JP2023525286A - 標的ｄｎａ配列の選択的捕捉 - Google Patents
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Abstract
ゲノムＤＮＡの多くの領域は、ゲノムの他の領域と非常に類似しており、そのため、類似した望ましくない領域を捕捉することなく、捕捉することは非常に困難である。これが、目的ではない領域の過剰な配列決定につながり、所望の領域のカバレッジが低下する。望ましくない領域の捕捉を最小限にするために、ブロッキングベイトが、類似しているが望ましくない断片が捕捉されることを防止するように設計された。これにより、目的の領域のより指向性の高い配列決定が可能になる。ブロッキングベイトは、望ましくないＤＮＡと優先的に結合する中程度に異なる配列を有し、ビオチンも他の修飾も含まず、そのため捕捉ベイトが選択される場合、後に残存する点で捕捉ベイトと異なる。
Description
発明の背景
関連出願との相互参照
本願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０２０年５月１１日に出願された米国出願番号６３／０２２，９６８に基づく優先権の利益を請求し、その内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の組み込み
関連出願との相互参照
本願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０２０年５月１１日に出願された米国出願番号６３／０２２，９６８に基づく優先権の利益を請求し、その内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の組み込み
添付の配列表の内容物は、参照により本願に組み込まれる。添付の配列表テキストファイルは、ＰＧＤＸ３１４０－１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、２０２１年５月５日に作成され、８ｋｂである。このファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＯＳを使用するコンピュータ上のＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄ（登録商標）を使用してアクセスすることができる。
発明の分野
発明の分野
本発明は、一般に、ゲノムの高度反復領域の配列決定に関し、より具体的には、反復ＤＮＡ配列を有するゲノムの領域を配列決定するための捕捉核酸分子およびブロッキング核酸分子の使用に関する。
背景情報
現在のハイブリダイゼーション捕捉ベイトは、固有の配列で効果的に働き、癌および他の疾患に関与していると考えられるゲノムの領域の捕捉およびディープシーケンシングを可能にする。捕捉される配列が固有ではなく、他の配列と非常に類似している場合、ゲノム全体から何千もの領域の捕捉が避けられず、望ましくはないが、いずれにしても配列決定される。現在、これは、マッピングまたはアライメントが適切に行われず、廃棄しなければならない多くの配列リードをもたらす。これは、他の場所で使用するであろう配列容量が無駄であることを意味する。さらに悪いことに、これらの配列の中にはミスアラインメントされる可能性があり、目的の領域で偽陽性を引き起こす可能性がある。これは、転座を特定するためにたいてい必要なイントロン領域で特に問題となる。
現在のハイブリダイゼーション捕捉ベイトは、固有の配列で効果的に働き、癌および他の疾患に関与していると考えられるゲノムの領域の捕捉およびディープシーケンシングを可能にする。捕捉される配列が固有ではなく、他の配列と非常に類似している場合、ゲノム全体から何千もの領域の捕捉が避けられず、望ましくはないが、いずれにしても配列決定される。現在、これは、マッピングまたはアライメントが適切に行われず、廃棄しなければならない多くの配列リードをもたらす。これは、他の場所で使用するであろう配列容量が無駄であることを意味する。さらに悪いことに、これらの配列の中にはミスアラインメントされる可能性があり、目的の領域で偽陽性を引き起こす可能性がある。これは、転座を特定するためにたいてい必要なイントロン領域で特に問題となる。
本発明は、捕捉核酸分子およびブロッキング核酸分子の使用により、ゲノムの高度に反復したおよび／または関連する領域の配列決定の精度が上昇するという独創的な発見に基づいている。
一実施形態では、本発明は、試料核酸を捕捉核酸分子およびブロッキング核酸分子とハイブリダイズさせる工程であって、ここで試料核酸は標的配列および非標的配列を有する、工程；標的配列にハイブリダイズした捕捉核酸分子を単離する工程；および単離した標的配列を配列決定する工程によって標的配列を配列決定する方法を提供する
１つの態様において、非標的配列は、核酸の繰り返し領域および／または関連領域を有する。別の態様では、ブロッキング核酸分子および捕捉核酸分子は、少なくとも約６０個から少なくとも約１２０個の核酸を有する。さらなる態様において、捕捉核酸としては、放射性ホスフェート、ビオチン、フルオロフォア、酵素またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、検出可能な標識で標識される。さらなる態様において、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子の約１０倍過剰で存在する。一態様において、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子に対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。別の態様では、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子と異なる少なくとも約４個の核酸分子を有する。さらなる態様において、標的配列は、少なくとも約６０個から少なくとも約１２０個の核酸を有する。さらなる態様において、配列決定は、次世代配列決定によるものである。
別の実施形態では、本発明は、試料核酸を捕捉核酸分子およびブロッキング核酸分子とハイブリダイズさせる工程であって、ここで試料核酸は標的配列および非標的配列を有する、工程；標的配列とハイブリダイズした捕捉核酸分子を単離する工程；および標的配列を配列決定する工程によって、標的配列の配列決定特異性および／または精度を改善する方法を提供する。
１つの態様において、非標的配列は、核酸の反復領域および／または関連領域を有する。別の態様では、ブロッキング核酸分子および捕捉核酸分子は、少なくとも約６０個から少なくとも約１２０個の核酸を有する。さらなる態様において、捕捉核酸としては、放射性ホスフェート、ビオチン、フルオロフォア、酵素またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、検出可能な標識で標識される。さらなる態様において、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子の約１０倍過剰で存在する。一態様において、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子に対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。別の態様では、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子と異なる少なくとも約４個の核酸分子を有する。さらなる態様において、標的配列は、少なくとも約６０個から少なくとも約１２０個の核酸を有する。さらなる態様において、配列決定は、次世代配列決定によるものである。
発明の詳細な説明
本発明は、捕捉核酸分子およびブロッキング核酸分子の使用により、ゲノムの高度に反復したおよび／または関連する領域の配列決定の精度が上昇するという独創的な発見に基づいている。
本発明は、捕捉核酸分子およびブロッキング核酸分子の使用により、ゲノムの高度に反復したおよび／または関連する領域の配列決定の精度が上昇するという独創的な発見に基づいている。
本発明の組成物および方法を記載する前に、本発明は、そのような組成物、方法、および条件が変化し得るので、記載される特定の組成物、方法、および実験条件に限定されないことが理解されるであろう。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲においてのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、本開示等を読めば当業者に明らかになる、本明細書に記載されるタイプの１つまたは複数の方法、および／またはステップを含む。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、この発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、修正および変形は本開示の精神および範囲に包含されることが理解されよう。次に、好ましい方法および材料について説明する。
本発明は、不要な領域に優先的に結合し、その捕捉を防止するように設計されたブロッキングベイトをハイブリダイゼーション捕捉に追加する方法を提供する。妨害する相同リピート配列がなければ、所望の領域は次に配列決定のために選択的に捕捉され得る。標的化ベイトおよびブロッキングベイトの間の中程度の配列の違いに加え、ブロッキングベイトはビオチンも捕捉に必要な他のタグも含まない。ブロッキングベイトは、不要な配列の捕捉を妨害するが、所望の領域の捕捉に最低限の影響しか与えない。
ゲノムＤＮＡの多くの領域は、ゲノムの他の領域と非常に類似しており、したがって、類似の望ましくない領域も捕捉せずに捕捉することは非常に困難である。これは、目的ではない領域の余分な配列決定をもたらし、所望の領域のカバレッジを低下させる。非目的領域の捕捉を最小化するために、ブロッキングベイトは、類似しているが望ましくない断片が捕捉されることを防止するように設計される。これにより、目的の領域のより指向性の高い配列決定が可能になる。ブロッキングベイトは、望ましくないＤＮＡと優先的に結合する中程度に異なる配列を有し、ビオチンも他の修飾も含まず、そのため捕捉ベイトが選択される場合、後に残存する点で補足ベイトと異なる。
一実施形態では、本発明は、試料核酸を捕捉核酸分子およびブロッキング核酸分子とハイブリダイズさせる工程であって、ここで試料核酸が標的配列および非標的配列を有する、工程；標的配列とハイブリダイズした捕捉核酸分子を単離する工程；および単離した標的配列を配列決定する工程によって、標的配列を配列決定する方法を提供する。一態様では、非標的配列は、核酸の反復領域および／または関連領域を有する。別の態様では、ブロッキング核酸分子および捕捉核酸分子は、少なくとも約６０尾～少なくとも約１２０個の核酸を有する。さらなる態様において、捕捉核酸としては、放射性ホスフェート、ビオチン、フルオロフォア、酵素、またはそれらの組み合わせが挙げられる、これらに限定されない、標識で標識される。さらなる態様において、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子の約１０倍過剰で存在する。一態様において、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子に対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。別の態様では、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子と異なる少なくとも約４個の核酸分子を有する。さらなる態様において、標的配列は、少なくとも約６０個から少なくとも約１２０個の核酸を有する。さらなる態様において、配列決定は、次世代配列決定によるものである。
本明細書で使用される語句「核酸」または「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはこれらのいずれかの断片を指し、あるいは一本鎖または二本鎖であってもよいし、センス鎖またはアンチセンス鎖を表してもよいゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を指し、あるいは天然起源または合成起源の任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様材料を指す。語句「核酸」または「核酸配列」としては、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはこれらのいずれかの断片、一本鎖または二本鎖であってもよいし、センス鎖またはアンチセンス鎖を表してもよいゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｉＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、あるいは天然期限または合成起源の任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様材料（例えば、ｉＲＮＡ、リボ核タンパク質（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ、例えばｉＲＮＰ））が挙げられる。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドを包含する。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造を包含し、例えば、Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156を参照されたい。
本明細書で使用される用語「標的領域」または「標的配列」は、配列決定の標的である核酸配列を指す。標的配列は、ＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡまたは他のＤＮＡの供給源のような任意の供給源に由来し得る。
ある態様では、標的配列は少なくとも約６０～１２０個の核酸長である。特定の態様では、標的配列は、少なくとも約６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０の核酸長である。
本明細書で使用する場合、用語「非標的配列」は、標的配列ではない任意の核酸配列を指す。非標的配列は、反復配列および／または関連配列を有していてもよい。反復ＤＮＡでは、ＤＮＡ反復のストレッチが、ゲノムに沿ったタンデムであるかまたは散在いているかのいずれかとしてゲノム中に生じる。これらの配列はタンパク質をコードしていない。高度に反復したＤＮＡと呼ばれるクラスの１つは、一本のストレッチにおいて数千回繰り返される短い配列、例えば５～１００ヌクレオチドからなり、サテライトＤＮＡを含む。関連配列は、標的配列と高い配列同一性を有するが、同一ではない配列である。
本明細書で使用する「試料核酸」は、標的配列および非標的配列を含む核酸を指す。
用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸鎖が塩基対形成によって相補鎖と結合するプロセスを意味する。ハイブリダイゼーション反応は、目的の特定の配列が低濃度で存在する試料であっても同定できるように、感度および選択的であり得る。好適なストリンジェントな条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液およびハイブリダイゼーション溶液中の塩またはホルムアミドの濃度、あるいはハイブリダイゼーション温度によって定義することができ、当該分野で周知である。特に、ストリンジェンシーは、塩の濃度を下げること、ホルムアミドの濃度を上げること、またはハイブリダイゼーション温度を上げることによって増加し得る。代替的な態様において、本発明の核酸は、本明細書に規定するように、種々のストリンジェンシー条件（例えば、高、中、および低）下でハイブリダイズする能力によって定義される。
例えば、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、約３７℃から４２℃で約５０％のホルムアミド中で起こり得る。ハイブリダイゼーションは、約３０℃から３５℃で、約３５％から２５％のホルムアミドで、低減したストリンジェンシー条件下で生じ得る。特に、ハイブリダイゼーションは、４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳおよび２００ｍｇ／ｍｌの剪断済みおよび変性済みサケ精子ＤＮＡ中で、高ストリンジェンシー条件下で生じ得る。ハイブリダイゼーションは、上記のように、しかし３５％ホルムアミド中、３５℃の低減した温度で、低減したストリンジェンシー条件下で生じ得る。特定のレベルのストリンジェンシーに対応する温度範囲は、目的の核酸のピリミジンに対するプリンの比率を計算すること、およびそれに応じて温度を調整することによってさらに狭くすることができる。上記の範囲および条件の変更は、当該分野で周知である。
用語「捕捉核酸分子」または「捕捉ベイト」は、本明細書において互換的に使用され、標的配列にハイブリダイズするように設計された核酸分子を指す。捕捉核酸分子は、標的配列と特異的にハイブリダイズし、単離するように設計される。
ある態様では、捕捉核酸分子は少なくとも約６０～１２０個の核酸長を有する。特定の態様では、捕捉核酸分子は、少なくとも約６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０個の核酸長である。
本明細書で使用する場合、用語「配列同一性」または「配列相同性」は、互換的に使用することができ、２つのポリヌクレオチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドの対応関係を指す。典型的には、配列同一性を決定するための技術は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定し、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定し、そしてこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。２つ以上の配列は、「相同性パーセント」とも称されるそれらの「同一性パーセント」を決定することによって比較することができる。より長い分子内の配列であり得る参照配列に対する同一性パーセントは、最適にアライメントされた２つの配列間の完全一致の数を参照配列の長さで割り、１００を乗じたものとして計算されてもよい。同一性パーセントはまた、例えば、国立衛生研究所から入手可能なバージョン２．２．９を含む高度なＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することによっても決定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)のアライメント方法に基づき、Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993); and Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)において議論されている。簡単に言えば、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一性を、２つの配列のうち短い方における記号の総数で割った、同一のアライメントされた記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として定義する。このプログラムは、比較される配列の全長にわたって同一性パーセントを決定するために使用され得る。デフォルトのパラメータは、例えばｂｌａｓｔｐプログラムで短いクエリー配列の検索を最適化するように提供される。このプログラムは、Wootton and Federhen, Computers and Chemistry 17: 149-163 (1993)のＳＥＧプログラムによって決定されるクエリー配列のセグメントをマスクオフするＳＥＧフィルタを使用することも可能にする。配列同一性の望ましい度合いの範囲は、約８０％から１００％およびその間の整数値である。開示される配列と本発明の配列との間の同一性パーセントは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％であり得る。一般に、完全一致は、参照配列の長さにわたって１００％の同一性を示す。ある場合には、配列同一性パーセントへの言及は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を使用して測定された配列同一性を指す。他の場合には、ＣｌｕｓｔａｌＷを多重配列アライメントに使用することができる。配列の比較および／または配列同一性の評価のためのさらに他のプログラムとしては、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－ＷｕｎｓｃｈアルゴリズムおよびＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒ ａｌｉｇｎｅｒを参照のこと）が挙げられる。最適なアライメントは、デフォルトパラメータを含む、選択されたアルゴリズムの任意の適切なパラメータを使用して評価され得る。
本明細書で使用する場合、用語「配列同一性パーセント（％）」または「同一性パーセント（％）」は、「相同性」も含み、最大配列同一性パーセントに達するように配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入した後、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、参照配列のヌクレオチドと同一である候補配列のヌクレオチドのパーセントとして定義される。比較のための配列の最適なアラインメントは、手動で行う以外に、Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482の局所相同性アルゴリズムによって、Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443の局所相同性アルゴリズムによって、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444の類似性検索方法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、精製され得る。
追加の態様において、捕捉核酸分子は、標的配列の相補体に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。特定の態様において、捕捉核酸は、標的配列の相補体に対して少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれらより高い、または完全（１００％）配列同一性を有する。
さらなる態様において、捕捉核酸分子は標識またはタグ付けされている。核酸標識の例としては、放射性ホスフェート、ビオチン、フルオロフォア、および酵素が挙げられる。特定の態様において、標識は、標的配列にハイブリダイズする捕捉核酸分子を単離するために使用される。
核酸を標識する方法は、当該分野において公知である。核酸を標識する例としては、γ－３２Ｐ ｒＡＴＰでのＤＮＡ ５’末端標識；α－３２Ｐ ｄＮＴＰ、Ｂｉｏｔｉｎ－ｄＮＴＰ、Ｆｌ－ｄＮＴＰでのＰＣＲによる標識；α－３２Ｐ ｄＮＴＰ、Ｂｉｏｔｉｎ－ｄＮＴＰ、ＦｌターミネーターヌクレオチドでのＦｌ－ｄＮＴＰ一塩基標識でのＤＮＡ ３’標識；α－３２Ｐ ｄＮＴＰ、Ｂｉｏｔｉｎ－ｄＮＴＰ、Ｆｌ－ｄＮＴＰでのＰＣＲによるランダムプライミング；およびα－３２Ｐ ｄＮＴＰ、Ｂｉｏｔｉｎ－ｄＮＴＰ、Ｆｌ－ｄＮＴＰでのＰＣＲによるニックトランスレーションが挙げられる。
核酸分子は、標識またはタグを使用して単離され得る。例えば、ビオチンで標識またはタグ付けされた核酸分子は、ストレプトアビジンおよび／またはアビジンを使用して単離され得る。ビオチンは、ストレプトアビジンおよびアビジンに極めて高い親和性、速いオンレート、および高い特異性で結合し、これらの相互作用は、目的のビオチン化分子を単離するために使用される。
用語「ブロッキング核酸分子」または「ブロッキングベイト」は、互換的に使用され、捕捉核酸分子と類似するが同一ではないように設計された核酸分子を指す。ブロッキング核酸分子は、非標的配列にハイブリダイズするように設計される。
ある態様では、ブロッキング核酸分子は少なくとも約６０～１２０個の核酸長である。特定の態様では、捕捉核酸分子は、少なくとも約６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０個の核酸長である。
追加の態様において、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子に対して少なくとも少なくとも約７０％の配列同一性を有する。特定の態様において、捕捉核酸は、捕捉核酸分子に対して少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれより高い、または完全（１００％）配列同一性を有する。
さらなる態様において、ブロッキング核酸は、捕捉核酸分子と異なる少なくとも約４個の核酸を有する。特定の態様において、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子とは異なる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の核酸を有する。
ある態様において、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子の少なくとも約１０倍過剰で存在する。特定の態様において、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子の少なくとも約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍過剰で存在する。
一態様において、単離された標的配列は配列決定される。配列決定は、当該分野において公知の任意の方法によって実施され得る。例示的な配列決定方法としては、例えば、次世代配列決定（ＮＧＳ）が挙げられる。例示的なＮＧＳ方法論としては、Ｒｏｃｈｅ ４５４シーケンサー、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＳＯＬｉＤシステム、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、ＢＧＩ／ＭＧＩシステム、Ｇｅｎａｐｓｙｓシステム、およびＩｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ、およびＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ装置などのＩｌｌｕｍｉｎａシステムが挙げられる。配列決定は、例えば、少なくとも２倍のカバレッジ、少なくとも１０倍のカバレッジ、少なくとも２０倍のカバレッジ、少なくとも３０倍のカバレッジ、少なくとも４０倍のカバレッジ、少なくとも５０倍のカバレッジ、少なくとも６０倍のカバレッジ、少なくとも７０倍のカバレッジ、少なくとも８０倍のカバレッジ、少なくとも９０倍のカバレッジ、少なくとも１００倍のカバレッジ、少なくとも２００倍のカバレッジ、少なくとも３００倍のカバレッジ、少なくとも４００倍のカバレッジ、少なくとも５００倍のカバレッジ、少なくとも６００倍のカバレッジ、少なくとも７００倍のカバレッジ、少なくとも８００倍のカバレッジ、少なくとも９００倍のカバレッジ、少なくとも１０００倍のカバレッジ、少なくとも２０００倍のカバレッジ、少なくとも３０００倍のカバレッジ、少なくとも４０００倍のカバレッジ、少なくとも５０００倍のカバレッジ、少なくとも６０００倍のカバレッジ、少なくとも７０００倍のカバレッジ、少なくとも８０００倍のカバレッジ、少なくとも９０００倍のカバレッジ、少なくとも１００００倍のカバレッジ、少なくとも１５０００倍のカバレッジ、少なくとも２００００倍のカバレッジ、およびその間の任意の数または範囲を含む、各ヌクレオチドの深いカバレッジで実施され得る。
別の実施形態では、本発明は、試料核酸を捕捉核酸分子およびブロッキング核酸分子とハイブリダイズさせる工程であって、ここで試料核酸は標的配列および非標的配列を有する、工程；標的配列とハイブリダイズした捕捉核酸分子を分離する工程；および標的配列を配列決定する工程によって、標的配列の配列決定特異性および／または精度を改善する方法を提供する。一態様では、非標的配列は、核酸の反復領域および／または関連領域を有する。別の態様では、ブロッキング核酸分子および捕捉核酸分子は、少なくとも約６０～少なくとも約１２０個の核酸を有する。さらなる態様において、捕捉核酸は、放射性ホスフェート、ビオチン、フルオロフォア、酵素またはそれらの組み合わせで標識される。さらなる態様において、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子の約１０倍過剰で存在する。一態様において、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子に対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する。別の態様では、ブロッキング核酸分子は、捕捉核酸分子と異なる少なくとも約４個の核酸分子を有する。さらなる態様において、標的配列は、少なくとも約６０個から少なくとも約１２０個の核酸を有する。さらなる態様において、配列決定は、次世代配列決定によるものである
以下の実施例は、本発明の実施形態をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。これらは使用され得るものの典型であるが、当業者に知られている他の手順、方法論、または技術が代替的に使用され得る。
実施例１
ＲＯＳイントロン３１のブロッキングベイトの同定
現在、関連配列からの干渉に起因して、反復領域の高いカバレッジを生成することは困難である。この方法は、ベイト長（多くの場合６０～１２０ｎｔ）よりも長く同一である領域の選択的捕捉を改善しないが、同一性よりもむしろその数の多さに起因して問題を引き起こし、かつ高度に関連する多くの短い配列に利益をもたらす。
ＲＯＳイントロン３１のブロッキングベイトの同定
現在、関連配列からの干渉に起因して、反復領域の高いカバレッジを生成することは困難である。この方法は、ベイト長（多くの場合６０～１２０ｎｔ）よりも長く同一である領域の選択的捕捉を改善しないが、同一性よりもむしろその数の多さに起因して問題を引き起こし、かつ高度に関連する多くの短い配列に利益をもたらす。
潜在的なブロッキングベイト配列を同定するために、最も高度に反復した領域のいくつかを含む捕捉パネル内のベイトを調べた。位置ｃｈｒ６：１１７６５４８８７～１１７６５５００６（ＲＯＳイントロン３１）のプライマーを、ＢＬＡＴを用いて分析し、ゲノム全体で数百の高度に類似した配列を有することが観察された。最も近い１８のマッチをＣｌｕｓｔａｌＷで互いにアライメントした。望ましいＲＯＳ１イントロン配列が１９配列のコンセンサスと異なる１３個の位置あった。ミスマッチは、他のゲノム領域との結合に最適なコンセンサス配列を作成し、ＲＯＳ１との結合の可能性を減らすように変更された。得られた配列をゲノムに対してＢＬＡＴしたところ、完全に一致するものは認められなかった。全てのゲノム配列は、少なくとも４つのミスマッチを有した。さらに、ＲＯＳ１配列は上位２００配列のリストには表示されなかった。したがって、この配列（配列番号１ ＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＣＴＣＡＡＴＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＡＡＧＧＣＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＡＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＴＧＴＴＡＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＡＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＣＴＣＡ）は、望ましくない配列が補足されることを防止するように、１０倍超過剰のブロッキングベイトとして機能し得る。
ｃｈｒ６：１１７６５４８８７～１１７６５５００６のコンセンサス配列の生成に使用した配列
表１
実施例２
ＲＯＳイントロン３１のブロッキングベイトの同定
ＲＯＳイントロン３１のブロッキングベイトの同定
ＲＯＳ１イントロン３１（ｃｈｒ６：１１７６５４１０８～１１７６５４２２７）からの第２のベイトを、同様の方法で検討した。１２０ｎｔのベイトに１２の変更を加え、再び、ゲノムに完全にマッチしないコンセンサス配列が得られた。コンセンサス配列にマッチする上位２００位は、ＲＯＳ１配列は含まなかった。したがって、このコンセンサス配列（配列番号２ ＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＡＡＧＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＡＡＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴ）もブロッキングベイトとしても使用され得る。
ｃｈｒ６：１１７６５４１０８～１１７６５４２２７のコンセンサス配列の生成に使用した配列
表２
関連する相同配列に問題がある標的化ＲＯＩの全領域に同じ方法の適用は、それらの領域についてより良いカバレッジおよびより少ない偽陽性をもたらし、配列決定アッセイの価値を高め得る。一般的に、これらのタグ付けられていないベイトは高いモル濃度で添加され得、それらのモル濃度は、性能を最適化するために個々にまたはグループとして調節され得る。個々の最適化は、経験的に、またはミスマッチの数、予想されるＴｍ、ＧＣ含量、ゲノム中のホモログの頻度、および／または他の手段などのベイト配列の特性を用いて行い得る。
実施例３
ＲＯＳイントロン３１のブロッキングベイトの同定
実施例３
ＲＯＳイントロン３１のブロッキングベイトの同定
ＲＯＳ１イントロン３１の反復領域における選択されたベイトを以下に示す。修飾されたブロッキングベイトのための提案された配列は、小文字またはダッシュで変更された実際の各ベイトの下に記載されている。これらは、ブロッキングベイトの使用によって得られた改善を試験するために使用し得る。
表３
本発明は、上記の実施例を参照して説明されたが、修正および変形が本発明の精神および範囲内に包含されることが理解されよう。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (20)
- 標的配列の配列決定方法であって、
ａ）試料核酸を捕捉核酸分子およびブロッキング核酸分子とハイブリダイズさせる工程であって、該試料核酸が該標的配列および非標的配列を含む、工程；
ｂ）該標的配列にハイブリダイズした該捕捉核酸分子を単離する工程；および
ｃ）該単離された標的配列を配列決定する工程
を含む、方法。 - 前記非標的配列が、核酸の繰り返し領域および／または関連領域を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ブロッキング核酸分子および前記捕捉核酸分子が、少なくとも約６０個～少なくとも１２０個の核酸を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記捕捉核酸が標識されている、請求項１記載の方法。
- 前記捕捉核酸が、放射性ホスフェート、ビオチン、フルオロフォア、酵素またはそれらの組み合わせからなる群から選択される標識で標識されている、請求項４に記載の方法。
- 前記ブロッキング核酸分子が、前記捕捉核酸分子の１０倍過剰に存在する、請求項１に記載の方法。
- 前記ブロッキング核酸分子が、前記捕捉核酸分子に対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記ブロッキング核酸分子が、前記捕捉核酸分子と異なる少なくとも約４個の核酸分子を有する、請求項１記載の方法。
- 前記標的配列が、少なくとも約６０個～少なくとも約１２０個の核酸を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記配列決定する工程が次世代配列決定を含む、請求項１記載の方法。
- 標的配列の配列決定特異性および／または精度を改善する方法であって、
ａ）試料核酸を捕捉核酸分子およびブロッキング核酸分子とハイブリダイズさせる工程であって、該試料核酸が、該標的配列および非標的配列を含む、工程；
ｂ）該標的配列にハイブリダイズした該捕捉核酸分子を単離する工程；および
ｃ）該標的配列を配列決定する工程
を含む、方法。 - 前記非標的配列が核酸の繰り返し領域および／または関連領域を含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記ブロッキング核酸分子および前記捕捉核酸分子が、少なくとも約６０個～少なくとも１２０個の核酸を含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記捕捉核酸が標識されている、請求項１１に記載の方法。
- 前記捕捉核酸が、放射性ホスフェート、ビオチン、フルオロフォア、酵素またはそれらの組み合わせからなる群から選択される標識で標識されている、請求項１４記載の方法。
- 前記ブロッキング核酸分子が、前記捕捉核酸分子の１０倍過剰に存在する、請求項１１に記載の方法。
- 前記ブロッキング核酸分子が、前記捕捉核酸分子に対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する、請求項１１に記載の方法。
- 前記ブロッキング核酸分子が、前記捕捉核酸分子と異なる少なくとも約４個の核酸分子を有する、請求項１１に記載の方法。
- 前記標的配列が、少なくとも約６０個～少なくとも１２０個の核酸を含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記配列決定する工程が次世代配列決定を含む、請求項１１に記載の方法。
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