JP2023519851A

JP2023519851A - 武装免疫細胞を産生する際に使用するための二重特異性抗体

Info

Publication number: JP2023519851A
Application number: JP2022558065A
Authority: JP
Inventors: チェン，マイケル; クァン，クオ－シャン; チェン，イ－ジョウ
Original assignee: サイトアームカンパニーリミテッド
Priority date: 2020-03-23
Filing date: 2021-03-23
Publication date: 2023-05-15
Also published as: US20240209084A1; TW202202522A; IL296566A; EP4126954A4; WO2021195067A1; AU2021244375A1; EP4126954A1; CN115551890A

Abstract

ＣＤ３及び腫瘍関連抗原に結合することができる二重特異性抗体、かかる二重特異性抗体で武装された免疫細胞、並びにがん治療におけるそれらの治療用途。また、本明細書では、二重特異性抗体で武装された免疫細胞を産生するための方法も提供される。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／９９３，０８０号の出願日の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

がんは、制御不能に分裂し、対象の正常な組織及び／又は臓器に浸潤し、破壊する能力を有する異常な細胞を特徴とする疾患である。がんは、世界で２番目の主要な死因であり、２０１８年には推定９６０万人の死亡に関与しており、最も一般的ながんとしては、肺がん（約２０９万人）、乳がん（約２０９万人）、結腸直腸がん（約１８０万人）、前立腺がん（約１２８万人）、皮膚がん（約１０４万人）、及び胃がん（約１０３万人）が挙げられる。

がんの治療は、がんの種類及び進行度によって異なる場合がある。がんに対する従来の治療としては、手術、放射線療法、及び化学療法が挙げられる。そのような治療は、通常、感染、血栓、出血、吐き気及び嘔吐、下痢、神経又は筋肉の損傷、失禁、並びに性及び生殖能力の問題などの様々な合併症又は副作用を引き起こす。免疫療法は、例えば、免疫チェックポイントをブロックすることによって、又は免疫細胞（例えば、Ｔ細胞若しくはＢ細胞）ががん細胞を標的とし、破壊する能力を増強することによって、がん細胞に対する対象の免疫応答を特異的に刺激することを目的とするがん治療のための代替的な戦略を提供する。神経毒性、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、アレルギー、臓器炎症、及び自己免疫障害を含む、免疫療法薬による過剰刺激又は非特異的毒性と関連付けられる重篤な有害作用が、がん患者において報告されている。

したがって、正常細胞及び／又は組織に影響を与えることなく、がん細胞を特異的に標的とする効率的ながん治療を開発することが非常に重要である。

本開示は、ＣＤ３（例えば、ヒトＣＤ３）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合することができる二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の開発に基づく。かかるＢｓＡｂは、ＢｓＡｂ内の抗ＣＤ３部分の細胞表面ＣＤ３への結合を介してＣＤ３陽性免疫細胞の表面に付着し、武装免疫細胞を産生することができる。

したがって、本開示は、いくつかの態様では、（ａ）ヒトＣＤ３に結合する第１の抗原結合断片、及び（ｂ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する第２の抗原結合断片を含む、二重特異性抗体を特徴とする。第１の抗原結合断片は、（ｉ）第１の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む第１の重鎖、及び（ｉｉ）第１の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む第１の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶ_Ｈは、第１の参照抗体と同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。他の実施形態では、第１のＶ_Ｈは、第１の参照抗体と比較して、ＣＤＲに５個以下のアミノ酸変異を含む。あるいは、又は加えて、第１のＶ_Ｌは、第１の参照抗体と同じ軽鎖ＣＤＲを含んでよい。他の実施形態では、第１のＶ_Ｌは、第１の参照抗体と比較して、ＣＤＲに５個以下のアミノ酸変異を含んでよい。いくつかの実施例では、第１の参照抗体は、ＣＴＡ．０２である。いくつかの実施例では、第１の参照抗体は、ＣＴＡ．０３である。他の実施例では、第１の参照抗体は、ＣＴＡ．０４である。更に他の実施例では、第１の参照抗体は、ＣＴＡ．０５である。これらの例示的な参照抗体の構造情報は、以下の表１に提供される。いくつかの実施例では、第１の重鎖及び第１の軽鎖は、第１の参照抗体と同じＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含む。

第２の抗原結合断片は、（ｉ）第２の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む第２の重鎖、及び（ｉｉ）第２の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む第２の軽鎖を含む。第２の抗原結合断片は、ＴＡＡに結合する。例としては、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ｃＭＥＴ、ＣＤ４７、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、メソテリン、又はＧＤ２が挙げられる。いくつかの例では、第２のＶ_Ｈは、第２の参照抗体と同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。あるいは、第２のＶ_Ｈは、第２の参照抗体と比較して、ＣＤＲに５個以下のアミノ酸変異を含んでもよい。あるいは、又は加えて、第２のＶ_Ｌは、同じ軽鎖ＣＤＲを含み得る。他の実施例では、第２のＶ_Ｌは、第２の参照抗体と比較して、ＣＤＲに５個以下のアミノ酸変異を含んでもよい。いくつかの例では、第２の参照抗体は、ＣＴＡＴ．０１、ＣＴＡＴ．０２、ＣＴＡＴ．０３、ＣＴＡＴ．０４、ＣＴＡＴ．０５、ＣＴＡＴ．０６、ＣＴＡＴ．０７、ＣＴＡＴ．０８、ＣＴＡＴ．０９、ＣＴＡＴ．１０、ＣＴＡＴ．１１、ＣＴＡＴ．１２、ＣＴＡＴ．１３、ＣＴＡＴ．１４、ＣＴＡＴ．１５、又はＣＴＡＴ．１６である。以下の表２を参照されたい。いくつかの実施例では、第２の抗原結合断片は、第２の参照抗体と同じＶ_Ｈ及び同じＶ_Ｌを含む。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合断片は、Ｆａｂ断片であり、第２の抗原結合断片は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施例では、Ｆａｂ断片は、第１のＶ_Ｈ及びＣＨ１断片を含む第１の重鎖、並びに第１のＶ_Ｌ及び軽鎖定常領域を含む第１の軽鎖を含む。具体的な実施例では、Ｆａｂ断片は、それぞれ、（ａ）配列番号１０及び配列番号１１、（ｂ）配列番号２３及び配列番号２４、２５、若しくは２２８、（ｃ）配列番号３５及び配列番号３６、又は（ｄ）配列番号４６及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖を含んでよい。いくつかの実施例では、第２の抗原結合断片のｓｃＦｖは、配列番号２５４～２７１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの例では、ｓｃＦｖは、ＣＨ１断片に連結され、ｗは、任意選択で、ペプチドリンカーを介してである。あるいは、ｓｃＦｖは、任意選択で、ペプチドリンカーを介して軽鎖定常領域に連結される。例えば、二重特異性抗体は、第１の軽鎖を含む第１のポリペプチド、並びにＮ末端からＣ末端にかけて、第１の重鎖、ペプチドリンカー、及びｓｃＦｖを含む第２のポリペプチドを含み得る。例としては、配列番号２２９～２４８のうちのいずれか１つが挙げられる。かかる二重特異性抗体は、配列番号２４、２５、及び２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含み得る。以下の表３を参照されたい。

他の例では、第１の抗原結合断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、第２の抗原結合断片は、Ｆａｂ断片である。ｓｃＦｖは、配列番号２５０～２５３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの実施例では、Ｆａｂ断片は、第２のＶ_Ｈ及びＣＨ１断片を含む第２の重鎖、並びに第２のＶ_Ｌ及び軽鎖定常領域を含む第２の軽鎖を含む。特定の実施例では、Ｆａｂ断片は、それぞれ、（１）配列番号５７及び配列番号５８、（２）配列番号７２及び配列番号７３、（３）配列番号８３及び配列番号８４、（４）配列番号９４及び配列番号９５、（５）配列番号１０５及び配列番号１０６、（６）配列番号１１６及び配列番号１１７、（７）配列番号１２７及び配列番号１２８、（８）配列番号１３８及び配列番号１３９、（９）配列番号１４９及び配列番号１５０、（１０）配列番号１６０及び配列番号１６１、（１１）配列番号１７１及び配列番号１７２、（１２）配列番号１８２及び配列番号１８３、（１３）配列番号１９３及び配列番号１９４、（１４）配列番号２０４及び配列番号２０５、（１５）配列番号２１５及び配列番号２１６、又は（１６）配列番号２２６及び配列番号２２７のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖を含む。

いくつかの実施例では、ｓｃＦｖは、任意選択で、ペプチドリンカーを介してＣＨ１断片に連結される。あるいは、ｓｃＦｖは、任意選択で、ペプチドリンカーを介して軽鎖定常領域に連結される。ペプチドリンカーのいずれも、少なくとも５アミノ酸長であってよい。

更に他の例では、第１の抗原結合断片及び第２の抗原結合断片の両方は、ｓｃＦｖ抗体である。いくつかの実施例では、二重特異性抗体は、２つのｓｃＦｖ抗体を含むポリペプチドを含む。

他の態様では、本開示は、表面ＣＤ３を発現する免疫細胞、並びに本明細書に開示される二重特異性抗体（例えば、表１～３に例示されるもの）のうちのいずれかを含む、武装免疫細胞を提供する。武装免疫細胞は、二重特異性抗体における第１の抗原結合断片と免疫細胞によって発現されるＣＤ３との間の相互作用を介して、二重特異性抗体を表面上に提示する。いくつかの実施形態では、
免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、又はそれらの組み合わせである。いくつかの例では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞であり得る。いくつかの実施例では、免疫細胞は、ヒト免疫細胞、例えば、ヒトドナーに由来する免疫細胞である。

加えて、本明細書では、本明細書に開示される武装免疫細胞を産生する方法が提供される。この方法は、本明細書に開示される二重特異性抗体の存在下で免疫細胞を含む細胞集団を培養して、二重特異性抗体の免疫細胞への結合を可能にし、それによって武装免疫細胞を産生することを含み得る。本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される武装免疫細胞もまた、本開示の範囲内である。

いくつかの実施形態では、細胞集団は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施例では、細胞集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はインビトロで幹細胞に由来する免疫細胞を含む。幹細胞は、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、又は誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞であってもよい。

いくつかの実施形態では、培養工程は、任意選択で、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）、又はそれらの組み合わせを含む、サイトカインを含む培養培地中で実施される。

更に、本明細書では、がんを治療するための方法であって、がんの治療を必要とする対象に、有効量の本明細書に開示される武装免疫細胞のうちのいずれかの集団を投与することを含む、方法が提供される。対象は、二重特異性抗体の第２の抗原結合断片が結合する、ＴＡＡに陽性であるがんを有するか、又は有すると疑われる。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトがん患者である。いくつかの実施形態では、武装免疫細胞は、対象に対して自己由来である。あるいは、武装免疫細胞は、対象に対して同種異系である。例示的ながんとしては、黒色腫、食道がん、胃がん、脳腫瘍、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、乳がん、膵臓がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝細胞がん、卵巣がん、前立腺がん、甲状腺がん、精巣がん、頭頚部扁平上皮がん、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。

他の態様では、本開示は、本明細書に開示される二重特異性抗体のうちのいずれかをコードするか、又は集合的にコードする、核酸又は一組の核酸（２つの核酸分子）を特徴とする。いくつかの実施例では、核酸又は一組の核酸は、ベクター又は一組のベクター、例えば、発現ベクターである。本明細書に開示される核酸又は一組の核酸のうちのいずれかを含む宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、又は哺乳動物細胞）もまた、本開示の範囲内である。

加えて、本開示は、（ｉ）二重特異性抗体の発現を可能にする条件下で本明細書に開示される宿主細胞を培養することと、（ｉｉ）二重特異性抗体を採取することと、を含む、二重特異性抗体を産生するための方法を特徴とする。

また、本開示の範囲内には、がん治療に使用するための本明細書に開示される武装免疫細胞、又は標的がんを治療する際に使用するための医薬品を製造するための武装免疫細胞のうちのいずれかの使用も含まれる。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明、並びに添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様を更に実証するために含まれ、図面を参照することによって、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と併せてよりよく理解され得る。

図１Ａ～１Ｎは、例示的な二重特異性抗体フォーマットの概略図である。図１Ａ～１Ｄ：抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＴＡＡｓｃＦｖ二重特異性フォーマットの構造。図１Ｅ～１Ｈ：抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／抗ＴＡＡＦａｂ二重特異性フォーマットの構造。図１Ｉ～１Ｌ：抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／抗ＴＡＡｓｃＦｖ二重特異性フォーマットの構造。図１Ｍ：一価の抗ＣＤ３抗体及び一価の抗ＴＡＡ抗体を含む、抗ＣＤ３ノブ／抗ＴＡＡホール二重特異性抗体フォーマットの構造。図１Ｎ：一価の抗ＣＤ３抗体及び一価の抗ＴＡＡｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質を含む、抗ＣＤ３ノブ／抗ＴＡＡｓｃＦｖホール抗体。図２Ａ～２Ｅは、図示される組換え二重特異性抗体を発現するためのＤＮＡ構築物の概略図を含む。図２Ａ：抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＴＡＡｓｃＦｖ二重特異性抗体を発現するための例示的な構築物。図２Ｂ：抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／抗ＴＡＡＦａｂ二重特異性抗体を発現するための例示的な構築物。図２Ｃ：抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／抗ＴＡＡｓｃＦｖ二重特異性抗体を発現するための例示的な構築物。図２Ｄ：抗ＣＤ３ノブ／抗ＴＡＡホール二重特異性抗体を発現するための例示的な構築物。図２Ｅ：抗ＣＤ３ノブ／抗ＴＡＡｓｃＦｖホール抗体を発現するための例示的な構築物。図３は、フローサイトメトリーによって測定した、Ｔ細胞に対する例示的な二重特異性抗体の結合親和性を示すチャートである。図４は、例示的な二重特異性抗体で武装された、又はＯＫＴ３抗体によってＨＴ－２９がん細胞に対して活性化されたＴ細胞の細胞毒性効果を示すチャートである。図５は、Ｔ細胞の表面上の例示的な二重特異性抗体のレベルの時間経過を示すチャートである。図６Ａ～６Ｂは、非還元条件下（図６Ａ）及び還元条件下（図６Ｂ）でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって示される例示的な二重特異性抗体の発現及びアセンブリを示す写真を含む。推定分子量：無傷のＢｓＡｂ＝９５ｋＤａ、重鎖＝６０ｋＤａ、及び軽鎖＝２５ｋＤａ。レーン１：タンパク質マーカー、レーン２：ＣＴＡ０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、レーン３：ＣＴＡ０４Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ。レーン４：ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、及びレーン５：ＣＴＡ０５Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ。図７Ａ～７Ｆは、還元又は非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して示される、例示的な抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗腫瘍二重特異性抗体の発現及びアセンブリを示す写真を含む。推定分子量：無傷のＢｓＡｂ＝９５ｋＤａ。図７Ａ～７Ｂ：非還元条件下でのＣＴＡ０３Ｆａｂ／抗ＴＡＡｓｃＦｖ二重特異性抗体。図７Ｃ～７Ｄ：還元条件下でのＣＴＡ０３Ｆａｂ／抗ＴＡＡｓｃＦｖ二重特異性抗体。図７Ｅ～７Ｆ：それぞれ、非還元及び還元条件下での抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ二重特異性抗体。図８は、Ｔ細胞及び腫瘍細胞に示される、様々な二重特異性抗体の結合活性を示す図である。ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）を、例示的な二重特異性抗体ＣＴＡ０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０４Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０５Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖＢｓＡｂと別個にインキュベートし、次いでＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦａｂ抗体及びフローサイトメーターで分析した。図９Ａ～９Ｌは、Ｔ細胞及び腫瘍細胞に示される例示的な抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗腫瘍ｓｃＦｖ二重特異性抗体の結合活性を示す図を含む。図９Ａ：ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）へのＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ結合。図９Ｂ：ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＥＧＦＲ^＋トリプルネガティブ乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）へのＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ結合。図９Ｃ：ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＨＥＲ２^＋乳がん（ＭＣＦ７／ＨＥＲ２）へのＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ結合。図９Ｄ：ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＰＳＭＡ^＋前立腺がん（ＬＮＣａＰ）へのＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０５ｓｃＦｖ結合。図９Ｅ：ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＥｐＣＡＭ^＋前立腺がん（ＬＮＣａＰ）へのＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０７ｓｃＦｖ結合。図９Ｆ：ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＦＡＰ^＋マウス線維芽細胞細胞（３Ｔ３／ＦＡＰ）へのＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０８ｓｃＦｖ結合。図９Ｇ：ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＰＤＬ１^＋トリプルネガティブ乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）へのＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０９ｓｃＦｖ結合。図９Ｈ：ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＣＤ３８^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）へのＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１０ｓｃＦｖ結合。図９Ｉ：ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＣＤ３３^＋ヒト急性骨髄性白血病（ＨＬ－６０）へのＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１１ｓｃＦｖ結合。図９Ｊ：ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＨＧＦＲ^＋ヒト肺がん（Ａ５４９）へのＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１２ｓｃＦｖ結合。図９Ｋ：ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＣＤ４７^＋乳がん（ＭＣＦ７／ＨＥＲ２）へのＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１３ｓｃＦｖ結合。図９Ｌ：ＢｓＡｂＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３ＦａｂＣＴＡ０３ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０４ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、及びＣＴＡ０５ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂの、ＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）（上パネル）及びＥＧＦＲ＋結腸がん（ＨＴ－２９）（下パネル）への結合。試料を、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦａｂ抗体及びフローサイトメトリーで分析した。図１０は、Ｔ細胞表面上の例示的なＢｓＡｂの保持能を示すチャートである。ヒトＴ細胞を、４つの異なる抗ＣＤ３抗体（ＣＴＡ０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０５Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ）のＦａｂを有するバリアント抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＣＤ１９ｓｃＦｖＢｓＡｂと１時間インキュベートし、次いで培地中で５分、２４、４８、及び７２時間培養した。培養後、細胞をＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦａｂ抗体で染色し、Ｔ細胞表面上のＢｓＡｂの保持を、フローサイトメトリーを使用して分析した。図１１Ａ及び１１Ｂは、本明細書に開示される例示的なＢｓＡｂで武装されたＴ細胞の形成を示す図を含む。図１１Ａ：左から右へＯＫＴ３、ＣＴＡ０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ。図１１Ｂ：ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ（左）及びＣＴＡ０５Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ（右）。ＰＢＭＣを、ＯＫＴ３又は様々なＢｓＡｂの存在下で培養した。次いで、細胞培養物を、ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ８抗体及びＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦａｂで染色し、次いでフローサイトメトリーを使用して分析した。図１２Ａ～１２Ｄは、示されるように例示的なＢｓＡｂで武装されたＴ細胞の形成を示す図を含む。図１２Ａ：ＯＫＴ３、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ（上パネル、左から右）、及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０９ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０１０ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１１ｓｃＦｖ（下パネル、左から右）。図１２Ｂ：ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０５ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０７ｓｃＦｖ、及びＣＴＡＦａｂ／ＣＴＡＴ０８ｓｃＦｖ（上パネル、左から右）、及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１３ｓｃＦｖ（下、左から右）。図１２Ｃ：ＯＫＴ３、ＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、及びＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡ０３Ｆａｂ（左から右）。図１２Ｄ：ＣＴＡ０３ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０４ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、及びＣＴＡ０５ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ（左から右）。細胞培養物を抗ＣＤ８抗体及びヤギ抗ヒトＩｇＧＦａｂで染色し、次いでフローサイトメトリーを使用して分析した。図１３Ａ～１３Ｂは、ＯＫＴ３抗体によって誘導されるか、又は腫瘍細胞に対して示される、例示的な二重特異性抗体で武装されたＴ細胞の細胞毒性活性を示すチャートを含む。図１３Ａ：Ｂ細胞リンパ腫に対する抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＣＤ１９ｓｃＦｖＢｓＡｂ。図１３Ｂ：ＨＴ２９細胞に対する抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３ＦａｂＢｓＡｂ。細胞を、示されるようにＯＫＴ３又は例示的なＢｓＡｂで培養した。次いで、細胞培養物を、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）と、いくつかのエフェクター細胞：標的細胞比（３：１、５：１、及び１０：１）で１８時間インキュベートした。腫瘍細胞死は、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を用いて決定した。図１４Ａ～１４Ｇは、がん細胞に対する抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＥＧＦＲｓｃＦｖＢｓＡｂ武装Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性活性を示す電荷を含む。図１４Ａ：ＨＴ２９細胞（ＥＧＦＲ＋結腸がん細胞）に対するＣＴＡ０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ又はＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞。図１４Ｂ：ＨＣＴ－１１６細胞（ＥＧＦＲ＋結腸がん細胞）に対するＣＴＡ０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ又はＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞。図１４Ｃ：ＨＥＲ２＋乳がん細胞（ＭＣＦ－７／ＨＥＲ２）に対する抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ）武装Ｔ細胞。図１４Ｄ：ＰＳＭＡ^＋前立腺がん細胞（ＬＮＣａＰ）に対する抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０５ｓｃＦｖ）武装Ｔ細胞。図１４Ｅ：ＥｐＣＡＭ^＋前立腺がん細胞（ＬＮＣａＰ）に対する抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０７ｓｃＦｖ）武装Ｔ細胞。図１４Ｆ～１４Ｇ：ＦＡＰ^－マウス線維芽細胞細胞（３Ｔ３）（図１４Ｆ）又はＦＡＰ^＋マウス線維芽細胞細胞（３Ｔ３／ＦＡＰ）（図１４Ｇ）に対する抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＦＡＰｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０８ｓｃＦｖ）武装Ｔ細胞。ＯＫＴ３培養Ｔ細胞又は武装Ｔ細胞を、いくつかのエフェクター細胞：標的細胞比（３：１、５：１、及び１０：１）で１８時間、がん細胞と共培養した。腫瘍細胞死は、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を用いて決定した。図１５Ａ～１５Ｅは、対応するがん細胞に対する例示的な抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＴＡＡｓｃＦｖＢｓＡｂのインビトロ細胞毒性活性を示すチャートを含む。図１５Ａ：トリプルネガティブ乳がん細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）に対する抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＰＤＬ１ｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０９ｓｃＦｖ）武装Ｔ細胞。図１５Ｂ：ＣＤ３８^＋Ｂ細胞リンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）に対する抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１０ｓｃＦｖ）武装Ｔ細胞。図１５Ｃ：ＣＤ３３^＋ヒト急性骨髄性白血病細胞（ＨＬ－６０）に対する抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１１ｓｃＦｖ）武装Ｔ細胞。図１５Ｄ：ＨＧＦＲ^＋ヒト肺がん細胞（Ａ５４９）に対する抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＨＧＦＲｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１２ｓｃＦｖ）武装Ｔ細胞。図１５Ｅ：ＣＤ４７^＋乳がん細胞（ＭＣＦ７／ＨＥＲ２）に対する抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＣＤ４７ｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１３ｓｃＦｖ）武装Ｔ細胞。ＯＫＴ３培養Ｔ細胞又は武装Ｔ細胞を、いくつかのエフェクター細胞：標的細胞比（３：１、５：１、及び１０：１）で１８時間、がん細胞と共培養した。腫瘍細胞死は、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を用いて決定した。図１６Ａ～１６Ｃは、リンパ腫に対する例示的な抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞のインビボ治療有効性を示す図を含む。ＳＣＩＤマウスに、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫細胞（２．５×１０^６細胞／マウス）を静脈内接種した。３日後、Ｔ細胞、ＣＴＡ０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞、及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞を、マウスに静脈内注射した（５×１０^６細胞／マウス、週１回、４回）。図１６Ａ：体重。図１６Ｂ：生存率。図１６Ｃ：後肢麻痺の発生率。図１７Ａ～１７Ｂは、ヒトトリプルネガティブ乳がんに対する例示的なＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞のインビボ治療有効性を示す図を含む。ＡＳＩＤマウスに、臨床的ヒト乳房腫瘍組織を皮下接種した。１９日後、Ｔ細胞、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞、及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞を、マウスに静脈内注射した（５×１０^６細胞／マウス、週１回、４回）。図１７Ａ：体重。図１７Ｂ：腫瘍サイズ。図１８Ａ～１８Ｄは、様々な抗ＣＤ３／抗ＴＡＡＢｓＡｂを有するＢｓＡｂ武装ＮＫＴ細胞の形成を示す図を含む。図１８Ａ：ＯＫＴ３（左）及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ（右）。図１８Ｂ：ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ（左）及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０５ｓｃＦｖ（右）。図１８Ｃ：ＯＫＴ３、ＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、及びＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ（左から右）。図１８Ｄ：ＣＴＡ０３ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０４ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、及びＣＴＡ０５ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ（左から右）。ＮＫＴ細胞（ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋）を培養し、示されるようにＯＫＴ３抗体又はＢｓＡｂの存在下で分化させた。次いで、細胞を、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ５６抗体、及びＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧＦａｂ抗体で染色した。細胞表面上のＢｓＡｂを、フローサイトメトリーを使用して分析した。図１９Ａ～１９Ｃは、点変異体ＢｓＡｂＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖの結合活性及び毒性を示すチャートを含む。図１９Ａ：ＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）への結合活性。図１９Ｂ：ＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）への結合活性。図１９Ｃ：ＯＫＴ３と培養したＴ細胞と比較した、武装Ｔ細胞の細胞毒性。細胞を、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３－０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０１ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３－０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３－０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０３－０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０１ｓｃＦｖＢｓＡｂとともに含み、次いで、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦａｂ抗体で染色した。細胞表面上の蛍光シグナルを、フローサイトメトリーを使用して検出した。細胞毒性分析のために、Ｔ細胞をＯＫＴ３又は様々なＢｓＡｂと培養して、武装Ｔ細胞を形成した。次いで、細胞を、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）と、いくつかのエフェクター細胞：標的細胞比（３：１、５：１、及び１０：１）で１８時間共培養した。腫瘍細胞死は、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を用いて決定した。

本開示は、ＣＤ３（例えば、ヒトＣＤ３）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合することができる二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の開発に基づく。かかるＢｓＡｂは、ＢｓＡｂ内の抗ＣＤ３部分の細胞表面ＣＤ３への結合を介してＣＤ３陽性免疫細胞の表面に付着し、武装免疫細胞を産生することができる。本明細書で使用される場合、「武装免疫細胞」という用語は、二重特異性抗体中の抗ＣＤ３部分の細胞表面ＣＤ３分子への結合を介して、本明細書に開示される二重特異性抗体を提示する免疫細胞を指す。細胞表面上の二重特異性抗体中の抗ＴＡＡ部分を介して、武装免疫細胞は、ＴＡＡを発現する疾患細胞（例えば、がん細胞）を標的とし、それによって疾患細胞に対する免疫応答を誘発することができる。

本明細書に開示されるＢｓＡｂは、ＣＤ３^＋免疫細胞及びＴＡＡ^＋がん細胞の両方に対する高い結合活性、並びに少なくとも７２時間のＣＤ３^＋免疫細胞上の高い保持レベルを示すことが本明細書に報告される。本明細書に開示されるＢｓＡｂで武装された免疫細胞は、インビトロ及びインビボの両方で対応するＴＡＡを発現するがん細胞に対して高い細胞毒性を示した。したがって、本明細書に開示されるＢｓＡｂ及び武装免疫細胞は、高い抗がん効果を有することが予想される。

したがって、本明細書では、ＣＤ３及びＴＡＡに結合することができる二重特異性抗体、かかる抗体を提示する武装免疫細胞、武装免疫細胞を産生するための二重特異性抗体を使用する方法、及び武装免疫細胞を使用してがんを治療する方法が提供される。

Ｉ．ＣＤ３及び腫瘍関連抗原に結合する二重特異性抗体
いくつかの態様では、本開示は、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３＋細胞）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（例えば、細胞表面上にＴＡＡを発現するがん細胞）に結合することができる二重特異性抗体を提供する。抗体（複数形で互換的に使用される）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書に開示される二重特異性抗体は、２つの抗原結合部分を含み、そのうちの１つは、ヒトＣＤ３などのＣＤ３に結合し、もう１つは、本明細書に開示されるものなどの腫瘍関連抗原に結合する。

典型的な抗体分子は、通常、抗原結合に関与する重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）として知られる、より保存されている領域に挟まれた、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）としても知られる超可変性の領域に更に細分化することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順序で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、当該技術分野で既知の方法を使用して、例えば、当該技術分野で周知であるＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、及び／又は接触（ｃｏｎｔａｃｔ）定義によって正確に特定することができる。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔａｌ．（１９９１）ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１－３２４２、Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７、Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉｅｔａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８、及びＡｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２－１４３（２００４）を参照されたい。また、ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ及びｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ）も参照されたい。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体部分は、参照抗体と同じ重鎖及び／若しくは軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）又は同じＶ_Ｈ及び／若しくはＶ_Ｌ鎖を共有してもよい。同じＶ_Ｈ及び／又はＶ_ＬＣＤＲを有する２つの抗体は、同じアプローチ（例えば、当該技術分野で既知のＫａｂａｔアプローチ、Ｃｈｏｔｈｉａアプローチ、ＡｂＭアプローチ、接触アプローチ、又はＩＭＧＴアプローチ）によって決定されるときに、それらのＣＤＲが同一であることを意味する。例えば、ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）を参照されたい。かかる抗ＣＤ１９抗体は、本明細書に記載される例示的な抗体と比較して、同じＶ_Ｈ、同じＶ_Ｌ、又は両方を有してもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体部分は、参照配列と比較して、ある特定のレベルの配列同一性を共有し得る。２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－７７，１９９３と同様に修飾された、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを使用して決定される。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、目的のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、ギャップＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載されるように利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体部分は、参照抗体と比較して１つ以上のアミノ酸変異を有し得る。本開示に開示されるアミノ酸残基変異（例えば、フレームワーク領域及び／又はＣＤＲにおける）は、保存的アミノ酸残基置換であり得る。本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対電荷又はサイズ特性を変化させないアミノ酸置換を指す。バリアントは、かかる方法を編纂する参照文献に見出されるような、当業者に既知のポリペプチド配列を変化させるための方法に従って調製することができる（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９、又はＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ）。アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。

Ａ．二重特異性抗体
本明細書に開示される二重特異性抗体は、ＣＤ３結合部分（抗ＣＤ３部分）及びＴＡＡ結合部分（抗ＴＡＡ部分）を含む。

（ｉ）ＣＤ３結合部分
本明細書に開示される二重特異性抗体のうちのいずれかにおける抗ＣＤ３部分は、ＣＤ３分子、例えば、ヒトＣＤ３に特異的な抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３部分は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む。いくつかの例では、抗ＣＤ３部分は、参照抗ＣＤ３抗体に由来し得る。例示的な参照抗ＣＤ３抗体としては、ＣＴＡ．０２、ＣＴＡ．０３、ＣＴＡ．０４、又はＣＴＡ．０５が挙げられる。これらの参照抗ＣＤ３抗体の構造情報は、以下の表１に提供される（Ｋａｂａｔスキームに基づく重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、太字及び下線である）。

参照抗体に由来する抗ＣＤ３結合部分（及び以下に開示される抗ＴＡＡ結合部分）は、参照抗体と実質的に類似した構造及び機能的特徴を有する結合部分を指す。構造的には、結合部分は、参照抗体と同じ重鎖及び／若しくは軽鎖相補性決定領域、又は同じＶ_Ｈ及び／若しくはＶ_Ｌ鎖を有し得る。あるいは、結合部分は、参照抗体と比較してその結合親和性及び結合特異性に著しく影響を与えることなく、フレームワーク領域のうちの１つ以上及び／又はＣＤＲのうちの１つ以上において限定された数のアミノ酸変異のみを有し得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３結合部分は、上記の表１に提供される、抗体ＣＴＡ．０２におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含んでもよい。あるいは、又は加えて、抗ＣＤ３結合部分は、同じく上記の表１に提供される、抗体ＣＴＡ．０２におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＣＤ３結合部分は、ＣＴＡ．０２と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＣＤ３結合部分は、ＣＴＡ．０２における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＣＤ３結合部分は、ＣＴＡ．０２における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０２のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０２のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＣＤ３抗体は、ＣＴＡ．０２としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。本明細書で使用される場合、「個別に」とは、抗体の１つのＣＤＲが、参照抗体（例えば、上記の表１に提供される抗ＣＤ３参照抗体、又は以下に開示される抗ＴＡＡ参照抗体のうちのいずれか）の対応するＣＤＲに対して示される配列同一性を共有することを意味する。「集合的に」とは、抗体の３つのＶ_Ｈ又はＶ_ＬＣＤＲの組み合わせが、参照抗体の対応する３つのＶ_Ｈ又はＶ_ＬＣＤＲの組み合わせに対して示される配列同一性を共有することを意味する。

いくつかの例では、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０２のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０２の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３結合部分は、上記の表１に提供される、抗体ＣＴＡ．０３におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含んでもよい。あるいは、又は加えて、抗ＣＤ３結合部分は、同じく上記の表１に提供される、抗体ＣＴＡ．０３におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＣＤ３結合部分は、ＣＴＡ．０３と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＣＤ３結合部分は、ＣＴＡ．０３における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＣＤ３結合部分は、ＣＴＡ．０３における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。１つの具体的な実施例では、本明細書に開示される抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０３に対するＶＬ鎖のＧ５８位の変異、例えば、アミノ酸残基置換（例えば、Ｇ５８Ａ）を含む。例えば、上記の表１のＣＴＡ．０３ＶＬ－０１を参照されたい。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０３のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０３のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＣＤ３抗体は、ＣＴＡ．０３としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０３のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０３の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。具体的な実施例では、本明細書に開示される抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０３のものと比較したＶＬ鎖のＤ５７位の変異、例えば、Ｄ５７Ｅなどのアミノ酸残基置換を含み得る。例えば、表１のＣＴＡ．０３ＶＬ－０２を参照されたい。

いくつかの実施例では、抗ＣＤ３結合部分は、上記の表１に提供される、抗体ＣＴＡ．０４におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＣＤ３結合部分は、同じく上記の表１に提供される、抗体ＣＴＡ．０４におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＣＤ３結合部分は、ＣＴＡ．０４と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＣＤ３結合部分は、ＣＴＡ．０４における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＣＤ３結合部分は、ＣＴＡ．０４における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０４のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０４のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＣＤ３抗体は、ＣＴＡ．０４としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０４のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０４の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＣＤ３結合部分は、上記の表１に提供される、抗体ＣＴＡ．０５におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＣＤ３結合部分は、同じく上記の表１に提供される、抗体ＣＴＡ．０５におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＣＤ３結合部分は、ＣＴＡ．０５と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＣＤ３結合部分は、ＣＴＡ．０５における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＣＤ３結合部分は、ＣＴＡ．０５における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０５のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０５のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＣＤ３抗体は、ＣＴＡ．０５としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０５のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＣＤ３部分は、ＣＴＡ．０５の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

（ｉｉ）ＴＡＡ結合部分
抗ＣＤ３結合部分に加えて、本明細書に開示される二重特異性抗体のうちのいずれかは、腫瘍関連抗原に特異的な第２の結合部分を更に含む。「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）という用語は、当該技術分野において十分に理解されており、同じ細胞型の非がん細胞と比較してがん細胞上及び／又はがん細胞中で差異的に発現される分子を指す。ＴＡＡの非限定的な例としては、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６３、ＣＤ７２ａ、ＣＤ７４、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ２４８、ＣＤ３１９、αｖβ３、α５β１、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ又はＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、血管内皮成長因子受容体１（ＶＥＧＦＲ－１）、ＶＥＧＦＲ－２、ＶＥＧＦＲ－３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、炭水化物抗原１２５（ＣＡ１２５）、がん胚性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ７、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、前立腺の６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、Ａ３３抗原、デスモグロイン－２（Ｄｓｇ２）、Ｄｓｇ３、Ｄｓｇ４、Ｅ－カドヘリンネオエピトープ、胎児ニコチン性アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ミューレリアン阻害物質ＩＩ型受容体（ＭＩＳＩＩＲ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、トムセン・フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ４、精巣がん抗原（ＣＴＡ）、ＮＹ－ＢＲ１、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）、インブリントされた部位の調節因子の兄弟（ＢＯＲＩＳ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、エクストラドメイン－Ｂフィブロネクチン（ＥＤＢ－ＦＮ）、糖タンパク質Ａ３３（ＧＰＡ３３）、テナシン－Ｃ（ＴＮＣ）、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＧＡＧＥ、ＢＡＧＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、メソテリン、ムチン関連Ｔｎ、シアリルＴｎ、グロボＨ、ステージ特異的胚抗原－４（ＳＳＥＡ－４）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、血管細胞接着タンパク質１（ＶＣＡＭ－１）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、又は肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合部分は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＤ２０（例えば、ヒトＣＤ２０）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＥＧＦＲ（例えば、ヒトＥＧＦＲ）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＨＥＲ２（例えば、ヒトＨＥＲ２）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＰＳＭＡ（例えば、ヒトＰＳＭＡ）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＥＡ（例えば、ヒトＣＥＡ）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＥｐＣＡＭ（例えば、ヒトＥｐＣＡＭ）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＦＡＰ（例えば、ヒトＦＡＰ）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＰＤＬ１（例えば、ヒトＰＤＬ１）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＤ３８（例えば、ヒトＣＤ３８）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＤ３３（例えば、ヒトＣＤ３３）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＨＧＦＲ（ｃＭＥＴ）（例えば、ヒトｃＭＥＴ）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＤ４７（例えば、ヒトＣＤ４７）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２（例えば、ヒトＴＲＡＩＬ－Ｒ２）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、メソテリン（例えば、ヒトメソテリン）に特異的である。いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、ＧＤ２（例えば、ヒトＧＤ２）に特異的である。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、参照抗ＴＡＡ抗体に由来し得る。例示的な参照抗ＴＡＡ抗体としては、ＣＴＡＴ．０１～ＣＴＡＴ．１６が挙げられる。これらの参照抗ＣＤ３抗体の構造情報は、以下の表２に提供される（Ｋａｂａｔスキームに基づく重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、太字及び下線である）。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０１におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０１におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０１と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０１における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０１における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０１のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０１のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．０１としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０１のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０１の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０２におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０２におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０２と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０２における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０２における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

１つの具体的な実施例では、本明細書に開示される抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０２に対するＶＬ鎖のＧ４２位の変異、例えば、アミノ酸残基置換（例えば、Ｇ４２Ａ）を含む。例えば、上記の表２のＣＴＡＴ．０２ＶＬ－０１を参照されたい。別の具体的な実施例では、本明細書に開示される抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０２に対するＶＬ鎖のＤ４１位の変異、例えば、アミノ酸残基置換（例えば、Ｄ４１Ｅ）を含む。例えば、上記の表２のＣＴＡＴ．０２ＶＬ－０２を参照されたい。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０２のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０２のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．０２としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０２のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０２の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０３におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０３におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０３と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０３における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０３における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０３のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０３のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．０３としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０３のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０３の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０４におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０４におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０４と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０４における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０４における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０４のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０４のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．０４としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０４のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０４の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０５におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０５におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０５と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０５における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０５における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０５のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０５のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．０５としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０５のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０５の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０６におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０６におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０６と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０６における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０６における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０６のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０６のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．０６としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０６のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０６の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０７におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０７におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０７と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０７における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０７における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０７のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０７のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．０７としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０７のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０７の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０８におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０８におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０８と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０８における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０８における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０８のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０８のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．０８としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０８のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０８の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０９におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．０９におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０９と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０９における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．０９における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０９のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０９のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．０９としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０９のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．０９の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１０におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１０におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１０と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１０における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１０における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１０のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１０のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．１０としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１０のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１０の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１１におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１１におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１１と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１１における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１１における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１１のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１１のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．１０としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１１のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１１の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１２におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１２におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１２と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１２における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１２における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１２のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１２のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．１２としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１２のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１２の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１３におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１３におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１３と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１３における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１３における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１３のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１３のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．１３としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１３のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１３の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１４におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１４におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１４と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１４における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１４における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１４のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１４のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．１４としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１４のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１４の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１５におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１５におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１５と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１５における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１５における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１５のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１５のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．１５としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１５のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１５の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

いくつかの実施例では、抗ＴＡＡ結合部分は、上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１６におけるものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ結合部分は、同じく上記の表２に提供される、抗体ＣＴＡＴ．１６におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有してもよい。かかる抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１６と同じＶ_Ｈ鎖及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。あるいは、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１６における対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ結合部分は、ＣＴＡＴ．１６における対応するフレームワーク領域と比較して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸変異（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１６のものと比較して、ＣＤＲのうちの１つ以上におけるある特定のレベルの変異を含み得る。例えば、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１６のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。あるいは、又は加えて、抗ＴＡＡ抗体は、ＣＴＡＴ．１６としてのＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１６のＣＤＲにおけるものと比較して、重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に集合的に最大１０個のアミノ酸変異（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸変異）を含み得る。いくつかの例では、抗ＴＡＡ部分は、ＣＴＡＴ．１６の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。

（ｉｉｉ）抗ＣＤ３／抗ＴＡＡ二重特異性抗体
本明細書に開示される二重特異性抗体は、当該技術分野で既知の任意の好適なフォーマットであってもよく、例えば、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２）：９５－１０６（２０１５）に開示されるものであって、その関連する開示は、本明細書に参照される主題及び目的のために参照により組み込まれる。いくつかの実施例が、以下に提供される。また、図１Ａ～１Ｎを参照されたい。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体は、Ｆａｂフォーマットの１つの抗原結合部分及び単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）フォーマットの他の抗原結合部分を含み得る。かかる二重特異性抗体は、２つのポリペプチドを含み得、１つは、ｓｃＦｖ断片に連結されたＦａｂ断片の重鎖又は軽鎖を含み、もう１つは、ｓｃＦｖ断片に連結されていないＦａｂの軽鎖又は重鎖を含む。

いくつかの例では、Ｆａｂ断片は、２つのポリペプチド鎖を含み、１つは、重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１）の断片に連結されたＶＨドメインを含み、もう１つは、軽鎖定常領域に連結されたＶＬドメインを含む。重鎖定常領域断片は、任意のＩｇサブクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭ由来であり得る。いくつかの実施例では、重鎖定常領域断片は、ＩｇＧ分子（例えば、ヒトＩｇＧ分子）に由来する。軽鎖定常領域は、カッパ鎖又はラムダ鎖（例えば、ヒトカッパ又はラムダ鎖）であり得る。ｓｃＦｖ断片は、ペプチドリンカーによって連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。例えば、Ｂｉｒｄｅｔａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６及びＨｕｓｔｏｎｅｔａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３を参照されたい。いくつかの例では、ｓｃＦｖ断片は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向を有する。あるいは、ｓｃＦｖ断片は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＶＬ－リンカー－ＶＨ配向を有する。二重特異性抗体において、ｓｃＦｖ断片は、Ｆａｂ断片の重鎖に連結され得る。あるいは、ｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片の軽鎖に連結され得る。図１Ａ～１Ｈを参照されたい。

いくつかの実施例では、本明細書に開示される二重特異性抗体は、Ｆａｂフォーマットの抗ＣＤ３結合部分及びｓｃＦｖフォーマットの抗ＴＡＡ結合部分を含み得る。例示的な図解が、図１Ａ～１Ｄに提供される。抗ＣＤ３Ｆａｂは、重鎖ＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び軽鎖ＶＬ－Ｃκ又はＶＬ－Ｃλドメインを含む。抗ＴＡＡｓｃＦｖは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。図１Ａ～１Ｄ。いくつかの例では、抗ＣＤ３Ｆａｂは、抗ＣＤ３Ｆａｂ重鎖のＣＨ１ドメインと抗腫瘍ｓｃＦｖのＶＨドメインとの間に配置されたペプチドリンカーを介して、抗ＴＡＡｓｃＦｖに連結され得る。例示的な図解は、図１Ａに提供される。他の例では、抗ＣＤ３Ｆａｂ重鎖のＣＨ１ドメインは、図１Ｂに示されるように、抗腫瘍ｓｃＦｖのＶＬドメインに連結され得る。他の例では、抗ＴＡＡｓｃＦｖは、ｓｃＦｖのＶＬドメイン（図１Ｃ）を介して、又は抗腫瘍ｓｃＦｖのＶＨドメイン（図１Ｄ）を介して、抗ＣＤ３Ｆａｂ軽鎖のＣκ又はＣλドメインに連結され得る。抗ＣＤ３Ｆａｂ重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ－Ｃｋ）の例、並びに抗ＴＡＡｓｃＦｖ断片の例は、それぞれ表１及び２に提供される。それらの任意の組み合わせは、本開示の範囲内である。

いくつかの実施例では、本明細書に開示される二重特異性抗体は、Ｆａｂフォーマットの抗ＴＡＡ結合部分及びｓｃＦｖフォーマットの抗ＣＤ３結合部分を含み得る。例示的な図解が、図１Ｅ～１Ｈに提供される。抗ＴＡＡＦａｂは、重鎖ＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び軽鎖ＶＬ－Ｃκ又はＶＬ－Ｃλドメインを含む。抗ＣＤ３ｓｃＦｖは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。図１Ｅ～１Ｈ。いくつかの例では、抗ＴＡＡＦａｂは、抗ＴＡＡＦａｂ重鎖のＣＨ１ドメインと抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＶＨドメインとの間に配置されたペプチドリンカーを介して、抗ＣＤ３ｓｃＦｖに連結され得る。例示的な図解は、図１Ｅに提供される。他の例では、抗ＴＡＡＦａｂ重鎖のＣＨ１ドメインは、図１Ｆに示されるように、抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＶＬドメインに連結され得る。他の例では、抗ＣＤ３ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖのＶＬドメイン（図１Ｇ）を介して、又は抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＶＨドメイン（図１Ｈ）を介して、抗ＴＡＡＦａｂ軽鎖のＣκ又はＣλドメインに連結され得る。抗ＴＡＡＦａｂ重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ－Ｃｋ）の例、並びに抗ＣＤ３ｓｃＦｖ断片の例は、それぞれ表２及び１に提供される。それらの任意の組み合わせは、本開示の範囲内である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体は、ｓｃＦｖフォーマットの両方の抗原結合部分を含んでもよい。例示的な図解が、図１Ｉ～１Ｌに提供される。

いくつかの実施例では、抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＶＨドメインは、ペプチドリンカーを介して抗ＴＡＡｓｃＦｖのＶＨドメインに連結され得る（図１Ｉ）。いくつかの実施例では、抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＶＨドメインは、ペプチドリンカーを介して抗ＴＡＡｓｃＦｖのＶＬドメインに連結され得る（図１Ｊ）。いくつかの実施例では、抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＶＬドメインは、ペプチドリンカーを介して抗ＴＡＡｓｃＦｖのＶＨドメインに連結され得る（図１Ｋ）。他の実施例では、抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＶＬドメインは、ペプチドリンカーを介して抗ＴＡＡｓｃＦｖのＶＨドメインに連結され得る（図１Ｌ）。例示的な抗ＣＤ３ｓｃＦｖ断片及び例示的な抗ＴＡＡｓｃＦｖ断片が、それぞれ表１及び２に提供される。二重特異性抗体を構築するためのそれらの任意の組み合わせは、本開示の範囲内である。

更に他の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体は、１つ以上のＦｃ領域を含んでもよく、これは、任意選択で、第１の重鎖のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又は両方におけるノブが、いくつかのアミノ酸側鎖を代替的なものと置き換えることによって作製され、かつ第２の重鎖のＣＨ３ドメインにおける並置位置のホールが、適切なアミノ酸側鎖を代替的なものと置き換えることによって作製される、「ノブ・イントゥ・ホール」構造であってもよい。例示的な図解が、図１Ｍ及び１Ｎに提供される。

典型的には、「ノブ・アンド・ホール（ａｋｎｏｂａｎｄａｈｏｌｅ）」又は「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）」という用語は、本明細書において互換的に使用される。ノブ・イントゥ・ホールアミノ酸変化は、二重特異性ＩｇＧ抗体の産生における重（Ｈ）鎖のヘテロ二量体化について当該技術分野で既知の合理的な設計戦略である。Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８（１－２）：７－１５（２００１）、その関連開示は、本明細書で参照される目的及び主題のために参照により本明細書に組み込まれる。

一実施例では、「ノブ・イントゥ・ホール」は、例えば、ＲｉｄｇｗａｙＪＢＢｅｔａｌ．，（１９９６）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（７）：６１７－２１及びＵＳ５，７３１，１６８に記載されているようなアプローチを提供し、これらの各々の関連開示は、本明細書で参照される目的及び主題のために参照により本明細書に組み込まれる。このアプローチは、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体の形成を促進し、対応するホモ二量体のアセンブリを妨げることが示されている。一態様では、ノブは、ＣＨ３ドメイン間の界面における小さなアミノ側鎖をより大きなものに置き換えることによって作製されるが、一方、ホールは、大きな側鎖をより小さなものに置き換えることによって構築される。具体的な実施例では、「ノブ」変異は、Ｔ３６６Ｗを含み、「ホール」変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む（ＡｔｗｅｌｌＳｅｔａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６－３５）。

いくつかの例では、二重特異性抗体は、第１のＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン及び第１のＶＬ－Ｃκ又はＶＬ－Ｃλドメインを含む抗ＣＤ３結合部分、並びに第２のＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン及び第２のＶＬ－Ｃκ又はＶＬ－Ｃλドメインを含む抗ＴＡＡ結合部分を含み得る。図１Ｍ。抗ＴＡＡ結合部分の重鎖におけるＣＨ２及び／又はＣＨ３が、ノブ／ホール修飾を含んでもよく、２つの重鎖間の結合を可能にする、抗ＣＤ３結合部分の重鎖におけるＣＨ２及び／又はＣＨ３。他の場合において、二重特異性抗体は、第１のＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン及び第１のＶＬ－Ｃκ又はＶＬ－Ｃλドメインを含む抗Ｃｄ３結合部分、並びに第２のＣＨ２－ＣＨ３ドメインに連結した抗ＴＡＡｓｃＦｖを含み得る。抗ＴＡＡ結合部位のＣＨ２及び／又はＣＨ３が、ノブ／ホール修飾を含んでもよく、２つの重鎖間の結合を可能にする、抗ＣＤ３結合部位の重鎖におけるＣＨ２及び／又はＣＨ３。図１Ｎ。この設定では、抗ＣＤ３結合部位のフォーマット及び抗ＴＡＡ結合部位のフォーマットを切り替えてもよい。

「ペプチドリンカー」という用語は、２つのポリペプチドを接続するための天然又は合成アミノ酸残基を有するペプチドを指す。例えば、ペプチドリンカーを使用して、１つのＶＨドメインと１つのＶＬドメインとを接続して、単鎖可変断片（例えば、ｓｃＦｖ）を形成すること；１つのｓｃＦｖと１つのＦａｂとを接続して、ｓｃＦｖ／Ｆａｂ組換え抗体を形成すること；２つのｓｃＦｖを接続して、ｓｃＦｖ／ｓｃＦｖ組換え抗体を形成すること；又は２つの一価抗体（例えば、２つの一価ＩｇＧ）、２つの一価抗体断片（例えば、２つの一価ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質）、又は１つの一価抗体及び１つの一価抗体断片（例えば、１つの一価ＩｇＧ及び一価ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質上）を接続することにより、二価抗体を形成することができる。好ましくは、ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸残基長、例えば５～１００アミノ酸残基長、より好ましくは１０～３０アミノ酸残基長を有するペプチドである。ｓｃＦｖ内のペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸残基長、好ましくは１５～２０アミノ酸残基長のペプチドである。好ましくは、ペプチドリンカーは、（Ｇ_ｎＳ）_ｍの配列を含み、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリンであり、ｎ及びｍは独立して、１～４の数字である。一実施例では、リンカーは、（Ｇ_２Ｓ）_４の配列を含む。別の実施例では、リンカーは、配列又は（Ｇ_４Ｓ）_３を含む。

第１の抗体断片（すなわち、抗ＣＤ３抗体断片）及び第２の抗体断片（すなわち、抗ＴＡＡ抗体断片）を連結するためのペプチドリンカーは、２つのポリペプチドを接続するのに好適な任意のペプチドであってよい。本開示のある特定の実施形態によれば、ペプチドリンカーは、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、又はそれ以上のアミノ酸残基長を有する、少なくとも５アミノ酸残基長を有するペプチドである。好ましくは、本組換え抗体のペプチドリンカーは、１０～３０個のグリシン（Ｇ）及び／又はセリン（Ｓ）残基からなる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗体は、対応する標的抗原（ＣＤ３及びＴＡＡ）又はそのエピトープの一方又は両方に特異的に結合する。抗原又はエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当該技術分野でよく理解されている用語である。分子は、代替標的と比較して、特定の標的抗原とより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、及び／又はより高い親和性で反応する場合、「特異的結合」を示すと言われている。抗体は、他の物質に結合するよりも高い親和性、アビディティで、より容易に、かつ／又はより長い持続時間で結合する場合、標的抗原又はエピトープに「特異的に結合する」。例えば、抗原（ＣＤ３及び／若しくはＴＡＡ）又はその中の抗原エピトープに特異的に（若しくは優先的に）結合する抗体は、この標的抗原に、同じ抗原中の他の抗原又は他のエピトープに結合するよりも高い親和性、アビディティで、より容易に、かつ／又はより長い持続時間で結合する抗体である。また、この定義では、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体は、第２の標的抗原に特異的に、又は優先的に結合してもしなくてもよいことが理解される。したがって、「特異的結合」又は「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を必要としない（ただし、それを含むことができる）。いくつかの実施例では、標的抗原又はそのエピトープに「特異的に結合する」抗体は、同じ抗原中の他の抗原又は他のエピトープに結合しない場合がある（すなわち、従来の方法では、ベースライン結合活性のみが検出され得る）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗体は、標的抗原（例えば、ＣＤ３及びＴＡＡ）又はその抗原エピトープの一方又は両方に対する好適な結合親和性を有する。本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、見かけの会合定数又はＫ_Ａを指す。Ｋ_Ａは、解離定数（Ｋ_Ｄ）の逆数である。本明細書に記載される二重特異性抗体は、ＣＤ３に対して少なくとも１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ以下（例えば、１ｎＭ未満又は０．１ｎＭ未満）の結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有し得る。あるいは、本明細書に記載される二重特異性抗体は、ＴＡＡに対して少なくとも１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ以下の結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有し得る。

増加した結合親和性は、減少したＫ_Ｄに対応する。第２の抗原と比較して、第１の抗原に対する抗体の高い親和性結合は、第２の抗原に結合するためのＫ_Ａ（又は数値Ｋ_Ｄ）よりも高い、第１の抗原に結合するためのより高いＫ_Ａ（又はより小さい数値Ｋ_Ｄ）によって示され得る。そのような場合、抗体は、第２の抗原（例えば、第２のコンフォメーション若しくはその模倣物における同じ第１のタンパク質、又は第２のタンパク質）と比較して、第１の抗原（例えば、第１のコンフォメーション又はその模倣物における第１のタンパク質）に対する特異性を有する。（例えば、特異性又は他の比較のための）結合親和性の差は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１０，０００、又は１０^５倍であり得る。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体を作製するための抗ＣＤ３及び／又は抗ＴＡＡ抗体のうちのいずれかは、標的抗原又はその抗原エピトープに対する抗体の結合親和性を増加させるために更に親和性成熟され得る。

結合親和性（又は結合特異性）は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、又は分光法（例えば、蛍光アッセイを使用する）を含む、様々な方法によって決定することができる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤Ｐ２０）である。これらの技法を使用して、結合された結合タンパク質の濃度を標的タンパク質濃度の関数として測定することができる。結合された結合タンパク質（［結合された］）の濃度は、一般に、以下の式によって遊離標的タンパク質（［遊離］）の濃度に関連する：
［結合された］＝［遊離］／（Ｋｄ＋［遊離］）

しかし、例えば、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ分析などの方法を使用して決定される、親和性の定量的測定値を得るのに十分であり、Ｋ_Ａに比例し、したがって、親和性の定性的測定値を得るために、又は例えば、機能的アッセイ、例えば、インビトロ若しくはインビボアッセイにおける活性によって親和性の推論を得るために、より高い親和性が、例えば、２倍高いかどうかを決定するなどの比較のために使用することができる場合があるため、Ｋ_Ａの正確な決定を行うことは必ずしも必要ではない。

本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体は、以下の表３に提供される（ＣＴＡ．０３の抗ＣＤ３結合部分を例として使用する）。他の抗ＣＤ３参照抗体（例えば、ＣＴＡ．０２、ＣＴＡ．０４、及びＣＴＡ．０５）からの抗ＣＤ３結合部分もまた、本開示の範囲内である。

また、本明細書では、薬学的に許容される賦形剤を更に含む、本明細書に開示される二重特異性抗体（又は同じく本明細書に開示される武装免疫細胞）のうちのいずれかを含む、薬学的組成物も提供される。薬学的に許容される賦形剤は、好適な又は便利な剤形を調製するために活性分子（二重特異性抗体又は武装免疫細胞など）と組み合わせた任意の不活性物質であってもよい。一般に、薬学的に許容される賦形剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、組換え抗体を含む製剤の他の成分と適合する。本薬学的組成物において用いるのに好適な薬学的に許容される賦形剤の例としては、水、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、乳酸リンゲル液、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。任意選択で、薬学的組成物は、組換え抗体、例えば、アミノ酸残基（ヒスチジン（Ｈ）又はセリン（Ｓ）残基など）、グルコース、ガラクトース、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、スクロース、トレハロース、又は抗酸化剤を貯蔵及び／又は安定化するための薬剤を更に含み得る。貯蔵時の腐敗を防止するため、すなわち、酵母及びカビなどの微生物の増殖を阻害するために、抗菌剤などの他の薬剤を添加してもよい。

Ｂ．二重特異性抗体を産生するための方法
本明細書に記載される二重特異性抗体のうちのいずれも、当該技術分野で既知の任意の方法によって作製することができる。例えば、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，（１９９８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋを参照されたい。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体を作製する際に使用するための抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＴＡＡ抗体は、従来のハイブリドーマ技術によって産生され得る。あるいは、抗ＣＤ３及び／又は抗ＴＡＡ抗体は、好適なライブラリー（例えば、ヒト抗体ライブラリー）から同定され得る。いくつかの例では、高親和性完全ヒトＣＤ３及び／又はＴＡＡ結合剤は、ヒト抗体ライブラリー、例えば、親和性成熟ライブラリー（例えば、ＣＤＲ領域のうちの１つ以上の変異を有する）から得ることができる。ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、又は哺乳類ディスプレイ技術を含む、本明細書に記載される標的抗原に結合することができる抗体を同定及び単離するための当該技術分野で既知のいくつかの常法が存在する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体は、従来の組換え技術によって産生されてもよい。一実施例では、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定され得る。単離されると、ＤＮＡを１つ以上の発現ベクター内に配置することができ、次いでこれを、Ｅ．ｃｏｌｉ、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。例えば、ＰＣＴ公開第８７／０４４６２号を参照されたい。次いで、ＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１）、又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全て又は一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって修飾され得る。

いくつかの例では、本明細書に記載される二重特異性抗体の一方又は両方の鎖をコードする核酸は、１つの発現ベクターにクローニングすることができ、各ヌクレオチド配列は、好適なプロモーターに作用可能に連結している。一実施例では、重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列の各々は、異なるプロンプターに対して作用可能な連結にある。あるいは、重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、重鎖及び軽鎖の両方が同じプロモーターから発現されるように、単一のプロモーターと操作可能な連結にあり得る。必要に応じて、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を、重鎖コード配列及び軽鎖コード配列の間に挿入することができる。

いくつかの実施例では、抗体の２つの鎖をコードするヌクレオチド配列を２つのベクターにクローニングし、これを同じ又は異なる細胞に導入することができる。２つの鎖が異なる細胞内で発現される場合、それらの各々を発現する宿主細胞から単離することができ、単離された重鎖及び軽鎖を混合し、抗体の形成を可能にする好適な条件下でインキュベートすることができる。

一般に、抗体の１つ又は全ての鎖をコードする核酸配列は、当該技術分野で既知の方法を使用して、好適なプロモーターと操作可能な連結において好適な発現ベクターにクローニングすることができる。例えば、ヌクレオチド配列及びベクターを、好適な条件下で制限酵素と接触させて、互いに対合し、リガーゼと一緒に接合され得る各分子上に相補的末端を作製することができる。あるいは、合成核酸リンカーを、遺伝子の末端にライゲーションすることができる。これらの合成リンカーは、ベクター内の特定の制限部位に対応する核酸配列を含有する。発現ベクター／プロモーターの選択は、抗体を産生する際に使用するための宿主細胞の種類に依存する。

本明細書に記載される抗体の発現には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間体早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ－ＬＴＲ、ＨＴＬＶ－１ＬＴＲなどのウイルスＬＴＲ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）早期プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃＵＶ５プロモーター、及び単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターを含むがこれらに限定されない、様々なプロモーターを使用することができる。

調節可能なプロモーターを使用することもできる。そのような調節可能なプロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃリプレッサーを転写調節因子として使用して、ｌａｃオペレーターを有する哺乳類細胞プロモーターからの転写を調節するもの［Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，４９：６０３－６１２（１９８７）］、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を使用するもの［Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，ａｎｄＢｕｊａｒｄ，Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７－５５５１（１９９２）、Ｙａｏ，Ｆ．ｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，９：１９３９－１９５０（１９９８）、Ｓｈｏｃｋｅｌｔ，Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６５２２－６５２６（１９９５）］が挙げられる。他のシステムとしては、アストラジオール、ＲＵ４８６、ジフェノールムリスレロン、又はラパマイシンを使用するＦＫ５０６二量体、ＶＰ１６、又はｐ６５が挙げられる。誘導システムは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、及びＡｒｉａｄから入手可能である。

オペロンを有するリプレッサーを含む調節可能なプロモーターを使用することができる。一実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃリプレッサーは、転写調節因子として機能して、ｌａｃオペレーターを有する哺乳類細胞プロモーターからの転写を調節することができ［Ｍ．Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，４９：６０３－６１２（１９８７）、ＧｏｓｓｅｎａｎｄＢｕｊａｒｄ（１９９２）、Ｍ．Ｇｏｓｓｅｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１（１９９２）］、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を転写活性化因子（ＶＰ１６）と組み合わせて、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）主要即時初期プロモーターに由来するｔｅｔＯを有する最小限のプロモーターとともに、ｔｅｔＲ－哺乳類細胞転写活性化因子融合タンパク質ｔＴａ（ｔｅｔＲ－ＶＰ１６）を作製し、哺乳類細胞における遺伝子発現を制御するためのｔｅｔＲ－ｔｅｔオペレーターシステムを作製した。一実施形態では、テトラサイクリン誘導性スイッチが使用される。テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）単独では、ｔｅｔＲ－哺乳類細胞転写因子融合誘導体ではなく、テトラサイクリンオペレーターがＣＭＶＩＥプロモーターのＴＡＴＡエレメントのために適切に下流に位置付けられるときに、哺乳類細胞における遺伝子発現を調節する強力なトランス調節因子として機能することができる（Ｙａｏｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１０（１６）：１３９２－１３９９（２００３））。このテトラサイクリン誘導性スイッチの１つの特別な利点は、それがテトラサイクリンリプレッサー－哺乳類細胞トランスアクチベーター又はリプレッサー融合タンパク質の使用を必要としないことであり、いくつかの例では、その調節効果を達成するために細胞に対して毒性であり得る（Ｇｏｓｓｅｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１（１９９２）、Ｓｈｏｃｋｅｔｔｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６５２２－６５２６（１９９５））。

追加的に、ベクターは、例えば、以下、哺乳類細胞内の安定又は一過性のトランスフェクタントを選択するためのネオマイシン遺伝子などの選択可能なマーカー遺伝子、高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの即時初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列、ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写終結及びＲＮＡプロセシングシグナル、複製のＳＶ４０ポリオーマ起点及び適切なエピソーム複製のためのＣｏｌＥ１、汎用性の高い多重クローニング部位である内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、並びにセンス及びアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７及びＳＰ６ＲＮＡプロモーターのうちのいくつか又は全てを含有することができる。導入遺伝子を含有するベクターを産生するための好適なベクター及び方法は、当該技術分野で周知であり、かつ入手可能である。

本明細書に記載される方法を実施するのに有用なポリアデニル化シグナルの例としては、ヒトコラーゲンＩポリアデニル化シグナル、ヒトコラーゲンＩＩポリアデニル化シグナル、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に開示される様々な構成の二重特異性抗体を産生するための例示的な構築物が、図２Ａ～２Ｅに提供される。

抗体のうちのいずれかをコードする核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）は、抗体を産生するのに好適な宿主細胞に導入され得る。宿主細胞は、抗体又はその任意のポリペプチド鎖の発現に好適な条件下で培養することができる。かかる抗体又はそのポリペプチド鎖は、従来の方法、例えば、親和性精製を介して、培養細胞によって（例えば、細胞又は培養上清から）回収することができる。必要に応じて、抗体のポリペプチド鎖は、抗体の産生を可能にする好適な期間、好適な条件下でインキュベートすることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体を調製するための方法は、本明細書に記載される二重特異性抗体の両鎖をコードする組換え発現ベクターを伴う。組換え発現ベクターは、従来の方法、例えば、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションによって好適な宿主細胞（例えば、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞）に導入することができる。陽性形質転換体宿主細胞を選択し、抗体を形成する２つのポリペプチド鎖の発現を可能にする好適な条件下で培養することができ、これらは細胞又は培養培地から回収することができる。必要に応じて、宿主細胞から回収した２本の鎖を、抗体の形成を可能にする好適な条件下でインキュベートすることができる。

一実施例では、各々が本明細書に開示される二重特異性抗体の１つの鎖をコードする、２つの組換え発現ベクターが提供される。２つの組換え発現ベクターの両方を、従来の方法、例えば、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションによって好適な宿主細胞（例えば、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞）に導入することができる。あるいは、発現ベクターの各々を好適な宿主細胞に導入することができる。陽性形質転換体を選択し、抗体のポリペプチド鎖の発現を可能にする好適な条件下で培養することができる。２つの発現ベクターが同じ宿主細胞内に導入されるとき、そこで産生される抗体は、宿主細胞から又は培養培地から回収することができる。必要に応じて、ポリペプチド鎖を宿主細胞から又は培養培地から回収し、次いで抗体の形成を可能にする好適な条件下でインキュベートすることができる。２つの発現ベクターが異なる宿主細胞に導入されるとき、それらの各々は、対応する宿主細胞から又は対応する培養培地から回収することができる。次いで、２つのポリペプチド鎖を、抗体の形成に好適な条件下でインキュベートすることができる。

組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクションし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収するために、標準的な分子生物学技法が使用される。例えば、いくつかの抗体は、プロテインＡ又はプロテインＧカップリングマトリックスとの親和性クロマトグラフィーによって単離され得る。

本明細書に記載される二重特異性抗体をコードする核酸のうちのいずれか、そのような抗体を含有するベクター（例えば、発現ベクター）、及びベクターを含む宿主細胞は、本開示の範囲内である。かかる二重特異性抗体を産生するための方法（例えば、組換え技術を介して宿主細胞を使用する）もまた、本開示の範囲内である。

ＩＩ．武装免疫細胞
別の態様では、本明細書では、本明細書に開示される二重特異性抗体（例えば、表１及び２に提供されるＦａｂ断片及び／若しくはｓｃＦｖ鎖を含むもの、又は上記の表３に提供される例示的な二重特異性抗体）のうちのいずれかで武装された免疫細胞が提供される。二重特異性抗体は、細胞表面ＣＤ３分子への結合を介して、ＣＤ３＋免疫細胞の表面上に提示され得る。

免疫細胞は、表面ＣＤ３又はその混合物を発現する任意のタイプの免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）であってもよい。例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、及び／又はマクロファージが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの例では、Ｔ細胞は、従来のＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの例では、Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。他の例では、Ｔ細胞は、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）である。免疫細胞は、体液ドナー（例えば、健康なドナー）などのドナーから得ることができる。あるいは、免疫細胞は、細胞株から得ることができるか、又は幹細胞、例えば、造血幹細胞、骨髄細胞、臍帯血細胞、又は誘導多能性幹細胞から分化し得る。

武装免疫細胞のうちのいずれかは、好適な免役細胞を、本明細書に開示される二重特異性抗体（例えば、表１及び２に提供されるＦａｂ断片及び／若しくはｓｃＦｖ鎖を含むもの、又は上記の表３に提供される例示的な二重特異性抗体）のうちのいずれかと、好適な条件下で好適な期間にわたってインキュベートすることによって産生され得る。抗ＣＤ３抗体単独（例えば、ＯＫＴ３）とは異なり、本明細書に開示される二重特異性抗体の、免疫細胞とのインキュベーションにより、二重特異性抗体が細胞表面上に提示される武装免疫細胞の産生がもたらされる。二重特異性抗体は、免疫細胞の増殖及び／又は分化を誘導することができ、例えば、その抗ＣＤ３結合部分を介してＴ細胞上のＣＤ３分子に結合することによって、エフェクター細胞へのナイーブＴ細胞の分化を誘導する。このようにして産生される武装免疫細胞は、武装免疫細胞の表面上に提示される二重特異性抗体の抗ＴＡＡ結合部分によってがん細胞上で発現されるＴＡＡ分子を認識することによって、がん細胞を標的化することが可能である。

いくつかの実施例では、本明細書に開示される武装免疫細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して産生され得る。例えば、ＰＢＭＣは、従来の方法を使用して、ドナー（例えば、ヒトドナー）から単離することができる。ドナーからＰＢＭＣを単離するのに好適な方法としては、密度遠心分離（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）Ｐａｑｕｅ）、細胞調製チューブ（ＣＰＴ）、及びＳＥＰＭＡＴＥ（商標）チューブが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施例では、ＰＢＭＣは、製造業者の指示に従って密度遠心分離を介してドナーから得られた全血試料から単離され得る。次いで、単離されたＰＢＭＣは、好適な細胞培養培地中で少なくとも７日間、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間、又はそれ以上、好ましくは、少なくとも１４日間、二重特異性抗体と培養することができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞などのＣＤ３^＋免疫細胞（例えば、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞及び／又はＮＫＴ細胞）の数は、培養後７日間増殖する。他の実施形態では、培養は１４日間継続され、ＣＤ３^＋Ｔ細胞の数は３倍増加する。

他の実施例では、細胞培養由来の免疫細胞が、本明細書に開示される武装免疫細胞の作製のために使用され得る。インビトロで培養された免疫細胞は、確立された細胞株由来であってもよい。あるいは、免疫細胞は、従来の方法に従って、好適な幹細胞、例えば、造血幹細胞、骨髄細胞、臍帯血細胞、又は誘導多能性幹細胞から分化され得る。

好適な量の免疫細胞（例えば、３×１０^５細胞）を、武装免役細胞を産生するための好適な条件下、好適な期間にわたって、約５００ｎｇ～約３，０００ｎｇ（例えば、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、又は３，０００ｎｇ）の二重特異性抗体の存在下、好適な細胞培養培地中で培養してもよい。細胞培養培地は、Ｔ細胞などの免疫細胞の成長を維持する、及び／又は免疫細胞の活性化を刺激するための１つ以上のサイトカインを含んでもよい。例としては、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２５、ＩＬ－２７、ＩＬ－３１、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、ＴＧＦ－β、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。追加的に又は代替的に、培地は、抗ＣＤ２８抗体又はマンノースなどの活性化目的のための抗体又は炭水化物を含んでもよい。

いくつかの実施例では、ＩＬ－２を培養培地中で使用して、ＰＢＭＣを培養して、例えば、武装ＣＤ８^＋Ｔ細胞を産生することができる。他の実施例では、ＩＬ－２及びＩＬ－７は、例えば、武装ＣＤ４＋Ｔ細胞を産生するためのＰＢＭＣを培養するための培養培地で使用され得る。武装Ｔｒｅｇ細胞を産生するために、ＩＬ－２、抗ＣＤ２８抗体、及びマンノースを細胞培養培地中で使用してもよい。

本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される武装免疫細胞もまた、本開示の範囲内である。

ＩＩＩ．武装免疫細胞によるがん治療
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される武装免疫細胞を使用してがんを治療するための方法を提供する。本明細書に開示される方法を実施するために、有効量の武装免疫細胞又はそのような免疫細胞を含む薬学的組成物は、例えばボーラスとして、又は一定期間にわたる連続注入によって静脈内投与などの好適な経路を介して治療を必要とする対象（例えば、ヒト）に投与することができる。いくつかの例では、武装免疫細胞は、対象に対して自己由来である。他の場合において、武装免疫細胞は、対象に対して同種異系である。

本明細書に記載される方法によって治療される対象は、哺乳動物、より好ましくはヒト又は非ヒト霊長類であり得る。哺乳動物としては、農場動物、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、及びラットが挙げられるが、これらに限定されない。治療を必要とするヒト対象は、二重特異性抗体が結合する標的ＴＡＡを発現する腫瘍細胞を担持することを特徴とする標的疾患／障害を有するか、有するリスクがあるか、又は有することが疑われる、ヒト患者であり得る。例示的ながんとしては、黒色腫、食道がん、胃がん、脳腫瘍、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、乳がん、膵臓がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝細胞がん、卵巣がん、前立腺がん、甲状腺がん、精巣がん、頭頚部扁平上皮がん、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。

特定の種類のがん細胞による特定の腫瘍関連抗原の存在は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍は、ＣＤ１９＋（例えば、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病）及び／又はＣＤ２０＋がん細胞（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫）を伴うことが多い。ＥＧＦＲは、肺がん及び結腸がんなどの様々な種類のがん上で発現される。ＨＥＲ２は、例えば、乳がんと関連付けられる。ＰＳＭＡは、例えば、前立腺がんと関連付けられる。ＣＥＡは、結腸がん、直腸がん、及び膵がんを含む様々な種類のがんと関連付けられる。ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＣＤ４７、及びＴＲＡＩＬ－Ｒ２は、固形腫瘍と関連付けられる。ＰＤＬ１は、膀胱がん、非小細胞肺がん、乳がん、小細胞肺がん等の様々ながんと関連付けられる。ＣＤ３８は、例えば、多発性骨髄腫と関連付けられる。ＣＤ３３は、例えば、ＡＭＬと会合する。ｃＭＥＴ（ＨＧＦＲ）は、例えば、非小細胞肺がんと関連付けられる。メソテリンは、中皮腫と関連付けられる。ＧＤ２は、神経芽細胞腫と関連付けられる。したがって、特定の種類のがんを治療するのに好適な抗ＴＡＡ結合部分を有する、本明細書に開示される二重特異性抗体を選択することは、医師の知識の範囲内である。

標的がんを有する対象は、日常的な診察、例えば、臨床検査、臓器機能検査、ＣＴスキャン、又は超音波によって特定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって治療される対象は、抗がん療法、例えば、化学療法、放射線療法、免疫療法、又は手術を受けた、又は受けているヒトがん患者であってもよい。かかる標的疾患／障害のうちのいずれかを有すると疑われる対象は、疾患／障害の１つ以上の症状を示し得る。疾患／障害のリスクがある対象は、その疾患／障害のリスク因子のうちの１つ以上を有する対象であり得る。

本明細書で使用される場合、「有効量」は、単独で、又は１つ以上の他の活性薬剤と組み合わせて、対象に治療効果を付与するために必要とされる各活性薬剤の量を指す。ある量の抗体が治療効果を達成したかどうかの判定は、当業者には明白であろう。有効量は、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、体調、サイズ、性別、及び体重を含む個別の患者パラメータ、治療期間、併用療法の性質（もしあれば）、特定の投与経路、並びに保健従事者の知識及び専門知識内の同様の因子に応じて、当業者によって認識されるように変化する。これらの因子は、当業者に周知であり、日常的な実験のみで対処することができる。最大用量の個別の成分又はそれらの組み合わせ、すなわち、健全な医学的判断による最高安全用量を使用することが一般に好ましい。

半減期などの経験的考慮事項は、概して、投与量の決定に寄与するであろう。例えば、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体などのヒト免疫系と適合性のある抗体を使用して、抗体の半減期を延長し、抗体が宿主の免疫系によって攻撃されるのを防ぐことができる。投与頻度は、治療の経過にわたって決定及び調整されてもよく、一般に、標的疾患／障害の治療及び／又は抑制及び／又は改善及び／又は遅延に基づいているが、必ずしもそうではない。あるいは、抗体の持続的連続放出製剤が適切であり得る。持続放出を達成するための様々な製剤及びデバイスは、当該技術分野で既知である。

一実施例では、本明細書に記載される抗体の投与量は、抗体の１回以上の投与を与えられた個体において経験的に決定され得る。個体には、アゴニストの増分投与量が与えられる。アゴニストの有効性を評価するために、疾患／障害の指標を追跡することができる。

特定の投与計画、すなわち、用量、タイミング及び反復は、特定の個体及びその個体の病歴、並びに個別の薬剤の特性（薬剤の半減期、及び当該技術分野で周知である他の考慮事項など）に依存する。

本開示の目的のために、本明細書に記載されるような武装免疫細胞の適切な投与量は、免疫細胞に対する特定の二重特異性抗体、用いられる免疫細胞の種類（又はその組成物）、疾患／障害の種類及び重症度、患者の臨床病歴及びアゴニストに対する応答、並びに主治医の裁量に依存する。典型的には、臨床医は、所望の結果を達成する投与量に達するまで、武装免疫細胞を投与する。投与量が所望の結果をもたらしたかどうかを判定する方法は、当業者には明白であろう。１つ以上の用量の武装免疫細胞の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的又は予防的であるかどうか、及び当業者に既知の他の要因に応じて、連続的又は断続的であり得る。武装免疫細胞の投与は、事前に選択された期間にわたって基本的に連続的であってもよく、又は、例えば、標的疾患若しくは障害を発症する前、発症中、又は発症後のいずれかにおいて、一連の間隔用量であってもよい。

いくつかの実施形態では、対象に投与される武装Ｔ細胞などの武装免疫細胞の量は、対象の約１×１０^４～１×１０^７細胞／Ｋｇ体重であり得る。ある特定の実施形態では、武装Ｔ細胞などの武装免疫細胞の量は、対象の約１×１０^５～１×１０^６細胞／Ｋｇ体重の対象に投与され得る。用量は、単回用量で、又は代替的に、複数回用量で投与することができる。

本明細書で使用される場合、「治療すること」という用語は、標的疾患若しくは障害、疾患／障害の症状、又は疾患／障害に対する素因を有する対象に対し、障害、疾患の症状、又は疾患若しくは障害に対する素因を治療する、治癒する、緩和する、軽減する、改変する、救済する、改善する、向上させる、又は影響を与えることを目的とした、１つ以上の活性薬剤を含む組成物を対象に適用又は投与することを指す。

標的疾患／障害を緩和することは、疾患の発症若しくは進行を遅延させること、又は疾患の重症度を低減すること、又は生存期間を延長することを含む。疾患を緩和すること、又は生存期間を延長することは、必ずしも治癒的な結果を必要としない。本発明で使用される場合、標的疾患又は障害の発症を「遅延させる」とは、疾患の進行を遅延させる、妨げる、減速させる、遅延させる、安定化する、及び／又は延期することを意味する。この遅延は、疾患の履歴及び／又は治療されている個体に応じて、様々な長さの時間であり得る。疾患の発症を「遅延させる」若しくは緩和する、又は疾患の発生を遅延させる方法は、所与の時間枠内で疾患の１つ以上の症状を発症する可能性を低減する、及び／又は所与の時間枠内で、方法を使用しない場合と比較して症状の程度を低減する方法である。そのような比較は、典型的には、統計的に有意な結果を与えるのに十分な数の対象を使用して、臨床研究に基づいている。

疾患の「発症」又は「進行」は、疾患の初期症状及び／又はそれに続く進行を意味する。疾患の発症は、当該技術分野で周知の標準的な臨床技法を使用して検出可能であり、評価することができる。しかしながら、発症はまた、検出できない可能性のある進行を指す。本開示の目的のために、発症又は進行は、症状の生物学的経過を指す。「発症」には、発生（ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）、再発、及び発生（ｏｎｓｅｔ）が含まれる。本明細書で使用される場合、標的疾患又は障害の「発生（ｏｎｓｅｔ）」又は「発生（ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）」は、初期発生及び／又は再発を含む。

医学分野の当業者に既知の従来の方法を使用して、治療されるがんの種類又はがんの部位に応じて、武装免疫細胞又はそのような免役細胞を含む薬学的組成物を対象に投与することができる。いくつかの例では、武装免疫細胞は、静脈内注入を介して投与され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される武装免疫細胞は、別の抗がん剤、例えば、化学療法剤、免疫療法剤、又はそれらの組み合わせとともに使用され得る。例えば、本明細書に開示される武装免疫細胞は、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤＬ１抗体などの免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせで使用され得る。本明細書で使用される場合、「組み合わせ」、「組み合わせた」という用語、及び関連用語は、本開示による複数の治療剤の同時又は逐次投与を指す。例えば、本明細書に開示される武装免疫細胞は、別の治療剤と同時に、又は別個の単位剤形で連続的に、又は単一の単位剤形で一緒に投与され得る。

一実施例では、本明細書に開示される武装免疫細胞を使用してＴＡＡを発現するがん細胞を有する対象（例えば、ヒトがん患者）を治療するための方法は、以下の工程を含んでよい。（ａ）患者からＰＢＭＣを単離する、（ｂ）武装Ｔ細胞などの武装免疫細胞を産生するように、ＴＡＡに特異的な結合部分を含む、本明細書に開示される二重特異性抗体を用いて工程（ａ）のＰＢＭＣを培養する、及び（ｃ）有効量の武装免疫細胞を対象に投与する。

工程（ａ）において、ＰＢＭＣは、対象から単離することができる。対象は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、チンパンジー、ウサギ、サル、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウマ、又はブタであり得る。好ましくは、対象は、ヒトである。対象からＰＢＭＣを単離するのに好適な方法としては、密度遠心分離（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）Ｐａｑｕｅ）、細胞調製チューブ（ＣＰＴ）、及びＳＥＰＭＡＴＥ（商標）チューブが挙げられるが、これらに限定されない。

工程（ｂ）において、単離されたＰＢＭＣを、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞を産生するように十分な期間（例えば、少なくとも７日間）、本発明の組換え抗体を含有する培地中で培養する。二重特異性抗体は、その抗ＣＤ３抗体断片によるＴ細胞の活性化を誘導することができる。このようにして産生された武装Ｔ細胞は、その表面上に結合した二重特異性抗体を有し、したがって、二重特異性抗体の抗ＴＡＡ抗体断片を介してがん細胞を特異的に標的とし得る。

工程（ｃ）において、工程（ｂ）で産生された武装Ｔ細胞などの武装免疫細胞は、がんを治療するために対象に投与することができる。対象に投与されるＴ細胞の量は、対象の約１×１０^４～１×１０^７細胞／Ｋｇ体重である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞の量は、対象の約１×１０^５～１×１０^６細胞／Ｋｇ体重で対象に投与される。用量は、単回用量で、又は代替的に、複数回用量で投与することができる。

任意選択で、工程（ｃ）の前に、本方法は、免疫細胞、例えば、親和性カラム、又は磁気ビーズを単離又は精製するのに好適な方法によって、工程（ｂ）の産生物からＴ細胞を更に単離してもよい。治療の有効性は、日常的な実践を介して調べることができる。

ＩＶ．がん治療のためのキット
本開示はまた、武装Ｔ細胞などの武装免疫細胞のうちのいずれか、又は本明細書に開示される二重特異性抗体のうちのいずれかを含むキットを提供する。かかるキットは、本明細書に開示される標的がんの治療又は緩和に使用され得る。かかるキットは、本明細書に記載される武装免疫細胞又は二重特異性抗体を含む、１つ以上の容器を含むことができる。

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のうちのいずれかに従って使用するための説明書を含むことができる。含まれる説明書は、本明細書に記載されるような標的疾患を治療する、発生を遅延させる、又は緩和するために、武装免疫細胞の投与又は武装免疫細胞を産生するための二重特異性抗体の使用の説明を含み得る。キットは、治療に好適な個体を、その個体が標的疾患を有するかどうかを特定することに基づいて選択する記述を更に含んでもよい。更に他の実施形態では、説明書は、標的疾患のリスクがある個体に抗体を投与する記述を含む。

武装Ｔ細胞又は二重特異性抗体などの武装免疫細胞の使用に関する説明書は、概して、意図される治療のための投与量、投薬スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）、又はサブユニット用量であり得る。本開示のキットで供給される説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）に書かれた説明書であるが、機械可読の説明書（例えば、磁気又は光学記憶ディスクで担持される説明書）もまた許容される。

ラベル又は添付文書は、組成物が、がん又は免疫障害（例えば、自己免疫疾患）などの疾患の治療、発生の遅延、及び／又は緩和に使用されることを示す。本明細書に記載される方法のうちのいずれかを実践するための説明書を提供することができる。

本発明のキットは、好適な包装である。好適な包装としては、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性包装（例えば、密封されたマイラーバッグ又はビニール袋）等が挙げられるが、これらに限定されない。また、吸入器、経鼻投与デバイス（例えば、噴霧器）、又はミニポンプなどの注入デバイスなどの特定のデバイスと組み合わせて使用するための包装も企図される。キットは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、輸液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器はまた、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、輸液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書に記載されるような武装免疫細胞又は二重特異性抗体である。

キットは、任意選択で、緩衝液及び解釈情報などの追加の構成要素を提供してもよい。通常、キットは、容器、及び当該容器上又はそれと関連付けられたラベル又は添付文書を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、上述のキットの内容物を含む製造物品を提供する。

一般的な技法
本開示の実践には、別段の指示がない限り、当該技術分野の技能内である分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技法が用いられる。そのような技法は、文献、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．，１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＮｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、ＩｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎｔｏＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒａｎｄＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒａｎｄＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒａｎｄＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙａｎｄＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａｐｒａｃｔｉｃｅａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄａｎｄＣ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗａｎｄＤ．Ｌａｎｅ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９９９）、ＴｈｅＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉａｎｄＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．ＨａｒｗｏｏｄＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡｐｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＶｏｌｕｍｅｓＩａｎｄＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒｅｄ．１９８５）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．（１９８５））、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４））、ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６））、ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓａｎｄＥｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬＰｒｅｓｓ，（１９８６））、及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，ＡｐｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅＴｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）において完全に説明されている。

更に詳述することなく、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる方法においても本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的又は主題のために参照により組み込まれる。

実施例１：組換え二重特異性抗体の産生
この実施例では、それぞれ、図１Ａ～１Ｌに示される構造を有する組換え抗体を、図２Ａ～２Ｅに示されるＤＮＡ構築物を使用して調製した。抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＴＡＡｓｃＦｖ二重特異性抗体の場合、構築物は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ａ）Ｉｇｋリーダー配列（ＬＳ）、抗ＣＤ３ＶＬ－Ｃｋドメイン又は抗ＣＤ３ＶＬ－Ｃλドメイン、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ＬＳ、抗ＣＤ３ＶＨ－ＣＨ１ドメイン、ペプチドリンカー、並びに抗ＴＡＡｓｃＦｖ（例えば、抗ＥＧＦＲｓｃＦｖ）（図１Ａ～１Ｄ）及び図２Ａの上位２つの構築物；又は（ｂ）ＬＳ、抗ＣＤ３ＶＬ－Ｃｋドメイン若しくは抗ＣＤ３ＶＬ－Ｃλドメイン、ペプチドリンカー、抗ＴＡＡｓｃＦｖ（例えば、抗ＥＧＦＲｓｃＦｖ）、ＩＲＥＳ、ＬＳ、及び抗ＣＤ３ＶＨ－ＣＨ１ドメイン（図１Ｂ及び図２Ａ、下位２つの構築物を含む。

抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／抗ＴＡＡＦａｂの場合、構築物は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ａ）ＬＳ、抗ＴＡＡＶＬ－Ｃｋドメイン（例えば、抗ＥＧＦＲＶＬ－Ｃｋドメイン）、ＩＲＥＳ、ＬＳ、抗ＴＡＡＶＨ－ＣＨ１ドメイン（例えば、抗ＥＧＦＲＶＨ－ＣＨ１ドメイン）、ペプチドリンカー、及び抗ＣＤ３ＶＨ－ＶＬドメイン若しくは抗ＣＤ３ＶＬ－ＶＨドメイン（図１Ｅ～１Ｈ及び図２Ｂ、上位２つの構築物）、又は（ｂ）ＬＳ、抗ＴＡＡＶＬ－Ｃｋドメイン（例えば、抗ＥＧＦＲＶＬ－Ｃｋドメイン）、ペプチドリンカー、抗ＣＤ３ＶＨ－ＶＬドメイン若しくは抗ＣＤ３ＶＬ－ＶＨドメイン、ＩＲＥＳ、ＬＳ、及び抗ＴＡＡＶＨ－ＣＨ１ドメイン（例えば、抗ＥＧＦＲＶＨ－ＣＨ１ドメイン）（図１Ｆ及び図２Ｂ、下位２つの構築物）を含む。

抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／抗ＴＡＡｓｃＦｖの場合、構築物は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＬＳ、抗ＴＡＡｓｃＦｖ（例えば、抗ＥＧＦＲｓｃＦｖ）、ペプチドリンカー、及び抗ＣＤ３ＶＨ－ＶＬドメイン又は抗ＣＤ３ＶＬ－ＶＨドメインを含む（図１Ｉ－ＩＬ及び図２Ｃ）。

抗ＣＤ３ノブ／抗ＴＡＡホール抗体の場合、抗ＣＤ３ノブ構築物は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＬＳ、抗ＣＤ３ＶＬ－Ｃｋドメイン又は抗ＣＤ３ＶＬ－Ｃλドメイン、ＩＲＥＳ、ＬＳ、及び抗ＣＤ３ＶＨ－ＣＨ１ノブＦｃを含み、一方、抗腫瘍ホールは、配列に、ＬＳ、抗ＴＡＡＶＬ－Ｃｋ（例えば、抗ＥＧＦＲＶＬ－Ｃｋドメイン）、ＩＲＥＳ、ＬＳ、及び抗ＴＡＡＶＨ－ＣＨ１－ホールＦｃ（例えば、抗ＥＧＦＲＶＨ－ＣＨ１－ホールＦｃ）を含んでいた（図２Ｄ）。

抗ＣＤ３ノブ／抗ＴＡＡｓｃＦｖホール抗体の場合、抗ＣＤ３ノブ構築物は、配列に、ＬＳ、抗ＣＤ３ＶＬ－Ｃｋドメイン又は抗ＣＤ３ＶＬ－Ｃλドメイン、ＩＲＥＳ、ＬＳ、及び抗ＣＤ３ＶＨ－ＣＨ１－ノブＦｃを含み、一方、抗腫瘍ホールは、配列に、ＬＳ、抗ＴＡＡｓｃＦｖ（例えば、抗ＥＧＦＲｓｃＦｖ）、ペプチドリンカー、及びホールＦｃを含んでいた（図２Ｅ）。

それぞれ、ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ（以前は抗ＥＧＦＲＦａｂ／ＣＡＴ．０２ｓｃＦｖという名称であった）及びＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ（以前は抗ＥＧＦＲＦａｂ／ａＣＤ３ｓｃＦｖという名称であり、その構造情報は、ＷＯ２０１８／１７７３７１に提供され、その関連開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために参照により組み込まれる）として指定される、２つの組換え抗体をそれに応じて調製した。ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ及びＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂの両方は、抗ＥＧＦＲＦａｂ及び抗ＣＤ３ｓｃＦｖを含み、抗ＥＧＦＲＦａｂのＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－Ｃｋドメインはそれぞれ、配列番号８３及び８４のアミノ酸配列を有していた。ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂの抗ＣＤ３ｓｃＦｖは、配列番号９のアミノ酸配列を有し、ＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂの抗ＣＤ３ｓｃＦｖは、ＷＯ２０１８／１７７３７１に提供される（ＣＴＡ０１は、ＷＯ２０１８／１７７３７１のＯＫＴ３という名称の同じ抗体である）。

実施例２：Ｔ細胞に対する組換え二重特異性抗体の効果
この実施例は、本明細書に開示される組換え二重特異性抗体の生物活性を調査する。

結合親和性
組換え抗体ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ及びＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂの結合親和性を、この実施例においてフローサイトメトリーによって調べた。ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ及びＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂの両方は、ＣＤ３陽性Ｔ細胞に結合することができた。ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂの結合親和性は、ＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂの結合親和性よりも高かった。図３。結合親和性の結果が、以下の表４に提供される。

細胞毒性効果
この実施例では、組換え抗体ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ又はＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂのがん細胞に対する細胞毒性効果を評価した。ＨＴ－２９細胞の約２．５％、１８．２％、２６．９％が、マウスＯＫＴ３によって活性化されたＣＤ３^＋／ＣＤ８^＋Ｔ細胞によって、それぞれ３：１、５：１、及び１０：１の効果細胞対標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）で殺傷され、ＨＴ－２９細胞の約１３．８％、３４．８％、及び６５．７％が、ＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂで武装されたＣＤ３^＋／ＣＤ８^＋Ｔ細胞によって殺傷され、ＨＴ－２９の約２８．１％、４４．４％、及び７６．７％が、同じＥ／Ｔ比でＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂで武装されたＴ細胞によって殺傷されたことが分かった（図４及び表５）。

データは、試験した二重特異性抗体の両方が、ＯＫＴ３抗体（抗ＣＤ３抗体）と比較してがん細胞に対するより高い細胞毒性効果を示し、ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂがより良い細胞毒性効果を示したことを示した。

Ｔ細胞の表面に残留した抗体の量に対する時間効果
ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ及びＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂを、２０％ＦＢＳの存在下でＴ細胞とともに２４時間インキュベートした。次いで、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析して、Ｔ細胞の表面上の抗体の残留量を評価した。このアッセイの結果は、Ｔ細胞の表面上の抗体の量が経時的に減少したことを示す。以下の図５及び表６。ＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂと比較して、ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂは分解の影響を受けにくかった。ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂの約８４．５％が、２４時間後もＴ細胞表面に残存したが、Ｔ細胞表面上に残存したＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂのレベルは、２４時間後に約４０％に低下した。

要するに、本明細書に開示される二重特異性抗体（ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ抗体によって例示される）は、ＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ対照抗体と比較して経時的に、Ｔ細胞に対するより高い結合親和性、より高い細胞毒性、及びより高いレベルのＴ細胞係合を示した。

実施例２：バリアント抗ＣＤ３／抗腫瘍二重特異性抗体の構築
様々な抗ＣＤ３／抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）のパネルを、遺伝子操作によって構築した。これらのＢｓＡｂは、４つの抗ＣＤ３抗体及び１６つの抗ＴＡＡ抗体（ＣＤ２０（ＣＴＡＴ０１）、ＣＤ１９（ＣＴＡＴ０２）、ＥＧＦＲ（ＣＴＡＴ０３）、ＨＥＲ２（ＣＴＡＴ０４）、ＰＳＭＡ（ＣＴＡＴ０５）、ＣＥＡ（ＣＴＡＴ０６）、ＥｐＣＡＭ（ＣＴＡＴ０７）、ＦＡＰ（ＣＴＡＴ０８）、ＰＤＬ１（ＣＴＡＴ０９）、ＣＤ３８（ＣＴＡＴ１０）、ＣＤ３３（ＣＴＡＴ１１）、ＨＧＦＲ（ＣＴＡＴ１２）、ＣＤ４７（ＣＴＡＴ１３）、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ＣＴＡＴ１４）、メソテリン（ＣＴＡＴ１５）、及びＧＤ２（ＣＴＡＴ１６））に由来した。上記の表１及び表２を参照されたい。

ＢｓＡｂは、哺乳動物宿主細胞における組換え技術を介して産生され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、還元条件下及び非還元条件下で収集され、検査された。簡単に述べると、非還元条件及び還元条件下で８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いたタンパク質電気泳動を実施して、抗ＣＤ３断片及び抗ＴＡＡ断片を含む様々なＢｓＡｂの構造及び分子量を分析した。

図６Ａ～６Ｂは、各々が４つの異なる抗ＣＤ３抗体（ＣＴＡ０２、ＣＴＡ０３、ＣＴＡ０４、及びＣＴＡ０５、上記の表１を参照）のＦａｂ、及び抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（ＣＴＡＴ０２、上記の表２を参照）を含む、ＢｓＡｂの発現及びアセンブリを示す。

図７Ａ～７Ｄは、各々が抗ＣＤ３Ｆａｂ（ＣＴＡ０３、上記の表１を参照）、並びに１６の異なる抗腫瘍抗体（ＣＤ２０（ＣＴＡＴ０１）、ＣＤ１９（ＣＴＡＴ０２）、ＥＧＦＲ（ＣＴＡＴ０３）、ＨＥＲ２（ＣＴＡＴ０４）、ＰＳＭＡ（ＣＴＡＴ０５）、ＣＥＡ（ＣＴＡＴ０６）、ＥｐＣＡＭ（ＣＴＡＴ０７）、ＦＡＰ（ＣＴＡＴ０８）、ＰＤＬ１（ＣＴＡＴ０９）、ＣＤ３８（ＣＴＡＴ１０）、ＣＤ３３（ＣＴＡＴ１１）、ＨＧＦＲ（ＣＴＡＴ１２）、ＣＤ４７（ＣＴＡＴ１３）、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ＣＴＡＴ１４）、メソテリン（ＣＴＡＴ１５）、及びＧＤ２（ＣＴＡＴ１６）、上記の表２を参照）のｓｃＦｖを含む、ＢｓＡｂの発現及びアセンブリを示す。図７Ｅ及び図７Ｆは、各々が４つの抗ＣＤ３抗体（ＣＴＡ０２～ＣＴＡ０５）のうちの１つのｓｃＦｖ、及び抗ＥＧＦＲＣＴＡＴ０３のＦａｂ断片を含む、ＢｓＡｂの発現を示す。

実施例３：抗ＣＤ３／抗ＴＡＡＢｓＡｂはＴ細胞に結合し、ＴＡＡを発現する腫瘍細胞を標的とする
様々な抗ＣＤ３／抗腫瘍ＢｓＡｂのＴ細胞及び腫瘍細胞への結合活性を、フローサイトメトリーを使用して分析した。ＣＤ３及びＣＤ１９に特異的なＢｓＡｂ（ＣＴＡ０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０４Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０５Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ）は全て、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）への結合活性を示し、かかるＢｓＡｂで武装されたＴ細胞を使用して、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫などのＣＤ１９＋疾患細胞を標的とすることができることを示した。図８。

また、他のＴＡＡへの結合断片を有するＢｓＡｂの結合活性を調べた。図９Ａ～１０Ｋに示されるように、
・ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖは、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）への結合活性を示した（図９Ａ）；
・ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖは、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＥＧＦＲ^＋トリプルネガティブ乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）への結合活性を示した（図９Ｂ）；
・ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖは、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＨＥＲ２^＋乳がん（ＭＣＦ７／ＨＥＲ２）への結合活性を示した（図９Ｃ）；
・ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０５ｓｃＦｖは、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＰＳＭＡ^＋前立腺がん（ＬＮＣａＰ）への結合活性を示した（図９Ｄ）；
・ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０７ｓｃＦｖは、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＥｐＣＡＭ^＋前立腺がん（ＬＮＣａＰ）への結合活性を示した（図９Ｅ）；
・ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０８ｓｃＦｖは、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＦＡＰ^＋マウス線維芽細胞細胞（３Ｔ３／ＦＡＰ）への結合活性を示した（図９Ｆ）；
・ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０９ｓｃＦｖは、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＰＤＬ１^＋トリプルネガティブ乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）への結合活性を示した（図９Ｇ）；
・ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１０ｓｃＦｖは、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＣＤ３８^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）への結合活性を示した（図９Ｈ）；
・ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１１ｓｃＦｖは、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＣＤ３３^＋ヒト急性骨髄性白血病（ＨＬ－６０）への結合活性を示した（図９Ｉ）；
・ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１２ｓｃＦｖは、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＨＧＦＲ^＋ヒト肺がん（Ａ５４９）への結合活性を示した（図９Ｊ）；並びに
・ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１３ｓｃＦｖは、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＣＤ４７^＋乳がん（ＭＣＦ７／ＨＥＲ２）への結合活性を示した（図９Ｋ）。

更に、様々な抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／抗腫瘍ＦａｂＢｓＡｂのＴ細胞及び腫瘍細胞への結合活性を、フローサイトメトリーを使用して分析した。図９Ｌは、４つの異なる抗ＣＤ３抗体（ＣＴＡ０２、ＣＴＡ０３、ＣＴＡ０４、ＣＴＡ０５）のｓｃＦｖ及び抗ＥＧＦＲＦａｂ（ＣＴＡＴ０３）からなるＢｓＡｂのＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＥＧＦＲ＋結腸がん（ＨＴ－２９）に対する標的化能を示す。結果は、ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０３ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０４ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、及びＣＴＡ０５ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂが全て、ＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＥＧＦＲ＋結腸がん（ＨＴ－２９）に対する標的化能を有することを実証した。

実施例４：Ｔ細胞表面上のＢｓＡｂの保持能
Ｔ細胞表面上のＢｓＡｂの保持時間を、インビトロインキュベーションプラットフォームを使用して分析した。簡単に述べると、ヒトＴ細胞を、様々な抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（ＣＴＡ０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０５Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ）と１時間インキュベートし、次いで培地中で５分間、２４時間、４８時間、及び７２時間培養した。培養後、フローサイトメトリーを使用して、Ｔ細胞表面上のＢｓＡｂの残留量を検出した。７２時間後、ＣＴＡ０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０５Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖは全て、Ｔ細胞表面上で検出され、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖは、Ｔ細胞表面上で最も高い保持量を有した。図１０。

実施例５：ワンステップインキュベーションによるＢｓＡｂを使用した武装免疫細胞の調製、
健康なドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＯＫＴ３抗体の存在下、又は本明細書に開示される例示的なＢｓＡｂの存在下で培養し（ＣＴＡ０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０５Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖを例として使用する）、Ｔ細胞に分化させた。全ての群を同じ条件下（５％ＣＯ_２供給及び３７℃での安定した湿度レベルのインキュベーター中）で培養した。７日後、フローサイトメトリーを使用して全ての群を分析して、ＢｓＡｂ武装Ｔ細胞の産生を測定した。

図１１Ａ及び１１Ｂに示されるように、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体は、ＰＢＭＣの正常Ｔ細胞のみへの分化を誘導したが、武装Ｔ細胞への分化は誘導しなかった。対照的に、ＣＴＡ０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０５Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖＢｓＡｂは全て、武装Ｔ細胞を成功裏に産生した。

別の実験では、ＰＢＭＣを培養し、ＯＫＴ３又は例示的な抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗腫瘍ｓｃＦｖＢｓＡｂ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０５ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０７ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０８ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ９ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１０ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１１ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１３ｓｃＦｖ）とともにＴ細胞に分化させた。全ての群を同じ条件下（５％ＣＯ_２及び３７℃での安定した湿度レベルのインキュベーター中）で培養した。７日後、フローサイトメトリーを使用して全ての群を分析して、ＢｓＡｂ武装Ｔ細胞が成功裏に生成されたかどうかを明らかにした。図１２Ａ及び１２Ｂは、ＯＫＴ３抗体が、ＰＢＭＣの正常なＴ細胞への分化をもたらしたが、武装Ｔ細胞は産生されなかったことを示す。対照的に、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０５ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０７ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０８ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ９ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１０ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１１ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１３ｓｃＦｖＢｓＡｂは全て、武装Ｔ細胞の産生をもたらした。

更に、ＰＢＭＣを培養し、ＯＫＴ３又は様々な抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／抗腫瘍ＦａｂＢｓＡｂ（ＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０３ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０４ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、及びＣＴＡ０５ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ）とともにＴ細胞に分化させた。全ての群を同じ条件下（５％ＣＯ２及び３７℃での安定した湿度レベルのインキュベーター中）で培養した。７日後、フローサイトメトリーを使用して全ての群を分析して、ＢｓＡｂ武装Ｔ細胞が成功裏に生成されたかどうかを明らかにした。図１２Ｃ及び１２Ｄは、従来のＯＫＴ３法が、ＰＢＭＣを正常なＴ細胞のみに分化させたが、武装Ｔ細胞には分化させなかったことを示す。しかしながら、ＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０３ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０４ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、及びＣＴＡ０５ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３ＦａｂＢｓＡｂは全て、武装Ｔ細胞を成功裏に生成した。

実施例６：腫瘍細胞に対するＢｓＡｂ武装Ｔ細胞のインビトロ毒性
抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９ＢｓＡｂで武装されたＴ細胞の、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）に対する細胞毒性活性を、この実施例において調査した。ＣＴＡ０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０５Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖを含む、本明細書に開示される例示的な抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９ＢｓＡｂ。ＯＫＴ３抗体で培養したＴ細胞を、インビトロ細胞毒性アッセイを使用して分析した。ＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）に対して、ＯＫＴ３で培養したＴ細胞の顕著な細胞毒性は観察されなかった。異なる点として、ＣＴＡ０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ、又はＣＴＡ０５Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖで培養したＴ細胞は、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）を効率的に殺傷した。試験したＢｓＡｂのうち、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞は、細胞毒性活性が最も良好であった。図１３Ａ。

更に、５つの異なる抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（ＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０３ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０４ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、及びＣＴＡ０５ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ）からなる抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／抗ＥＧＦＲＦａｂＢｓＡｂで武装されたＴ細胞、並びに従来のＯＫＴ３抗体で培養したＴ細胞のＥＧＦＲ^＋結腸がん（ＨＴ－２９）殺傷活性を、インビトロ細胞毒性アッセイを使用して分析した。図１３Ｂは、ＯＫＴ３でインキュベートしたＴ細胞が、ＥＧＦＲ^＋結腸がん（ＨＴ－２９）を効率的に殺傷しなかったが、ＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０３ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０４ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、及びＣＴＡ０５ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂで培養した武装Ｔ細胞が、ＥＧＦＲ^＋結腸がん（ＨＴ－２９）を効率的に殺傷したことを示す。図１３Ｂ。

別の実験では、様々な抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗腫瘍ｓｃＦｖＢｓＡｂ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０５ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０７ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０８ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ９ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１０ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１１ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１３ｓｃＦｖを含む）で生成された武装Ｔ細胞の腫瘍細胞殺傷活性を更に分析した。図１４Ａ及び１４Ｂに示されるように、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞は、ＥＧＦＲ^＋結腸がん細胞ＨＴ２９及びＨＣＴ－１１６を効率的に殺傷した。図１４Ｃは、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞が、ＨＥＲ２^＋乳がん（ＭＣＦ７／ＨＥＲ２）を効率的に殺傷したことを示す。図１４Ｄは、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０５ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞が、ＰＳＭＡ^＋前立腺がん（ＬＮＣａＰ）を効率的に殺傷したことを示す。図１４Ｅは、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０７ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞が、ＥｐＣＡＭ^＋前立腺がん（ＬＮＣａＰ）を効率的に殺傷したことを示す。更に、図１４Ｆ～１４Ｇは、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０８ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞が、ＦＡＰ^＋マウス線維芽細胞細胞（３Ｔ３／ＦＡＰ）を効率的に殺傷したことを示す。

加えて、図１５Ａは、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０９ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞が、ＰＤＬ１^＋トリプルネガティブ乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を効率的に殺傷したことを示す。図１５Ｂは、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１０ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞が、ＣＤ３８^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）を効率的に殺傷したことを示す。図１５Ｃは、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１１ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞が、ＣＤ３３^＋ヒト急性骨髄性白血病（ＨＬ－６０）を効率的に殺傷したことを示す。図１５Ｄは、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１２ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞が、ＨＧＦＲ^＋ヒト肺がん（Ａ５４９）を効率的に殺傷したことを示す。図１５Ｅは、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ１３ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞が、ＣＤ４７^＋乳がん（ＭＣＦ７／ＨＥＲ２）を効率的に殺傷したことを示す。

実施例７：ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞のインビボ抗がん活性
抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（ＣＴＡ０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ）武装Ｔ細胞のインビボがん阻害を評価した。ＣＴＡ０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞を、Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）を有するＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。体重、生存率、及び後肢麻痺の発生率を記録した。図１６Ａ～１６Ｃは、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞が、がんを効果的に阻害するための最良の治療有効性を有していたことを示す。

実施例８：ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍活性
抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＥＧＦＲｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ）武装Ｔ細胞及び抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ）武装Ｔ細胞のインビボ腫瘍阻害を評価した。ヒトトリプルネガティブ乳がんを有する患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）マウスモデルに、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞を静脈内注射した。体重及び腫瘍サイズを記録した。図１７Ａ～１７Ｂは、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ武装Ｔ細胞の両方が、ヒトトリプルネガティブ乳がんの腫瘍増殖を効率的に阻害したことを示す。

実施例９：ＢｓＡｂを使用してＰＢＭＣから武装ＮＫＴ細胞を産生するためのワンステップインキュベーション

健康なドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養し、従来のＯＫＴ３法、又はＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０５ｓｃＦｖＢｓＡｂでＮＫＴ細胞（ＣＤ８^＋ＣＤ５６^＋）に分化させた。全ての群を同じ環境（５％ＣＯ_２及び３７℃での安定した湿度レベルのインキュベーター中）で培養した。７日後、フローサイトメトリーを使用して全ての群を分析して、ＢｓＡｂ武装ＮＫＴ細胞が成功裏に生成されたかどうかを明らかにした。図１８Ａ及び１８Ｂは、ＯＫＴ３法が、ＰＢＭＣを誘導して正常なＮＫＴ細胞のみに分化させたが、武装Ｔ細胞の形成を誘導しなかったことを示す。異なる点では、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０３ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０４ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０５ｓｃＦｖＢｓＡｂは全て、武装ＮＫＴ細胞を成功裏に生成した。

同様のアッセイでは、健康なドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養し、ＯＫＴ抗体の存在下で、又はＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０３ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０４ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、及びＣＴＡ０５ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３ＦａｂＢｓＡｂでＮＫＴ細胞（ＣＤ８^＋ＣＤ５６^＋）に分化させた。全ての群を同じ環境（５％ＣＯ_２及び３７℃での安定した湿度レベルのインキュベーター中）で培養した。７日後、フローサイトメトリーを使用して全ての群を分析して、ＢｓＡｂ武装ＮＫＴ細胞が成功裏に生成されたかどうかを明らかにした。図３４は、従来のＯＫＴ３法が、ＰＢＭＣを正常なＮＫＴ細胞のみに分化させたが、武装Ｔ細胞には分化させなかったことを示す。しかしながら、ＣＴＡ０１ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０２ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０３ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、ＣＴＡ０４ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３Ｆａｂ、及びＣＴＡ０５ｓｃＦｖ／ＣＴＡＴ０３ＦａｂＢｓＡｂは全て、武装ＮＫＴ細胞を成功裏に生成した。

実施例１０：点変異を伴うＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖＢｓＡｂの構築及び
その特徴付け
点変異を、遺伝子操作によってＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖＢｓＡｂに導入し、ＢｓＡｂＣＴＡ０３－０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０１ｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ（ＶＬＧ５８Ａ）／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ（ＶＬＧ４２Ａ））、ＣＴＡ０３－０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０２ｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ（ＶＬＧ５８Ａ）／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ（ＶＬＤ４１Ｅ））、ＣＴＡ０３－０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０２ｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ（ＶＬＤ５７Ｅ）／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ（ＶＬＤ４１Ｅ））、及びＣＴＡ０３－０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０１ｓｃＦｖ（ＣＴＡ０３Ｆａｂ（ＶＬＤ５７Ｅ）／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖ（ＶＬＧ４２Ａ））をもたらした。より具体的には、点変異Ｇ５８Ａ及びＤ５７ＥをＣＴＡ０３のＶＬに導入し、Ｇ４２Ａ及びＤ４１ＥをＣＴＡＴ０２のＶＬに導入した。上記の表２を参照されたい。

ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）に対するＢｓＡｂの結合能を、フローサイトメトリーを使用して分析した。図１９Ａ～１９Ｂは、ＣＴＡ０３－０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０１ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３－０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３－０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０３－０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０１ｓｃＦｖＢｓＡｂが全て、ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）に対する標的化能力を有することを示す。追加的に、ＢｓＡｂの標的細胞への結合は、用量依存的である。

点変異体ＢｓＡｂ（ＣＴＡ０３－０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０１ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３－０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３－０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０２ｓｃＦｖ、及びＣＴＡ０３－０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０１ｓｃＦｖ）で生成した武装Ｔ細胞によるＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫に対する殺傷活性を、元のＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖＢｓＡｂ武装Ｔ細胞の殺傷活性と比較した。図１９Ｃは、ＯＫＴ３でインキュベートしたＴ細胞が、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）に対して細胞毒性を示さなかったことを示す。一方、ＣＴＡ０３－０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０１ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３－０１Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０２ｓｃＦｖ、ＣＴＡ０３－０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０２ｓｃＦｖ、又はＣＴＡ０３－０２Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２－０１ｓｃＦｖで培養した武装Ｔ細胞は、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞性リンパ腫（Ｒａｊｉ）を効率的に殺傷し、細胞毒性は全て親ＣＴＡ０３Ｆａｂ／ＣＴＡＴ０２ｓｃＦｖＢｓＡｂより良好であった。

他の実施形態
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等の、又は同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、別途明示的に記載されない限り、開示される各特徴は、一連の一般的な同等又は類似の特徴の一例にすぎない。

上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明を様々な使用及び条件に適合させるための様々な変更及び修正を行うことができる。したがって、他の実施形態もまた特許請求の範囲内である。

等価物
いくつかの本発明の実施形態が本明細書に記載され例示されているが、当業者は、機能を実施するための、並びに／又は本明細書に記載される結果及び／若しくは１つ以上の利点を得るための様々な他の手段及び／若しくは構造を容易に想定し、そのような変形及び／又は修正の各々は、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的に、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成は、本発明の教示が使用される特定の１つ又は複数の用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載される特定の発明の実施形態に対する多くの等価物を、日常的な実験のみを使用して認識するか、又は確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は、単なる例として提示され、添付の特許請求の範囲及びその等価物の範囲内で、発明の実施形態は、具体的に記載され、特許請求される以外の方法で実施され得ることが理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載される各個別の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。加えて、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、２つ以上のかかる特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の任意の組み合わせは、本開示の発明の範囲内に含まれる。

本明細書で定義及び使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義、及び／又は定義された用語の通常の意味を制御するように理解されるべきである。

本明細書に開示される全ての参照文献、特許、及び特許出願は、各々が引用される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、文書の全体を包含し得る。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される無制限の物品「ａ」及び「ａｎ」は、それとは反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される語句「及び／又は」は、そのように結合された要素、すなわち、場合によっては結合的に存在し、他の場合では分離的に存在する要素の「いずれか又は両方」を意味すると理解されるべきである。「及び／又は」で列挙される複数の要素は、同じ様式、すなわち、そのように結合された要素のうちの「１つ以上」で解釈されるべきである。「及び／又は」という句によって具体的に特定された要素以外に、具体的に特定されたそれらの要素に関連するか又は関連しないかにかかわらず、他の要素が任意選択で存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む」などのオープン・エンド言語と併せて使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（任意選択でＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）、更に別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（任意選択で他の要素を含む）等を指すことができる。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「又は」は、上記で定義される「及び／又は」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、リスト内のアイテムを分離する場合、「又は」又は「及び／又は」は、包括的であると解釈されなければならず、すなわち、要素の数又はリストのうちの少なくとも１つであるが、１つを超えるものも含み、任意選択で、追加の非公開アイテムを含む。「のうちの１つのみ」若しくは「のうちの正確に１つ」、又は特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」など、明確に反対に示される用語のみが、要素の数又はリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指すことになる。一般に、本明細書で使用される「又は」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、又は「のうちの正確に１つ」などの排他性の用語が先行する場合、排他的代替案（すなわち、「一方又は他方であるが両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。特許請求の範囲において使用される場合、「から本質的になる」は、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。

「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容誤差範囲内であることを意味し、これは、その値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの限界に一部依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣例に従って、許容される標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、及びより好ましくは更に最大±１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生体系又は生物学的過程に関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは２倍以内であることを意味し得る。本出願及び特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、別段の記載がない限り、「約」という用語は暗黙的であり、本文脈において、特定の値について許容誤差範囲内であることを意味する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。

本明細書及び特許請求の範囲において使用されるように、１つ以上の要素のリストに関して「少なくとも１つ」という語句は、要素のリスト内の要素のうちのいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されたいが、要素のリスト内に具体的に列挙される各々及び全ての要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、具体的に特定されたそれらの要素に関連するかどうかにかかわらず、任意選択で存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は等価的に、「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」、又は等価的に、「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、Ｂが存在しない（及び任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）少なくとも１つのＡ（任意選択で、１つより多くのＡを含む）を指し、別の実施形態では、Ａが存在しない（及び任意選択で、Ａ以外の要素を任意に含む）少なくとも１つのＢ（任意選択で、１つより多くのＢを含む）を指し、更に別の実施形態では、少なくとも１つのＡ（任意選択で、１つより多くのＡを含む）及び少なくとも１つのＢ（及び任意選択で、他の要素を含む）を指し得る等である。

逆に明確に示されない限り、１つより多くの工程又は行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、方法の工程又は行為の順序は、必ずしも、方法の工程又は行為が列挙される順序に限定されないことも理解されたい。

Claims

二重特異性抗体であって、
（ａ）ヒトＣＤ３に結合する第１の抗原結合断片であって、前記第１の抗原結合断片が、第１の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む第１の重鎖、及び第１の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む第１の軽鎖を含み、前記第１のＶ_Ｈが、第１の参照抗体と比較して、同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）又は５個以下のアミノ酸変異を含み、前記第１のＶ_Ｌが、前記参照抗体と比較して、同じ軽鎖ＣＤＲ又は５個以下のアミノ酸変異を含み、前記第１の参照抗体が、ＣＴＡ．０２、ＣＴＡ．０３、ＣＴＡ．０４、又はＣＴＡ．０５である、第１の抗原結合断片と、
（ｂ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する第２の抗原結合断片であって、前記第２の抗原結合断片が、第２の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む第２の重鎖、及び第２の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む第２の軽鎖を含む、第２の抗原結合断片と、を含む、二重特異性抗体。
前記第１の重鎖及び前記第１の軽鎖が、前記第１の参照抗体と同じＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
前記第２の抗原結合断片が、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ｃＭＥＴ、ＣＤ４７、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、メソテリン、又はＧＤ２である、ＴＡＡに結合する、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。
前記第２のＶ_Ｈが、第２の参照抗体と比較して、同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）又は５個以下のアミノ酸変異を含み、前記第２のＶ_Ｌが、前記第２の参照抗体と比較して、同じ軽鎖ＣＤＲ又は５個以下のアミノ酸変異を含み、前記第２の参照抗体が、ＣＴＡＴ．０１、ＣＴＡＴ．０２、ＣＴＡＴ．０３、ＣＴＡＴ．０４、ＣＴＡＴ．０５、ＣＴＡＴ．０６、ＣＴＡＴ．０７、ＣＴＡＴ．０８、ＣＴＡＴ．０９、ＣＴＡＴ．１０、ＣＴＡＴ．１１、ＣＴＡＴ．１２、ＣＴＡＴ．１３、ＣＴＡＴ．１４、ＣＴＡＴ．１５、又はＣＴＡＴ．１６である、請求項３に記載の二重特異性抗体。
前記第２の抗原結合断片が、前記第２の参照抗体と同じＶ_Ｈ及び同じＶ_Ｌを含む、請求項４に記載の二重特異性抗体。
前記第１の抗原結合断片が、Ｆａｂ断片であり、前記第２の抗原結合断片が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、前記Ｆａｂ断片が、前記第１のＶ_Ｈ及びＣＨ１断片を含む前記第１の重鎖と、前記第１のＶ_Ｌ及び軽鎖定常領域を含む前記第１の軽鎖と、を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記Ｆａｂ断片が、それぞれ、（ａ）配列番号１０及び配列番号１１、（ｂ）配列番号２３及び配列番号２４、２５、若しくは２２８、（ｃ）配列番号３５及び配列番号３６、又は（ｄ）配列番号４６及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む、前記第１の重鎖及び前記第１の軽鎖を含む、請求項６に記載の二重特異性抗体。
前記第２の抗原結合断片の前記ｓｃＦｖが、配列番号２５４～２７１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項６又は７に記載の二重特異性抗体。
前記ｓｃＦｖが、ペプチドリンカーを介して前記ＣＨ１断片又は前記軽鎖定常領域に連結される、請求項６～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記二重特異性抗体が、前記第１の軽鎖を含む第１のポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記第１の重鎖、前記ペプチドリンカー、及び前記ｓｃＦｖを含む第２のポリペプチドと、を含む、請求項７に記載の二重特異性抗体。
前記第１のポリペプチドが、配列番号２２９～２４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の二重特異性抗体。
前記第２のポリペプチドが、配列番号２４、２５、及び２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０又は１１に記載の二重特異性抗体。
前記第１の抗原結合断片が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、前記第２の抗原結合断片が、Ｆａｂ断片であり、前記Ｆａｂ断片が、前記第２のＶ_Ｈ及びＣＨ１断片を含む前記第２の重鎖と、前記第２のＶ_Ｌ及び軽鎖定常領域を含む前記第２の軽鎖と、を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記ｓｃＦｖが、配列番号２５０～２５３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の二重特異性抗体。
前記Ｆａｂ断片が、それぞれ、（１）配列番号５７及び配列番号５８、（２）配列番号７２及び配列番号７３、（３）配列番号８３及び配列番号８４、（４）配列番号９４及び配列番号９５、（５）配列番号１０５及び配列番号１０６、（６）配列番号１１６及び配列番号１１７、（７）配列番号１２７及び配列番号１２８、（８）配列番号１３８及び配列番号１３９、（９）配列番号１４９及び配列番号１５０、（１０）配列番号１６０及び配列番号１６１、（１１）配列番号１７１及び配列番号１７２、（１２）配列番号１８２及び配列番号１８３、（１３）配列番号１９３及び配列番号１９４、（１４）配列番号２０４及び配列番号２０５、（１５）配列番号２１５及び配列番号２１６、又は（１６）配列番号２２６及び配列番号２２７のアミノ酸配列を含む、前記第１の重鎖及び前記第１の軽鎖を含む、請求項１３又は１４に記載の二重特異性抗体。
前記ｓｃＦｖが、任意選択で、少なくとも５アミノ酸長であるペプチドリンカーを介して、前記ＣＨ１断片又は前記軽鎖定常領域に連結される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記第１の抗原結合断片及び前記第２の抗原結合断片の両方が、ｓｃＦｖ抗体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記二重特異性抗体が、２つの前記ｓｃＦｖ抗体を含むポリペプチドを含む、請求項１３に記載の二重特異性抗体。
表面ＣＤ３を発現する免疫細胞、及び請求項１～１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む、武装免疫細胞であって、前記武装免疫細胞が、前記二重特異性抗体における前記第１の抗原結合断片と前記免疫細胞によって発現される前記ＣＤ３との間の相互作用を介して、前記二重特異性抗体を前記表面上に提示する、武装免疫細胞。
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、又はそれらの組み合わせである、請求項１９に記載の武装免疫細胞。
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞である、請求項２０に記載の武装免疫細胞。
前記免疫細胞が、ヒト免疫細胞である、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の武装免疫細胞。
前記ヒト免疫細胞が、ヒトドナーに由来する、請求項２２に記載の武装免疫細胞。
請求項１９に記載の武装免疫細胞を産生する方法であって、前記二重特異性抗体の存在下で前記免疫細胞を含む細胞集団を培養して、前記二重特異性抗体の前記免疫細胞への結合を可能にし、それによって前記武装免疫細胞を産生することを含む、方法。
前記細胞集団が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２４に記載の方法。
前記細胞集団が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はインビトロで幹細胞に由来する免疫細胞を含み、任意選択で、前記幹細胞が、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、又は誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項２５に記載の方法。
前記培養工程が、任意選択で、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）、又はそれらの組み合わせを含む、サイトカインを含む培養培地中で行われる、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法によって産生される、武装免疫細胞の集団。
がんを治療するための方法であって、がんの治療を必要とする対象に、有効量の請求項１９～２３及び２８のいずれか一項に記載の武装免疫細胞の集団を投与することを含み、前記対象が、前記二重特異性抗体の前記第２の抗原結合断片が結合する前記ＴＡＡに陽性であるがんを有するか、又は有する疑いがある、方法。
前記対象が、ヒトがん患者である、請求項２９に記載の方法。
前記武装免疫細胞が、前記対象に対して自己由来である、請求項２９又は３０に記載の方法。
前記武装免疫細胞が、前記対象に対して同種異系である、請求項２９又は３０に記載の方法。
前記がんが、黒色腫、食道がん、胃がん、脳腫瘍、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、乳がん、膵臓がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝細胞がん、卵巣がん、前立腺がん、甲状腺がん、精巣がん、頭頚部扁平上皮がん、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫からなる群から選択される、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードするか、又は集合的にコードする、核酸又は一組の核酸。
ベクター又は一組のベクターである、請求項３４に記載の核酸又は一組の核酸。
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項３５に記載の核酸又は一組の核酸。
請求項３４～３６のいずれか一項に記載の核酸又は一組の核酸を含む、宿主細胞。
前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、又は哺乳動物細胞である、請求項３７に記載の宿主細胞。
二重特異性抗体を産生するための方法であって、
（ｉ）請求項３７又は３８に記載の宿主細胞を、前記二重特異性抗体の発現を可能にする条件下で培養することと、
（ｉｉ）前記二重特異性抗体を採取することと、を含む、方法。