JP2023520533A - 体液を保存するための安定化組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
周囲温度で体液を保存するための水性安定化組成物が提供される。水性安定化組成物は、単糖、二糖、又はこれらの組み合わせから選択される糖と、緩衝剤と、Ｃ１－Ｃ６アルカノールと、ホウ酸、ホウ酸の塩、又はこれらの組み合わせと、キレート剤とを含み、組成物は、４．５～５．２のＰＨを有する。水性安定化組成物を使用して体液を保存する方法もまた提供され、方法は、Ａ）体液の試料を得ることと、Ｂ）体液を水性安定化組成物と接触させて混合物を形成することと、Ｃ）（Ｂ）の混合物を混合して均一な混合物を形成することと、Ｄ）均一な混合物を周囲温度で保存することとを含む。【選択図】図１
Description
本発明は、周囲温度で体液を保存するための安定化組成物及び方法に関する。
尿は、ほとんどの動物において代謝の複雑な液体副産物であり、様々な分析試験に使用される。ヒトでは、尿は、主に水と、尿素、クレアチニン、尿酸、並びに微量の酵素、炭水化物、ホルモン、脂肪酸、色素、ムチン、及び無機イオンを含む有機溶質からなる。健常な個体からであっても、尿はまた、赤血球、白血球、尿路上皮細胞、腎細胞、前立腺細胞、及び細菌を含有する。尿は、泌尿生殖器から直接この試料型に細胞及び無細胞物質を脱落させることに起因して、泌尿器病理の研究のためのバイオマーカーの貴重な供給源である。妊婦からの尿もまた、非侵襲性の出生前診断及び予後試験のための、胎児ＤＮＡの有用な供給源である（ＮＢＹ Ｔｓｕｉ，Ｐ Ｊｉａｎｇ，ＫＣＫ Ｃｈｏｗ，Ｘ Ｓｕ，ＴＹ Ｌｅｕｎｇ，Ｈ Ｓｕｎ，ＫＣＡ Ｃｈａｎ，ＲＷＫ Ｃｈｉｕ ａｎｄ ＹＭＤ Ｌｏ（２０１２）．Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｚｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｅｔａｌ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｕｒｉｎｅ ｏｆ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｗｏｍｅｎ ｂｙ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（１０）：ｅ４８３１９）。
尿中無細胞ＤＮＡ（ＵｃｆＤＮＡ）は、泌尿生殖器路から尿中に脱落する細胞、又は糸球体濾過を通過する循環中の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のいずれかに由来する。ｃｆＤＮＡは、健常な個体及び疾患（例えば、糖尿病、心血管疾患、臓器移植、脳卒中、てんかん、自己免疫疾患、敗血症、及び外傷）を有する個人の両方において、尿を含む様々な細胞外体液中に断片化核酸として存在し、液体生検の重要なツールとして機能する（Ｒ Ｍｅｄｄｅｂ，Ｅ Ｐｉｓａｒｅｖａ，ＡＲ Ｔｈｉｅｒｒｙ（２０１９）Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ６５（５）：６２３－６３３．Ｄｏｉ：１０．１３７３／ｃｌｉｎｃｈｅｍ．２０１８．２９８３２３；ＣＭ Ｓｔｅｗａｒｔ，ＰＤ Ｋｏｔｈａｒｉ，Ｆ Ｍｏｕｌｉｅｒｅ，Ｒ Ｍａｉｒ，Ｓ Ｓｏｍｎａｙ，Ｒ Ｂｅｎａｙｅｄ，Ａ Ｚｅｈｉｒ，Ｂ Ｗｅｉｇｅｌｔ，Ｓ－Ｊ Ｄａｗｓｏｎ，ＭＥ Ａｒｃｉｌａ，ＭＦ Ｂｅｒｇｅｒ，ＤＷＹ Ｔｓｕｉ（２０１８）Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２４４（５）：６１６－６２７．Ｄｏｉ：１０．１００２／ｐａｔｈ．５０４８）。ＵｃｆＤＮＡは、がんのスクリーニング、診断、予後、並びにがんの進行及び治療有効性の監視のための有用かつ超非侵襲的なツールである可能性を有すると考えられている（Ｔ Ｌｕ ａｎｄ Ｊ Ｌｉ（２０１７）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｆｕｔｕｒｅ．Ａｍ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７（１１）：２３１８－２３３２；Ｓ Ｖａｎ Ｋｅｅｒ，Ｊ Ｐａｔｔｙｎ，ＷＡＡ Ｔｊａｌｍａ，Ｘ Ｖａｎ Ｏｓｔａｄｅ，Ｍ Ｉｅｖｅｎ，Ｐ Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ，Ａ Ｖｏｒｓｔｅｒｓ（２０１７）Ｆｉｒｓｔ－ｖｏｉｄ ｕｒｉｎｅ：Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｔｒｉａｇｅ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｏｍｅｎ．Ｅｕｒ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ＆Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１６：１－１１）。例えば、最初の排泄（ｆｉｒｓｔ－ｖｏｉｄ）尿は、後の分画よりも高リスクヒトパピローマウイルス（４．８～１６０倍）及びヒトＤＮＡを含有することが最近報告された（Ａ Ｖｏｒｓｔｅｒｓ，Ｐ Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ，Ｇ Ｃｌｉｆｆｏｒｄ（２０１４）Ｕｒｉｎｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ＨＰＶ：ｒａｔｉｏｎａｌｅ ｆｏｒ ｕｓｉｎｇ ｆｉｒｓｔ ｖｏｉｄ．ＢＭＪ ３４９：ｇ６２５２）。
様々な臨床分野、特に腫瘍学及び出生前診断における無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分析の関心が高まっているにもかかわらず、試料の取り扱いに関する研究はほとんど報告されておらず、分析的コンセンサスは利用可能ではない。尿中に必然的に見出される有核細胞は、ゲノムＤＮＡを尿中に放出して、試料処理及び保存中にＤＮＡ背景の増加をもたらし得る。加えて、酵素分解は、比較的小さい分子量を考えると、真のｃｆＤＮＡレベルを不明瞭にする可能性がある。したがって、尿検体は、収集から短時間（２～４時間）の内に処理する、収集後に冷蔵する、又は安定化化合物を使用して保存する、のいずれかの特別な処理を必要とする。試料の収集性を考えると、試料収集後の尿中のｃｆＤＮＡの元の割合及び完全性を維持するために、保存剤が好ましくは使用される。
ＵｃｆＤＮＡは、液体生検の非侵襲的な形態として大きな可能性を有する。ＤＮＡは、尿の細胞画分及び無細胞画分の両方に存在し得、ＤＮＡの収集及び処理のために使用される手順は、バイオマーカー分析の結果に大きく影響する（ＬＫ Ｌａｒｓｅｎ，ＧＥ Ｌｉｎｄ，Ｐ Ｇｕｌｄｂｅｒｇ，Ｃ Ｄａｈｌ（２０１９）ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｕｒｉｎｅ：Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｅｓｉｇｎ，ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ，ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２０，２６５７）。尿中の細胞及びＤＮＡは、保存時に分解されやすいため（ＴＨＴ Ｃｈｅｎｇ，Ｐ Ｊｉａｎｇ，ＪＣＷ Ｔａｍ，Ｘ Ｓｕｎ，Ｗ－Ｓ Ｌｅｅ，ＳＣＹ Ｙｕ，ＪＴＣ Ｔｅｏｈ，ＰＫＦ Ｃｈｉｕ，Ｃ－Ｆ Ｎｇ，Ｋ－Ｍ Ｃｈｏｗ，Ｃ－Ｃ Ｓｚｅｔｏ，ＫＣＡ Ｃｈａｎ，ＲＷＫ Ｃｈｉｕ，ＹＭＤ Ｌｏ（２０１７）Ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ ｃｆＤＮＡ．Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５０（９）：４９６－５０１．Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｌｉｎｂｉｏｃｈｅｍ．２０１７．０２．０１７）、尿試料が直ちに処理されない場合、適切な保存が重要である。ヒトの尿は、核酸－加水分解酵素（ヌクレアーゼ）の機能に好適な環境である。具体的には、ＤＮａｓｅ Ｉは、尿における主要なＤＮＡ加水分解酵素であり、尿におけるその活性は、血清におけるその活性よりも１００倍超高い（ＯＥ Ｂｒｙｚｇｕｎｏｖａ，ＰＰ Ｌａｋｔｉｏｎｏｖ（２０１５）Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｕｒｉｎｅ：ｓｏｕｒｃｅｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ａｃｔａ Ｎａｔｕｒａｅ Ｖｏｌ ７（３）：４８－５４．Ｄｏｉ：１０．３２６０７／２０７５８２５１－２０１５－７－３－４８－５４）。体温でのｕｃｆＤＮＡの半減期は、約２．６～５．１時間である（ＴＨＴ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）、上記）。現在、登録されているがんインビトロ診断（ＩＶＤ）のいずれも、ｕｃｆＤＮＡに純粋に基づいていない（ＷＪ Ｌｏｃｋｅ，Ｄ Ｇｕａｎｚｏｎ，Ｃ Ｍａ，ＹＪ Ｌｉｅｗ，ＫＲ Ｄｕｅｓｉｎｇ，ＫＹＣ Ｆｕｎｇ，ＪＰ Ｒｏｓｓ（２０１９）ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ：ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ．Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ １０：１１５０．Ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｇｅｎｅ．２０１９．０１１５０）。主な理由の１つは、ｕｃｆＤＮＡを保存する際のワークフローがまだ標準化されていないためである。したがって、任意の生化学的及び分子遺伝学的試験の効果的かつ効率的な使用のために、試料収集プロセス、試料輸送、試料処理、及び試料保存／安定性は、最適化され、標準化されるべきである。
健常な個体において、ｃｆＤＮＡは、有核細胞のアポトーシスに由来する（Ｍ Ｓｔｒｏｕｎ，Ｊ Ｌｙａｕｔｅｙ，Ｃ Ｌｅｄｅｒｒｅｙ，Ａ Ｏｌｓｏｎ－Ｓａｎｄ，Ｐ Ａｎｋｅｒ（２００１）Ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＤＮＡ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖｅ ＤＮＡ ｒｅｌｅａｓｅ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ３１３（１－２）：１３９－１４２）。悪性腫瘍では、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）と称される全ｃｆＤＮＡの腫瘍由来画分は、アポトーシス、壊死、及び活性分泌の組み合わせによる、腫瘍細胞に由来し得る（Ｍ Ｓｔｒｏｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）ｓｕｐｒａ；Ｓ Ｊａｈｒ，Ｈ Ｈｅｎｔｚｅ，Ｓ Ｅｎｇｌｉｓｃｈ，Ｄ Ｈａｒｄｔ，ＦＯ Ｆａｃｋｅｌｍａｙｅｒ，ＲＤ Ｈｅｓｃｈ，Ｒ Ｋｎｉｐｐｅｒｓ（２００１）ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｏｒｉｇｉｎ ｆｒｏｍ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｎｄ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１（４）：１６５９－１６６５；ＯＥ Ｂｒｙｚｇｕｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）、上記）。ｃｔＤＮＡは、腫瘍特異的変異、コピー数の変動、及びＤＮＡメチル化状態の変化を含有する（Ｇ Ｓａｎｔｏｎｉ，ＭＢ Ｍｏｒｅｌｌｉ，Ｃ Ａｍａｎｔｉｎｉ，Ｎ Ｂａｔｔｅｌｌｉ（２０１８）Ｕｒｉｎａｒｙ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ：Ａｎ ｕｐｄａｔｅ．Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ８：３６２．Ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１８．００３６２）。ｃｔＤＮＡレベルは、腫瘍体積とともに増加することが多く、標的化された免疫療法に対する応答を予測し、腫瘍の不均一性を監視し、拡大する薬剤耐性腫瘍クローンを明らかにするために使用することができる（ＲＪ Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ，ＪＨ Ｌｅｅ，ＲＦ Ｋｅｆｆｏｒｄ，Ｈ Ｒｉｚｏｓ（２０１８）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｋｉｔｓ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｆｒｅｅ ＤＮＡ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２８－２２９：２１－２７．Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃａｎｃｅｒｇｅｎ．２０１８．０８．００５）。
がん診断は、がん検出、診断、及び治療監視のための直接腫瘍組織生検のみへの依存から離れ始めた。次世代シーケンシング及びゲノムバイオインフォマティクス分析は、顕微鏡レベルの組織診断から分子ゲノムレベルのがん診断への新たなパラダイムシフトをもたらした。体液（すなわち、血液、血漿、尿など）からの液体生検などの新規の非侵襲的がん診断プラットフォームは、ｃｔＤＮＡ又は循環腫瘍細胞、プロテオミクス、メタボロミクス、及びエクソソームを調査するために使用され、これは、他の分析物の中でも、ｃｔＤＮＡをアッセイするために使用される（Ｘ Ｗｕ，Ｌ Ｚｈｕ ａｎｄ ＰＣ Ｍａ．Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｎｏｖｅｌ ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｂｅｙｏｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ Ｅｄｕｃ Ｂｏｏｋ．２０１８ Ｍａｙ ２３；（３８）：９６４－９７７．Ｄｏｉ：１０．１２００／ＥＤＢＫ＿１９９７６７）。
分子バイオマーカーは、広範囲にわたって調査され、がん患者における治療応答の早期検出、監視、及び予測に寄与し得る（Ｌ Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉ ａｎｄ Ａ Ｍｅｌｎｉｃｋ（２０１７）ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３５（７）：７９３－７９５）。これらのバイオマーカーは、がんの発生及び進行に関連する遺伝的及びエピジェネティックな事象を表す。ＤＮＡ過剰メチル化は、エピジェネティックなプロセスのうちの一例である。尿及び血液などの体液中の過剰メチル化ＤＮＡの検出は、腫瘍学的バイオマーカーとして興味あるものである。がん治療における重要な進展は、原発性又は転移性腫瘍から体液に脱落した腫瘍細胞の遺伝物質の分析を伴う「液体生検」である。液体生検は、典型的には、ｃｆＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド、エクソソーム、又は血液、尿、唾液、及び脳脊髄液などの生体流体に由来する細胞の抽出及び分析を伴う（ＡＤ Ｍｅｏ，Ｊ Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｙ Ｃｈｅｎｇ，ＭＤ Ｐａｓｉｃ，ＧＭ Ｙｏｕｓｅｆ（２０１７）Ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ：Ａ ｓｔｅｐ ｆｏｒｗａｒｄ ｔｏｗａｒｄｓ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ ｕｒｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ １６：８０．Ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９４３－０１７－０６４４－５）。様々な液体生検試料のうち、尿及び唾液は、試料収集の専門家を必要とせずに容易に得られ、連続的なサンプリングを通じて疾患のリアルタイムの監視を可能にする。
血漿中の無細胞循環ＤＮＡは、１９４８年にＭａｎｄｅｌ及びＭｅｔａｉｓによって初めて観察された（Ｐ Ｍａｎｄｅｌ，Ｐ Ｍｅｔａｉｓ（１９４８）Ｌｅｓ ａｃｉｄｅｓ ｎｕｃｌｅｉｑｕｅｓ ｄｕ ｐｌａｓｍａ ｓａｎｇｕｉｎｅ ｃｈｅｚ ｌ’ｈｏｍｍｅ．Ｃ Ｒ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｐａｒｉｓ：２４１－２４３）。がん患者の血清及び血漿における遊離ＤＮＡレベルの増加が示された（ＳＡ Ｌｅｏｎ，Ｂ Ｓｈａｐｉｒｏ，ＤＭ Ｓｋｌａｒｏｆｆ，ＭＪ Ｙａｒｏｓ（１９７７）Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３７：６４６－６５０；Ｓ Ｊａｈｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）、上記）。Ｊａｈｒら（２００１、上記）からのデータは、アポトーシス細胞及び壊死細胞ががん患者における血漿ＤＮＡの主要な供給源である可能性と一致する。腫瘍ＤＮＡの特徴は、がん患者の血漿から抽出された遺伝物質で見出されている。これらの特徴は、鎖の安定性の減少、並びに特異的ながん遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、及びマイクロサテライト改変の存在を含む（Ｐ Ａｎｋｅｒ，Ｈ Ｍｕｌｃａｈｙ，ＸＱ Ｃｈｅｎ，Ｍ Ｓｔｒｏｕｎ（１９９９）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ（ｐｌａｓｍａ／ｓｅｒｕｍ）ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ １８：６５－７３．Ｄｏｉ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２３／Ａ：１００６２６０３１９９１３）。多くの異なるがんで得られた結果は、血漿ＤＮＡが尿ＤＮＡと同様に、がんの診断、予後、及びフォローアップ試験の開発に好適な標的であり得ることを示す。
腎疾患の新しいバイオマーカーの調査は、現在、緊急の問題であり、腎疾患は、米国の人口の最大１０人に１人に影響を及ぼす（Ｊ Ｃｏｒｅｓｈ，Ｅ Ｓｅｌｖｉｎ，ＬＡ Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ Ｍａｎｚｉ，ＪＷ Ｋｕｓｅｋ，Ｐ Ｅｇｇｅｒｓ，Ｆ Ｖａｎ Ｌｅｎｔｅ，ＡＳ Ｌｅｖｅｙ（２００７）Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．ＪＡＭＡ ２９８（１７）：２０３８－２０４７）。細胞間伝達で使用される尿細胞外小胞（ＵＥＶ）は、バイオマーカー発見のための理想的なプラットフォームを表す（ＫＣ Ｍｉｒａｎｄａ，ＤＴ Ｂｏｎｄ，Ｍ ＭｃＫｅｅ，Ｊ Ｓｋｏｇ，ＴＧ Ｐａｕｎｅｓｃｕ，Ｎ Ｄａ Ｓｉｌｖａ，Ｄ Ｂｒｏｗｎ，ＬＭ Ｒｕｓｓｏ（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈｉｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｅｘｏｓｏｍｅｓ／ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ７８（２）：１９１－１９９．Ｄｏｉ：１０．１０３８／ｋｉ．２０１０．１０６）。ＵＥＶは、ＲＮＡ及びタンパク質を充填した小さな（２０～１，０００ｎｍ）球状構造であり、泌尿生殖器路全体に沿って健常な細胞及び異常な細胞によって常に放出される（Ａ Ｇａｍｅｚ－Ｖａｌｅｒｏ，ＳＩ Ｌｏｚａｎｏ－Ｒａｍｏｓ，Ｉ Ｂａｎｃｕ，Ｒ Ｌａｕｚｕｒｉｃａ－Ｖａｌｄｅｍｏｒｏｓ，ＦＥ Ｂｏｒｒａｓ（２０１５）Ｕｒｉｎａｒｙ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｓ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６．Ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１５．００００６）。ＵＥＶという用語は、形質膜由来（例えば、微小胞、エクソソーム様小胞、エクトソーム、及びレトロウイルス様粒子）及びエンドソーム由来両方の小胞又はエクソソームを指す。ＵＥＶは、その起源の細胞の生理学的状態を反映するように思われる（Ｇａｍｅｚ－Ｖａｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）、上記、Ｄ Ｔａｔａｒｕｃｈ－Ｗｅｉｎｅｒｔ，Ｌ Ｍｕｓａｎｔｅ，Ｏ Ｋｒｅｔｚ，Ｈ Ｈｏｌｔｈｏｆｅｒ（２０１６）Ｕｒｉｎａｒｙ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ５：３０２８１－ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３４０２／ｊｅｖ．ｖ５．３０２８１）。加えて、分泌された小胞は、「エクソソームシャトルＲＮＡ」として知られるｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｔＲＮＡによって細胞間伝達の特定の態様を媒介する（Ｈ Ｖａｌａｄｉ，Ｋ Ｅｋｓｔｒｏｍ，Ａ Ｂｏｓｓｉｏｓ，Ｍ Ｓｊｏｓｔｒａｎｄ，ＪＪ Ｌｅｅ，ＬＯ Ｌｏｔｖａｌｌ（２００７）Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９：６５４－６５９）。尿収集方法、ＵＥＶ濃縮方法、及びＲＮＡ抽出方法に応じて、顕著な変動が報告されたＲＮＡプロファイルにおいて観察されている（Ｄ Ｔａｔａｒｕｃｈ－Ｗｅｉｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１６）、上記）。
最近の研究では、ＥＶが生殖器－泌尿器系悪性腫瘍のタイムリーな診断及び監視の鍵である可能性が示唆されている。ＥＶのサブクラスである尿エクソソームは、タンパク質、ｍＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含有し、ネフロン及び泌尿生殖器路の全ての区域の細胞によって放出される小さな小胞である。前立腺細胞によって産生されたエクソソームは、前立腺射精管を介して、尿道に直接流入し、容易に検出することができる尿に移行する前立腺分泌物とともに移動する（ＯＥ Ｂｒｙｚｇｕｎｏｖａ，ＭＭ Ｚａｒｉｐｏｖ，ＴＥ Ｓｋｖｏｒｔｓｏｖａ，ＥＡ Ｌｅｋｃｈｎｏｖ，ＡＥ Ｇｒｉｇｏｒ’ｅｖａ，ＩＡ Ｚａｐｏｒｏｚｈｃｈｅｎｋｏ，ＥＳ Ｍｏｒｏｚｋｉｎ，ＥＩ Ｒｙａｂｃｈｉｋｏｖａ，ＹＢ Ｙｕｒｃｈｅｎｋｏ，ＶＥ Ｖｏｉｔｓｉｔｓｋｉｙ，ＰＰ Ｌａｋｔｉｏｎｏｖ（２０１６）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｕｒｉｎｅ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １１（６）：ｅ０１５７５６６．Ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５７５６６）。Ｎｉｌｓｓｏｎら（Ｊ Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｊ Ｓｋｏｇ，Ａ Ｎｏｒｄｓｔｒａｎｄ，Ｖ Ｂａｒａｎｏｖ，Ｌ Ｍｉｎｃｈｅｖａ－Ｎｉｌｓｓｏｎ，ＸＯ Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ，Ａ Ｗｉｄｍａｒｋ（２００９）Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｕｒｉｎｅ ｅｘｏｓｏｍｅｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １００：１６０３－１６０７．Ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｂｊｃ．６６０５０５８）は、前立腺がん患者の尿から単離されたエクソソームにおいて、２つの既知の前立腺がんｍＲＮＡバイオマーカーであるＰＣＡ３及びＴＭＰＲＳＳ２－ＥＲＧを検出することができ、前立腺がん診断において使用するためのＥＶの可能性を示した。この研究及び他の研究は、前立腺がんの診断マーカーとして尿から単離されたエクソソーム中のＲＮＡの使用を支持し、がんバイオマーカーの代替的で感受性のある独自の新しい種類のスクリーニングを提供する。
泌尿器がんの場合、尿は、剥離した腫瘍細胞及び無細胞腫瘍ＤＮＡを含有し、容易に、非侵襲的に、かつ反復して得ることができるため、多くの状況で好ましい液体生検源である（ＬＫ Ｌａｒｓｅｎ，ＧＥ Ｌｉｎｄ，Ｐ Ｇｕｌｄｂｅｒｇ，Ｃ Ｄａｈｌ（２０１９）ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｕｒｉｎｅ：Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｅｓｉｇｎ，ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ，ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２０，２６５７）。血液と比較して、尿は、泌尿生殖器路におけるがんの早期検出又は再発を監視するためのより感受性のある代替物であると考えられる（ＳＹ Ｌｉｎ，ＪＡ Ｌｉｎｅｈａｎ，ＴＧ Ｗｉｌｓｏｎ，ＤＳＢ Ｈｏｏｎ（２０１７）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｐｒｏｓｔａｔｅ，ｂｌａｄｄｅｒ，ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ Ｆｏｃｕｓ ３（２－３）：２６５－２７２．Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｕｆ．２０１７．０３．００９）。加えて、家庭で収集することができる試料を得るために有資格者を必要としない。しかしながら、臨床実施における尿中過剰メチル化ＤＮＡの利用は、尿中核酸の保存という課題によって制限される。したがって、尿は、下流分析を可能にするために核酸保存が確保されるような方法で保存及び輸送される必要がある（Ｊ Ｂｏｓｓｃｈｉｅｔｅｒ，Ｓ Ｂａｃｈ，ＩＶ Ｂｉｊｎｓｄｏｒｐ，ＬＩ Ｓｅｇｅｒｉｎｋ，ＷＦ Ｒｕｒｕｐ，ＡＰ ｖａｎ Ｓｐｌｕｎｔｅｒ，Ｉ Ｂａｈｃｅ，ＰＷ Ｎｏｖｉａｎｔｉ，Ｇ Ｋａｚｅｍｉｅｒ，ＲＪＡ ｖａｎ Ｍｏｏｒｓｅｌａａｒ，ＲＤＭ Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎ，ＪＡ Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｊｚｅｎ（２０１８）Ａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｕｒｉｎｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １３（８）：ｅ０２００９０６）。
尿などの体液を周囲温度で保存するための安定化組成物の需要が存在する。
この背景情報は、本発明に関連する可能性があると出願人が考える情報を公表することを目的として提供される。前述の情報のいずれも、本発明に対して先行技術を構成すると認めることは、必ずしも意図されておらず、また解釈されるべきではない。
体液などの生体試料中の核酸安定化のための複数の市販品が存在するが、これらは主にＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかを安定化することを意図しているが、両方を同時に安定化することを意図していない。尿などの体液中の細胞及び無細胞核酸の両方を効率的に安定化するための組成物はまだ報告されていない。インタクトな細菌及びヒト細胞の溶解を防止し、それによって、そうでなければインビボの尿中シグナルを汚染するであろう、生体試料中への望ましくない核酸の放出を遮断する、収集デバイス及びその中に位置する組成物を提供することが有益である。組成物は、加えて、膜小胞の放出を防止するであろう。これは、無細胞ＲＮＡが微小胞及び細胞外小胞（エクソソームを含むがこれに限定されない）を含む膜小胞に封入されるため、重要である。好ましくは、組成物は、尿などの体液中の無細胞核酸及び細胞核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の両方の安定性及び完全性を、室温で最低７日間維持し、化学的及び酵素ベース両方の分解を防止する。本出願は、そのような組成物を開示する。
一態様では、体液を周囲温度で保存するための水性安定化組成物が提供され、組成物は、単糖、二糖、又はこれらの組み合わせから選択される糖と、緩衝剤と、Ｃ１－Ｃ６アルカノールと、ホウ酸、ホウ酸の塩、又はこれらの組み合わせと、キレート剤とを含み、組成物は、４．５～５．２のｐＨを有する。
別の態様では、体液を保存する方法が提供され、方法は、ａ）体液の試料を得ることと、ｂ）体液を水性安定化組成物と接触させて混合物を形成することであって、組成物が、単糖、二糖、又はこれらの組み合わせから選択される糖と、緩衝剤と、Ｃ１－Ｃ６アルカノールと、ホウ酸、ホウ酸の塩、又はこれらの組み合わせと、キレート剤とを含み、組成物が、４．５～５．２のｐＨを有する、形成することと、ｃ）（ｂ）の混合物を混合して均一な混合物を形成することと、ｄ）均一な混合物を周囲温度で保存することとを含む。
更に別の態様では、水性組成物が提供され、これには、単糖、二糖、又はこれらの組み合わせから選択される糖と、緩衝剤と、Ｃ１－Ｃ６アルカノールと、ホウ酸、ホウ酸の塩、又はこれらの組み合わせと、キレート剤と、体液とを含む。
最終製品に到達するための開発の進行を含む本発明のより良好な理解のために、添付の図面と併せて使用される以下の説明を参照されたい。
女性及び男性のドナーからの尿中無細胞ＤＮＡ（ＵｃｆＤＮＡ）を図示する図表であり、尿試料中のＵｃｆＤＮＡの量が試料及び性別依存性の両方であることを示す。
細菌増殖による安定化されていない朝一の最初の排泄（ＦＭＦＶ）尿試料の濁度の増加を図示する図表である（図２Ｂによって更に証明される）。
ＲＴ（室温）で７日後の安定化されていない尿試料中の細菌及びヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）含有量の定量化のための細菌１６Ｓ及びβ－グロビンｑＰＣＲアッセイから決定されたΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を図示する図表である。
室温で７日後のヒト無細胞ＤＮＡ含有量の大幅な低下を示す、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ分析の結果を図示する。
室温で７日後のヒト無細胞ＤＮＡ含有量の大幅な低下を示す、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ分析の結果を図示する。
（ｉ）安定性及び（ｉｉ）中立性を、それぞれ、ΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］及びΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として図示し、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温での７日間の保存後の尿試料中のヒトｃｆＤＮＡ含有量の定量化のためのβ－グロビンｑＰＣＲアッセイから決定された図表である。Ｃｔ（Ｔ０）及びＣｔ（Ｔ７）は、それぞれ、０日目及び７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）及びＣｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、それぞれ、０日目の化学物質を含む尿検体及び保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
（ｉ）安定性及び（ｉｉ）中立性を、それぞれ、ΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］及びΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として図示し、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温での７日間の保存後の尿試料中のヒトｃｆＤＮＡ含有量の定量化のためのβ－グロビンｑＰＣＲアッセイから決定された図表である。Ｃｔ（Ｔ０）及びＣｔ（Ｔ７）は、それぞれ、０日目及び７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）及びＣｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、それぞれ、０日目の化学物質を含む尿検体及び保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
（ｉ）安定性及び（ｉｉ）中立性を、それぞれ、ΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］及びΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として図示し、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温での７日間の保存後の尿試料中のヒトｃｆＤＮＡ含有量の定量化のためのβ－グロビンｑＰＣＲアッセイから決定された図表である。Ｃｔ（Ｔ０）及びＣｔ（Ｔ７）は、それぞれ、０日目及び７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）及びＣｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、それぞれ、０日目の化学物質を含む尿検体及び保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下で、室温で７日間保存した後の尿試料中のヒトｃｆＤＮＡ含有量の定量化のためのβ－グロビンｑＰＣＲアッセイから決定されたΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］を図示する図表である。Ｃｔ（Ｔ）は、７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、０日目の保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下で、室温で７日間保存した後の尿試料中のヒトｃｆＤＮＡ含有量の定量化のためのβ－グロビンｑＰＣＲアッセイから決定されたΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］を図示する図表である。Ｃｔ（Ｔ）は、７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、０日目の保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
（ｉ）安定性及び（ｉｉ）中立性を、それぞれ、ΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］及びΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として図示し、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温での７日間の保存後の尿試料中のヒトｃｆＤＮＡ含有量の定量化のためのβ－グロビンｑＰＣＲアッセイから決定された。Ｃｔ（Ｔ０）及びＣｔ（Ｔ７）は、それぞれ、０日目及び７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）及びＣｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、それぞれ、０日目の化学物質を含む尿検体及び保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
ｃｆＤＮＡが保存されていない試料において分解され、本出願の水性安定化組成物において安定化されることを示す、これらの保存されていない尿試料及び化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）含有試料の代表的なＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎプロファイル分析を図示する。
（ｉ）安定性及び（ｉｉ）中立性を、それぞれ、ΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ）－Ｃｔ（Ｔ０）］及びΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として図示し、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温での７日間又は１４日間の保存後の尿試料中のヒトｃｆＤＮＡ含有量の定量化のためのβ－グロビンｑＰＣＲアッセイから決定された図表である。Ｃｔ（Ｔ０）及びＣｔ（Ｔ）は、それぞれ、０日目及び７日目又は１４日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）及びＣｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、それぞれ、０日目の化学物質を含む尿検体及び保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
（ｉ）安定性及び（ｉｉ）中立性を、それぞれ、ΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ）－Ｃｔ（Ｔ０）］及びΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として図示し、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温での７日間又は１４日間の保存後の尿試料中のヒトｃｆＤＮＡ含有量の定量化のためのβ－グロビンｑＰＣＲアッセイから決定された図表である。Ｃｔ（Ｔ０）及びＣｔ（Ｔ）は、それぞれ、０日目及び７日目又は１４日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）及びＣｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、それぞれ、０日目の化学物質を含む尿検体及び保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
（ｉ）安定性及び（ｉｉ）中立性を、それぞれ、ΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ）－Ｃｔ（Ｔ０）］及びΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として図示し、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温での７日間又は１４日間の保存後の尿試料中のヒトｃｆＤＮＡ含有量の定量化のためのβ－グロビンｑＰＣＲアッセイから決定された図表である。Ｃｔ（Ｔ０）及びＣｔ（Ｔ）は、それぞれ、０日目及び７日目又は１４日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）及びＣｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、それぞれ、０日目の化学物質を含む尿検体及び保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
図６（ｉ‐ｉ）Ａ及びＢは、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温で７日間保存した後の、前立腺がん細胞をスパイクした尿試料（Ｓ）中のヒトｃｆＤＮＡ含有量の定量化のためのβ－グロビンｑＰＣＲアッセイから決定されたΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ）－Ｃｔ（Ｔ０ＮＡ）］を図示する図表である。Ｃｔ（Ｔ）は、０日目又は７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、０日目の保存されていないスパイクした検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
図６（ｉ‐ｉｉ）Ｃは、保存されていない尿試料及び化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）含有尿試料の代表的なＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎプロファイル分析を図示する。
図６（ｉｉ）Ａは、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温で７日間保存した後の、前立腺がん細胞をスパイクした尿試料（Ｓ）中のヒトｃｆＤＮＡ含有量の定量化のためのβ－グロビンｑＰＣＲアッセイから決定されたΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ）－Ｃｔ（Ｔ０ＮＡ）］を図示する図表である。Ｃｔ（Ｔ）は、０日目又は７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、０日目の保存されていないスパイクした検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。図６（ｉｉ）Ｂは、ｄｄＰＣＲアッセイを使用して決定されたこれらの試料のうちのいくつかの単位体積当たりのβ－グロビン遺伝子のコピー数を図示する図表である。全体として、図６（ｉ‐ｉ）、図６（ｉ‐ｉｉ）及び図６（ｉｉ）は、本出願の水性安定化組成物が、室温で少なくとも７日間、濃度依存的様式で前立腺がん細胞の完全性を維持することを示唆する。
本出願の水性安定化組成物との混合、及びＳｔｒｅｃｋから市販されている組成物を含む様々な条件下での０日目及び室温で７日間保存した後の、有核白血球をスパイクした尿試料（Ｓ）中のヒトｃｆＤＮＡ含有量の定量化のためのβ－グロビンｑＰＣＲアッセイから決定されたΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］を図示する図表である。Ｃｔ（Ｔ）は、０日目又は７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、０日目の保存されていないスパイクした検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
ＣｐＧメチルトランスフェラーゼを使用してインビトロでのプラスミドＤＮＡメチル化を確認する、ＨｐａＩＩ及びＭｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ消化パターンを示す。
室温で７日間にわたる本組成物中のＤＮＡメチル化の保存を示唆する、メチル化プラスミドのＰＣＲ増幅のＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ結果を示す。
室温で７日間にわたる本組成物中のＤＮＡメチル化の保存を示唆する、メチル化プラスミドのＰＣＲ増幅のＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ結果を示す。
室温で７日間保存した後の、精製されたＨＰＶ１６プラスミドＤＮＡをスパイクした保存されていない尿試料及び化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）含有尿試料の両方におけるＨＰＶプラスミドＤＮＡ及び細菌ＤＮＡのそれぞれの定量化のための、アンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）及び細菌１６Ｓ ｑＰＣＲアッセイから決定されたΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を図示する図表である。Ｃｔ（Ｔ７）は、７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０）は、０日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
室温で７日間保存した後の、精製されたＨＰＶ１６プラスミドＤＮＡをスパイクした保存されていない尿試料及び化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）含有尿試料の両方におけるＨＰＶプラスミドＤＮＡ及び細菌ＤＮＡのそれぞれの定量化のための、アンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）及び細菌１６Ｓ ｑＰＣＲアッセイから決定されたΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を図示する図表である。Ｃｔ（Ｔ７）は、７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０）は、０日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
（ｉ）安定性及び（ｉｉ）中立性を、それぞれ、ΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］及びΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として図示し、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温での７日間の保存後の尿試料中のヒトＥＶ ＲＮＡ含有量の定量化のためのβ－アクチンＲＴ－ｑＰＣＲアッセイから決定された。Ｃｔ（Ｔ０）及びＣｔ（Ｔ７）は、それぞれ、０日目及び７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）及びＣｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、それぞれ、０日目の化学物質を含む尿検体及び保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
０日目及び７日目の保存されていない尿検体及び化学Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）含有尿検体の両方からの細胞外小胞（ＥＶ）ＲＮＡの代表的な電気泳動トレースを図示する。
（ｉ）安定性及び（ｉｉ）中立性を、それぞれ、ΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］及びΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として図示し、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温での７日間の保存後の尿試料中のヒトＥＶ ＲＮＡ含有量の定量化のためのβ－アクチンＲＴ－ｑＰＣＲアッセイから決定された。Ｃｔ（Ｔ０）及びＣｔ（Ｔ７）は、それぞれ、０日目及び７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）及びＣｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、それぞれ、０日目の化学物質を含む尿検体及び保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
（ｉ）安定性及び（ｉｉ）中立性を、それぞれ、ΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］及びΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として図示し、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温での７日間の保存後の尿試料中のヒトＥＶ ＲＮＡ含有量の定量化のためのβ－アクチンＲＴ－ｑＰＣＲアッセイから決定された。Ｃｔ（Ｔ０）及びＣｔ（Ｔ７）は、それぞれ、０日目及び７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）及びＣｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、それぞれ、０日目の化学物質を含む尿検体及び保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
（ｉ）安定性及び（ｉｉ）中立性を、それぞれ、ΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］及びΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として図示し、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温での７日間の保存後の尿試料中のヒト無細胞ＲＮＡ含有量の定量化のためのβ－アクチンＲＴ－ｑＰＣＲアッセイから決定された図表である。Ｃｔ（Ｔ０）及びＣｔ（Ｔ７）は、それぞれ、０日目及び７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）及びＣｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、それぞれ、０日目の化学物質を含む尿検体及び保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
（ｉ）安定性及び（ｉｉ）中立性を、それぞれ、ΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］及びΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として図示し、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温での７日間の保存後の尿試料中のヒト細胞ＲＮＡ含有量の定量化のためのβ－アクチンＲＴ－ｑＰＣＲアッセイから決定された図表である。Ｃｔ（Ｔ０）及びＣｔ（Ｔ７）は、それぞれ、０日目及び７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）及びＣｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、それぞれ、０日目の化学物質を含む尿検体及び保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
（ｉ）安定性及び（ｉｉ）中立性を、それぞれ、ΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］及びΔＣｔ［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として図示し、本出願の水性安定化組成物との混合を含む様々な条件下での０日目及び室温での７日間の保存後の尿試料中のヒト細胞ＲＮＡ含有量の定量化のためのβ－アクチンＲＴ－ｑＰＣＲアッセイから決定された図表である。Ｃｔ（Ｔ０）及びＣｔ（Ｔ７）は、それぞれ、０日目及び７日目のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）及びＣｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、それぞれ、０日目の化学物質を含む尿検体及び保存されていない検体（ＮＡ）のｑＰＣＲサイクル閾値を示す。
本出願の水性安定化組成物と混合された、保存されていない尿検体（ＮＡ）及び化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）含有尿検体の両方における、０日目及び７日目の抽出された細胞ＤＮＡのＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎプロファイルを図示する。
ＰＣＲ増幅ＧＡＰＤＨ産物のＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎプロファイルを示す。
細菌１６Ｓ ｑＰＣＲアッセイから決定された細菌ＤＮＡ含有率を図示する。
本出願の水性安定化組成物と混合された、保存されていない唾液検体（ＴＥ）及び化学物質Ｆ含有唾液検体の両方における、０日目及び７日目の抽出されたｃｆＤＮＡのＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎプロファイルを図示する。ＴＥは、１ＸＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液を表す。
（定義）
別段の定義がされない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
別段の定義がされない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、続くリストが包括的ではなく、任意の他の追加の好適な項目、例えば、１つ以上の更なる特徴、構成要素、及び／又は要素を必要に応じて含んでも含まなくてもよいことを意味すると理解される。
本明細書で使用される場合、「実質的に」、「約」、及び「およそ」などの程度の用語は、最終結果が著しく変化しないような修飾された用語の合理的な量の逸脱を意味する。これらの程度の用語は、この逸脱が修飾する単語の意味を否定しない場合、修飾された用語の少なくとも±１０％の逸脱を含むと解釈されるべきである。
本明細書で使用される場合、「体液」という用語は、ヒト又は動物からの天然に存在する流体を意味し、尿、唾液、痰、血清、血漿、血液、咽頭、鼻／鼻咽頭及び副鼻腔分泌物、粘膜、胃液、膵液、骨髄吸引液、脳脊髄液、糞便、精液、授乳若しくは月経の産物、子宮頸部分泌物、膣液、涙液、又はリンパ液を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、体液は、尿又は唾液から選択される。別の実施形態では、体液は、尿である。
本明細書で使用される場合、「周囲温度」という用語は、収集の時点から、輸送中に（通常はより短い期間（例えば、５日未満）であるが、比較的極端な温度を伴い得る）、並びに分析前の長期保存中に、体液（例えば、尿試料）と本明細書に記載の水性安定化組成物との混合物が受ける可能性がある温度の範囲を指す。一実施形態では、周囲温度は、約－２０℃～約５０℃の範囲である。別の実施形態では、周囲温度は、室温（ＲＴ）であり、約１５℃～約２５℃の範囲である。
本明細書で使用される場合、「単糖」という用語は、加水分解によってより単純な糖に分解されず、アルドース又はケトースのいずれかとして分類され、１分子当たり１つ以上のヒドロキシル基を含有する糖を意味すると理解される。一実施形態では、単糖は、フルクトース、グルコース、マンノース、又はガラクトースから選択される。別の実施形態では、単糖は、フルクトース、グルコース、又はこれらの組み合わせである。
本明細書で使用される場合、「二糖」という用語は、２つの単糖単位がグリコシド結合によって結合される化合物を意味すると理解される。一実施形態では、二糖は、スクロース、トレハロース、及びラクトースから選択される。別の実施形態では、二糖は、スクロースである。
二糖を含む本出願に従う組成物は、そのような溶液が、非常に高い粘度を有し得、混合の困難さに起因して、構成要素の不適切な混合及び／又は検体（すなわち、体液）への添加をもたらす可能性があるため、調製がより困難であり得ることが分かった。全体的に、試料の加工性のため、本出願の組成物及び方法には、二糖よりも単糖が好ましい。
本明細書で使用される場合、「キレータ」又は「キレート剤」という用語は、ある特定の金属イオン（例えば、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋）と可溶性で安定した錯体を形成し、様々な体液試料において豊富にある酵素であるデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）又はエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ）及びエキソヌクレアーゼ（例えば、３’～５’エキソヌクレアーゼ）などの他の構成要素と通常反応することができないようにイオンを隔離する化学物質を意味すると理解される。本組成物において、キレート剤は、生体試料におけるＤＮａｓｅ及び微生物増殖の阻害に関与する。キレータは、例えば、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２－シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）グリシン、トリエチレンテトラアミン（ＴＥＴＡ）、テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）、デスフェリオキシミン、クエン酸無水物（ｃｉｔｒａｔｅ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、アンモニウムビシトレート（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃｉｔｒａｔｅ）、クエン酸、クエン酸ジアンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、及びクエン酸リチウムであり得る。これらのキレート剤は、単独で、又は２つ以上のこれらの組み合わせで使用され得る。
本明細書で使用される場合、「Ｃ１－Ｃ６アルカノール」という用語は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｎ－ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、又はこれらの任意の組み合わせなどの直鎖又は分枝鎖を意味すると理解される。本組成物の一実施形態では、好ましいアルコールは、エタノールである。
一実施形態では、体液を周囲温度で保存するための水性安定化組成物が提供され、組成物は、単糖、二糖、又はこれらの組み合わせから選択される糖と、緩衝剤と、Ｃ１－Ｃ６アルカノールと、ホウ酸、ホウ酸の塩、又はこれらの組み合わせと、キレート剤とを含み、組成物は、４．５～５．２のｐＨを有する。
一実施形態では、水性組成物は、ホウ酸、ホウ酸の塩、例えば、ホウ酸二水素塩、ホウ酸水素塩、ジボレート、トリボレート、テトラボレート、メタボレート、ヒドロキソボレート（ｈｙｄｒｏｘｏｂｏｒａｔｅ）、ホウ酸塩など、又はこれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、水性組成物は、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、又はこれらの組み合わせを含む。更に別の実施形態では、水性組成物は、ホウ酸を含む。一実施形態では、ホウ酸、ホウ酸の塩、又はこれらの組み合わせは、約０．５％～約５％（重量／体積）、又は約１％～約３％（重量／体積）、又は約２％～約２．５％（重量／体積）、又は約２．２％（重量／体積）の量で水性安定化組成物に存在する。
一実施形態では、糖は、単糖、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ガラクトースなど、又はこれらの組み合わせである。別の実施形態では、単糖は、フルクトース、グルコース、又はこれらの組み合わせである。別の実施形態では、糖は、二糖、例えば、トレハロース、ラクトース、若しくはスクロース、又はこれらの組み合わせである。別の実施形態では、二糖は、スクロースである。一実施形態では、糖は、約５％～約４５％（重量／体積）、又は約５％～約４０％（重量／体積）、又は約１０％～約３０％（重量／体積）、又は約１８％～約２２％（重量／体積）、又は約２０％（重量／体積）の量で水性安定化組成物に存在する。
一般に、本水性安定化組成物のｐＨは、１つ以上の適切な緩衝剤を使用して所望の範囲に維持することができる。一実施形態によれば、組成物は、ｐＨを４．５～５．２の好ましい範囲内に維持するために、３～６．５の範囲で、２５℃で、対数酸解離定数であるｐＫａ値を有する１つ、２つ以上の緩衝剤（非限定的な例は、酢酸緩衝液及びクエン酸緩衝液、例えば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、及びクエン酸アンモニウム）を含む。一実施形態では、緩衝剤は、酢酸ナトリウムである。
酸解離定数Ｋａは、溶液中の酸の強度の定量的尺度である。Ｋａ値が大きいほど、溶液中の分子の解離が大きくなるため、酸が強くなる。Ｋａ値がまたがる桁数が多いため、実際には酸解離定数の対数尺度であるｐＫａがより一般的に用いられる。ｐＫａの値が大きいほど、任意の所与のｐＨでの解離の程度が小さい、すなわち、酸が弱くなる。生体において、酸－塩基恒常性及び酵素動態は、細胞及び体内に存在する多くの酸及び塩基のｐＫａ値に依存する。化学において、ｐＫａ値の知識は緩衝液の調製に必要であり、錯体を形成する酸又は塩基と金属イオンとの間の相互作用を定量的に理解するための前提条件でもある。当業者は、所与の化合物／緩衝液が溶液のｐＨを緩衝することができるのは、その濃度が十分であり、かつ溶液のｐＨがそのｐＫａに（約１ｐＨ単位内で）近い場合に限られることを理解するであろう。一実施形態では、本組成物のｐＨは、４．５～５．２の範囲である。好ましい実施形態では、組成物のｐＨは、約５．０である。水性安定化組成物中の緩衝剤の量は、例えば、約１５０ｍＭ～約１．７５Ｍ、又は約１５０ｍＭ～約１．５Ｍ、又は約５００ｍＭ～約１．２Ｍ、又は約０．７Ｍ～約０．８Ｍ、又は約０．７５Ｍの量のものである。
一実施形態では、水性安定化組成物中のＣ１－Ｃ６アルカノールは、メタノール又はエタノールから選択される。別の実施形態では、Ｃ１－Ｃ６アルカノールは、エタノールである。更に別の実施形態では、Ｃ１－Ｃ６アルカノールは、約５％～約５０％（体積／体積）、又は約１０％～約３０％（体積／体積）、又は約２０％～約２５％（体積／体積）、又は約２３％（体積／体積）の量で水性安定化組成物に存在する。
エタノールは、タンパク質の脱水又は水活性の低減を引き起こし、その後、タンパク質間の静電的誘引、凝集、及び不溶化を引き起こす。理論に拘束されることを望まないが、発明者は、使用される割合でのエタノールが、この組成物においてほとんど～全く固定特性を有さないと考え、むしろ全体的な安定性にとって重要であり、本組成物に含まれ得る他の化学化合物の官能性を増強する。加えて、可燃性液体の出荷／輸送については、危険物の輸送（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ Ｄａｎｇｅｒｏｕｓ Ｇｏｏｄｓ）（ＴＤＧ）規制（Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ（ＵＮ）番号１１７０）免除のために、溶液中のエタノールなどの有機溶媒を２４体積％未満に保つことが望ましい。そうでなければ、エタノールが＞２４％の溶液は、クラス３（可燃性液体）に分類され、特別な包装が義務付けられ、輸送の複雑さ及びコストが増加する。そのため、約２３％（体積／体積）以下を含む水性安定化組成物が特に有利である。
別の実施形態では、水性安定化組成物中のキレート剤は、例えば、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２－シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）、テトラアザシクロテトラデカン四酢酸（ＴＥＴＡ）、デスフェリオキシミン、又はこれらのキレータ類似体から選択される。別の実施形態では、キレート剤は、ＣＤＴＡである。別の実施形態では、キレート剤は、約１０ｍＭ～約１２０ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、又は約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、又は約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、又は約５０ｍＭの量で水性安定化組成物に存在する。
水性安定化組成物の一実施形態では、組成物は、約５％～約４５％（重量／体積）、約５％～約４０％（重量／体積）、又は約１０％～約３０％（重量／体積）、又は約１８％～約２２％（重量／体積）、又は約２０％（重量／体積）の量の糖（フルクトース、グルコース、スクロース、又はこれらの組み合わせなど、好ましくは、フルクトース、グルコース、又はこれらの組み合わせ）と、約１５０ｍＭ～約１．７５Ｍ、又は約１５０ｍＭ～約１．５Ｍ、又は約５００ｍＭ～約１．２Ｍ、又は約０．７Ｍ～約０．８Ｍ、又は約０．７５Ｍの量の緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウムなど）と、約５％～約５０％（体積／体積）、又は約１０％～約３０％（体積／体積）、又は約２０％～約２５％（体積／体積）、又は２３％（体積／体積）の量のＣ１－Ｃ６アルカノール（例えば、メタノール、エタノール、又はこれらの組み合わせ、好ましくは、エタノール）と、約０．５％～約５％（重量／体積）、又は約１％～約３％（重量／体積）、又は約２％～約２．５％（重量／体積）、又は約２．２％（重量／体積）の量のホウ酸、ホウ酸の塩、又はこれらの組み合わせ（好ましくは、ホウ酸）と、約１０ｍＭ～約１２０ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、又は約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、又は約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、又は約５０ｍＭの量のキレート剤（ＣＤＴＡなど）とを含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。
一実施形態では、水性安定化組成物は、細胞（がん細胞又は有核血液細胞など）、細胞外小胞、核酸（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、及び細胞外小胞ＲＮＡ（ＥＶ ＲＮＡ）などの細胞ＤＮＡ及びＲＮＡ）、及び／又は体液に含まれる微生物（細菌又はウイルスなど）を安定化する。
別の実施形態では、体液を保存するための方法が提供され、方法は、ａ）体液の試料を得ることと、ｂ）体液を、上で定義される水性安定化組成物と接触させて混合物を形成することと、ｃ）（ｂ）の混合物を混合して均一な混合物を形成することと、ｄ）均一な混合物を周囲温度で保存することとを含む。一実施形態では、体液を保存することは、細胞（がん細胞又は有核血液細胞など）、細胞外小胞、核酸（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、及び細胞外小胞ＲＮＡ（ＥＶ ＲＮＡ）などのＤＮＡ及びＲＮＡ）、及び／又は体液に含まれる微生物（細菌又はウイルスなど）を安定化することを含む。別の実施形態では、体液に含まれる細胞、核酸、細胞外小胞、及び／又は微生物は、周囲温度で少なくとも７日間安定化される。別の実施形態では、体液に含まれる細胞、核酸、細胞外小胞、及び／又は微生物は、周囲温度で少なくとも１４日間安定化される。別の実施形態では、体液は、尿又は唾液である。別の実施形態では、体液は、尿である。
更に別の実施形態では、水性組成物が提供され、これには、単糖、二糖、又はこれらの組み合わせから選択される糖と、緩衝剤と、Ｃ１－Ｃ６アルカノールと、ホウ酸、ホウ酸の塩、又はこれらの組み合わせと、キレート剤と、体液とを含む。一実施形態では、体液は、尿である。別の実施形態では、体液は尿であり、体液を含む水性組成物のｐＨは５～５．５である。別の実施形態では、糖は、約１．５％～約１５％（重量／体積）、又は約２％～約１０％（重量／体積）、又は約５％～約７％（重量／体積）、又は約６％（重量／体積）の量で存在し、緩衝剤は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ、又は約２００ｍＭ～約４００ｍＭ、又は約２２０ｍＭ～約２４０ｍＭ、又は約２３０ｍＭ、又は約２２５ｍＭの量で存在し、Ｃ１－Ｃ６アルカノールは、約２％～約４０％（体積／体積）、又は約３％～約２０％（体積／体積）、又は約５％～約１０％（体積／体積）、又は約６．５％（体積／体積）、又は約６．９％（体積／体積）の量で存在し、ホウ酸、ホウ酸の塩、又はこれらの組み合わせは、約０．１％～約２％（重量／体積）、又は約０．２％～約１．５％（重量／体積）、又は約０．５％～約１．０％（重量／体積）、又は約０．７％（重量／体積）、又は約０．６％（重量／体積）の量で存在し、キレート剤は、約２．５ｍＭ～約５０ｍＭ、又は約５ｍＭ～約２５ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約１６ｍＭ、又は約１５ｍＭの量で存在する。
一実施形態では、体液は尿であり、尿試料は、例えば、「ＬＩＱＵＩＤ ＳＡＭＰＬＥＲ，ＫＩＴ ＯＦ ＰＡＲＴＳ，ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＡＳＳＥＭＢＬＹ」と題されるＷＯ２０１４／０３７１５２に記載されている、所定の体積の所定の尿部分（例えば、最初の排泄）を捕捉するためのデバイスを使用して収集される。一実施形態では、Ｃｏｌｌｉ－Ｐｅｅ（登録商標）Ｆｉｒｓｔ Ｖｏｉｄ Ｕｒｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｎｏｖｏｓａｎｉｓ）を使用することができる。水性安定化組成物は、収集時にデバイス内に存在し得るか、又は収集直後に尿を水性安定化組成物と接触させることができる。尿試料及び水性安定化組成物を含有するリザーバは、適切なキャップで密封することができ、組み合わせられた試料及び安定化組成物は、例えば、チューブを反転させることによって、穏やかに混合することができる。尿試料はまた、標準的な尿検体容器（例えば、ＶＷＲ；カタログ番号１０８０４－０５０）に収集され、次いで安定化組成物と混合されてもよい。あるいは、収集された尿は、アイスパック上で実験室に輸送され、そこで、本安定化組成物と混合され得る。
別の実施形態では、体液は唾液であり、唾液試料は、例えば、「ＣＯＮＴＡＩＮＥＲ ＳＹＳＴＥＭ ＦＯＲ ＲＥＬＥＡＳＡＢＬＹ ＳＴＯＲＩＮＧ Ａ ＳＵＢＳＴＡＮＣＥ」と題されるＷＯ２００７／０６８０９４、「ＳＡＭＰＬＥ ＲＥＣＥＩＶＩＮＧ ＤＥＶＩＣＥ」と題されるＷＯ２０１０／０２００４３、及び「ＣＬＯＳＵＲＥ，ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ，ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＵＳＩＮＧ ＳＡＭＥ」と題されるＷＯ２０１０／１３００５５に記載されているものなどのデバイスを使用して収集される。
別の実施形態では、体液は糞便であり、糞便試料は、「ＤＥＶＩＣＥ ＦＯＲ ＣＯＬＬＥＣＴＩＮＧ，ＴＲＡＮＳＰＯＲＴＩＮＧ ＡＮＤ ＳＴＯＲＩＮＧ ＢＩＯＭＯＬＥＣＵＬＥＳ ＦＲＯＭ Ａ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＡＭＰＬＥと題されるＷＯ２０１５／１７２２５０に記載されるようなデバイスを使用して収集される。
更に別の実施形態では、体液の試料は、標準的な市販の実験室又は輸送チューブ（例えば、１０ｍＬの丸底チューブ（９２×１５．３ｍｍ）、カタログ番号６０．６１０、Ｓａｒｓｔｅｄｔ、又は試料の種類及びサイズに応じて大きなチューブ）に収集され得る。体液の試料及び水性安定化組成物を含有するチューブは、適切なキャップで密封することができ、組み合わせられた試料及び安定化組成物は、例えば、チューブを反転させることによって、穏やかに混合することができる。
体液は、好ましくは、収集点で直ちに安定化組成物と混合されるべきである。さもなければ、試料は、組成物と混合する前に、アイスパック上で保存及び／若しくは輸送されるか、又は冷蔵されるべきである。
当業者が理解するように、本明細書に記載の水性安定化組成物（「化学物質」）は、様々な比で体液の試料と組み合わせることができる。例えば、体液が尿である場合、試料を過度に希釈し、したがって、収集された分析物を減少させることを避けることが望ましい。したがって、化学物質：尿の比は、例えば、０．２５：１～０．７５：１、例えば、０．２５：１、０．３０：１、０．３５：１、０．４０：１、０．４５：１、０．５０：１、０．５５：１、０．６０：１、０．６５：１、０．７０：１、又は０．７５：１の範囲であり得る。一実施形態では、化学物質：尿の比は、０．４０：１～０．４５：１である。
糞便などの他の体液については、十分な混合を確実にするために、より高い化学物質：試料の比を使用することができる。
一実施形態では、体液を水性安定化組成物と接触させ、混合して均一な混合物を形成するステップの後、均一な混合物は、約１．５％～約１５％（重量／体積）、又は約２％～約１０％（重量／体積）、又は約５％～約７％（重量／体積）、又は約６％（重量／体積）の量の糖（例えば、フルクトース、グルコース、スクロース、又はこれらの組み合わせ、好ましくは、フルクトース、グルコース、又はこれらの組み合わせ）と、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ、又は約２００ｍＭ～約４００ｍＭ、又は約２２０ｍＭ～約２４０ｍＭ、又は約２３０ｍＭ、又は約２２５ｍＭの量の緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウムなど）と、約２％～約４０％（体積／体積）、又は約３％～約２０％（体積／体積）、又は約５％～約１０％（体積／体積）、又は約６．５％（体積／体積）、又は約６．９％（体積／体積）の量のＣ１－Ｃ６アルカノール（例えば、メタノール、エタノール、又はこれらの組み合わせ、好ましくは、エタノール）と、約０．１％～約２．２％（重量／体積）、又は約０．２％～約１．５％（重量／体積）、又は約０．５％～約１．０％（重量／体積）、又は約０．７％（重量／体積）、又は約０．６％（重量／体積）の量のホウ酸、ホウ酸の塩、又はこれらの組み合わせ（好ましくは、ホウ酸）と、約２．５ｍＭ～約５０ｍＭ、又は約５ｍＭ～約２５ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約１６ｍＭ、又は約１５ｍＭの量のキレート剤（好ましくは、ＣＤＴＡ）とを含む。
上述のように、一実施形態では、水性安定化組成物は、細胞（がん細胞又は有核血液細胞など）、細胞外小胞、核酸（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、及び細胞外小胞ＲＮＡ（ＥＶ ＲＮＡ）などのＤＮＡ及びＲＮＡ）、及び／又は体液に含まれる微生物（細菌又はウイルスなど）を安定化する。一実施形態では、水性安定化組成物は、体液のそのような構成要素を周囲温度で少なくとも７日間安定化する。別の実施形態では、水性安定化組成物は、体液のそのような構成要素を周囲温度で少なくとも１４日間安定化する。そのような安定化は、当業者に既知の方法、例えば、無細胞核酸の分解を監視することにより（材料及び方法のセクション、並びに後の実施例に更に記載される）、評価することができる。
ΔＣｔは、所与の遺伝子の量又は発現の相対的変化に対応する。ΔＣｔは、Ｃｔ（Ｔ）－Ｃｔ（Ｔ０）に対応し、Ｃｔ（Ｔ）は、７日目又は１４日目のサイクル閾値を表し、Ｃｔ（Ｔ０）は、０日目のサイクル閾値を示す。反応のサイクル閾値（Ｃｔ）値を、ＰＣＲ産物の蛍光が背景シグナルの上で検出され得る場合のサイクル数として定義した。本研究では、Ｃｔ（Ｔ７又はＴ１４）－Ｃｔ（Ｔ０）として計算される場合、このΔＣｔは、室温で特定の時間量にわたって保存した後の保存されていない試料及び保存された試料における異なる分析物の安定性の変化を説明する。ΔＣｔは、Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）として計算される場合、ΔＣｔは、中立性（収集時、すなわち０日目の保存されていない尿試料に対する、尿試料中の所与の化学物質の添加による分析物の基底濃度の変化）を説明する。不変のΔＣｔ値又は０に近いΔＣｔ値は、分析物の濃度が経時的に著しく変化していないことを意味する（したがって、試験条件下での組成物中の分析物の安定性を示す）ため、安定性を示す。例えば、本無細胞ＤＮＡ研究において、ΔＣｔ値は、７日間にわたって室温で維持された、保存されていない試料において＋２～＋１４の範囲であった。この顕著なΔＣｔ値の増加（中央値：＞＋５）は、保存されていない試料中の無細胞ＤＮＡの分解を示す。一方、本水性安定化組成物中での室温での保存後の無細胞ＤＮＡの検出のΔＣｔの中央値はほぼゼロであり、無細胞ＤＮＡの安定性及び含有量の保存を示し、間接的に細胞の安定性及び完全性も説明する。無細胞ＲＮＡに関して、保存されていない試料における＋２．５の中央ΔＣｔ値は、無細胞ＲＮＡ分解を示し、一方、比較的低い１．３の中央ΔＣｔ値は、保存されていない試料と比較した場合、保存された試料中の無細胞ＲＮＡ含有量のより良い安定性を示す。細胞ＲＮＡの安定性に関して、保存されていない試料における＋７．０の中央ΔＣｔ値は、細胞ＲＮＡの顕著な分解を示す。一方、保存された試料における２未満の中央ΔＣｔ値は、細胞ＲＮＡの安定性を示す。同様に、ＥＶ ＲＮＡに関して、保存されていない試料における＋３を超える中央ΔＣｔ値は、ＥＶ ＲＮＡの不安定性及び検出の不全を示すが、保存された試料における０．５の中央ΔＣｔ値は、優れたＥＶ ＲＮＡ安定性及び検出を示す。これは、体液中の細胞、細胞外小胞、核酸、及び／又は微生物の安定化を評価する単なる例示的な方法の１つであり、そのような安定化を評価する他の方法が、当業者に既知であり、かつ／又は以下に記載される材料及び方法のセクション並びに実施例に更に詳細に概説される。
以下の実施例７に更に詳細に記載されるように、ホルマリン／ホルムアルデヒド系固定剤を含有する保存剤／組成物を使用して、生体試料又は検体中の細胞を固定し、細胞核酸の細胞外空間への漏出を防止することができる。そのような組成物は、ホルムアルデヒド、又は代替的にホルムアルデヒドを放出することができる化合物、例えば、ホルムアルデヒド放出剤／ホルムアルデヒド供与体／ホルムアルデヒド放出保存剤を含有してもよく、これは、ホルムアルデヒドをゆっくりと放出する化学化合物である。注目すべきことに、凍結組織から単離したＤＮＡと比較した場合、ホルマリン固定組織は、高い頻度の非再現性配列変化を示す（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ Ｍ，Ｓｅｄｍａｋ Ｄ，Ｊｅｗｅｌｌ Ｓ（２００２）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｉｘａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６１（６）：１９６１－１９７１）。最も一般的に使用される固定剤の主成分であるホルムアルデヒドは、ＤＮＡ－タンパク質及びＲＮＡ－タンパク質架橋の生成につながる。更に、固定溶液が緩衝されていない状況では、核酸が断片化する。上記の両方が、ＰＣＲに基づく分析のための課題を提供する（Ｇｉｌｂｅｒｔ ＭＴＰ，Ｈａｓｅｌｋｏｒｎ Ｔ，Ｂｕｎｃｅ Ｍ，Ｓａｎｃｈｅｚ ＪＪ，Ｌｕｃａｓ ＳＢ，Ｊｅｗｅｌｌ ＬＤ，Ｖａｎ Ｍａｒｃｋ Ｅ，Ｗｏｒｏｂｅｙ Ｍ（２００７）Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ ｆｉｘｅｄ，ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ－Ｗｈｉｃｈ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｒｅ ｕｓｅｆｕｌ ｗｈｅｎ？ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（６）：ｅ５３７．Ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００００５３７、Ｗｏｎｇ ＳＱ，Ｌｉ Ｊ，Ｔａｎ ＡＹ－Ｃ，Ｖｅｄｕｒｕｒｕ Ｒ，Ｐａｎｇ Ｊ－ＭＢ，Ｄｏ Ｈ，Ｅｌｌｕｌ Ｊ，Ｄｏｉｇ Ｋ，Ｂｅｌｌ Ａ，ＭａｃＡｒｔｈｕｒ ＧＡ，Ｆｏｘ ＳＢ，Ｔｈｏｍａｓ ＤＭ，Ｆｅｌｌｏｗｅｓ Ａ，Ｐａｒｉｓｏｔ ＪＰ，Ｄｏｂｒｏｖｉｃ Ａ（２０１４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｒｔｉｆａｃｔｓ ｉｎ ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ ｔｕｍｏｕｒｓ ｔｅｓｔｅｄ ｆｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｏｔｓｐｏｔ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７：２３．Ｄｏｉ：１０．１１８６／１７５５－８７９４－７－２３）。具体的には、このＤＮＡへの化学的損傷は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの忠実度及びＰＣＲ増幅効率を低減する（Ｓｉｋｏｒｓｋｙ ＪＡ，Ｐｒｉｍｅｒａｎｏ ＤＡ，Ｆｅｎｇｅｒ ＴＷ，Ｄｅｎｖｉｒ Ｊ（２００７）ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｄｕｃｅｓ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ａｎｄ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３５５（２）：４３１－４３７）。したがって、ホルマリン／ホルムアルデヒド系固定剤は、分子分析には理想的ではない。したがって、本明細書に開示されるように、周囲温度で体液を保存するための水性安定化組成物及び方法の利点は、本出願の組成物及び方法が、ホルムアルデヒド、又はホルムアルデヒド放出剤、ホルムアルデヒド供与体、若しくはホルムアルデヒド放出保存剤などのアルデヒドを放出することができる化合物／構成要素の使用を必要としないことである。
（材料及び方法）
［無細胞核酸抽出］
無細胞核酸抽出を、製造業者のプロトコルに従い、ＱｉａＡｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；カタログ番号５５１１４）を使用して行った。朝一の最初の排泄（ＦＭＦＶ）ヒト尿、ランダムな真昼の最初の排泄（ＦＶ）尿試料、及び唾液試料を、室温（ＲＴ）で１０～２０分間、３０００ｇ～３８００ｇで遠心分離し、清澄化した上清（２～４ｍＬ）を無細胞核酸の抽出に使用した。抽出された無細胞核酸プロファイルを、ＨＳ Ｄ５０００ ｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号５０６７－５５９２）及び試薬（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号５０６７－５５９３）を使用して、４２００ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎプラットフォームで評価した。
［無細胞核酸抽出］
無細胞核酸抽出を、製造業者のプロトコルに従い、ＱｉａＡｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；カタログ番号５５１１４）を使用して行った。朝一の最初の排泄（ＦＭＦＶ）ヒト尿、ランダムな真昼の最初の排泄（ＦＶ）尿試料、及び唾液試料を、室温（ＲＴ）で１０～２０分間、３０００ｇ～３８００ｇで遠心分離し、清澄化した上清（２～４ｍＬ）を無細胞核酸の抽出に使用した。抽出された無細胞核酸プロファイルを、ＨＳ Ｄ５０００ ｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号５０６７－５５９２）及び試薬（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号５０６７－５５９３）を使用して、４２００ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎプラットフォームで評価した。
［尿細胞外小胞（ＥＶ）ＲＮＡ抽出］
尿ＥＶ ＲＮＡ抽出を、ｅｘｏＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；カタログ番号７７１６４）又は限外濾過を使用して行った。尿試料を、室温で１０分間、３０００×ｇで遠心分離し、続いて０．８０μｍのシリンジフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（登録商標）Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ（登録商標）、カタログ番号１６５９２、又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）－ＡＡ、カタログ番号ＳＬＡＡ０３３ＳＢ）を使用して上清を濾過することにより事前に清澄化した後、製造業者の指示に従い、ＥＶ単離及び＞２００ヌクレオチド（ｎｔ）長ＲＮＡ抽出を行った（補足情報：ｅｘｏＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｍｉｄｉ／Ｍａｘｉ Ｋｉｔを使用して、尿からｍｉＲＮＡを含むエクソソームＲＮＡを精製）。限外濾過を使用したＥＶ及びＥＶ ＲＮＡ単離を、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１００再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＵＦＣ９１００２４）を備える、ＡＭＩＣＯＮ Ｕｌｔｒａ－１５遠心ユニットを使用して以下のように行った。
尿ＥＶ ＲＮＡ抽出を、ｅｘｏＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；カタログ番号７７１６４）又は限外濾過を使用して行った。尿試料を、室温で１０分間、３０００×ｇで遠心分離し、続いて０．８０μｍのシリンジフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（登録商標）Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ（登録商標）、カタログ番号１６５９２、又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）－ＡＡ、カタログ番号ＳＬＡＡ０３３ＳＢ）を使用して上清を濾過することにより事前に清澄化した後、製造業者の指示に従い、ＥＶ単離及び＞２００ヌクレオチド（ｎｔ）長ＲＮＡ抽出を行った（補足情報：ｅｘｏＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｍｉｄｉ／Ｍａｘｉ Ｋｉｔを使用して、尿からｍｉＲＮＡを含むエクソソームＲＮＡを精製）。限外濾過を使用したＥＶ及びＥＶ ＲＮＡ単離を、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１００再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＵＦＣ９１００２４）を備える、ＡＭＩＣＯＮ Ｕｌｔｒａ－１５遠心ユニットを使用して以下のように行った。
１．室温（ＲＴ）で５分間、４０００ｇでの遠心分離を使用して、空のＵｌｔｒａｃｅｌ－１００ １５ｍＬカラムを、１ＸＰＢＳ ｐＨ７．４（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１００１００２３）で洗浄した。
２．事前に清澄化及び濾過した尿試料を、室温で１０分間、４０００ｇで遠心分離を行うことによってＵｌｔｒａｃｅｌ－１００カラムを使用して濃縮し、得られる濾液を廃棄した。
３．保持した濃縮した尿を含むＵｌｔｒａｃｅｌ－１００ １５ｍＬのカラムフィルタを、室温で５分間、４０００ｇで遠心分離することによって、１ＸＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１００１００２３）で洗浄した。
３．７００μＬのＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７９３０６）を、ＥＶ ＲＮＡ抽出のための捕捉されたＥＶの溶解のために、洗浄したＵｌｔｒａｃｅｌ－１００フィルタに直接添加した。フィルタカラムを新しい５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、１０秒間ボルテックスし、室温で５分間インキュベートした後、室温で５分間、４０００ｇで遠心分離した。
４．得られた濾液及びフィルタ上に保持された暗示的な溶解物を、ＥＶ ＲＮＡ単離のために回収した。１００μＬのクロロホルムを添加し、激しくボルテックスする。室温で２～５分間静置する。
５．４℃で１５分間、１２，０００ｘｇで遠心分離する。約４００μＬの水相を新しいチューブに移す。
６．混合物をＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移す前に、４００μＬ（等体積）の７０％エタノールを添加し、適宜混合する。室温で３０秒間、８，０００ｘｇで遠心分離する。濾液を廃棄する。
７．カラムに７００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＷＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加する。室温で３０秒間、８，０００ｘｇで遠心分離する。濾液を廃棄する。
８．カラムに５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加する。室温で３０秒間、８，０００ｘｇで遠心分離する。濾液を廃棄する。
９．カラムに５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加する。室温で２分間、８，０００ｘｇで遠心分離する。濾液を廃棄し、空のカラムを新しい２ｍＬ収集チューブ（Ｑｉａｇｅｎ）に移す。蓋を開いた状態でカラムを５分間最大速度で遠心分離し、膜を乾燥させる。
１０．乾燥させたスピンカラムの中心に２０μＬのＲＮａｓｅフリー水を添加する。カラムを室温で１分間静置し、続いて室温で１分間、最大速度で遠心分離する。
１１．収集したＲＮＡ試料は、定量化及び下流処理まで－８０℃で保存する。
１２．抽出したＥＶ ＲＮＡ試料を、製造業者の指示に従い、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ Ｋｉｔ （カタログ番号５０６７－１５１３）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで定量化し、かつ／又は下流ｃＤＮＡ調製物のためのＱｕａｎｔ－ｉＴ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｒ１１４９０）を使用して、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ定量化分析を行った。
［１６Ｓ ｑＰＣＲアッセイ］
尿試料から抽出した核酸を、２Ｘ ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７２５１２１）を使用して、細菌ＤＮＡ含有量の定量化のためにｑＰＣＲアッセイに供した。細菌１６ｓ ｒＲＮＡのプライマー及びｑＰＣＲ条件は、以下の通りである：ＢａｃｒＲＮＡ１７３－フォワードプライマー５’ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ ３’（配列番号１）、ＢａｃｒＲＮＡ１７３－リバースプライマー５’ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ ３’（配列番号２）（ＤＣ Ｅｍｅｒｙ，ＤＫ Ｓｈｏｅｍａｒｋ，ＴＥ Ｂｌａｔｓｔｏｎｅ，ＣＭ Ｗａｔｅｒｆａｌｌ，ＪＡ Ｃｏｇｈｉｌｌ，ＴＡ Ｃｅｒａｊｅｗｓｋａ，Ｍ Ｄａｖｉｅｓ，ＮＸ Ｗｅｓｔ，ＳＪ Ａｌｌｅｎ（２０１７）１６Ｓ ｒＲＮＡ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｓ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｐｏｓｔ－ｍｏｒｔｅｍ ｂｒａｉｎ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ９：１９５．Ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｒｉａｇｉ．２０１７．００１９５）。増幅混合物（２０μＬ）には、１０μＬの２ＸｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、それぞれ１μＬの１０μＭフォワードプライマー及びリバースプライマー、６μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＮＦＷ、カタログ番号１０９７７０２３）、及び２μＬの抽出した尿中無細胞核酸が含まれた。連続希釈（１、１：１０、１：１００、及び１：１０００）によるＥ．ｃｏｌｉ ｇＤＮＡ標準品及び非テンプレート対照（２μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水）を、各ｑＰＣＲ実行に使用した。ＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（＃１８５１１９６）で行い、条件は以下の通りである：９５℃、５分、［９５℃：２０秒、５６℃：３０秒］×４５サイクル。溶融曲線は、試料を６５℃～９５℃まで０．５℃刻みで加熱し、プレートを刻みごとに５秒間読み取ることによって得た。細菌無細胞ＤＮＡ又は細胞ＤＮＡ定量化分析は、［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を表す「ΔＣｔ」を使用して行った。「Ｃｔ（Ｔ７）」及び「Ｃｔ（Ｔ０）」は、それぞれ、７日目及び０日目のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。
尿試料から抽出した核酸を、２Ｘ ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７２５１２１）を使用して、細菌ＤＮＡ含有量の定量化のためにｑＰＣＲアッセイに供した。細菌１６ｓ ｒＲＮＡのプライマー及びｑＰＣＲ条件は、以下の通りである：ＢａｃｒＲＮＡ１７３－フォワードプライマー５’ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ ３’（配列番号１）、ＢａｃｒＲＮＡ１７３－リバースプライマー５’ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ ３’（配列番号２）（ＤＣ Ｅｍｅｒｙ，ＤＫ Ｓｈｏｅｍａｒｋ，ＴＥ Ｂｌａｔｓｔｏｎｅ，ＣＭ Ｗａｔｅｒｆａｌｌ，ＪＡ Ｃｏｇｈｉｌｌ，ＴＡ Ｃｅｒａｊｅｗｓｋａ，Ｍ Ｄａｖｉｅｓ，ＮＸ Ｗｅｓｔ，ＳＪ Ａｌｌｅｎ（２０１７）１６Ｓ ｒＲＮＡ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｓ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｐｏｓｔ－ｍｏｒｔｅｍ ｂｒａｉｎ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ９：１９５．Ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｒｉａｇｉ．２０１７．００１９５）。増幅混合物（２０μＬ）には、１０μＬの２ＸｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、それぞれ１μＬの１０μＭフォワードプライマー及びリバースプライマー、６μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＮＦＷ、カタログ番号１０９７７０２３）、及び２μＬの抽出した尿中無細胞核酸が含まれた。連続希釈（１、１：１０、１：１００、及び１：１０００）によるＥ．ｃｏｌｉ ｇＤＮＡ標準品及び非テンプレート対照（２μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水）を、各ｑＰＣＲ実行に使用した。ＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（＃１８５１１９６）で行い、条件は以下の通りである：９５℃、５分、［９５℃：２０秒、５６℃：３０秒］×４５サイクル。溶融曲線は、試料を６５℃～９５℃まで０．５℃刻みで加熱し、プレートを刻みごとに５秒間読み取ることによって得た。細菌無細胞ＤＮＡ又は細胞ＤＮＡ定量化分析は、［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を表す「ΔＣｔ」を使用して行った。「Ｃｔ（Ｔ７）」及び「Ｃｔ（Ｔ０）」は、それぞれ、７日目及び０日目のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。
［ヒトβ－グロビンｑＰＣＲアッセイ］
尿試料から抽出した核酸を、２Ｘ ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７２５１２１）を使用して、細菌ＤＮＡ含有量の定量化のためにｑＰＣＲアッセイに供した。ヒトβ－グロビンｑＰＣＲアッセイのプライマー及びＰＣＲ条件は、文献に記載されており（Ｍ Ｊｕｎｇ，Ｓ Ｋｌｏｔｚｅｋ，Ｍ Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｉ，Ｍ Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ，Ｋ Ｊｕｎｇ（２００３）Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｄｕｒｉｎｇ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ ４９（６）：１０２８－１０２９）、以下の通りである：フォワードプライマー：５′ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ ３′（配列番号３）、リバースプライマー：５′ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ ３′（配列番号４）。増幅混合物（２０μＬ）には、１０μＬの２Ｘ ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲマスターミックス、それぞれ１μＬの１０μＭフォワードプライマー及びリバースプライマー、６μＬのヌクレアーゼフリー水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０９７７０２３）、及び２μＬの抽出した尿中無細胞核酸が含まれた。連続希釈（１、１：１０、１：１００、１：１０００）によるヒトｇＤＮＡ標準品及び非テンプレート対照（２μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水）を、各ｑＰＣＲ実行に使用した。ＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（＃１８５１１９６）で行い、条件は以下の通りである：９５℃、５分、［（９５℃：２０秒、５６℃：３０秒）×４５サイクル］。溶融曲線は、試料を６５℃～９５℃まで０．５℃刻みで加熱し、プレートを刻みごとに５秒間読み取ることによって得た。安定性評価の場合：ヒト無細胞ＤＮＡ定量化分析は、［Ｃｔ（Ｔ）－Ｃｔ（Ｔ０）］を表す「ΔＣｔ」を使用して行った。「Ｃｔ（Ｔ）」は、７日目又は１４日目のｑＰＣＲサイクル閾値を表し、「Ｃｔ（Ｔ０）」は、保存されていない尿試料及び化学物質含有尿試料の両方の０日目のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。保存されていない０日目（ＮＡ）の試料に対する無細胞ＤＮＡ定量化は、［Ｃｔ（Ｔ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］としてΔＣｔ計算を用いて定量化され、ここで、Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、０日目の保存されていない試料のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。更に、中立性（すなわち、収集時の尿試料中への所与の化学物質の添加による無細胞ＤＮＡの基底濃度の変化）を評価するために、ΔＣｔ計算を［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として行い、ここで、Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）は、化学物質／安定化溶液を含む０日目の尿試料のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。
尿試料から抽出した核酸を、２Ｘ ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７２５１２１）を使用して、細菌ＤＮＡ含有量の定量化のためにｑＰＣＲアッセイに供した。ヒトβ－グロビンｑＰＣＲアッセイのプライマー及びＰＣＲ条件は、文献に記載されており（Ｍ Ｊｕｎｇ，Ｓ Ｋｌｏｔｚｅｋ，Ｍ Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｉ，Ｍ Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ，Ｋ Ｊｕｎｇ（２００３）Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｄｕｒｉｎｇ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ ４９（６）：１０２８－１０２９）、以下の通りである：フォワードプライマー：５′ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ ３′（配列番号３）、リバースプライマー：５′ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ ３′（配列番号４）。増幅混合物（２０μＬ）には、１０μＬの２Ｘ ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲマスターミックス、それぞれ１μＬの１０μＭフォワードプライマー及びリバースプライマー、６μＬのヌクレアーゼフリー水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０９７７０２３）、及び２μＬの抽出した尿中無細胞核酸が含まれた。連続希釈（１、１：１０、１：１００、１：１０００）によるヒトｇＤＮＡ標準品及び非テンプレート対照（２μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水）を、各ｑＰＣＲ実行に使用した。ＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（＃１８５１１９６）で行い、条件は以下の通りである：９５℃、５分、［（９５℃：２０秒、５６℃：３０秒）×４５サイクル］。溶融曲線は、試料を６５℃～９５℃まで０．５℃刻みで加熱し、プレートを刻みごとに５秒間読み取ることによって得た。安定性評価の場合：ヒト無細胞ＤＮＡ定量化分析は、［Ｃｔ（Ｔ）－Ｃｔ（Ｔ０）］を表す「ΔＣｔ」を使用して行った。「Ｃｔ（Ｔ）」は、７日目又は１４日目のｑＰＣＲサイクル閾値を表し、「Ｃｔ（Ｔ０）」は、保存されていない尿試料及び化学物質含有尿試料の両方の０日目のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。保存されていない０日目（ＮＡ）の試料に対する無細胞ＤＮＡ定量化は、［Ｃｔ（Ｔ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］としてΔＣｔ計算を用いて定量化され、ここで、Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）は、０日目の保存されていない試料のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。更に、中立性（すなわち、収集時の尿試料中への所与の化学物質の添加による無細胞ＤＮＡの基底濃度の変化）を評価するために、ΔＣｔ計算を［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として行い、ここで、Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）は、化学物質／安定化溶液を含む０日目の尿試料のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。
［インビトロＤＮＡメチル化アッセイ］
このアッセイは、文献に記載されている（Ｃ Ｅｒｎｓｔ，ＰＯ ＭｃＧｏｗａｎ，Ｖ Ｄｅｌｅｖａ，ＭＪ Ｍｅａｎｅｙ，Ｍ Ｓｚｙｆ，Ｇ Ｔｕｒｅｃｋｉ（２００８）Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｐｏｓｔ－ｍｏｒｔｅｍ ｂｒａｉｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７４（１）：１２３－１２５）。ｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１７５１）は、２５個のＣＣＧＧ部位を含む。１μｇのプラスミドを、製造業者のプロトコルに従い、ＣｐＧジヌクレオチド中の全てのシトシンヌクレオチドをメチル化する酵素であるＣｐＧメチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２２６Ｓ）で処理した。メチル化状態を確認するために、メチル化プラスミド（ｐＧＬ３－ＣＨ３）を、ＨｐａＩＩ及びＭｓｐＩによる制限エンドヌクレアーゼ消化に供した。これらの酵素はどちらも同じ部位（ＣＣＧＧ）を認識する。ＨｐａＩＩは、内部Ｃがメチル化されるときにＤＮＡを切断することを遮断され、ＭｓｐＩは、内部Ｃのメチル化状態に感受性がない。インビトロメチル化ｐＧＬ３プラスミドを、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’ｓ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５ ｋｉｔ（カタログ番号Ｄ４０１３）を使用してカラム精製した。等量の精製されたプラスミドを、１ＸＴＥ緩衝液ｐＨ８．０（陽性対照）、又は本発明の組成物を含む男性プール及び女性プールＦＭＦＶ尿試料のいずれかにスパイクし、反応チューブを室温で７日間保持した。インキュベーション後、Ｑｉａｇｅｎ ＥｐｉＴｅｃ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｋｉｔ（カタログ番号５９１０４）を使用して、ＤＮＡ試料を亜硫酸水素塩変換した。亜硫酸水素塩処理は、非メチル化プラスミド（シトシンからウラシルへの変換）とメチル化プラスミド（メチル化シトシンは変換に対して免疫を維持する）との間に配列差異をもたらす（Ｙ Ｌｉ ａｎｄ ＴＯ Ｔｏｌｌｅｆｓｂｏｌ（２０１１）ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７９１：１１－２１．Ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－６１７７９－３１６－５＿２）。メチル化プラスミド特異的プライマーを使用したＰＣＲ実験は、２７８ｂｐアンプリコンを生成する。プライマーを、Ｅｒｎｓｔら（２００８）、上記に記載されるように使用した（フォワードプライマー：５’－ＡＡＧＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴＴＧＧＴ－３’（配列番号５）、リバースプライマー：５’－ＴＴＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡＣＴＣＡＣＣＣＡＡＡ－３’（配列番号６））。
このアッセイは、文献に記載されている（Ｃ Ｅｒｎｓｔ，ＰＯ ＭｃＧｏｗａｎ，Ｖ Ｄｅｌｅｖａ，ＭＪ Ｍｅａｎｅｙ，Ｍ Ｓｚｙｆ，Ｇ Ｔｕｒｅｃｋｉ（２００８）Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｐｏｓｔ－ｍｏｒｔｅｍ ｂｒａｉｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７４（１）：１２３－１２５）。ｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１７５１）は、２５個のＣＣＧＧ部位を含む。１μｇのプラスミドを、製造業者のプロトコルに従い、ＣｐＧジヌクレオチド中の全てのシトシンヌクレオチドをメチル化する酵素であるＣｐＧメチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２２６Ｓ）で処理した。メチル化状態を確認するために、メチル化プラスミド（ｐＧＬ３－ＣＨ３）を、ＨｐａＩＩ及びＭｓｐＩによる制限エンドヌクレアーゼ消化に供した。これらの酵素はどちらも同じ部位（ＣＣＧＧ）を認識する。ＨｐａＩＩは、内部Ｃがメチル化されるときにＤＮＡを切断することを遮断され、ＭｓｐＩは、内部Ｃのメチル化状態に感受性がない。インビトロメチル化ｐＧＬ３プラスミドを、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’ｓ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５ ｋｉｔ（カタログ番号Ｄ４０１３）を使用してカラム精製した。等量の精製されたプラスミドを、１ＸＴＥ緩衝液ｐＨ８．０（陽性対照）、又は本発明の組成物を含む男性プール及び女性プールＦＭＦＶ尿試料のいずれかにスパイクし、反応チューブを室温で７日間保持した。インキュベーション後、Ｑｉａｇｅｎ ＥｐｉＴｅｃ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｋｉｔ（カタログ番号５９１０４）を使用して、ＤＮＡ試料を亜硫酸水素塩変換した。亜硫酸水素塩処理は、非メチル化プラスミド（シトシンからウラシルへの変換）とメチル化プラスミド（メチル化シトシンは変換に対して免疫を維持する）との間に配列差異をもたらす（Ｙ Ｌｉ ａｎｄ ＴＯ Ｔｏｌｌｅｆｓｂｏｌ（２０１１）ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７９１：１１－２１．Ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－６１７７９－３１６－５＿２）。メチル化プラスミド特異的プライマーを使用したＰＣＲ実験は、２７８ｂｐアンプリコンを生成する。プライマーを、Ｅｒｎｓｔら（２００８）、上記に記載されるように使用した（フォワードプライマー：５’－ＡＡＧＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴＴＧＧＴ－３’（配列番号５）、リバースプライマー：５’－ＴＴＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡＣＴＣＡＣＣＣＡＡＡ－３’（配列番号６））。
［ＨＰＶプラスミドスパイクインアッセイ］
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株ＨＰＶ１６プラスミド（ヒトパピローマウイルス、１６型クローン）（ＡＴＣＣカタログ番号４５１１３）を、ＺｙｍｏＰＵＲＥ ＩＩ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ ｐｒｅｐ Ｓａｍｐｌｅ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４２０２及びＤ４２０３）を使用して、ＨＰＶ１６プラスミドの抽出のためのＬＢ培地中で培養した。抽出／精製されたプラスミドを、本発明の保存化学物質の有無にかかわらず、濃度（１～１０ｎｇ／ｍＬ）で女性プール及び男性プールの朝一の最初の排泄尿試料にスパイクした。各プラスミドスパイクした尿試料の２００μＬのアリコートを、ＱＩＡｃｕｂｅ ＣｏｎｎｅｃｔでＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔを使用して、全ＤＮＡ抽出のために処理した。各反応チューブ中及び異なる日（Ｔ０及びＴ７）のプラスミドＤＮＡの量を、ＨＰＶ１６プラスミド骨格上に見出されるアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）についてｑＰＣＲアッセイを使用して定量化した。ＡｍｐＲ ｑＰＣＲプライマー及び条件は、以下の通りである：フォワードプライマー（ＦＰ）：５’ＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣＧＡＧ ３’（配列番号７）、リバースプライマー（ＲＰ）：５’ＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣ ３’（配列番号８）。増幅混合物（２０μＬ）には、１０μＬの２Ｘ ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲマスターミックス、それぞれ１μＬの１０μＭフォワードプライマー及びリバースプライマー、６μＬのヌクレアーゼフリー水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０９７７０２３）、及び２μＬの抽出した尿中核酸が含まれた。連続希釈（１、１：１０、１：１００、１：１０００）によるＨＰＶ１６プラスミド標準品及び非テンプレート対照（２μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水）を、各ｑＰＣＲ実行に使用した。ＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（＃１８５１１９６）で行い、条件は次の通りである：９５℃、５分、［（９５℃：２０秒、５５℃：３０秒）×４５サイクル］。溶融曲線は、試料を６５℃～９５℃まで０．５℃刻みで加熱し、プレートを刻みごとに５秒間読み取ることによって得た。ＨＰＶプラスミドＤＮＡ定量化分析は、［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を表す「ΔＣｔ」を使用して行った。「Ｃｔ（Ｔ７）」及び「Ｃｔ（Ｔ０）」は、それぞれ、７日目及び０日目のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株ＨＰＶ１６プラスミド（ヒトパピローマウイルス、１６型クローン）（ＡＴＣＣカタログ番号４５１１３）を、ＺｙｍｏＰＵＲＥ ＩＩ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ ｐｒｅｐ Ｓａｍｐｌｅ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４２０２及びＤ４２０３）を使用して、ＨＰＶ１６プラスミドの抽出のためのＬＢ培地中で培養した。抽出／精製されたプラスミドを、本発明の保存化学物質の有無にかかわらず、濃度（１～１０ｎｇ／ｍＬ）で女性プール及び男性プールの朝一の最初の排泄尿試料にスパイクした。各プラスミドスパイクした尿試料の２００μＬのアリコートを、ＱＩＡｃｕｂｅ ＣｏｎｎｅｃｔでＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔを使用して、全ＤＮＡ抽出のために処理した。各反応チューブ中及び異なる日（Ｔ０及びＴ７）のプラスミドＤＮＡの量を、ＨＰＶ１６プラスミド骨格上に見出されるアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）についてｑＰＣＲアッセイを使用して定量化した。ＡｍｐＲ ｑＰＣＲプライマー及び条件は、以下の通りである：フォワードプライマー（ＦＰ）：５’ＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣＧＡＧ ３’（配列番号７）、リバースプライマー（ＲＰ）：５’ＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣ ３’（配列番号８）。増幅混合物（２０μＬ）には、１０μＬの２Ｘ ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲマスターミックス、それぞれ１μＬの１０μＭフォワードプライマー及びリバースプライマー、６μＬのヌクレアーゼフリー水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０９７７０２３）、及び２μＬの抽出した尿中核酸が含まれた。連続希釈（１、１：１０、１：１００、１：１０００）によるＨＰＶ１６プラスミド標準品及び非テンプレート対照（２μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水）を、各ｑＰＣＲ実行に使用した。ＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（＃１８５１１９６）で行い、条件は次の通りである：９５℃、５分、［（９５℃：２０秒、５５℃：３０秒）×４５サイクル］。溶融曲線は、試料を６５℃～９５℃まで０．５℃刻みで加熱し、プレートを刻みごとに５秒間読み取ることによって得た。ＨＰＶプラスミドＤＮＡ定量化分析は、［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を表す「ΔＣｔ」を使用して行った。「Ｃｔ（Ｔ７）」及び「Ｃｔ（Ｔ０）」は、それぞれ、７日目及び０日目のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。
［尿中無細胞及び細胞ＲＮＡ抽出］
尿ペレットからの全細胞ＲＮＡを、１）製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（カタログ番号．７４１３４）を使用して抽出し、３０μＬのＲＮａｓｅフリー水に溶出する、及び／又は２）以下に記載されるように、Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ３９３４）使用をして抽出した。
尿ペレットからの全細胞ＲＮＡを、１）製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（カタログ番号．７４１３４）を使用して抽出し、３０μＬのＲＮａｓｅフリー水に溶出する、及び／又は２）以下に記載されるように、Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ３９３４）使用をして抽出した。
各時点で、試料を２０分間３８００ｘｇで回転させた。ペレットを各時点で７５０μＬのＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ ＬＳ（及び２５０μＬの水）に再懸濁した。試料を５分間静置した後、－８０℃で凍結させた。試料を室温で解凍し、以下のように処理した：
１．２００μＬのクロロホルムを添加し、激しくボルテックスする。室温で２～１５分間静置する。
２．４℃で１５分間、１２，０００ｘｇで遠心分離する（水相の体積はＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ体積の約７０％である）。５００μＬの水相を新しいチューブに移す。
３．５０μＬの１０ｘ ＤＮａｓｅ緩衝液及び１μＬのＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号Ｄ９９０５Ｋ）を添加する。３７℃で１５分間インキュベートする。
４．５００μＬ（等体積）の酸フェノールクロロホルムを添加し、激しくボルテックスする。５分間静置し、続いて４℃で１０分間、１２，０００ｘｇで遠心分離する。水相を新しいチューブに移し、１μＬの２０μｇ／μＬのグリコーゲン及び５００μＬのイソプロパノールを添加する。室温で１０分間静置する。
５．４℃で８分間、１２，０００ｘｇで遠心分離する。上清を取り除き、ペレットを１ｍＬの７５％エタノールで洗浄する。試料をボルテックスし、５分間１２，０００ｘｇで遠心分離する。上清を取り除き、ペレットを５～１０分間風乾する。
６．３０μＬのＲＮａｓｅフリー水にペレットを再懸濁する。
全無細胞核酸を、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（カタログ番号５５１１４）を使用して上清から抽出し、３０～５０μＬのキット緩衝液ＡＶＥに溶出した。ＲＮＡプロファイル分析を、２１００ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで、Ｐｉｃｏ６０００ ＲＮＡ ａｓｓａｙ（カタログ番号５０６７－１５１３）を使用して行った。ｍＲＮＡ標的分析を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号４３３１１８２）からのβ－アクチン（ＡＣＴＢ：Ｈｓ００３５７３３３＿ｇ１）のＴａｑｍａｎ ｂａｓｅｄ ＲＴ－ｑＰＣＲ ａｓｓａｙを使用して行った。無細胞ＲＮＡ定量化研究については、ｃＤＮＡ合成の前に、ＤＮＡｓｅ Ｉ消化を使用して無細胞ＤＮＡ除去を行い、続いてＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４２０４）を使用して、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；カタログ番号５５１１４）に記載される指示に従い、ＲＮＡクリーンアップを行った。
［細胞、無細胞、及びＥＶ ＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲアッセイ］
製造業者のプロトコルに従い、ｃＤＮＡを、ランダムへキサマー及びＭ－ＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２８０２５－０１３）を使用して、各試料から抽出された当量のＲＮＡで調製した。β－アクチンＴａｑｍａｎアッセイは、製造業者のプロトコルに従い、Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ ｗｉｔｈ ＵＮＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４４４００３８）を用いて、２μＬのｃＤＮＡ（純粋）を使用して行い、各試料を２つ組又は３つ組のいずれかで実行した。最初に、ＡＣＴＢ ＴａｑＭａｎアッセイの効率を、血液ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡの連続希釈液を使用して試験した。ＰＣＲ反応をＢｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（カタログ番号１８５１１９６）で行い、条件は以下の通りである：５０℃、２分、９５℃：１０分、［９５℃：１５秒、６０℃：１分］×４５サイクル。ＲＮＡ安定性定量化は、［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を表す「ΔＣｔ」として表した。「Ｃｔ（Ｔ７）」及び「Ｃｔ（Ｔ０）」は、それぞれ、７日目及び０日目のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。更に、中立性（収集時の尿試料中への所与の化学物質の添加による分析物の基底濃度の変化）を評価するために、ΔＣｔ計算を［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として行い、ここで、Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）は、化学物質／安定化溶液を含む０日目の尿試料のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。
製造業者のプロトコルに従い、ｃＤＮＡを、ランダムへキサマー及びＭ－ＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２８０２５－０１３）を使用して、各試料から抽出された当量のＲＮＡで調製した。β－アクチンＴａｑｍａｎアッセイは、製造業者のプロトコルに従い、Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ ｗｉｔｈ ＵＮＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４４４００３８）を用いて、２μＬのｃＤＮＡ（純粋）を使用して行い、各試料を２つ組又は３つ組のいずれかで実行した。最初に、ＡＣＴＢ ＴａｑＭａｎアッセイの効率を、血液ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡの連続希釈液を使用して試験した。ＰＣＲ反応をＢｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（カタログ番号１８５１１９６）で行い、条件は以下の通りである：５０℃、２分、９５℃：１０分、［９５℃：１５秒、６０℃：１分］×４５サイクル。ＲＮＡ安定性定量化は、［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を表す「ΔＣｔ」として表した。「Ｃｔ（Ｔ７）」及び「Ｃｔ（Ｔ０）」は、それぞれ、７日目及び０日目のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。更に、中立性（収集時の尿試料中への所与の化学物質の添加による分析物の基底濃度の変化）を評価するために、ΔＣｔ計算を［Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）－Ｃｔ（Ｔ０ ＮＡ）］として行い、ここで、Ｃｔ（Ｔ０ Ｃｈｅｍ）は、化学物質／安定化溶液を含む０日目の尿試料のｑＰＣＲサイクル閾値を表す。
［標的β－グロビン遺伝子のＤＮＡ試料のドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）分析］
ｄｄＰＣＲについての個々の反応物は、２３μＬの最終体積中に２ｘ ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６４０３４）を含む１００ｎＭの最終プライマー濃度を含んだ。２０μＬの反応ミックスを、６５μＬのＤｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｉｌ ｆｏｒ ＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６４００６）を含むＤＧ ８カートリッジ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６４００８）に移し、ＤＧ８ガスケット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６３００９）で覆い、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒで液滴に変換した。次いで、液滴を９６ウェルプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１２００１９２５）に移し、Ｐｉｅｒｃｅ－ａｂｌｅ Ｆｏｉｌ Ｈｅａｔ Ｓｅａｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８１４０４０）で、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＰＸ１ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ Ｓｅａｌｅｒ（カタログ番号１８１４０００）を使用して、１８０℃で６秒間熱密封した。次いで、試料を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（カタログ番号１８５１１９６）において、３段階サイクリングプログラム：５分間９５℃、続いて３０秒間９５℃を５０サイクル、１分間５８℃、３０秒間７２℃に設定されたアニーリング温度、続いて５分間４℃、５分間９０℃を各１サイクル、また１２℃で保持、を使用してサイクル処理した。β－グロビンｄｄＰＣＲアッセイで使用したプライマーは、上述のβ－グロビンｑＰＣＲアッセイで使用したものと同じであった（フォワードプライマー：５′ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ ３′（配列番号３）、リバースプライマー：５′ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ ３′（配列番号４））。全てのランプ速度を２℃／秒に設定した。次いで、サイクルプレートを移し、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６４００３）で読み取り、データをＱｕａｎｔａ－Ｓｏｆｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６４０１１）で分析した。分析のために、存在量を濃度（１μＬ当たりのコピー数）として報告し、受容された液滴の合計は、所与の試料について１０，０００個を超えた。
ｄｄＰＣＲについての個々の反応物は、２３μＬの最終体積中に２ｘ ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６４０３４）を含む１００ｎＭの最終プライマー濃度を含んだ。２０μＬの反応ミックスを、６５μＬのＤｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｉｌ ｆｏｒ ＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６４００６）を含むＤＧ ８カートリッジ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６４００８）に移し、ＤＧ８ガスケット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６３００９）で覆い、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒで液滴に変換した。次いで、液滴を９６ウェルプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１２００１９２５）に移し、Ｐｉｅｒｃｅ－ａｂｌｅ Ｆｏｉｌ Ｈｅａｔ Ｓｅａｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８１４０４０）で、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＰＸ１ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ Ｓｅａｌｅｒ（カタログ番号１８１４０００）を使用して、１８０℃で６秒間熱密封した。次いで、試料を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（カタログ番号１８５１１９６）において、３段階サイクリングプログラム：５分間９５℃、続いて３０秒間９５℃を５０サイクル、１分間５８℃、３０秒間７２℃に設定されたアニーリング温度、続いて５分間４℃、５分間９０℃を各１サイクル、また１２℃で保持、を使用してサイクル処理した。β－グロビンｄｄＰＣＲアッセイで使用したプライマーは、上述のβ－グロビンｑＰＣＲアッセイで使用したものと同じであった（フォワードプライマー：５′ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ ３′（配列番号３）、リバースプライマー：５′ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ ３′（配列番号４））。全てのランプ速度を２℃／秒に設定した。次いで、サイクルプレートを移し、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６４００３）で読み取り、データをＱｕａｎｔａ－Ｓｏｆｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６４０１１）で分析した。分析のために、存在量を濃度（１μＬ当たりのコピー数）として報告し、受容された液滴の合計は、所与の試料について１０，０００個を超えた。
［尿中細胞ＤＮＡ抽出及び定量化］
尿ペレットからの全細胞ＤＮＡを、製造業者の指示に従い、ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号５１３０６）を使用して抽出し、５０μＬの溶出緩衝液又はヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）に溶出した。各時点で、試料を２０分間３８００ｘｇで回転させた。尿ペレットを抽出まで－８０℃で冷凍保存した。ペレットを室温で解凍し、２００μＬの１Ｘ ＰＢＳに再懸濁し、続いて全ＤＮＡ抽出を行った。全細胞ＤＮＡ定量化は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（商標）ｄｓＤＮＡ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｐ７５８１）を使用して行った。全ゲノムＤＮＡプロファイルを、指示に従ってＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｔａｐｅを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎで評価した。ヒトゲノムＤＮＡの標的化増幅を、約１Ｋｂのアンプリコン産物についてＧＡＰＤＨ ＰＣＲを使用して行った。ＧＡＰＤＨ ｑＰＣＲアッセイのプライマー及びＰＣＲ条件は、以下の通りである：フォワードプライマー：５’－ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＧＡ ＴＴＴ ＧＧＴ ＣＧＴ ＡＴＴ Ｇ－３’（配列番号９）、リバースプライマー：５’－ＣＴＣ ＴＣＴ ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＧＴ ＧＣＴ ＣＴＴ Ｇ－３’（配列番号１０）。９５℃、５分、［９５℃、３０秒；５６℃、３０秒；７２℃、６０秒］ｘ２５サイクル；７２℃、１０分、４℃、保持。各反応は以下のように設定した：
尿ペレットからの全細胞ＤＮＡを、製造業者の指示に従い、ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号５１３０６）を使用して抽出し、５０μＬの溶出緩衝液又はヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）に溶出した。各時点で、試料を２０分間３８００ｘｇで回転させた。尿ペレットを抽出まで－８０℃で冷凍保存した。ペレットを室温で解凍し、２００μＬの１Ｘ ＰＢＳに再懸濁し、続いて全ＤＮＡ抽出を行った。全細胞ＤＮＡ定量化は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（商標）ｄｓＤＮＡ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｐ７５８１）を使用して行った。全ゲノムＤＮＡプロファイルを、指示に従ってＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｔａｐｅを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎで評価した。ヒトゲノムＤＮＡの標的化増幅を、約１Ｋｂのアンプリコン産物についてＧＡＰＤＨ ＰＣＲを使用して行った。ＧＡＰＤＨ ｑＰＣＲアッセイのプライマー及びＰＣＲ条件は、以下の通りである：フォワードプライマー：５’－ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＧＡ ＴＴＴ ＧＧＴ ＣＧＴ ＡＴＴ Ｇ－３’（配列番号９）、リバースプライマー：５’－ＣＴＣ ＴＣＴ ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＧＴ ＧＣＴ ＣＴＴ Ｇ－３’（配列番号１０）。９５℃、５分、［９５℃、３０秒；５６℃、３０秒；７２℃、６０秒］ｘ２５サイクル；７２℃、１０分、４℃、保持。各反応は以下のように設定した：
以下の実施例において、組成物中の糖の割合は重量／体積であり、組成物中のアルカノール（例えば、メタノール又はエタノール）の割合は体積／体積であり、ホウ酸の割合は、重量／体積である。
実施例１－尿中無細胞ＤＮＡ含有量は、試料及び性別依存性である。
約２０～３０ｍＬの、朝一の最初の排泄（ＦＭＦＶ）尿を、健康な女性及び男性のドナーから尿検体カップに収集し、下流処理までアイスパック上で輸送及び保存した。尿収集の３時間以内に、各検体の４．５ｍＬのアリコートを、室温で２０分間，３，８００ｇで遠心分離した。無細胞核酸を、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号５５１１４；材料及び方法を参照）を使用して、直ちに、又は－８０℃で保存された凍結上清アリコートのいずれかから得られた上清の各４．０ｍＬから抽出した。その後、尿中無細胞ＤＮＡ（Ｕｃｆ－ＤＮＡ）濃度を、Ｐｉｃｏ－Ｇｒｅｅｎ定量化アッセイを使用して測定した。女性ドナーの平均尿中無細胞ＤＮＡ濃度は、男性の約３ｎｇ／ｍＬと比較して、約１５ｎｇ／ｍＬであった（図１を参照）。男性の尿中よりも女性の尿中の無細胞ＤＮＡの量が多く存在することは、文献でも報告されている（Ｓｔｒｅｌｅｃｋｉｅｎｅ Ｇ，Ｒｅｉｄ ＨＭ，Ａｒｎｏｌｄ Ｎ，Ｂａｕｅｒｓｃｈｌａｇ Ｄ，Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｍ．Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｉｎ ｕｒｉｎｅ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｋｉｔｓ，ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｇｅｎｄｅｒ ａｎｄ ｉｎｔｅｒ－ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２０１８，６４（５）：２２５－２３０を参照されたい）。
実施例２－ヒト無細胞ＤＮＡは、室温で保存された安定化されていない尿中で分解する。
保存剤又は安定化剤（ＮＡ）の不在下では、室温で保存された尿は、可視及び分子変化の両方を受ける。この実施例では、２０～３０ｍＬの、朝一の最初の排泄（ＦＭＦＶ）尿を健康な女性ドナーから収集し、室温で７日間保存した。この期間中、この代表的な尿試料は、細菌数（ＯＤ６００ｎｍ）の増加によって測定されるように、次第に濁った（図２Ａ）。この観察は、細菌１６Ｓ ＤＮＡのΔＣｔの劇的な減少を示した定量的な細菌１６Ｓ ｑＰＣＲアッセイ（図２Ｂ、材料及び方法を参照）によって更に裏付けられ、細菌細胞の過剰増殖及び溶解による細菌無細胞ＤＮＡ含有量の増加を示した。対照的に、β－グロビンＤＮＡのΔＣｔの劇的な増加があり、ヒト無細胞ＤＮＡ含有量の有意な減少を示した（図２Ｂ～Ｄ）。これは、β－グロビン無細胞ＤＮＡ ｑＰＣＲアッセイ（図２Ｂ、材料及び方法を参照）及びＡｇｉｌｅｎｔ ４２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ分析（図２Ｃ～Ｄの矢印を参照、材料及び方法を参照）によって測定された。０日目及び７日目の尿アリコートから抽出した無細胞ＤＮＡを比較する両方の方法は、室温で７日間後の無細胞ＤＮＡ含有量の大幅な低下を明らかに示す（図２Ｂ～Ｄ）。
実施例３－無細胞ＤＮＡのための本尿安定化組成物において異なる糖（単糖／二糖）を使用することができる。
５人の健常な男性及び女性のドナーが６０～７０ｍＬの朝一の最初の排泄（ＦＭＦＶ）尿検体を提供した。検体をアイスパック上で実験室に輸送し、そこで、１）２０ｍＬの各検体を、安定化組成物の不在下（保存されていない）で保存した、及び２）１２ｍＬの各尿検体を、異なる糖、すなわち、グルコース（Ｃｈｅｍ Ｇ）、スクロース（Ｃｈｅｍ Ｓ）、及びフルクトース（Ｃｈｅｍ Ｆ）、並びに４ｍＬの９５％エタノールを含有する４ｍＬの原液［表１（ｉ）］と混合した。この実施例では、尿と混合した後の安定化溶液の最終組成を以下に記載する［表１（ｉｉ）を参照］。両方の種類の検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。
０日目及び７日目に、４．５ｍＬの各保存されていない検体及び異なる化学物質含有検体のアリコートを、室温で２０分間、３，８００ｇで遠心分離した。遠心分離後に各検体から４．０ｍＬの上清を回収し、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、材料及び方法を参照）を使用して無細胞ＤＮＡを抽出した。２マイクロリットルの、各検体からの精製された無細胞ＤＮＡは、β－グロビンｑＰＣＲ分析においてテンプレートとして機能した（材料及び方法を参照）。図３Ａ及び３Ｂは、保存されていない検体を室温で７日間保存した後のヒト無細胞ＤＮＡ含有量の劇的な減少を示す、β－グロビンＤＮＡのΔＣｔの劇的な増加を示す。対照的に、ほぼゼロのΔＣｔ中央値によって示されるように、室温で７日後の異なる糖を含む検体において、ヒト無細胞ＤＮＡレベルに著しい変化はなかった［図３Ａ（ｉ）及び３Ｂ（ｉ）］。更に、収集時（０日目）の保存されていない（ＮＡ）試料に対して、化学物質の添加時の尿試料における無細胞ＤＮＡ含有量に著しい変化はなかった［図３Ａ（ｉｉ）及び３Ｂ（ｉｉ）］。
別の実験設定では、健常な男性及び女性のドナーが、Ｃｏｌｌｉ－ｐｅｅ（登録商標）デバイス（Ｎｏｖｏｓａｎｉｓ）を使用して、ランダムな最初の排泄（ＦＶ）尿検体を提供した。検体はアイスパック上で実験室に輸送され、そこで、男性及び女性の尿試料をプールして、男性プール検体及び女性プール検体をそれぞれ生成した。各プールした検体のアリコートを、１）安定化組成物の不在下（保存されていない）で保存した、及び２）１：０．４３の尿：化学物質比で、異なる糖［表２（ｉ）］、すなわち、グルコース（Ｃｈｅｍ Ｇ）及びフルクトース（Ｃｈｅｍ Ｆ）を含有する化学物質と混合した。この実施例では、尿と混合した後の安定化溶液の最終組成を以下に記載する［表２（ｉｉ）を参照］。全ての検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。
０日目及び７日目に、２．５ｍＬの各保存されていない検体及び異なる化学物質含有検体のアリコートを、室温で１０分間、３，０００ｇで遠心分離し、続いて０．８μｍのシリンジフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（登録商標）Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ（登録商標）、カタログ番号１６５９２、又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）－ＡＡ、カタログ番号ＳＬＡＡ０３３ＳＢ）を使用して濾過した。２．０ｍＬの事前に清澄された上清を、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、材料及び方法を参照）を使用して、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）抽出に使用した。図３Ｃ（ｉ）は、保存されていない検体を室温で７日間保存した後のヒト無細胞ＤＮＡ含有量の劇的な減少を示す、β－グロビンＤＮＡのΔＣｔ（中央値：＋５．８）の劇的な増加を示す。対照的に、β－グロビンＤＮＡレベルのΔＣｔに著しい変化はなく、室温で７日後の化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）及び化学物質Ｇ（Ｃｈｅｍ Ｇ）含有検体におけるヒト無細胞ＤＮＡ含有量に変化がないことを示唆した［図３Ｃ（ｉ）］。更に、収集時（０日目）の保存されていない（ＮＡ）試料に対して、化学物質の添加時の尿試料における無細胞ＤＮＡ含有量に著しい変化はなかった［図３Ｃ（ｉｉ）］。
二糖スクロースを含む本組成物は、溶液の粘度が非常に高く、成分の不適切な混合をもたらすため、調製が困難である。高粘度は更に、混合が困難なため、検体に安定化溶液を不適切に添加することにつながる可能性がある。したがって、安定化溶液の調製及び試験におけるこれらの基本的な複雑な事態を回避するために、無細胞ＤＮＡ含有量の十分な安定化を維持しながら、単糖含有組成物が効果的であることに焦点を当てることにした（図３Ｂ及び３Ｃ）。全体的に、試料の加工性のため、本発明には、二糖よりも単糖類が好ましい。
実施例４：糖、アルコール、緩衝液、及び低ｐＨの存在は、本組成物の安定化効果を調節する。
６人の健常な女性ドナーが、３０ｍＬの朝一の第１の排泄尿（ＦＭＦＶ）検体を提供し、それらの尿試料を一緒にプールして、２つの異なるプール尿検体を生成した：１）１５ｍＬの各プール尿検体を、安定化組成物の不在下（ＮＡ）で保存した、並びに２）１１ｍＬの各プール尿検体を、３ｍＬの原液（本組成物の異なる反復を伴う；以下の表３）及び表４に記載される１ｍＬの９５％エタノール／メタノールと混合した。プールした尿と混合した後の最終組成は、以下の表５に記載される。全ての検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。比較のために、２５ｍＬのプールした尿を、「Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｕｒｉｎｅ Ｐｒｅｓｅｒｖｅ」（カタログ番号２３０２１６）として市販されている、５ｍＬのＳｔｒｅｃｋの尿固定剤（参照組成物）と混合し、室温で少なくとも７日間保存した。この参照組成物は、ホルムアルデヒド放出剤イミダゾリジニル尿素、並びにＫ３ ＥＤＴＡ及びグリシンを含む。
０日目及び７日目に、４．５ｍＬの各保存されていない検体及び化学物質含有プール検体のアリコートを、室温で２０分間、３，８００ｇで遠心分離した。遠心分離後に４．０ｍＬの上清を各検体から回収し、－８０℃で保存した。安定化組成物の有無にかかわらず無細胞ＤＮＡの安定性を評価するために、０日目及び７日目の保存されていない尿試料及び異なる化学物質含有尿試料の両方からの凍結上清を、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、材料及び方法を参照）を使用して無細胞ＤＮＡ抽出に供した。２マイクロリットルの、各検体からの精製された無細胞ＤＮＡは、β－グロビンｑＰＣＲ分析においてテンプレートとして機能した（材料及び方法を参照）。
図４（Ａ及びＢ）は、保存されていない検体を室温で７日間保存した後のヒト無細胞ＤＮＡ含有量の劇的な減少を示す、β－グロビンＤＮＡのΔＣｔの劇的な増加を示す（ＮＡ Ｔ７、図４Ａ及び４Ｂ）。プール尿検体のうちの１つを使用して、本組成物の安定化効率に対する異なるアルコール（エタノール及びメタノール）の効果を調査した。図４Ａは、本組成物中のエタノールがメタノールで置換されてもよいことを示唆しているが、メタノールは、使用される濃度において毒性であり、エタノールと比較して、家庭での収集には理想的ではない。更に、本組成物（Ｃｈｅｍ Ｆ，ｐＨ４．７～５．０）を含む尿検体中のヒト無細胞ＤＮＡは、室温で７日後の「Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｕｒｉｎｅ Ｐｒｅｓｅｒｖｅ」として知られるＳｔｒｅｃｋの尿固定剤に類似していることが見出され（図４Ｂ）、本組成物は、本組成物及び参照組成物の両方の同様のΔＣｔ値によって示されるように、この参照組成物と同様に有効であることが示唆された。エタノール、緩衝塩（例えば、酢酸ナトリウム）、糖、エタノール＋糖、及びエタノール＋塩のいずれかの除去、並びにｐＨの上昇（≧５．５）によって、ΔＣｔ値の減少によって示されるように、化学物質Ｆ組成物の無細胞ＤＮＡ含有量を保存する効果が低下した。ΔＣｔのこの減少は、エタノール（ｐＨ４．７～５．０）を含む化学物質Ｆの完全な組成物と比較した場合、異なる化学反復において室温で７日間維持された尿試料中の無細胞ＤＮＡ含有量の増加を示唆する（図４Ｂ）。最後に、このデータは、本組成物の理想的なｐＨ範囲が４．７～５．０（＋／－０．２）であることを示す。
実施例５：室温で尿中の核酸を保存するための安定化組成物。
合計１１人の健常なドナー（男性及び女性）が４０～６０ｍＬの朝一の最初の排泄（ＦＭＦＶ）尿検体を提供した。検体はアイスパック上で実験室に輸送され、そこで、ｉ）２０ｍＬの各検体を、安定化組成物の不在下（保存されていない）で保存し、２）１２ｍＬの各尿検体を、安定化溶液［４ｍＬの原液；表６（ｉ）及び４ｍＬの９５％エタノール］と混合した。この実施例では、尿と混合した後の安定化溶液の最終組成を以下に記載する［表６（ｉｉ）を参照］。両方の種類の検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。０日目及び７日目に、４．５ｍＬの各保存されていない検体及び安定化溶液を含む検体のアリコートを、室温で２０分間、３，８００ｇで遠心分離した。遠心分離後に各検体から４．０ｍＬの上清を回収し、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、材料及び方法を参照）を使用して無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を抽出した。２マイクロリットルの、各検体からの精製されたｃｆＤＮＡは、β－グロビンｑＰＣＲ分析においてテンプレートとして機能した（材料及び方法を参照）。図５Ａは、保存されていない検体を室温で７日間保存した後のヒト無細胞ＤＮＡ含有量の劇的な減少を示す、β－グロビンＤＮＡのΔＣｔの劇的な増加を図示する（図５Ａ）。対照的に、β－グロビンＤＮＡレベルのΔＣｔに著しい変化はなく、室温で７日後のＣｈｅｍ Ｆ含有検体におけるヒト無細胞ＤＮＡレベルに変化がないことを示唆した［図５Ａ（ｉ）］。更に、収集時（０日目）の保存されていない（ＮＡ）試料に対して、化学物質の添加時の尿試料における無細胞ＤＮＡ含有量に著しい変化はなかった［図５Ａ（ｉｉ）］。ＨＳＤ５０００ ｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した代表的なＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎプロファイル分析（図５Ｂ）は、保存されていない０日目のアリコート、化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）０日目、及び７日目のアリコートにおける無細胞核酸の存在を示し、無細胞核酸は、保存されていない７日目アリコートにおいて分解された。
別の実験設定では、男性及び女性の両方の健常なドナーからの尿試料をプールして、男性及び女性プール尿検体を生成した。各検体のアリコートを、１）安定化組成物の不在下で（保存されていない）、２）１：０．４３の比で原液［表７（ｉ）］と混合して、及び３）Ｎｏｒｇｅｎ尿収集及び保存チューブ（カタログ１８１１１）で混合して保存した。この実施例では、尿と混合した後の安定化溶液「化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）」の最終組成を以下に記載する［表７（ｉｉ）を参照］。全ての検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。０日目及び７日目に、２．５ｍＬの各保存されていない尿検体及び安定化溶液含有尿検体のアリコートを、室温で１０分間、３，０００ｇで遠心分離し、続いて０．８μｍのシリンジフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（登録商標）Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ（登録商標）、カタログ番号１６５９２、又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）－ＡＡ、カタログ番号ＳＬＡＡ０３３ＳＢ）を行った。遠心分離後に各検体から２．０ｍＬの上清を回収し、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、材料及び方法を参照）を使用して無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を抽出した。図５Ｃ（ｉ）は、保存されていない検体を室温で７日間保存した後のヒト無細胞ＤＮＡ含有量の劇的な減少を示す、β－グロビンＤＮＡのΔＣｔの劇的な増加を図示する［図５Ｃ（ｉ）］。対照的に、β－グロビンＤＮＡレベルのΔＣｔに著しい変化はなく、室温で７日後の化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）含有検体におけるヒト無細胞ＤＮＡレベルに変化がないことを示唆した［図５Ｃ（ｉ）］。一方で、Ｎｏｒｇｅｎ尿保存剤を含有する試料は、検体を室温で７日間保存した後のヒト無細胞ＤＮＡ含有量の劇的な減少を示す、β－グロビンＤＮＡのΔＣｔの顕著な増加を示した（図５Ｃ（ｉ））］。更に、収集時（０日目）の保存されていない（ＮＡ）試料に対して、化学物質の添加時の尿試料における無細胞ＤＮＡ含有量に著しい変化はなかった［図５Ｃ（ｉｉ）］。
別の実験設定では、Ｃｏｌｌｉ－ｐｅｅ（登録商標）デバイス（Ｎｏｖｏｓａｎｉｓ）を使用して収集した健常な男性及び女性のドナーからの最初の排泄尿試料をプールして、それぞれ男性及び女性のプール尿検体を生成した。各検体のアリコートを、１）安定化組成物の不在下で（保存されていない）、２）１：０．４３の比で原液（表７ｉ）と混合して、及び３）Ｎｏｒｇｅｎ尿収集及び保存チューブ（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ、カタログ１８１１１）で混合して保存した。この実施例では、尿と混合した後の安定化溶液の最終組成を以下に記載する（表７（ｉｉ）を参照）。全ての検体を少なくとも１４日間室温（２３±３℃）で保存した。０日目及び１４日目に、２．５ｍＬの各保存されていない尿検体及び安定化溶液含有尿検体のアリコートを、室温で１０分間、３，０００ｇで遠心分離し、続いて０．８μｍのシリンジフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（登録商標）Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ（登録商標）、カタログ番号１６５９２、又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）－ＡＡ、カタログ番号ＳＬＡＡ０３３ＳＢ）を行った。遠心分離後に各検体から２．０ｍＬの上清を回収し、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、材料及び方法を参照）を使用して無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を抽出した。図５Ｄ（ｉ）及び５Ｅ（ｉ）は、保存されていない検体を室温で１４日間保存した後のヒト無細胞ＤＮＡ含有量の劇的な減少を示す、β－グロビンＤＮＡのΔＣｔの劇的な増加を示す。対照的に、β－グロビンＤＮＡレベルのΔＣｔに著しい変化はなく、室温で１４日後のＣｈｅｍ Ｆ含有検体におけるヒト無細胞ＤＮＡレベルに変化がないことを示唆した［図５Ｄ（ｉ）、５Ｅ（ｉ）］。一方、Ｎｏｒｇｅｎ尿保存剤を含有する試料は、室温で１４日間保管した場合、それぞれ、女性及び男性の尿検体においてヒト無細胞ＤＮＡ含有量の増加又は減少を示す、β－グロビンのΔＣｔの減少［図５Ｄ（ｉ）］又はβ－グロビンＤＮＡのΔＣｔの増加［図５Ｅ（ｉ）］のいずれかを示した。更に、Ｎｏｒｇｅｎ尿保存剤含有女性尿試料は、添加時（０日目）の化学物質Ｆ試料と比較したとき、中立性の変化を示した［図５Ｄ（ｉｉ）］。
実施例６：安定化組成物は、室温で７日間前立腺がん細胞の完全性を維持する。
男性ドナーからの尿は、正常なターンオーバー中に前立腺から脱落した結果として、剥離した前立腺上皮細胞を含み得る。更に、尿中へのこの分泌は、特に前立腺がん患者において前立腺マッサージを行うことによる前立腺の物理的操作によっても増加し得る。したがって、安定化溶液含有尿試料中の細胞の安定性及び無傷性（ｉｎｔａｃｔｎｅｓｓ）を試験するために、前立腺がん細胞を目的の細胞型の１つとして使用した。
経時的な無細胞ＤＮＡ含有量を使用して、安定化組成物である化学物質Ｆの存在下で細胞の完全性を測定した。１つの実験設定［実施例６（ｉ）］では、朝一の最初の排泄尿（ＦＭＦＶ）検体を、３人の健常な男性及び３人の女性ドナーからプールして、１つの女性プール（ＦＰ）尿検体及び１つの男性プール（ＭＰ）尿検体を生成した。男性尿とともに、女性尿試料もこの研究に含めて、より濃縮された、高バイオマス含有尿マトリックスにおけるがん細胞の安定性を試験した。プールした検体を、室温で１０～２０分間、３，０００ｇで遠心分離し、続いて０．２ミクロンフィルタを使用して得られた上清を濾過した。これらの事前に清澄化された無細胞尿検体を等分し、次いで前立腺がん細胞（ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７４０（商標））をスパイク（Ｓ）した。
スパイクされた前立腺がん細胞の安定性に対する化学物質Ｆの濃度依存的効果を試験するために、様々な量（ｍＬ）の原液（表８を参照）及び固定量の９５％エタノールを添加して、スパイクされた前立腺がん細胞を含有する事前に清澄化された尿と混合した後、化学物質Ｆにおける様々な構成要素の異なる最終濃度を達成した（表９を参照）。原液及びエタノールを、表１０に記載されるように、スパイクされた前立腺がん細胞を含有する事前に清澄化された尿と混合した。
別の実験設定［実施例（６ｉｉ）］では、朝一の最初の排泄尿（ＦＭＦＶ）検体を、３人の健常な女性からプールして、１つの女性プール（ＦＰ）尿検体を生成した。プールした検体を、室温で１０～２０分間、３，０００ｇで遠心分離し、続いて０．２ミクロンフィルタを使用して得られた上清を濾過した。これらの事前に清澄化された無細胞尿検体を等分し、次いで前立腺がん細胞（ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７４０（商標））をスパイク（Ｓ）した。この実験設定では、９５％エタノールの量（ｍＬ）も、表１１に指定されるように、スパイクされた前立腺がん細胞を含有する事前に清澄化された尿と混合した後、化学物質Ｆにおける構成要素の異なる最終濃度を達成するために、原液（ｍＬ）の量（表８）の変動とともに変化した。原液及びエタノールの量を、表１２に記載されるように、スパイクされた前立腺がん細胞を含有する事前に清澄化された尿と混合した。
両方の実験設定において、検体を、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、材料及び方法を参照）を使用して、無細胞ＤＮＡ抽出の３０～６０分（０日目）又は７日前に本発明の組成物とともにインキュベートした。抽出されたヒト無細胞ＤＮＡを、β－グロビンｑＰＣＲアッセイ（図６（ｉ‐ｉ）（Ａ及びＢ）及び図６（ｉｉ）Ａ、材料及び方法を参照）を使用して定量化し、０日目の保存されていない尿（ＮＡ）に正規化した。
図６（ｉ‐ｉ）、図６（ｉ‐ｉｉ）は、スパイクされたヒト前立腺細胞が、濃度依存的様式で、比較的一定量のエタノールを含む化学物質Ｆの存在下でゲノムＤＮＡを上清に漏出させなかったことを示唆する。化学物質Ｆの添加なし（ＮＡ）では、ΔＣｔの著しい増加をもたらし、したがって、０．５Ｘ及び０．８Ｘ化学物質Ｆにおける著しい変化と比較して、男性及び女性のプール検体の両方における無細胞ＤＮＡ含有量［図６（ｉ‐ｉ）Ａ及びＢ］の減少を示した。一方、０．２５Ｘ濃度は、ＭＰ尿試料においてΔＣｔの減少（ゲノムＤＮＡの漏出につながる細胞安定性の不全に起因するｃｆＤＮＡ含有量の増加を意味する）、又はＦＰ尿試料においてΔＣｔの増加（ｃｆＤＮＡのより多くの分解につながる化学安定性の不全に起因するｃｆＤＮＡ含有量の減少を意味する）のいずれかを示した。この差異は、尿マトリックスに依存する可能性がある。女性の尿試料において高いバイオマスが存在するため、０．２５Ｘの強度で希釈された構成要素の濃度は、尿ＤＮａｓｅからの無細胞ＤＮＡの分解を阻害することができず、したがって、分解速度は、保存速度よりも速く、全体的なｃｆＤＮＡ含有量損失につながる。一方、男性の尿マトリックスは低いバイオマスを含有するため、０．２５Ｘの強度での化学構成要素の濃度は、依然として尿ＤＮａｓｅからの無細胞ＤＮＡ分解を阻害することができ、したがって、保存速度は、分解速度よりも速く、全体的な無細胞ＤＮＡ含有量の増加につながる。全体的に、ＦＰ及びＭＰ尿試料の両方において、無細胞ＤＮＡプロファイル及び細胞安定性に対する化学物質Ｆの濃度依存的効果が存在する。ＦＰ検体の代表的なｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎプロファイル分析（図６（ｉ‐ｉｉ）Ｃ）もまた、０．８Ｘ及び０．５Ｘ希釈化学物質Ｆと比較した場合、０日目（図６（ｉ‐ｉｉ）Ｃの黒色トレース）と７日目（図６（ｉ‐ｉｉ）Ｃの灰色トレース）との間に化学物質Ｆ（ＮＡ）及び０．２５Ｘ化学物質Ｆの不在下の無細胞核酸プロファイルにおいて劇的な差異を示した（図６（ｉ‐ｉｉ）Ｃ）。
図６（ｉｉ）Ａはまた、スパイクされた前立腺がん細胞が、様々な量のエタノールを含む化学物質Ｆの存在下で、１Ｘが最も効果的であり、０．２５Ｘが最も効果的ではない濃度依存的様式で、ゲノムＤＮＡを上清に漏出させなかったことも示唆する。０．２５Ｘ化学物質Ｆは、０日目のΔＣｔの初期減少、つまりｃｆＤＮＡ含量の増加、続いてΔＣｔの増加をもたらし、７日目の無細胞ＤＮＡ含有量の減少を示唆した（図６（ｉｉ）Ａ）。β－グロビンｑＰＣＲアッセイの結果（図６（ｉｉ）Ａ）は、β－グロビンドロップレットデジタルＰＣＲアッセイによって更に裏付けられ（図６（ｉｉ）Ｂ）、これはまた、１Ｘ化学物質Ｆ溶液が、単位体積当たりのβ－グロビン遺伝子のコピー数を維持する一方で、０．２５Ｘ化学物質Ｆは、０日目の初期増加、続いて、スパイクされた尿検体における室温で７日後の単位体積当たりのβ－グロビン遺伝子のコピー数の著しい減少をもたらしたことを明らかにした（図６（ｉｉ）Ｂ）。全体として、データは、本発明の組成物が、室温で少なくとも７日間、濃度依存的様式で前立腺がん細胞の完全性を維持することを示唆する。
実施例７：本発明の組成物は、事前に清澄化された尿検体にスパイクされ、室温で７日間保存された有核白血球の完全性を維持する。
大半の健常な個体の体液（例えば、血液及び尿）は、通常、相当量の無細胞核酸を含有しないため、無細胞核酸の量の増加は、通常、健康上の問題（又は妊娠）を示す。しかしながら、血液試料を患者から収集した後、細胞溶解が始まり、血液細胞内の核酸が無細胞核酸と混合されることにより、無細胞核酸の単離及び区別が困難になる。加えて、これらの無細胞核酸は、インビトロでヌクレアーゼ開始分解されやすい。その結果、無細胞核酸の存在がもはや正確には確認できないため、無細胞核酸の疾患兆候能力は低下し得る。理想的には、生体試料内の細胞溶解及び無細胞核酸分解の防止により、無細胞核酸が正確に測定され、任意の疾患リスクの存在が検出されることが可能となる。
保存剤を使用して、生体試料又は検体中の細胞を固定し、細胞核酸の細胞外空間への漏出を防止することができる。無細胞核酸が単離された後、これらは、多数のがんを含むがこれらに限定されない疾患状態の存在、不在、又は重症度を特定するために試験され得る。世界中の病理学コレクションは、集団及び疾患を研究するための遺伝物質のアーカイブを示す。しかしながら、保存目的のために、これらのコレクションの大部分は、生体分子の架橋をもたらす処理であるホルマリン／ホルムアルデヒド含有溶液中に固定されている。ホルムアルデヒド放出剤、ホルムアルデヒド供与体、又はホルムアルデヒド放出保存剤は、ホルムアルデヒドをゆっくりと放出する化学化合物である。注目すべきことに、凍結組織から単離したＤＮＡと比較した場合、ホルマリン固定組織は、高い頻度の非再現性配列変化を示す（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ Ｍ，Ｓｅｄｍａｋ Ｄ，Ｊｅｗｅｌｌ Ｓ（２００２）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｉｘａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６１（６）：１９６１－１９７１）。最も一般的に使用される固定剤の主成分であるホルムアルデヒドは、ＤＮＡ－タンパク質及びＲＮＡ－タンパク質架橋の生成につながる。更に、固定溶液が緩衝されていない状況では、核酸が断片化する。上記の両方が、ＰＣＲに基づく分析のための課題を提供する（Ｇｉｌｂｅｒｔ ＭＴＰ，Ｈａｓｅｌｋｏｒｎ Ｔ，Ｂｕｎｃｅ Ｍ，Ｓａｎｃｈｅｚ ＪＪ，Ｌｕｃａｓ ＳＢ，Ｊｅｗｅｌｌ ＬＤ，Ｖａｎ Ｍａｒｃｋ Ｅ，Ｗｏｒｏｂｅｙ Ｍ（２００７）Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ ｆｉｘｅｄ，ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ－Ｗｈｉｃｈ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｒｅ ｕｓｅｆｕｌ ｗｈｅｎ？ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（６）：ｅ５３７．Ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００００５３７、Ｗｏｎｇ ＳＱ，Ｌｉ Ｊ，Ｔａｎ ＡＹ－Ｃ，Ｖｅｄｕｒｕｒｕ Ｒ，Ｐａｎｇ Ｊ－ＭＢ，Ｄｏ Ｈ，Ｅｌｌｕｌ Ｊ，Ｄｏｉｇ Ｋ，Ｂｅｌｌ Ａ，ＭａｃＡｒｔｈｕｒ ＧＡ，Ｆｏｘ ＳＢ，Ｔｈｏｍａｓ ＤＭ，Ｆｅｌｌｏｗｅｓ Ａ，Ｐａｒｉｓｏｔ ＪＰ，Ｄｏｂｒｏｖｉｃ Ａ（２０１４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｒｔｉｆａｃｔｓ ｉｎ ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ ｔｕｍｏｕｒｓ ｔｅｓｔｅｄ ｆｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｏｔｓｐｏｔ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７：２３．Ｄｏｉ：１０．１１８６／１７５５－８７９４－７－２３）。具体的には、このＤＮＡへの化学的損傷は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの忠実度及びＰＣＲ増幅効率を低減する（Ｓｉｋｏｒｓｋｙ ＪＡ，Ｐｒｉｍｅｒａｎｏ ＤＡ，Ｆｅｎｇｅｒ ＴＷ，Ｄｅｎｖｉｒ Ｊ（２００７）ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｄｕｃｅｓ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ａｎｄ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３５５（２）：４３１－４３７）。したがって、ホルマリン／ホルムアルデヒド系固定剤は、分子分析には理想的ではない。
この実施例では、尿試料にスパイクされた、単離された白血球の細胞安定性を、ＳｔｒｅｃｋのＣｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｕｒｉｎｅ Ｐｒｅｓｅｒｖｅ中のホルムアルデヒド放出保存剤と比較して（実施例４に記載されるように）、本発明の保存剤の存在下で評価した。赤血球の選択的溶解後、１ｍＬの全血から白血球を調製した。ペレット化して洗浄した白血球を尿試料にスパイクし、ｃｆＤＮＡ含有量を使用して、白血球の安定性／無傷性を測定した。女性及び男性のドナーからのＦＭＦＶ尿試料を一緒にプールして、それぞれ、２つの女性及び２つの男性プール尿試料を生成した。試料を、１０～２０分間、３，０００ｇで遠心分離し、続いて０．２ミクロンフィルタを使用して上清を濾過することによって、「事前に清澄化した」。事前に清澄化された尿試料を等分し、白血球をスパイクし、続いて、表１３（以下を参照）に言及される最終濃度の本化学物質、又はＳｔｒｅｃｋのＣｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｕｒｉｎｅ Ｐｒｅｓｅｒｖｅを添加した。有核白血球をスパイクした、事前に清澄化された尿試料に添加された原液（表１４）及びエタノールの量を表１５に記載する（以下を参照）。製造業者のプロトコルに従い、ＱｉａＡｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、ｃｆＤＮＡ抽出の３０～６０分（０日目）又は７日前に、試料を室温でインキュベートした。抽出したｃｆＤＮＡを、β－グロビンｑＰＣＲアッセイを使用して定量化した（材料及び方法を参照）。
データ（図７を参照）は、スパイクされた白血球が、本発明の組成物である化学物質Ｆの存在下で、室温で７日後、ΔＣｔの中央値がほぼゼロで、ゲノムＤＮＡを上清に漏出させなかったことを示唆し、ｃｆＤＮＡの保存、並びに経時的な細胞の安定性及び完全性を示唆する。本発明の組成物は、ＤＮＡを架橋するリスクなしに、室温でｃｆＤＮＡを安定化する点において、Ｓｔｒｅｃｋのホルムアルデヒド放出化学物質と機能的に同等である。
実施例８：本組成物は、女性プール及び男性プール尿試料の両方において、室温で７日間、ＤＮＡメチル化状態を維持する。
ＤＮＡメチル化は、メチル基がＤＮＡ分子に付加されるプロセスであり、遺伝子発現を制御するために細胞が使用するいくつかのエピジェネティック機構のうちの１つである。これは、遺伝子発現、胚発生、細胞増殖、分化、及び染色体安定性などの多くの生物学的プロセスにおいて極めて重要な役割を果たす。異常なＤＮＡメチル化は、しばしば、がんなどの疾患の発生をもたらすＤＮＡ恒常性の喪失及びゲノム不安定性に関連する（Ｙ Ｌｉ，ＴＯ Ｔｏｌｌｅｆｓｂｏｌ（２０１１）ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７９１：１１－２１）。
理想的な尿保存溶液は、エピジェネティックバイオマーカーとしてのＤＮＡメチル化を伴う研究において、ＤＮＡのメチル化状態を維持しなければならない。したがって、ＤＮＡメチル化状態に対する化学物質Ｆの効果を調べるために、２５個のＣＣＧＧ部位を含有するｐＧＬ３－ｂａｓｉｃプラスミドを使用して、インビトロＤＮＡメチル化アッセイを行った。このアッセイは、材料及び方法のセクションに記載されているように、以下のステップを伴った。１）プラスミドのインビトロメチル化、続いて、制限エンドヌクレアーゼ消化を使用したメチル化の確認（図８Ａ）。２）対照１Ｘ ＴＥ緩衝液又は化学物質Ｆ（１Ｘ）でインキュベートしたメチル化プラスミドの亜硫酸水素塩処理（以下の表１６を参照）、続いて、材料及び方法のセクションに記載されるプライマーを使用したメチル化プラスミドの精製及びＰＣＲ増幅。尿試料に添加された原液（表１７）及び９５％エタノールの量を表１８に記載する。１Ｘ ＴＥ緩衝液、並びに化学物質Ｆ溶液中でインキュベートされたメチル化プラスミドの約２７８塩基対ＰＣＲ産物の存在は（図８Ｂ及び８Ｃ）、化学物質Ｆで処理された女性プール（ＦＰ）及び男性プール（ＭＰ）尿試料の両方におけるＤＮＡのメチル化状態が、室温で７日間維持されたことを示唆する。
実施例９：本発明の組成物は、室温で７日間保存した後の朝一の最初の排泄尿試料中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を保存する。
子宮頸がんは、子宮頸がんとの関連性に応じて、高リスク及び低リスクとして分類されるある特定の種類の性器ＨＰＶによる性的獲得感染によって引き起こされる（Ｍｕｎｏｚ Ｎ，Ｂｏｓｃｈ ＦＸ，ｄｅ Ｓａｎｊｏｓｅ Ｓ，Ｈｅｒｒｅｒｏ Ｒ，Ｃａｓｔｅｌｌｓａｑｕｅ Ｘ，Ｓｈａｈ ＫＶ，Ｓｎｉｊｄｅｒｓ ＰＪ，Ｍｅｉｊｅｒ ＣＪ（２００３）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８（６）：５１８－５２７．Ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ０２１６４１）。ＨＰＶ １６、１８、３１、３３、３５、４５、５２、５８、３９、５１、５６、及び５９は、高リスクＨＰＶ遺伝子型として分類されており（Ｂｏｕｖａｒｄ Ｖ，Ｂａａｎ Ｒ，Ｓｔｒａｉｆ Ｋ，Ｇｒｏｓｓｅ Ｙ，Ｓｅｃｒｅｔａｎ Ｂ，Ｅｌ Ｇｈｉｓｓａｓｓｉ Ｆ，Ｂｅｎｂｒａｈｉｍ－Ｔａｌｌａａ Ｌ，Ｇｕｈａ Ｎ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃ，Ｇａｌｉｃｈｅｔ Ｌ，Ｃｏｇｌｉａｎｏ Ｖ（２００９）Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ－Ｐａｒｔ Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０：３２１－３２２）、このうち、２つのＨＰＶ型（１６及び１８）が、ＷＨＯによると、子宮頸がん及び前がん子宮頸部病変の主な原因（７０％）である。
非侵襲的である尿は、ＨＰＶ検出に関する文献に基づいて、子宮頸部検体におけるＨＰＶ検出の単純で実現可能な代替物を提供する（Ｖｏｒｓｔｅｒｓ，Ｐ Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ，Ｇ Ｃｌｉｆｆｏｒｄ（２０１４）Ｕｒｉｎｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ＨＰＶ：ｒａｔｉｏｎａｌｅ ｆｏｒ ｕｓｉｎｇ ｆｉｒｓｔ ｖｏｉｄ．ＢＭＪ ３４９：ｇ６２５２、Ｂｅｒｎａｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃｏｂａｓ ４８００ ＨＰＶ ｔｅｓｔ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１（２０１４）５４８－５５２、Ｅｎｅｒｌｙ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ２０１３：５ ６７－７９）。この研究では、外因性ＨＰＶ環状ＤＮＡ（ＨＰＶ１６）をスパイクした尿の安定性に対する本組成物の効果を評価した。この系は、ＨＰＶ１６感染患者の尿試料中の保護された（頸部細胞内及び／又は宿主タンパク質で覆われた粒子）、並びに保護されていない状態の両方において存在するであろう内因性ウイルス粒子の混合集団と比較して最も困難なシナリオ（尿空間／マトリックス中に浮遊する保護されていない環状ＤＮＡ）を提示する。
健常な男性及び女性のドナーが、朝一の最初の排泄（ＦＭＦＶ）尿検体を提供し、これらは、アイスパック上で実験室に輸送され、一緒にプールして、２つの男性及び２つの女性プール尿試料を生成した。精製されたＨＰＶ１６プラスミドＤＮＡ（材料及び方法を参照）を、本発明の組成物である化学物質Ｆ（ｐＨ４．７～５．０）の有無にかかわらず、１～１０ｎｇ／ｍＬの濃度で、約１ｍＬのプールされたＦＭＦＶ尿試料にスパイクし、最大７日間、室温で保存した。尿試料と組み合わせた後の安定化組成物「化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）」の構成要素の最終濃度は、表１９（以下）に記載される。０日目及び７日目に、ＨＰＶ１６プラスミドスパイクした尿試料の各々の２００μＬのアリコートを、製造業者のプロトコルに従い、ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔを使用して全ＤＮＡ抽出のために処理した。１００μＬのキット溶出緩衝液を使用してＤＮＡを溶出した。抽出したＤＮＡを更に、ＨＰＶ１６プラスミド骨格上のアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）を使用したＨＰＶ１６プラスミドＤＮＡ定量化のためのｑＰＣＲアッセイに供した。細菌ＤＮＡを、１６Ｓ ｑＰＣＲアッセイを使用して定量化した（材料及び方法を参照）。
室温で７日後、本発明の組成物は、ΔＣｔ中央値の顕著な増加を示した保存されていない検体とは異なり、保存された尿検体におけるΔＣｔ中央値がゼロに近いことによって示されるように、ＦＭＦＶ尿試料における外因性スパイクインＨＰＶ１６プラスミドＤＮＡを安定化した（図９Ａ）。加えて、本発明の組成物は、７日間の室温での保存後の細菌ＤＮＡ含有量の増加を示唆するΔＣｔの中央値の顕著な減少を示した保存されていない検体とは異なり、ΔＣｔの中央値がゼロに近いことによって示されるように、ＦＭＦＶ尿試料中の細菌ＤＮＡの増加を防止した（図９Ｂ）。尿試料中のスパイクされたＨＰＶ１６ ＤＮＡから得られた安定性結果は、患者試料中に存在する内因性ＨＰＶ１６粒子の安定性に外挿することができる。
実施例１０：室温での尿中の細胞外小胞（ＥＶ）ＲＮＡの保存のための安定化組成物。
試料の種類として非侵襲的である尿は、液体生検目的で使用される場合、血液よりも明らかな利点がある。尿は前立腺分泌物を含み、したがって、前立腺がんの検出及び監視のための潜在的な貴重な供給源となる。前立腺がんは、男性におけるがん関連死亡の第２の主要原因であり、世界中で最も一般的に診断される男性の悪性腫瘍であり、２０１２年には１１００万を超える症例が記録された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ／）（ＯＥ Ｂｒｙｚｇｕｎｏｖａ，ＭＭ Ｚａｒｉｐｏｖ，ＴＥ Ｓｋｖｏｒｔｓｏｖａ，ＥＡ Ｌｅｋｃｈｎｏｖ，ＡＥ Ｇｒｉｇｏｒ’ｅｖａ，ＩＡ Ｚａｐｏｒｏｚｈｃｈｅｎｋｏ，ＥＡ Ｍｏｒｏｚｋｉｎ，ＥＩ Ｒｙａｂｃｈｉｋｏｖａ，ＹＢ Ｙｕｒｃｈｅｎｋｏ，ＶＥ Ｖｏｉｔｓｉｔｓｋｉｙ，ＰＰ Ｌａｋｔｉｏｎｏｖ（２０１６）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｕｒｉｎｅ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１（６）：ｅ０１５７５６６．Ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５７５６６）。
最もよく特徴付けられた前立腺がんの尿バイオマーカーは、前立腺がんにおける発現の増加を伴う、ＰＣＡ３（ＤＤ３）として知られる非コードＥＶ ＲＮＡである（ＭＪ Ｂｕｓｓｅｍａｋｅｒｓ，Ａ ｖａｎ Ｂｏｋｈｏｖｅｎ，ＧＷ Ｖｅｒｈａｅｇｈ，ＦＰ Ｓｍｉｔ，ＨＦＭ Ｋａｒｔｈａｕｓ，ＪＡ Ｓｃｈａｌｋｅｎ，ＦＭＪ Ｄｅｂｒｕｙｎｅ，Ｎ Ｒｕ，ＷＢ Ｉｓａａｃｓ（１９９９）ＤＤ３：ａ ｎｅｗ ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ，ｈｉｇｈｌｙ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：５９７５－５９７９、ＫＬ Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，ＤＰａｔｉｌ，ＫＪＳ Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｇ Ｌｅｅ，Ｋ Ｗｅｈｒｍｅｙｅｒ，Ｍ Ｔｏｒｌａｋ，Ｊ Ｃｌａｒｋ，ＣＳ Ｃｏｏｐｅｒ，ＣＳ Ｍｏｒｅｎｏ，ＭＧ Ｓａｎｄａ（２０１８）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｓｔ－ＤＲＥ ｕｒｉｎｅ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ７７（９）：９９０－９９９．Ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏｓ．２３３５５）。ＥｘｏＤｘ前立腺試験（Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）も、高悪性度前立腺がんの予測のための尿中エクソソームＲＮＡ含有量に基づいている（Ｊ ＭｃＫｉｅｒｎａｎ，ＭＪ Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｖ Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｓ Ｂｅｎｔｉｎｋ，Ｍ Ｎｏｅｒｈｏｌｍ，Ｓ Ｂｅｌｚｅｒ，Ｊ Ｓｋｏｇ，ＭＷ Ｋａｔｔａｎ，Ａ Ｐａｒｔｉｎ，Ｇ Ａｎｄｒｉｏｌｅ，Ｇ Ｂｒｏｗｎ，ＪＴ Ｗｅｉ，ＩＭ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｐ ＣＶａｒｒｏｌｌ（２０１６）Ａ ｎｏｖｅｌ ｕｒｉｎｅ ｅｘｏｓｏｍｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ａｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｂｉｏｐｓｙ．ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ ２（７）：８８２－８８９．Ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａｏｎｃｏｌ．２０１６．００９７）。微生物増殖の可能性、並びに試料収集及び実験室への輸送の時点での宿主細胞及び細胞外小胞（ＥＶ）の不安定な性質により、多施設収集及び診療所での収集が大規模な募集に対してますます禁止され、また収集と処理との間の時間に変動につながるため、家庭サンプリングのための尿試料の安定化の必要性が推進される。したがって、家庭サンプリングのための尿安定化の開発は、液体生検分析で使用される様々な尿由来バイオマーカー（例えば、前立腺がんにおける尿中ＥＶ ＲＮＡ）の新しい用途を開く。
実験設定のうちの１つでは、朝一の最初の排泄尿試料を、標準的な尿収集カップに健常な男性及び女性のドナーから収集した。検体をアイスパック上で実験室に輸送し、そこで、試料を一緒にプールして、プール尿検体（ＭＰ、男性プール、ＦＰ、女性プール）を形成した。ｉ）３０ｍＬのプールした尿を、安定化組成物の不在下（保存されていない）で保存し、２）２４ｍＬのプール尿検体を、安定化組成物［４ｍＬの原液（表２０）及び２ｍＬの９５％エタノール］と混合し、保存した。原液の組成は、表２０に記載される。両方の種類の検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。尿と混合した後の安定化溶液「化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）」の最終組成を表２１に記載する。０日目及び７日目に、１０ｍＬの各保存されていない尿検体及びＣｈｅｍ Ｆ含有尿検体のアリコートを、室温で１０分間、３，０００ｇで遠心分離し、続いて０．８μＭ濾過を行った。遠心分離及び濾過後に各検体から回収した事前に清澄化された上清を、ＥｘｏＲＮｅａｓｙ ｍａｘｉ ｋｉｔを用いたＥＶ ＲＮＡ抽出に使用した（Ｑｉａｇｅｎ、材料及び方法を参照）。抽出されたＲＮＡ試料の濃度を、２１００ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ及び／又はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ定量化を使用して測定した。ｃＤＮＡを、Ｍ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキットを使用して調製し、ｑＰＣＲを、β－アクチン（ＡＣＴＢ）ＴａｑＭａｎアッセイを使用して行った（材料及び方法を参照）。ｃＤＮＡ合成のために、保存されていない状態及び安定化状態からの等量（ｎｇ）の抽出された全ＲＮＡを、所与の尿試料に使用した。
別の実験設定では、男性及び女性の健常なドナーが、Ｃｏｌｌｉ－Ｐｅｅ（登録商標）Ｆｉｒｓｔ Ｖｏｉｄ Ｕｒｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｎｏｖｏｓａｎｉｓ）を使用して、ランダムな（真昼）最初の排泄尿試料を提供した。検体をアイスパック上で実験室に輸送し、そこで、試料を一緒にプールして、プール尿検体（ＭＰ、男性プール、ＦＰ、女性プール）を形成した。ｉ）４０ｍＬのプールした尿を、安定化組成物の不在下（保存されていない）で保存し、２）２８ｍＬのプール尿検体を、１２ｍＬの化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）安定化組成物と混合し、保存した。安定化溶液の組成を表２２ｉに記載する。両方の種類の検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。尿と混合した後の安定化溶液「Ｃｈｅｍ Ｆ」の最終組成を表２２ｉｉに記載する。０日目及び７日目に、１７ｍＬの各保存されていない検体及びＣｈｅｍ Ｆ含有検体のアリコートを、室温で１０分間、３，０００ｇで遠心分離し、続いて０．８μＭ濾過を行った。１６ｍＬの事前に清澄化された上清を、遠心分離及び濾過後に各検体から回収し、ＥｘｏＲＮｅａｓｙ ｍａｘｉ ｋｉｔを使用して、ＥＶ ＲＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ、材料及び方法を参照）。抽出されたＲＮＡ試料の濃度を、２１００ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ及び／又はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ定量化を使用して測定した（材料及び方法を参照）。抽出したＥＶ ＲＮＡのプロファイルも、２１００ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで決定した。ｃＤＮＡ合成のために、保存されていない状態及び安定化状態からの等量（ｎｇ）の抽出された全ＲＮＡを、所与の尿試料に使用した。ｃＤＮＡは、Ｍ－ＭＬＶ Ｍ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して調製され、ｑＰＣＲは、β－アクチンＴａｑＭａｎアッセイを使用して行われた（材料及び方法を参照）。β－アクチンは、ｑＰＣＲアッセイを使用したエクソソームｍＲＮＡ定量化のためのハウスキーピング遺伝子とみなされた（Ｈ Ｊｉａｎｇ，Ｚ Ｌｉ，Ｘ Ｌｉ，Ｊ Ｘｉａ（２０１５）Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｏｒｇａｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｒｅｐ １１：４６５７－４６６３．Ｄｏｉ：１０．３８９２／ｍｍｒ．２０１５．３３１２、ＫＣ Ｍｉｒａｎｄａ，ＤＴ Ｂｏｎｄ，Ｍ ＭｃＫｅｅ，Ｊ Ｓｋｏｇ，ＴＧ Ｐａｕｎｅｓｃｕ，Ｎ Ｄａ Ｓｉｌｖａ，Ｄ Ｂｒｏｗｎ，ＬＭ Ｒｕｓｓｏ（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈｉｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｅｘｏｓｏｍｅｓ／ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ７８（２）：１９１－１９９．Ｄｏｉ：１０．１０３８／ｋｉ．２０１０．１０６、Ｓ Ｈａｑｕｅ，ＳＲ Ｖａｉｓｅｌｂｕｈ（２０１８）Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｗｏ－ｓｔｅｐ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５（３）：ｅ９６．Ｄｏｉ：１０．１４４４０／ｊｂｍ．２０１８．２４９、Ｌ Ｄｏｎｇ，Ｗ Ｌｉｎ，Ｐ Ｑｉ，Ｍ Ｘｕ，Ｚ Ｗｕ，Ｓ Ｎｉ，Ｄ Ｈａｕｎｇ，Ｗ－Ｗ Ｗｅｎｇ，Ｃ Ｔａｎ，Ｗ Ｓｈｅｎｇ，Ｘ Ｚｈｏｕ，Ｘ Ｄｕ（２０１６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｌｏｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｔｈｅｉｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｓ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２５（７）：１１５８－１１６６．Ｄｏｉ：１０．１１５８／１０５５－９９６５．ＥＰＩ－１６－０００６）。
両実験設定からの合計７つの試料（３つの女性プール尿試料及び４つの男性プール尿試料）からの全体的なデータを組み合わせ、図１０Ａに提示する。図１０Ａは、室温で７日間保存した後の保存されていない尿検体及び安定化溶液含有尿検体の両方におけるβ－アクチン（ＡＣＴＢ）ＲＮＡ含有量の［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を表すΔＣｔを図示する。β－アクチン（ＡＣＴＢ）ＲＮＡのΔＣｔ（ΔＣｔの中央値≧＋２；図１０Ａ）の増加は、室温で７日間保存された保存されていない検体におけるＥＶ ＲＮＡ含有量の喪失を示す。しかしながら、Ｃｈｅｍ Ｆ含有尿検体におけるβ－アクチンＲＮＡのΔＣｔの変化は、著しくなく（ΔＣｔの中央値はほぼ０であった；図１０Ａ）、室温で７日後のＥＶ ＲＮＡ含有量の安定化を示す。更に、収集時（０日目）の保存されていない（ＮＡ）試料に対して、化学物質の添加時の尿試料におけるＥＶ ＲＮＡ含有量に著しい変化はなかった［図１０Ａ（ｉｉ）］。図１０Ｂは、０日目及び７日目の保存されていない尿検体及びＣｈｅｍ Ｆ含有尿検体の両方からのＥＶ ＲＮＡの代表的な電気泳動トレースを図示する。電気泳動トレースは、保存されていない０日目の検体と同様のＥＶ ＲＮＡプロファイルを示したＣｈｅｍ Ｆを含有する０日目及び７日目の検体とは異なり、７日目の保存されていない尿検体のＥＶ ＲＮＡプロファイルにおいて顕著な変化を明確に示す。
別の実験設定では、男性及び女性の健常なドナーが、Ｃｏｌｌｉ－Ｐｅｅ（登録商標）Ｆｉｒｓｔ Ｖｏｉｄ Ｕｒｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｎｏｖｏｓａｎｉｓ）を使用して、ランダムな（真昼）最初の排泄尿試料を提供した。検体をアイスパック上で実験室に輸送し、そこで、試料を一緒にプールして、プールした尿検体（ＭＰ、男性プール；ＦＰ、女性プール）を形成した。プールした尿のアリコートを、１）安定化組成物の不在下（保存されていない）で保存した、２）１：０．４３の尿：化学物質比で異なる糖を含有する原液［表２２（ｉｉｉ）］と混合し、保存した。全ての検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。尿と混合した後の安定化溶液の最終組成を表２２（ｉｖ）に記載する。０日目及び７日目に、８．５ｍＬの各保存されていない尿検体、Ｃｈｅｍ Ｆ含有尿検体、及びＳｔｒｅｃｋ保存剤含有尿検体のアリコートを、室温で１０分間、３，０００ｇで遠心分離し、続いて０．８μＭ濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（登録商標）Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ（登録商標）、カタログ番号１６５９２、又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）－ＡＡ、カタログ番号ＳＬＡＡ０３３ＳＢ）を行った。８ｍＬの事前に清澄化された上清を、遠心分離及び濾過後に各検体から回収し、ＥＶ ＲＮＡを、限外濾過を使用して抽出した（材料及び方法のＥＶ ＲＮＡ抽出を参照）。抽出されたＲＮＡ試料の濃度を、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ定量化を使用して測定した（材料及び方法を参照）。ｃＤＮＡ合成のために、保存されていない状態及び安定化状態からの等量（ｎｇ）の抽出された全ＲＮＡを、所与の尿試料に使用した。ｃＤＮＡを、Ｍ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して調製し、ｑＰＣＲを、β－アクチンＴａｑＭａｎアッセイを使用して行った（材料及び方法を参照）。
図１０Ｃは、室温で７日間保存した後の保存されていない尿検体及び安定化溶液含有尿検体の両方におけるβ－アクチン（ＡＣＴＢ）ＲＮＡ含有量の［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を表すΔＣｔを図示する。β－アクチン（ＡＣＴＢ）ＲＮＡのΔＣｔ［ΔＣｔの中央値＞＋３．５；図１０Ｃ（ｉ）］の増加は、室温で７日間保存された保存されていない検体におけるＥＶ ＲＮＡ含有量の喪失を示す。Ｃｈｅｍ Ｆ及びＣｈｅｍ Ｇを含有する検体は、β－アクチンＲＮＡについて、それぞれ、１．５及び１．１の中央ΔＣｔ値を示し、室温で７日後のＥＶ ＲＮＡ含有量の効率的な安定化を示した［図１０Ｃ（ｉ）］。更に、収集時（０日目）の保存されていない（ＮＡ）試料に対して、化学物質の添加時の尿試料におけるＥＶ ＲＮＡ含有量に著しい変化はなかった［図１０Ｃ（ｉｉ）］。
別の実験設定では、男性及び女性の健常なドナーが、Ｃｏｌｌｉ－Ｐｅｅ（登録商標）Ｆｉｒｓｔ Ｖｏｉｄ Ｕｒｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｎｏｖｏｓａｎｉｓ）を使用して、ランダムな（真昼）最初の排泄尿試料を提供した。検体をアイスパック上で実験室に輸送し、そこで、試料を一緒にプールして、プール尿検体（ＭＰ、男性プール；ＦＰ、女性プール）を形成した。プールした尿のアリコートを、１）安定化組成物の不在下（ＮＡ、保存されていない）で保存した、２）１：０．４３の尿：化学物質比で化学物質Ｆ安定化組成物と混合し、保存した、及び３）５ｍＬのＳｔｒｅｃｋの尿保存剤（カタログ番号２３０２１６）と混合し、保存した。安定化溶液の組成は、表２３（ｉ）に記載される。両方の種類の検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。尿と混合した後の安定化溶液の最終組成を表２３（ｉｉ）に記載する。０日目及び７日目に、１１ｍＬの各保存されていない尿検体、Ｃｈｅｍ Ｆ含有尿検体、及びＳｔｒｅｃｋ保存剤含有尿検体のアリコートを、室温で１０分間、３，０００ｇで遠心分離し、続いて０．８μＭ濾過を行った。１０ｍＬの事前に清澄化された上清を、遠心分離及び濾過後に各検体から回収し、ＥｘｏＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ ｋｉｔを使用して、ＥＶ ＲＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ、材料及び方法を参照）。抽出されたＲＮＡ試料の濃度を、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ定量化を使用して測定した（材料及び方法を参照）。ｃＤＮＡ合成のために、保存されていない状態及び安定化状態からの等量（ｎｇ）の抽出された全ＲＮＡを、所与の尿試料に使用した。ｃＤＮＡを、Ｍ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して調製し、ｑＰＣＲを、β－アクチンＴａｑＭａｎアッセイを使用して行った（材料及び方法を参照）。
図１０Ｄは、室温で７日間保存した後の保存されていない尿検体及び安定化溶液含有尿検体の両方におけるβ－アクチン（ＡＣＴＢ）ＲＮＡ含有量の［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を表すΔＣｔを図示する。β－アクチン（ＡＣＴＢ）ＲＮＡのΔＣｔ［ΔＣｔの中央値≧＋３．５；図１０Ｃ（ｉ）］の増加は、室温で７日間保存された保存されていない検体におけるＥＶ ＲＮＡ含有量の喪失を示す。Ｃｈｅｍ Ｆ含有検体は、β－アクチンＲＮＡについて、＋１．１の中央ΔＣｔ値を示し、室温で７日後のＥＶ ＲＮＡ含有量の効率的な安定化を示した。一方で、７日間の安定時点（Ｔ７）のβ－アクチンＲＮＡについて＋１．８の中央ΔＣｔ値を示したにもかかわらず、Ｓｔｒｅｃｋ保存剤含有尿検体は、０日目の時点でＥＶ ＲＮＡの有意な喪失（＋３．３の中央ΔＣｔ値）を示し、ＥＶ ＲＮＡの安定性及び含有量の全体的な喪失を示唆した［図１０Ｄ（ｉｉ）］。
実施例１１：室温での尿中の無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を保存するための安定化組成物。
男性及び女性の健常なドナーが、Ｃｏｌｌｉ－Ｐｅｅ（登録商標）Ｆｉｒｓｔ Ｖｏｉｄ Ｕｒｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｎｏｖｏｓａｎｉｓ）を使用して、ランダムな（真昼）最初の排泄尿試料を提供した。検体をアイスパック上で実験室に輸送し、そこで、試料を一緒にプールして、プール尿検体（ＭＰ、男性プール；ＦＰ、女性プール）を形成した。プールした尿のアリコートを、１）安定化組成物の不在下（保存されていない）で保存した、２）１：０．４３の尿：化学物質比で化学物質Ｆ安定化組成物と混合し、保存した。安定化溶液の組成は、表２４に記載される。両方の種類の検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。尿と混合した後の安定化溶液の最終組成を表２５に記載する。０日目及び７日目に、２．５ｍＬの各保存されていない尿検体及びＣｈｅｍ Ｆ含有尿検体のアリコートを、室温で１０分間、３，０００ｇで遠心分離し、続いて０．８μＭ濾過を行った。遠心分離及び濾過後に各検体から２ｍＬの事前に清澄化された上清を回収し、ＱｉａＡｍｐ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、材料及び方法を参照）を使用して無細胞核酸を抽出した。抽出された核酸をＤＮＡｓｅ消化に供して、ＤＮＡ混入を除去して、全無細胞ＲＮＡを効率的に精製した。抽出されたＲＮＡ試料の濃度を、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ定量化を使用して測定した（材料及び方法を参照）。ｃＤＮＡ合成のために、保存されていない状態及び安定化状態からの等量（ｎｇ）の抽出された全ＲＮＡを、所与の尿試料に使用した。ｃＤＮＡを、Ｍ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して調製し、ｑＰＣＲを、β－アクチンＴａｑＭａｎアッセイを使用して行った（材料及び方法を参照）。
図１１（ｉ）は、室温で７日間保存した後の保存されていない尿検体及びＣｈｅｍ Ｆ含有尿検体の両方におけるβ－アクチン（ＡＣＴＢ）ＲＮＡ含有量の［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を表すΔＣｔを図示する。保存されていない検体を室温で７日間保存した後の無細胞ＲＮＡ含有量の減少を示唆するΔＣｔ中央値の増加（＋２．５）があったが、対照的に、１．３のΔＣｔ中央値によって示されるように、室温で７日後のＣｈｅｍ Ｆ含有検体におけるβ－アクチン無細胞ＲＮＡレベルにおける変化はあまりなかった［図１１（ｉ）］。更に、収集時（０日目）の保存されていない（ＮＡ）試料に対して、化学物質の添加時の尿試料における無細胞ＲＮＡ含有量に顕著な変化はなかった［図１１（ｉｉ）］。
実施例１２：室温での尿中の尿中細胞ＲＮＡの保存のための安定化組成物。
この実施例は、２つの別個の研究で構成される。第１の研究では、８人の男性及び８人の女性のドナーからの真昼の最初の排泄尿試料を、Ｃｏｌｌｉ－Ｐｅｅ（登録商標）Ｆｉｒｓｔ－ｖｏｉｄ Ｕｒｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｎｏｖｏｓａｎｉｓ）を使用して収集し、プールして合計４つのプールした尿検体（男性（ＭＰ）２つ及び女性（ＦＰ）２つ）を形成した。ｉ）４０ｍＬの各検体を、安定化組成物の不在下（保存していない）で保存した、及びｉｉ）２８ｍＬの各尿検体を１２ｍＬの原液と混合した（表２６）。両方の種類の検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。尿と混合した後の最終組成を、以下の表２７に記載する。
第２の研究では、４人の健常なドナーが、３０ｍＬの朝一の最初の排泄（ＦＭＦＶ）尿検体を提供し、それらの尿試料を一緒にプールして、２つのプールした尿検体を生成した。ｉ）３０ｍＬの各検体を、安定化組成物の不在下（保存されていない、ＮＡ）で保存した、並びにｉｉ）２４ｍＬの各尿検体を、４ｍＬの原液（表２８）及び２ｍＬの９５％エタノールと混合した。両方の種類の検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。尿と混合した後の安定化溶液「Ｃｈｅｍ Ｆ」の最終組成を表２９に記載する。比較のために、２５ｍＬの尿を、「Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｕｒｉｎｅ Ｐｒｅｓｅｒｖｅ」（カタログ番号２３０２１６）として市販されている、５ｍＬのＳｔｒｅｃｋの尿固定剤（参照組成物）と混合し、室温で少なくとも７日間保存した。参照組成物は、ホルムアルデヒド放出剤イミダゾリジニル尿素、並びにＫ３ ＥＤＴＡ及びグリシンを含む。
０日目及び７日目に、１５～１６ｍＬの各保存されていない尿検体、Ｃｈｅｍ Ｆ含有尿検体、及びＳｔｒｅｃｋ保存剤含有尿検体のアリコートを、室温で２０分間、３，８００ｇで遠心分離した。遠心分離後に各検体から全細胞ペレットを回収し、製造業者のプロトコルに従い、材料及び方法に記載されているＴｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（研究Ｉ）又はＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（研究ＩＩ）のいずれかを使用して尿細胞ＲＮＡを抽出した。β－アクチン（ＡＣＴＢ）ＴａｑＭａｎベースのＲＴ－ｑＰＣＲ実験を使用して抽出された細胞ＲＮＡでの標的化ｍＲＮＡ分析を、記載されるように行った（材料及び方法を参照）。
第１の実験設定からの合計４つの試料（２つの女性プール尿試料及び２つの男性プール尿試料）からの全体的なデータを組み合わせ、図１２Ａに提示する。図１２Ａ（ｉ）は、室温で７日間保存した後の保存されていない尿検体及びＣｈｅｍ Ｆ含有尿検体の両方におけるβ－アクチン（ＡＣＴＢ）ＲＮＡ含有量の［Ｃｔ（Ｔ７）－Ｃｔ（Ｔ０）］を表すΔＣｔを図示する。細胞β－アクチン（ＡＣＴＢ）ＲＮＡ含有量のΔＣｔの劇的な増加があり、室温で７日間保存された保存されていない検体における細胞ＲＮＡ含有量の劇的な喪失を示した。しかしながら、細胞β－アクチンＲＮＡのΔＣｔは、保存されていない検体と比較したとき（図１２Ａ（ｉ））、Ｃｈｅｍ Ｆ含有検体において著しく低く、これは、室温で７日後の安定化溶液を含有する尿検体における細胞ＲＮＡの安定性を示す。更に、収集時（０日目）の保存されていない（ＮＡ）試料に対して、化学物質の添加時の尿試料における細胞ＲＮＡ含有量に主な変化はなかった［図１２Ａ（ｉｉ）］。
図１２Ｂ（ｉ）は更に、細胞β－アクチン（ＡＣＴＢ）ＲＮＡ含有量のΔＣｔの劇的な増加があり、室温で７日間保存された保存されていない検体及びＳｔｒｅｃｋの尿保存剤含有検体の両方における細胞ＲＮＡ含有量の劇的な喪失を示した。しかしながら、細胞β－アクチンのΔＣｔは、保存されていない検体及びＳｔｒｅｃｋの保存剤含有検体と比較したとき、Ｃｈｅｍ Ｆ含有検体において著しく低かった［図１２Ｂ（ｉ）］。更に、Ｃｈｅｍ Ｆ含有検体と比較したとき、Ｓｔｒｅｃｋの保存剤含有検体は、収集時（０日目）の保存されていない（ＮＡ）試料に対して、化学物質の添加時の尿試料における細胞ＲＮＡ含有量により大きい変化を示した［図１２Ｂ（ｉｉ）］。全体的に、このデータは、室温で７日後の本安定化組成物を含有する検体において細胞ＲＮＡ安定性を示す。
実施例１３：室温での尿中の尿中細胞ＤＮＡの保存のための安定化組成物。
この研究では、健常な６人の男性及び６人の女性のドナーからの真昼の最初の排泄尿試料を、Ｃｏｌｌｉ－Ｐｅｅ（登録商標）Ｆｉｒｓｔ－ｖｏｉｄ Ｕｒｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｎｏｖｏｓａｎｉｓ）を使用して収集し、プールして合計４つのプールした尿検体［２つの男性プール（ＭＰ）及び２つの女性プール（ＦＰ）］を形成した。ｉ）３０ｍＬの各検体を、安定化組成物の不在下（保存していない）で保存した、及びｉｉ）２１ｍＬの各尿検体を９ｍＬの原液と混合した（表３０）。両方の種類の検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。尿と混合した後の最終組成を、以下の表３１に記載する。
０日目及び７日目に、１５ｍＬの各保存されていない検体及びＣｈｅｍ Ｆ含有検体のアリコートを、室温で１０分間、３０００ｇで遠心分離した。遠心分離後に各検体から全細胞ペレットを回収し、製造業者のプロトコルに従って、ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して尿細胞ＤＮＡを抽出した。抽出した細胞ＤＮＡのプロファイルを、ゲノムＤＮＡ ｔａｐｅを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎで評価した。抽出したＤＮＡを使用して、記載されるようにＤＮＡ安定性を測定するために、約１ＫｂのＰＣＲ産物（ＧＡＰＤＨ遺伝子）を増幅した（材料及び方法を参照）。
図１３Ａは、保存されていない尿検体（ＮＡ）及び化学物質Ｆ含有尿検体の両方における、抽出された細胞ＤＮＡの０日目及び７日目のＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎプロファイルを図示する。ＦＰ試料では、室温で７日間保存された保存されていない検体において、高分子量ゲノムＤＮＡの一貫した劇的な喪失があった。ＭＰの保存されていない試料では、１つのプールした試料は、細菌増殖による高分子量ゲノムＤＮＡの増加を示し、一方、第２のプールした試料は、室温で７日後に高分子量ゲノムＤＮＡの著しい減少を示した。しかしながら、高分子量ゲノムＤＮＡのプロファイルは、室温で７日後のＣｈｅｍ Ｆ含有ＦＰ及びＭＰの両方の尿検体において保存され（図１３Ａ）、したがって、細胞ＤＮＡの安定性を示した。次に、アンプリコンサイズが約１ＫｂのＧＡＰＤＨ遺伝子の標的化増幅を行い、０日目及び７日目の時点での保存されていない尿検体及びＣｈｅｍ Ｆ含有尿検体の両方における高分子量ＤＮＡバンドの安定性を決定した。
図１３Ｂは、ＧＡＰＤＨ ＰＣＲ増幅の結果を示す。約１Ｋｂの産物の存在は、室温で７日間保存した後、Ｃｈｅｍ Ｆ含有ＦＰ及びＭＰ両方の尿検体において、ヒト細胞ＤＮＡの安定性を強く示す。保存されていない検体では、ＧＡＰＤＨ ＰＣＲ増幅は失敗し、ヒト細胞ＤＮＡの安定性が欠如していることが示された。材料及び方法に記載されているように、ＦＰ及びＭＰ両方の検体から抽出されたＤＮＡで細菌１６Ｓ ｑＰＣＲを行った。０日目に対して７日目の細菌ＤＮＡ含有量に著しい変化を示さなかった化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）含有検体とは異なり、細菌１６ｓ ｑＰＣＲは、室温で７日間保持されたＦＰ及びＭＰの両方の保存されていない尿試料における細菌ＤＮＡ含有量の割合の劇的な増加を示した（図１３Ｃ）。全体として、データは、室温で７日間保存した後の安定化溶液を含有する尿検体において、ヒト細胞ＤＮＡが保存され、細菌増殖が防止されることを示唆する。一方、保存されていない検体は、７日間の室温での保存後、ヒト細胞ＤＮＡの完全な喪失及び細菌ＤＮＡの劇的な増加を示した。
実施例１４：室温で保存された唾液試料における無細胞核酸プロファイルを保存するための安定化組成物。
尿と同様に、唾液サンプリングは、簡単で安全かつ安価であり、家庭での収集に理想的である。唾液は、唾液腺に栄養を与える血管系から濾過、処理、及び分泌される様々な分子（例えば、酵素、ホルモン、抗体、ムチン、増殖因子、核酸、エクソソーム、及び抗菌成分）で構成される。これらの多くは、経細胞又は傍細胞経路により細胞間の空間を通過することによって、血液から唾液に入る。したがって、血液中に見出されるほとんどの化合物は、唾液中にも存在する。したがって、唾液は、健康及び疾患を監視するための高い潜在能力を示す（Ｙ－Ｈ Ｌｅｅ ａｎｄ ＤＴ Ｗｏｎｇ（２００９）Ｓａｌｉｖａ：ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｂｉｏｆｌｕｉｄ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｍ Ｊ Ｄｅｎｔ ２２（４）：２４１－２４８、Ｋ－Ａ Ｈｙｕｎ，Ｈ Ｇｗａｋ，Ｊ Ｌｅｅ，Ｂ Ｋｗａｋ，Ｈ－Ｉ Ｊｕｎｇ（２０１８）Ｓａｌｉｖａｒｙ ｅｘｏｓｏｍｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ ９：３４０）。
この研究では、生の唾液試料を６人の健常な個体から収集し、一緒に混合して、プールした唾液試料を形成した。ｉ）７ｍＬのプールした唾液試料を、３ｍＬの１Ｘ ＴＥ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ９８５８）（保存されていない）と混合し、ｉｉ）７ｍＬのプールした唾液を、３ｍＬの原液と混合した（表３２を参照）。細胞外コンパートメントと細胞コンパートメントの効率的な分離のために、ＴＥ緩衝液を保存されていない検体に添加して、唾液の粘液性を克服した。両方の種類の検体を少なくとも７日間室温（２３±３℃）で保存した。唾液と混合した後の最終組成を以下の表３３に記載する。
０日目及び７日目に、４．５ｍＬの各保存されていない検体及び化学物質Ｆ（Ｃｈｅｍ Ｆ）含有検体のアリコートを、室温で２０分間、３，８００ｇで遠心分離した。遠心分離後に各検体から４．０ｍＬの上清を回収し、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、材料及び方法を参照）を使用して無細胞核酸を抽出した。抽出した無細胞核酸のプロファイルを、ＨＳ Ｄ５０００ ｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号５０６７－５５９２）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎで評価した。図１４は、保存されていない唾液検体（ＮＡ）及び保存されたＣｈｅｍ Ｆ含有唾液検体の両方における、０日目及び７日目の抽出された無細胞ＤＮＡのＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎプロファイルを図示する。Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎデータ（図１４）は、室温で７日後の安定化溶液を含む唾液試料における無細胞ＤＮＡプロファイルの保存を明確に示し、一方、０日目のプロファイルと比較して、室温で７日後の保存されていない試料における無細胞ＤＮＡプロファイルに劇的な変化があった。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、本発明が属する当業者の技術レベルを示し、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、具体的かつ個別に、参照により組み込まれると示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
このようにして、本発明を説明すると、同様のことが多くの点で変化し得ることは明らかであろう。そのような変形は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱するとみなされるべきではなく、当業者には明らかであろう全てのそのような変更は、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。特許請求の範囲の範囲は、説明のために設定された好ましい実施形態に限定されるべきではなく、全体としての説明と一致する最も広範な解釈を与えられるべきである。
Claims (50)
- 周囲温度で体液を保存するための水性安定化組成物であって、
単糖、二糖、又はこれらの組み合わせから選択される糖と、
緩衝剤と、
Ｃ１－Ｃ６アルカノールと、
ホウ酸、ホウ酸の塩、又はこれらの組み合わせと、
キレート剤と、を含み、
前記組成物が、４．５～５．２のｐＨを有する、水性安定化組成物。 - 前記糖が、単糖である、請求項１に記載の組成物。
- 前記単糖が、フルクトース、グルコース、マンノース、ガラクトース、又はこれらの組み合わせから選択される、請求項２に記載の組成物。
- 前記単糖が、フルクトース、グルコース、又はこれらの組み合わせから選択される、請求項３に記載の組成物。
- 前記糖が、二糖である、請求項１に記載の組成物。
- 前記二糖が、トレハロース、ラクトース、若しくはスクロース、又はこれらの組み合わせから選択される、請求項５に記載の組成物。
- 前記二糖が、スクロースである、請求項６に記載の組成物。
- 前記緩衝剤が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、又はこれらの組み合わせであり、
任意選択で、前記酢酸緩衝液が、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、又はこれらの組み合わせから選択され、
任意選択で、前記クエン酸緩衝液が、クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、又はこれらの組み合わせから選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記緩衝剤が、酢酸ナトリウムである、請求項８に記載の組成物。
- 前記Ｃ１－Ｃ６アルカノールが、メタノール又はエタノールから選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記Ｃ１－Ｃ６アルカノールが、エタノールである、請求項１０に記載の組成物。
- 前記キレート剤が、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２－シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）、テトラアザシクロテトラデカン四酢酸（ＴＥＴＡ）、デスフェリオキシミン、又はこれらのキレータ類似体から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記キレート剤が、ＣＤＴＡである、請求項１２に記載の組成物。
- 前記糖が、約５％～約４５％（重量／体積）、又は約５％～約４０％（重量／体積）、又は約１０％～約３０％（重量／体積）、又は約１８％～約２２％（重量／体積）、又は約２０％（重量／体積）の量で存在し、
前記緩衝剤が、約１５０ｍＭ～約１．７５Ｍ、又は約１５０ｍＭ～約１．５Ｍ、又は約５００ｍＭ～約１．２Ｍ、又は約０．７Ｍ～約０．８Ｍ、又は約０．７５Ｍの量で存在し、
前記Ｃ１－Ｃ６アルカノールが、約５％～約５０％（体積／体積）、又は約１０％～約３０％（体積／体積）、又は約２０％～約２５％（体積／体積）、又は約２３％（体積／体積）の量で存在し、
前記ホウ酸、前記ホウ酸の塩、又は前記これらの組み合わせが、約０．５％～約５％（重量／体積）、又は約１％～約３％（重量／体積）、又は約２％～約２．５％（重量／体積）、又は約２．２％（重量／体積）の量で存在し、
前記キレート剤が、約１０ｍＭ～約１２０ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、又は約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、又は約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、又は約５０ｍＭの量で存在する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記組成物が、
約５％～約４５％（重量／体積）、又は約５％～約４０％（重量／体積）、又は約１０％～約３０％（重量／体積）、又は約１８％～約２２％（重量／体積）、又は約２０％（重量／体積）の量のフルクトース、グルコース、スクロース、又はこれらの組み合わせと、
約１５０ｍＭ～約１．７５Ｍ、又は約１５０ｍＭ～約１．５Ｍ、又は約５００ｍＭ～約１．２Ｍ、又は約０．７Ｍ～約０．８Ｍ、又は約０．７５Ｍの量の酢酸ナトリウムと、
約５％～約５０％（体積／体積）、又は約１０％～約３０％（体積／体積）、又は約２０％～約２５％（体積／体積）、又は約２３％（体積／体積）の量のメタノール、エタノール、又はこれらの組み合わせと、
約０．５％～約５％（重量／体積）、又は約１％～約３％（重量／体積）、又は約２％～約２．５％（重量／体積）、又は約２．２％（重量／体積）の量のホウ酸と、
約１０ｍＭ～約１２０ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、又は約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、又は約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、又は約５０ｍＭの量ＣＤＴＡと、を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記組成物が、
約５％～約４５％（重量／体積）、又は約５％～約４０％（重量／体積）、又は約１０％～約３０％（重量／体積）、又は約１８％～約２２％（重量／体積）、又は約２０％（重量／体積）の量のフルクトース、グルコース、又はこれらの組み合わせと、
約１５０ｍＭ～約１．７５Ｍ、又は約１５０ｍＭ～約１．５Ｍ、又は約５００ｍＭ～約１．２Ｍ、又は約０．７Ｍ～約０．８Ｍ、又は約０．７５Ｍの量の酢酸ナトリウムと、
約５％～約５０％（体積／体積）、又は約１０％～約３０％（体積／体積）、又は約２０％～約２５％（体積／体積）、又は約２３％（体積／体積）の量のエタノールと、
約０．５％～約５％（重量／体積）、又は約１％～約３％（重量／体積）、又は約２％～約２．５％（重量／体積）、又は約２．２％（重量／体積）の量のホウ酸と、
約１０ｍＭ～約１２０ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、又は約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、又は約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、又は約５０ｍＭの量ＣＤＴＡと、を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記組成物が、前記体液中に含まれる細胞、細胞外小胞、核酸、及び／又は微生物を安定化する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞が、がん細胞又は有核血液細胞から選択される、請求項１７に記載の組成物。
- 前記核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１７に記載の組成物。
- 前記ＤＮＡが、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）などの無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む、請求項１９に記載の組成物。
- 前記核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１７に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡが、無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む、請求項２１に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡは、細胞外小胞ＲＮＡ（ＥＶ ＲＮＡ）を含む、請求項２１に記載の組成物。
- 前記微生物が、細菌又はウイルスから選択される、請求項１７に記載の組成物。
- 体液を保存するための方法であって、
ａ）前記体液の試料を得ることと、
ｂ）前記体液を、請求項１～２４のいずれか一項に定義される水性安定化組成物と接触させて、混合物を形成することと、
ｃ）前記（ｂ）の混合物を混合して均一な混合物を形成することと、
ｄ）前記均一な混合物を周囲温度で保存することと、を含む、方法。 - 前記体液を保存することが、前記体液に含まれる細胞、細胞外小胞、核酸、及び／又は微生物を安定化することを含む、請求項２５に記載の方法。
- 前記細胞が、がん細胞又は有核血液細胞から選択される、請求項２６に記載の方法。
- 前記核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項２６に記載の方法。
- 前記ＤＮＡが、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）などの無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む、請求項２８に記載の方法。
- 前記核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項２６に記載の方法。
- 前記ＲＮＡが、無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む、請求項３０に記載の方法。
- 前記ＲＮＡは、細胞外小胞ＲＮＡ（ＥＶ ＲＮＡ）を含む、請求項３０に記載の方法。
- 前記微生物が、細菌又はウイルスから選択される、請求項２６に記載の方法。
- 前記体液中に含まれる前記細胞、核酸、細胞外小胞、及び／又は微生物が、周囲温度で少なくとも７日間、又は周囲温度で少なくとも１４日間安定化される、請求項２６～３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液が、尿又は唾液である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項２５～３４のいずれか一項に記載の方法。
- 水性組成物であって、
単糖、二糖、又はこれらの組み合わせから選択される糖と、
緩衝剤と、
Ｃ１－Ｃ６アルカノールと、
ホウ酸、ホウ酸の塩、又はこれらの組み合わせと、
キレート剤と、
体液と、を含む、水性組成物。 - 前記糖が、単糖である、請求項３６に記載の組成物。
- 前記単糖が、フルクトース、グルコース、マンノース、ガラクトース、又はこれらの組み合わせから選択される、請求項３７に記載の組成物。
- 前記単糖が、フルクトース、グルコース、又はこれらの組み合わせから選択される、請求項３８に記載の組成物。
- 前記糖が、二糖である、請求項３６に記載の組成物。
- 前記二糖が、トレハロース、ラクトース、若しくはスクロース、又はこれらの組み合わせから選択される、請求項４０に記載の組成物。
- 前記二糖が、スクロースである、請求項４１に記載の組成物。
- 前記緩衝剤が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、又はこれらの組み合わせであり、
任意選択で、前記酢酸緩衝液が、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、又はこれらの組み合わせから選択され、
任意選択で、前記クエン酸緩衝液が、クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、又はこれらの組み合わせから選択される、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記緩衝剤が、酢酸ナトリウムである、請求項４３に記載の組成物。
- 前記Ｃ１－Ｃ６アルカノールが、メタノール又はエタノールから選択される、請求項３６～４４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記Ｃ１－Ｃ６アルカノールが、エタノールである、請求項４５に記載の組成物。
- 前記キレート剤が、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２－シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）、テトラアザシクロテトラデカン四酢酸（ＴＥＴＡ）、デスフェリオキシミン、又はこれらのキレータ類似体から選択される、請求項３６～４６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記キレート剤が、ＣＤＴＡである、請求項４７に記載の組成物。
- 前記糖が、約１．５％～約１５％（重量／体積）、又は約２％～約１０％（重量／体積）、又は約５％～約７％（重量／体積）、又は約６％（重量／体積）の量で存在し、
前記緩衝剤が、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ、又は約２００ｍＭ～約４００ｍＭ、又は約２２０ｍＭ～約２４０ｍＭ、又は約２３０ｍＭ、又は約２２５ｍＭの量で存在し、
前記Ｃ１－Ｃ６アルカノールが、約２％～約４０％（体積／体積）、又は約３％～約２０％（体積／体積）、又は約５％～約１０％（体積／体積）、又は約６．５％（体積／体積）、又は約６．９％（体積／体積）の量で存在し、
前記ホウ酸、前記ホウ酸の塩、又は前記これらの組み合わせが、約０．１％～約２％（重量／体積）、又は約０．２％～約１．５％（重量／体積）、又は約０．５％～約１．０％（重量／体積）、又は約０．７％（重量／体積）、又は約０．６％（重量／体積）の量で存在し、
前記キレート剤が、約２．５ｍＭ～約５０ｍＭ、又は約５ｍＭ～約２５ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約１６ｍＭ、又は約１５ｍＭの量で存在する、請求項３６～４８のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記体液が、尿又は唾液である、請求項３６～４９のいずれか一項に記載の組成物。
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