JP2023526069A - 長時間作用アシル化インスリン化合物 - Google Patents

長時間作用アシル化インスリン化合物 Download PDF

Info

Publication number
JP2023526069A
JP2023526069A JP2022569032A JP2022569032A JP2023526069A JP 2023526069 A JP2023526069 A JP 2023526069A JP 2022569032 A JP2022569032 A JP 2022569032A JP 2022569032 A JP2022569032 A JP 2022569032A JP 2023526069 A JP2023526069 A JP 2023526069A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
compound
γglu
pharmaceutically acceptable
acceptable salt
insulin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2022569032A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7456007B2 (ja
Inventor
パトリック ブレナン，シーマス
ベンジャミン フローラ，デイビッド
キッセリョフ，バーディスラフ
リウ，ウェン
アルシデス バレンスエラ，フランシスコ
Original Assignee
イーライ リリー アンド カンパニー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by イーライ リリー アンド カンパニー filed Critical イーライ リリー アンド カンパニー
Publication of JP2023526069A publication Critical patent/JP2023526069A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7456007B2 publication Critical patent/JP7456007B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

現在記載されている化合物は、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病及び／又は高血糖症の治療に関する。より具体的には、記載された化合物は、血中グルコースを低下させる長時間作用アシル化インスリン化合物、そのような化合物を含む薬学的成物、そのような化合物の治療的使用、及びアシル化インスリン化合物を作製するために使用される中間体化合物に関する。

Description

発明の詳細な説明
本発明は、糖尿病及び／又は高血糖症の治療の分野である。特に、本発明は、血中グルコースを低下させる化合物、そのような化合物を含む薬学的組成物、及びそのような化合物の治療的使用に関する。
糖尿病患者のインスリン補充療法は、理想的には、健康な個体の内因性インスリン分泌のパターンに可能な限り近いものであろう。インスリンの生理学的要求は、（ａ）「食事」インスリンとしても知られる、食事に関連した血中グルコース糖を処理するためにインスリンのパルスを必要とする栄養吸収段階、及び（ｂ）「基礎」インスリンとしても知られる、空腹時血中グルコースを維持するために肝臓でのグルコース生産を調節するためのインスリンの持続的な送達を必要とする吸収後段階、の２つの段階に分けることができる。
糖尿病の人々に対する効果的なインスリン療法は、一般に、即効型の食事時の食事インスリンと、１日１回又は２回投与して、食時間の血中グルコースレベルを制御する長時間作用基礎インスリンの、２種類の外因性インスリン製剤の併用を伴う場合がある。模倣することが望ましい可能性がある内因性インスリンのうちの１つ以上の特徴には、ヒトインスリン受容体に対する結合親和性、ヒトＩＧＦ－１受容体よりもヒトインスリン受容体への優先的な結合、ヒトインスリン受容体のリン酸化、及び血中でのグルコース低下が含まれる。
望ましい外因性基礎インスリンは、長時間作用を提供する必要もある、つまり、重大な低血糖のリスクなしに、好ましくは２４時間以上、最も好ましくは１６８時間以上にわたって血中グルコースレベルを制御する。一部の基礎インスリンの作用持続時間は２４時間以上である。長時間作用プロファイルを有し、その間の有効性に著しい変動がない化合物は、夜間低血糖のリスクを低下させ、患者の低血糖のリスクを増加させることなく、毎日の投与時間の変動を大きくさせることを可能にする。したがって、毎週の投与が非常に望ましい。望ましい可能性がある外因性基礎インスリンの特徴には、血流からのクリアランス速度の低減をもたらす可能性のある受容体結合の減弱、及び／又は貯蔵寿命の延長の安定性に寄与し得る複数濃度での化学安定性、及び／又は複数回投与デバイスでの使用を可能にするであろう濃縮製剤における安定性が含まれる。
患者の糖尿病及び／又は高血糖症に対する代替治療の必要性が存在する。いくつかのアシル化インスリン化合物が知られている（例えば、米国特許第７，６１５，５３２号、米国特許第１０，４００，０２１号、ＵＳ９，０４５，５６０、ＵＳ９，０１８，１６１を参照されたい）が、更なる代替治療の必要性が残存する。
本発明は、糖尿病の治療、ヘモグロビンＡ１ｃの低減、及び／又は血中グルコースレベルの低減を必要とする患者においてそれらを行うのに有用な長時間作用アシル化インスリン化合物を提供する。本発明の化合物は、以下の望ましい特徴のうちのいずれかを有する：既知のアシル化インスリン（例えば、インスリンデグルデク）よりも遅いクリアランス速度、増強されたバイオアベイラビリティ、経時的にヒトにおけるより安定した薬物動態プロファイル、及び／又はインビボでの化合物の増加された作用持続時間。加えて、本発明の化合物は低い化学的分解速度を示し、これは、それらが化学的安定性を高め、かつ／又は既知のアシル化インスリンよりも長い貯蔵寿命を達成することができることを示す。
本発明は、式Ｉの化合物：
Figure 2023526069000001
 （式中、Ｘは、－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－、－Ｌｙｓ－（２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸）－、及び－εＬｙｓ－Ｇｌｙ－からなる群から選択される）、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
したがって、式Ｉの化合物は、以下からなる修飾ヒトインスリンである：
Ａ１４位の天然のチロシンアミノ酸残基がグルタミン酸アミノ酸残基に変異している、配列番号１のＡ鎖配列、及びＢ１６位の天然のチロシンアミノ酸残基がヒスチジンアミノ酸残基に変異しており、Ｂ２５位の天然のフェニルアラニンアミノ酸残基がヒスチジンアミノ酸残基に変異しており、Ｂ３０位の天然のスレオニンアミノ酸残基が欠失している、配列番号２のＢ鎖配列（ここで、配列番号１の６位のシステインと配列番号１の１１位のシステインとの間にジスルフィド結合が存在し、配列番号１の７位のシステインと配列番号２の７位のシステインとの間にジスルフィド結合が存在し、かつ配列番号１の２０位のシステインと配列番号２の１９位のシステインとの間にジスルフィド結合が存在し、
Ｂ２９位のリジンアミノ酸残基は、リジン側鎖のエプシロン－アミノ基とＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－、ＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－Ｌｙｓ－（２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸）－、又はＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－εＬｙｓ－Ｇｌｙ－とのコンジュゲーションによって化学修飾されている）、又はその薬学的に許容される塩。
本発明の好ましい実施形態によれば、Ｘは、－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－か、又はその薬学的に許容される塩である。
本発明の別の好ましい実施形態によれば、Ｘは、－Ｌｙｓ－（２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸）－、又はその薬学的に許容される塩である。
本発明の更に好ましい実施形態によれば、Ｘは、－εＬｙｓ－Ｇｌｙ－、又はその薬学的に許容される塩である。
本発明のより好ましい実施形態では、Ｘは、－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－であるか、又はその薬学的に許容される塩である。
本発明の好ましい実施形態は、
Figure 2023526069000002
 である化合物を提供し、これは、配列番号１のＡ鎖、配列番号３のＢ鎖（Ｂ鎖の２９位のリジン側鎖のエプシロン－アミノ基は、ＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－とコンジュゲートすることによって化学修飾される）からなる式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容される塩である。
好ましくは、本発明は、
Figure 2023526069000003
 である化合物を提供し、これは、配列番号１のＡ鎖、配列番号４のＢ鎖（Ｂ鎖の２９位のリジン側鎖のエプシロン－アミノ基は、ＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－Ｌｙｓ－（２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸）－とコンジュゲートすることによって化学修飾される）からなる式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容される塩である。
好ましくは、本発明は、
Figure 2023526069000004
 である化合物を提供し、これは、配列番号１のＡ鎖、配列番号５のＢ鎖（Ｂ鎖の２９位のリジン側鎖のエプシロン－アミノ基は、ＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－εＬｙｓ－Ｇｌｙ－とコンジュゲートすることによって化学修飾される）からなる式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容される塩である。
本出願の別の態様によれば、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物が提供される。
本出願の別の態様は、患者のＩ型及び／又はＩＩ型糖尿病を治療する方法を提供し、これには、それを必要とする患者に、有効量の本発明による式Ｉの化合物、若しくはその薬学的に許容される塩、又は式Ｉの化合物を含む薬学的組成物を投与することが含まれる。
本出願の更なる態様は、患者の高血糖症を治療する方法を提供し、これには、それを必要とする患者に、有効量の本発明による式Ｉの化合物、若しくはその薬学的に許容される塩、又は式Ｉの化合物を含む薬学的組成物を投与することが含まれる。
本出願の別の態様はまた、療法に使用される式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
本出願は、糖尿病の治療及び／又は高血糖症の治療に使用される式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容される塩を更に提供する。
本発明の化合物は、以下に記載する新規中間体化合物を使用して作製される。
本出願の更なる態様によれば、以下の式を有する化合物Ａが提供される：
Figure 2023526069000005
本出願はまた、以下の式を有する化合物Ｂを提供する：
Figure 2023526069000006
本出願はまた、以下の式を有する化合物Ｃを提供する：
Figure 2023526069000007
本発明の別の態様は、化合物Ａ、Ｂ、及びＣのうちのいずれか１つから選択される化合物を使用して、式Ｉの化合物を調製するためのプロセスを提供する。
本出願の別の態様は、Ｉ型及び／若しくはＩＩ型糖尿病並びに／又は高血糖症の治療のための薬物の製造における、式Ｉの化合物のうちのいずれか１つ、又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
本出願は更に、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩の調製又は製造における、化合物Ａ、Ｂ、又はＣのうちのいずれか１つの使用を提供する。
「治療」又は「治療すること」という用語は、本明細書で使用される場合、糖尿病若しくは高血糖症、又はインスリン投与がこれらの状態の症状及び合併症に対抗するか、又はそれらを緩和する目的に適応される他の状態を有する患者の管理及び看護を指す。治療される患者は動物であり、好ましくはヒトである。
本明細書で使用される場合、「有効量」は、本発明の化合物又は本発明の化合物を含む薬学的組成物の量又は用量を指し、これは、患者又は対象に単回又は複数回用量で投与されると、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医が求めている組織、系、動物、哺乳動物、又はヒトに対して、生物学的若しくは医学的応答、又は所望の治療効果を誘発する。用量は、より高い初期負荷用量、その後でより少ない用量を含むことができる。
「患者」、「対象」、及び「個体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、動物を指す。好ましくは、用語はヒトを指す。ある特定の実施形態では、患者、好ましくはヒトは、血中グルコースレベルを低下させることにより恩恵を受けるであろう疾患又は障害又は状態で更に特徴付けられる。
本発明の化合物を含む薬学的組成物は、そのような治療を必要とする患者に非経口投与することができる。非経口投与は、シリンジ、任意でペン様シリンジ、又は機械駆動式注射器を用いた皮下、筋肉内又は静脈内注射によって実施することができる。あるいは、非経口投与は、注入ポンプを用いて行うことができる。
本発明の実施形態は、患者への投与、好ましくは毎週の投与に適した薬学的組成物を提供し、これには、それを必要とする患者に治療有効量の本発明の化合物及び１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を投与することが含まれる。そのような薬学的組成物は、当該技術分野で周知である医薬品用の従来の賦形剤を使用する様々な技術のいずれかによって調製することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２００６））。
特許請求される化合物は、糖尿病及び／又は糖尿病に関連する状態を治療するのに有用な１つ以上の追加の治療剤と同時に、別個に、又は順次組み合わせて使用することができる。特許請求される化合物と組み合わせることができる追加の治療剤の非限定的な例には、インスリン又はインスリン類似体、ビグアナイド、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、ジペプチジルペプチダーゼ－４（「ＤＰＰ－４」）阻害剤、ナトリウム依存性グルコース輸送体（ＳＧＬＴ２）阻害剤、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）若しくはＧＬＰ－１アナログ、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）若しくはＧＩＰアナログ、オキシントモジュリン若しくはオキシントモジュリン類似体などのインクレチン化合物、又は前述の薬剤のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。特許請求される化合物及び追加の治療剤（複数可）は、単一の丸剤、カプセル、錠剤、若しくは注射可能な製剤などの同じ送達経路及びデバイスを介して一緒に投与されるか、あるいは別個の送達デバイス若しくは経路のいずれかで同時に別個に投与されるか、あるいは逐次的に投与されるかのいずれかであり得る。
本明細書で使用される場合、「ＢＨＩ」は生合成ヒトインスリンを意味し、「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を意味し、「Ｂｏｃ」はｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニルを意味し、「ｔＢｕ」はｔｅｒｔ－ブチルを意味し、「ＰｙＢｏｐ」はベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを意味し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを意味し、「ＤＩＥＡ」はジイソプロピルエチルアミンを意味し、「ＤＣＭ」はジクロロメタンを意味し、「ＨＦＩＰ」はヘキサフルオロイソプロパノールを意味し、「ＡＣＮ」はアセトニトリルを意味し、「Ｆｍｏｃ」はフルオレニルメチルオキシカルボニルを意味し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを意味し、「ＴＣＩ」は二鎖インスリンを意味し、「ＳＣＩ」は単鎖インスリンを意味し、「ＴＩＳ」はトリイソプロピルシランを意味し、「ＴＳＴＵ」は（Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートを意味し、「Ｓｕ」はスクシンイミジルを意味し、「ＣｐＢ」はカルボキシペプチダーゼ－Ｂを意味し、「ＲＰ－ＨＰＬＣ」は逆相ＨＰＬＣを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを意味し、「ＨＳＡ」はヒト血清アルブミンを意味し、「「Ｃ２０－ＯＨ」はイコサン二酸を意味し、「γＧｌｕ」は側鎖ガンマカルボキシル基を介して結合したＬ－グルタミン酸を意味し、「Ｌｙｓ」はＬ－リジンを意味し、「εＬｙｓ」は側鎖エプシロン－アミノ基を介して結合したＬ－リジンを意味し、Ｇｌｙはグリシンを意味する。
式Ｉには、インスリンＡ鎖及びＢ鎖のアミノ酸残基の標準的な１文字アミノ酸コードが含まれているが、そのアミノ酸残基の構造が拡張されたリジンであるＢ鎖の残基２９を除く。Ｃ２０－ＯｔＢｕは、ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２－ｔブチルであるか、又は２０－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２０－オキソ－エイコサン酸とも呼ばれ、γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）は、Ｌ－グルタミン酸α－ｔ－ブチルエステルであり、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）は、Ｌ－リジンエプシロンアミノｔ－ブトキシカルボニルである。Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０－ヒト二鎖インスリン（ＴＣＩ；Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０－ＢＨＩ）は、Ａ鎖の１４位のチロシンアミノ酸残基がグルタミン酸アミノ酸残基に変異しており、Ｂ鎖の１６位の天然のチロシンアミノ酸残基がヒスチジンアミノ酸残基に変異しており、Ｂ鎖の２５位の天然のフェニルアラニンアミノ酸残基がヒスチジンアミノ酸残基に変異しており、Ｂ３０位の天然のスレオニンアミノ酸残基が欠失している、修飾ヒトインスリンを指す。
２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸、γＧｌｕ、及びεＬｙｓの構造。
Figure 2023526069000008
実施例１は、Ｂ鎖の２９位のリジンのエプシロン－アミノ基をリンカー－脂肪酸中間体：Ｃ２０－ＯｔＢｕ－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｙ－ＯＨで選択的にアシル化することによって生成され得、ここで、Ｃ２０－ＯｔＢｕは、２０－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２０－オキソ－エイコサン酸であり、γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）は、側鎖ガンマカルボキシル基を介して接続されたＬ－グルタミン酸α－ｔ－ブチルエステルであり、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）は、Ｌ－リジンエプシロン－アミノｔ－ブトキシカルボニルであり、Ｇｌｙはグリシンである。
実施例２は、Ｂ鎖の２９位のリジンのエプシロン－アミノ基をリンカー－脂肪酸中間体：Ｃ２０－ＯｔＢｕ－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－（２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸）－ＯＨで選択的にアシル化することによって生成され得、ここで、Ｃ２０－ＯｔＢｕは、２０－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２０－オキソ－エイコサン酸であり、γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）は、側鎖ガンマカルボキシル基を介して接続されたＬ－グルタミン酸α－ｔ－ブチルエステルであり、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）は、Ｌ－リジンエプシロン－アミノｔ－ブトキシカルボニルである。
実施例３は、Ｂ鎖の２９位のリジンのエプシロン－アミノ基をリンカー－脂肪酸中間体：Ｃ２０－ＯｔＢｕ－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－εＬｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｙ－ＯＨで選択的にアシル化することによって生成され（ここで、Ｃ２０－ＯｔＢｕは、２０－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２０－オキソ－エイコサン酸であり、γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）は、側鎖ガンマカルボキシル基を介して接続されたＬ－グルタミン酸α－ｔ－ブチルエステルであり、εＬｙｓ（Ｂｏｃ）は、側鎖エプシロン－アミノ基を介して接続されたＬ－リジンアルファアミノｔ－ブトキシカルボニルであり、Ｇｌｙはグリシンである）、続いて酸不安定Ｂｏｃ及びｔＢｕ基が除去され得る。
式Ｉの化合物の生成は、３つの主な段階で起こり得る：１）Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０－ＢＨＩの生成、２）リンカー－脂肪酸中間体の合成、並びに３）式Ｉの化合物を単離するためのアシル化、脱保護、精製及び塩交換。
本化合物のインスリン部分は、組換えＤＮＡ技法を使用した前駆体タンパク質分子の産生などにより、当業者に知られている様々な技法によって調製することができる。ｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含むＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。本明細書に記載される前駆体タンパク質分子をコードするコード配列は、遺伝子コードの重複又は縮重の結果として変化し得る。本発明の前駆体タンパク質を産生するために、ＤＮＡを宿主細胞に導入することができる。適切な宿主細胞は、前駆体タンパク質を産生するための発現系で一過性に又は安定してトランスフェクト又は形質転換される。宿主細胞は、大腸菌のＫ１２株又はＢ株などの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞などの哺乳動物細胞であり得る。
発現ベクターは、典型的には、エピソーム、又は宿主染色体ＤＮＡの一体化した部分のいずれかとして、宿主生物中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたそれらの細胞の選択を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、及びジヒドロ葉酸レダクターゼを含む。
本発明の化合物は、当技術分野で知られている様々な手順、並びに以下に記載の方法によって調製され得る。記載される経路の各々についての具体的な合成工程は、本明細書に記載の化合物を調製するための異なる方法において組み合わせることができる。実施例２及び３は、実施例１と同様の方法で調製される。
式Ｉのアシル化インスリンの調製
実施例１
Figure 2023526069000009
 実施例１は、配列番号１のＡ鎖、配列番号３のＢ鎖（Ｂ鎖の２９位のＬｙｓは、ＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－とコンジュゲートすることによって化学修飾される）からなる。
実施例１の合成の概要：実施例１は、成熟生合成Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０－ヒト二鎖インスリン（ＴＣＩ；Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０－ＢＨＩ）のＢ鎖の２９位のリジンのエプシロン－アミノ基の選択的アシル化、又は化合物Ａ（Ｃ２０－ＯｔＢｕ－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ－（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）と指定されるリンカー－脂肪酸中間体を用いた単鎖インスリン（ＳＣＩ；プレプロインスリンＡ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０－ＢＨＩ）構築物のＢ鎖の２９位のリジンの類似のエプシロン－アミノ基の直接アシル化によって生成される。好ましい方法は、プレプロインスリンＳＣＩ構築物のアシル化である。インスリン分子のＡ１及びＢ１アミノ末端がそれぞれＣ－ペプチド及びリーダー配列によって遮断されているため、この方法により、Ｂ鎖の２９位のリジンのエプシロン－アミノ基のアシル化効率が高くなる。実施例１の完全に成熟した二鎖生成物は、アシル化及びＴＦＡ脱保護工程の後で、ＣｐＢ及びトリプシンによる酵素消化によって達成される。ＳＣＩ構築物のＮ末端のアシル化が発生し、二重アシル化副生成物をもたらしても、リーダー配列の酵素的除去により、この物質も目的の生成物に変換される。
分子の生成は、次の３つの主要な段階で発生する：
１）単鎖プレプロインスリン構築物（ＳＣＩ）のＥ．ｃｏｌｉ発現及び精製：これは、好ましいアシル化方法に使用され得るか、又は成熟二鎖インスリン類似体（ＴＣＩ、Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０－ＢＨＩ）に酵素的に処理される；
２）リンカー脂肪酸中間体（化合物Ａ）の合成；並びに
３ａ）ＴＣＩのアシル化、脱保護、又は３ｂ）ＳＣＩのアシル化、脱保護、及び酵素消化、その後の精製及び塩交換により、実施例１を得る。
ＳＣＩインスリン構築物を生成するために、新しい発現ベクターが開発され、Ｅ．ｃｏｌｉ発酵で使用される。これは以下の配列（配列番号７）から構成される。
Figure 2023526069000010
ここで、残基１～３４はリーダーペプチドを構成し、残基３５～６３はＢ鎖（ｄｅｓＢ３０Ｔ）を構成し、残基６４～９７は修飾Ｃ－ペプチド（天然のプロインスリン番号付け規則を使用したｄｅｓ６４Ｋ）を構成し、残基９８～１１８はＡ鎖を構成する。ジスルフィド結合は、天然のインスリンジスルフィド結合に対応する。ジスルフィド結合は、Ｃ４１とＣ１０４との間、Ｃ５３とＣ１１７との間、及びＣ１０３とＣ１０８との間にある。ＣｐＢとトリプシンによる酵素消化により、完全に成熟したＴＣＩ類似体が生成される。
Figure 2023526069000011
ジスルフィド結合は、Ｃ７（配列番号１）とＣ７（配列番号８）との間、Ｃ２０（配列番号１）とＣ１９（配列番号８）との間、及びＣ６（配列番号１）とＣ１１（配列番号１）との間にある。ＳＣＩ及びＴＣＩ構築物の両方が、精製のために標準的なＲＰ－ＨＰＬＣカラムに通され、アシル化反応の前に固体のＴＦＡ塩として凍結乾燥されることに留意する。リンカー脂肪酸分子は、固相合成を使用して生成される。この分子は、溶液相法のみを使用して、又は固相法と組み合わせて生成することができる。
ＴＣＩ又はＳＣＩ Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０－ＢＨＩへのリンカー脂肪酸のコンジュゲーションは、Ｂｏｃ／ｔＢｕ保護アミノ酸ベースのリンカー脂肪酸の溶解性により、乾燥有機溶媒（ＤＭＳＯ）中で行われる。しかしながら、有機溶媒の使用を最小限に抑えるために、リンカー脂肪酸を水溶液に可溶化するために、別の保護／脱保護スキームを考案することができる。同様に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用してＢｏｃ／ｔＢｕ保護基を除去する酸性の化学変換を、別の手段で達成することができる。
化合物Ａのリンカー脂肪酸分子は、固相合成を使用して生成される
化合物Ａ（Ｃ２０－ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｙ－ＯＨは、固相ペプチド合成によって生成される。Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（７６９ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、樹脂に対して１．５ｅｑ．）を、ＰｙＢｏｐ（８４９ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、樹脂に対して１．４９ｅｑ．）、及び１０ｍＬのＤＭＦ中のＤＩＥＡ（１５２０ｕｌ、８．７ｍｍｏｌ、８ｅｑ．）と２分間混合し、ＤＣＭで事前に膨潤し、ＤＭＦで事前に洗浄したＨ－Ｇｌｙ－２－クロロトリチル－クロリド樹脂（１．１ｇ、０．９９ｍｍｏｌ／ｇ、１．１ｍｍｏｌ；Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＲＨＧ－１１６０－ＰＩ）を含む反応槽に移した。スラリーを１．５時間混合し、濾過し、次いで樹脂をＤＭＦでよく洗浄する（カイザーテストは陰性である）。樹脂を２０％ピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍＬ、３０分）で処理することにより、Ｆｍｏｃ保護基を除去する。樹脂（４０ｍＬ）のＤＭＦ洗浄後、カイザーテストは陽性であり、最終生成物は、Ｈ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｙ－２－クロロトリチル－クロリド樹脂（理論上は１．１ｍｍｏｌ）である。
１０ｍＬのＤＭＦ中のＤＩＥＡを塩基（１５２０μｌ、８．７ｍｍｏｌ、８．０ｅｑ）として使用して、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ（７０１ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を、ＰｙＢｏｐ（８４５ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．４９ｅｑ．）で事前に活性化し（２分）、樹脂に移す。スラリーを３時間混合し、濾過し、樹脂をＤＭＦでよく洗浄した（カイザーテストは陰性である）。樹脂を２０％ピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍＬ、３０分）で処理し、続いて樹脂をＤＭＦで洗浄する（４０ｍＬ、カイザー試験は陽性）ことにより、Ｆｍｏｃ保護基を除去する。２番目及び３番目のＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ残基は、１．５時間のカップリング時間を使用して上記の条件を繰り返すことによって樹脂にカップリングされる。
最後のＦｍｏｃ保護基を除去した後、１０ｍＬのＤＭＦ中のＤＩＥＡを塩基（１５２０μｌ、８．７ｍｍｏｌ、８．０ｅｑ）として使用して、２０－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２０－オキソ－イコサン酸（６６０ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を、ＰｙＢｏｐ（８４５ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．４９ｅｑ．）で事前に活性化し（２分）、樹脂に移す。スラリーを３時間混合し、濾過し、樹脂をＤＭＦでよく洗浄した（カイザーテストは陰性である）。樹脂からの切断：３０％ＨＦＩＰ／ＤＣＭ（２０ｍＬ）と１時間混合することにより、保護されたリンカー－脂肪酸を樹脂から切断する。樹脂を濾別し、ＤＣＭでよくすすぐ。合わせた濾液を真空中で蒸発させて油状物にする。残留油状物をＡＣＮ（１５～２０ｍＬ）で希釈し、再び真空中で蒸発させて油状物にする。試料を再びＡＣＮ（１５～２０ｍＬ）に溶解し、真空中で蒸発させて油状物を形成する。穏やかな窒素流により残留ＡＣＮを蒸発させて、２．３グラムの粗製の非晶質固体を得る（理論的収量＝１．４グラム）。
精製：粗製試料を２ｍＬのＤＭＦ及び２０ｍＬのＡＣＮ（フラスコの洗浄を含む）に溶解する。水を添加して、３５ｍＬの濁った溶液を得る。更に１０ｍＬのＡＣＮを添加して、透明な溶液を得る（総体積は４５ｍＬ（３３％水溶液）に相当する）。試料をセミ分取シアノＲＰ－ＨＰＬＣカラム（ＳｉｌａＣｈｒｏｍ ＸＤＢ１－ＣＮ；１０μｍ、１００Å；２．１ｘ２５ｃｍ）に充填することにより精製を行う。４０～７５％Ｂ勾配を使用して、６０℃で１５ｍＬ／分で、７１分かけて試料を溶出する（Ａ緩衝液＝水中０．１５％ＴＦＡ及びＢ緩衝液＝ＡＣＮ）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣにより所望の生成物を含むと決定された画分をプールし、凍結し、凍結乾燥して、６９６ｍｇの化合物Ａを白色の無定形固体として得る（理論５２％；ＲＰ－ＨＰＬＣによる純度９１％；観測ＭＷ＝１２３９．６ダルトン；理論ＭＷ＝１２３９．６５ダルトン）。
化合物Ｂ（Ｃ２０－ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－（２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸）－ＯＨを、実質的に化合物Ａの合成の手順に記載されているように調製するが、出発樹脂をＨ－（２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸）－２－クロロトリチル－クロリド樹脂（１．８ｇ、０．６２ｍｍｏｌ／ｇ、１．１ｍｍｏｌ；Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＲＨＸ－１１０７４－ＰＩ）に変更する。化合物Ｂは、ＲＰ－ＨＰＬＣにより白色の無定形固体として単離される。観測ＭＷ＝１３２７．５ダルトン；理論ＭＷ＝１３２７．７３ダルトン。
化合物Ｃ（Ｃ２０－ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－εＬｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｙ－ＯＨを、実質的に化合物Ａの合成手順に記載されているように調製するが、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨビルディングブロックをＢｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨに変更する。化合物Ｃは、ＲＰ－ＨＰＬＣにより白色の無定形固体として単離される。観測ＭＷ＝１２３９．５ダルトン；理論ＭＷ＝１２３９．６５ダルトン。
実施例１を単離するためのアシル化、脱保護、精製及び塩交換
アシル化：化合物Ａ（（Ｃ２０－ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）（６０．８ｍｇ；０．０４３７ｍｍｏｌ；１．２ｅｑ．；上に記載の合成）及びＴＳＴＵ（１２．０４ｍｇ ０．０４０ｍｍｏｌ；１．１ｅｑ．）を、２００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解する。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、２５．３μＬ；０．１４５ｍｍｏｌ；４ｅｑ．）を、この溶液に添加し、得られた混合物を室温で３０分間インキュベートして、ＤＭＳＯ中に化合物Ａ－ＯＳｕエステルを生成し、直接使用する。
二鎖インスリンＡ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０－ＢＨＩ（ＴＦＡ塩；２０５ｍｇ；０．０３６４ｍｍｏｌ）の溶液に、２ｍＬの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を溶解し、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ；８１．６μＬ ０．５４６ｍｍｏｌ、１５ｅｑ．、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ３３４８２）を添加し、その直後に乾燥ＤＭＳＯ中の上記化合物Ａ－ＯＳｕエステルを添加する。反応混合物を周囲温度で１２分間撹拌し、ジエチルエーテル／ＤＣＭ／ＴＦＡ（３０：１０：０．２ｖ／ｖ；４０ｍＬ体積）の混合物に添加する。得られた白色の沈殿物を遠心分離により単離し、ジエチルエーテルで１回粉砕する。
脱保護（Ｂｏｃ及びＯｔＢｕ基の除去）：上記のエーテルで湿った白色の沈殿物を、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／水の混合物（９２．５：５．０：２．５ｖ／ｖ；５ｍＬ）で２０分間処理する。ジエチルエーテル（４０ｍＬ）を添加し、得られた沈殿物を遠心分離により収集し、エーテルで１回洗浄し、乾燥させる。逆相（ＲＰ）－ＨＰＬＣ分析は、脱保護工程が完了したことを示す（９％未反応のＡ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０－ＢＨＩ；６１％のＢ２９－アシル化生成物；１３％のＡ１、Ｂ２９－ビス－アシル化生成物）。
精製：上記の粗製生成物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８／ＡＣＮ（６０：４０ｖ／ｖ；１５ｍＬ）に溶解する。ストリップを使用したｐＨ測定は、２～３の酸性ｐＨを示す。レベルは、２ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８）を添加することにより調整し、溶液もｐＨ８にする。Ａ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８／ＡＣＮ（６０／４０ｖ／ｖ）及びＢ緩衝液：０．５ＮａＣｌ／ＡＣＮ（６０／４０ｖ／ｖ）を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８を使用して、ＧＥ Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ陰イオン交換カラム（２．６ｘ１０ｃｍ）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを、最初の精製工程として行う。試料をカラムに充填し、安定したＵＶベースラインに達するまでＡ緩衝液で洗浄する。試料を多段階勾配で溶出する：１分間にわたって０～８％のＢ、５９分間にわたって８～５０％のＢ、最後に９０％のＢを１２分間保持する。流量を１０ｍＬ／分に設定し、２２５ｎｍ及び２８０ｎｍでＵＶ監視を行い、画分収集時間を０．５分に設定する。Ｗａｔｅｒｓ Ｘ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８、４．６ｘ５０ｍｍカラムを備えた分析用ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して、所望の生成物を含む画分を特定する。所望画分をプールし（総体積約８０ｍＬ）、ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で２００ｍＬに希釈する。
ＲＰ－ＨＰＬＣによる精製：上記の希釈画分をＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８カラム（２．１×２５ｃｍ）に充填し、標準的なＴＦＡ／水／ＡＣＮ勾配を使用して更に精製する。緩衝液Ａ＝０．１５％ＴＦＡ／水及び緩衝液Ｂ＝ＡＣＮ。試料を多段階勾配で溶出する：１分間にわたって０～１０％Ｂ、次に１５ｍＬ／分の流量で、７１分間にわたって１０～４５％Ｂ、画分収集時間を０．５分に設定し、カラム温度は５０℃である。ＵＶ監視は、２２５ｎｍ及び２８０ｎｍで行われる。Ｗａｔｅｒｓ Ｘ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８、４．６ｘ５０ｍｍカラムを備えた分析用ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して、所望の生成物を含む画分を特定する。所望の画分をプールし（総体積約１１３ ｍＬ；ＲＰ－ＨＰＬＣにより９９．８％）。
塩交換、ＨＣｌ塩への変換：塩ＨＣｌ変換に使用される溶出緩衝液は、Ａ１緩衝液：０．１Ｍ塩化アンモニウム水溶液及びＡ２緩衝液：緩衝液Ｂ：ＡＣＮを含む０．０１％ＨＣｌである。上記のプールした画分を水で２００ｍＬに希釈し、Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８カラム（２．１ｘ２５ｃｍ）ＨＰＬＣカラムに再充填する。カラムを３カラム体積のＡ１緩衝液で洗浄し、続いて３カラム体積のＡ２緩衝液で洗浄する。２２５ｎｍ及び２８０ｎｍでＵＶ監視しながら、試料を、１分間にわたって０～１０％（Ａ２－Ｂ）、次いで７１分間にわたって１０～７０％（Ａ２－Ｂ）の勾配を使用して溶出する。所望の生成物を含む画分を分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８、４．６ｘ５０ｍｍ）により特定し、プールし、凍結し、凍結乾燥して、実施例１の化合物を白色の粉末（１５３ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ；全体的な収率６４％）として得る。純度は分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで確認され、９８．９％であることがわかった。ＥＳＭＳデコンボリューション処理されたスペクトル：観測ＭＷ：６５３１．２ダルトン；理論ＭＷ：６，５３３．４ダルトン。
ＳＣＩのアシル化の代替方法：化合物Ａ（（Ｃ２０－ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）（５８４．６ｍｇ；０．４２４ｍｍｏｌ；３．５ｅｑｕｉｖ）及びＴＳＴＵ（１２５．６ｍｇ ０．４１７ｍｍｏｌ；３．４ｅｑ．）を１．０ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解する。ＤＩＥＡ（１６８．３μＬ；０．９６６ｍｍｏｌ；８ｅｑ．）を添加し、得られた混合物を室温で３０分間インキュベートして、ＤＭＳＯ中にＡ－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミドエステル（化合物Ａ－ＯＳｕエステル）を生成し、直接使用する。
１６ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解したＳＣＩ－Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０－ＢＨＩ（ＴＦＡ塩；１５８７ｍｇ；０．１２１ｍｍｏｌ）の溶液に、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ；４５２μＬ ３．０２ｍｍｏｌ、２５ｅｑ．、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ３３４８２）を添加し、続いてＤＭＳＯ中の化合物Ａ－ＯＳｕエステルを、（１．１１ｅｑ．、０．４ｅｑ．、０．４ｅｑ．、０．７ｅｑ．、０．４ｅｑ．）の分量で各分量約１０分間隔で添加する。反応の進行は、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣによって監視される。反応混合物を周囲温度で合計６０分間撹拌した後、５０ｍＬの２つの等分に分割し、ジエチルエーテル／ＤＣＭ／ＴＦＡ（３０：１０：０．２ｖ／ｖ；４０ｍＬ体積）の混合物で満たす。得られた白色の沈殿物を遠心分離により単離し、洗浄し、３０ｍＬのジエチルエーテルで２回粉砕する。
脱保護（Ｂｏｃ及びＯｔＢｕ基の除去）：上記のエーテルで湿った白色の沈殿物を、ＴＦＡ／トリイソプロピルシランの混合物（ＴＩＳ；Ａｌｄｒｉｃｈ）／水（９２．５：５．０：２．５ｖ／ｖ；１０ｍＬ）で３０分間処理する。各混合物に、ジエチルエーテル（４０ｍＬ）を添加し、得られた沈殿物を遠心分離により収集し、エーテルで１回洗浄する。収集したペレットを完全に乾燥させて残留エーテルを除去し、粉砕して微粉末にする。ＲＰ－ＨＰＬＣ分析は、脱保護工程が完了したことを示す（４％未反応のＳＣＩ－Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０－ＢＨＩ；５１％のＢ２９－アシル化生成物；３８％のＮ末端、Ｂ２９ビス－アシル化生成物）。
酵素消化（リーダー配列及びＣ－ペプチドの除去）：乾燥粉末粗製生成物を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８（６００ｍＬ）に完全に溶解する。この溶液に、６．０ｍＬの０．１Ｍ ＣａＣｌ２溶液、６．３６３ｍＬのカルボキシペプチダーゼ－Ｂ原液（水中２．９ｍｇ／ｍＬ）、及び１．５８７ｍＬのトリプシン原液（水中１．０ｍｇ／ｍＬ）を添加する。溶液を室温で１２０分間インキュベートする。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＬＣ－ＭＳ分析により、実施例１の成熟化合物（ＩＦＡ－１９７）の完全な生成が確認される。溶液を４５ｍＬの氷酢酸で酸性化する（ｐＨ試験紙によりｐＨ２～３）。
分取ＲＰ－ＨＰＬＣによる消化生成物の単離：上記の酸性消化溶液に含まれる所望の生成物は、一連の分取ＲＰ－ＨＰＬＣ精製操作において単離される。一般に、所望の生成物は、０．０５％ＴＦＡを含む線形水／ＡＣＮ勾配を使用してＲＰ－ＨＰＬＣカラムから溶出され、所望の生成物を含む画分がプールされ、凍結され、凍結乾燥される。この工程中に所望の純度が達成される場合は、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーを省略することができる。
分取ＡＥＸクロマトグラフィーによる初期精製工程（任意）：Ａ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８／ＡＣＮ（６０／４０ ｖ／ｖ）及びＢ緩衝液：０．５ＮａＣｌ／ＡＣＮ（６０／４０ｖ／ｖ）を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８を使用して、ＧＥ Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ陰イオン交換カラム（２．６ｘ１１．５ｃｍ）を用いたＡＥＸを行って、任意の残りのＣ－ペプチド又はリーダー配列を除去する。凍結乾燥粉末の２つのバッチを、１２ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８／４０％ＡＣＮ（追加の１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８緩衝液を用いて、ｐＨ８にする）で溶解する。その後、各溶液を１００％Ａ緩衝液で平衡化し、安定したＵＶベースラインに達するまでＡ緩衝液で洗浄したＡＥＸカラムに充填する。試料を、６０分間にわたって０～５０％のＢ、及び１００％のＢを１２分間保持する線形勾配で溶出する。流量を１０ｍＬ／分に設定し、２２５ｎｍ及び２８０ｎｍでＵＶ監視を行い、画分収集時間を０．５分に設定する。
Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８、４．６ｘ５０ｍｍカラムを備えた分析用ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して、所望の生成物を含む画分を特定する。所望の画分をプールし（全体積２２５ｍＬ）、脱塩／ＨＣｌ変換工程まで４℃で保存する。
塩交換；ＨＣｌ塩への変換：Ａ１緩衝液：０．１Ｍ塩化アンモニウム水溶液及びＡ２緩衝液：緩衝液Ｂ：ＡＣＮを含む０．０１％ＨＣｌを用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム（２．１ｘ２５ｃｍ、５μｍ、１００Å）を使用した分取ＲＰ－ＨＰＬＣにより、脱塩とＨＣｌ塩形態への変換とを同時に達成する。ＡＥＸ精製工程からのプールされた溶液を、３つの等しい部分（それぞれ７５ｍＬ）に分割する。各部分を７５ｍＬのｍｉｌｌｉ－Ｑ水及び１．５ｍＬの氷酢酸で希釈する。各溶液（約１５１ｍＬ）を、Ａ１緩衝液で平衡化し、２カラム体積のＡ１緩衝液、２カラム体積のＡ２緩衝液で洗浄したＲＰ－ＨＰＬＣカラムに充填する。試料を、１分間にわたって５～１０％（Ａ２Ｂ）、次いで、１５ｍＬ／分で、５５℃で７１分間にわたって１０～４０％（Ａ２Ｂ））の線形勾配で溶出する。所望の生成物を含む画分をＲＰ－ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８、４．６ｘ５０ｍｍ）により特定し、プールし、凍結し、凍結乾燥して、実施例１のＨＣｌ塩を白色の無定形粉末（３５４ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ；全体的な収率４５％）として得る。純度は分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで確認され、９９％であることがわかった。ＥＳＭＳ：デコンボリューション処理されたスペクトル：観測ＭＷ：６５３１．２ダルトン；理論ＭＷ：６，５３３．４ダルトン。
実施例２
Figure 2023526069000012
 実施例２は、配列番号１のＡ鎖、配列番号４のＢ鎖（Ｂ鎖の２９位のＬｙｓ側鎖のエプシロン－アミノ基は、ＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－Ｌｙｓ－（２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸）－とコンジュゲートすることによって化学修飾される）からなる式Ｉの化合物である。
実施例２は、（（Ｃ２０－ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－（２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸）－ＯＨ）（化合物Ｂ）をアシル化工程で使用することを除き、実質的に実施例１の手順に記載されるように調製される。ＥＳＭＳ：デコンボリューション処理されたスペクトル：観測ＭＷ：６６２０．１ダルトン；理論ＭＷ：６，６２１．５ダルトン。
実施例３
Figure 2023526069000013
 実施例３は、配列番号１のＡ鎖、配列番号５のＢ鎖（Ｂ鎖の２９位のＬｙｓ側鎖のエプシロン－アミノ基は、ＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－εＬｙｓ－Ｇｌｙ－とコンジュゲートすることによって化学修飾される）からなる式Ｉの化合物である。
実施例３は、（（Ｃ２０－ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－εＬｙｓ（Ｂｏｃ）－（Ｇｌｙ）－ＯＨ）（化合物Ｃ）をアシル化工程で使用することを除き、実質的に実施例１の手順に記載されるように調製される。ＥＳＭＳデコンボリューション処理されたスペクトル：観測ＭＷ：６５３２．０ダルトン；理論ＭＷ：６，５３３．４ダルトン。
インビトロ受容体親和性
組換えｈＩＲ－Ａ、ｈＩＲ－Ｂ、又はｈＩＧＦ－１Ｒを過剰発現する、安定してトランスフェクトされた２９３ＨＥＫ細胞からの分画遠心分離工程を使用して調製された膜を使用して、実施例１、２、及び３、並びに対照化合物（生合成ヒトインスリン（ＢＨＩ）、及びインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１））を、ヒトインスリン受容体（ｈＩＲ）及びヒトＩＧＦ－１受容体（ｈＩＧＦ－１Ｒ）シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）競合的放射性リガンド結合アッセイにおいて試験する。
安定してトランスフェクトされた細胞株は、ｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドを使用して受容体ｃＤＮＡをヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にサブクローニングし、続いてジェネテシンで選択することにより調製される。生成された細胞株は、ヒトＩＲ－Ａ、Ｃ末端Ｃ９タグ（ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号６））を含むヒトＩＲ－Ｂ、ヒトＩＧＦ－１Ｒ、及びＣ末端Ｃ９タグ（ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ）を含むラットＩＲ－Ａである。細胞を、５％ＣＯ２の加湿環境で成長させる。典型的には、受容体に応じて、継代６～１２までの細胞ペレットを、膜の調製のために凍結する。
凍結した細胞ペレットを、５０ｍＬの緩衝液当たり１つのＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤錠およびＥＤＴＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含む氷冷ホモジナイゼーション／再懸濁緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で解凍する。オーバーヘッドモーター駆動のＴｅｆｌｏｎ－ｇｌａｓｓ Ｐｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーで１５～２０ストロークを使用して細胞をホモジナイズし、続いて４℃で１０分間、１１００×ｇで遠心分離する。上清を氷上で保存し、ペレットを前と同じようにホモジナイズし、４℃で１０分間、１１００×ｇで遠心分離する。全ての上清を合わせ、続いて４℃で６０分間、３５，０００×ｇで遠心分離する。ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液（４～５ｍＬ／ｇの開始細胞ペースト）に再懸濁し、液体窒素で急速凍結した後、－８０℃で保存する。タンパク質濃度は、標準としてＢＳＡを含むビシンコニン酸（ＢＣＡ）キット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定される。
受容体結合親和性（Ｋｉ）は、両方ともＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手したヒト組換え（３－［１２５Ｉ］－ヨードチロシル－Ａ１４）－インスリン（２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）又はヒト組換え［１２５Ｉ］－インスリン様成長因子１（１８５３ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）のいずれかとの競合的放射性リガンド結合アッセイから決定する。ポリビニルトルエン（ＰＶＴ）コムギ胚芽凝集素結合ＳＰＡビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用したシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）法でアッセイを行う。アッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）は、０．１％（ｗ／ｖ）脂肪酸不含ＢＳＡ、０．００１％（ｗ／ｖ）ＮＰ－４０（４－ノニルフェニル－ポリエチレングリコール）、又は０．１％（ｗ／ｖ）脂肪酸不含ＨＳＡのいずれかを含み、全ての化合物試験及び試薬調製に使用される。Ｆｒｅｅｄｏｍ／Ｅｖｏロボット（Ｔｅｃａｎ）を使用して、アッセイ緩衝液で、試験試料又は対照の３倍段階希釈を使用した１０点濃度応答曲線を作成する。５０μＬの化合物希釈液をＴｅＭＯロボット（Ｔｅｃａｎ（登録商標））を用いて９６ウェル白色透明底マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に添加し、続いて、Ｍｕｌｔｉｆｌｏ Ｆ／Ｘ（Ｂｉｏｔｅｋ）バルク分注機器を使用して、放射性リガンド（５０μＬ）、膜（５０μＬ）、及びＳＰＡビーズ（５０μＬ）全てを添加する。放射性リガンドの最終濃度は約４０ｐＭであり、添加されたＳＰＡビーズの量は０．１５ｍｇ／ウェルである。
方程式Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｌ／Ｋｄ）に基づいて、親和性定数（Ｋｉ）をＩＣ５０値から計算し、式中、Ｌ＊は、実験で使用される放射性リガンドの濃度と等しく、Ｋｄは、飽和結合分析から決定されたそれぞれの受容体の放射性リガンドの平衡結合親和性定数と等しい。
幾何平均Ｋｉ＝１０（Ｌｏｇ Ｋｉ値の加算平均）
誤差はデルタ法を使用して計算され、ここで、ＳＥＭ＝ＧｅｏＭｅａｎ×（（Ｌｏｇ１０ Ｋｉ値の標準偏差）／（ｎの平方根））×ｌｎ１０である
表１Ａ、Ｂ、Ｃ：ヒトインスリン受容体サブタイプＡ及びＢ（ｈＩＲ－Ａ及びｈＩＲ－Ｂ）並びにヒトインスリン様成長因子－１受容体（ｈＩＧＦ－１Ｒ）結合親和性、Ｋｉ値は幾何平均であり、ＳＥＭはデルタ法を使用して計算された誤差である。
Figure 2023526069000014
Figure 2023526069000015
Figure 2023526069000016
表１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃのデータは、実施例１、２、及び３が、アッセイ緩衝液中０．１％ＢＳＡ、０．００１％ＮＰ－４０、又は０．１％ＨＳＡのいずれかを使用して、ｈＩＧＦ－Ｒへの非常に低い結合でヒトＩＲ－Ａ及びヒトＩＲ－Ｂに結合することを示す。
受容体機能活性化
インスリン受容体には、リガンド結合時に自身のチロシン残基を自己リン酸化して、インスリンシグナル伝達経路を誘導するように作用するアダプタータンパク質の動員を可能にする細胞内チロシンキナーゼドメインが含まれる。チロシン残基の受容体自己リン酸化を刺激するための機能的な細胞活性は、ｈＩＲ－Ａ、ｈＩＲ－Ｂ、又はｈＩＧＦ－１Ｒを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、それぞれＣ末端Ｃ９エピトープ（ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ、配列番号６）でリガンド処理した後に決定される。
ｈＩＲ－Ａ又はｈＩＲ－Ｂ－Ｃ９を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞をトリプシノゲン化し、１０００ｒｐｍで沈降させる。ピルビン酸ナトリウムを含まないＤＭＥＭ高グルコース＋０．１％ＢＳＡを含む飢餓培地で細胞を再懸濁し、９６ウェルのポリ－Ｄ－リジンコーティングプレートに５０Ｋ～６０Ｋ細胞／ウェルの密度で播種する。細胞を標準的な組織培養条件下で一晩インキュベートする。アルブミン結合の効果を評価するために、ピルビン酸ナトリウムを含まないＤＭＥＭ高グルコース＋０．１％のＢＳＡを含む培地で細胞の刺激を行う。ｈＩＲ－Ａ又はｈＩＲ－Ｂ細胞を１０～０．００００１６９μＭの範囲の様々な濃度のリガンドで、３７℃で６０分間刺激した後、アッセイ日に、細胞を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、及び新たに追加された完全プロテアーゼ阻害カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ Ａ３２９５５）＋２ｍＭバナデート（Ｓｉｇｍａ Ｓ６５０８）を含む溶解緩衝液により溶解する。各受容体のキナーゼドメインによるチロシン自己リン酸化のレベルは、細胞ライセートをＥＬＩＳＡプレートに適用することによって決定される。ここで、活性化された受容体は、ＩＲ－Ａの場合は３．５μｇ／ｍｌのＩＲ（Ａｂ ８３－１４）、又はＩＲ－Ｂの場合は２μｇ／ｍｌのＣ９エピトープタグのいずれかに対する抗体によって捕捉され、続いて１：５０００の比率で抗ホスホチロシン西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート、ＨＲＰ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １６－１０５）でチロシンリン酸化のレベルが検出される。
ＩＲ ＥＬＩＳＡの場合、９６ウェルプレートは、ＩＲ－Ａの場合は３．５μｇ／ｍＬのＡｂ ８３－１４、又はＩＲ－Ｂの場合は２μｇ／ｍＬの抗Ｃ９ Ａｂのいずれかでコーティングされる。抗体を２０ｍＭ炭酸Ｎａ、ｐＨ９．６に希釈し、４℃で一晩インキュベートする。２日目に、プレートをＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＴＢＳ）で３回洗浄する。プレートをＴＢＳＴ中１％ＢＳＡで１時間遮断する。ブロッキング緩衝液を除去し、細胞ライセートをプレートに適用する。プレートを室温で１時間シェーカー上でインキュベートする。プレートを１×ＴＢＳＴで３回洗浄する。二次抗体（抗ホスホチロシン－ＨＲＰ（１Ｘプロテイナーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテルを含むＴＢＳＴで、１０ｍＬ中２μＬ（１／５０００）のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ １６－１０５））を適用する。プレートを室温で１時間シェーカー上で更にインキュベートする。ｐＩＲのシグナルを発生させるために、プレートをＴＢＳＴで４回洗浄する。ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ ３４０２１）をプレートに１００μＬ／ウェルの体積で添加し、室温で５分間インキュベートする。１００μＬ／ウェルの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加することにより反応を停止させ、プレートを５分間インキュベートする。プレートをＯＤ４５０ｎｍで読み取る。
インスリン受容体活性化、０．１％カゼイン（ＢＳＡ不含法）
０．１％カゼインの存在下でのＩＲＡ及びＩＲＢリン酸化に対する実施例の効果を測定するために、ｈＩＲＡ－ＨＥＫ２９３－ｚｅｏ又はｈＩＲＢ－Ｃ９－ＨＥＫ２９３－Ｇ４１８細胞を、最初に、高グルコースを含み、０．１％ＢＳＡを含むピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ １１９６５－０８４）を含まないＤＭＥＭ中の９６ウェルのポリ－Ｄ－リジンコーティングプレート（Ｂｉｏｃｏａｔ ３５４４６１）に６０，０００細胞／ウェルでプレーティングする。次に、細胞を組織培養インキュベーターで、３７℃で一晩インキュベートする。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートはまた、２０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の３．５μｇ／ｍＬの抗インスリン受容体抗体８３－１４（ＩＲＡアッセイ用）又は２．０μｇ／ｍＬの抗Ｃ９抗体（ＩＲＢアッセイ用）でコーティングされ、４℃で一晩インキュベートされる。
翌日、ＥＬＩＳＡプレートを、２００μＬの洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）を含むＴＢＳ－Ｔ）で３回洗浄し、ＴＢＳ－Ｔ中の１％ＢＳＡで少なくとも１時間遮断する。アッセイ培地は、高グルコースを含み、ピルビン酸ナトリウムを含まないＤＭＥＭ中の０．１％カゼインで調製する。以下の化合物をアッセイ培地中でそれぞれの濃度：ヒトインスリンを２００ｎＭ、実施例を６０μＭ、ｈＩＧＦ－１を２０μＭ、及びＡｓｐＢ１０を２００ｎＭに希釈する。化合物を、１：３希釈で連続希釈する。細胞プレートを５０μＬのアッセイ培地で２回すすぎ、次いで５０μＬのアッセイ培地及び５０μＬの希釈化合物を細胞プレートの個々のウェルに移す。２００ｎＭ ＢＨＩを移す。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
プロテアーゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ Ａ３２９６５）及びオルトバナジン酸ナトリウム（最終濃度２ｍＭ）を溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１％ＮＰ４０）に添加する。１時間のインキュベーション後、細胞プレートを最初に１００μＬの冷ＤＰＢＳで洗浄し、１００μＬの溶解緩衝液に４℃で１５分間溶解する。細胞ライセートプレートを混合し、３００μＬのＢＨＩ処理細胞ライセートを、ＢＨＩで半分処理した細胞プレートから希釈プレートの最初のカラムに移す。２００μＬの溶解緩衝液をこの希釈プレートの他の１１のカラムに添加し、１００μＬのライセートを２００μＬの溶解緩衝液に移し、１１回繰り返すことにより、ライセートを１１回１：３に連続希釈する。化合物で処理した細胞プレートから１０μＬのライセートを希釈プレートに移し、１９０μＬのライセートを各ウェルに添加する。ＥＬＩＳＡプレートを前述のように洗浄し、次に１００μＬの希釈ライセートを適切なＥＬＩＳＡプレートに移す。プレートを室温で１時間シェーカー上でインキュベートする。
プレートを前述のように洗浄し、ＴＢＳＴ（プロテアーゼ阻害剤及び４０μＭオルトバナジン酸ナトリウムを含む）で１：５０００に希釈した１００μＬの二次抗体を各プレートに添加する。プレートを室温で１時間シェーカー上でインキュベートする。プレートを前述のように洗浄し、５０μＬのＴＭＢをプレートに添加して約２分間展開させる。ＴＭＢ反応を５０μＬの２Ｎ硫酸で停止させ、プレートを４５０ｎｍで読み取る。
機能的効力は、陽性対照、ヒトインスリン（ｈＩＲ－Ａ及びｈＩＲ－Ｂリン酸化アッセイ）の最大有効濃度（１００ｎＭ）又は１０ｎＭの陽性対照ｈＩＧＦ－１（ｈＩＧＦ－１Ｒリン酸化アッセイ）に対して最大半量応答（ＥＣ５０）を誘発する濃度として報告される。ＩＣ５０値は、４パラメータロジスティック非線形回帰分析から決定される（ＮＧＲ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ １３）。必要であれば、曲線上部又は底部パラメータを、それぞれ１００又は０に設定する。
ＥＣ５０の報告値は幾何平均として示され、平均の標準誤差（ＳＥＭ）はデルタ法を使用して計算され、独立した測定の数は「ｎ」で示される（表２）。
Figure 2023526069000017
表２のデータは、実施例１、２、及び３がヒトインスリン受容体Ａ及びＢに結合し、刺激することを示す。
１型糖尿病のラットモデルにおけるインビボ効力の評価
実施例１、２、及び３のグルコース低下及び薬物動態を、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置ラット糖尿病モデルで調査する。体重４００～４２５グラムのオスのスプラーグ－ドーリーラットを、Ｅｎｖｉｇｏ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａから入手する。約１週間順化させた後、ラットをイソフルランで麻酔し、Ｚａｎｏｓａｒ（８９２５６、Ｔｅｖａ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ、４０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）を１回注射する。ラットをＺａｎｏｓａｒの注射から３日後に研究に使用する。非空腹時血中グルコースが４００～５５０ｍｇ／ｄＬである動物のみをこれらの研究に使用する。
ラットを、血中グルコース及び体重において同等の分散をもたらすように群化した後、無作為化する。血中グルコースを、Ａｃｃｕ－Ｃｈｅｋ Ａｖｉｖａ血糖値計（Ｒｏｃｈｅ）を使用して測定する。
試験物質（ペプチド溶液；１ｍＬ／ｋｇ；皮下；投与段階の１日目に単回投与）又はビヒクル（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９ｍｇ／ｍＬのグリセロール、３．１５ｍｇ／ｍＬのｍ－クレゾール、ｐＨ７．６；１ｍＬ／ｋｇ；皮下；投与段階の１日目に単回投与）は、投与１日目の０８００の動物の体重に基づいて投与される。グルコース測定のための血液試料を、尾の断切りによって収集する。動物は実験中ずっと自由摂餌摂水させる。これらの研究からの血漿試料は、化合物レベルの分析のために送られる。
投与の０、１、２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、及び１２０時間後に、血糖値計を使用して全血を全血中グルコースのために収集する。値の差が３０ｍｇ／ｄＬを超えない限り、値は重複して記録される。これが発生した場合、三重の値が記録される。ラットのグルコースが３５ｍｇ／ｄＬ未満に低下した場合、同じ群内で＞１００ｍｇ／ｄＬのラットを除いて、群全体に２ｍＬの５０％デキストロースを経口投与する。救助されたラットを観察し、デキストロース負荷後２～４時間ごとに血中グルコースを測定する。観察期間中、ラットのグルコースが３５ｍｇ／ｄＬ未満に低下した場合、同じ群内で＞１００ｍｇ／ｄＬのラットを除いて、群全体に２ｍＬの５０％デキストロースを経口投与する。デキストロース負荷後２～４時間ごとに血中グルコースを測定して、観察を続ける。ラットに２ｍＬの５０％デキストロースを経口投与した場合、その後に記録された全てのグルコース値は研究計算から除外される。動物が救助されたとしても、ＰＫはデキストロースボーラスの影響を受けないため、ＰＫ時点を収集するための研究は続けられる。
免疫親和性－ＬＣ／ＭＳラット血漿アッセイ：実施例のＰＫを特徴付けるために、血漿試料（１０μＬアリコート）を、免疫沈降とそれに続くＬＣ／ＭＳ分析により無傷のインスリン濃度について分析する。実施例を使用して標準及びブランク試料を１００％対照ラット血漿で調製し、安定した同位体標識抗体（実施例とは無関係）を内部標準として全ての標準及び試料に添加する。免疫沈降では、ビオチン標識抗ヒトマウス抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、１０Ｒ－Ｉ１３４Ｅ）を捕捉試薬として使用し、その後、Ｄｙｎａｌ Ｍ－２８０ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ６０２１０）に結合させる。磁気ビーズ固定化試料を０．１％ＣＨＡＰＳ、続いてＰＢＳで洗浄し、実施例を２０％ＡＣＮ、２％ギ酸水溶液、及び２０％Ｉｎｖｉｔｒｏｓｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，４６－５５５３）を含む溶液で溶出する。血漿試料は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ／Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計を使用して、０．０１～５．３μｇ／ｍＬ（１．６～８０２ｎＭ）の範囲にわたって定量化される。
非コンパートメント薬物動態分析は、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ ｖ８．１を使用して実施される。ラットＰＫ分析では、排出半減期の推定に使用される濃度は、平均、５０ｎｍｏｌ／ｋｇ投与群では投与の４４～１２０時間後、１００ｎｍｏｌ／ｋｇ投与群では投与の３２～１２０時間後、２００ｎｍｏｌ／ｋｇ投与群では投与の１８～１２０時間後、そして４００ｎｍｏｌ／ｋｇ投与群では投与の１８～１２０時間後である。
表３Ａ、３Ｂ：ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置ラット糖尿病モデルにおける実施例１のグルコース低下（３Ａ）及び薬物動態効果（３Ｂ）。
Figure 2023526069000018
Figure 2023526069000019
Figure 2023526069000020
Figure 2023526069000021
Figure 2023526069000022
Figure 2023526069000023
表３Ｂ、４Ｂ、５Ｂの略語：ＡＵＣ０－ｉｎｆ＝０から無限大までの曲線下面積、ＣＬ／Ｆ＝クリアランス／バイオアベイラビリティ、Ｔｍａｘ＝最大濃度までの時間、Ｃｍａｘ／Ｄ＝投与当たりの最大血漿濃度、Ｔ１／２＝半減期。［データは平均＋／－ＳＤである（Ｎ＝５）
表３Ａ、４Ａ、及び５Ａのデータは、３つ全ての実施例のインビボでの強力な用量依存性グルコース低下効果を示す。表３Ｂ、４Ｂ、及び５Ｂのデータは、３つ全ての実施例のインビボでの作用持続時間を示す。
１型糖尿病のブタモデルにおける薬物クリアランスの評価
この研究の目的は、３．６ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与後の糖尿病ユカタンミニブタにおける実施例のグルコース低下及び薬物動態を調査することである。血液試料を１６８時間にわたって収集する。
糖尿病（アロキサン誘導）の去勢されたオスのユカタンミニブタ（平均月齢２３ヶ月、平均体重４４ｋｇ）を個別に飼育し、常に新鮮な水を自由に摂取できるようにし、１日２食のハウス食餌を与える。動物は、研究中ではないときの糖尿病状態を管理するために、適切な維持基礎インスリン及び食事インスリンを１日２回受ける。動物は無作為に処置群に入れられ、囲いに戻される。実施例は、六量体製剤で４００Ｕ／ｍＬとして製剤化される（１９ｍｇ／ｍＬのグリセロール、４Ｚｎ／ｈｅｘ、３．１５ｍｇ／ｍＬのｍ－クレゾール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６）。
研究の前日に、ブタは１日の配給量の半分を給餌され、朝の維持投与で０．２Ｕ／ｋｇのＨｕｍａｌｏｇ Ｍｉｘ７５／２５を受ける。予定された試験用量投与の約１２時間前に、ブタは１日分の配給量の半分を給餌され、０．２Ｕ／ｋｇのＨｕｍａｌｏｇのみを受ける。２４時間後の試料が収集されるまで、全ての動物を絶食させる。
研究の朝、全ての動物は拘束のためにスリングに入れ、それらの血管アクセスポートにアクセスして（採血に備えて）、開通性を確認した。動物は無作為に処置群（ｎ＝６）に入れられ、個々の囲いに戻される。最初の２つの投与前試料を収集し、Ｕ１００インスリン注射器で動物の側腹部皮下に試験物質０．６Ｕ／ｋｇ／３．６ｎｍｏｌ／Ｋｇ（４００Ｕ／ｍｌのインスリン濃度に基づく、７単位／ブタの体積の平均）を注射する（０分）。全ての研究動物は、残りの採血期間中、清潔で新鮮な水を自由に摂取できる。
一連の血液試料（各４．０ｍＬ）を各動物から収集し、次の時点でＫ３ＥＤＴＡ抗凝固剤を含むチューブに入れる：皮下（ｓｃ）投与後－０．５、０、１．５、３、６、１２、１８、２４、３６、４２、４８、５４、６０、７２、９６、１２０、１４４、及び１６８時間。
動物に３００グラムのＳ－９食餌を与え、２４時間及び６０時間の試料後に０．２Ｕ／ｋｇのＨｕｍａｌｏｇをｓｃ投与する。７２時間の試料後、動物は通常の維持インスリン及び給餌計画を再開する。全ての試料は、朝の食餌と維持インスリン投与前に収集される。
全血試料は、収集直後に湿った氷上で維持される。次に、血漿を遠心分離（約４℃で少なくとも１５分間、約３０００ＲＰＭ）で分離し、２つのアリコートに分けて、グルコース分析の場合は約－２０℃、ＰＫ分析の場合は－７０℃で凍結保存する。
血漿グルコース濃度は、自動Ｂｅｃｋｍａｎ ＡＵ４８０ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用して決定され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８でグラフ化される。
免疫親和性－ＬＣ／ＭＳブタ血漿アッセイ：試験実施例のＰＫを特徴付けるために、血漿試料（１００μＬアリコート）を、免疫沈降とそれに続くＬＣ／ＭＳ分析により無傷の実施例濃度について分析する。試験実施例を使用して標準及びブランク試料を１００％対照ブタ血漿で調製し、安定した同位体標識抗体（実施例とは無関係）を内部標準として全ての標準及び試料に添加する。免疫沈降では、ビオチン標識抗ヒトマウス抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、カタログ番号１０Ｒ－Ｉ１３４Ｅ）を捕捉試薬として使用し、その後、Ｄｙｎａｌ Ｍ－２８０ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ６０２１０）に結合させる。磁気ビーズ固定化試料を０．１％ＣＨＡＰＳ、続いてＰＢＳで洗浄し、試験実施例及びその内部標準を２０％ＡＣＮ、２％ギ酸水溶液、及び２０％Ｉｎｖｉｔｒｏｓｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，４６－５５５３）を含む溶液で溶出する。血漿試料は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ／Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計を使用して、０．１～５２．３ｎｇ／ｍＬ（０．０１６～８．０ｎＭ）の範囲にわたって定量化される。
薬物動態分析：非コンパートメント薬物動態分析は、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ ｖ８．１を使用して実施される。ＰＫ分析では、排出半減期の推定に使用される濃度は、平均、投与の５０時間～１６０時間後（３．６ｎｍｏｌ／ｋｇ ＳＣに相当）である。
Figure 2023526069000024
Figure 2023526069000025
表６Ａ及び６Ｂのデータは、１型糖尿病のブタモデルにおける３つ全ての実施例のインビボでの強力かつ持続的なグルコース低下効果を示す。
配列
配列番号１ 修飾インスリンＡ鎖（Ａ１４Ｅ）；式ＩのＡ鎖
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮ
配列番号２ 修飾インスリンＢ鎖（Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０）；式ＩのＢ鎖
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＨＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫ
ここで、２９位のＬｙｓは、Ｌｙｓ側鎖のエプシロン－アミノ基とＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－Ｘ－とのコンジュゲーションによって化学修飾され、Ｘは、－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－、－Ｌｙｓ－（２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸）－、又は－εＬｙｓ－Ｇｌｙ－である。
配列番号３ 実施例１のＢ鎖
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＨＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫ
ここで、２９位のＬｙｓは、Ｌｙｓ側鎖のエプシロン－アミノ基とＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－とのコンジュゲーションによって化学修飾される。
配列番号４ 実施例２のＢ鎖
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＨＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫ
ここで、２９位のＬｙｓは、Ｌｙｓ側鎖のエプシロン－アミノ基とＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－Ｌｙｓ－（２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸）－とのコンジュゲーションによって化学修飾される。
配列番号５ 実施例３のＢ鎖
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＨＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫ
ここで、２９位のＬｙｓは、Ｌｙｓ側鎖のエプシロン－アミノ基とＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－εＬｙｓ－Ｇｌｙ－とのコンジュゲーションによって化学修飾される。
配列番号６ Ｃ末端Ｃ９エピトープ
ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ
配列番号７ 単鎖インスリン
ＭＨＨＨＨＨＨＱＡＩＦＶＬＱＧＳＬＤＱＤＰＥＦＥＮＬＹＦＱＩＥＧＧＲＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＨＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮ
配列番号８ 修飾インスリンＢ鎖（Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＨＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫ

Claims (17)

  1. 式Ｉの化合物：
    Figure 2023526069000026
     （式中、Ｘは、－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－、－Ｌｙｓ－（２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸）－、及び－εＬｙｓ－Ｇｌｙ－からなる群から選択される）、又はその薬学的に許容される塩。
  2. Ｘが、－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－である、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
  3. Ｘが、－Ｌｙｓ－（２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸）－である、請求項１記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
  4. Ｘが、－εＬｙｓ－Ｇｌｙ－である、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
  5. 式：
    Figure 2023526069000027
     である、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
  6. 式：
    Figure 2023526069000028
     である、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
  7. 式：
    Figure 2023526069000029
     である、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と、を含む薬学的組成物。
  9. 患者のＩ型及び／又はＩＩ型糖尿病を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項８に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
  10. 患者の高血糖症を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項８に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
  11. 治療に使用される、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
  12. Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病の治療に使用される、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
  13. 高血糖症の治療に使用される、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
  14. 式：
    Figure 2023526069000030
     からなる群から選択される化合物、又はその薬学的に許容される塩。
  15. 請求項１４に記載の群から選択される化合物を使用して、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を調製するための、プロセス。
  16. 糖尿病の治療のための薬物の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用。
  17. 高血糖症の治療のための薬物の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用。
JP2022569032A 2020-05-15 2021-05-13 長時間作用アシル化インスリン化合物 Active JP7456007B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063025463P 2020-05-15 2020-05-15
US63/025,463 2020-05-15
PCT/US2021/032144 WO2021231676A1 (en) 2020-05-15 2021-05-13 Extended time action acylated insulin compounds

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023526069A true JP2023526069A (ja) 2023-06-20
JP7456007B2 JP7456007B2 (ja) 2024-03-26

Family

ID=78524979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022569032A Active JP7456007B2 (ja) 2020-05-15 2021-05-13 長時間作用アシル化インスリン化合物

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20230174609A1 (ja)
EP (1) EP4149516A1 (ja)
JP (1) JP7456007B2 (ja)
KR (1) KR20230009499A (ja)
CN (1) CN115867308A (ja)
AU (1) AU2021273262A1 (ja)
BR (1) BR112022022885A2 (ja)
CA (1) CA3177905A1 (ja)
CL (1) CL2022003187A1 (ja)
CO (1) CO2022016338A2 (ja)
CR (1) CR20220641A (ja)
EC (1) ECSP22087958A (ja)
IL (1) IL297976A (ja)
MX (1) MX2022014309A (ja)
PE (1) PE20230832A1 (ja)
WO (1) WO2021231676A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116162147B (zh) * 2021-11-24 2023-10-03 成都奥达生物科技有限公司 一种长效胰岛素类似物
CN115947822B (zh) * 2022-07-04 2023-08-18 北京惠之衡生物科技有限公司 一种长效酰化胰岛素衍生物及其药物组合物和应用
CN115894719B (zh) * 2022-11-24 2023-10-20 武汉禾元生物科技股份有限公司 一种人血清白蛋白胰岛素偶联物及其制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5693609A (en) * 1994-11-17 1997-12-02 Eli Lilly And Company Acylated insulin analogs
BR9813111A (pt) 1997-10-24 2000-08-15 Lilly Co Eli Composições de insulina insolúveis
US6444641B1 (en) * 1997-10-24 2002-09-03 Eli Lilly Company Fatty acid-acylated insulin analogs
US20170008928A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Novo Nordisk A/S Novel peptides and peptide derivatives and uses thereof
JOP20190273A1 (ar) 2017-05-26 2019-11-24 Lilly Co Eli مركب إنسولين معالج بأسيل

Also Published As

Publication number Publication date
IL297976A (en) 2023-01-01
ECSP22087958A (es) 2022-12-30
CO2022016338A2 (es) 2022-11-29
CN115867308A (zh) 2023-03-28
PE20230832A1 (es) 2023-05-19
CL2022003187A1 (es) 2023-03-03
BR112022022885A2 (pt) 2022-12-20
KR20230009499A (ko) 2023-01-17
WO2021231676A1 (en) 2021-11-18
EP4149516A1 (en) 2023-03-22
CA3177905A1 (en) 2021-11-18
AU2021273262A1 (en) 2022-12-08
MX2022014309A (es) 2022-12-07
CR20220641A (es) 2023-01-19
US20230174609A1 (en) 2023-06-08
JP7456007B2 (ja) 2024-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI810606B (zh) Gip/glp1共促效劑化合物
JP7270105B2 (ja) インスリン類似体およびその使用方法
JP7456007B2 (ja) 長時間作用アシル化インスリン化合物
JP6665349B2 (ja) アシル化インスリン化合物
CN115298207A (zh) Gip/glp1共激动剂化合物

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221212

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20221212

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231114

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240206

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20240220

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240313

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7456007

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150