KR20230002461A - 나노갭 디바이스에 직접 부착된 효소 돌연변이체 - Google Patents

나노갭 디바이스에 직접 부착된 효소 돌연변이체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체분자의 전자 감지를 위한 나노갭 디바이스에 관한 것이다.

Description

나노갭 디바이스에 직접 부착된 효소 돌연변이체
상호 참조
본 출원은 2020년 3월 25일에 출원된 미국 가 특허 출원 제62/994,712호의 이익을 주장하며, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
분야
본 발명은 생체분자를 감지 및 시퀀싱하기 위한 나노디바이스에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 단백질-브릿징된 나노갭 디바이스의 구성을 위한 물질의 조성물, 방법, 및 디바이스를 제공한다.
수 나노미터 거리만큼 분리된 2개의 전극에 단일 단백질 분자를 연결할 때 단일 단백질 분자의 전도도를 측정할 수 있다. 이러한 배열은 주사 터널 현미경(STM)을 사용하여 이의 금속 팁과 금속 기질을 각각의 동족 단백질을 인식하는 리간드 또는 항원으로 작용화함으로써 달성되었다.1 더욱이, 상기 STM 설정은 저항성 펄스로부터 효소, 예를 들어, Φ29 DNA 폴리머레이스의 생화학적 반응을 감지할 수 있다.2 이러한 과학적 발견은 전기 신호를 측정함으로써 효소의 구조적 움직임을 감지하는 전자 기술의 개발 가능성을 강력하게 시사한다. 그러나, 전극과 단백질 사이의 공유결합적 연결은 비-공유결합적 연결보다 접촉을 더 안정적으로 만들어, 개선된 전류 흐름을 생성한다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 효소의 활성을 모니터링하기 위한 전자 나노디바이스를 예시한다.
도 2는 구조적 영역과 시스테인 잔기가 표시되어 있는 Φ29 DNA 폴리머레이스의 결정 구조(PDB # 1XHX)를 도시한다.
도 3은 프라이머-주형 DNA 및 도입되는 뉴클레오타이드 기질과 복합된 Φ29 DNA 폴리머레이스의 결정 구조(PDB #: 2PYL)를 기반으로 하는, 본 발명의 야생형 Φ29 DNA 폴리머레이스 내의 돌연변이 부위를 예시한다.
도 4는 나노갭을 제작하는 공정을 도시한다.
도 5는 수직형 나노갭의 어레이를 제작하는 공정을 도시한다.
도 6은 프라이머-주형 DNA 및 도입되는 뉴클레오타이드 기질과 복합된 Φ29 DNA 폴리머레이스의 결정 구조(PDB #: 2PYL)를 기반으로 하는, 본 발명의 Φ29 DNA 폴리머레이스 내의 시스테인 돌연변이체의 구조를 도시한다.
도 7은 프라이머-주형 DNA 및 도입되는 뉴클레오타이드 기질과 복합된 Φ29 DNA 폴리머레이스의 결정 구조(PDB #: 2PYL)를 기반으로 하는, 본 발명의 Φ29 DNA 폴리머레이스 내의 셀레노시스테인 돌연변이체의 구조를 도시한다.
도 8은 프라이머-주형 DNA 및 도입되는 뉴클레오타이드 기질과 복합된 Φ29 DNA 폴리머레이스의 결정 구조(PDB #: 2PYL)를 기반으로 하는, 본 발명의 Φ29 DNA 폴리머레이스 내의 4-(아지도메틸)-L-페닐알라닌 돌연변이체의 구조를 도시한다.
도 9a 및 9b는 (a) 4-(아지도메틸)-L-페닐알라닌 돌연변이체 내의 아지드와 전극 상에 코팅된 단층 내의 트리페닐포스핀 에스테르의 반응; (b) 나노갭을 브릿징하는 아미드 결합의 형성을 통한 단백질의 전극으로의 직접 연결을 예시한다.
도 10은 열 화학 리소그래피 방법(TCNL)을 사용하여 나노갭을 제작하는 공정을 도시한다.
본 발명은 생체분자를 감지하기 위한 효소의 활성을 직접적으로 모니터링하는 전자 디바이스를 제공한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 디바이스는 수 나노미터만큼 분리되어 나노갭(102)을 형성하는 2개의 전극(101)을 갖는 회로를 포함한다. 각 전극은 이의 쐐기형 단부를 제외하고 유전체층(103)으로 부동태화된다. 야생형의 돌연변이체인, 효소(104)는 전극에 공유결합적으로 직접 부착되어, 나노갭을 브릿징한다. 공유결합적 부착은 상기 언급된 비-공유결합적 접촉과 비교하여 옴 저항을 감소시킨다. 효소의 활성은 바이어스(106) 하에 전기 신호 기록 디바이스(105)로 전기 신호를 기록함으로써 모니터링될 수 있다.
본 발명은 또한 본연의 기능에 영향을 미치지 않으면서 전극에 부착하기 위한 작용기를 보유하도록 돌연변이된 2개의 부위를 갖는 효소 돌연변이체를 제공한다. 효소는 천연의, 돌연변이된, 합성된 및 이들의 조합인, DNA 폴리머레이스, RNA 폴리머레이스, DNA 헬리케이스, DNA 라이게이스, DNA 엑소뉴클레이스, 역전사효소, RNA 프리메이스, 리보솜, 수크레이스, 락테이스일 수 있다. 효소는 또한 천연의, 돌연변이된 또는 합성된, 수용체, 리간드, 항원 및 항체 등으로 대체될 수 있다. 박테리오파지 Φ29 DNA 폴리머레이스가 본 개시내용에 제시된 본 발명의 장점 및 신규성을 입증하기 위한 예로서 선택된다. 일반적으로, 다른 효소에도 동일한 원리를 적용할 수 있다. Φ29 DNA 폴리머레이스는 DNA를 효율적으로 합성할 수 있는 가닥 변위 능력과 높은 가공성을 가진 효소이다.3 이는 또한 높은 뉴클레오티드 삽입 식별 값(104-106)5 및 중합 오류를 교정하는 3'에서 5'의 엑소뉴클레이스 활성6, 7으로 인해 다른 폴리머레이스4 보다 높은 충실도를 갖는다. 이 모든 것들은 이의 구조의 고유함에 기인한다. 결정 구조를 기반으로,8 Φ29 DNA 폴리머레이스는 5개의 구조적 서브도메인 - 각각, 엑소뉴클레이스, TPR1 및 TRP2, 손바닥, 엄지, 손가락 - 을 포함한다(도 2). 손바닥, 엄지 및 손가락은 반쯤 열린 오른손과 유사할 수 있다. 또한 말단 단백질 영역 1(Terminal Protein Regions 1; TPR1) 및 2(TPR2)라고 하는 단백질 프라이밍된 DNA 폴리머레이스 서브그룹에 특별히 존재하는 2개의 삽입이 있다. TPR1 서브도메인은 단백질 프라이밍된 개시를 위해 말단 단백질(TP)과의 상호작용에 관여한다. TPR2, 엄지 및 손바닥 서브도메인은 중합 활성 부위에서 업스트림 이중 DNA를 둘러싸는 내부 고리 유사 구조를 형성하여, 효소에 이의 고유한 높은 가공성을 제공한다. TPR2, 손바닥 및 손가락 서브도메인은, 엑소뉴클레이스 도메인과 함께 다운스트림 주형 가닥을 감싸는 터널을 형성한다. 이 좁은 치수의 터널은 dsDNA 결합을 방해하여, 주형이 활성 부위에 도달하도록 두 가닥의 용융을 강제하고, 폴리머레이스에 가닥 변위 능력을 제공한다. 시스테인의 티올 측쇄가 금속 표면과 반응한다는 것은 잘 알려져 있다. Φ29 DNA 폴리머레이스는 7개의 시스테인 잔기를 가지고 있지만, 단백질 내부에 위치하여(도 2에 도시됨), 이들이 금속 전극과 효율적으로 반응하는 것을 방지한다. 본 발명에서, Φ29 DNA 폴리머레이스 돌연변이체는 엑소뉴클레이스 및 TPR1 도메인 둘 다의 루프(부위 301 및 302, 도 3)에 2개의 아미노산 돌연변이를 함유한다. 돌연변이는 효소의 생화학적 기능에 영향을 미치지 않을 것이며, 2개의 돌연변이 부위는 상기 나노갭을 브릿징할 수 있는 거리만큼 분리되어 있다.
본 발명은 천연의, 합성된, 변형된 및 이들의 조합인, 생체분자, 예를 들어, 하지만 이에 제한되지는 않는, 핵산, 단백질, 다당류를 감지하고 시퀀싱하기 위한 나노디바이스를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 3 nm 내지 20 nm 범위의 거리만큼 분리된 2개의 나노-전극에 의해 형성된 나노갭을 제공한다. 이 2개의 전극의 단부는 이의 나노갭 측면에서 쐐기형이며, 이의 상단 표면은 유전체층 및/또는 화학적 부동태화 분자의 단층으로 덮여 있다. 나노갭을 제작하는 공정은 도 4에 도시되어 있으며 방법 1에 상세히 기술되어 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 유전체층에 의해 단일 하부 전극으로부터 수직으로 분리된 전극의 어레이를 제공한다(도 5). 이러한 유형의 형식은 나노갭의 보다 높은 패키징 밀도를 허용한다. 게다가, 모든 상부 전극은 동일한 전기적 극성을 가지며, 이는 하전된 분자가 상부 전극 사이에서 측면 접촉 가교결합을 할 수 없도록 하는 수단을 제공한다. 상부 전극 사이의 측면 거리는 기본적으로 상한이 없는, 수 나노미터(nm)에서 마이크로미터(um) 및 밀리미터(mm)에 이르는 수직 갭 크기에 필적하거나 이보다 더 크다.
일부 실시양태에서, 나노갭을 브릿징하는 데 사용되는 단백질은 돌연변이된 2 내지 7개의 시스테인을 포함하는 야생형 Φ29 DNA 폴리머레이스의 C 내지 X 돌연변이체이다. 폴리머레이스 조작 공정은 방법 3에 기술되어 있다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, C22A, C290A(M-2), 뿐만 아니라 C22A, C290A 및 C455V(M-4)를 갖는 돌연변이체는 야생형과 동일한 활성을 갖는다. 다른 돌연변이체는 야생형에 비해 덜 활성이다.
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 나노갭을 브릿징하는 데 사용되는 단백질은 G111C 및 V276C의 돌연변이를 갖는 야생형 Φ29 DNA 폴리머레이스의 돌연변이체이다(도 6). 새로 도입된 시스테인은 ~6.4 nm의 거리만큼 분리된 단백질의 루프에 위치한다. 이들은 천연 시스테인에 비해 더 빨리 접근할 수 있다. 2개의 조작된 시스테인의 티올기는 각각 금속 전극과 반응하여 나노갭을 공유결합적으로 브릿징한다.
일부 실시양태에서, 금속 표면은 ω-머캅토 PEG(SR-1, 하기에 도시됨)에 의해 부동태화되어 효소가 부착된 후 전극 상의 비특이적 흡착을 방지한다:
Figure pct00002
일부 실시양태에서, 단백질은 G111U 및 V276U(U는 셀레노시스테인임)의 돌연변이를 갖는 야생형 Φ29 DNA 폴리머레이스의 돌연변이체이다. Se-Au 결합은 유사한 SAM에서 S-Au 결합에 비해 더 안정적이지만, 둘 모두 유사한 총 확률의 전하 캐리어 터널링을 갖는다.9 셀레노시스테인은 ~5.2의 pKa를 갖고, 이는 이의 측쇄 셀레놀이 생리학적 pH에서 탈양성자화됨을 의미한다.10
한 실시양태에서, 본 발명은 금속 전극 상에 단층을 형성하기 위해 화학 시약(CR-1)을 합성하는 방법을 제공한다(반응식 1, 상세한 내용은 방법 4 참조). CR-1의 트리페닐포스파닐 에스테르는 아지도 작용기와 반응하여 아미드 결합을 형성한다.11
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 금속 전극 상에 단층을 형성하기 위해 방법 4에 기재된 바와 유사한 방식으로 화학 시약(CR-2)을 합성하는 방법을 제공한다(반응식 2). CR-2의 트리페닐포스파닐 에스테르는 아지도 작용기와 반응하여 아미드 결합을 형성한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 실시양태에서, 전극의 표면은 CR-1, CR-2, 또는 SR-1과 CR-1 또는 CR-2의 혼합물의 단층으로 덮인다. 본 발명은 상기 단층을 형성하는 방법을 제공한다(방법 5).
한 실시양태에서, 본 발명은 상기 나노갭을 브릿징하기 위해 G111X 및 V276X(X는 4-(아지도메틸)-L-페닐알라닌임)의 돌연변이된 Φ29 DNA 폴리머레이스(도 8)를 제공한다. 돌연변이된 단백질은 방법 6에 기재된 방법으로 발현된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 슈타우딩거 반응을 통해 나노갭을 브릿징하기 위해 CR-1 또는 CR-2로 코팅된 전극에 아지도 돌연변이체를 부착하는 방법을 제공한다. 도 9a에 도시된 바와 같이, 아지드는 극미량의 슈타우딩거 반응을 통해 트리페닐포스파닐 에스테르와 반응하여 도 9b에 도시된 아미드 결합을 형성하여 단백질을 전극에 연결시킨다.
또 다른 실시양태에서, 비관련된 단백질(비제한적인 예는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 Smt3 및 스키스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum)으로부터의 글루타티온-S-트랜스퍼레이스를 포함함)은 Φ29 DNA 폴리머레이스의 2개의 2차 구조 요소(잔기 K110과 G111, K150과 E151, 및 Y156과 K157을 포함하나 이에 제한되지는 않음) 사이에 유전적으로 삽입된다. 촉매 활성을 유지하는 이러한 단백질은 야생형 Φ29 DNA 폴리머레이스에 대해 너무 넓을 수 있는, 연장된 갭을 브릿징하기 위해 상기 기재된 실시양태와 함께 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 비관련된 단백질(비제한적인 예는 사카로마이세스 세레비시아에로부터의 Smt3 및 스키스토소마 자포니쿰으로부터의 글루타티온-S-트랜스퍼레이스를 포함함)은 N-말단 Φ29 DNA 폴리머레이스에 삽입되고 강성 펩타이드(하나의 비제한적인 예는 서열 PAPAP임)에 의해 연결된다. 촉매 활성을 유지하는 이러한 단백질은 야생형 Φ29 DNA 폴리머레이스에 대해 너무 넓을 수 있는, 연장된 갭을 브릿징하기 위해 상기 기재된 실시양태와 함께 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 열 화학 리소그래피 방법(TCNL)12, 13을 사용하여 전도성 층 상에 단일 나노갭 또는 다중 나노갭을 제공한다, 방법 7 참조.
방법론
방법 1 은 도 4에 기술된 작업 흐름과 관련되며, 하기 절차에 따라 상기 나노갭을 생성한다.
P1: 반도체 또는 절연(유리) 기판(401)을 준비한다.
P2: 화학 기상 증착(CVD), 원자층 증착(ALD), 물리 기상 증착(PVD), 분자 기상 증착(MVD), 전기도금, 또는 스핀 코팅에 의해 SiNx, SiOx 또는 기타 유전체 재료의 절연층(402)을 증착한다. 바람직한 방법은 플라즈마 증강 CVD(PECVD) 또는 저압 CVD(LPCVD)이다.
P3: 화학 기상 증착(CVD), 원자층 증착(ALD), 물리 기상 증착(PVD), 분자 기상 증착(MVD), 전기도금 또는 스핀 코팅에 의해 SiNx, SiOx 또는 임의의 유전체 재료의 또 다른 절연층(403)을 증착한다. 바람직한 방법은 플라즈마 증강 CVD(PECVD) 또는 저압 CVD(LPCVD)이다.
P4: 10,000 내지 500,000 uC/cm2의 선량으로 EBL에 의해 전극선 패턴화 공정을 수행한 후, 마스크로서 포토레지스트(404)를 사용하여 포토리소그래피를 수행한다.
P5: 반응성 이온 에칭(Reactive Ion Etching; RIE) 또는 이온 빔 에칭(Ion Beam Etching; IBE)을 사용하여 선 에칭을 수행한 후, RIE 또는 IBE를 수행하고, 절연층(402) 상에서 중단하거나 또는 약간 과잉 에칭한 후, 포토레지스트 마스크를 제거한다.
P6: 전도성 재료, 예컨대 Au, Pt, Pd, W, Ti, Ta, TiNx, TaNx, Al, Ag 또는 기타 금속 복합재 및/또는 반도체에 사용되는 일반적인 HK/MG 재료의 전극층(405)을 증착한다. 이는 또한 우수한 접착력과 전기/화학적 특성을 제공하기 위해 2개 이상의 층의 조합일 수 있다. 이는 P2에서 언급한 방법으로 제조할 수 있으며, 가장 바람직한 방법은 ALD이다.
P7: 화학적 기계적 연마 공정을 수행한 후, 평탄화(CMP)를 수행한다.
P8: CMP 터치-업을 완료한다.
P9: 화학 기상 증착(CVD), 원자층 증착(ALD), 물리 기상 증착(PVD), 분자 기상 증착(MVD), 전기도금 또는 스핀 코팅 등에 의해 SiNx, SiOx, AlxOy, HfOx 또는 기타 유전체 재료의 유전체층(406)을 증착한다. 바람직한 방법은 ALD이다.
P10: 10,000 내지 500,000 uC/cm2 선량으로 EBL을 사용하여 전극 갭 패턴화 공정을 수행한 후, 포토리소그래피를 수행한다.
P11: RIE 또는 IBE를 사용하여 갭 에칭 공정을 수행하고, 절연층(402) 상에서 중단하거나 또는 약간 과잉 에칭한다.
P12: 포토레지스트를 걷어낸다.
P13: 상호 접속부 및 패드 패턴화를 떼어낸 후, 삭제한다.
방법 2 는 도 5에 기술된 작업 흐름과 관련되며, 하기 절차에 따라 상기 나노갭의 어레이를 생성한다.
P1: 반도체 또는 절연(예를 들어, 유리) 기판(501)을 준비한다.
P2: 화학 기상 증착(CVD), 원자층 증착(ALD), 물리 기상 증착(PVD), 분자 기상 증착(MVD), 전기도금 또는 스핀 코팅에 의해 SiNx, SiOx, AlxOy, HfOx 또는 기타 유전체 재료의 절연층(502)을 증착한다. 바람직한 방법은 플라즈마 증강 CVD(PECVD) 또는 저압 CVD(LPCVD)이다.
P3 & P4: P2에 언급된 방법에 의해, 일반적인 금속 전도성 재료, 예컨대 Au, Pt, Pd, W, Ti, Ta, TiNx, TaNx, Al, Ag, 기타 금속, 금속 복합재, 및/또는 반도체 산업에서 사용되는 일반적인 HK/MG 재료의 하부 전극층(503)을 증착한다. 바람직한 방법은 ALD이다. 또한, 전극층은 선 패턴화 방법(EBL, EUV, DUV, 콘택트 마스크)에 의해 패턴화되어 1 nm 초과의 전극 폭을 가질 수 있다.
P5: CVD, ALD, PVD, MVD, 전기도금 또는 스핀 코팅(504)에 의해 SiNx, SiOx, AlxOy, HfOx 또는 기타 유전체 재료의 나노갭으로서 작용하도록 유전체층(504)을 증착한다. 바람직한 방법은 ALD이다. 갭 크기는 일반적으로 단백질 분자의 직경과 비슷하다.
P6 & P7: P2에 언급된 방법에 의해, 전도성 재료, Au, Pt, Pd, W, Ti, Ta, TiNx, TaNx, Al, Ag, 기타 금속, 금속 복합재, 및/또는 반도체 산업에서 사용되는 일반적인 HK/MG 재료를 포함하는 상부 전극 어레이(505)를 제작한다. 바람직한 방법은 ALD이다. 전극 어레이의 제작은 선 패턴화 - EBL, EUV, DUV 또는 콘택트 마스크 - 및 에칭 방법을 사용하여 수행된다. 각 전극의 폭과 두께는 1 nm 초과이다.
P8: CVD, ALD, PVD, MVD, 전기도금 또는 스핀 코팅에 의해 SiNx, SiOx, AlxOy, HfOx 또는 기타 유전체 재료의 캡 유전체층을 증착한다. 바람직한 방법은 ALD이다.
방법 3 : 주형으로서 Φ29 DNA 폴리머레이스에 대한 유전자를 보유하는 플라스미드를 사용하여, 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 시스테인 잔기에 대한 코돈을 다른 잔기(알라닌, 발린, 세린, 글리신 및 류신을 포함하나 이에 제한되지 않음)에 대한 코돈으로 돌연변이시켰다.14 모든 돌연변이를 디데옥시 (생어) 시퀀싱에 의해 확인하였다. 원하는 돌연변이체 유전자를 보유하는 플라스미드를 BL-21(DE3) 세포로 형질전환시켰다. 액체 배양물을 성장시키고, 단백질의 발현을 IPTG를 사용하여 유도하였다. 30℃에서 3시간 동안 성장시킨 후, 세포를 수확하고, 용해하고, 재조합 단백질을 Ni-NTA 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질을 헤파린 컬럼을 사용하여 추가로 정제하였다. 단백질은 나중에 사용하기 위해 -80℃에 저장하였다. 충분한 발현 및 촉매 활성을 나타내는 단백질 돌연변이체에 대한 유전자를 보유하는 플라스미드를 추가 라운드의 부위 지정 돌연변이 유발을 위한 주형으로 사용하였다.
방법 4 : 무수 DMF 중 4-(아세틸티오)벤조산의 용액에, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC), 및 촉매량의 디메틸아미노피리딘(DMAP)을 첨가하였다. 용액을 0℃에서 30분 동안 교반한 후, 무수 DMF 중 용액 (2-히드록시페닐)디페닐포스핀을 첨가하고 밤새 교반하였다. 이후, 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 디클로로메탄 중 5% 메탄올을 사용하는 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물을 얻었다.
방법 5 : 에탄올 중 CR-1 또는 CR-2의 용액을 먼저 1시간 동안 피롤리딘으로 처리하여 질소 하에 아세틸 보호기를 제거하였다. 이후, 용액을 나노갭 기질에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션한 후, 에탄올로 기질을 세정하였다.
방법 6 : Φ29 DNA 폴리머레이스의 특정 위치(33, 111, 276 및 369를 포함하지만 이에 제한되지 않음)에 있는 코돈을 주형으로서 Φ29 DNA 폴리머레이스에 대한 유전자를 보유하는 플라스미드를 사용하여 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 TAG로 돌연변이시켰다14. 모든 돌연변이를 디데옥시 (생어) 시퀀싱에 의해 확인하였다. 원하는 돌연변이체 유전자를 보유하는 플라스미드를 pEVOL-pAzF15와 함께 BL-21(DE3) 세포로 공동 형질전환시켰다. 액체 배양물을 성장시키고, 단백질의 발현을 IPTG와 아라비노스를 사용하여 유도하였다. 방법 3에 기술된 바와 같이, 추가 성장 및 단백질 발현을 수행하였다.
방법 7 은 열 화학 리소그래피 방법(TCNL)을 사용하여 나노센서를 제조하기 위한 도 10에 기술된 작업 흐름과 관련된다.
P1: 반도체 또는 절연(예를 들어, 유리) 기판(1001)을 준비한다.
P2: 화학 기상 증착(CVD), 원자층 증착(ALD), 물리 기상 증착(PVD), 분자 기상 증착(MVD), 전기도금 또는 스핀 코팅에 의해 SiNx, SiOx, AlxOy, HfOx 또는 기타 유전체 재료의 절연층(1002)을 증착한다. 바람직한 방법은 플라즈마 증강 CVD(PECVD) 또는 저압 CVD(LPCVD)이다.
P3: P2에 언급된 방법에 의해, 일반적인 금속 전도성 재료, 예컨대 Au, Pt, Pd, W, Ti, Ta, TiNx, TaNx, Al, Ag, 기타 금속, 금속 복합재 및/또는 반도체 산업에서 사용되는 일반적인 HK/MG 재료의 하부 전극층(1003)을 증착한다. 바람직한 방법은 ALD이다.
P4: 선 패턴화 방법(EBL, EUV, DUV, 콘택트 마스크)에 의해 전극층(1003)을 패턴화한 후, 전극을 더 크게 에칭하여 기정된 폭으로 갭을 생성한다.
P5: 폴리프탈알데히드 고분자(PPA)와 같으나 이에 제한되지 않는 온도 반응성(TCNL과 호환 가능)인 보호 캡 층(1004)을 스핀 코팅한다.
P6-1: 캡 층(1004)의 기정된 부피를 열화학적으로 제거하여, 단일 쌍 전극(1003)의 원하는 영역을 노출시킨다.
P6-2: 기정된 부피의 캡 층(1004)을 열화학적으로 제거하여, 다중 쌍 전극(1003)의 복수의 영역을 노출시킨다.
하기는 본 발명의 일부 청구 가능한 중요점이다:
1. 하기를 포함하는 생체고분자의 식별, 특징규명, 또는 시퀀싱을 위한 시스템:
(a) 3 nm 내지 20 nm 범위의 거리만큼 분리된(평면형 나노갭) 또는 2 nm 내지 20 nm의 두께를 갖는 유전체 절연층에 의해 분리된(수직형 나노갭) 제1 전극 및 제2 전극에 의해 형성된 나노갭;
(b) 제1 작용기를 제1 전극과, 그리고 제2 작용기를 제2 전극과 공유결합적으로 반응시킴으로써 상기 나노갭을 브릿징하기 위한 나노갭 크기에 필적하거나 이보다 더 큰 거리만큼 분리된 2개의 작용기를 보유하는 단백질 돌연변이체;
(c) 제1 전극과 제2 전극 사이에 인가되는 바이어스 전압;
(d) 상기 단백질이 화학적 반응을 수행함에 따라 발생하는 전기 신호를 기록하는 디바이스; 및
(e) 데이터 분석용 소프트웨어.
2. 효소의 활성을 모니터링하기 위한 방법:
(a) 3 nm 내지 20 nm 범위의 거리만큼 분리된(평면형 나노갭) 또는 2 nm 내지 20 nm의 두께를 갖는 유전체 절연층에 의해 분리된(수직형 나노갭) 제1 전극 및 제2 전극에 의해 형성된 나노갭을 제공하는 단계;
(b) 전극에의 부착을 위한 나노갭 크기에 필적하거나 이보다 더 큰 거리만큼 분리된, 천연 또는 비천연 아미노산의 측쇄로부터의 적어도 2개의 작용기 에테르를 보유하는 효소 돌연변이체를 제공하는 단계;
(c) 제1 전극과 공유결합적으로 반응하는 제1 작용기, 및 제2 전극과 공유결합적으로 반응하는 제2 작용기를 통해 효소를 부착함으로써 상기 나노갭을 브릿징하는 단계;
(d) 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스 전압을 인가하는 단계;
(e) 효소가 이의 기질과 반응하여 생성된 전기 신호를 기록하는 단계; 및
(f) 데이터 분석용 소프트웨어를 제공하는 단계.
3. 생체고분자의 식별, 특징규명, 또는 시퀀싱을 위한 방법:
(a) 3 nm 내지 20 nm 범위의 거리만큼 분리된(평면형 나노갭) 또는 2 nm 내지 20 nm의 두께를 갖는 유전체 절연층에 의해 분리된(수직형 나노갭) 제1 전극 및 제2 전극에 의해 형성된 나노갭을 제공하는 단계;
(b) 전극에의 부착을 위한 나노갭 크기에 필적하거나 이보다 더 큰 거리만큼 분리된, 천연 또는 비천연 아미노산의 측쇄로부터의 적어도 2개의 작용기 에테르를 보유하는 폴리머레이스 돌연변이체를 제공하는 단계;
제1 전극과 공유결합적으로 반응하는 제1 작용기, 및 제2 전극과 공유결합적으로 반응하는 제2 작용기를 통해 효소를 부착함으로써 상기 나노갭을 브릿징하는 단계;
(c) 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스 전압을 인가하는 단계;
(d) 효소가 이의 기질과 반응하여 생성된 전기 신호를 기록하는 단계; 및
(e) 데이터 분석용 소프트웨어를 제공하는 단계.
4. 열 화학 리소그래피 방법(TCNL)을 사용하여 나노갭 및 나노갭의 어레이를 제작하는 방법.
5. 전극 표면 상에 단층을 형성하여 생물학적 분자의 비특이적 흡착을 방지하는 방법.
6. 혼합된 단층의 형성을 위해 화학 시약 CR-1 및 CR-2를 합성하기 위한 접근법.
7. 아미드 결합을 형성함으로써 단백질 돌연변이체와 CR-1 또는 CR-2의 반응을 통해 상기 나노갭을 브릿징하는 방법.
일반 사항: 달리 정의되지 않는 한, 본원에 언급된 모든 기술 간행물, 특허 및 기타 문서는 그 전문이 참고로 포함되며, 본원에 사용된 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명이 다양한 실시양태의 설명에 의해 예시되었고 이들 실시양태가 상당히 상세하게 설명되었지만, 출원서의 범위를 한정하거나 어떠한 방식으로든 제한하려는 것은 출원인의 의도가 아니다. 추가적인 이점 및 수정은 당업자에게 용이하게 나타날 것이다. 따라서 더 넓은 양태에서 본 발명은 특정 세부 사항, 대표적인 디바이스, 장치 및 방법, 그리고 도시되고 설명된 예시적인 실시예로 제한되지 않는다. 따라서, 출원인의 일반적인 발명 사상의 정신을 벗어나지 않으면서 이러한 세부 사항에서 벗어날 수 있다.
인용 문헌
Figure pct00005
Figure pct00006

Claims (44)

  1. 생체고분자의 식별, 특징규명, 또는 시퀀싱을 위한 시스템으로서,
    a. 비전도성 기판 상에서 나노미터 거리만큼 분리된(평면형 나노갭) 또는 나노미터 두께를 갖는 유전체 절연층에 의해 분리된(수직형 나노갭) 제1 전극 및 제2 전극에 의해 형성된 나노갭; 및
    b. 적어도 2개의 작용기 중 제1 작용기를 통해 제1 전극에 공유결합적으로 부착하고 적어도 2개의 작용기 중 제2 작용기를 통해 제2 전극에 공유결합적으로 부착함으로써 상기 나노갭을 브릿징하는 나노갭 크기에 필적한 거리만큼 분리된 적어도 2개의 작용기를 보유하도록 조작된 단백질로서, 여기서 2개의 작용기는 서로 상이하거나 동일한 것인 단백질
    을 포함하는, 생체고분자의 식별, 특징규명, 또는 시퀀싱을 위한 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    a. 제1 전극과 제2 전극 사이에 인가되는 바이어스 전압;
    b. 단백질이 생체고분자와 상호작용하거나 생화학적 반응을 수행함에 따라 단백질에 의해 유도되는 전류 변동을 기록하는 디바이스; 및
    c. 생체고분자 또는 생체고분자의 서브유닛을 식별하거나 특징규명하는 데이터 분석용 소프트웨어
    를 추가로 포함하는 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 생체고분자가 천연의, 합성된, 변형된 및 이들의 조합인, DNA, RNA, 단백질, 탄수화물, 폴리펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 다당류 및 이들의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 단백질이 천연의, 돌연변이된, 합성된 및 이들의 조합인, 효소, 수용체, 리간드, 항원, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 효소가 천연의, 돌연변이된, 합성된 및 이들의 조합인, DNA 폴리머레이스, RNA 폴리머레이스, DNA 헬리케이스, DNA 라이게이스, DNA 엑소뉴클레이스, 역전사효소, RNA 프리메이스, 리보솜, 수크레이스, 락테이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  6. 제5항에 있어서, DNA 폴리머레이스가 Φ29 DNA 폴리머레이스인 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 작용기가 티올, 셀레놀, 아지드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  8. 제1항에 있어서, 단백질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 갖는 야생형 Φ29 DNA 폴리머레이스의 돌연변이체인 시스템: (a) C22A 및 C290A 돌연변이; (b) C22A, C290A 및 C455V 돌연변이; (c) X가 시스테인 또는 셀레노시스테인 또는 4-(아지도메틸)-L-페닐알라닌, 또는 이들의 조합인 G111X 및 V276X 돌연변이; (d) G111C 및 V276C 돌연변이; (e) G111U 및 V276U 돌연변이; (f) X가 4-(아지도메틸)-L-페닐알라닌인 G111X 및 V276X 돌연변이; 및 (g) 이들의 조합.
  9. 제1항에 있어서, 나노갭에서 전극의 단부 표면이 1'-트리페닐포스파닐 4-(아세틸티오)벤조에이트(CR-1) 또는 1'-트리페닐포스파닐 4-((아세틸티오)메틸)벤조에이트(CR-2) 또는 티올화 올리고(에틸렌 글리콜)(SR-1) 또는 티올화 폴리(에틸렌 글리콜), 또는 SR-1과 CR-1 또는 CR-2의 혼합물로 작용화하도록 구성된 것인 시스템.
  10. 제1항에 있어서, 단백질 상의 2개의 작용기 사이의 거리가 비관련된 다른 단백질 및/또는 펩타이드를 단백질에 유전적으로 삽입함으로써 연장되는 것인 시스템.
  11. 제10항에 있어서, 비관련된 단백질이 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 Smt3 또는 스키스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum)으로부터의 글루타티온-S-트랜스퍼레이스이고, 펩타이드가 PAPAP인 시스템.
  12. 제10항에 있어서, 단백질이 야생형, 돌연변이된 또는 합성된 Φ29 DNA 폴리머레이스이고, 비관련된 단백질 및/또는 펩타이드의 삽입 위치가 N-말단에 있거나 잔기 K110과 G111 사이, 또는 K150과 E151 사이, 또는 Y156과 K157 사이, 또는 이들의 조합에 있는 것인 시스템.
  13. 제1항에 있어서, 전극이 Au(금), Pt(백금), Pd(팔라듐), W(텅스텐), Ti(티타늄), Ta(탄탈륨), Al(알루미늄), Ag(은), TiNx, TaNx, 기타 금속 복합재, 반도체에 사용되는 일반적인 HK/MG 재료 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 금속 재료를 포함하는 것인 시스템.
  14. 제1항에 있어서, 나노갭 크기가 약 3 nm 내지 20 nm인 시스템.
  15. 제1항에 있어서, 평면형 나노갭의 2개의 전극의 단부가 실질적으로 쐐기 모양이거나 나노갭에서 실질적으로 테이퍼링된 것인 시스템.
  16. 제1항에 있어서, 나노갭에서 단부 표면을 제외한 전극의 상부 표면이 유전체층 및/또는 화학적 부동태화 분자의 단층에 의해 실질적으로 덮이는 것인 시스템.
  17. 제16항에 있어서, 부동태화 분자가 ω-머캅토 PEG(SR-1)를 포함하는 것인 시스템.
  18. 제1항에 있어서, 수직형 나노갭이 제1 전극 및 유전체층에 의해 분리된 단일 제2 전극의 어레이에 의해 형성된 나노갭의 어레이를 포함하는 것인 시스템.
  19. 제1항에 있어서, 유전체층이 SiNx, SiOx, AlxOy, HfOx, 및 기타 유전체 재료 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 재료를 포함하는 것인 시스템.
  20. 제1항에 있어서, 2개의 전극은 열 화학 리소그래피 방법(TCNL)을 사용하여 연속 전도성 와이어를 통해 절단함으로써 제작되고, 갭 및 전극은 TCNL 호환 재료의 층으로 충전되거나 덮이고 갭을 가로지르는 한 쌍의 노출된 나노섬이 나노갭을 형성하는 2개의 전극의 단부 표면을 나타내는 것인 시스템.
  21. 제20항에 있어서, TCNL 호환 재료가 폴리프탈알데하이드 고분자(PPA)를 포함하는 것인 시스템.
  22. 제20항에 있어서, 나노갭이 복수의 노출된 나노섬 쌍을 갖는 동일한 전극 쌍 상에 형성된 복수의 나노갭을 포함하는 것인 시스템.
  23. 생체고분자의 식별, 특징규명, 또는 시퀀싱을 위한 방법으로서,
    a. 제1 전극 및 제2 전극을 비전도성 기판 상에 서로 인접하게 배치하거나(평면형 나노갭), 하나를 유전체 절연층에 의해 분리된 다른 하나의 위에 배치하여(수직형 나노갭) 나노갭을 형성하는 단계;
    b. 전극에의 부착을 위해 나노갭 크기에 필적한 거리만큼 분리된 적어도 2개의 작용기를 보유하도록 조작된 단백질을 제공하는 단계;
    c. 단백질을, 적어도 2개의 작용기 중 제1 작용기를 통해 제1 전극에 공유결합적으로 부착하고 적어도 2개의 작용기 중 제2 작용기를 통해 제2 전극에 공유결합적으로 부착함으로써 나노갭을 브릿징하는 단계;
    d. 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스 전압을 인가하는 단계;
    e. 상기 단백질이 생체고분자와 상호작용하거나 생화학적 반응을 수행함에 따라 상기 단백질에 의해 유도되는 전류 변동을 기록하는 디바이스를 제공하는 단계; 및
    f. 생체고분자 또는 생체고분자의 서브유닛을 식별하거나 특징규명하는 데이터 분석용 소프트웨어를 제공하는 단계
    를 포함하는, 생체고분자의 식별, 특징규명, 또는 시퀀싱을 위한 방법.
  24. 제23항에 있어서, 생체고분자가 천연의, 합성된, 변형된, 및 이들의 조합인, DNA, RNA, 단백질, 탄수화물, 폴리펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 다당류, 및 이들의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 단백질이 천연의, 돌연변이된, 합성된 및 이들의 조합인, 효소, 수용체, 리간드, 항원 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  26. 제23항에 있어서, 효소가 천연의, 돌연변이된, 합성된 및 이들의 조합인, DNA 폴리머레이스, RNA 폴리머레이스, DNA 헬리케이스, DNA 라이게이스, DNA 엑소뉴클레이스, 역전사효소, RNA 프리메이스, 리보솜, 수크레이스, 락테이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  27. 제23항에 있어서, DNA 폴리머레이스가 Φ29 DNA 폴리머레이스인 방법.
  28. 제23항에 있어서, 작용기가 티올, 셀레놀, 아지드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 제23항에 있어서, 단백질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 갖는 야생형 Φ29 DNA 폴리머레이스의 돌연변이체인 방법: (a) C22A 및 C290A 돌연변이; (b) C22A, C290A 및 C455V 돌연변이; (c) X가 시스테인 또는 셀레노시스테인 또는 4-(아지도메틸)-L-페닐알라닌, 또는 이들의 조합인 G111X 및 V276X 돌연변이; (d) G111C 및 V276C 돌연변이; (e) G111U 및 V276U 돌연변이; (f) X가 4-(아지도메틸)-L-페닐알라닌인 G111X 및 V276X 돌연변이; 및 (g) 이들의 조합.
  30. 제23항에 있어서, 나노갭에서 전극의 단부 표면이 1'-트리페닐포스파닐 4-(아세틸티오)벤조에이트(CR-1) 또는 1'-트리페닐포스파닐 4-((아세틸티오)메틸)벤조에이트(CR-2) 또는 티올화 올리고(에틸렌 글리콜)(SR-1) 또는 티올화 폴리(에틸렌 글리콜), 또는 SR-1과 CR-1 또는 CR-2의 혼합물로 작용화하도록 구성된 것인 방법.
  31. 제23항에 있어서, 단백질 상의 2개의 작용기 사이의 거리가 다른 비관련된 단백질 및/또는 펩타이드를 단백질에 유전적으로 삽입함으로써 연장되는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 비관련된 단백질이 사카로마이세스 세레비시아에로부터의 Smt3 또는 스키스토소마 자포니쿰으로부터의 글루타티온-S-트랜스퍼레이스이고, 펩타이드가 PAPAP인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 단백질이 야생형, 돌연변이된 또는 합성된 Φ29 DNA 폴리머레이스이고, 비관련된 단백질 및/또는 펩타이드의 삽입 위치가 N-말단에 있거나 잔기 K110과 G111 사이, 또는 K150과 E151 사이, 또는 Y156과 K157 사이, 또는 이들의 조합에 있는 것인 방법.
  34. 제23항에 있어서, 전극이 Au(금), Pt(백금), Pd(팔라듐), W(텅스텐), Ti(티타늄), Ta(탄탈륨), Al(알루미늄), Ag(은), TiNx, TaNx, 기타 금속 복합재, 반도체에 사용되는 일반적인 HK/MG 재료 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 금속 재료로 제조된 것인 방법.
  35. 제23항에 있어서, 나노갭 크기가 약 3 nm 내지 20 nm인 방법.
  36. 제23항에 있어서, 평면형 나노갭의 2개의 전극의 단부가 실질적으로 쐐기 모양이거나 나노갭에서 실질적으로 테이퍼링된 것인 방법.
  37. 제23항에 있어서, 나노갭에서 단부 표면을 제외한 전극의 상부 표면이 유전체층 및/또는 화학적 부동태화 분자의 단층에 의해 실질적으로 덮이는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 부동태화 분자가 ω-머캅토 PEG(SR-1)를 포함하는 것인 방법.
  39. 제23항에 있어서, 수직형 나노갭이 제1 전극 및 유전체층에 의해 분리된 단일 제2 전극의 어레이에 의해 형성된 나노갭의 어레이를 포함하는 것인 방법.
  40. 제23항에 있어서, 유전체층이 SiNx, SiOx, AlxOy, HfOx, 및 기타 유전체 재료 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 재료로 제작되는 것인 방법.
  41. 제23항에 있어서, 2개의 전극은 열 화학 리소그래피 방법(TCNL)을 사용하여 연속 전도성 와이어를 통해 절단함으로써 제작되고, 갭 및 전극은 TCNL 호환 재료의 층으로 충전되거나 덮이고 갭을 가로지르는 한 쌍의 노출된 나노섬이 나노갭을 형성하는 2개의 전극의 단부 표면을 나타내는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, TCNL 호환 재료가 폴리프탈알데하이드 고분자(PPA)를 포함하는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 나노갭이 복수의 노출된 나노섬 쌍을 갖는 동일한 전극 쌍 상에 형성된 복수의 나노갭을 포함하는 것인 방법.
  44. 제23항에 있어서, 단백질이 적어도 하나의 아지드 작용기를 갖도록 돌연변이되고 전극 단부 표면 중 적어도 하나가 1'-트리페닐포스파닐 4-(아세틸티오)벤조에이트(CR-1) 또는 1'-트리페닐포스파닐 4-((아세틸티오)메틸)벤조에이트(CR-2)로 작용화되고; 여기서 돌연변이된 단백질은 슈타우딩거 반응을 통해 CR-1 또는 CR-2 작용화된 전극에 공유결합적으로 부착되는 것인 방법.
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