用される同じ組み合わせおよび同じ用量で与えられる。免疫アッセイ、SARS-CoV-2による抗原刺激および病理学的評価を同じように行う。
データの解釈
本発明者らの仮説は、SLHCMVワクチンが、第I相ヒト試験における最終的な試験を可能にするのに十分な規模および純度で、GMP工程において製造されることを予測する。さらに、本発明者らは、SLHCMVベクター化ワクチンがアカゲザルモデルにおいて有効性を実証することができると考える。このような結果は、おそらく直観に反するが、HCMVがアカゲザル線維芽細胞中でその生活環を完了することができ（43）、マカクにおいて強いTEM応答を誘発することができることを実証する文献中の発表に基づけば可能である。
完全に不活化されたHCMVベクター化ワクチンをヒトにおいて使用した場合に見られるように、マカクにおけるSLHCMVワクチンに対する免疫応答はワクチンの最小限の拡散で達成される応答を反映する可能性が高いので、マカクにおけるSLHCMVワクチンに対する免疫応答も興味深い。いくらかのゲノム複製の証拠にもかかわらず、HCMV（Towne）ベースのワクチンは、マカクにおいて最小限の全身拡散または全身拡散の非存在を可能にするはずである。したがって、RhCMVとTowneベクター化抗原に対する対照的な免疫応答は、免疫応答のいずれの性質が免疫調節のみに依存し、いずれがベクターの拡散に依存するかを明らかにするはずである。
統計解析
統計解析は、ワクチン調製物の特徴に中心が置かれている。本発明者らの以前の経験は、単一コピーBACが他のプラスミドと同様の、すなわち、ポリメラーゼのエラー率によって課されるアンプリコンシーケンシングによる検出レベル（約0.1％）（46～50）を下回る変異率を有することを示唆している。マカクにおけるSLHCMVゲノム複製は、（i）初回刺激または追加免疫の1週間後の血漿中のワクチンウイルス配列、（ii）注射部位からの生検組織におけるgB発現（HCMVgB特異的Ab;後期遺伝子としてのgBはゲノム複製後にのみ発現される）、または（iii）追加免疫の1ヶ月後の力価の倍増によって定義されるHCMVgBに対する既往抗体応答のいずれによっても決定される。
実施例8. 抗CD3一本鎖可変断片に連結されたSARS-CoV-2 RBDドメインを含むコンジュゲートポリペプチドワクチン
本発明者らは、分泌を可能にするためにいずれも組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）シグナル配列が先行する、SP34クローン由来のヒト化抗CD3一本鎖可変断片（scFv）とSARS-CoV-2受容体結合ドメイン（RBD）との間での融合タンパク質であるs3-RBD（SEQ ID NO.6）と命名されたコンジュゲートポリペプチドワクチンを設計した。RBDは、ヒト受容体ACE2へのSARS-CoV-2スパイクタンパク質の結合に関与するSARS-CoV-2スパイクタンパク質のセグメントであり、しばしば中和抗体の標的となる。s3-RBDは、RBD応答性B細胞（それらの細胞表面、RBD特異的抗原受容体を介して）およびヘルパーT細胞（CD3を介して）の両方を結合する能力を有する。特定の作用機序に関する以下の理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、B細胞およびT細胞上のこれらの同族受容体の対またはクラスタの結合が両細胞型の活性化をもたらすはずであり、続いてB細胞の継続的な発達を促すと仮定する。T細胞の補助を受けるB細胞は、体細胞高頻度変異を受け、最終的に高親和性RBD特異的抗体の産生体へと発達する可能性がより高い。
s3-RBDを発現する遺伝子ワクチンでアカゲザルを免疫するために、本発明者らは、SEQ ID NO.7に与えられるヌクレオチド配列を有するコドン最適化されたオープンリーディングフレームを調製した。この配列を合成し、次いで、当業者に公知の技術を使用して、ヒトEF-1-αプロモーター配列の下流およびSV40由来のポリアデニル化シグナル（SEQ ID NO.8に与えられる完全な発現カセット配列をもたらす）の上流に、発現カセット中に配置した。発現カセットを含有するプラスミドは、DNAワクチンとして投与するために中程度の規模でエンドトキシンを含まないように調製した。E1、E3欠失35型アデノウイルスベクター中へのDNA配列の移入を可能にする35型アデノウイルスシャトルプラスミドのE1領域中にも発現カセットをクローニングした。
非ヒト霊長類における遺伝子ワクチンの状況で本発明者らのs3-RBD免疫原に対する免疫応答を評価するために、本発明者らは、電気穿孔されたDNA初回刺激（0日目）およびAd35ベクター化追加免疫（28日目;図8）を使用して9匹のサルの免疫化を実施した。試験した免疫原は、SARS-CoV-2 S1ドメイン、RBDドメイン単独、またはs3-RBDであり、すべてEF-1αプロモーターの制御下でコドン最適化されたORFから発現された。単離されたRBDドメインとs3-RBD融合タンパク質の両方の上流にtPAシグナル配列を配置して、それらの分泌を可能にした（図8）。
ワクチン接種プロトコル中のELISAによる結合抗体の評価は、免疫化に対するRBDドメインの優位性（S1ドメイン全体と比較して）、およびRBD単独に対するs3-RBD構築物の優れた性能（図9）の両方を実証した。驚くべきことに、S1免疫原の成績は非常に低く、3匹のワクチンレシピエントの1匹のみにおいて検出可能な結合および中和抗体を誘発した。S1に対する低い結合抗体応答は、2匹の動物においてELISAによって認識可能であったが（図9）、他の群におけるはるかに高い応答と比較すると、わずかであったことに留意されたい。これら2匹のS1レシピエント動物のうちの1匹で中和活性が検出された（図9、黒い点線）。RBDドメイン単独に対する免疫応答は、RBDドメインをコードする遺伝子ワクチンを受けた3匹の動物すべてにおいて、すべての追加免疫後の時点で検出可能であった（図9、灰色の破線）。しかしながら、結合抗体応答は、s3-RBDを受けた群で最も高かった（図9、黒い実線）。
それらの天然のエンベロープタンパク質を欠くが代わりにSARS-CoV-2スパイクタンパク質を有するレンチウイルス粒子である偽型化レンチウイルス粒子に対して中和活性を試験した。1匹の動物について、生成された曲線の例を図10に示す。感染が50％に低下する希釈として、各曲線について中和力価50（NT50）を取る。図10では、最初の2つの時点でNT50は検出されないが、その後のすべての時点からの血清は、偽型粒子の感染力を50％未満に低下させることによって中和を実証する。すべてのRBDワクチンレシピエントがシュードウイルスアッセイにおいて中和力価を示し、動物D2は1:6539のピーク力価を有し（図11）、これは回復期の人々のおよそ90パーセンタイルである（Moore and Klasse,2020）。しかしながら、結合抗体についてのELISAアッセイの場合と同様に、s3-RBDを発現する遺伝子ワクチンのレシピエントは最も高い中和力価を達成し、3例中2例において、4週目後のほとんどの時点ですべてのRBDレシピエント動物を超えた（図11）。実際、s3-RBDレシピエント動物における幾何平均力価は、RBDレシピエントにおける幾何平均力価を少なくとも4倍上回った。1匹のs3-RBDレシピエント動物が、アッセイにおいて定量可能であった最大値（1:10240）を超える力価で抗体を生成したので、実際の倍数増加はより高い。s3-RBDレシピエントにおける中和抗体応答はまた、印象的な持続性を示し、すべての動物が最初の免疫後32週を通じて中和を維持した（図11）。対照的に、RBD単独のレシピエント3匹のうち2匹では、中和活性は本発明者らのアッセイにおける検出限界を24週までに下回る。
いくつかの報告されている事例では、膜結合性抗原（例えば、それらの抗原は、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーまたは膜貫通セグメントを有するので）に対する免疫応答は、分泌形態の同じ抗原に対する免疫応答よりも良好である。したがって、本発明者らは、抗CD3 scFv断片、SARS-CoV-2のB.1.351（「南アフリカ」）株のRBD、およびヒトPDGF受容体からの膜貫通セグメントを含むコンジュゲートポリペプチドを作製した。得られたアミノ酸配列をSEQ ID NO.25として示す。このポリペプチドに対するコドン最適化された核酸配列（SEQ ID NO.26）を合成し、（その第1のイントロンを含む）EF1-αプロモーター配列の下流およびSV40ポリアデニル化配列の上流に、pUC19プラスミド中にクローニングした。
本発明者らは次に、s3-RBD（B.1.351）-PDGFRtmコンジュゲートポリペプチド（SEQ ID NO.25）が、ヒト細胞中で発現された場合に、ヒト対象における抗RBD（B.1.351）抗体応答の誘導のためにおそらく必要とされる免疫反応性RBD（B.1.351）を含有することを確認した。ヒト胎児腎臓細胞株、293中にs3-RBD（B.1.351）-PDGFRtmをコードするプラスミドをトランスフェクションし、2日後に、以下の手順を使用する抗体染色によって細胞内の免疫反応性RBD（B.1.351）タンパク質の存在を確認した。アッセイ-1日目に、ウェルあたり35万個の細胞を6ウェルプレート中に播種した。0日目に、DMEM中の150マイクロリットルの0.1mg/mlPEIを等量のDMEM中の3mcgDNAに添加することによって、ポリエチレンイミン（PEI）トランスフェクションミックスを調製した。このミックスを室温で20分間インキュベートした。2.7mlの完全培地を添加した。複合体化されたDNAを含む培地を6ウェルプレート中の洗浄した293細胞に添加した。一晩インキュベートするためにプレートをインキュベータに戻した。1日目に、トランスフェクションミックスを細胞から除去し、細胞を洗浄し、2mlの新鮮な培地を添加した。2日目に、5％PFAで細胞を固定し、0.05％Triton X-100を含有する緩衝液で洗浄して透過処理し、抗RBD一次抗体と2時間インキュベートし、再度洗浄し、HRPコンジュゲート化二次抗体とともに2時間インキュベートし、洗浄し、TrueBlue HRP基質と5～15分間インキュベートし、最後に水中で消光した。結果（図13D）は、s3-RBD（B.1.351）-PDGFRtm構築物が、免疫反応性RBD（B.1.351）を含むコンジュゲートポリペプチドを首尾よく産生することを実証している。
実施例9. 抗CD3一本鎖可変断片および抗体Fc領域に連結されたSARS-CoV-2 RBDドメインを含むコンジュゲートポリペプチドワクチン
多価抗原ディスプレイは、B細胞受容体（BCR）の効率的な架橋および改善された抗原輸送、エンドサイトーシスによる取り込み、および最終的には提示を介して、より強く、より長く持続する抗体応答を推進することができる（Brinkkemper Vaccines 7,2019;Tokatlian Science 363:649,2019）。反復エピトープは、BCRに対してより高い効果的な結合活性を有し、かつ受容体を架橋してB細胞を効果的に活性化することができる（Cimica Clin Immunol 183:99,2017;Zabel J Immunol 192:5499,2014）。15～20のハプテン分子の5～10nmの間隔は、B細胞活性化のために理想的である（Vogelstein PNAS 79:395,1982）。多量体抗原は、タンパク質としてエクスビボで最も一般的に産生されるが、インビボで遺伝子ワクチンによっても産生され得る。
ワクチン抗原の免疫原性を改善するための1つの方法は、例えば、25～50nmの直径のナノ粒子（NP）上にワクチン抗原を提示することである。インフルエンザおよび呼吸器合胞体ウイルス（RSV）ワクチンを作製するための努力と同様に、認可されたヒトパピローマウイルスおよびHBsAgワクチンはNPを含む（Darricarrere J Virol 92,2018;Hsia Nature 535:136,2016;Kanekiyo Nat Immunol 20:362,2019;Marcandalli Cell 176:1420,2019）。動物における研究は、NP提示が、可溶性タンパク質と同じ抗原の送達と比較して、Ab応答の量および質を大幅に改善することを示している（Brinkkemper Vaccines 7,2019）。したがって、RSV抗原のNPディスプレイは、NAb力価を10倍超増強した（Marcandalli Cell 176:1420,2019）。NP提示はまた、インフルエンザHAについて示されたように、特に最も高い交差反応性のBCRとの相互作用の結合活性を増加させることによってNAb幅を改善することができる多価の抗原的にモザイクの免疫原の作製を可能にする（Kanekiyo Nat Immunol 20:362,2019）。
免疫グロブリン「結晶化可能断片」またはFcは二量体化分子である;したがって、免疫原がFcとの融合タンパク質として発現されると、結果は、上記の理由により、より大きな免疫原性を有する可能性が高い二量体分子である。Fc領域はまた、12の融合したパートナーを含有する明確に定義された複合体へと重合するように修飾することもできる（Mekhaiel Sci Rep 1:124）。さらに、サルベージ新生児Fc受容体との相互作用、およびより大きな分子に対するより遅い腎クリアランスのために、Fcドメインの存在は、融合タンパク質の血漿半減期を著しく増加させる（Roopenian＆Akilesh,2007 and Kontermann,2011）。結合されたFcドメインはまた、これらの分子が免疫細胞上に見出されるFc受容体（FcR）と相互作用することを可能にし、これは腫瘍治療およびワクチンにおけるこれらの分子の使用にとって特に重要な特徴である（Nimmerjahn＆Ravetch,2008）。
多量体s3-RBDの発現を可能にし、Fcドメインによって与えられる他の利益を達成するために、したがって、本発明者らは、そのC末端でヒトIgG1Fcドメインに融合した、「s3-RBD-Fc」（SEQ ID NO.9）と呼ばれるコンジュゲートポリペプチドワクチンs3-RBDからなるタンパク質分子を設計した。次に、本発明者らは、s3-RBD-Fcを発現することができるコドン最適化されたORFを調製した（SEQ ID NO.10）。
s3-RBD-Fcの免疫原性を試験するために、アカゲザルに投与される適切なDNAおよびアデノウイルスベクター中に導入される発現カセット中にこのORFを操作する。
実施例10. ダイアボディを形成する抗CD3一本鎖可変断片に連結されたSARS-CoV-2 RBDドメインを含む二量体化コンジュゲートポリペプチドワクチン
s3-RBDは、それ自体がモノクローナル抗体SP34由来の重鎖および軽鎖可変領域VHおよびVLを含む抗CD3 scFv断片を含む。機能的な単量体scFv断片を形成するために、これらのVH領域およびVL領域は、2つのドメインがCD3結合のために必要とされる適切な三次元立体配置を達成することを可能にするために必要とされる柔軟なリンカーによって隔てられている。単量体scFvの適切な折り畳みを可能にするために、リンカーの長さは、通常、＞12アミノ酸、最も頻繁には15アミノ酸（Wang Antibodies 8:43,2019）である。
より短いリンカーは、VHおよびVL領域が空間的に正しく関連した単量体の折り畳みを可能にするには不十分な長さを有するので、2つの可変ドメインを連結するより短いリンカーは、多量体scFv分子の形成を決定することができる。2つの可変ドメインを連結するリンカーの長さが8～12残基未満に低下すると、VH-VL断片の二量体の集合が促進され、2つの抗原結合部位を有するダイアボディが生成される（Holliger et al.,1993;Kortt et al.,1994;Aflthan et al.,1995）。リンカー配列が5アミノ酸未満へさらに低下すると、三量体または四量体分子（トリアボディ、テトラボディ）の生成をもたらすことが示されている（Iliades et al.,1997;Kortt et al.,1997;Pei et al.,1997;Le Gall et al.,1999;Dolezal et al.,2000;Hudson and Kortt,1999）。
したがって、本発明者らは、VH-VLリンカーの長さを5アミノ酸に短縮させることによってs3-RBDの二量体化形態を設計した（SEQ ID NO.11）。本発明者らは、コンジュゲートポリペプチド免疫原のこの二量体化形態をコードするコドン最適化されたORFを調製した（SEQ ID NO.12）。このコドン最適化されたORFは、発現カセットに、ならびに免疫原性試験のために動物に投与されるDNAおよびアデノウイルスベクターに連続して操作される。
ダイアボディの報告された結晶構造を評価すると、著しい構造多様性が明らかであり、ダイアボディ構造の不安定性が示唆された（Kim Sci Rep 6:34515,2016）。ダイアボディの結晶構造では、軽鎖はFvドメイン間の相互作用に寄与せず、2つの重鎖は比較的小さな相互作用界面を形成する。人工タンパク質構築の一般的かつ信頼性の高い媒介因子としてダイアボディを使用するために、抗原結合部位（例えば、CD3結合部位）間の予測可能な配向および距離が有利であることが提案された。それにもかかわらず、最も単純な設計の多くのダイアボディ、すなわち、リンカー配列が5個のアミノ酸に短縮したダイアボディは、小さすぎて安定な構造を有することができないように見受けられるFvドメイン間の相互作用界面を有した（Moraga Cell 160:1196,2015;Perisic Structure 2:1217,1994）。EFループ中のアルギニン残基の置換およびFvドメイン間への1つまたは複数のジスルフィド架橋の導入によって、ダイアボディ構造をより堅固にし、予測可能にすることができることが示された。
次に、本発明者らは、VH-VLリンカーの長さを5アミノ酸に短縮し、EFループ中の正に荷電したリジン残基を置換し、ジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基を導入することによって、より大きな安定性が予測されるs3-RBDの二量体化形態（SEQ ID NO.13）を設計した。本発明者らは、増強された安定性を有するコンジュゲートポリペプチド免疫原のこの二量体化形態をコードするコドン最適化されたORF（SEQ ID NO.14）を調製した。このコドン最適化されたORFは、発現カセットに、ならびに免疫原性試験のために動物に投与されるDNAおよびアデノウイルスベクターに連続して操作される。
eDis3-RBDとも呼ばれる増強された二量体化抗CD3-RBDコンジュゲートポリペプチドをコードするプラスミドDNA分子を、DNAワクチンとして（0日目に1mgのDNAの電気穿孔によって）3匹のアカゲザルに投与した。RBD単独をコードする35型アデノベクターを用いて、28日目に追加免疫による免疫化を行った（図12）。これらのマカクにおける抗体応答を、初回刺激および追加免疫のためにRBD単独を使用して得られた抗体応答と比較した。結果は、eDis3-RBDを使用した改善されたピーク抗体応答（幾何平均の6.3倍の増加）およびワクチン接種後24週間残存した持続的抗体応答の増加（幾何平均の5倍の増加;図12、eDis3-RBDの黒い平均実線をRBD単独の黒い平均点線と比較せよ）の両方を実証する。
実施例11. 抗CD2一本鎖可変断片に連結されたSARS-CoV-2 RBDドメインを含むコンジュゲートポリペプチドワクチン
CD2は、T細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞の表面に見出される接着分子である。CD2は、LFA-3（CD58）を含む他の細胞の表面上に発現される他の接着分子に結合する。CD2は共刺激分子として機能し、これは、CD2を介して送られたシグナルがTCR結合によって送られたシグナルと協働して、静止したT細胞における細胞増殖およびサイトカイン産生を誘導することを意味する。CD2とCD3-TCR複合体との密接な関連は、最適なT細胞応答に不可欠であると思われる。CD2はまた、LFA-3に結合し、それによって抗原非依存性細胞接着、ナイーブTヘルパー細胞の増殖、およびメモリー細胞におけるIFN-γ産生の誘導を引き起こす重要な接着分子である。LFA-3に加えて、CD2はCD48およびCD59と相互作用することができる。
以下のタンパク質要素:（細胞からのコンジュゲートポリペプチドの分泌を可能にするための）組織プラスミノーゲン活性化因子シグナル配列、ラット抗CD2抗体由来の抗CD2scFv、LO-CD2a（例えば、米国特許第6,849,258号参照）;柔軟なリンカー;およびSARS-CoV-2 RBD（コドン最適化された）に対するコード配列を融合することによって、本発明者らは、SARS-CoV-2スパイクのRBDとCD2結合ポリペプチドとを含むコンジュゲートポリペプチドを作製した。得られたアミノ酸配列をSEQ ID NO.15として示す。このポリペプチドに対するコドン最適化された核酸配列（SEQ ID NO.16）を合成し、（その第1のイントロンを含む）EF1-αプロモーター配列の下流およびSV40ポリアデニル化配列の上流に、pUC19プラスミド中にクローニングする。
s2-RBDとも呼ばれる抗CD2-RBDコンジュゲートポリペプチドをコードするプラスミドDNA分子を、DNAワクチンとして（0日目に1mgのDNAの電気穿孔によって）2匹のアカゲザルに投与した。RBD単独をコードする35型アデノベクターを用いて、28日目に追加免疫による免疫化を行った（図12）。これらのマカクにおける抗体応答を、初回刺激および追加免疫のためにRBD単独を使用して得られた抗体応答と比較した。結果は、s2-RBDを使用した改善されたピーク抗体応答（幾何平均の2.8倍の増加）およびワクチン接種後24週間残存した持続的抗体応答の増加（幾何平均の5倍の増加;図12、s2-RBDの灰色の平均破線をRBD単独の黒い平均点線と比較せよ）の両方を実証する。
実施例12. ダイアボディを形成する抗CD2一本鎖可変断片に連結されたSARS-CoV-2 RBDドメインを含む二量体化コンジュゲートポリペプチドワクチン
抗CD2 scFv-RBDの二量体化形態を、VH-VLリンカーの長さを5アミノ酸に短縮させることによって設計した（SEQ ID NO.17）。本発明者らは、コンジュゲートポリペプチド免疫原のこの二量体化形態をコードするコドン最適化されたORFを調製した（SEQ ID NO.18）。このコドン最適化されたORFは、発現カセットに、ならびに免疫原性試験のために動物に投与されるDNAおよびアデノウイルスベクターに連続して操作される。
次に、本発明者らは、VH-VLリンカーの長さを5アミノ酸に短縮し、ジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基を導入することによって、より大きな安定性が予測される抗CD2 scFv-RBDの二量体化形態を設計した（SEQ ID NO.19）。この構築物において使用される抗CD2 scFvは、不安定性を引き起こすと予測されるEFループ内の重要な位置に正に帯電した残基を有さない。本発明者らは、抗CD2 scFv-RBDのこの増強された安定性の二量体化形態をコードするコドン最適化されたORFを調製した（SEQ ID NO.20）。このコドン最適化されたORFは、発現カセットに、ならびに免疫原性試験のために動物に投与されるDNAおよびアデノウイルスベクターに連続して操作される。
実施例13. CD2に結合するLFA-3のN末端ドメインに連結されたSARS-CoV-2 RBDドメインを含むコンジュゲートポリペプチドワクチン
遺伝子ワクチンにおける送達のためのコンジュゲートポリペプチド免疫原は、ワクチンレシピエント中で適切な細胞表面受容体に結合する任意のタンパク質配列を使用して設計することができる。ヒトCD58の179残基の外部ドメインは、膜貫通セグメントまたはグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）リンカーのいずれかを介して膜に固定された2つの細胞外免疫グロブリン様ドメインからなる（Dustin et al.,1987b;Wallich et al.,1998）。CD58の95残基の膜遠位N末端ドメイン（1dCD58）は、完全にCD2への接着を担う（Sun et al.）。
以下のタンパク質要素:（細胞からのコンジュゲートポリペプチドの分泌を可能にするための）組織プラスミノーゲン活性化因子シグナル配列、ヒトCD58の第1の細胞外ドメイン、1dCD58;柔軟なリンカー;およびSARS-CoV-2 RBD（コドン最適化された）に対するコード配列を融合することによって、本発明者らは、SARS-CoV-2スパイクのRBDとCD2結合ポリペプチドとを含むコンジュゲートポリペプチドを作製した。得られたアミノ酸配列をSEQ ID NO.21として示す。このポリペプチドに対するコドン最適化された核酸配列（SEQ ID NO.22）を合成し、（その第1のイントロンを含む）EF1-αプロモーター配列の下流およびSV40ポリアデニル化配列の上流に、pUC19プラスミド中にクローニングする。
本発明者らはまた、組織プラスミノーゲン活性化因子シグナル配列、1dCD58、柔軟なリンカーおよびSARS-CoV-2 RBD（B.1.351）（すなわち、SARS-CoV-2株B.1.351由来のRBD）のコード配列を融合することによって、B.1.351（「南アフリカ」）株SARS-CoV-2のRBDとCD2結合ポリペプチドとを含むコンジュゲートポリペプチドを作製した。得られたアミノ酸配列をSEQ ID NO.23として示す。このポリペプチドに対するコドン最適化された核酸配列（SEQ ID NO.24）を合成し、（その第1のイントロンを含む）EF1-αプロモーター配列の下流およびSV40ポリアデニル化配列の上流に、pUC19プラスミド中にクローニングする。
本発明者らは次に、1dCD58-RBD（B.1.351）-コンジュゲートポリペプチド（SEQ ID NO.23）が、ヒト細胞中で発現された場合に、ヒト対象における抗RBD（B.1.351）抗体応答の誘導のためにおそらく必要とされる免疫反応性RBD（B.1.351）を含有することを確認した。ヒト胎児腎臓細胞株、293中に1dCD58-RBD（B.1.351）をコードするプラスミドをトランスフェクションし、2日後に、以下の手順を使用する抗体染色によって細胞内の免疫反応性RBD（B.1.351）タンパク質の存在を確認した。アッセイ-1日目に、ウェルあたり35万個の細胞を6ウェルプレート中に播種した。0日目に、DMEM中の150マイクロリットルの0.1mg/mlPEIを等量のDMEM中の3mcgDNAに添加することによって、ポリエチレンイミン（PEI）トランスフェクションミックスを調製した。このミックスを室温で20分間インキュベートした。2.7mlの完全培地を添加した。複合体化されたDNAを含む培地を6ウェルプレート中の洗浄した293細胞に添加した。一晩インキュベートするためにプレートをインキュベータに戻した。1日目に、トランスフェクションミックスを細胞から除去し、細胞を洗浄し、2mlの新鮮な培地を添加した。2日目に、5％PFAで細胞を固定し、0.05％Triton X-100を含有する緩衝液で洗浄して透過処理し、抗RBD一次抗体と2時間インキュベートし、再度洗浄し、HRPコンジュゲート化二次抗体とともに2時間インキュベートし、洗浄し、TrueBlue HRP基質と5～15分間インキュベートし、最後に水中で消光した。結果（図13C）は、1dCD58-RBD（B.1.351）構築物が、免疫反応性RBD（B.1.351）を含むコンジュゲートポリペプチドを首尾よく産生することを実証している。
実施例14. 抗CD4一本鎖可変断片に連結されたSARS-CoV-2 RBDドメインを含むコンジュゲートポリペプチドワクチン
CD4は、ヘルパーT細胞ならびにいくつかの単球、マクロファージおよび樹状細胞の表面に見出される糖タンパク質である。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーとして、CD4は、細胞の表面に露出したD1～D4として知られる4つの免疫グロブリンドメインを含む。D1ドメインは、抗原提示細胞によってMHCクラスII分子上に提示されたペプチドに応答するヘルパーT細胞の生物学の大部分を規定するMHCクラスII分子のβ2ドメインとの相互作用に寄与する。CD4は、HIV-1エンベロープ糖タンパク質に対する一次侵入受容体でもある。
以下のタンパク質要素:（細胞からのコンジュゲートポリペプチドの分泌を可能にするための）組織プラスミノーゲン活性化因子シグナル配列、ヒト化マウス抗CD4抗体由来の抗CD4 scFv、hu5A8（例えば、AIDS Res Hum Retro 13:933を参照）;柔軟なリンカー;およびSARS-CoV-2 RBD（コドン最適化された）に対するコード配列を融合することによって、本発明者らは、SARS-CoV-2スパイクのRBDとCD4結合ポリペプチドとを含むコンジュゲートポリペプチドを作製した。得られたアミノ酸配列をSEQ ID NO.27として示す。このポリペプチドに対するコドン最適化された核酸配列（SEQ ID NO.28）を合成し、（その第1のイントロンを含む）EF1-αプロモーター配列の下流およびSV40ポリアデニル化配列の上流に、pUC19プラスミド中にクローニングする。
実施例1～7の参考文献
Figure 2023527146000003
Figure 2023527146000004
Figure 2023527146000005
Figure 2023527146000006
Figure 2023527146000007
実施例8～13の参考文献
Figure 2023527146000008
Figure 2023527146000009
Figure 2023527146000010
前述の開示は、理解を明確にするために例示および例としてある程度詳細に記載されているが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および修正が実施され得ることを理解するであろう。さらに、本明細書で提供される各参考文献は、あたかも各参考文献が個別に参照により組み入れられているのと同じ程度まで、その全体が参照により組み入れられる。
例示的な態様
本開示の主題に従って提供される例示的な態様には、特許請求の範囲および以下の態様が含まれるが、これらに限定されない。
1. 哺乳動物において病原体に対する免疫応答を誘導するためのワクチンであって、免疫細胞上に存在する表面タンパク質に特異的に結合するリガンドまたは抗体断片に連結された、該病原体由来の抗原を含むコンジュゲートポリペプチドを含む、ワクチン。
2. 前記表面タンパク質が、シグナル伝達および/または接着に関与する豊富なT細胞表面タンパク質である、態様1のワクチン。
3. 前記豊富なT細胞表面タンパク質がCD2、CD3、CD4またはCD5である、態様2のワクチン。
4. 前記豊富なT細胞表面タンパク質がCD2またはCD3である、態様3のワクチン。
5. 前記免疫細胞がT細胞または抗原提示細胞（APC）である、態様1～4のいずれか1つのワクチン。
6. 前記リガンドが細胞接着分子の外部ドメインである、態様1～5のいずれか1つのワクチン。
7. 前記細胞接着分子がCD58である、態様6のワクチン。
8. 前記表面タンパク質がT細胞によって優先的に発現される、態様1～7のいずれか1つのワクチン。
9. 前記抗体断片が抗体由来のscFv鎖である、態様1～8のいずれか1つのワクチン。
10. 前記コンジュゲートポリペプチドが、脂質アンカー、膜貫通セグメント、多量体化ドメイン、またはこれらの要素の任意の組み合わせをさらに含む、態様1～9のいずれか1つのワクチン。
11. 前記脂質アンカーがグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーである、態様10のワクチン。
12. 脂質アンカーの付加がシグナル配列によって指示される、態様10または11のワクチン。
13. 前記シグナル配列がCD55に由来する、態様12のワクチン。
14. 前記膜貫通セグメントが、PDGF受容体、グリコホリンA、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質に由来する、態様10～13のいずれか1つのワクチン。
15. 前記多量体化ドメインがT4フィブリチンに由来する、態様10～14のいずれか1つのワクチン。
16. 前記多量体化ドメインがFcドメインである、態様10～14のいずれか1つのワクチン。
17. 前記Fcドメインが、前記コンジュゲートポリペプチドのC末端に位置する、態様16のワクチン。
18. 前記FcドメインがヒトIgG1Fcドメインである、態様16または17のワクチン。
19. 前記コンジュゲートポリペプチドが、単一のポリペプチド鎖内に前記抗原と前記リガンドまたは前記抗体断片とを含む融合タンパク質である、態様1～18のいずれか1つのワクチン。
20. 前記抗体断片が抗体由来のscFv鎖であり、該scFvのVHおよびVL領域が柔軟なリンカーによって隔てられている、態様19のワクチン。
21. 前記柔軟なリンカーが12アミノ酸長以上であり、前記コンジュゲートポリペプチドが単量体として前記表面タンパク質に優先的に結合する、態様20のワクチン。
22. 前記柔軟なリンカーが12アミノ酸長より短く、前記コンジュゲートポリペプチドが多量体として前記表面タンパク質に優先的に結合する、態様20のワクチン。
23. 前記多量体が、単量体単位間のジスルフィド結合によって安定化される、態様22のワクチン。
24. 前記柔軟なリンカーが5アミノ酸長である、態様22または23のワクチン。
25. 前記コンジュゲートポリペプチドがtPAリーダー配列をさらに含む、態様1～24のいずれか1つのワクチン。
26. 前記tPAリーダー配列が23アミノ酸長である、態様25のワクチン。
27. 前記病原体由来の第2の抗原をさらに含む、態様1～26のいずれか1つのワクチン。
28. 前記病原体がウイルスである、態様1～27のいずれか1つのワクチン。
29. 前記ウイルスがSARS-CoV-2である、態様28のワクチン。
30. 前記コンジュゲートポリペプチド内に存在する前記抗原が、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質またはその断片を含む、態様29のワクチン。
31. 前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の前記断片が、S1ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む、態様30のワクチン。
32. 前記第2の抗原が、SARS-CoV-2E、M、N、nsp3、nsp4もしくはnsp6タンパク質、またはその断片を含む、態様27～31のいずれか1つのワクチン。
33. 前記第2の抗原が、SARS-CoV-2EおよびMタンパク質を含む融合タンパク質、またはその断片を含む、態様32のワクチン。
34. 前記哺乳動物がヒトである、態様1～33のいずれか1つのワクチン。
35. 電気穿孔または皮下注射用に製剤化されている、態様1～34のいずれか1つのワクチン。
36. 前記コンジュゲートポリペプチドが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、およびSEQ ID NO:21からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、態様1～35のいずれか1つのワクチン。
37. 哺乳動物において病原体に対する免疫応答を誘導するためのワクチンであって、免疫細胞上に存在する表面タンパク質に特異的に結合するリガンドまたは抗体断片に融合した、該病原体由来の抗原を含むコンジュゲートポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ワクチン。
38. 前記表面タンパク質が、シグナル伝達および/または接着に関与する豊富なT細胞表面タンパク質である、態様37のワクチン。
39. 前記豊富なT細胞表面タンパク質がCD2、CD3、CD4またはCD5である、態様38のワクチン。
40. 前記豊富なT細胞表面タンパク質がCD2またはCD3である、態様39のワクチン。
41. 前記免疫細胞がT細胞または抗原提示細胞（APC）である、態様37～40のいずれか1つのワクチン。
42. 前記リガンドが細胞接着分子の外部ドメインである、態様37～41のいずれか1つのワクチン。
43. 前記細胞接着分子がCD58である、態様42のワクチン。
44. 前記表面タンパク質がT細胞によって優先的に発現される、態様37～43のいずれか1つのワクチン。
45. 前記抗体断片が抗体由来のscFv鎖である、態様37～44のいずれか1つのワクチン。
46. 前記コンジュゲートポリペプチドが、脂質アンカー、膜貫通セグメント、多量体化ドメイン、またはこれらの要素の任意の組み合わせをさらに含む、態様33～45のいずれか1つのワクチン。
47. 前記脂質アンカーがグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーである、態様46のワクチン。
48. 脂質アンカーの付加がシグナル配列によって指示される、態様46または47のワクチン。
49. 前記シグナル配列がCD55に由来する、態様48のワクチン。
50. 前記膜貫通セグメントが、PDGF受容体、グリコホリンA、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質に由来する、態様46～49のいずれか1つのワクチン。
51. 前記多量体化ドメインがT4フィブリチンに由来する、態様46～50のいずれか1つのワクチン。
52. 前記多量体化ドメインがFcドメインである、態様46～50のいずれか1つのワクチン。
53. 前記Fcドメインが、前記コンジュゲートポリペプチドのC末端に位置する、態様52のワクチン。
54. 前記FcドメインがヒトIgG1Fcドメインである、態様52または53のワクチン。
55. 前記scFvのVHおよびVL領域が、前記コンジュゲートポリペプチド内で柔軟なリンカーによって隔てられている、態様45～54のいずれか1つのワクチン。
56. 前記柔軟なリンカーが12アミノ酸長以上であり、前記コンジュゲートポリペプチドが単量体として前記表面タンパク質に優先的に結合する、態様55のワクチン。
57. 前記柔軟なリンカーが12アミノ酸長より短く、前記コンジュゲートポリペプチドが多量体として前記表面タンパク質に優先的に結合する、態様55のワクチン。
58. 前記多量体がジスルフィド結合によって安定化されている、態様57のワクチン。
59. 前記柔軟なリンカーが5アミノ酸長である、態様57または58のワクチン。
60. 前記コンジュゲートポリペプチドがtPAリーダー配列を含む、態様37～59のいずれか1つのワクチン。
61. 前記tPAリーダー配列が23アミノ酸長である、態様60のワクチン。
62. 前記病原体由来の第2の抗原をコードする第2のポリヌクレオチドをさらに含む、態様37～61のいずれか1つのワクチン。
63. 前記病原体がウイルスである、態様37～62のいずれか1つのワクチン。
64. 前記ウイルスがSARS-CoV-2である、態様63のワクチン。
65. 前記コンジュゲートポリペプチド内に存在する前記抗原が、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質またはその断片を含む、態様64のワクチン。
66. 前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の前記断片が、S1ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む、態様65のワクチン。
67. 前記第2の抗原が、SARS-CoV-2E、M、N、nsp3、nsp4もしくはnsp6タンパク質、またはその断片を含む、態様62～66のいずれか1つのワクチン。
68. 前記第2の抗原が、SARS-CoV-2EおよびMタンパク質を含む融合タンパク質、またはその断片を含む、態様67のワクチン。
69. 前記哺乳動物がヒトである、態様37～68のいずれか1つのワクチン。
70. 電気穿孔または皮下注射用に製剤化されている、態様37～69のいずれか1つのワクチン。
71. 前記コンジュゲートポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、および/または前記第2の抗原をコードする前記第2のポリヌクレオチドがコドン最適化されている、態様37～70のいずれか1つのワクチン。
72. 前記コンジュゲートポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが第1の発現カセット内に存在し、該ポリヌクレオチドが第1のプロモーターに機能的に連結されており、かつ/または
前記第2の抗原をコードする前記第2のポリヌクレオチドが第2の発現カセット内に存在し、該第2のポリヌクレオチドが第2のプロモーターに機能的に連結されている、
態様37～71のいずれか1つのワクチン。
73. 前記第2のプロモーターが哺乳動物プロモーターである、態様72のワクチン。
74. 前記哺乳動物プロモーターがEF-1αプロモーターである、態様73のワクチン。
75. 前記第1および/または第2の発現カセットがベクター内に存在する、態様37～74のいずれか1つのワクチン。
76. 前記ベクターが裸のDNAとして投与される、態様75のワクチン。
77. 前記ベクターがウイルスベクターである、態様75のワクチン。
78. 前記ウイルスベクターがサイトメガロウイルス（CMV）、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、態様77のワクチン。
79. インビボトランスフェクション試薬をさらに含む、態様37～78のいずれか1つのワクチン。
80. 前記インビボトランスフェクション試薬がin vivo-jetPEI（商標）である、態様79のワクチン。
81. 皮下トランスフェクション用に製剤化されている、態様37～80のいずれか1つのワクチン。
82. 前記ベクターが、
（a）前記第1の発現カセット、または前記第1および第2の発現カセットを含有する、CMVゲノムまたはその一部と;
（b）複製起点を含むバクテリア人工染色体（BAC）配列と;
（c）少なくとも2つのウイルス直列反復配列を含む第1のターミナーゼ複合体認識座位（TCRL1）と;
（d）少なくとも2つのウイルス直列反復配列を含む第2のターミナーゼ複合体認識座位（TCRL2）と
を含む環状CMVベクターであり、
該CMVゲノムまたはその一部は、TCRL1およびTCRL2に隣接しており、それにより、TCRL1からTCRL2まで延びかつ該CMVゲノムまたはその一部を含む、該環状ベクターの第1の領域を画定し;
該BAC配列は、TCRL1からTCRL2まで延びかつ該CMVゲノムまたはその一部を含まない、該環状ベクターの第2の領域中に位置する、
態様78～81のいずれか1つのワクチン。
83. 前記ベクターが、
（a）前記第1の発現カセット、または前記第1および第2の発現カセットを含有する、CMVゲノムまたはその一部と;
（b）単細胞生物において機能する複製起点を含む配列と;
（c）HVターミナーゼ複合体による切断を指示することができる組換え的に導入されたポリヌクレオチド配列を含む1つまたは複数のターミナーゼ複合体認識座位（TCRL）と
を含む環状CMVベクターであり、
該CMVゲノムまたはその一部は、該複製起点を含む配列からTCRLによって隔てられており;
該CMVゲノムまたはその一部は、少なくとも一方の端においてTCRLに接しており;
該複製起点を含む配列は、少なくとも一方の端においてTCRLに接している、
態様78～81のいずれか1つのワクチン。
84. 前記1つまたは複数のターミナーゼ複合体認識座位が、Pac1部位およびPac2部位を含む、態様82または83のワクチン。
85. 前記ターミナーゼ複合体認識座位のすべてが、Pac1部位およびPac2部位を含む、態様84のワクチン。
86. 前記第1のプロモーターがウイルスプロモーターである、態様77～85のいずれか1つのワクチン。
87. 前記ウイルスプロモーターがpp65bプロモーターである、態様86のワクチン。
88. 前記ベクターがCMVベクターであり、該CMVがTowne HCMVである、態様78～87のいずれか1つのワクチン。
89. 前記コンジュゲートポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、およびSEQ ID NO:22からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、態様37～88のいずれか1つのワクチン。
90. 免疫細胞上に存在する表面タンパク質に特異的に結合するリガンドまたは抗体断片に連結された、病原体由来の抗原を含むコンジュゲートポリペプチド。
91. 前記表面タンパク質が、シグナル伝達および/または接着に関与する豊富なT細胞表面タンパク質である、態様90のコンジュゲートポリペプチド。
92. 前記表面タンパク質がCD2、CD3、CD4またはCD5である、態様90または91のコンジュゲートポリペプチド。
93. 前記表面タンパク質がCD2またはCD3である、態様92のコンジュゲートポリペプチド。
94. 前記免疫細胞がT細胞または抗原提示細胞（APC）である、態様90～93のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチド。
95. 前記リガンドが細胞接着分子の外部ドメインである、態様90～94のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチド。
96. 前記細胞接着分子がCD58である、態様95のコンジュゲートポリペプチド。
97. 前記表面タンパク質がT細胞によって優先的に発現される、態様90～96のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチド。
98. 前記抗体断片が抗体由来のscFv鎖である、態様90～94または95～97のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチド。
99. 脂質アンカー、膜貫通セグメント、多量体化ドメイン、またはこれらの要素の任意の組み合わせをさらに含む、態様90～98のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチド。
100. 前記脂質アンカーがグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーである、態様99のコンジュゲートポリペプチド。
101. 脂質アンカーの付加がシグナル配列によって指示される、態様99または100のコンジュゲートポリペプチド。
102. 前記シグナル配列がCD55に由来する、態様101のコンジュゲートポリペプチド。
103. 前記膜貫通セグメントが、PDGF受容体、グリコホリンA、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質に由来する、態様99～102のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチド。
104. 前記多量体化ドメインがT4フィブリチンに由来する、態様99～103のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチド。
105. 前記多量体化ドメインがFcドメインである、態様99～103のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチド。
106. 前記Fcドメインが、前記コンジュゲートポリペプチドのC末端に位置する、態様105のコンジュゲートポリペプチド。
107. 前記FcドメインがヒトIgG1Fcドメインである、態様105または106のコンジュゲートポリペプチド。
108. 前記抗体断片が抗体由来のscFv鎖であり、該scFvのVHおよびVL領域が柔軟なリンカーによって隔てられている、態様98～107のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチド。
109. 前記柔軟なリンカーが12アミノ酸長以上であり、前記コンジュゲートポリペプチドが単量体として前記表面タンパク質に優先的に結合する、態様108のコンジュゲートポリペプチド。
110. 前記柔軟なリンカーが12アミノ酸長より短く、前記コンジュゲートポリペプチドが多量体として前記表面タンパク質に優先的に結合する、態様109のコンジュゲートポリペプチド。
111. 前記多量体が、単量体単位間のジスルフィド結合によって安定化される、態様110のコンジュゲートポリペプチド。
112. 前記柔軟なリンカーが5アミノ酸長である、態様110または111のコンジュゲートポリペプチド。
113. tPAリーダー配列をさらに含む、態様90～112のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチド。
114. 前記tPAリーダー配列が23アミノ酸長である、態様113のコンジュゲートポリペプチド。
115. 前記病原体がウイルスである、態様90～114のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチド。
116. 前記ウイルスがSARS-CoV-2である、態様115のコンジュゲートポリペプチド。
117. 前記抗原がSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質またはその断片を含む、態様116のコンジュゲートポリペプチド。
118. 前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の前記断片が、S1ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む、態様117のコンジュゲートポリペプチド。
119. SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、およびSEQ ID NO:21からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、態様90～118のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチド。
120. （i）組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）シグナル配列と;（ii）CD2、CD3またはCD4に特異的に結合する一本鎖可変断片（scFv）と;（iii）柔軟なリンカーと;（iv）SARS-CoV-2受容体結合ドメイン（RBD）とを含む、コンジュゲートポリペプチド。
121. SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID 25またはSEQ ID NO:27のアミノ酸配列を含む、態様120のコンジュゲートポリペプチド。
122. 態様90～121のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
123. コドン最適化されている、態様122のポリヌクレオチド。
124. SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、態様123のポリヌクレオチド。
125. 態様122～124のいずれか1つのポリヌクレオチドを含む発現カセット。
126. SEQ ID NO:8のヌクレオチド配列を含む、態様125の発現カセット。
127. 態様125または126の発現カセットを含むベクター。
128. プラスミドである、態様127のベクター。
129. アデノウイルスベクターである、態様127のベクター。
130. 態様98～121のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチドを含むダイアボディ。
131. 態様99～121のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチドを含む二量体。
132. 態様90～121のいずれか1つのコンジュゲートポリペプチド、態様122～124のいずれか1つのポリヌクレオチド、態様125または126の発現カセット、態様127～129のいずれか1つのベクター、態様130のダイアボディ、または態様131の二量体を含む、ワクチン。
133. 態様1～89または132のワクチンのいずれかを哺乳動物に投与する工程を含む、該哺乳動物において病原体に対する免疫応答を誘導する方法。
134. 前記ワクチンが、皮下にまたは電気穿孔によって投与される、態様133の方法。
135. 前記方法が、前記コンジュゲートポリペプチド内に存在する前記抗原に対する、前記哺乳動物における中和抗体応答を誘導し、該中和応答が、前記ワクチンによって該哺乳動物において誘導される任意の抗体依存性感染増強（ADEI）よりも実質的に大きい、態様133または134の方法。
136. 前記ワクチンが前記哺乳動物においてADEIを実質的に誘導しない、態様135の方法。
137. 前記第2の抗原に対する、CD4＋およびCD8＋T細胞応答の両方を誘導する、態様133～136のいずれか1つの方法。
138. 態様127または128のベクターを含むDNA初回刺激を電気穿孔によって前記哺乳動物に投与し、その後、RBDをコードするアデノウイルスベクターを用いて追加免疫する工程を含む、態様133～137のいずれか1つの方法。
139. 前記追加免疫が約28日後に行われる、態様138の方法。
140. 前記哺乳動物がヒトである、態様133～139のいずれか1つの方法。
非公式の配列表
Figure 2023527146000011
Figure 2023527146000012
Figure 2023527146000013
Figure 2023527146000014
Figure 2023527146000015
Figure 2023527146000016
Figure 2023527146000017
Figure 2023527146000018
Figure 2023527146000019
Figure 2023527146000020
Figure 2023527146000021

Claims (140)

  1. 哺乳動物において病原体に対する免疫応答を誘導するためのワクチンであって、免疫細胞上に存在する表面タンパク質に特異的に結合するリガンドまたは抗体断片に連結された、該病原体由来の抗原を含むコンジュゲートポリペプチドを含む、ワクチン。
  2. 前記表面タンパク質が、シグナル伝達および/または接着に関与する豊富なT細胞表面タンパク質である、請求項1記載のワクチン。
  3. 前記豊富なT細胞表面タンパク質がCD2、CD3、CD4またはCD5である、請求項2記載のワクチン。
  4. 前記豊富なT細胞表面タンパク質がCD2またはCD3である、請求項3記載のワクチン。
  5. 前記免疫細胞がT細胞または抗原提示細胞（APC）である、請求項1記載のワクチン。
  6. 前記リガンドが細胞接着分子の外部ドメインである、請求項1記載のワクチン。
  7. 前記細胞接着分子がCD58である、請求項6記載のワクチン。
  8. 前記表面タンパク質がT細胞によって優先的に発現される、請求項1記載のワクチン。
  9. 前記抗体断片が抗体由来のscFv鎖である、請求項1記載のワクチン。
  10. 前記コンジュゲートポリペプチドが、脂質アンカー、膜貫通セグメント、多量体化ドメイン、またはこれらの要素の任意の組み合わせをさらに含む、請求項1記載のワクチン。
  11. 前記脂質アンカーがグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーである、請求項10記載のワクチン。
  12. 脂質アンカーの付加がシグナル配列によって指示される、請求項10記載のワクチン。
  13. 前記シグナル配列がCD55に由来する、請求項12記載のワクチン。
  14. 前記膜貫通セグメントが、PDGF受容体、グリコホリンA、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質に由来する、請求項10記載のワクチン。
  15. 前記多量体化ドメインがT4フィブリチンに由来する、請求項10記載のワクチン。
  16. 前記多量体化ドメインがFcドメインである、請求項10記載のワクチン。
  17. 前記Fcドメインが、前記コンジュゲートポリペプチドのC末端に位置する、請求項16記載のワクチン。
  18. 前記FcドメインがヒトIgG1Fcドメインである、請求項16記載のワクチン。
  19. 前記コンジュゲートポリペプチドが、単一のポリペプチド鎖内に前記抗原と前記リガンドまたは前記抗体断片とを含む融合タンパク質である、請求項1記載のワクチン。
  20. 前記抗体断片が抗体由来のscFv鎖であり、該scFvのVHおよびVL領域が柔軟なリンカーによって隔てられている、請求項19記載のワクチン。
  21. 前記柔軟なリンカーが12アミノ酸長以上であり、前記コンジュゲートポリペプチドが単量体として前記表面タンパク質に優先的に結合する、請求項20記載のワクチン。
  22. 前記柔軟なリンカーが12アミノ酸長より短く、前記コンジュゲートポリペプチドが多量体として前記表面タンパク質に優先的に結合する、請求項20記載のワクチン。
  23. 前記多量体が、単量体単位間のジスルフィド結合によって安定化される、請求項22記載のワクチン。
  24. 前記柔軟なリンカーが5アミノ酸長である、請求項22記載のワクチン。
  25. 前記コンジュゲートポリペプチドがtPAリーダー配列をさらに含む、請求項1記載のワクチン。
  26. 前記tPAリーダー配列が23アミノ酸長である、請求項25記載のワクチン。
  27. 前記病原体由来の第2の抗原をさらに含む、請求項1記載のワクチン。
  28. 前記病原体がウイルスである、請求項1記載のワクチン。
  29. 前記ウイルスがSARS-CoV-2である、請求項28記載のワクチン。
  30. 前記コンジュゲートポリペプチド内に存在する前記抗原が、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質またはその断片を含む、請求項29記載のワクチン。
  31. 前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の前記断片が、S1ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む、請求項30記載のワクチン。
  32. 前記第2の抗原が、SARS-CoV-2E、M、N、nsp3、nsp4もしくはnsp6タンパク質、またはその断片を含む、請求項29記載のワクチン。
  33. 前記第2の抗原が、SARS-CoV-2EおよびMタンパク質を含む融合タンパク質、またはその断片を含む、請求項32記載のワクチン。
  34. 前記哺乳動物がヒトである、請求項1記載のワクチン。
  35. 電気穿孔または皮下注射用に製剤化されている、請求項1記載のワクチン。
  36. 前記コンジュゲートポリペプチドが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25およびSEQ ID NO:27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載のワクチン。
  37. 哺乳動物において病原体に対する免疫応答を誘導するためのワクチンであって、免疫細胞上に存在する表面タンパク質に特異的に結合するリガンドまたは抗体断片に融合した、該病原体由来の抗原を含むコンジュゲートポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ワクチン。
  38. 前記表面タンパク質が、シグナル伝達および/または接着に関与する豊富なT細胞表面タンパク質である、請求項37記載のワクチン。
  39. 前記豊富なT細胞表面タンパク質がCD2、CD3、CD4またはCD5である、請求項38記載のワクチン。
  40. 前記豊富なT細胞表面タンパク質がCD2またはCD3である、請求項39記載のワクチン。
  41. 前記免疫細胞がT細胞または抗原提示細胞（APC）である、請求項37記載のワクチン。
  42. 前記リガンドが細胞接着分子の外部ドメインである、請求項37記載のワクチン。
  43. 前記細胞接着分子がCD58である、請求項42記載のワクチン。
  44. 前記表面タンパク質がT細胞によって優先的に発現される、請求項37記載のワクチン。
  45. 前記抗体断片が抗体由来のscFv鎖である、請求項37記載のワクチン。
  46. 前記コンジュゲートポリペプチドが、脂質アンカー、膜貫通セグメント、多量体化ドメイン、またはこれらの要素の任意の組み合わせをさらに含む、請求項37記載のワクチン。
  47. 前記脂質アンカーがグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーである、請求項46記載のワクチン。
  48. 脂質アンカーの付加がシグナル配列によって指示される、請求項46記載のワクチン。
  49. 前記シグナル配列がCD55に由来する、請求項48記載のワクチン。
  50. 前記膜貫通セグメントが、PDGF受容体、グリコホリンA、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質に由来する、請求項46記載のワクチン。
  51. 前記多量体化ドメインがT4フィブリチンに由来する、請求項46記載のワクチン。
  52. 前記多量体化ドメインがFcドメインである、請求項46記載のワクチン。
  53. 前記Fcドメインが、前記コンジュゲートポリペプチドのC末端に位置する、請求項52記載のワクチン。
  54. 前記FcドメインがヒトIgG1Fcドメインである、請求項52記載のワクチン。
  55. 前記scFvのVHおよびVL領域が、前記コンジュゲートポリペプチド内で柔軟なリンカーによって隔てられている、請求項45記載のワクチン。
  56. 前記柔軟なリンカーが12アミノ酸長以上であり、前記コンジュゲートポリペプチドが単量体として前記表面タンパク質に優先的に結合する、請求項55記載のワクチン。
  57. 前記柔軟なリンカーが12アミノ酸長より短く、前記コンジュゲートポリペプチドが多量体として前記表面タンパク質に優先的に結合する、請求項55記載のワクチン。
  58. 前記多量体がジスルフィド結合によって安定化されている、請求項57記載のワクチン。
  59. 前記柔軟なリンカーが5アミノ酸長である、請求項57記載のワクチン。
  60. 前記コンジュゲートポリペプチドがtPAリーダー配列を含む、請求項37記載のワクチン。
  61. 前記tPAリーダー配列が23アミノ酸長である、請求項60記載のワクチン。
  62. 前記病原体由来の第2の抗原をコードする第2のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項37記載のワクチン。
  63. 前記病原体がウイルスである、請求項37記載のワクチン。
  64. 前記ウイルスがSARS-CoV-2である、請求項63記載のワクチン。
  65. 前記コンジュゲートポリペプチド内に存在する前記抗原が、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質またはその断片を含む、請求項64記載のワクチン。
  66. 前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の前記断片が、S1ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む、請求項65記載のワクチン。
  67. 前記第2の抗原が、SARS-CoV-2E、M、N、nsp3、nsp4もしくはnsp6タンパク質、またはその断片を含む、請求項62記載のワクチン。
  68. 前記第2の抗原が、SARS-CoV-2EおよびMタンパク質を含む融合タンパク質、またはその断片を含む、請求項67記載のワクチン。
  69. 前記哺乳動物がヒトである、請求項37記載のワクチン。
  70. 電気穿孔または皮下注射用に製剤化されている、請求項37記載のワクチン。
  71. 前記コンジュゲートポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、および/または前記第2の抗原をコードする前記第2のポリヌクレオチドがコドン最適化されている、請求項37または62記載のワクチン。
  72. 前記コンジュゲートポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが第1の発現カセット内に存在し、該ポリヌクレオチドが第1のプロモーターに機能的に連結されており、かつ/または
    前記第2の抗原をコードする前記第2のポリヌクレオチドが第2の発現カセット内に存在し、該第2のポリヌクレオチドが第2のプロモーターに機能的に連結されている、
    請求項37または62記載のワクチン。
  73. 前記第2のプロモーターが哺乳動物プロモーターである、請求項72記載のワクチン。
  74. 前記哺乳動物プロモーターがEF-1αプロモーターである、請求項73記載のワクチン。
  75. 前記第1および/または第2の発現カセットがベクター内に存在する、請求項72記載のワクチン。
  76. 前記ベクターが裸のDNAとして投与される、請求項75記載のワクチン。
  77. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項75記載のワクチン。
  78. 前記ウイルスベクターがサイトメガロウイルス（CMV）、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項77記載のワクチン。
  79. インビボトランスフェクション試薬をさらに含む、請求項37記載のワクチン。
  80. 前記インビボトランスフェクション試薬がin vivo-jetPEI（商標）である、請求項79記載のワクチン。
  81. 皮下トランスフェクション用に製剤化されている、請求項37記載のワクチン。
  82. 前記ベクターが、
    （a）前記第1の発現カセット、または前記第1および第2の発現カセットを含有する、CMVゲノムまたはその一部と;
    （b）複製起点を含むバクテリア人工染色体（BAC）配列と;
    （c）少なくとも2つのウイルス直列反復配列を含む第1のターミナーゼ複合体認識座位（TCRL1）と;
    （d）少なくとも2つのウイルス直列反復配列を含む第2のターミナーゼ複合体認識座位（TCRL2）と
    を含む環状CMVベクターであり、
    該CMVゲノムまたはその一部は、TCRL1およびTCRL2に隣接しており、それにより、TCRL1からTCRL2まで延びかつ該CMVゲノムまたはその一部を含む、該環状ベクターの第1の領域を画定し;
    該BAC配列は、TCRL1からTCRL2まで延びかつ該CMVゲノムまたはその一部を含まない、該環状ベクターの第2の領域中に位置する、
    請求項78記載のワクチン。
  83. 前記ベクターが、
    （a）前記第1の発現カセット、または前記第1および第2の発現カセットを含有する、CMVゲノムまたはその一部と;
    （b）単細胞生物において機能する複製起点を含む配列と;
    （c）HVターミナーゼ複合体による切断を指示することができる組換え的に導入されたポリヌクレオチド配列を含む1つまたは複数のターミナーゼ複合体認識座位（TCRL）と
    を含む環状CMVベクターであり、
    該CMVゲノムまたはその一部は、該複製起点を含む配列からTCRLによって隔てられており;
    該CMVゲノムまたはその一部は、少なくとも一方の端においてTCRLに接しており;
    該複製起点を含む配列は、少なくとも一方の端においてTCRLに接している、
    請求項78記載のワクチン。
  84. 前記1つまたは複数のターミナーゼ複合体認識座位が、Pac1部位およびPac2部位を含む、請求項82記載のワクチン。
  85. 前記ターミナーゼ複合体認識座位のすべてが、Pac1部位およびPac2部位を含む、請求項84記載のワクチン。
  86. 前記第1のプロモーターがウイルスプロモーターである、請求項77記載のワクチン。
  87. 前記ウイルスプロモーターがpp65bプロモーターである、請求項86記載のワクチン。
  88. 前記ベクターがCMVベクターであり、該CMVがTowne HCMVである、請求項78記載のワクチン。
  89. 前記コンジュゲートポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項37記載のワクチン。
  90. 免疫細胞上に存在する表面タンパク質に特異的に結合するリガンドまたは抗体断片に連結された、病原体由来の抗原を含むコンジュゲートポリペプチド。
  91. 前記表面タンパク質が、シグナル伝達および/または接着に関与する豊富なT細胞表面タンパク質である、請求項90記載のコンジュゲートポリペプチド。
  92. 前記表面タンパク質がCD2、CD3、CD4またはCD5である、請求項90記載のコンジュゲートポリペプチド。
  93. 前記表面タンパク質がCD2またはCD3である、請求項92記載のコンジュゲートポリペプチド。
  94. 前記免疫細胞がT細胞または抗原提示細胞（APC）である、請求項90記載のコンジュゲートポリペプチド。
  95. 前記リガンドが細胞接着分子の外部ドメインである、請求項90記載のコンジュゲートポリペプチド。
  96. 前記細胞接着分子がCD58である、請求項95記載のコンジュゲートポリペプチド。
  97. 前記表面タンパク質がT細胞によって優先的に発現される、請求項90記載のコンジュゲートポリペプチド。
  98. 前記抗体断片が抗体由来のscFv鎖である、請求項90記載のコンジュゲートポリペプチド。
  99. 脂質アンカー、膜貫通セグメント、多量体化ドメイン、またはこれらの要素の任意の組み合わせをさらに含む、請求項90記載のコンジュゲートポリペプチド。
  100. 前記脂質アンカーがグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーである、請求項99記載のコンジュゲートポリペプチド。
  101. 脂質アンカーの付加がシグナル配列によって指示される、請求項99記載のコンジュゲートポリペプチド。
  102. 前記シグナル配列がCD55に由来する、請求項101記載のコンジュゲートポリペプチド。
  103. 前記膜貫通セグメントが、PDGF受容体、グリコホリンA、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質に由来する、請求項99記載のコンジュゲートポリペプチド。
  104. 前記多量体化ドメインがT4フィブリチンに由来する、請求項99記載のコンジュゲートポリペプチド。
  105. 前記多量体化ドメインがFcドメインである、請求項99記載のコンジュゲートポリペプチド。
  106. 前記Fcドメインが、前記コンジュゲートポリペプチドのC末端に位置する、請求項105記載のコンジュゲートポリペプチド。
  107. 前記FcドメインがヒトIgG1Fcドメインである、請求項105記載のコンジュゲートポリペプチド。
  108. 前記抗体断片が抗体由来のscFv鎖であり、該scFvのVHおよびVL領域が柔軟なリンカーによって隔てられている、請求項98記載のコンジュゲートポリペプチド。
  109. 前記柔軟なリンカーが12アミノ酸長以上であり、前記コンジュゲートポリペプチドが単量体として前記表面タンパク質に優先的に結合する、請求項108記載のコンジュゲートポリペプチド。
  110. 前記柔軟なリンカーが12アミノ酸長より短く、前記コンジュゲートポリペプチドが多量体として前記表面タンパク質に優先的に結合する、請求項108記載のコンジュゲートポリペプチド。
  111. 前記多量体が、単量体単位間のジスルフィド結合によって安定化される、請求項110記載のコンジュゲートポリペプチド。
  112. 前記柔軟なリンカーが5アミノ酸長である、請求項110記載のコンジュゲートポリペプチド。
  113. tPAリーダー配列をさらに含む、請求項90記載のコンジュゲートポリペプチド。
  114. 前記tPAリーダー配列が23アミノ酸長である、請求項113記載のコンジュゲートポリペプチド。
  115. 前記病原体がウイルスである、請求項90記載のコンジュゲートポリペプチド。
  116. 前記ウイルスがSARS-CoV-2である、請求項115記載のコンジュゲートポリペプチド。
  117. 前記抗原がSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質またはその断片を含む、請求項116記載のコンジュゲートポリペプチド。
  118. 前記SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の前記断片が、S1ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む、請求項117記載のコンジュゲートポリペプチド。
  119. SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25およびSEQ ID NO:27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項90記載のコンジュゲートポリペプチド。
  120. （i）組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）シグナル配列と;（ii）CD2、CD3またはCD4に特異的に結合する一本鎖可変断片（scFv）と;（iii）柔軟なリンカーと;（iv）SARS-CoV-2受容体結合ドメイン（RBD）とを含む、コンジュゲートポリペプチド。
  121. SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID 25またはSEQ ID NO:27のアミノ酸配列を含む、請求項120記載のコンジュゲートポリペプチド。
  122. 請求項90または請求項121記載のコンジュゲートポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  123. コドン最適化されている、請求項122記載のポリヌクレオチド。
  124. SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:28からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項123記載のポリヌクレオチド。
  125. 請求項122記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット。
  126. SEQ ID NO:8のヌクレオチド配列を含む、請求項125記載の発現カセット。
  127. 請求項125記載の発現カセットを含むベクター。
  128. プラスミドである、請求項127記載のベクター。
  129. アデノウイルスベクターである、請求項127記載のベクター。
  130. 請求項98記載のコンジュゲートポリペプチドを含むダイアボディ。
  131. 請求項99記載のコンジュゲートポリペプチドを含む二量体。
  132. 請求項90もしくは請求項120記載のコンジュゲートポリペプチド、請求項122記載のポリヌクレオチド、請求項125記載の発現カセット、請求項127記載のベクター、請求項130記載のダイアボディ、または請求項131記載の二量体を含む、ワクチン。
  133. 請求項1、37または132のいずれか一項記載のワクチンを哺乳動物に投与する工程を含む、該哺乳動物において病原体に対する免疫応答を誘導する方法。
  134. 前記ワクチンが、皮下にまたは電気穿孔によって投与される、請求項133記載の方法。
  135. 前記方法が、前記コンジュゲートポリペプチド内に存在する前記抗原に対する、前記哺乳動物における中和抗体応答を誘導し、該中和応答が、前記ワクチンによって該哺乳動物において誘導される任意の抗体依存性感染増強（ADEI）よりも実質的に大きい、請求項133記載の方法。
  136. 前記ワクチンが前記哺乳動物においてADEIを実質的に誘導しない、請求項135記載の方法。
  137. 前記第2の抗原に対する、CD4＋およびCD8＋T細胞応答の両方を誘導する、請求項133記載の方法。
  138. 請求項125記載のベクターを含むDNA初回刺激を電気穿孔によって前記哺乳動物に投与し、その後、RBDをコードするアデノウイルスベクターを用いて追加免疫する工程を含む、請求項133記載の方法。
  139. 前記追加免疫が約28日後に行われる、請求項138記載の方法。
  140. 前記哺乳動物がヒトである、請求項133記載の方法。
JP2022570449A 2020-05-19 2021-05-19 免疫応答を誘導するためのコンジュゲートポリペプチドおよびワクチン Pending JP2023527146A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063027250P 2020-05-19 2020-05-19
US63/027,250 2020-05-19
US202063058362P 2020-07-29 2020-07-29
US63/058,362 2020-07-29
PCT/US2021/033259 WO2021236841A2 (en) 2020-05-19 2021-05-19 Conjugate polypeptides and vaccines for inducing immune responses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023527146A true JP2023527146A (ja) 2023-06-27
JPWO2021236841A5 JPWO2021236841A5 (ja) 2024-05-27

Family

ID=78707602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022570449A Pending JP2023527146A (ja) 2020-05-19 2021-05-19 免疫応答を誘導するためのコンジュゲートポリペプチドおよびワクチン

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230087396A1 (ja)
EP (1) EP4153314A4 (ja)
JP (1) JP2023527146A (ja)
AU (1) AU2021273821A1 (ja)
CA (1) CA3183325A1 (ja)
GB (1) GB2612713A (ja)
IL (1) IL298371A (ja)
WO (1) WO2021236841A2 (ja)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1490056A (zh) * 2002-10-18 2004-04-21 ��¡���ɵ°��̲��о����� 针对hiv-1的免疫方法和组合物
CN103415534A (zh) * 2009-03-10 2013-11-27 贝勒研究院 靶向抗原呈递细胞的癌症疫苗
EP3574006A1 (en) * 2017-01-25 2019-12-04 Tessa Therapeutics Ltd. TGF-ß DECOY RECEPTOR

Also Published As

Publication number Publication date
GB2612713A (en) 2023-05-10
AU2021273821A1 (en) 2022-12-15
US20230087396A1 (en) 2023-03-23
EP4153314A4 (en) 2024-05-22
IL298371A (en) 2023-01-01
CA3183325A1 (en) 2021-11-25
GB202219036D0 (en) 2023-02-01
WO2021236841A3 (en) 2021-12-30
WO2021236841A2 (en) 2021-11-25
EP4153314A2 (en) 2023-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rose et al. Glycoprotein exchange vectors based on vesicular stomatitis virus allow effective boosting and generation of neutralizing antibodies to a primary isolate of human immunodeficiency virus type 1
DK2772265T3 (en) Recombinant HCMV and RHCMV vectors and uses thereof
US11034730B2 (en) Dengue virus chimeric polyepitope composed of fragments of non-structural proteins and its use in an immunogenic composition against dengue virus infection
Schell et al. Significant protection against high-dose simian immunodeficiency virus challenge conferred by a new prime-boost vaccine regimen
AU2011252792A1 (en) Recombinant HCMV and RhCMV vectors and uses thereof
KR19990087126A (ko) 합성 사람 면역결핍 바이러스 유전자
US20110014221A1 (en) Hiv combination vaccine and prime boost
CN116348132A (zh) 基于合成的被修饰的痘苗安卡拉（smva）的冠状病毒疫苗
Ljungberg et al. DNA vaccination of ferrets with chimeric influenza A virus hemagglutinin (H3) genes
JP2023527146A (ja) 免疫応答を誘導するためのコンジュゲートポリペプチドおよびワクチン
US11008368B2 (en) Engineered HCV E2 immunogens and related vaccine compositions
CN116761811A (zh) 用于诱导免疫应答的缀合多肽和疫苗
Hidajat et al. Construction and immunogenicity of replication-competent adenovirus 5 host range mutant recombinants expressing HIV-1 gp160 of SF162 and TV1 strains
Boehme et al. Engineering recombinant reoviruses to display gp41 membrane-proximal external-region epitopes from HIV-1
RU2782528C1 (ru) Аденовирусы и способы применения аденовирусов
WO2006132966A2 (en) Webbed hiv envelope immunogens, methods for production and use of same
Johnson Interactions with innate immunity determine the immunogenicity of adenovirus vectors types 5, 28, and 35: Implications for vaccine design
Moodie Sequential Adeno-Associated Virus delivered HIV-1 subtype C Env Glycoproteins as Novel Vaccine Immunogens.
Schlehuber Human immunodeficiency virus epitope display on vesicular stomatitis virus

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230125

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20231016

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240516

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240516