JP2023519872A

JP2023519872A - ナノギャップデバイスに直接結合される酵素変異体

Info

Publication number: JP2023519872A
Application number: JP2022558279A
Authority: JP
Inventors: ペイミンジャン，; サンジャイビー．ハリ，; キスプチュン，; ミンレイ，
Original assignee: ユニバーサルシーケンシングテクノロジーコーポレイション
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2023-05-15
Also published as: WO2021195433A2; EP4127234A4; KR20230002461A; EP4127234A2; WO2021195433A3; CN115605612A

Abstract

本発明は、生体分子の電子感知のためのナノギャップデバイスに関する。本発明は、生体分子を感知するために酵素の活性を直接的にモニターする電子デバイスを提供する。図１に示されるように、上記デバイスは、ナノギャップ（１０２）を形成するために、数ナノメートルだけ分離された２個の電極（１０１）を有する回路を含む。各電極は、その楔状の端部を除いて誘電性層（１０３）で不動態化される。酵素（１０４）（これは、その野生型の変異体である）は、電極に共有結合的に直接結合され、上記ナノギャップを架橋する。

Description

相互参照
本出願は、２０２０年３月２５日出願の米国仮特許出願第６２／９９４，７１２号（これは、その全体において、本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。

分野
本発明は、生体分子を検知およびシーケンシングするためのナノデバイスに関する。より具体的には、本発明は、デバイス、方法、およびタンパク質で架橋されたナノギャップデバイスの構築のための組成物を提供する。

発明の背景
１個のタンパク質分子を、数ナノメートルの距離だけ分離された２個の電極に接続する場合に、その分子のコンダクタンスが測定され得る。このような配列は、その金属先端および金属基材を、リガンドまたは抗原それぞれの同族タンパク質を認識するリガンドまたは抗原で官能化することによって、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）を使用して達成された^１。さらに、上記ＳＴＭ機構は、酵素、例えば、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼの生化学的反応を、抵抗性パルスから感知し得る^２。これらの科学的発見は、電気シグナルを測定することによって、酵素のコンホメーション移動を検出する電子的技術を開発する可能性を強く示唆する。しかし、電極とタンパク質との間の共有結合的接続は、接触を非共有結合的なものより安定にし、改善された電流を生じる。

図１は、酵素の活性をモニターするための電子ナノデバイスを図示する。

図２は、その構造領域およびシステイン残基が示された、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼの結晶構造（ＰＤＢ＃１ＸＨＸ）を示す。

図３は、プライマー－テンプレートＤＮＡおよび入来する、ヌクレオシド基質と複合体化したΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの結晶構造（ＰＤＢ＃：２ＰＹＬ）に基づいて、本発明における野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ中の変異部位を図示する。

図４は、ナノギャップを製作するプロセスを示す。

図５は、垂直ナノギャップのアレイを製作するプロセスを示す。

図６は、プライマー－テンプレートＤＮＡおよび入来するヌクレオチド基質と複合体化したΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの結晶構造（ＰＤＢ＃：２ＰＹＬ）に基づいて、本発明におけるΦ２９ＤＮＡポリメラーゼのシステイン変異体の構造を示す。

図７は、プライマー－テンプレートＤＮＡおよび入来するヌクレオチド基質と複合体化したΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの結晶構造（ＰＤＢ＃：２ＰＹＬ）に基づいて、本発明におけるΦ２９ＤＮＡポリメラーゼのセレノシステイン変異体の構造を示す。

図８は、プライマー－テンプレートＤＮＡおよび入来するヌクレオチド基質と複合体化したΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの結晶構造（ＰＤＢ＃：２ＰＹＬ）に基づいて、本発明におけるΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの４－（アジドメチル）－Ｌ－フェニルアラニン変異体の構造を示す。

図９ａおよび９ｂは、（ａ）４－（アジドメチル）－Ｌ－フェニルアラニン変異体におけるアジドと、上記電極上にコーティングされた単層中のトリフェニルホスフィフィンエステルとの反応；（ｂ）上記ナノギャップを架橋するためにアミド結合の形成を通じた、電極への上記タンパク質の直接接続を図示する。

図１０は、熱化学リソグラフィー法（ＴＣＮＬ）を使用してナノギャップを製作するプロセスを示す。

発明の要旨
本発明は、生体分子を感知するために酵素の活性を直接的にモニターする電子デバイスを提供する。図１に示されるように、上記デバイスは、ナノギャップ（１０２）を形成するために、数ナノメートルだけ分離された２個の電極（１０１）を有する回路を含む。各電極は、その楔状の端部を除いて誘電性層（１０３）で不動態化される。酵素（１０４）（これは、その野生型の変異体である）は、電極に共有結合的に直接結合され、上記ナノギャップを架橋する。上記共有結合は、上述の非共有結合的接触と比較して、オーム抵抗を低減する。上記酵素の活性は、バイアス（１０６）の下で、電気シグナル記録デバイス（１０５）で電気シグナルを記録することによってモニターされ得る。

本発明はまた、その天然の機能に影響を及ぼすことなく、電極への結合のための官能基を有するように変異された２つの部位を有する酵素変異体を提供する。上記酵素は、天然であるか、変異されているか、合成されているか、およびこれらの組み合わせのいずれかの、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡプライマーゼ、リボソーム、スクラーゼ、ラクターゼであり得る。上記酵素はまた、天然であるか、変異されているか、または合成されているかのいずれかの、レセプター、リガンド、抗原、および抗体などによって置換され得る。バクテリオファージΦ２９ＤＮＡポリメラーゼが、本開示で提示される発明の長所および新規性を示すために例として選択される。概して、他の酵素にも同じ原理が適用可能である。上記Φ２９ＤＮＡポリメラーゼは、高い処理能力およびＤＮＡを効率的に合成する鎖置換能力を有する酵素である^３。それはまた、重合エラーを校正するために^６，７、その高いヌクレオチド挿入識別値（nucleotide insertion discrimination value）（１０^４～１０^６）^５および３’から５’エキソヌクレアーゼ活性に起因して、他のポリメラーゼより高い忠実度を有する^４。これらの全ては、その構造の特有さに原因がある。その結晶構造に基づいて^８、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼは、５個の構造的サブドメイン－それぞれ、エキソヌクレアーゼ、ＴＰＲ１およびＴＲＰ２、パーム（ｐａｌｍ）、サム（ｔｈｕｍｂ）、フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）、を含む（図２）。そのパーム、サム、およびフィンガーは、半開きの右手に類似であり得る。末端タンパク質領域（ＴｅｒｍｉｎａｌＰｒｏｔｅｉｎＲｅｇｉｏｎ）１（ＴＰＲ１）および（ＴＰＲ２）といわれるタンパク質でプライミングされるＤＮＡポリメラーゼサブグループに特異的に存在する２個の挿入がまた存在する。上記ＴＰＲ１サブドメインは、タンパク質でプライミングされる開始のための末端タンパク質（ＴＰ）との相互作用に関与する。ＴＰＲ２、サム、およびパームサブドメインは、重合活性部位において上流の二重鎖ＤＮＡをとり囲む内部の環様構造を形成し、上記酵素にその固有の高い処理能力を提供する。上記ＴＰＲ２、パームおよびフィンガーサブドメインは、エキソヌクレアーゼドメインと一緒に、下流のテンプレート鎖を包むトンネルを形成する。このトンネルの狭い寸法は、ｄｓＤＮＡ結合が起こらないようにし、上記２個の鎖の融解を強要して、上記テンプレートが活性部位に達することを可能にし、上記ポリメラーゼに鎖置換能力を提供する。システインのチオール側鎖が金属表面と反応することは周知である。Φ２９ＤＮＡポリメラーゼは、７個のシステイン残基を有するが、それらは、タンパク質の内部に位置し（図２に示される）、それらが金属電極と反応することを有効に防止する。本発明において、上記Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、エキソヌクレアーゼおよびＴＰＲ１ドメイン両方のループにおいて２個のアミノ酸変異を含む（部位３０１および３０２、図３）。上記変異は、上記酵素の生化学的機能に影響を及ぼさず、上記２個の変異部位は、上記ナノギャップを架橋し得る距離で分離されている。

本発明は、生体分子（例えば、天然であるか、合成されているか、改変されているか、およびこれらの組み合わせのいずれかの、核酸、タンパク質、ポリサッカリドが挙げられるが、これらに限定されない）の感知およびシーケンシングのためのナノデバイスを提供する。

発明の詳細な説明
１つの実施形態において、本発明は、３ｎｍ～２０ｎｍの範囲に及ぶ距離だけ分離された２個のナノ電極によって形成されたナノギャップを提供する。これらの２個の電極の端部は、それらのナノギャップ側において楔形にされ、それらの頂部表面は、誘電性層および／または化学的不動態化分子の単層によって覆われる。ナノギャップを製作するプロセスは、図４に示され、方法１において詳細に記載される。

別の実施形態において、本発明は、誘電性層によって１個の底部電極から垂直に分離された電極のアレイを提供する（図５）、このタイプの形式は、ナノギャップのより高い充填密度を可能にする。他に、上記頂部電極の全ては、同じ電気的極性を有し、これは、上記荷電した分子を、頂部電極の間を架橋する側方の接触から防止する手段を提供する。上記頂部電極間の側方の距離は、数ナノメートル（ｎｍ）から数マイクロメートル（μｍ）、および数ミリメートル（ｍｍ）までの垂直ギャップサイズに匹敵するかまたはこれより大きく、基本的に上限はない。

いくつかの実施形態において、上記ナノギャップを架橋するために使用されるタンパク質は、２～７個のシステイン（両端を含む）が変異した、野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼのＣからＸへの変異体である。ポリメラーゼ操作プロセスは、方法３に記載される。表１に示されるように、Ｃ２２ＡおよびＣ２９０Ａを有する変異体（Ｍ－２）、ならびにＣ２２Ａ、Ｃ２９０Ａ、およびＣ４５５Ｖを有する変異体（Ｍ－４）は、野生型と同じ活性を有する。他の変異体は、野生型と比較して、活性が低い。

いくつかの実施形態において、上記ナノギャップを架橋するために使用されるタンパク質は、Ｇ１１１ＣおよびＶ２７６Ｃの変異を有する野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼの変異体である（図６）。新たに導入されるシステインは、約６．４ｎｍの距離だけ隔てられる、上記タンパク質のループに位置する。それらは、天然システインと比較してより迅速にアクセスされ得る。上記２個の操作されたシステインのこのチオール基は、それぞれ、金属電極と反応して、ナノギャップを共有結合的に架橋する。

いくつかの実施形態において、上記金属表面は、酵素が結合した後に上記電極上の非特異的吸着を防止するために、ω－メルカプトＰＥＧ（以下に示されるＳＲ－１）によって不動態化される：

いくつかの実施形態において、上記タンパク質は、Ｇ１１１ＵおよびＶ２７６Ｕ（Ｕは、セレノシステインである）の変異を有する野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。Ｓｅ－Ａｕ結合は、類似のＳＡＭｓにおけるＳ－Ａｕ結合と比較して、電荷キャリアトンネル現象（ｃｈａｒｇｅｃａｒｒｉｅｒｔｕｎｎｅｌｉｎｇ）の全体的な類似する確率をともに有するものの、より安定である^９。セレノシステインは、約５．２のｐＫａを有し、これは、その側鎖セレノールが、生理学的ｐＨにおいて脱プロトン化されることを意味する^１０。

１つの実施形態において、本発明は、金属電極上の単層の形成のための化学的試薬（ＣＲ－１）を合成する方法を提供する（スキーム１、詳細については方法４を参照のこと）。ＣＲ－１のトリフェニルホスファネイルエステルは、アジド官能基（ａｚｉｄｏｆｕｎｃｔｉｏｎ）と反応して、アミド結合を形成する^１１。

別の実施形態において、本発明は、金属電極上の単層の形成のための方法４に記載されるものと類似の方法で化学的試薬（ＣＲ－２）を合成する方法を提供する（スキーム２）。ＣＲ－２のトリフェニルホスファネイルエステルは、アジド官能基と反応して、アミド結合を形成する。

いくつかの実施形態において、電極の表面は、ＣＲ－１、ＣＲ－２、またはＳＲ－１とＣＲ－１もしくはＣＲ－２との混合物の単層によって覆われる。本発明は、上記単層を形成する方法を提供する（方法５）。

１つの実施形態において、本発明は、上記ナノギャップを架橋するために、Ｇ１１１ＸおよびＶ２７６Ｘ（Ｘは、４－（アジドメチル）－Ｌ－フェニルアラニンである）の変異したΦ２９ＤＮＡポリメラーゼを提供する（図８）。上記変異したタンパク質は、方法６に記載されるとおりの方法によって発現される。

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応を介して上記ナノギャップを架橋するためのＣＲ－１またはＣＲ－２でコーティングされた電極にアジド変異体を結合するための方法を提供する。図９ａに示されるように、アジドは、トリフェニルホスファネイルエステルと痕跡の無い（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ）Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応を介して反応して、図９ｂに示されるアミド結合を形成して、上記タンパク質を電極に接続する。

別の実施形態において、関連のないタンパク質（非限定的な例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＳｍｔ３およびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍに由来するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼが挙げられる）が、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼの２個の二次構造エレメント（残基Ｋ１１０およびＧ１１１、Ｋ１５０およびＥ１５１、ならびにＹ１５６およびＫ１５７が挙げられるが、これらに限定されない）の間に遺伝子的に挿入される。触媒活性を保持するこのようなタンパク質は、伸長されたギャップ（これは野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼにとっては広すぎる）を架橋するために上記の実施形態とともに使用され得る。

別の実施形態において、関連のないタンパク質（非限定的な例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＳｍｔ３およびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍに由来するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼが挙げられる）は、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端に挿入され、硬いペプチド（１つの非限定的な例は、配列ＰＡＰＡＰである）によって接続する。触媒活性を保持するこのようなタンパク質は、伸長されたギャップ（これは野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼにとっては広すぎる）を架橋するために上記の実施形態とともに使用され得る。

１つの実施形態において、本発明は、熱化学リソグラフィー法（ＴＣＮＬ）^{１２，１３}を使用して導電性層上に単一のナノギャップまたは複数のナノギャップを提供する（方法７を参照のこと）。

方法論
方法１は、以下の手順に従うことによって、上記ナノギャップを生成する、図４に描写されたワークフローに関する。
Ｐ１：半導体または絶縁（ガラス）基材を調製する（４０１）。
Ｐ２：ＳｉＮ_ｘ、ＳｉＯ_ｘ、または他の誘電性材料の絶縁層（４０２）を、化学蒸着（ＣＶＤ）、原子層堆積（ＡＬＤ）、物理蒸着（ＰＶＤ）、分子層蒸着（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｖａｐｏｒｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）（ＭＶＤ）、電気めっき、またはスピンコーティングによって堆積させる。好ましい方法は、プラズマ強化ＣＶＤ（ＰＥＣＶＤ）または減圧ＣＶＤ（ＬＰＣＶＤ）である。
Ｐ３：ＳｉＮ_ｘ、ＳｉＯ_ｘ、または任意の誘電性材料の別の絶縁層（４０３）を、化学蒸着（ＣＶＤ）、原子層堆積（ＡＬＤ）、物理蒸着（ＰＶＤ）、分子層蒸着（ＭＶＤ）、電気めっき、またはスピンコーティングによって堆積させる。好ましい方法は、プラズマ強化ＣＶＤ（ＰＥＣＶＤ）または減圧ＣＶＤ（ＬＰＣＶＤ）である。
Ｐ４：１０，０００～５００，０００μＣ／ｃｍ^２の線量を用いるＥＢＬによって、続いて、マスクとしてフォトレジスト（４０４）を使用してフォトリソグラフによって電極ラインパターン形成（electrode line patterning）のプロセスを行う。
Ｐ５：ＲＩＥまたはＩＢＥを使用してラインエッチングを行い、続いて、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）またはイオンビームエッチング（ＩＢＥ）を行い、絶縁層４０２上でまたはわずかにオーバーエッチングさせて停止させ、続いて、フォトレジストマスクを除去する。
Ｐ６：導電性材料（例えば、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｗ、Ｔｉ、Ｔａ、ＴｉＮｘ、ＴａＮｘ、Ａｌ、Ａｇ、もしくは他の金属複合材、および／または半導体において使用される一般的なＨＫ／ＭＧ材料）の電極層（４０５）を堆積させる。それはまた、良好な接着および電気的／化学的特性を提供するために２またはこれより多くの層の組み合わせであり得る。それは、Ｐ２で言及される方法によって調製され得、最も好ましい方法は、ＡＬＤである。
Ｐ７：化学的機械的研磨、続いて、平坦化（ＣＭＰ）のプロセスを行う。
Ｐ８：ＣＭＰ仕上げを完了させる。
Ｐ９：ＳｉＮ_ｘ、ＳｉＯ_ｘ、Ａｌ_ｘＯ_ｙ、ＨｆＯ_ｘ、または他の誘電性材料の誘電性層（４０６）を、化学蒸着（ＣＶＤ）、原子層堆積（ＡＬＤ）、物理蒸着（ＰＶＤ）、分子層蒸着（ＭＶＤ）、電気めっき、またはスピンコーティングなどによって堆積させる。好ましい方法は、ＡＬＤである。
Ｐ１０：１０，０００～５００，０００μＣ／ｃｍ^２の線量を用いるＥＢＬを使用する電極ギャップパターン形成、続いて、フォトリソグラフィーのプロセスを行う。
Ｐ１１：ＲＩＥまたはＩＢＥを使用する、ギャップエッチングのプロセスを行い、絶縁層４０２上でまたはわずかにオーバーエッチングさせて停止させる。
Ｐ１２：フォトレジストを剥離する。
Ｐ１３．相互接続のリフトオフおよびパッドパターン形成、続いて、削除。

方法２は、以下の手順に従うことによって、上記ナノギャップのアレイを生成する、図５に描写されたワークフローに関する。
Ｐ１：半導体または絶縁（例えば、ガラス）基材を調製する（５０１）。
Ｐ２：ＳｉＮ_ｘ、ＳｉＯ_ｘ、Ａｌ_ｘＯ_ｙ、ＨｆＯ_ｘ、または他の誘電性材料の絶縁層（５０２）を、化学蒸着（ＣＶＤ）、原子層堆積（ＡＬＤ）、物理蒸着（ＰＶＤ）、分子層蒸着（ＭＶＤ）、電気めっき、またはスピンコーティングによって堆積させる。好ましい方法は、プラズマ強化ＣＶＤ（ＰＥＣＶＤ）または減圧ＣＶＤ（ＬＰＣＶＤ）である。
Ｐ３およびＰ４：一般的な金属、導電性材料、例えば、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｗ、Ｔｉ、Ｔａ、ＴｉＮ_ｘ、ＴａＮ_ｘ、Ａｌ、Ａｇ、他の金属、金属複合材、および／または半導体産業において使用される一般的なＨＫ／ＭＧ材料の底部電極層（５０３）を、Ｐ２において言及される方法によって堆積させる。好ましい方法は、ＡＬＤである。さらに、上記電極層を、１ｎｍより大きな電極幅を有するように、ラインパターン形成法（ＥＢＬ、ＥＵＶ、ＤＵＶ、コンタクトマスク）によってパターン形成し得る。
Ｐ５：誘電性層（５０４）を、ＣＶＤ、ＡＬＤ、ＰＶＤ、ＭＶＤ、電気めっき、またはスピンコーティングによって、ＳｉＮ_ｘ、ＳｉＯ_ｘ、Ａｌ_ｘＯ_ｙ、ＨｆＯ_ｘ、または他の誘電性材料のナノギャップとして機能するように堆積させる（５０４）。好ましい方法は、ＡＬＤである。上記ギャップサイズは、タンパク質分子の直径に概して匹敵する。
Ｐ６およびＰ７：Ｐ２において言及される方法によって、導電性材料、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｗ、Ｔｉ、Ｔａ、ＴｉＮ_ｘ、ＴａＮ_ｘ、Ａｌ、Ａｇ、他の金属、金属複合材、および／または半導体産業において使用される一般的なＨＫ／ＭＧ材料を含む頂部電極アレイ（５０５）を製作する。好ましい方法は、ＡＬＤである。電極アレイの製作は、ラインパターン形成－ＥＢＬ、ＥＵＶ、ＤＵＶ、またはコンタクトマスク、およびエッチング方法を使用して行われる。各電極の幅および厚みは、１ｎｍより大きい。
Ｐ８：ＳｉＮ_ｘ、ＳｉＯ_ｘ、Ａｌ_ｘＯ_ｙ、ＨｆＯ_ｘ、または他の誘電性材料のキャップ誘電性層を、ＣＶＤ、ＡＬＤ、ＰＶＤ、ＭＶＤ、電気めっき、またはスピンコーティングによって堆積させる。好ましい方法は、ＡＬＤである。

方法３：システイン残基のコドンを、テンプレートとしてΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子を有するプラスミドを使用して、他の残基（アラニン、バリン、セリン、グリシン、およびロイシンが挙げられるが、これらに限定されない）のコドンへと部位指向性変異誘発によって変異させる^１４。全ての変異を、ジデオキシ（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシングによって検証する。所望の変異体遺伝子を有するプラスミドを、ＢＬ－２１（ＤＥ３）細胞へと形質転換する。液体培養物を増殖させ、上記タンパク質の発現を、ＩＰＴＧで誘導する。３０℃で３時間の増殖後、上記細胞を採取し、溶解し、上記組換えタンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーによって精製する。上記タンパク質を、ヘパリンカラムを使用してさらに精製する。タンパク質を、後の使用のために－８０℃で貯蔵する。十分な発現および触媒活性を示すタンパク質変異体の遺伝子を有するプラスミドを、さらなるラウンドの部位指向性変異誘発のためのテンプレートとして使用する。

方法４：無水ＤＭＦ中の４－（アセチルチオ）安息香酸の溶液に、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、および触媒量のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を添加する。上記溶液を、０℃で３０分間撹拌し、続いて、無水ＤＭＦ中の（２－ヒドロキシフェニル）ジフェニルホスフィンの溶液を添加し、一晩撹拌する。次いで、その溶媒をロータリーエバポレーションによって除去し、その残渣を、ジクロロメタン中５％メタノールを使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、所望の生成物を得た。

方法５：エタノール中のＣＲ－１またはＣＲ－２の溶液を、先ず、ピロリジンで１時間処理して、窒素下でアセチル保護基を除去する。次いで、その溶液を、ナノギャップ基材に添加し、１時間インキュベートし、続いて、その基材をエタノールですすぐ。

方法６： Φ２９ＤＮＡポリメラーゼの特定の位置（３３、１１１、２７６、および３６９が挙げられるが、これらに限定されない）のコドンを、テンプレートとしてΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子を有するプラスミドを使用して、部位指向性変異誘発によってＴＡＧへと変異させる^１４。全ての変異を、ジデオキシ（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシングによって検証する。所望の変異遺伝子を有するプラスミドを、ｐＥＶＯＬ－ｐＡｚＦ^１５とともにＢＬ－２１（ＤＥ３）細胞へと形質転換する。液体培養物を増殖させ、上記タンパク質の発現を、ＩＰＴＧおよびアラビノースで誘導する。方法３に記載されるように、さらなる増殖およびタンパク質を行う。

方法７は、熱化学リソグラフィー法（ＴＣＮＬ）を使用してナノセンサを生成する、図１０において描写されたワークフローに関する。
Ｐ１：半導体または絶縁（例えば、ガラス）基材を調製する（１００１）。
Ｐ２：ＳｉＮ_ｘ、ＳｉＯｘ、Ａｌ_ｘＯ_ｙ、ＨｆＯ_ｘ、または他の誘電性材料の絶縁層（１００２）を、化学蒸着（ＣＶＤ）、原子層堆積（ＡＬＤ）、物理蒸着（ＰＶＤ）、分子層蒸着（ＭＶＤ）、電気めっき、またはスピンコーティングによって堆積させる。好ましい方法は、プラズマ強化ＣＶＤ（ＰＥＣＶＤ）または減圧ＣＶＤ（ＬＰＣＶＤ）である。
Ｐ３：一般的な金属、導電性材料、例えば、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｗ、Ｔｉ、Ｔａ、ＴｉＮ_ｘ、ＴａＮ_ｘ、Ａｌ、Ａｇ、他の金属、金属複合材、および／または半導体産業において使用される一般的なＨＫ／ＭＧ材料の底部電極層（１００３）を、Ｐ２において言及される方法によって堆積させる。好ましい方法は、ＡＬＤである。
Ｐ４：電極層（１００３）を、ラインパターン形成法（ＥＢＬ、ＥＵＶ、ＤＵＶ、コンタクトマスク）によってパターン形成し、続いて、電極層をより大きくエッチングして、所定の幅を有するギャップを作製する。
Ｐ５：温度応答性（ＴＣＮＬと適合性）である保護キャップ層（１００４）（例えば、ポリフタルアルデヒドポリマー（ＰＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない）をスピンコーティングする
Ｐ６－１：所定の容積のキャップ層（１００４）を熱化学的に除去し、１個の対になった電極（１００３）の所望の面積を露出する。
Ｐ６－２：所定の容積のキャップ層（１００４）を熱化学的に除去し、多数の対になった電極（１００３）を露出する。

以下は、本発明のいくつかの特許請求可能な重要な点である：
１．生体ポリマーの同定、特徴付けまたはシーケンシングのためのシステムであって、上記システムは、
（ａ）３ｎｍ～２０ｎｍの範囲に及ぶ距離だけ（平面ナノギャップ）または２ｎｍ～２０ｎｍの間の厚みを有する誘電性絶縁層によって（垂直ナノギャップ）分離された、第１の電極および第２の電極によって形成されるナノギャップ；
（ｂ）２個の官能基を有するタンパク質変異体であって、上記２個の官能基は、第１の官能基が上記第１の電極と、および上記第２の官能基が上記第２の電極と共有結合的に反応することによって、上記ナノギャップを架橋するために、上記ナノギャップに匹敵するかまたはこれより大きい距離だけ分離された、タンパク質変異体；
（ｃ）上記第１の電極と上記第２の電極との間に印加されるバイアス電圧；
（ｄ）上記タンパク質が化学反応を行う間に、上記タンパク質によって生成される電気シグナルを記録するデバイス；および
（ｅ）データ分析のためのソフトウェア、
を含むシステム。
２．酵素の活性をモニターするための方法であって、前記方法は、
（ａ）３ｎｍ～２０ｎｍの範囲に及ぶ距離だけ（平面ナノギャップ）または２ｎｍ～２０ｎｍの厚みを有する誘電性絶縁層によって（垂直ナノギャップ）分離された、第１の電極および第２の電極によって形成されるナノギャップを提供する工程；
（ｂ）電極への結合のために上記ナノギャップサイズに匹敵するかまたはこれより大きい距離だけ分離された、天然または非天然アミノ酸の側鎖に由来する少なくとも２個の官能基エーテルを有する酵素変異体を提供する工程；
（ｃ）上記第１の官能基が上記第１の電極と、および上記第２の官能基が上記第２の電極と共有結合的に反応することを通じて、上記酵素を結合させることによって上記ナノギャップを架橋する工程；
（ｄ）上記第１の電極と上記第２の電極との間でバイアス電圧を印加する工程；
（ｅ）上記酵素がその基質と反応することによって生成される上記電気シグナルを記録する工程；および
（ｆ）データ分析のためのソフトウェアを提供する工程、
を包含する方法。
３．生体ポリマーの同定、特徴付けまたはシーケンシングのための方法であって、上記方法は、
（ａ）３ｎｍ～２０ｎｍの範囲に及ぶ距離だけ（平面ナノギャップ）または２ｎｍ～２０ｎｍの間の厚みを有する誘電性絶縁層によって（垂直ナノギャップ）分離された、第１の電極および第２の電極によって形成されるナノギャップを提供する工程；
（ｂ）電極への結合のために上記ナノギャップサイズに匹敵するかまたはこれより大きい距離だけ分離された、天然または非天然アミノ酸の側鎖に由来する少なくとも２個の官能基エーテルを有するポリメラーゼ変異体を提供する工程；
上記第１の官能基が上記第１の電極と、および上記第２の官能基が上記第２の電極と共有結合的に反応することを通じて、上記酵素を結合させることによって上記ナノギャップを架橋する工程；
（ｃ）上記第１の電極と上記第２の電極との間でバイアス電圧を印加する工程；
（ｄ）上記酵素がその基質と反応することによって生成される上記電気シグナルを記録する工程；および
（ｅ）データ分析のためのソフトウェアを提供する工程、
を包含する方法。
４．熱化学リソグラフィー法（ＴＣＮＬ）を使用して、ナノギャップおよびナノギャップのアレイを製作する方法。
５．電極の表面上に単層を形成して、生物学的分子の非特異的吸着を防止する方法。
６．混合された単層の形成のために。化学的試薬ＣＲ－１およびＣＲ－２を合成するアプローチ。
７．アミド結合を形成することによって、ＣＲ－１またはＣＲ－２とタンパク質変異体との反応を介して、上記ナノギャップを架橋する方法。

概論：別段定義されなければ、本明細書で言及される全ての技術的刊行物、特許、および他の文書は、それらの全体において参考として援用され、本明細書で私用される科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明は、種々の実施形態の記載によって例証されており、かつこれらの実施形態はかなり詳細に記載されているが、本出願の範囲を制限するまたは何らかの方法で限定することは、本出願の意図するところではない。さらなる利点および改変は、当業者に容易に明らかである。従って、その最も広い局面の発明は、具体的な詳細、代表的なデバイス、装置および方法、ならびに示されかつ記載される例証的な例に限定されない。よって、出願人の包括的な発目の概念の趣旨から逸脱することなく、このような詳細からの逸脱が行われ得る。

Claims

生体ポリマーの同定、特徴付けまたはシーケンシングのためのシステムであって、前記システムは、
ａ．非導電性基材上でナノメートルの距離だけ（平面ナノギャップ）またはナノメートルの厚さを有する誘電性絶縁層によって（垂直ナノギャップ）分離された、第１の電極および第２の電極によって形成されるナノギャップ；ならびに
ｂ．少なくとも２個の官能基を有するように操作されたタンパク質であって、前記少なくとも２個の官能基は、前記少なくとも２個の官能基のうちの第１の官能基を通じて前記第１の電極に、および前記少なくとも２個の官能基のうちの第２の官能基を通じて前記第２の電極に共有結合的に結合させることによって前記ナノギャップを架橋する、前記ナノギャップサイズに匹敵した距離だけ分離されており、ここで前記２個の官能基は、互いに異なるかまたは同じである、タンパク質、
を含む、システム。
ａ．前記第１の電極と前記第２の電極との間に印加されるバイアス電圧；
ｂ．前記タンパク質が前記生体ポリマーと相互作用するかまたは生化学的反応を行うときに、前記タンパク質によって引き起こされる電流変動を記録するデバイス；および
ｃ．前記生体ポリマーまたは前記生体ポリマーのサブユニットを同定するかまたは特徴付けるデータ分析のためのソフトウェア、
をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
前記生体ポリマーは、天然であるか、合成されているか、改変されているか、およびこれらの組み合わせのいずれかの、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリサッカリド、およびそれらのアナログからなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
前記タンパク質は、天然であるか、変異されているか、合成されているか、およびこれらの組み合わせのいずれかの、酵素、レセプター、リガンド、抗原、および抗体からなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
前記酵素は、天然であるか、変異されているか、合成されているか、およびこれらの組み合わせのいずれかの、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡプライマーゼ、リボソーム、スクラーゼ、ラクターゼからなる群より選択される、請求項４に記載のシステム。
前記ＤＮＡポリメラーゼは、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼである、請求項５に記載のシステム。
前記官能基は、チオール、セレノール、アジドおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
前記タンパク質は、（ａ）Ｃ２２ＡおよびＣ２９０Ａ変異；（ｂ）Ｃ２２Ａ、Ｃ２９０Ａ、およびＣ４５５Ｖ変異；（ｃ）Ｇ１１１ＸおよびＶ２７６Ｘ変異であって、ここでＸは、システインもしくはセレノシステインまたは４－（アジドメチル）－Ｌ－フェニルアラニン、またはこれらの組み合わせである変異；（ｄ）Ｇ１１１ＣおよびＶ２７６Ｃ変異；（ｅ）Ｇ１１１ＵおよびＶ２７６Ｕ変異；（ｆ）Ｇ１１１ＸおよびＶ２７６Ｘ変異であって、ここでＸは、４－（アジドメチル）－Ｌ－フェニルアラニンである変異；ならびに（ｇ）これらの組み合わせからなる群より選択される変異を有する野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼの変異体である、請求項１に記載のシステム。
前記ナノギャップにおける前記電極の端部表面は、１’－トリフェニルホスファネイル４－（アセチルチオ）ベンゾエート（ＣＲ－１）もしくは１’－トリフェニルホスファネイル４－（（アセチルチオ）メチル）ベンゾエート（ＣＲ－２）またはチオール化オリゴ（エチレングリコール）（ＳＲ－１）もしくはチオール化ポリ（エチレングリコール）、または前記ＳＲ－１と前記ＣＲ－１もしくは前記ＣＲ－２との混合物で官能化するように構成される、請求項１に記載のシステム。
前記タンパク質上の前記２個の官能基間の距離は、別の関連のないタンパク質および／またはペプチドを、前記タンパク質へと遺伝子的に挿入することによって延ばされる、請求項１に記載のシステム。
前記関連のないタンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＳｍｔ３またはＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍに由来するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼであり、前記ペプチドは、ＰＡＰＡＰである、請求項１０に記載のシステム。
前記タンパク質は、野生型か、変異されているかまたは合成されているかのいずれかの、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼであり、前記関連のないタンパク質および／またはペプチドの挿入の位置は、Ｎ末端にあるか、または残基Ｋ１１０とＧ１１１、もしくはＫ１５０とＥ１５１、もしくはＹ１５６とＫ１５７との間にあるか、あるいはこれらの組み合わせである、請求項１０に記載のシステム。
前記電極は、Ａｕ（金）、Ｐｔ（白金）、Ｐｄ（パラジウム）、Ｗ（タングステン）、Ｔｉ（チタン）、Ｔａ（タンタル）、Ａｌ（アルミニウム）、Ａｇ（銀）、ＴｉＮｘ、ＴａＮｘ、他の金属複合材、半導体において使用される一般的なＨＫ／ＭＧ材料、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される金属材料を含む、請求項１に記載のシステム。
前記ナノギャップサイズは、約３ｎｍ～２０ｎｍである、請求項１に記載のシステム。
平面ナノギャップにおける前記２個の電極の端部は、前記ナノギャップにおいて実質的に楔形または実質的にテーパー状にされている、請求項１に記載のシステム。
前記ナノギャップにおける端部表面を除く前記電極の頂部表面は、誘電性層および／または化学的不動態化分子の単層によって実質的に覆われている、請求項１に記載のシステム。
前記不動態化分子は、ω－メルカプトＰＥＧ（ＳＲ－１）を含む、請求項１６に記載のシステム。
前記垂直ナノギャップは、ナノギャップのアレイを含み、前記ナノギャップのアレイは、誘電性層によって分離された第１の電極のアレイおよび単一の第２の電極によって形成される、請求項１に記載のシステム。
前記誘電性層は、ＳｉＮ_ｘ、ＳｉＯ_ｘ、Ａｌ_ｘＯ_ｙ、ＨｆＯ_ｘ、および他の誘電性材料ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含む、請求項１に記載のシステム。
前記２個の電極は、熱化学リソグラフィー法（ＴＣＮＬ）を使用して連続導電性ワイヤを切断することによって製作され、前記ギャップおよび前記電極は、ＴＣＮＬ適合性材料の層によって充填されているかまたは覆われており、前記ギャップを横断する一対の露出されたナノアイレットは、前記ナノギャップを形成する前記２個の電極の端部表面を表す、請求項１に記載のシステム。
前記ＴＣＮＬ適合性材料は、ポリフタルアルデヒドポリマー（ＰＰＡ）を含む、請求項２０に記載のシステム。
前記ナノギャップは、複数の露出されたナノアイレット対とともに同じ電極対上に形成された複数のナノギャップを含む、請求項２０に記載のシステム。
生体ポリマーを同定、特徴付け、またはシーケンシングするための方法であって、前記方法は、
ａ．第１の電極および第２の電極を、非導電性基材上に互いに隣り合って（平面ナノギャップ）、または一方を誘電性絶縁層によって分離された他方の頂部に（垂直ナノギャップ）配置することによってナノギャップを形成する工程、
ｂ．前記電極への結合のために前記ナノギャップサイズに匹敵する距離だけ分離された少なくとも２個の官能基を有するように操作されたタンパク質を提供する工程；
ｃ．前記タンパク質を、前記少なくとも２個の官能基のうちの第１の官能基を通じて前記第１の電極に、および前記少なくとも２個の官能基のうちの第２の官能基を通じて前記第２の電極に共有結合させることによって、前記ナノギャップを架橋する工程；
ｄ．前記第１の電極と前記第２の電極との間にバイアス電圧を印加する工程；
ｅ．前記タンパク質が前記生体ポリマーと相互作用するかまたは生化学的反応を行うときに、前記タンパク質によって引き起こされる電流変動を記録するデバイスを提供する工程；および
ｆ．前記生体ポリマーまたは前記生体ポリマーのサブユニットを同定するかまたは特徴付けるデータ分析のためのソフトウェアを提供する工程、
を包含する、方法。
前記生体ポリマーは、天然であるか、合成されているか、改変されているか、およびこれらの組み合わせのいずれかの、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリサッカリド、およびそれらのアナログからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
前記タンパク質は、天然であるか、変異されているか、合成されているか、およびこれらの組み合わせのいずれかの、酵素、レセプター、リガンド、抗原、および抗体からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
前記酵素は、天然であるか、変異されているか、合成されているか、およびこれらの組み合わせのいずれかの、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡプライマーゼ、リボソーム、スクラーゼ、ラクターゼからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼは、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２３に記載の方法。
前記官能基は、チオール、セレノール、アジドおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される。請求項２３に記載の方法。
前記タンパク質は、（ａ）Ｃ２２ＡおよびＣ２９０Ａ変異；（ｂ）Ｃ２２Ａ、Ｃ２９０Ａ、およびＣ４５５Ｖ変異；（ｃ）Ｇ１１１ＸおよびＶ２７６Ｘ変異であって、ここでＸは、システインまたはセレノシステインまたは４－（アジドメチル）－Ｌ－フェニルアラニン、またはこれらの組み合わせである変異；（ｄ）Ｇ１１１ＣおよびＶ２７６Ｃ変異；（ｅ）Ｇ１１１ＵおよびＶ２７６Ｕ変異；（ｆ）Ｇ１１１ＸおよびＶ２７６Ｘ変異であって、ここでＸは、４－（アジドメチル）－Ｌ－フェニルアラニンである変異；ならびに（ｇ）これらの組み合わせからなる群より選択される変異を有する野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼの変異体である、請求項２３に記載の方法。
前記ナノギャップにおける前記電極の端部表面は、１’－トリフェニルホスファネイル４－（アセチルチオ）ベンゾエート（ＣＲ－１）もしくは１’－トリフェニルホスファネイル４－（（アセチルチオ）メチル）ベンゾエート（ＣＲ－２）またはチオール化オリゴ（エチレングリコール）（ＳＲ－１）もしくはチオール化ポリ（エチレングリコール）、または前記ＳＲ－１と前記ＣＲ－１もしくは前記ＣＲ－２との混合物で官能化するように構成される、請求項２３に記載の方法。
前記タンパク質上の前記２個の官能基間の距離は、別の関連のないタンパク質および／またはペプチドを、前記タンパク質へと遺伝子的に挿入することによって延ばされる、請求項２３に記載の方法。
前記関連のないタンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＳｍｔ３またはＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍに由来するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼであり、前記ペプチドは、ＰＡＰＡＰである、請求項３１に記載の方法。
前記タンパク質は、野生型か、変異されているかまたは合成されているかのいずれかの、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼであり、前記関連のないタンパク質および／またはペプチドの挿入の位置は、Ｎ末端にあるか、または残基Ｋ１１０とＧ１１１、もしくはＫ１５０とＥ１５１、もしくはＹ１５６とＫ１５７との間にあるか、あるいはこれらの組み合わせである、請求項３１に記載の方法。
前記電極は、Ａｕ（金）、Ｐｔ（白金）、Ｐｄ（パラジウム）、Ｗ（タングステン）、Ｔｉ（チタン）、Ｔａ（タンタル）、Ａｌ（アルミニウム）、Ａｇ（銀）、ＴｉＮｘ、ＴａＮｘ、他の金属複合材、半導体において使用される一般的なＨＫ／ＭＧ材料、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される金属材料から作製される、請求項２３に記載の方法。
前記ナノギャップサイズは、約３ｎｍ～２０ｎｍである、請求項２３に記載の方法。
平面ナノギャップにおける前記２個の電極の端部は、前記ナノギャップにおいて実質的に楔形または実質的にテーパー状にされている、請求項２３に記載の方法。
前記ナノギャップにおける端部表面を除く前記電極の頂部表面は、誘電性層および／または化学的不動態化分子の単層によって実質的に覆われている、請求項２３に記載の方法。
前記不動態化分子は、ω－メルカプトＰＥＧ（ＳＲ－１）を含む、請求項３７に記載の方法。
前記垂直ナノギャップは、ナノギャップのアレイを含み、前記ナノギャップのアレイは、誘電性層によって分離された第１の電極のアレイおよび単一の第２の電極によって形成される、請求項２３に記載の方法。
前記誘電性層は、ＳｉＮ_ｘ、ＳｉＯ_ｘ、Ａｌ_ｘＯ_ｙ、ＨｆＯ_ｘ、および他の誘電性材料ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される材料で製作される、請求項２３に記載の方法。
前記２個の電極は、熱化学リソグラフィー法（ＴＣＮＬ）を使用して連続導電性ワイヤを切断することによって製作され、前記ギャップおよび前記電極はＴＣＮＬ適合性材料の層によって充填されているかまたは覆われており、前記ギャップを横断する一対の露出されたナノアイレットは、前記ナノギャップを形成する前記２個の電極の端部表面を表す、請求項２３に記載の方法。
前記ＴＣＮＬ適合性材料は、ポリフタルアルデヒドポリマー（ＰＰＡ）を含む、請求項４１に記載の方法。
前記ナノギャップは、複数の露出されたナノアイレット対とともに同じ電極対上に形成された複数のナノギャップを含む、請求項４１に記載の方法。
前記タンパク質は、少なくとも１個のアジド官能基を有するように変異され、前記電極端部表面のうちの少なくとも一方は、１’－トリフェニルホスファネイル４－（アセチルチオ）ベンゾエート（ＣＲ－１）もしくは１’－トリフェニルホスファネイル４－（（アセチルチオ）メチル）ベンゾエート（ＣＲ－２）で官能化され；ここで前記変異されたタンパク質は、前記ＣＲ－１または前記ＣＲ－２官能化電極に、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応を通じて、共有結合される、請求項２３に記載の方法。