JP2023513083A - ナノ電子工学測定のために作出された高分子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、バイオポリマーの配列決定／特定のための機能性構成要素として分子ナノワイヤーに組み込むための酵素を作出する方法を提供する。この酵素は、天然、変異、または合成のいずれかであるＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡプライマーゼ、リボソーム、スクラーゼ、またはラクターゼを含むがこれらに限定されない。本開示は、バイオポリマーの感知／特定または配列決定のために電子回路に組み込むように作出された生体分子に関する。

Description

相互参照
本出願は、参照によって本明細書に全体を組み入れた２０２０年１月３１日出願の米国特許仮出願第６２／９６８，９２９号の利益を主張する。
分野
本開示は、バイオポリマーの感知／特定または配列決定のために電子回路に組み込むように作出された生体分子に関する。
背景
生物系で通常見られるポリマー高分子は一般的に、特定の順序で連結した基本要素の規定された組、いわゆる配列を含む。この配列は、ポリマーの三次元構造および生物系におけるその機能を規定する。タンパク質の場合、この機能は酵素反応または結合事象であってもよく、炭水化物の場合、この機能は認識要素であってもよい。核酸の場合、この機能は遺伝情報の担体であってもよい。したがって、ポリマー高分子の配列を正確に決定することは、その機能を理解する上で重要である。
核酸の特定の場合では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列決定技術の第１世代（「サンガー配列決定法」）は、バルク溶液中で実施される酵素反応によって得られる重合生成物を分析する方法を使用した［１］。理想的な条件下でのこの技術のためのリード長は、１０００塩基対（ｂｐ）またはそれより長くなる可能性がある。この取り組みは、国際的なヒトゲノムプロジェクトに使用され、最初のヒトゲノム配列を生成するのに１０年以上かかり、約２７億ドルの費用がかかった［２、３］。この技術は、環状プラスミドなどの小さな遺伝子エレメントの配列決定には適しているが、大規模なゲノミクスのツールとしては使用できない。次世代配列決定（ＮＧＳ）技術は、１０００ドルのゲノムに向けて開発され、ヒトゲノムの配列決定の費用および時間を削減した［４、５］。しかし、ＮＧＳは、リード長が短いため、ヒトゲノムにおける複雑な構造の変形形態および反復配列が障害となっている。
さらに、ＮＧＳはサンガー配列決定法よりも精度が低いため、特に変異を決定するために、ディープシークエンシングが必要になることが多い。標識ヌクレオチドの代わりに標識酵素を使用するＮＧＳ変形形態でも短いリードしか生成しない［６］。
このため、１分子レベルで核酸を解読する第３世代配列決定技術が開発された。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの配列決定プラットフォームは、個々の組み込み事象によって発せられる蛍光シグナルを検出するｚｅｒｏ－ｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ（ＺＭＷ）を使用する［７］。この技術は長いＤＮＡ配列を読み取ることができるが、比較的高い誤り率が欠点である。したがって、個別化医療および疫学を含む幅広い適用で、精度がより高く、分析がより簡単で、展開費用がより低い配列決定プラットフォームが所望されている。
その他の取り組みでは、配列決定のためにナノポアを使用する。Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって販売されているものなどの生物学的ナノポアは、膜貫通タンパク質ポアを使用する［８］。この技術によってリード長は延長するが、精度が低いという欠点もあるため、ＮＧＳと組み合わせて使用されることが多い。生物学的ナノポアチップは、製造費用が高く、手頃な価格の配列決定や幅広い展開の障害となっている。
半導体技術によって作製された無機材料の固体ナノポアは、費用対効果の高い方法で大量生産することができる［９］。しかし、固体ナノポアの形状は、生物学的ポアの形状のように正確に制御することができない。したがって、イオン電流を測定するのではなく、配列決定のために固体ナノポアに感知機構を組み込むことが必要である。
ナノポアおよびバイオセンサーの様々な配置が記載されてきた。１つの取り組み［１０］は、ヌクレオチド三リン酸類似体からハイブリダイゼーションプローブをナノポアに供給するバイオセンサーを使用して検出可能な応答を惹起する。［１１］で一般的に記載されている別の方法は、ナノギャップの両側を架橋分子で接続し、ヌクレオチド組み込み事象によって生じる関連バイオセンサーのコンフォメーション変化を伝達する。これらの構成要素の理想的な構成によって、感度および再現性を最大化させる。
系の個々の構成要素はまた、組成物において変化することがある。例えば、架橋はカーボンナノチューブまたはＤＮＡナノワイヤーを含んでいてもよいが、後者には、化学的に定義され、別個の場所で官能化できるという明確な利点がある。しかし、１個のＤＮＡ分子の伝導率については、特にその長さが３０ｎｍを超える場合、意見が分かれている。
Ｅ．ｃｏｌｉおよびバクテリオファージｐｈｉ２９（ｐｈｉ２９ ｐｏｌ）由来のＤＮＡポリメラーゼは、バイオセンサーとして日常的に使用されている。［１１］、［１２］、［１３］、および［１４］で認められるものなどの開示は、プローブ、バイオセンサー、およびリンカーの無数の構成を広く対象としているが、それらを達成する方法については詳細には教示していない。例えば、［１３］で提案された１つの実施形態は、充分に確立されたチオール－マレイミドカップリング化学を用いて、バイオセンサーをプローブに選択的にコンジュゲートすることを記載しており、そうするには、バイオセンサーの他のシステイン残基を全て除去することが必要で、これは並大抵の作業ではないことをさらに認めている。ｐｈｉ２９ｐｏｌの特定の場合、７個の天然システイン残基を他の天然に存在する残基に変異させなければならないだろう。酵素はかろうじて安定しており、１個の変異でも有害な機能的結果を引き起こす可能性があるため、そうするのはかなりの量の実験を必要とする非常に困難な課題である［１５、１６］。他の場合では、システイン残基は酵素の構造または機能に不可欠である。例えば、パパインプロテアーゼは、その触媒サイクルにシステイン残基を利用する［１７］。別の例として、抗体は通常、システイン残基によって形成されるジスルフィド結合を使用してその構造を維持している［１８］。
開示［１３］はまた、非限定的な例として「クリックケミストリー」を引用して、遺伝的に組み込まれた非天然アミノ酸を使用してコンジュゲーションを容易にする実施形態を記載している。いくつかの異なる種類の生体適合コンジュゲーション化学が記載されているが、バイオセンサーをプローブに連結するのに最も適したものを決定するには、かなりの量の実験を必要とする。
問題のある開示のもう１つの例は［１２］に認められ、複数の連結点を使用してバイオセンサーを付着させ、バイオセンサーをプローブに密接にカップリングさせることによって感度の増強を容易にする。しかし、タンパク質の表面はコンジュゲーションを可能にする多くの部位を提供しており、プローブへの最適な接触点または複数の接触点を決定するには、広範な実験が必要である。所定の付着点がなければ、酵素プローブの向きを制御することができず、プローブ機能に顕著な影響を与える可能性がある。さらに、付着部位の数を増加させると、構成の可能性が組合せ的に増加する。
タンパク質融合タグは、先行技術において、タンパク質の発現、溶解度、および活性を増強するために広く使用されたことがある［１９］。ポリメラーゼの特定の場合では、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのタンパク質Ｓｓｏ７ｄを融合させると、ＤＮＡとの会合を維持することによって、熱安定性ポリメラーゼの処理能力が向上することが示された［２０］。別の例では、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をｐｈｉ２９ｐｏｌに融合させて精製を助けているが、そうするにはトレハロースを添加してタンパク質の溶解度を保持することが必要であった［２１］。そのような添加剤を使用せずに発現および溶解性を増強するポリメラーゼの実施形態が望ましい。
図１は、分子デバイスの感知構成要素として作出されたタンパク質の原理を示す。
図２は、クリックアンカーによってタンパク質とコンジュゲートしたＤＮＡｄｕｏを示す。
図３は、コンジュゲーションおよび固定化のためにタンパク質に組み込まれたセレノシステインおよびその誘導体の構造を示す。
図４は、コンジュゲーションおよび固定化のためにタンパク質に組み込まれたフェニルアラニン由来の非天然アミノ酸を示す。
図５は、コンジュゲーションおよび固定化のためにタンパク質に組み込まれたリジン由来の非天然アミノ酸を示す。
図６は、本発明で作出されたＤＮＡの構成の概略図を示す。
図７は、一部の天然残基が非天然アミノ酸に置換された溶解性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼを示す（空間充填モデルとして表示した）。
図８は、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの７個の天然システイン残基を示す（空間充填モデルとして表示した）。
図９は、修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡワイヤーの構造を示す。
図１０は、ＤＮＡの内部修飾に使用される機能性分子を示す。
図１１は、化合物１００７および１００８の合成経路を示す。
図１２は、ｐｈｉ２９ポリメラーゼの２個のシステイン変異体のゲル分析画像を示す。Ａ）ＳＵＭＯ－ｐｈｉ２９変異体Ｃ１１ＡおよびＣ１１ＶをＮｉ－ＮＴＡカラムから溶出し（ＥＬ１およびＥＬ２）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。分子量ラダー（Ｍ）との比較に基づくと、上のバンドは完全長の生成物であり、下のバンドは切断された生成物である。Ｂ）異なる量のＳＵＭＯ－ｐｈｉ２９ポリメラーゼ変異体Ｃ１１Ｖの活性を方法に記載されているようにアッセイし、アガロースゲル電気泳動によって分析した。ＷＴは野生型ＳＵＭＯ－ｐｈｉ２９ポリメラーゼである。
図１３は、特定の非天然アミノ酸残基を含有するＳＵＭＯ－ｐｈｉ２９ポリメラーゼ変異体の特性を示す。Ａ）異なる量のＳＵＭＯ－ｐｈｉ２９ポリメラーゼ野生型（ＷＴ）およびＹ３６９ｐＡｚＦ変異体をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。Ｂ）異なる量のＳＵＭＯ－ｐｈｉ２９ポリメラーゼ変異体Ｙ３６９ｐＡｚＦの活性を方法に記載されているようにアッセイし、アガロースゲル電気泳動によって分析した。ＷＴは野生型のＳＵＭＯ－ｐｈｉ２９ポリメラーゼであり、ＴはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのｐｈｉ２９ポリメラーゼである。Ｕは単位を示す。Ｃ）ＳＵＭＯ－ｐｈｉ２９ポリメラーゼ変異体Ｅ３３ｐＡｚＦおよびＹ３６９ｐＡｚＦを異なる濃度のＰＥＧ５Ｋ－ＤＢＣＯ分子（変異体の下の数字、μＭ）と共に２０℃でインキュベートし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。Ｄ）ｐｈｉ２９ポリメラーゼ変異体Ｅ３３ｐＡｚＦを示されたＤＢＣＯコンジュゲートと共に４℃でインキュベートし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。「ＤＮＡ」とは、内部アミンを介してＤＢＣＯ－ＰＥＧ５－ＴＦＰエステルに予めコンジュゲートされた一本鎖ＤＮＡ分子である。
発明の概要
本発明は、バイオポリマーの配列決定／特定のための機能性構成要素として、分子ナノワイヤーに組み込むための酵素を作出する方法を提供する。前記酵素は、天然の、変異された、または合成されたＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡプライマーゼ、リボソーム、スクラーゼ、またはラクターゼを含むがこれらに限定されない。
バイオポリマーは、天然または合成のＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、多糖類などを含むがこれらに限定されず、分子ナノワイヤーは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡまたはＤＮＡ二重鎖）、ＤＮＡｄｕｏ（２本のｄｓＤＮＡ）、［２４］で開示されたようなＤＮＡナノ構造、またはそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。ＤＮＡｄｕｏは単純なＤＮＡナノ構造であり、１本のＤＮＡ二重鎖と比較して伝導率が増加している。以下では、ＤＮＡｄｕｏおよびＤＮＡポリメラーゼを使用して、酵素を作出する方法を例示する。同じ取り組みまたは原理は、１本のＤＮＡ二重鎖およびＤＮＡナノ構造、センサーとして酵素を使用する様々なバイオポリマーの配列決定および／または特定に適用される。
図１は、典型的なＤＮＡ配列決定デバイスを示しており、ＤＮＡポリメラーゼ（タンパク質センサー１０１）は、ＤＮＡｄｕｏ（１０２）と称する一対の二本鎖ＤＮＡ分子を含むＤＮＡｄｕｏに付着しており、ギャップサイズが２ｎｍから１０００ｎｍ、好ましくは５ｎｍから１００ｎｍ、最も好ましくは５ｎｍから３０ｎｍであるナノギャップを形成する２つの電極（１０３）に並列に接続されている。このデバイスは、鋳型とともにＤＮＡプライマーへの個々のヌクレオシド三リン酸の組み込みを触媒する酵素のプロセスを、これらの化学的事象によって引き起こされるＤＮＡナノワイヤーの伝導率の変化を記録することによってリアルタイムでモニターすることができる。したがって、そのようなデバイスの１つの適用は、１分子レベルでの核酸の配列決定である。配列決定処理能力を向上させるために、これらのナノギャップ／ナノワイヤーデバイスは、［２４］に記載されているように、約１００から約１億、好ましくは１万から１００万のサイズのアレイを形成することができる。例えば、より長いリード長、精度の向上、および運用コストの削減などの利点がもたらされるだろう。
発明の詳細な説明
本発明の一実施形態では、前記酵素は、２個の所定の位置で直交する官能基（２０１、図２）を含有する非天然アミノ酸残基を有する作出されたＤＮＡポリメラーゼである。酵素活性と協調して電流が変動するように、ＤＮＡｄｕｏの所定の場所でＤＮＡｄｕｏに明白に付着している。２個の付着点によって、ＤＮＡｄｕｏに対するポリメラーゼの方向をより良好に制御することができる。
本発明の一部の実施形態では、前記酵素は、予め選択された部位（７０２、図７）に非天然アミノ酸を用いて作出された野生型ＤＮＡポリメラーゼである。この選択された場所は、酵素の触媒活性を妨害することなく酵素事象を感知するように、デバイスに高い感度をもたらす。１つの例は、エキソヌクレアーゼドメインに１個の非天然アミノ酸を配置し、フィンガードメインにもう１個を配置することである。他の例は、フィンガードメインに１個の非天然アミノ酸を配置し、他の場所はパーム（ｐａｌｍ）、ＴＰＲ１、サム（ｔｈｕｍｂ）、およびΔＴＰＲ２ドメインの非排他的なリストから選択することを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、変異体ＤＮＡポリメラーゼは、溶解性および活性の増強を付与する遺伝的にコードされた融合タンパク質（７０１）（配列番号１）を含む。融合ポリメラーゼは、１個または２個だけのシステイン残基を含有するように作出されており（図８、配列番号２）、タンパク質は部位特異的にバイオコンジュゲーションするためにチオールアクセプターと反応することができる。このような変異体は、バイオセンサーとして機能する触媒活性を保持している。
一部の実施形態では、融合ポリメラーゼは、やや酸性の条件下で所望の部位で求電子剤と選択的に反応するために、そのシステインの一部をセレノシステイン（３０１、図３）で置換して作出されている。
一部の実施形態では、タンパク質工学に使用される非天然アミノ酸は、セレノシステインの誘導体（図３に示されているが、これらに限定されない）であり、方法論で記載されたクローニング方法によって前記タンパク質および変異体に組み込まれる。
一部の実施形態では、前記非天然アミノ酸は天然のフェニルアラニンの誘導体であり、方法論で記載されたクローニング方法によって前記タンパク質および変異体に組み込まれる。フェニルアラニン誘導体の一部を図４に示すが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、前記非天然アミノ酸は天然のリジンの誘導体であり、方法論で記載されたクローニング方法によって前記タンパク質および変異体に組み込まれる。リジン誘導体の一部を図５に示すが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本発明は、前記タンパク質または変異体を組み込み、タンパク質の動きを電気シグナルに伝達するための媒体として、分子接合部を形成するＤＮＡｄｕｏを提供する。各ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定の場合、作出されたタンパク質またはポリメラーゼにおける前記非天然アミノ酸の１個と反応することができる官能化された１個のヌクレオシド（Ｎｍ）、およびナノギャップにおいてそれぞれ２つの電極に付着するためにその２つの末端に２個の官能基（Ｂｍ）を有する（図６（ａ））。
一部の実施形態では、前記ＤＮＡ接合部は１本のＤＮＡ二重鎖（ｄｓＤＮＡ）であり、その各鎖は、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定の場合、前記タンパク質またはポリメラーゼに作出された前記非標準非天然アミノ酸と反応することができる１個の官能化されたヌクレオシド（Ｎｍ）、およびナノギャップにおいて２つの電極に付着するために二重鎖の各末端に１個または２個の官能基（Ｂｍ）を有する（図６（ｂ）＆（ｃ））。さらに、ＤＮＡ配列は回文構造であってもよく、二重鎖が溶液中でオリゴヌクレオチドから自発的に形成されるのを可能にする。
一部の実施形態では、前記ＤＮＡ接合部は、［２４、２５］で開示されたようなＤＮＡナノ構造であり、ナノ構造の２個の予め定義された場所は、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定の場合、前記タンパク質またはポリメラーゼに作出された前記非標準非天然アミノ酸と反応することができる官能化されたヌクレオシド（Ｎｍ）、およびナノギャップにおいて２つの電極に付着するためにＤＮＡナノ構造の各末端に１個または２個の官能基（Ｂｍ）を有する（図６（ｄ））。
一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡは、その内部塩基の１個にアミノ官能基を有する。例えば、アミノ基はピリミジン塩基の５位またはプリン塩基の７位に位置する。これらのヌクレオシドの一部を図９に示すが、これらに限定されない。これらのヌクレオシドは、それぞれのホスホルアミダイトに変換することができ、自動ＤＮＡ合成装置によってＤＮＡに組み込むことができる。
アミノ化されたＤＮＡは、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定の場合、前記タンパク質またはポリメラーゼに作出された前記非天然アミノ酸と特異的に反応することができる官能基でさらに官能化する。その一部を図１０に示す。これらの各化合物は、アルキルアミンと迅速に反応することができるＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含有する。これらの化合物は、１００７および１００８以外は市販されている。化合物１００７および１００８は、図１１に示した方法によって合成される。まず、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下で１，２，４－トリアジン－６－プロパン酸（１１０１）をＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と反応させて１００７を合成する。化合物１００８は、２－（４－（ブロモメチル）フェニル）－５－（メチルチオ）－１，３，４－オキサジアゾール（１１０２）［２２］から出発し、４つのステップを経て合成する。
本発明の一部の実施形態では、ＤＮＡｄｕｏは一般的に、３から５０ナノメートルの範囲の距離で隔てられた２つの電極を架橋することができる長さの２本の二本鎖ＤＮＡを含む。一部の他の実施形態では、ＤＮＡｄｕｏは、２本の二本鎖ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＸＮＡ、またはＤＮＡからＲＮＡ、ＤＮＡからＰＮＡ、ＤＮＡからＸＮＡ、ＲＮＡからＰＮＡ、ＲＮＡからＸＮＡ、もしくはＰＮＡからＸＮＡのハイブリッドによって置換される。
一部の実施形態では、単独の、またはＤＮＡｄｕｏもしくはＤＮＡナノ構造の一部であるＤＮＡ二重鎖の配列は、１０から１５０塩基対の範囲の長さのＧＣ塩基対を少なくとも５０％含有する。標準塩基に加えて、ＤＮＡ二重鎖はまた、その伝導率を改善するための修飾核酸塩基および／または塩基類似体を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡｄｕｏは、自己相補配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドから溶液中で自発的に形成される回文構造二本鎖ＤＮＡを含む。ＤＮＡｄｕｏ中の両方の二本鎖ＤＮＡ分子は、らせん軸に沿って極性のない同じ対称性を有する。ＤＮＡｄｕｏを分子ワイヤーとして使用してナノギャップを架橋すると、その２つの末端を２つの電極のいずれかに付着させることができ、これは、電気的極性を引き起こさないだろう。
方法論
クローニング。融合タンパク質およびｐｈｉ２９由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｈｉ２９ｐｏｌ）をコードする配列を有する遺伝子カセットを、ｐＥＴ２１ａなどのＴ７ベースのプラスミドに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させた。点変異は、所望の変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって作製した［２３］。組換えタンパク質は、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースを使用して精製した。典型的な収量は、培養物１リットル当たり約３０ｍｇである（図１２Ａおよび１３Ａ）。
活性のアッセイ。典型的な非限定的な反応では、酵素（１００ｎｇ）を、プラスミドＤＮＡ（２０ｎｇ）、ｄＮＴＰ、および一本鎖ＤＮＡプライマーを含有する緩衝溶液中で３０℃でインキュベートする。生成物はＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離し、蛍光によって可視化する（図１２Ｂおよび１３Ｂ）。
ＤＢＣＯによるＤＮＡ官能化。典型的な非限定的な反応では、アミノ官能基を含有する一本鎖ＤＮＡ（５０μＭ）をＤＢＣＯ－ＰＥＧ５－ＴＦＰエステル（２．５ｍＭ）と共に四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中、２５℃で一晩インキュベートする。未反応のリンカーは、エタノール沈殿によって除去する。
高分子－酵素コンジュゲーション。典型的な非限定的な反応では、ｐ－アジドフェニルアラニン残基を含有する酵素（３０μＭ）を、ＤＢＣＯコンジュゲート高分子（１５０μＭ）を含有する緩衝液中で２０℃（図１３Ｃ）または４℃（図１３Ｄ）で一晩インキュベートする。
配列リスト
配列番号１
種類：タンパク質
有機体：合成配列
その他の情報：ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質
Figure 2023513083000001
 配列番号２
種類：タンパク質
有機体：合成配列
その他の情報：１個のシステインを有するＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質
Figure 2023513083000002
 配列番号３
種類：タンパク質
有機体：合成配列
その他の情報：１個のシステインおよび１個の遺伝的にコードされた非標準アミノ酸を有するＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質
Figure 2023513083000003
 配列番号４
種類：タンパク質
有機体：合成配列
その他の情報：２個の遺伝的にコードされた非標準アミノ酸を有するＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質
Figure 2023513083000004
本発明の請求できる項目は以下を含むが、これらに限定されない。
一実施形態は、２つの電極間のナノギャップを架橋するＤＮＡ二重鎖またはＤＮＡｄｕｏである。前記ＤＮＡ二重鎖またはＤＮＡｄｕｏは以下を含む。
ａ．Ａ型、またはＢ型、またはＺ型の二本鎖ＤＮＡ分子。
ｂ．天然のものまたは非天然のものを含む二本鎖核酸らせん。
ｃ．生体分子によって接続された二本鎖分子。
ｄ．末端にリンカーを含有する二本鎖分子。
ｅ．１００から２００，０００Ｄａの範囲の分子量の分子を含む認識分子を付着するための内部官能基を含有する二本鎖分子。
ｆ．核酸塩基が、天然のもの、修飾されたもの、または合成されたもの、またはそれらの組合せのいずれかである１本の核酸二重鎖（二本鎖）、核酸三重鎖、核酸四重鎖、核酸オリガミ構造（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｏｒｉｇａｍｉ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、およびそれらの組合せなどの［２５］で開示されたような二本鎖ＤＮＡの伝導率を増加させる修飾ヌクレオチドを含有する二本鎖ＤＮＡ。
一実施形態は、所定の位置に上記の前記非標準アミノ酸残基のうちの１個を少なくとも含有するように作出された機能性タンパク質である。
ａ．前記タンパク質は、溶解性および安定性が増強した別のタンパク質と融合される。
ｂ．前記タンパク質は、作出された分子ワイヤーと自発的かつ正確に共有結合性の接続を形成する。
一実施形態は、所定の位置に上記の前記非標準アミノ酸残基のうちの２個を含有するように作出された機能性タンパク質であり、前記タンパク質は、作出された分子ワイヤーの２個の所定の位置で自発的かつ正確に共有結合性の接続を形成する。
一実施形態は、酵素を生体分子および有機分子で標識する方法である。
一実施形態は、機能性分子の上記の前記ＮＨＳ、ＰＦＰ、またはＴＦＰエステルまたはその他の化学的に活性のある種と反応することができる求核剤を内部に有するＤＮＡ二重鎖またはＤＮＡｄｕｏまたはＤＮＡナノ構造である。
ａ．前記分子ワイヤーは、２から１０００ｎｍ、好ましくは５から１００ｎｍ、最も好ましくは５から３０ｎｍの範囲の長さを有する。
ｂ．前記分子ワイヤーは、作出されたタンパク質と自発的かつ正確に共有結合性の接続を形成する。
一実施形態は、所定の場所に異なる官能基を有するＤＮＡを作出する方法である。
総論
本明細書で記載した刊行物、特許、およびその他の文書は全て、参照によって全体を組み入れる。
別段の定義がない限り、本明細書で使用した技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本発明は、様々な実施形態の説明によって例示され、これらの実施形態はかなり詳細に記載されているが、出願の範囲を限定したり、いかなる方法によっても制限したりすることを本出願人は意図していない。さらなる利点および変更は、当業者には容易に理解されるであろう。したがって、そのより広い態様において、本発明は、特定の詳細、代表的なデバイス、装置および方法、ならびに図示され説明された例示的な例に限定されない。したがって、出願人の一般的な発明概念の趣旨から逸脱することなく、そのような詳細からは逸脱していてもよい。
参考文献
Figure 2023513083000005
Figure 2023513083000006
Figure 2023513083000007

Claims (38)

  1. バイオポリマーを特定する、特徴付ける、または配列決定するための系であって、
    ａ．第１の電極と第２の電極を互いに隣接させて形成されるナノギャップ、
    ｂ．分子ワイヤーの１つの末端を前記第１の電極に、前記分子ワイヤーの別の末端を前記第２の電極にそれぞれ化学結合によって付着させることによって前記ナノギャップを架橋する前記ナノギャップに相当する長さを有する核酸分子ワイヤーであって、前記分子ワイヤー内の所定の位置にある２個の内部ヌクレオシドが官能化されており、タンパク質または感知分子の付着を可能にし、前記分子ワイヤーが各末端に１個または複数の付着部位を有する、核酸分子ワイヤー、ならびに
    ｃ．前記バイオポリマーと相互作用するか、または前記バイオポリマーとの化学的もしくは生化学的反応を実行することができる、前記分子ワイヤー上の２個の対応する官能化部位に付着した２個の付着部位を有する感知プローブであって、前記２個の付着部位が、前記分子ワイヤー上の２個の官能化部位と相互作用し、前記感知プローブの方向を制御する、感知プローブ、
    を含む、系。
  2. ａ．前記第１の電極と前記第２の電極との間に印加されるバイアス電圧、
    ｂ．前記感知プローブと前記バイオポリマーとの相互作用によって引き起こされる前記分子ワイヤーを通る電流変動を記録するデバイス、および
    ｃ．前記バイオポリマーまたは前記バイオポリマーのサブユニットを特定するまたは特徴付けるデータ分析のためのソフトウェア、
    をさらに含む、請求項１に記載の系。
  3. 前記バイオポリマーが、天然のもの、合成されたもの、修飾されたもの、およびそれらの組合せのいずれかであるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、多糖類、およびそれらの類似体からなる群より選択される、請求項１に記載の系。
  4. 前記感知プローブが、天然のもの、変異されたもの、合成されたもの、およびそれらの組合せのいずれかである核酸プローブ、酵素、受容体、リガンド、抗原、および抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の系。
  5. 前記酵素が、天然のもの、変異されたもの、合成されたもの、およびそれらの組合せのいずれかであるＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡプライマーゼ、リボソーム、スクラーゼ、ラクターゼからなる群より選択される、請求項４に記載の系。
  6. 前記酵素が、所定の部位に非天然アミノ酸を含むように作出されている、請求項４に記載の系。
  7. タンパク質工学に使用される前記非天然アミノ酸が、天然のもの、合成されたもの、変異されたもの、またはそれらの組合せのいずれかであるセレノシステインまたはフェニルアラニンまたはリジンまたはそれらの誘導体である、請求項６に記載の系。
  8. 前記ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ上の２個の作出された部位が、フィンガードメインにおける１個の部位と共に、またエキソヌクレアーゼ、またはパーム、またはサム、またはＴＰＲ１またはＤＴＰＲ２ドメインのいずれかにおける他の部位と共に構成される、請求項５に記載の系。
  9. 前記ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼが、前記分子ワイヤーに付着するために１個または２個だけのシステイン残基を含むように作出されている、請求項５に記載の系。
  10. 前記ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼが少なくとも１個のセレノシステインを含むように作出されているか、またはそれらのポリメラーゼにおける少なくとも１個のシステインがセレノシステインで置換されている、請求項５に記載の系。
  11. 前記分子ワイヤーが、１本の核酸二重鎖、核酸二重鎖ｄｕｏ、核酸三重鎖、核酸四重鎖、核酸オリガミ構造、およびそれらの組合せからなる群より選択され、前記核酸鎖がＡ型、Ｂ型、またはＺ型のいずれかであり、核酸塩基が天然または非天然のいずれかである、請求項１に記載の系。
  12. 前記１本の核酸二重鎖が、各鎖の所定の位置に官能化核酸塩基、各二重鎖の末端または各鎖の末端に１個の付着部位を含み、前記核酸二重鎖ｄｕｏが、各二重鎖に１個の官能化核酸塩基および各二重鎖の末端に１個の付着部位を有する、請求項１１に記載の系。
  13. 核酸二重鎖の配列が回文構造である、請求項１１に記載の系。
  14. 前記核酸分子ワイヤーが、所定の位置の内部塩基の１個にアミノ官能基を含む、請求項１に記載の系。
  15. アミノ官能基を有する前記塩基が、アジド、マレイミド、環外オレフィンマレイミド、フラン、ジベンゾシクロオクタン、テトラジン、トリアジン、オキサジアゾールスルホンを含むがこれらに限定されない活性化カルボキシレートを有する部分でさらに官能化されている、請求項１４に記載の系。
  16. 前記核酸二重鎖ｄｕｏが、天然のもの、修飾されたもの、合成されたもの、またはそれらの組合せのいずれかである２本の二本鎖ＰＮＡ、ＸＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＰＮＡ、ＤＮＡ／ＸＮＡ、ＲＮＡ／ＰＮＡ、ＲＮＡ／ＸＮＡもしくはＰＮＡ／ＸＮＡのハイブリッドを含むか、あるいは天然のもの、修飾されたもの、合成されたもの、またはそれらの組合せのいずれかである２本の二本鎖ＰＮＡ、ＸＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＰＮＡ、ＤＮＡ／ＸＮＡ、ＲＮＡ／ＰＮＡ、ＲＮＡ／ＸＮＡもしくはＰＮＡ／ＸＮＡのハイブリッドによって置換されている、請求項１１に記載の系。
  17. 前記核酸分子ワイヤーが、少なくとも５０％のＧＣ塩基対を含む、請求項１に記載の系。
  18. 前記２つの電極の末端間のナノギャップサイズまたは距離が、約２から１０００ｎｍ、または約５から１００ｎｍ、または約５から３０ｎｍである、請求項１に記載の系。
  19. 前記ナノギャップが複数のナノギャップを含み、それぞれが一対の電極、分子ワイヤー、感知プローブ、および１個のナノギャップに関連付けられる任意の特色を含む、請求項１に記載の系。
  20. バイオポリマーを特定する、特徴付ける、または配列決定するための方法であって、
    ａ．第１の電極と第２の電極を互いに隣接させてナノギャップを形成するステップ、
    ｂ．前記ナノギャップに相当する長さを有する核酸分子ワイヤーを提供するステップであって、前記分子ワイヤーの所定の位置にある２個の内部ヌクレオシドが官能化されており、タンパク質または感知分子の付着を可能にし、前記分子ワイヤーが各末端に１個または複数の付着部位を有する、ステップ、
    ｃ．前記バイオポリマーと相互作用するか、または前記バイオポリマーとの化学的もしくは生化学的反応を実行することができる感知プローブを提供するステップであって、前記感知プローブは、前記分子ワイヤー上の２個の官能化された部位と相互作用することができる２個の付着部位を有する、ステップ、
    ｄ．前記分子ワイヤーの末端の付着部位を通して、前記分子ワイヤーの１つの末端を前記第１の電極に付着させ、前記分子ワイヤーの別の末端を前記第２の電極に付着させるステップ、
    ｅ．前記感知プローブの２個の付着部位および前記分子ワイヤーの２個の官能化された部位を通して前記分子ワイヤーに前記感知プローブを付着させるステップを含み、
    ステップ「ｅ」はステップ「ｄ」の前に行われてもよく、その逆であってもよい、方法。
  21. ａ．前記第１の電極と前記第２の電極との間にバイアス電圧を印加するステップ、
    ｂ．前記感知プローブと前記バイオポリマーとの相互作用によって引き起こされる前記分子ワイヤーを通る電流変動を記録するデバイスを提供するステップ、
    ｃ．前記バイオポリマーまたは前記バイオポリマーのサブユニットを特定するまたは特徴付けるデータ分析のためのソフトウェアを提供するステップ
    をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記バイオポリマーが、天然のもの、合成されたもの、修飾されたもの、およびそれらの組合せのいずれかであるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、多糖類、およびそれらの類似体からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記感知プローブが、天然のもの、変異されたもの、合成されたもの、およびそれらの組合せのいずれかである核酸プローブ、酵素、受容体、リガンド、抗原、および抗体からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記酵素が、天然のもの、変異されたもの、合成されたもの、およびそれらの組合せのいずれかであるＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡプライマーゼ、リボソーム、スクラーゼ、ラクターゼからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記酵素が、所定の部位に非天然アミノ酸を含むように作出されている、請求項２３に記載の方法。
  26. タンパク質工学に使用される前記非天然アミノ酸が、セレノシステインもしくはフェニルアラニンもしくはリジンを含むか、または天然のもの、合成されたもの、変異されたもの、もしくはそれらの組合せのいずれかであるセレノシステインもしくはフェニルアラニンもしくはリジンの誘導体を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ上の前記２個の官能化された部位が、フィンガードメインにおける１個の部位と共に、またエキソヌクレアーゼ、またはパーム、またはサム、またはＴＰＲ１またはＤＴＰＲ２ドメインのいずれかにおける他の部位と共に構成される、請求項２４に記載の方法。
  28. 前記ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼが、前記分子ワイヤーに付着するために１個または２個だけのシステイン残基を含むように作出されている、請求項２４に記載の方法。
  29. 前記ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼが少なくとも１個のセレノシステインを含むか、または少なくとも１個のシステインがセレノシステインで置換されているように作出されている、請求項２４に記載の方法。
  30. 前記分子ワイヤーが、１本の核酸二重鎖、核酸二重鎖ｄｕｏ、核酸三重鎖、核酸四重鎖、核酸オリガミ構造、およびそれらの組合せからなる群より選択され、前記核酸鎖がＡ型、Ｂ型、またはＺ型のいずれかであり、核酸塩基が天然または非天然のいずれかである、請求項２０に記載の方法。
  31. 前記１本の核酸二重鎖が、各鎖の所定の位置に１個の官能化核酸塩基、各二重鎖の末端または各鎖の末端に１個の付着部位を含み、前記核酸二重鎖ｄｕｏが、各二重鎖に１個の官能化核酸塩基および各二重鎖の末端に１個の付着部位を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 核酸二重鎖の配列が回文構造である、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記核酸分子ワイヤーが、所定の位置の内部塩基の１個にアミノ官能基を含む、請求項２０に記載の方法。
  34. アミノ官能基を有する前記塩基が、アジド、マレイミド、環外オレフィンマレイミド、フラン、ジベンゾシクロオクタン、テトラジン、トリアジン、またはオキサジアゾールスルホンを含むがこれらに限定されない活性化カルボキシレートを含む部分でさらに官能化されている、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記核酸二重鎖ｄｕｏが、天然のもの、修飾されたもの、合成されたもの、またはそれらの組合せのいずれかである２本の二本鎖ＰＮＡ、ＸＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＰＮＡ、ＤＮＡ／ＸＮＡ、ＲＮＡ／ＰＮＡ、ＲＮＡ／ＸＮＡもしくはＰＮＡ／ＸＮＡのハイブリッドを含むか、あるいは天然のもの、修飾されたもの、合成されたもの、またはそれらの組合せのいずれかである２本の二本鎖ＰＮＡ、ＸＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＰＮＡ、ＤＮＡ／ＸＮＡ、ＲＮＡ／ＰＮＡ、ＲＮＡ／ＸＮＡもしくはＰＮＡ／ＸＮＡのハイブリッドによって置換されている、請求項３０に記載の方法。
  36. 前記核酸分子ワイヤーが、少なくとも５０％のＧＣ塩基対を含む、請求項２０に記載の方法。
  37. 前記２つの電極の末端間のナノギャップサイズまたは距離が、約２から１０００ｎｍ、または約５から１００ｎｍ、または約５から３０ｎｍである、請求項２０に記載の方法。
  38. 前記ナノギャップが複数のナノギャップを含み、それぞれが一対の電極、分子ワイヤー、感知プローブ、および１個のナノギャップに関連付けられる任意の特色を含む、請求項２０に記載の方法。
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