JP2023522212A - 治療用ｍｕｓｋ抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヒト筋特異的チロシンタンパク質キナーゼ(MuSK)に結合し、活性化することができる抗体ベースの分子、例えば全長抗体、その抗原結合ドメイン、及び抗体誘導体に関する。本発明は、前記MuSK抗体を使用して神経筋症状を治療する方法を更に開示する。

Description

本出願は、2020年4月17日に出願された米国仮特許出願第63/011,986号、2020年6月12日に出願された同第63/038,633号、及び2020年11月11日に出願された同第63/112,375号の利益を主張するものであり、これらは全体が参照により本明細書に組み込まれる。
分野
本発明は、ヒト筋特異的チロシンタンパク質キナーゼ(MuSK)に結合し、活性化することができる抗体ベースの分子、例えば全長抗体、その抗原結合ドメイン、及び抗体誘導体に関する。本発明は、前記MuSK抗体を使用して神経筋症状を治療する方法を更に開示する。
背景
筋特異的キナーゼ(MuSK)は、神経筋接合部(NMJ)の確立及び維持のために必須の受容体型チロシンキナーゼである。神経由来のヘパリン硫酸プロテオグリカンであるアグリンと、アグリン受容体であるLRP4によるMuSKの活性化は、NMJのシナプス後側のアセチルコリン受容体(AChR)のクラスター化につながり、神経筋伝達及び筋収縮を可能にする。MuSKのエクトドメインは、3つの免疫グロブリン様ドメイン(Ig様ドメイン1～3)、及びWntの受容体であるFrizzledタンパク質におけるドメインに関連するシステインリッチドメイン(Fz-CRD)を含む。
多くの神経筋障害は、機能低下したNMJによって特徴付けられる。シナプスを確立し、維持するためのMuSKシグナル伝達の重要性により、MuSKを刺激することは、これらの障害に対する治療的可能性を有しうると推測させる。この仮説に沿って、筋萎縮性側索硬化症(ALS)のマウスモデルにおいて、MuSK過剰発現が1カ月を超えて神経支配及び運動機能を維持したことが実証された。加えて、いくつかのモノクローナルMuSK結合scFvが、ファージディスプレイを使用して同定された。これらのMuSKバインダーの1つは、(マウス化)IgG形態で作製され、ALSマウスで試験も行われた(Cantorら、「Preserving Neuromuscular Synapses in ALS by Stimulating MuSK with a Therapeutic Agonist Antibody」、Elife 7:e34375頁(2018)、及びSengupta-Ghoshら、「Muscle Specific Kinase(MuSK)Activation Preserves Neuromuscular Junctions in the Diaphragm but is not Sufficient to Provide a Functional Benefit in the SOD1G93A Mouse Model of ALS」、Neurobiol. Dis. 124:340～352頁(2019)参照)。どちらの研究も、抗体#13を、SOD1-G93Aマウスに受動的に移行させ、抗体#13による処置が、モック治療マウスと比較して、NMJの神経支配を改善し、筋肉の除神経を遅らせることを実証した。Cantorら、「Preserving Neuromuscular Synapses in ALS by Stimulating MuSK with a Therapeutic Agonist Antibody」、Elife 7:e34375頁(2018)は、更に、運動ニューロンの生存率と筋肉機能が改善し、寿命のわずかな延長をもたらしたことを実証した。これらの研究は、MuSKアゴニストがALSマウスにおいて神経筋シナプスの構造的完全性を少なくとも維持する能力を有することを実証しているが、筋肉機能の改善を確認するためには、更なる研究が必要である。他の神経筋障害におけるMuSKアゴニスト抗体の治療可能性を評価することは、重要な新しい研究方向のようである(Vergoossenら、「MuSK Antibodies, Lessons Learned from Poly- and Monoclonality」、J. Autoimmun. 112: 102488頁(2020))。
米国特許第5,225,539号 米国特許第5,530,101号 米国特許第5,585,089号 米国特許第5,859,205号 米国特許第6,407,213号 米国特許第6,881,557号
Cantorら、「Preserving Neuromuscular Synapses in ALS by Stimulating MuSK with a Therapeutic Agonist Antibody」、Elife 7:e34375頁(2018) Sengupta-Ghoshら、「Muscle Specific Kinase(MuSK)Activation Preserves Neuromuscular Junctions in the Diaphragm but is not Sufficient to Provide a Functional Benefit in the SOD1G93A Mouse Model of ALS」、Neurobiol. Dis. 124:340～352頁(2019) Vergoossenら、「MuSK Antibodies, Lessons Learned from Poly- and Monoclonality」、J. Autoimmun. 112: 102488頁(2020) Carillo, H. and Lipman, D.、SIAM、J. Applied Math.、48:1073頁(1988) Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research 12(1): 387頁(1984) Altschul, S. F.ら、J. Mol. Biol. 215:403～410頁(1990) Madeira, F.ら、Nucleic Acids Research 47(W1): W636～W641頁(2019) Needleman and Wunsch、J. Mol. Biol. 48(3):443～453頁(1970) enikoff and Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915～10919頁(1992) Burdenら、「The Role of MuSK in Synapse Formation and Neuromuscular Disease」、Cold Spring Harb. Perspect. 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本発明は、当該技術分野におけるこの不足及び他の不足を克服することを目的とする。
図面の簡単な説明
図1A～図1Dは、Dok7のC末端領域がシナプス分化に必須であることを実証する。図1Aは、Dok7の二量体化及びチロシンリン酸化MuSKへの結合を媒介する、Dok7におけるプレクストリン相同性(PH)ドメイン及びホスホチロシン結合(PTB)ドメインを示す概略図である。C末端領域は、MuSKへのDok7の動員後にリン酸化される2つのチロシン残基Y396及びY406を含む。Dok7 1124_1127 dupマウス(本明細書においてDok7 CMマウス及びDok7CM/CMマウスとも称される)は、Dok7タンパク質のフレームシフト、中途終結、並びにY396及びY406の欠失を含む切断につながる、Dok7先天性重症筋無力症を有するヒトに見られる最も一般的な変異を示す。Dok7 Y396F;Y406F(Dok7 2YF)マウスは、Y396及びY406をフェニルアラニンで置き換えた変異を有する。 図1A～図1Dは、Dok7のC末端領域がシナプス分化に必須であることを実証する。図1Bは、交雑Dok7CM/+ C57BL/6マウスに由来する子孫のカイ二乗分析を示し、Dok7CM/CMホモ接合マウスが生後に生存しなかったことを示す。対照的に、Dok72YF/2YFマウスは、P5～P10で遺伝子型決定した場合、予想される数で存在していた。 図1A～図1Dは、Dok7のC末端領域がシナプス分化に必須であることを実証する。図1Cは、E18.5での野生型、Dok7CM/CM及びDok72YF/2YFのマウス由来の横隔膜筋を、Alexa488-α-BGTで染色してAChR(赤色)を標識し、ニューロフィラメント/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経終末(緑色)を標識した蛍光顕微鏡画像を示す。スケールバー=10μm。 図1A～図1Dは、Dok7のC末端領域がシナプス分化に必須であることを実証する。図1Dは、E18.5において、シナプス数、シナプスサイズ、及びシナプスAChRの密度がそれぞれ1/4.5倍、1/4倍、1/5倍に減少したことを示すグラフを示す。Dok72YF/2YFマウスでは、シナプスサイズは正常であったが、シナプスAChRの密度が軽度に(15%)減少した。Dok72YF/2YFマウスのシナプスの形状は、細長く見えることが多かった。グラフは、各遺伝子型の3匹のマウスについての値及びこれらのマウスの平均±SEM値を示す(n.s.、有意ではない;p、****<0.00005)。 図2A～図2Dは、切断型Dok7が十分に発現され、MuSKチロシンリン酸化がDok7CM/CMマウスにおいて著しく減少することを実証する。図2A～図2Bは、Dok7を、E18.5の野生型、Dok7CM/+及びDok72YF/2YFのマウスの筋肉から免疫沈降させたイムノブロットである。ブロットを、Dok7に対する抗体でプローブした(図9A～図9B)。図9Aは、Dok7CMによってコードされた切断型Dok7(t-Dok7)が、予測されたサイズで移動するが、野生型Dok7よりも低い1/3倍のレベルで発現されることを示す。野生型及び変異型タンパク質の定量及び比較は、2つのタンパク質が同じライセートから共免疫沈降される場合に単純化した;同様の結果が、野生型マウス及びDok7CM/CMマウスにおける発現の比較によって得られた(図10A～図10C)。散布図は、各遺伝子型からの8匹のマウスについての値及びの平均±SEM値を示す(p、****<0.00005)。 図2A～図2Dは、切断型Dok7が十分に発現され、MuSKチロシンリン酸化がDok7CM/CMマウスにおいて著しく減少することを実証する。図2A～図2Bは、Dok7を、E18.5の野生型、Dok7CM/+及びDok72YF/2YFのマウスの筋肉から免疫沈降させたイムノブロットである。図2Bは、変異Dok7Y396F;Y406Fタンパク質が予測されたサイズで移動し、発現が野生型Dok7と同様であることを示す。散布図は、各遺伝子型の11匹のマウスについての値及び平均±SEM値を示す(n.s.、有意ではない)。 図2A～図2Dは、切断型Dok7が十分に発現され、MuSKチロシンリン酸化がDok7CM/CMマウスにおいて著しく減少することを実証する。図2C～図2Dは、MuSKを、E18.5の野生型、Dok7CM/CM、及びDok72YF/2YFマウスの筋肉から免疫沈降させ、ブロットをMuSK又はホスホチロシンに対する抗体でプローブしたことを示す。MuSKリン酸化を定量し、MuSK発現に対して正規化した。図2Cは、MuSKリン酸化が、Dok7CM/CMマウスにおいて、野生型マウスより低く1/7倍であることを示している。散布図は、各遺伝子型の7匹のマウスについての値及び平均±SEM値を示す(p、****<0.00005)。 図2A～図2Dは、切断型Dok7が十分に発現され、MuSKチロシンリン酸化がDok7CM/CMマウスにおいて著しく減少することを実証する。図2C～図2Dは、MuSKを、E18.5の野生型、Dok7CM/CM、及びDok72YF/2YFマウスの筋肉から免疫沈降させ、ブロットをMuSK又はホスホチロシンに対する抗体でプローブしたことを示す。MuSKリン酸化を定量し、MuSK発現に対して正規化した。図2Dは、MuSKチロシンリン酸化が、Dok72YF/2YFマウス及び野生型マウスにおいて類似していることを示す。散布図は、各遺伝子型の5匹のマウスについての値及び平均±SEM値を示す(n.s.、有意ではない)。 図3A～図3Dは、シナプスへの及びMuSK/Dok7複合体へのCrKの動員が、Dok7CM/CMマウスにおいて低下していることを実証する。図3Aは、Crk-L(緑色)が、E18.5の野生型マウス由来の前脛骨筋の断面のシナプスにおいてAChRと共局在していることを示す画像である。Crk-L染色は、Dok7CM/CMマウス及びDok72YF/2YFマウスのシナプス部位で持続するが、動員は、Dok7CM/CMマウスのシナプスで減少しているようである。スケールバー=5μm。 図3A～図3Dは、シナプスへの及びMuSK/Dok7複合体へのCrKの動員が、Dok7CM/CMマウスにおいて低下していることを実証する。図3Bは、MuSKを、E18.5の野生型、Dok7CM/CM及びDok72YF/2YFのマウスの筋肉から免疫沈降させ、ブロットを、MuSK又はCrkに対する抗体でプローブしたことを示す。MuSK複合体と共単離したCrkのレベルを、MuSK発現に対して正規化した。CrkとMuSK複合体との会合は、Dok7CM/CMマウスで1/2.8倍に減少した;散布図は、各遺伝子型の8匹のマウスについての値及び平均±SEM値を示す(p、****<0.00005)。CrkとMuSK複合体との会合は、Dok72YF/2YFマウスで24%減少した;4匹のマウスについての平均±SEM値を示す(p、*<0.05、****<0.00005)。 図3A～図3Dは、シナプスへの及びMuSK/Dok7複合体へのCrKの動員が、Dok7CM/CMマウスにおいて低下していることを実証する。図3Cは、MuSK傍膜領域(JM)が、Dok7に対する結合部位(配列番号129の残基547～554)及びCrkに対する潜在的な結合部位(配列番号129の残基554～557)を含むことを示す。 図3A～図3Dは、シナプスへの及びMuSK/Dok7複合体へのCrKの動員が、Dok7CM/CMマウスにおいて低下していることを実証する。図3Dは、HAタグ付き形態のDok7又はCrk-Iを、トランスフェクトされた293T細胞から発現させた実験結果を示す。MuSK JM(配列番号272～275)由来のビオチンタグ付きペプチドを、トランスフェクトされた293T細胞由来のライセートと共にインキュベートした。ビオチンタグ付きペプチドをストレプトアビジン-アガロースビーズで捕捉し、単離されたタンパク質のブロットを、HA及びCrkに対する抗体でプローブした。Dok7及びCrkはいずれも、非リン酸化ペプチドよりもホスホペプチドに対して、より大きな結合を示した。MuSK JMホスホペプチドのコンセンサス(NPXY)PTB結合部位における-3位の重要アスパラギンの変異は、Dok7の結合を妨げたが、Crkの結合は妨げなかった。対照的に、MuSK JMホスホペプチドのコンセンサスSH2部位の変異は、CrkのMuSK JMホスホペプチドへの結合を妨げた。 図4A～図4Fは、MuSKに対する抗体がヒト及びマウスのMuSKに高い親和性で結合し、培養筋管においてMuSKリン酸化を刺激し、インビボでMuSKに結合することを実証する。図4Aは、ビーズ結合アッセイを用いて一価Fabの形態で試験した、異なるMuSK抗原に対する抗体クローンのKD値を示す表である。KD値は、n=3からの平均値及びs.d.である。滴定を図12A～図12Cに示す。 図4A～図4Fは、MuSKに対する抗体がヒト及びマウスのMuSKに高い親和性で結合し、培養筋管においてMuSKリン酸化を刺激し、インビボでMuSKに結合することを実証する。図4Bは、C2筋管を、ストレプトアビジンとのプレインキュベーションによってそれぞれ四量体化した、陰性対照Fab(アイソタイプ)を含むビオチン化Fabで30分間処理した実験の結果を示す。MuSKを免疫沈降させ、ウエスタンブロットをMuSK又はホスホチロシン(pTyr)に対する抗体でプローブした。MuSKリン酸化を、総MuSK発現に対して正規化した。散布図は、各Fabについての値及び平均±SEMを示す。 図4A～図4Fは、MuSKに対する抗体がヒト及びマウスのMuSKに高い親和性で結合し、培養筋管においてMuSKリン酸化を刺激し、インビボでMuSKに結合することを実証する。図4Cは、ビーズベースの結合アッセイを用いて試験した、固定化hFz、hECD、mFz、及びmECDに対するIgG抗体のKD値を示す表である。KD値は、n=3からの平均値及びs.d.である。滴定を図12A～図12Cに示す。 図4A～図4Fは、MuSKに対する抗体がヒト及びマウスのMuSKに高い親和性で結合し、培養筋管においてMuSKリン酸化を刺激し、インビボでMuSKに結合することを実証する。図4Dは、C2筋管を、0.5nMのアグリン、マウスIgG2若しくはヒトIgG1のFc領域又はアイソタイプ対照のいずれかを伴う10nMの抗体X2、X3又はX17で処理し、MuSKを図4Bに記載されるように分析した実験の結果を示す。散布図は、MuSK発現に対して正規化したMuSKリン酸化の値と平均±SEMを示す。 図4A～図4Fは、MuSKに対する抗体がヒト及びマウスのMuSKに高い親和性で結合し、培養筋管においてMuSKリン酸化を刺激し、インビボでMuSKに結合することを実証する。図4Eは、X17-mIgG2a-LALAPGの血液半減期測定値を示すプロットである。3匹のマウスについての単一指数曲線による蛍光強度の中央値の非線形最小二乗フィッティングを示す。半減期は4.9±0.2日と決定された。 図4A～図4Fは、MuSKに対する抗体がヒト及びマウスのMuSKに高い親和性で結合し、培養筋管においてMuSKリン酸化を刺激し、インビボでMuSKに結合することを実証する。図4Fは、MuSK抗体mIgG2a-X17がシナプスでMuSKと会合し、10mg/kgでMuSKを飽和させることを実証する。P30野生型マウスに、MuSKアゴニスト抗体mIgG2a-X17(0、0.4、2、10mg/kg)を腹腔内注射した。2日後、マウスを屠殺し、横隔膜筋をAlexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、Alexa647ヤギ抗ヒトIgG, F(ab')2断片特異的で染色してX17を標識した。シナプスにおけるmIgG2a-X17の飽和レベルを、X17対AChRシグナル強度の比によって測定した。各濃度における3匹のマウスからの平均±SEM値を示す。 図5A～図5Eは、MuSKに対するアゴニスト抗体mIgG2a-X17が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図5Aは、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドにおけるDok7 1124_1127 dupマウスが、生後1～2週間生存することを示す。混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4に、アゴニスト抗体mIgG2a-X17又はアイソタイプ等価陰性対照で処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡したが、P4、P24及びP44でmIgG2a-X17を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=12)は、成体として生存した。X17を注射した12匹の変異体マウスのうち、6匹をP60で屠殺した。X17を注射した3匹の変異体マウスは、生後3週間で、第2の計画注射の直前に死んだ。3匹の変異体マウスを、疾患再発実験のために年を取らせた。散布図は、各マウスについての生存時間及び平均±SEM値を示す(p、****<0.00005)。 図5A～図5Eは、MuSKに対するアゴニスト抗体mIgG2a-X17が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図5Bは、mIgG2a-X17を注射したDok7 1124_1127 dupマウスでは、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupとは異なり、体重が増加したことを示す。Dok7 1124_1127 dupマウスに、mIgG2a-X17(10mg/kg)をP4、P24及びP44で注射した。 図5A～図5Eは、MuSKに対するアゴニスト抗体mIgG2a-X17が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図5Cは、mIgG2a-X17が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおけるシナプス発達を回復させることを実証する。P60野生型マウス及びDok7 1124_1127マウスからの横隔膜筋を、Alexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、βIIIチューブリン/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経終末を標識した。mIgG2a-X17で処置したDok7 1124_1127 dupマウスにおいて、シナプスは、単純なプラーク様形状から、成熟マウス神経筋シナプスに特徴的な複雑なプレッツェル様形状に成熟した。スケールバー=10mm。mIgG2a-X17で処置したDok7 1124_1127 dupマウスにおいて、シナプス数、シナプスサイズ、及びシナプスAChRの密度は、それぞれ正常レベルの60%、60%、及び68%に回復した。3匹のマウスからの平均±SEM値(マウスあたり>50シナプス)を示す(n.s.、**<0.005、****<0.00005)。 図5A～図5Eは、MuSKに対するアゴニスト抗体mIgG2a-X17が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図5Dは、X17でレスキューされたDok7 1124_1127 dupマウスの脛骨前筋から単離された単一筋線維において、Crk-L(中央パネル)が、AChR(左パネル)及び神経末端(右パネル)によってマークされたシナプスに集中していることを示す画像である。3匹のマウスからの平均±SEM値(1匹当たり10シナプス; n.s.、有意でない)。スケールバー=5μm。 図5A～図5Eは、MuSKに対するアゴニスト抗体mIgG2a-X17が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図5Eは、mIgG2a-X17が、Dok7 1124_1127 dupマウスの運動パフォーマンスをレスキューすることを示すグラフである。握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時によって評価されるように、Dok 1124 1127 dupの運動パフォーマンスは、mIgG2a-X17による処置によって完全に回復した。散布図は、18匹の野生型マウス及びX17でレスキューした9匹のDok7 1124_1127 dupマウスの値及び平均±SEM値を示す(n.s.、有意でない)。 図6A～図6Cは、mIgG2a-X17が、成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおいて疾患再発を好転させることを実証する。マウスに、mIgG2a-X17(10mg/kg)を、P4、P24及びP44、又はP4、P18のいずれかで注射し、次いで抗体処置を中止した。これらのDok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し、運動性を数カ月間維持したが、最終的には、体重が減少し始め(図6A～図6B)、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時(図6C)によって評価されるように、運動障害を示し始めた。この時点で、マウスに、mIgG2a-X17を再注射しないか(図6A)、又はmIgG2a-X17(図6B)を再注射した。再注射されていないマウスは数日以内に死亡したが(図6A)、一方で、mIgG2a-X17処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し始め(図6B)、処置の再開後1週間までに、それらの運動障害が好転した(図6C)。Dok7 1124_1127 dupマウスは、ロータロッドでの運動パフォーマンスが5.5倍向上し、握力が1.25倍向上した(p、*<0.05、***<0.0005(図6C))。 図6A～図6Cは、mIgG2a-X17が、成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおいて疾患再発を好転させることを実証する。マウスに、mIgG2a-X17(10mg/kg)を、P4、P24及びP44、又はP4、P18のいずれかで注射し、次いで抗体処置を中止した。これらのDok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し、運動性を数カ月間維持したが、最終的には、体重が減少し始め(図6A～図6B)、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時(図6C)によって評価されるように、運動障害を示し始めた。この時点で、マウスに、mIgG2a-X17を再注射しないか(図6A)、又はmIgG2a-X17(図6B)を再注射した。再注射されていないマウスは数日以内に死亡したが(図6A)、一方で、mIgG2a-X17処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し始め(図6B)、処置の再開後1週間までに、それらの運動障害が好転した(図6C)。Dok7 1124_1127 dupマウスは、ロータロッドでの運動パフォーマンスが5.5倍向上し、握力が1.25倍向上した(p、*<0.05、***<0.0005(図6C))。 図6A～図6Cは、mIgG2a-X17が、成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおいて疾患再発を好転させることを実証する。マウスに、mIgG2a-X17(10mg/kg)を、P4、P24及びP44、又はP4、P18のいずれかで注射し、次いで抗体処置を中止した。これらのDok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し、運動性を数カ月間維持したが、最終的には、体重が減少し始め(図6A～図6B)、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時(図6C)によって評価されるように、運動障害を示し始めた。この時点で、マウスに、mIgG2a-X17を再注射しないか(図6A)、又はmIgG2a-X17(図6B)を再注射した。再注射されていないマウスは数日以内に死亡したが(図6A)、一方で、mIgG2a-X17処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し始め(図6B)、処置の再開後1週間までに、それらの運動障害が好転した(図6C)。Dok7 1124_1127 dupマウスは、ロータロッドでの運動パフォーマンスが5.5倍向上し、握力が1.25倍向上した(p、*<0.05、***<0.0005(図6C))。 図7は、Dok7 CM(つまりDok7 1124_1127 dup)マウスにおけるシナプスの終板幅、除神経、共局在を示す。終板バンド(破線)の幅は、Dok7CM/CMマウスで45%増加したが、Dok72YF/2YFマウスでは正常であった。Dok7CM/CMマウスにおいて、AChRクラスターの17%は、神経終末によって完全に対抗されておらず、筋線維が除神経されたことが示唆された。Dok7CM/CMマウスにおける多くのシナプスは、シナプスにおけるAChR濃縮領域の半分近くが神経終末と並置されていなかったため、部分的に神経支配されていた。各遺伝子型の3匹のマウスからの平均±SEM値(1匹当たり100シナプス)を示す(p、*<0.05; p、**<0.005; p、***<0.0005; p、****<0.00005; n.s. 有意ではない)。スケールバー=50μm。 図8は、Dok7のカルボキシ末端領域におけるY396及びY406Fが、神経筋シナプスの成熟のために重要でないことを実証する。P35の野生型マウス及びDok72YF/2YFマウス由来の横隔膜筋をAlexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、ニューロフィラメント/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経終末を標識した。スケールバー=10μm。Dok72YF/2YFマウスにおいて、シナプスは、プラーク様形状から、成熟マウス神経筋シナプスに特徴的な複雑なプレッツェル様形状に成熟した。シナプスの数は、野生型マウス及びDok72YF/2YFマウスにおいて同様であった。シナプスAChRの密度及びシナプスサイズは、Dok72YF/2YFマウスにおいて、野生型マウスよりも、それぞれ15%及び20%大きかった。3匹のマウスからの平均±SEM値(1匹当たり100シナプス)を示す(n.s.、有意ではない; p、***<0.0005、****<0.00005)。 図9A～図9Bは、野生型及び切断型Dok7が、Dok7のPH/PTBドメインに対する抗体で、同様の効率で検出されることを実証する。図9Aは、HEK293細胞に、Dok7 1124_1127 TGCC dupによってコードされるHAタグ化Dok7又はHAタグ化切断型Dok7のいずれかを発現するプラスミドを一過性にトランスフェクトした実験の結果を示す。細胞ライセート中のタンパク質(三連)をSDS-PAGEによって分離し、ウエスタンブロットをDok7のPTBドメインに対するウサギ抗体又はHAに対するモノクローナル抗体のいずれかでプローブした。野生型及び切断型のDok7タンパク質についてのバンドの灰色レベルを測定し、ウエスタンブロット法で検出したレベルをDok7に対するウサギ抗体で正規化し、加えて、ウエスタンブロット法で検出したレベルをHAに対する抗体で正規化した。野生型Dok7の比率は、切断型Dok7の比率と同等であり、Dok7に対するウサギ抗体が、ウエスタンブロット法により同様の効率で野生型Dok7タンパク質及び切断型Dok7タンパク質を検出したことを示した。 図9A～図9Bは、野生型及び切断型Dok7が、Dok7におけるPH/PTBドメインに対する抗体で同様の効率で検出されることを実証する。図9Bは、野生型及び切断型のDok7を、Dok7のPTBドメインに対するヤギ抗体によって同様の効率で免疫沈降させた実験の結果を示す。HEK293細胞に、Dok7 1124_1127 TGCC dupによってコードされるHAタグ化Dok7及びHAタグ化切断型Dok7を発現するプラスミドを一過性に同時トランスフェクトした。Dok7タンパク質を、HAに対するモノクローナル抗体又はDok7におけるPTBドメインに対するヤギ抗体のいずれかで細胞ライセート(三連)から免疫沈降させ、ウエスタンブロットを、HAに対するモノクローナル抗体でプローブした。灰色レベルを測定し、対照、非トランスフェクト試料中のバックグラウンドバンドのレベルを差し引き、Dok7に対するヤギ抗体で免疫沈降させた各タンパク質の値を、HAに対する抗体で免疫沈降させた同じタンパク質の値に対して正規化した。この比率は、野生型Dok7タンパク質及び切断型Dok7タンパク質について同等であり、Dok7に対するヤギ抗体が野生型タンパク質及び切断型タンパク質を同様の効率で免疫沈降させたことを示した。図9A～図9Bの散布図は、3つの実験からの値及び平均±SEMを示す(n.s.、有意ではない)。 図10A～図10Cは、Dok7 RNAの発現が、Dok7CM/CMマウスにおいて正常であることを実証する。図10Aは、Dok7 RNAのRT-PCR増幅により、E18.5の野生型マウス及びDok7CM/CMマウスからの筋肉でDok7mRNAレベルが類似していることが示されたことを示す。GAPDHをローディング対照として使用した。 図10A～図10Cは、Dok7 RNAの発現が、Dok7CM/CMマウスにおいて正常であることを実証する。図10Bは、Dok7 mRNAレベルをqPCRによって定量した実験の結果を示す。結果は、Dok7 mRNAレベルが、Dok7CM/CMマウスにおいて正常であることを示した。散布図は、3匹のマウスからの値及び平均±SEM値を示す(n.s.、有意ではない)。 図10A～図10Cは、Dok7 RNAの発現が、Dok7CM/CMマウスにおいて正常であることを実証する。図10Cは、Dok7を、E18.5の野生型マウス及びDok7CM/CMマウスの筋肉から免疫沈降させ、ブロットを、Dok7に対する抗体でプローブした実験の結果を示す。Dok7CM/CMによってコードされる切断型Dok7(t-Dok7)は、予測されるサイズで移行するが、野生型Dok7より低く1/3倍のレベルで発現される。散布図は、各遺伝子型からの10匹のマウスについての値及び平均±SEM値を示す(p、****<0.00005)。 図11は、Y396及びY406が、唯一のチロシン残基でない場合に、アグリン刺激によってリン酸化されるDok7中の主要なチロシン残基であることを実証する。野生型マウス及びDok72YF/2YFマウスから筋細胞株を作製し、培養した筋管を、アグリンで30分間処理した。MuSKを免疫沈降させ、ウエスタンブロットを、MuSK又はホスホチロシン(pTyr)に対する抗体でプローブした。アグリンは、野生型ではDok7チロシンリン酸化を刺激するが、Dok72YF/2YF筋管では刺激しない。 図12A～図12Cは、MuSK抗体クローンの結合特徴を示す。図12A～図12Cは、ビーズベースの結合アッセイを使用して試験した場合の、Fab形態のMuSKに対する抗体の固定化hFz、hECD、mFz、及びmECDへの結合滴定を示す。曲線は、1:1結合モデルの最適な適合を示す。KD値を図5Aに列挙する。図12Aと図12Bのデータセットは、異なる計器で測定され、異なるシグナル範囲となった。 図12A～図12Cは、MuSK抗体クローンの結合特徴を示す。図12A～図12Cは、ビーズベースの結合アッセイを使用して試験した場合の、Fab形態のMuSKに対する抗体の固定化hFz、hECD、mFz、及びmECDへの結合滴定を示す。曲線は、1:1結合モデルの最適な適合を示す。KD値を図5Aに列挙する。図12Aと図12Bのデータセットは、異なる計器で測定され、異なるシグナル範囲となった。 図12A～図12Cは、MuSK抗体クローンの結合特徴を示す。図12A～図12Cは、ビーズベースの結合アッセイを使用して試験した場合の、Fab形態のMuSKに対する抗体の固定化hFz、hECD、mFz、及びmECDへの結合滴定を示す。曲線は、1:1結合モデルの最適な適合を示す。KD値を図5Aに列挙する。図12Cは、図12Aと同様の方法で行った、IgG形態のMuSKに対する抗体の結合滴定を示す。 図13A～図13Dは、野生型マウスにおけるMuSKアゴニスト抗体mIgG2a-X17の長期注射が、生存、神経筋シナプスの組織化、体重増加、又は運動挙動に影響を及ぼさないことを実証する。図13Aは、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドの、P4、P24及びP44にmIgG2a-X17を注射した野生型マウス(n=4)が、屠殺されたP60まで生存した実験の結果を示す散布図である。散布図は、9匹の未注射野生型マウス及びmIgG2a-X17を注射した4匹の野生型マウスの生存時間、並びに平均±SEM値を示す(n.s.、有意ではない)。 図13A～図13Dは、野生型マウスにおけるMuSKアゴニスト抗体mIgG2a-X17の長期注射が、生存、神経筋シナプスの組織化、体重増加、又は運動挙動に影響を及ぼさないことを実証する。図13Bは、mIgG2a-X17を注射した野生型マウス(n=4)が、野生型マウス(n=9)と同様に体重が増加した実験の結果を示すプロットである。 図13A～図13Dは、野生型マウスにおけるMuSKアゴニスト抗体mIgG2a-X17の長期注射が、生存、神経筋シナプスの組織化、体重増加、又は運動挙動に影響を及ぼさないことを実証する。図13Cは、野生型マウスでのmIgG2a-X17の長期注射が、神経筋シナプスの組織化に影響を及ぼさないことを示す。P60の野生型マウス及びmIgG2a-X17を注射した野生型マウス由来の横隔膜筋を、Alexa488-α-BGTで染色してアセチルコリン受容体(AChR)を標識し、βIIIチューブリン/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経終末を標識した。mIgG2a-X17で処置した野生型マウスにおいて、シナプスは、単純なプラーク様形状から、成熟マウス神経筋シナプスに特徴的な複雑なプレッツェル様形状に成熟した。スケールバー=10mm。野生型マウスにおけるmIgG2a-X17の注射は、シナプス数、シナプスサイズ、及びAChR密度に影響を及ぼさない。各カテゴリーの2匹のマウスからの100シナプスを分析した。 図13A～図13Dは、野生型マウスにおけるMuSKアゴニスト抗体mIgG2a-X17の長期注射が、生存、神経筋シナプスの組織化、体重増加、又は運動挙動に影響を及ぼさないことを実証する。図13Dは、野生型マウスにおけるmIgG2a-X17の長期注射が運動挙動に影響を及ぼさないことを示す散布図である。mIgG2a-X17を注射した野生型マウスの運動パフォーマンスは、握力及び回転ロータロッドから落下するまでの潜時によって評価されるように、未注射野生型マウスと同様であった。散布図は、18匹の野生型マウス及びmIgG2a-X17を注射した4匹の野生型マウスについての値並びに平均±SEM値を示す(n.s.、有意ではない)。 図14A～図14Bは、混合遺伝的バックグラウンドのDok7CM/CMマウスが生後約2週間生存することを示す表である。混合遺伝的バックグラウンドマウスを使用して、Dok7CM/CMマウスの生存を分析した。C57BL/6バックグラウンドのDok7CM/+マウスを、野生型CBA、129svl、FVB又はBALB/cマウスに交配した。次いで、ヘテロ接合FI子孫を交雑させて、混合バックグラウンドのDok7CM/CMマウスを作製した。P5～P10の子孫又は死後での遺伝子型を決定した。図14Aは、F2マウスのx2平方解析を示す表であり、表は、遺伝子型の発生が偶然に起こりにくいことを示し、各混合遺伝的バックグラウンドのホモ接合Dok7CM/CMマウスが生後に生存することを示す。 図14A～図14Bは、混合遺伝的バックグラウンドのDok7CM/CMマウスが生後約2週間生存することを示す表である。混合遺伝的バックグラウンドマウスを使用して、Dok7CM/CMマウスの生存を分析した。C57BL/6バックグラウンドのDok7CM/+マウスを、野生型CBA、129svl、FVB又はBALB/cマウスに交配した。次いで、ヘテロ接合FI子孫を交雑させて、混合バックグラウンドのDok7CM/CMマウスを作製した。P5～P10の子孫又は死後での遺伝子型を決定した。図14Bは、混合遺伝的バックグラウンドのホモ接合Dok7CM/CMマウスの平均及び最大生存時間(日数)を示す表である。 図15A～図15Eは、Dok7のC末端領域が、混合遺伝的バックグラウンドのDok7CM/CMマウスにおける神経筋シナプスの完全な分化及び成熟のために不可欠であることを実証する。図15A～図15Cにおいて、E18.5及びP10における野生型マウス及びC57BL/6-CBA混合遺伝的バックグラウンドのDok7CM/CMマウス由来の横隔膜筋を、Alexa488-α-BGTで染色してAChR(赤色)を標識し、ニューロフィラメント/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経終末(緑色)を標識した。図15Aは、E18.5において、終板バンド(白色の破線)が、Dok7CM/CMにおいて、野生型マウスよりも30%広い幅であることを示す。更に、Dok7CM/CMマウスにおいて、AChRクラスターの15%に神経終末が存在せず、共局在指標(シナプシン/AChR)が1/3.5倍に低下した。スケールバー=50μm。3匹のマウスからの平均±SEM値を示す(p、*<0.05; p、****<0.00005)。 図15A～図15Eは、Dok7のC末端領域が、混合遺伝的バックグラウンドのDok7CM/CMマウスにおける神経筋シナプスの完全な分化及び成熟のために不可欠であることを示す。図15A～図15Cにおいて、E18.5及びP10における野生型マウス及びC57BL/6-CBA混合遺伝的バックグラウンドのDok7CM/CMマウス由来の横隔膜筋を、Alexa488-α-BGTで染色してAChR(赤色)を標識し、ニューロフィラメント/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経終末(緑色)を標識した。図15Bは、E18.5のDok7CM/CMマウスにおいて、シナプスの数、シナプスサイズ、及びシナプスAChRの密度がそれぞれ1/3.2倍、1/4.5倍、及び1/8倍に減少したことを示す。3匹のマウスからの平均±SEM値(1匹当たり100シナプス)を示す(p、****<0.00005)。スケールバー=10μm。 図15A～図15Eは、Dok7のC末端領域が、混合遺伝的バックグラウンドのDok7CM/CMマウスにおける神経筋シナプスの完全な分化及び成熟のために不可欠であることを示す。図15A～図15Cにおいて、E18.5及びP10における野生型マウス及びC57BL/6-CBA混合遺伝的バックグラウンドのDok7CM/CMマウス由来の横隔膜筋を、Alexa488-α-BGTで染色してAChR(赤色)を標識し、ニューロフィラメント/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経終末(緑色)を標識した。図15Cは、P10において、シナプスの数、シナプスサイズ及びシナプスAChRの密度が、Dok7CM/CMマウスにおいて、1/10倍を超えて減少したことを示す。加えて、神経終末は、Dok7CM/CMマウスにおけるAChRクラスターの20%から消失している。3匹のマウスからの平均±SEM値(1匹当たり100シナプス)を示す(p、****<0.00005)。 図15A～図15Eは、Dok7のC末端領域が、混合遺伝的バックグラウンドのDok7CM/CMマウスにおける神経筋シナプスの完全な分化及び成熟のために不可欠であることを示す。図15Dは、Dok7を、E18.5の野生型マウス及びDok7CM/CMマウスの筋肉から免疫沈降させ、ブロットを、Dok7に対する抗体でプローブしたことを示す。Dok7CM/CMによってコードされる切断型Dok7(t-Dok7)は、予測されるサイズで移行するが、野生型Dok7よりも低い1/3倍のレベルで発現される。Dok7発現及びMuSKリン酸化は、C57BL/6-CBA混合品種及びC57BL/6近交系マウスにおいて同程度に減少したため、他の因子が、混合遺伝的バックグラウンドにおいて生存率の増加をもたらしたと推定される。散布図は、各遺伝子型からの8匹のマウスについての値及び平均±SEM値を示す(p、****<0.00005)。 図15A～図15Eは、Dok7のC末端領域が、混合遺伝的バックグラウンドのDok7CM/CMマウスにおける神経筋シナプスの完全な分化及び成熟のために不可欠であることを示す。図15Eは、MuSKを、El8.5の野生型、Dok7CM/CMの筋肉から免疫沈降させ、ブロットをMuSK、ホスホチロシン、及びCrkに対する抗体でプローブしたことを示す。MuSK複合体と共分離したホスホチロシン及びCrkのレベルを、MuSK発現に正規化した。CrkのMuSK複合体との会合は、Dok7CM/CMマウスにおいて、野生型マウスよりも低く1/2.8倍であった。MuSKチロシンリン酸化は、Dok7CM/CMマウスにおいて、野生型マウスより低く、1/5倍である。散布図は、各遺伝子型の3匹のマウスについての値及び平均±SEM値を示す(p、**<0.005、****<0.00005)。スケールバー=10μm。 図16A～図16Bは、潜在的なオフターゲット部位の配列解析が、これらの遺伝子の変異を同定することができなかったことを示す表である。図16Aは、Dok 7CM マウスにおける上位の潜在的オフターゲット遺伝子配列1～5(配列番号280～284)を示す。 図16A～図16Bは、潜在的なオフターゲット部位の配列解析が、これらの遺伝子の変異を同定することができなかったことを示す表である。図16Bは、Dok72YFマウスにおける上位の潜在的オフターゲット遺伝子配列1～5(配列番号285～289)を示す。 図17A～図17Cは、抗体X2及びX3が、X17と同様に、Dok7CM/CMマウスを、早期致死性からレスキューしたことを示すグラフである。図17Aは、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7CM/CMマウスに、P4で10mg/kgのmIgG2a-X3を注射した実験の結果を示す(図46Bも参照)。この用量で、X3は、マウスを致死性からレスキューできなかった。 図17A～図17Cは、抗体X2及びX3が、X17と同様に、Dok7CM/CMマウスを、早期致死性からレスキューしたことを示すグラフである。図17Bは、対照的に、P4で20mg/kgのmIgG2a-X3を用いた投与が、マウスを早期致死性からレスキューしたことを示す(図47Bも参照)。これらのマウスに、続いて10mg/kgのmIgG2a-X3をP18にて注射したところ、マウスを屠殺したP60まで生存した。 図17A～図17Cは、抗体X2及びX3が、X17と同様に、Dok7CM/CMマウスを、早期致死性からレスキューしたことを示すグラフである。図17Cは、Dok7CM/CMマウスに20mg/kgのhIgG1-X2をP4で投与したところ、同様に、Dok7CM/CMマウスを早期致死性からレスキューしたことを示す。その後、10mg/kgのhIgG1-X2をP18で注射したところ、Dok7CM/CMマウスは、マウスが屠殺されるP60まで生存した。 図18は、ラマ免疫Fabライブラリのファージディスプレイ選択の戦略の概要を示す概略図である。 図19は、ヒト又はマウスMuSKへの抗体の結合不良を明らかにするELISA実験の結果を示す。 図20は、3B2が、Dok7 1124_1127 dupマウスの生後早期致死性をレスキューすることを実証するプロットである。 図21は、C2C12リン酸化アッセイにおける、本発明のMuSK抗体によって誘導されるリン酸化パーセントを示すグラフである。 図22は、ELISAを介して測定されたヒト、カニクイザル、ラット又はマウスのMuSKへの3B2抗体及び3B2抗体バリアントの結合親和性を示すグラフである。 図23は、BiacoreにおけるpH7.4及びpH5.5での、MuSKアゴニストFab(Fab X17、Fab X2、Fab X2m4、Fab X3、Fab 3B2、Fab 3B2g2m1、Fab X9)のマウスMuSKに対する結合を示すグラフである。 図24は、MuSKリン酸化が、天然リガンドのアグリン、及びMuSKのFzドメインを標的とするアゴニストMuSK-mAb 3B2g2m1によって共刺激されうることを示す散布図である。 図25A～図25Bは、MuSKに対するアゴニスト抗体mIgG2a-X17とhIgG-X17との組合せが、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図25Aは、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスが生後1～2週間生存することを示す散布図である。混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4に、アゴニスト抗体X17又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照(n=11)を注射したDok7 1124_1127 dupマウスは、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡したが、P4でmIgG2a-X17を注射し、P24及びP44でhIgG-X17を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=3)は成体として生存した。mIgG2a-X17、次いでhIgG-X17を注射した変異マウスをP60で屠殺した。散布図は、各マウスについての生存時間及び平均±SEM値を示す(p、****<0.00005)。 図25A～図25Bは、MuSKに対するアゴニスト抗体mIgG2a-X17とhIgG-X17との組合せが、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図25Bは、mIgG2a-X17、次いでhIgG-X17を注射したDok7 1124_1127 dupマウスが、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なり、体重が増加したことを示すプロットである。Dok7 1124_1127 dupマウスに、P4でmIgG2a-X17(1Omg/kg)、並びにP24及びP44でhIgG-X17(10mg/kg)を注射した。 図26は、mIgG2a-X17とhIgG-X17との組合せが、Dok7 1124_1127 dupマウスの運動パフォーマンスをレスキューすることを実証する。握力(左パネル)及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時(右パネル)によって評価されるように、Dok7 1124_1127 dupマウスの運動パフォーマンスは、mIgG2a-X17とhIgG-X17との組合せでの処置によって完全に回復した。散布図は、27匹の野生型マウス及び3匹のmIgG2a-X17とhIgG-X17との組合せでレスキューしたDok7 1124_1127 dupマウスについての値及び平均±SEM値を示す(n.s.、有意ではない)。 図27は、MuSKアゴニスト抗体hIgG-X17がMuSKとシナプスで会合し、MuSKを20mg/kgで飽和させることを実証する。P40の野生型マウスに、MuSKアゴニスト抗体hIgG-X17(0、2、10、20mg/kg)を腹腔内注射した。2日後、マウスを屠殺し、横隔膜筋をAlexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、Alexa647ヤギ抗ヒトIgG, F(ab')2断片特異的で染色してX17を標識した。シナプスにおけるX17の飽和レベルを、X17対AChRのシグナル強度の比によって測定した。各濃度における3匹のマウスからの平均±SEM値を示す。 図28A～図28Bは、MuSKに対するアゴニスト抗体であるhIgG-X17が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図28Aは、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスが生後1～2週間生存することを示す散布図である。混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4でアゴニスト抗体gG-X17又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡したが、一方で、P4、P18及びP38又はP4及びP18でhIgG-X17を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=4)は成体として生存した。hIgG-X17を注射した4匹の変異体マウスのうち、2匹をP60で屠殺し、2匹の変異体マウスを疾患再発実験のために年を取らせた。散布図は、各マウスについての生存時間及び平均±SEM値を示す(p、****<0.00005)。 図28A～図28Bは、MuSKに対するアゴニスト抗体であるhIgG-X17が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図28Bは、hIgG-X17を注射したDok7 1124_1127 dupマウスが、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なり、体重が増加したことを示すプロットである。Dok7 1124_1127 dupマウスに、hIgG-X17を、P4(20mg/kg)、P18、及びP38(10mg/kg)、又はP4(20mg/kg)、及びP18(10mg/kg)で注射した。 図29は、hIgG-X17が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおけるシナプス発達を回復させることを実証する。P60の野生型及びDok7 1124_1127 dupマウス由来の横隔膜筋を、Alexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、βIIIチューブリン/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経終末を標識した。hIgG-X17で処置したDok7 1124_1127 dupマウスでは、シナプスは、単純なプラーク様形状から、成熟マウス神経筋シナプスに特徴的な複雑なプレッツェル様形状に成熟した。スケールバー=10mm。hIgG-X17で処置したDok7 1124_1127 dupマウスにおいて、シナプス数、シナプスサイズ、及びシナプスAChRの密度は、それぞれ正常レベルの70%、50%、及び40%に回復した。2匹のマウスからの平均±SEM値(マウスあたり>50シナプス)を示す。 図30は、hIgG-X17が、Dok7 1124_1127 dupマウスの運動パフォーマンスをレスキューすることを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスの運動パフォーマンスは、握力(左パネル)及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時(右パネル)によって評価されるように、hIgG-X17での処置によって完全に回復した。散布図は、27匹の野生型マウス及び2匹のhIgG-X17でレスキューしたDok7 1124_1127 dupマウスについての値及び平均±SEM値を示す。 図31A～図31Cは、hIgG-X17が、成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおける疾患再発を好転させることを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスに、MuSKアゴニスト抗体を、P4、P24及びP44、又はP4、P18のいずれかで注射した後、抗体処置を中止した。これらのDok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し、運動性を数カ月間維持したが、最終的には、体重が減少し始め(図31A、図31B)、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時(図31C)によって評価されるように、運動障害を示し始めた。このとき、マウスに、hIgG-X17を再注射しないか(図31A)、又は再注射した(図31B)。再注射されていないマウスは数日以内に死亡したが(図31A)、一方で、X17処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し始め(図31B)、処置の再開後1週間までに、それらの運動障害が好転した(図31C、左パネル)。Dok7 1124_1127 dupマウスでは、ロータロッドでのパフォーマンスが3.25倍向上したが、野生型マウスではパフォーマンスは1.30倍向上した(p、***<0.0005)。Dok7 1124_1127 dupマウスでは、その握力が1.30倍向上したが、野生型マウスではパフォーマンスは向上しなかった(p、***<0.0005)(図31C)。 図31A～図31Cは、hIgG-X17が、成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおける疾患再発を好転させることを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスに、MuSKアゴニスト抗体を、P4、P24及びP44、又はP4、P18のいずれかで注射した後、抗体処置を中止した。これらのDok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し、運動性を数カ月間維持したが、最終的には、体重が減少し始め(図31A、図31B)、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時(図31C)によって評価されるように、運動障害を示し始めた。このとき、マウスに、hIgG-X17を再注射しないか(図31A)、又は再注射した(図31B)。再注射されていないマウスは数日以内に死亡したが(図31A)、一方で、X17処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し始め(図31B)、処置の再開後1週間までに、それらの運動障害が好転した(図31C、左パネル)。Dok7 1124_1127 dupマウスでは、ロータロッドでのパフォーマンスが3.25倍向上したが、野生型マウスではパフォーマンスは1.30倍向上した(p、***<0.0005)。Dok7 1124_1127 dupマウスでは、その握力が1.30倍向上したが、野生型マウスではパフォーマンスは向上しなかった(p、***<0.0005)(図31C)。 図31A～図31Cは、hIgG-X17が、成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおける疾患再発を好転させることを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスに、MuSKアゴニスト抗体を、P4、P24及びP44、又はP4、P18のいずれかで注射した後、抗体処置を中止した。これらのDok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し、運動性を数カ月間維持したが、最終的には、体重が減少し始め(図31A、図31B)、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時(図31C)によって評価されるように、運動障害を示し始めた。このとき、マウスに、hIgG-X17を再注射しないか(図31A)、又は再注射した(図31B)。再注射されていないマウスは数日以内に死亡したが(図31A)、一方で、X17処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し始め(図31B)、処置の再開後1週間までに、それらの運動障害が好転した(図31C、左パネル)。Dok7 1124_1127 dupマウスでは、ロータロッドでのパフォーマンスが3.25倍向上したが、野生型マウスではパフォーマンスは1.30倍向上した(p、***<0.0005)。Dok7 1124_1127 dupマウスでは、その握力が1.30倍向上したが、野生型マウスではパフォーマンスは向上しなかった(p、***<0.0005)(図31C)。 図32A～図32Bは、野生型マウスにおける3B2の長期注射が、生存又は体重増加に影響を及ぼさないことを実証する。図32Aは、P4及びP18に3B2(n=3)を注射されたC57BL/6-CBA混合バックグラウンドの野生型マウスが、屠殺されたP38まで生存したことを示す散布図である。散布図は、4匹の未注射野生型マウス及び3匹の3B2注射野生型マウスの生存時間、並びに平均±SEM値を示す(n.s.、有意ではない)。 図32A～図32Bは、野生型マウスにおける3B2の長期注射が、生存又は体重増加に影響を及ぼさないことを実証する。図32Bは、3B2(n=3)を注射された野生型マウスが、野生型マウス(n=4)と同様に、体重が増加したことを示す散布図である。 図33A～図33Bは、MuSKに対する3B2アゴニスト抗体が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおいて致死性をレスキューすることを実証する。図33Aは、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスが、生後1～2週間生存することを示す散布図である。混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4にアゴニスト抗体3B2又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡したが、3B2(n=3)をP4、P18、及びP38、又はP4及びP18で注射したDok7 1124_1127 dupマウスは、成体として生存した。3B2を注射した3匹の変異体マウスのうち、2匹をP60で屠殺し、1匹の変異体マウスを疾患再発実験のために年を取らせた。散布図は、各マウスについての生存時間及び平均±SEM値を示す(p、****<0.00005)。 図33A～図33Bは、MuSKに対する3B2アゴニスト抗体が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおいて致死性をレスキューすることを実証する。図33Bは、3B2を注射したDok7 1124_1127 dupマウスが、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なり、体重が増加したことを示す散布図である。Dok7 1124_1127 dupマウスに、3B2を、P4(20mg/kg)、P18、及びP38(10mg/kg)で注射した。 図34は、3B2が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおけるシナプス発達を回復させることを実証する。P60の野生型マウス及びDok7 1124_1127 dupマウスからの横隔膜筋を、Alexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、βIIIチューブリン/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経終末を標識した。3B2で処置したDok7 1124_1127 dupマウスにおいて、シナプスは、単純なプラーク様形状から、成熟マウス神経筋シナプスに特徴的な複雑なプレッツェル様形状に成熟した。スケールバー=10mm。3B2で処置したDok7 1124_1127 dupマウスでは、シナプス数、シナプスサイズ、及びシナプスAChRの密度が、それぞれ正常レベルの80%、75%、及び40%に回復した。2匹のマウスからの平均±SEM値(マウスあたり>50シナプス)を示す。 図35は、3B2が、Dok7 1124_1127 dupマウスの運動パフォーマンスをレスキューすることを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスの運動パフォーマンスは、握力(左パネル)及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時(右パネル)によって評価されるように、3B2での処置によって完全に回復した。散布図は、27匹の野生型マウス、及び2匹の3B2でレスキューしたDok7 1124_1127 dupマウスについての値及び平均±SEM値を示す。 図36は、3B2が、Dok7 1124_1127 dupマウスを少なくとも2カ月間、健康に維持することを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスに、3B2を、P4、P18、及びP38で注射した後、抗体処置を中止した。このDok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し、数カ月にわたって運動性を維持したが、最終的には体重が減少し始め、数日以内に死亡した。 図37は、3B2が、成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおける疾患再発を好転させることを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスに、P4、P24及びP44でmIgG2a-X17を注射した後、抗体処置を中止した。これらのDok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し、数カ月にわたって運動性を維持したが、最終的には体重が減少し始めた。この時点で、マウスに3B2を再注射した。3B2による処置を再開した後、このDok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し始めた。 図38A～図38Bは、野生型マウスにおけるhIgG-X2の長期注射が、生存又は体重増加に影響を及ぼさないことを実証する。図38Aは、P4及びP18にhIgG-X2を注射した、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドの野生型マウス(n=3)が、屠殺されたP38まで生存したことを示す散布図である。散布図は、4匹の未注射野生型マウス及びhIgG-X2を注射した3匹の野生型マウスについての生存時間及び平均±SEM値を示す(n.s.、有意ではない)。 図38A～図38Bは、野生型マウスにおけるhIgG-X2の長期注射が、生存又は体重増加に影響を及ぼさないことを実証する。図38Bは、hIgG-X2を注射した野生型マウス(n=3)が、野生型マウス(n=4)と同様に体重が増加したことを示す散布図である。 図39A～図39Bは、MuSKに対するアゴニスト抗体であるhIgG-X2が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図39Aは、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスが生後1～2週間生存することを示す散布図である。混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4にアゴニスト抗体gG-X2又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡したが、hIgG-X2をP4及びP18で注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=2)は、成体として生存した。hIgG-X2を注射した変異マウスを、疾患再発実験のために年をとらせた。散布図は、各マウスについての生存時間及び平均±SEM値を示す(p、****<0.00005)。 図39A～図39Bは、MuSKに対するアゴニスト抗体であるhIgG-X2が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図39Bは、hIgG-X2を注射したDok7 1124_1127 dupマウスでは、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なり、体重が増加したことを示す散布図である。Dok7 1124_1127 dupマウスに、hIgG-X2を、P4(20mg/kg)及びP18(10mg/kg)で注射した。 図40A～図40Bは、hIgG-X2が、成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおいて疾患再発を好転させることを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスに、P4及びP18でhIgG-X2を注射した後、抗体処置を中止した。これらのDok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し、運動性を数週間維持したが、最終的には、体重が減少し始め(図40A)、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時(図40B)によって評価されるように、運動障害を示し始めた。この時点で、マウスにhIgG-X2を再注射した。X2処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し始め(図40A)、処置の再開後3週間までに、その運動障害は完全に好転した(図40B)。 図40A～図40Bは、hIgG-X2が、成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおいて疾患再発を好転させることを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスに、P4及びP18でhIgG-X2を注射した後、抗体処置を中止した。これらのDok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し、運動性を数週間維持したが、最終的には、体重が減少し始め(図40A)、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時(図40B)によって評価されるように、運動障害を示し始めた。この時点で、マウスにhIgG-X2を再注射した。X2処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し始め(図40A)、処置の再開後3週間までに、その運動障害は完全に好転した(図40B)。 図41A～図41Bは、MuSKに対するアゴニスト抗体hIgG-X2m4が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図41Aは、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスが、生後1～2週間生存することを示す散布図である。混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4で、アゴニスト抗体hIgG-X2m4又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡したが、hIgG-X2m4をP4及びP18で注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=3)は、成体として生存した。hIgG-X2m4を注射した変異マウスを、生存についてモニタリングしたか、又はhIgG-X17を用いた疾患再発実験のために年を取らせた。散布図は、各マウスについての生存時間及び平均±SEM値を示す(p、****<0.00005)。 図41A～図41Bは、MuSKに対するアゴニスト抗体hIgG-X2m4が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図41Bは、hIgG-X2m4を注射したDok7 1124_1127 dupマウスで、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なり、体重が増加したことを示す散布図である。Dok7 1124_1127 dupマウスに、hIgG-X2m4を、P4(20mg/kg)及びP18(10mg/kg)で注射した。1匹のマウスを、hIgG-X17を用いた疾患再発実験に使用し、他のマウスは、生存についてモニタリングした。 図42は、hIgG-X2m4が、Dok7 1124_1127 dupマウスを少なくとも2カ月間、健康に維持することを示す散布図である。Dok7 1124_1127 dupマウスに、X2m4をP4及びP18で注射した後、抗体処置を中止した。これらのDok7 1124_1127 dupマウスは体重が増え、数カ月間、運動性を維持したが、最終的には体重が減少し始め、数日以内に死亡した。 図43A～図43Bは、野生型マウスにおけるmIgG2a-X3の長期注射が、生存又は体重増加に影響を及ぼさないことを実証する。図43Aは、P4、P24及びP44にmIgG2a-X3を注射したC57BL/6-CBA混合バックグラウンドの野生型マウス(n=2)が、屠殺されたP60まで生存したことを示す散布図である。散布図は、9匹の未注射野生型マウス及びmIgG2a-X3を注射した2匹の野生型マウスについての生存時間及び平均±SEM値を示す。 図43A～図43Bは、野生型マウスにおけるmIgG2a-X3の長期注射が、生存又は体重増加に影響を及ぼさないことを実証する。図43Bは、mIgG2a-X3(n=2)を注射した野生型マウスが、注射していない野生型マウスと同様に、体重が増加したことを示す散布図である(n=9)。 図44は、野生型マウスにおけるmIgG2a-X3の長期注射が、神経筋シナプスの組織に影響を及ぼさないことを実証する。P60の野生型マウス及びmIgG2a-X3を注射した野生型マウス由来の横隔膜筋を、Alexa488-α-BGTで染色してアセチルコリン受容体を標識し、βIII-チューブリン/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経末端を標識した。mIgG2a-X3で処置した野生型マウスにおいて、シナプスは、単純なプラーク様形状から、成熟マウス神経筋シナプスに特徴的な複雑なプレッツェル様形状に成熟した。スケールバー=10mm。野生型マウスにおけるmIgG2a-X3の注射は、シナプス数、シナプスサイズ、及びAChR密度に影響を及ぼさない。各カテゴリーの2匹のマウスからの100シナプスを分析した。 図45は、野生型マウスにおけるmIgG2a-X3の長期注射が、運動挙動に影響を及ぼさないことを実証する。mIgG2a-X3を注射した野生型マウスの運動パフォーマンスは、握力(左パネル)及び回転ロータロッドから落下するまでの潜時(右パネル)によって評価されるように、未注射野生型マウスと同様であった。散布図は、27匹の野生型マウス及びmIgG2a-X3を注射した2匹の野生型マウスについての値並びに平均±SEM値を示す。 図46A～図46Bは、P4での10mg/kgの、MuSKに対するアゴニスト抗体であるmIgG2a-X3が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性を数日間レスキューすることを実証する。図46Aは、C57BL/6-CBAno混合バックグラウンドにおけるDok7 1124_1127 dupマウスが、生後1～2週間生存することを示す散布図である。混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4に、アゴニスト抗体mIgG2a-X3又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 マウス(n=11)、及びmIgG2a-X33を注射したDok7 1124_1127 マウス(n=4)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡した。散布図は、各マウスについての生存時間及び平均±SEM値を示す(p、**<0.05)。 図46A～図46Bは、P4での10mg/kgの、MuSKに対するアゴニスト抗体であるmIgG2a-X3が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性を数日間レスキューすることを実証する。図46Bは、mIgG2a-X3を注射したDok7 1124_1127 dupマウスでは、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスと同様に、体重が増加しなかったことを示す散布図である。Dok7 1124_1127 dupマウスに、P4で、mIgG2a-X3(10mg/kg)を注射した。 図47A～図47Bは、P4での20mg/kgの、MuSKに対するアゴニスト抗体mIgG2a-X3が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図47Aは、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスが、生後1～2週間生存することを示す散布図である。混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4に、アゴニスト抗体mIgG2a-X3(20mg/kg)又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡した。mIgG2a-X3を、P4(20mg/kg)及びP18(10mg/kg)で注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=2)は、成体として生存した。mIgG2a-X3を注射した変異マウスを、疾患再発実験のために年を取らせた。散布図は、各マウスについての生存時間及び平均±SEM値を示す。 図47A～図47Bは、P4での20mg/kgの、MuSKに対するアゴニスト抗体mIgG2a-X3が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図47Bは、mIgG2a-X3を注射したDok7 1124_1127 dupマウスが、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なり、体重が増加したことを示す散布図である。Dok7 1124_1127 dupマウスに、mIgG2a-X3を、P4(20mg/kg)及びP18(10mg/kg)で注射した。 図48は、mIgG2a-X3が、Dok7 1124_1127 dupマウスを少なくとも2カ月間、健康に維持することを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスに、mIgG2a-X3を、P4及びP18で注射した後、抗体処置を中止した。これらのDok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し、2カ月間、運動性を維持したが、最終的には体重が減少し始め、数日以内に死亡した。 図49A～図49Bは、MuSKに対するアゴニスト抗体mIgG2a-X9が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューしうることを実証する。図49Aは、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスが、生後1～2週間生存することを示す散布図である。混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4に、アゴニスト抗体mIgG2a-X9又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)、及びmIgG2a-X9を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=6)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡した。mIgG2a-X9(10mg/kg)をP4、P24及びP44で注射した1匹のDok7 1124_1127 dupマウスのみが、P60まで生存した。散布図は、各マウスについての生存時間及び平均±SEM値を示す(n.s.、有意ではない)。 図49A～図49Bは、MuSKに対するアゴニスト抗体mIgG2a-X9が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューしうることを実証する。図49Bは、mIgG2a-X9を注射したDok7 1124_1127 dupマウスでは、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスと同様に、体重が増加しなかったことを示す散布図である。mIgG2a-X9を注射した1匹のDok7 1124_1127 dupマウスのみ、経時的に体重が増加した。Dok7 1124_1127 dupマウスに、mIgG2a-X9(10mg/kg)をP4、P24及びP44で注射した。 図50は、MuSKアゴニスト抗体3B2g2m1がシナプスでMuSKと会合し、MuSKを20mg/kgで飽和させることを実証する。P30野生型マウスに、MuSKアゴニスト抗体3B2g2m1(0、2、10、20mg/kg)を腹腔内注射した。2日後、マウスを屠殺し、横隔膜筋をAlexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、Alexa647ヤギ抗ヒトIgG, F(ab')2断片特異的で染色して3B2g2m1を標識した。シナプスにおける3B2g2m1の飽和レベルを、3B2g2m1対AChRのシグナル強度の比によって測定した。各濃度における3匹のマウスからの平均±SEM値を示す。 図51A～図51Bは、野生型マウスにおける3B2g2m1の長期注射が、生存又は体重増加に影響を及ぼさないことを実証する。図51Aは、P4、P24及びP44に10mg/kgの3B2g2m1を注射したC57BL/6-CBA混合バックグラウンドの野生型マウス(n=6)が、P4、P24及びP44に10mg/kgのアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブを注射した野生型マウス(n=6)と同様に生存し、体重が増加したことを示す散布図である。 図51A～図51Bは、野生型マウスにおける3B2g2m1の長期注射が、生存又は体重増加に影響を及ぼさないことを実証する。図51Bは、3B2g2m1をP4に20mg/kgで開始して週に2回注射したC57BL/6-CBA混合バックグラウンドの野生型マウスが、アイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブをP4に20mg/kgで開始して週に2回注射した野生型マウスと同様に、生存して体重が増加したことを示す散布図である。 図52A～図52Bは、MuSKに対するアゴニスト抗体3B2g2m1が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図52Aは、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスが生後1～2週間生存することを示す散布図である。混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4に、アゴニスト抗体3B2g2m1又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡したが、3B2g2m1をP4(20mg/kg)、P18(10mg/kg)、及びP38(10mg/kg)で注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=10)は、成体として生存した。3B2g2m1を注射した変異マウス10匹のうち、3匹をP60で屠殺し、7匹を疾患再発実験のために年を取らせた。散布図は、各マウスについての生存時間及び平均±SEM値を示す(p、****<0.00005)。 図52A～図52Bは、MuSKに対するアゴニスト抗体3B2g2m1が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する。図52Bは、3B2g2m1を注射したDok7 1124_1127 dupマウスが、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なり、体重が増加したことを示す散布図である。Dok7 1124_1127 dupマウスに、3B2g2m1を、P4(20mg/kg)、P18(10mg/kg)、及びP44(10mg/kg)で注射した。 図53は、3B2g2m1が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおけるシナプス発達を回復させることを実証する。P60の野生型マウス及びDok7 1124_1127 dupマウス由来の横隔膜筋を、Alexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、βIIIチューブリン/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経終末を標識した。3B2g2m1で処置したDok7 1124_1127 dupマウスでは、シナプスは、単純なプラーク様形状から、成熟マウス神経筋シナプスに特徴的な複雑なプレッツェル様形状に成熟した。スケールバー=10mm。3B2g2m1で処置したDok7 1124_1127 dupマウスにおいて、シナプス数、シナプスサイズ、及びシナプスAChRの密度は、それぞれ正常レベルの80%、50%、及び60%に回復した。3匹のマウスからの平均±SEM値(1匹当たり>50シナプス)を示す(p、*<0.05、****<0.00005)。 図54は、3B2g2m1が、Dok7 1124_1127 dupマウスの運動パフォーマンスをレスキューすることを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスの運動パフォーマンスは、握力(左パネル)及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時(右パネル)によって評価されるように、3B2g2m1での処置によって完全に回復した。散布図は、27匹の野生型マウス及び3B2g2m1 でレスキューした10匹のDok7 1124_1127 dupマウスについての値及び平均±SEM値を示す(n.s.、有意ではない)。 図55は、3B2g2m1が、Dok7 1124_1127 dupマウスを少なくとも2カ月間、健康に維持することを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスに、3B2g2m1をP4、P18及びP38に注射した後、抗体処置を中止した。これらのDok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し、数カ月間にわたって運動性を維持したが、最終的には体重が減少し始めた。この時点で、マウスに5mg/kg又は10mg/kgのいずれかの3B2g2m1を再注射した。3B2g2m1の処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dup マウスは体重が増加し始めた。 図56A～図56Cは、3B2g2m1が、成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおける疾患再発を好転させることを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスに、3B2g2m1をP4、P18及びP38で注射した後、抗体処置を中止した。このDok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し、数カ月間にわたってその運動性を維持したが、最終的には体重が減少し始め(図56A)、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時によって評価されるように、運動障害を示し始めた(図56B)。この時点で、マウスに3B2g2m1を再注射した(図56A)。3B2g2m1の処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し始め(図56A)、処置の再開後1週間までに、その運動障害が好転した(図56B～図56C)。Dok7 1124_1127 dupマウスは、ロータロッドでのパフォーマンスが5.5倍向上し(図56b)、握力が1.1倍向上した(図56c)。 図56A～図56Cは、3B2g2m1が、成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおける疾患再発を好転させることを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスに、3B2g2m1をP4、P18及びP38で注射した後、抗体処置を中止した。このDok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し、数カ月間にわたってその運動性を維持したが、最終的には体重が減少し始め(図56A)、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時によって評価されるように、運動障害を示し始めた(図56B)。この時点で、マウスに3B2g2m1を再注射した(図56A)。3B2g2m1の処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し始め(図56A)、処置の再開後1週間までに、その運動障害が好転した(図56B～図56C)。Dok7 1124_1127 dupマウスは、ロータロッドでのパフォーマンスが5.5倍向上し(図56b)、握力が1.1倍向上した(図56c)。 図56A～図56Cは、3B2g2m1が、成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおける疾患再発を好転させることを実証する。Dok7 1124_1127 dupマウスに、3B2g2m1をP4、P18及びP38で注射した後、抗体処置を中止した。このDok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し、数カ月間にわたってその運動性を維持したが、最終的には体重が減少し始め(図56A)、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時によって評価されるように、運動障害を示し始めた(図56B)。この時点で、マウスに3B2g2m1を再注射した(図56A)。3B2g2m1の処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し始め(図56A)、処置の再開後1週間までに、その運動障害が好転した(図56B～図56C)。Dok7 1124_1127 dupマウスは、ロータロッドでのパフォーマンスが5.5倍向上し(図56b)、握力が1.1倍向上した(図56c)。 図57は、MuSKに対するアゴニスト抗体3B2g2m1が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューすることを実証する(週2回の長期投与)。図57は、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスが、生後1～2週間生存することを実証する。混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4から開始して週に2回、アゴニスト抗体3B2g2m1(20mg/kg)で処置した。3B2g2m1を注射したDok7 1124_1127 dup マウス(n=4)は、成体として生存し、体重が増加した。 図58A～図58Cは、MuSK抗体処置が、Dok7 1124_1127 dupマウスの生存を延長させることを示す。図58Aは、示されるMuSKアゴニスト抗体又はアイソタイプ対照(モタビズマブ)をP4(20mg/kg)、P18(10mg/kg)及びP38(10mg/kg)で注射したDok7 1124_1127 dupマウスの生存プロットを示す。 図58A～図58Cは、MuSK抗体処置が、Dok7 1124_1127 dupマウスの生存を延長させることを示す。図58Bは、MuSKアゴニスト抗体又はアイソタイプ対照(モタビズマブ)をP4(20mg/kg)、P18(10mg/kg)で注射したDok7 1124_1127 dupマウスの生存プロットを示す。 図58A～図58Cは、MuSK抗体処置が、Dok7 1124_1127 dupマウスの生存を延長させることを示す。図58Cは、体重減少(図58C)が生じた数日後に、示されるMuSKアゴニスト抗体(10mg/kg)を再注射した(処置を再開した)Dok7 1124_1127 dupマウスの生存プロットを示す。これらの結果は、MuSKアゴニスト抗体の注射が、Dok7 1124_1127 dupマウスの生存を延長させることを実証する。
詳細な説明
一般的定義
以下の用語又は定義は、本発明の理解を補助するためにのみ提供される。本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。実務者には、当該技術分野の定義及び用語について、特に、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、Plainsview、New York(1989)及びAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47)、John Wiley & Sons、New York(1999)が示される。本明細書で提供される定義は、当業者によって理解される範囲よりも狭い範囲を有すると解釈されるべきではない。
別段の指示がない限り、具体的に詳述されていない全ての方法、工程、技術、及び操作は、当業者には明らかであるような、それ自体公知の方法で実施することができ、及び実施されている。例えば、標準的なハンドブック、上記で言及された一般的な背景技術、及びその中で引用される更なる参考文献が再び参照される。
本明細書で使用される場合、「a」、「an」及び「the」という単数形には、文脈上明らかに別様に解すべき場合を除き、単数及び複数の言及物が含まれる。
本明細書で使用される場合、「含む(comprising)」、「含む(comprises)」及び「含む(comprised of)」という用語は、「含有する(including)」、「含有する(uncludes)」又は「含有する(containing)」、「含有する(contains)」と同義であって、包含的又は開放的であり、追加の、列挙されていないメンバー、化合物、生成物、要素、又は方法工程を除外しない。生成物又は組成物の文脈で使用される「本質的にからなる(essentially consists of)」という表現(「本質的にからなる生成物(a product essentially consisting of)」又は「本質的にからなる組成物(a composition essentially consisting of)」)は、追加の分子が存在してもよいが、そのような分子は、該生成物又は組成物の特徴/活性/機能性を変更/変化させないことを意味する。例えば、組成物自体が、抗体の1つとして又は抗体断片の1つとして同様の特徴/活性/機能性を示す場合、組成物は、本質的に抗体又は抗体断片からなるものでありうる。
端点による数値範囲の列挙は、それぞれの範囲内に含まれる全ての数及び分数、並びに列挙された端点を含む。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、パラメータ、量、持続時間等の測定可能な値を指す場合、指定された値の+/-10%以下、好ましくは+/-5%以下、より好ましくは+/-1%以下、更により好ましくは+/-0.1%以下の変動を、開示される発明においてそのような変動が行われるのに適切である限り、包含することを意味する。修飾語「約」が指す値自体もまた、具体的に及び好ましく開示されていることを理解されたい。
本明細書で使用される場合、アミノ酸残基は、それらの完全な名称によって、又は標準的な3文字若しくは1文字のアミノ酸コードに従って示される。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、コードされたアミノ酸及びコードされていないアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸、並びに修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含みうる任意の長さのアミノ酸の高分子形態を指す。「ペプチド」はまた、通常最大50個のアミノ酸の長さを有する、アミノ酸のポリマーである。ポリペプチド又はペプチドは、アミノ酸配列によって表される。
本明細書で使用される場合、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、「核酸」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドの高分子形態を指す。核酸分子は、主にその塩基配列によって特徴付けられる核酸配列によって表される。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、また既知又は未知の任意の機能を実行しうる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、制御領域、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。核酸分子は、直鎖状であっても環状であってもよい。
本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、同じ又は異なる分類群からの2つの巨大分子間、特に2つのポリペプチド又はポリヌクレオチド間の、少なくとも二次構造の同一性又は類似性を示し、ここで前記類似性は、共通の祖先に起因する。したがって、「ホモログ」という用語は、前記二次構造の類似性、及び場合により三次構造の類似性を有する、そのように関連する巨大分子を示す。2つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列との間の「配列同一性(のパーセンテージ)」は、当業者に既知の方法を使用して、例えば、第2のヌクレオチド配列の対応する位置のヌクレオチドと同一である第1のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数を第1のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数で除し、100%を掛けることによって、又はNCBI Blast等の配列アライメントのための既知のコンピュータアルゴリズムを使用することによって、計算してもよい。2つのアミノ酸配列間の配列類似性の程度を決定する際に、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮してもよい。「保存的」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基と置き換えられるアミノ酸置換であって、ポリペプチドの機能、活性、又は他の生物学的特性にほとんど又は本質的に影響を及ぼさないアミノ酸置換として一般に説明されうる。考えられる保存的アミノ酸置換は、本明細書ですでに例示されている。アミノ酸配列及び核酸配列は、その全長にわたって100%の配列同一性を有する場合、「完全に同一である」と言われる。
本出願を通じて、特定のアミノ酸配列の配列番号(例として配列番号Y)が参照される各場合に、アミノ配列の酸配列番号Yに対して少なくとも80%の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでその配列を置き換えてもよい。本出願全体を通して、「配列が、別の配列と少なくともX%同一である」という文言は、「配列が、別の配列と少なくともX%の配列同一性を有する」と置き換えられてもよい。
所与のアミノ酸配列とそれぞれその同一性パーセンテージ(少なくとも80%)によって本明細書に記載される各アミノ酸配列は、更なる好ましい実施形態では、所与のアミノ酸配列とそれぞれ少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれを超える同一性を有する。好ましい実施形態では、配列同一性は、本明細書で特定される配列の全長を比較することによって決定される。所与のアミノ酸配列との類似性パーセンテージ(少なくとも80%)により本明細書に記載の各アミノ酸配列は、更なる好ましい実施形態では、所与のアミノ酸配列とそれぞれ少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれを超える類似性を有する。好ましい実施形態では、配列類似性は、本明細書で特定される配列の全長を比較することによって決定される。本明細書に別段の指示がない限り、所与の配列番号との同一性又は類似性は、前記配列の全長に基づいた(つまり、その全長にわたる若しくは全体としての)同一性又は類似性を意味する。
「配列同一性」は、配列を比較することによって決定される2つ以上のアミノ酸(ポリペプチド又はタンパク質)配列又は2つ以上の核酸(ポリヌクレオチド)配列間の関係として本明細書で定義される。2つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、本明細書で特定される配列番号全体又はその一部内での同一性を評価することによって定義される。その一部とは、配列番号の長さの少なくとも50%、又は少なくとも60%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも90%を意味しうる。
当該技術分野において、「同一性」とは、場合によってアミノ酸配列の文字列間の一致によって決定される、アミノ酸配列間の配列関連性の程度も意味する。2つのアミノ酸配列間の「類似性」は、1つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を、第2のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、例えば、限定されないが、Computational Molecular Biology、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993; Computer Analysis of Sequence Data、Part I、Griffin, A. M. and Griffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994; Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heine, G.、Academic Press、1987;Sequence Analysis Primer、Gribskov, M. and Devereux, J.編、M Stockton Press、New York、1991;及びCarillo, H. and Lipman, D.、SIAM、J. Applied Math.、48:1073頁(1988)に記載の方法を含む、公知の方法によって容易に計算することができる。
同一性を決定するための好ましい方法は、試験した配列間で最大の一致を与えるように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムで体系化されている。2つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、例えば、GCGプログラムパッケージ(Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research 12(1): 387頁(1984))、BestFit、FASTA、BLASTN、及びBLASTP(Altschul, S. F.ら、J. Mol. Biol. 215:403～410頁(1990))、EMBOSS Needle(Madeira, F.ら、Nucleic Acids Research 47(W1): W636～W641頁(2019))が挙げられる。BLASTプログラムは、NCBI及び他の出所(BLAST Manual、Altschul, S.ら、NCBI NLM NIH Bethesda、MD20894; Altschul, S.ら、J. Mol. Biol. 215: 403～410頁(1990))から公的に利用可能である。EMBOSSプログラムは、EMBL-EBIから公的に利用可能である。周知のSmith Watermanアルゴリズムを使用して、同一性を決定してもよい。EMBOSS Needleプログラムは、使用に好ましいプログラムである。
ポリペプチド配列の比較のための好ましいパラメータとしては、以下のアルゴリズム:Needleman and Wunsch、J. Mol. Biol. 48(3):443～453頁(1970); 比較マトリックス: Henikoff and Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915～10919頁(1992)からのBLOSUM62;ギャップオープンペナルティ:10;及びギャップ延長ペナルティ:0.5が挙げられる。これらのパラメータで有用なプログラムは、EMBL-EBIからEMBOSS Needleプログラムとして公的に入手可能である。前述のパラメータは、タンパク質のグローバルペアワイズシーケンスアライメント(エンドギャップに対するペナルティは伴わない)のデフォルトパラメータである。
核酸の比較のための好ましいパラメータとしては、以下のアルゴリズム:Needleman and Wunsch、J. Mol. Biol. 48:443～453頁(1970); 比較マトリックス: DNAfull; ギャップオープンペナルティ:10; ギャップ延長ペナルティ:0.5が挙げられる。これらのパラメータで有用なプログラムは、EMBL-EBIからEMBOSS Needleプログラムとして公的に入手可能である。前述のパラメータは、ヌクレオチド配列のグローバルペアワイズシーケンスアライメント(エンドギャップに対するペナルティは伴わない)のデフォルトパラメータである。
本明細書に記載の任意の実施形態は、その組合せが互いに排他的ではない限り、任意の1つ又は複数の他の実施形態と組み合わされたものでありうる実施形態も、本明細書で提供される。
MuSK抗体ベースの分子
本発明は、筋特異的チロシンタンパク質キナーゼ(MuSK)に結合し、そのシグナル伝達及び/又はリン酸化を活性化することができる抗体ベースの分子、例えば、本明細書に記載の抗体、そのエピトープ結合ドメイン、及び抗体誘導体に関する。そのような抗体ベースの分子は、対象がMuSKシグナル伝達又はMuSKリン酸化の増加を必要としている症状、例えば、神経筋症状の治療に有用である。
本発明の第1の態様は、MuSKのエピトープに結合する抗体ベースの分子に関する。MuSKは、骨格筋において発現される受容体チロシンキナーゼであり、神経筋シナプスの形成及び維持において、極めて重要で支配的な役割を果たす(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBurdenら、「The Role of MuSK in Synapse Formation and Neuromuscular Disease」、Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5:a009167頁(2013))。MuSKは、3つのIg様ドメイン及びFrizzled(Fz)様ドメインを含む細胞外領域と、膜近接領域、キナーゼドメイン及び短い細胞質尾部を含む細胞内領域とを含む、一回貫通型の120kDaの膜貫通タンパク質である(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるJenningsら、「Muscle-Specific trk-Related Receptor with a Kringle Domain Defines a Distinct Class of Receptor Tyrosine Kinases」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2895～2899頁(1993)及びValenzuelaら、「Receptor Tyrosine Kinase Specific for the Skeletal Muscle Lineage: Expression in Embryonicmuscle, at the Neuromuscular Junction, and After Injury」、Neuron 15: 573～584頁(1995))。MuSKリン酸化は、運動ニューロンによって提供されるシグナルであるアグリンによって刺激される。活性化されると、MuSKは、(1)シナプス伝達に不可欠なAChR及び追加の筋肉タンパク質を密集及び定着させ、(2)筋「シナプス核」内のシナプスタンパク質をコードする遺伝子の転写を増強し、並びに(3)シナプス前分化、及び筋肉への運動神経終末の付着を促進する逆行性シグナルの産生を促進する経路を刺激する。MuSKの非存在下では、神経筋シナプスは形成されない(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBurdenら、「The Role of MuSK in Synapse Formation and Neuromuscular Disease」、Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5: a009167頁(2013))。MuSKは、シナプス形成中のその役割に加えて、成体型シナプスを維持するためにも必要であり、その理由は、成体筋肉におけるMuSK発現の阻害が、シナプス前及びシナプス後分化における深刻な欠陥をもたらすためである(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるKongら、「Inhibition of Synapse Assembly in Mammalian Muscle in vivo by RNA Interference」、EMBO Rep 5:183～188頁(2004)及びHesserら、「Synapse Disassembly and Formation of New Synapses in Postnatal Muscle Upon Conditional Inactivation of MuSK」、Mol. Cell. Neurosci.31:470～480頁(2006))。マウスにおけるこれらの知見と一致して、MuSKキナーゼ活性を損なうか、又はMuSKから下流のシグナル伝達ステップを阻害する変異は、構造的及び機能的に欠陥のあるシナプスを特徴とする筋無力症(CM)を引き起こし、筋力低下及び疲労をもたらす(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBeesonら、「Dok-7 Mutations Underlie a Neuromuscular Junction Synaptopathy」、Science 313: 1975～1978頁(2006); Mullerら、「Phenotypical Spectrum of DOK7 Mutations in Congenital Myasthenic Syndromes」、Brain 130: 1497～1506頁(2007);及びSelcenら、「A Compensatory Subpopulation of Motor Neurons in a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis」、J. Comp. Neurol. 490:209～219頁(2008))。
ヒトMuSKのアミノ酸配列は、以下の配列番号129のアミノ酸配列を有する。
Figure 2023522212000001
本発明によれば、本明細書に記載のMuSK抗体系分子は、MuSKタンパク質のFrizzled(Fz)様ドメイン内のエピトープに結合する。MuSKのFz様ドメインは、以下に示すように、配列番号130のアミノ酸配列を有する。
Figure 2023522212000002
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体に結合することができる抗原決定基を指す。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖等の分子表面基からなり、通常、特有の三次元構造特性、及び特有の荷電特性を有する。立体構造エピトープと非立体構造エピトープとは、変性溶媒の存在下で立体構造エピトープへの結合は喪失するが非立体構造エピトープへの結合は喪失しないという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基(エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる)を含んでもよく、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば特異的抗原結合ペプチドによって効果的にブロックされる(言い換えれば、アミノ酸残基が、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある)アミノ酸残基を含んでもよい。エピトープは、典型的に、固有の空間立体配座において、少なくとも3個、より通常は、少なくとも5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個又はそれを超えるアミノ酸を含む。
本発明のMuSK抗体ベースの分子は、配列番号130のMuSK Fz様ドメイン配列内のエピトープに、代替エピトープよりも高頻度で、より迅速に、より長い持続時間及び/又はより高い親和性若しくはアビディティで、免疫特異的に結合する。一実施形態では、本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子は、配列番号130の任意の2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれを超えるアミノ酸残基に免疫特異的に結合する。本明細書で使用される場合、「親和性」、「特異的結合」、「結合」、「免疫特異的結合」、「結合活性」又は「特異的結合活性」という用語は、本明細書に定義される抗体又は抗体断片が、配列番号130のMuSK-Fz様ドメイン配列内のエピトープに結合する程度を指す。
一実施形態では、本明細書に開示されるMuSK抗体ベースの分子は、約10-7M又はそれ未満のKDに対応する親和性でMuSK Fz様ドメインに結合する。例えば、本明細書に開示されるMuSK抗体ベースの分子は、例えば、Biacore3000機器において(好ましくは、抗体をリガンドとして、MuSKを分析物として使用して)、表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって決定される場合、約10-8M、約10-9M、約10-10M、約10-11M、約10-12M又はそれ未満のKDに対応する親和性でMuSK Fz様ドメインに結合する。本明細書に開示されるMuSK抗体ベースの分子は、非特異的抗原(例えばウシ血清アルブミン、カゼイン等)への結合に対するその親和性より少なくとも1/10倍、例えば少なくとも1/100倍、例えば少なくとも1/1,000倍、例えば少なくとも1/10,000倍、例えば少なくとも1/100,000倍の低さのKDに対応する親和性でMuSK Fz様ドメインに結合する。親和性が低い場合の量は抗体のKDに依存し、抗体のKDが非常に低い(つまり、抗体が非常に特異的である)場合、抗原に対する親和性が非特異的抗原に対する親和性よりも低い場合の量は、少なくとも10,000倍でありうる。本明細書で使用される「kd」(秒-1又は1/s)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度定数を指す。この値はk0ff値とも称される。「ka」(M-1×秒-1又は1/M)という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度定数を指す。「KD」(M)という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を指し、kdをkaで割ることによって得られる。本明細書で使用される場合、「KA」(M-1又は1/M)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合平衡定数を指し、kaをkdで割ることによって得られる。
一実施形態では、本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子は、抗原結合を増強させる抗体リサイクルを可能にする、MuSKに対するpH依存性結合親和性を有する。例えば、一実施形態では、会合速度定数又は解離速度定数は、酸性pH条件対中性pH条件対塩基性pH条件下で異なりうる。一実施形態では、本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子は、中性pH条件、例えば約7.0～7.9のpHと比較して、酸性pH条件、例えば<7.0のpHにおいて、より高い解離速度定数を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子は、酸性pH(例えば、約5.5のpH)で、中性pH(約7.4のpH)と比較して2～3倍高い解離速度定数(つまり、低い結合親和性)を有する。一実施形態では、MuSK抗体ベースの分子は、中性pH条件で、酸性pH条件よりも高い親和性でMuSK Fz様ドメインに結合する。言い換えると、一実施形態では、MuSK抗体ベースの分子は、酸性pH条件下で、中性pH条件下よりも高い解離速度でMuSK Fz様ドメインに結合する。中性pH条件は、7.0～7.9からなるpHであるとして定義されてもよい。酸性pH条件は、7.0未満のpHであるとして定義されてもよい。より高いとは、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%高いことを意味しうる。このpH依存性解離特性を有する抗体は、結合及び活性化後、リソソーム分解前に抗原から解離する。解離すると、抗体は、新生児Fc受容体を介して再び循環に移行し、放出されて、より多くの抗原に結合する。
本発明のMuSK抗体が、Fz様ドメイン内のそれぞれのエピトープに結合することにより、MuSKシグナル伝達が活性化される。特に、本発明のMuSK抗体が、MuSK Fz様ドメインのそれぞれのエピトープに結合するとき、この結合は、上記のようにMuSKリン酸化及び活性化を誘導する。本発明のMuSK抗体は、アグリン活性化によって誘導されるMuSKリン酸化と比較して、約50%～約100%でMuSKリン酸化を誘導する(例えば、本明細書に記載のC2C12リン酸化アッセイにおいて測定される場合)。一実施形態では、本発明のMuSK抗体は、約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100% 95%のMuSKリン酸化を誘導する(アグリン活性化によって誘導されるMuSKリン酸化と比較して)。一実施形態では、本発明のMuSK抗体ベースの分子は、MuSK結合時に、約90%～約100%のMuSKリン酸化を誘導する(アグリン活性化によって誘導されるMuSKリン酸化と比較して)。MuSKのリン酸化は、ウエスタンブロッティング等の当業者に既知の技術を使用して評価しうる。本明細書の実施例に記載されるリン酸化アッセイ(つまり、C2C12筋管リン酸化アッセイ)もまた、リン酸化を評価するために使用することができる。
一部の実施形態では、本発明のMuSK抗体、つまり、MuSKのFzドメインに結合するMuSK抗体は、MuSKの天然リガンド結合及び刺激に干渉しない(つまり、遮断、抑制、阻害、又は低減しない)。一部の実施形態では、MuSK抗体は、MuSK活性化をその天然リガンド、つまりアグリンと共刺激して、活性化、例えば、MuSKリン酸化等の追加的効果を生じさせる。したがって、一部の実施形態では、本発明のMuSK抗体は、天然のリガンド結合によって誘導される天然のMuSK活性化、つまり、リン酸化を増強する。一部の実施形態では、本発明の抗体は、天然リガンドとの組合せで、内因性活性化レベルの>100%、例えば内因性活性化レベルの少なくとも110%、130%、150%、200%へMuSKを活性化する(つまり、MuSKをリン酸化する)。MuSKのリン酸化は、先に示されているように評価しうる。
したがって、一実施形態では、本発明のMuSK抗体ベースの分子の活性は、以下を含む:(i)配列番号130のMuSK Frizzled(Fz)様ドメイン配列に存在するヒト筋特異的チロシンタンパク質キナーゼ(MuSK)のエピトープに結合し、そのエピトープに結合する際、前記抗体ベースの分子は、MuSKリン酸化を誘導する、及び/又は(ii)MuSK Fz様ドメインへの結合は、天然又は内因性MuSKリガンド誘導性リン酸化を遮断、抑制、又は阻害せず、前記天然又は内因性MuSKリガンド誘導性リン酸化を増強しうる、並びに(iii)MuSK Fz様ドメインへの結合が、酸性pH条件よりも中性pH条件において、より高い親和性で生じる。これらの特徴は全て、本明細書で更に定義されている。
抗体ベースの分子としては、限定されないが、完全抗体、全抗体のエピトープ結合断片、及び抗体誘導体が挙げられる。抗体のエピトープ結合断片は、親抗体(例えば、Fab又は(Fab)2断片)の実際の断片化によって得ることができる。或いは、エピトープ結合断片は、そのような親抗体のアミノ酸配列の一部を含むアミノ酸配列である。本明細書で使用される場合、分子は、親抗体又はその一部の実際の化学修飾を通じて得られる場合、又はそのような親抗体又はその関連部分のアミノ酸配列と実質的に類似するアミノ酸配列を含む場合(例えば、そのような親分子若しくはその関連部分から30%未満、20%未満、10%未満、若しくは5%未満しか差異がない、又はそのような親分子若しくはその関連部分から10アミノ酸残基、若しくは10未満、9未満、8未満、7未満、6未満、5未満、4未満、3未満若しくは2未満のアミノ酸残基しか差異がない)、抗体(又はその関連部分)の「誘導体」であると言われる。
一実施形態では、本発明の抗体ベースの分子は、インタクトの免疫グロブリン又はそのエピトープ結合断片を有する分子である。本明細書で使用される場合、「断片」、「領域」、「部分」、及び「ドメイン」という用語は、その使用の内容が別途示されていない限り、一般的に同義であると意図される。天然に存在する抗体は、通常、少なくとも2つの重(H)鎖及び少なくとも2つの軽(L)鎖で構成される四量体を典型的に含む。各重鎖は、重鎖可変(VH)領域及び重鎖定常(CH)領域で構成され、これらは通常、3つのドメイン(CH1ドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメイン)を含む。重鎖は、IgG(IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4のサブタイプ)、IgA(IgA1及びIgA2のサブタイプ)、IgM及びIgEを含む任意のアイソタイプの重鎖でありうる。各軽鎖は、軽鎖可変(VL)領域及び軽鎖定常(CL)領域で構成される。軽鎖としては、カッパ鎖及びラムダ鎖が挙げられる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、典型的には、抗原認識に関与し、重鎖及び軽鎖の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)及び古典的補体系の第1成分(C1q)を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介しうる。VH領域及びVL領域は、「相補性決定領域」又は「CDR」と呼ばれる超可変領域と、それを差し挟む「フレームワーク領域」(FR)と呼ばれる、より保存された配列の領域に更に細分化することができる。各VH領域及びVL領域は、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置された3つのCDRドメイン及び4つのFRドメインからなる:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。特に関連するのは、天然に存在しうるものと異なる物理的環境に存在するように「単離」されているか、又は天然に存在する抗体とアミノ酸配列において異なるように修飾されている、抗体及びそのエピトープ結合断片である。
エピトープ結合能力を示す抗体の断片(Fab及び(Fab)2断片を含む)は、例えば、インタクト抗体のプロテアーゼ切断によって得ることができる。単一ドメイン抗体断片は、1つの可変ドメイン(例えば、VL又はVH)のみを有する。本発明に包含されるエピトープ結合断片の例としては、(i)VL、VH、CL及びCH1ドメインを含有する一価断片であるFab'又はFab断片;(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab')2断片;(iii)本質的にVHドメイン及びCH1ドメインからなるFd断片;(iv)本質的にVL及びVHドメインからなるFv断片;(v)本質的にVH又はVLドメインからなり(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWardら、「Binding Activities Of A Repertoier of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted From Escherichia coli.」Nature 341 :544～546頁(1989))、ドメイン抗体とも呼ばれる(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるHoltら、「Domain Antibodies: Proteins for Therapy」、Trends Biotechnol.21(11):484～490頁(2003))、dAb断片;(vi)ナノボディ(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるRevetsら、「Nanobodies As Novel Agents For Cancer Therapy」、Expert Opin. Biol. Ther. 5(1):111～124頁(2005)、及び(vii)単離された相補性決定領域(CDR)が挙げられる。エピトープ結合断片は、そのような抗体のCDRドメインの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つ全てを含有しうる。一実施形態では、抗体の断片(又は領域若しくは部分若しくはドメイン)は、30～100個のアミノ酸又は50～150個のアミノ酸又は70～200個のアミノ酸を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。一実施形態では、抗体の断片(又は領域若しくは部分若しくはドメイン)の長さは、抗体(全長抗体)の長さの少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%である。一実施形態では、断片は、前記抗体のエピトープ結合断片又は機能的断片であり、少なくともある程度、抗体の活性を誘導することが予測されるものであることを意味する。「少なくともある程度」は、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、150%、200%又はそれより多くを意味しうる。一実施形態では、抗体又は抗体の断片は、抗体の検出可能な活性を誘導すべきである。抗体の活性は、本明細書において先に定義されている。
そのような抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を使用して得られうる。例えば、F(ab')2断片は、全長抗体をペプシンで処理することによって生成されうる。得られたF(ab')2断片を処理して、ジスルフィド架橋を還元してFab'断片を作製してもよい。Fab断片は、IgG抗体をパパインで処理することによって得られてもよい。Fab'断片は、IgG抗体のペプシン消化で得られてもよい。Fab'断片は、F(ab')2断片を、還元剤、例えばジチオスレイトール等で処理することによって得ることができる。抗体断片はまた、そのような断片をコードする核酸を組換え細胞において発現させることによって生成されてもよい(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるEvansら、「Rapid Expression Of An Anti-Human C5 Chimeric Fab Utilizing A Vector That Replicates In COS And 293 Cells」、J. Immunol. Meth. 184:123～38頁(1995)参照)。例えば、F(ab')2断片の一部をコードするキメラ遺伝子は、そのような切断型抗体断片分子を生ずるように、重鎖のCH1ドメイン及びヒンジ領域をコードするDNA配列、続いて翻訳終止コドンを含むことができる。所望のエピトープに結合することができる好適な断片は、インタクト抗体と同じ方法で、有用性について容易にスクリーニングされうる。
抗体誘導体としては、抗体の少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを含有する分子が挙げられ、典型的には、組換え技術を使用して形成される。一つの例示的な抗体誘導体としては、単鎖Fv(scFv)が挙げられる。scFvは、Fv断片の2つのドメイン、VL領域及びVH領域から形成され、これらは別個の遺伝子によってコードされてもよい。そのような遺伝子配列又はcDNAをコードする遺伝子配列は、組換え方法を使用して、可撓性リンカー(典型的には約10、12、15又はそれを超えるアミノ酸残基)によって連結され、これにより、遺伝子配列は、VL及びVH領域が会合して一価のエピトープ結合分子を形成する、単一のタンパク質鎖として作製される(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBirdら、「Single-Chain Antigen-Binding Proteins」、Science 242:423～426頁(1988);及びHustonら、「Protein Engineering Of Antibody Binding Sites: Recovery Of Specific Activity In An Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced In Escherichia coli」、Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)85:5879～5883頁(1988)参照)。或いは、異なる単一のポリペプチド鎖のVL及びVH領域が共に会合することを可能にするために、短すぎない(例えば、約9残基以上)可撓性リンカーを用いることにより、2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する二重特異性抗体を形成することができる。
別の実施形態では、抗体誘導体は、2つのscFvを、タンデムで連結することによって(つまり、タンデムscFv)又はそれらが二量体化してダイアボディを形成するように連結することによって操作された二価(divalent又はbivalent)の単鎖可変断片である(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるHolligerら、「‘Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments」、Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)90(14)、6444～8頁(1993))。更に別の実施形態では、本抗体は、3つのscFvを、タンデムで連結することによって又は三量体を形成してトリアボディを形成するように連結することによって操作されたトリアボディ、つまり、三価の一本鎖可変断片である。別の実施形態では、抗体は、4つの一本鎖可変断片の四量体である。別の実施形態では、抗体は、抗原結合領域の対を形成するタンデムFdセグメントの対(VH-CH1-VH-CH1)を含む抗体である「直鎖状抗体」である(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるZapataら、Protein Eng. 8(10):1057～1062頁(1995)参照)。別の実施形態では、抗体誘導体は、CH3領域に結合した一本鎖Fv領域(つまり、scFv-CH3)からなるミニボディである。
本発明の文脈におけるこれら及び他の有用な抗体断片及び抗体誘導体は、本明細書で更に論じられる。また、抗体ベースの分子という用語には、別段の定めのない限り、抗体様ポリペプチド、例えばキメラ抗体及びヒト化抗体、並びに酵素切断、ペプチド合成、及び組換え技術等の任意の既知の技術によって提供される、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体断片(エピトープ結合断片又は機能的断片)も含まれることを理解されたい。一実施形態では、「抗体ベースの分子」という用語は、「抗体」という用語又は「抗体又はその機能断片」という表現によって置き換えられてもよい。
本明細書で生成される抗体は、任意のアイソタイプの抗体でありうる。本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、又はIgM)を指す。アイソタイプの選択は、典型的には、所望のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性(ADCC)誘導等によって導かれる。例示的なアイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4である。本明細書に開示されるMuSK抗体の特に有用なアイソタイプとしては、IgG1及びIgG2が挙げられる。
ヒト軽鎖定常領域のカッパ又はラムダのいずれかを使用してもよい。所望の場合、本発明のMuSK抗体のクラスを、既知の方法によって切り替えてもよい。例えば、元々IgMであった本発明の抗体を、本発明のIgG抗体に、クラスを切り替えてもよい。更に、クラススイッチ技術を使用して、1つのIgGサブクラスを別のサブクラスに、例えば、IgG1からIgG2に変換してもよい。したがって、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のために、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、又はIgM抗体にアイソタイプを切り替えることによって変化させてもよい。
一実施形態では、本発明の抗体ベースの分子は、特に、治療目的に使用される場合、「ヒト化」される。「ヒト化」という用語は、一般に、組換え技術を使用して調製されるキメラ分子であって、非ヒト種由来の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造及び/又は配列に基づく残りの免疫グロブリン構造とを有するキメラ分子を指す。抗原結合部位は、ヒト定常ドメインに融合された完全な非ヒト抗体可変ドメイン、又はヒト可変ドメインの適切なヒトフレームワーク領域に移植されたそのような可変ドメインの相補性決定領域(CDR)のみのいずれかを含んでもよい。そのようなヒト化分子のフレームワーク残基は、野生型(例えば、完全ヒト)であってもよく、又は、ヒト化の基礎として機能しているヒト抗体の配列には見出されない1つ又は複数のアミノ酸の置換を含有するように修飾されていてもよい。ヒト化は、分子の定常領域がヒト個体において免疫原として機能する可能性を減少又は消失させるが、外来の可変領域に対して免疫応答する可能性は残る(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLoBuglio, A.F.ら、「Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4220～4224頁(1989)参照)。別のアプローチは、ヒト由来の定常領域を提供するだけでなく、可変領域をヒト形態にできるだけ近づけて再形成するように修飾することに焦点を当てる。重鎖及び軽鎖の両方の可変領域が、問題の抗原に応答して変化し、結合能を決定する3つの相補性決定領域(CDR)を含む。CDRは、4つのフレームワーク領域(FR)に隣接している。FRは、所与の種において比較的保存されており、CDRのための骨格を推定的に提供する。非ヒト抗体が特定の抗原に関して調製されるとき、可変領域は、非ヒト抗体に由来するCDRを、修飾されるヒト抗体に存在するFR上に移植することによって「再形成」又は「ヒト化」されうる。本明細書に記載の非ヒト抗体をヒト化するための好適な方法は、当該技術分野において公知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるSato, K.ら、Cancer Res 53:851～856頁(1993); Riechmann, L.ら、「Reshaping Human Antibodies for Therapy」、Nature 332:323～327頁(1988); Verhoeyen, M.ら、「Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity」、Science 239:1534～1536頁(1988); Kettleborough, C. A.ら、「Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation」、Protein Engineering 4:773～3783頁(1991); Maeda, H.ら、「Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity」、Human Antibodies Hybridoma 2:124～134頁(1991); Gorman, S. D.ら、「Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181～4185頁(1991); Tempest, P.R.ら、「Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection In Vivo」、Bio/Technology 9:266～271頁(1991); Co, M. S.ら、「Humanized Antibodies For Antiviral Therapy」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869～2873頁(1991); Carter, P.ら、「Humanization Of An Anti-pl85her2 Antibody For Human Cancer Therapy」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285～4289頁(1992);及びCo, M.S.ら、「Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen」、J. Immunol. 148: 1149～1154頁(1992)を参照。一部の実施形態では、本発明のヒト化MuSK抗体は、全てのCDR配列を保持する(例えば、ラマ又はマウス抗体に由来する6つのCDRを全て含むヒト化抗体)。他の実施形態では、本発明のヒト化MuSK抗体は、元の抗体に関して改変されている1つ又は複数のCDR(1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ)を有する。抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書に開示される抗体をヒト化するために好適である(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWinterによる米国特許第5,225,539号; Queen and Selickによる米国特許第5,530,101号及び同第5,585,089号; Robertらによる米国特許第5,859,205号; Carterによる米国特許第6,407,213号;並びにFooteによる米国特許第6,881,557号参照)。
いくつかの抗体において、CDRの一部、つまり、「特異性決定残基」(「SDR」)と呼ばれる、結合に必要なCDR残基のサブセットのみが、抗体の結合を保持するために必要である。抗原に接触せず、SDR内に存在しないCDR残基は、Chothia超可変ループの外側に存在するKabat CDRの領域からの以前の研究(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるKabatら、SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST、National Institutes of Health Publication No. 91～3242頁(1992); Chothia, C.ら、「Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins」、J. Mol. Biol. 196:901～917頁(1987)参照)に基づいて、分子モデリングによって及び/若しくは経験的に、又は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGonzales, N.R.ら、「SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity」、Mol. Immunol. 41:863～872頁(2004)に記載されているように、同定することができる。そのようなヒト化抗体において、1つ又は複数のドナーCDR残基が存在しないか又はドナーCDR全体が排除されている位置において、位置を占めるアミノ酸残基は、アクセプター抗体配列における対応する位置(Kabatナンバリングによる)を占めるアミノ酸残基でありうる。CDRに含まれることとなる、ドナーアミノ酸に対するアクセプターのそのような置換の数は、競合する考慮事項のバランスを反映する。そのような置換は、ヒト化抗体における非ヒトアミノ酸の数を減少させること、及び潜在的な免疫原性を結果として減少させることにおいて、潜在的に有利である。しかしながら、置換は親和性の変化を引き起こす可能性もあり、親和性の有意な低下は回避されることが好ましい。置換は、活性の変化を引き起こす可能性もある。活性の著しい低下を引き起こすそのような置換も好ましくは回避される。この状況で、抗体又は抗体断片は、依然として、本明細書において先に定義されている抗体の検出可能な活性又は少なくともある程度の抗体の活性を示すべきである。CDR内の置換のための位置及び置換されるアミノ酸は、経験的に選択されてもよい。
代替的に、ファージディスプレイ技術を使用して、本発明の抗体ベースの分子のCDR親和性を増加させる(又は減少させる)ことができる。親和性成熟と称されるこの技術は、突然変異誘導又は「CDRウォーキング」を使用し、標的抗原又はその抗原断片を使用して再選択して、初期又は親抗体と比較したときに抗原に対してより高い(又はより低い)親和性で結合するCDRを有する抗体を同定する(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGlaserら、「Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis In A Filamentous Phage Vector System」、J. Immunology 149:3903～3913頁(1992)参照)。単一ヌクレオチドではなくコドン全体を変異生成することにより、アミノ酸変異のセミランダム化レパートリーが生じる。バリアントクローンのプールからなるライブラリを構築してもよく、そのバリアントクローンのそれぞれは、単一のCDRにおける単一のアミノ酸改変によって、かかるライブラリの別のメンバーとは異なり、ライブラリは、各CDR残基に対する各可能なアミノ酸置換を潜在的に表すバリアントを含有する。抗原に対する結合親和性が増加した(又は減少した)変異体は、固定化変異体を標識抗原と接触させることによってスクリーニングすることができる。当該技術分野において公知の任意のスクリーニング方法を使用して、抗原に対する親和性の増加又は減少を有するバリアント抗体ベースの結合分子を同定することができる(例えば、ELISA)(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWu, H.ら、「Stepwise In Vitro Affinity Maturation of Vitaxin, An Alphav Beta 3-Specific Humanized mAb」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6037～6042頁(1998); Yeltonら、「Affinity Maturation Of The BR96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis」、J. Immunology 155:1994頁(1995)参照)。軽鎖をランダム化するCDRウォーキングを使用してもよい(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるSchier, R.ら、「Isolation Of Picomolar Affinity Anti-c-erbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site」、J. Mol. Biol. 263:551～567頁(1996)参照)。
MuSK抗体分子の親和性成熟のための方法は、本明細書において記載されており、また例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるKrause, J.C.ら、「An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function of a Human Antibody」、MBio. 2(1): e00345～10頁(2011); Kuan, C.T.ら、「Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas」、Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645頁(2010); Hackel, B.J.ら、「Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes」、J. Mol. Biol. 401(l):84～96頁(2010); Montgomery, D.L.ら、「Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41」、MAbs 1(5):462～474頁(2009); Gustchina, E.ら、「Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth」、Virology 393(1): 112～119頁(2009); Finlay, W.J.ら、「Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions」、J. Mol. Biol. 388(3):541～558頁(2009); Bostrom, J.ら、「Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development」、Methods Mol. Biol. 525:353～376頁(2009); Steidl, S.ら、「In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification」、Mol. Immunol.46(1): 135～144頁(2008);及びBarderas, R.ら、「Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(26):9029～9034頁(2008)に開示されている。
本発明のある態様において、本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子は、本明細書のTable 1(表1)及びTable 2(表2)に示される、任意の1つ、任意の2つ、任意の3つ、任意の4つ、任意の5つ、又は任意の6つのCDRのアミノ酸配列を含む。
一態様では、ヒト筋特異的チロシン-タンパク質キナーゼ(MuSK)に結合する抗体ベースの分子は、重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、(i)配列番号1～16、135、136、若しくは147～149のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号1～16、135、136、若しくは147～149のいずれか1つの修飾アミノ酸配列であって、配列番号1～16、135、136、若しくは147～149のいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有する修飾アミノ酸配列を含む相補性決定領域1(CDR-H1)、(ii)配列番号17～32、137、138、若しくは150～155のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号17～32、137、138、若しくは150～155のいずれか1つの修飾アミノ酸配列であって、配列番号17～32、137、138、若しくは150～155のいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有する修飾アミノ酸配列を含む相補性決定領域2(CDR-H2);及び(iii)配列番号33～48、139、140、156～158、若しくは240～251のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号33～48、139、140、156～158、若しくは240～251のいずれか1つの修飾アミノ酸配列であって、配列番号33～48、139、140、156～158、若しくは240～251のいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有する修飾アミノ酸配列を含む相補性決定領域3(CDR-H3)を含む。
一実施形態では、ヒト筋特異的チロシン-タンパク質キナーゼ(MuSK)に結合する抗体ベースの分子は、(i)配列番号1のCDR-H1、配列番号17のCDR-H2、及び配列番号33のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(ii)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号34のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(iii)配列番号3のCDR-H1、配列番号19のCDR-H2、及び配列番号35のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(iv)配列番号4のCDR-H1、配列番号20のCDR-H2、及び配列番号36のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(v)配列番号5のCDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号37のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(vi)配列番号6のCDR-H1、配列番号22のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(vii)配列番号7のCDR-H1、配列番号23のCDR-H2、及び配列番号39のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(viii)配列番号8のCDR-H1、配列番号24のCDR-H2、及び配列番号40のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(ix)配列番号9のCDR-H1、配列番号25のCDR-H2、及び配列番号41のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(x)配列番号10のCDR-H1、配列番号26のCDR-H2、及び配列番号42のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xi)配列番号11のCDR-H1、配列番号27のCDR-H2、及び配列番号43のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xii)配列番号12のCDR-H1、配列番号28のCDR-H2、及び配列番号44のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xiii)配列番号13のCDR-H1、配列番号29のCDR-H2、及び配列番号45のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xiv)配列番号14のCDR-H1、配列番号30のCDR-H2、及び配列番号46のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xv)配列番号15のCDR-H1、配列番号31のCDR-H2、及び配列番号47のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xvi)配列番号16のCDR-H1、配列番号32のCDR-H2、及び配列番号48のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xvii)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号139のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに(xviii)配列番号136のCDR-H1、配列番号138のCDR-H2、及び配列番号140のCDR-H3を含む重鎖可変領域を含む。重鎖CDR配列の配列は、下記のTable 1(表1)に示される。
一実施形態では、ヒト筋特異的チロシン-タンパク質キナーゼ(MuSK)に結合する抗体ベースの分子は、(ii.a)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号240のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m1)、(ii.b)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号241のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m2)、(ii.c)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号242のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m3)、(ii.d)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号243のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m4)、(ii.e)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号244のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m5)、(ii.f)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号245のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m6)、(ii.g)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号246のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m7)、(ii.h)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、配列番号247のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m8)を含む。
一実施形態では、ヒト筋特異的チロシン-タンパク質キナーゼ(MuSK)に結合する抗体ベースの分子は、(xvii.a)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号248のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X17m1)、(xvii.b)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号249のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X17m2)、(xvii.c)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号250のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X17m3)、(xvii.d)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号251のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X17m6)を含む。
一実施形態では、ヒト筋特異的チロシン-タンパク質キナーゼ(MuSK)に結合する抗体ベースの分子は、重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、(xix)配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xx)配列番号148のCDR-H1、配列番号151のCDR-H2、及び配列番号157のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xxi)配列番号149のCDR-H1、配列番号152のCDR-H2、及び配列番号158のCDR-H3を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト筋特異的チロシンタンパク質キナーゼ(MuSK)に結合する抗体ベースの分子は、重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、(xxii)配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域(3B2g1m1/3B2g2m1)、(xxiii)配列番号147のCDR-H1、配列番号154のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域(3B2g1m2/3B2g2m2)、(xxiv)配列番号147のCDR-H1、配列番号155のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域(3B2g1m4/3B2g2m4)を含む。重鎖CDR配列の配列は、下記のTable 1(表1)に示される。
一実施形態では、ヒト筋特異的チロシンタンパク質キナーゼ(MuSK)に結合する抗体ベースの分子は、重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2又は配列番号153に対して少なくとも80%の配列同一性を有するCDR-H2アミノ酸配列、及び配列番号156のCDR-H3を含む(3B2g2m1)。本実施形態によれば、配列番号153に対して少なくとも80%の配列同一性を有するCDR-H2アミノ酸配列は、配列番号153のアミノ酸配列に対して1つ又は複数のアミノ酸置換を含み、前記置換は、残基1、2、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17又はこれらの任意の組合せにある。別の実施形態では、CDR-H2アミノ酸配列は、配列番号153に対して、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。一実施形態では、抗体のCDR-H2は、3位にプロリン(P)、4位にトリプトファン(W)、及び5位にセリン(S)又はアスパラギン(N)を含む。
一実施形態では、ヒト筋特異的チロシン-タンパク質キナーゼ(MuSK)に結合する抗体ベースの分子は、重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む。
重鎖CDR配列の配列は、下記のTable 1(表1)に示される。
Figure 2023522212000003
Figure 2023522212000004
一部の実施形態では、本明細書に開示されるMuSK抗体ベースの分子は、軽鎖可変領域を更に含む。軽鎖可変領域は、(i)配列番号49～64、141、142、若しくは159～169のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号49～64、141、142、若しくは159～169のいずれか1つの修飾アミノ酸配列であって、配列番号49～64、141、142、若しくは159～169のいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有する修飾アミノ酸配列を有する相補性決定領域1(CDR-L1)、(ii)配列番号65～80、143、144、若しくは170～179のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号65～80、143、144、若しくは170～179のいずれか1つの修飾アミノ酸配列であって、配列番号65～80、143、144、若しくは170～179のいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有する修飾アミノ酸配列を有する相補性決定領域2(CDR-L2)、及び(iii)配列番号81～96、145、146、若しくは180～195のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号81～96、145、146、若しくは180～195のいずれか1つの修飾アミノ酸配列であって、配列番号81～96、145、146、若しくは180～195のいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有する修飾アミノ酸配列を有する相補性決定領域3(CDR-L3)を含む。
一実施形態では、本明細書に開示されるMuSK抗体ベースの分子の軽鎖可変領域は、(i)配列番号49のCDR-L1、配列番号65のCDR-L2、及び配列番号81のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(ii)配列番号50のCDR-L1、配列番号66のCDR-L2、及び配列番号82のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(iii)配列番号51のCDR-L1、配列番号67のCDR-L2、及び配列番号83のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(iv)配列番号52のCDR-L1、配列番号68のCDR-L2、及び配列番号84のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(v)配列番号53のCDR-L1、配列番号69のCDR-L2、及び配列番号85のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(vi)配列番号54のCDR-L1、配列番号70のCDR-L2、及び配列番号86のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(vii)配列番号55のCDR-L1、配列番号71のCDR-L2、及び配列番号87のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(viii)配列番号56のCDR-L1、配列番号72のCDR-L2、及び配列番号88のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(ix)配列番号57のCDR-L1、配列番号73のCDR-L2、及び配列番号89のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(x)配列番号58のCDR-L1、配列番号74のCDR-L2、及び配列番号90のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xi)配列番号59のCDR-L1、配列番号75のCDR-L2、及び配列番号91のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xii)配列番号60のCDR-L1、配列番号76のCDR-L2、及び配列番号92のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xiii)配列番号61のCDR-L1、配列番号77のCDR-L2、及び配列番号93のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xiv)配列番号62のCDR-L1、配列番号78のCDR-L2、及び配列番号94のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xv)配列番号63のCDR-L1、配列番号79のCDR-L2、及び配列番号95のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xvi)配列番号64のCDR-L1、配列番号80のCDR-L2、及び配列番号96のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xvii)配列番号141のCDR-L1、配列番号143のCDR-L2、及び配列番号145のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xviii)配列番号142のCDR-L1、配列番号144のCDR-L2、及び配列番号146のCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む。軽鎖CDR配列の配列は、下記のTable 2(表2)に示される。
一実施形態では、本明細書に開示されるMuSK抗体ベースの分子の軽鎖可変領域は、(xix)配列番号159のCDR-L1、配列番号170のCDR-L2、及び配列番号180のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xx)配列番号159のCDR-L1、配列番号171のCDR-L2、及び配列番号181のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxi)配列番号160のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号182のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxii)配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxiii)配列番号159のCDR-L1、配列番号171のCDR-L2、及び配列番号184のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxiv)配列番号159のCDR-L1、配列番号173のCDR-L2、及び配列番号185のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxv)配列番号159のCDR-L1、配列番号173のCDR-L2、及び配列番号186のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxvi)配列番号161のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号187のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxvii)配列番号162のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号188のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxviii)配列番号163のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号188のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxix)配列番号164のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号189のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxx)配列番号165のCDR-L1、配列番号175のCDR-L2、及び配列番号190のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxxi)配列番号166のCDR-L1、配列番号176のCDR-L2、及び配列番号191のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxxi)配列番号167のCDR-L1、配列番号177のCDR-L2、及び配列番号192のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxxii)配列番号168のCDR-L1、配列番号178のCDR-L2、及び配列番号193のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxxiii)配列番号169のCDR-L1、配列番号179のCDR-L2、及び配列番号194のCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本明細書に開示されるMuSK抗体ベースの分子の軽鎖可変領域は、配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号195のCDR-L3又は配列番号195に対して少なくとも80%の配列同一性を有するCDR-L3を含む軽鎖可変領域を含む。本実施形態によれば、配列番号195に対して少なくとも80%の配列同一性を有するCDR-L3アミノ酸配列は、配列番号195のアミノ酸配列に対して1つ又は複数のアミノ酸置換を含み、前記置換は、残基1、2、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17又はこれらの任意の組合せにある。別の実施形態では、CDR-L3アミノ酸配列は、配列番号195のアミノ酸配列に対して、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。
軽鎖CDR配列の配列は、下記のTable 2(表2)に示される。
Figure 2023522212000005
Figure 2023522212000006
本明細書に開示されるMuSK抗体ベースの分子の重鎖CDR配列及び/又は軽鎖CDR配列に対する好適なアミノ酸修飾には、例えば、上述のように、本明細書に開示されるCDR配列の結合特性と類似の又は増強された結合特性を有するバリアントCDR配列をもたらす保存的置換又は機能的に等価なアミノ酸残基の置換が含まれる。抗体のMuSK結合を維持又は増強する1、2、3、4、5個又はより多くのアミノ酸置換(CDRの長さに応じる)を含有するTable 1(表1)及びTable 2(表2)のCDRが本発明に包含される。得られた修飾CDRは、Table 1(表1)及びTable 2(表2)のCDRと、配列において少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%類似している。Table 1(表1)の重鎖CDR配列並びに/又はTable 1(表1)及びTable 2(表2)の軽鎖CDR配列に対する好適なアミノ酸修飾には、例えば、Table 1(表1)及びTable 2(表2)のCDR配列の結合特性と類似の又は増強された結合特性を有するバリアントCDR配列をもたらす保存的置換又は機能的に等価なアミノ酸残基の置換が含まれる。保存的置換は、それらの側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。遺伝子的にコードアミノ酸は、以下の4つのファミリーに分けることができる:(1)酸性(アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩)、(2)塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン)、(3)非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、及び(4)非荷電極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン)。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、まとめて、芳香族アミノ酸に分類されることもある。或いは、アミノ酸レパートリーは、以下のようにグループ化されうる:(1)酸性(アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩)、(2)塩基性(リジン、アルギニンヒスチジン)、(3)脂肪族(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン)、ここで、セリン及びトレオニンは、場合により脂肪族-ヒドロキシルとして別個にグループ化される;(4)芳香族(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン)、(5)アミド(アスパラギン、グルタミン);並びに(6)硫黄含有(システイン及びメチオニン)(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるStryer(編)、Biochemistry、第2版、WH Freeman and Co.、1981)。非保存的置換を、Table 1(表1)の重鎖CDR配列及びTable 2(表2)の軽鎖CDR配列に対して行ってもよい。非保存的置換は、CDRの1つ又は複数のアミノ酸残基を、異なるクラスのアミノ酸由来の1つ又は複数のアミノ酸残基で置換して、CDRの結合特性を改善又は増強することを含む。Table 1(表1)の重鎖可変領域CDR及び/又はTable 2(表2)の軽鎖可変領域CDRのアミノ酸配列は、MuSK結合を維持又は増強する1つ又は複数の内部の中性アミノ酸の挿入又は欠失を更に含んでもよい。
一実施形態では、MuSK抗体ベースの分子は、
(i)配列番号1のCDR-H1、配列番号17のCDR-H2、及び配列番号33のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号49のCDR-L1、配列番号65のCDR-L2、及び配列番号81のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(ii)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号34のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号50のCDR-L1、配列番号66のCDR-L2、及び配列番号82のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(iii)配列番号3のCDR-H1、配列番号19のCDR-H2、及び配列番号35のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号51のCDR-L1、配列番号67のCDR-L2、及び配列番号83のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(iv)配列番号4のCDR-H1、配列番号20のCDR-H2、及び配列番号36のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号52のCDR-L1、配列番号68のCDR-L2、及び配列番号84のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(v)配列番号5のCDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号37のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号53のCDR-L1、配列番号69のCDR-L2、及び配列番号85のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(vi)配列番号6のCDR-H1、配列番号22のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号54のCDR-L1、配列番号70のCDR-L2、及び配列番号86のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(vii)配列番号7のCDR-H1、配列番号23のCDR-H2、及び配列番号39のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号55のCDR-L1、配列番号71のCDR-L2、及び配列番号87のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(viii)配列番号8のCDR-H1、配列番号24のCDR-H2、及び配列番号40のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号56のCDR-L1、配列番号72のCDR-L2、及び配列番号88のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(ix)配列番号9のCDR-H1、配列番号25のCDR-H2、及び配列番号41のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号57のCDR-L1、配列番号73のCDR-L2、及び配列番号89のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(x)配列番号10のCDR-H1、配列番号26のCDR-H2、及び配列番号42のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号58のCDR-L1、配列番号74のCDR-L2、及び配列番号90のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(xi)配列番号11のCDR-H1、配列番号27のCDR-H2、及び配列番号43のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号59のCDR-L1、配列番号75のCDR-L2、及び配列番号91のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(xii)配列番号12のCDR-H1、配列番号28のCDR-H2、及び配列番号44のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号60のCDR-L1、配列番号76のCDR-L2、及び配列番号92のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(xiii)配列番号13のCDR-H1、配列番号29のCDR-H2、及び配列番号45のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号61のCDR-L1、配列番号77のCDR-L2、及び配列番号93のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(xiv)配列番号14のCDR-H1、配列番号30のCDR-H2、及び配列番号46のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号62のCDR-L1、配列番号78のCDR-L2、及び配列番号94のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(xv)配列番号15のCDR-H1、配列番号31のCDR-H2、及び配列番号47のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号63のCDR-L1、配列番号79のCDR-L2、及び配列番号95のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(xvi)配列番号16のCDR-H1、配列番号32のCDR-H2、及び配列番号48のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号64のCDR-L1、配列番号80のCDR-L2、及び配列番号96のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
(xvii)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号139のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号141のCDR-L1、配列番号143のCDR-L2、及び配列番号145のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、並びに
(xviii)配列番号136のCDR-H1、配列番号138のCDR-H2、及び配列番号140のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号142のCDR-L1、配列番号144のCDR-L2、及び配列番号146のCDR-L3を含む軽鎖可変領域
を含む。
一実施形態では、MuSK抗体ベースの分子は、
(ii.a)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号240のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号50のCDR-L1、配列番号66のCDR-L2、及び配列番号82のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(X2m1);
(ii.b)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号241のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号50のCDR-L1、配列番号66のCDR-L2、及び配列番号82のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(X2m2);
(ii.c)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号242のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号50のCDR-L1、配列番号66のCDR-L2、及び配列番号82のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(X2m3);
(ii.d)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号243のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号50のCDR-L1、配列番号66のCDR-L2、及び配列番号82のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(X2m4);
(ii.e)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号244のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号50のCDR-L1、配列番号66のCDR-L2、及び配列番号82のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(X2m5);
(ii.f)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号245のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号50のCDR-L1、配列番号66のCDR-L2、及び配列番号82のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(X2m6);
(ii.g)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号246のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号50のCDR-L1、配列番号66のCDR-L2、及び配列番号82のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(X2m7);
(ii.f)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、配列番号247のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号50のCDR-L1、配列番号66のCDR-L2、及び配列番号82のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(X2m8)
を含む。
一実施形態では、MuSK抗体ベースの分子は、
(xvii.a)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号248のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号141のCDR-L1、配列番号143のCDR-L2、及び配列番号145のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(X17m1);
(xvii.b)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号249のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号141のCDR-L1、配列番号143のCDR-L2、及び配列番号145のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(X17m2);
(xvii.c)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号250のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号141のCDR-L1、配列番号143のCDR-L2、及び配列番号145のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(X17m3);
(xvii.d)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号251のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号141のCDR-L1、配列番号143のCDR-L2、及び配列番号145のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(X17m6)
を含む。
一実施形態では、MuSK抗体ベースの分子は、
(i)配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号170のCDR-L2、及び配列番号180のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(14D10);
(ii)配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号171のCDR-L2、及び配列番号181のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(7G4);
(iii)配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号160のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号182のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(3C4);
(iv)配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(3B2);
(v)配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号171のCDR-L2、及び配列番号184のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(3G3);
(vi)配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号173のCDR-L2、及び配列番号185のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(31G2);
(vii)配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号173のCDR-L2、及び配列番号186のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(31B7);
(viii)配列番号148のCDR-H1、配列番号151のCDR-H2、及び配列番号157のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号161のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号187のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(17H10);
(ix)配列番号148のCDR-H1、配列番号151のCDR-H2、及び配列番号157のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号162のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号188のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(23B6);
(x)配列番号148のCDR-H1、配列番号151のCDR-H2、及び配列番号157のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号163のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号188のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(30E1);
(xi)配列番号148のCDR-H1、配列番号151のCDR-H2、及び配列番号157のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号164のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号189のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(30A11);
(xii)配列番号149のCDR-H1、配列番号152のCDR-H2、及び配列番号158のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号165のCDR-L1、配列番号175のCDR-L2、及び配列番号190のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(16F11);
(xiii)配列番号149のCDR-H1、配列番号152のCDR-H2、及び配列番号158のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号166のCDR-L1、配列番号176のCDR-L2、及び配列番号191のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(4C11);
(xiv)配列番号149のCDR-H1、配列番号152のCDR-H2、及び配列番号158のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号167のCDR-L1、配列番号177のCDR-L2、及び配列番号192のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(7A12);
(xv)配列番号149のCDR-H1、配列番号152のCDR-H2、及び配列番号158のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号168のCDR-L1、配列番号178のCDR-L2、及び配列番号193のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(7G12);
(xvi)配列番号149のCDR-H1、配列番号152のCDR-H2、及び配列番号158のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号169のCDR-L1、配列番号179のCDR-L2、及び配列番号194のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(7B8);
(xvii)配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(3B2g1m1);
(xviii)配列番号147のCDR-H1、配列番号154のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(3B2g1m2);
(xvix)配列番号147のCDR-H1、配列番号155のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(3B2g1m4);
(xx)配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号195のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(3B2g2m1);
(xxi)配列番号147のCDR-H1、配列番号154のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号195のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(3B2g2m2);並びに
(xxii)配列番号147のCDR-H1、配列番号155のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号195のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(3B2g2m4)
を含む。
好ましい実施形態では、MuSK抗体ベースの分子は、配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号195のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(3B2g2m1)を含む。
本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子は、可変軽(VL)鎖、可変重(VH)鎖、又はVL鎖及びVH鎖の組合せを含みうる。一部の実施形態では、MuSK抗体ベースの分子のVH鎖は、下記のTable 3(表3)に示されるVHアミノ酸配列のいずれか1つ、又はTable 3(表3)に列挙されるVHアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、若しくは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、MuSK抗体ベースの分子のVL鎖は、下記のTable 3(表3)に示されるVLアミノ酸配列のいずれか1つ、又はTable 3(表3)に列挙されるVLアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、若しくは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。
Figure 2023522212000007
Figure 2023522212000008
Figure 2023522212000009
Figure 2023522212000010
Figure 2023522212000011
Figure 2023522212000012
一実施形態では、本明細書に開示されるMuSK抗体ベースの分子は、(i)配列番号97と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号98と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(ii)配列番号99及び252～259のうちのいずれか1つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号100と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(iii)配列番号101と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号102と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(iv)配列番号103と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号104と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(v)配列番号105と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号106と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(vi)配列番号107と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号108と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は(vii)配列番号109と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号110と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(viii)配列番号111と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号112と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(ix)配列番号113と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号114と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(x)配列番号115と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号116と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xi)配列番号117と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号118と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xii)配列番号119と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号120と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xiii)配列番号121と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号122と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xiv)配列番号123と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号124と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xv)配列番号125と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号126と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xvi)配列番号127と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号128と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xvii)配列番号131及び260～263のうちのいずれか1つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号132と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに(xviii)配列番号133と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号134と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるMuSK抗体ベースの分子は、(i)配列番号196と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号197と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(ii)配列番号198と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号199と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(iii)配列番号200と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号201と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(iv)配列番号202と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号203と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(v)配列番号204と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号205と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(vi)配列番号206と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号207と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(vii)配列番号208と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号209と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(viii)配列番号210と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号211と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(vix)配列番号212と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号213と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(x)配列番号214と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号215と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xi)配列番号216と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号217と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xii)配列番号218と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号219と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xiii)配列番号220と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号221と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xiv)配列番号222と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号223と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xv)配列番号224と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号225と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xvi)配列番号226と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号227と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xvii)配列番号228と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号229と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xviii)配列番号230と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号231と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xix)配列番号232と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号233と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xx)配列番号234と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号235と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xxi)配列番号236と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号237と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、(xxii)配列番号238と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号229と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む。
本発明の別の態様は、本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子をコードする単離ポリヌクレオチドに関する。一実施形態では、本発明のMuSK抗体をコードするポリヌクレオチドは、上記CDR、例えば配列番号1～48、135～140、147～158、及び240～251の重鎖CDR並びに配列番号49～96、141～146及び159～195の軽鎖CDRのうちの任意の1つ、任意の2つ、任意の3つ、任意の4つ、任意の5つ、又は任意の6つをコードする配列を含む。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、VHドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、VHドメインは、(i)配列番号1のCDR-H1、配列番号17のCDR-H2、及び配列番号33のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(ii)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号34のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(iii)配列番号3のCDR-H1、配列番号19のCDR-H2、及び配列番号35のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(iv)配列番号4のCDR-H1、配列番号20のCDR-H2、及び配列番号36のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(v)配列番号5のCDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号37のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(vi)配列番号6のCDR-H1、配列番号22のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(vii)配列番号7のCDR-H1、配列番号23のCDR-H2、及び配列番号39のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(viii)配列番号8のCDR-H1、配列番号24のCDR-H2、及び配列番号40のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(ix)配列番号9のCDR-H1、配列番号25のCDR-H2、及び配列番号41のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(x)配列番号10のCDR-H1、配列番号26のCDR-H2、及び配列番号42のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xi)配列番号11のCDR-H1、配列番号27のCDR-H2、及び配列番号43のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xii)配列番号12のCDR-H1、配列番号28のCDR-H2、及び配列番号44のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xiii)配列番号13のCDR-H1、配列番号29のCDR-H2、及び配列番号45のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xiv)配列番号14のCDR-H1、配列番号30のCDR-H2、及び配列番号46のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xv)配列番号15のCDR-H1、配列番号31のCDR-H2、及び配列番号47のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xvi)配列番号16のCDR-H1、配列番号32のCDR-H2、及び配列番号48のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xvii)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号139のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに(xviii)配列番号136のCDR-H1、配列番号138のCDR-H2、及び配列番号140のCDR-H3を含む重鎖可変領域、を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、VHドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、VHドメインは、(ii.a)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号240のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m1)、(ii.b)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号241のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m2)、(ii.c)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号242のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m3)、(ii.d)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号243のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m4)、(ii.e)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号244のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m5)、(ii.f)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号245のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m6)、(ii.g)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号246のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m7)、(ii.h)配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、配列番号247のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X2m8)を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、VHドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、VHドメインは、(xvii.a)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号248のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X17m1)、(xvii.b)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号249のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X17m2)、(xvii.c)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号250のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X17m3)、(xvii.d)配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号251のCDR-H3を含む重鎖可変領域(X17m6)を含む。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、VHドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、VHドメインは、(xix)配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xx)配列番号148のCDR-H1、配列番号151のCDR-H2、及び配列番号157のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xxi)配列番号149のCDR-H1、配列番号152のCDR-H2、及び配列番号158のCDR-H3を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、VHドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、VHドメインは、(xxii)配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xxiii)配列番号147のCDR-H1、配列番号154のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、(xxiv)配列番号147のCDR-H1、配列番号155のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、VLドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、VLドメインは、(i)配列番号49のCDR-L1、配列番号65のCDR-L2、及び配列番号81のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(ii)配列番号50のCDR-L1、配列番号66のCDR-L2、及び配列番号82のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(iii)配列番号51のCDR-L1、配列番号67のCDR-L2、及び配列番号83のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(iv)配列番号52のCDR-L1、配列番号68のCDR-L2、及び配列番号84のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(v)配列番号53のCDR-L1、配列番号69のCDR-L2、及び配列番号85のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(vi)配列番号54のCDR-L1、配列番号70のCDR-L2、及び配列番号86のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(vii)配列番号55のCDR-L1、配列番号71のCDR-L2、及び配列番号87のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(viii)配列番号56のCDR-L1、配列番号72のCDR-L2、及び配列番号88のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(ix)配列番号57のCDR-L1、配列番号73のCDR-L2、及び配列番号89のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(x)配列番号58のCDR-L1、配列番号74のCDR-L2、及び配列番号90のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xi)配列番号59のCDR-L1、配列番号75のCDR-L2、及び配列番号91のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xii)配列番号60のCDR-L1、配列番号76のCDR-L2、及び配列番号92のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xiii)配列番号61のCDR-L1、配列番号77のCDR-L2、及び配列番号93のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xiv)配列番号62のCDR-L1、配列番号78のCDR-L2、及び配列番号94のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xv)配列番号63のCDR-L1、配列番号79のCDR-L2、及び配列番号95のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xvi)配列番号64のCDR-L1、配列番号80のCDR-L2、及び配列番号96のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xvii)配列番号141のCDR-L1、配列番号143のCDR-L2、及び配列番号145のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、並びに(xviii)配列番号142のCDR-L1、配列番号144のCDR-L2、及び配列番号146のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、を含む。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、VLドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、VLドメインは、(xix)配列番号159のCDR-L1、配列番号170のCDR-L2、及び配列番号180のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xx)配列番号159のCDR-L1、配列番号171のCDR-L2、及び配列番号181のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxi)配列番号160のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号182のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxii)配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxiii)配列番号159のCDR-L1、配列番号171のCDR-L2、及び配列番号184のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxiv)配列番号159のCDR-L1、配列番号173のCDR-L2、及び配列番号185のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxv)配列番号159のCDR-L1、配列番号173のCDR-L2、及び配列番号186のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxvi)配列番号161のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号187のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxvii)配列番号162のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号188のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxviii)配列番号163のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号188のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxix)配列番号164のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号189のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxx)配列番号165のCDR-L1、配列番号175のCDR-L2、及び配列番号190のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxxi)配列番号166のCDR-L1、配列番号176のCDR-L2、及び配列番号191のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxxi)配列番号167のCDR-L1、配列番号177のCDR-L2、及び配列番号192のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxxii)配列番号168のCDR-L1、配列番号178のCDR-L2、及び配列番号193のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxxiii)配列番号169のCDR-L1、配列番号179のCDR-L2、及び配列番号194のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、を含む。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、VLドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、VLドメインは、(xxxiv)配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、(xxxv)配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号195のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、を含む。
一実施形態では、MuSK抗体ベースの分子をコードする単離ポリヌクレオチドは、下記のTable 3(表3)に示されるVH及び/又はVLドメイン配列のいずれか1つをコードする。本明細書に記載の核酸分子は、単離ポリヌクレオチド、発現ベクターの部分、又は直鎖状DNA配列の部分、例えばインビトロ転写/翻訳に使用される直鎖状DNA配列、並びに本明細書に記載される抗体又はその結合断片の原核生物、真核生物、又は繊維状ファージの発現、分泌、及び/又は提示に適合するベクターを含む。
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成によって、例えば、自動ポリヌクレオチドシンセサイザーでの固相ポリヌクレオチド合成によって作製され、完全な一本鎖又は二本鎖分子に組み立てられてもよい。或いは、本発明のポリヌクレオチドは、PCR、続いてルーチンのクローニング等の他の技術によって作製されてもよい。所与の配列のポリヌクレオチドを製造又は取得するための技術は、当該技術分野で周知である。
本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも1つの非コード配列、例えば、プロモーター又はエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、RepA結合を促進するシス配列等を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列は、例えば、リンカー配列、マーカー又はタグ配列、例えばタンパク質の精製若しくは検出を容易にするためのヒスチジンタグ若しくはHAタグ、シグナル配列、RepA等の融合タンパク質パートナー、Fc部分、又はバクテリオファージコートタンパク質、例えばpIX若しくはpill等をコードする追加の配列を含んでもよい。
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むベクターに関する。そのようなベクターとしては、限定されないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、例えば限定されないが、ワクシナベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルス発現のためのベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は本明細書に記載のポリヌクレオチドを任意の手段で所与の生物又は遺伝的バックグラウンドへ導入してコードされた抗体ポリペプチドの発現を促進するのに適した任意の他のベクターが挙げられる。一実施形態では、本明細書に記載の重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を、単独で又は本明細書に記載の軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列と共に、プロモーター、翻訳開始セグメント(例えば、リボソーム結合配列及び開始コドン)、3'非翻訳領域、ポリアデニル化シグナル、終結コドン、及び転写終結の配列と組み合わせて、1つ又は複数の発現ベクター構築物を形成する。
一実施形態では、ベクターは、アデノウイルス随伴ウイルス(AAV)ベクターである。本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを中枢神経系へ送達するのに好適ないくつかの治療用AAVベクターは、当該技術分野において公知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるDevermanら、「Gene Therapy for Neurological Disorders: Progress and Prospects」、Nature Rev. 17:641～659頁(2018)参照。好適なAAVベクターとしては、天然形態であるか又は屈性を増強するために操作された血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10又はAAV11が挙げられる。本明細書に記載のMuSK抗体の治療発現に特に好適なCNSに対する屈性を有することが知られているAAVベクターとしては、天然形態の又は屈性を増強するために操作されたAAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8及びAAV9が挙げられる。一実施形態では、AAVベクターは、AAV2ベクターである。別の実施形態では、AAVベクターは、AAV5ベクターである(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるVitaleら、「Anti-tau Conformational scFv MCI Antibody Efficiently Reduces Pathological Tau Species in Adult JNPL3 Mice」、Acta Neuropalhol. Commun. 6:82頁(2018))。別の実施形態では、AAVベクターは、AAV9ベクターである(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるHaiyanら、「Targeting Root Cause by Systemic scAAV9-hIDS Gene Delivery: Functional Correction and Reversal of Severe MPSII in Mice」、Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 10:327～340頁(2018))。別の実施形態では、AAVベクターは、AAVrhlOベクターである(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLiuら、「Vectored Intracerebral Immunizations with the Anti-Tau Monoclonal Antibody PHF1 Markedly Reduces Tau Pathology in Mutant Transgenic Mice」、J. Neurosci. 36(49): 12425～35頁(2016))。
別の実施形態では、AAVベクターは、屈性を制御するために、1つの血清型、例えばAAV2のゲノムと、別の血清型、例えば、AAV1又はAAV3～9のカプシドタンパク質とを含むハイブリッドベクターである。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBroekmanら、「Adeno-associated Virus Vectors Serotyped with AAV8 Capsid are More Efficient than AAV-1 or-2 Serotypes for Widespread Gene Delivery to the Neonatal Mouse Brain」、Neuroscience 138:501～510頁(2006)参照。一実施形態では、AAVベクターは、AAV2/8ハイブリッドベクターである(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Isingら、「AAV-mediated Expression of Anti-Tau ScFv Decreases Tau Accumulation in a Mouse Model of Tauopathy」、J. Exp. Med. 214(5): 1227頁(2017))。別の実施形態では、AAVベクターは、AAV2/9ハイブリッドベクターである(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるSimonら、「A Rapid Gene Delivery-Based Mouse Model for Early-Stage Alzheimer Disease-Type Tauopathy」、J. Neuropath. Exp. Neurol. 72(11): 1062～1頁(2013))。
別の実施形態では、AAVベクターは、脳実質内投与後にその増強されたCNS形質導入のために操作又は選択されたもの、例えば、AAV-DJ(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGrimmら、J. Viol. 82:5887～5911頁(2008));神経幹細胞及び前駆細胞の形質導入の増強のために操作又は選択されたもの、例えば、SCH9及びAAV4.18(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMurlidharanら、J. Virol. 89: 3976～3987頁(2015)及びOjalaら、Mol. Ther. 26:304～319頁(2018));増強された逆行性形質導入のために操作又は選択されたもの、例えばrAAV2-レトロ(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMullerら、Nat. Biotechnol. 21:1040-1046頁(2003));脳内皮細胞への選択的形質導入のために操作又は選択されたもの、例えば、AAV-BRI(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるKorbelinら、EMBO Mol. Med. 8: 609～625頁(2016));又はIV投与後の成体CNSの増強された形質導入のために操作又は選択されたもの、例えば、AAV-PHP.B及びAAVPHP.eB(Devermanら、Nat. Biotechnol. 34: 204～209頁(2016)及びChanら、Nat. Neurosci. 20: 1172～1179頁(2017))である。
本実施形態によれば、MuSK抗体ベースの分子をコードする発現ベクター構築物は、重鎖ポリペプチド、その機能的断片、そのバリアント、又はそれらの組合せをコードするポリヌクレオチド配列を含む。代替的に、発現構築物は、軽鎖ポリペプチドをコードする核酸配列、その機能的断片、そのバリアント、又はそれらの組合せを含んでもよい。一実施形態では、発現ベクター構築物は、重鎖ポリペプチド、その機能的断片若しくはそのバリアントと、軽鎖ポリペプチド、その機能的断片若しくはそのバリアントとをコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、発現構築物は、MuSK抗体ベースの分子の発現を駆動するために好適なプロモーター配列を更に含む。好適なプロモーター配列としては、限定されないが、伸長因子-1αプロモーター(EF1a)プロモーター、ホスホグリセラートキナーゼ-1プロモーター(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター(CMV)、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβアクチンプロモーター(CAG)、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、シミアンウイルス40プロモーター(SV40)、及びCK6プロモーターが挙げられる。当該技術分野で公知の哺乳類細胞における遺伝子発現を駆動するために好適な他のプロモーターもまた、本明細書に開示される発現構築物への組込みに好適である。
一実施形態では、発現構築物は、リンカー配列を更にコードする。リンカー配列は、発現構築物の1つ又は複数の構成要素(コードされた抗体の重鎖及び軽鎖の構成要素)を空間的に分離及び/又は連結するアミノ酸配列をコードすることができる。
本発明の別の態様は、MuSK抗体をコードする1つ又は複数のベクターを含み、本明細書に記載の前記MuSK抗体を産生する宿主細胞である。本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子は、場合により、細胞株、混合細胞株、不死化細胞、又は不死化細胞のクローン集団によって、当該技術分野で周知のように作製することができる(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるAusubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.、NY, N.Y.(1987-2001); Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor, N.Y.(1989); Harlow and Lane、Antibodies, a Laboratory Manual、Cold Spring Harbor, N.Y.(1989); Colliganら編、Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons, Inc.、NY(1994-2001); Colliganら、Current Protocols in Protein Science、John Wiley & Sons、NY, N.Y.(1997-2001)参照)。
一部の実施形態では、発現のために選択される宿主細胞は、哺乳類起源のものであってもよい。好適な哺乳類宿主細胞としては、限定されないが、COS-1細胞、COS-7細胞、HEK293細胞、BHK21細胞、CHO細胞、BSC-1細胞、HeG2細胞、SP2/0細胞、HeLa細胞、哺乳類骨髄腫細胞、哺乳類リンパ腫細胞、又はこれらの任意の誘導体、不死化若しくは形質転換細胞が挙げられる。他の好適な宿主細胞としては、限定されないが、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が挙げられる。或いは、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化できない種又は生物、例えば、原核細胞又は原核生物、例えばBL21、BL21(DE3)、BL21-GOLD(DE3)、XLl-Blue、JM109、HMS174、HMS174(DE3)、並びに任意の天然又は操作された大腸菌種(E. coli spp)、クレブシエラ種(Klebsiella spp.)又はシュードモナス種(Pseudomonas spp)の株から選択されうる。
本明細書に記載されるMuSK抗体ベースの分子は、上記の単離ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞を使用して、任意の様々な技術によって調製することができる。一般に、抗体は、抗体の作製を可能にするための細胞培養技術、例えば従来の技術を介した、又は抗体遺伝子、重鎖及び/若しくは軽鎖を好適な細菌又は哺乳類細胞宿主へトランスフェクトすることを介したモノクローナル抗体の生成によって製造することができ、抗体は、組換え体であってもよい。一実施形態では、本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子は、モノクローナル抗体又はその機能的結合断片である。標準的な分子生物学的技術を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収する。宿主細胞へのトランスフェクションは、原核宿主細胞又は真核宿主細胞への外来DNAの導入のために一般的に使用される様々な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクション等を使用して実施することができる。本明細書に記載の抗体は、原核宿主細胞又は真核宿主細胞のいずれかで発現することが可能であるが、真核細胞(特に哺乳類細胞)では、適切に折り畳まれ、免疫学的に活性な抗体が構築及び分泌される可能性が原核細胞よりも高いため、そのような真核細胞、特に哺乳類細胞において抗体を発現することが好ましいことがある。
上述のように、本発明の組換え抗体を発現するための例示的な哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)が挙げられる(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるUrlaub and Chasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、77: 4216～4220頁(1980)に記載のdhfr-CHO細胞)。他の好適な哺乳類宿主細胞としては、限定されないが、NS0骨髄腫細胞、COS細胞、及びSP2細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入されるとき、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、又はより好適には、宿主細胞が増大する培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたって宿主細胞を培養することによって産生される。
宿主細胞を用いて、機能性抗体断片、例えばFab断片又はscFv分子等を作製することもできる。上記の手順の変形が本発明の範囲内であることを理解されたい。例えば、本明細書に記載の抗体の軽鎖及び/又は重鎖のいずれかの機能的断片をコードするDNAで宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましい場合がある。組換えDNA技術を用いて、目的の抗原に結合するために必要でない軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするDNAの一部又は全てを除去してもよい。そのような切断されたDNA分子から発現される分子も、本明細書に記載の抗体に包含される。
抗体及び抗体結合断片は、既知の方法、例えば、限定されないが、プロテインA精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィー等によって、組換え細胞培養物から回収及び精製される。高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)を精製に使用してもよい。
MuSK抗体ベースの分子を含む医薬組成物
本発明のMuSK抗体ベースの分子又はMuSK抗体ベースの分子をコードするポリヌクレオチドは、組成物として有利に投与される。一実施形態では、そのような組成物は、活性治療剤(つまり、MuSK抗体)と、1つ又は複数の様々な他の薬学的に許容される成分とを含む医薬組成物である。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるREMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(第21版)(2005)(Troy, D.B.ら(編)Lippincott Williams & Wilkins(Pubis.)、Baltimore MD)参照。好ましい形態は、意図される投与様式及び治療的適用に依存する。組成物はまた、所望の製剤に応じて、薬学的に許容される非毒性担体、賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、洗剤(例えば、Tween-20又はTween-80等の非イオン性洗剤)、安定剤(例えば、糖又はタンパク質を含まないアミノ酸)、保存剤、組織固定剤、可溶化剤、及び/又は医薬組成物に含めるのに好適な他の材料を含んでもよく、これらは、動物又はヒト投与のための医薬組成物を製剤化するために一般的に使用される媒体である。希釈剤は、組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤としては、蒸留水、生理学的リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液が挙げられる。加えて、医薬組成物又は製剤は、他の担体、又は非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤等を含んでもよい。本発明の医薬組成物に使用できる適切な水性及び非水性担体としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール類(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)、並びにこれらの好適な混合物、植物油、例えばオリーブ油、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油、及びゴマ油、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、トラガントガム、並びに注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチル、及び/又は種々の緩衝液が挙げられる。他の担体は、医薬分野で周知である。
薬学的に許容される担体としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。薬学的活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が企図される。
組成物はまた、ゆっくりと代謝される巨大なマクロ分子、例えばタンパク質、キトサン等の多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びコポリマー(例えば、ラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロース等)、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び脂質凝集体(例えば、油滴又はリポソーム)等を含んでもよい。担体と医薬組成物の他の成分との適合性は、本発明の活性抗体ベースの分子の所望の生物学的特性に対する著しく有害な影響がないこと(例えば、抗原結合に対して実質的な影響に至らないこと(例えば、10%以下の相対的阻害、5%以下の相対的阻害等))に基づいて、決定される。
本発明の医薬組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤、例えば、(1)アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の水溶性抗酸化剤、(2)アスコルビルパルミチン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロール等の油溶性抗酸化剤、及び(3)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート剤を含むことができる。
本発明の医薬組成物は、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール若しくはグリセロール、又は塩化ナトリウム等を組成物中に含んでもよい。
本発明の医薬組成物はまた、選択された投与経路に適切な1つ又は複数のアジュバント、例えば、医薬組成物の保存期間又は有効性を向上させうる保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、防腐剤又は緩衝剤等を含有してもよい。本発明の抗体は、急速な放出に対して抗体を保護する担体と共に調製されてもよく、例えば、制御放出製剤、例えば、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系等が挙げられる。そのような担体としては、ゼラチン、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、又は単独で若しくはワックスとの併用での生分解性若しくは生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸、又は当該技術分野で周知の他の材料が挙げられうる。そのような製剤を調製するための方法は、一般的に当業者に知られている。例えば、SUSTAINED AND CONTROLLED RELEASE DRUG DELIVERY SYSTEMS、J. R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc.、New York、1978参照。
一態様において、本発明の抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするために製剤化されてもよい。非経口投与のための薬学的に許容される担体としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射可能な溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。
注射用の医薬組成物は、典型的に、製造及び保管の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は薬物高濃度を達成するために適した他の秩序だった構造として製剤化されてもよい。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール類(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)及びこれらの好適な混合物を含有する水性又は非水性の溶媒又は分散媒、オリーブ油等の植物油、並びにオレイン酸エチル等の注射用有機エステルでありうる。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングを用いることによって、分散剤の場合には所要の粒径を保つことによって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール類、例えばグリセロール、マンニトール若しくはソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の吸収時間の延長は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアレート塩及びゼラチンをその組成物に含めることによってもたらされうる。滅菌注射可能な溶液は、活性化合物を、適量で、必要に応じて、例えば上で列挙した成分の1つ又は組合せと共に適当な溶媒中に組み込み、続いて滅菌マイクロ濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法としては、先に滅菌濾過したその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分との粉末が得られる真空乾燥及びフリーズドライ(凍結乾燥)が挙げられる。
非経口投与の場合、本発明の薬剤は、典型的には、生理学的に許容される希釈剤中の該物質と、滅菌液体でありうる薬学的担体、例えば水、油、生理食塩水、グリセロール、又はエタノール等との、注射用量の溶液又は懸濁液として製剤化される。更に、湿潤剤又は乳化剤、界面活性剤、pH緩衝物質等の補助物質が、組成物中に存在してもよい。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物、又は合成起源のものである。ピーナッツ油、ダイズ油、及び鉱油は、全て有用な材料の例である。一般に、グリコール、例えばプロピレングリコール又はポリエチレングリコールが、液体担体、特に注射用溶液のために好ましい。本発明の薬剤は、活性成分の持続的な放出を可能にするような方法で製剤化することができるデポー注射剤又はインプラント調製物の形態で投与されてもよい。例示的な組成物は、約5mg/mLのscFvを、HClでpH6.0に調整した50mM L-ヒスチジン及び150mM NaCl含有水性緩衝液中に製剤化して含む。
典型的には、組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして注射剤として調製される。注射前に液体ビヒクル中で溶液又は懸濁液とするのに好適な固体形態が調製されてもよい。調製物はまた、アジュバント効果の増強のために、リポソーム又はマイクロ粒子、例えばポリラクチド、ポリグリコリド、又はコポリマーで乳化又はカプセル化されてもよい(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLangerら、Science 249:1527頁(1990); Hanesら、Advanced Drug Delivery Reviews 28:97～119頁(1997))。他の投与様式に適した更なる製剤としては、経口製剤、鼻腔内製剤、肺製剤、坐剤、及び経皮適用が挙げられる。
MuSK抗体ベースの分子を含む医薬組成物の投与
本発明のMuSK抗体ベースの分子は、治療的処置のための非経口、局所、経口又は鼻腔内手段によって投与することができる。筋肉内注射(例えば、腕又は脚の筋肉内への注射)及び静脈内注射は、本発明の分子の投与の好ましい方法である。いくつかの方法において、そのような分子は、徐放性組成物又はデバイス、例えば、Medipad(商標)デバイス(Elan Pharm. Technologies社、Dublin, Ireland)として投与される。いくつかの方法では、本明細書に開示される抗体は、例えば、頭蓋内注射のように、特定の組織に直接注射される。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、非経口的に投与される。本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与」という語句は、経腸及び局所投与以外の、通常は注射による投与様式を示し、表皮、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、頭蓋内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、髄腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢内、くも膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外及び胸骨内の注射、皮下及び注入を含む。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内又は皮下の注射又は注入によって投与される。
治療用途(つまり、神経筋障害、例えば、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、重症筋無力症、又は先天性筋無力症と診断された患者に関連する用途)において、本発明のMuSK抗体ベースの分子は、疾患の発症におけるその合併症及び中間的な病理学的表現型を含む疾患の症状(生化学的、組織学的、及び/又は行動評価によって提示されるもの)を治癒、治療、又は少なくとも部分的に停止するために十分な量で、そのような患者に投与される。一部の実施形態では、本発明の治療用分子の投与は、神経筋障害を低減又は消失させる。
上述の症状の処置のための本発明で提供される治療分子の有効用量は、多くの様々な因子、例えば、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、及び投与される他の薬剤に応じて変化しうる。処置投薬量は、典型的には、それらの安全性及び有効性を最適化するために滴定される。投薬量が与えられる任意の所与の日に、本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子の投薬量は、患者の体重の約0.0001～約100mg/kg、より通常は約0.01～約20mg/kgの範囲でありうる。例えば、投薬量は、1mg/kg体重又は10mg/kg体重でありうるか、又は1～10mg/kg体重の範囲内でありうる。したがって、例示的な投薬量としては、約0.1～約10mg/kg体重、約0.1～約5mg/kg体重、約0.1～約2mg/kg体重、約0.1～約1mg/kg体重、例えば約0.15mg/kg体重、約0.2mg/kg体重、約0.5mg/kg体重、約1mg/kg体重、約1.5mg/kg体重、約2mg/kg体重、約5mg/kg体重、又は約10mg/kg体重が挙げられる。
当業者である医師又は獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方しうる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成し、所望の効果が達成されるまで徐々に投薬量を増加させるために、医薬組成物中の抗体ベースの分子の用量を、必要よりも低いレベルで開始することができる。一般に、本発明の組成物の好適な1日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量である化合物の量である。このような有効用量は、一般に、上述の因子に依存する。投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下であってよく、例えば、標的の部位の近位に投与されてもよい。所望される場合、医薬組成物の有効な1日用量は、1日を通して適切な間隔で別々に投与される2回、3回、4回、5回、6回又はより多くの回数の部分用量として、任意に単位剤形で投与されてもよい。本発明の抗体ベースの分子は単独で投与することが可能であるが、上記のように、抗体ベースの分子を医薬組成物として投与することが好ましい。
治療目的のために、本発明のMuSK抗体ベースの分子は、通常、複数回投与される。単回投与(例えば、ボーラス又は注射)間の間隔は、毎週、毎月、又は毎年でありうる。いくつかの方法において、投薬量は、1～1000μg/mLの血漿濃度を達成するように、及びいくつかの方法において、25～300μg/mLを達成するように調整される。或いは、本発明の治療用分子は、徐放性製剤として投与することができ、その場合、必要な投与頻度は少なくなる。投与量及び頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変動する。一般的に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体が続く。scFv分子は血清半減期が一般的に短い。
別の実施形態では、MuSKのシグナル伝達及び/又はリン酸化の減少によって媒介される症状の治療のための抗体ベースの分子のインビボでの発現及び形成を促進するために、本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子をコードする組換え核酸配列を含む医薬組成物が、対象に投与される。本発明のこの実施形態での使用に好適な発現ベクター構築物は、上記に記載されている。
ポリヌクレオチド組成物は、対象への組成物の投与の少なくとも約1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、20時間、25時間、30時間、35時間、40時間、45時間、50時間、又は60時間以内に、対象においてMuSK抗体ベースの分子の生成をもたらすことができる。組成物は、対象に組成物を投与してから少なくとも約1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、又は10日間以内に、対象において抗体ベースの分子の生成をもたらすことができる。組成物は、対象への組成物の投与の約1時間～約6日間、約1時間～約5日間、約1時間～約4日間、約1時間～約3日間、約1時間～約2日間、約1時間～約1日間、約1時間～約72時間、約1時間～約60時間、約1時間～約48時間、約1時間～約36時間、約1時間～約24時間、約1時間～約12時間、又は約1時間～約6時間以内に対象において抗体ベースの分子の生成をもたらすことができる。
組成物は、それを必要とする対象に投与されるとき、対象において抗体ベースの分子の持続的な生成をもたらすことができる。組成物は、対象において、少なくとも約1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、26日間、27日間、28日間、29日間、30日間、31日間、32日間、33日間、34日間、35日間、36日間、37日間、38日間、39日間、40日間、41日間、42日間、43日間、44日間、45日間、46日間、47日間、48日間、49日間、50日間、51日間、52日間、53日間、54日間、55日間、56日間、57日間、58日間、59日間、又は60日間、対象において抗体ベースの分子の生成をもたらすことができる。
MuSK結合抗体ベースの分子の治療的有用性
本発明の一態様は、筋特異的チロシン-タンパク質キナーゼ(MuSK)シグナル伝達の増加を必要とする対象におけるMuSKシグナル伝達を増加させる方法に関する。この方法は、対象に、本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子、又は本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子若しくは本明細書に記載のMuSK抗体ベースの分子をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与する工程を含む。この方法に従って、組成物は、投与前の対象におけるMuSKシグナル伝達と比較して対象におけるMuSKシグナル伝達を増加させるために有効な量で投与される。そのような投与は、神経筋障害、例えば、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、重症筋無力症(MG)、先天性筋無力症、MuSK-MG、脊髄筋萎縮症(SMA)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)、シャルコー・マリー・トゥース病(CMT)、遠位遺伝性運動ニューロパシー(dHMN)、デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)、肢帯筋ジストロフィー(LGMD)、先天性筋ジストロフィー(CMD)、サルコペニア(SP)、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィーを有する対象に提供されてもよい。一実施形態では、治療される対象は、先天性筋無力症を有する対象である。一実施形態では、治療される対象は、Dok7媒介性先天性筋無力症を有する対象である。本発明のこの態様に従って、そのような投与は、神経筋症状を治療する。
一実施形態では、それを必要とする対象に投与されるMuSK抗体ベースの分子は、配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-H1、配列番号172のCDR-H2、及び配列番号195のCDR-H3を含む軽鎖可変領域を含む、MuSK抗体ベースの分子(3B2g2m1)である。
一実施形態では、それを必要とする対象に投与されるMuSK抗体ベースの分子は、配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-H1、配列番号172のCDR-H2、及び配列番号183のCDR-H3を含む軽鎖可変領域を含む、MuSK抗体ベースの分子(3B2g1m1)である。
一実施形態では、それを必要とする対象に投与されるMuSK抗体ベースの分子は、配列番号147のCDR-H1、配列番号154のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-H1、配列番号172のCDR-H2、及び配列番号183のCDR-H3を含む軽鎖可変領域を含む、MuSK抗体ベースの分子(3B2g1m2)である。
一実施形態では、それを必要とする対象に投与されるMuSK抗体ベースの分子は、配列番号147のCDR-H1、配列番号154のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-H1、配列番号172のCDR-H2、及び配列番号195のCDR-H3を含む軽鎖可変領域を含む、MuSK抗体ベースの分子(3B2g2m2)である。
一実施形態では、それを必要とする対象に投与されるMuSK抗体ベースの分子は、配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-H1、配列番号172のCDR-H2、及び配列番号183のCDR-H3を含む軽鎖可変領域を含む、MuSK抗体ベースの分子(3B2)である。
本明細書で使用されるとき、「治療」又は「治療すること」という用語は、疾患若しくは障害の進行若しくは重症度を改善、遅延若しくは好転させること、又はそのような疾患若しくは障害の1つ若しくは複数の症状若しくは副作用を改善、遅延若しくは好転させることを意味する。本発明の目的のために、「治療」又は「治療すること」は、有益な又は所望の臨床結果を得るためのアプローチを更に意味する。「有益な又は所望の臨床結果」には、限定されないが、部分的又は全般的であり、検出可能又は検出不可である症状の緩和、障害又は疾患の程度の減少、疾患又は障害状態の安定化(つまり、悪化させない)、疾患又は障害状態の遅延又は進行の減速、疾患又は障害状態の改善又は緩和、及び疾患又は障害の寛解が含まれる。
抗体ベースの分子の「有効量」とは、限定されないが、臨床結果を含む意図された生物学的効果又は所望の治療結果を達成するために、必要な用量及び期間で十分な量を指す。本発明の抗体ベースの分子に適用されるとき、「治療有効量」という語句は、障害又は疾患状態の進行、又は障害又は疾患の症状を改善、緩和、安定化、好転、徐行又は遅延させるために十分な抗体の量を示すことが意図される。一実施形態では、本発明の方法は、抗体ベースの分子と、他の化合物とを組み合わせた投与を提供する。そのような場合、「有効量」は、意図される生物学的効果を引き起こすために十分な組合せの量である。
本発明の別の態様は、対象における先天性筋無力症を治療する方法に関する。本方法は、先天性筋無力症を有する対象に、筋特異的チロシン-タンパク質キナーゼ(MuSK)アゴニストを、MuSKリン酸化を増強させるために有効な量で投与し、それによって対象における先天性筋無力症を治療する工程を含む。
一部の実施形態では、MuSKアゴニストは、本明細書に記載されるMuSKアゴニスト抗体である。MuSKアゴニスト抗体は、MuSKに結合し、MuSKシグナル伝達又はリン酸化を増強するものである。一実施形態では、MuSKアゴニスト抗体は、ヒトMuSKのFrizzled様ドメインに結合する。一実施形態では、MuSKアゴニスト抗体は、配列番号130のアミノ酸配列(Fz様ドメイン)を有するエピトープに結合する。好適なMuSKアゴニスト抗体としては、本明細書に開示されるものが挙げられる。一部の実施形態では、先天性筋無力症は、DOK7媒介性先天性筋無力症である。
本発明の詳細な説明は、以下の実施例によって更に例証されるが、それらの実施例は、いかなる方法でも限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例1及び実施例5～12の材料及び方法
マウス
Dok7 CMマウス(本明細書においてDok7 1124 1127 dupマウスとも称する)を作製するために、インビトロ転写sgRNA(5'-CTGCTCAGTCTGCCCCC-3'(配列番号264))(5ng/μl)及びインビトロ転写Cas9 RNA(10ng/μl)を、TGCC重複を含有するDNA修復テンプレート(5'-ATGCCGGCAATCTG GACGTCTGGCGGGCCGGTGAGGAATTCGGTTCTCTGCTCAGTCTGCCTGCCCCCTGG AGCCAGCGCACCTGAGCCCAGACTGTGTGCCTGCCCACCTGGGGCGGCCGAGTA-3'(配列番号265)(10ng/μl)と共に、C57BL/6接合子の前核に微注入した(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるPriceら、「Specific Disruption of Abca1 Targeting Largely Mimics the Effects of miR-33 Knockout on Macrophage Cholesterol Efflux and Atherosclerotic Plaque Development」、Circ. Res. 124:874～880頁(2019))。注射した接合子から生まれた14匹のマウスを、テイルDNA(プライマー:5'-GCAGTTACAG GAGGTTGG-3'(配列番号266))を配列決定することによって分析した。1匹のマウスが、所望のTGCC重複を有するDok7対立遺伝子を保有していた。ファウンダーマウスを野生型C57BL/6マウスと交配させ、Dok7 CM系統を生成した。DNA配列決定により、Dok7変異の配列が確認された。続いて、プライマーを使用してマウスを遺伝子型決定した(フォワード:5'-GCGGCCTCGGCAGTTACAG-3'(配列番号267);リバース: 5'-GCTTTACCTTG AGTCCGCCACAGA-3'(配列番号268))。オフターゲット認識の確率が最も高い5つのゲノム遺伝子座を分析した。これらの遺伝子における変異に関する証拠は見出されなかった(図16A～16B)。
Dok7 2YFマウスを生成するために、C57BL/6接合子の細胞質に、sgRNA(5'-TTCGAGGTGTGTCATAG-3'(配列番号269))(15ng/μl)を注射し、Cas9 RNA(30ng/μl)を、チロシン396及びチロシン406をフェニルアラニンに変換するためのDNA修復テンプレート(5'-ATGCCGGCAGCAACCTGGACGTGTGGCGGGCCGG TGAGGAATTCGGTTCTCTGCTCAGTCTGCCTGCCCCCTGGAGCCAGCGCACCTGAGC CCAGACTGTGTGCCTGCCCACCTGGGGCGGCCGAGTA-3'((配列番号270)(30ng/μl)と共に、インビトロ転写した。注射した接合子から生まれた33匹のマウスを、テイルDNA(プライマー:5'-TGGCATTGCC ACAGGCAG-3'(配列番号271))を配列決定することによって分析した。1匹のマウスが、所望のチロシンからフェニルアラニンへの置換を有するDok7対立遺伝子を保有していた。ファウンダーマウスを野生型C57BL/6マウスと交配させ、Dok7 2YF系統を生成した。これらの系統からのDNA配列決定により、Dok7変異の配列を確認した。マウスを収容し、施設内動物使用管理委員会(IACUC)のガイドラインに従って維持した。
培養骨格筋細胞の増大
C2C12マウス筋細胞(ATCCカタログ番号CRL-1772)を、37℃で、増殖培地(GM)、つまり、10%の胎児ウシ血清(FBS; GemCell(商標))を補足した、4.5g/Lグルコース、L-グルタミン及びピルビン酸ナトリウム(Coming cellgro)含有ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で増大させた。筋芽細胞が70%コンフルエントになったときに、分化培地(DM)、つまり2%熱不活化ウマ血清を補足した4.5g/Lグルコース及び1mM L-グルタミン含有DMEMに交換することにより、筋芽細胞融合及び筋管分化を誘導した。不死化筋芽細胞を、野生型胚及びDok7 2YF胚から単離し、前述のように増大させた(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるSmithら、「Src, Fyn, and Yes are not Required for Neuromuscular Synapse Formation but are Necessary for Stabilization of Agrin-Induced Clusters of Acetylcholine Receptors」、J. Neurosci. 21:3151～3160頁(2001))。
C2筋管のアグリン及び抗体処置
C2C12筋管が形成された3日後、培養物を、2.5nMのストレプトアビジン、10nMのIgG、又は0.5nMの組換え神経アグリン-B8(R&D Systems社)との組合せで、10nMのビオチン化Fabで30分間処理した。筋管を、4℃で、溶解緩衝液(50mM塩化ナトリウム、30mMトリエタノールアミン、pH7.5、50mMフッ化ナトリウム、5mM EDTA、5mM EGTA、2mMオルトバナジン酸ナトリウム、1mM N-エチルマレイミド、1mMテトラチオン酸ナトリウム、10μMペプスタチン、及び完全プロテアーゼ阻害剤ミックス)(Roche社)中で均質化した。NP-40を終濃度1%まで添加し、抽出物を4℃で30分間、揺らしながらインキュベートした。不溶性タンパク質を12,000rpmにて4℃で20分間遠心分離することによって除去した。上清を、プロテインG-アガロースビーズ(Sigma-Aldrich社)で、4℃で1時間予め清澄化した後、MuSK(MuSK 1A)に対する抗体と4℃で一晩インキュベートした(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるTakata, K.ら、「Characterization of Pathogenic Monoclonal Autoantibodies Derived from Muscle-Specific Kinase Myasthenia Gravis Patients」、JCI Insight 4(12):el27167頁(2019)及びFichtnerら、「Affinity Maturation is Required for Pathogenic Monovalent IgG4 Autoantibody Development in Myasthenia Gravis」、J. Exp. Med.217(12):e20200513頁(2020))。複合体を、プロテインG-アガロースビーズと4時間インキュベートした。続いて、ビーズを、1% NP-40を含む溶解緩衝液中で洗浄した(9分間3回)。タンパク質を、溶解緩衝液中1% SDSでビーズから溶出した。
MuSK及びDok7の筋肉組織からの単離
全脚筋肉又は培養筋肉細胞を、溶解緩衝液(50mM塩化ナトリウム、30mMトリエタノールアミンpH7.5、50mMフッ化ナトリウム、5mM EDTA、5mM EGTA、2mMオルトバナジン酸ナトリウム、1mM N-エチルマレイミド、1mMテトラチオン酸ナトリウム、10μMペプスタチン、及び完全プロテアーゼ阻害剤ミックス(Roche社)中で、4℃で均質化した。NP-40を終濃度1%まで添加し、抽出物を4℃で30分間、揺らしながらインキュベートした。不溶性タンパク質を12,000rpmにて4℃で20分間遠心分離することによって除去した。上清を、プロテインG-アガロースビーズ(Sigma-Aldrich社)を用いて4℃で1時間予め清澄化した後、MuSK(MuSK 1A)に対する抗体(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるTakata, K.ら、「Characterization of Pathogenic Monoclonal Autoantibodies Derived from Muscle-Specific Kinase Myasthenia Gravis Patients」、JCI Insight 4(12):el27167頁(2019)及びFichtnerら、「Affinity Maturation is Required for Pathogenic Monovalent IgG4 Autoantibody Development in Myasthenia Gravis」、J. Exp. Med.217(12):e20200513頁(2020)又はヤギ抗Dok7(R&D Systems社、AF 6398)と4℃で一晩インキュベートし、続いてプロテインG-アガロースビーズと4時間インキュベートした。続いて、ビーズを、1% NP-40を含む溶解緩衝液中で洗浄した(9分間3回)。タンパク質を、溶解緩衝液中1%SDSでビーズから溶出した。
ウエスタンブロッティング
タンパク質をSDS-PAGEによって分画し、PVDF膜に転写した。ブロットを、MuSK(R&D Systems社、AF 562)、ホスホチロシン(Millipore社、05-321)、又はDok7(#1916)に対する抗体で、以前に記載されているようにプローブした(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるHerbst & Burden、「The Juxtamembrane Region of MuSK has a Critical Role in Agrin-Mediated Signaling」、EMBO J. 19:67～77頁(2000); Bergaminら、「The Cytoplasmic Adaptor Protein Dok7 Activates the Receptor Tyrosine Kinase MuSK via Dimerization」、Mol. Cell 39: 100～109頁(2010); Hallockら、「Dok-7 Regulates Neuromuscular Synapse Formation by Recruiting Crk and Crk-L」、Genes Dev. 24:2451～2461頁(2010); Remedioら、「Diverging Roles for Lrp4 and Wnt Signaling in Neuromuscular Synapse Development During Evolution」、Genes Dev. 30: 1058～1069頁(2016);及びJaworski & Burden、「Neuromuscular Synapse Formation in Mice Lacking Motor Neuron- and Skeletal Muscle-Derived Neuregulin-1」、J. Neurosci. 26:655～661頁(2006))。Crkに対する抗体(BD Bioscience社、610035)及びCrk-Lに対する抗体(Santa Cruz Biotechnology社、sc-365092)は、以前に記載されている(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるHallockら、「Dok-7 Regulates Neuromuscular Synapse Formation by Recruiting Crk and Crk-L」、Genes Dev. 24:2451～2461頁(2010))。バンド強度を、ChemiDocイメージングシステムで(BioRad社)、以前に記載されているように定量化した(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるRemedioら、「Diverging Roles for Lrp4 and Wnt Signaling in Neuromuscular Synapse Development During Evolution」、Genes Dev. 30:1058～1069頁(2016))。グラフは、少なくとも3つの別々の実験からの平均値を示す。Wilcoxon-Mann-Whitney検定を、統計的有意性を決定するために使用し、GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを用いて実施した。
ホールマウント筋肉免疫組織化学
横隔膜筋を、酸素化L-15培地中のE18.5胚及び生後マウスから解離した。筋肉を、Sylgardコーティングされた解離皿にピン留めし、1% PFA中で1.5時間固定し、3% BSAを含むPBS(Sigma社、IgGフリー)及び0.5% Triton X-100(PBT)で1時間ブロッキングした。横隔膜筋を、Alexa488コンジュゲートα-BGT(Invitrogen社)で染色してAChRを標識し、ニューロフィラメント-L(Synaptic Systems社、171002)、b-TUBIII(Synaptic Systems社、302302)又はシナプシン1/2(Synaptic Systems社、106002)に対する抗体で染色して運動軸索及び神経終末を標識した(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるKim & Burden、「MuSK Controls where Motor Axons Grow and Form Synapses」、Nat. Neurosci. 11:19～27頁(2008))。抗体を、ピペットで筋肉に強制的に移し、筋肉を、加湿室内のオービタルシェーカーを用いて4℃で一晩インキュベートした。横隔膜筋を、5時間にわたって10回、PTで室温にて洗浄し、PBSですすいだ後、筋肉を50%グリセロール中にホールマウントした。各遺伝子型の少なくとも3匹のマウスからの筋肉を各実験のために解析した。画像を、Zeiss LSM 800共焦点顕微鏡で取得した。飽和を避けるために、検出器のゲイン及びレーザーの強度を調整した。シナプスの数及びサイズ、シナプスAChRの密度、終板ゾーンの幅、除神経の程度及び共局在指標(シナプシン/AChR)を、FIJI/ImageJソフトウェアを使用して、以前に記載されているように定量化した(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるJaworski & Burden、「Neuromuscular Synapse Formation in Mice Lacking Motor Neuron- and Skeletal Muscle-Derived Neuregulin-1」、J. Neurosci. 26:655～661頁(2006))。Wilcoxon-Mann-Whitney検定を、統計的有意性を決定するために使用し、GraphPad Prism 9.0ソフトウェアを用いて実施した。
単一筋線維の単離及び染色
脛骨前筋を酸素化L-15培地中で解体し、Sylgardでコーティングされた皿にピン留めし、2% PFA(PBS中)で2時間固定した。PBS中で数回すすいだ後、1～3本の筋線維を、鋭利な鉗子を用いて手動で裂いた(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるRalstonら、「The Organization of the Golgi Complex and Microtubules in Skeletal Muscle is Fiber Type-Dependent」、J. Neurosci. 19:10694～10705頁(1999))。固定した筋線維を、5%BSA、1%正常ヤギ血清、及び0.04%サポニンを含有するPBSにおいて、室温で2時間ブロックした。次いで、線維を一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートし、0.04%サポニンを含有するPBSで5分間3回洗浄し、二次抗体と共に室温で2時間インキュベートし、再度洗浄し、VectaShild(Vector Laboratories社)にマウントした。Crk-Lに対する抗体(Santa Cruz Biotechnology社、sc-365092)を使用し、シナプス後膜をAlexaFluor488-α-BGT(Invitrogen社)で染色することによって可視化した。
凍結切除免疫組織化学
四肢筋肉をOCT培地に埋め込み、ドライアイスのプラットフォームで凍結した。ポリ-L-リジンコーティングガラススライド上へ収集した10μm切片を、1～4%PFA中で10分間固定し、3%BSAを含有するPBS(PB)で5分間3回洗浄し、PB+0.5% X-Triton(PBT)で10分間透過処理し、PB中で洗浄し、PBT中のCrk-Lに対する一次抗体(Santa Cruz Biotechnology社、sc-365092)と4℃で一晩、加湿チャンバ内でインキュベートした。切片をPB中で5分間3回洗浄した後、PBS中で希釈した二次抗体及びAlexaFluor488-α-BGT(Invitrogen社)と4℃で一晩、加湿チャンバ内でインキュベートした。切片を、PB中、次いでPBS中で5分間3回洗浄した後、VECTASHIELD褪色防止マウント媒体にマウントした。
挙動
握力を、前肢及び全肢の両方の握力を測定する握力装置(Bioseb社)を用いて測定した。前肢の握力を測定するために、マウスを金属グリッドの中心に位置させ、尾の付け根で軽く保持し、前足のみがグリッドを把持できるようにした。前肢の把持がグリッドから外れるまでマウスを徐々に後方に引いた。握力計は、把持が外れると、適用される最大力(グラム単位)をデジタルで表示した。全肢測定のために、マウスに前肢と後肢の両方でグリッドを把持させ、マウスを、グリッドを把持しなくなるまで徐々に後方に引いた。前肢及び全肢の測定のいずれも、6回連続試行の平均を、前肢又は全肢の握力の指標として用いた。マウスに、各試行の間に10～15秒間、前肢と全肢の試験の間に1～3時間の間隔を与えた。体重を、全ての握力測定の後に決定し、潜在的な共変性を分析した。握力の評価の頑強性と信頼性を高めるため、全ての測定は同じ実験者が行った(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMandilloら、「Reliability, Robustness, and Reproducibility in Mouse Behavioral Phenotyping: A Cross-Laboratory Study」、Physiol. Genomics 34:243～255頁(2008)及びOuryら、「MACF1 Links Rapsyn to Microtubule- and Actin-Binding Proteins to Maintain Neuromuscular Synapses」、J. Cell Biol. 218:1686～1705頁(2019))。
P60の雄及び雌のマウスの運動機能を、ロータロッド(AccuRotor four-channel、Omnitech Electronics, Inc.社)で評価した。マウスを、2.5rpmで回転するロータロッド(3.0cm回転シリンダ)に載せ、5分間にわたって回転速度を40rpmに直線的に増加させた。ロッドから落下するまでの時間を測定した。各マウスに、5分間隔で3回の試験を行い、3回の試験から、落下するまでの最長潜時を記録した。Wilcoxon-Mann-Whitney検定を、統計的有意性を決定するために使用し、GraphPad Prism 9.0ソフトウェアを用いて実施した。
ヒト合成抗体の開発
Fzドメイン及びC末端隣接配列(マウスMuSKのD307～T494及びヒトMuSKのK314～T495)を含む全長細胞外領域(マウスMuSKのE22～T494及びヒトMuSKのE22～T495)を、EXPI293細胞におけるマウスIgkVIIIの分泌シグナル配列を用いて、Aviタグ及びHis6タグを有するC末端融合体として発現させた。発現は、ExpiFectamine 293 Transfection kit(Thermo Fisher Scientific社)を使用し、ベンダーが提供する標準的な手順を用いて行った。タンパク質を、HiTrapニッケルカラム(GE Healthcare社)を使用して、濾過した培養上清から精製し、0.5mMのビオチンと10mMのATPの存在下でBirA酵素を使用してインビトロでビオチン化した。ビオチン化タンパク質を、Superdex S75 10/300カラム(GE Healthcare社)を使用して更に精製した。
抗体ファージディスプレイライブラリの選別は、以前に記載されているように行った(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMillerら、「T Cell Receptor-Like Recognition of Tumor in vivo by Synthetic Antibody Fragment」、PLoS One 7:e43746頁(2012))。簡潔に述べると、ファージディスプレイライブラリを、最初に、第1のラウンドで100nMの4つ全ての抗原で選別し、続いて、第2、第3、及び第4のラウンドで、それぞれ100、50、及び20nMの単一抗原を用いて選別した。ヒト及びマウスのFzドメインの両方に結合するクローンを濃縮するために、複数の選別戦略を用い、代替抗原を連続して使用した(例えば、ヒトFz-マウスECD-ヒトECD)。個々のクローンを、4つの抗原45を用いるファージELISAを用いてスクリーニングし、全ての抗原に対する結合を示すクローンのDNA配列を決定した。
選択されたクローンの重鎖のC末端にAviタグを有するFabタンパク質を、以前に記載されているように、大腸菌から産生し、ビオチン化した(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMillerら、「T Cell Receptor-Like Recognition of Tumor in vivo by Synthetic Antibody Fragment」、PLoS One 7:e43746頁(2012))。クローンX17のマウスIgG2a-LALAPG試料を、Fc領域のLALAPG変異(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLoら、「Effector-Attenuating Substitutions That Maintain Antibody Stability and Reduce Toxicity in Mice」、J. Biol. Chem. 292:3900～3908頁(2017))及びヒトCH1ドメインを含有するpFUSE-mIgG2a-Fcベクター(InvivoGen社)の修飾体、並びにpFUSE-CLIgベクター(InvivoGen社)を使用して作製した。このキメラ抗体は、ヒトFab配列及びマウスFc配列から構成された。加えて、マウスFc配列を、LALA変異を含有するヒトIgG1由来のものと交換して、hIgG1-X17抗体、hIgG1-X2抗体、及びhIgG1-X3抗体を作製した。
親和性測定
Fab及びIgGの形態の抗体クローンの親和性を、ビーズ結合アッセイを使用して測定した(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるNishikoriら、「Broad Ranges of Affinity and Specificity of Anti-Histone Antibodies Revealed by a Quantitative Peptide Immunoprecipitation Assay」、J. Mol. Biol. 424:391～399頁(2012);Nadyら、「ETO Family Protein Mtgrl Mediates Prdml4 Functions in Stem Cell Maintenance and Primordial Germ Cell Formation」、Elife 4:el0150頁(2015);及びHattoriら、「Multiplex Bead Binding Assays Using Off-the-Shelf Components and Common Flow Cytometers」、J. Immunol. Methods 490:112952頁(2020))。ビオチン化ヒト抗原タンパク質を、Dynabeads M280ストレプトアビジンビーズ(Thermo Fisher Scientific社)に、100μlのPBSB(0.5%ウシ血清アルブミン(BSA社、GeminiBio)を含有するPBS)中の10倍希釈ビーズと、100μlの50nM Fzタンパク質とを迅速に混合することによって固定化した。次いで、ビーズを2μMのビオチンでブロッキングし、PBSBで2回洗浄し、1mlのPBSB中に再懸濁した。この反応は、必要に応じて、測定回数に対して適切に規模を調整した。96ウェルポリプロピレンプレート(Greiner Bio-One社、カタログ番号650261)のウェル中に、5マイクロリットルの希釈ビーズと20μlの抗体試料を混合し、室温で30分間、穏やかに振盪させながらインキュベートした。試料を96ウェルフィルタープレート(Millipore社 MultiScreen HTS HV、0.45mm、Thermo Fisher社)のウェルに移した。液体を、真空マニホールドを使用して除去し、ウェルを、真空マニホールドを使用して200μlの氷冷PBSBで3回洗浄した。ビーズを、AlexaFluor 647(Jackson Immuno Research社、AlexaFluor(登録商標)647 AffmiPure Goat Anti-Human IgG, F(ab')2断片特異的、109-605-097)で標識した抗ヒトFab抗体で染色した。洗浄後、ビーズを70μlのPBSB中に懸濁し、iQueスクリーナー(Sartorius社)又はIntellicyt HTFCシステムを使用して分析した。得られた滴定曲線を、GraphPad Prizmソフトウェアを使用して、1:1結合モデルの非線形最小二乗適合によって分析した。
血中半減期測定
マウス血液試料を遠心分離し、上清をPBSB中で2000倍希釈した。抗体レベルを、結合反応を4℃で行ったことを除いて、上記のビーズアッセイを使用して定量した。半減期は、単一の指数曲線で、蛍光強度の中央値の非線形最小二乗を当てはめることによって決定した。
ホスホペプチドプルダウンアッセイ
293T細胞に、HAタグ付きDok-7及びHAタグ付きCrklをコードするプラスミドを37℃で48時間トランスフェクトした(Lipofectamine 3000、Thermofisher Scientific社)。48時間後、トランスフェクトした細胞を、溶解緩衝液中4℃で均質化し、NP-40を終濃度1%まで添加し、抽出物を、揺らしながら4℃で30分間インキュベートした。不溶性タンパク質を、12,000rpmにて4℃で20分間遠心分離することにより除去した。上清を、ストレプトアビジン-アガロースビーズ(Sigma-Aldrich社)を用いて、4℃で1時間予め清澄化した。
4つのビオチン化ホスホペプチド、(1)ELLLDRLHPNPMYQRMPLLLN(配列番号272)、(2)ELLLDRLHPNPMp(Y)QRMPLLLN(配列番号273)、(3)ELLLDRLHPAPMp(Y)QRMPLLLN(配列番号274)、及び(4)ELLLDRLHPNPMp(Y)AAAPLLLN(配列番号275)(Thermofisher Scientific社)をストレプトアビジンアガロースビーズに固定し、1% NP-40を含有する溶解緩衝液(50mM塩化ナトリウム、30mMトリエタノールアミン、pH7.5、50mMフッ化ナトリウム、5mM EDTA、5mM EGTA、2mMオルトバン酸ナトリウム、1mM N-メチルイミド、1mMテトラチオン酸ナトリウム、及び10μMペプスタチン、及び完全プロテアーゼ阻害剤ミックス)(Roche社)中4℃で一晩インキュベートした。ストレプトアビジン-アガロースビーズで予め清澄化した細胞抽出物を、ストレプトアビジン-アガロースビーズに固定化したビオチン化ホスホペプチドと共に4℃で一晩インキュベートした。続いて、ビーズを、1% NP-40を含む溶解緩衝液中で洗浄した(9分間3回)。タンパク質を溶解緩衝液中1% SDSでビーズから溶出した。HAタグに対する抗体(Abcam社、ab49969)を使用してウエスタンブロッティングを行った。
RT-qPCR
トータルRNAを、E18.5の野生型胚及びDok-7CM胚の筋肉からTRIZOL試薬(Invitrogen社)を使用して単離し、Superscript-Ill First strandキット(Invitrogen社)で逆転写した。リアルタイム定量PCRを、LightCycler 480(Roche社)で、SYBR Green Masterキット(Roche社)を使用して行った。PCRは、Hprtについては、5'-CTGGTGAA AAGGACCTCTCGAAG-3'(配列番号276)及び5'-CCAGTTTCACTAATGACACAAACG-3'(配列番号277)のプライマー対、Dok7については、5'-TCAGCCTCAGAAGAGCGTGTTG-3'(配列番号278)及び5'-GCCTCAGAAGAGGAACTGGATAG-3'(配列番号279)のプライマー対を使用して行った。試料を3回に分けて実行し、Dok7発現レベルをHprt発現に対して正規化した。
(実施例1)
Dok7先天性筋無力症の疾患メカニズム及び治療的レスキュー
先天性筋無力症(CM)は、神経筋シナプスの形成、機能、及び維持に重要な役割を果たす遺伝子の変異によって引き起こされる疾患群である(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMullerら、「Congenital Myasthenic Syndromes: Spotlight on Genetic Defects of Neuromuscular Transmission」、Expert Rev. Mol. Med. 9:1～20頁(2007);Engel, A. G.、「Current Status of the Congenital Myasthenic Syndromes」、Neuromuscul. Disord. 22:99～111頁(2012);及びEngelら、「Congenital Myasthenic Syndromes: Pathogenesis, Diagnosis, and Treatment」、Lancet Neurol. 14:420～434頁(2015))。大部分で、これらの遺伝子の変異は劣性であり、遺伝子活性を低下させ、神経筋シナプスの構造的及び機能的欠損の早期発症につながるシナプス欠陥を引き起こし、これは、生涯を通じて、変動する、疲労しやすい又は持続的な筋力低下の原因となる。
神経筋シナプスの形成及び維持のために重要なアダプタータンパク質をコードする遺伝子であるDok7の変異(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるOkadaら、「The Muscle Protein Dok-7 is Essential for Neuromuscular Synaptogenesis」、Science 312:1802～1805頁(2006))は、全てのCM症例のうちの相当な割合(10～20%)を占めている(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBeesonら、「Dok-7 Mutations Underlie a Neuromuscular Junction Synaptopathy」、Science 313: 1975～1978頁(2006); Mullerら、「Phenotypical Spectrum of DOK7 Mutations in Congenital Myasthenic Syndromes」、Brain 130:1497～1506頁(2007);及びHamuroら、「Mutations Causing DOK7 Congenital Myasthenia Ablate Functional Motifs in Dok-7」、J. Biol. Chem. 283:5518～5524頁(2008))。疾患は、四肢、首、及び顔の筋肉を衰弱させ、脱力を引き起こし、Dok7 CM患者の4分の1は、生涯のある時点で非侵襲的な人工呼吸を必要とする。アドレナリン受容体を活性化するアルブテロール/サルブタモールは、十分には理解されていないメカニズムを通じて一部のDok7 CM患者に利益をもたらしうるが、臨床症状を軽減する治療法はほとんどない(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLiewluckら、「Beneficial Effects of Albuterol in Congenital Endplate Acetylcholinesterase Deficiency and Dok-7 Myasthenia」、Muscle Nerve 44:789～794頁(2011)及びBurkeら、「Salbutamol Benefits Children with Congenital Myasthenic Syndrome due to DOK7 mutations」、Neuromuscul. Disord. 23:170～175頁(2013))。
神経筋シナプスの形成及び維持には、高度に特殊化したシナプス前膜及びシナプス後膜の組立てが必要であり、いくつかの主要分子の協調作用を必要とする(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBurden, S. J, 「The Formation of Neuromuscular Synapses」、Genes Dev. 12: 133～148頁(1998); Sanes & Lichtman、「Induction, Assembly, Maturation and Maintenance of a Postsynaptic Apparatus」、Nat. Rev. Neurosci. 2: 791～805頁(2001); Burden, S.J.、「SnapShot: Neuromuscular Junction」、Cell 144: 826～826頁(2011); Burdenら、「The Role of MuSK in Synapse Formation and Neuromuscular Disease」、Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5: a009167頁(2013)、及びTintignacら、「Mechanisms Regulating Neuromuscular Junction Development and Function and Causes of Muscle Wasting」、Physiol. Rev. 95: 809～852頁(2015))。運動神経終末から放出されるアグリンは、筋肉中のリポタンパク質受容体関連タンパク質4(Lrp4)に結合し、Lrp4と、シナプス分化の主要な調節因子として作用する受容体チロシンキナーゼである筋特異的キナーゼ(MuSK)との間の複合体の形成を刺激する(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBurdenら、「The Role of MuSK in Synapse Formation and Neuromuscular Disease」、Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5:a009167頁(2013);Tintignacら、「Mechanisms Regulating Neuromuscular Junction Development and Function and Causes of Muscle Wasting」、Physiol. Rev. 95:809～852頁(2015); McMahan, U. J.、「The Agrin Hypothesis」、Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 55:407～418頁(1990);Jenningsら、「Muscle-Specific trk-Related Receptor with a Kringle Domain Defines a Distinct Class of Receptor Tyrosine Kinases」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2895～2899頁(1993);DeChiaraら、「The Receptor Tyrosine Kinase MuSK is Required for Neuromuscular Junction Formation in vivo」、Cell 85:501～512頁(1996);Glassら、「Agrin Acts via a MuSK Receptor Complex」、Cell 85:513～523頁(1996);Kimら、「Lrp4 is a Receptor for Agrin and Forms a Complex with MuSK」、Cell 135:334～342頁(2008);及びZhangら、「LRP4 Serves as a Coreceptor of Agrin」、Neuron. 60:285～297頁(2008)参照)。MuSK活性化の結果として、シナプス後膜にクラスター化されたLrp4は、運動軸索に逆行性シグナル伝達を行い、シナプス前分化を刺激する(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるYumotoら、「Lrp4 is a Retrograde Signal for Presynaptic Differentiation at Neuromuscular Synapses」、Nature 489:438～442頁(2012))。アグリン、Lrp4、及びMuSKの変異、並びにアセチルコリン受容体(AChR)サブユニット遺伝子の変異もまたCMを引き起こす(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるEngelら、「Congenital Myasthenic Syndromes: Pathogenesis, Diagnosis, and Treatment」、Lancet Neurol. 14:420～434頁(2015)及びMcMackenら、「The Increasing Genetic and Phenotypical Diversity of Congenital Myasthenic Syndromes」、Neuropediatrics 48:294～308頁(2017))。
MuSK活性化はまた、Dok7に依存する。Dok7のアミノ末端領域は、プレクストリン相同性(PH)及びホスホチロシン結合(PTB)ドメインを含み(図1A)、これらはDok7を二量体化し、MuSK近膜(JM)領域内のリン酸化チロシンモチーフに結合するように機能する(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるYamanashiら、「Activation of Receptor Protein-Tyrosine Kinases from the Cytoplasmic Compartment」、J. Biochem. 151:353～359頁(2012))。Dok7の欠如又はDok7の結合を妨げるMuSK JM領域の変異によるDok7のMuSKへの結合の失敗は、アグリンのMuSKリン酸化刺激の失敗につながる(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるOkadaら、「The Muscle Protein Dok-7 is Essential for Neuromuscular Synaptogenesis」、Science 312:1802～1805頁(2006);Herbst & Burden、「The Juxtamembrane Region of MuSK has a Critical Role in Agrin-Mediated Signaling」、EMBO J. 19:67～77頁(2000);及びZhouら、「Distinct Domains of MuSK Mediate its Abilities to Induce and to Associate with Postsynaptic Specializations」、J. Cell Biol. 146:1133～1146頁(1999))。このことは、Dok7のMuSKへの結合が、MuSKのリン酸化を、おそらくはMuSKの二量体化を促進することによって安定化するために必要であることを示す(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBergaminら、The Cytoplasmic Adaptor Protein Dok7 Activates the Receptor Tyrosine Kinase MuSK via Dimerization」、Mol. Cell 39: 100～109頁(2010))。更に、アグリン刺激型MuSKリン酸化は、Dok7のカルボキシ末端領域における2つのチロシン残基のリン酸化をもたらし、アセチルコリン受容体(AChR)のクラスター化に関与するCrkタンパク質及びCrk-Lタンパク質の動員を引き起こす(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるHallockら、「Dok-7 Regulates Neuromuscular Synapse Formation by Recruiting Crk and Crk-L」、Genes Dev. 24:2451～2461頁(2010)及びHamuroら、「Mutations Causing DOK7 Congenital Myasthenia Ablate Functional Motifs in Dok-7」、J. Biol. Chem. 283:5518～5524頁(2008))。
Dok7 CMの最も一般的な原因は、4塩基対の重複(1124 1127 dup TGCC)であり、この重複は、Dok7 CMに1つ又は2つの変異対立遺伝子としてほぼ常に存在し、Dok7のフレームシフト及び中途終結をもたらす(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBeesonら、「Dok-7 Mutations Underlie a Neuromuscular Junction Synaptopathy」、Science 313:1975～1978頁(2006)及びCossinsら、「The Spectrum of Mutations that Underlie the Neuromuscular Junction Synaptopathy in DOK7 Congenital Myasthenic Syndrome」、Hum. Mol. Genet. 21:3765～3775頁(2012))。Dok7の切断形態は、PHドメイン及びPTBドメインを保持し、MuSKのチロシンリン酸化JM領域に結合するが(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBeesonら、「Dok-7 Mutations Underlie a Neuromuscular Junction Synaptopathy」、Science 313: 1975～1978頁(2006))、リン酸化され、Crkタンパク質を動員する2つのチロシン残基を欠いている。これら及び他の知見は、切断型Dok7にこれらの2つのチロシン残基が存在しないことが、このDok7 CMに共通する形態のシナプス欠陥の原因であることを示唆した(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるEngelら、「Congenital Myasthenic Syndromes: Pathogenesis, Diagnosis, and Treatment」、Lancet Neurol. 14:420～434頁(2015); Hallockら、「Dok-7 Regulates Neuromuscular Synapse Formation by Recruiting Crk and Crk-L」、Genes Dev. 24:2451～2461頁(2010);及びHamuroら、「Mutations Causing DOK7 Congenital Myasthenia Ablate Functional Motifs in Dok-7」、J. Biol. Chem. 283:5518～5524頁(2008))。しかしながら、Dok7 1124_1127 dup TGCC CMのメカニズムは解明されていない。
Dok7のC末端領域はシナプス形成に不可欠である
Dok7のカルボキシ末端領域の喪失が、いかに神経筋シナプスの構造及び機能の欠陥をもたらすかを研究するために、Dok7 CMの最も一般的な形態のマウスモデル(Dok7 1124_1127 dup)を生成した(図1A)。カルボキシ末端領域の2つのチロシン残基をフェニルアラニンに変異させた第2のマウス変異体(Dok7 Y396F; Y406F)も作製した(図1A)。
Dok7 CMマウスと称するホモ接合Dok7 1124_1127 dupマウスは、El8.5において予想される数で存在したが、神経筋シナプスが呼吸及び生存に不可欠である出生の際には1日後に生きているものはほとんどいなかった(図1B)。E18.5胚からの横隔膜筋を、シナプス前及びシナプス後分化の視覚化を可能にするプローブで染色した。Dok7 CMにおいて、野生型マウスの1/5倍のシナプスが見られた(図1C)。更に、シナプスサイズ及びシナプスAChRの密度がそれぞれ1/5倍に減少したため、形成されたシナプスは未熟であった(図1C;図7)。対照的に、Dok7 2YFマウスと称するホモ接合 Dok7 Y396F; Y406Fマウスは、予想される頻度で出生し(図IB)、それらの神経筋シナプスはほぼ正常に見えた(図1C; 図8)。更に、Dok7 2YFマウスは、繁殖可能な成体マウスとして育った。これらの知見を合わせると、Dok7のカルボキシ末端領域における2つのチロシン残基の喪失が、驚くべきことに、Dok7 CMマウスにおける致死性の原因ではなく、またシナプス形成における重度の欠陥ではないことが示唆される。
Dok7タンパク質レベル及びMuSKチロシンリン酸化は、Dok7 CMマウスにおいて低減している
カルボキシ末端領域の喪失がいかにシナプス欠陥を引き起こすかを決定するために、Dok7 CMマウスにおけるDok7 mRNA及び切断型Dok7タンパク質の発現を、切断型タンパク質及び野生型タンパク質を等しく検出したDok7 PTBドメインに対する抗体を用いて測定した(図9A～図9B)。Dok7 CMマウスからの筋肉でDok7 mRNAレベルは正常であることが分かったが(図10A～図10C)、切断型Dok7タンパク質は、野生型Dok7タンパク質より低く1/3倍のレベルで発現された(図2A;図10A～図10C)。
Dok7は、MuSKを二量体化するための二量体として機能し、MuSKチロシンリン酸化を安定化するため(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBergaminら、「The Cytoplasmic Adaptor Protein Dok7 Activates the Receptor Tyrosine Kinase MuSK via Dimerization」、Mol.Cell 39:100～109頁(2010))、Dok7 CMマウスにおけるDok7タンパク質レベルの低下が、MuSKチロシンリン酸化の低減につながりうるかどうかを検討した。MuSKを免疫沈降させ、MuSKリン酸化を測定したところ、Dok7 CMマウスではMuSKリン酸化が1/7倍に減少したが、Dok7 2YFマウスでは正常であった(図2C～図2D)。
Crkタンパク質は、Dok7と同様に、MuSKに直接動員される
Dok7 CM及びDok7 2YF変異体マウスの両方において、シナプスへのCrk動員が欠けているか又は著しく低減していることが予想された。実際、シナプス及びMuSK複合体へのCrk動員は、Dok7 CMマウスでは実質的に減少していたが(1/2.8倍)(図3A～図3B)、驚くべきことに、Dok7 2YFマウスでは軽度にしか減少していなかった(28%)(図3A～図3B)。これらの知見から、Crkが、Dok7に加えて、チロシンリン酸化シナプスタンパク質に動員されていることが示唆された。
3つの活性化ループのチロシン及びY553は、アグリン刺激後にMuSKでリン酸化される(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるOkadaら、「The Muscle Protein Dok-7 is Essential for Neuromuscular Synaptogenesis」、Science 312:1802～1805頁(2006);Herbst & Burden、「The Juxtamembrane Region of MuSK has a Critical Role in Agrin-Mediated Signaling」、EMBO J 19:67～77頁(2000);Wattyら、「The in vitro and in vivo Phosphotyrosine Map of Activated MuSK」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4585～4590頁(2000);及びTillら、「Crystal Structure of the MuSK Tyrosine Kinase: Insights into Receptor Autoregulation」、Structure 10: 1187～1196頁(2002))。MuSK JM領域におけるY553は、Dok7を動員するPTB結合部位内だけでなく、Crkタンパク質の潜在的なSH2結合モチーフ内にもあることが分かった(図3C)。図3Dは、CrkI並びにDok7が、MuSK JM部位にリン酸化依存的に結合したことを示す。SH2結合モチーフを構成するが、PTB結合部位を構成していないアミノ酸の変異は、CrkI結合を損なった(図3D)。したがって、Crkは、Dok7のリン酸化カルボキシ末端領域のみならず、MuSKのチロシンリン酸化JM領域にも直接結合することができる。Crkを、シナプス及びMuSK複合体に動員するこの冗長性は、Dok7 2YFマウスにおけるCrkとMuSK複合体とのほぼ正常な会合を説明し、Dok7 CMマウスとDok7 2YFマウスの表現型が異なることの基礎となりうる。
したがって、MuSK JM領域は、PTBドメイン及びSH2ドメイン含有タンパク質のための重複した結合部位を有する。これは、受容体チロシンキナーゼの下流のシグナル伝達様式における柔軟性及び調節を提供する配置であり、現在理解されているよりも一般的なものでありうる。
ヒト及びマウスのMuSKに対するアゴニスト抗体の開発
減少したMuSKリン酸化がDok7 CMにおける疾患の決定的なものである場合、MuSKを刺激することは、シナプス欠陥をレスキューし、致死性を克服しうると推論された。減少したMuSKリン酸化が疾患の中心であるという概念を、Dok7 CMマウスを作製し、MuSKを標的とするアゴニスト抗体を用いて処置することによって探索した。
合成ヒト抗体をFab形態で発現するファージディスプレイライブラリを、マウス及びヒトのMuSKの両方の細胞外領域でFz様ドメインに結合する抗体についてスクリーニングした。Fz様ドメインを標的としたが、その理由は、このドメインがMuSK機能に必須ではなく、以前の研究において、Fz様ドメインに対する抗体が、マウスにおいて明らかな有害性を引き起こさないことが示されているためである(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるRemedioら、「Diverging Roles for Lrp4 and Wnt Signaling in Neuromuscular Synapse Development During Evolution」、Genes Dev.30:1058～1069頁(2016)及びCantorら、「Preserving Neuromuscular Synapses in ALS by Stimulating MuSK with a Therapeutic Agonist Antibody」、Elife 7:e34375頁(2018))。
ヒト及びマウスのMuSKにおけるFz様ドメインに結合する高親和性抗体を同定した(図4A;図12A～図12C)。X1を除く各Fabの四量体化バージョンが、マウスC2筋管におけるMuSKリン酸化を刺激した(図4B)。マウスIgG2a形態及びヒトIgG1形態両方の抗体X3及び抗体X17、並びにヒトIgG1形態での抗体X2は、ヒト及びマウスのMuSKにナノモル未満の親和性で結合し、同様に、MuSKチロシンリン酸化を、アグリンに関係なく刺激した(図4C～図4D)。これらの抗体が同様の活性を有していたため、X17を、インビボでの更なる分析のために選択した。
抗体X17を、Fcドメインエフェクター機能を低下させる、いわゆるLALAPG変異を有するマウスIgG2a形態で(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLoら、「Effector-Attenuating Substitutions That Maintain Antibody Stability and Reduce Toxicity in Mice」、J. Biol. Chem. 292:3900～3908頁(2017))、野生型マウスに腹腔内注射した。X17は、血液中で5日の半減期を有することが分かった(図4E)。X17を染色して神経筋シナプスにおける標的会合を定量化することにより、10mg/kgのX17が、シナプスMuSKを飽和させるのに十分であることが分かった(図4F)。2カ月間にわたる野生型マウスでのmIgG2a-X17(P4、P24及びP44で10mg/kg)の長期注射は、神経筋シナプスの組織化、体重増加、又は運動挙動に影響を及ぼさなかった(図13A～図13D)。
アゴニスト抗体X17は、Dok7 CMマウスのシナプス形成及び致死性をレスキューする
C57BL/6バックグラウンドのDok7 CMマウスは出生時に死亡したが、混合遺伝子バックグラウンドのDok7 CMマウスは生後1～2週間生存することが分かり(図14A～図14B)、治療有効性を研究するための実験を促進した。C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 CMマウスは、発育不全であり、シナプス形成に欠陥を有していたように、生後直ぐに疾患の徴候を示した(図15A～図15E)。生後数週間生存したにもかかわらず、Dok7発現、MuSKリン酸化、及び神経終末の組織化及びAChRは、同一のDok7変異を有するEl8.5の近交C57BL/6マウス及び混合種C57BL/6-CBAマウスにおいて類似していた。
Dok7 CMマウスに、P4で、10mg/kgの抗体X17又はアイソタイプ合致陰性対照抗体を注射した。未処置のDok7 CMマウス、又はアイソタイプ対照抗体を注射したDok7 CMマウスは、体重が減少し続け、P10～12で1週間以内に死亡した(図5A～図5B)。抗体X17の注射は、体重減少を好転させ、この早期致死性からDok7 CMマウスをレスキューした(図5A～図5B)。続く3週間にわたって、抗体X17を注射した12匹のDok7 CMマウスのうち9匹において体重増加が継続した;X17注射マウスのうち3匹において体重増加が遅くなり、P23～P24で死んだ。別の抗体X3は、20mg/kgで投与したときは、生後早期致死性からDok7 CMマウスをレスキューしたが、10mg/kgで投与したときはレスキューせず(図17A～図17C)、このことは、シナプスが成熟の重要な過程を経ている際、より高い初期用量のMuSKアゴニスト抗体が、早期の生後発達においてより有効でありうることを示唆した。
抗体X17の注射を、P24及びP44で9匹の生存Dok7 CMマウスで繰り返し、長期投薬が長期生存につながりうるかどうかを決定した。Dok7 CMマウスの運動パフォーマンスを評価し、屠殺してシナプスを調べた場合に、9匹の生存Dok7 CMマウスにおける抗体X17の長期投薬は、これらのDok7 CMマウスを少なくとも2カ月間レスキューした(図5A～図5B)。
抗体X17は、神経筋シナプスが、完全に成熟したマウス神経筋シナプスに特徴的な複雑なプレッツェル様形状を発達させたように、シナプス形成及び成熟をレスキューした(図5C)。更に、XI7は、神経筋シナプスへのCrkタンパク質の動員をレスキューした(図5D)。
抗体X17は、前肢握力及びロータロッドアッセイによって評価される場合のDok7 CMマウスの運動機能をレスキューした(図5E)。更に、抗体XI7を注射したDok7 CMマウスは、繁殖可能であり、予想される頻度で子孫を産生した。これらの知見を合わせると、減少したMuSKチロシンリン酸化が、Dok7 CMマウスにおける疾患の中心であるという考えが支持される。Dok7のカルボキシ末端領域がシナプス形成における更なる役割を有するとしても、そのような機能は、MuSKを刺激することによって無効になりうる。
成体Dok7 CMマウスにおける治療的好転
次に、X17が成体期に発症する神経筋の欠陥を好転させることができるかどうかを調べた。この問いは、ヒトにおけるDok7 CMは成人期に治療される可能性が高いために、ヒトにおける治療法の開発に特に関連する問いである。Dok7 CMマウスを、P4、P24及びP44、又はP4及びP18のいずれかでX17で処置し、その後、抗体処置を中止した。これらのDok7 CMマウスは、2～3カ月間、体重及び運動性を維持し続け(図6A)、レスキューが、血液中の抗体の寿命よりも持続的であることを示した。しかしながら、これらのDok7 CMマウスは、最終的に体重が減少し始め、運動障害を示し始めた(図6A～図6B)。マウスが約0.4g/日の割合で体重減少を示しているとき、X17を再度注射し、Dok7 CMマウスの体重及び運動性をモニタリングした。XI7処置を再開した2日後、Dok7 CMマウスは体重が回復し始め、次週にわたって約0.4g/日で増加した(図6A)。抗体処置を再開してから1週間以内に、Dok7 CMマウスの運動パフォーマンスが回復した(図6B)。レスキューされたマウスは、抗体処置後、マウスを屠殺した時までの少なくとも更なる1週間にかけて、体重増加及び運動パフォーマンスの改善が続いた(図6A～図6B)。
実施例1の考察
アゴニスト抗体でMuSKを刺激することは、シナプス形成及び運動機能をレスキューし、致死性を防止し、Dok7 CMマウスが受胎可能成体として生後に繁殖することを可能にした。更に、抗体処置の中止後、Dok7 CM成体マウスは最終的に運動障害を示したが、この障害は抗体治療を再開した後に速やかに好転した。このことは、この治療戦略が、ヒトにおけるDok7 CM及び他の神経筋疾患に利益をもたらしうることを示唆する。
Dok7の以前のほとんどの研究は、Dok7を過剰発現するトランスフェクトされた筋肉細胞及び非筋肉細胞の分析に依るものである(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるOkadaら、「The Muscle Protein Dok-7 is Essential for Neuromuscular Synaptogenesis」、Science 312:1802～1805頁(2006); Hamuroら、「Mutations Causing DOK7 Congenital Myasthenia Ablate Functional Motifs in Dok-7」、J. Biol. Chem. 283:5518～5524頁(2008);及びHallockら、「Dok-7 Regulates Neuromuscular Synapse Formation by Recruiting Crk and Crk-L」、Genes Dev. 24:2451～2461頁(2010))。MuSKを刺激するためのアグリン及びLrp4の通常の要件が迂回されるこの文脈では、Dok7変異のインビボでの結果が、Dok7の過剰発現のためにマスクされている可能性がある。
以前の研究は、この一般的な形態のDok7 CMについて、古典的なES細胞遺伝子標的化を使用して生成された類似のマウスモデルを記載していた(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるArimuraら、「Neuromuscular Disease.DOK7 Gene Therapy Benefits Mouse Models of Diseases Characterized by Defects in the Neuromuscular Junction」、Science 345:1505～1508頁(2014))。これらの変異マウスの致死性は、野生型Dok7を発現するアデノウイルス関連ベクターによってレスキューされ、Dok7 CMを処置するための治療アプローチを確立したが(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるArimuraら、「Neuromuscular Disease. DOK7 Gene Therapy Benefits Mouse Models of Diseases Characterized by Defects in the Neuromuscular Junction」、Science 345:1505～1508頁(2014))、この研究は、Dok7 1124_1127 dupマウスモデルにおける疾患の原因を検討しなかった。
Dok7 1124_1127 dup変異を保有する近交系C57BL/6マウスは、同じ変異を有するヒトよりも重篤な機能欠陥を示した。非近交系マウスは生後数週間生存したのに対し、近交系変異マウスは出生時に死亡したため、混合遺伝的バックグラウンドを有するマウスでは、変異型表現型の重症度が低いことが分かった。ハイブリッド系統における修飾因子が、疾患の重症度を低下させている可能性があり、又はC57BL/6マウスが、表現型を悪化させる遺伝子を保有している可能性がある。いずれの場合においても、混合バックグラウンドのDok7 CMマウスの適度に延長された寿命は、治療法をより良く評価するためのより長い時間的ウインドウを提供するマウスモデルを提供する。
これらの実験は、標的療法による先天的致死性からの完全なレスキューを実証する。これらの知見は、疾患を処置するための、予期されなかった治療的アプローチを示す。なぜなら、この戦略は、変異タンパク質を直接標的とせず、むしろ、上流遺伝子、この場合はDok7の変異によって引き起こされる、活性が低下した野生型タンパク質を標的とするためである。そのようなエピスタシスのレスキューは、Dok7に加えて、アグリン、Lrp4、又はMuSKの変異によって引き起こされるCM、並びに更なる神経筋疾患に対して治療法を提供しうる。更に、この戦略は、疾患メカニズムが理解され、適切な標的が同定されている、ヒトにおける劣性遺伝疾患を治療するための広範な用途の可能性を有する。
(実施例2)
MuSK抗体
MuSKのFrizzleドメインを標的とする単純抗体の選択
2匹のラマを、組換えヒトMuSK(R&D systems社、カタログ番号9810-MK)で免疫した。免疫化ラマから単離したPBLを、de Haardら(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるde Haardら、「A Large Non-Immunized Human Fab Fragment Phage Library that Permits Rapid Isolation and Kinetic Analysis of High Affinity Antibodies」、J. Biol. Chem. 274:18218～18230頁(1999)参照)に記載の戦略を用いて、RNA抽出、RT-PCR、及びファージミドにおけるFabのPCRクローニングに使用した。全長ヒトMuSK、全長マウスMuSK、又はIg1様及び/若しくはIg2様及び/若しくはIg3様ドメインを欠くヒトMuSKのいずれかを使用して、パニングファージディスプレイ選択を最大3ラウンド実施した(図18)。
濃縮を伴う各選択について、個々のクローンを96深ウェルプレートで増大させ、ペリプラズム画分を調製した。これらのペリプラズム抽出物(Fab含有)を、ELISAにおいて、全長ヒトMuSK、全長マウスMuSK、又はIg1様及び/若しくはIg2様及び/若しくはIg3様ドメインを欠くヒトMuSKへの結合について試験した。次いで、ELISAにおける明確な結合を示すFabを、全長ヒトMuSK、全長マウスMuSK、又はIg1様及び/若しくはIg2様及び/若しくはIg3様ドメインを欠くヒトMuSKでコーティングしたCM5チップにてBiacoreでオフ速度について試験した。ヒト及びマウスのMuSKに対して良好な親和性を有するバインダー及びMuSKのFrizzleドメインに対して特異的なバインダーを配列決定した。6つの異なるバインダーのファミリーを得た:1E11、6F8、10F1、17H10、14D10、16F11。これらを、LALA変異(L234A、L235A)を有するヒトIgG1の配列を含むベクターにクローニングして、エフェクター機能をノックアウトした。HEK293細胞において抗体を作製し、プロテインAカラムで精製した。
ELISAにおけるヒト及びマウスのMuSKへの抗体の結合
ELISAプレートを、ヒトMuSK(R&D Systems社、カタログ番号10189-MK)又はマウスMuSK(HEK 293細胞で自社作製)を用いて0.2μg/mlでコーティングした。プレートを洗浄及びブロッキングした後、抗MuSK抗体の希釈系列を適用し、室温で2時間結合させた。結合を、ヤギ抗ヒトFc-HRP(Jackson Immunoresearch社、カタログ番号109-035-008)及びTMB(Merck Millipore社、#CL07)で検出した。620nmでのODを、96ウェルELISAプレートリーダーで測定した。
6つの抗体(1E11、6F8、10F1、17H10、14D10及び16F11)全てが、ヒトMuSKへの結合を示した。しかしながら、マウスMuSKへの結合は、16F11を除いて乏しかった。16F11では、マウスMuSKへの結合は増加し、ヒトMuSKに対するよりも高い16F11濃度であった(図19)。結論として、このアッセイでは、試験した6つの抗体のうち5つの抗体のヒト-マウス交差反応結合不良が明らかになった。
マウスの交差反応性を改善するための軽鎖シャッフリング
同じ抗原への繰り返し曝露の際に、例えばラマの免疫化期間に、免疫応答は、標的に対する抗体の親和性を増加させることによって最適化される。二次応答は、一次応答よりも数log倍高い親和性を有する抗体を誘導することができる。その結果、B細胞は、様々な抗体を産生し、したがって、抗原に対する様々な親和性のバリアントを産生する。上記で選択した6つの抗体のうちの5つは、マウス交差反応性が低かった。したがって、鎖シャッフリングをmAbに適用した。この方法において、Fab分子のVHは、個々のラマVLレパートリー全てにクローニングされる。得られたライブラリは、Fabに特異的なVH鎖及びランダムなVL鎖を有するFabファージを含む。ファージディスプレイ及びMuSKの異なるバリアント(上述のものと同様)を使用して、免疫化された動物において天然に存在する、より高い親和性のバリアントを選択した。濃縮を伴う各選択について、個々のクローンを96深ウェルプレートで増大させ、ペリプラズム画分を調製した。これらのペリプラズム抽出物(Fab含有)を、全長ヒトMuSK及び全長マウスMuSKでコーティングされたCM5チップにおいてBiacoreで結合について試験した。ヒト及びマウスのMuSKに対する良好な親和性を有するバインダーを配列決定した。このキャンペーンは、14D10、16F11、6F8、及び17H10で成功した。10F1及び1E11については、マウス交差反応性の改善は得られなかった。
14D10について、6つの異なる配列の交差反応性バインダーを得た:31G2、31B7、3C4、7G4、3G3及び3B2。17H10について、3つの異なる配列の交差反応性バインダーを得た:23B6、30E1及び30A11。16F11について、4つの異なる配列の交差反応性バインダーを得た:4C11、7G12、7B8及び7A12。
これらを全て、LALA変異(L234A、L235A)を有するヒトIgG1の配列を含むベクターにクローニングして、エフェクター機能をノックアウトした。HEK293細胞において抗体を作製し、プロテインAカラムで精製した。
ELISAにおけるヒト及びマウスのMuSKへの抗体の結合
ELISAプレートを、0.2μg/mlで、ヒトMuSK(R&D Systems社、カタログ番号10189-MK)、アカゲザルMuSK(HEK293細胞で自社作製)、又はマウスMuSK(HEK293細胞で自社作製)でコーティングした。プレートを洗浄及びブロッキングした後、抗MuSK抗体の希釈系列を適用し、室温で2時間結合させた。結合を、ヤギ抗ヒトFc-HRP(Jackson Immunore search社、カタログ番号109-035-008)及びTMB(Merck Millipore社、#CL07)で検出した。0.5N H2SO4(ChemLab社、#CL052615)で反応を停止させた後、450nmのODを、96ウェルELISAプレートリーダーで測定した。EC50の値を、Table 4(表4)にまとめる。試験した全てのクローンについて、マウスMuSKに対する改善された親和性を確認した。
Figure 2023522212000013
以下の基準を使用して、最良のクローンを選択した:(i)ヒト、アカゲザル及びマウスのMuSKに対する最高親和性;(ii)ヒト、アカゲザル及びマウスのMuSK間の親和性の最小差;(iii)ヒト、アカゲザル及びマウスのMuSK間の親和性の最大10倍差;(iv)CDRの配列解析に基づく製造可能性の問題に対するリスクの低さ;並びに(v)ヒトとの最高同一性/相同性。
クローン3B2、30A11及び30E1を、HEK293細胞における大規模抗体産生及び詳細な特性決定のために選択した。
Biacoreにおけるヒト対マウスのMuSKに対する結合親和性
MuSKへの一価結合は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるHuijbersら、「MuSK Myasthenia Gravis Monoclonal Antibodies: Valency Dictates Pathogenicity」、Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm. 6(3):e547頁(2019)に記載されているように、アグリン誘導性MuSKリン酸化及びAChRクラスター化を阻害しうる。したがって、MuSKに対する3B2、30E1及び30A11のFabの親和性を評価することが重要である。実際、親和性の低いFabは、mAbの一価結合を低減することができ、したがって、潜在的に安全性の利点を有する。したがって、ヒト及びマウスのMuSKに対するFab親和性を、BiacoreにおけるmAb親和性と比較した。
親和性決定のために、CM5チップをヒト又はマウスいずれかのMuSK(200RU)でコーティングし、親和性を計算することができるように抗体(mAb及びFab)の希釈系列を適用した。
このアッセイを使用して、3B2 mAbの親和性は、ヒト及びマウスのMuSKの両方に対して0.1nMであった。Fab 3B2は、ヒトMuSKに対して3nM、及びマウスMuSKに対して1.5nMの親和性を示し、これは、mAbの親和性よりも低く1/15～1/30倍である。
30E1は、ヒトMuSK(0.01nM)に対してマウスMuSK(0.1nM)と比較して10倍の差の結合親和性を示した。30A11は、ヒトMuSK(0.001nM)対マウスMuSK(0.1nM)で、それらの結合の親和性に関して100倍もの差を示した。したがって、両方の抗体は、十分にマウス交差反応性ではない。更に、30E1Fab及び30A11Fabは、ヒトMuSKに対して、それぞれ0.07nM及び0.8nMの高い親和性を示した。両方の抗体のマウス交差反応性の欠如は、Fabについても観察された。これらの結果は、ヒトMuSK対マウスMuSKでそれらへの親和性を比較した場合、30E1及び30A11mAbでは10～100倍の差があり、30E1及び30A11のFabでは少なくとも1000倍の差があることを示唆する(Table 5(表5))。抗体の標的に対する親和性のこの差は、インビボでのマウス実験を評価してデータをヒトに翻訳することが困難であるため、抗体の更なる開発には推奨されない。結論として、3B2のmAb及びFabが、更なる開発のための所望の親和性特性及び種間反応性を示す。
Figure 2023522212000014
C2C12リン酸化アッセイにおける抗体の効力
3B2、30E1、30A11によって誘導されるMuSKリン酸化の拡張を評価するために、マウスC2C12筋管を用いたインビトロMuSKリン酸化アッセイを使用した(91031101、Sigma Cell line service社、ECACC)。分化した筋管を10nMの抗体で刺激した。MuSKリン酸化に対する陽性対照は、0.1nMのラットニューラルアグリン(550-AG-100、R&D systems社)を適用する刺激条件であった。MuSKの免疫沈降は、4℃での一晩のインキュベーション中に、曝露直後に始まった。結合した抗原-抗体複合体を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ(V7820、
Promega社)を使用して4℃で少なくとも1時間沈降させ、その後、徹底的に洗浄した。同時に、ストレプトアビジンコーティングMSDプレート(L15SA-1、MSD社)をブロッキングし、ビオチン化hIgG4抗MuSKでコーティングした(クローン13-3B5 - Evitria社製801457.1 PID 9860 - ビオチン化はargenx社で行った)。MuSKタンパク質を、酸条件を適用したビーズから溶出し、続いて中和ステップを行い、hIgG4抗MuSKコーティングMSDプレート上で少なくとも2.5時間、室温でインキュベートした。試料のインキュベーションは、共溶出抗MuSK hIgGl抗体の薬物干渉を制限するために、溶液中の切断型MuSK(MuSK Δ1-2-3Ig、HEKでのargenx社製)の存在下で行った。試料をプレート上に四重にロードし、試料中の全MuSK(PA1-1741、Thermoscientific社及びMBS9205728、MyBioSource社のミックス)及びリン酸化MuSK(05-321 Millipore Corp社(クローン4G10)及びab10321、Abcam社(クローンPY20)のミックス)の二重検出を可能にした。SULFO-TAGコンジュゲート抗体を、それぞれ、全MuSK検出のための抗ウサギIgG(32AB-1、MSD社)及びリン酸化MuSK検出のための抗マウスIgG(R32AC-1、MSD社)に適用して、最終検出を行った。結合抗体を、Quickplex SQ 120(MSD社)を使用して検出した。
C2C12筋管にアグリン(1nM)を添加すると、MuSKリン酸化が誘導され、これを100%に設定した。3つの独立した実験を行った。この実験的設定を使用して、3B2、30E1及び30A11は、このアッセイにおいて、50～94%の間でMuSKリン酸化を誘導することができた(Table 6(表6))。
Figure 2023522212000015
3B2は、Dok7 1124_1127 dupマウスの生後早期致死性をレスキューする
第1の実験において、野生型マウス(C57BL/6//CBA)におけるP4及びP18の両方での10mg/kgの3B2の腹腔内(IP)投与は、少なくとも5週間、体重及び全体的な健康に関して、アイソタイプを注射した野生型マウスとの明確な差異を示さず、安全上の懸念又は毒性の問題がないことを示唆し、3B2抗体が更なるインビボでの実験作業に安全であることを明らかにした。
次に、3B2を、CMSマウスモデルであるDok7 1124_1127 dupマウスに投与した。Dok7 1124_1127 dupマウス(以下、Dok7マウスと呼ぶ)では、切断型Dok7が十分に発現せず、MuSKチロシンリン酸化が著しく低下する。Dok7マウスにおけるMuSKリン酸化のレベル低下は、疾患において重要な役割を果たす。MuSKに対するアゴニスト抗体でMuSKリン酸化を刺激することは、Dok7マウスの致死性をレスキューし、変異体マウスが成体として生存することを可能にすることができる。実際、3B2(P4での20mg/kg IP、及びP18での10mg/kg IP)の投与は、Dok7変異体マウスの生後早期致死性をレスキューすることができた(図20)。
3B2の問題点(Liabilities)の除去とCDR移植
3B2抗体をPBS-Tween中で1mg/mLに希釈し、37℃で最大6週間インキュベートした。次に、試料を質量分析によって分析し、脱アミド化、グリコシル化、異性化、並びにVH及びVL中の酸化部位についてスクリーニングした。予測通り、2つの問題点として、VH-CDR2における1つの脱アミド部位と、VL-CDR3における1つの酸化部位とが同定された。両方の問題点を除去するために変異体を作製した。更に、3B2は、すでに高いヒト同一性/相同性(それぞれ94.2%及び97.7%)を有していたが、最も近いヒト生殖系列配列にCDRを移植することによって100%まで更に改善した。
これらの2つの戦略を組み合わせることにより、Table 7(表7)にまとめている合計8つのバリアントを作製した。抗体を、HEK293細胞において、ヒトIgG1-LALA骨格で作製し、プロテインAカラムで精製した。
Figure 2023522212000016
Biacoreにおける3B2の配列最適化バリアントの親和性
親和性決定のために、カニクイザル、ラット及びマウスのMuSK(200RU)でCM5チップをコーティングし、66.7nMの抗体を適用し、動態パラメータを計算した(Table 8(表8))。以下のような結論を得ることができた:(1)3B2g1m3及び3B2g2m3(m3バリアント)は、試験した全ての種について、MuSKに対する親和性の有意な低下を示す;(2)3B2g1m2及び3B2g2m2(m2バリアント)は、MuSKに対する親和性のいくらかの低下を示す;(3)3B2g1m1、3B2g2m1、3B2g1m4、3B2g2m4(m1及びm4バリアント)は、試験した全ての種について、MuSKに対する親和性の低下を示さない;並びに(4)全てのクローンについてg1バリアントとg2バリアントとの間に差異がない(CDR3におけるVLメチオニン対セリン)。
Figure 2023522212000017
従来の抗体は、非特異的エンドサイトーシス又はピノサイトーシスによって、又は受容体媒介性内在化を介して細胞内に取り込まれる。抗原に一度しか結合できない従来の抗体とは対照的に、リサイクル抗体は、単一の抗体分子が抗原に複数回結合することができるように操作されている。実際、従来の抗体が、受容体等の膜アンカー抗原に結合すると、抗体-抗原複合体は内在化され、リソソーム内で分解される。これにより、治療用抗体の半減期が短くなり、有効な血漿抗体濃度を維持するために抗体薬物を頻繁に又はより高用量で投与する必要が生じる。抗体は、抗体がエンドソーム内の酸性pHで抗原から解離するように操作されうる。一旦解離すると、リサイクル抗体は、エンドソーム内のFcRn(胎児性Fc受容体)に自由に結合し、これにより抗体は循環に戻され、より多くの抗原に結合する。
MuSKは、筋肉細胞の膜に発現している。MuSKの内在化は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるZhuら、「Muscle-Specific Receptor Tyrosine Kinase Endocytosis in
Acetylcholine Receptor Clustering in Response to Agrin」、J. Neurosci. 28(7): 1688～1696頁(2008)に記載されている。したがって、この標的に対するリサイクル抗体は、興味深いものでありうる。
これまでに報告されているpH依存性抗体のほとんどは、CDRの大掛かりな操作の後に得られたものであるが、この特性は前から存在していたものでありうる。3B2及び最適化された配列バリアントが、MuSKに結合するための生来の既存のpH依存性を有するかどうかをBiacoreで調べた。
本発明者らの抗体のMuSKへのpH依存的結合を研究するために、上記と同じBiacoreを使用したが、今回は、解離をpH7.4に代えてpH5.5で行った。結果は、3B2が、MuSK(カニクイザル、ラット、又はマウス)に対してpH依存性で結合し、親和性がpH5.5で低下することを実証する(Table 9(表9))。さまざまなバリアントについて、次のような結論を導き出すことができる(1)3B2g1m3及び3B2g2m3(m3バリアント)は、試験した全ての種について、MuSKに対する親和性の有意な低下を示す;(2)3B2g1m2及び3B2g2m2(m2バリアント)は、MuSKに対する親和性のいくらかの低下を示す;(3)3B2g1m1、3B2g2m1、3B2g1m4、3B2g2m4(ml及びm4バリアント)は、試験した全ての種について、MuSKに対する親和性の低下を示さない;並びに(4)全てのクローンについてg1バリアントとg2バリアントとの間に差異がない(CDR3におけるVLメチオニン対セリン)。
Figure 2023522212000018
3B2バリアントを評価するインビトロMuSKリン酸化アッセイ
本発明者らのアゴニスト3B2バリアント抗体によって誘導されるMuSKリン酸化の拡張を評価するために、マウスC2C12筋管を使用するインビトロMuSKリン酸化アッセイを用いた。対照として、アグリン、親3B2、及びモタビズマブ(非MuSK結合Ab)を含む。C2C12筋管にアグリンを添加すると、MuSKリン酸化が誘導され、これを100%に設定した。これには、非MuSKバインダーであるモタビズマブによるMuSKリン酸化を誘導することによって分析したMuSKリン酸化のバックグラウンドを差し引くことが含まれる。親3B2Abは、1nMのアグリンと同程度にMuSKリン酸化を誘導した。更に、3B2バリアント3B2g1m1及び3B2g2m1は、親の3B2Abと同等に良好に作用した。3B2g1m2及び3B2g2m2もまた、強力にMuSKリン酸化を誘導した(+/-80%)。3B2g1m3及び3B2g2m3は、MuSKを誘導する能力を失い、MuSKリン酸化が約13%となった。興味深いことに、3B2g1m4及び3B2g2m4は、muSKを誘導する能力をほぼ半分失い、MuSKリン酸化が約58%となった(図21)。
ELISAにおける異なる種由来のコーティングされたMuSKへの3B2バリアントの結合親和性
異なる種由来のMuSKタンパク質に対する3B2バリアントの結合親和性を評価するために、ELISAを行った。プレートを、MuSK形態のヒト、カニクイザル、ラット、又はマウスでコーティングし、3B2と比較して異なる3B2バリアントの結合を、上記のように評価した。このアッセイでは、3B2g1m1、3B2g2m1、3B2g1m4及び3B2g2m4は、3B2と比較して親和性を失わなかった。一方、3B2g1m2、3B2g2m2、3B2g1m3及び3B2g2m3は、異なる種由来のMuSKに対する結合親和性を失った(図22)。
(実施例3)
アゴニストMuSK抗体のpH依存性の違い
従来の抗体は、非特異的エンドサイトーシス又はピノサイトーシスによって又は受容体媒介性内在化を介して細胞内に取り込まれる。上述のように、抗原に一度しか結合できない従来の抗体とは対照的に、リサイクル抗体は、単一の抗体分子が抗原に複数回結合することができるように操作される。実際、従来の抗体が、受容体等の膜アンカー抗原に結合すると、抗体-抗原複合体は内在化され、リソソーム内で分解される。これにより、治療用抗体の半減期が短くなり、有効な血漿抗体濃度を維持するために抗体薬物を頻繁に又はより高用量で投与する必要が生じる。抗体は、抗体がエンドソーム内の酸性pHで抗原から解離するように操作されうる。一旦解離すると、リサイクル抗体は、エンドソーム内のFcRn(胎児性Fc受容体)に自由に結合し、これにより、抗体は循環に戻され、より多くの抗原に結合する。
MuSKは筋肉細胞の膜に発現している。MuSKの内在化は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるZhuら、「Muscle-Specific Receptor Tyrosine Kinase Endocytosis in Acetylcholine Receptor Clustering in Response to Agrin」、J. Neurosci. 28(7): 1688～1696頁(2008)に記載されている。したがって、この標的に対するリサイクル抗体は、興味深いものである可能性がある。
これまでに報告されているpH依存性抗体のほとんどは、CDRの大掛かりな操作の後に得られたものであるが、この特性は前から存在していたものでありうる。X2、X2m4、X3、X9、X17、3B2及び3B2g2m1が、MuSKへの結合のための生来の既存のpH依存性を有するかどうかをBiacoreで調べた。
本明細書に記載の抗体のMuSKへのpH依存的結合を研究するために、Biacore T200を使用した。簡潔に述べると、CM5チップをヒト及びマウスMuSK(200RU)でコーティングし、22.2nMのFabを適用し、動態パラメータを計算した。会合はpH7.4で行い、解離はpH7.4及びpH5.5で行った。以下のFabを試験した:X2、X2m4、X3、X9、X17、3B2及び3B2g2m1(Table 10(表10)及び図23)。興味深いことに、これらの結果は、3B2g2m1が、ヒトMuSK及びマウスMuSKの両方に対してpH依存性を有することを示唆している。pH5.5における結合親和性は非常に低く、エンドソームpHにおける急速な解離を生じさせ、3B2g2m1のリサイクルを可能にする。
Figure 2023522212000019
(実施例4)
Fzドメインを標的とするアゴニストMuSK抗体は、その天然リガンドであるアグリンによるMuSK活性化を妨げない
MuSKの活性化には、運動ニューロン分泌アグリン、筋膜に位置するLRP4、及び細胞質DOK-7が必要である。LRP4及びMuSKは、アグリンの非存在下で予め組み立てられるが、MuSKの活性化は、アグリンの存在下でのみ誘導される。実際、MuSKを有するアグリン結合LRP4は、MuSKトランスリン酸化及び活性化を開始する(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるStieglerら、「Crystal Structure of the Agrin-Responsive Immunoglobulin-Like Domains 1 and 2 of the Receptor Tyrosine Kinase MuSK」、J. Mol. Biol. 364:424～433頁(2006);Kimら、「Lrp4 is a Receptor for Agrin and Forms a Complex with MuSK」、Cell 135:334～342頁(2008);Zhangら、「Agrin Binds to the N-Terminal Region of Lrp4 Protein and Stimulates Association between Lrp4 and the First Immunoglobulin-Like Domain in Muscle-Specific Kinase(MuSK)」、J. Biol. Chem. 286:40624～40630頁(2011);及びZongら、「Structural Basis of Agrin-LRP4-MuSK Signaling」、Genes Dev. 26:247～258頁(2012))。
MuSKのFzドメインを標的とするMuSKアゴニスト抗体は、アグリンによるMuSKの活性化を妨げる可能性がある。Fz結合MuSKアゴニスト抗体がアグリンと共にMuSKを活性化できるかどうかを試験するために、インビトロ共刺激実験を行った。
マウスC2C12筋管を用いたインビトロMuSKリン酸化アッセイを使用して、アゴニストMuSK抗体3B2g2m1によって誘導されるMuSKリン酸化の拡張を、非飽和状態のアグリン(0.1nMアグリン)の存在下又は非存在下で評価した。対照として、アグリン(1nM及び0.1nM)、及びモタビズマブ(アイソタイプ対照、非MuSK結合mAb、333nM)を含む。全ての刺激は30分間行った。1nMのアグリンをC2C12筋管に添加すると、MuSKリン酸化が誘導され、これを100%に設定した。これには、非MuSKバインダーであるモタビズマブによるMuSKリン酸化を誘導することによって分析したMuSKリン酸化のバックグラウンドを差し引くことが含まれる。0.1nMのアグリンでMuSKを刺激すると、53%のMuSKリン酸化の誘導がもたらされ、このアッセイにおけるアグリンの最適未満の濃度であることが示唆される。0.01～333nMの3B2g2m1(アグリンなし)を滴定すると、用量依存的にMuSKリン酸化が増加する。重要なことに、3B2g2m1と最適未満の濃度である0.1nMのアグリンとの共刺激は、3B2g2m1又は0.1nMのアグリンのみでの刺激と比較して、MuSKリン酸化の増加をもたらした。注目すべきことに、0.3nMの3B2g2m1を0.1nMのアグリンと組み合わせると、1nMのアグリンのみでの刺激と同様に、100% MuSKリン酸化が得られた(図24)。このデータは、MuSKのFzドメインに結合する3B2g2m1が、アグリンと並行してMuSKを刺激することができることを示唆する。更に、3B2g2m1は、その天然リガンドアグリンの上位でMuSKを活性化し、MuSKリン酸化の増加をもたらすことができることが示唆されうる。実際、アグリンはLRP4に結合し、次いでLRP4はMuSKのIg-1様ドメインに結合する。したがって、FzドメインをアゴニストMuSK抗体で標的化することによってMuSKを活性化することは、その天然リガンドアグリンによるMuSK活性化を妨げるものではない。
(実施例5)
MuSKアゴニスト抗体mIgG2a-X17及びhIgG-X17
mIgG2a-X17及びhIgG-X17抗体の組合せの治療的有用性を、Dok7モデルにおいて試験した。P4でアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置したC57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_27 dupマウスは生後1～2週間で死亡したが(混合遺伝子バックグラウンドの未処置のDok7 1124_27 dupマウスも同様)、P4で10mg/kgのmIgG2a-X17(n=3)並びにP24及びP44で10mg/kgのhIgG-X17を注射したDok7 1124_1127 dupマウスは成体としての生存が見られた(図25A～図25B)。
P4で10mg/kgのmIgG2a-X17(n=3)並びにP24及びP44で10mg/kgのhIgG-X17を注射したDok7 1124_1127 dupマウスは、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なり、体重が増加した(図25B)。更に、mIgG2a-X1とhIgG-X17との組合せは、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時によって評価されるように、Dok7 1124_27 dupマウスの運動機能をレスキューした(図26)。
これらの知見を合わせると、MuSKに対するアゴニスト抗体mIgG2a-X17が、hIgG-X17との組合せで、若いDok7 1124_1127 dupマウスをレスキューすることが実証される。
(実施例6)
MuSKアゴニスト抗体hIgG-X17
MuSKアゴニスト抗体hIgG-X17がシナプスでMuSKに会合するかどうかを決定するために、P40の野生型マウスに、MuSKアゴニスト抗体hIgG-X17(0、2、10、20mg/kg)を腹腔内注射した。2日後、マウスを屠殺し、横隔膜筋をAlexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、Alexa647ヤギ抗ヒトIgG、F(ab')2断片特異的で染色してXI7を標識した。シナプスにおけるX17の飽和レベルを、X17対AChRのシグナル強度の比によって測定した。図27のグラフは、MuSKアゴニスト抗体hIgG-X17がシナプスでMuSKと会合し、MuSKを20mg/kgで飽和させることを示す。
次に、hIgG-X17が若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューするかどうかを調べるために、混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4で、アゴニスト抗体hIgG-X17又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。未処置マウスと同様に、アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)は、生後1～2週間で死亡したが、P4、P18、及びP38でhIgG-X17を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=4)は、成体として生存した(図28A)。更に、P4で20mg/kgのhIgG-X17、及びP18及びP38で10mg/kgのhIgG-X17を注射したDok7 1124_1127 dupマウスは、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なって、体重が増加した(図28B)。
hIgG-X17が若いDok7 1124_1127 dupマウスのシナプス発達を回復させるかどうかを評価するために、P60の野生型及びDok7 1124_1127 dupマウス由来の横隔膜筋をAlexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、βIIIチューブリン/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経終末を標識した(図29)。hIgG-X17で処置したDok7 1124_1127 dupマウスにおいて、シナプスは、単純なプラーク様形状から、成熟したマウス神経筋シナプスに特徴的な複雑なプレッツェル様形状に成熟し(図29の免疫組織化学画像を参照)、シナプス数、シナプスサイズ、及びシナプスAChRの密度は、それぞれ正常レベルの70%、50%、及び40%に回復した(図29のグラフを参照)。
hIgG-X17は、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時によって評価されるように、Dok7 1124_1127 dupマウスの運動機能をレスキューした(図30)。
次に、hIgG-X17が、Dok7 1124_1127 dupマウスにおいて成体期に発症する神経筋の欠陥を好転させることができるかどうかを評価した。簡潔に述べると、Dok7 1124_1127 dupマウスに、P4、p24、及びP44、又はP4、P18のいずれかでMuSKアゴニスト抗体を注射した後、抗体処置を中止した。これらのDok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し、数カ月にわたって運動性を維持したが、最終的には体重が減少し始め(図31A、図31B)、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時によって評価されるように、運動障害を示し始めた(図31C)。次いで、マウスに、hIgG-X17を再注射しないか(図31A)、又は再注射した(図31B)。更なる用量の抗体を受けなかったマウスは、数日以内に死亡し(図31A)、別のX17処置を受けたマウスでは、Dok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し始め(図31B)、処置の再開後1週間までに、その運動障害が好転した(図31C)。Dok7 1124_1127 dupマウスは、ロータロッドでのパフォーマンスを3.25倍向上させたが、野生型マウスのパフォーマンスは、1.30倍向上した(図31C)。Dok7 1124_1127 dupマウスは、その握力が1.30倍向上したが、野生型マウスのパフォーマンスは向上しなかった(図31C)。
(実施例7)
MuSKアゴニスト抗体3B2
野生型マウスにおけるMuSKアゴニスト抗体3B2の長期注射が生存又は体重増加に影響を及ぼすかどうかを決定するために、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドマウスに、P4及びP18で3B2を注射し(n=3)、注射しなかったC57BL/6-CBA混合バックグラウンドマウス(n=4)と比較した。3B2注射野生型マウスは、未注射野生型マウスと同様に、P38での屠殺まで生存し(図32A)、未注射野生型マウスと同様に体重が増加した(図32B)。
次に、3B2が若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューするかどうかを調べるために、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4に、MuSKアゴニスト抗体3B2又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡したが、P4で20mg/kgの3B2、P18で10mg/kgの3B2、及びP38で10mg/kgの3B2を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=3)は、成体として生存した(図33A)。更に、P4で20mg/kgの3B2、P18で10mg/kgの3B2、及びP38で20mg/kgの3B2を注射したDok7 1124_1127 dupマウスは、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なり、体重が増加した(図33B)。
3B2が若いDok7 1124_1127 dupにおけるシナプス発達を回復させるかどうかを評価するために、P60の野生型及びDok7 1124_1127 dupマウスからの横隔膜筋をAlexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、βIIIチューブリン/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経末端を標識した(図34)。3B2で処置したDok7 1124_1127 dupマウスにおいて、シナプスは、単純なプラーク様形状から、成熟したマウス神経筋シナプスに特徴的な複雑なプレッツェル様形状に成熟し(図34の免疫組織化学画像を参照)、シナプス数、シナプスサイズ、及びシナプスAChRの密度は、それぞれ正常レベルの80%、75%、及び40%に回復した(図34のグラフを参照)。
3B2は、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時によって評価されるように、Dok7 1124_27 dupマウスの運動パフォーマンスをレスキューする(図35)。更に、P4、P18及びP38でのMuSKアゴニスト抗体3B2の注射は、Dok7 1124_27 dupマウスを少なくとも2カ月間、健康に維持する(図36)。
次に、3B2が成体Dok7 1124_27 dupマウスにおける疾患再発を好転させることができるかどうかを評価した。簡潔に述べると、Dok7 1124_27 dupマウスに、P4、P24及びP44で10mg/kgのmIgG2a-X-17を注射した。Dok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し、数カ月間その運動性を維持したが、最終的には体重が減少し始めた(図37)。次いで、マウスに、10mg/kgの3B2を注射した(図37)。3B2による処置を再開した後、このDok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し始めた(図37)。
(実施例8)
MuSKアゴニスト抗体hIgG-X2
野生型マウスにおけるMuSKアゴニスト抗体hIgG-X2の長期注射が生存又は体重増加に影響を及ぼすかどうかを決定するために、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドマウスにP4及びP18にhIgG-X2を注射し(n=3)、注射しなかったC57BL/6-CBA混合バックグラウンドマウス(n=4)と比較した。hIgG-X2を注射した野生型マウスは、注射しなかった野生型マウスと同様に、P38での屠殺まで生存し(図38A)、注射しなかった野生型マウスと同様に体重が増加した(図38B)。
次に、hIgG-X2が若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューするかどうかを調べるために、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4に、MuSKアゴニスト抗体hIgG-X2又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡したが、P4で20mg/kgのhIgG-X2及びP18で10mg/kgのhIgG-X2を注射したDok7 1124_1127 dupマウスは成体として生存した(n=2)(図39A)。更に、P4で20mg/kgのhIgG-X2、及びP18で10mg/kgのhIgG-X2を注射したDok7 1124_1127 dupマウスは、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なり、体重が増加した(図39B)。
次に、hIgG-X2が、成体Dok7 1124_1127 dupマウスの疾患再発を好転させることができるかどうかを評価した。簡単に述べると、Dok7 1124_1127 dupマウスに、P4で20mg/kgのhIgG-X2、及びP18で10mg/kgのhIgG-X2を注射した。Dok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し、数カ月間その運動性を維持したが、最終的には体重が減少し始め(図40)、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時によって評価されるように、運動障害を示し始めた(図40B)。次いで、マウスに10mg/kgのhIgG-X2を注射した(図40A)。hIgG-X2での処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し始め(図40A)、その運動障害が完全に好転した(図40B)。
(実施例9)
MuSKアゴニスト抗体hIgG-X2m4
hIgG-X2m4が若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューするかどうかを調べるために、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4に、MuSKアゴニスト抗体hIgG-X2m4又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡したが、P4で20mg/kg hIgG-X2m4、及びP18で10mg/kg hIgG-X2m4を注射したDok7 1124_1127 dupマウスは、成体として生存した(n=3)(図41A)。更に、P4で20mg/kg hIgG-X2m4、及びP18で10mg/kg hIgG-X2m4を注射したDok7 1124_1127 dupマウスは、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なり、体重が増加した(図41b)。更に、P4で20mg/kgのhIgG-X2m4、及びP18で10mg/kgのhIgG-X2m4を注射することで、Dok7 1124_1127 dupマウスは少なくとも2カ月間健康を維持する(図42)。
(実施例10)
MuSKアゴニスト抗体mIgG2a-X3
野生型マウスにおけるMuSKアゴニスト抗体mIgG2a-X3の注射が生存又は体重増加に影響を及ぼすかどうかを決定するために、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドマウスに、P4、p24及びP44にて10mg/kgのmIgG2a-X3を注射し(n=2)、注射しなかったC57BL/6-CBA混合バックグラウンドマウス(n=9)と比較した。mIgG2a-X3を注射した野生型マウスは、注射しなかった野生型マウスと同様にP60での屠殺まで生存し(図43A)、注射しなかった野生型マウスと同様に体重が増加した(図43B)。
mIgG2a-X3の注射が神経筋シナプスの組織に影響を及ぼすかどうかを評価するために、P60の野生型マウス及びmIgG2a-X3を注射した野生型マウスからの横隔膜筋をAlexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、βIIIチューブリン/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経終末を標識した(図44)。mIgG2a-X3で処置した野生型マウスにおいて、シナプスは、単純なプラーク様形状から、成熟マウス神経筋シナプスの特徴である複雑なプレッツェル様形状に成熟した(図44の免疫組織化学画像を参照)。野生型マウスにおけるmIgG2a-X3の注射は、シナプス数、シナプスサイズ、及びシナプスAChRの密度に影響を及ぼさなかった(図44のグラフを参照)。更に、野生型マウスにおけるmIgG2a-X3の長期注射は、握力及び回転ロータロッドから落下するまでの潜時によって評価されるように、運動挙動に影響を与えない(図45)。
mIgG2a-X3が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューするかどうかを調べるために、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4に、10mg/kgのmIgG2a-X3又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)と、mIgG2a-X3を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=4)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡した(図46A～図46B)。図46A～図46Bの結果は、P4に10mg/kgで投与されたMuSKアゴニスト抗体mIgG2a-X3が、モタビズマブと比較して、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性を数日間レスキューすることを実証する。
次に、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4に20mg/kgのmIgG2a-X3又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで、P18に10mg/kgのmIgG2a-X3又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dup マウス(n=11)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡したが、mIgG2a-X3を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=2)は屠殺まで生存した(図47A)。mIgG2a-X3を注射したDok7 1124_1127 dupマウスは、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なり、体重が増加した(図47B)。更に、P4に20mg/kgのmIgG2a-X3、及びP18に10mg/kgのmIgG2a-X3を注射することは、Dok7 1124_1127 dupマウスを少なくとも2カ月間、健康に維持する(図47B、図48)。
(実施例11)
MuSKアゴニスト抗体mIgG2a-X9
mIgG2a-X9が、若いDok7 1124_1127 dupマウスにおいて致死性をレスキューするかどうかを調べるために、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4、P24及びP44に10mg/kgのMuSKアゴニスト抗体mIgG2a-X9又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)、及びmIgG2a-X9を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=5)の多くは、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡した(図49A)。mIgG2a-X9を注射した1匹のDok7 1124_1127 dupマウスは、P60まで生存した(図49A)。同様に、mIgG2a-X9を注射したほとんどのDok7 1124_1127 dupマウスは、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスと同様に、体重が増加しなかった(図49B)。しかしながら、図49Bは、mIgG2a-X9を注射した1匹のDok7 1124_1127 dupマウスが、経時的に体重が増加したことを示す。
(実施例12)
MuSKアゴニスト抗体3B2g2m1
MuSKアゴニスト抗体3B2g2m1がシナプスでMuSKに会合するかどうかを決定するために、P30野生型マウスに、MuSKアゴニスト3B2g2m1(0、2、10、20mg/kg)を腹腔内注射した。2日後、マウスを屠殺し、横隔膜筋をAlexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、Alexa647ヤギ抗ヒトIgG, F(ab')2断片特異的で染色して3B2g2m1を標識した。シナプスにおける3B2g2m1の飽和レベルを、3B2g2m1対AChRのシグナル強度の比によって測定した。図50のグラフは、MuSKアゴニスト抗体3B2g2m1がシナプスでMuSKと会合し、MuSKを20mg/kgで飽和させることを示す。
野生型マウスにおけるMuSKアゴニスト抗体3B2g2m1の長期注射が生存又は体重増加に影響を及ぼすかどうかを決定するために、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドマウスに、P4、P24、及びP44にて10mg/kgの3B2g2m1(n=6)を注射し、P4、P24、及びP44に10mg/kgのアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブ(n=6)を注射したC57BL/6-CBA混合バックグラウンドマウスと比較した。3B2g2m1を注射されたマウスは、野生型マウスと同様に生存し、体重が増加した(図51A)。図51Bは、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドで、P4に開始して1週間に2回、20mg/kgの3B2g2m1(n=6)を注射した野生型マウスが、P4に開始して1週間に2回、20mg/kgのアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブ(n=6)を注射された野生型マウスと同様に生存し、体重が増加したことを実証する。これらの結果は、野生型マウスにおける3B2g2m1の長期注射が、生存又は体重増加に影響を及ぼさないことを示している。
3B2g2m1が若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューするかどうかを調べるために、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4に、MuSKアゴニスト抗体3B2g2m1又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。アイソタイプ対照を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=11)は、未処置マウスと同様に、生後1～2週間で死亡したが、P4、P18及びP38に3B2g2m1を注射したDok7 1124_1127 dupマウス(n=10)は、成体として生存した(図52A)。更に、P4に20mg/kgの3B2g2m1並びにP18及びP38に10mg/kgの3B2g2m1を注射したDok7 1124_1127 dupマウスは、アイソタイプ対照抗体で処置したDok7 1124_1127 dupマウスとは異なって、体重が増加した(図52b)。
3B2g2m1が若いDok7 1124_1127 dupマウスにおけるシナプス発達を回復させるかどうかを評価するために、P60の野生型マウス及びDok7 1124_1127 dupマウス由来の横隔膜筋をAlexa488-α-BGTで染色してAChRを標識し、βIIIチューブリン/シナプシンに対する抗体で染色して運動軸索/神経終末を標識した(図53)。3B2g2m1で処置したDok7 1124_1127 dupマウスにおいて、シナプスは、単純なプラーク様形状から、成熟したマウス神経筋シナプスに特徴的な複雑なプレッツェル様形状に成熟し(図53の免疫組織化学画像を参照)、シナプス数、シナプスサイズ、及びシナプスAChRの密度は、それぞれ正常レベルの80%、50%、及び60%に回復した(図53のグラフを参照)。
3B2g2m1は、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時によって評価されるように、Dok7 1124_27 dupマウスの運動パフォーマンスをレスキューする(図54)。更に、P4、P18、及びP38での3B2g2m1の注射は、Dok7 1124_27 dupマウスを、少なくとも2カ月間、健康に維持したが、最終的にマウスは体重が減少し始めた(図55)。しかしながら、初期体重減少後の5mg/kg又は10mg/kgのいずれかの3B2g2m1の投与は、処置したDok7 1124_1127 dupマウスの体重を増加させた(図55)。
次に、3B2g2m1が成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおける疾患再発を好転させることができるかどうかを評価した。簡潔に述べると、Dok7 1124_1127 dupマウスに、P4、P18、及びP38で3B2g2m1を注射した。Dok7 1124_1127 dupマウスは、体重が増加し、数カ月間その運動性を維持したが、最終的には、握力及び回転するロータロッドから落下するまでの潜時によって評価されるように、体重が減少し(図56A)、運動障害を示し始めた(図56B)。このとき、マウスに3B2g2m1を再注射した(図56B)。3B2g2m1処置を再開した後、Dok7 1124_1127 dupマウスは体重が増加し始め(図56A)、処置の再開後1週間までに、その運動障害が好転した(図56B)。Dok7 1124_1127 dup マウスは、ロータロッドでのパフォーマンスが5.5倍向上し、握力が1.1倍向上した(図56C)。これらの結果は、3B2g2m1が成体Dok7 1124_1127 dupマウスにおける疾患再発を好転させることを実証する。
長期3B2g2m1が若いDok7 1124_1127 dupマウスにおける致死性をレスキューするかどうかを調べるために、C57BL/6-CBA混合バックグラウンドのDok7 1124_1127 dupマウスを、P4に開始して1週間に2回、20mg/kgのMuSKアゴニスト抗体3B2g2m1又はアイソタイプ等価陰性対照であるモタビズマブで処置した。3B2g2m1(n=4)を注射したDok7 1124_1127 dup マウスは、成体として生存し、体重が増加した(図57)。
図58A～図58Cは、示されるMuSKアゴニスト抗体の注射が、Dok7 1124_1127 dupマウスの生存を延長させることを実証する。図58Aは、示されるMuSKアゴニスト抗体又はアイソタイプ対照(モタビズマブ)をP4(20mg/kg)、P18(10mg/kg)、P38(10mg/kg)に注射し、次いで抗体処置を中止したDok7 1124_1127 dupマウスの生存プロットである。図58Bは、示されるMuSKアゴニスト抗体又はアイソタイプ対照(モタビズマブ)をP4(20mg/kg)、P18(10mg/kg)に注射し、次いで抗体処置を中止したDok7 1124_1127 dupマウスの生存プロットである。図58Cは、体重減少の数日後に、MuSKアゴニスト抗体(10mg/kg)で再注射(処置を再開)し、次いで、抗体処置を中止したDok7 1124_1127 dupマウスの生存プロットである。
好ましい実施形態を、本明細書で詳細に記載及び説明しているが、様々な修正、追加、置換等を本発明の趣旨から逸脱することなく行いうることは当業者には明らかであり、したがって、それらは、以下の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられる。

Claims (41)

  1. ヒト筋特異的チロシン-タンパク質キナーゼ(MuSK)のエピトープに結合する抗体ベースの分子であって、前記エピトープが、配列番号130のMuSK Frizzled(Fz)様ドメイン配列に存在し、前記抗体ベースの分子が、そのエピトープに結合するとMuSKリン酸化を誘導する、抗体ベースの分子。
  2. 前記抗体ベースの分子が、中性pH条件下で、酸性pH条件下よりも高い親和性で前記MuSK Fz様ドメインに結合する、請求項1に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  3. 前記抗体ベースの分子が、前記MuSK Fz様ドメインに結合する際、アグリン誘導性MuSKリン酸化を阻害しない、請求項1又は2に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  4. 前記抗体ベースの分子が、前記MuSK Fz様ドメインに結合すると、アグリン誘導性MuSKリン酸化を増強する、請求項1又は2に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  5. 前記抗体ベースの分子が、
    配列番号147、1～16、135、136、148、149のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号147、1～16、135、136、148、若しくは149のいずれか1つの修飾アミノ酸配列であって、前記修飾配列が、配列番号147、1～16、135、136、148、若しくは149のいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有する、修飾アミノ酸配列を含む相補性決定領域1(CDR-H1)、
    配列番号153、17～32、137、138、150、151、154、155のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号153、17～32、137、138、150、151、154、若しくは155のいずれか1つの修飾アミノ酸配列であって、前記修飾配列が、配列番号153、17～32、137、138、150、151、154、若しくは155のいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有する、修飾アミノ酸配列を含む相補性決定領域2(CDR-H2)、及び
    配列番号156、33～48、139、140、157～158、240～251のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号156、33～48、139、140、157～158、240～251のいずれか1つの修飾アミノ酸配列であって、前記修飾配列が、配列番号156、33～48、139、140、157～158、若しくは240～251のいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有する、修飾アミノ酸配列を含む相補性決定領域3(CDR-H3)
    を含む重鎖可変領域を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  6. 前記重鎖可変領域が、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号1のCDR-H1、配列番号17のCDR-H2、及び配列番号33のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、及び配列番号34のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号3のCDR-H1、配列番号19のCDR-H2、及び配列番号35のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号4のCDR-H1、配列番号20のCDR-H2、及び配列番号36のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号5のCDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号37のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号6のCDR-H1、配列番号22のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号7のCDR-H1、配列番号23のCDR-H2、及び配列番号39のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号8のCDR-H1、配列番号24のCDR-H2、及び配列番号40のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号9のCDR-H1、配列番号25のCDR-H2、及び配列番号41のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号10のCDR-H1、配列番号26のCDR-H2、及び配列番号42のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号11のCDR-H1、配列番号27のCDR-H2、及び配列番号43のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号12のCDR-H1、配列番号28のCDR-H2、及び配列番号44のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号13のCDR-H1、配列番号29のCDR-H2、及び配列番号45のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号14のCDR-H1、配列番号30のCDR-H2、及び配列番号46のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号15のCDR-H1、配列番号31のCDR-H2、及び配列番号47のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号16のCDR-H1、配列番号32のCDR-H2、及び配列番号48のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、及び配列番号139のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに
    配列番号136のCDR-H1、配列番号138のCDR-H2、及び配列番号140のCDR-H3を含む重鎖可変領域
    からなる群から選択される、請求項5に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  7. 前記重鎖可変領域が、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号148のCDR-H1、配列番号151のCDR-H2、及び配列番号157のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号149のCDR-H1、配列番号152のCDR-H2、及び配列番号158のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号154のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号155のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに
    配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域
    からなる群から選択される、請求項5に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  8. 前記抗体ベースの分子の前記重鎖可変領域が、ヒト又はヒト化免疫グロブリンの重鎖フレームワーク領域を更に含む、請求項5から7のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  9. 前記分子が、
    配列番号97と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号99と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号101と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号103と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号105と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号107と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号109と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号111と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号113と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号115と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号117と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号119と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号121と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号123と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号125と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号127と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号131と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号133と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号252と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号253と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号254と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号255と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号256と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号257と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号258と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号259と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号260と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号261と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号262と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
    配列番号263と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  10. 前記分子が、
    配列番号196と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号198と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号200と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号202と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号204と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号206と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号208と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号210と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号212と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号214と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号216と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号218と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号220と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号222と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号224と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号226と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号228と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号230と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号232と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号234と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    配列番号236と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
    配列番号238と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  11. 前記抗体が、二価又は多価の単一ドメイン抗体である、請求項1から10のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  12. 前記抗体ベースの分子が、軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域が、
    配列番号159、49～64、141、142、160～169のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号159、49～64、141、142、若しくは160～169のいずれか1つの修飾アミノ酸配列であって、前記修飾配列が、配列番号159、49～64、141、142、若しくは160～169のいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有する、修飾アミノ酸配列を有する相補性決定領域1(CDR-L1)、
    配列番号172、65～80、143、144、170、171、173～179のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号172、65～80、143、144、170、171、若しくは173～179のいずれか1つの修飾アミノ酸配列であって、前記修飾配列が、配列番号172、65～80、143、144、170、171、若しくは173～179のいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有する、修飾アミノ酸配列を有する相補性決定領域2(CDR-L2)、及び
    配列番号195、81～96、145、146、180～194のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号195、81～96、145、146、若しくは180～194のいずれか1つの修飾アミノ酸配列であって、前記修飾配列が、配列番号195、81～96、145、146、若しくは180～194のいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有する、修飾アミノ酸配列を有する相補性決定領域3(CDR-L3)
    を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  13. 前記軽鎖可変領域が、
    配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号195のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号49のCDR-L1、配列番号65のCDR-L2、及び配列番号81のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号50のCDR-L1、配列番号66のCDR-L2、及び配列番号82のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号51のCDR-L1、配列番号67のCDR-L2、及び配列番号83のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号52のCDR-L1、配列番号68のCDR-L2、及び配列番号84のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号53のCDR-L1、配列番号69のCDR-L2、及び配列番号85のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号54のCDR-L1、配列番号70のCDR-L2、及び配列番号86のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号55のCDR-L1、配列番号71のCDR-L2、及び配列番号87のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号56のCDR-L1、配列番号72のCDR-L2、及び配列番号88のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号57のCDR-L1、配列番号73のCDR-L2、及び配列番号89のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号58のCDR-L1、配列番号74のCDR-L2、及び配列番号90のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号59のCDR-L1、配列番号75のCDR-L2、及び配列番号91のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号60のCDR-L1、配列番号76のCDR-L2、及び配列番号92のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号61のCDR-L1、配列番号77のCDR-L2、及び配列番号93のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号62のCDR-L1、配列番号78のCDR-L2、及び配列番号94のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号63のCDR-L1、配列番号79のCDR-L2、及び配列番号95のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号64のCDR-L1、配列番号80のCDR-L2、及び配列番号96のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号141のCDR-L1、配列番号143のCDR-L2、及び配列番号145のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号142のCDR-L1、配列番号144のCDR-L2、及び配列番号146のCDR-L3を含む軽鎖可変領域
    からなる群から選択される、請求項12に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  14. 前記軽鎖可変領域が、
    配列番号159のCDR-L1、配列番号170のCDR-L2、及び配列番号180のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号159のCDR-L1、配列番号171のCDR-L2、及び配列番号181のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号160のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号182のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号159のCDR-L1、配列番号171のCDR-L2、及び配列番号184のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号159のCDR-L1、配列番号173のCDR-L2、及び配列番号185のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号159のCDR-L1、配列番号173のCDR-L2、及び配列番号186のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号161のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号187のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号162のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号188のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号163のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号188のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号164のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号189のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号165のCDR-L1、配列番号175のCDR-L2、及び配列番号190のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号166のCDR-L1、配列番号176のCDR-L2、及び配列番号191のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号167のCDR-L1、配列番号177のCDR-L2、及び配列番号192のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号168のCDR-L1、配列番号178のCDR-L2、及び配列番号193のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号169のCDR-L1、配列番号179のCDR-L2、及び配列番号194のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、並びに
    配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域
    からなる群から選択される、請求項12に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  15. 前記抗体ベースの分子の前記軽鎖可変領域が、ヒト又はヒト化免疫グロブリンの重鎖フレームワーク領域を更に含む、請求項13又は14に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  16. 前記抗体又はその結合断片が、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号195のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号1のCDR-H1、配列番号17のCDR-H2、及び配列番号33のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号49のCDR-L1、配列番号65のCDR-L2、及び配列番号81のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号2のCDR-H1、配列番号18のCDR-H2、並びに配列番号34及び240～247のうちのいずれか1つのCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号50のCDR-L1、配列番号66のCDR-L2、及び配列番号82のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号3のCDR-H1、配列番号19のCDR-H2、及び配列番号35のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号51のCDR-L1、配列番号67のCDR-L2、及び配列番号83のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号4のCDR-H1、配列番号20のCDR-H2、及び配列番号36のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号52のCDR-L1、配列番号68のCDR-L2、及び配列番号84のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号5のCDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号37のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号53のCDR-L1、配列番号69のCDR-L2、及び配列番号85のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号6のCDR-H1、配列番号22のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号54のCDR-L1、配列番号70のCDR-L2、及び配列番号86のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号7のCDR-H1、配列番号23のCDR-H2、及び配列番号39のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号55のCDR-L1、配列番号71のCDR-L2、及び配列番号87のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号8のCDR-H1、配列番号24のCDR-H2、及び配列番号40のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号56のCDR-L1、配列番号72のCDR-L2、及び配列番号88のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号9のCDR-H1、配列番号25のCDR-H2、及び配列番号41のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号57のCDR-L1、配列番号73のCDR-L2、及び配列番号89のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号10のCDR-H1、配列番号26のCDR-H2、及び配列番号42のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号58のCDR-L1、配列番号74のCDR-L2、及び配列番号90のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号11のCDR-H1、配列番号27のCDR-H2、及び配列番号43のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号59のCDR-L1、配列番号75のCDR-L2、及び配列番号91のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号12のCDR-H1、配列番号28のCDR-H2、及び配列番号44のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号60のCDR-L1、配列番号76のCDR-L2、及び配列番号92のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号13のCDR-H1、配列番号29のCDR-H2、及び配列番号45のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号61のCDR-L1、配列番号77のCDR-L2、及び配列番号93のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号14のCDR-H1、配列番号30のCDR-H2、及び配列番号46のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号62のCDR-L1、配列番号78のCDR-L2、及び配列番号94のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号15のCDR-H1、配列番号31のCDR-H2、及び配列番号47のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号63のCDR-L1、配列番号79のCDR-L2、及び配列番号95のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号16のCDR-H1、配列番号32のCDR-H2、及び配列番号48のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号64のCDR-L1、配列番号80のCDR-L2、及び配列番号96のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号135のCDR-H1、配列番号137のCDR-H2、並びに配列番号139及び248～251のうちのいずれか1つのCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号141のCDR-L1、配列番号143のCDR-L2、及び配列番号145のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、並びに
    配列番号136のCDR-H1、配列番号138のCDR-H2、及び配列番号140のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号142のCDR-L1、配列番号144のCDR-L2、及び配列番号146のCDR-L3を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  17. 前記抗体又はその結合断片が、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号170のCDR-L2、及び配列番号180のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号171のCDR-L2、及び配列番号181のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号160のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号182のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号171のCDR-L2、及び配列番号184のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号173のCDR-L2、及び配列番号185のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号173のCDR-L2、及び配列番号186のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号148のCDR-H1、配列番号151のCDR-H2、及び配列番号157のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号161のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号187のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号148のCDR-H1、配列番号151のCDR-H2、及び配列番号157のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号162のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号188のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号148のCDR-H1、配列番号151のCDR-H2、及び配列番号157のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号163のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号188のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号148のCDR-H1、配列番号151のCDR-H2、及び配列番号157のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号164のCDR-L1、配列番号174のCDR-L2、及び配列番号189のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号149のCDR-H1、配列番号152のCDR-H2、及び配列番号158のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号165のCDR-L1、配列番号175のCDR-L2、及び配列番号190のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号149のCDR-H1、配列番号152のCDR-H2、及び配列番号158のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号166のCDR-L1、配列番号176のCDR-L2、及び配列番号191のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号149のCDR-H1、配列番号152のCDR-H2、及び配列番号158のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号167のCDR-L1、配列番号177のCDR-L2、及び配列番号192のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号149のCDR-H1、配列番号152のCDR-H2、及び配列番号158のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号168のCDR-L1、配列番号178のCDR-L2、及び配列番号193のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号149のCDR-H1、配列番号152のCDR-H2、及び配列番号158のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号169のCDR-L1、配列番号179のCDR-L2、及び配列番号194のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号154のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号155のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号154のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号195のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、並びに
    配列番号147のCDR-H1、配列番号155のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号195のCDR-L3を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  18. 前記抗体ベースの分子が、
    配列番号234と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号235と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号228と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号229と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号230と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号231と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号232と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号233と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号236と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号237と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに
    配列番号238と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号239と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  19. 前記抗体ベースの分子が、
    配列番号97と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号98と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号99及び252～259のうちのいずれか1つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号100と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号101と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号102と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号103と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号104と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号105と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号106と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号107と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号108と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号109と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号110と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号111と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号112と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号113と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号114と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号115と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号116と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号117と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号118と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号119と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号120と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号121と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号122と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号123と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号124と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号125と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号126と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号127と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号128と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号131及び260～263のうちのいずれか1つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号132と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに
    配列番号133と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号134と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  20. 前記抗体ベースの分子が、
    配列番号196と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号197と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号198と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号199と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号200と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号201と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号202と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号203と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号204と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号205と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号206と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号207と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号208と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号209と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号210と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号211と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号212と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号213と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号214と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号215と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号216と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号217と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号218と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号219と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号220と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号221と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号222と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号223と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    配列番号224と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号225と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに
    配列番号226と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号227と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  21. 前記抗体ベースの分子が、キメラ抗体又はそのエピトープ結合断片である、請求項1から20のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  22. 前記抗体ベースの分子が、ヒト化抗体又はそのエピトープ結合断片である、請求項1から21のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  23. 前記抗体ベースの分子が、モノクローナル抗体又はそのエピトープ結合断片である、請求項1から22のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  24. 前記抗体ベースの分子が、全長抗体、抗体のエピトープ結合断片、又は抗体誘導体である、請求項1から23のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  25. 前記抗体ベースの分子が、F(ab)断片、F(ab')断片、及びF(ab')2断片から選択されるエピトープ結合断片である、請求項24に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  26. 前記抗体ベースの分子が、scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディからなる群から選択される抗体誘導体である、請求項24に記載のMuSK抗体ベースの分子。
  27. 請求項1から26のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子をコードする単離ポリヌクレオチド。
  28. 請求項27に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
  29. 請求項28に記載のベクターを含む宿主細胞。
  30. 請求項1から26のいずれか一項に記載のMuSK抗体ベースの分子、請求項27に記載のポリヌクレオチド、又は請求項28に記載のベクターと、
    薬学的に許容される担体と
    を含む医薬組成物。
  31. それを必要とする対象における筋特異的チロシン-タンパク質キナーゼ(MuSK)シグナル伝達を増加させる方法であって、前記方法が、
    請求項30に記載の医薬組成物を前記対象に投与する工程を含み、前記組成物が、前記投与前の前記対象におけるMuSKシグナル伝達と比較して前記対象におけるMuSKシグナル伝達を増加させるために有効な量で投与される、方法。
  32. 前記対象が、神経筋障害を有する、請求項31に記載の方法。
  33. 前記神経筋障害が、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、重症筋無力症(MG)、先天性筋無力症、MuSK-MG、脊髄筋萎縮症(SMA)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)、シャルコー・マリー・トゥース病(CMT)、遠位遺伝性運動ニューロパシー(dHMN)、デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)、肢帯筋ジストロフィー(LGMD)、先天性筋ジストロフィー(CMD)、サルコペニア(SP)、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィーから選択される、請求項32に記載の方法。
  34. 前記神経筋障害が、先天性筋無力症である、請求項33に記載の方法。
  35. 前記先天性筋無力症が、DOK7媒介性先天性筋無力症である、請求項34に記載の方法。
  36. 前記医薬組成物が、MuSK抗体ベースの分子を含み、前記抗体ベースの分子が、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号195のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号153のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号154のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、
    配列番号147のCDR-H1、配列番号154のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号195のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、又は
    配列番号147のCDR-H1、配列番号150のCDR-H2、及び配列番号156のCDR-H3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号159のCDR-L1、配列番号172のCDR-L2、及び配列番号183のCDR-L3を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項31から35のいずれか一項に記載の方法。
  37. 対象における先天性筋無力症を治療する方法であって、前記方法が、
    先天性筋無力症を有する対象に、筋特異的チロシン-タンパク質キナーゼ(MuSK)アゴニストを、MuSKリン酸化を増強させるために有効な量で投与し、それによって前記対象における先天性筋無力症を治療する工程を含む、方法。
  38. 前記MuSKアゴニストが、MuSKアゴニスト抗体である、請求項37に記載の方法。
  39. 前記MuSKアゴニスト抗体が、配列番号130のMuSK Frizzled様ドメイン配列に結合する、請求項38に記載の方法。
  40. 前記先天性筋無力症が、DOK7媒介性先天性筋無力症である、請求項37に記載の方法。
  41. 対象における先天性筋無力症を治療する方法であって、前記方法が、
    先天性筋無力症を有する対象に、請求項30に記載の医薬組成物を投与し、それによって前記対象における先天性筋無力症を治療する工程を含む、方法。
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