CN115843268A - 治疗性MuSK抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及能够与人肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)结合并将其激活的基于抗体的分子，包括全长抗体、其抗原结合结构域和抗体衍生物。本发明还公开了使用前述MuSK抗体来治疗神经肌肉病症的方法。
Description
本申请要求于2020年4月17日提交的美国临时专利申请序列号63/011,986、2020年6月12日提交的美国临时专利申请序列号63/038,633以及2020年11月11日提交的美国临时专利申请序列号63/112,375的权益，其在此通过引用整体并入。
技术领域
本发明涉及能够与人肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)结合并将其激活的基于抗体的分子，包括全长抗体、其抗原结合结构域和抗体衍生物。本发明还公开了使用前述MuSK抗体来治疗神经肌肉病症的方法。
背景技术
肌肉特异性激酶(muscle-specific kinase，MuSK)是用于建立和维持神经肌肉接头(NMJ)的必需受体酪氨酸激酶。突触蛋白聚糖(神经元来源的硫酸肝素蛋白聚糖)和LRP4(突触蛋白聚糖受体)对MuSK的激活导致NMJ突触后侧上的乙酰胆碱受体(acetylcholinereceptor，AChR)聚集，从而实现神经肌肉传递和肌肉收缩。MuSK的胞外结构域包含三个免疫球蛋白样结构域(Ig样结构域1至3)和与卷曲蛋白(Wnt受体)中的那些相关的半胱氨酸富集结构域(Fz-CRD)。
许多神经肌肉病症以受损的NMJ为特征。由于MuSK信号传导对于建立和维持突触的重要性，人们很容易推测出刺激MuSK可对这些病症具有治疗潜力。根据这一假设，在肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)小鼠模型中，显示MuSK过表达保持神经支配和运动功能超过一个月。另外，使用噬菌体展示鉴定了数种单克隆MuSK结合scFv。其中一种MuSK结合剂以(鼠化的)IgG形式产生，并且还在ALS小鼠中进行了测试(Cantor etal.,“Preserving Neuromuscular Synapses in ALS by Stimulating MuSK with aTherapeutic Agonist Antibody,”Elife 7:e34375(2018)和Sengupta-Ghosh et al.,“Muscle Specific Kinase(MuSK)Activation Preserves Neuromuscular Junctions inthe Diaphragm but is not Sufficient to Provide a Functional Benefit in theSOD1G93A Mouse Model of ALS,”Neurobiol.Dis.124:340-352(2019))。二者均在SOD1-G93A小鼠中研究了被动转移抗体#13，并且表明与经模拟处理的小鼠相比，用抗体#13处理改善了NMJ的神经支配并减慢了肌肉去神经支配。Cantor et al.,“PreservingNeuromuscular Synapses in ALS by Stimulating MuSK with a Therapeutic AgonistAntibody,”Elife 7:e34375(2018)进一步表明运动神经元存活和肌肉功能得到改善，从而略微延长了寿命。这些研究表明，MuSK激动剂在ALS小鼠中至少能够保持神经肌肉突触的结构完整性，需要更多的研究来确定肌肉功能的改善。评价MuSK激动性抗体在其他神经肌肉病症中的治疗潜力似乎是重要的新研究方向(Vergoossen et al.,“MuSK Antibodies,Lessons Learned from Poly-and Monoclonality,”J.Autoimmun.112:102488(2020))。
本发明旨在克服这种缺陷和本领域中的其他缺陷。
附图说明
图1A至1D表明了Dok7的C端区域对于突触分化至关重要。图1A是示出了Dok7中的pleckstrin同源(pleckstrin Homology，PH)和磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域的示意图，所述结构域介导Dok7二聚化并与酪氨酸磷酸化的MuSK结合。C端区域包含两个酪氨酸残基Y396和Y406，它们在将Dok7募集至MuSK之后被磷酸化。Dok7 1124_1127dup(本文中也称为Dok7 CM和Dok7CM/CM小鼠)小鼠(代表了在患有Dok7先天性肌无力的人中存在的最常见突变)导致Dok7蛋白的框移、提前终止和截短，包括缺失Y396和Y406。Dok7 Y396F；Y406F(Dok72YF)小鼠携带用苯丙氨酸替换Y396和Y406的突变。图1B示出了来源于互交Dok7CM/+C57BL/6小鼠的后代的卡方分析，显示Dok7CM/CM纯合小鼠在出生之后没有存活。相比之下，当在P5至P10进行基因分型时，Dok72YF/2YF小鼠以预期的数量存在。图1C示出了在E18.5来自野生型、Dok7CM/CM和Dok72YF/2YF小鼠的膈肌的荧光显微术图像，所述膈肌用Alexa 488-a-BGT染色以标记AChR(红色)和用针对神经丝/突触蛋白的抗体染色以标记运动轴突/神经末梢(绿色)。比例尺＝10μm。图1D示出了这样的图，其显示在E18.5，突触的数量、突触尺寸和突触AChR的密度分别降低至4.5分之一、4分之一和5分之一。在Dok72YF/2YF小鼠中，突触尺寸正常，但突触AChR的密度适度(15％)降低。Dok72YF/2YF小鼠中突触的形状经常出现拉长。所述图示出了每种基因型的3只小鼠的值和这些小鼠的平均值±SEM值(n.s.，不显著；p，****<0.00005)。
图2A至2D表明了在Dok7CM/CM小鼠中截短的Dok7表达不佳并且MuSK酪氨酸磷酸化严重降低。图2A至2B是其中从E18.5野生型、Dok7CM/+和Dok72YF/2YF小鼠的肌肉中免疫沉淀Dok7的免疫印迹。用针对Dok7的抗体探测印迹(图9A至9B)。图9A示出了由Dok7CM编码的截短的Dok7(t-Dok7)以预测的尺寸迁移，但表达水平是野生型Dok7的3倍低。简化了野生型和突变体蛋白的定量和比较，因为这两种蛋白质是从同一裂解物中共免疫沉淀的；通过比较野生型和Dok7CM/CM小鼠中的表达获得了类似的结果(图10A至10C)。散点图示出了来自每种基因型的八只小鼠的值和平均值±SEM值(p，****<0.00005)。图2B示出了突变的Dok7 Y396F；Y406F蛋白以预测尺寸迁移，并且表达与野生型Dok7相似。散点图示出了每种基因型的11只小鼠的值和平均值±SEM值(n.s.，不显著)。图2C至2D示出了从E18.5野生型、Dok7CM/CM和Dok72YF/2YF小鼠的肌肉中免疫沉淀出MuSK，并且用针对MuSK或磷酸酪氨酸的抗体探测印迹。对MuSK磷酸化进行定量并相对于MuSK表达进行归一化。图2C示出了MuSK磷酸化在Dok7CM/CM小鼠中是在野生型小鼠中的7倍低。散点图示出了每种基因型的7只小鼠的值和平均值±SEM值(p，****<0.00005)。图2D示出了MuSK酪氨酸磷酸化在Dok72YF/2YF和野生型小鼠中相似。散点图示出了每种基因型的5只小鼠的值和平均值±SEM值(n.s.，不显著)。
图3A至3D表明了Crk向突触和向MuSK/Dok7复合物的募集在Dok7CM/CM小鼠中受损。图3A是示出了在来自E18.5野生型小鼠的胫骨前肌横截面中，在突触处Crk-L(绿色)与AChR共定位的图像。Crk-L染色在Dok7CM/CM和Dok72YF/2YF小鼠中的突触部位持续存在，但在Dok7CM/CM小鼠的突触处募集显示减少。比例尺＝5μm。图3B示出了从E18.5野生型、Dok7CM/CM和Dok72YF/2YF小鼠的肌肉中免疫沉淀出MuSK，并且用针对MuSK或Crk的抗体探测印迹。将与MuSK复合物共分离的Crk水平相对于MuSK表达进行归一化。在Dok7CM/CM小鼠中，Crk与MuSK复合物的缔合降低了2.8倍；散点图示出了每种基因型的8只小鼠的值和平均值±SEM值(p，****<0.00005)。在Dok72YF/2YF小鼠中，Crk与MuSK复合物的缔合降低了24％；示出了4只小鼠的平均值±SEM值(p，*<0.05,****<0.00005)。图3C示出了MuSK近膜区(JM)包含Dok7的结合位点(SEQ ID NO:129的残基547至554)和Crk的潜在结合位点(SEQ ID NO:129的残基554至557)。图3D示出了其中从经转染的293T细胞中表达HA标记形式的Dok7或Crk-I的实验的结果。将来自MuSK JM的生物素标记的肽(SEQ ID NO:272至275)与来自经转染293T细胞的裂解物一起孵育。用链霉亲和素-琼脂糖珠捕获生物素标记的肽，并用针对HA和Crk的抗体探测分离蛋白质的印迹。Dok7和Crk二者均显示出与磷酸肽的结合均比与非磷酸化肽的结合更强。MuSK JM磷酸肽中共有(NPXY)PTB结合位点中第-3位处的关键天冬酰胺的突变阻止了Dok7的结合，但不阻止Crk的结合。相比之下，MuSK JM磷酸肽中共有SH2位点的突变阻止了Crk与MuSK JM磷酸肽的结合。
图4A至4F表明了针对MuSK的抗体以高亲和力结合人MuSK和小鼠MuSK，刺激所培养肌管中的MuSK磷酸化并在体内结合MuSK。图4A是示出了针对不同MuSK抗原的抗体克隆的KD值的表格，所述抗体克隆使用珠结合测定以单价Fab形式进行测试。KD值是来自n＝3的平均值和s.d.。图12A至12C给出了滴定。图4B示出了这样的实验的结果，在所述实验中将C2肌管用生物素化的Fab处理30分钟，包括阴性对照Fab(同种型)，其各自均通过与链霉亲和素预孵育而四聚化。对MuSK进行免疫沉淀，并用针对MuSK或磷酸酪氨酸(pTyr)的抗体探测Western印迹。将MuSK磷酸化相对于总MuSK表达进行归一化。散点图示出了每种Fab的值和平均值±SEM。图4C是示出了IgG抗体针对固定化hFz、hECD、mFz和mECD的KD值的表格，如使用基于珠的结合测定所测试的。KD值是来自n＝3的平均值和s.d.。12A至12C给出了滴定。图4D示出了这样的实验的结果，在所述实验中将C2肌管用0.5nM突触蛋白聚糖、10nM抗体X2、X3或X17(以小鼠IgG2a或人IgG1 Fc区)，或同种型对照进行处理，并如图4B中所述分析MuSK。散点图示出了相对于MuSK表达归一化的MuSK磷酸化的值，以及平均值±SEM。图4E是示出了X17-mIgG2a-LALAPG的血液半衰期测量值的图。示出了3只小鼠的以单指数曲线对中值荧光强度的非线性最小二乘拟合。半衰期确定为4.9±0.2天。图4F表明MuSK抗体mIgG2a-X17在突触处接合MuSK并以10mg/kg使MuSK饱和。将P30野生型小鼠腹膜内注射MuSK激动剂抗体mIgG2a-X17(0mg/kg、0.4mg/kg、2mg/kg、10mg/kg)。在两天之后，将小鼠处死并将膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记AChR以及用Alexa 647山羊抗人IgG，F(ab')2片段特异性进行染色以标记X17。通过X17与AChR信号强度之比来测量突触处mIgG2a-X17的饱和水平。示出了每个浓度下来自3只小鼠的平均值±SEM值。
图5A至5E表明了针对MuSK的激动剂抗体mIgG2a-X17在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中挽救致死。图5A示出了C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠在出生之后存活一至两周。在P4用激动剂抗体mIgG2a-X17或同种型等效阴性对照处理混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。与未经处理的小鼠一样，注射了同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)在出生之后一至两周死亡，而在P4、P24和P44注射了mIgG2a-X17的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝12)存活，成为成体。注射X17的12只突变体小鼠中有6只在P60时被处死；注射了X17的3只突变体小鼠在出生之后三周就在第二次计划注射之前死亡，并且使3只突变体小鼠变老以进行疾病复发实验。散点图示出了每只小鼠的存活时间和平均值±SEM值(p，****<0.00005)。图5B示出了不同于用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠，注射了mIgG2a-X17的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加。在P4、P24和P44对Dok7 1124_1127dup小鼠注射mIgG2a-X17(10mg/kg)。图5C表明在年轻的Dok7 1124_1127dup小鼠中mIgG2a-X17恢复突触发育。将来自P60野生型和Dok7 1124_1127小鼠的膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记AchR，以及用针对βIII微管蛋白/突触蛋白的抗体染色以标记运动轴突/神经末梢。在用mIgG2a-X17处理的Dok7 1124_1127dup小鼠中，突触从简单的斑块样形状成熟为复杂的椒盐卷饼样形状(pretzel-like shape)，这是成熟鼠神经肌肉突触的特征。比例尺＝10mm。在用mIgG2a-X17处理的Dok7 1124_1127dup小鼠中，突触的数量、突触尺寸和突触AChR的密度分别恢复至正常水平的60％、60％和68％。示出了来自3只小鼠(每只小鼠>50个突触)的平均值±SEM值(n.s.，**<0.005，****<0.00005)。图5D是示出了从用X17挽救的Dok7 1124_1127dup小鼠的胫骨前肌分离的单个肌纤维中，Crk-L(中间图)集中在突触处，由AChR(左图)和神经末梢(右图)标记。来自3只小鼠(每只小鼠10个突触)的平均值±SEM值(n.s.，不显著)。比例尺＝5μm。图5E是示出了mIgG2a-X17挽救Dok7 1124_1127dup小鼠的运动表现的图。用mIgG2a-X17处理完全恢复了Dok 1124_1127dup小鼠的运动表现，如通过握力和从旋转的转棒仪(rotarod)掉落的等待时间所评估的。散点图示出了18只野生型小鼠和用X17挽救的9只Dok7 1124_1127dup小鼠的值以及平均值±SEM值(n.s.，不显著)。
图6A至6C表明了mIgG2a-X17在成年Dok7 1124_1127dup小鼠中逆转疾病复发。在P4、P24和P44或在P4、P18对小鼠注射mIgG2a-X17(10mg/kg)，并随后中断抗体处理。这些Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加并且维持其运动性数个月，但最终开始体重减轻(图6A至6B)并表现出运动缺陷，如通过握力和从旋转的转棒仪掉落的等待时间所评估的(图6C)。此时，小鼠不进行再注射mIgG2a-X17(图6A)或再注射mIgG2a-X17(图6B)。未再注射的小鼠在数天内死亡(图6A)，而在重新开始mIgG2a-X17处理之后，Dok7 1124_1127dup小鼠开始体重增加(图6B)，并且在重新开始处理之后一周，它们的运动缺陷被逆转(图6C)。Dok7 1124_1127dup小鼠在转棒仪上的表现为5.5倍高，并且它们的握力为1.25倍高(p，*<0.05，***<0.0005(图6C)。
图7提供了Dok7 CM(即Dok7 1124_1127dup)小鼠中突触的终板宽度、去神经支配、共定位。终板带宽度(虚线)在Dok7CM/CM小鼠中提高了45％，但在Dok72YF/2YF小鼠中则正常。在Dok7CM/CM小鼠中，17％的AChR簇完全不受神经末梢的控制，表明肌纤维去神经支配。Dok7CM /CM小鼠中的许多突触部分地受到神经支配，因为突触处近一半的富集AChR的区域没有与神经末梢并列。示出了每种基因型的来自3只小鼠(每只小鼠100个突触)的平均值±SEM值(p，*<0.05；p，**<0.005；p，***<0.0005；p，****<0.00005；n.s.不显著)。比例尺＝50μm。
图8表明了Dok7羧基端区域中的Y396和Y406F对于神经肌肉突触的成熟是可有可无的。将来自P35野生型和Dok72YF/2YF小鼠的膈肌用Alexa488-a-BGT染色以标记AchR以及用针对神经丝/突触蛋白的抗体染色以标记运动轴突/神经末梢。比例尺＝10μm。在Dok72YF/2YF小鼠中，突触从斑块样成熟为复杂的椒盐卷饼样形状，这是成熟鼠神经肌肉突触的特征。野生型和Dok72YF/2YF小鼠的突触数量相似。突触AChR密度和突触尺寸在Dok72YF/2YF小鼠中分别比在野生型小鼠中大15％和20％。示出了来自3只小鼠(每只小鼠100个突触)的平均值±SEM值(n.s.，不显著；p，***<0.0005，****<0.00005)。
图9A至9B表明了用针对Dok7中PH/PTB结构域的抗体以相似的效率检测野生型和截短的Dok7。图9A示出了这样的实验的结果，在所述实验中将HEK 293细胞用表达由Dok71124_1127TGCC dup编码的HA标记的截短的Dok7或HA标记的Dok7的质粒瞬时转染。通过SDS-PAGE分离细胞裂解物中的蛋白质(一式三份)，并用针对Dok7中PTB结构域的兔抗体或针对HA的单克隆抗体探测Western印迹。测量野生型和截短的Dok7蛋白的带的灰度水平，并且将用针对Dok7的兔抗体通过Western印迹检测的水平借助于用针对HA的抗体通过Western印迹检测的水平归一化。野生型Dok7的比率与截短的Dok7的比率相当，表明针对Dok7的兔抗体以相似的效率通过Western印迹检测出野生型和截短的Dok7蛋白。图9B示出了这样的实验的结果，在所述实验中野生型和截短的Dok7通过针对Dok7中的PTB结构域的山羊抗体以相似的效率进行免疫沉淀。将HEK 293细胞用表达由Dok7 1124_1127TGCC dup编码的HA标记的截短Dok7和HA标记的Dok7的质粒瞬时共转染。用针对HA的单克隆抗体或针对Dok7中PTB结构域的山羊抗体从细胞裂解物中免疫沉淀Dok7蛋白(一式三份)，并用针对HA的单克隆抗体探测Western印迹。测量灰度；减去对照、未经转染样品中背景带的水平；并且将用针对Dok7的山羊抗体免疫沉淀的每种蛋白质的值相对于用针对HA的抗体免疫沉淀的相同蛋白质的值进行归一化。该比率与野生型和截短的Dok7蛋白相当，表明针对Dok7的山羊抗体以相似的效率免疫沉淀野生型和截短的蛋白质。图9A至9B中的散点图示出了来自3次实验的值和平均值±SEM(n.s.，不显著)。
图10A至10C表明了在Dok7CM/CM小鼠中Dok7 RNA表达是正常的。图10A示出了Dok7RNA的RT-PCR扩增显示Dok7 mRNA水平在来自E18.5野生型和Dok7CM/CM小鼠的肌肉中相似。将GAPDH用作上样对照。图10B示出了这样的实验的结果，在所述实验中通过qPCR定量Dok7mRNA水平，其显示在Dok7CM/CM小鼠中Dok7 mRNA水平是正常的。散点图示出了来自3只小鼠的值和平均值±SEM值(n.s.，不显著)。图10C示出了这样的实验的结果，在所述实验中从E18.5野生型和Dok7CM/CM小鼠的肌肉中免疫沉淀Dok7并用针对Dok7的抗体探测印迹。由Dok7CM/CM编码的截短的Dok7(t-Dok7)以预测尺寸迁移，但表达水平是野生型Dok7的3倍低。散点图示出了来自每种基因型的10只小鼠的值和平均值±SEM值(p，****<0.00005)。
图11表明了Y396和Y406如果不是Dok7中被突触蛋白聚糖刺激磷酸化的唯一酪氨酸残基，也是主要酪氨酸残基。从野生型和Dok72YF/2YF小鼠产生肌肉细胞系，并将培养的肌管用突触蛋白聚糖处理30分钟。对MuSK进行免疫沉淀，并用针对MuSK或磷酸酪氨酸(pTyr)的抗体探测Western印迹。突触蛋白聚糖在野生型而非Dok72YF/2YF肌管中刺激Dok7酪氨酸磷酸化。
图12A至12C示出了MuSK抗体克隆的结合特征。图12A至12C示出了以Fab形式的针对MuSK的抗体与固定化的hFz、hECD、mFz和mECD的结合滴定，如使用基于珠的结合测定所测试的。曲线示出了1:1结合模型的最佳拟合。KD值列在图5A中。图12A和图12B中的数据集是在不同的仪器上获得的，这导致了不同的信号范围。图12C示出了以IgG形式的针对MuSK的抗体的结合滴定，如与图12A中相同的方式进行。
图13A至13D表明了在野生型小鼠中长期注射MuSK激动剂抗体mIgG2a-X17对存活、神经肌肉突触的组织、体重增加或运动行为没有影响。图13A是示出了这样的实验的结果的散点图，在所述实验中在P4、P24和P44注射mIgG2a-X17的C57BL/6-CBA混合背景中的野生型小鼠(n＝4)存活直至P60它们被处死时。散点图示出了9只未经注射的野生型小鼠和4只注射mIgG2a-X17的野生型小鼠的存活时间以及平均值±SEM值(n.s.，不显著)。图13B是示出了这样的试验的结果的图，在所述实验中注射mIgG2a-X17的野生型小鼠(n＝4)与野生型小鼠(n＝9)一样体重增加。图13C示出了对野生型小鼠长期注射mIgG2a-X17对神经肌肉突触的组织没有影响。将来自P60野生型和注射mIgG2a-X17的野生型小鼠的膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记乙酰胆碱受体(AChR)以及用针对βIII-微管蛋白/突触蛋白的抗体染色以标记运动轴突/神经末梢。在用mIgG2a-X17处理的野生型小鼠中，突触从简单的斑块样形状成熟为复杂的椒盐卷饼样形状，这是成熟的鼠神经肌肉突触的特征。比例尺＝10mm。在野生型小鼠中注射mIgG2a-X17对突触数量、突触尺寸和AChR密度没有影响。分析了每个类别中来自2只小鼠的100个突触。图13D是示出了在野生型小鼠中长期注射mIgG2a-X17对运动行为没有影响的散点图。注射mIgG2a-X17的野生型小鼠的运动表现与未经注射的野生型小鼠相似，如通过握力和从旋转的转棒仪掉落的等待时间所评估的。散点图示出了18只野生型小鼠和4只注射mIgG2a-X17的野生型小鼠的值以及平均值±SEM值(n.s.，不显著)。
图14A至14B是示出了混合遗传背景中的Dok7CM/CM小鼠在出生之后存活大约两周的表格。使用小鼠的混合遗传背景来分析Dok7CM/CM小鼠的存活。将C57BL/6背景中的Dok7CM/+小鼠与野生型CBA、129sv1、FVB或BALB/c小鼠杂交。然后将杂合F1后代互交以产生混合背景中的Dok7CM/CM小鼠。在P5至P10或死后确定后代的基因型。图14A是示出了对F2小鼠的x2方分析的表格，其显示基因型的发生不太可能偶然发生，表明每种混合遗传背景中的纯合Dok7CM/CM小鼠在出生之后存活。图14B是示出了混合遗传背景中纯合Dok7CM/CM小鼠的平均和最大存活时间(天数)的表格。
图15A至15E表明了Dok7的C端区域对于混合遗传背景中的Dok7CM/CM小鼠中神经肌肉突触的完全分化和成熟是必不可少的。在图15A至15C中，将E18.5和P10的来自野生型和C57BL/6-CBA混合背景中Dok7CM/CM小鼠的膈肌用Alexa 488-a-BGT染色以标记AChR(红色)以及用针对神经丝/突触蛋白的抗体染色以标记运动轴突/神经末梢(绿色)。图15A示出了在E18.5，终板带(白色虚线)在Dok7CM/CM中比在野生型小鼠中宽30％。此外，在Dok7CM/CM小鼠中，15％的AChR簇不存在神经末梢并且共定位指数(突触蛋白/AChR)降低了3.5倍。比例尺＝50μm。示出了来自3只小鼠的平均值±SEM值(p，*<0.05；p，****<0.00005)。图15B示出了在E18.5 Dok7CM/CM小鼠中突触的数量、突触尺寸和突触AChR的密度分别降低了3.2倍、4.5倍和8倍。示出了来自3只小鼠(每只小鼠100个突触)的平均值±SEM值(p，****<0.00005)。比例尺＝10μm。图15C示出了在Dok7CM/CM小鼠中，在P10突触的数量、突触尺寸和突触AChR的密度降低了超过10倍。另外，Dok7CM/CM小鼠中20％的AChR簇不存在神经末梢。示出了来自3只小鼠(每只小鼠100个突触)的平均值±SEM值(p，****<0.00005)。图15D示出了从E18.5野生型和Dok7CM/CM小鼠的肌肉中免疫沉淀Dok7，并且用针对Dok7的抗体探测印迹。由Dok7CM/CM编码的截短Dok7(t-Dok7)以预测尺寸迁移，但表达水平是野生型Dok7的3倍低。因为Dok7表达和MuSK磷酸化在C57BL/6-CBA混合品种和C57BL/6近交小鼠中降低到相同程度，因此其他因素可导致混合遗传背景下的存活提高。散点图示出了来自每种基因型的八只小鼠的值和平均值±SEM值(p，****<0.00005)。图15E示出了从E18.5野生型、Dok7CM/CM的肌肉中免疫沉淀MuSK，并且用针对MuSK、磷酸酪氨酸和Crk的抗体探测印迹。将与MuSK复合物共分离的磷酸酪氨酸和Crk的水平相对于MuSK表达进行归一化。Crk与MuSK复合物的缔合在Dok7CM/CM小鼠中是在野生型小鼠中的2.8倍低。MuSK酪氨酸磷酸化在Dok7CM/CM小鼠中是在野生型小鼠的5倍低。散点图示出了每种基因型的3只小鼠的值和平均值±SEM值(p，**<0.005，****<0.00005)。比例尺＝10μm。
图16A至16B是示出了潜在脱靶位点的序列分析未能鉴定这些基因中的突变的表格。示出了排序靠前的潜在的在Dok7 CM小鼠中的脱靶基因序列1至5(图16A；SEQ ID NO:280至284)和在Dok7 2YF小鼠中的脱靶基因序列1至5(图16B；SEQ ID NO:285至289)。
图17A至17C是示出了抗体X2和X3与X17一样使Dok7CM/CM小鼠免于早期致死的图。图17A示出了这样的实验的结果，在所述实验中在P4对C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7CM/CM小鼠注射10mg/kg mIgG2a-X3(也参见图46B)。在这个剂量下，X3未能使小鼠免于致死。相比之下，在P4用20mg/kg mIgG2a-X3给药使小鼠免于早期致死(图17B(也参见图47B))。随后在P18对这些小鼠注射10mg/kg mIgG2a-X3，这导致其存活直至P60小鼠被处死时。图17C示出了在P4用20mg/kg hIgG1-X2对Dok7CM/CM小鼠给药同样使Dok7CM/CM小鼠免于早期致死；随后在P18注射10mg/kg hIgG1-X2导致Dok7CM/CM小鼠存活直至P60小鼠被处死时。
图18是示出了用于美洲驼(llama)免疫Fab文库的噬菌体展示选择的策略概述的示意图。
图19示出了ELISA实验的结果，其显示出抗体与人MuSK或小鼠MuSK的不良结合。
图20是表明了3B2挽救Dok7 1124_1127dup小鼠的早期产后致死的图。
图21是示出了在C2C12磷酸化测定中由本发明的MuSK抗体诱导的磷酸化百分比的图。
图22是示出了通过ELISA测量的3B2抗体和3B2抗体变体与人MuSK、食蟹猴MuSK、大鼠MuSK或小鼠MuSK结合亲和力的图。
图23是在pH 7.4和pH 5.5下在Biacore中MuSK激动剂Fab(Fab X17、X2、X2m4、X3、3B2、3B2g2m1、X9)对小鼠MuSK的结合的图示。
图24是示出了MuSK磷酸化可以通过其天然配体、突触蛋白聚糖和靶向MuSK的Fz结构域的激动剂MuSK-mAb 3B2g2m1而共刺激的散点图。
图25A至25B表明了与hIgG-X17组合的针对MuSK的激动剂抗体mIgG2a-X17在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中挽救致死。图25A是示出了C57BL/6-CBA混合背景中的Dok71124_1127dup小鼠在出生之后存活一至两周的散点图。在P4用激动剂抗体X17或同种型等效阴性对照莫维珠单抗(Motavizumab)处理混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。注射同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)与未经处理的小鼠一样，在出生之后一至两周死亡，而在P4注射mIgG2a-X17(n＝3)和在P24和P44注射hIgG-X17的Dok7 1124_1127dup小鼠存活，成为成体。将注射mIgG2a-X17并随后注射hIgG-X17的突变体小鼠在P60处死。散点图示出了每只小鼠的存活时间和平均值±SEM值(p，****<0.00005)。图25B是示出了与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，注射mIgG2a-X17并随后注射hIgG-X17的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加的图。在P4对Dok7 1124_1127dup小鼠注射mIgG2a-X17(10mg/kg)，以及在P24和P44处注射hIgG-X17(10mg/kg)。
图26表明了与hIgG-X17组合的mIgG2a-X17挽救了Dok7 1124_1127小鼠的运动表现。通过用与hIgG-X17组合的mIgG2a-X17进行处理完全恢复了Dok7 1124_1127dup小鼠的运动表现，如通过握力(左图)和从旋转的转棒仪掉落的等待时间(右图)所评估的。散点图示出了27只野生型小鼠和用与hIgG-X17组合的mIgG2a-X17挽救的3只Dok7 1124_1127dup小鼠的值和平均值±SEM值(n.s.，不显著)。
图27表明了MuSK激动剂抗体hIgG-X17在突触处接合MuSK并以20mg/kg使MuSK饱和。将P40野生型小鼠腹膜内注射MuSK激动剂抗体hIgG-X17(0mg/kg、2mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)。在两天之后，将小鼠处死并将膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记AChR以及用Alexa 647山羊抗-人IgG，F(ab')2片段特异性进行染色以标记X17。通过X17与AChR信号强度之比来测量突触处X17的饱和水平。示出了每个浓度下来自3只小鼠的平均值±SEM值。
图28A至28B表明了针对MuSK的激动剂抗体hIgG-X17在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中挽救致死。图28A是示出了C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠在出生之后存活一至两周的散点图。在P4用激动剂抗体hIgG-X17或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。与未经处理的小鼠一样，注射同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)在出生之后一至两周死亡，而在P4、P18和P38或在P4和P18注射hIgG-X17的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝4)存活，成为成体。将4只注射hIgG-X17的突变体小鼠中的2只在P60处死；使2只突变体小鼠变老以进行疾病复发实验。散点图示出了每只小鼠的存活时间和平均值±SEM值(p，****<0.00005)。图28B是示出了与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，注射hIgG-X17的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加的图。在P4(20mg/kg)、P18和P38(10mg/kg)或者P4(20mg/kg)和P18(10mg/kg)对Dok7 1124_1127dup小鼠注射hIgG-X17。
图29表明了hIgG-X17在年轻的Dok7 1124_1127dup小鼠中恢复突触发育。将来自P60野生型和Dok7 1124_1127dup小鼠的膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记AChR以及用针对βIII微管蛋白/突触蛋白的抗体染色以标记运动轴突/神经末梢。在用hIgG-X17处理的Dok7 1124_1127dup小鼠中，突触从简单的斑块样形状成熟为复杂的椒盐卷饼样形状，这是成熟鼠神经肌肉突触的特征。比例尺＝10mm。在用hIgG-X17处理的Dok7 1124_1127dup小鼠中，突触的数量、突触尺寸和突触AChR的密度分别恢复至正常水平的70％、50％和40％。示出了来自2只小鼠(每只小鼠>50个突触)的平均值±SEM值。
图30表明了hIgG-X17挽救了Dok7 1124_1127dup小鼠的运动表现。通过用hIgG-X17进行处理完全恢复了Dok7 1124_1127dup小鼠的运动表现，如通过握力(左图)和从旋转的转棒仪上掉落的等待时间(右图)所评估的。散点图示出了27只野生型小鼠和2只用hIgG-X17挽救的Dok7 1124_1127dup小鼠的值和平均值±SEM值。
图31A至31C表明了hIgG-X17在成年Dok7 1124_1127dup小鼠中逆转了疾病复发。在P4、P24和P44或者在P4、P18对Dok7 1124_1127dup小鼠注射MuSK激动剂抗体，并随后中断抗体处理。这些Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加并且维持其运动性数个月，但最终开始体重减轻(图31A、图31B)，并表现出运动缺陷，如通过握力和从旋转的转棒仪掉落的等待时间所评估的(图31C)。此时，小鼠不进行再注射(图31A)，或再注射hIgG-X17(图31B)。未再注射的小鼠在数天内死亡(图31A)，而在重新开始X17处理之后，Dok7 1124_1127dup小鼠开始体重增加(图3B)，并且在重新开始处理之后一周，它们的运动缺陷被逆转(图31C，左图)。Dok71124_1127dup小鼠在转棒仪上的表现为3.25倍高，而野生型小鼠的表现为1.30倍高(p，***<0.0005)。Dok7 1124_1127dup小鼠的握力为1.30倍高，而野生型小鼠的表现没有提高(p，***<0.0005)(图31C)。
图32A至32B表明了在野生型小鼠中长期注射3B2对存活或体重增加没有影响。图32A是示出了在P4和P18注射3B2的C57BL/6-CBA混合背景中的野生型小鼠(n＝3)存活直至P38它们被处死时的散点图。散点图示出了4只未经注射的野生型小鼠和3只注射3B2的野生型小鼠的存活时间以及平均值±SEM值(n.s.，不显著)。图32B是示出了注射3B2的野生型小鼠(n＝3)与野生型小鼠(n＝4)一样体重增加的散点图。
图33A至33B表明了针对MuSK的3B2激动剂抗体在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中挽救致死。图33A是示出了C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠在出生之后存活一至两周的散点图。在P4用激动剂抗体3B2或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。注射了同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)与未经处理的小鼠一样，在出生之后一至两周死亡，而在P4、P18和P38或者在P4和P18注射3B2的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝3)存活，成为成体。将3只注射了3B2的突变体小鼠中的2只在P60处死；使1只突变体小鼠变老以进行疾病复发实验。散点图示出了每只小鼠的存活时间和平均值±SEM值(p，****<0.00005)。图33B是示出了与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，注射了3B2的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加的散点图。在P4(20mg/kg)、P18和P38(10mg/kg)对Dok7 1124_1127dup小鼠注射3B2。
图34表明了3B2在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中恢复突触发育。将来自P60野生型和Dok7 1124_1127dup小鼠的膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记AChR以及用针对βIII微管蛋白/突触蛋白的抗体染色以标记运动轴突/神经末梢。在用3B2处理的Dok7 1124_1127dup小鼠中，突触从简单的斑块样形状成熟为复杂的椒盐卷饼样形状，这是成熟的鼠神经肌肉突触的特征。比例尺＝10mm。在用3B2处理的Dok7 1124_1127dup小鼠中，突触的数量、突触尺寸和突触AChR的密度分别恢复至正常水平的80％、75％和40％。示出了来自2只小鼠(每只小鼠>50个突触)的平均值±SEM值。
图35表明了3B2挽救Dok7 1124_1127dup小鼠的运动表现。通过用3B2进行处理完全恢复了Dok7 1124_1127dup小鼠的运动表现，如通过握力(左图)和从旋转的转棒仪掉落的等待时间(右图)所评估的。散点图示出了27只野生型小鼠和2只用3B2挽救的Dok7 1124_1127dup小鼠的值和平均值±SEM值。
图36表明了3B2维持Dok7 1124_1127dup小鼠健康至少两个月。在P4、P18和P38对Dok7 1124_1127dup小鼠注射3B2，并随后中断抗体处理。该Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加并维持其运动性数个月，但最终开始体重减轻并在数天内死亡。
图37表明了3B2在成年Dok7 1124_1127dup小鼠中逆转了疾病复发。在P4、P24和P44对Dok7 1124_1127dup小鼠注射mIgG2a-X17并随后中断抗体处理。这些Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加并维持其运动性数个月，但最终开始体重减轻。此时，对小鼠再注射3B2。在重新开始用3B2处理之后，该Dok7 1124_1127dup小鼠开始体重增加。
图38A至38B表明了在野生型小鼠中长期注射hIgG-X2对存活或体重增加没有影响。图38A是示出了在P4和P18注射hIgG-X2的C57BL/6-CBA混合背景中的野生型小鼠(n＝3)存活直至P38它们被处死时的散点图。散点图示出了4只未经注射的野生型小鼠和3只注射了hIgG-X2的野生型小鼠的存活时间以及平均值±SEM值(n.s.，不显著)。图38B是示出了注射hIgG-X2的野生型小鼠(n＝3)与野生型小鼠(n＝4)一样体重增加的散点图。
图39A至39B表明了针对MuSK的激动剂抗体hIgG-X2在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中挽救致死。图39A是示出了C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠在出生之后存活一至两周的散点图。在P4用激动剂抗体hIgG-X2或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。与未经处理的小鼠一样，注射了同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)在出生之后一至两周死亡，而在P4和P18注射了hIgG-X2的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝2)存活，成为成体。使注射了hIgG-X2的突变体小鼠变老以用于疾病复发实验。散点图示出了每只小鼠的存活时间和平均值±SEM值(p，****<0.00005)。图39B是示出了与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，注射了hIgG-X2的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加的散点图。在P4(20mg/kg)和P18(10mg/kg)对Dok7 1124_1127dup小鼠注射hIgG-X2。
图40A至40B表明了在hIgG-X2成年Dok7 1124_1127dup小鼠中逆转疾病复发。在P4和P18对Dok7 1124_1127dup小鼠注射hIgG-X2并随后中断抗体处理。这些Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加并维持其运动性数周，但最终开始体重减轻(图40A)并且表现出运动缺陷，如通过握力和从旋转的转棒仪掉落的等待时间所评估的(图40B)。此时，对小鼠再注射hIgG-X2。在重新开始X2处理之后，Dok7 1124_1127dup小鼠开始体重增加(图40A)，并且在重新开始处理之后三周，它们的运动缺陷被完全逆转(图40B)。
图41A至41B表明了针对MuSK的激动剂抗体hIgG-X2m4在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中挽救致死。图41A是示出了C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠在出生之后存活一至两周的散点图。在P4用激动剂抗体hIgG-X2m4或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。与未经处理的小鼠一样，注射了同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)在出生之后一至两周死亡，而在P4和P18注射了hIgG-X2m4的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝3)存活，成为成体。监测注射了hIgG-X2m4的突变体小鼠的存活，或者使其变老以进行用hIgG-X17的疾病复发实验。散点图示出了每只小鼠的存活时间和平均值±SEM值(p，****<0.00005)。图41B是示出了与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，注射了hIgG-X2m4的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加的散点图。在P4(20mg/kg)和P18(10mg/kg)对Dok7 1124_1127dup小鼠注射hIgG-X2m4。一只小鼠用于用hIgG-X17的疾病复发实验，监测其他小鼠的存活。
图42是示出了hIgG-X2m4维持Dok7 1124_1127dup小鼠健康至少两个月的散点图。在P4和P18对Dok7 1124_1127dup小鼠注射X2m4，并随后中断抗体处理。这些Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加并维持其运动性数个月，但最终开始体重减轻并在数天内死亡。
图43A至43B表明了在野生型小鼠中长期注射mIgG2a-X3对存活或体重增加没有影响。图43A是示出了在P4、P24和P44注射mIgG2a-X3的C57BL/6-CBA混合背景中的野生型小鼠(n＝2)存活直至P60它们被处死时的散点图。散点图示出了9只未经注射的野生型小鼠和2只注射了mIgG2a-X3的野生型小鼠的存活时间和平均值±SEM值。图43B是示出了注射了mIgG2a-X3的野生型小鼠(n＝2)与未经注射的野生型小鼠(n＝9)一样体重增加的散点图。
图44表明了在野生型小鼠中长期注射mIgG2a-X3对神经肌肉突触的组织没有影响。将来自P60野生型和注射了mIgG2a-X3的野生型小鼠的膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记乙酰胆碱受体以及用针对βIII微管蛋白/突触蛋白的抗体染色以标记运动轴突/神经末梢。在用mIgG2a-X3处理的野生型小鼠中，突触从简单的斑块样形状成熟为复杂的椒盐卷饼样形状，这是成熟的鼠神经肌肉突触的特征。比例尺＝10mm。在野生型小鼠中注射mIgG2a-X3对突触数量、突触尺寸和AChR密度没有影响。分析了每个类别中来自2只小鼠的100个突触。
图45表明了在野生型小鼠中长期注射mIgG2a-X3对运动行为没有影响。注射了mIgG2a-X3的野生型小鼠的运动表现与未经注射的野生型小鼠相似，如通过握力(左图)和从旋转的转棒仪上掉落的等待时间(右图)所评估的。散点图示出了27只野生型小鼠和2只注射了mIgG2a-X3的野生型小鼠的值和平均值±SEM值。
图46A至46B表明了在P4时10mg/kg的针对MuSK的激动剂抗体mIgG2a-X3在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中挽救致死数天。图46A是示出了C57BL/6-CBA混合背景中的Dok71124_1127dup小鼠在出生之后存活一至两周的散点图。在P4用激动剂抗体mIgG2a-X3或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。注射了同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)和注射了mIgG2a-X3的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝4)与未经处理的小鼠一样，在出生之后一至两周死亡。散点图示出了每只小鼠的存活时间和平均值±SEM值(p，**<0.05)。图46B是示出了与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠一样，注射了mIgG2a-X3的Dok7 1124_1127dup小鼠没有体重增加的散点图。在P4对Dok7 1124_1127dup小鼠注射mIgG2a-X3(10mg/kg)。
图47A至47B表明了在P4时20mg/kg的针对MuSK的激动剂抗体mIgG2a-X3在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中挽救致死。图47A是示出了C57BL/6-CBA混合背景中的Dok71124_1127dup小鼠在出生之后存活一至两周的散点图。在P4用激动剂抗体mIgG2a-X3(20mg/kg)或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。与未经处理的小鼠一样，注射了同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)在出生之后一至两周死亡。在P4(20mg/kg)和P18(10mg/kg)注射mIgG2a-X3的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝2)存活，成为成体。使注射了mIgG2a-X3的突变体小鼠变老以进行疾病复发实验。散点图示出了每只小鼠的存活时间和平均值±SEM值。图47B是示出了与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，注射了mIgG2a-X3的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加的散点图。在P4(20mg/kg)和P18(10mg/kg)对Dok7 1124_1127dup小鼠注射mIgG2a-X3。
图48表明了mIgG2a-X3维持Dok7 1124_1127dup小鼠健康至少两个月。在P4和P18对Dok7 1124_1127dup小鼠注射mIgG2a-X3，并随后中断抗体处理。这些Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加并维持其运动性两个月，但最终开始体重减轻并在数天内死亡。
图49A至49B表明了针对MuSK的激动剂抗体mIgG2a-X9在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中可以挽救致死。图49A是示出了C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠在出生之后存活一至两周的散点图。在P4用激动剂抗体mIgG2a-X9或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。注射了同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)和注射了mIgG2a-X9的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝6)与未经处理的小鼠一样，在出生之后一至两周死亡。仅一只在P4、P24和P44注射了mIgG2a-X9(10mg/kg)的Dok7 1124_1127dup小鼠存活直至P60。散点图示出了每只小鼠的存活时间和平均值±SEM值(n.s.，不显著)。图49B是示出了与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠一样，注射了mIgG2a-X9的Dok7 1124_1127dup小鼠没有体重增加的散点图。仅一只注射了mIgG2a-X9的Dok7 1124_1127dup小鼠随时间体重增加。在P4、P24和P44对Dok7 1124_1127dup小鼠注射mIgG2a-X9(10mg/kg)。
图50表明了MuSK激动剂抗体3B2g2m1在突触处接合MuSK并以20mg/kg使MuSK饱和。将P30野生型小鼠腹腔内注射MuSK激动剂抗体3B2g2m1(0mg/kg、2mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)。在两天之后，将小鼠处死并将膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记AChR以及用Alexa647山羊抗人IgG，F(ab')2片段特异性进行染色以标记3B2g2m1。通过3B2g2m1与AChR信号强度的比率来测量突触处3B2g2m1的饱和水平。示出了每个浓度下来自3只小鼠的平均值±SEM值。
图51A至51B表明了在野生型小鼠中长期注射3B2g2m1对存活或体重增加没有影响。图51A是这样的散点图，其示出了在P4、P24和P44注射了10mg/kg 3B2g2m1的C57BL/6-CBA混合背景中的野生型小鼠(n＝6)与在P4、P24和P44注射了10mg/kg同种型等效阴性对照莫维珠单抗的野生型小鼠(n＝6)一样存活并且体重增加。图51B是这样的散点图，其示出了从P4开始每周两次注射20mg/kg 3B2g2m1的C57BL/6-CBA混合背景中的野生型小鼠(n＝6)像从P4开始每周两次注射20mg/kg同种型等效阴性对照莫维珠单抗的野生型小鼠(n＝6)一样存活并且体重增加。
图52A至52B表明了针对MuSK的激动剂抗体3B2g2m1在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中挽救致死。图52A是示出了C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠在出生之后存活一至两周的散点图。在P4用激动剂抗体3B2g2m1或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。与未经处理的小鼠一样，注射了同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)在出生之后一至两周死亡，而在P4(20mg/kg)、P18(10mg/kg)和P38(10mg/kg)注射了3B2g2m1的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝10)存活，成为成体。将注射了3B2g2m1的10只突变体小鼠中的3只在P60处死；使7只突变体小鼠变老以进行疾病复发实验。散点图示出了每只小鼠的存活时间和平均值±SEM值(p，****<0.00005)。图52B是示出了与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，注射了3B2g2m1的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加的散点图。在P4(20mg/kg)、P18(10mg/kg)和P44(10mg/kg)对Dok7 1124_1127dup小鼠注射3B2g2m1。
图53表明了3B2g2m1在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中恢复突触发育。将来自P60野生型和Dok7 1124_1127dup小鼠的膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记AChR以及用针对βIII微管蛋白/突触蛋白的抗体染色以标记运动轴突/神经末梢。在用3B2g2m1处理的Dok71124_1127dup小鼠中，突触从简单的斑块样形状成熟为复杂的椒盐卷饼样形状，这是成熟的鼠神经肌肉突触的特征。比例尺＝10mm。在用3B2g2m1处理的Dok7 1124_1127dup小鼠中，突触的数量、突触尺寸和突触AChR的密度分别恢复至正常水平的80％、50％和60％。示出了来自3只小鼠(每只小鼠>50个突触)的平均值±SEM值(p，*<0.05，****<0.00005)。
图54表明了3B2g2m1挽救了Dok7 1124_1127dup小鼠的运动表现。通过用3B2g2m1进行处理完全恢复了Dok7 1124_1127dup小鼠的运动表现，如通过握力(左图)和从旋转的转棒仪掉落的等待时间(右图)所评估的。散点图示出了27只野生型小鼠和用3B2g2m1挽救的10只Dok7 1124_1127dup小鼠的值以及平均值±SEM值(n.s.，不显著)。
图55表明了3B2g2m1维持Dok7 1124_1127dup小鼠健康至少两个月。在P4、P18和P38对Dok7 1124_1127dup小鼠注射3B2g2m1并随后中断抗体处理。这些Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加并维持其运动性数个月，但最终开始体重减轻。此时，对小鼠再注射5mg/kg或10mg/kg的3B2g2m1。在重新开始3B2g2m1处理之后，Dok7 1124_1127dup小鼠开始体重增加。
图56A至56C表明了3B2g2m1在成年Dok7 1124_1127dup小鼠中逆转疾病复发。在P4、P18和P38对Dok7 1124_1127dup小鼠注射3B2g2m1，并随后中断抗体处理。该Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加并维持其运动性数个月，但最终开始体重减轻(图56A)并表现出运动缺陷，如通过握力和从旋转的转棒仪掉落的等待时间所评估的(图56B)。此时，对小鼠再注射3B2g2m1(图56A)。在重新开始3B2g2m1处理之后，Dok7 1124_1127dup小鼠开始体重增加(图56A)，并且在重新开始处理一周之后其运动缺陷被逆转(图56B至56C)。Dok7 1124_1127dup小鼠在转棒仪上的表现为5.5倍高(图56B)，并且其握力为1.1倍高(图56C)。
图57表明了针对MuSK的激动剂抗体3B2g2m1在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中挽救致死(每周2次长期给药)。图57表明了C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠在出生之后存活一至两周。从P4开始每周两次用激动剂抗体3B2g2m1(20mg/kg)处理混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。注射了3B2g2m1的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝4)存活，成为成体并且体重增加。
图58A至58C示出了MuSK抗体处理延长Dok7 1124_1127dup小鼠的存活。图58A示出了在P4(20mg/kg)、P18(10mg/kg)和P38(10mg/kg)注射所示MuSK激动剂抗体或同种型对照(莫维珠单抗)的Dok7 1124_1127dup小鼠的存活图。图58B示出了在P4(20mg/kg)、P18(10mg/kg)注射MuSK激动剂抗体或同种型对照(莫维珠单抗)的Dok7 1124_1127dup小鼠的存活图。图58C示出了在体重减轻发生数天之后再注射所示MuSK激动剂抗体(10mg/kg)(用其重新开始处理)的Dok7 1124_1127dup小鼠的存活图(图58C)。这些结果表明注射MuSK激动剂抗体延长了Dok7 1124_1127dup小鼠的存活。
发明详述
一般定义
提供以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明。除非本文中明确定义，否则本文中使用的所有术语具有与其对于本发明领域的技术人员来说相同的含义。对于本领域的定义和术语，实践者特别地参考Sambrook et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Press,Plainsview,New York(1989)；和Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47),John Wiley&Sons,New York(1999)。本文中提供的定义不应被解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。
除非另外指明，否则对本领域技术人员将明显的是，可以以本身已知的方式进行并且已经进行了未具体详细描述的所有方法、步骤、技术和操作。例如，再次参考标准手册、上面提及的一般背景技术以及其中引用的其他参考文献。
除非上下文另外明确指出，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种和更多个/种。
本文中使用的术语“包含”与“包括”或“含有”同义，并且是包括性的或开放式的，而不排除另外的非记载成员、化合物、产品、要素或方法步骤。在产品或组合物(“基本上由……组成的产品”或“基本上由……组成的组合物”)的上下文中使用的表述“基本上由……组成”意指可存在另外的分子，但这样的分子不改变所述产品或组合物的特征/活性/功能。例如，如果组合物本身将表现出与抗体之一或抗体片段之一相似的特征/活性/功能，则组合物可基本上由抗体或抗体片段组成。
通过端点对数值范围的记载包括在相应范围内纳入的所有数字和分数，以及所记载的端点。
本文中涉及例如参数、量、时距(temporal duration)等可测量值时使用的术语“约/大约”意在涵盖指定值的或相对于指定值的+/-10％或更小、优选+/-5％或更小、更优选+/-1％或更小、并且还更优选+/-0.1％或更小的变化，在此范围内这样的变化适合于在所公开的发明中实施。应理解，修饰语“约”所指的值本身也被具体地且优选地公开。
本文中使用的氨基酸残基将通过它们的全名或根据标准的三字母或单字母氨基酸代码来表示。
本文中使用的术语“多肽”或“蛋白质”可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸(其可包括编码和非编码氨基酸、经化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸)的聚合物形式和具有经修饰肽骨架的多肽。“肽”也是氨基酸的聚合物，其长度通常多至50个氨基酸。多肽或肽由氨基酸序列表示。
本文中使用的术语“核酸分子”、“多核苷酸”、“多核酸”、“核酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合物形式。核酸分子由核酸序列表示，其主要特征在于其碱基序列。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以进行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、控制区、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线性的或环状的。
本文中使用的术语“同源性”表示来自相同或不同分类单元的两个大分子之间，特别是两个多肽或多核苷酸之间的至少二级结构同一性或相似性，其中所述相似性归因于共同祖先。因此，术语“同源物”表示具有所述二级和任选三级结构相似性的如此相关的大分子。为了比较两个或更多个核苷酸序列，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“序列同一性(百分比)”可以使用本领域技术人员已知的方法来计算，例如通过将第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中对应位置处的核苷酸相同的核苷酸数量除以第一核苷酸序列中核苷酸的总数并乘以100％，或者通过使用用于序列比对的已知的计算机算法，例如NCBIBlast。在确定两个氨基酸序列之间的序列相似性的程度时，本领域技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸替换，其通常可以描述为其中一个氨基酸残基被具有相似化学结构的另一氨基酸残基替换并且对多肽的功能、活性或其他生物学特性影响很小或基本没有影响的的氨基酸替换。可能的保守氨基酸替换已在本文中例示。如果氨基酸序列和核酸序列在其整个长度上具有100％序列同一性，则称它们为“完全相同”。
在本申请通篇，每次提到特定的氨基酸序列SEQ ID NO(以SEQ ID NO:Y为例)，可以将其替换为：包含与氨基酸序列SEQ ID NO:Y具有至少80％序列同一性或相似性的氨基酸序列的多肽。在本申请通篇，措辞“与另一序列至少X％相同的序列”可以替换为“与另一序列具有至少X％序列同一性的序列”。
在另一些优选的实施方案中，本文中所述的每个氨基酸序列凭借其分别与给定氨基酸序列的同一性百分比(至少80％)而分别与该给定的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性或更高的同一性。在一个优选实施方案中，序列同一性通过比较本文中所标识的序列的全长来确定。在另一些优选的实施方案中，本文中所述的每个氨基酸序列凭借其分别与给定氨基酸序列的相似性百分比(至少80％)而分别与该给定的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的相似性或更高的相似性。在一个优选实施方案中，序列相似性通过比较本文中所标识的序列的全长来确定。除非本文中另有说明，否则与给定SEQ ID NO的同一性或相似性意指基于所述序列的全长(即在其全长上或作为整体)的同一性或相似性。
“序列同一性”在本文中定义为两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。两个氨基酸序列之间的同一性优选地通过评估它们在如本文中所标识的整个SEQ ID NO或其部分内的同一性来确定。其部分可以意指SEQ ID NO长度的至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。
在本领域中，“同一性”还意指氨基酸序列之间的序列关联性程度，这视情况而定，如由这样的序列的串之间的匹配所确定。两个氨基酸序列之间的“相似性”通过比较一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸代替物与第二多肽的序列来确定。“同一性”和“相似性”可以很容易地通过已知方法计算，包括但不限于以下中所描述的那些：ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heine,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991；和Carillo,H.,andLipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。
确定同一性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。确定同一性和相似性的方法被编入公开可用的计算机程序中。确定两个序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括例如GCG程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research12(1):387(1984))、BestFit、FASTA、BLASTN和BLASTP(Altschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、EMBOSS Needle(Madeira,F.,et al.,Nucleic AcidsResearch 47(W1):W636-W641(2019))。BLAST程序可从NCBI和其他来源公开获得(BLASTManual,Altschul,S.,et al.,NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894；Altschul,S.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。EMBOSS程序可从EMBL-EBI公开获得。公知的SmithWaterman算法也可用于确定同一性。EMBOSS Needle程序是优选使用的程序。
用于多肽序列比较的优选参数包括以下：算法：Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48(3):443-453(1970)；比较矩阵：BLOSUM62，其来自Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919(1992)；空位开放罚分：10，和空位延伸罚分：0.5。可用于这些参数的程序作为来自EMBL-EBI的EMBOSS Needle程序可公开获得。前述参数是蛋白质全局配对序列比对的默认参数(以及对末端空位没有罚分)。
用于核酸比较的优选参数包括以下：算法：Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比较矩阵：DNAfull；空位开放罚分：10；空位延伸罚分：0.5。可用于这些参数的程序作为EMBL-EBI的EMBOSS Needle程序可公开获得。前述参数是核苷酸序列的全局配对序列比对的默认参数(以及对末端空位没有罚分)。
本文中还提供了这样的一些实施方案，其中本文中所述的任何实施方案可以与任何一个或更多个另外的实施方案组合，只要该组合不是相互排斥的。
基于MuSK抗体的分子
本发明涉及基于抗体的分子，包括本文中所述的抗体、其表位结合结构域和抗体衍生物，其能够结合肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)并激活肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)的信号传导和/或磷酸化。这样的基于抗体的分子可用于治疗其中对象需要提高的MuSK信号传导或MuSK磷酸化的病症，例如神经肌肉病症。
本发明的第一方面涉及结合MuSK表位的基于抗体的分子。MuSK是受体酪氨酸激酶，其在骨骼肌中表达，并在形成和维持神经肌肉突触中具有关键的主要作用(Burden etal.,“The Role of MuSK in Synapse Formation and Neuromuscular Disease,”ColdSpring Harb.Perspect.Biol.5:a009167(2013)，其在此通过引用整体并入)。MuSK是单通道、120kDa跨膜蛋白，由包含三个Ig样结构域和一个卷曲(Fz)样结构域的胞外区域和包含近膜区域、激酶结构域和短胞质尾区的胞内区域构成(Jennings et al.,“Muscle-Specific trk-Related Receptor with a Kringle Domain Defines a Distinct Classof Receptor Tyrosine Kinases,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2895-2899(1993)和Valenzuela et al.,“Receptor Tyrosine Kinase Specific for the Skeletal MuscleLineage:Expression in Embryonicmuscle,at the Neuromuscular Junction,and AfterInjury,”Neuron 15:573-584(1995)，其在此通过引用整体并入)。MuSK磷酸化受到突触蛋白聚糖的刺激，突触蛋白聚糖是运动神经元提供的信号。一旦被激活，MuSK会刺激以下途径：(1)聚集和锚定AChR和对突触传递至关重要的另外的肌肉蛋白，(2)增强编码突触蛋白的基因在肌肉“突触核”中的转录，以及(3)促进逆行信号的产生，所逆行信号促进突触前分化和运动神经末梢与肌肉的附着。在不存在MuSK的情况下，神经肌肉突触无法形成(Burdenet al.,“The Role of MuSK in Synapse Formation and Neuromuscular Disease,”ColdSpring Harb.Perspect.Biol.5:a009167(2013)，其在此通过引用整体并入)。除了其在突触形成期间发挥的作用之外，还需要MuSK来维持成体突触，因为成体肌肉中MuSK表达的抑制导致突触前和突触后分化的严重缺陷(Kong et al.,“Inhibition of SynapseAssembly in Mammalian Muscle in vivo by RNA Interference,”EMBO Rep 5:183-188(2004)和Hesser et al.,“Synapse Disassembly and Formation of New Synapses inPostnatal Muscle Upon Conditional Inactivation of MuSK,”Mol.Cell.Neurosci.31:470-480(2006)，其在此通过引用整体并入)。与小鼠中的这些发现一致，损害MuSK激酶活性或抑制MuSK下游信号传导步骤的突变会导致肌无力(CM)，其特征在于突触结构和功能缺陷，导致肌肉无力和疲劳(Beeson et al.,“Dok-7 Mutations Underlie a NeuromuscularJunction Synaptopathy,”Science 313:1975-1978(2006)；Muller et al.,“Phenotypical Spectrum of DOK7 Mutations in Congenital Myasthenic Syndromes,”Brain 130:1497-1506(2007)；和Selcen et al.,“A Compensatory Subpopulation ofMotor Neurons in a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis,”J.Comp.Neurol.490:209-219(2008)，其在此通过引用整体并入)。
人MuSK的氨基酸序列具有以下SEQ ID NO:129的氨基酸序列。
根据本发明，本文中所述的基于MuSK抗体的分子与MuSK蛋白的卷曲(Fz)样结构域内的表位结合。MuSK的Fz样结构域具有如下所示的SEQ ID NO:130的氨基酸序列。
本文中使用的术语“表位”是指能够与抗体结合的抗原决定簇。表位通常包含分子的表面基团例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于与前者(而非后者)的结合在变性溶剂的存在下会丢失。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其他氨基酸残基，例如被特定抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基在特定抗原结合肽的“覆盖区(footprint)”内)。表位通常包含至少3个，并且更通常是至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个空间构象独特的氨基酸。
本发明的基于MuSK抗体的分子相比结合替代表位更频繁、更快速、更持久和/或以更强的亲和力或亲合力免疫特异性地结合SEQ ID NO:130的MuSK Fz样结构域序列中的表位。在一个实施方案中，本文中所述的基于MuSK抗体的分子与SEQ ID NO:130的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基免疫特异性地结合。本文中使用的术语“亲和力”、“特异性结合”、“结合”、“免疫特异性结合”、“结合活性”或“特异性结合活性”是指本文中所定义的抗体或抗体片段与SEQ ID NO:130的MuSK-Fz样结构域序列内的表位结合的程度。
在一个实施方案中，本文中公开的基于MuSK抗体的分子以对应于约10-7M或更小的KD的亲和力与MuSK Fz样结构域结合。例如，本文中公开的基于MuSK抗体的分子以对应于以下KD的亲和力与MuSK Fz样结构域结合，所述KD为约10-8M、约10-9M、约10-10M、约10-11M、约10-12M或更低，当通过例如表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)技术在Biacore 3000仪器中(优选使用抗体作为配体和MuSK作为分析物)所确定的。本文中所公开的基于MuSK抗体的分子以对应于以下KD的亲和力与MuSK Fz样结构域结合，所述KD是所述基于MuSK抗体的分子与非特异性抗原(例如，牛血清白蛋白、酪蛋白等)结合的亲和力至少10倍低，例如至少100倍低、例如至少1,000倍低、例如至少10,000倍低，例如至少100,000倍低。亲和力降低的量取决于抗体的KD，所以当抗体的KD非常低时(即抗体是高度特异性的)，那么对抗原的亲和力的量比对非特异性抗原的亲和力低，其可以是至少10,000倍低。本文中使用的术语“kd”(秒-1或1/秒)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。该值也称为koff值。本文中使用的术语“ka”(M-1×秒-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数。本文中使用的术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数并且通过将kd除以ka获得。本文中使用的术语“KA”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数并且通过将ka除以kd获得。
在一个实施方案中，本文中所述的基于MuSK抗体的分子对MuSK具有pH依赖性结合亲和力，这允许抗体再循环以增强抗原结合。例如，在一个实施方案中，缔合速率常数或解离速率常数在酸性与中性与碱性pH条件下可以不同。在一个实施方案中，与中性pH条件(例如约7.0至7.9的pH)相比，本文中所述的基于MuSK抗体的分子在酸性pH条件(例如<7.0的pH)下具有更高的解离速率常数。在一些实施方案中，与中性pH(约7.4的pH)相比，本文中所述的基于MuSK抗体的分子在酸性pH(例如，约5.5的pH)下具有2倍至3倍高的解离速率常数(即，降低的结合亲和力)。在一个实施方案中，基于MuSK抗体的分子与MuSK Fz样结构域结合，其亲和力在中性pH条件下比在酸性pH条件下更高。换言之，在一个实施方案中，基于MuSK抗体的分子与MuSK Fz样结构域结合，其解离速率在酸性pH条件下比在中性pH条件下更高。中性pH条件可以定义为包含7.0到7.9的pH。酸性pH条件可定义为小于7.0的pH。更高可意味着至少高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％。具有这种pH依赖性解离特征的抗体在结合和激活之后但在溶酶体降解之前与抗原解离。一旦解离，抗体就会通过新生Fc受体被转运回循环并被释放以结合更多抗原。
本发明的MuSK抗体与Fz样结构域内它们各自的表位的结合激活了MuSK信号传导。特别地，当本发明的MuSK抗体结合MuSK Fz样结构域中它们各自的表位时，这种结合诱导了MuSK磷酸化和激活，如上所述。相对于突触蛋白聚糖激活诱导的MuSK磷酸化，本发明的MuSK抗体诱导约50％至约100％的MuSK磷酸化(如在例如本文中所述的C2C12磷酸化测定中测量的)。在一个实施方案中，本发明的MuSK抗体诱导约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％95％的MuSK磷酸化(相对于突触蛋白聚糖激活诱导的MuSK磷酸化)。在一个实施方案中，本发明的基于MuSK抗体的分子在MuSK结合时诱导约90％至约100％的MuSK磷酸化(相对于由突触蛋白聚糖激活诱导的MuSK磷酸化)。MuSK的磷酸化可以使用技术人员已知的技术例如western印迹来评估。本文中实施例中描述的磷酸化测定(即，C2C12肌管磷酸化测定)也可用于评估磷酸化。
在一些实施方案中，本发明的MuSK抗体，即与MuSK的Fz-结构域结合的MuSK抗体，不干扰(即，不阻断、阻碍、抑制或减少)天然配体结合和MuSK的刺激。在一些实施方案中，MuSK抗体与其天然配体(即突触蛋白聚糖)共刺激MuSK激活，以产生累加的激活效应，例如MuSK磷酸化。因此，在一些实施方案中，本发明的MuSK抗体增强由天然配体结合诱导的天然MuSK激活，即磷酸化。在一些实施方案中，本发明的抗体与天然配体组合，将MuSK激活(即MuSK磷酸化)至>100％的内源性激活水平，例如至少110％、130％、150％、200％的内源性激活水平。可以如前所述评估MuSK的磷酸化。
因此，在一个实施方案中，本发明的基于MuSK抗体的分子的活性包括：(i)与人肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)的表位结合，所述表位存在于SEQ ID NO:130的MuSK卷曲(Fz)样结构域序列中，其中所述基于抗体的分子在与其表位结合之后诱导MuSK磷酸化，和/或(ii)与MuSK Fz样结构域的结合不阻断、阻碍或抑制天然或内源性MuSK配体诱导的磷酸化，并且可以增强所述天然或内源性MuSK配体诱导的磷酸化，以及(iii)与MuSK Fz样结构域的结合以在中性pH条件下比在酸性pH条件下更高的亲和力发生。
所有这些特征已在本文中进一步定义。
基于抗体的分子包括但不限于完整抗体、完整抗体的表位结合片段和抗体衍生物。抗体的表位结合片段可以通过亲本抗体的实际片段化获得(例如，Fab或(Fab)2片段)。或者，表位结合片段是包含这样的亲本抗体的部分氨基酸序列的氨基酸序列。如本文中使用的，如果分子通过亲本抗体或其部分的实际化学修饰获得，或者如果其包含的氨基酸序列为与这样的亲本抗体或其相关部分的氨基酸序列基本相似(例如，与这样的亲本分子或这样的其相关部分的差异小于30％、小于20％、小于10％或小于5％，或与这样的亲本分子或其相关部分的差异在于10个氨基酸残基或少于10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸残基)，则称该分子为抗体(或其相关部分)的“衍生物”。
在一个实施方案中，本发明的基于抗体的分子是完整的免疫球蛋白或具有其表位结合片段的分子。本文中使用的术语“片段”、“区域”、“部分”和“结构域”通常意在同义，除非它们的使用在上下文另有说明。天然存在的抗体通常包含四聚体，其通常由至少两条重(H)链和至少两条轻(L)链构成。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)构成，通常由三个结构域(CH1、CH2和CH3结构域)构成。重链可以是任何同种型，包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。每条轻链由轻链可变(VL)区和轻链恒定(CL)区构成。轻链包括κ链和λ链。重链和轻链可变区通常负责抗原识别，而重链和轻链恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为“互补决定区”或“CDR”，其散布着更保守序列的区域，称为“框架区”(framework region，FR)。每个VH和VL区由三个CDR结构域和四个FR结构域构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。特别相关的是这样的抗体及其表位结合片段，其已经“分离”，以便存在于不同于其中其可存在于自然界中的物理环境中，或者已被修饰以便在氨基酸序列上不同于天然存在的抗体。
表现出表位结合能力的抗体片段(包括Fab和(Fab)2片段)可以例如通过完整抗体的蛋白酶切割获得。单结构域抗体片段仅具有一个可变结构域(例如，VL或VH)。本发明涵盖的表位结合片段的实例包括(i)Fab'或Fab片段，其是包含VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含通过在铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)主要由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)基本上由VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward et al.“Binding Activities Of A Repertoire Of SingleImmunoglobulin Variable Domains Secreted From Escherichia coli,”Nature 341:544-546(1989)，其在此通过引用整体并入)，其基本上由VH或VL结构域组成并且也称为结构域抗体(Holt et al.“Domain Antibodies:Proteins For Therapy,”TrendsBiotechnol.21(11):484-490(2003)，其在此通过引用整体并入)；(vi)纳米抗体(Revetset al.“Nanobodies As Novel Agents For Cancer Therapy,”Expert Opin.Biol.Ther.5(l):l11-124(2005)，其在此通过引用整体并入)，以及(vii)分离的互补决定区(complementarity determining region，CDR)。表位结合片段可包含这样的抗体的1、2、3、4、5或全部6个CDR结构域。在一个实施方案中，抗体的片段(或区域或部分或结构域)包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：30至100个氨基酸或50至150个氨基酸或70至200个氨基酸。在一个实施方案中，抗体的片段(或区域或部分或结构域)的长度是抗体(全长抗体)长度的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一个实施方案中，片段是所述抗体的表位结合片段或功能片段，意味着预计它将至少在一定程度上引发抗体的活性。“至少在一定程度上”可以表示至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、150％、200％或更多。在一个实施方案中，抗体或抗体的片段应该引发抗体的可检测活性。抗体的活性已在本文中早先定义。
这样的抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得。例如，F(ab')2片段可以通过用胃蛋白酶处理全长抗体来产生。可以处理所得F(ab')2片段以减少二硫桥以产生Fab'片段。Fab片段可以通过用木瓜蛋白酶处理IgG抗体来获得，并且Fab'片段可以通过IgG抗体的胃蛋白酶消化获得。可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理F(ab')2片段来获得Fab'片段。抗体片段也可以通过在重组细胞中表达编码这样的片段的核酸来产生(参见例如，Evans et al.“Rapid Expression Of An Anti-Human C5 Chimeric Fab UtilizingA Vector That Replicates In COS And 293Cells,”J.Immunol.Meth.184:123-38(1995)，其在此通过引用整体并入)。例如，编码F(ab')2片段的一部分的嵌合基因可以包括编码CH1结构域和重链铰链区的DNA序列，随后是翻译终止密码子以产生这样的截短的抗体片段分子。可以以与完整抗体相同的方式容易地筛选能够与所期望表位结合的合适片段以供使用。
抗体衍生物包括含有抗体的至少一个表位结合结构域的那些分子，并且通常使用重组技术形成。一种示例性抗体衍生物包括单链Fv(scFv)。scFv由Fv片段的两个结构域VL区和VH区形成，它们可以由不同的基因编码。使用重组方法，通过灵活的接头(通常具有约10、12、15或更多个氨基酸残基)将这样的基因序列或其编码cDNA连接起来，这使得它们能够制成单个蛋白质链，其中VL和VH区域缔合以形成单价表位结合分子(参见例如，Bird etal.“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426(1988)；和Hustonet al.“Protein Engineering Of Antibody Binding Sites:Recovery Of SpecificActivity In An Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced In Escherichiacoli,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:5879-5883(1988)，其在此通过引用整体并入)。或者，通过使用不太短(例如，不少于约9个残基)的柔性接头以使不同单条多肽链的VL和VH区能够缔合在一起，其可以形成对两个不同的表位具有结合特异性的双特异性抗体。
在另一个实施方案中，抗体衍生物是二价或双价单链可变片段，其通过将两个scFv串联(即串联scFv)连接在一起或使它们二聚化形成双抗体来改造(Holliger et al.“‘Diabodies’:Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90(14),6444-8(1993)，其在此通过引用整体并入)。在又一个实施方案中，抗体是三抗体，即三价单链可变片段，其通过将三个scFv串联或以三聚体形式连接在一起以形成三抗体来改造。在另一个实施方案中，抗体是四个单链可变片段的四抗体。在另一个实施方案中，抗体是“线性抗体”，其是包含形成抗原结合区对的串联Fd区段对(VH-CH1-VH-CH1)的抗体(参见Zapata et al.Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)，其在此通过引用整体并入)。在另一个实施方案中，抗体衍生物是微抗体，其由与CH3区偶联的单链Fv区(即，scFv-CH3)组成。
本文中还讨论了这些和本发明背景下的其他有用抗体片段和衍生物。还应理解，除非另有说明，否则术语基于抗体的分子还包括抗体样多肽，例如嵌合抗体和人源化抗体，以及保留与抗原特异性结合能力的抗体片段(表位结合片段或功能片段)，其由任何已知技术，例如酶促切割、肽合成和重组技术提供。在一个实施方案中，措辞“基于抗体的分子”可以由词语“抗体”或由表述“抗体或其功能片段”替代。
如本文中产生的抗体可以是任何同种型。本文中使用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。同种型的选择通常由所期望的效应物功能指导，例如抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependentcellular cytotoxicity，ADCC)诱导。示例性同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。本文中公开的MuSK抗体的特别有用的同种型包括IgG1和IgG2。
可以使用人轻链恒定区κ或λ。如果期望的话，可以通过已知方法转换本发明的MuSK抗体的类别。例如，原本是IgM的本发明的抗体可以被类别转换为本发明的IgG抗体。此外，类别转换技术可用于将一种IgG亚类转化为另一种，例如从IgG1转化为IgG2。因此，本发明的抗体的效应物功能可以通过同种型转换而改变为，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体以用于多种治疗用途。
在一个实施方案中，本发明的基于抗体的分子是“人源化的”，特别是如果它们待用于治疗目的时。术语“人源化”是指通常使用重组技术制备的嵌合分子，其具有来源于来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余免疫球蛋白结构。抗原结合位点可以包含与人恒定结构域融合的完整非人抗体可变结构域，或者包含接枝到人可变结构域的适当人框架区的这样的可变结构域的仅互补决定区(CDR)。这样的人源化分子的框架残基可以是野生型的(例如，完全是人的)，或者它们可以经修饰以包含人抗体(人抗体的序列已作为人源化的基础)中不存在的一个或更多个氨基酸替换。人源化减少了或消除了分子的恒定区将在人个体中充当免疫原的可能性，但对外源可变区的免疫应答的可能性仍然存在(LoBuglio,A.F.et al.“Mouse/Human ChimericMonoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:4220-4224(1989)，其在此通过引用整体并入)。另一种方法不仅侧重于提供人来源的恒定区，而且修饰可变区以重构它们使其尽可能接近人形式。重链和轻链的可变区都包含三个互补决定区(CDR)，它们响应于所讨论的抗原而变化并决定结合能力。CDR侧接四个框架区(FR)，它们在给定的物种中相对保守，并且假定为CDR提供了支架。当针对特定抗原制备非人抗体时，可通过将来源于非人抗体的CDR接枝到待修饰的人抗体中存在的FR上来“重构”或“人源化”可变区。用于人源化本文中所述的非人抗体的合适方法是本领域已知的，参见例如Sato,K.et al.,Cancer Res 53:851-856(1993)；Riechmann,L.et al.,“Reshaping Human Antibodies for Therapy,”Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen,M.et al.,“Reshaping Human Antibodies:Grafting AnAntilysozyme Activity,”Science 239:1534-1536(1988)；Kettleborough,C.A.et al.,“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting:The ImportanceOf Framework Residues On Loop Conformation,”Protein Engineering 4:773-3783(1991)；Maeda,H.et al.,“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,”Human Antibodies Hybridoma 2:124-134(1991)；Gorman,S.D.et al.,“Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4181-4185(1991)；Tempest,P.R.et al.,“Reshaping A Human Monoclonal Antibody ToInhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection In Vivo,”Bio/Technology9:266-271(1991)；Co,M.S.et al.,“Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2869-2873(1991；Carter,P.et al.,“Humanization Of AnAnti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-4289(1992)；和Co,M.S.et al.,“Chimeric And Humanized Antibodies WithSpecificity For The CD33 Antigen,”J.Immunol.148:1149-1154(1992)，其在此通过引用整体并入。在一些实施方案中，本发明的人源化MuSK抗体保留所有CDR序列(例如，包含来自美洲驼或小鼠抗体的所有六个CDR的人源化抗体)。在另一些实施方案中，本发明的人源化MuSK抗体具有相对于原始抗体改变的一个或更多个CDR(一、二、三、四、五、六个)。将抗体人源化的方法是本领域公知的并且适合于将本文中公开的抗体人源化(参见，例如，Winter的美国专利号5,225,539；Queen和Selick的美国专利号5,530,101和5,585,089；Robert等的美国专利号5,859,205；Carter的美国专利号6,407,213；以及Foote的美国专利号6,881,557，其在此通过引用整体并入)。
在一些抗体中，仅需要CDR的一部分，即称为“特异性决定残基”(“specificitydetermining residue，SDR”)的结合所需的CDR残基的子集来保持抗体的结合。不接触抗原且不在SDR中的CDR残基可以基于先前对位于Chothia高变环之外的Kabat CDR区域的研究(参见Kabat et al.,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,NationalInstitutes of Health Publication No.91-3242(1992)；Chothia,C.et al.,“CanonicalStructures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，其在此通过引用整体并入)通过分子建模和/或经验或如Gonzales,N.R.etal.,“SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human GermlineTemplates To Minimize Its Immunogenicity,”Mol.Immunol.41:863-872(2004)(其在此通过引用整体并入)中所述进行鉴定。在这样的人源化抗体中，在其中一个或更多个供体CDR残基不存在或其中整个供体CDR被省略的位置处，占据所述位置的氨基酸残基可以是占据接受体抗体序列中相应位置的氨基酸残基(通过Kabat编号)。所包括的CDR中供体氨基酸的接受体的这样的替换的数量反映了竞争考虑的平衡。这样的替换可有利于减少人源化抗体中非人氨基酸的数量，并从而降低潜在的免疫原性。然而，替换也可引起亲和力的变化，并且优选避免亲和力的显著降低。替换也可导致活性变化。还优选避免这样的导致活性显著降低的替换。在这种情况下，抗体或抗体片段仍应表现出如本文中早先定义的抗体的可检测活性或至少在一定程度上表现出抗体的活性。也可以凭经验选择CDR内的替换位置和要替换的氨基酸。
噬菌体展示技术可替代地用于提高(或降低)本发明的基于抗体的分子的CDR亲和力。该技术(称为亲和力成熟)采用诱变或“CDR步移(CDR walking)”和使用靶抗原或其抗原片段进行重新选择，以鉴定当与初始或亲本抗体比较时具有以更高(或更低)亲和力与抗原结合的CDR的抗体(参见例如Glaser et al.,“Antibody Engineering By Codon-BasedMutagenesis In A Filamentous Phage Vector System,”J.Immunology 149:3903-3913(1992)，其在此通过引用整体并入)。诱变整个密码子而不是单个核苷酸导致氨基酸突变的半随机库。文库可以由变体克隆库组成构成，每个变体克隆与这样的文库的另一个成员的不同之处在于单个CDR中的单个氨基酸改变，并且其包含可能代表每个CDR残基的每个可能氨基酸替换的变体。可以通过将固定化的突变体与经标记的抗原接触来筛选对抗原具有提高(或降低)的结合亲和力的突变体。本领域已知的任何筛选方法可用于鉴定对抗原具有提高或降低的亲和力的基于变体抗体的结合分子(例如，ELISA)(参见Wu,H.et al.,“Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin,An Alphav Beta3-SpecificHumanized mAb,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:6037-6042(1998)；Yelton et al.,“Affinity Maturation Of The BR96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-BasedMutagenesis,”J.Immunology 155:1994(1995)，其在此通过引用整体并入)。可以使用使轻链随机化的“CDR步移”(参见Schier,R.et al.,“Isolation Of Picomolar AffinityAnti-c-erbB-2Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The ComplementarityDetermining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site,”J.Mol.Biol.263:551-567(1996)，其在此通过引用整体并入)。
用于MuSK抗体分子亲和力成熟的方法在本文中描述并公开于例如Krause,J.C.etal.,“An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site ArchitectureEnhances Function of a Human Antibody,”MBio.2(1):e00345-10(2011)；Kuan,C.T.etal.,“Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant ImmunotoxinsTargeting Malignant Gliomas And Melanomas,”Int.J.Cancer 10.1002/ijc.25645(2010)；Hackel,B.J.et al.,“Stability And CDR Composition Biases Enrich BinderFunctionality Landscapes,”J.Mol.Biol.401(1):84-96(2010)；Montgomery,D.L.etal.,“Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal AntibodyAgainst HIV-1gp41,”MAbs 1(5):462-474(2009)；Gustchina,E.et al.,“AffinityMaturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal FabDerived From A Synthetic
Human Antibody Library And Directed AgainstThe Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With ImprovedHIV-1Neutralization Potency And Breadth,”Virology393(1):112-119(2009)；Finlay,W.J.et al.,“Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGETherapy:Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of MutationalPlasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions,”J.Mol.Biol.388(3):541-558(2009)；Bostrom,J.et al.,“Improving Antibody BindingAffinity And Specificity For Therapeutic Development,”Methods Mol.Biol.525:353-376(2009)；Steidl,S.et al.,“In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSFAntibodies By Targeted CDR-Diversification,”Mol.Immunol.46(1):135-144(2008)；和Barderas,R.et al.,“Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In SilicoModeling,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105(26):9029-9034(2008)，其在此通过引用整体并入。
在本发明的一个方面中，如本文中所述的基于MuSK抗体的分子包含任意一个、任意两个、任意三个、任意四个、任意五个或任意六个如本文中表1和表2中提供的CDR的氨基酸序列。
在一方面中，与人肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)结合的基于抗体的分子包含重链可变区，其中重链可变区包含：(i)互补决定区1(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:1至16、135、136、147至149中任一个的氨基酸序列，或者经修饰的SEQ ID NO:1至16、135、136、147至149中任一个的氨基酸序列，所述经修饰序列与SEQ ID NO:1至16、135、136、147至149中的任一个具有至少80％序列同一性；(ii)互补决定区2(CDR-H2)，其包含SEQ ID NO:17至32、137、138、150至155中任一个的氨基酸序列，或者经修饰的SEQ ID NO:17至32、137、138、150至155中任一个的氨基酸序列，所述经修饰序列与SEQ ID NO:17至32、137、138、150至155中任一个具有至少80％序列同一性；和(iii)互补决定区3(CDR-H3)，其包含SEQ ID NO:33至48、139、140、156至158、240至251中任一个的氨基酸序列，或者经修饰的SEQ ID NO:33至48、139、140、156至158、或240至251中任一个的氨基酸序列，所述经修饰序列与SEQ IDNO:33至48、139、140、156至158、或240至251中的任一个具有至少80％序列同一性。
在一个实施方案中，与人肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)结合的基于抗体的分子包含：(i)包含SEQ ID NO:1的CDR-H1、SEQ ID NO:17的CDR-H2和SEQ ID NO:33的CDR-H3的重链可变区；(ii)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:34的CDR-H3的重链可变区；(iii)包含SEQ ID NO:3的CDR-H1、SEQ ID NO:19的CDR-H2和SEQ IDNO:35的CDR-H3的重链可变区；(iv)包含SEQ ID NO:4的CDR-H1、SEQ ID NO:20的CDR-H2和SEQ ID NO:36的CDR-H3的重链可变区；(v)包含SEQ ID NO:5的CDR-H1、SEQ ID NO:21的CDR-H2和SEQ ID NO:37的CDR-H3的重链可变区；(vi)包含SEQ ID NO:6的CDR-H1、SEQ IDNO:22的CDR-H2和SEQ ID NO:38的CDR-H3的重链可变区；(vii)包含SEQ ID NO:7的CDR-H1、SEQ ID NO:23的CDR-H2和SEQ ID NO:39的CDR-H3的重链可变区；(viii)包含SEQ ID NO:8的CDR-H1、SEQ ID NO:24的CDR-H2和SEQ ID NO:40的CDR-H3的重链可变区；(ix)包含SEQID NO:9的CDR-H1、SEQ ID NO:25的CDR-H2和SEQ ID NO:41的CDR-H3的重链可变区；(x)包含SEQ ID NO:10的CDR-H1、SEQ ID NO:26的CDR-H2和SEQ ID NO:42的CDR-H3的重链可变区；(xi)包含SEQ ID NO:11的CDR-H1、SEQ ID NO:27的CDR-H2和SEQ ID NO:43的CDR-H3的重链可变区；(xii)包含SEQ ID NO:12的CDR-H1、SEQ ID NO:28的CDR-H2和SEQ ID NO:44的CDR-H3的重链可变区；(xiii)包含SEQ ID NO:13的CDR-H1、SEQ ID NO:29的CDR-H2和SEQID NO:45的CDR-H3的重链可变区；(xiv)包含SEQ ID NO:14的CDR-H1、SEQ ID NO:30的CDR-H2和SEQ ID NO:46的CDR-H3的重链可变区；(xv)包含SEQ ID NO:15的CDR-H1、SEQ ID NO:31的CDR-H2和SEQ ID NO:47的CDR-H3的重链可变区；(xvi)包含SEQ ID NO:16的CDR-H1、SEQ ID NO:32的CDR-H2和SEQ ID NO:48的CDR-H3的重链可变区；(xvii)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:139的CDR-H3的重链可变区；和(xviii)包含SEQ ID NO:136的CDR-H1、SEQ ID NO:138的CDR-H2和SEQ ID NO:140的CDR-H3的重链可变区。重链CDR序列的序列在下表1中提供。
在一个实施方案中，与人肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)结合的基于抗体的分子包含：(ii.a)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:240的CDR-H3的重链可变区(X2m1)；(ii.b)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:241的CDR-H3的重链可变区(X2m2)；(ii.c)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ IDNO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:242的CDR-H3的重链可变区(X2m3)；(ii.d)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:243的CDR-H3的重链可变区(X2m4)；(ii.e)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:244的CDR-H3的重链可变区(X2m5)；(ii.f)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:245的CDR-H3的重链可变区(X2m6)；(ii.g)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:246的CDR-H3的重链可变区(X2m7)；(ii.h)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ IDNO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:247的CDR-H3的重链可变区(X2m8)。
在一个实施方案中，与人肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)结合的基于抗体的分子包含：(xvii.a)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:248的CDR-H3的重链可变区(X17m1)；(xvii.b)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:249的CDR-H3的重链可变区(X17m2)；(xvii.c)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:250的CDR-H3的重链可变区(X17m3)；(xvii.d)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:251的CDR-H3的重链可变区(X17m6)。
在一个实施方案中，与人肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)结合的基于抗体的分子包含重链可变区，其中重链可变区包含：(xix)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区；(xx)包含SEQ ID NO:148的CDR-H1、SEQ ID NO:151的CDR-H2和SEQ ID NO:157的CDR-H3的重链可变区；(xxi)包含SEQ ID NO:149的CDR-H1、SEQ ID NO:152的CDR-H2和SEQ ID NO:158的CDR-H3的重链可变区；
在一个实施方案中，与人肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)结合的基于抗体的分子包含重链可变区，其中重链可变区包含：(xxii)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ IDNO:153的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区(3B2g1m1/3B2g2m1)；(xxiii)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:154的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区(3B2g1m2/3B2g2m2)；(xxiv)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:155的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区(3B2g1m4/3B2g2m4)。重链CDR序列的序列在下表1中提供。
在一个实施方案中，与人肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)结合的基于抗体的分子包含重链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:153的CDR-H2或与SEQ ID NO:153具有至少80％序列同一性的CDR-H2氨基酸序列，以及SEQ ID NO:156的CDR-H3(3B2g2m1)。根据该实施方案，与SEQ ID NO:153具有至少80％序列同一性的CDR-H2氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:153的氨基酸序列的一个或更多个氨基酸替换，其中所述替换存在于残基1、2、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或其任意组合处。在一个实施方案中，CDR-H2氨基酸序列与SEQ ID NO:153具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一个实施方案中，抗体的CDR-H2在第3位包含脯氨酸(P)、在第4位包含色氨酸(W)以及在第5位包含丝氨酸(S)或天冬酰胺(N)。
在一个实施方案中，与人肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)结合的基于抗体的分子包含重链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:153的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3。
下表1中提供了重链CDR序列的序列。
表1.MuSK抗体的重链CDR序列
在一些实施方案中，本文中公开的基于MuSK抗体的分子还包含轻链可变区。轻链可变区包含：(i)互补决定区1(CDR-L1)，其具有SEQ ID NO:49至64、141、142、159至169中任一个的氨基酸序列，或者经修饰的SEQ ID NO:49至64、141、142或159至169中任一个的氨基酸序列，所述经修饰序列与SEQ ID NO:49至64、141、142或159至169中的任一个具有至少80％序列同一性；(ii)互补决定区2(CDR-L2)，其具有SEQ ID NO:65至80、143、144、170至179中任一个的氨基酸序列，或者经修饰SEQ ID NO:65至80、143、144或170至179中任一个的氨基酸序列，所述经修饰序列与SEQ ID NO:65至80、143、144或170至179中任一个具有至少80％序列同一性；和(iii)互补决定区3(CDR-L3)，其具有SEQ ID NO:81至96、145、146、180至195中任一个的氨基酸序列，或者经修饰的SEQ ID NO:81至96、145、146或180至195中任一个的氨基酸序列，所述经修饰序列与SEQ ID NO:81至96、145、146或180至195中的任一个具有至少80％序列同一性。
在一个实施方案中，本文中公开的基于MuSK抗体的分子的轻链可变区包含：(i)包含SEQ ID NO:49的CDR-L1、SEQ ID NO:65的CDR-L2和SEQ ID NO:81的CDR-L3的轻链可变区；(ii)包含SEQ ID NO:50的CDR-L1、SEQ ID NO:66的CDR-L2和SEQ ID NO:82的CDR-L3的轻链可变区；(iii)包含SEQ ID NO:51的CDR-L1、SEQ ID NO:67的CDR-L2和SEQ ID NO:83的CDR-L3的轻链可变区；(iv)包含SEQ ID NO:52的CDR-L1、SEQ ID NO:68的CDR-L2和SEQ IDNO:84的CDR-L3的轻链可变区；(v)包含SEQ ID NO:53的CDR-L1、SEQ ID NO:69的CDR-L2和SEQ ID NO:85的CDR-L3的轻链可变区；(vi)包含SEQ ID NO:54的CDR-L1、SEQ ID NO:70的CDR-L2和SEQ ID NO:86的CDR-L3的轻链可变区；(vii)包含SEQ ID NO:55的CDR-L1、SEQ IDNO:71的CDR-L2和SEQ ID NO:87的CDR-L3的轻链可变区；(viii)包含SEQ ID NO:56的CDR-L1、SEQ ID NO:72的CDR-L2和SEQ ID NO:88的CDR-L3的轻链可变区；(ix)包含SEQ ID NO:57的CDR-L1、SEQ ID NO:73的CDR-L2和SEQ ID NO:89的CDR-L3的轻链可变区；(x)包含SEQID NO:58的CDR-L1、SEQ ID NO:74的CDR-L2和SEQ ID NO:90的CDR-L3的轻链可变区；(xi)包含SEQ ID NO:59的CDR-L1、SEQ ID NO:75的CDR-L2和SEQ ID NO:91的CDR-L3的轻链可变区；(xii)包含SEQ ID NO:60的CDR-L1、SEQ ID NO:76的CDR-L2和SEQ ID NO:92的CDR-L3的轻链可变区；(xiii)包含SEQ ID NO:61的CDR-L1、SEQ ID NO:77的CDR-L2和SEQ ID NO:93的CDR-L3的轻链可变区；(xiv)包含SEQ ID NO:62的CDR-L1、SEQ ID NO:78的CDR-L2和SEQID NO:94的CDR-L3的轻链可变区；(xv)包含SEQ ID NO:63的CDR-L1、SEQ ID NO:79的CDR-L2和SEQ ID NO:95的CDR-L3的轻链可变区；(xvi)包含SEQ ID NO:64的CDR-L1、SEQ ID NO:80的CDR-L2和SEQ ID NO:96的CDR-L3的轻链可变区；(xvii)包含SEQ ID NO:141的CDR-L1、SEQ ID NO:143的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3的轻链可变区；(xviii)包含SEQ IDNO:142的CDR-L1、SEQ ID NO:144的CDR-L2和SEQ ID NO:146的CDR-L3的轻链可变区。轻链CDR序列的序列在下表2中提供。
在一个实施方案中，本文中公开的基于MuSK抗体的分子的轻链可变区包含：(xix)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:170的CDR-L2和SEQ ID NO:180的CDR-L3的轻链可变区；(xx)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:171的CDR-L2和SEQ ID NO:181的CDR-L3的轻链可变区；(xxi)包含SEQ ID NO:160的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQID NO:182的CDR-L3的轻链可变区；(xxii)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区；(xxiii)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:171的CDR-L2和SEQ ID NO:184的CDR-L3的轻链可变区；(xxiv)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:173的CDR-L2和SEQ ID NO:185的CDR-L3的轻链可变区；(xxv)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:173的CDR-L2和SEQ ID NO:186的CDR-L3的轻链可变区；(xxvi)包含SEQ ID NO:161的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:187的CDR-L3的轻链可变区；(xxvii)包含SEQ ID NO:162的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:188的CDR-L3的轻链可变区；(xxviii)包含SEQ ID NO:163的CDR-L1、SEQ IDNO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:188的CDR-L3的轻链可变区；(xxix)包含SEQ ID NO:164的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:189的CDR-L3的轻链可变区；(xxx)包含SEQID NO:165的CDR-L1、SEQ ID NO:175的CDR-L2和SEQ ID NO:190的CDR-L3的轻链可变区；(xxxi)包含SEQ ID NO:166的CDR-L1、SEQ ID NO:176的CDR-L2和SEQ ID NO:191的CDR-L3的轻链可变区；(xxxi)包含SEQ ID NO:167的CDR-L1、SEQ ID NO:177的CDR-L2和SEQ IDNO:192的CDR-L3的轻链可变区；(xxxii)包含SEQ ID NO:168的CDR-L1、SEQ ID NO:178的CDR-L2和SEQ ID NO:193的CDR-L3的轻链可变区；(xxxiii)包含SEQ ID NO:169的CDR-L1、SEQ ID NO:179的CDR-L2和SEQ ID NO:194的CDR-L3的轻链可变区。
在一个实施方案中，本文中公开的基于MuSK抗体的分子的轻链可变区包含SEQ IDNO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:195的CDR-L3或与SEQ ID NO:195具有至少80％序列同一性的CDR-L3。根据该实施方案，与SEQ ID NO:195具有至少80％序列同一性的CDR-L3氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:195的氨基酸序列的一个或更多个氨基酸替换，其中所述替换存在于残基1、2、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或其任意组合处。在一个实施方案中，CDR-L3氨基酸序列与SEQ ID NO:195具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
下表2中提供了轻链CDR序列的序列。
表2.MuSK抗体的轻链CDR序列
对本文中公开的基于MuSK抗体的分子的重链CDR序列和/或轻链CDR序列的合适的氨基酸修饰包括，例如导致变体CDR序列具有与上述的本文中公开的CDR序列相似或增强的结合特征的保守替换或功能等同的氨基酸残基替换。本发明涵盖表1和表2的CDR，其包含维持或增强抗体的MuSK结合的1、2、3、4、5个或更多个氨基酸替换(取决于CDR的长度)。所得经修饰的CDR在序列上与表1和表2的CDR有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％相似。对表1的重链CDR序列和/或表1和表2的轻链CDR序列合适的氨基酸修饰包括，例如导致变体CDR序列具有与表1和表2中CDR序列相似或增强的结合特征的保守替换或功能等同的氨基酸残基替换。保守替换是在其侧链相关的氨基酸家族中发生的那些。遗传编码的氨基酸可分为四个家族：(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；(3)非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；和(4)不带电荷的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香族氨基酸。或者，氨基酸库可分为(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性(赖氨酸、精氨酸组氨酸)，(3)脂肪族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)，其中丝氨酸和苏氨酸任选地单独分为脂肪族-羟基；(4)芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；(5)酰胺(天冬酰胺、谷氨酰胺)；和(6)含硫(半胱氨酸和甲硫氨酸)(Stryer(ed.),Biochemistry,2nd ed,WH Freeman and Co.,1981，其在此通过引用整体并入)。还可以对表1的重链CDR序列和表2的轻链CDR序列进行非保守替换。非保守替换涉及用来自不同类别的氨基酸的一个或更多个氨基酸残基替换CDR的一个或更多个氨基酸残基以改善或增强CDR的结合特性。表1的重链可变区CDR和/或表2的轻链可变区CDR的氨基酸序列还可以包含维持或增强MuSK结合的一个或更多个内部中性氨基酸插入或缺失。
在一个实施方案中，基于MuSK抗体的分子包含：
(i)包含SEQ ID NO:1的CDR-H1、SEQ ID NO:17的CDR-H2和SEQ ID NO:33的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:49的CDR-L1、SEQ ID NO:65的CDR-L2和SEQ ID NO:81的CDR-L3的轻链可变区；
(ii)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:34的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:50的CDR-L1、SEQ ID NO:66的CDR-L2和SEQ ID NO:82的CDR-L3的轻链可变区；
(iii)包含SEQ ID NO:3的CDR-H1、SEQ ID NO:19的CDR-H2和SEQ ID NO:35的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:51的CDR-L1、SEQ ID NO:67的CDR-L2和SEQ ID NO:83的CDR-L3的轻链可变区；
(iv)包含SEQ ID NO:4的CDR-H1、SEQ ID NO:20的CDR-H2和SEQ ID NO:36的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:52的CDR-L1、SEQ ID NO:68的CDR-L2和SEQ ID NO:84的CDR-L3的轻链可变区；
(v)包含SEQ ID NO:5的CDR-H1、SEQ ID NO:21的CDR-H2和SEQ ID NO:37的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:53的CDR-L1、SEQ ID NO:69的CDR-L2和SEQ ID NO:85的CDR-L3的轻链可变区；
(vi)包含SEQ ID NO:6的CDR-H1、SEQ ID NO:22的CDR-H2和SEQ ID NO:38的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:54的CDR-L1、SEQ ID NO:70的CDR-L2和SEQ ID NO:86的CDR-L3的轻链可变区；
(vii)包含SEQ ID NO:7的CDR-H1、SEQ ID NO:23的CDR-H2和SEQ ID NO:39的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:55的CDR-L1、SEQ ID NO:71的CDR-L2和SEQ ID NO:87的CDR-L3的轻链可变区；
(viii)包含SEQ ID NO:8的CDR-H1、SEQ ID NO:24的CDR-H2和SEQ ID NO:40的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:56的CDR-L1、SEQ ID NO:72的CDR-L2和SEQ IDNO:88的CDR-L3的轻链可变区；
(ix)包含SEQ ID NO:9的CDR-H1、SEQ ID NO:25的CDR-H2和SEQ ID NO:41的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:57的CDR-L1、SEQ ID NO:73的CDR-L2和SEQ ID NO:89的CDR-L3的轻链可变区；
(x)包含SEQ ID NO:10的CDR-H1、SEQ ID NO:26的CDR-H2和SEQ ID NO:42的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:58的CDR-L1、SEQ ID NO:74的CDR-L2和SEQ ID NO:90的CDR-L3的轻链可变区；
(xi)包含SEQ ID NO:11的CDR-H1、SEQ ID NO:27的CDR-H2和SEQ ID NO:43的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:59的CDR-L1、SEQ ID NO:75的CDR-L2和SEQ ID NO:91的CDR-L3的轻链可变区；
(xii)包含SEQ ID NO:12的CDR-H1、SEQ ID NO:28的CDR-H2和SEQ ID NO:44的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:60的CDR-L1、SEQ ID NO:76的CDR-L2和SEQ IDNO:92的CDR-L3的轻链可变区；
(xiii)包含SEQ ID NO:13的CDR-H1、SEQ ID NO:29的CDR-H2和SEQ ID NO:45的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:61的CDR-L1、SEQ ID NO:77的CDR-L2和SEQ IDNO:93的CDR-L3的轻链可变区；
(xiv)包含SEQ ID NO:14的CDR-H1、SEQ ID NO:30的CDR-H2和SEQ ID NO:46的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:62的CDR-L1、SEQ ID NO:78的CDR-L2和SEQ IDNO:94的CDR-L3的轻链可变区；
(xv)包含SEQ ID NO:15的CDR-H1、SEQ ID NO:31的CDR-H2和SEQ ID NO:47的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:63的CDR-L1、SEQ ID NO:79的CDR-L2和SEQ ID NO:95的CDR-L3的轻链可变区；
(xvi)包含SEQ ID NO:16的CDR-H1、SEQ ID NO:32的CDR-H2和SEQ ID NO:48的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:64的CDR-L1、SEQ ID NO:80的CDR-L2和SEQ IDNO:96的CDR-L3的轻链可变区；
(xvii)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:139的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:141的CDR-L1、SEQ ID NO:143的CDR-L2和SEQID NO:145的CDR-L3的轻链可变区；和
(xviii)包含SEQ ID NO:136的CDR-H1、SEQ ID NO:138的CDR-H2和SEQ ID NO:140的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:142的CDR-L1、SEQ ID NO:144的CDR-L2和SEQID NO:146的CDR-L3的轻链可变区。
在一个实施方案中，基于MuSK抗体的分子包含：
(ii.a)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:240的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:50的CDR-L1、SEQ ID NO:66的CDR-L2和SEQ IDNO:82的CDR-L3的轻链可变区(X2m1)；
(ii.b)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:241的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:50的CDR-L1、SEQ ID NO:66的CDR-L2和SEQ IDNO:82的CDR-L3的轻链可变区(X2m2)；
(ii.c)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:242的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:50的CDR-L1、SEQ ID NO:66的CDR-L2和SEQ IDNO:82的CDR-L3的轻链可变区(X2m3)；
(ii.d)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:243的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:50的CDR-L1、SEQ ID NO:66的CDR-L2和SEQ IDNO:82的CDR-L3的轻链可变区(X2m4)；
(ii.e)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:244的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:50的CDR-L1、SEQ ID NO:66的CDR-L2和SEQ IDNO:82的CDR-L3的轻链可变区(X2m5)；
(ii.f)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:245的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:50的CDR-L1、SEQ ID NO:66的CDR-L2和SEQ IDNO:82的CDR-L3的轻链可变区(X2m6)；
(ii.g)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:246的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:50的CDR-L1、SEQ ID NO:66的CDR-L2和SEQ IDNO:82的CDR-L3的轻链可变区(X2m7)；
(ii.f)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:247的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:50的CDR-L1、SEQ ID NO:66的CDR-L2和SEQ IDNO:82的CDR-L3的轻链可变区(X2m8)。
在一个实施方案中，基于MuSK抗体的分子包含：
(xvii.a)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:248的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:141的CDR-L1、SEQ ID NO:143的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3的轻链可变区(X17m1)；
(xvii.b)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:249的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:141的CDR-L1、SEQ ID NO:143的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3的轻链可变区(X17m2)；
(xvii.c)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:250的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:141的CDR-L1、SEQ ID NO:143的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3的轻链可变区(X17m3)；
(xvii.d)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:251的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:141的CDR-L1、SEQ ID NO:143的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3的轻链可变区(X17m6)。
在一个实施方案中，基于MuSK抗体的分子包含：
(i)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:170的CDR-L2和SEQ IDNO:180的CDR-L3的轻链可变区(14D10)；
(ii)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:171的CDR-L2和SEQ IDNO:181的CDR-L3的轻链可变区(7G4)；
(iii)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:160的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ IDNO:182的CDR-L3的轻链可变区(3C4)；
(iv)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ IDNO:183的CDR-L3的轻链可变区(3B2)；
(v)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:171的CDR-L2和SEQ IDNO:184的CDR-L3的轻链可变区(3G3)；
(vi)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:173的CDR-L2和SEQ IDNO:185的CDR-L3的轻链可变区(31G2)；
(vii)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:173的CDR-L2和SEQ IDNO:186的CDR-L3的轻链可变区(31B7)；
(viii)包含SEQ ID NO:148的CDR-H1、SEQ ID NO:151的CDR-H2和SEQ ID NO:157的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:161的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQID NO:187的CDR-L3的轻链可变区(17H10)；
(ix)包含SEQ ID NO:148的CDR-H1、SEQ ID NO:151的CDR-H2和SEQ ID NO:157的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:162的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ IDNO:188的CDR-L3的轻链可变区(23B6)；
(x)包含SEQ ID NO:148的CDR-H1、SEQ ID NO:151的CDR-H2和SEQ ID NO:157的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:163的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ IDNO:188的CDR-L3的轻链可变区(30E1)；
(xi)包含SEQ ID NO:148的CDR-H1、SEQ ID NO:151的CDR-H2和SEQ ID NO:157的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:164的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ IDNO:189的CDR-L3的轻链可变区(30A11)；
(xii)包含SEQ ID NO:149的CDR-H1、SEQ ID NO:152的CDR-H2和SEQ ID NO:158的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:165的CDR-L1、SEQ ID NO:175的CDR-L2和SEQ IDNO:190的CDR-L3的轻链可变区(16F11)；
(xiii)包含SEQ ID NO:149的CDR-H1、SEQ ID NO:152的CDR-H2和SEQ ID NO:158的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:166的CDR-L1、SEQ ID NO:176的CDR-L2和SEQID NO:191的CDR-L3的轻链可变区(4C11)；
(xiv)包含SEQ ID NO:149的CDR-H1、SEQ ID NO:152的CDR-H2和SEQ ID NO:158的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:167的CDR-L1、SEQ ID NO:177的CDR-L2和SEQ IDNO:192的CDR-L3的轻链可变区(7A12)；
(xv)包含SEQ ID NO:149的CDR-H1、SEQ ID NO:152的CDR-H2和SEQ ID NO:158的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:168的CDR-L1、SEQ ID NO:178的CDR-L2和SEQ IDNO:193的CDR-L3的轻链可变区(7G12)；
(xvi)包含SEQ ID NO:149的CDR-H1、SEQ ID NO:152的CDR-H2和SEQ ID NO:158的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:169的CDR-L1、SEQ ID NO:179的CDR-L2和SEQ IDNO:194的CDR-L3的轻链可变区(7B8)；
(xvii)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:153的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQID NO:183的CDR-L3的轻链可变区(3B2g1m1)；
(xviii)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:154的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQID NO:183的CDR-L3的轻链可变区(3B2g1m2)；
(xvix)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:155的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQID NO:183的CDR-L3的轻链可变区(3B2g1m4)；
(xx)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:153的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ IDNO:195的CDR-L3的轻链可变区(3B2g2m1)；
(xxi)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:154的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ IDNO:195的CDR-L3的轻链可变区(3B2g2m2)；和
(xxii)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:155的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQID NO:195的CDR-L3的轻链可变区(3B2g2m4)。
在一个优选实施方案中，基于MuSK抗体的分子包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:153的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ IDNO:195的CDR-L3(3B2g2m1)。
本文中所述的基于MuSK抗体的分子可包含可变轻(VL)链、可变重(VH)链或VL和VH链的组合。在一些实施方案中，基于MuSK抗体的分子的VH链包含下表3中提供的VH氨基酸序列中的任一者，或与表3中列出的VH氨基酸序列中的任一者具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，基于MuSK抗体的分子的VL链包含下表3中提供的VL氨基酸序列中的任一者，或与表3中列出的VL氨基酸序列中的任一者具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的氨基酸序列。
表3.MuSK抗体可变重链(VH)和可变轻链(VL)抗体序列
在一个实施方案中，本文中公开的基于MuSK抗体的分子含有：(i)包含与SEQ IDNO:97具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:98具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(ii)包含与SEQ ID NO:99和252至259中任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:100具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(iii)包含与SEQ ID NO:101具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:102具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(iv)包含与SEQ ID NO:103具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:104具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(v)包含与SEQ ID NO:105具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:106具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(vi)包含与SEQ ID NO:107具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:108具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；或(vii)包含与SEQ ID NO:109具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:110具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(viii)包含与SEQ ID NO:111具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:112具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(ix)包含与SEQ ID NO:113具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:114具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(x)包含与SEQ ID NO:115具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:116具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xi)包含与SEQ ID NO:117具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ IDNO:118具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xii)包含与SEQ ID NO:119具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:120具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xiii)包含与SEQ ID NO:121具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:122具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xiv)包含与SEQ ID NO:123具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:124具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xv)包含与SEQ ID NO:125具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:126具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xvi)包含与SEQ ID NO:127具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:128具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xvii)包含与SEQ ID NO:131和260至263中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:132具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；以及(xviii)包含与SEQ ID NO:133具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:134具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文中公开的基于MuSK抗体的分子含有：(i)包含与SEQ IDNO:196具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:197具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(ii)包含与SEQ ID NO:198具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:199具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(iii)包含与SEQ ID NO:200具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:201具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(iv)包含与SEQID NO:202具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:203具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(v)包含与SEQ ID NO:204具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:205具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(vi)包含与SEQ ID NO:206具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:207具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(vii)包含与SEQ ID NO:208具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:209具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(viii)包含与SEQ ID NO:210具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:211具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(vix)包含与SEQ ID NO:212具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:213具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(x)包含与SEQ ID NO:214具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ IDNO:215具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xi)包含与SEQ ID NO:216具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:217具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xii)包含与SEQ ID NO:218具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:219具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xiii)包含与SEQ ID NO:220具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:221具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xiv)包含与SEQ IDNO:222具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:223具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xv)包含与SEQ ID NO:224具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:225具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xvi)包含与SEQ ID NO:226具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:227具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(xvii)包含与SEQ ID NO:228具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:229具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xviii)包含与SEQ ID NO:230具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:231具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xix)包含与SEQ ID NO:232具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:233具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xx)包含与SEQ ID NO:234具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQID NO:235具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xxi)包含与SEQ ID NO:236具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:237具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(xxii)包含与SEQ ID NO:238具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:239具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明的另一方面涉及编码本文中所述的基于MuSK抗体的分子的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，编码本发明的MuSK抗体的多核苷酸包含编码上述CDR中的任意一种、任意两种、任意三种、任意四种、任意五种或任意六种的序列，包括SEQ ID NO:1至48、135至140、147至158、240至251的重链CDR和SEQ ID NO:49至96、141至146和159至195的轻链CDR。
在一个实施方案中，多核苷酸包含编码VH结构域的核苷酸序列，其中所述VH结构域包含：(i)包含SEQ ID NO:1的CDR-H1、SEQ ID NO:17的CDR-H2和SEQ ID NO:33的CDR-H3的重链可变区；(ii)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:34的CDR-H3的重链可变区；(iii)包含SEQ ID NO:3的CDR-H1、SEQ ID NO:19的CDR-H2和SEQ IDNO:35的CDR-H3的重链可变区；(iv)包含SEQ ID NO:4的CDR-H1、SEQ ID NO:20的CDR-H2和SEQ ID NO:36的CDR-H3的重链可变区；(v)包含SEQ ID NO:5的CDR-H1、SEQ ID NO:21的CDR-H2和SEQ ID NO:37的CDR-H3的重链可变区；(vi)包含SEQ ID NO:6的CDR-H1、SEQ IDNO:22的CDR-H2和SEQ ID NO:38的CDR-H3的重链可变区；(vii)包含SEQ ID NO:7的CDR-H1、SEQ ID NO:23的CDR-H2和SEQ ID NO:39的CDR-H3的重链可变区；(viii)包含SEQ ID NO:8的CDR-H1、SEQ ID NO:24的CDR-H2和SEQ ID NO:40的CDR-H3的重链可变区；(ix)包含SEQID NO:9的CDR-H1、SEQ ID NO:25的CDR-H2和SEQ ID NO:41的CDR-H3的重链可变区；(x)包含SEQ ID NO:10的CDR-H1、SEQ ID NO:26的CDR-H2和SEQ ID NO:42的CDR-H3的重链可变区；(xi)包含SEQ ID NO:11的CDR-H1、SEQ ID NO:27的CDR-H2和SEQ ID NO:43的CDR-H3的重链可变区；(xii)包含SEQ ID NO:12的CDR-H1、SEQ ID NO:28的CDR-H2和SEQ ID NO:44的CDR-H3的重链可变区；(xiii)包含SEQ ID NO:13的CDR-H1、SEQ ID NO:29的CDR-H2和SEQID NO:45的CDR-H3的重链可变区；(xiv)包含SEQ ID NO:14的CDR-H1、SEQ ID NO:30的CDR-H2和SEQ ID NO:46的CDR-H3的重链可变区；(xv)包含SEQ ID NO:15的CDR-H1、SEQ ID NO:31的CDR-H2和SEQ ID NO:47的CDR-H3的重链可变区；(xvi)包含SEQ ID NO:16的CDR-H1、SEQ ID NO:32的CDR-H2和SEQ ID NO:48的CDR-H3的重链可变区；(xvii)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:139的CDR-H3的重链可变区；和(xviii)包含SEQ ID NO:136的CDR-H1、SEQ ID NO:138的CDR-H2和SEQ ID NO:140的CDR-H3的重链可变区。
在一些实施方案中，多核苷酸包含编码VH结构域的核苷酸序列，其中所述VH结构域包含：(ii.a)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:240的CDR-H3的重链可变区(X2m1)；(ii.b)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQID NO:241的CDR-H3的重链可变区(X2m2)；(ii.c)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:242的CDR-H3的重链可变区(X2m3)；(ii.d)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:243的CDR-H3的重链可变区(X2m4)；(ii.e)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:244的CDR-H3的重链可变区(X2m5)；(ii.f)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:245的CDR-H3的重链可变区(X2m6)；(ii.g)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:246的CDR-H3的重链可变区(X2m7)；(ii.h)包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ IDNO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:247的CDR-H3的重链可变区(X2m8)。
在一些实施方案中，多核苷酸包含编码VH结构域的核苷酸序列，其中所述VH结构域包含：(xvii.a)包含SEQ ID NO:135的CDR-Hl、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:248的CDR-H3的重链可变区(X17m1)；(xvii.b)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:249的CDR-H3的重链可变区(X17m2)；(xvii.c)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:250的CDR-H3的重链可变区(X17m3)；(xvii.d)包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:251的CDR-H3的重链可变区(X17m6)。
在一个实施方案中，多核苷酸包含编码VH结构域的核苷酸序列，其中所述VH结构域包含：(xix)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区；(xx)包含SEQ ID NO:148的CDR-H1、SEQ ID NO:151的CDR-H2和SEQID NO:157的CDR-H3的重链可变区；(xxi)包含SEQ ID NO:149的CDR-H1、SEQ ID NO:152的CDR-H2和SEQ ID NO:158的CDR-H3的重链可变区。
在一个实施方案中，多核苷酸包含编码VH结构域的核苷酸序列，其中所述VH结构域包含：(xxii)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:153的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区；(xxiii)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:154的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区；(xxiv)包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:155的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区。
在一个实施方案中，多核苷酸包含编码VL结构域的核苷酸序列，其中所述VL结构域包含：(i)包含SEQ ID NO:49的CDR-L1、SEQ ID NO:65的CDR-L2和SEQ ID NO:81的CDR-L3的轻链可变区；(ii)包含SEQ ID NO:50的CDR-L1、SEQ ID NO:66的CDR-L2和SEQ ID NO:82的CDR-L3的轻链可变区；(iii)包含SEQ ID NO:51的CDR-L1、SEQ ID NO:67的CDR-L2和SEQ IDNO:83的CDR-L3的轻链可变区；(iv)包含SEQ ID NO:52的CDR-L1、SEQ ID NO:68的CDR-L2和SEQ ID NO:84的CDR-L3的轻链可变区；(v)包含SEQ ID NO:53的CDR-L1、SEQ ID NO:69的CDR-L2和SEQ ID NO:85的CDR-L3的轻链可变区；(vi)包含SEQ ID NO:54的CDR-L1、SEQ IDNO:70的CDR-L2和SEQ ID NO:86的CDR-L3的轻链可变区；(vii)包含SEQ ID NO:55的CDR-L1、SEQ ID NO:71的CDR-L2和SEQ ID NO:87的CDR-L3的轻链可变区；(viii)包含SEQ IDNO:56的CDR-L1、SEQ ID NO:72的CDR-L2和SEQ ID NO:88的CDR-L3的轻链可变区；(ix)包含SEQ ID NO:57的CDR-L1、SEQ ID NO:73的CDR-L2和SEQ ID NO:89的CDR-L3的轻链可变区；(x)包含SEQ ID NO:58的CDR-L1、SEQ ID NO:74的CDR-L2和SEQ ID NO:90的CDR-L3的轻链可变区；(xi)包含SEQ ID NO:59的CDR-L1、SEQ ID NO:75的CDR-L2和SEQ ID NO:91的CDR-L3的轻链可变区；(xii)包含SEQ ID NO:60的CDR-L1、SEQ ID NO:76的CDR-L2和SEQ ID NO:92的CDR-L3的轻链可变区；(xiii)包含SEQ ID NO:61的CDR-L1、SEQ ID NO:77的CDR-L2和SEQ ID NO:93的CDR-L3的轻链可变区；(xiv)包含SEQ ID NO:62的CDR-L1、SEQ ID NO:78的CDR-L2和SEQ ID NO:94的CDR-L3的轻链可变区；(xv)包含SEQ ID NO:63的CDR-L1、SEQ IDNO:79的CDR-L2和SEQ ID NO:95的CDR-L3的轻链可变区；(xvi)包含SEQ ID NO:64的CDR-L1、SEQ ID NO:80的CDR-L2和SEQ ID NO:96的CDR-L3的轻链可变区；(xvii)包含SEQ IDNO:141的CDR-L1、SEQ ID NO:143的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3的轻链可变区；和(xviii)包含SEQ ID NO:142的CDR-L1、SEQ ID NO:144的CDR-L2和SEQ ID NO:146的CDR-L3的轻链可变区。
在一个实施方案中，多核苷酸包含编码VL结构域的核苷酸序列，其中所述VL结构域包含：(xix)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:170的CDR-L2和SEQ ID NO:180的CDR-L3的轻链可变区；(xx)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:171的CDR-L2和SEQID NO:181的CDR-L3的轻链可变区；(xxi)包含SEQ ID NO:160的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:182的CDR-L3的轻链可变区；(xxii)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区；(xxiii)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:171的CDR-L2和SEQ ID NO:184的CDR-L3的轻链可变区；(xxiv)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:173的CDR-L2和SEQ ID NO:185的CDR-L3的轻链可变区；(xxv)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:173的CDR-L2和SEQ ID NO:186的CDR-L3的轻链可变区；(xxvi)包含SEQ ID NO:161的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ IDNO:187的CDR-L3的轻链可变区；(xxvii)包含SEQ ID NO:162的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:188的CDR-L3的轻链可变区；(xxviii)包含SEQ ID NO:163的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:188的CDR-L3的轻链可变区；(xxix)包含SEQ ID NO:164的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:189的CDR-L3的轻链可变区；(xxx)包含SEQ ID NO:165的CDR-L1、SEQ ID NO:175的CDR-L2和SEQ ID NO:190的CDR-L3的轻链可变区；(xxxi)包含SEQ ID NO:166的CDR-L1、SEQ ID NO:176的CDR-L2和SEQ ID NO:191的CDR-L3的轻链可变区；(xxxi)包含SEQ ID NO:167的CDR-L1、SEQ ID NO:177的CDR-L2和SEQID NO:192的CDR-L3的轻链可变区；(xxxii)包含SEQ ID NO:168的CDR-L1、SEQ ID NO:178的CDR-L2和SEQ ID NO:193的CDR-L3的轻链可变区；(xxxiii)包含SEQ ID NO:169的CDR-L1、SEQ ID NO:179的CDR-L2和SEQ ID NO:194的CDR-L3的轻链可变区。
在一个实施方案中，多核苷酸包含编码VL结构域的核苷酸序列，其中所述VL结构域包含：(xxxiv)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2、和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区；(xxxv)包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQID NO:195的CDR-L3的轻链可变区。
在一个实施方案中，编码基于MuSK抗体的分子的分离的多核苷酸编码如下表3中提供的VH和/或VL结构域序列中的任一者。本文中所述的核酸分子包括分离的多核苷酸、表达载体的部分或线性DNA序列的部分，包括用于体外转录/翻译的线性DNA序列、以及与本文中所述的抗体或其结合片段的原核、真核或丝状噬菌体表达、分泌和/或展示相容的载体。
本发明的多核苷酸可以通过化学合成例如在自动化多核苷酸合成仪上的固相多核苷酸合成来产生并且组装成完整的单链或双链分子。或者，本发明的多核苷酸可以通过其他技术例如PCR，随后是常规克隆来产生。用于产生或获得给定序列的多核苷酸的技术是本领域公知的。
本发明的多核苷酸可以包含至少一种非编码序列，例如启动子或增强子序列、内含子、多腺苷酸化信号、促进RepA结合的顺式序列等。多核苷酸序列还可以包含另外的序列，其编码例如接头序列、标志物或标签序列(例如组氨酸标签或HA标签)以促进纯化或检测蛋白质、信号序列、融合蛋白配偶体(例如RepA、Fc部分)或噬菌体外壳蛋白(例如pIX或pIII)。
本发明的另一个实施方案涉及包含编码如本文中所述的基于MuSK抗体的分子的至少一种多核苷酸的载体。这样的载体包括但不限于质粒载体、病毒载体，包括但不限于牛痘载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或这样的任何其他载体，所述其他载体适用于将本文中所述的多核苷酸通过任何方式引入到给定生物体或遗传背景以促进编码的抗体多肽的表达。在一个实施方案中，编码重链可变结构域的多核苷酸序列，单独或与编码如本文中所述的轻链可变结构域的多核苷酸序列一起，与启动子、翻译起始区段(例如，核糖体结合序列和起始密码子)、3'非翻译区、多聚腺苷酸化信号、终止密码子和转录终止的序列组合以形成一个或更多个表达载体构建体。
在一个实施方案中，载体是腺病毒相关病毒(adenoviral-associated viral，AAV)载体。许多适合于将编码本文中所述抗体的多核苷酸递送至中枢神经系统的治疗性AAV载体是本领域已知的。参见例如，Deverman et al.,“Gene Therapy for NeurologicalDisorders:Progress and Prospects,”Nature Rev.17:641-659(2018),Nature Rev.17:641-659(2018)，其在此通过引用整体并入。合适的AAV载体包括以天然形式或针对增强的趋向性而改造的血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、或AAV11。特别适合于本文中所述MuSK抗体的治疗性表达的已知对CNS具有趋向性的AAV载体包括以天然形式或针对增强的趋向性而改造的AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8和AAV9。在一个实施方案中，AAV载体是AAV2载体。在另一个实施方案中，AAV载体是AAV5载体(Vitale etal.,“Anti-tau Conformational scFv MC1 Antibody Efficiently ReducesPathological Tau Species in Adult JNPL3 Mice,”Acta Neuropathol.Commun.6:82(2018)，其在此通过引用整体并入)。在另一个实施方案中，AAV载体是AAV9载体(Haiyan etal.,“Targeting Root Cause by Systemic scAAV9-hIDS Gene Delivery:FunctionalCorrection and Reversal of Severe MPSII in Mice,”Mol.Ther.MethodsClin.Dev.10:327-340(2018)，其在此通过引用整体并入)。在另一个实施方案中，AAV载体是AAVrh10载体(Liu et al.,“Vectored Intracerebral Immunizations with the Anti-Tau Monoclonal Antibody PHF1 Markedly Reduces Tau Pathology in MutantTransgenic Mice,”J.Neurosci.36(49):12425-35(2016)，其在此通过引用整体并入)。
在另一个实施方案中，AAV载体是杂合载体，其包含一种血清型(例如AAV2)的基因组和另一种血清型(例如AAV1或AAV3至9)的衣壳蛋白以控制趋向性。参见例如，Broekmanet al.,“Adeno-associated Virus Vectors Serotyped with AAV8 Capsid are MoreEfficient than AAV-1or-2 Serotypes for Widespread Gene Delivery to theNeonatal Mouse Brain,”Neuroscience 138:501-510(2006)，其在此通过引用整体并入。在一个实施方案中，AAV载体是AAV2/8杂合载体(Ising et al.,“AAV-mediatedExpression of Anti-Tau ScFv Decreases Tau Accumulation in a Mouse Model ofTauopathy,”J.Exp.Med.214(5):1227(2017)，其在此通过引用整体并入)。在另一个实施方案中，AAV载体是AAV2/9杂合载体(Simon et al.,“A Rapid Gene Delivery-Based MouseModel for Early-Stage Alzheimer Disease-Type Tauopathy,”J.Neuropath.Exp.Neurol.72(11):1062-71(2013)，其在此通过引用整体并入)。
在另一个实施方案中，AAV载体是经改造或经选择用于以下的AAV载体：其在实质内施用之后增强CNS转导，例如AAV-DJ(Grimm et al.,J.Viol.82:5887-5911(2008)，其在此通过引用整体并入)；对神经干细胞和祖细胞的转导提高，例如SCH9和AAV4.18(Murlidharan et al.,J.Virol.89:3976-3987(2015)和Ojala et al.,Mol.Ther.26:304-319(2018)，其在此通过引用整体并入)；增强的逆行转导，例如rAAV2-retro(Muller etal.,Nat.Biotechnol.21:1040-1046(2003)，其在此通过引用整体并入)；选择性转导至脑内皮细胞中，例如AAV-BRI(Korbelin et al.,EMBO Mol.Med.8:609-625(2016)，其在此通过引用整体并入)；或者在IV施用之后增强对成体CNS的转导，例如AAV-PHP.B和AAVPHP.eB(Deverman et al.,Nat.Biotechnol.34:204-209(2016)和Chan et al.,Nat.Neurosci.20:1172-1179(2017)，其在此通过引用整体并入。
根据该实施方案，编码基于MuSK抗体的分子的表达载体构建体包含编码重链多肽、其功能片段、其变体或其组合的多核苷酸序列。表达构建体可替代地包含编码轻链多肽、其功能片段、其变体或其组合的核酸序列。在一个实施方案中，表达载体构建体包含编码重链多肽、其功能片段或其变体和轻链多肽、其功能片段或其变体的核酸序列。
在一个实施方案中，表达构建体还包含适合于驱动基于MuSK抗体的分子的表达的启动子序列。合适的启动子序列包括但不限于延伸因子1-α启动子(EF1a)启动子、磷酸甘油酸激酶-1启动子(PGK)启动子、巨细胞病毒即早基因启动子(CMV)、嵌合肝特异性启动子(liver-specific promoter，LSP)、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)、四环素响应性启动子(TRE)、甲状腺素转运蛋白启动子(TTR)、猿病毒40启动子(SV40)和CK6启动子。本领域已知的适合于驱动哺乳动物细胞中基因表达的其他启动子也适合于并入到本文中公开的表达构建体中。
在一个实施方案中，表达构建体还编码接头序列。接头序列可以编码在空间上分离和/或连接表达构建体的一个或更多个组件(所编码抗体的重链和轻链组件)的氨基酸序列。
本发明的另一个方面是宿主细胞，其包含编码MuSK抗体并产生如本文中所述的所述MuSK抗体的一种或更多种载体。本文中所述的基于MuSK抗体的分子可以任选地由细胞系、混合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群体产生，如本领域公知的(参见例如，Ausubel et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2001)；Sambrook et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Harlow and Lane,Antibodies,aLaboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Colligan et al.,eds.,CurrentProtocols in Immunology,John Wiley&Sons,Inc.,NY(1994-2001)；Colligan et al.,Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，其在此通过引用整体并入)。
在一些实施方案中，选择用于表达的宿主细胞可以是哺乳动物来源的。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于COS-1细胞、COS-7细胞、HEK293细胞、BHK21细胞、CHO细胞、BSC-1细胞、HeG2细胞、SP2/0细胞、HeLa细胞、哺乳动物骨髓瘤细胞、哺乳动物淋巴瘤细胞或其任何衍生的、永生化的或转化的细胞。其他合适的宿主细胞包括但不限于酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞。或者，宿主细胞可以选自不能使多肽糖基化的物种或生物体，例如原核细胞或生物体，例如BL21、BL21(DE3)、BL21-GOLD(DE3)、XL1-Blue、JM109、HMS174、HMS174(DE3)，以及任何天然的或经改造的大肠杆菌属(E.coli spp)、克雷伯菌属(Klebsiellaspp)或假单胞菌属(Pseudomonas spp)菌株。
本文中所述的基于MuSK抗体的分子可以通过多种技术中的任一种使用上文所述的分离的多核苷酸、载体和宿主细胞来制备。一般而言，抗体可以通过细胞培养技术产生，包括通过常规技术产生单克隆抗体，或者通过将抗体基因、重链和/或轻链转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中，以允许产生抗体，其中抗体可以是重组的。在一个实施方案中，本文中所述的基于MuSK抗体的分子是单克隆抗体或其功能结合片段。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞并从培养基中回收抗体。可以使用通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术进行对宿主细胞的转染，例如通过电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达本文中所述的抗体，但有时优选在真核细胞，特别是在哺乳动物细胞中表达抗体，因为这样的真核细胞(并且特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更有可能组装和分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。
如上所述，用于表达本发明的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980)，其在此通过引用整体并入)。另一些合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达或者更优选使抗体分泌到其中培养宿主细胞的培养基中的一段时间来产生抗体。
宿主细胞也可用于产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。可以理解，上述操作的变化也在本发明的范围内。例如，可期望用编码本文中所述抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA来转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于去除编码轻链和重链中的任一者或两者的DNA中的对于与目的抗原结合不是必需的一些或全部。从这样的截短的DNA分子表达的分子也涵盖在本文中所述的抗体中。
抗体和抗体结合片段通过已知方法从重组细胞培养物中回收和纯化，所述方法包括但不限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱(“HPLC”)也可用于纯化。
包含基于MuSK抗体的分子的药物组合物
将本发明的基于MuSK抗体的分子或编码基于MuSK抗体的分子的多核苷酸有利地作为组合物施用。在一个实施方案中，这样的组合物是包含活性治疗剂(即，MuSK抗体)和多种其他可药用组分中的一种或更多种的药物组合物。参见REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICE OFPHARMACY(21st Edition)(2005)(Troy,D.B.et al.(Eds.)Lippincott Williams&Wilkins(Publs.),Baltimore MD)，其在此通过引用整体并入。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。取决于所期望的制剂，组合物还可以包含可药用无毒载体、赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如，非离子型洗涤剂，例如吐温-20或吐温-80)、稳定剂(例如，糖或不含蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适合于包含在药物组合物中的其他物质，并且它们是通常用于配制用于动物或人施用的药物组合物的载剂。选择稀释剂以不影响组合的生物活性。这样的稀释剂的一些实例是蒸馏水、生理磷酸缓冲盐水、林格溶液(Ringer’s solution)、右旋糖溶液和Hank溶液。另外，药物组合物或制剂还可以包含其他载体，或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。可用于本发明药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油和芝麻油)、羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)，和/或多种缓冲液。其他载体在制药领域是公知的。
可药用载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在本发明的药物组合物中的用途。
组合物还可以包含大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖(如壳聚糖)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如，胶乳官能化琼脂糖、琼脂糖、纤维素等)、聚合物氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。基于对本发明的基于活性抗体的分子的所期望生物学特性没有显著负面影响(例如，对抗原结合小于显著影响(例如，10％或更少的相对抑制、5％或更少的相对抑制等))来确定药物组合物的载体和其他组分的适用性。
本发明的药物组合物还可以包含可药用抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的药物组合物还可以在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇，例如甘露糖醇、山梨糖醇、甘油或氯化钠。
本发明的药物组合物还可以包含适合于所选施用途径的一种或更多种辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，它们可以提高药物组合物的保质期或有效性。本发明的抗体可以与将保护抗体免于快速释放的载体一起制备，所述载体例如控制释放制剂，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。这样的载体可以包括明胶，单硬脂酸甘油酯，二硬脂酸甘油酯，生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸，其单独地或与蜡一起，或本领域公知的其他物质。用于制备这样的制剂的方法通常是本领域技术人员已知的。参见例如，SUSTAINED ANDCONTROLLED RELEASE DRUG DELIVERY SYSTEMS,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
在一个实施方案中，本发明的抗体可配制成确保在体内适当分布。用于肠胃外施用的可药用载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是已知的。
注射用药物组合物通常必须是无菌的并且在制备和储存条件下是稳定的。组合物可以配制成溶液剂、微乳剂、脂质体或适合实现高药物浓度的其他有序结构。载体可以是水性或非水性溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。恰当的流动性可以例如通过使用包衣(例如卵磷脂)来维持，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸来维持，以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，将优选在所述组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇(例如甘油、甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现可注射组合物的延长吸收。无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物与例如上文列举的成分之一或组合(根据需要)一起并入合适的溶剂中，随后灭菌微滤来制备。通常，分散体通过将活性化合物并入到含有基本分散介质和所需其他成分的无菌载剂中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的所期望成分的粉末。
对于肠胃外施用，本发明的药剂通常与药用载体一起配制成物质在生理上可接受的稀释剂中的可注射剂量的溶液剂或混悬剂，所述药用载体可以是无菌液体，例如水、油、盐水、甘油、或乙醇。另外，组合物中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等。药物组合物的另一些组分是石油、动物、植物或合成来源的组分。花生油、大豆油和矿物油都是可用物质的实例。一般而言，二醇类(例如丙二醇或聚乙二醇)是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液。本发明的药剂可以以储库注射剂或植入制剂的形式施用，其可以以允许活性成分持续释放的这样的方式配制。示例性组合物包含约5mg/mL的scFv，配制在由50mM L-组氨酸、150mM NaCl组成的水性缓冲液中，用HCl调节至pH 6.0。
通常，组合物制备为可注射剂，作为液体溶液剂或混悬剂；也可以制备适合于在注射之前溶解在或悬浮在液体载剂中的固体形式。制剂也可以乳化或包封在脂质体或微粒中，例如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物，以增强辅料效果(Langer,et al.,Science 249:1527(1990)；Hanes,et al.,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119(1997)，其在此通过引用整体并入)。适合于另一些施用方式的另外制剂包括经口、鼻内和肺部制剂、栓剂和经皮应用。
包含基于MuSK抗体的分子的药物组合物的施用
本发明的基于MuSK抗体的分子可以通过肠胃外、表面、经口或鼻内方式施用以用于治疗性治疗。肌内注射(例如，注射到臂或腿肌肉中)和静脉内输注是本发明分子的优选施用方法。在一些方法中，这样的分子作为缓慢释放组合物或装置施用，例如MedipadTM装置(Elan Pharm.Technologies,Dublin,Ireland)。在一些方法中，本文中公开的抗体直接注射到特定组织中，例如颅内注射。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物是肠胃外施用的。本文中使用的短语“肠胃外施用”及其变形表示除肠内和表面施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括经表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、颅内、眶内、心内、皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内注射、皮下和输注。在一个实施方案中，药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注施用。
在治疗性应用中(即，在涉及已被诊断患有神经肌肉病症例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、重症肌无力或先天性肌无力的患者的应用中)，本发明的基于MuSK抗体的分子以这样的量施用于这样的患者，所述量足以治愈、治疗或至少部分地抑制疾病的症状(由生物化学、组织学和/或行为评估得出)，包括其并发症和疾病发展中的中间病理表型。在一些实施方案中，本发明的治疗性分子的施用减少或消除了神经肌肉病症。
用于治疗上述病症的本发明所提供的治疗性分子的有效剂量可根据许多不同因素而变化，包括施用方式、靶部位、患者的生理状态、所施用的其他药物。通常滴定治疗剂量以优化其安全性和效力。在给予剂量的任何给定日期，本文中所述的基于MuSK抗体的分子的剂量可以为约0.0001mg/kg至约100mg/kg患者体重，并且更通常为约0.01mg/kg至约20mg/kg患者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1mg/kg至10mg/kg体重范围内。因此示例性剂量包括：约0.1mg/kg至约10mg/kg体重、约0.1mg/kg至约5mg/kg体重、约0.1mg/kg至约2mg/kg体重、约0.1mg/kg至约1mg/kg体重，例如约0.15mg/kg体重、约0.2mg/kg体重、约0.5mg/kg体重、约1mg/kg体重、约1.5mg/kg体重、约2mg/kg体重、约5mg/kg体重、或约10mg/kg体重。
具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于为达到所期望治疗效果所需水平的水平开始药物组合物中的基于抗体的分子的剂量，并逐渐提高剂量直至达到所期望效果。一般而言，本发明组合物的合适日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这样的有效剂量将通常取决于上述因素。施用可以例如是静脉内的、肌内的、腹膜内的或皮下的，并且例如靠近靶部位施用。如果期望的话，药物组合物的有效日剂量可以作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量在全天以适当的间隔分开施用来施用，任选地以单位剂型施用。虽然本发明的基于抗体的分子可以单独施用，但优选将基于抗体的分子作为药物组合物施用，如上所述。
出于治疗目的，本发明的基于MuSK抗体的分子通常在多个时刻施用。单次剂量(例如，推注或输注)之间的间隔可以是每周、每月或每年。在一些方法中，调整剂量以达到1至1000μg/mL的血浆浓度，并且在一些方法中为25至300μg/mL的血浆浓度。或者，本发明的治疗分子可以作为缓慢释放制剂施用，在这种情况下需要较低频率的施用。剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期而变化。一般而言，人抗体显示出最长的半衰期，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。scFv分子通常具有短的血清半衰期。
在另一个实施方案中，包含编码如本文中所述的基于MuSK抗体的分子的重组核酸序列的药物组合物施用于对象以促进基于抗体的分子的体内表达和形成以治疗由减少的信号传导和/或MuSK的磷酸化介导的病症。适用于本发明的该实施方案的表达载体构建体在上文进行了描述。
多核苷酸组合物可使得在向对象施用组合物的至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时、或60小时内在对象中产生基于MuSK抗体的分子。所述组合物可以使得在向对象施用组合物的至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天之内在对象中产生基于抗体的分子。所述组合物可使得在向对象施用组合物的约1小时至约6天、约1小时至约5天、约1小时至约4天、约1小时至约3天、约1小时至约2天、约1小时至约1天、约1小时至约72小时、约1小时至约60小时、约1小时至约48小时、约1小时至约36小时、约1小时至约24小时、约1小时至约12小时或约1小时至约6小时内在对象中产生基于抗体的分子。
所述组合物在施用于有此需要的对象时可使得在对象中持续产生基于抗体的分子。组合物可以使得在对象中持续至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、或60天产生基于抗体的分子。基于MuSK结合抗体的分子的治疗效用
本发明的一个方面涉及在有此需要的对象中提高肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MusK)信号传导的方法。该方法涉及向对象施用如本文中所述的基于MuSK抗体的分子，或者包含如本文中所述的基于MuSK抗体的分子的药物组合物，或者编码如本文中所述的基于MuSK抗体的分子的多核苷酸。根据该方法，所述组合物以相对于在所述施用之前对象中的MuSK信号传导有效提高对象中的MuSK信号传导的量施用。可以向患有神经肌肉病症的对象提供这样的施用，所述神经肌肉病症例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、重症肌无力(MG)、先天性肌无力、MuSK-MG、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓延髓性肌萎缩(SBMA)、夏科-马里-图思病(CMT)、远端遗传性运动神经元神经病(dHMN)、迪谢内肌营养不良(DMD)、肢带型肌营养不良(LGMD)、先天性肌营养不良(CMD)、肌肉减少症(SP)、埃默里-德赖弗斯肌营养不良。在一个实施方案中，待治疗的对象是患有先天性肌无力的对象。在一个实施方案中，待治疗的对象是患有Dok7介导的先天性肌无力的对象。根据本发明的这个方面，这样的施用治疗神经肌肉病症。
在一个实施方案中，向有此需要的对象施用的基于MuSK抗体的分子是包含以下的基于MuSK抗体的分子：包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:153的CDR-H2、和SEQ IDNO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:195的CDR-L3的轻链可变区(3B2g2m1)。
在一个实施方案中，向有此需要的对象施用的基于MuSK抗体的分子是包含以下的基于MuSK抗体的分子：包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:153的CDR-H2、和SEQ IDNO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区(3B2g1m1)。
在一个实施方案中，向有此需要的对象施用的基于MuSK抗体的分子是包含以下的基于MuSK抗体的分子：包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:154的CDR-H2、和SEQ IDNO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区(3B2g1m2)。
在一个实施方案中，向有此需要的对象施用的基于MuSK抗体的分子是包含以下的基于MuSK抗体的分子：包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:154的CDR-H2、和SEQ IDNO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:195的CDR-L3的轻链可变区(3B2g2m2)。
在一个实施方案中，向有此需要的对象施用的基于MuSK抗体的分子是包含以下的基于MuSK抗体的分子：包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2、和SEQ IDNO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区(3B2)。
本文中使用的术语“治疗”及其变形意指改善、减缓或逆转疾病或病症的进展或严重程度，或改善、减缓或逆转这样的疾病或病症的一种或更多种症状或副作用。出于本发明的目的，“治疗”或其变形还意指用于获得有益或期望的临床结果的方法，其中“有益或期望的临床结果”包括但不限于部分或全部地，可检出或不可检出地，缓解症状、减轻病症或疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病或病症状态、延迟或减慢疾病或病症状态的进展、改善或减轻疾病或病症状态、以及缓解疾病或病症。
基于抗体的分子的“有效量”是指在必要的剂量和时间段内足以实现预期的生物学作用或期望的治疗结果(包括但不限于临床结果)的量。当应用于本发明的基于抗体的分子时，短语“治疗有效量”旨在表示足以改善、减轻、稳定、逆转、减缓或延迟病症或疾病状态的进展或病症或疾病的症状的进展的抗体的量。在一个实施方案中，本发明的方法提供了与其他化合物组合的基于抗体的分子的施用。在这样的情况下，“有效量”是足以引起预期生物学作用的组合的量。
本发明的另一方面涉及在对象中治疗先天性肌无力的方法。该方法涉及向患有先天性肌无力的对象施用对于提高MuSK磷酸化有效的量的肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)激动剂，从而在对象中治疗先天性肌无力。
在一些实施方案中，MuSK激动剂是如本文中所述的MuSK激动剂抗体。MuSK激动剂抗体是与MuSK结合并增强MuSK信号传导或磷酸化的抗体。在一个实施方案中，MuSK激动剂抗体结合人MuSK的卷曲样结构域。在一个实施方案中，MuSK激动剂抗体与具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的表位(Fz样结构域)结合。合适的MuSK激动剂抗体包括本文中公开的那些。在一些实施方案中，先天性肌无力是DOK7介导的先天性肌无力。
实施例
本说明书通过以下实施例进一步举例说明，其不应被解释为以任何方式进行限制。
用于实施例1和实施例5至12的材料和方法
小鼠-为了产生Dok7 CM小鼠(本文中也称为Dok7 1124_1127dup小鼠)，将体外转录的sgRNA(5′-CTGCTCAGTCTGCCCCC-3′(SEQ ID NO:264))(5ng/μl)和体外转录的Cas9 RNA(10ng/μl)与含有TGCC复制的DNA修复模板
(10ng/μl)一起显微注射到C57BL/6受精卵的原核中(Price et al.,“SpecificDisruption of Abca1 Targeting Largely Mimics the Effects of miR-33Knockout onMacrophage Cholesterol Efflux and Atherosclerotic Plaque Development,”Circ.Res.124:874-880(2019)，其在此通过引用整体并入)。通过对尾部DNA进行测序(引物：5′-GCAGTTACAG GAGGTTGG-3′(SEQ ID NO:266))分析了从所注射受精卵中出生的14只小鼠。一只小鼠携带具有所期望TGCC重复的Dok7等位基因。将建立者小鼠(founder mouse)与野生型C57BL/6小鼠杂交以产生Dok7 CM系。DNA测序确定了Dok7突变的序列。随后使用引物对小鼠进行基因分型(正向：5′-GCGGCCTCGGCAGTTACAG3′(SEQ ID NO：267)；反向：5′GCTTTACCTTG AGTCCGCCACAGA-3′(SEQ ID NO：268))。分析了对脱靶识别概率评分最高的五个基因组基因座。没有发现这些基因突变的证据(图16A至16B)。
为了产生Dok7 2YF小鼠，将sgRNA(5′-TFFCATTGCC ACAGGCAG-3′(SEQ ID NO：271)(SEQ ID NO:269))(15ng/μl)和体外转录的Cas9 RNA(30ng/μl)与将酪氨酸396和酪氨酸406转化为苯丙氨酸的DNA修复模板
(30ng/μl)一起注射到C57BL/6受精卵的细胞质中。通过对尾部DNA进行测序(引物：5′-TGGCATTGCC ACAGGCAG-3′(SEQ ID NO：271))分析了从所注射受精卵中出生的33只小鼠。一只小鼠携带了具有所期望的酪氨酸到苯丙氨酸替换的Dok7等位基因。将建立者小鼠与野生型C57BL/6小鼠杂交以产生Dok7 2YF系。来自这些系的DNA测序确定了Dok7突变的序列。根据机构动物使用和护理委员会(Institutional Animal Use and CareCommittee，IACUC)指南对小鼠进行饲养和维持。
培养的骨骼肌细胞的生长-将C2C12小鼠肌肉细胞(ATCC目录号CRL-1772)在37℃下在以下生长培养基(GM)中培养：Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium，DMEM)，其含有4.5g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠(Corningcellgro)，补充有10％胎牛血清(FBS；GemCellTM)。当成肌细胞70％汇合时，通过切换成分化培养基(differentiation medium，DM)来诱导成肌细胞融合和肌管分化，所述分化培养基(DM)为：DMEM，其具有4.5g/L葡萄糖和1mM L-谷氨酰胺，补充有2％热灭活马血清。从野生型和Dok7 2YF胚胎中分离永生化成肌细胞，并如前所述进行培养(Smith et al.,“Src,Fyn,and Yes are not Required for Neuromuscular Synapse Formation but areNecessary for Stabilization of Agrin-Induced Clusters of AcetylcholineReceptors,”J.Neurosci.21:3151-3160(2001)，其在此通过引用整体并入)。
C2肌管的突触蛋白聚糖和抗体处理-在C2C12肌管形成之后三天，将培养物用与2.5nM链霉亲和素复合的10nM生物素化Fab、10nM IgG或0.5nM重组神经突触蛋白聚糖-B8(R&D Systems)处理30分钟。将肌管在4℃下在裂解缓冲液(50mM氯化钠、30mM三乙醇胺pH7.5、50mM氟化钠、5mM EDTA、5mM EGTA、2mM原钒酸钠、1mM N-乙基马来酰亚胺、1mM连四硫酸钠、10μM胃蛋白酶抑制剂加完全蛋白酶抑制剂混合物)(Roche)中均质化。添加NP-40至终浓度为1％，并将提取物在4℃下摇动孵育30分钟。通过在4℃下以12,000rpm离心20分钟去除不溶性蛋白质。将上清液在4℃下用蛋白G-琼脂糖珠(Sigma-Aldrich)预清洁1小时，然后在4℃下与针对MuSK的抗体(MuSK 1A)(Takata,K.et al.,“Characterization ofPathogenic Monoclonal Autoantibodies Derived from Muscle-Specific KinaseMyasthenia Gravis Patients,”JCI Insight 4(12):e127167(2019)和Fichtner et al.,“Affinity Maturation is Required for Pathogenic Monovalent IgG4 AutoantibodyDevelopment in Myasthenia Gravis,”J.Exp.Med.217(12):e20200513(2020)，其在此通过引用整体并入)孵育过夜。将复合物与蛋白G-琼脂糖珠一起孵育4小时。随后将珠在含有1％ NP-40的裂解缓冲液中洗涤(3次持续9分钟)。用裂解缓冲液中的1％ SDS从珠中洗脱蛋白质。
从肌肉组织中分离MuSK和DOk7-将完整的腿肌肉或培养的肌肉细胞在4℃下在裂解缓冲液(50mM氯化钠、30mM三乙醇胺pH 7.5、50mM氟化钠、5mM EDTA、5mM EGTA、2mM原钒酸钠、1mM N-乙基马来酰亚胺、1mM连四硫酸钠、10μM胃蛋白酶抑制剂加完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche))中均质化。添加NP-40至终浓度为1％，并将提取物在4℃下摇动孵育30分钟。通过在4℃下以12,000rpm离心20分钟去除不溶性蛋白质。将上清液在4℃下用蛋白G-琼脂糖珠(Sigma-Aldrich)预清洁1小时，然后在4℃下与针对MuSK的抗体(MuSK 1A)(Takata,K.et al.,“Characterization of Pathogenic Monoclonal Autoantibodies Derivedfrom Muscle-Specific Kinase Myasthenia Gravis Patients,”JCI Insight 4(12):e127167(2019)和Fichtner et al.,“Affinity Maturation is Required forPathogenic Monovalent IgG4 Autoantibody Development in Myasthenia Gravis,”J.Exp.Med.217(12):e20200513(2020)，其在此通过引用整体并入)或山羊抗Dok7(R&DSystems，AF 6398)孵育过夜，随后与蛋白G-琼脂糖珠孵育4小时。随后将珠在含有1％ NP-40的裂解缓冲液中洗涤(3次持续9分钟)。用裂解缓冲液中的1％ SDS从珠中洗脱蛋白质。
Western印迹将蛋白质通过SDS-PAGE进行分级并将其转移至PVDF膜。用针对MuSK的抗体(R&D Systems，AF562)、针对磷酸酪氨酸的抗体(Millipore，05-321)或针对Dok7的抗体(#1916)对印迹进行探测，如前所述(Herbst&Burden,“The Juxtamembrane Region ofMuSK has a Critical Role in Agrin-Mediated Signaling,”EMBO J.19:67-77(2000)；Bergamin et al.,“The Cytoplasmic Adaptor Protein Dok7 Activates the ReceptorTyrosine Kinase MuSK via Dimerization,”Mol.Cell 39:100-109(2010)；Hallock etal.,“Dok-7 Regulates Neuromuscular Synapse Formation by Recruiting Crk andCrk-L,”Genes Dev.24:2451-2461(2010)；Remedio et al.,“Diverging Roles for Lrp4and Wnt Signaling in Neuromuscular Synapse Development During Evolution,”Genes Dev.30:1058-1069(2016)；和Jaworski&Burden,“Neuromuscular SynapseFormation in Mice Lacking Motor Neuron-and Skeletal Muscle-DerivedNeuregulin-1,”J.Neurosci.26:655-661(2006)，其在此通过引用整体并入)。针对Crk的抗体(BD Bioscience，610035)和针对Crk-L的抗体(Santa Cruz Biotechnology，sc-365092)先前已经描述(Hallock et al.,“Dok-7 Regulates Neuromuscular Synapse Formationby Recruiting Crk and Crk-L,”Genes Dev.24:2451-2461(2010)，其在此通过引用整体并入)。用ChemiDoc成像系统(BioRad)对带强度进行定量，如前所述(Remedio et al.,“Diverging Roles for Lrp4 and Wnt Signaling in Neuromuscular SynapseDevelopment During Evolution,”Genes Dev.30:1058-1069(2016)，其在此通过引用整体并入)。图示出了至少三个单独实验的平均值。将Wilcoxon-Mann-Whitney检验用于确定统计学显著性，并使用GraphPad Prism 6.0软件进行。
完整封固肌肉免疫组织化学。在氧合L-15培养基中从E18.5胚胎和出生之后小鼠中解剖膈肌。将肌肉固定到Sylgard涂覆的解剖皿上，在1％PFA中固定1.5小时，并在含有3％ BSA(不含Sigma IgG)和0.5％ Triton X-100(PBT)的PBS中封闭1小时。将膈肌用Alexa488缀合的a-BGT(Invitrogen)染色以标记AChR，并用针对神经丝-L的抗体(SynapticSystems，171002)、针对b-TUBIII的抗体(Synaptic Systems 302302)或针对突触蛋白1/2的抗体(Synaptic Systems，106002)染色以分别标记运动轴突和神经末梢(Kim&Burden,“MuSK Controls where Motor Axons Grow and Form Synapses,”Nat.Neurosci.11:19-27(2008)，其在此通过引用整体并入)。将抗体强制移液到肌肉中，并将肌肉在4℃下在定轨振荡器(orbital shaker)上在湿润室中孵育过夜。将膈肌在室温下用PT在5小时进程内洗涤10次，并在PBS中清洗，然后将肌肉完整封固在50％甘油中。对于每个实验，分析来自每种基因型的至少3只小鼠的肌肉。用Zeiss LSM 800共聚焦显微镜获得图像。对检测器增益(detector gain)和激光强度进行了调整以避免饱和。使用FIJI/ImageJ软件对突触的数量和尺寸、突触AChR的密度、终板区的宽度、去神经支配的程度和共定位指数(Synapsin/AChR)进行定量，如前所述(Jaworski&Burden,“Neuromuscular Synapse Formation inMice Lacking Motor Neuron-and Skeletal Muscle-Derived Neuregulin-1,”J.Neurosci.26:655-661(2006)，其在此通过引用整体并入)。将Wilcoxon-Mann-Whitney检验用于确定统计学显著性，并使用GraphPad Prism9.0软件进行。
单肌肉纤维的分离和染色在氧合L-15培养基中解剖胫骨前肌并将其固定至Sylgard涂覆的皿并在2％PFA(在PBS中)中固定2小时。在PBS中清洗数次之后，用细镊子人工取出(tease)一至三个肌纤维(Ralston et al.,“The Organization of the GolgiComplex and Microtubules in Skeletal Muscle is Fiber Type-Dependent,”J.Neurosci.19:10694-10705(1999)，其在此通过引用整体并入)。将固定的肌纤维在含有5％ BSA、1％正常山羊血清和0.04％皂苷的PBS中在室温下封闭2小时。然后将纤维与一抗在4℃下孵育过夜，用含有0.04％皂苷的PBS洗涤3次持续5分钟，与二抗在室温下一起孵育2小时，再次洗涤，并封固在VectaShield(Vector Laboratories)中。使用针对Crk-L的抗体(Santa Cruz Biotechnology，sc-365092)，并通过用Alexa Fluor 488–α-BGT(Invitrogen)染色来显现突触后膜。
冷冻切片免疫组织化学将肢肌肉包埋在OCT培养基中并在干冰平台上冷冻。将收集到聚L-赖氨酸包被的载玻片上的10μm切片在1至4％PFA中固定10分钟，在含3％ BSA(PB)的PBS中洗涤3次持续5分钟，用PB+0.5％ X-Triton(PBT)透化10分钟，在PB中洗涤并在4℃下与针对Crk-L的一抗(Santa Cruz Biotechnology，sc-365092)在PBT中在湿润室中孵育过夜。将切片在PB中洗涤3次持续5分钟，然后与在PBS中稀释的二抗和Alexa Fluor 488–α-BGT(Invitrogen)在4℃下在湿润室中过夜孵育。将切片在PB中中洗涤3次持续5分钟，然后在PBS中洗涤3次持续5分钟，然后封固在VECTASHIELD防消退封固培养基中。
行为使用握力装置(Bioseb)测量握力，所述握力装置测量前肢和全肢握力二者。为了测量前肢握力，将小鼠定位于金属网格的中心并轻轻抬起其尾基部，以便只有其前爪能够抓握网格。将小鼠稳定地向后牵拉，直到前肢抓握从网格中放开。握力计以数字方式显示放开抓握时施加的最大力(以克计)。对于全肢测量，允许小鼠用前肢和后肢二者抓握网格，并将小鼠稳定地向后牵拉，直到小鼠失去对网格的抓握。将前肢和全肢二者测量的六次连续试验的平均值作为前肢或全肢握力的指标。在试验之间给予小鼠10至15秒的间隔，并在前肢与全肢测试之间给予1至3小时的间隔。在所有握力测量之后确定体重以分析潜在的协变性。为了提高握力评估的稳健性和可靠性，所有测量均由同一实验者进行(Mandilloet al.,“Reliability,Robustness,and Reproducibility in Mouse BehavioralPhenotyping:A Cross-Laboratory Study,”Physiol.Genomics 34:243-255(2008)andOury et al.,“MACF1 Links Rapsyn to Microtubule-and Actin-Binding Proteins toMaintain Neuromuscular Synapses,”J.Cell Biol.218:1686-1705(2019)，其在此通过引用整体并入)。
在转棒仪(AccuRotor四通道，Omnitech Electronics,Inc.)上评估P60时雄性和雌性小鼠的运动功能。将小鼠置于以2.5rpm旋转的转棒仪(3.0厘米旋转圆柱体)上，并且旋转速度在5分钟进程内线性提高至40rpm。测量从杆上掉落的时间。每只小鼠以5分钟的间隔进行3次试验，并且记录3次试验中掉落的最长等待时间。将Wilcoxon-Mann-Whitney检验用于确定统计学显著性，并使用GraphPad Prism 9.0软件进行。
人合成抗体的开发。将全长胞外区(小鼠MuSK的E22至T494和人MuSK的E22至T495)(包括Fz结构域和C端侧翼序列(小鼠MuSK的D307至T494和人MuSK的K314至T494))使用在EXPI293细胞中的小鼠IgkVIII的分泌信号序列使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific)使用供应商提供的标准操作表达为具有Avi-和His6-标签的C端融合体。从过滤的培养上清液中使用HiTrap镍柱(GE Healthcare)纯化蛋白质，并将其在0.5mM生物素和10mM ATP存在下使用BirA酶在体外进行生物素化。将生物素化的蛋白质使用Superdex S7510/300柱(GE Healthcare)进一步纯化。
如前所述(Miller et al.,“T Cell Receptor-Like Recognition of Tumor invivo by Synthetic Antibody Fragment,”PLoS One 7:e43746(2012)，其在此通过引用整体并入)进行抗体噬菌体展示文库的分选。简言之，将噬菌体展示文库首先在第一轮中以100nM的所有四种抗原进行分选，随后在第二轮、第三轮和第四轮中分别以100nM、50nM和20nM的单抗原进行分选。为了富集与人和小鼠Fz结构域均结合的克隆，采用了多种分选策略，其中在连续轮次中使用替代抗原(例如，人Fz-小鼠ECD-人ECD)。使用四种抗原45使用噬菌体ELISA筛选单独克隆，并确定表现出与所有抗原结合的克隆的DNA序列。
从大肠杆菌(E.coli)中产生在所选克隆的重链C端具有Avi-标签的Fab蛋白，并如前所述(Miller et al.,“T Cell Receptor-Like Recognition of Tumor in vivo bySynthetic Antibody Fragment,”PLoS One 7:e43746(2012)，其在此通过引用整体并入)将其进行生物素化。克隆X17的小鼠IgG2a-LALAPG样品使用以下产生：经修饰形式的pFUSE-mIgG2a-Fc载体(InvivoGen)，其在Fc区中包含LALAPG突变(Lo et al.,“Effector-Attenuating Substitutions That Maintain Antibody Stability and ReduceToxicity in Mice,”J.Biol.Chem.292:3900-3908(2017)，其在此通过引用整体并入)。和人CH1结构域和pFUSE-CLIg载体(InvivoGen)。这种嵌合抗体由人Fab和小鼠Fc序列组成。另外，将小鼠Fc序列更换为来自人IgG1的含有LALA突变的Fc序列，以产生hIgG1-X17、hIgG1-X2和hIgG1-X3抗体。
亲和力测量使用珠结合测定来测量Fab和IgG形式的抗体克隆的亲和力(Nishikori et al.,“Broad Ranges of Affinity and Specificity of Anti-HistoneAntibodies Revealed by a Quantitative Peptide Immunoprecipitation Assay,”J.Mol.Biol.424:391-399(2012)；Nady et al.,“ETO Family Protein Mtgr1 MediatesPrdm14 Functions in Stem Cell Maintenance and Primordial Germ CellFormation,”Elife 4:e10150(2015)；和Hattori et al.,“Multiplex Bead BindingAssays Using Off-the-Shelf Components and Common Flow Cytometers,”J.Immunol.Methods490:112952(2020)，其在此通过引用整体并入)。通过快速混合PBSB(含有0.5％牛血清白蛋白(BSA，GeminiBio)的PBS)中的100μl 10倍稀释的珠和100μl的50nMFz蛋白将生物素化的人抗原蛋白固定在Dynabeads M280链霉亲和素珠(Thermo FisherScientific)上。然后将珠用2μM生物素封闭，用PBSB洗涤两次并重悬于1ml PBSB中。必要时根据测量次数适当缩放该反应。将5微升稀释的珠和20μl抗体样品在96孔聚丙烯板(Greiner Bio-One，目录号650261)的孔中混合，并在室温下于轻轻摇动下孵育30分钟。将样品转移至96孔滤板(Millipore MultiScreen HTS HV，0.45mm，Thermo Fisher)的孔中；使用真空歧管去除液体，并使用真空歧管用200μl冰冷的PBSB将孔洗涤3次。将珠用以AlexaFluor 647标记的抗人Fab抗体(Jackson Immuno Research,Alexa
647AffiniPure山羊抗人IgG，F(ab')2片段特异性，109-605-097)进行染色。在洗涤之后，将珠悬浮于70μlPBSB中，并使用iQue筛选器(Sartorius)或Intellicyt HTFC系统进行分析。使用GraphPadPrizm软件通过1:1结合模型的非线性最小二乘拟合来分析所得滴定曲线。
血液半衰期测量将小鼠血液样品离心，并将上清液在PBSB中稀释2000倍。除了在4℃下进行结合反应之外，使用上述珠测定对抗体水平进行定量。半衰期通过以单指数曲线对中值荧光强度的非线性最小二乘拟合来确定。
磷酸肽牵出(Pull-Down)测定将293T细胞用编码HA标记的Dok-7和HA标记的CrkI的质粒在37℃下转染48小时(Lipofectamine 3000，Thermofisher Scientific)。在48小时之后，将经转染的细胞在4℃下在裂解缓冲液中均质化；添加NP-40至终浓度为1％，并将提取物在4℃下于摇动下孵育30分钟。通过在4℃下以12,000rpm离心20分钟去除不溶性蛋白质。将上清液在4℃下用链霉亲和素-琼脂糖珠(Sigma-Aldrich)预清洁1小时。
将四种生物素化磷酸肽(1)ELLLDRLHPNPMYQRMPLLLN(SEQ ID NO：272)，(2)ELLLDRLHPNPMp(Y)QRMPLLLN(SEQ ID NO：273)，(3)ELLLDRLHPAPMp(Y)QRMPLLLN(SEQ IDNO：274)，和(4)ELLLDRLHPNPMp(Y)AAAPLLLN(SEQ ID NO：275)(Thermofisher Scientific)固定在链霉亲和素琼脂糖珠上，并在4℃下在含有1％ NP-40的裂解缓冲液(50mM氯化钠、30mM三乙醇胺pH 7.5、50mM氟化钠、5mM EDTA、5mM EGTA、2mM原钒酸钠、1mM N-乙基马来酰亚胺、1mM连四硫酸钠和10μM胃蛋白酶抑制剂加完全蛋白酶抑制剂混合物)(Roche)中孵育过夜。将在链霉亲和素-琼脂糖珠上预清洁的细胞提取物与固定在链霉亲和素-琼脂糖珠上的生物素化磷酸肽一起在4℃下孵育过夜。随后将珠在含有1％ NP-40的裂解缓冲液中洗涤(3次持续9分钟)。用裂解缓冲液中的1％ SDS从珠中洗脱蛋白质。使用针对HA标签的抗体(Abcam，ab49969)进行Western印迹。
RT-qPCR使用TRIZOL试剂(Invitrogen)从E18.5野生型和Dok-7 CM胚胎的肌肉中分离总RNA，并用Superscript-III First strand试剂盒(Invitrogen)进行逆转录。使用SYBR Green Master试剂盒(Roche)在LightCycler 480(Roche)上进行实时定量PCR。使用以下引物对进行PCR：针对Hprt的5′-CTGGTGAA AAGGACCTCTCGAAG-3′(SEQ ID NO：276)和5′-CCAGTTTCACTAATGACACAAA CG-3′(SEQ ID NO：277)，针对Dok7的5′-TCAGCCTCAGAAGAGCGTGTTG-3′(SEQ ID NO：278)和5′-GCCTCAGAAGAGGAACTGGATAG-3′(SEQID NO：279)。样品以一式三份运行，并将Dok7表达水平相对于Hprt表达进行归一化。
实施例1–Dok7先天性肌无力的疾病机制和治疗挽救
先天性肌无力(CM)是由在神经肌肉突触的形成、功能和维持中发挥关键作用的基因中的突变引起的一组疾病(参见例如，Muller et al.,“Congenital MyasthenicSyndromes:Spotlight on Genetic Defects of Neuromuscular Transmission,”ExpertRev.Mol.Med.9:1-20(2007)；Engel,A.G.,“Current Status of the CongenitalMyasthenic Syndromes,”Neuromuscul.Disord.22:99-111(2012)；和Engel et al.,“Congenital Myasthenic Syndromes:Pathogenesis,Diagnosis,and Treatment,”LancetNeurol.14:420-434(2015)，其在此通过引用整体并入)。在大多数情况下，这些基因中的突变是隐性的并降低基因活性，导致突触缺陷，其导致神经肌肉突触中的结构和功能缺陷过早发生，这导致整个生命中出现波动和易疲劳或持续的肌无力。
Dok7(编码对形成和维持神经肌肉突触至关重要的衔接蛋白的基因)(Okada etal.,“The Muscle Protein Dok-7is Essential for Neuromuscular Synaptogenesis,”Science 312:1802-1805(2006)，其在此通过引用整体并入)中的突变构成了所有CM病例的相当一部分(10至20％)(Beeson et al.,“Dok-7 Mutations Underlie a NeuromuscularJunction Synaptopathy,”Science 313:1975-1978(2006)；Muller et al.,“Phenotypical Spectrum of DOK7 Mutations in Congenital Myasthenic Syndromes,”Brain 130:1497-1506(2007)；和Hamuro et al.,“Mutations Causing DOK7 CongenitalMyasthenia Ablate Functional Motifs in Dok-7,”J.Biol.Chem.283:5518-5524(2008)，其在此通过引用整体并入)。所述疾病使人衰弱，导致肢、颈部和面部肌肉无力，并且四分之一的Dok7 CM患者在其一生中的某个时间点需要非侵入性通气。很少有治疗能减轻临床症状，虽然激活肾上腺素能受体的舒喘灵(albuterol)/沙丁胺醇(salbutamol)可以通过知之甚少的机制为Dok7 CM患者亚群提供益处(Liewluck et al.,“BeneficialEffects of Albuterol in Congenital Endplate Acetylcholinesterase Deficiencyand Dok-7 Myasthenia,”Muscle Nerve 44:789-794(2011)和Burke et al.,“SalbutamolBenefits Children with Congenital Myasthenic Syndrome due to DOK7 mutations,”Neuromuscul.Disord.23:170-175(2013)，其在此通过引用整体并入)。
神经肌肉突触的形成和维持需要高度特化的突触前膜和突触后膜的组装，需要数个关键分子的协调作用(Burden,S.J,“The Formation of Neuromuscular Synapses,”Genes Dev.12:133-148(1998)；Sanes&Lichtman,“Induction,Assembly,Maturation andMaintenance of a Postsynaptic Apparatus,”Nat.Rev.Neurosci.2:791-805(2001)；Burden,S.J.,“SnapShot:Neuromuscular Junction,”Cell 144:826-826(2011)；Burdenet al.,“The Role of MuSK in Synapse Formation and Neuromuscular Disease,”ColdSpring Harb.Perspect.Biol.5:a009167(2013)；和Tintignac et al.,“MechanismsRegulating Neuromuscular Junction Development and Function and Causes ofMuscle Wasting,”Physiol.Rev.95:809-852(2015)，其在此通过引用整体并入)。从运动神经末梢释放的突触蛋白聚糖与肌肉中的脂蛋白受体相关蛋白4(Lrp4)结合，刺激Lrp4与肌肉特异性激酶(MuSK)之间复合物的形成，MuSK是用作突触分化的主要调节子的受体酪氨酸激酶(Burden et al.,“The Role of MuSK in Synapse Formation and NeuromuscularDisease,”Cold Spring Harb.Perspect.Biol.5:a009167(2013)；Tintignac et al.,“Mechanisms Regulating Neuromuscular Junction Development and Function andCauses of Muscle Wasting,”Physiol.Rev.95:809-852(2015)；McMahan,U.J.,“TheAgrin Hypothesis,”Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.55:407-418(1990)；Jenningset al.,“Muscle-Specific trk-Related Receptor with a Kringle Domain Defines aDistinct Class of Receptor Tyrosine Kinases,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2895-2899(1993)；DeChiara et al.,“The Receptor Tyrosine Kinase MuSK is Required forNeuromuscular Junction Formation in vivo,”Cell 85:501-512(1996)；Glass et al.,“Agrin Acts via a MuSK Receptor Complex,”Cell 85:513-523(1996)；Kim et al.,“Lrp4 is a Receptor for Agrin and Forms a Complex with MuSK,”Cell 135:334-342(2008)；和Zhang et al.,“LRP4 Serves as a Coreceptor of Agrin,”Neuron.60:285-297(2008)，其在此通过引用整体并入)。Lrp4(由于MuSK激活而在突触后膜中聚集)以逆行方式向运动轴突发出信号以刺激突触前分化(Yumoto et al.,“Lrp4 is a RetrogradeSignal for Presynaptic Differentiation at Neuromuscular Synapses,”Nature 489:438-442(2012)，其在此通过引用整体并入)。Agrin、Lrp4和MuSK以及乙酰胆碱受体(AChR)亚基基因中的突变也会导致CM(Engel et al.,“Congenital Myasthenic Syndromes:Pathogenesis,Diagnosis,and Treatment,”Lancet Neurol.14:420-434(2015)和McMacken et al.,“The Increasing Genetic and Phenotypical Diversity ofCongenital Myasthenic Syndromes,”Neuropediatrics 48:294-308(2017)，其在此通过引用整体并入)。
MuSK激活还取决于Dok7。Dok7的氨基末端区域包含pleckstrin同源性(pleckstrin homology，PH)和磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域(图1A)，其功能是使Dok7二聚化并结合MuSK近膜(JM)区域中的磷酸化酪氨酸基序(Yamanashi et al.,“Activation ofReceptor Protein-Tyrosine Kinases from the Cytoplasmic Compartment,”J.Biochem.151:353-359(2012)，其在此通过引用整体并入)。由于缺少Dok7或MuSK JM区域中阻止Dok7结合的突变，Dok7未能与MuSK结合，导致突触蛋白聚糖无法刺激MuSK磷酸化(Okada et al.,“The Muscle Protein Dok-7is Essential for NeuromuscularSynaptogenesis,”Science 312:1802-1805(2006)；Herbst&Burden,“The JuxtamembraneRegion of MuSK has a Critical Role in Agrin-Mediated Signaling,”EMBO J.19:67-77(2000)；和Zhou et al.,“Distinct Domains of MuSK Mediate its Abilities toInduce and to Associate with Postsynaptic Specializations,”J.Cell Biol.146:1133-1146(1999)，其在此通过引用整体并入)，表明Dok7与MuSK的结合对于稳定MuSK磷酸化至关重要，这可能通过促进MuSK二聚化(Bergamin et al.,The Cytoplasmic AdaptorProtein Dok7 Activates the Receptor Tyrosine Kinase MuSK via Dimerization,”Mol.Cell 39:100-109(2010)，其在此通过引用整体并入)。另外，突触蛋白聚糖刺激的MuSK磷酸化导致Dok7羧基端区域中两个酪氨酸残基的磷酸化，引发参与乙酰胆碱受体(AChR)聚集的Crk和Crk-L蛋白的募集(Hallock et al.,“Dok-7 Regulates NeuromuscularSynapse Formation by Recruiting Crk and Crk-L,”Genes Dev.24:2451-2461(2010)和Hamuro et al.,“Mutations Causing DOK7 Congenital Myasthenia Ablate FunctionalMotifs in Dok-7,”J.Biol.Chem.283:5518-5524(2008)，其在此通过引用整体并入)。
Dok7 CM的最常见原因是四碱基对重复(1124_1127dup TGCC)，其几乎总是作为一个或两个突变体等位基因存在于Dok7 CM中，导致Dok7的框移和过早终止(Beeson et al.,“Dok-7 Mutations Underlie a Neuromuscular Junction Synaptopathy,”Science 313:1975-1978(2006)和Cossins et al.,“The Spectrum of Mutations that Underlie theNeuromuscular Junction Synaptopathy in DOK7 Congenital Myasthenic Syndrome,”Hum.Mol.Genet.21:3765-3775(2012)，其在此通过引用整体并入)。Dok7的截短形式保留了PH和PTB结构域，并且与MuSK的酪氨酸磷酸化JM区域结合(Beeson et al.,“Dok-7Mutations Underlie a Neuromuscular Junction Synaptopathy,”Science 313:1975-1978(2006)，其在此通过引用整体并入)，但缺少两个被磷酸化并募集Crk蛋白的酪氨酸残基。这些和其他发现表明，截短的Dok7中这两个酪氨酸残基的缺乏是这种常见形式的Dok7CM中突触缺陷的原因(Engel et al.,“Congenital Myasthenic Syndromes:Pathogenesis,Diagnosis,and Treatment,”Lancet Neurol.14:420-434(2015)；Hallocket al.,“Dok-7 Regulates Neuromuscular Synapse Formation by Recruiting Crk andCrk-L,”Genes Dev.24:2451-2461(2010)；和Hamuro et al.,“Mutations Causing DOK7Congenital Myasthenia Ablate Functional Motifs in Dok-7,”J.Biol.Chem.283:5518-5524(2008)，其在此通过引用整体并入)。然而，Dok7 1124_1127dup TGCC CM的机制尚未阐明。
Dok7的C端区域对于突触的形成至关重要
为了研究Dok7羧基端区域的缺失如何导致神经肌肉突触的结构和功能缺陷，产生了最常见形式的Dok7 CM(Dok7 1124_1127dup)的小鼠模型(图1A)。还产生了第二小鼠突变体(Dok7 Y396F；Y406F)，其中羧基端区域中的两个酪氨酸残基突变为苯丙氨酸(图1A)。
称为Dok7 CM小鼠的纯合Dok7 1124_1127dup小鼠在E18.5时以预期数量存在，但在出生一天后很少发现存活，此时神经肌肉突触对于呼吸和存活是必不可少的(图1B)。将来自E18.5胚胎的膈肌用允许显现突触前和突触后分化的探针进行染色。在Dok7 CM中存在的突触比在野生型小鼠中的少5倍(图1C)。此外，所形成的突触是不成熟的，因为突触尺寸和突触AChR的密度各自降低了5倍(图1C；图7)。相比之下，称为Dok7 2YF小鼠的纯合Dok7Y396F；Y406F小鼠以预期的频率出生(图1B)，并且其神经肌肉突触在很大程度上显示正常(图1C；图8)。此外，Dok7 2YF小鼠作为能生育的成年小鼠茁壮成长(thrive)。总之，出人意料的是，这些发现表明Dok7羧基端区域中两个酪氨酸残基的缺失并不是Dok7 CM小鼠中致死和突触形成严重缺陷的原因。
在Dok7 CM小鼠中Dok7蛋白水平和MuSK酪氨酸磷酸化降低
为了确定羧基端区域的缺失如何导致突触缺陷，使用针对Dok7 PTB结构域的抗体来测量Dok7 CM小鼠中Dok7 mRNA和截短的Dok7蛋白的表达，所述抗体同样检测截短的和野生型蛋白(图9A至9B)。发现Dok7 mRNA水平在来自Dok7 CM小鼠的肌肉中是正常的(图10A至10C)，而截短的Dok7蛋白的表达水平是野生型Dok7蛋白的3倍低(图2A；图10A至10C)。
因为Dok7用作二聚体使MuSK二聚化，稳定MuSK酪氨酸磷酸化(Bergamin et al.,“The Cytoplasmic Adaptor Protein Dok7 Activates the Receptor Tyrosine KinaseMuSK via Dimerization,”Mol.Cell 39:100-109(2010)，其在此通过引用整体并入)，因此考虑了Dok7 CM小鼠中Dok7蛋白水平的降低是否可导致MuSK酪氨酸磷酸化减少。对MuSK进行免疫沉淀，测量MuSK磷酸化，并发现MuSK磷酸化在Dok7 CM小鼠中降低了7倍，但在Dok72YF小鼠中正常(图2C至2D)。
Crk蛋白被直接募集至MuSK以及Dok7
预计在Dok7 CM和Dok7 2YF突变体小鼠二者中，向突触的Crk募集都将不存在或严重减少。事实上，在Dok7 CM小鼠中，向突触和向MuSK复合物的Crk募集均显著降低(2.8倍)(图3A至3B)，但出人意料的是，在Dok7 2YF小鼠中仅适度降低(28％)(图3A至3B)。这些发现表明，除了Dok7之外，Crk还被募集至酪氨酸磷酸化的突触蛋白。
在突触蛋白聚糖刺激之后，三个激活环酪氨酸和Y553在MuSK中被磷酸化(Okadaet al.,“The Muscle Protein Dok-7is Essential for NeuromuscularSynaptogenesis,”Science 312:1802-1805(2006)；Herbst&Burden,“The JuxtamembraneRegion of MuSK has a Critical Role in Agrin-Mediated Signaling,”EMBO J.19:67-77(2000)；Watty et al.,“The in vitro and in vivo Phosphotyrosine Map ofActivated MuSK,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:4585-4590(2000)；和Till et al.,“Crystal Structure of the MuSK Tyrosine Kinase:Insights into ReceptorAutoregulation,”Structure 10:1187-1196(2002)，其在此通过引用整体并入)。发现MuSKJM区域中的Y553不仅在募集Dok7的PTB结合位点内，而且还在Crk蛋白的潜在SH2结合基序(图3C)。图3D示出了CrkI以及Dok7以磷酸化依赖性方式结合MuSK JM位点。构成SH2结合基序但不构成PTB结合位点的氨基酸的突变损害了CrkI结合(图3D)。因此，Crk不仅可以与Dok7的磷酸化羧基端区域结合，还可以与MuSK的酪氨酸磷酸化JM区域直接结合。这种将Crk募集至突触和MuSK复合物的冗余可解释在Dok7 2YF小鼠中Crk与MuSK复合物接近正常的缔合，并且可以是Dok7 CM和Dok7 2YF小鼠的不同表型的基础。
因此，MuSK JM区域具有包含PTB结构域和SH2结构域的蛋白质的重叠结合位点，即在受体酪氨酸激酶下游信号传导模式中提供了灵活性和调节的排列，这可能比目前所理解的更常见。
针对人MuSK和小鼠MuSK的激动剂抗体的开发
如果减少的MuSK磷酸化对Dok7 CM中的疾病至关重要，则推断刺激MuSK可以挽救突触缺陷并克服致死。通过产生靶向MuSK的激动剂抗体并用其处理Dok7 CM小鼠，探索了降低的MuSK磷酸化对于疾病起支配作用的观点。
筛选表达Fab形式的合成人抗体的噬菌体展示文库中与小鼠MuSK和人MuSK二者的胞外区域中的Fz样结构域结合的抗体。Fz样结构域被靶向，因为该结构域对于MuSK功能不是必需的，并且先前的研究表明针对Fz样结构域的抗体对小鼠没有明显伤害(Remedio etal.,“Diverging Roles for Lrp4 and Wnt Signaling in Neuromuscular SynapseDevelopment During Evolution,”Genes Dev.30:1058-1069(2016)和Cantor et al.,“Preserving Neuromuscular Synapses in ALS by Stimulating MuSK with aTherapeutic Agonist Antibody,”Elife 7:e34375(2018)，其在此通过引用整体并入)。
鉴定了结合人MuSK和小鼠MuSK中Fz样结构域的高亲和力抗体(图4A；图12A至12C)。除X1之外，每种Fab的四聚体化形式均刺激小鼠C2肌管中的MuSK磷酸化(图4B)。以小鼠IgG2a和人IgG1形式二者的抗体X3和X17以及以人IgG1形式的X2以低于nM的亲和力结合人MuSK和小鼠MuSK，并且同样刺激MuSK酪氨酸磷酸化，其不依赖于突触蛋白聚糖(图4C至4D)。由于抗体具有相似的活性，因此选择X17进行体内进一步分析。
将具有降低Fc结构域效应物功能的所谓LALAPG突变(Lo et al.,“Effector-Attenuating Substitutions That Maintain Antibody Stability and ReduceToxicity in Mice,”J.Biol.Chem.292:3900-3908(2017)，其在此通过引用整体并入)的小鼠IgG2a形式的抗体X17腹膜内注射到野生型小鼠中。发现X17在血液中的半衰期为5天(图4E)。通过对X17进行染色以定量神经肌肉突触处的靶标接合，发现10mg/kg X17足以使突触MuSK饱和(图4F)。在两个月内在野生型小鼠中长期注射mIgG2a-X17(在P4、P24和P44 10mg/kg)对神经肌肉突触的组织、体重增加或运动行为没有影响(图13A至13D)。
激动剂抗体X17挽救Dok7 CM小鼠的突触形成和致死
尽管C57BL/6背景中的Dok7 CM小鼠在出生时死亡，但发现混合遗传背景中的Dok7CM小鼠在出生之后存活了一到两周(图14A至14B)，这有助于研究治疗效力的实验。在C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 CM小鼠在出生之后不久就显示出疾病体征，因为它们是发育不良的并且在突触形成方面具有缺陷(图15A至15E)。尽管在出生之后存活了数周，但Dok7表达、MuSK磷酸化以及神经末梢的组织以及AChR在携带相同Dok7突变的E18.5近交C57BL/6和混合品种C57BL/6-CBA小鼠中是相似的。
将Dok7 CM小鼠在P4时注射10mg/kg抗体X17，或同种型匹配的阴性对照抗体。未经处理的Dok7 CM小鼠或注射同种型对照抗体的Dok7 CM小鼠体重持续下降，并且在一周内在P10至P12时死亡(图5A至5B)。抗体X17的注射逆转了体重减轻并使Dok7 CM小鼠免于这种早期致死(图5A至5B)。在接下来的三周内，注射了抗体X17的12只Dok7 CM小鼠中有9只持续体重增加；三只注射了X17的小鼠的体重增加减慢并且其在P23至P24死亡。另一种抗体X3在以20mg/kg给药而非以10mg/kg给药时使Dok7 CM小鼠免于出生之后早期致死(图17A至17C)，表明较高初始剂量的MuSK激动剂抗体可在出生之后早期发育期间(当突触正在经历成熟的关键步骤)更有效。
在P24和P44在九只存活的Dok7 CM小鼠中重复注射抗体X17以确定长期给药是否可导致长期存活。在九只存活的Dok7 CM小鼠中长期给药抗体X17挽救了这些Dok7 CM小鼠至少两个月(图5A至5B)，在此时评估它们的运动表现并将小鼠处死以检查其突触。
抗体X17挽救了突触的形成和成熟，因为神经肌肉突触发育成完全成熟的鼠神经肌肉突触的复杂椒盐卷饼样形状特征(图5C)。此外，X17挽救了Crk蛋白向神经肌肉突触的募集(图5D)。
抗体X17挽救了Dok7 CM小鼠的运动功能，如通过前肢握力和转棒仪测定所评估的(图5E)。此外，注射了抗体X17的Dok7 CM小鼠是能生育的并以预期的频率产生后代。总之，这些发现支持这样的观点：降低的MuSK酪氨酸磷酸化对于Dok7 CM小鼠中的疾病极为重要。虽然Dok7的羧基端区域在突触形成中具有另外的作用，但这样的功能也可以通过刺激MuSK来覆盖。
成年Dok7 CM小鼠的治疗逆转
接下来，研究了X17是否可以逆转成年期出现的神经肌肉缺陷，这是与开发人治疗特别相关的问题，因为人的Dok7 CM可能会在成年期间得到治疗。在P4、P24和P44或在P4和P18用X17处理Dok7 CM小鼠，但随后中断抗体处理。这些Dok7 CM小鼠在2到3个月内继续维持它们的体重和运动性(图6A)，表明该挽救比抗体在血液中的寿命时间更长。然而，这些Dok7 CM小鼠最终开始体重减轻并表现出运动缺陷(图6A至6B)。当小鼠以约0.4g/天的速率体重减轻时，再次注射X17并监测Dok7 CM小鼠的体重和运动性。在恢复X17处理之后两天，Dok7 CM小鼠开始恢复体重，在接下来的一周内提高约0.4g/天(图6A)。在重新开始抗体处理之后的一周内，Dok7 CM小鼠的运动表现得到恢复(图6B)。被挽救的小鼠在抗体处理之后至少又一周中继续体重增加并且其运动表现得以改善，直到小鼠被处死时(图6A至6B)。
实施例1的讨论
用激动剂抗体刺激MuSK挽救了突触形成和运动功能，防止了致死并允许Dok7 CM小鼠在出生之后茁壮成长为能生育的成年小鼠。此外，在停止抗体处理之后，Dok7 CM成年小鼠最终表现出运动缺陷，这在重新开始抗体处理之后很容易逆转，表明这种治疗策略可以为Dok7 CM以及人中的其他神经肌肉疾病提供益处。
大多数先前对Dok7的研究依赖于对过表达Dok7的经转染肌肉细胞和非肌肉细胞的分析(Okada et al.,“The Muscle Protein Dok-7is Essential for NeuromuscularSynaptogenesis,”Science 312:1802-1805(2006)；Hamuro et al.,“Mutations CausingDOK7 Congenital Myasthenia Ablate Functional Motifs in Dok-7,”J.Biol.Chem.283:5518-5524(2008)；和Hallock et al.,“Dok-7 RegulatesNeuromuscular Synapse Formation by Recruiting Crk and Crk-L,”Genes Dev.24:2451-2461(2010)，其在此通过引用整体并入)。在这种情况下，它绕过了对突触蛋白聚糖和Lrp4刺激MuSK的正常需求，由于Dok7过表达，Dok7突变的体内后果可能已被掩盖。
较早的研究描述了使用经典ES细胞基因靶向产生的类似小鼠模型，以用于这种常见形式的Dok7 CM(Arimura et al.,“Neuromuscular Disease.DOK7 Gene TherapyBenefits Mouse Models of Diseases Characterized by Defects in theNeuromuscular Junction,”Science 345:1505-1508(2014)，其在此通过引用整体并入)。尽管这些突变体小鼠的致死可以通过表达野生型Dok7的腺病毒相关载体来挽救，建立了治疗Dok7 CM的治疗方法(Arimura et al.,“Neuromuscular Disease.DOK7 Gene TherapyBenefits Mouse Models of Diseases Characterized by Defects in theNeuromuscular Junction,”Science 345:1505-1508(2014)，其在此通过引用整体并入)，但本研究未检查Dok7 1124_1127dup小鼠模型中的疾病原因。
携带Dok7 1124_1127dup突变的近交C57BL/6小鼠表现出比具有相同突变的人更严重的功能缺陷。发现在具有混合遗传背景的小鼠中突变体表型不太严重，因为远交小鼠在出生之后存活了数周，而近交突变体小鼠在出生时死亡。杂交系中的修饰基因(modifier)可减轻疾病的严重程度，或者C57BL/6小鼠可含有使表型恶化的基因。在任一种情况下，混合背景中的Dok7 CM小鼠的适度延长寿命提供了呈现更长的时间窗以更好地评估治疗剂的小鼠模型。
这些实验表明通过靶向治疗完全挽救了先天性致死。这些发现表明了意料之外的治疗疾病的治疗方法，因为该策略不直接靶向突变体蛋白，而是靶向由上游基因(在此种情况中为Dok7)突变引起的活性降低的野生型蛋白。这样的上位性挽救可以为由Agrin、Lrp4或MuSK(除了Dok7之外)中的突变引起的CM以及另外的神经肌肉疾病提供治疗。此外，该策略具有广泛用于治疗人中隐性遗传性病症的潜能，对于所述隐性遗传性病症，疾病机制已被了解并已鉴定出合适的靶标。
实施例2-MUSK抗体
靶向MuSK卷曲结构域的简单抗体的选择
用重组人MuSK(R&Dsystems，目录号9810-MK)对两只美洲驼进行免疫接种。使用deHaard et al.,“A Large Non-Immunized Human Fab Fragment Phage Library thatPermits Rapid Isolation and Kinetic Analysis of High Affinity Antibodies,”J.Biol.Chem.274:18218-18230(1999)(其在此通过引用整体并入)描述的策略，将从经免疫接种的美洲驼中分离的PBL用于RNA提取、RT-PCR和在噬菌粒中PCR克隆Fab。使用全长人MuSK、全长小鼠MuSK或缺乏Ig1样和/或Ig2样和/或Ig3样结构域的人MuSK进行多达三轮的淘选噬菌体展示选择(图18)。
对于每个富集选择，将单独克隆在96深孔板中培养并制备周质级分。在ELISA中测试这些周质提取物(含有Fab)与全长人MuSK、全长小鼠MuSK或缺乏Ig1样和/或Ig2样和/或Ig3样结构域的人MuSK的结合。然后在包被有全长人MuSK、全长小鼠MuSK或缺乏Ig1样和/或Ig2样和/或Ig3样结构域的人MuSK的CM5芯片上在Biacore中测试在ELISA中显示明确结合的Fab的解离率。对针对人MuSK和小鼠MuSK具有良好亲和力和对MuSK的卷曲结构域具有特异性的结合剂进行测序。获得了六个不同的结合剂家族：1E11、6F8、10F1、17H10、14D10、16F11。将这些克隆到包含具有敲除效应物功能的LALA突变(L234A、L235A)的人IgG1序列的载体中。在HEK293细胞中产生抗体并将其在蛋白A柱上纯化。
ELISA中抗体与人MuSK和小鼠MuSK的结合
将ELISA板用人MuSK(R&D systems，目录号10189-MK)或小鼠MuSK(在HEK293细胞中内部生产)以0.2μg/ml进行包被。在洗涤和封闭板之后，施加抗-MusK抗体的稀释系列并使其在室温下结合2小时。用山羊抗人Fc-HRP(Jackson Immunoresearch，目录号109-035-008)和TMB(Merck Millipore#CL07)检测结合。用96孔ELISA读板器测量620nm处的OD。
所有6种抗体(1E11、6F8、10F1、17H10、14D10和16F11)均显示出与人MuSK结合。然而，与小鼠MuSK的结合很差，除了16F11。在16F11浓度较高时，16F11与小鼠MuSK的结合相比于与人MuSK的结合提高(图19)。总之，该测定显示所测试的6种抗体中5种的人小鼠交叉反应性结合较差。
轻链混编(Light Chain Shuffling)以改善小鼠交叉反应性
在反复暴露于相同抗原时，例如在美洲驼免疫接种期间，通过提高抗体对靶标的亲和力来优化免疫应答。再次应答可以引发亲和力是初次应答中数个对数倍高的抗体。作为结果，B细胞产生对抗原具有不同亲和力的不同的抗体及其变体。上面所选六种抗体中有五种的小鼠交叉反应性较差。因此，将链混编应用于mAb。在这个过程中，将Fab分子的VH克隆到VL的完全相应的美洲驼库中。所得文库将包含具有对Fab具有特异性的VH链和随机VL链的Fab-噬菌体。使用噬菌体展示和MuSK的不同变体(类似于上面所述)，选择了在经免疫接种动物中天然存在的更高亲和力的变体。对于每个富集选择，将单独克隆在96深孔板中培养，并且制备周质级分。在包被有全长人MuSK和全长小鼠MuSK的CM5芯片上在Biacore中测试了这些周质提取物(包含Fab)的结合。对针对人MuSK和小鼠MuSK具有良好亲和力的结合剂进行测序。该行动在14D10、16F11、6F8和17H10取得了成功。对于10F1和1E11，未获得小鼠交叉反应性的改善。
对于14D10，获得了交叉反应性结合剂的6个不同序列：31G2、31B7、3C4、7G4、3G3和3B2。对于17H10，获得了交叉反应性结合剂的3个不同序列：23B6、30E1和30A11。对于16F11，获得了交叉反应性结合剂的4个不同序列：4C11、7G12、7B8和7A12。
将这些都克隆到包含具有敲除效应物功能的LALA突变(L234A、L235A)的人IgGl序列的载体中。在HEK293细胞中产生抗体并将其在蛋白A柱上纯化。
ELISA中抗体与人MuSK和小鼠MuSK的结合
将ELISA板用人MuSK(R&D Systems，目录号10189-MK)、恒河猴MuSK(在HEK293细胞中内部生产)或小鼠MuSK(在HEK293细胞中内部生产)以0.2μg/ml包被。在洗涤和封闭板之后，施加抗MuSK抗体的稀释系列并使其在室温下结合2小时。用山羊抗人Fc-HRP(JacksonImmunoresearch，目录号109-035-008)和TMB(Merck Millipore#CL07)检测结合。在用0.5NH2SO4(ChemLab#CL052615)停止反应之后，用96孔ELISA读板器测量450nm处的OD。EC50值总结在表4中。确定了所有测试的克隆对小鼠MuSK的亲和力都提高。
表4：轻链混编的克隆表征，从与人MuSK、小鼠MuSK和恒河猴MuSK的结合ELISA得到的每种mAb的EC50值
*选择粗体序列用于在HEK293细胞中和在深度表征中大规模抗体产生。
以下标准用于选择最佳克隆：(i)对人MuSK、恒河猴MuSK和小鼠MuSK的亲和力最高；(ii)人MuSK、恒河猴MuSK和小鼠MuSK之间的亲和力差异最小；(iii)人MuSK、恒河猴MuSK和小鼠MuSK之间的亲和力差异为最大10倍；(iv)基于CDR序列分析的可制造性问题的风险低；以及(v)人同一性/同源性最高。
选择克隆3B2、30A11和30E1用于在HEK293细胞中和在深度表征中大规模抗体产生。
Biacore中针对人MuSK与小鼠MuSK的结合亲和力
与MuSK的单价结合可抑制突触蛋白聚糖诱导的MuSK磷酸化和AChR聚集，如Huijbers et al.,“MuSK Myasthenia Gravis Monoclonal Antibodies:ValencyDictates Pathogenicity,”Neurol.Neuroimmunol.Neuroinflamm.6(3):e547(2019)中所述，其在此通过引用整体并入。因此，评估3B2、30E1和30A11 Fab对MuSK的亲和力很重要。实际上，亲和性较低的Fab可以减少mAb的单价结合，并因此具有潜在的安全优势。因此，在Biacore中将Fab对人MuSK和小鼠MuSK的亲和力与mAb对人MuSK和小鼠MuSK的亲和力进行了比较。
对于亲和力测定，用人MuSK或小鼠MuSK(200RU)包被CM5芯片并施加抗体(mAb和Fab)的稀释系列以便能够计算亲和力。
使用该测定，3B2 mAb对人MuSK和小鼠MuSK二者的亲和力均为0.1nM。Fab 3B2显示出对人MuSK的亲和力为3nM，以及对小鼠MuSK的亲和力为1.5nM，其是mAb的亲和力的15至30倍低。
30E1在与人MuSK结合(0.01nM)和与小鼠MuSK结合(0.1nM)的亲和力方面显示出10倍的差异。30A11在与人MuSK结合(0.001nM)和与小鼠MuSK结合(0.1nM)的亲和力方面甚至显示出100倍的差异。所以这两种抗体都没有足够的小鼠交叉反应性。此外，30E1 Fab和30A11 Fab对人MuSK显示出高亲和力，分别为0.07nM和0.8nM。对于Fab，也观察到两种抗体缺乏小鼠交叉反应性。这些结果表明，当比较其对人MuSK与对小鼠MuSK的亲和力时，30E1和30A11 mAb的差异为10至100倍，而30E1和30A11 Fab的差异为至少1000倍(表5)。不建议将抗体对其靶标的这种亲和力差异用于抗体的进一步开发，因为很难评估体内小鼠实验并将数据转化到人。总之，3B2 mAb和Fab显示出所期望的亲和力特征和跨物种反应性以用于进一步开发。
表5：Biacore中mAb和Fab对人MuSK与对小鼠MuSK的亲和力
C2C12磷酸化测定中抗体的效力
为了评价由3B2、30E1、30A11诱导的MuSK磷酸化的程度，使用了采用小鼠C2C12肌管的体外MuSK磷酸化测定(91031101，Sigma Cell line service ECACC)。将分化的肌管用10nM的抗体刺激。MuSK磷酸化的阳性对照是施加0.1nM神经大鼠突触蛋白聚糖(550-AG-100，R&D systems)的刺激条件。在4℃下过夜孵育期间，在暴露之后立即开始MuSK的免疫沉淀。使用链霉亲和素包被的磁珠(V7820，Promega)在4℃下沉淀结合的抗原-抗体复合物至少1小时，并随后彻底洗涤。同时，将链霉亲和素包被的MSD板(L15SA-1，MSD)封闭并用生物素化的hIgG4抗MuSK(克隆13-3B5-Evitria产生801457.1PID 9860-在argenx进行生物素化)进行包被。在施加酸性条件下从珠中洗脱MuSK蛋白，随后进行中和步骤，并将其在hIgG4抗MuSK包被的MSD板上在室温下孵育至少2.5小时。在溶液中在存在截短的MuSK(MuSK Δ1-2-3 Ig，在HEK中产生argenx)的情况下进行样品孵育，以限制共洗脱的抗MuSK hIgG1抗体的药物干扰。将样品以一式四份加载到板上，其允许以一式两份检测样品中的总MuSK(PA1-1741，Thermoscientific和MBS9205728，MyBioSource的混合物)和磷酸化MuSK(05-321Millipore Corp(克隆4G10)和ab10321，Abcam(克隆PY20)的混合物)。施加SULFO-TAG缀合的抗体进行最终检测，分别是抗兔IgG用于总MuSK检测(32AB-1，MSD)以及抗小鼠IgG用于磷酸化MuSK检测(R32AC-1，MSD)。使用Quickplex SQ 120(MSD)检测结合的抗体。
向C2C12肌管添加突触蛋白聚糖(1nM)诱导MuSK磷酸化并将其设定为100％。进行了三个独立的实验。使用该实验设置，3B2、30E1和30A11可以在该测定中诱导MuSK磷酸化，为50％至94％(表6)。
表6：C2C12小鼠测定中诱导的磷酸化百分比(％)
| ％与突触蛋白聚糖相比 | 测定1 | 测定2 | 测定3 | 平均 | STD |
| 1nM突触蛋白聚糖 | 100 | 100 | 100 | 100 | 0 |
| 0.1nM突触蛋白聚糖 | NA | 64 | 56 | 60 | 6 |
| 莫维珠单抗 | 38 | 20 | 17 | 25 | 11 |
| 3B2 | 74 | 94 | 64 | 77 | 15 |
| 30E1 | 66 | 82 | 50 | 66 | 16 |
| 30A11 | 73 | 89 | 74 | 79 | 9 |
3B2挽救Dok7 1124_1127 Dup小鼠的早期产后致死
在第一个实验中，在野生型小鼠(C57BL/6//CBA)中在P4和P18二者时以10mg/kg腹膜内(IP)施用3B2至少5周，显示出在体重和整体健康状况方面与经同种型注射的野生型小鼠没有差异，表明没有安全问题或毒性问题，并且表明3B2抗体对于进一步的体内实验工作是安全的。
接下来，将3B2施用于Dok7 1124_1127dup小鼠(CMS小鼠模型)。在Dok7 1124_1127dup小鼠(下文中称为Dok7小鼠)中，截短的Dok7表达不佳，并且MuSK酪氨酸磷酸化严重降低。Dok7小鼠中MuSK磷酸化水平的降低在疾病中发挥关键作用。用针对MuSK的激动剂抗体刺激MuSK磷酸化可以挽救Dok7小鼠的致死，使突变体小鼠存活，成为成体。实际上，施用3B2(P4时20mg/kg IP和P18时10mg/kg IP)可以挽救Dok7突变体小鼠的早期出生之后致死(图20)。
3B2去除可能性和CDR接枝
将3B2抗体在PBS-吐温中稀释至1mg/mL，并在37℃下孵育多至6周。接下来，通过质谱来分析样品并针对VH和VL中的脱酰胺、糖基化、异构化和氧化位点进行筛选。正如预测的那样，确定了两种可能性(liability)：VH-CDR2中的1个脱酰胺位点和VL-CDR3中的1个氧化位点。产生去除这两种可能性的突变体。此外，3B2已经具有高的人同一性/同源性(分别为94.2％和97.7％)，但其通过在最接近的人种系序列上进行CDR接枝进一步提高至100％。
组合这两种策略，总共产生了8种变体，总结在表7中。以人IgG1-LALA骨架在HEK293细胞中产生了抗体并将其在蛋白A柱上纯化。
表7：为去除可能性和获得100％人同一性而产生的变体
Biacore中3B2的序列优化变体的亲和力
对于亲和力测定，将CM5芯片用食蟹猴MuSK、大鼠MuSK和小鼠MuSK(200RU)包被并且施加66.7nM的抗体并计算动力学参数(表8)。可以得出以下结论：(1)3B2g1m3和3B2g2m3(m3变体)显示出对所有所测试物种的MuSK的亲和力均显著降低；(2)3B2g1m2和3B2g2m2(m2变体)显示出对MuSK的亲和力有所降低；(3)3B2g1m1、3B2g2m1、3B2g1m4、3B2g2m4(m1和m4变体)显示出对所有所测试物种的MuSK的亲和力均未降低；以及(4)对于所有克隆，g1与g2变体之间没有差异(CDR3中的VL甲硫氨酸与丝氨酸)。
表8：Biacore中mAb对食蟹猴MuSK与对小鼠MuSK与对大鼠MuSK的亲和力、在pH7.4下的缔合和解离
常规抗体通过非特异性胞吞作用或胞饮作用或通过受体介导的内化作用而被摄取到细胞中。对再循环抗体进行改造，使得单抗体分子可以与抗原多次结合，相比之下常规抗体可与抗原仅结合一次。事实上，一旦常规抗体与膜锚定抗原(例如受体)结合，抗体-抗原复合物就会内化并在溶酶体内降解。这导致治疗性抗体的半衰期更短，需要频繁施用抗体药物或以更高的剂量施用以维持有效的血浆抗体浓度。可以对抗体进行改造，使得抗体在内体内在酸性pH值下与抗原解离。一旦解离，再循环抗体就自由地与内体中的FcRn(新生Fc受体)结合，从而将抗体转运回循环中以与更多抗原结合。
MuSK在肌肉细胞的膜上表达并且MuSK的内化描述于Zhu et al.,“Muscle-Specific Receptor Tyrosine Kinase Endocytosis in Acetylcholine ReceptorClustering in Response to Agrin,”J.Neurosci.28(7):1688-1696(2008)中，其在此通过引用整体并入。因此，针对该靶标的再循环抗体可以是目的抗体。
迄今为止报道的大多数pH依赖性抗体是在对CDR进行大量改造之后获得的，但有时这种特性可以是预先存在的。如果3B2和优化的序列变体具有针对与MuSK结合的天然存在的pH依赖性，则在Biacore中进行研究。
为了研究我们的抗体与MuSK的pH依赖性结合，使用与上述相同的Biacore，但现在在pH 5.5而不是pH 7.4下进行解离。结果表明，3B2以pH依赖性与MuSK(食蟹猴、大鼠或小鼠)结合，在pH 5.5时亲和力降低(表9)。对于不同的变体，可以得出以下结论：(1)3B2g1m3和3B2g2m3(m3变体)显示出对所有所测试物种的MuSK的亲和力均显著降低；(2)3B2g1m2和3B2g2m2(m2变体)显示出对MuSK的亲和力有所降低；(3)3B2g1m1、3B2g2m1、3B2g1m4、3B2g2m4(m1和m4变体)显示出对所有所测试物种的MuSK的亲和力均未降低；以及(4)对于所有克隆，g1与g2变体之间没有差异(CDR3中的VL甲硫氨酸与丝氨酸)。
表9：Biacore中mAb对食蟹猴MuSK与对小鼠MuSK与对大鼠MuSK的亲和力，pH7.4下的缔合，pH5.5下的解离
评价3B2变体的体外MuSK磷酸化测定
为了评价由我们的激动性3B2变体抗体诱导的MuSK磷酸化的程度，使用了采用小鼠C2C12肌管的体外MuSK磷酸化测定。对照包括突触蛋白聚糖、亲本3B2和莫维珠单抗(非MuSK结合Ab)。向C2C12肌管添加突触蛋白聚糖诱导MuSK磷酸化并将其设置为100％，这包括减去通过非MuSK结合剂莫维珠单抗诱导MuSK磷酸化分析的背景MuSK磷酸化。亲本3B2 Ab诱导的MuSK磷酸化与1nM突触蛋白聚糖诱导的一样多。此外，3B2变体3B2g1m1和3B2g2m1的表现与亲本3B2 Ab一样好。3B2g1m2和3B2g2m2还诱导强MuSK磷酸化(+/-80％)。3B2g1m3和3B2g2m3失去了诱导MuSK的能力，导致MuSK磷酸化为约13％。令人感兴趣的是，3B2g1m4和3B2g2m4几乎失去了一半诱导MuSK的能力，导致MuSK磷酸化为约58％(图21)。
ELISA中3B2变体对来自不同物种的所包被MuSK的结合亲和力
为了评价3B2变体与来自不同物种的MuSK蛋白的结合亲和力，进行了ELISA。将板用来自人、食蟹猴、大鼠或小鼠的MuSK包被并且如上所述评估与3B2相比不同的3B2变体的结合。在该测定中，与3B2相比，3B2g1m1、3B2g2m1、3B2g1m4和3B2g2m4没有失去亲和力。而3B2g1m2、3B2g2m2、3B2g1m3和3B2g2m3失去了对来自不同物种的MuSK的结合亲和力(图22)。
实施例3–激动性MuSK抗体的pH依赖性的差异
常规抗体通过非特异性胞吞作用或胞饮作用或通过受体介导的内化作用而被摄取到细胞中。如上文所述，对再循环抗体进行改造使得单抗体分子可以与抗原多次结合，相比之下常规抗体可仅一次结合抗原。事实上，一旦常规抗体与膜锚定抗原(例如受体)结合，抗体-抗原复合物就会内化并在溶酶体内降解。这导致治疗性抗体的半衰期更短，需要频繁施用抗体药物或以更高的剂量施用以维持有效的血浆抗体浓度。可以对抗体进行改造，使得抗体在内体内在酸性pH下与抗原解离。一旦解离，再循环抗体就自由地与内体中的FcRn(新生Fc受体)结合，从而将抗体转运回循环中以与更多抗原结合。
MuSK在肌肉细胞膜上表达并且MuSK的内化描述于Zhu et al.,“Muscle-SpecificReceptor Tyrosine Kinase Endocytosis in Acetylcholine Receptor Clustering inResponse to Agrin,”J.Neurosci.28(7):1688-1696(2008)中，其在此通过引用整体并入。因此，针对该靶标的再循环抗体可以是目的抗体。
迄今为止报道的大多数pH依赖性抗体是在对CDR进行大量改造之后获得的，但有时这种特性可以是预先存在的。在Biacore中研究了X2、X2m4、X3、X9、X17、3B2和3B2g2m1是否具有针对与MuSK结合的天然存在的pH依赖性。
为了研究本文中所述的抗体与MuSK的pH依赖性结合，使用了Biacore T200。简言之，将CM5芯片用人MuSK和小鼠MuSK(200RU)包被并施加22.2nM的Fab并计算动力学参数。在pH7.4下进行缔合，在pH7.4并且还在pH5.5下进行解离。测试了以下Fab：X2、X2m4、X3、X9、X17、3B2和3B2g2m1(表10和图23)。令人感兴趣的是，这些结果表明3B2g2m1对人MuSK和小鼠MuSK二者均具有pH依赖特性特性。在pH 5.5下的结合亲和力非常低，导致在内体pH下快速解离，从而允许3B2g2m1再循环。
表10：Biacore中MuSK激动剂Fab对人MuSK和小鼠MuSK的解离速率分析，在pH 7.4下缔合，在pH 7.4或pH 5.5下解离。
实施例4–靶向Fz结构域的激动性MuSK抗体不干扰通过其天然配体突触蛋白聚糖的MuSK激活
MuSK的激活需要运动神经元分泌的突触蛋白聚糖、位于肌膜的LRP4和细胞质DOK-7。LRP4和MuSK在不存在突触蛋白聚糖的情况下预组装，但MuSK的激活仅在存在突触蛋白聚糖的情况下被诱导。事实上，突触蛋白聚糖结合的LRP4与MuSK启动了MuSK反式磷酸化和激活(Stiegler et al.,“Crystal Structure of the Agrin-Responsive Immunoglobulin-Like Domains 1and 2of the Receptor Tyrosine Kinase MuSK,”J.Mol.Biol.364:424–433(2006)；Kim et al.,“Lrp4 is a Receptor for Agrin and Forms a Complex withMuSK,”Cell 135:334-342(2008)；和Zhang et al.,“Agrin Binds to the N-TerminalRegion of Lrp4 Protein and Stimulates Association between Lrp4 and the FirstImmunoglobulin-Like Domain in Muscle-Specific Kinase(MuSK),”J.Biol.Chem.286:40624–40630(2011)；和Zong et al.,“Structural Basis of Agrin-LRP4-MuSKSignaling,”Genes Dev.26:247–258(2012)，其在此通过引用整体并入)。
靶向MuSK的Fz结构域的MuSK激动性抗体可以潜在地干扰突触蛋白聚糖对MuSK的激活。为了测试Fz结合MuSK激动剂抗体是否可以与突触蛋白聚糖一起激活MuSK，进行了体外共刺激实验。
使用了采用小鼠C2C12肌管的体外MuSK磷酸化测定，以评价在有或没有突触蛋白聚糖(0.1nM突触蛋白聚糖)的非饱和条件下激动性MuSK抗体3B2g2m1诱导的MuSK磷酸化的程度。对照包括突触蛋白聚糖(1nM和0.1nM)和莫维珠单抗(同种型对照，非MuSK结合mAb，333nM)。所有刺激均进行30分钟。向C2C12肌管添加1nM突触蛋白聚糖诱导MuSK磷酸化并将其设置为100％，这包括减去通过非MuSK结合剂莫维珠单抗的MuSK磷酸化诱导分析的背景MuSK磷酸化。用0.1nM的突触蛋白聚糖刺激MuSK会导致53％的MuSK磷酸化诱导，表明在该测定中突触蛋白聚糖的浓度次优。从0.01至333nM滴定3B2g2m1(不含突触蛋白聚糖)导致MuSK磷酸化的剂量依赖性提高。重要的是，与仅使用3B2g2m1或0.1nM突触蛋白聚糖的刺激相比，3B2g2m1与次优浓度的0.1nM突触蛋白聚糖的共刺激导致MuSK磷酸化提高。值得注意的是，与0.1nM的突触蛋白聚糖组合的0.3nM的3B2g2m1导致100％ MuSK磷酸化，类似于仅使用1nM突触蛋白聚糖的刺激(图24)。该数据表明，与MuSK的Fz结构域结合的3B2g2m1可以与突触蛋白聚糖平行地刺激MuSK。此外，可以表明3B2g2m1可以在其天然配体突触蛋白聚糖之上激活MuSK，导致MuSK磷酸化提高。事实上，突触蛋白聚糖与LRP4结合，其继而与MuSK的Ig-1样结构域结合。因此，通过用激动性MuSK抗体靶向Fz结构域来激活MuSK，不会干扰通过其天然配体突触蛋白聚糖的MuSK激活。
实施例5–MuSK激动剂抗体mIgG2a-X17和hIgG-X17
在Dok7模型中测试了mIgG2a-X17和hIgG-X17抗体组合的治疗效用。尽管在P4用同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理的C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_27dup小鼠在出生之后一至两周死亡(混合遗传背景中未经处理的Dok7 1124_27dup小鼠也是如此)，但是发现在P4注射10mg/kg mIgG2a-X17(n＝3)和在P24和P44注射10mg/kg hIgG-X17的Dok71124_1127dup小鼠存活，成为成体(图25A至25B)。
与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，在P4注射10mg/kgmIgG2a-X17和在P24和P44注射10mg/kg hIgG-X17的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加(图25B)。此外，mIgG2a-X1和hIgG-X17的组合挽救了Dok7 1124_27dup小鼠的运动功能，如通过握力和从旋转的转棒仪掉落的等待时间所评估的(图26)。
总之，这些发现表明针对MuSK的激动剂抗体，与hIgG-X17组合的mIgG2a-X17挽救了年轻的Dok7 1124_1127dup小鼠。
实施例6–MuSK激动剂抗体hIgG-X17
为了确定MuSK激动剂抗体hIgG-X17是否在突触处接合MuSK，将P40野生型小鼠腹膜内注射MuSK激动剂抗体hIgG-X17(0mg/kg、2mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)。在两天之后，将小鼠处死并将膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记AchR，以及用Alexa 647山羊抗-人IgG，F(ab')2片段特异性进行染色以标记X17。通过X17与AChR信号强度之比来测量突触处X17的饱和水平。图27的图表明了MuSK激动剂抗体hIgG-X17在突触处接合MuSK并以20mg/kg使MuSK饱和。
接下来，为了研究在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中hIgG-X17是否挽救致死，在P4用激动剂抗体hIgG-X17或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。与未经处理的小鼠一样，注射同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)在出生之后一至两周死亡，而在P4、P18和P38注射hIgG-X17的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝4)存活，成为成体(图28A)。此外，与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，在P4注射20mg/kg hIgG-X17和在P18和P38注射10mg/kg hIgG-X17的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加(图28B)。
为了评价在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中hIgG-X17是否恢复突触发育，将来自P60野生型和Dok7 1124_1127dup小鼠的膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记AchR，以及用针对βIII微管蛋白/突触蛋白的抗体染色以标记运动轴突/神经末梢(图29)。在用hIgG-X17处理的Dok7 1124_1127dup小鼠中，突触从简单的斑块样形状成熟为复杂的椒盐卷饼样形状，这是成熟鼠神经肌肉突触的特征(参见图29的免疫组织化学图像)，并且突触的数量、突触尺寸和突触AChR的密度分别恢复至正常水平的70％、50％和40％(参见图29的图)。
hIgG-X17挽救了Dok7 1124_27dup小鼠的运动功能，如通过握力和从旋转的转棒仪掉落的等待时间所评估的(图30)。
接下来，评价hIgG-X17是否可以逆转Dok7 1124_1127dup小鼠成年期间出现的神经肌肉缺陷。简言之，在P4、P24和P44或在P4、P18对Dok7 1124_1127dup小鼠注射MuSK激动剂抗体，并随后中断抗体处理。这些Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加并且在数个月内维持了它们的运动性，但最终开始体重减轻(图31A、图31B)，并表现出运动缺陷，如通过握力和从旋转的转棒仪掉落的等待时间所评估的(图31C)。然后小鼠不进行再注射(图31A)，或再注射hIgG-X17(图31B)。未接受另外剂量的抗体的小鼠在数天内死亡(图31A)，而在接受另一种X17处理的小鼠中Dok7 1124_1127dup小鼠开始体重增加(图31B)，并且在重新开始处理之后一周它们的运动缺陷被逆转(图31C)。Dok7 1124_1127dup小鼠在转棒仪上的表现为3.25倍高，而野生型小鼠的表现为1.30倍高(图31C)。Dok7 1124_1127dup小鼠的握力为1.30倍高，而野生型小鼠的表现没有提高(图31C)。
实施例7–MuSK激动剂抗体3B2
为了确定在野生型小鼠中长期注射MuSK激动剂抗体3B2对存活或体重增加是否具有影响，在P4和P18对C57BL/6-CBA混合背景小鼠注射3B2(n＝3)，并且将其与未经注射的C57BL/6-CBA混合背景小鼠(n＝4)进行比较。与未经注射的野生型小鼠一样，注射了3B2的野生型小鼠存活直到在P38时被处死(图32A)并且体重增加与未经注射的野生型小鼠相似(图32B)。
接下来，为了研究在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中3B2是否挽救了致死，在P4用MuSK激动剂抗体3B2或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。注射同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)与未经处理的小鼠一样，在出生之后一至两周死亡，而在P4注射20mg/kg 3B2、在P18注射10mg/kg 3B2，以及在P38注射10mg/kg 3B2的Dok7 1124_1127dup小鼠存活，成为成体(n＝3)(图33A)。此外，与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，在P4注射20mg/kg 3B2、在P18注射10mg/kg 3B2和在P38注射20mg/kg 3B2的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加(图33B)。
为了评价在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中3B2是否恢复突触发育，将来自P60野生型和Dok7 1124_1127dup小鼠的膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记AchR，以及用针对βIII微管蛋白/突触蛋白的抗体染色以标记运动轴突/神经末梢(图34)。在用3B2处理的Dok71124_1127dup小鼠中，突触从简单的斑块样形状成熟为复杂的椒盐卷饼样形状，这是成熟鼠神经肌肉突触的特征(参见图34的免疫组织化学图像)，并且突触的数量、突触尺寸和突触AchR的密度分别恢复至正常水平的80％、75％和40％(参见图34的图)。
3B2挽救了Dok7 1124_27dup小鼠的运动表现，如通过握力和从旋转的转棒仪掉落的等待时间所评估的(图35)。此外，在P4、P18和P38注射MuSK激动剂抗体3B2维持Dok71124_1127dup小鼠健康至少两个月(图36)。
接下来，评价了在成年Dok7 1124_1127dup小鼠中3B2是否可以逆转疾病复发。简言之，在P4、P24和P44对Dok7 1124_1127dup小鼠注射10mg/kg mIgG2a-X-17。Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加并维持其运动性数月，但最终开始体重减轻(图37)。然后对小鼠注射10mg/kg 3B2(图37)。在重新开始用3B2处理之后，该Dok7 1124_1127dup小鼠开始体重增加(图37)。
实施例8–MuSK激动剂抗体hIgG-X2
为了确定在野生型小鼠中长期注射MuSK激动剂抗体hIgG-X2对存活或体重增加是否具有影响，在P4和P18对C57BL/6-CBA混合背景小鼠注射hIgG-X2(n＝3)并将其与未注射的C57BL/6-CBA混合背景小鼠(n＝4)进行比较。与未经注射的野生型小鼠一样，注射了hIgG-X2的野生型小鼠存活直至在P38时处死(图38A)并且体重增加与未经注射的野生型小鼠相似(图38B)。
接下来，为了研究在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中hIgG-X2是否挽救致死，在P4用MuSK激动剂抗体hIgG-X2或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。与未经处理的小鼠一样，注射同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)在出生之后一至两周死亡，而在P4注射20mg/kg hIgG-X2和在P18注射10mg/kg hIgG-X2的Dok7 1124_1127dup小鼠存活，成为成体(n＝2)(图39A)。此外，与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，在P4注射20mg/kg hIgG-X2和在P18注射10mg/kg hIgG-X2的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加(图39B)。
接下来，评价在成年Dok7 1124_1127dup小鼠中hIgG-X2是否可以逆转疾病复发。简言之，在P4对Dok7 1124_1127dup小鼠注射20mg/kg hIgG-X2，并在P18注射10mg/kghIgG-X2。Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加并在数个月内维持其运动性，但最终开始体重减轻(图40)并表现出运动缺陷，如通过握力和从旋转的转棒仪掉落的等待时间所评估的(图40B)。然后对小鼠注射10mg/kg hIgG-X2(图40A)。在重新开始用hIgG-X2处理之后，Dok71124_1127dup小鼠开始体重增加(图40A)，并且它们的运动缺陷完全逆转(图40B)。
实施例9–MuSK激动剂抗体hIgG-X2m4
为了研究在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中，hIgG-X2m4是否挽救致死，在P4用MuSK激动剂抗体hIgG-X2m4或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。与未经处理的小鼠一样，注射同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)在出生之后一至两周死亡，而在P4注射20mg/kg hIgG-X2m4和在P18注射10mg/kg hIgG-X2m4的Dok7 1124_1127dup小鼠存活，成为成体(n＝3)(图41A)。此外，与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，在P4注射20mg/kg hIgG-X2m4和在P18注射10mg/kg hIgG-X2m4的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加(图41B)。此外，在P4注射20mg/kg hIgG-X2m4和在P18注射10mg/kg hIgG-X2m4维持Dok7 1124_1127dup小鼠健康至少两个月(图42)。
实施例10–MuSK激动剂抗体mIgG2a-X3
为了确定在野生型小鼠中注射MuSK激动剂抗体mIgG2a-X3对存活或体重增加是否具有影响，在P4、P24和P44对C57BL/6-CBA混合背景小鼠注射10mg/kg mIgG2a-X3(n＝2)，并将其与未经注射的C57BL/6-CBA混合背景小鼠(n＝9)进行比较。与未经注射的野生型小鼠一样，注射mIgG2a-X3的野生型小鼠存活直至在P60被处死(图43A)并且体重增加与未经注射的野生型小鼠相似(图43B)。
为了评价注射mIgG2a-X3对神经肌肉突触的组织是否具有影响，将来自P60野生型和注射了mIgG2a-X3的野生型小鼠的膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记AchR，以及用针对βIII微管蛋白/突触蛋白的抗体染色以标记运动轴突/神经末梢(图44)。在用mIgG2a-X3处理的野生型小鼠中，突触从简单的斑块样形状成熟为复杂的椒盐卷饼样形状，这是成熟鼠神经肌肉突触的特征(参见图44的免疫组织化学图像)。在野生型小鼠中注射mIgG2a-X3对突触的数量、突触尺寸和突触AChR的密度没有影响(参见图44的图)。此外，在野生型小鼠中长期注射mIgG2a-X3对运动行为没有影响，如通过握力和从旋转的转棒仪掉落的等待时间所评估的(图45)。
为了研究在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中mIgG2a-X3是否挽救致死，在P4用10mg/kg mIgG2a-X3或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。注射同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)和注射mIgG2a-X3的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝4)与未经处理的小鼠一样，在出生之后一至两周死亡(图46A至46B)。图46A至46B中的结果表明与莫维珠单抗相比，在P4以10mg/kg施用的MuSK激动剂抗体mIgG2a-X3在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中挽救致死数天。
接下来，在P4用20mg/kg mIgG2a-X3或同种型阴性对照处理C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠，在P18用10mg/kg mIgG2a-X3或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。与未经处理的小鼠一样，注射同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)在出生之后一至两周死亡，而注射mIgG2a-X3的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝2)存活直至被处死(图47A)。与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，注射了mIgG2a-X3的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加(图47B)。此外，在P4注射20mg/kg mIgG2a-X3和在P18注射10mg/kg mIgG2a-X3维持Dok7 1124_1127dup小鼠健康至少两个月(图47B；图48)。
实施例11–MuSK激动剂抗体mIgG2a-X9
为了在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中研究mIgG2a-X9是否挽救致死，在P4、P24和P44用10mg/kg MuSK激动剂抗体mIgG2a-X9或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。注射同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)和注射mIgG2a-X9的大多数Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝5)与未经处理的小鼠一样，在出生之后一至两周死亡(图49A)。一只注射了mIgG2a-X9的Dok7 1124_1127dup小鼠存活直至P60(图49A)。同样，注射mIgG2a-X9的大多数Dok7 1124_1127dup小鼠没有体重增加，与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠一样(图49B)。然而，图49B表明注射了mIgG2a-X9的单只Dok7 1124_1127dup小鼠体重随时间增加。
实施例12–MuSK激动剂抗体3B2g2m1
为了确定MuSK激动剂抗体3B2g2m1是否在突触处接合MuSK，将P30野生型小鼠腹膜内注射MuSK激动剂3B2g2m1(0mg/kg、2mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)。在两天之后，将小鼠处死，并将膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记AchR，以及用Alexa 647山羊抗-人IgG，F(ab')2片段特异性进行染色以标记3B2g2m1。通过3B2g2m1与AChR信号强度的比率来测量突触处3B2g2m1的饱和水平。图50的图表明MuSK激动剂抗体3B2g2m1在突触处接合MuSK并以20mg/kg使MuSK饱和。
为了确定在野生型小鼠中长期注射MuSK激动剂抗体3B2g2m1对存活或体重增加是否具有影响，在P4、P24和P44对C57BL/6-CBA混合背景小鼠注射10mg/kg 3B2g2m1(n＝6)，并将其与在P4、P24和P44注射10mg/kg同种型等效阴性对照莫维珠单抗的C57BL/6-CBA混合背景小鼠(n＝6)进行比较。注射了3B2g2m1的小鼠像野生型小鼠一样存活并且体重增加(图51A)。图51B表明从P4开始每周两次注射20mg/kg 3B2g2m1的C57BL/6-CBA混合背景中的野生型小鼠(n＝6)，像从P4开始每周两次注射20mg/kg同种型等效阴性对照莫维珠单抗的野生型小鼠(n＝6)一样存活并且体重增加。这些结果表明，在野生型小鼠中长期注射3B2g2m1对存活或体重增加没有影响。
为了研究在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中3B2g2m1是否挽救致死，在P4用MuSK激动剂抗体3B2g2m1或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理C57BL/6-CBA混合背景中的Dok71124_1127dup小鼠。与未经处理的小鼠一样，注射同种型对照的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝11)在出生之后一至两周死亡，而在P4、P18和P38注射3B2g2m1的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝10)存活，成为成体(图52A)。此外，与用同种型对照抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠不同，在P4注射20mg/kg 3B2g2m1和在P18和P38注射10mg/kg 3B2g2m1的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加(图52B)。
为了评价在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中，3B2g2m1是否恢复突触发育，将来自P60野生型和Dok7 1124_1127dup小鼠的膈肌用Alexa 488-α-BGT染色以标记AchR，以及用针对βIII微管蛋白/突触蛋白的抗体染色以标记运动轴突/神经末梢(图53)。在用3B2g2m1处理的Dok7 1124_1127dup小鼠中，突触从简单的斑块样形状成熟为复杂的椒盐卷饼样形状，这是成熟鼠神经肌肉突触的特征(参见图53的免疫组织化学图像)并且突触的数量、突触尺寸和突触AChR的密度分别恢复至正常水平的80％、50％和60％(参见图53的图)。
3B2g2m1挽救Dok7 1124_27dup小鼠的运动表现，如通过握力和从旋转的转棒仪上掉落的等待时间所评估的(图54)。此外，在P4、P18和P38注射3B2g2m1维持Dok7 1124_1127dup小鼠健康至少两个月，但小鼠最终开始体重减轻(图55)。然而，在初始体重减轻之后施用5mg/kg或10mg/kg的3B2g2m1使经处理的Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加(图55)。
接下来，评价在成年Dok7 1124_1127dup小鼠中3B2g2m1是否可以逆转疾病复发。简言之，在P4、P18和P38对Dok7 1124_1127dup小鼠注射3B2g2m1。Dok7 1124_1127dup小鼠体重增加并维持其运动性数月，但最终开始体重减轻(图56A)并显示出运动缺陷，如通过握力和从旋转的转棒仪掉落的等待时间所评估的(图56B)。此时，对小鼠再注射3B2g2m1(图56B)。在重新开始3B2g2m1处理之后，Dok7 1124_1127dup小鼠开始体重增加(图56A)，并且在重新开始处理一周之后，其运动缺陷被逆转(图56B)。Dok7 1124_1127dup小鼠在转棒仪上的表现为5.5倍高，并且其握力为1.1倍高(图56C)。这些结果表明，在成年Dok7 1124_1127dup小鼠中3B2g2m1逆转疾病复发。
为了研究在年轻Dok7 1124_1127dup小鼠中长期3B2g2m1是否能挽救致死，从P4开始每周两次用20mg/kg MuSK激动剂抗体3B2g2m1或同种型等效阴性对照莫维珠单抗处理C57BL/6-CBA混合背景中的Dok7 1124_1127dup小鼠。注射了3B2g2m1的Dok7 1124_1127dup小鼠(n＝4)存活，成为成体并且体重增加(图57)。
图58A至58C表明注射所示MuSK激动剂抗体延长了Dok7 1124_1127dup小鼠的存活。图58A是在P4(20mg/kg)、P18(10mg/kg)、P38(10mg/kg)注射如所示的MuSK激动剂抗体或同种型对照(莫维珠单抗)并随后中断抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠的存活图。图58B是在P4(20mg/kg)、P18(10mg/kg)注射MuSK激动剂抗体或同种型对照(莫维珠单抗)并随后中断抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠的存活图。图58C是在体重减轻数天之后再注射(重新开始处理)MuSK激动剂抗体(10mg/kg)并随后中断抗体处理的Dok7 1124_1127dup小鼠的存活图。
尽管在本文中已经详细描绘和描述了一些优选实施方案，但是对于相关领域的技术人员将明显的是，在不脱离本发明的精神下可以进行多种修改、添加、替换等，并因此这些被认为是在随附权利要求书中限定的本发明的范围内。
Claims (41)
1.基于抗体的分子，其与人肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)的表位结合，所述表位存在于SEQ ID NO:130的MuSK卷曲(Fz)样结构域序列中，其中所述基于抗体的分子在与MuSK的表位结合之后诱导MuSK磷酸化。
2.权利要求1所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子在中性pH条件下以比在酸性pH条件下更高的亲和力结合MuSK Fz样结构域。
3.权利要求1或权利要求2所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子在与MuSK Fz样结构域结合之后不抑制突触蛋白聚糖诱导的MuSK磷酸化。
4.权利要求1或权利要求2所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子在与MuSK Fz样结构域结合之后增强突触蛋白聚糖诱导的MuSK磷酸化。
5.权利要求1至4中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子包含含有以下的重链可变区：
互补决定区1(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:147、1至16、135、136、148、149中任一个的氨基酸序列，或者经修饰的SEQ ID NO:147、1至16、135、136、148或149中任一个的氨基酸序列，所述经修饰序列与SEQ ID NO:147、1至16、135、136、148或149中任一个具有至少80％序列同一性；
互补决定区2(CDR-H2)，其包含SEQ ID NO:153、17至32、137、138、150、151、154、155中任一个的氨基酸序列，或者经修饰的SEQ ID NO:153、17至32、137、138、150、151、154或155中任一个的氨基酸序列，所述经修饰序列与SEQ ID NO:153、17至32、137、138、150、151、154或155中任一个具有至少80％序列同一性；和
互补决定区3(CDR-H3)，其包含SEQ ID NO:156、33至48、139、140、157至158、240至251中任一个的氨基酸序列，或者经修饰的SEQ ID NO:156、33至48、139、140、157至158、240至251中任一个的氨基酸序列，所述经修饰序列与SEQ ID NO:156、33至48、139、140、157至158或240至251中任一个具有至少80％序列同一性。
6.权利要求5所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述重链可变区选自：
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:153的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:1的CDR-H1、SEQ ID NO:17的CDR-H2和SEQ ID NO:33的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:34的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的CDR-H1、SEQ ID NO:19的CDR-H2和SEQ ID NO:35的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:4的CDR-H1、SEQ ID NO:20的CDR-H2和SEQ ID NO:36的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:5的CDR-H1、SEQ ID NO:21的CDR-H2和SEQ ID NO:37的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:6的CDR-H1、SEQ ID NO:22的CDR-H2和SEQ ID NO:38的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:7的CDR-H1、SEQ ID NO:23的CDR-H2和SEQ ID NO:39的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:8的CDR-H1、SEQ ID NO:24的CDR-H2和SEQ ID NO:40的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:9的CDR-H1、SEQ ID NO:25的CDR-H2和SEQ ID NO:41的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:10的CDR-H1、SEQ ID NO:26的CDR-H2和SEQ ID NO:42的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:11的CDR-H1、SEQ ID NO:27的CDR-H2和SEQ ID NO:43的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:12的CDR-H1、SEQ ID NO:28的CDR-H2和SEQ ID NO:44的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:13的CDR-H1、SEQ ID NO:29的CDR-H2和SEQ ID NO:45的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:14的CDR-H1、SEQ ID NO:30的CDR-H2和SEQ ID NO:46的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:15的CDR-H1、SEQ ID NO:31的CDR-H2和SEQ ID NO:47的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:16的CDR-H1、SEQ ID NO:32的CDR-H2和SEQ ID NO:48的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:139的CDR-H3的重链可变区；和
包含SEQ ID NO:136的CDR-H1、SEQ ID NO:138的CDR-H2和SEQ ID NO:140的CDR-H3的重链可变区。
7.权利要求5所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述重链可变区选自：
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:148的CDR-H1、SEQ ID NO:151的CDR-H2和SEQ ID NO:157的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:149的CDR-H1、SEQ ID NO:152的CDR-H2和SEQ ID NO:158的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:154的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:155的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区；和
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区。
8.权利要求5至7中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子的所述重链可变区还包含人或人源化免疫球蛋白重链框架区。
9.权利要求1至8中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述分子含有：
包含与SEQ ID NO:97具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:99具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:101具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:103具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:105具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:107具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:109具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:111具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:113具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:115具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:117具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:119具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:121具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:123具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:125具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:127具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:131具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:133具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:252具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:253具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:254具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:255具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:256具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:257具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:258具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:259具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:260具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:261具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:262具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含与SEQ ID NO:263具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
10.权利要求1至8中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述分子含有：
包含与SEQ ID NO:196具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:198具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:200具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:202具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:204具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:206具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:208具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:210具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:212具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:214具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:216具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:218具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:220具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:222具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:224具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:226具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:228具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:230具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:232具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:234具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；
包含与SEQ ID NO:236具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含与SEQ ID NO:238具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
11.权利要求1至10中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述抗体是二价或多价单结构域抗体。
12.权利要求1至10中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：
互补决定区1(CDR-L1)，其具有SEQ ID NO:159、49至64、141、142、160至169中任一个的氨基酸序列，或者经修饰的SEQ ID NO:159、49至64、141、142或160至169中任一个的氨基酸序列，所述经修饰序列与SEQ ID NO:159、49至64、141、142或160至169中任一个具有至少80％序列同一性；
互补决定区2(CDR-L2)，其具有SEQ ID NO:172、65至80、143、144、170、171、173至179中任一个的氨基酸序列，或者经修饰的SEQ ID NO:172、65至80、143、144、170、171或173至179中任一个的氨基酸序列，所述经修饰序列与SEQ ID NO:172、65至80、143、144、170、171或173至179中任一个具有至少80％序列同一性；和
互补决定区3(CDR-L3)，其具有SEQ ID NO:195、81至96、145、146、180至194中任一个的氨基酸序列，或者经修饰的SEQ ID NO:195、81至96、145、146或180至194中任一个的氨基酸序列，所述经修饰序列与SEQ ID NO:195、81至96、145、146或180至194中任一个具有至少80％序列同一性。
13.权利要求12所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述轻链可变区选自：
包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:195的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:49的CDR-L1、SEQ ID NO:65的CDR-L2和SEQ ID NO:81的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:50的CDR-L1、SEQ ID NO:66的CDR-L2和SEQ ID NO:82的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:51的CDR-L1、SEQ ID NO:67的CDR-L2和SEQ ID NO:83的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:52的CDR-L1、SEQ ID NO:68的CDR-L2和SEQ ID NO:84的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:53的CDR-L1、SEQ ID NO:69的CDR-L2和SEQ ID NO:85的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:54的CDR-L1、SEQ ID NO:70的CDR-L2和SEQ ID NO:86的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:55的CDR-L1、SEQ ID NO:71的CDR-L2和SEQ ID NO:87的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:56的CDR-L1、SEQ ID NO:72的CDR-L2和SEQ ID NO:88的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:57的CDR-L1、SEQ ID NO:73的CDR-L2和SEQ ID NO:89的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:58的CDR-L1、SEQ ID NO:74的CDR-L2和SEQ ID NO:90的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:59的CDR-L1、SEQ ID NO:75的CDR-L2和SEQ ID NO:91的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:60的CDR-L1、SEQ ID NO:76的CDR-L2和SEQ ID NO:92的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:61的CDR-L1、SEQ ID NO:77的CDR-L2和SEQ ID NO:93的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:62的CDR-L1、SEQ ID NO:78的CDR-L2和SEQ ID NO:94的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:63的CDR-L1、SEQ ID NO:79的CDR-L2和SEQ ID NO:95的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:64的CDR-L1、SEQ ID NO:80的CDR-L2和SEQ ID NO:96的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:141的CDR-L1、SEQ ID NO:143的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:142的CDR-L1、SEQ ID NO:144的CDR-L2和SEQ ID NO:146的CDR-L3的轻链可变区。
14.权利要求12所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述轻链可变区选自：
包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:170的CDR-L2和SEQ ID NO:180的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:171的CDR-L2和SEQ ID NO:181的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:160的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:182的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:171的CDR-L2和SEQ ID NO:184的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:173的CDR-L2和SEQ ID NO:185的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:173的CDR-L2和SEQ ID NO:186的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:161的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:187的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:162的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:188的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:163的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:188的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:164的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:189的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:165的CDR-L1、SEQ ID NO:175的CDR-L2和SEQ ID NO:190的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:166的CDR-L1、SEQ ID NO:176的CDR-L2和SEQ ID NO:191的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:167的CDR-L1、SEQ ID NO:177的CDR-L2和SEQ ID NO:192的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:168的CDR-L1、SEQ ID NO:178的CDR-L2和SEQ ID NO:193的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:169的CDR-L1、SEQ ID NO:179的CDR-L2和SEQ ID NO:194的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区；和
包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区。
15.权利要求13或权利要求14所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子的所述轻链可变区还包含人或人源化免疫球蛋白重链框架区。
16.权利要求1至4中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述抗体或其结合片段含有：
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:153的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:195的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:1的CDR-H1、SEQ ID NO:17的CDR-H2和SEQ ID NO:33的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:49的CDR-L1、SEQ ID NO:65的CDR-L2和SEQ ID NO:81的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:18的CDR-H2和SEQ ID NO:34和240至247中任一个的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:50的CDR-L1、SEQ ID NO:66的CDR-L2和SEQID NO:82的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:3的CDR-H1、SEQ ID NO:19的CDR-H2和SEQ ID NO:35的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:51的CDR-L1、SEQ ID NO:67的CDR-L2和SEQ ID NO:83的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:4的CDR-H1、SEQ ID NO:20的CDR-H2和SEQ ID NO:36的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:52的CDR-L1、SEQ ID NO:68的CDR-L2和SEQ ID NO:84的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:5的CDR-H1、SEQ ID NO:21的CDR-H2和SEQ ID NO:37的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:53的CDR-L1、SEQ ID NO:69的CDR-L2和SEQ ID NO:85的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:6的CDR-H1、SEQ ID NO:22的CDR-H2和SEQ ID NO:38的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:54的CDR-L1、SEQ ID NO:70的CDR-L2和SEQ ID NO:86的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:7的CDR-H1、SEQ ID NO:23的CDR-H2和SEQ ID NO:39的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:55的CDR-L1、SEQ ID NO:71的CDR-L2和SEQ ID NO:87的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:8的CDR-H1、SEQ ID NO:24的CDR-H2和SEQ ID NO:40的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:56的CDR-L1、SEQ ID NO:72的CDR-L2和SEQ ID NO:88的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:9的CDR-H1、SEQ ID NO:25的CDR-H2和SEQ ID NO:41的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:57的CDR-L1、SEQ ID NO:73的CDR-L2和SEQ ID NO:89的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:10的CDR-H1、SEQ ID NO:26的CDR-H2和SEQ ID NO:42的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:58的CDR-L1、SEQ ID NO:74的CDR-L2和SEQ ID NO:90的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:11的CDR-H1、SEQ ID NO:27的CDR-H2和SEQ ID NO:43的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:59的CDR-L1、SEQ ID NO:75的CDR-L2和SEQ ID NO:91的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:12的CDR-H1、SEQ ID NO:28的CDR-H2和SEQ ID NO:44的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:60的CDR-L1、SEQ ID NO:76的CDR-L2和SEQ ID NO:92的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:13的CDR-H1、SEQ ID NO:29的CDR-H2和SEQ ID NO:45的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:61的CDR-L1、SEQ ID NO:77的CDR-L2和SEQ ID NO:93的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:14的CDR-H1、SEQ ID NO:30的CDR-H2和SEQ ID NO:46的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:62的CDR-L1、SEQ ID NO:78的CDR-L2和SEQ ID NO:94的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:15的CDR-H1、SEQ ID NO:31的CDR-H2和SEQ ID NO:47的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:63的CDR-L1、SEQ ID NO:79的CDR-L2和SEQ ID NO:95的CDR-L3的轻链可变区；和
包含SEQ ID NO:16的CDR-H1、SEQ ID NO:32的CDR-H2和SEQ ID NO:48的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:64的CDR-L1、SEQ ID NO:80的CDR-L2和SEQ ID NO:96的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:135的CDR-H1、SEQ ID NO:137的CDR-H2和SEQ ID NO:139和248至251中任一个的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:141的CDR-L1、SEQ ID NO:143的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3的轻链可变区；以及
包含SEQ ID NO:136的CDR-H1、SEQ ID NO:138的CDR-H2和SEQ ID NO:140的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:142的CDR-L1、SEQ ID NO:144的CDR-L2和SEQ ID NO:146的CDR-L3的轻链可变区。
17.权利要求1至4中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述抗体或其结合片段含有：
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:170的CDR-L2和SEQ ID NO:180的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:171的CDR-L2和SEQ ID NO:181的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:160的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:182的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:171的CDR-L2和SEQ ID NO:184的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:173的CDR-L2和SEQ ID NO:185的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:173的CDR-L2和SEQ ID NO:186的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:148的CDR-H1、SEQ ID NO:151的CDR-H2和SEQ ID NO:157的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:161的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:187的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:148的CDR-H1、SEQ ID NO:151的CDR-H2和SEQ ID NO:157的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:162的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:188的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:148的CDR-H1、SEQ ID NO:151的CDR-H2和SEQ ID NO:157的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:163的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:188的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:148的CDR-H1、SEQ ID NO:151的CDR-H2和SEQ ID NO:157的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:164的CDR-L1、SEQ ID NO:174的CDR-L2和SEQ ID NO:189的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:149的CDR-H1、SEQ ID NO:152的CDR-H2和SEQ ID NO:158的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:165的CDR-L1、SEQ ID NO:175的CDR-L2和SEQ ID NO:190的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:149的CDR-H1、SEQ ID NO:152的CDR-H2和SEQ ID NO:158的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:166的CDR-L1、SEQ ID NO:176的CDR-L2和SEQ ID NO:191的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:149的CDR-H1、SEQ ID NO:152的CDR-H2和SEQ ID NO:158的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:167的CDR-L1、SEQ ID NO:177的CDR-L2和SEQ ID NO:192的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:149的CDR-H1、SEQ ID NO:152的CDR-H2和SEQ ID NO:158的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:168的CDR-L1、SEQ ID NO:178的CDR-L2和SEQ ID NO:193的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:149的CDR-H1、SEQ ID NO:152的CDR-H2和SEQ ID NO:158的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:169的CDR-L1、SEQ ID NO:179的CDR-L2和SEQ ID NO:194的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:153的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:154的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:155的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:154的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:195的CDR-L3的轻链可变区；以及
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:155的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:195的CDR-L3的轻链可变区。
18.权利要求1至4中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子含有：
包含与SEQ ID NO:234具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:235具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:228具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:229具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:230具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:231具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:232具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:233具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:236具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:237具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；以及
包含与SEQ ID NO:238具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:239具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
19.权利要求1至4中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子含有：
包含与SEQ ID NO:97具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:98具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:99和252至259中任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:100具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:101具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:102具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:103具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:104具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:105具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:106具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:107具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:108具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:109具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:110具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:111具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:112具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:113具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:114具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:115具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:116具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:117具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:118具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:119具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:120具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:121具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:122具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:123具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:124具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:125具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:126具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:127具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:128具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:131和260至263中任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:132具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；以及
包含与SEQ ID NO:133具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:134具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
20.权利要求1至4中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子含有：
包含与SEQ ID NO:196具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:197具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:198具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:199具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:200具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:201具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:202具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:203具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:204具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:205具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:206具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:207具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:208具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:209具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:210具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:211具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:212具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:213具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:214具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:215具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:216具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:217具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:218具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:219具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:220具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:221具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:222具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:223具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
包含与SEQ ID NO:224具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:225具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；以及
包含与SEQ ID NO:226具有至少80％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQID NO:227具有至少80％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
21.权利要求1至20中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子是嵌合抗体或其表位结合片段。
22.权利要求1至21中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子是人源化抗体或其表位结合片段。
23.权利要求1至22中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子是单克隆抗体或其表位结合片段。
24.权利要求1至23中任一项所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子是全长抗体、抗体的表位结合片段或抗体衍生物。
25.权利要求24所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子是选自F(ab)片段、F(ab')片段和F(ab')2片段的表位结合片段。
26.权利要求24所述的基于MuSK抗体的分子，其中所述基于抗体的分子是选自scFv、微抗体、双抗体、三抗体和四抗体的抗体衍生物。
27.分离的多核苷酸，其编码权利要求1至26中任一项所述的基于MuSK抗体的分子。
28.载体，其包含权利要求27所述的分离的多核苷酸。
29.宿主细胞，其包含权利要求28所述的载体。
30.药物组合物，其包含：
权利要求1至26中任一项所述的基于MuSK抗体的分子、权利要求27所述的多核苷酸、或权利要求28所述的载体，以及
可药用载体。
31.在有此需要的对象中提高肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)信号传导的方法，所述方法包括：
向所述对象施用权利要求30所述的药物组合物，其中所述组合物以相对于在所述施用之前所述对象中的MuSK信号传导有效提高所述对象中的MuSK信号传导的量施用。
32.权利要求31所述的方法，其中所述对象患有神经肌肉病症。
33.权利要求32所述的方法，其中所述神经肌肉病症选自肌萎缩侧索硬化(ALS)、重症肌无力(MG)和先天性肌无力、MuSK-MG、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓延髓性肌萎缩(SBMA)、夏科马里图思病(CMT)、远端遗传性运动神经元神经病(dHMN)、迪谢内肌营养不良(DMD)、肢带型肌营养不良(LGMD)、先天性肌营养不良(CMD)、肌肉减少症(SP)、埃默里-德赖弗斯肌营养不良。
34.权利要求33所述的方法，其中所述神经肌肉病症是先天性肌无力。
35.权利要求34所述的方法，其中所述先天性肌无力是DOK7介导的先天性肌无力。
36.权利要求31至35中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含基于MuSK抗体的分子，所述基于抗体的分子含有：
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:153的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:195的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:153的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:154的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:154的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:195的CDR-L3的轻链可变区；或者
包含SEQ ID NO:147的CDR-H1、SEQ ID NO:150的CDR-H2和SEQ ID NO:156的CDR-H3的重链可变区，和包含SEQ ID NO:159的CDR-L1、SEQ ID NO:172的CDR-L2和SEQ ID NO:183的CDR-L3的轻链可变区。
37.在对象中治疗先天性肌无力的方法，所述方法包括：
以有效提高MuSK磷酸化的量向患有先天性肌无力的对象施用肌肉特异性酪氨酸蛋白激酶(MuSK)激动剂，从而在所述对象中治疗先天性肌无力。
38.权利要求37所述的方法，其中所述MuSK激动剂是MuSK激动剂抗体。
39.权利要求38所述的方法，其中所述MuSK激动剂抗体结合SEQ ID NO:130的MuSK卷曲样结构域序列。
40.权利要求37所述的方法，其中所述先天性肌无力是DOK7介导的先天性肌无力。
41.在对象中治疗先天性肌无力的方法，所述方法包括：
向患有先天性肌无力的对象施用权利要求30所述的药物组合物，从而在所述对象中治疗先天性肌无力。
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