JP2023519266A - チアミンの類似体及び誘導体と結合するアプタマー - Google Patents

チアミンの類似体及び誘導体と結合するアプタマー Download PDF

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Abstract

本開示は、チアミンの類似体及び誘導体等の特定の小分子に結合するオリゴヌクレオチドアプタマー、ならびにかかる小分子に結合するアプタマーを作製する方法に関する。また、本明細書に開示されるアプタマーを含む、リボスイッチ及びポリヌクレオチドカセットも企図される。さらに、治療遺伝子等の標的遺伝子の調節のために、前記アプタマー、リボスイッチ、及び／またはポリヌクレオチドを使用する方法が提供される。また、本明細書では、標的遺伝子発現のモジュレーターである小分子も提供され、ここで、標的遺伝子は、本明細書に記載されるアプタマーを含むリボスイッチを含有する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月２４日に出願された米国特許出願第６２／９９４，１３５号に対する優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、特定の小分子に結合するオリゴヌクレオチドアプタマー及びかかる小分子に結合するアプタマーを作製する方法に関する。また、標的遺伝子の発現を調節するためのリボスイッチ及びポリヌクレオチドカセットも企図され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、本明細書に開示されるアプタマーを含む。さらに、標的遺伝子が本明細書に記載されるアプタマーを含むリボスイッチを含有している、標的遺伝子発現のモジュレーターである小分子が提供される。
アプタマーは、標的リガンドに高い親和性及び特異性で結合するオリゴヌクレオチドである。これらの核酸配列は、最初のアプタマー薬が最近ＦＤＡにより承認されたこと、及び臨床パイプラインでアプタマー薬が追加されたことにより、治療上及び診断上の価値が高いことが証明されている。それらの高度な特異性と汎用性により、ＲＮＡアプタマーは、がん、ウイルス感染症及び他の疾患を含めたヒトの疾患との闘いにおいて、新たなＲＮＡナノテクノロジー分野の極めて重要なツールの１つとして確立された。
さらに、アプタマーは、アプタマーリガンドの存在下または非存在下で特定の効果を有するリボスイッチの一部として利用され得る。例えば、アプタマーリガンドの存在または非存在に応答して遺伝子発現を調節するためにリボスイッチを使用してよい。
しかしながら、原核生物供給源に由来するかまたはインビトロでの選択方法を使用して作製されるアプタマーは、真核生物系での治療標的遺伝子の発現に必要な機能を実証できないことがよくある。そのため、小分子リガンドの存在または非存在に応答して遺伝子発現を調節することができる新規アプタマー配列が必要とされている。
本明細書では、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）及びその類似体または誘導体等の小分子に結合するアプタマー配列を提供する。また、標的遺伝子の発現を調節するためのリボスイッチ及びポリヌクレオチドカセットも企図され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、本明細書に開示されるアプタマーを含む。さらに、治療遺伝子等の標的遺伝子の調節のために前記のアプタマー、リボスイッチ、及び／またはポリヌクレオチドカセットを使用する方法が提供される。また、本明細書では、標的遺伝子発現のモジュレーターである小分子も提供され、ここで、標的遺伝子は、本明細書に記載されるアプタマーを含むリボスイッチを含有する。
一態様では、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットが提供され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含み、アプタマーコード配列は、
ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＸ２ＴＸ３ＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＸ４ＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号１）
を含み、ここで、
Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
Ｘ２は、Ｃであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ３は、Ｔであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ４は、ＡまたはＧであり、
Ｘ５は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ６は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ７は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、Ｃ、Ｇ、またはＴであり、
Ｘ１０は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ１１は、ＡまたはＴであり、
Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
Ｘ１３は、ＣまたはＴである。
一態様では、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットが提供され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含み、アプタマーコード配列は、
ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＸ２ＴＸ３ＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号２）
を含み、ここで、
Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
Ｘ２は、Ｃであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ３は、Ｔであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ５は、ＧまたはＴであり、
Ｘ６は、ＣまたはＴであり、
Ｘ７は、ＣまたはＴであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、ＧまたはＴであり、
Ｘ１０は、Ａ、Ｇ、またはＴであり、
Ｘ１１は、ＡまたはＴであり、
Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
Ｘ１３は、ＣまたはＴである。
一態様では、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットが提供され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含み、アプタマーコード配列は、
ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号３）
を含み、ここで、
Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
Ｘ１３は、ＣまたはＴである。
一態様では、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットが提供され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含み、アプタマーコード配列は、
ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＴＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号４）
を含み、ここで、
Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、ＧまたはＴであり、
Ｘ１０は、Ａ、Ｇ、またはＴであり、かつ
Ｘ１１は、ＡまたはＴである。
一態様では、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットが提供され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含み、アプタマーコード配列は、
ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＴＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号５）
を含み、ここで、
Ｘ５は、ＧまたはＴであり、
Ｘ６は、ＣまたはＴであり、かつ
Ｘ７は、ＣまたはＴである。
一態様では、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットが提供され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含み、アプタマーコード配列は、
ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＸ４ＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０ＡＣＣＴＧＴＴＣＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号６）
を含み、ここで、
Ｘ４は、ＡまたはＧであり、
Ｘ５は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ６は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ７は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、ＣまたはＧであり、かつ
Ｘ１０は、任意のヌクレオチドである。
一態様では、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットが提供され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含み、アプタマーコード配列は、配列番号７～３６（表１を参照のこと）からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む。一態様では、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットが提供され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含み、アプタマーコード配列は、配列番号７～３６（表１を参照のこと）からなる群から選択される配列を含む。
一態様では、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットが提供され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含み、アプタマーコード配列は、配列番号８、９、１４～１８、２１、２５、２６、及び３０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む。一態様では、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットが提供され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含み、アプタマーコード配列は、配列番号８、９、１４～１８、２１、２５、２６、及び３０からなる群から選択される配列を含む。
好ましい実施形態では、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットが提供され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含み、アプタマーコード配列は、配列番号９、１４、及び２６からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む。さらに好ましい実施形態では、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットが提供され、ここで、ポリヌクレオチドカセットは、小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含み、アプタマーコード配列は、配列番号９、１４、及び２６からなる群から選択される配列を含む。
一態様では、小分子に結合するアプタマーをコードする配列が提供され、ここで、アプタマーコード配列は、
ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＸ２ＴＸ３ＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＸ４ＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号１）
を含み、ここで、
Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
Ｘ２は、Ｃであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ３は、Ｔであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ４は、ＡまたはＧであり、
Ｘ５は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ６は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ７は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、Ｃ、Ｇ、またはＴであり、
Ｘ１０は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ１１は、ＡまたはＴであり、
Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
Ｘ１３は、ＣまたはＴである。
実施形態では、アプタマーコード配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ１がＡではない；Ｘ２がＣではない；Ｘ３がＴではない；Ｘ４がＧではない；Ｘ５がＧではない；Ｘ６がＣではない；Ｘ７がＣではない；Ｘ８がＴではない；Ｘ９がＧではない；Ｘ１０がＡではない；Ｘ１１がＡではない；Ｘ１２がＴではない；及びＸ１３がＣではない。
実施形態では、以下の全てがアプタマーコード配列中に同時に存在することはない：Ｘ１がＡである；Ｘ２がＣである；Ｘ３がＴである；Ｘ４がＧである；Ｘ５がＧである；Ｘ６がＣである；Ｘ７がＣである；Ｘ８がＴである；Ｘ９がＧである；Ｘ１０がＡである；Ｘ１１がＡである；Ｘ１２がＴである；及びＸ１３がＣである。
一態様では、小分子に結合するアプタマーをコードする配列が提供され、ここで、アプタマーコード配列は、
ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＸ２ＴＸ３ＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号２）
を含み、ここで、
Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
Ｘ２は、Ｃであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ３は、Ｔであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ５は、ＧまたはＴであり、
Ｘ６は、ＣまたはＴであり、
Ｘ７は、ＣまたはＴであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、ＧまたはＴであり、
Ｘ１０は、Ａ、Ｇ、またはＴであり、
Ｘ１１は、ＡまたはＴであり、
Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
Ｘ１３は、ＣまたはＴである。
実施形態では、アプタマーコード配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ１がＡではない；Ｘ２がＣではない；Ｘ３がＴではない；Ｘ４がＧではない；Ｘ５がＧではない；Ｘ６がＣではない；Ｘ７がＣではない；Ｘ８がＴではない；Ｘ９がＧではない；Ｘ１０がＡではない；Ｘ１１がＡではない；Ｘ１２がＴではない；及びＸ１３がＣではない。実施形態では、以下の全てがアプタマーコード配列中に同時に存在することはない：Ｘ１がＡである；Ｘ２がＣである；Ｘ３がＴである；Ｘ５がＧである；Ｘ６がＣである；Ｘ７がＣである；Ｘ８がＴである；Ｘ９がＧである；Ｘ１０がＡである；Ｘ１１がＡである；Ｘ１２がＴである；及びＸ１３がＣである。
一態様では、小分子に結合するアプタマーをコードする配列が提供され、ここで、アプタマーコード配列は、
ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号３）
を含み、ここで、
Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
Ｘ１３は、ＣまたはＴである。
実施形態では、アプタマーコード配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ１２がＴではない；及びＸ１３がＣではない。実施形態では、以下の全てがアプタマーコード配列中に同時に存在することはない：Ｘ１２がＴである、及びＸ１３がＣである。
一態様では、小分子に結合するアプタマーをコードする配列が提供され、ここで、アプタマーコード配列は、
ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＴＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号４）
を含み、ここで、
Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、ＧまたはＴであり、
Ｘ１０は、Ａ、Ｇ、またはＴであり、かつ
Ｘ１１は、ＡまたはＴである。
実施形態では、アプタマーコード配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ１がＡではない；Ｘ８がＴではない；Ｘ９がＧではない；Ｘ１０がＡではない；Ｘ１１がＡではない。実施形態では、以下の全てがアプタマーコード配列中に同時に存在することはない：Ｘ１がＡである；Ｘ８がＴである；Ｘ９がＧである；Ｘ１０がＡである；Ｘ１１がＡである；Ｘ１２がＴである；及びＸ１３がＣである。
一態様では、小分子に結合するアプタマーをコードする配列が提供され、ここで、アプタマーコード配列は、
ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＴＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号５）
を含み、ここで、
Ｘ５は、ＧまたはＴであり、
Ｘ６は、ＣまたはＴであり、かつ
Ｘ７は、ＣまたはＴである。
実施形態では、アプタマーコード配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ５がＧではない；Ｘ６がＣではない；及びＸ７がＣではない。実施形態では、以下の全てがアプタマーコード配列中に同時に存在することはない：Ｘ５がＧである；Ｘ６がＣである；及びＸ７がＣである。
一態様では、小分子に結合するアプタマーをコードする配列が提供され、ここで、アプタマーコード配列は、
ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＸ４ＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０ＡＣＣＴＧＴＴＣＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号６）
を含み、ここで、
Ｘ４は、ＡまたはＧであり、
Ｘ５は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ６は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ７は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、ＣまたはＧであり、かつ
Ｘ１０は、任意のヌクレオチドである。
一態様では、小分子に結合するアプタマーをコードする配列が提供され、ここで、アプタマーコード配列は、配列番号７～３６（表１を参照のこと）からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、アプタマーコード配列は、配列番号８、９、１４～１８、２１、２５、２６、及び３０からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、アプタマーコード配列は、配列番号９、１４、及び２６からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、アプタマーは、式Ｉ～ＶＩＩＩによる構造を有する小分子が含まれる、本明細書に開示される小分子に結合するか、そうでなければその存在に応答する。実施形態では、小分子は、式Ｉ
Figure 2023519266000002
 による構造を有し、式中、
Ｒ１は、ＯＨ、アミノ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホスファート、ピロホスファート、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－フェニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－複素環、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－フェニル、及び－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－複素環からなる群から選択される。
実施形態では、小分子は、式ＩＩ
Figure 2023519266000003
 による構造を有し、式中、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－（ＣＨ２）ｎ－Ｒ６、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ４、－ＣＨＲ５－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｓ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｓ－Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｓ－複素環、及び－Ｓ－ＣＨ２－複素環からなる群から選択されるか、
または、Ｒ２は、化合物が、ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）結合を介して接続されている２つの式ＩＩの分子の二量体を形成するよう－Ｓ－［式ＩＩ］であり、
Ｒ３は、ＯＨ、アミノ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホスファート、ピロホスファート、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－フェニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－複素環、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－フェニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－複素環からなる群から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ６は、ヒドロキシル、アミノ、アミド、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルであり、かつ
ｎは、１～８であり、
ここで、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ビシクリル基、トリシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい。
実施形態では、小分子は、式ＩＩＩ
Figure 2023519266000004
 による構造を有し、式中、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－（ＣＨ２）ｎ－Ｒ６、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ４、－ＣＨＲ５－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｓ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｓ－Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｓ－複素環、及び－Ｓ－ＣＨ２－複素環からなる群から選択され、
Ｒ３１は、ＯＨ及びホスファートからなる群から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ６は、ヒドロキシル、アミノ、アミド、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルであり、かつ
ｎは、１～８であり、
ここで、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ビシクリル基、トリシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい。
実施形態では、小分子は、式ＩＶ
Figure 2023519266000005
 による構造を有し、式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
ここで、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ビシクリル基、トリシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい。
実施形態では、小分子は、式Ｖ
Figure 2023519266000006
 による構造を有し、式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
ここで、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ビシクリル基、トリシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい。
実施形態では、小分子は、式ＶＩ
Figure 2023519266000007
 による構造を有し、式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
ここで、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ビシクリル基、トリシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい。
いくつかの実施形態では、小分子は、式ＶＩＩ
Figure 2023519266000008
 による構造を有し、式中、
各Ｒ７は、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択され、
追加または別法として、２つの隣接するＲ７基が一緒になって５員または６員の芳香族または非芳香族の縮合環を形成してよく、これが、０～２個の環ヘテロ原子を含有し、かつ、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択される最大４つの置換基により置換されており、
ｍは、０、１、２、３または４である。
いくつかの実施形態では、小分子は、式ＶＩＩＩ
Figure 2023519266000009
 による構造を有し、式中、
各Ｒ８は、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択され、
追加または別法として、２つの隣接するＲ８基が一緒になって５員または６員の芳香族または非芳香族の縮合環を形成してよく、これが、０～２個の環ヘテロ原子を含有し、かつ、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択される最大４つの置換基により置換されており、
各Ｒ９は、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択され、
追加または別法として、２つの隣接するＲ９基が一緒になって５員または６員の芳香族または非芳香族の縮合環を形成してよく、これが、０～２個の環ヘテロ原子を含有し、かつ、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択される最大４つの置換基により置換されており、
ｘは、０、１、２または３であり、
ｙは、０、１、２、３、または４である。
いくつかの実施形態では、アプタマーは、アセフルチアミン、アセチアミン、アリチアミン、アンプロリウム、ベクロチアミン、ベンフォチアミン、ベンチアミン、ビスベンチアミン、セトチアミン、シコチアミン、フルスルチアミン、モノホスホチアミン、オクトチアミン、オキシチアミン、プロスルチアミン、スルブチアミン、チアミン、チアミンピロリン酸、及びビンチアモールからなる群から選択される小分子に結合するか、そうでなければその存在に応答する。好ましい実施形態では、アプタマーは、ベンフォチアミン、フルスルチアミン、及びプロスルチアミンからなる群から選択される小分子に結合するか、そうでなければその存在に応答する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ベンフォチアミンに結合するか、そうでなければその存在に応答する。実施形態では、アプタマーは、フルスルチアミンに結合するか、そうでなければその存在に応答する。実施形態では、アプタマーは、プロスルチアミンに結合するか、そうでなければその存在に応答する。
いくつかの実施形態では、アプタマーは、等モル量のフルスルチアミン、ベンフォチアミンまたはプロスルチアミンと比較してチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）に対して低結合性を有する、及び／または低応答性を示す。アプタマーが、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットの一部としてコードされるリボスイッチとの関連にあるいくつかの実施形態では、アプタマーは、等モル量のフルスルチアミン、ベンフォチアミンまたはプロスルチアミンと比較してＴＰＰに対しては低応答性を有する。
また、小分子に応答した、標的遺伝子発現の調節のためのリボスイッチも提供され、ここで、リボスイッチは、本明細書に開示されるアプタマーを含む。一実施形態では、リボスイッチコード配列は、配列番号３７の配列を含む。
また、小分子に応答した、標的遺伝子の発現の調節のためのポリヌクレオチドカセットも提供され、ポリヌクレオチドカセットは、
（ａ）リボスイッチと、
（ｂ）５’イントロン及び３’イントロンが隣接する選択的にスプライスされるエクソンと、を含み、
ここで、リボスイッチは、（ｉ）３’イントロンの５’スプライス部位配列が含まれるステムを含むエフェクター領域、及び（ｉｉ）本明細書に開示されるアプタマーを含み、
選択的にスプライスされるエクソンは、選択的にスプライスされるエクソンがスプライスされて標的遺伝子のｍＲＮＡとなる際に、標的遺伝子と共にインフレームにある終止コドンを含む。
一実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号３７の配列を含み、かつ、アプタマーコード配列をさらに含む、リボスイッチコード配列を含み、ここで、アプタマー配列は、本明細書に開示されるアプタマー配列から選択される。
一実施形態では、本明細書に開示されるアプタマー、リボスイッチ、及び／またはポリヌクレオチドカセットを含む核酸分子が提供される。また、本明細書に開示されるリボスイッチまたはポリヌクレオチドカセットを含有する標的遺伝子を含む核酸分子も提供される。一実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子のタンパク質コード配列中に位置する。一実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子の非翻訳領域内または標的遺伝子のイントロン内に位置する。
また、本明細書に開示される核酸分子のうちのいずれかを含むベクターも提供される。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される。
一態様では、目的の化合物（例えば、式Ｉ～ＶＩＩＩによる化合物等の、チアミンの類似体または誘導体）に応答して標的遺伝子発現を調節するアプタマーを同定するための方法が提供され、かかる方法は、
（ｉ）親アプタマー配列を選択するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で選択されたアプタマーの全部または一部をコードする配列を含むリボスイッチライブラリーを生成するステップであって、アプタマーコード配列が、アプタマーの１つ以上の不対領域において１つ以上のランダムに変異させたヌクレオチドを含み、変異アプタマー配列が、レポーター遺伝子の発現を制御するリボスイッチとの関連にある、リボスイッチライブラリーを生成するステップ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からのライブラリーを、目的化合物への曝露に応答した標的遺伝子発現の調節が親アプタマー配列と比較して増大している（例えば、誘導または抑制の倍率がより高い）アプタマーについてスクリーニングするステップ、
（ｉｖ）ステップ（ｉ）において選択されたアプタマーの代わりにステップ（ｉｉｉ）で同定されたアプタマーでステップ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を任意選択で繰り返すステップ、を含む。
実施形態では、親アプタマー配列は、ＴＴＰアプタマーである（推定ＴＰＰアプタマーまたは既知のＴＰＰアプタマー）。実施形態では、親アプタマー配列は、Ｒｆａｍ ＴＰＰリボスイッチファミリーＲＦ０００５９から選択される。実施形態では、アプタマー配列の１つ以上の不対領域は、接合部（Ｊ）領域である。追加または別法として、不対領域は、ループ（Ｌ）領域であってよい。さらなる実施形態では、１つ以上の不対領域における１つ以上のヌクレオチドがランダムに変異しているアプタマーをコードする配列はまた、対（Ｐ）領域において、例えば、不対領域に隣接する１つ以上の対ヌクレオチドにおいて、１つ以上のヌクレオチドが変異している。
実施形態では、目的化合物は、チアミンの類似体または誘導体である。実施形態では、チアミン類似体は、フルスルチアミン、ベンフォチアミンまたはプロスルチアミンである。一実施形態では、アプタマーは、等モル量のフルスルチアミン、ベンフォチアミンまたはプロスルチアミンと比較してチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）に対して低結合性を有する、及び／または低応答性を示す。実施形態では、目的化合物は、式Ｉ～ＶＩＩＩによる化合物である。実施形態では、目的化合物は、式Ｉ～ＩＩＩによる化合物である。
態様では、本開示は、式Ｉ～ＶＩＩＩの化合物を提供する。実施形態では、本開示は、式Ｉ～ＶＩＩＩの化合物を医薬組成物で提供する。
ｔｈｉＣ ＴＰＰアプタマー及びｔｈｉＭ ＴＰＰアプタマーをそれぞれ含む合成リボスイッチＴＰＰｚまたはＴＰＰｍが、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）またはチアミン類似体での処理に応答してルシフェラーゼ発現を誘導することを示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＰＰｚリボスイッチまたはＴＰＰｍリボスイッチを含有するルシフェラーゼ遺伝子を含有するコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を示されている用量にて、ＴＰＰで処理するか、または未処理で放置した。ルシフェラーゼ活性は、平均任意光単位（ＡＬＵ）±Ｓ．Ｄ．として表され、誘導倍率は、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露された細胞で記録されたルシフェラーゼ活性を、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露されなかった細胞で記録されたルシフェラーゼ活性で割った商として計算された。
ｔｈｉＣ ＴＰＰアプタマー及びｔｈｉＭ ＴＰＰアプタマーをそれぞれ含む合成リボスイッチＴＰＰｚまたはＴＰＰｍが、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）またはチアミン類似体での処理に応答してルシフェラーゼ発現を誘導することを示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＰＰｚリボスイッチまたはＴＰＰｍリボスイッチを含有するルシフェラーゼ遺伝子を含有するコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を示されている用量にて、フルスルチアミンで処理するか、または未処理で放置した。ルシフェラーゼ活性は、平均任意光単位（ＡＬＵ）±Ｓ．Ｄ．として表され、誘導倍率は、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露された細胞で記録されたルシフェラーゼ活性を、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露されなかった細胞で記録されたルシフェラーゼ活性で割った商として計算された。
ｔｈｉＣ ＴＰＰアプタマー及びｔｈｉＭ ＴＰＰアプタマーをそれぞれ含む合成リボスイッチＴＰＰｚまたはＴＰＰｍが、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）またはチアミン類似体での処理に応答してルシフェラーゼ発現を誘導することを示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＰＰｚリボスイッチまたはＴＰＰｍリボスイッチを含有するルシフェラーゼ遺伝子を含有するコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を示されている用量にて、プロスルチアミンで処理するか、または未処理で放置した。ルシフェラーゼ活性は、平均任意光単位（ＡＬＵ）±Ｓ．Ｄ．として表され、誘導倍率は、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露された細胞で記録されたルシフェラーゼ活性を、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露されなかった細胞で記録されたルシフェラーゼ活性で割った商として計算された。
ｔｈｉＣ ＴＰＰアプタマー及びｔｈｉＭ ＴＰＰアプタマーをそれぞれ含む合成リボスイッチＴＰＰｚまたはＴＰＰｍが、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）またはチアミン類似体での処理に応答してルシフェラーゼ発現を誘導することを示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＰＰｚリボスイッチまたはＴＰＰｍリボスイッチを含有するルシフェラーゼ遺伝子を含有するコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を示されている用量にて、ビスベンチアミン、ベクロチアミンまたはスルブチアミンで処理するか、または未処理で放置した。ルシフェラーゼ活性は、平均任意光単位（ＡＬＵ）±Ｓ．Ｄ．として表され、誘導倍率は、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露された細胞で記録されたルシフェラーゼ活性を、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露されなかった細胞で記録されたルシフェラーゼ活性で割った商として計算された。
ＴＰＰアプタマーのファミリー（ＲｆａｍファミリーＲＦ０００５９）から差し引かれた推定アプタマー配列（１４Ｇ４）が、フルスルチアミンに応答してルシフェラーゼ発現を調節することを示す。細胞に、推定ＴＰＰアプタマーである１４Ｇ４（受託番号ＡＡＣＹ０２３６５４０３３．１／Ｒｆａｍ ＲＦ０００５９からの９０３－８００）を含むルシフェラーゼ－リボスイッチコンストラクトをトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞において、トランスフェクトされた細胞を示されている用量にてフルスルチアミンで処理した。誘導倍率は、フルスルチアミンに曝露された細胞で記録されたルシフェラーゼ活性を、フルスルチアミンに曝露されなかった細胞で記録されたルシフェラーゼ活性で割った商として計算された。
ＴＰＰアプタマーのファミリー（ＲｆａｍファミリーＲＦ０００５９）から差し引かれた推定アプタマー配列（１４Ｇ４）が、フルスルチアミンに応答してルシフェラーゼ発現を調節することを示す。細胞に、推定ＴＰＰアプタマーである１４Ｇ４（受託番号ＡＡＣＹ０２３６５４０３３．１／Ｒｆａｍ ＲＦ０００５９からの９０３－８００）を含むルシフェラーゼ－リボスイッチコンストラクトをトランスフェクトした。他の種類のヒト及びマウスの細胞株において、トランスフェクトされた細胞を示されている用量にてフルスルチアミンで処理した。誘導倍率は、フルスルチアミンに曝露された細胞で記録されたルシフェラーゼ活性を、フルスルチアミンに曝露されなかった細胞で記録されたルシフェラーゼ活性で割った商として計算された。
天然のＰ１ステムを有する親アプタマー１４Ｇ４（配列番号３８）の予測される構造を示す。１４Ｇ４アプタマーの予測される構造は、ステムの位置及び不対領域を含めて本明細書に記載のように決定された。各塩基の周りの構造の陰影は、その塩基対合する確率を示し、陰影が濃いほど確率が高い。不対領域の場合、濃い陰影は、不対である確率を示す。
アプタマー１４Ｇ４コード配列（配列番号７）及びそこから派生したライブラリーを示す。アプタマーライブラリーＡ１（配列番号３９）、Ａ２（配列番号４０）、またはＡ３（配列番号４１）を取得するためにランダムに変異させたヌクレオチドはそれぞれ、図３Ｂのアプタマーコード配列において「Ｎ」で示されており、不対であるかまたは不対領域に隣接するヌクレオチドに対応する。
リボスイッチ内に含有されたアプタマーの変異誘発を介した、遺伝子調節活性の改善を示す。ランダムに変異させたアプタマー（アプタマーライブラリーＡ１、Ａ２、またはＡ３から派生）を含むリボスイッチコンストラクトを、ＨＥＫ細胞での遺伝子調節活性の改善についてスクリーニングした。トランスフェクトされたＨＥＫ細胞を、５０μＭのフルスルチアミンで処理するかまたは未処理で放置した。スクリーニングで単離され、リボスイッチ１４Ｇ４と比較して改善された遺伝子調節活性を示す、再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチの例を図４Ａに示す。誘導倍率は、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露された細胞で記録されたルシフェラーゼ活性を、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露されなかった細胞で記録されたルシフェラーゼ活性で割った商として計算された。
リボスイッチ内に含有されたアプタマーの変異誘発を介した、遺伝子調節活性の改善を示す。ランダムに変異させたアプタマー（アプタマーライブラリーＡ１、Ａ２、またはＡ３から派生）を含むリボスイッチコンストラクトを、ＨＥＫ細胞での遺伝子調節活性の改善についてスクリーニングした。トランスフェクトされたＨＥＫ細胞を、５０μＭのフルスルチアミンで処理するかまたは未処理で放置した。再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチが様々種類の細胞において標的遺伝子の用量依存的誘導に有用であることを示す。ＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２試薬を使用して、ＡＭＬ１２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞及びＡＲＰＥ－１９細胞に再設計されたリボスイッチコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、示されている用量にてフルスルチアミンで処理した。誘導倍率は、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露された細胞で記録されたルシフェラーゼ活性を、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露されなかった細胞で記録されたルシフェラーゼ活性で割った商として計算された。
リボスイッチ内に含有されたアプタマーの変異誘発を介した、遺伝子調節活性の改善を示す。ランダムに変異させたアプタマー（アプタマーライブラリーＡ１、Ａ２、またはＡ３から派生）を含むリボスイッチコンストラクトを、ＨＥＫ細胞での遺伝子調節活性の改善についてスクリーニングした。トランスフェクトされたＨＥＫ細胞を、５０μＭのフルスルチアミンで処理するかまたは未処理で放置した。再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチが、異なるＴＰＰ類似体に応答してルシフェラーゼ発現を調節することを示す。ＡＭＬ１２細胞は、再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチをトランスフェクトされ、示されている用量にてフルスルチアミン、ベンフォチアミン、またはプロスルチアミンで処理された。誘導倍率は、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露された細胞で記録されたルシフェラーゼ活性を、ＴＰＰまたはチアミン類似体に曝露されなかった細胞で記録されたルシフェラーゼ活性で割った商として計算された。
１４Ｇ４の変異誘発を介して取得された、３Ｈ４アプタマーコード配列のヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。アプタマーライブラリーＡ４（配列番号４２）を取得するためにランダムに変異させたヌクレオチドは、アプタマーコード配列において「Ｎ」で示されている。
アプタマー／リガンド結合に関与する選択アプタマーヌクレオチドの変異誘発が、哺乳類細胞においてアプタマーベースのリボスイッチの遺伝子調節活性を改善することができることを示す。ＨＥＫ２９３細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞及びＡＭＬ１２細胞に、アプタマーライブラリーＡ４から単離された再設計されたアプタマー配列を含む、リボスイッチコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、示されている用量にてフルスルチアミンで処理するかまたは未処理で放置した。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチが、チアミンと化学構造上の特徴を共有する様々なチアミン誘導体に応答してルシフェラーゼの発現を誘導する能力を示す。ＡＭＬ１２細胞に、示されているリボスイッチコンストラクトをトランスフェクトし、示されている用量にてフルスルチアミン、ベンフォチアミン、またはプロスルチアミンで処理するかまたは未処理で放置した。誘導倍率は、チアミン類似体化合物で処理した細胞から取得したルシフェラーゼ活性を、チアミン類似体で処理していない細胞から取得したルシフェラーゼ活性で割った商として計算された。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチが、リガンドに応答して様々な標的遺伝子の発現を誘導する能力を示す。アプタマー６Ｂ４を含むリボスイッチが、フルスルチアミン処理に応答して高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現を調節することを示す。ＥＧＦＰ－６Ｂ４コンストラクトを含有する、安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、５０μＭにてフルスルチアミンで２４時間処理するかまたは未処理で放置した。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチが、リガンドに応答して様々な標的遺伝子の発現を誘導する能力を示す。アプタマー６Ｂ４を含むリボスイッチが、フルスルチアミン処理に応答して高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現を調節することを示す。ＥＧＦＰ－６Ｂ４コンストラクトを含有する、安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、示されている用量（図７Ｂ）にてフルスルチアミンで２４時間処理した。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチが、リガンドに応答して様々な標的遺伝子の発現を誘導する能力を示す。３Ｈ４または１５Ｄ１０を含むリボスイッチがそれぞれ、フルスルチアミン処理に応答してマウスエリスロポエチン（ｍＥｐｏ）の発現を調節することを示す。ＡＭＬ１２細胞に、Ｅｐｏ－３Ｈ４またはＥｐｏ－１５Ｄ１０コンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、示されている用量にてフルスルチアミンで処理するかまたは未処理で放置した。ｍＥｐｏ ＥＬＩＳＡを使用してｍＥｐｏの発現を検出及び定量し、平均±Ｓ．Ｄ．として表した。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチが、リガンドに応答して様々な標的遺伝子の発現を誘導する能力を示す。３Ｈ４または１５Ｄ１０を含むリボスイッチがそれぞれ、フルスルチアミン処理に応答してマウスエリスロポエチン（ｍＥｐｏ）の発現を調節することを示す。ＡＭＬ１２細胞に、Ｅｐｏ－３Ｈ４またはＥｐｏ－１５Ｄ１０コンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、示されている用量にてフルスルチアミンで処理するかまたは未処理で放置した。誘導倍率は、フルスルチアミンで処理した細胞から産生されたｍＥｐｏの量を、フルスルチアミンで処理していない細胞から産生されたｍＥｐｏの量で割った商として計算された。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチによるインビボでのルシフェラーゼの誘導発現を示す。（１）アプタマーを含まない調節不可能リボスイッチ（「対照１」）、（２）アプタマー３Ｈ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ３Ｈ４」もしくは「３Ｈ４」）、または（３）アプタマー６Ｂ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ６Ｂ４」もしくは「６Ｂ４」）を有する、イントロン－選択的エクソン－イントロンのカセットを含有する、アデノ随伴ＡＡＶ２／８ウイルス粒子を作製した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（各群ｎ＝５匹）に、マウス１匹あたり１．０×１０１１のウイルス粒子を単回尾静脈注射により注射した。ＡＡＶ送達の２８日後、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのプロスルチアミンを腹腔内に注射した。ルシフェラーゼ活性を、薬物投与の前日、ならびに薬物投与の６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に測定した。プロスルチアミンの初回投与後、マウスに以下のとおり追加の３回の投与及び撮像サイクルを行った：３６日目（ＡＡＶ投与後）：１００ｍｇ／ｋｇ；４３日目：２００ｍｇ／ｋｇ；及び５１日目：４００ｍｇ／ｋｇ。再設計されたリボスイッチ３Ｈ４または６Ｂ４を持つルシフェラーゼ遺伝子を含むＡＡＶベクターをトランスフェクトされたマウスの、示されている時点及びプロスルチアミンの用量でのルシフェラーゼ発現を示す。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチによるインビボでのルシフェラーゼの誘導発現を示す。（１）アプタマーを含まない調節不可能リボスイッチ（「対照１」）、（２）アプタマー３Ｈ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ３Ｈ４」もしくは「３Ｈ４」）、または（３）アプタマー６Ｂ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ６Ｂ４」もしくは「６Ｂ４」）を有する、イントロン－選択的エクソン－イントロンのカセットを含有する、アデノ随伴ＡＡＶ２／８ウイルス粒子を作製した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（各群ｎ＝５匹）に、マウス１匹あたり１．０×１０１１のウイルス粒子を単回尾静脈注射により注射した。ＡＡＶ送達の２８日後、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのプロスルチアミンを腹腔内に注射した。ルシフェラーゼ活性を、薬物投与の前日、ならびに薬物投与の６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に測定した。プロスルチアミンの初回投与後、マウスに以下のとおり追加の３回の投与及び撮像サイクルを行った：３６日目（ＡＡＶ投与後）：１００ｍｇ／ｋｇ；４３日目：２００ｍｇ／ｋｇ；及び５１日目：４００ｍｇ／ｋｇ。薬物投与の前日、ならびに投与の６時間後、２４時間後、４８時間後及び７２時間後に異なる群で観察されたルシフェラーゼの蛍光強度を示す。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチによるインビボでのルシフェラーゼの誘導発現を示す。（１）アプタマーを含まない調節不可能リボスイッチ（「対照１」）、（２）アプタマー３Ｈ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ３Ｈ４」もしくは「３Ｈ４」）、または（３）アプタマー６Ｂ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ６Ｂ４」もしくは「６Ｂ４」）を有する、イントロン－選択的エクソン－イントロンのカセットを含有する、アデノ随伴ＡＡＶ２／８ウイルス粒子を作製した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（各群ｎ＝５匹）に、マウス１匹あたり１．０×１０１１のウイルス粒子を単回尾静脈注射により注射した。ＡＡＶ送達の２８日後、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのプロスルチアミンを腹腔内に注射した。ルシフェラーゼ活性を、薬物投与の前日、ならびに薬物投与の６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に測定した。プロスルチアミンの初回投与後、マウスに以下のとおり追加の３回の投与及び撮像サイクルを行った：３６日目（ＡＡＶ投与後）：１００ｍｇ／ｋｇ；４３日目：２００ｍｇ／ｋｇ；及び５１日目：４００ｍｇ／ｋｇ。薬物投与の前日、ならびに投与の６時間後、２４時間後、４８時間後及び７２時間後に異なる群で観察されたルシフェラーゼの蛍光強度を示す。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチによるインビボでのルシフェラーゼの誘導発現を示す。（１）アプタマーを含まない調節不可能リボスイッチ（「対照１」）、（２）アプタマー３Ｈ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ３Ｈ４」もしくは「３Ｈ４」）、または（３）アプタマー６Ｂ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ６Ｂ４」もしくは「６Ｂ４」）を有する、イントロン－選択的エクソン－イントロンのカセットを含有する、アデノ随伴ＡＡＶ２／８ウイルス粒子を作製した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（各群ｎ＝５匹）に、マウス１匹あたり１．０×１０１１のウイルス粒子を単回尾静脈注射により注射した。ＡＡＶ送達の２８日後、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのプロスルチアミンを腹腔内に注射した。ルシフェラーゼ活性を、薬物投与の前日、ならびに薬物投与の６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に測定した。プロスルチアミンの初回投与後、マウスに以下のとおり追加の３回の投与及び撮像サイクルを行った：３６日目（ＡＡＶ投与後）：１００ｍｇ／ｋｇ；４３日目：２００ｍｇ／ｋｇ；及び５１日目：４００ｍｇ／ｋｇ。薬物投与の前日、ならびに投与の６時間後、２４時間後、４８時間後及び７２時間後に異なる群で観察されたルシフェラーゼの蛍光強度を示す。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチによるインビボでのルシフェラーゼの誘導発現を示す。（１）アプタマーを含まない調節不可能リボスイッチ（「対照１」）、（２）アプタマー３Ｈ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ３Ｈ４」もしくは「３Ｈ４」）、または（３）アプタマー６Ｂ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ６Ｂ４」もしくは「６Ｂ４」）を有する、イントロン－選択的エクソン－イントロンのカセットを含有する、アデノ随伴ＡＡＶ２／８ウイルス粒子を作製した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（各群ｎ＝５匹）に、マウス１匹あたり２．５×１０１１のウイルス粒子を単回尾静脈注射により注射した。ＡＡＶ送達の２８日後、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのプロスルチアミンを腹腔内に注射した。ルシフェラーゼ活性を、薬物投与の前日、ならびに薬物投与の６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に測定した。プロスルチアミンの初回投与後、マウスに以下のとおり追加の３回の投与及び撮像サイクルを行った：３６日目（ＡＡＶ投与後）：１００ｍｇ／ｋｇ；４３日目：２００ｍｇ／ｋｇ；及び５１日目：４００ｍｇ／ｋｇ。薬物投与の前日、ならびに投与の６時間後、２４時間後、４８時間後及び７２時間後に異なる群で観察されたルシフェラーゼの蛍光強度を示す。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチによるインビボでのルシフェラーゼの誘導発現を示す。（１）アプタマーを含まない調節不可能リボスイッチ（「対照１」）、（２）アプタマー３Ｈ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ３Ｈ４」もしくは「３Ｈ４」）、または（３）アプタマー６Ｂ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ６Ｂ４」もしくは「６Ｂ４」）を有する、イントロン－選択的エクソン－イントロンのカセットを含有する、アデノ随伴ＡＡＶ２／８ウイルス粒子を作製した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（各群ｎ＝５匹）に、マウス１匹あたり２．５×１０１１のウイルス粒子を単回尾静脈注射により注射した。ＡＡＶ送達の２８日後、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのプロスルチアミンを腹腔内に注射した。ルシフェラーゼ活性を、薬物投与の前日、ならびに薬物投与の６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に測定した。プロスルチアミンの初回投与後、マウスに以下のとおり追加の３回の投与及び撮像サイクルを行った：３６日目（ＡＡＶ投与後）：１００ｍｇ／ｋｇ；４３日目：２００ｍｇ／ｋｇ；及び５１日目：４００ｍｇ／ｋｇ。薬物投与の前日、ならびに投与の６時間後、２４時間後、４８時間後及び７２時間後に異なる群で観察されたルシフェラーゼの蛍光強度を示す。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチによるインビボでのルシフェラーゼの誘導発現を示す。（１）アプタマーを含まない調節不可能リボスイッチ（「対照１」）、（２）アプタマー３Ｈ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ３Ｈ４」もしくは「３Ｈ４」）、または（３）アプタマー６Ｂ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ６Ｂ４」もしくは「６Ｂ４」）を有する、イントロン－選択的エクソン－イントロンのカセットを含有する、アデノ随伴ＡＡＶ２／８ウイルス粒子を作製した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（各群ｎ＝５匹）に、マウス１匹あたり２．５×１０１１のウイルス粒子を単回尾静脈注射により注射した。ＡＡＶ送達の２８日後、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのプロスルチアミンを腹腔内に注射した。ルシフェラーゼ活性を、薬物投与の前日、ならびに薬物投与の６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に測定した。プロスルチアミンの初回投与後、マウスに以下のとおり追加の３回の投与及び撮像サイクルを行った：３６日目（ＡＡＶ投与後）：１００ｍｇ／ｋｇ；４３日目：２００ｍｇ／ｋｇ；及び５１日目：４００ｍｇ／ｋｇ。薬物投与の前日、ならびに投与の６時間後、２４時間後、４８時間後及び７２時間後に異なる群で観察されたルシフェラーゼの蛍光強度を示す。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチによるインビボでのルシフェラーゼの誘導発現を示す。（１）アプタマーを含まない調節不可能リボスイッチ（「対照１」）、（２）アプタマー３Ｈ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ３Ｈ４」もしくは「３Ｈ４」）、または（３）アプタマー６Ｂ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ６Ｂ４」もしくは「６Ｂ４」）を有する、イントロン－選択的エクソン－イントロンのカセットを含有する、アデノ随伴ＡＡＶ２／８ウイルス粒子を作製した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（各群ｎ＝５匹）に、マウス１匹あたり１．０×１０１１のウイルス粒子を単回尾静脈注射により注射した。ＡＡＶ送達の２８日後、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのプロスルチアミンを腹腔内に注射した。ルシフェラーゼ活性を、薬物投与の前日、ならびに薬物投与の６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に測定した。プロスルチアミンの初回投与後、マウスに以下のとおり追加の３回の投与及び撮像サイクルを行った：３６日目（ＡＡＶ投与後）：１００ｍｇ／ｋｇ；４３日目：２００ｍｇ／ｋｇ；及び５１日目：４００ｍｇ／ｋｇ。異なる薬物用量及び群について、薬物投与後のプロスルチアミン処置時のルシフェラーゼ発現の相対的増加を示す。ルシフェラーゼ発現の誘導倍率は、プロスルチアミンで処置したマウスから得た光子／秒を、プロスルチアミン処置の１日前にマウスから得た値で割った商として計算された。
再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチによるインビボでのルシフェラーゼの誘導発現を示す。（１）アプタマーを含まない調節不可能リボスイッチ（「対照１」）、（２）アプタマー３Ｈ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ３Ｈ４」もしくは「３Ｈ４」）、または（３）アプタマー６Ｂ４を含むリボスイッチカセット（「スイッチ６Ｂ４」もしくは「６Ｂ４」）を有する、イントロン－選択的エクソン－イントロンのカセットを含有する、アデノ随伴ＡＡＶ２／８ウイルス粒子を作製した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（各群ｎ＝５匹）に、マウス１匹あたり２．５×１０１１のウイルス粒子を単回尾静脈注射により注射した。ＡＡＶ送達の２８日後、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのプロスルチアミンを腹腔内に注射した。ルシフェラーゼ活性を、薬物投与の前日、ならびに薬物投与の６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に測定した。プロスルチアミンの初回投与後、マウスに以下のとおり追加の３回の投与及び撮像サイクルを行った：３６日目（ＡＡＶ投与後）：１００ｍｇ／ｋｇ；４３日目：２００ｍｇ／ｋｇ；及び５１日目：４００ｍｇ／ｋｇ。異なる薬物用量及び群について、薬物投与後のプロスルチアミン処置時のルシフェラーゼ発現の相対的増加を示す。ルシフェラーゼ発現の誘導倍率は、プロスルチアミンで処置したマウスから得た光子／秒を、プロスルチアミン処置の１日前にマウスから得た値で割った商として計算された。
追加の式ＩＶ、Ｖ、及びＶＩのチアミン類似体と比較してフルスルチアミンまたはベンフォチアミンに対して応答した、ルシフェラーゼ標的遺伝子発現の誘導を示す。ルシフェラーゼ標的遺伝子は、１５Ｄ１０アプタマーを含むリボスイッチをコードする配列を含有していた。群ＩＶの化合物を、それらがＨＥＫ２９３細胞でルシフェラーゼ発現を誘導する能力について試験した。
追加の式ＩＶ、Ｖ、及びＶＩのチアミン類似体と比較してフルスルチアミンまたはベンフォチアミンに対して応答した、ルシフェラーゼ標的遺伝子発現の誘導を示す。ルシフェラーゼ標的遺伝子は、１５Ｄ１０アプタマーを含むリボスイッチをコードする配列を含有していた。群ＩＶの化合物を、それらがＡＭＬ１２細胞でルシフェラーゼ発現を誘導する能力について試験した。
追加の式ＩＶ、Ｖ、及びＶＩのチアミン類似体と比較してフルスルチアミンまたはベンフォチアミンに対して応答した、ルシフェラーゼ標的遺伝子発現の誘導を示す。ルシフェラーゼ標的遺伝子は、１５Ｄ１０アプタマーを含むリボスイッチをコードする配列を含有していた。群Ｖ及び群ＶＩの化合物を、それらがＨＥＫ２９３細胞でルシフェラーゼ発現を誘導する能力について試験した。
追加の式ＩＶ、Ｖ、及びＶＩのチアミン類似体と比較してフルスルチアミンまたはベンフォチアミンに対して応答した、ルシフェラーゼ標的遺伝子発現の誘導を示す。ルシフェラーゼ標的遺伝子は、１５Ｄ１０アプタマーを含むリボスイッチをコードする配列を含有していた。群Ｖ及び群ＶＩの化合物を、それらがＡＭＬ１２細胞でルシフェラーゼ発現を誘導する能力について試験した。
追加の式ＩＶ、Ｖ、及びＶＩのチアミン類似体と比較してフルスルチアミンまたはベンフォチアミンに対して応答した、ルシフェラーゼ標的遺伝子発現の誘導を示す。ルシフェラーゼ標的遺伝子は、１５Ｄ１０アプタマーを含むリボスイッチをコードする配列を含有していた。最も強力な化合物を、それらがＡＲＰＥ－１９細胞でルシフェラーゼ発現を誘導する能力についてさらに試験した。
追加の式ＩＶ、Ｖ、及びＶＩのチアミン類似体と比較してフルスルチアミンまたはベンフォチアミンに対して応答した、ルシフェラーゼ標的遺伝子発現の誘導を示す。ルシフェラーゼ標的遺伝子は、１５Ｄ１０アプタマーを含むリボスイッチをコードする配列を含有していた。最も強力な化合物を、それらがＨｅｐ Ｇ２細胞でルシフェラーゼ発現を誘導する能力についてさらに試験した。
本明細書では、チアミンまたはＴＰＰ、及びチアミンまたはＴＰＰの類似体もしくは誘導体等の小分子に結合するか、そうでなければその存在に応答するアプタマー配列を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるアプタマー配列は、チアミンまたはＴＰＰの類似体もしくは誘導体に応答した、標的遺伝子の発現の調節に有用である。また、本明細書に開示されるアプタマー配列を含むリボスイッチ、及び標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットも企図され、ポリヌクレオチドカセットは、本明細書に開示されるリボスイッチをコードする配列を含む。また、本明細書では、治療遺伝子等の標的遺伝子の調節のため、及びそれを必要とする対象の治療のために、アプタマー、リボスイッチ、及び／またはポリヌクレオチドカセットを使用する方法も提供される。
アプタマー
アプタマーは、三次元構造に折り畳まれることにより、高い親和性及び特異性で特定のリガンドに非共有結合で結合する一本鎖核酸分子である。アプタマーリガンドには、イオン、小分子、タンパク質、ウイルス、及び細胞が含まれる。アプタマーリガンドは、例えば、有機化合物、アミノ酸、ステロイド、炭水化物、またはヌクレオチドであり得る。小分子アプタマーリガンドの非限定的な例としては、抗生物質、治療薬、色素、補因子、代謝物、分子マーカー、神経伝達物質、汚染物質、毒素、食品偽和剤、発がん性物質、乱用薬物が挙げられる。したがって、アプタマーは、小分子の検出に有用である。アプタマーによる低分子検出の用途としては、環境モニタリング、食品安全、医学（診断を含む）、微生物学、分析化学、法科学、農業、及び基礎生物学研究が挙げられる。
本明細書で使用する用語「アプタマー」とは、あるクラスのリガンドに特異的に結合するＲＮＡポリヌクレオチド（またはそのＲＮＡポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列）を指す。用語「リガンド」とは、アプタマーが特異的に結合する分子を指す。アプタマーは、意図される標的分子（すなわち、リガンド）と複合体を形成する能力がある結合領域を有する。アプタマーは典型的には、長さが約１５～約２００ヌクレオチドである。より一般的には、アプタマーは、長さが約３０～約１００ヌクレオチド、例えば、長さが７０～９０ヌクレオチドである。アプタマーは典型的には、アプタマーがステムを形成する複数の対（Ｐ）領域、及びアプタマーが連結（Ｊ）領域またはループ（Ｌ）領域を形成する不対領域を含む。対領域には、５’末端（Ｐ１）から出発して順に番号付けし、各ステムに順に番号付けしていくことができる（Ｐ２、Ｐ３等）。ループ（Ｌ１、Ｌ２等）には、隣接する対領域に基づいて番号付けされ、連結領域は、それらが連結する対領域に従って番号付けされる。
一実施形態では、アプタマーコード配列は、
ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＸ２ＴＸ３ＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＸ４ＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号１）
を含み、ここで、
Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
Ｘ２は、Ｃであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ３は、Ｔであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ４は、ＡまたはＧであり、
Ｘ５は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ６は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ７は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、Ｃ、Ｇ、またはＴであり、
Ｘ１０は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ１１は、ＡまたはＴであり、
Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
Ｘ１３は、ＣまたはＴである。
実施形態では、アプタマーコード配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ１がＡではない；Ｘ２がＣではない；Ｘ３がＴではない；Ｘ４がＧではない；Ｘ５がＧではない；Ｘ６がＣではない；Ｘ７がＣではない；Ｘ８がＴではない；Ｘ９がＧではない；Ｘ１０がＡではない；Ｘ１１がＡではない；Ｘ１２がＴではない；及びＸ１３がＣではない。実施形態では、以下の全てがアプタマーコード配列中に同時に存在することはない：Ｘ１がＡである；Ｘ２がＣである；Ｘ３がＴである；Ｘ５がＧである；Ｘ６がＣである；Ｘ７がＣである；Ｘ８がＴである；Ｘ９がＧである；Ｘ１０がＡである；Ｘ１１がＡである；Ｘ１２がＴである；及びＸ１３がＣである。
一実施形態では、アプタマーコード配列は、
ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＸ２ＴＸ３ＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号２）
を含み、ここで、
Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
Ｘ２は、Ｃであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ３は、Ｔであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ５は、ＧまたはＴであり、
Ｘ６は、ＣまたはＴであり、
Ｘ７は、ＣまたはＴであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、ＧまたはＴであり、
Ｘ１０は、Ａ、Ｇ、またはＴであり、
Ｘ１１は、ＡまたはＴであり、
Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
Ｘ１３は、ＣまたはＴである。
実施形態では、アプタマーコード配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ１がＡではない；Ｘ２がＣではない；Ｘ３がＴではない；Ｘ４がＧではない；Ｘ５がＧではない；Ｘ６がＣではない；Ｘ７がＣではない；Ｘ８がＴではない；Ｘ９がＧではない；Ｘ１０がＡではない；Ｘ１１がＡではない；Ｘ１２がＴではない；及びＸ１３がＣではない。実施形態では、以下の全てがアプタマー配列中に同時に存在することはない：Ｘ１がＡである；Ｘ２がＣである；Ｘ３がＴである；Ｘ５がＧである；Ｘ６がＣである；Ｘ７がＣである；Ｘ８がＴである；Ｘ９がＧである；Ｘ１０がＡである；Ｘ１１がＡである；Ｘ１２がＴである；及びＸ１３がＣである。
一実施形態では、アプタマーコード配列は、ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号３）を含み、
ここで、
Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
Ｘ１３は、ＣまたはＴである。
実施形態では、アプタマーコード配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ１２がＴではない；及びＸ１３がＣではない。実施形態では、以下の全てがアプタマー配列中に同時に存在することはない：Ｘ１２がＴである、及びＸ１３がＣである。
一実施形態では、アプタマーコード配列は、ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＴＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号４）を含み、
ここで、
Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、ＧまたはＴであり、
Ｘ１０は、Ａ、Ｇ、またはＴであり、かつ
Ｘ１１は、ＡまたはＴである。
実施形態では、アプタマーコード配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ１がＡではない；Ｘ８がＴではない；Ｘ９がＧではない；Ｘ１０がＡではない；Ｘ１１がＡではない。実施形態では、以下の全てがアプタマー配列中に同時に存在することはない：Ｘ１がＡである；Ｘ８がＴである；Ｘ９がＧである；Ｘ１０がＡである；Ｘ１１がＡである；Ｘ１２がＴである；及びＸ１３がＣである。
一実施形態では、アプタマーコード配列は、
ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＴＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号５）
を含み、ここで、
Ｘ５は、ＧまたはＴであり、
Ｘ６は、ＣまたはＴであり、かつ
Ｘ７は、ＣまたはＴである。
実施形態では、アプタマーコード配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ５がＧではない；Ｘ６がＣではない；及びＸ７がＣではない。実施形態では、以下の全てがアプタマー配列中に同時に存在することはない：Ｘ５がＧである；Ｘ６がＣである；及びＸ７がＣである。
一実施形態では、アプタマーコード配列は、ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＸ４ＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０ＡＣＣＴＧＴＴＣＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号６）を含み、
ここで、
Ｘ４は、ＡまたはＧであり、
Ｘ５は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ６は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ７は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、ＣまたはＧであり、かつ
Ｘ１０は、任意のヌクレオチドである。
一実施形態では、アプタマーコード配列は、配列番号７～３６（表１を参照のこと）からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、アプタマーコード配列は、配列番号７～３６からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。参照ポリペプチドまたは核酸配列に関して「配列同一性パーセント」は、配列を整列させ、配列同一性パーセントが最大となるよう、必要に応じてギャップを導入した後、参照ポリペプチドまたは核酸の配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である、候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。アミノ酸または核酸の配列同一性パーセントを決定することを目的としたアラインメントは、当業者に既知の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアプログラムを使用して達成することができる。
Figure 2023519266000010
Figure 2023519266000011
Figure 2023519266000012
当業者であれば、本明細書に記載されるアプタマーがリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得ることを理解するであろう。実施形態では、本明細書に記載されるアプタマーは、例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡが含まれる、より長いＲＮＡポリヌクレオチドの一部である。
一態様では、配列
ＡＣＸ１ＧＧＧＧＵＣＣＧＧＣＸ２ＵＸ３ＵＵＣＡＵＵＵＧＧＣＸ４ＣＣＧＧＵＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＵＵＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＵＧＵＵＸ１２ＡＣＧＧＡＵＡＡＵＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＵ（配列番号４３）、
を含むアプタマーが提供され、ここで、
Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
Ｘ２は、Ｃであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ３は、Ｕであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ４は、ＡまたはＧであり、
Ｘ５は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ６は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ７は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、Ｃ、Ｇ、またはＵであり、
Ｘ１０は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ１１は、ＡまたはＵであり、
Ｘ１２は、ＣまたはＵであり、かつ
Ｘ１３は、ＣまたはＵである。
実施形態では、アプタマー配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ１がＡではない；Ｘ２がＣではない；Ｘ３がＵではない；Ｘ４がＧではない；Ｘ５がＧではない；Ｘ６がＣではない；Ｘ７がＣではない；Ｘ８がＵではない；Ｘ９がＧではない；Ｘ１０がＡではない；Ｘ１１がＡではない；Ｘ１２がＵではない；及びＸ１３がＣではない。
実施形態では、以下の全てがアプタマー配列中に同時に存在することはない：Ｘ１がＡである；Ｘ２がＣである；Ｘ３がＵである；Ｘ４がＧである；Ｘ５がＧである；Ｘ６がＣである；Ｘ７がＣである；Ｘ８がＵである；Ｘ９がＧである；Ｘ１０がＡである；Ｘ１１がＡである；Ｘ１２がＵである；及びＸ１３がＣである。
一態様では、配列
ＡＣＸ１ＧＧＧＧＵＣＣＧＧＣＸ２ＵＸ３ＵＵＣＡＵＵＵＧＧＣＧＣＣＧＧＵＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＵＵＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＵＧＵＵＸ１２ＡＣＧＧＡＵＡＡＵＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＵ（配列番号４４）、
を含むアプタマーが提供され、ここで、
Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
Ｘ２は、Ｃであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ３は、Ｕであるかまたはヌクレオチドがなく、
Ｘ５は、ＧまたはＵであり、
Ｘ６は、ＣまたはＵであり、
Ｘ７は、ＣまたはＵであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、ＧまたはＵであり、
Ｘ１０は、Ａ、Ｇ、またはＵであり、
Ｘ１１は、ＡまたはＵであり、
Ｘ１２は、ＣまたはＵであり、かつ
Ｘ１３は、ＣまたはＵである。
実施形態では、アプタマー配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ１がＡではない；Ｘ２がＣではない；Ｘ３がＵではない；Ｘ４がＧではない；Ｘ５がＧではない；Ｘ６がＣではない；Ｘ７がＣではない；Ｘ８がＵではない；Ｘ９がＧではない；Ｘ１０がＡではない；Ｘ１１がＡではない；Ｘ１２がＵではない；及びＸ１３がＣではない。実施形態では、以下の全てがアプタマー配列中に同時に存在することはない：Ｘ１がＡである；Ｘ２がＣである；Ｘ３がＵである；Ｘ５がＧである；Ｘ６がＣである；Ｘ７がＣである；Ｘ８がＵである；Ｘ９がＧである；Ｘ１０がＡである；Ｘ１１がＡである；Ｘ１２がＵである；及びＸ１３がＣである。
一態様では、配列
ＡＣＡＧＧＧＧＵＣＣＧＧＣＣＵＵＵＵＣＡＵＵＵＧＧＣＧＣＣＧＧＵＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＣＵＵＵＧＡＡＣＣＵＧＵＵＸ１２ＡＣＧＧＡＵＡＡＵＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＵ（配列番号４５）、
を含むアプタマーが提供され、ここで、
Ｘ１２は、ＣまたはＵであり、かつ
Ｘ１３は、ＣまたはＵである。
実施形態では、アプタマー配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ１２がＵではない；及びＸ１３がＣではない。実施形態では、以下のうちのいずれもアプタマー配列中に同時に存在することはない：Ｘ１２がＵである、及びＸ１３がＣである。
一態様では、配列
ＡＣＸ１ＧＧＧＧＵＣＣＧＧＣＣＵＵＵＵＣＡＵＵＵＧＧＣＧＣＣＧＧＵＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＣＵＵＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＵＧＵＵＵＡＣＧＧＡＵＡＡＵＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＵ（配列番号４６）、
を含むアプタマーが提供され、ここで、
Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、ＧまたはＵであり、
Ｘ１０は、Ａ、Ｇ、またはＵであり、かつ
Ｘ１１は、ＡまたはＵである。
実施形態では、アプタマー配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ１がＡではない；Ｘ８がＵではない；Ｘ９がＧではない；Ｘ１０がＡではない；及びＸ１１がＡではない。実施形態では、以下の全てがアプタマー配列中に同時に存在することはない：Ｘ１がＡである；Ｘ８がＵである；Ｘ９がＧである；Ｘ１０がＡである；Ｘ１１がＡである；Ｘ１２がＵである；及びＸ１３がＣである。
一態様では、配列
ＡＣＡＧＧＧＧＵＣＣＧＧＣＣＵＵＵＵＣＡＵＵＵＧＧＣＧＣＣＧＧＵＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＵＵＵＧＡＡＣＣＵＧＵＵＵＡＣＧＧＡＵＡＡＵＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＵ（配列番号４７）、
を含むアプタマーが提供され、ここで、
Ｘ５は、ＧまたはＵであり、
Ｘ６は、ＣまたはＵであり、かつ
Ｘ７は、ＣまたはＵである。
実施形態では、アプタマー配列は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：Ｘ５がＧではない；Ｘ６がＣではない；及びＸ７がＣではない。実施形態では、以下の全てがアプタマー配列中に同時に存在することはない：Ｘ５がＧである；Ｘ６がＣである；及びＸ７がＣである。
一態様では、配列
ＡＣＡＧＧＧＧＵＣＣＧＧＣＣＵＵＵＵＣＡＵＵＵＧＧＣＸ４ＣＣＧＧＵＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＵＵＸ８Ｘ９Ｘ１０ＡＣＣＵＧＵＵＣＡＣＧＧＡＵＡＡＵＧＣＣＧＣＵＧＣＡＧＧＧＡＧＵ（配列番号４８）、
を含むアプタマーが提供され、ここで、
Ｘ４は、ＡまたはＧであり、
Ｘ５は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ６は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ７は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
Ｘ９は、ＣまたはＧであり、かつ
Ｘ１０は、任意のヌクレオチドである。
一態様では、小分子に結合するアプタマーが提供され、ここで、アプタマーは、配列番号４９～７８からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、アプタマー配列は、配列番号４９～７８からなる群から選択される配列を含む。実施形態では、アプタマー配列は、配列番号５１、５６、及び６８からなる群から選択される配列を含む。
アプタマーリガンド
一実施形態では、アプタマーリガンドは、チアミン（ビタミンＢ１）である、あるいはチアミン類似体である、及び／またはチアミンの誘導体である。本明細書で使用される場合、用語「チアミン類似体」とは、チアミンと比較して同様の物理的、化学的、生化学的、または薬理学的な特性を有する分子を指し、例えば、アンプロリウムまたはシコチアミンが挙げられる。チアミン類似体は、チアミン誘導体であってよい。本明細書で使用される場合、用語「チアミン誘導体」とは、修飾または置換によって、チアミンから誘導される、またはそのチアゾール環が開環形態である化合物を指す。チアミン誘導体として、例えば、アセフルチアミン、アセチアミン、アリチアミン、ベクロチアミン、ベンフォチアミン、ベンチアミン、ビスベンチアミン、セトチアミン、フルスルチアミン、モノホスホチアミン、オクトチアミン、プロスルチアミン、スルブチアミン、チアミン、チアミンピロリン酸、またはビンチアモールが挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、アプタマーは、式Ｉ～ＶＩＩＩによる構造を有する小分子が含まれる、本明細書に開示される小分子に結合するか、そうでなければその存在または付加に応答する。実施形態では、小分子は、式Ｉ
Figure 2023519266000013
 による構造を有し、式中、
Ｒ１は、ＯＨ、アミノ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホスファート、ピロホスファート、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－フェニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－複素環、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－フェニル、及び－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－複素環からなる群から選択される。
実施形態では、小分子は、式ＩＩ
Figure 2023519266000014
 による構造を有し、式中、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－（ＣＨ２）ｎ－Ｒ６、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ４、－ＣＨＲ５－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｓ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｓ－Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｓ－複素環、及び－Ｓ－ＣＨ２－複素環からなる群から選択されるか、
または、Ｒ２は、化合物が、ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）結合を介して接続されている２つの式ＩＩの分子の二量体を形成するよう－Ｓ－［式ＩＩ］であり、
Ｒ３は、ＯＨ、アミノ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホスファート、ピロホスファート、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－フェニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－複素環、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－フェニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－複素環からなる群から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ６は、ヒドロキシル、アミノ、アミド、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルであり、かつ
ｎは、１～８であり、
ここで、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ビシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい。
実施形態では、小分子は、式ＩＩＩ
Figure 2023519266000015
 による構造を有し、式中、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－（ＣＨ２）ｎ－Ｒ６、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ４、－ＣＨＲ５－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｓ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｓ－Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｓ－複素環、及び－Ｓ－ＣＨ２－複素環からなる群から選択され、
Ｒ３１は、ＯＨ及びホスファートからなる群から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ６は、ヒドロキシル、アミノ、アミド、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルであり、かつ
ｎは、１～８であり、
ここで、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ビシクリル基、トリシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい。
実施形態では、小分子は、式ＩＶ
Figure 2023519266000016
 による構造を有し、式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
ここで、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ビシクリル基、トリシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい。
実施形態では、小分子は、式Ｖ
Figure 2023519266000017
 による構造を有し、式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
ここで、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ビシクリル基、トリシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい。
実施形態では、小分子は、式ＶＩ
Figure 2023519266000018
 による構造を有し、式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
ここで、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ビシクリル基、トリシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい。
実施形態では、小分子は、式ＶＩＩ
Figure 2023519266000019
 による構造を有し、式中、
各Ｒ７は、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択され、
追加または別法として、２つの隣接するＲ７基が一緒になって５員または６員の芳香族または非芳香族の縮合環を形成してよく、これが、０～２個の環ヘテロ原子を含有し、かつ、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択される最大４つの置換基により置換されており、
ｍは、０、１、２、３または４である。
いくつかの実施形態では、小分子は、式ＶＩＩＩ
Figure 2023519266000020
 による構造を有し、式中、
各Ｒ８は、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択され、
追加または別法として、２つの隣接するＲ８基が一緒になって５員または６員の芳香族または非芳香族の縮合環を形成してよく、これが、０～２個の環ヘテロ原子を含有し、かつ、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択される最大４つの置換基により置換されており、
各Ｒ９は、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択され、
追加または別法として、２つの隣接するＲ９基が一緒になって５員または６員の芳香族または非芳香族の縮合環を形成してよく、これが、０～２個の環ヘテロ原子を含有し、かつ、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択される最大４つの置換基により置換されており、
ｘは、０、１、２または３であり、
ｙは、０、１、２、３、または４である。
用語「アルキル」とは、飽和脂肪族基のラジカルを指し、直鎖アルキル基及び分岐鎖アルキル基が含まれる。好ましい実施形態では、直鎖または分岐鎖のアルキルは、その骨格に６個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖ではＣ１－Ｃ６、分岐鎖ではＣ３－Ｃ６）。アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
用語「シクロアルキル」とは、環に３～６個の炭素を有する飽和炭素環基を指す。シクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルが挙げられる。
用語「ビシクリル」とは、２つの連結環系を有する飽和炭素環基を指し、縮合または架橋していてよい。二環式基としては、ビシクル［２．１．１］ヘキサン、ビシクル［２．２．１］ヘプタン、デカリン等が挙げられる。用語「トリシクリル」とは、３つの連結環系を有する飽和炭素環基を指し、縮合及び／または架橋していてよい。三環式基としては、アダマンタン等が挙げられる。
用語「アルケニル」とは、不飽和脂肪族基を指し、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する、直鎖アルケニル基及び分岐鎖アルケニル基が含まれる。好ましい実施形態では、アルケニル基は、２～６個の炭素原子を有する（例えば、Ｃ２－Ｃ６アルケニル）。
本明細書で使用される場合、用語「ハロゲン」または「ハロ」により、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒまたは－Ｉ、及び好ましくは－Ｆ、－Ｃｌまたは－Ｂｒが指定される。
本明細書で使用される場合、用語「アルコキシル」または「アルコキシ」とは、酸素原子を介して結合している、上記で定義されているようなアルキル基を指す。代表的アルコキシル基としては、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ等が挙げられる。
用語「アミン」及び「アミノ」とは、非置換及び置換の両方のアミン、例えば、以下の一般式で表すことができる部分を指し、
Figure 2023519266000021
 式中、Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して、Ｈ及びＣ１－Ｃ３アルキルから選択される。
用語「アミド」とは、非置換及び置換の両方のアミド置換基、例えば、以下の一般式で表すことができる部分を指し、
Figure 2023519266000022
 式中、Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して、Ｈ及びＣ１－Ｃ３アルキルから選択される。
用語「スルホンアミド（ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）」または「スルホンアミド（ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｏ）」とは、非置換及び置換の両方のスルホンアミド置換基、例えば、以下の一般式で表すことができる部分を指し、
Figure 2023519266000023
 式中、Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して、Ｈ及びＣ１－Ｃ３アルキルから選択される。
本明細書で使用される場合、用語「アリール」には、０～４個のヘテロ原子が含まれ得る、５員及び６員の単環式芳香族基、例えば、ベンゼン、ピレン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン及びピリミジンが含まれる。環構造にヘテロ原子を有するアリール基は、「アリール複素環」または「ヘテロアリール」基と呼ばれる場合もある。用語「アリール」にはまた、２つ以上の炭素が２つの隣接する環（環は、「縮合環」である）に共通している環式環を２つ以上有し、環のうちの少なくとも１つが芳香族である、多環式環系も含まれる。したがって、アリールには、０～５個のヘテロ原子が含まれ得る８員～１０員の縮合二環式芳香族基が含まれ、それにおいて、一方または両方の環が芳香族、例えば、ナプチレン、キノロン、イソキノリン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、テトラヒドロナプチレン等である。各アリール基は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択される１～５つの置換基で置換されてもよい。
「ヘテロシクリル」の「複素環」という用語は、１～３個の環ヘテロ原子を有する非芳香族複素環を指す。好ましい複素環は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１～３個のヘテロ原子を有する５員及び６員の複素環基である。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ原子」とは、炭素または水素以外の任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、及びイオウである。
本明細書で使用される場合、それぞれの表現の定義、例えば、アルキル、Ｒ１、Ｒ２等は、それが任意の構造で２回以上現れる場合、同じ構造の他の箇所でのその定義とは独立していることが意図される。
そのような置換が、置換される原子と置換基の許容される価数に従っていること、及びその置換が、安定な化合物、例えば、転位、環化、脱離等によるような変換を自発的に起こさない化合物をもたらすこと、という暗黙の条件が含まれることが理解されるであろう。
本明細書に開示されるアプタマーリガンドは、特定の幾何学的形態または立体異性体形態、及びその混合物で存在し得る。そのような幾何学的形態または立体異性体形態としては、シス－及びトランス－の異性体、Ｒ－及びＳ－の鏡像異性体、ジアステレオマー、（Ｄ）－異性体、（Ｌ）－異性体、そのラセミ混合物、ならびにそれらの他の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の不斉炭素原子は、アルキル基等の置換基で存在し得る。
式Ｉ～ＶＩＩＩによる化合物は、酸性または塩基性の官能基を含有してよく、したがって、塩形態で存在してよい。好ましくは、塩形態は、薬学的に許容される塩である。これに関し、用語「薬学的に許容される塩」とは、本明細書に開示される化合物の、比較的無毒な無機及び有機の酸付加塩及び塩基付加塩を指す。
式Ｉ～ＶＩＩＩによる化合物は、アミノまたはアルキルアミノ等の１つ以上の塩基性官能基を含有してよく、したがって、それらは、薬学的に許容される酸と共に薬学的に許容される塩を形成する能力がある。これらの塩は、投与ビヒクルもしくは剤形製造工程においてインサイチュで調製するか、またはその遊離塩基形態にある精製された本明細書に開示の化合物を、好適な有機酸または無機酸と別々に反応させ、こうして形成された塩をその後の精製時に単離することによって調製することができる。代表的塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプチラート（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩等が挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１－１９を参照のこと）。
対象化合物の薬学的に許容される塩には、例えば無毒な有機酸または無機酸からの、化合物の従来の無毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、そのような従来の無毒性塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等のような無機酸に由来するもの；及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸（Ｉｓｏｔｈｉｏｎｉｃ）等のような有機酸から調製される塩が挙げられる。
他の場合には、式Ｉ～ＶＩＩＩによる化合物は、１つ以上の酸性官能基を含有してよく、したがって、薬学的に許容される塩基と共に薬学的に許容される塩を形成する能力がある。これらの塩は同様に、投与ビヒクルもしくは剤形製造工程においてインサイチュで調製するか、あるいはその遊離酸形態にある精製された化合物を、薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩等の好適な塩基と別々に反応させるか、アンモニアと別々に反応させるか、または薬学的に許容される有機の第一級、第二級もしくは第三級アミンと別々に反応させることによって調製することができる。代表的アルカリまたはアルカリ土類の塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミニウム塩等が挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等が挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（上掲）を参照のこと）。
実施形態では、本明細書で提供されるアプタマーは、本明細書で提供される１つ以上のチアミン類似体もしくはＴＰＰ類似体に結合するか、そうでなければその存在に応答する、及び／または本明細書で提供されるチアミンもしくはＴＰＰの類似体もしくは誘導体の代謝物、例えば、ＴＰＰ及び／またはチアミンに結合するか、そうでなければそれに応答する。
アプタマーの自身のリガンドへの結合の特異性は、無関係の分子に対するアプタマーの解離定数と比較した、自身のリガンドに対するアプタマーの比較解離定数（Ｋｄ）の点から定義することができる。したがって、リガンドは、アプタマーに対して、無関係の物質に対するよりも高い親和性で結合する分子である。典型的には、自身のリガンドに関するアプタマーのＫｄは、無関係の分子とのアプタマーのＫｄの少なくとも約１０分の１である。他の実施形態では、Ｋｄは、無関係の分子とのアプタマーのＫｄの少なくとも約２０分の１、少なくとも約５０分の１、少なくとも約１００分の１、及び少なくとも約２００分の１、少なくとも約５００分の１、少なくとも約１０００分の１、または少なくとも約１０，０００分の１である。
一実施形態では、アプタマーは、ＴＰＰに対し、式Ｉ～ＶＩ１の化合物に対する前記アプタマーの親和性、またはアセフルチアミン、アセチアミン、アリチアミン、ベクロチアミン、ベンフォチアミン、ベンチアミン、ビスベンチアミン、セトチアミン、シコチアミン、フルスルチアミン、モノホスホチアミン、オクトチアミン、プロスルチアミン、スルブチアミン、もしくはビンチアモールに対する前記アプタマーの親和性の少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも５００分の１、少なくとも１０００分の１、または少なくとも１０，０００分の１の低親和性で結合する。一実施形態では、アプタマーは、ＴＰＰに対し、式Ｉ～ＶＩ１の化合物に対する前記アプタマーの親和性、またはアセフルチアミン、アセチアミン、アリチアミン、ベクロチアミン、ベンフォチアミン、ベンチアミン、ビスベンチアミン、セトチアミン、シコチアミン、フルスルチアミン、モノホスホチアミン、オクトチアミン、プロスルチアミン、スルブチアミン、もしくはビンチアモールに対する前記アプタマーの親和性の少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも５００分の１、少なくとも１０００分の１、または少なくとも１０，０００分の１の低親和性で結合する。
遺伝子発現調節のためのアプタマー
いくつかの実施形態では、本開示により企図されるアプタマーは、遺伝子発現の調節のために使用される。標的遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）の発現の調節は、様々な状況において都合がよい。遺伝子の治療的発現との関連において、例えば、小分子の存在に応答して導入遺伝子の調節された発現を可能にする技術は、標的遺伝子発現のレベル及びそのタイミングの調節を可能にすることによって安全性及び有効性を増強させることができる。研究の場では、遺伝子発現の調節により、様々な実験条件の体系的な調査が可能になる。
実施形態では、アプタマーをコードする配列は、本明細書に記載の小分子の存在または非存在に応答して標的遺伝子の発現レベルを調節する能力を提供する遺伝子調節カセットの一部である。実施形態では、遺伝子調節カセットはさらに、標的遺伝子を含む。本明細書で使用される場合、「標的遺伝子」とは、本明細書に開示されるアプタマーに結合する小分子のため、本明細書に開示される小分子リガンドの存在または非存在に応答して発現される導入遺伝子を指す。実施形態では、標的遺伝子は、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡのコード配列を含む。標的遺伝子は、標的遺伝子発現の調節に使用されるアプタマーに対して異種であり、標的遺伝子の調節に使用されるポイヌクレオチドカセットに対して異種である、及び／または標的遺伝子の調節に使用されるポリヌクレオチドカセットの一部に対して異種である。
本明細書に記載されるアプタマーは、リガンドの存在／非存在に応答して標的遺伝子の発現を調節するために使用される場合、リボスイッチの一部としてアプタマーをコードするポリヌクレオチドカセットの一部であり得る。用語「遺伝子調節カセット」、「調節カセット」、または「ポリヌクレオチドカセット」は、本明細書では同じ意味で使用される。
実施形態では、本明細書に開示のアプタマーに結合する小分子の存在は、小分子非存在下での標的遺伝子の発現と比較して標的遺伝子の発現の増加をもたらす。そのような実施形態では、アプタマーは「オン」スイッチを構成する。実施形態では、標的遺伝子の発現は、本明細書に開示されるアプタマーに結合する小分子の存在下で、かかる小分子の非存在下の場合と比較して少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１０，０００倍増加する。実施形態では、標的遺伝子の発現は、本明細書に開示されるアプタマーに結合する小分子の存在下で、かかる小分子の非存在下の場合と比較して２倍～１０倍、５倍～１０倍、５倍～１５倍、５倍～２０倍、５倍～２５倍、５倍～３０倍、１０倍～２０倍、１０倍～３０倍、１０倍～４０倍、１０倍～５０倍、１０倍～１００倍、１０倍～５００倍、１０倍～１，０００倍、５０倍～１００倍、５０倍～５００倍、５０倍～１００倍、５０倍～１，０００倍、１００倍～１，０００倍、または１００倍～１０，０００倍増加する。
実施形態では、本明細書に開示のアプタマーに結合する小分子の存在は、小分子非存在下での標的遺伝子の発現と比較して標的遺伝子の発現の減少をもたらす。そのような実施形態では、アプタマーは「オフ」スイッチを構成する。実施形態では、標的遺伝子の発現は、本明細書に開示されるアプタマーに結合する小分子の存在下で、かかる小分子の非存在下の場合と比較して少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１０，０００倍減少する。一実施形態では、標的遺伝子の発現は、本明細書に開示されるアプタマーに結合する小分子の存在下で、かかる小分子の非存在下の場合と比較して２倍～１０倍、５倍～１０倍、５倍～１５倍、５倍～２０倍、５倍～２５倍、５倍～３０倍、１０倍～２０倍、１０倍～３０倍、１０倍～４０倍、１０倍～５０倍、１０倍～１００倍、１０倍～５００倍、１０倍～１，０００倍、５０倍～１００倍、５０倍～５００倍、５０倍～１００倍、５０倍～１，０００倍、１００倍～１，０００倍、または１００倍～１０，０００倍減少する。
実施形態では、アプタマーは、リボスイッチの一部である。リボスイッチは、アプタマー特異的リガンド分子の存在または非存在に応答して、ＲＮＡポリヌクレオチドの安定性を調節する、及び／またはＲＮＡポリヌクレオチドからのタンパク質の生成を調節する、ＲＮＡポリヌクレオチドの調節セグメントである。実施形態では、リボスイッチは、センサー領域（例えば、アプタマー領域）及びエフェクター領域を含み、これらは一緒になって、リガンド（例えば、小分子）の存在の感知すること、及び標的遺伝子の発現の増加または減少をもたらす効果を引き起こすことに関与する。本明細書に記載されるリボスイッチは組換えであり、２つ以上の供給源からのポリヌクレオチドを利用する。実施形態では、センサー及びエフェクター領域は、ポリヌクレオチドリンカーにより連結されている。実施形態では、ポリヌクレオチドリンカーは、ＲＮＡステムまたは対領域（すなわち、二本鎖であるＲＮＡポリヌクレオチドの領域）を形成する。実施形態では、アプタマーとエフェクター領域を連結する対領域は、アプタマーステムの全部または一部（例えば、例としてアプタマーＰ１ステムの全部または一部）を含む。
アプタマー配列を含むリボスイッチを使用して、例えば、未成熟転写終結をもたらすｒｈｏ非依存性転写終結ヘアピンの形成を制御してよい。アプタマー配列を含むリボスイッチはまた、ＲＮＡの構造変化を誘導して、リボソーム結合部位の隔絶及び翻訳の阻害をもたらす場合もある。本明細書に開示されるアプタマー配列を含む代替的リボスイッチ構造はさらに、小分子リガンドの存在に応答してｍＲＮＡのスプライシングに影響を与えることができる。
選択的スプライシングリボスイッチ
一実施形態では、本明細書に記載されるアプタマーは、生じたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ前駆体）の、アプタマー／リガンドに仲介される選択的スプライシングによる、標的遺伝子の調節のための遺伝子調節カセットの一部としてコードされる。この文脈において、遺伝子調節カセットは、センサー領域（例えば、本明細書に記載されるアプタマー）及びエフェクター領域を含むリボスイッチを含み、それらの領域は、小分子リガンドの存在を感知すること、及び選択的エクソンへのスプライシングを変化させることに一緒になって関与する。スプライシングとは、新生メッセンジャーＲＮＡ前駆体（ｍＲＮＡ前駆体）からイントロン配列が除去され、エクソンが一緒に連結されてｍＲＮＡが形成されるプロセスを指す。スプライス部位は、エクソンとイントロンの間の接合部であり、イントロンの５’末端及び３’末端（すなわち、それぞれ、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位）における異なるコンセンサス配列により定義される。スプライシングは、核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）と多様な補助タンパク質の集まりである、スプライセオソームと呼ばれる大きな多成分構造体により行われる。スプライセオソームは、様々なシス調節配列を認識することによってエクソン／イントロンの境界を定義し、イントロン配列を除去し、エクソンを継ぎ合わせて最終メッセージ（例えば、ｍＲＮＡ）にする。選択的スプライシングの場合、特定のエクソンが含まれるかまたは除外されて最終コードメッセージが変更され、それにより、生じる発現タンパク質を変えることができる。
一実施形態では、標的遺伝子発現の調節は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１２６７４７に開示のＤＮＡコンストラクトのいずれを使用しても達成される。本開示の実施形態では、ＷＯ２０１６／１２６７４７に開示のリボスイッチ及びポリヌクレオチドカセットは、ＷＯ２０１６／１２６７４７に開示のアプタマー配列の代わりに本明細書に記載されるアプタマーコード配列を含む。
一実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、（ａ）リボスイッチ、及び（ｂ）５’イントロン及び３’イントロンが隣接する選択的にスプライスされるエクソン、を含み、リボスイッチは、（ｉ）３’イントロンの５’スプライス部位配列が含まれるステムを含むエフェクター領域、及び（ｉｉ）本明細書に開示されるアプタマーを含む。実施形態では、エフェクター領域は、選択的エクソンの３’に隣接するイントロンのイントロン内５’スプライス部位（「５’ｓｓ」）配列、及び３’イントロンの５’ｓｓ配列に相補的な配列を含む。アプタマーがそのリガンドと結合すると、エフェクター領域はステムを形成し、したがって、選択的エクソンの３’末端にあるスプライスドナー部位へのスプライシングを阻止する。ある種の条件下では（例えば、アプタマーがそのリガンドに結合していない場合）、エフェクター領域は、選択的エクソンの３’末端にあるスプライスドナー部位へのアクセスを提供するという状況にあり、標的遺伝子のｍＲＮＡ内への選択的エクソンの包含がもたらされる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、リガンドに応答して標的遺伝子の発現を調節するために、標的遺伝子内に配される。一実施形態では、選択的にスプライスされるエクソンは、選択的にスプライスされるエクソンがスプライスされて標的遺伝子のｍＲＮＡとなる際に、標的遺伝子と共にインフレームにある終止コドンを含む。
一実施形態では、遺伝子調節カセットは、配列番号３７の配列を含み、ここで、－Ｘ－は、本明細書に開示のアプタマーコード配列を表す。小文字は、アプタマーとリボスイッチの残りの部分とを連結する対のステムの配列を示す。一実施形態では、選択的エクソン（以下の配列番号３７では下線が引かれている）は、別の選択的エクソンの配列で置き換えられる。
配列番号３７－
Figure 2023519266000024
選択的エクソンには、５’イントロン配列及び３’イントロン配列が隣接している。本明細書に開示の遺伝子調節カセットに使用され得る５’イントロン配列及び３’イントロン配列は、標的遺伝子から切り出されて、アプタマーと結合するリガンドの存在または非存在に応じて標的遺伝子のｍＲＮＡかまたはｍＲＮＡに選択的エクソンを含む標的遺伝子のいずれかを作ることができる、任意の配列であり得る。５’イントロン配列及び３’イントロン配列は、各々、スプライシングが生じるために必要な配列、すなわち、スプライスドナー配列、スプライスアクセプター配列及び分岐部位配列を有する。一実施形態では、遺伝子調節カセットの５’イントロン配列及び３’イントロン配列は、１つ以上の天然に存在するイントロンまたはそれらの部分に由来する。一実施形態では、５’イントロン配列及び３’イントロン配列は、切断型ヒトベータグロビンイントロン２（ＩＶＳ２Δ）、ヒト０３－グロビン遺伝子のイントロン２、ＳＶ４０ ｍＲＮＡイントロン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．からのｐＣＭＶ－ＬａｃＺベクターで使用される）、ヒトトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子のイントロン６（Ｎｏｔｔ Ａｊｉｔ，ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ．２００３，９：６０７０６１７）、ヒト第ＩＸ因子からのイントロン（Ｓｕｍｉｋｏ Ｋｕｒａｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．１９９５，２７０（１０），５２７６）、標的遺伝子自身の内因性イントロン、または任意のゲノム断片かもしくは調節されたスプライシングに十分であるエレメントを含有する（Ｔｈｏｍａｓ Ａ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５（３７）：３３１）合成イントロン（Ｙｉ Ｌａｉ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００６：１７（１０）：１０３６）に由来する。
一実施形態では、選択的エクソン及びリボスイッチは、標的遺伝子の内因性イントロン内にあるよう操作される。すなわち、イントロン（または実質的に同様のイントロン配列）は、天然では、標的遺伝子のその位置で生じる。この場合、選択的エクソンのすぐ上流のイントロン配列は、５’イントロンまたは５’イントロン配列と呼ばれ、選択的エクソンのすぐ下流のイントロン配列は、３’イントロンまたは３’イントロン配列と呼ばれる。この場合、内因性イントロンは改変されて、選択的エクソンの５’末端及び３’末端に隣接するスプライスアクセプター配列及びスプライスドナー配列を含有する。一実施形態では、５’イントロン及び／または３’イントロンは、標的遺伝子にとって外因性である。
選択的スプライシング遺伝子調節カセットのスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位を修飾して、強化または減弱することができる。すなわち、標準的クローニング法、部位特異的変異導入等により、スプライス部位を、スプライスドナーまたはスプライスアクセプターのコンセンサスに近づくよう改変することができる。スプライスのコンセンサスにより類似したスプライス部位は、スプライシングを促進する傾向があり、したがって、強化される。スプライスのコンセンサスにあまり類似しないスプライス部位は、スプライシングを妨げる傾向があり、したがって、減弱される。最も一般的なクラスのイントロン（Ｕ２）のスプライスドナーのコンセンサスは、Ａ／Ｃ Ａ Ｇ∥Ｇ Ｔ Ａ／Ｇ Ａ Ｇ Ｔである（∥は、エクソン／イントロン境界を示す）。スプライスアクセプターのコンセンサスは、Ｃ Ａ Ｇ∥Ｇである（∥は、エクソン／イントロン境界を示す）。スプライスドナー及びスプライスアクセプターの部位における特定のヌクレオチドの頻度が、当該技術分野で報告されている（例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｑ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．１９８８．７（５）：９１９－９３２を参照のこと）。５’及び３’のスプライス部位の強度を調整して、選択的エクソンのスプライシングを調節することができる。
スプライシングを調節するために行うことができる、選択的スプライシング遺伝子調節カセットに存在する５’イントロン及び３’イントロンに対する追加の改変としては、イントロン内スプライシングエンハンサーエレメント、イントロン内スプライシングサプレッサーエレメント及び／またはスプライス部位を改変、除去、及び／または追加すること、及び／または分岐部位配列を改変することが挙げられる。
一実施形態では、５’イントロンは、標的遺伝子と共にインフレームにある終止コドンを含有するよう改変されてある。５’イントロン配列及び３’イントロン配列はまた、潜在性スライス部位が除去されるよう改変することもでき、これは、公的に利用可能なソフトウェアで同定することができる（例えば、Ｋａｐｕｓｔｉｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１１．１－８を参照のこと）。
５’イントロン配列及び３’イントロン配列の長さは、例えば、ウイルス発現コンストラクトのサイズ要件を満たすために、調整することができる。一実施形態では、５’イントロン配列及び／または３’イントロン配列は、長さが約５０～約３００ヌクレオチドである。一実施形態では、５’イントロン配列及び／または３’イントロン配列は、長さが約１２５～約２４０ヌクレオチドである。
エフェクター領域のステム部分は、リガンドのアプタマー結合時に選択的エクソンの選択的スプライシングを実質的に阻止し、一方で、リガンドが十分な量で存在しない場合にスプライス部位へのアクセスも可能にするよう、十分な長さ（かつ、ＧＣ含量）であるべきである。実施形態では、エフェクター領域のステム部分は、３’イントロンの５’スプライス部位配列、及びその５’スプライス部位配列のその相補配列に加え、ステム配列を含む。実施形態では、この追加のステム配列は、アプタマーステムからの配列を含む。ステム部分の長さと配列は、リガンドが存在しない場合に標的遺伝子の許容されるバックグラウンドの発現を可能にし、リガンドが存在する場合は標的遺伝子の許容される発現レベルを可能にするステムを同定するために、既知の技術を使用して改変することができる。一実施形態では、リボスイッチのエフェクター領域のステムは、長さが約７～約２０塩基対である。一実施形態では、エフェクター領域のステムは、長さが８～１１塩基対である。ステムの長さに加え、ステムのＧＣ塩基対含量を変化させてステムの安定性を改変することができる。
一実施形態では、本明細書に開示される選択的スプライシング遺伝子調節カセットの一部である選択的エクソンは、転写されてｍＲＮＡ前駆体になり、選択的にスプライスされて標的遺伝子のｍＲＮＡになる能力があるポリヌクレオチド配列である。一実施形態では、選択的エクソンは、選択的エクソンが標的遺伝子のｍＲＮＡに含まれる場合に、そのｍＲＮＡからの標的遺伝子の発現が阻止または低減されるよう、翻訳を阻害する少なくとも１つの配列を含有する。好ましい実施形態では、選択的エクソンは、選択的エクソンがスプライシングによって標的遺伝子のｍＲＮＡに含まれる場合に標的遺伝子と共にインフレームにある終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）を含有する。実施形態では、選択的エクソンは、終止コドンに加えて、または終止コドンの代替として、選択的エクソンがスプライシングによって標的遺伝子のｍＲＮＡ内、例えば、マイクロＲＮＡ結合部位等に組み込まれている場合に翻訳を低減もしくは実質的に阻止する、ｍＲＮＡの分解をもたらす別の配列を含む。一実施形態では、選択的エクソンは、ｍＲＮＡの分解をもたらすｍｉＲＮＡ結合配列を含む。一実施形態では、選択的エクソンは、このポリペプチド配列を含有するタンパク質の安定性を低下させるポリペプチド配列をコードする。一実施形態では、選択的エクソンは、このポリペプチド配列を含有するタンパク質を分解に誘導するポリペプチド配列をコードする。
基底レベルまたはバックグラウンドレベルの選択的エクソンのスプライシングは、エクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）配列及びエクソンスプライスサプレッサー（ＥＳＳ）配列を変化させること、及び／またはＥＳＥ配列もしくはＥＳＳ配列を選択的エクソン内に導入することによって最適化することができる。選択的エクソンの配列に対するそのような変更は、部位特異的変異導入が挙げられるがこれに限定されない、当該技術分野で公知の方法を使用して達成することができる。別法として、所望の配列（例えば、選択的エクソンの全部または一部を含む）のオリゴヌクレオチドを、商業的供給源から入手して遺伝子調節カセットにクローニングすることができる。ＥＳＳ配列及びＥＳＥ配列の同定は、例えば、ＥＳＥｆｉｎｄｅｒ ３．０（Ｃａｒｔｅｇｎｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．ＥＳＥｆｉｎｄｅｒ：ａ ｗｅｂ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｅｘｏｎｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，３１（１３）：３５６８－３５７１）及び／または利用可能な他の資源を使用することを含め、当該技術分野で公知の方法によって達成することができる。
一実施形態では、選択的エクソンは、天然に存在するエクソンである。別の実施形態では、選択的エクソンは、既知のエクソンの全部または一部に由来する。この文脈において、「由来する」とは、選択的エクソンが、天然に存在するエクソン、もしくはその一部と実質的に相同ではあるが、エクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）配列及びエクソンスプライスサプレッサー（ＥＳＳ）配列を変化させること、及び／またはＥＳＥ配列もしくはＥＳＳ配列を選択的エクソン内に導入することによって生じた変異等の様々な変異が含有され得る配列を含有していることを指す。本明細書で使用される場合、「相同性」及び「相同な」とは、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の同一性のパーセントを指す。ある配列と別の配列の間の対応は、当該技術分野で公知の技術によって決定することができる。例えば、相同性は、２つのポリペプチド分子の配列を整列させ、容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用してそれらを直接比較することによって決定することができる。別法として、相同性は、相同領域間での安定な二重鎖が形成される条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）での消化、及び消化された断片のサイズ決定によって決定することができる。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列はそれぞれ、適切な挿入または欠失により最適に整列させた後に、上記の方法を使用して決定したそのヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、及び少なくとも約９５％が分子の定義された長さにわたり一致する場合、互いに「実質的に相同」である。
一実施形態では、選択的エクソンは、標的遺伝子にとって外因性であるが、標的遺伝子が発現される生物に由来する配列に由来し得る。本明細書で使用される場合、「外因性」とは、遺伝子型が、比較される対象となるかまたは導入もしくは組み込みの対象となる実体の残りの部分の遺伝子型とは異なる実体に由来することを意味する。例えば、異なる細胞型に遺伝子工学技術によって導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（また、発現された場合、異種ポリペプチドをコードすることができる）。一実施形態では、選択的にスプライスされるエクソンは、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）のエクソン２、変異ヒトウィルムス腫瘍１エクソン５、マウスカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩデルタエクソン１６、またはＳＩＲＴ１エクソン６に由来する。実施形態では、選択的にスプライスされるエクソンは、配列番号７９（ＧＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＡＴＴＴＣＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＡＧＴＡＧＡＡＧ）の改変ＤＨＦＲエクソン２であるかまたはそれを含む。実施形態では、選択的にスプライスされるエクソンは、配列番号９８：ＧＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＡＴＴＴＣＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＡＧＴＡＧＡＡＧの改変ＤＨＦＲエクソン２であるかまたはそれを含む。
自己切断リボザイムによるアプタマー媒介性の切断
一実施形態では、アプタマー媒介性の標的遺伝子の発現は、小さなエンドヌクレアーゼ的リボザイムのアプタマー媒介性の調節によって調節される。リボザイムは、化学反応を触媒するＲＮＡ酵素である。本明細書に開示される核酸及び方法では、リボザイムは、標的細胞型において自己切断する任意の小さなエンドヌクレアーゼ的リボザイムであってよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型、デルタ肝炎ウイルス型、Ｖａｒｋｕｄサテライト型、ツイスター（ｔｗｉｓｔｅｒ）型、ツイスター・シスター（ｔｗｉｓｔｅｒ ｓｉｓｔｅｒ）型、ピストル型またはハチェット（ｈａｔｃｈｅｔ）型リボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、一実施形態では、リボスイッチ、及び本明細書に開示されるアプタマーに連結されたリボザイムを含有するリボスイッチを含む遺伝子発現カセットが提供される。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１３６６０８には、アプタマーリガンドの存在下でリボザイムの自己切断を活性化するようなリボスイッチ（「オフ」スイッチ）またはアプタマーの存在下でリボザイムの自己切断を阻害するようなリボスイッチ（「オン」スイッチ）が記載されている。
「オフ」スイッチのシナリオでは、アプタマー／リガンド結合は、リボザイムのリボヌクレアーゼ機能を増大させて、ポリヌクレオチドカセットを含有する標的遺伝子ＲＮＡの切断をもたらし、それにより標的遺伝子発現を低下させる。そのようなオフスイッチの例としては、ステムによりアプタマーに連結されているツイスターリボザイムを含むリボスイッチを含む、標的遺伝子の発現の調節のためのポリヌクレオチドカセットが挙げられ、ここで、ツイスターリボザイムとアプタマーを連結するステムは、ツイスターリボザイムのＰ３ステムの位置でリボザイムに結合しており、標的遺伝子は、ツイスターリボザイムのＰ１ステムに連結している、（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１３６６０８の図１ａ、図１ｂ、または図３ａ、及び関連する本文を参照のこと）。
「オン」スイッチのシナリオでは、アプタマー／リガンド結合は、リボザイムのリボヌクレアーゼ機能を阻害して、ポリヌクレオチドカセットを含有する標的遺伝子ＲＮＡの切断を減少させ、それによりリガンドの存在下での標的遺伝子発現を増大させる。オンスイッチの例としては、アプタマーに連結されたツイスターリボザイムを含むリボスイッチが挙げられ、ここで、アプタマーは、ツイスターリボザイムのＰ１ステムの３’末端または５’末端に連結されており、アプタマーが、ツイスターリボザイムのＰ１ステムの３’末端に連結されている場合は、ツイスターリボザイムのＰ１ステムの３’アームの一部分は、選択的にアプタマーＰ１ステムの５’アームであり、アプタマーが、ツイスターリボザイムのＰ１ステムの５’末端に連結されている場合は、ツイスターリボザイムのＰ１ステムの５’アームの一部分は、選択的にアプタマーＰ１ステムの３’アームである（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１３６６０８の図６ａ、及び図６ｂならびに関連する本文を参照のこと）。
ポリアデニル化のアプタマー調節
実施形態では、標的遺伝子の発現は、アプタマーにより調節されるポリアデニル化によって調節される。ほぼすべての真核生物のｍＲＮＡの３’末端は、２０～２５０のアデノシン残基のホモポリマーであるポリ（Ａ）テールを含む。ｍＲＮＡへのポリ（Ａ）テールの付加はｍＲＮＡを分解から保護するため、遺伝子の発現は、対応するｍＲＮＡのポリアデニル化を調節することにより影響を受け得る。
一実施形態では、標的遺伝子の発現は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１５６６５８に記載のように、アプタマーにより調節される、ポリアデニル化シグナルの接近可能性を介して調節される。そのような実施形態では、リボスイッチは、エフェクターステムループ及び本明細書に記載されるアプタマーを含み、ここで、エフェクターステムループは、ポリアデニル化シグナルを含み、かつ、アプタマーとエフェクターステムループは、アプタマーステムの非共有アーム及びエフェクターステムループの非共有アームに相補的な配列を含む、選択的な共有ステムアームにより連結されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１５６６５８の図１ａ、図１ｂ、図２ａ、及び図５ａならびに関連する本文を参照のこと）。一実施形態では、エフェクターステムループは、選択的な共有ステムアームが、３’アプタマーステムアームの全部または一部分、及びエフェクターステムの５’アームの全部または一部分を含むよう、アプタマーの３’に位置する。一実施形態では、エフェクターステムループは、選択的な共有ステムアームが、５’アプタマーステムアームの全部または一部分、及びエフェクターステムの３’アームの全部または一部分を含むよう、アプタマーの５’に位置する。一実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、ＡＡＴＡＡＡまたはＡＴＴＡＡＡである。一実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、下流エレメント（ＤＳＥ）である。一実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、上流配列エレメント（ＵＳＥ）である。一実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、２つのリボスイッチを含み、第１のリボスイッチのエフェクターステムループは、ポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡまたはＡＴＴＡＡＡの全部または一部を含み、第２のリボスイッチのエフェクターステムループは、下流エレメント（ＤＳＥ）の全部または一部を含む。一実施形態では、２つのリボスイッチは各々、同じリガンドと結合するアプタマーを含む。一実施形態では、２つのリボスイッチは、異なるリガンドと結合する異なるアプタマーを含む。
いくつかの実施形態では、リボスイッチは、感知領域（例えば、本明細書に記載されるアプタマー）と、スプライセオソームの一部である核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）Ｕ１の結合部位を含むエフェクター領域とを含む。ＷＯ２０１７／１３６５９１には、エフェクター領域がＵ１ ｓｎＲＮＰ結合部位を含むリボスイッチが記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。アプタマーがそのリガンドと結合すると、エフェクター領域はステムを形成し、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位をＵ１ ｓｎＲＮＰとの結合から隔絶する。ある種の条件下では（例えば、アプタマーが、自身のリガンドに結合していない場合）、エフェクター領域は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位へのアクセスを提供するという状況にあり、Ｕ１ ｓｎＲＮＰがｍＲＮＡと結合し、ポリアデニル化を阻害してメッセージの分解をもたらすことを可能にする。Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰと結合し、それによりＵ１ ｓｎＲＮＰを標的遺伝子の３’ＵＴＲに動員して、標的遺伝子メッセージのポリアデニル化を抑制する能力がある、任意のポリヌクレオチド配列であり得る。一実施形態では、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は、コンセンサス部位ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡ（配列番号８０）（ｍＲＮＡ内にある場合はＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡ（配列番号８１））である。いくつかの実施形態では、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は、このコンセンサス配列の変異であり、例えば、コンセンサス配列よりも短いかまたは１つ以上のヌクレオチドが変更されている配列が含まれる。一実施形態では、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は、配列ＣＡＧＧＴＡＡＧを含有する。いくつかの実施形態では、結合部位は、ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡ（配列番号８０）、ＣＡＧＧＴＡＡＧＴ、及びＣＡＧＧＴＡＡＧから選択される配列によってコードされる。Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合部位は、遺伝子からの任意の５’スプライス部位、例えば、ヒトＤＨＦＲエクソン２からの５’スプライス部位であり得る。
リボヌクレアーゼ切断のアプタマー媒介性の調節
一実施形態では、標的遺伝子の発現は、アプタマーにより調節されるリボヌクレアーゼ切断を介して調節される。リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）は、特定のリボヌクレアーゼ基質配列を認識して切断する。本明細書では、標的遺伝子のＤＮＡ内に組み込まれた場合に、アプタマー／リガンドにより媒介される、生じたＲＮＡのリボヌクレアーゼ切断によって標的遺伝子の発現を調節する能力を提供する組換えＤＮＡコンストラクトを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるアプタマーコード配列は、リボヌクレアーゼ基質配列、及びエフェクター領域と、アプタマーがリガンドに結合すると標的遺伝子発現が生じるようなアプタマー（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１６１０５３に記載のとおり）とを含むリボスイッチを含有するかまたはコードするコンストラクトの一部である。実施形態では、ＲＮａｓｅ Ｐ基質配列は、リボスイッチに連結され、リボスイッチは、エフェクター領域及び本明細書に記載されるアプタマーを含み、エフェクター領域は、ＲＮａｓｅ Ｐ基質配列の一部分に相補的な配列を含む。アプタマーへの好適なリガンドの結合は、アプタマーとエフェクター領域の構造変化を誘導し、リボヌクレアーゼによる切断のためのリボヌクレアーゼ基質配列の接近可能性を変化させる。
一実施形態では、アプタマー配列は、ＲＮａｓｅ Ｐ基質配列に対して５’に位置し、エフェクター領域は、リーダー配列の全部または一部、及びＲＮａｓｅ Ｐ基質配列の５’アクセプターステム配列の全部または一部を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１６１０５３の図１ａ、図１ｂ、及び図３ｂならびに関連する本文を参照のこと。さらなる実施形態では、ＲＮａｓｅ Ｐの基質のアクセプターステムとリボスイッチエフェクター領域とは、０、１、２、３、または４のヌクレオチドにより区切られている。他の実施形態では、エフェクター領域のステムには、リーダー配列（及びその補体）に加え、ＲＮａｓｅ Ｐの基質のアクセプターステムの１つ以上のヌクレオチド、及びアクセプターステムの１つ以上のヌクレオチドに相補的な配列が含まれる。
一実施形態では、ポリヌクレオチドカセットのアプタマー配列は、ＲＮａｓｅ Ｐ基質配列に対して３’に位置し、エフェクター領域は、ＲＮａｓｅ Ｐ基質配列の３’アクセプターステムの全部または一部に相補的な配列を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１６１０５３の図３ａ及び関連する本文を参照のこと。さらなる実施形態では、ＲＮａｓｅ Ｐの基質の３’アクセプターステムに相補的なエフェクター領域配列は、１～７ヌクレオチドである。言い換えれば、エフェクター領域のステムには、アクセプターステムの１～７ヌクレオチドが含まれ、また、このアクセプターステムの１～７ヌクレオチドに相補的な配列が含まれる。実施形態では、リボスイッチは、ＲＮａｓｅ Ｐの基質の３’に位置するため、エフェクター領域ステムとＲＮａｓｅ Ｐの基質のアクセプターステムとは重ならない。実施形態では、エフェクター領域とＲＮａｓｅ Ｐの基質のアクセプターステムとが直接隣接している（すなわち、重なっていない）。他の実施形態では、エフェクター領域とＲＮａｓｅ Ｐの基質のアクセプターステムとは、１、２、３、４、５以上のヌクレオチドにより区切られている。
本明細書に開示されるアプタマー及び遺伝子調節カセットを使用して、標的細胞、組織または生物で発現され得る任意の標的遺伝子の発現を調節することができる。用語「標的遺伝子」とは、細胞に導入されるポリヌクレオチドであり、かつ、転写されてＲＮＡになり、適切な条件下で翻訳及び／または発現される能力があるポリヌクレオチドを指す。別法として、標的遺伝子は、標的細胞にとって内因性であり、遺伝子調節カセットは、標的遺伝子内（例えば、内因性標的遺伝子の既存の非翻訳領域またはイントロン内）に配される。標的遺伝子の一例は、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。一実施形態では、標的遺伝子は、組換えＤＮＡコンストラクトを転写させる細胞にとって外因性である。別の実施形態では、標的遺伝子は、組換えＤＮＡコンストラクトを転写させる細胞にとって内因性である。標的遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子、またはタンパク質非コードＲＮＡをコードする配列であってよい。標的遺伝子は、例えば、構造タンパク質、酵素、細胞シグナル伝達タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、ジンクフィンガータンパク質、ホルモン、輸送タンパク質、増殖因子、サイトカイン、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、膜貫通タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、受容体分子、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、翻訳機構、チャネルタンパク質、モータータンパク質、細胞接着分子、ミトコンドリアタンパク質、代謝酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、交換因子、シャペロンタンパク質、及びこれらのうちのいずれかのモジュレーター、をコードする遺伝子であってよい。実施形態では、標的遺伝子は、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ヒトインスリン、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｃａｓ９）、または免疫グロブリン（またはその部分）、例えば治療用抗体等をコードする。
実施形態では、本明細書に開示されるアプタマー及び遺伝子調節カセットは、真核細胞、例えば哺乳類細胞、より具体的にはヒト細胞での標的遺伝子の発現を調節するために使用される。実施形態では、本明細書に開示されるアプタマー及び遺伝子調節カセットは、眼（角膜及び網膜を含む）、中枢神経系（脳を含む）、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、気道、筋肉、皮膚、肺、軟骨、精巣、動脈、胸腺、骨髄、または腫瘍での標的遺伝子の発現を調節するために使用される。
一態様では、組換えベクター、及びそれらの、標的遺伝子と遺伝子調節カセットとを含むポリヌクレオチドの導入のための使用を提供し、遺伝子調節カセットは、本明細書に開示されるアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡコンストラクトには、宿主細胞でのＤＮＡの複製と、標的細胞における標的遺伝子の適切なレベルでの発現とをもたらすＤＮＡセグメントが含まれる、追加のＤＮＡエレメントが含まれる。当業者は、発現制御配列（プロモーター、エンハンサー等）が、標的細胞において標的遺伝子の発現を促進するそれらの能力に基づいて選択されることを理解する。「ベクター」とは、インビトロまたはインビボで、宿主細胞内へ送達されるべきポリヌクレオチドを含む、組換えプラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ミニ染色体、ＤＮＡミニサークルまたはウイルス（ウイルス由来配列を含む）を意味する。一実施形態では、組換えベクターは、ウイルスベクターであるかまたは複数のウイルスベクターの組み合わせである。
標的細胞、組織、または生物における標的遺伝子の発現のためのウイルスベクターは当該技術分野で公知であり、それらとして、アデノウイルス（ＡＶ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルス及びレンチウイルスのベクター、ならびに単純ヘルペス１型（ＨＳＶ１）ベクターが挙げられる。
アデノウイルスベクターには、例えば、Ｅ１領域及びＥ３領域における欠失を介して複製欠損にされてある、ヒトアデノウイルス２型及びヒトアデノウイルス５型に基づくものが含まれる。転写カセットをＥ１領域内に挿入して、組換えＥ１／Ｅ３欠失ＡＶベクターを得ることができる。アデノウイルスベクターにはまた、ウイルスコード配列を含有しないヘルパー依存性高容量アデノウイルスベクター（高容量「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」または「ガッテド（ｇｕｔｔｅｄ）」ベクターとしても知られる）も含まれる。これらのベクターは、ウイルスのＤＮＡ複製とパッケージングに必要なシス作用エレメント、主に、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）及びパッケージングシグナル（ＣＹ）を含有する。これらのヘルパー依存性ＡＶベクターのゲノムには、数百塩基対から最大約３６ｋｂの外来ＤＮＡを運ぶ可能性がある。
組換えアデノ随伴ウイルス「ｒＡＡＶ」ベクターには、任意のアデノ随伴ウイルス血清型に由来する任意のベクターが含まれ、それらとしては、限定することなく、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０等が挙げられる。ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上、好ましくは、Ｒｅｐ及び／またはＣａｐ遺伝子が、全部または一部欠失していてよいが、機能的な隣接ＩＴＲ配列は保持されている。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶゲノムの、レスキュー、複製、パッケージング及び潜在的染色体組み込みのために保持される。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列により機能的なレスキュー、複製及びパッケージングがもたらされる限り、（例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって）変化させてよい。
別法として、レンチウイルスベクター等の他の系を使用することもできる。レンチウイルスベースの系は、非分裂でも分裂細胞でも遺伝子導入が可能であるため、それらは、例えば、ＣＮＳの非分裂細胞を標的とする用途に有用となる。レンチウイルスベクターはヒト免疫不全ウイルスに由来し、そのウイルスのように宿主ゲノムに組み込まれ、非常に長期の遺伝子発現の可能性を提供する。
遺伝子調節カセットを含有する標的遺伝子を保持する、プラスミド、ＹＡＣ、ミニ染色体及びミニサークル等のポリヌクレオチドはまた、例えば、カチオン性脂質、ポリマー、または両方を担体として使用する、非ウイルスベクター系によって細胞または生物内に導入することもできる。結合ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）ポリマー系及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー系もまた、細胞にベクターを送達するために使用され得る。細胞にベクターを送達するための他の方法としては、ハイドロダイナミック法（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及び電気穿孔ならびに超音波の使用が挙げられ、いずれも細胞培養及び生物を対象とする。遺伝子送達のためのウイルス及びウイルス以外の送達システムのレビューについては、参照により本明細書に組み込まれるＮａｙｅｒｏｓｓａｄａｔ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ．２０１２；１：２７）を参照のこと。
一態様では、本開示は、標的遺伝子（例えば、治療遺伝子）の発現を調節する方法を提供し、（ａ）本明細書に開示されるアプタマーを含むポリヌクレオチドカセットを標的遺伝子内に挿入すること、（ｂ）ポリヌクレオチドカセットを含む標的遺伝子を細胞内に導入すること、及び（ｃ）細胞を、標的遺伝子の発現を誘導するための有効量で、アプタマーと特異的に結合する小分子リガンドに曝露すること、を含む。態様では、標的細胞での標的遺伝子の発現は、標的遺伝子が導入された細胞に所望の特性を付与するか、そうでなければ所望の治療結果をもたらす。
一実施形態では、本明細書に開示されるアプタマーを含む遺伝子調節カセットは、（５’または３’の非翻訳領域内というよりむしろ）標的遺伝子のタンパク質コード配列内に挿入される。一実施形態では、本明細書に開示されるアプタマーを含む単一の遺伝子調節カセットが標的遺伝子内に挿入される。他の実施形態では、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の遺伝子調節カセットが標的遺伝子に挿入され、１つ以上の遺伝子調節カセットが、本明細書に開示されるアプタマーを含む。一実施形態では、２つの遺伝子調節カセットが標的遺伝子内に挿入され、一方または両方の遺伝子調節カセットが、本明細書に開示されるアプタマーを含む。複数の遺伝子調節カセットが標的遺伝子内に挿入される場合、それら各々が、単一のリガンドを使用して標的遺伝子発現を調節することができるよう同じアプタマーを含有することができる。他の実施形態では、複数の遺伝子調節カセットが標的遺伝子内に挿入され、複数の異なる小分子リガンドへの曝露により標的遺伝子発現が調節されるよう、各々が異なるアプタマーを含有することができる。
治療方法及び医薬組成物
一態様では、遺伝子治療により送達される治療用タンパク質のレベルを調節する方法が提供される。本明細書に開示されるアプタマーを含む調節カセットを含有する治療遺伝子配列は、体内の標的細胞に、例えば、ベクターによって送達される。標的遺伝子発現の細胞特異性は、プロモーター及び／またはベクター内の他の要素によって、及び／またはウイルスベクターのカプシドによって制御され得る。標的遺伝子を含有するベクターコンストラクトの送達、及び調節された標的遺伝子の安定なトランスフェクションをもたらす標的組織のトランスフェクションは、治療用タンパク質を生成する際の最初のステップである。しかしながら、標的遺伝子配列内にあるアプタマーのため、標的遺伝子は顕著なレベルでは発現されない、すなわち、調節カセットリボスイッチ内に含有されるアプタマーに結合する特定のリガンドの非存在下では、標的遺伝子は「オフ状態」にある。アプタマー特異的リガンドが投与された場合にのみ、標的遺伝子発現が活性化される。
標的遺伝子を含有するベクターコンストラクトの送達と活性化リガンドの送達には一般に、時間的な隔たりがある。活性化リガンドの送達は、標的遺伝子が発現される時期、及びタンパク質発現レベルを制御する。リガンドは、数多くの経路によって送達され得、それには、硝子体内、眼球内、吸入、皮下、筋肉内、皮内、病巣内、局所、腹腔内、静脈内（ＩＶ）、動脈内、血管周囲、脳内、脳室内、経口、舌下、唇下、口腔、経鼻、胸腔内、心臓内、髄腔内、硬膜外、骨内、または関節内が含まれるが、これらに限定されない。
リガンドの送達のタイミングは、標的遺伝子の活性化についての要件によって異なる。例えば、標的遺伝子によってコードされる治療用タンパク質が常に必要とされる場合は、標的遺伝子の継続的な活性化、ひいては治療用タンパク質の継続的な発現を確実にするために、経口小分子リガンドを連日、または１日複数回送達してよい。標的遺伝子に長時間作用効果がある場合は、誘導リガンドを、より少ない頻度で、例えば、週１回、２週に１回、月１回で投与してよい。
リボスイッチを含む遺伝子調節カセットとの関連において本明細書に記載されるこのアプタマーは、アプタマーに特異的なリガンドの時間的投与によって決定される方法で、治療用導入遺伝子の発現を時間的に制御することを可能にする。リガンド投与時のみの治療用導入遺伝子の発現では、リガンドの非存在下で標的遺伝子をオフにできることにより、遺伝子治療の処置の安全性が高まる。
異なるアプタマーを複数のリボスイッチで使用して、異なるリガンドに標的遺伝子の発現を上方制御または下方制御させることができる。特定の実施形態では、調節カセットを含有する各治療遺伝子は、特定の小分子により活性化される特定のアプタマーをカセット内に有する。これは、各治療遺伝子が、その内部に収容されたアプタマーに特異的なリガンドによってのみ活性化され得ることを意味する。これらの実施形態では、各リガンドは、１つの治療遺伝子を活性化するだけである。これにより、いくつかの異なる「標的遺伝子」を一個体に送達できる可能性が許容され、各標的遺伝子は、各々に収容された調節カセット内に含有されたアプタマーに対する特定リガンドの送達時に活性化される。
リボスイッチとの関連において本明細書に開示されるアプタマーは、活性化リガンドが送達された際に、遺伝子が身体に送達され得る任意の治療用タンパク質（エリスロポエチン（ＥＰＯ）または治療用抗体等）を身体に産生させることを可能にする。この治療用タンパク質送達方法は、後で注射または注入される、体外でのそのような治療用タンパク質（例えば、がんで、または炎症性疾患もしくは自己免疫性疾患を阻害するために使用される抗体）の製造に取って代わることができる。調節された標的遺伝子を含有する身体は、遺伝子特異的リガンドが投与されるとスイッチがオンになる生物製剤製造工場となる。
一実施形態では、標的タンパク質は、特定のＤＮＡ配列を標的とし、かつ編集することができるヌクレアーゼであってよい。そのようなヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９、ジンクフィンガー含有ヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮが挙げられる。これらのヌクレアーゼの場合、ヌクレアーゼタンパク質は、標的内在性遺伝子を編集するのに十分である短期間しか必要とされない場合がある。しかしながら、調節されないヌクレアーゼ遺伝子が身体に送達された場合、このタンパク質が細胞の残りの寿命の間存在し得る。ヌクレアーゼの場合、ヌクレアーゼが長く存在するほど、オフターゲット編集のリスクが高くなる。そのようなタンパク質の発現の調節には、安全面での大きな利点がある。この場合、調節カセットを含有するヌクレアーゼ標的遺伝子を含有するベクターが、体内の適切な細胞に送達され得るであろう。標的遺伝子は、カセット特異的リガンドの非存在下では「オフ」状態にあるので、ヌクレアーゼは何も産生されない。活性化リガンドが投与された場合にのみ、ヌクレアーゼが産生される。十分な編集が行われるだけの十分な時間が経過すると、リガンドは取り除かれ、再び投与されることはない。したがって、ヌクレアーゼ遺伝子はその後「オフ」状態になり、それ以上のヌクレアーゼは産生されず、編集は停止する。この手法は、ＣＥＰ２９０の変異によって引き起こされるＬＣＡ１０、及びＡＢＣＡ４の変異によって引き起こされるシュタルガルト病等の、多くの遺伝性網膜症を含め、遺伝的状態を修正するために使用され得る。
特定のリガンド投与時のみ活性化される、治療用タンパク質をコードする調節された標的遺伝子の投与は、例えば、治療用抗体によるがん、免疫調節性タンパク質もしくは抗体による免疫障害、調節された遺伝子としての抗Ｃ５抗体もしくは抗体断片による代謝性疾患、ＰＮＨ等の希少疾患、または治療用抗体による眼血管新生、及び免疫調節性タンパク質による萎縮型ＡＭＤ等、多くの異なる種類の疾患を治療するための治療遺伝子を調節するために使用されてよい。
多種多様な特定の疾患及び状態の治療を可能にする多種多様な特定の標的遺伝子は、本明細書に記載されるアプタマー／リガンドを使用して発現が調節され得る標的遺伝子としての使用に好適である。例えば、インスリンまたはインスリン類似体（好ましくはヒトインスリンまたはヒトインスリンの類似体）を標的遺伝子として使用して、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはメタボリックシンドロームを治療してよく、ヒト成長ホルモンを標的遺伝子として使用して、成長障害を有する小児または成長ホルモン分泌不全の成人を治療してよく、エリスロポエチン（好ましくはヒトエリスロポエチン）を標的遺伝子として使用して、慢性腎臓病による貧血、骨髄異形成による貧血、またはがん化学療法による貧血を治療してよい。本明細書に開示されるアプタマー及び遺伝子発現カセットに適合する追加の標的遺伝子としては、色盲の治療のための環状ヌクレオチド依存性カチオンチャネルアルファ－３（ＣＮＧＡ３）及び環状ヌクレオチド依存性カチオンチャネルベータ－３（ＣＮＧＢ３）、網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障の治療のためのレチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、Ｘ連鎖性網膜色素変性症の治療のためのＸ連鎖性網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＰＧＲ）、パーキンソン病の治療等のためのグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症の治療のためのナンセンス転写産物調節因子１（ＵＰＦ１）、及び放射線誘発性口内乾燥症及びシェーグレン症候群の治療のためのアクアポリンが挙げられるが、これらに限定されない。追加の標的遺伝子としては、ＡｒｃｈＴ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ株ＴＰ００９からのアーキロドプシン）、Ｊａｗｓ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓａｌｉｎａｒｕｍ（Ｓｈａｒｋ株）由来のクラックスハロロドプシン）、ｉＣ１Ｃ２（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉからのチャネルロドプシンＣｈＲ１とＣｈＲ２間のキメラＣ１Ｃ２のバリアント）、または光伝達カスケードの非活性化を仲介するＧＴＰａｓｅ複合体の重要な構成成分であるＲｇｓ９－アンカー型タンパク質（Ｒ９ＡＰ）が挙げられる。
本明細書に開示されるアプタマーを含む発現コンストラクトは特に、嚢胞性線維症、血友病、筋ジストロフィー、サラセミア、または鎌状赤血球貧血症等の単一遺伝子欠損によって生じる疾患の治療に好適であり得る。したがって、ヒトβ－、γ－、δ－、またはζ－グロビンを標的遺伝子として使用して、β－サラセミアまたは鎌状赤血球貧血症を治療してよく、ヒト第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を標的遺伝子として使用して、血友病Ａまたは血友病Ｂを治療してよい。
本明細書に記載の小分子は一般に、患者への投与に好適な医薬組成物を形成するために１つ以上の薬学的に許容される担体と組み合わせられる。薬学的に許容される担体としては、一般に製薬分野で使用される溶媒、結合剤、希釈剤、崩壊剤、滑沢剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が挙げられる。医薬組成物は、錠剤、ピル、カプセル、トローチ等の形態であってよく、それらが意図される投与経路に適合するよう製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、経口、吸入、経皮（局所的）、経粘膜が挙げられる。
チアミンの類似体または誘導体を含む医薬組成物は、標的遺伝子を望ましく調節するのに十分な量のチアミンの類似体または誘導体が患者に送達されるような投与スケジュールで患者に投与される。剤形が、錠剤、ピル等である場合、好ましくは、医薬組成物は、０．１ｍｇ～１０ｇのチアミンの類似体もしくは誘導体、０．５ｍｇ～５ｇのチアミンの類似体もしくは誘導体、１ｍｇ～１ｇのチアミンの類似体もしくは誘導体、２ｍｇ～７５０ｍｇのチアミンの類似体もしくは誘導体、５ｍｇ～５００ｍｇのチアミンの類似体もしくは誘導体、１０ｍｇ～２５０ｍｇのチアミンの類似体もしくは誘導体、または１５０ｍｇ～３００ｍｇのチアミンの類似体もしくは誘導体を含む。
医薬組成物は、１日１回または１日複数回（例えば、１日に２回、３回、４回、５回、またはそれ以上の回数）投与してよい。別法として、医薬組成物は、１日１回よりも低頻度で、例えば、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、もしくは１４日ごとに１回、または月１回もしくは数か月ごとに１回で投与してよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少ない回数だけ、例えば、１回、２回、３回等だけ患者に投与してよい。
本明細書では、標的遺伝子によってコードされる治療用タンパク質の発現増加を必要とする患者を治療する方法を提供し、かかる方法は、本明細書に開示されるアプタマーが結合するか、そうでなければ応答する対象である、リガンドを含む医薬組成物を患者に投与することを含み、ここで、患者は、標的遺伝子を含む組換えＤＮＡを以前に投与されており、標的遺伝子は、アプタマーのリガンドによって標的遺伝子の発現を調節する能力を提供する、本明細書に開示される遺伝子調節カセットを含有する。本明細書では、標的遺伝子によってコードされる治療用タンパク質の発現増加を必要とする患者を治療する方法に使用するための、本明細書に開示されるアプタマーが結合するか、そうでなければ応答する対象である、リガンドを含む医薬組成物を提供し、ここで、患者は、標的遺伝子を含む組換えＤＮＡを以前に投与されており、標的遺伝子は、アプタマーのリガンドによって標的遺伝子の発現を調節する能力を提供する、本明細書に開示される遺伝子調節カセットを含有する。
検出及び／または診断での使用のためのアプタマー
キメラまたは物理的なコンジュゲーションを介して、広範囲な検出薬及び診断用薬をアプタマーに連結することができる。さらに、アプタマーを、バイオセンサー、マイクロ流体デバイス及び他の検出用プラットフォームに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、アプタマーを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）及び他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び他のポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコースが含まれるがこれらに限定されない、ポリアルキレングリコール部分に結合させる。
いくつかの実施形態では、アプタマーを、蛍光部分またはラベル、造影剤、放射性同位体部分、放射線不透過性部分等が含まれるがこれらに限定されない検出可能部分、例えば、ビオチン、フルオロフォア、発色団、スピン共鳴プローブ、ナノ粒子（金、磁性、及び超常磁性ナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない）、量子ドット、放射能標識体等の検出可能な標識に結合させる。例示的フルオロフォアとしては、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、ローダミン等）及び他の発光分子（例えば、管腔）が挙げられる。フルオロフォアは、環境感受性である場合があり、基質との結合時に構造変化を受ける改変タンパク質の１つ以上の残基の近くに位置する場合、その蛍光が変化する（例えば、ダンシルプローブ）。例示的放射能標識体としては、１つ以上の低感受性核を有する原子を含有する小分子が挙げられる（１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ等）。他の有用な部分は、当該技術分野で公知である。
いくつかの実施形態では、アプタマーを、抗炎症剤、抗がん剤、抗神経変性剤、抗感染剤、または一般的に治療剤が含まれるがこれらに限定されない、治療用部分に結合させる。
化合物に結合するアプタマーを同定するための方法
本明細書では、目的化合物（チアミン類似体、ＴＰＰ類似体、またはそれらの誘導体が含まれる小分子）に結合するか、そうでなければその目的化合物の付加、もしくはそれに対する曝露に応答して、リボスイッチの一部である場合の標的遺伝子発現を調節する、アプタマーを同定するための方法を開示する。一実施形態では、方法は、
（ｉ）親アプタマー配列を選択するステップ、
（ｉｉ）（ｉ）で選択されたアプタマーをコードする配列を含むアプタマーライブラリーを生成するステップであって、アプタマーコード配列中の１つ以上のヌクレオチドを、アプタマー中の１つ以上の不対領域に対応する１つ以上の位置でランダムに変異させ、変異アプタマー配列が、レポーター遺伝子の発現を制御するリボスイッチとの関連にある、アプタマーライブラリーを生成するステップ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からのライブラリーを、チアミン類似体に応答した標的遺伝子発現の調節が親アプタマー配列と比較して増大している（例えば、誘導または抑制の倍率がより高い）アプタマーについてスクリーニングするステップ、
（ｉｖ）ステップ（ｉ）で選択されたアプタマーではなくステップ（ｉｉｉ）で同定されたアプタマーでステップ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を任意選択で繰り返すステップ、を含む。
親アプタマー配列は、既知のＴＰＰアプタマー配列等のＴＰＰアプタマーであっても、または利用可能なデータベースで相同配列の検索によって同定される推定ＴＰＰアプタマーであってもよい。親アプタマー配列は、本明細書に開示されるアプタマー配列であってよい。
親アプタマー配列を選択するステップでは、例えば、（ｉ）推定ＴＰＰアプタマーを同定すること、（ｉｉ）標的遺伝子（例えば、レポーター遺伝子）の発現を調節するリボスイッチ内にアプタマーを挿入すること、及び（ｉｉｉ）、リボスイッチ／標的遺伝子コンストラクトを、チアミンまたはＴＰＰの類似体もしくは誘導体（例えば、本明細書に記載される化合物）に曝露すること、を伴い得る。
推定ＴＰＰアプタマーは、ＲＮＡファミリーのコレクションである、それぞれが多重配列アラインメント、コンセンサス二次構造及び共分散モデル（ＣＭ）により表されているＲｆａｍデータベース等の、適切な配列データベースから同定することができる。実施形態では、推定ＴＰＰアプタマーは、Ｒｆａｍ ＴＰＰリボスイッチファミリーＲＦ０００５９から同定される。実施形態では、推定ＴＰＰアプタマーは、配列番号９４または配列番号９５（それぞれ、ステムを有するｔｈｉＣアプタマーまたはｔｈｉＭアプタマー）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％少なくとも９８％または少なくとも９９％同一な配列を有する。
配列番号９４：
ＧＵＡＡＵＧＵＧＵＣＧＧＡＧＵＧＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＵＵＣＣＣＣＵＡＡＡＧＣＵＧＡＧＡＣＣＧＣＡＵＵＧＣＧＧＧＡＵＣＣＧＵＵＧＡＡＣＣＵＧＡＵＣＡＧＧＣＵＡＡＵＡＣＣＵＧＣＧＡＡＧＧＧＡＡＣＡＣＡＵＵＡＣ
配列番号９５：
ＧＵＡＡＵＧＵＣＵＣＧＧＧＧＵＧＣＣＣＵＵＣＵＧＣＧＵＧＡＡＧＧＣＵＧＡＧＡＡＡＵＡＣＣＣＧＵＡＵＣＡＣＣＵＧＡＵＣＵＧＧＡＵＡＡＵＧＣＣＡＧＣＧＵＡＧＧＧＡＡＧＡＣＡＵＵＡＣ
推定ＴＰＰアプタマーは、当業者に既知の技術を使用してリボスイッチ内に挿入することができる。ＴＰＰ及び１つ以上のチアミンまたはＴＰＰの類似体もしくは誘導体（例えば、本明細書に記載される化合物）の存在に対するアプタマーの反応性は、細胞培養及び／または無細胞系で試験することができる。特に、細胞培養系は、真核細胞培養であり、例えば、哺乳類、植物、または昆虫の細胞培養が含まれる。
チアミンまたはＴＰＰの類似体もしくは誘導体（例えば、本明細書に記載される化合物）に応答するアプタマーを同定するために、アプタマーをコードする配列（すなわち、親アプタマー）の１つ以上のヌクレオチド位置をランダム化する。ランダム化のためのヌクレオチド位置は、親アプタマー配列の構造に基づいて選択することができる。予測される二次構造は、ＲＮＡｆｏｌｄ（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＲＮＡＷｅｂＳｕｉｔｅ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉ）等の利用可能なプログラムを使用すること、及び／または関連アプタマーの結晶構造との比較によって（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｈｉＭリボスイッチ、Ｅｄｗａｒｄｓ，ＴＥ ＆ Ｆｅｒｒｅ－Ｄ’Ａｍａｒｅ，ＡＲ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２００６ Ｓｅｐ；１４（９）：１４５９－６８）取得することができる。例えば、ループ（Ｌ）領域（例えば、Ｌ３及び／またはＬ５）、及び連結（Ｊ）領域（例えば、Ｊ３－２（対領域Ｐ３とＰ２を連結）、Ｊ２－４、及び／またはＪ４－５）等のアプタマーの不対領域を同定することができ、１つ以上の不対領域の１つ以上のヌクレオチドをランダム化して、アプタマーのライブラリーを生成することができる。実施形態では、１つ以上の不対領域に隣接する１つ以上のヌクレオチドがランダム化される。さらに、対（Ｐ）領域の１つ以上のヌクレオチドをランダム化することができる。さらに、不対領域または対領域の１つ以上のヌクレオチドを付加または除去することができる。変異誘発されたアプタマー配列は、リボスイッチとの関連においてアプタマー配列のライブラリーとして提供され得る。実施形態では、アプタマーライブラリーは、本明細書に開示される遺伝子発現カセットの一部としてリボスイッチとの関連において提供される。
１つ以上の変異を含有するアプタマーコード配列は、ＴＰＰもしくは１つ以上のチアミンまたはＴＰＰの類似体もしくは誘導体の存在に対する反応性について上記のように試験することができる。実施形態では、１つ以上の変異を含有するアプタマーは、類似体または誘導体に対して応答性であるが、それが由来する親アプタマーよりも、（同じリボスイッチ／遺伝子発現カセットとの関連において）チアミン及び／またはＴＰＰに対する反応性が低下している。
所望の化合物に対して応答性であるアプタマーは、ヌクレオチドをランダム化することによってさらに変異誘発させることができる。選択された位置、例えば、不対領域におけるヌクレオチドをランダム化して、上記のようにライブラリーを作製することができる。
いくつかの実施形態では、目的化合物は、アセフルチアミン、アセチアミン、アリチアミン、アンプロリウム、ベクロチアミン、ベンフォチアミン、ベンチアミン、ビスベンチアミン、セトチアミン、シコチアミン、フルスルチアミン、モノホスホチアミン、オクトチアミン、オキシチアミン、プロスルチアミン、スルブチアミン、またはビンチアモール等のチアミン類似体である。実施形態では、チアミンまたはＴＰＰの類似体は式Ｉ～ＶＩＩＩの化合物であり、これには化合物Ｍ１０～Ｍ９９が含まれるが、これらに限定されない。実施形態では、チアミンまたはＴＰＰの類似体は、Ｍ１０、Ｍ１６、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２１、Ｍ２６、Ｍ２７、Ｍ２８、Ｍ２９、Ｍ３０、Ｍ３１、Ｍ３２、Ｍ３３、及びＭ３４のうちの１つである。
本明細書で開示される方法で使用されるレポーター遺伝子によってコードされるレポータータンパク質は、酵素活性または分光光度特性等のレポータータンパク質の特性を検出することによりアッセイするか、または抗体ベースのアッセイの場合のように間接的にアッセイすることができるタンパク質である。容易に検出可能なレポーター遺伝子産物の例としては、ピューロマイシン耐性マーカー（ｐａｃ）、３－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、オロチジン５’－リン酸脱炭酸酵素（ＵＲＡ３）、アルギニンパーミアーゼＣＡＮ１、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能シグナルの他の例としては、細胞表面マーカーが挙げられ、例えば、ＣＤ４が挙げられるが、これに限定されない。本明細書に開示されるアプタマーを同定するための方法での使用に好適なレポーター遺伝子にはまた、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びその誘導体）、または蛍光タグに融合させたタンパク質も含まれる。蛍光タグ及びタンパク質の例としては、（３－Ｆ）Ｔｙｒ－ＥＧＦＰ、Ａ４４－ＫＲ、ａａｃｕＧＦＰ１、ａａｃｕＧＦＰ２、ａｃｅＧＦＰ、ａｃｅＧＦＰ－Ｇ２２２Ｅ－Ｙ２２０Ｌ、ａｃｅＧＦＰ－ｈ、ＡｃＧＦＰ１、ＡｄＲｅｄ、ＡｄＲｅｄ－Ｃ１４８Ｓ、ａｅｕｒＧＦＰ、ａｆｒａＧＦＰ、ａｌａｊＧＦＰ１、ａｌａｊＧＦＰ２、ａｌａｊＧＦＰ３、ａｍＣｙａｎ１、ａｍＦＰ４８６、ａｍＦＰ４９５、ａｍＦＰ５０６、ａｍＦＰ５１５、ａｍｉｌＦＰ４８４、ａｍｉｌＦＰ４９０、ａｍｉｌＦＰ４９７、ａｍｉｌＦＰ５０４、ａｍｉｌＦＰ５１２、ａｍｉｌＦＰ５１３、ａｍｉｌＦＰ５９３、ａｍｉｌＦＰ５９７、ａｎｍ１ＧＦＰ１、ａｎｍ１ＧＦＰ２、ａｎｍ２ＣＰ、ａｎｏｂＣＦＰ１、ａｎｏｂＣＦＰ２、ａｎｏｂＧＦＰ、ａｐｕｌＦＰ４８３、ＡＱ１４、ＡＱ１４３、Ａｑｕａｍａｒｉｎｅ、ａｓＣＰ５６２、ａｓＦＰ４９９、ＡｓＲｅｄ２、ａｓｕｌＣＰ、ａｔｅｎＦＰ、ａｖＧＦＰ、ａｖＧＦＰ４５４、ａｖＧＦＰ４８０、ａｖＧＦＰ５０９、ａｖＧＦＰ５１０、ａｖＧＦＰ５１４、ａｖＧＦＰ５２３、ＡｚａｍｉＧｒｅｅｎ、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＢＤＦＰ１．６、ｂｆｌｏＧＦＰａ１、ｂｆｌｏＧＦＰｃ１、ＢＦＰ、ＢＦＰ．Ａ５、ＢＦＰ５、ｂｓＤｒｏｎｐａ（Ｏｎ）、ｃｃａｌＧＦＰ１、ｃｃａｌＧＦＰ３、ｃｃａｌＯＦＰ１、ｃｃａｌＲＦＰ１、ｃｃａｌＹＦＰ１、ｃＥＧＦＰ、ｃｅｒＦＰ５０５、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣＦＰ、ｃＦＰ４８４、ｃｆＳＧＦＰ２、ｃｇｆｍＫａｔｅ２、ＣＧＦＰ、ｃｇｆＴａｇＲＦＰ、ｃｇｉｇＧＦＰ、ｃｇｒｅＧＦＰ、ＣｈｅＧＦＰ１、ＣｈｅＧＦＰ２、ＣｈｅＧＦＰ４、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｃｉｔｒｉｎｅ２、Ｃｌｏｍｅｌｅｏｎ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｃｐ－ｍＫａｔｅ、ｃｐＣｉｔｒｉｎｅ、ｃｐＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ１７４－１７３、ＣｙＯＦＰ１、ＣｙＰｅｔ、ＣｙＲＦＰ１（ＣｙＲＦＰ１）、ｄ－ＲＦＰ６１８、Ｄ１０、ｄ１ＥｏｓＦＰ（緑）、ｄ１ＥｏｓＦＰ（赤）、ｄ２ＥｏｓＦＰ（緑）、ｄ２ＥｏｓＦＰ（赤）、ｄｅＧＦＰ１、ｄｅＧＦＰ２、ｄｅＧＦＰ３、ｄｅＧＦＰ４、ｄｅｎｄＦＰ（緑）、ｄｅｎｄＦＰ（赤）、Ｄｅｎｄｒａ（緑）、Ｄｅｎｄｒａ（赤）、Ｄｅｎｄｒａ２（緑）、Ｄｅｎｄｒａ２（赤）、Ｄｅｎｄｒａ２－Ｍ１５９Ａ（緑）、Ｄｅｎｄｒａ２－Ｍ１５９Ａ（オレンジ）、Ｄｅｎｄｒａ２－Ｔ６９Ａ（緑）、Ｄｅｎｄｒａ２－Ｔ６９Ａ（オレンジ）、ｄｆＧＦＰ、ｄｉｍｅｒ１、ｄｉｍｅｒ２、ｄｉｓ２ＲＦＰ、ｄｉｓ３ＧＦＰ、ｄＫｅｉｍａ、ｄＫｅｉｍａ５７０、ｄＬａｎＹＦＰ、ＤｒＣＢＤ、Ｄｒｅｉｋｌａｎｇ（Ｏｎ）、Ｄｒｏｎｐａ（Ｏｎ）、Ｄｒｏｎｐａ－２（Ｏｎ）、Ｄｒｏｎｐａ－３（Ｏｎ）、ｄｓＦＰ４８３、ＤｓｐＲ１、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍａｘ、ＤｓＲｅｄ．Ｍ１、ＤｓＲｅｄ．Ｔ３、ＤｓＲｅｄ．Ｔ４、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓｔＣ１、ｄＴＦＰ０．１、ｄＴＦＰ０．２、ｄＴＧ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＶＦＰ、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、Ｅ２－Ｏｒａｎｇｅ、Ｅ２－Ｒｅｄ／Ｇｒｅｅｎ、ＥａＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ１．２、ＥＢＦＰ１．５、ＥＢＦＰ２、ＥＣＦＰ、ＥＣＦＰＨ１４８Ｄ、ＥＣＧＦＰ、ｅｅｃｈＧＦＰ１、ｅｅｃｈＧＦＰ２、ｅｅｃｈＧＦＰ３、ｅｅｃｈＲＦＰ、ｅｆａｓＣＦＰ、ｅｆａｓＧＦＰ、ｅｆｏｒＣＰ、ＥＧＦＰ、ｅＧＦＰ２０３Ｃ、ｅＧＦＰ２０５Ｃ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｙａｎ－Ｅｍｉｔｔｉｎｇ ＧＦＰ、ＥｏｓＦＰ（緑）、ＥｏｓＦＰ（赤）、ｅｑＦＰ５７８、ｅｑＦＰ６１１、ｅｑＦＰ６１１Ｖ１２４Ｔ、ｅｑＦＰ６５０、ｅｑＦＰ６７０、ＥＹＦＰ、ＥＹＦＰ－Ｑ６９Ｋ、ｆａｂｄＧＦＰ、ｆｆＤｒｏｎｐａ（Ｏｎ）、ＦｏｌｄｉｎｇＲｅｐｏｒｔｅｒＧＦＰ、ＦＰ５８６、ＦＰｒｆｌ２．３、ＦＲ－１、ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ、ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ－Ｍ、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇａｍｉｌｌｕｓ（Ｏｎ）、Ｇａｍｉｌｌｕｓ０．１、Ｇａｍｉｌｌｕｓ０．２、Ｇａｍｉｌｌｕｓ０．３、Ｇａｍｉｌｌｕｓ０．４、ＧＣａＭＰ２、ｇｆａｓＧＦＰ、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、ＧＦＰ－１５１ｐｙＴｙｒＣｕ、ＧＦＰ－Ｔｙｒ１５１ｐｙｚ、ＧＦＰｍｕｔ２、ＧＦＰｍｕｔ３、ＧＦＰｘｍ１６、ＧＦＰｘｍ１６１、ＧＦＰｘｍ１６２、ＧＦＰｘｍ１６３、ＧＦＰｘｍ１８、ＧＦＰｘｍ１８１ｕｖ、ＧＦＰｘｍ１８ｕｖ、ＧＦＰｘｍ１９、ＧＦＰｘｍ１９１ｕｖ、ＧＦＰｘｍ１９ｕｖ、Ｈ９、ＨｃＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ７、ｈｃｒｉＧＦＰ、ｈｍＧＦＰ、ＨｒｉＣＦＰ、ＨｒｉＧＦＰ、ｉＦＰ１．４、ｉＦＰ２．０、ｉＬｏｖ、ｉｑ－ＥＢＦＰ２、ｉｑ－ｍＡｐｐｌｅ、ｉｑ－ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３、ｉｑ－ｍＥｍｅｒａｌｄ、ｉｑ－ｍＫａｔｅ２、ｉｑ－ｍＶｅｎｕｓ、ｉＲＦＰ６７０、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ７１３、ｉＲＦＰ７２０、ＩｒｉｓＦＰ（緑）、ＩｒｉｓＦＰ（オレンジ）、ＩｒｉｓＦＰ－Ｍ１５９Ａ（緑）、Ｊｒｅｄ、Ｋａｅｄｅ（緑）、Ｋａｅｄｅ（赤）、Ｋａｔｕｓｈｋａ、Ｋａｔｕｓｈｋａ－９－５、Ｋａｔｕｓｈｋａ２Ｓ、ＫＣＹ、ＫＣＹ－Ｇ４２１９、ＫＣＹ－Ｇ４２１９－３８Ｌ、ＫＣＹ－Ｒ１、ＫＣＹ－Ｒ１－１５８Ａ、ＫＣＹ－Ｒ１－３８Ｈ、ＫＣＹ－Ｒ１－３８Ｌ、ＫＦＰ１（Ｏｎ）、ＫｉｋＧＲ１（緑）、ＫｉｋＧＲ１（赤）、ＫｉｌｌｅｒＯｒａｎｇｅ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ＫＯ、Ｋｏｈｉｎｏｏｒ（Ｏｎ）、ｌａｅｓＧＦＰ、ｌａＧＦＰ、ＬａｎＦＰ１、ＬａｎＦＰ２、ｌａｎＲＦＰ－ΔＳ８３ｌ、ＬａｎＹＦＰ、ｌａＲＦＰ、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ１、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ２、ＬＳＳｍＯｒａｎｇｅ、Ｍ３５５ＮＡ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ｍＡｐｐｌｅ、Ｍａｒｏｏｎ０．１、ｍＡｚａｍｉＧｒｅｅｎ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＢｅＲＦＰ、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ１、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ２、ｍｃ１、ｍｃ２、ｍｃ３、ｍｃ４、ｍｃ５、ｍｃ６、ＭｃａＧ１、ＭｃａＧ１ｅａ、ＭｃａＧ２、ｍＣａｒｄｉｎａｌ、ｍＣａｒｍｉｎｅ、ｍｃａｖＦＰ、ｍｃａｖＧＦＰ、ｍｃａｖＲＦＰ、ｍｃＣＦＰ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ．Ｂ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ．Ｂ２、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ．Ｂ２４、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ２、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ２．Ｄ３、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ２．Ｎ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ２．Ｎ（Ｔ６５Ｓ）、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ２、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｌａｖＧＲ２（緑）、ｍＣｌａｖＧＲ２（赤）、ｍＣｌｏｖｅｒ３、ｍＣｙＲＦＰ１、ｍＥＣＦＰ、ｍｅｆｆＣＦＰ、ｍｅｆｆＧＦＰ、ｍｅｆｆＲＦＰ、ｍＥＧＦＰ、ｍｅｌｅＣＦＰ、ｍｅｌｅＲＦＰ、ｍＥｍｅｒａｌｄ、ｍＥｏｓ２（緑）、ｍＥｏｓ２（赤）、ｍＥｏｓ２－Ａ６９Ｔ（緑）、ｍＥｏｓ２－Ａ６９Ｔ（オレンジ）、ｍＥｏｓ３．１（緑）、ｍＥｏｓ３．１（赤）、ｍＥｏｓ３．２（緑）、ｍＥｏｓ３．２（赤）、ｍＥｏｓ４ａ（緑）、ｍＥｏｓ４ａ（赤）、ｍＥｏｓ４ｂ（緑）、ｍＥｏｓ４ｂ（赤）、ｍＥｏｓＦＰ（緑）、ｍＥｏｓＦＰ（赤）、ｍＥｏｓＦＰ－Ｆ１７３Ｓ（緑）、ｍＥｏｓＦＰ－Ｆ１７３Ｓ（赤）、ｍＥｏｓＦＰ－Ｍ１５９Ａ（緑）、ｍＥＹＦＰ、ＭｆａＧ１、ｍＧａｒｎｅｔ、ｍＧａｒｎｅｔ２、ｍＧｅｏｓ－Ｃ（Ｏｎ）、ｍＧｅｏｓ－Ｅ（Ｏｎ）、ｍＧｅｏｓ－Ｆ（Ｏｎ）、ｍＧｅｏｓ－Ｌ（Ｏｎ）、ｍＧｅｏｓ－Ｍ（Ｏｎ）、ｍＧｅｏｓ－Ｓ（Ｏｎ）、ｍＧｉｎｇｅｒ１、ｍＧｉｎｇｅｒ２、ｍＧｒａｐｅ１、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＧｒａｐｅ３、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ＭｉＣｙ、ｍＩＦＰ、ｍｉｎｉＳＯＧ、ｍｉｎｉＳＯＧＱ１０３Ｖ、ｍｉｎｉＳＯＧ２、ｍｉＲＦＰ、ｍｉＲＦＰ６７０、ｍｉＲＦＰ６７０ｎａｎｏ、ｍｉＲＦＰ６７０ｖ１、ｍｉＲＦＰ７０３、ｍｉＲＦＰ７０９、ｍｉＲＦＰ７２０、ｍＩｒｉｓＦＰ（緑）、ｍＩｒｉｓＦＰ（赤）、ｍＫ－ＧＯ（初期）、ｍＫ－ＧＯ（後期）、ｍＫａｌａｍａ１、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅＭ４１ＧＳ１５８Ｃ、ｍＫａｔｅＳ１５８Ａ、ｍＫａｔｅＳ１５８Ｃ、ｍＫａｔｅ２、ｍＫｅｉｍａ、ｍＫｅｌｌｙ１、ｍＫｅｌｌｙ２、ｍＫＧ、ｍＫｉｋＧＲ（緑）、ｍＫｉｋＧＲ（赤）、ｍＫｉｌｌｅｒＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＫＯ２、ｍＫＯκ、ｍＬｕｍｉｎ、ｍＭａｐｌｅ（緑）、ｍＭａｐｌｅ（赤）、ｍＭａｐｌｅ２（緑）、ｍＭａｐｌｅ２（赤）、ｍＭａｐｌｅ３（緑）、ｍＭａｐｌｅ３（赤）、ｍＭａｒｏｏｎ１、ｍｍＧＦＰ、ｍＭｉＣｙ、ｍｍｉｌＣＦＰ、ｍＮｅｃｔａｒｉｎｅ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ２．５、ｍＮｅｐｔｕｎｅ６８１、ｍＮｅｐｔｕｎｅ６８４、Ｍｏｎｔｉｐｏｒａｓｐ．＃２０－９１１５、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍｏｘＢＦＰ、ｍｏｘＣｅｒｕｌｅａｎ３、ｍｏｘＤｅｎｄｒａ２（緑）、ｍｏｘＤｅｎｄｒａ２（赤）、ｍｏｘＧＦＰ、ｍｏｘＭａｐｌｅ３（緑）、ｍｏｘＭａｐｌｅ３（赤）、ｍｏｘＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍｏｘＶｅｎｕｓ、ｍＰａｐａｙａ、ｍＰａｐａｙａ０．７、ｍＰｌｕｍ、ｍＰｌｕｍ－Ｅ１６Ｐ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＲｅｄ７、ｍＲｅｄ７Ｑ１、ｍＲｅｄ７Ｑ１Ｓ１、ｍＲｅｄ７Ｑ１Ｓ１ＢＭ、ｍＲＦＰ１、ｍＲＦＰ１－Ｑ６６Ｃ、ｍＲＦＰ１－Ｑ６６Ｓ、ｍＲＦＰ１－Ｑ６６Ｔ、ｍＲＦＰ１．１、ｍＲＦＰ１．２、ｍＲｏｊｏＡ、ｍＲｏｊｏＢ、ｍＲｏｕｇｅ、ｍＲｔｍｓ５、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２、ｍＲｕｂｙ３、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ｍＳｃａｒｌｅｔ－Ｈ、ｍＳｃａｒｌｅｔ－Ｉ、ｍＳｔａｂｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ｍＴａｇＢＦＰ２、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＴＦＰ０．３、ｍＴＦＰ０．７（Ｏｎ）、ｍＴＦＰ１、ｍＴＦＰ１－Ｙ６７Ｗ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ｍｕＧＦＰ、ｍＵｋＧ、ｍＶｅｎｕｓ、ｍＶｅｎｕｓ－Ｑ６９Ｍ、ｍＶＦＰ、ｍＶＦＰ１、ｍＷａｓａｂｉ、Ｎｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｊｉＦＰ（緑）、ＮｉｊｉＦＰ（オレンジ）、ＮｏｗＧＦＰ、ｏｂｅＣＦＰ、ｏｂｅＧＦＰ、ｏｂｅＹＦＰ、ＯＦＰ、ＯＦＰｘｍ、ｏｘＢＦＰ、ｏｘＣｅｒｕｌｅａｎ、ｏｘＧＦＰ、ｏｘＶｅｎｕｓ、Ｐ１１、Ｐ４、Ｐ４－１、Ｐ４－３Ｅ、Ｐ９、ＰＡ－ＧＦＰ（Ｏｎ）、Ｐａｄｒｏｎ（Ｏｎ）、Ｐａｄｒｏｎ（ｓｔａｒ）（Ｏｎ）、Ｐａｄｒｏｎ０．９（Ｏｎ）、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１（Ｏｎ）、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ２（Ｏｎ）、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ３（Ｏｎ）、ＰＡｍＫａｔｅ（Ｏｎ）、ＰＡＴａｇＲＦＰ（Ｏｎ）、ＰＡＴａｇＲＦＰ１２９７（Ｏｎ）、ＰＡＴａｇＲＦＰ１３１４（Ｏｎ）、ｐｃＤｒｏｎｐａ（緑）、ｐｃＤｒｏｎｐａ（赤）、ｐｃＤｒｏｎｐａ２（緑）、ｐｃＤｒｏｎｐａ２（赤）、ＰｄａＣ１、ｐｄａｅ１ＧＦＰ、ｐｈｉＹＦＰ、ｐｈｉＹＦＰｖ、ｐＨｌｕｏｒｉｎ、ｅｃｌｉｐｔｉｃ、ｐＨｌｕｏｒｉｎ、ｅｃｌｉｐｔｉｃ（酸性）、ｐＨｌｕｏｒｉｎ、ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ（酸性）、ｐＨｌｕｏｒｉｎ、ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ（アルカリ性）、ｐＨｌｕｏｒｉｎ２（酸性）、ｐＨｌｕｏｒｉｎ２（アルカリ性）、ｐＨｕｊｉ、ＰｌａｍＧＦＰ、ｐｍｅａＧＦＰ１、ｐｍｅａＧＦＰ２、ｐｍｉｍＧＦＰ１、
ｐｍｉｍＧＦＰ２、Ｐｐ２ＦｂＦＰ、Ｐｐ２ＦｂＦＰＬ３０Ｍ、ｐｐｌｕＧＦＰ１、ｐｐｌｕＧＦＰ２、ｐｐｏｒＧＦＰ、ｐｐｏｒＲＦＰ、ＰＳ－ＣＦＰ（シアン）、ＰＳ－ＣＦＰ（緑）、ＰＳ－ＣＦＰ２（シアン）、ＰＳ－ＣＦＰ２（緑）、ｐｓａｍＣＦＰ、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ（Ｆａｒ－ｒｅｄ）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ（オレンジ）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ２（Ｆａｒ－ｒｅｄ）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ２（オレンジ）、ｐｔｉｌＧＦＰ、Ｒ３－２＋ＰＣＢ、ＲＣａＭＰ、ＲＤＳｍＣｈｅｒｒｙ０．１、ＲＤＳｍＣｈｅｒｒｙ０．２、ＲＤＳｍＣｈｅｒｒｙ０．５、ＲＤＳｍＣｈｅｒｒｙ１、ｒｆｌｏＧＦＰ、ｒｆｌｏＲＦＰ、ＲＦＰ６１１、ＲＦＰ６１８、ＲＦＰ６３０、ＲＦＰ６３７、ＲＦＰ６３９、ｒｏＧＦＰ１、ｒｏＧＦＰ１－Ｒ１、ｒｏＧＦＰ１－Ｒ８、ｒｏＧＦＰ２、ｒｒｅｎＧＦＰ、ＲＲｖＴ、ｒｓＣｈｅｒｒｙ（Ｏｎ）、ｒｓＣｈｅｒｒｙＲｅｖ（Ｏｎ）、ｒｓＣｈｅｒｒｙＲｅｖ１．４（Ｏｎ）、ｒｓＥＧＦＰ（Ｏｎ）、ｒｓＥＧＦＰ２（Ｏｎ）、ｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ（Ｏｎ）、ｒｓＦｏｌｄｅｒ（緑）、ｒｓＦｏｌｄｅｒ２（緑）、ｒｓＦｕｓｉｏｎＲｅｄ１（Ｏｎ）、ｒｓＦｕｓｉｏｎＲｅｄ２（Ｏｎ）、ｒｓＦｕｓｉｏｎＲｅｄ３（Ｏｎ）、ｒｓＴａｇＲＦＰ（ＯＮ）、Ｓａｎｄｅｒｃｙａｎｉｎ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ｓａｒｃＧＦＰ、ＳＢＦＰ１、ＳＢＦＰ２、ＳＣＦＰ１、ＳＣＦＰ２、ＳＣＦＰ３Ａ、ＳＣＦＰ３Ｂ、ｓｃｕｂＧＦＰ１、ｓｃｕｂＧＦＰ２、ｓｃｕｂＲＦＰ、ｓｅｃＢＦＰ２、ＳＥＹＦＰ、ｓｇ１１、ｓｇ１２、ｓｇ２５、ｓｇ４２、ｓｇ５０、ＳＧＦＰ１、ＳＧＦＰ２、ＳＧＦＰ２（２０６Ａ）、ＳＧＦＰ２（Ｅ２２２Ｑ）、ＳＧＦＰ２（Ｔ６５Ｇ）、ＳＨａｒｄｏｎｎａｙ、ｓｈＢＦＰ、ｓｈＢＦＰ－Ｎ１５８Ｓ／Ｌ１７３Ｉ、ＳｈＧ２４、Ｓｉｒｉｕｓ、ＳｉｒｉｕｓＧＦＰ、Ｓｋｙｌａｎ－ＮＳ（Ｏｎ）、Ｓｋｙｌａｎ－Ｓ（Ｏｎ）、ｓｍＵＲＦＰ、ＳＮＩＦＰ、ＳＯＰＰ、ＳＯＰＰ２、ＳＯＰＰ３、ＳＰＯＯＮ（ｏｎ）、ｓｔｙｌＧＦＰ、ＳｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒＧＦＰ、ＳｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ＳｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２ｏｘ、ＳｕｐｅｒＮｏｖａＧｒｅｅｎ、ＳｕｐｅｒＮｏｖａＲｅｄ、ＳＹＦＰ２、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＴａｇＢＦＰ、ＴａｇＣＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＴａｇＲＦＰ６７５、ＴａｇＹＦＰ、ｔｄ－ＲＦＰ６１１、ｔｄ－ＲＦＰ６３９、ｔｄｉｍｅｒ２（１２）、ｔｄＫａｔｕｓｈｋａ２、ＴＤｓｍＵＲＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｔＫｅｉｍａ、Ｔｏｐａｚ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ－Ｖ１９７Ｌ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ－ＧＬ、Ｕｌｔｒａｍａｒｉｎｅ、ＵｎａＧ、ｕｓＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＶＦＰ、ｖｓｆＧＦＰ－０、ｖｓｆＧＦＰ－９、Ｗ１Ｃ、Ｗ２、Ｗ７、ＷａｓＣＦＰ、Ｗｉ－Ｐｈｙ、ＹＰｅｔ、ｚＦＰ５３８、ｚｏａｎ２ＲＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、αＧＦＰ、１０Ｂ、２２Ｇ、５Ｂ、６Ｃ、Ａ１ａ、ａａｃｕＣＰ、ａｃａｎＦＰ、ａｈｙａＣＰ、ａｍｉｌＣＰ、ａｍｉｌＣＰ５８０、ａｍｉｌＣＰ５８６、ａｍｉｌＣＰ６０４、ａｐｕｌＣＰ５８４、ＢＦＰｓｏｌ、Ｂｌｕｅ１０２、ＣＦＰ４、ｃｇｉｇＣＰ、ＣｈｅＧＦＰ３、Ｃｌｏｖｅｒ１．５、ｃｐａｓＣＰ、Ｃｙ１１．５、ｄＣｌａｖＧＲ１．６、ｄＣｌｏｖｅｒ２、ｄＣｌｏｖｅｒ２Ａ２０６Ｋ、ｄｈｏｒＧＦＰ、ｄｈｏｒＲＦＰ、ｄＰａｐａｙａ０．１、Ｄｒｏｎｐａ－Ｃ６２Ｓ、ＤｓＲｅｄ－Ｔｉｍｅｒ、ｅｃｈＦＰ、ｅｃｈｉＦＰ、ＥＹＦＰ－Ｆ４６Ｌ、ｆｃＦＰ、ｆｃｏｍＦＰ、Ｆｐａａｇａｒ、Ｆｐａｇ＿ｆｒａｇ、Ｆｐｃｏｎｄｃｈｒｏｍ、ＦＰｍａｎｎ、ＦＰｍｃａｖｇｒ７．７、Ｇａｍｉｌｌｕｓ０．５、ｇｄｊｉＣＰ、ｇｆａｓＣＰ、ＧＦＰｈａｌ、ｇｔｅｎＣＰ、ｈｃｒｉＣＰ、ｈｆｒｉＦＰ、ＫｉｋＧ、ＬＥＡ、ｍｃＦＰ４９７、ｍｃＦＰ５０３、ｍｃＦＰ５０６、ｍＣｈｅｒｒｙ１．５、ｍＣｌａｖＧＲ１、ｍＣｌａｖＧＲ１．１、ｍＣｌａｖＧＲ１．８、ｍＣｌｏｖｅｒ１．５、ｍｃＲＦＰ、ｍｅｆｆＣＰ、ｍＥｏｓ２－ＮＡ、ｍｅｒｕＦＰ、ｍＫａｔｅ２．５、ｍＯＦＰ．Ｔ．１２、ｍＯＦＰ．Ｔ．８、ｍｏｎｔＦＰ、ｍｏｘＥｏｓ３．２、ｍＰＡ－ＧＦＰ、ｍＰａｐａｙａ０．３、ｍＰａｐａｙａ０．６、ｍＲＦＰ１．３、ｍＲＦＰ１．４、ｍＲＦＰ１．５、ｍＴＦＰ０．４、ｍＴＦＰ０．５、ｍＴＦＰ０．６、ｍＴＦＰ０．８、ｍＴＦＰ０．９、ｍＴＦＰ１－Ｙ６７Ｈ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ－１４６Ｇ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ－１４６Ｓ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ－ＤＲ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ－ＧＬ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ－ＧＶ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ－ＲＡ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２－Ｇ、ＮｐＲ３７８４ｇ、ＰＤＭ１－４、ｐｓｕｐＦＰ、Ｑ８０Ｒ、ｒｆｌｏＧＦＰ２、ＲｐＢｐｈＰ１、ＲｐＢｐｈＰ２、ＲｐＢｐｈＰ６、ｒｒＧＦＰ、ＲＳＧＦＰ１、ＲＳＧＦＰ２、ＲＳＧＦＰ３、ＲＳＧＦＰ４、ＲＳＧＦＰ６、ＲＳＧＦＰ７、Ｒｔｍｓ５、ｓｃｌｅＦＰ１、ｓｃｌｅＦＰ２、ｓｐｉｓＣＰ、ｓｔｙｌＣＰ、ｓｙｍｐＦＰ、ＴｅＡＰＣα、ｔＰａｐａｙａ０．０１、Ｔｒｐ－ｌｅｓｓＧＦＰ、ｖｓＧＦＰ、Ｘｐａ、ｙＥＧＦＰ、ＹＦＰ３、ｚＧＦＰ、及びｚＲＦＰが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に開示されるアプタマーライブラリーをスクリーニングするための方法としては、レポーター遺伝子の活性をアプタマー制御下で測定すること、及び／またはスクリーニングに使用されるチアミンもしくはＴＰＰの類似体の非存在下でのレポーター遺伝子の活性と比較した、スクリーニングに使用されるチアミンもしくはＴＰＰの類似体の存在下でのレポーター遺伝子の活性を比較すること、が挙げられ得る。
製造物品及びキット
本明細書に記載される方法で使用するためのキットまたは製造物品もまた提供される。態様では、キットは、好適な包装に入った本明細書に記載される組成物（例えば、遺伝子調節カセットを含有する標的遺伝子を含むベクターを送達するための組成物）を含む。本明細書に記載される組成物（眼科用の注射用組成物等）のための好適な包装は、当該技術分野で公知であり、例えば、バイアル（密封バイアル等）、容器、アンプル、ボトル、広口瓶、フレキシブル包装（例えば、密封マイラー（Ｍｙｌａｒ）または密封ビニール袋）等が挙げられる。これらの製造物品をさらに滅菌及び／または密封してよい。
本明細書に記載される組成物を含むキットもまた提供される。これらのキットはさらに、本明細書に記載される使用等の、組成物の使用方法に関する説明書（複数可）を含んでよい。本明細書に記載されるキットにはさらに、商業的及び使用者の立場から望ましい他の材料が含まれてよく、これには、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び組成物の投与を実施するため、または本明細書に記載される任意の方法を実施するための指示を記載した添付文書が含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるアプタマー配列を含有する遺伝子調節カセットを含む、標的遺伝子の発現のためのｒＡＡＶ、注射に好適な薬学的に許容される担体を含み、かつ、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び、注射を実施するための指示を記載した添付文書のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは、眼内注射、筋肉内注射、静脈内注射等に好適である。
本明細書で開示されている組成物及び方法の変形が当業者により作成され得ることが理解かつ予想されるべきであり、また、そのような変更が本開示の範囲内に含まれるべきであることが意図される。以下の実施例では本発明がさらに説明されるが、どのような形でも本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
本明細書で引用されているすべての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で提供されるすべてのヌクレオチド配列は、特に断らない限り、５’から３’方向である。配列表は、本明細書と共に提出され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
実施例１．チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）応答性アプタマーを含む合成リボスイッチは、ＴＰＰ及びチアミン類似体に応答して遺伝子発現を調節することができる
実験手順
リボスイッチコンストラクト：Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．でアプタマーを合成してもらい、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニング戦略（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＮＥＢ）を使用して合成アプタマー配列をイントロン－エクソン－イントロンカセットにクローニングして、Ｇ１７リボスイッチカセットのグアニンアプタマー（全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１２６７４７に記述の配列番号１５を参照のこと）を、Ａｌｉｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｔａｂｒｉｚｉｃａ ｔｈｉＣ遺伝子（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｓ．２０１７ Ｊａｎ；１９５：７１－８０）からのＴＰＰアプタマー、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｈｉＭ遺伝子（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２００６ Ｓｅｐ；１４（９）：１４５９－６８）からのＴＰＰアプタマーで置き換え、それぞれのリボスイッチであるＴＰＰｚ及びＴＰＰｍを作製した。
ＴＰＰｚリボスイッチをルシフェラーゼレポーター遺伝子に挿入することにより、配列番号８２を得た。大文字は、ルシフェラーゼコード配列を示す。小文字は、イントロン／選択的エクソン／イントロンとリボスイッチの配列を示す。ｔｈｉＣアプタマーコード配列（配列番号９６）には下線が引かれている。一実施形態では、配列番号８２を含むリボスイッチが提供され、ここで、配列番号８２におけるアプタマーコード配列（配列番号９６）は、本明細書に開示される別のアプタマー配列で置き換えられる。
配列番号８２
Figure 2023519266000025
Figure 2023519266000026
ＴＰＰｍリボスイッチをルシフェラーゼレポーター遺伝子に挿入することにより、配列番号８３を得た。大文字は、ルシフェラーゼコード配列を示す。小文字は、イントロン／選択的エクソン／イントロンとリボスイッチの配列を示す。ｔｈｉＭアプタマーコード配列（配列番号９７）には下線が引かれている。一実施形態では、配列番号８３を含むリボスイッチが提供され、ここで、配列番号８３におけるアプタマーコード配列（配列番号９７）は、本明細書に開示される別のアプタマー配列で置き換えられる。
配列番号８３
Figure 2023519266000027
Figure 2023519266000028
トランスフェクション：トランスフェクション前日、３．５×１０４のヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を９６ウェル平底プレートに播種した。プラスミドＤＮＡ（５００ｎｇ）を、チューブまたは９６ウェルＵ底プレートに加えた。別途、ＴｒａｎｓＩＴ－２９３試薬（Ｍｉｒｕｓ；１．４μＬ）を、５０μＬのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に加え、室温（ＲＴ）で５分間静置した。その後、この希釈したトランスフェクション試薬を５０μＬにてＤＮＡに加えて混合し、室温で２０分間インキュベートした。最後に、この溶液を７μＬにて９６ウェルプレートのウェルの細胞に加えた。トランスフェクションの４時間後、トランスフェクション溶液を含有する培地を、アプタマー誘導物質としてＴＰＰ、フルスルチアミン、プロスルチアミン、ビスベンチアミン、ベクロチアミン塩酸塩、またはスルブチアミンいずれかを含有する培地に置き換えた。
培養細胞のホタルルシフェラーゼアッセイ：培地交換の２４時間後、インキュベーターからプレートを取り外し、実験台で数分間ＲＴに平衡化し、その後吸引した。Ｇｌｏ－ｌｙｓｉｓバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、１００μＬ、ＲＴ）を加え、プレートを少なくとも５分間室温のまま置いた。その後、ウェルの内容物を５０μＬのトリチュレーションで混合し、各試料の２０μＬを、ｇｌｏ－ｌｙｓｉｓバッファーで１０％に希釈してあった２０μＬのｂｒｉｇｈｔ－ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。９６のウェルを、不透明な白色３８４ウェルプレートに間隔をあけて配した。ＲＴでの５分間のインキュベーションの後、Ｔｅｃａｎ機器を５００ｍｓの読み取り時間で使用して発光を測定した。ルシフェラーゼ活性は、平均任意光単位（ＡＬＵ）±Ｓ．Ｄ．として表され、誘導倍率は、ＴＰＰまたは類似体で処理した細胞から取得したルシフェラーゼ活性を、ＴＰＰまたは類似体で処理しなかった細胞から取得したルシフェラーゼ活性で割った商として計算された。
結果
Ａ．ｔａｂｒｉｚｉｃａ ｔｈｉＣリボスイッチ（リボスイッチＴＰＰｚ用）またはＥ．ｃｏｌｉ ｔｈｉＭリボスイッチ（リボスイッチＴＰＰｍ用）からのＴＰＰアプタマーをそれぞれ、合成リボスイッチ遺伝子発現カセット内に挿入することによって、ＴＰＰ応答性リボスイッチを含む遺伝子発現カセットが作製された。ここでは、アプタマー配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１２６７４７に記載のように、インフレームにある終止コドンを含有する選択的エクソンの下流のイントロンに挿入した。アプタマーへのリガンドの結合は、３’イントロンの５’スプライス部位の接近可能性を制御し、したがって、選択的スプライシングを調節することによる標的遺伝子の発現の調節を可能にする。
図１Ａに示すように、合成リボスイッチのＴＰＰｚ及びＴＰＰｍの両方ともＴＰＰに応答してルシフェラーゼ発現を調節する。ＴＰＰｚは、ＴＰＰｍより低濃度でも標的遺伝子発現を誘導し、これは、Ａ．ｔａｂｒｉｚｉｃａ ｔｈｉＣアプタマーが、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｈｉＭアプタマーと比較して哺乳類細胞での高いＴＰＰ結合親和性を有することを示している。
合成リボスイッチＴＰＰｚ及びＴＰＰｍがチアミンにも応答するかどうかを決定するため、チアミン類似体の一群を調査した。図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、ＴＰＰｚ及びＴＰＰｍは、フルスルチアミン及びプロスルチアミンの処理に応答してルシフェラーゼ発現を誘導するが、ビスベンチアミン、ベクロチアミン塩酸塩、及びスルブチアミンによる処理では、ルシフェラーゼ発現に対する効果が弱いかまたはまったくない（図１Ｄを参照のこと）。いずれの場合でも、リボスイッチＴＰＰｚは、ＴＰＰｍよりも低濃度で標的遺伝子発現を誘導した。
これらのデータは、哺乳類細胞において、異種アプタマー配列を含む合成リボスイッチが、多種多様なチアミン関連分子に用量依存的に応答して標的遺伝子発現を効果的に誘導することができることを示す。
実施例２．ＴＰＰアプタマー相同配列は、チアミン類似体に応答して哺乳類細胞での遺伝子発現を調節する。
実験手順：
リボスイッチの構築：ＴＰＰアプタマー相同配列をＲｆａｍ １２．０（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／）から取得して合成した（Ｔｗｉｓｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。ＴＰＰアプタマー相同配列を含有するリボスイッチコンストラクトを作製するため、合成したオリゴをＰＣＲのテンプレートとして使用し、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニング（ＮＥＢ）を使用してＧ１７リボスイッチコンストラクト（ＷＯ２０１６／１２６７４７）のグアニンアプタマーを置き換えた。
トランスフェクション及びホタルルシフェラーゼアッセイを実施例１に記載のように実施した。
結果：
例えばヒト対象での、治療を目的とした遺伝子の調節には、治療される対象に天然には存在しない合成化合物（フルスルチアミン等）と組み合わせた合成リボスイッチの使用が特に有用である。これは、患者に調節性化合物が存在しないことで、治療遺伝子の厳密に制御された発現が可能になるためである。
ＴＰＰｚ及びＴＰＰｍと比較して、チアミン類似体に対して応答した遺伝子調節活性が増大しているアプタマーを同定するため、相同配列を有する推定ＴＰＰアプタマーをＲｆａｍ １２．０（ＲＮＡファミリーのデータベースＲＦ０００５９、ｈｔｔｐ：／／ｒｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／ｆａｍｉｌｙ／ＲＦ０００５９）から取得した。この推定ＴＰＰアプタマー（受託番号ＡＡＣＹ０２３６５４０３３．１、８９５位で始まり、８１５位で終わる配列を有し、本明細書では１４Ｇ４と呼ばれる）を、実施例１に記載のように選択的スプライシングに基づく遺伝子調節カセットに挿入して、アプタマーリボスイッチ１４Ｇ４を作製した。
１４Ｇ４リボスイッチをルシフェラーゼレポーター遺伝子に挿入することにより、配列番号８４を得た。大文字は、ルシフェラーゼコード配列を示す。小文字は、イントロン／選択的エクソン／イントロンとリボスイッチの配列を示す。１４Ｇ４アプタマーコード配列（配列番号７）には下線が引かれている。一実施形態では、配列番号８４を含むリボスイッチが提供され、ここで、配列番号８４におけるアプタマーコード配列（配列番号７）は、本明細書に開示される別のアプタマー配列で置き換えられる。
配列番号８４
Figure 2023519266000029
Figure 2023519266000030
このリボスイッチを、それがルシフェラーゼ遺伝子発現を調節する能力についてＨＥＫ２９３細胞で試験した。図２に示すように、ルシフェラーゼ発現は、フルスルチアミンによる処理時に用量依存的に１００倍増加した。さらに、１４Ｇ４リボスイッチは、複数の型の細胞において、フルスルチアミンによる処理に応答してルシフェラーゼ遺伝子発現を調節した。
この実験は、哺乳類細胞において合成小分子に応答して標的遺伝子発現を顕著に誘導する能力があるアプタマーを含む、哺乳類リボスイッチの作製成功を示す。
実施例３．チアミン類似体に対する感受性が増大している再設計アプタマー配列を含むリボスイッチの作製。
リボスイッチ１４Ｇ４は、ＴＰＰと比較してフルスルチアミンに対して選択性があることから、さらなる改善のために選択された。１４Ｇ４リボスイッチの予測される二次構造（ＲＮＡｆｏｌｄ、ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＲＮＡＷｅｂＳｕｉｔｅ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉ）と、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｈｉＭリボスイッチの結晶学による構造とを比較した後、１４Ｇ４配列において、らせん形成に関与するとは考えられないがリガンド結合時に三次構造に関与し得る３つの領域を同定した。これらの３つの領域を配列ランダム化のために選択し、活性が改善された再設計アプタマー配列を有するリボスイッチを作製した。
３つのアプタマーライブラリーＡ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ、領域Ｊ４－５、Ｊ２－４及びＪ３－２の６位かまたは隣接するヌクレオチドをランダム化することにより作製された（図３を参照のこと）。単一の細菌コロニーをピックし、リボスイッチコンストラクトを含有するプラスミドを、リボスイッチ１４Ｇ４と比較した、５０μＭのフルスルチアミンに応答した遺伝子調節活性改善についてＨＥＫ２９３細胞でスクリーニングした。図４Ａに示すように、１Ｄ１０、３Ｈ４、４Ｈ２、６Ｂ４、６Ｃ４、及び６Ｇ１２を含め、単離されたアプタマーコンストラクトのうちのいくつかは、親コンストラクトの１４Ｇ４と比較して、フルスルチアミン依存性の誘導の増大を示している。これらの再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチはまた、アルファマウス肝１２（ＡＭＬ１２）、Ｃ２Ｃ１２（マウス筋芽細胞株）、及び成体網膜色素上皮細胞株－１９（ＡＲＰＥ－１９）等の他の細胞型でも標的遺伝子発現の顕著な増強をもたらす（図４Ｂを参照のこと）。さらに、再設計されたアプタマー配列を含む選択されたリボスイッチはまた、（ＡＭＬ１２細胞で）プロスルチアミン及びベンフォチアミンによる処理に応答して標的遺伝子発現を増加させた（図４Ｃを参照のこと）。
このデータは、再設計されたアプタマー配列を含む単離されたリボスイッチが、多種多様な合成小分子に応答して多種多様な細胞型での標的遺伝子発現を誘導するのに有用であることを示している。
遺伝子調節活性をさらに増強させるため、ライブラリーＡ４を使用して２回目の変異誘発を実施した（図５を参照のこと）。このライブラリーでは、３Ｈ４のバリアントリボスイッチコンストラクトのアプタマー配列を６つのヌクレオチド位置、すなわち、３Ｈ４アプタマーの予測される二次構造のＪ３－２領域の３塩基及びＪ２－４領域の３塩基にてランダム化した。単一の細菌コロニーをピックし、リボスイッチコンストラクトを含有するプラスミドを、リボスイッチ３Ｈ４と比較した遺伝子調節活性改善について５０μＭのフルスルチアミンを使用してＨＥＫ２９３細胞でスクリーニングした。
ライブラリーＡ４から単離された異なるアプタマーバリアントを含むいくつかのリボスイッチは、１４Ｇ４と３Ｈ４の両方と比較して、フルスルチアミンに対してさらなる感受性改善を示し、アプタマー／リガンド結合に関与する選択ヌクレオチドの変異誘発が、哺乳類細胞においてアプタマーベースのリボスイッチの遺伝子調節活性を改善することができることを示している（図６Ａを参照のこと）。
次に、アプタマーライブラリーＡ４から単離された、再設計アプタマー配列を含むリボスイッチが、チアミンと化学構造上の特徴を共有する他のチアミン類似体に応答する能力を決定した。図６Ｂに示すように、アプタマー１５Ａ５及び１５Ｄ１０を含む３Ｈ４由来リボスイッチは、合成分子であるフルスルチアミン、プロスルチアミン、及びベンフォチアミンに応答してルシフェラーゼ発現を強力に調節するが、天然に存在するＴＰＰに対してはほとんど応答しない。さらに、再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチである１５Ａ５及び１５Ｄ１０は、親リボスイッチの３Ｈ４と比較して、フルスルチアミン、プロスルチアミン、及びベンフォチアミンに応答した動的範囲の顕著な改善を示す。
この例は、複数回の変異誘発を介して、いくつかの合成チアミン類似体による処理に応答して標的遺伝子発現を増強させる、再設計されたアプタマー配列を含む改善されたリボスイッチが作製可能であることを示している。
実施例４．合成チアミン類似体リボスイッチは、フルスルチアミンに応答して様々な標的遺伝子の発現を調節することができる
実施例３で考察されているように、再設計されたアプタマー配列を含む単離されたリボスイッチは、様々なチアミン類似体に応答してレポータータンパク質ルシフェラーゼの発現を効率的に誘導する。単離されたアプタマーが他の標的遺伝子の発現を調節する能力を試験するため、再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチのうちのいくつかを、マウスエリスロポエチン（ｍＥｐｏ）のｃＤＮＡ配列及び高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のｃＤＮＡ配列内に挿入した。
実験手順：
リボスイッチコンストラクト：アプタマー３Ｈ４または１５Ｄ１０を含有する選択的スプライシングリボスイッチを、それぞれ、コンストラクトＣｏｎ８－Ｅｐｏ（配列番号８５）のマウスエリスロポエチンｃＤＮＡ配列に３０８位にて挿入し、コンストラクトＥｐｏ－３Ｈ４（配列番号８６）及びＥｐｏ－１５Ｄ１０（配列番号８７）を得た。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによってエリスロポエチン遺伝子の発現の発現が誘導された。アプタマー６Ｂ４を含有するリボスイッチカセットを、ベクターｐＥＧＦＰ－Ｃ１の高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするｃＤＮＡ配列内に２７６位にて挿入し、ＥＧＦＰ－６Ｂ４コンストラクト（配列番号８８）を作製した。アプタマー配列を含まないイントロン－エクソン－イントロンカセットをＣｏｎ８－Ｅｐｏ内に挿入して、構成的標的遺伝子発現の対照としての役割を果たすコンストラクトＥｐｏ－Ｃｏｎ１（配列番号８９）を作製した。
３Ｈ４リボスイッチをエリスロポエチン遺伝子に挿入することにより、配列番号８６を得た。大文字は、エリスロポエチンコード配列（配列番号８５を参照のこと）を示す。小文字は、イントロン／選択的エクソン／イントロンとリボスイッチの配列を示す。３Ｈ４アプタマーコード配列（配列番号９）には下線が引かれている。
配列番号８６
Figure 2023519266000031
１５Ｄ１０リボスイッチをエリスロポエチン遺伝子に挿入することにより、配列番号８７を得た。大文字は、エリスロポエチンコード配列（配列番号８５を参照のこと）を示す。小文字は、イントロン／選択的エクソン／イントロンとリボスイッチの配列を示す。１５Ｄ１０アプタマーコード配列（配列番号２６）には下線が引かれている。
配列番号８７
Figure 2023519266000032
６Ｂ４リボスイッチをＥＧＦＰ遺伝子に挿入することにより、配列番号８８を得た。大文字は、ＥＧＦＰコード配列を示す。小文字は、イントロン／選択的エクソン／イントロンとリボスイッチの配列を示す。６Ｂ４アプタマーコード配列（配列番号１４）には下線が引かれている。
配列番号８８
Figure 2023519266000033
アプタマー配列を含まないイントロン－エクソン－イントロンカセットをエリスロポエチン遺伝子に挿入することにより、配列番号８９を得た。大文字は、エリスロポエチンコード配列（配列番号８５を参照のこと）を示す。小文字は、イントロン／選択的エクソン／イントロン配列を示す。
配列番号８９
Figure 2023519266000034
マウスエリスロポエチンについての酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）：ＡＭＬ１２細胞にＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を実施例１に記載のようにトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、ＡＭＬ１２細胞をフルスルチアミンを用いて、または用いずに、示されている用量にて処理した。トランスフェクトされた細胞からの上清を、フルスルチアミン処理の２４時間後に採取し、上清中のｍＥｐｏの検出のため、製造者（Ｒ＆Ｄ）の指示に従ってＥＬＩＳＡにかけた。
ＥＧＦＰ－６Ｂ４を発現する細胞株の作製：Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、ＨＥＫ２９３細胞のデフォルトのパラメータを適用して、ＨＥＫ２９３細胞に１００ｎｇのプラスミドＤＮＡで電気穿孔することにより、ＥＧＦＰ－６Ｂ４コンストラクトを含有する安定な細胞株を作製した。電気穿孔の４８時間後、細胞培養物を８００μｇ／ｍｌの抗生物質Ｇ４１８で２週間処理し、Ｇ４１８耐性遺伝子を担持する、ＥＧＦＰ－６Ｂ４カセットを安定して発現する細胞を選択した。細胞をトリプシン処理した。細胞懸濁液中のＥＧＦＰの蛍光強度を、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ装置を使用してフローサイトメトリーにより決定した。得られたデータを、ＧｕａｖａＳｏｆｔ ３．３を使用して分析した。誘導の倍率増加は、フルスルチアミンで処理した細胞から取得された平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、フルスルチアミンで処理しなかった細胞から取得されたＭＦＩで割った商として計算された。
フローサイトメトリー分析：安定的にＥＧＦＰ－６Ｂ４コンストラクトを形質導入された１．５×１０５のＨＥＫ２９３細胞を、フルスルチアミン処理の１日前に２４ウェルプレートに播種した。細胞をフルスルチアミンで２４時間処理した。ＥＧＦＰの蛍光強度を上記のようにフローサイトメトリーによって決定した。
結果：
コンストラクトＥＧＦＰ－６Ｂ４を発現する細胞は、フルスルチアミン処理の非存在下ではレポータータンパク質ＥＧＦＰの低発現を示したが、フルスルチアミンの存在下ではＥＧＦＰ発現の１４倍の増加を示し（図７Ａを参照のこと）、これは、再設計されたアプタマー６Ｂ４を含むリボスイッチが、合成リガンドのフルスルチアミンに応答してルシフェラーゼ以外のレポータータンパク質の発現を誘導する能力を示している。さらに、フルスルチアミン処理に応答したＥＧＦＰ発現の誘導は、用量依存的であった（図７Ｂを参照のこと）。
次に、アプタマー３Ｈ４及び１５Ｄ１０を含むリボスイッチがｍＥｐｏの遺伝子発現を調節する能力を調べた。フルスルチアミンの非存在下では、ｍＥｐｏ－３Ｈ４またはｍＥｐｏ－１５Ｄ１０を含有する細胞は、非常に低いレベルのｍＥｐｏを発現した。しかしながら、フルスルチアミンでの処理時には、ｍＥｐｏ－３Ｈ４コンストラクトまたはｍＥｐｏ－１５Ｄ１０コンストラクトを含有する細胞において、ｍＥｐｏの発現が用量依存的に増強した。予想したとおり、対照コンストラクトｍＥｐｏ－Ｃｏｎ１は、フルスルチアミンの有無にかかわらずｍＥｐｏを恒常的に発現した（図７Ｃを参照のこと）。１２．５μＭのフルスルチアミンでの処理に応答して、ｍＥｐｏの発現は、フルスルチアミン非存在下での発現と比較して約４０倍（Ｅｐｏ－１５Ｄ１０）または９倍（Ｅｐｏ－３Ｈ４）誘導され（図７Ｄを参照のこと）、誘導物質が１２．５μＭでのｍＥｐｏ－１５Ｄ１０からのｍＥｐｏのレベルは、構成的で調節不可能なｍＥｐｏ－Ｃｏｎ１コンストラクトからのレベルの約６１．３％である。
これらの結果は、再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチが小分子に応答して遺伝子発現を誘導する能力は、特定の標的遺伝子配列に限定されないことを実証しており、標的遺伝子発現の調節にこれらのアプタマーリボスイッチを一般に適用できることを示している。
実施例５：合成リボスイッチは、マウスにおいてインビボで遺伝子発現を調節する
再設計されたアプタマーがインビボで遺伝子発現を誘導する能力を評価するため、レポータータンパク質ルシフェラーゼの遺伝子に挿入された、再設計されたリボスイッチを保持するアデノ関連ウイルスベクター（ＡＡＶ）をマウスにトランスフェクトした。プロスルチアミンを、ルシフェラーゼ発現を誘導するためのアプタマーリガンドとして使用した。
実験手順：
ＡＡＶ２．８ウイルス粒子の生成：マウスのトランスフェクションに使用されたＡＡＶ２．８粒子は、ＡＡＶ２に由来するウイルスゲノム及びＡＡＶ８に由来するカプシドを含んだ。（１）アプタマーを含まない調節不可能リボスイッチ（「ｌｕｃｉ－Ｃｏｎ１」、配列番号９０）、（２）アプタマー３Ｈ４を含むリボスイッチカセット（「ｌｕｃｉ－３Ｈ４」、配列番号９１）、または（３）アプタマー６Ｂ４を含むリボスイッチカセット（「ｌｕｃｉ－６Ｂ４」、配列番号９２）と共にイントロン－エクソン－イントロンカセットを含有するルシフェラーゼ遺伝子をそれぞれ、ＡＡＶ２プラスミドベクターにクローニングした。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、ＣＭＶ及びユビキチンＣのエンハンサーエレメントならびにニワトリβ－アクチンプロモーターが含まれる、ＣＡＳＩプロモーターにより制御された。ウイルスベクターをＡＡＶ８カプシド内にパッケージングし、製造者のプロトコル（Ｖｉｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って作製した。
アプタマー配列を含まないイントロン－エクソン－イントロンカセットをルシフェラーゼレポーター遺伝子に挿入することにより、配列番号９０を得た。大文字は、ルシフェラーゼコード配列を示す。小文字は、イントロン／選択的エクソン／イントロン配列を示す。
配列番号９０
Figure 2023519266000035
Figure 2023519266000036
３Ｈ４リボスイッチをルシフェラーゼレポーター遺伝子に挿入することにより、配列番号９１を得た。大文字は、ルシフェラーゼコード配列を示す。小文字は、イントロン／選択的エクソン／イントロンとリボスイッチの配列を示す。３Ｈ４アプタマーコード配列（配列番号９）には下線が引かれている。
配列番号９１
Figure 2023519266000037
Figure 2023519266000038
６Ｂ４ボスイッチをルシフェラーゼレポーター遺伝子に挿入することにより、配列番号９２を得た。大文字は、ルシフェラーゼコード配列を示す。小文字は、イントロン／選択的エクソン／イントロンとリボスイッチの配列を示す。６Ｂ４アプタマーコード配列（配列番号１４）には下線が引かれている。
配列番号９２
Figure 2023519266000039
Figure 2023519266000040
動物試験：雄Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１．０×１０１１または２．５×１０１１のゲノムコピーの受容ＡＡＶ２．８ウイルス粒子を単回尾静脈注射により投与した。ＡＡＶベクター送達の２８日後、マウスを５０ｍｇ／ｋｇのプロスルチアミンで腹腔内（Ｉ．Ｐ．）処置した。ルシフェラーゼ活性を、薬物投与の前日、ならびに薬物投与の６時間後、２４時間後、４８時間後及び７２時間後に測定した。プロスルチアミンの初回投与後、マウスに以下のとおり追加の３回の投与及び撮像サイクルを行った：３６日目（ＡＡＶ投与後）：１００ｍｇ／ｋｇ；４３日目：２００ｍｇ／ｋｇ；及び５１日目：４００ｍｇ／ｋｇ。
生きた動物の非侵襲的生物発光イメージング：イメージング前、マウスを２％イソフルランで麻酔し、１５０ｍｇ／ｋｇ体重のルシフェリンを注射した。薬物投与後の示されている時点で、ルシフェリン注射の２～５分以内にＢｒｕｋｅｒ Ｘｔｒｅｍｅシステムを使用して撮像した。ルシフェラーゼ活性を、平均光子／秒±Ｓ．Ｄ．として表した。（ｎ＝５）。ルシフェラーゼ遺伝子発現の誘導倍率は、プロスルチアミンで処置したマウスから得た光子／秒を、プロスルチアミン処置の前日にマウスから得た値で割った商として計算された。
結果：
動物での遺伝子発現の調節におけるリボスイッチを試験するため、リボスイッチを含むかまたは含まないルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＡＶベクターを、マウスに静脈内送達した。マウスを、ＡＡＶ注射の４週間にプロスルチアミンで腹腔内（Ｉ．Ｐ．）処置した。単一用量（５０ｍｇ／ｋｇ）のプロスルチアミン処置の６時間後、ルシフェラーゼ活性は、リボスイッチ３Ｈ４または６Ｂ４を含むルシフェラーゼ遺伝子を含有するＡＡＶベクターを注射されたマウスでは顕著に増大したが、同用量の調節不可能な対照ベクターＣｏｎ１を注射されたマウス群では増大しなかった（図８Ａ～図８Ｅを参照のこと）。さらに、プロスルチアミン処置時のルシフェラーゼ活性の増大は用量依存的であった。５０ｍｇ／ｋｇの単一用量または５０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの２用量のプロスルチアミンで処置したマウスの群では、それぞれ、誘導されたルシフェラーゼ活性は、単一用量処置の２４時間後、誘導物質処置前のレベルまで減弱した。しかしながら、より高用量の誘導物質プロスルチアミン（すなわち、２００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ）により追加で処置されたマウスでは、誘導されたルシフェラーゼ活性は４８時間以上そのままであった。
これらの結果は、再設計されたアプタマー配列を含むリボスイッチが、インビボでの用量依存的なチアミン類似体での処置時に標的遺伝子発現を選択的に誘導することを示す。
実施例６～９９：チアミン類似体リボスイッチは、新規チアミン類似体に応答して哺乳類細胞での遺伝子発現を調節する
実験手順：
チアミン類似体の生成
溶媒及び試薬はすべて商業的に入手し、受領した状態のまま使用した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、言及された重水素化溶媒でのＢｒｕｋｅｒ装置（３００ＭＨｚまたは４００ＭＨｚ）で記録した。化学シフトはｐｐｍで、また結合定数はｈｅｒｔｚで表される。最終化合物はすべて、２２０～４００メッシュシリカゲルを使用するフラッシュクロマトグラフィーまたはＣＨ３ＣＮ／水を溶媒として用いる逆相ＨＰＬＣによって精製した。薄層クロマトグラフィーを、シリカゲル６０ Ｆ－２５４（厚さ０．２５ｎｍ）プレートで行った。可視化お、ＵＶ光及び／または１０％リンモリブデン酸含有エタノールを用いて達成した。公称（低分解能）質量スペクトルを、Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＰＩ ３０００質量分析計のいずれかで取得した。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を、Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴまたはＡｇｉｌｅｎｔ ＴＯＦ質量分析計のいずれかで取得した。他のＬＣ－ＭＳ実験はすべて、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣにＡｇｉｌｅｎｔ四重極型質量分析を組み合わせて行った。化合物の純度は、２３０ｎＭ及び２５４ｎＭの波長でのＬＣ－ＭＳにより決定した。ここに報告する最終化合物はすべて純度が９５％以上である。
実施例６（Ｍ１９）
（（（Ｚ）－２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）メチル（３ｒ，５ｒ，７ｒ）－アダマンタン－１－カルボキシラート
Figure 2023519266000041
ステップ１
（３ｒ，５ｒ，７ｒ）－アダマンタン－１－カルボニルクロリド
Figure 2023519266000042
（３ｒ，５ｒ，７ｒ）－アダマンタン－１－カルボン酸（１０．０ｇ、５５．４ｍｍｏｌ）及びＳＯＣｌ２（３２．８ｇ、２７５ｍｍｏｌ、２０．０ｍＬ）の混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＴＬＣ（ジクロロメタン：メタノール＝１０：１、ブロモクレゾールグリーン、Ｒｆ＝０．６２）は、出発物質が完全に消費されたことを示した。混合物を濃縮し、表題化合物（１１．０ｇ、９９．７％）を無色結晶として得、これをそれ以上精製せずに次ステップの反応に直接使用した。
ステップ２
クロロメチル（３ｒ，５ｒ，７ｒ）－アダマンタン－１－カルボキシラート
Figure 2023519266000043
（３ｒ，５ｒ，７ｒ）－アダマンタン－１－カルボン酸（１５ｇ、８３．２ｍｍｏｌ、１当量）、臭化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢ）（２．６８ｇ、８．３２ｍｍｏｌ、０．１当量）及びＮａＨＣＯ３（２１．０ｇ、２５０．０ｍｍｏｌ、３当量）の混合物の、ＤＣＭ（１５０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１５０ｍＬ）の溶液に、クロロ（クロロスルホニルオキシ）メタン（１６．５ｇ、９９．９ｍｍｏｌ、１．２当量）を２０℃で滴加した。混合物を２０℃で１５時間撹拌した（気体発生）。放置すると、混合物は２層に分離し、水層を二塩化メチレンで抽出した（１００ｍＬで２回）。合わせた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させてろ過し、濃縮して、無色の粗油として得た。粗生成物を石油エーテル（５００ｍＬ）で希釈し、シリカゲルパッドを通してろ過した。ろ液を濃縮し、表題化合物（１５．５ｇ、８１．４％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ５．７２ （ｓ， ２Ｈ）， ２．０５－１．９２ （ｍ， ６Ｈ）， １．７４－１．７０ （ｍ， ２Ｈ）。
ステップ３
（（（Ｚ）－２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）メチル（３ｒ，５ｒ，７ｒ）－アダマンタン－１－カルボキシラート
Figure 2023519266000044
ビタミンＢ１（１０ｇ、３３．２ｍｍｏｌ、１当量）及びＫＩ（５５１．０ｍｇ、３．３２ｍｍｏｌ、０．１当量）の混合物の、Ｈ２Ｏ（１５０ｍＬ）及びＴＨＦ（１５０ｍＬ）の溶液にＮａＯＨ（２．６６ｇ、６６．５ｍｍｏｌ、２当量）を少しずつ加え、混合物を２０℃で０．５時間撹拌した。クロロメチル（３ｒ，５ｒ，７ｒ）－アダマンタン－１－カルボキシラート（１５．２ｇ、６６．５ｍｍｏｌ、２当量）を混合物に滴加し、得られた混合物を２０℃でさらに１２時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応の完了を示した。反応混合物は２層に分離した。水層を酢酸エチルで抽出した（２００ｍＬで３回）。合わせた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させてろ過し、濃縮して粗生成物を得た（ＴＬＣ：酢酸エチル／エタノール＝１０／１、生成物Ｒｆ＝０．２）。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフフィー（二塩化メチレン／メタノール＝１０／１）で精製し、生成物を黄色固体として得、それをｐｒｅ－ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍ；移動相：水－アセトニトリル、０．０５％アンモニアヒドロキシド（ｖ／ｖ）添加、２０分）によってさらに精製し、表題化合物（５８０．２４ｍｇ、４％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９３ （ｓ， １Ｈ）， ７．８２ （ｓ， １Ｈ）， ６．９６ （ｂｒ， ２Ｈ）， ４．９５ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５２－３．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）， １．９４ （ｓ， ６Ｈ）， １．８０－１．７８ （ｍ， ６Ｈ）， １．６８－１．６２ （ｍ， ６Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４７５．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例７（Ｍ１０）
（Ｚ）－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）ピバル酸メチル
Figure 2023519266000045
ビタミンＢ１（１．００ｇ、３．７８ｍｍｏｌ、１．００当量）のＥｔＯＨ溶液（１０．０ｍＬ）に、ＮａＯＥｔ（２５７ｍｇ、３．７８ｍｍｏｌ、１．００当量）、ピバル酸クロロメチル（５６９ｍｇ、３．７８ｍｍｏｌ、５４７ｕＬ、１．００当量）及びＮａＯＨ（４５．４ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ、０．３０当量）を加えた。混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を得た。残渣を分取ＨＰＬＣで精製し、表題化合物（６１．０ｍｇ、３．４％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９３ （ｓ， １Ｈ）， ７．８３ （ｓ， １Ｈ）， ６．７１ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ０．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．９６ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３４ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．６０ － ３．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）， １．９６ （ｓ， ３Ｈ）， １．１２ （ｓ， ９Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ３９７．３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例８（Ｍ１６）
（Ｚ）－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）イソ酪酸メチル
Figure 2023519266000046
ステップ１
ナトリウム（Ｚ）－２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－チオラート
Figure 2023519266000047
ビタミンＢ１（４０．０ｇ、１３２ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ溶液（８０．０ｍＬ）に、ＮａＯＥｔ（４０．０ｇ、１２３ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ溶液を－１０℃で加えた。混合物を１０℃で３０分間撹拌した。形成された固体をろ過により回収して乾燥させ、表題化合物（３６．０ｇ、８８．９％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ９．５１ （ｓ， １Ｈ）， ８．０５ （ｓ， １Ｈ）， ７．１８ （ｓ， ２ Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．６５－３．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０１－２．９５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３４ （ｓ， ３Ｈ）。
ステップ２
（Ｚ）－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）イソ酪酸メチル
Figure 2023519266000048
ナトリウム（Ｚ）－２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－チオラート（３．００ｇ、９．８６ｍｍｏｌ）の混合物のＥｔＯＨ溶液（３０．０ｍＬ）に、ＮａＯＨ（１２０ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）を２５℃で加え、続いてイソ酪酸クロロメチル（１．３５ｇ、９．８８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌し、濃縮して残渣を得た。残渣を分取ＨＰＬＣ（塩基性条件）で精製し、凍結乾燥させて１５０ｍｇの茶色粗固体を得、それを分取ＨＰＬＣ（ＮＨ４ＨＣＯ３で緩衝）によってさらに精製した後、凍結乾燥して表題化合物（５０．１ｍｇ、２９％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９２ （ｓ， １Ｈ）， ７．８３ （ｓ， １Ｈ）， ６．７０ （ｂｒ， ２Ｈ）， ４．９６ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３４ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４１－３．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５０－２．４０ （ｍ， １Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）， １．９５ （ｓ， ３Ｈ）， １．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ６Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ３８３．３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例９（Ｍ１８）
（Ｚ）－１－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）ピバル酸エチル
Figure 2023519266000049
ステップ１
１－クロロエチルピバラート
Figure 2023519266000050
塩化ピバロイル（９．８０ｇ、８１．２ｍｍｏｌ、１０．０ｍＬ）及び２，４，６－トリメチル－１，３，５－トリオキサン（４．９５ｇ、３７．４ｍｍｏｌ、５．００ｍＬ）の混合物にＺｎＣｌ２（１Ｍ、２．５０ｍＬ）を加え、混合物を９０℃で１時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈した。得られた有機溶液を、氷冷したＮａＨＣＯ３溶液（２０．０ｍＬ×３）及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、ろ過し、濃縮して残渣を得た。残渣を９０℃で蒸留し（ゲージ圧：－０．０９ＭＰａ）、表題化合物（１．６０ｇ）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ６．５２－６．５６ （ｍ， １Ｈ）， １．８０ （ｄ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．２２ （ｓ， ９Ｈ）。
ステップ２
（Ｚ）－１－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）ピバル酸エチル
Figure 2023519266000051
ナトリウム（Ｚ）－２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－チオラート（３．００ｇ、９．８６ｍｍｏｌ）の混合物のＥｔＯＨ溶液（３０．０ｍＬ）に、ＮａＯＥｔ（３．２０ｇ、９．８８ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ溶液を２５℃で加え、続いて１－クロロエチルピバラート（１．６０ｇ、９．７２ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（１２０ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２５℃で１２時間撹拌し、濃縮して残渣を得た。残渣を分取ＨＰＬＣで精製した後、凍結乾燥させ、表題化合物（６０．０ｍｇ、収率２％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９２ （ｓ， １Ｈ）， ７．８５ （ｓ， １Ｈ）， ６．４８ （ｂｒ， ２Ｈ）， ５．７４－５．７９ （ｍ， １Ｈ）， ４．４６ （ｄ， Ｊ ＝ １５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３７ （ｓ， １Ｈ）， ４．２８ （ｄ， Ｊ ＝ １５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５３－３．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５２－２．５７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３０ （ｓ， ３Ｈ）， １．９５ （ｓ， ３Ｈ）， １．２９ （ｄ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．３３ （ｓ， ９Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４１１．３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１０（Ｍ２１）
（Ｚ）－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）安息香酸メチル
Figure 2023519266000052
ビタミンＢ１（５ｇ、１６．６ｍｍｏｌ、１当量）及びＫＩ（１３８．０ｍｇ、８３１．０μｍｏｌ、０．０５当量）の混合物のＨ２Ｏ溶液（２５ｍＬ）に、ＮａＯＨ（１．３３ｇ、３３．２ｍｍｏｌ、２当量）を少しずつ加えた。混合物を２０℃で０．５時間撹拌し、次いで、安息香酸クロロメチル（２．８４ｇ、１６．６ｍｍｏｌ、１当量）のＴＨＦ溶液（２５ｍＬ）を滴加した。その後、反応混合物をさらに１０時間２０℃にて撹拌した。ＬＣＭＳは、新たな生成物が形成されたことを示した。５ｍＬのメタノールを加えて混合物をクエンチし、飽和重炭酸ナトリウム水溶液でｐＨを約７に調整した。その後、水相を酢酸エチルで抽出した（２００ｍＬで２回）。合わせた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させてろ過し、濃縮して粗生成物を得、それを酢酸エチル（５０ｍＬ）でトリチュレートし、表題化合物（７００ｍｇ、１０％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９６－７．９２ （ｍ， ３Ｈ）， ７．８１ （ｓ， １Ｈ）， ７．７３－７．６７ （ｍ， １Ｈ）， ７．５７－７．５３ （ｍ， ２Ｈ）， ６．７６ （ｂｒｓ， ２Ｈ）， ５．２８ （ｓ， ２Ｈ）， ４．７４－４．７０ （ｍ， １Ｈ）， ４．３２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５４－３．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６９－２．６６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２６ （ｓ， ３Ｈ）， １．９６ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４１７．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１１（Ｍ３４）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）ナフタレン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000053
ビタミンＢ１（９ｇ、２９．９ｍｍｏｌ、１当量）及びＫＩ（４９７．０ｍｇ、２．９９ｍｍｏｌ、０．１当量）の混合物の、Ｈ２Ｏ（１５０ｍＬ）及びＴＨＦ（１５０ｍＬ）の溶液に、ＮａＯＨ（２．３９ｇ、５９．８ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。混合物を２０℃で０．５時間撹拌した。塩化１－ナフトイル（１１．１ｇ、５８．０ｍｍｏｌ、８．７１ｍＬ、１．９４当量）を滴加した。反応混合物を２０℃でさらに１２時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応の完了を示した。反応混合物を酢酸エチルで抽出した（１００ｍＬで３回）。水相を飽和重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ７～８に調整し、酢酸エチルで抽出した（１００ｍＬで３回）。合わせた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させてろ過し、濃縮して粗生成物を得、それを酢酸エチル（１０ｍＬ）でトリチュレートし、表題化合物（４２０ｍｇ、９６２μｍｏｌ、収率３％）をオフホワイトの固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．２１－８．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ８．０５－８．０２ （ｍ， １Ｈ）， ７．９９ （ｓ， １Ｈ）， ７．９２－７．９１ （ｍ， １Ｈ）， ７．８８ （ｓ， １Ｈ）， ７．６８－７．５９ （ｍ， ３Ｈ）， ６．７４ （ｂｒｓ， ２Ｈ）， ４．７０－４．６８ （ｍ， １Ｈ）， ４．４４ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７０－２．６８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１３ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４３７．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１２（Ｍ２６）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000054
ビタミンＢ１（１．００ｇ、３．３２ｍｍｏｌ、１．００当量）及びＮａＯＨ（１３３．０ｍｇ、３．３２ｍｍｏｌ、１．００当量）の、Ｈ２Ｏ（５０．０ｍＬ）及びＴＨＦ（５．００ｍＬ）の溶液に、塩化ベンゾイル（９３５．０ｍｇ、６．６５ｍｍｏｌ、７７２．０μＬ、２．００当量）を０℃で加えた。反応混合物を０℃で０．５時間撹拌した。ＬＣＭＳは、出発物質が消費され、所望の質量を有する生成物が検出されたことを示した。反応混合物をＭｅＯＨ（５．００ｍＬ）でクエンチし、ｐＨ＝７に調整し、１０：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨで抽出した（２５．０ｍＬで２回）。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させてろ過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得、それをＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ／ＤＣＭ（２：２：１）でトリチュレートすると、表題化合物（２５１ｍｇ、１８．６％）が白色固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８９ （ｓ， １Ｈ）， ７．８２ （ｓ， １Ｈ）， ７．７３ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．６５ （ｂｒｓ， ２Ｈ）， ４．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３９ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１４ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ３８７．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１３（Ｍ２７）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－メチルプロパンチオアート
Figure 2023519266000055
ビタミンＢ１（１．００ｇ、３．３２ｍｍｏｌ、１．００当量）及びＮａＯＨ（２６６ｍｇ、６．６５ｍｍｏｌ、２．００当量）の、Ｈ２Ｏ（５０．０ｍＬ）及びＴＨＦ（５．００ｍＬ）の溶液に、塩化イソブチリル（７０８ｍｇ、６．６５ｍｍｏｌ、６９５．０μＬ、２．００当量）を０℃で加えた。反応混合物を０℃で０．５時間撹拌し、ＭｅＯＨ（５．００ｍＬ）でクエンチし、ｐＨ＝７に調整した。混合物を１０：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨで抽出した（２５．０ｍＬで２回）。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させてろ過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ／ＤＣＭ（２：２：１）でトリチュレートし、表題化合物（２２４．０ｍｇ、１９．０％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．７９ （ｓ， １Ｈ）， ７．７７ （ｓ， １Ｈ）， ６．６８ （ｂｒｓ， ２Ｈ）， ４．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｑ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６０－２．５０ （ｍ， １Ｈ）， ２．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．２６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０７ （ｓ， ３Ｈ）， １．０２ （ｓ， ３Ｈ）， １．００ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ３５３．３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１４（Ｍ２８）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２，２－ジメチルプロパンチオアート
Figure 2023519266000056
ナトリウム（Ｚ）－２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－チオラート（０．５０ｇ、１．６４ｍｍｏｌ、１．００当量）及びＮａＯＨ（６５．７ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ、１．００当量）の混合物のＨ２Ｏ溶液（５．００ｍＬ）に、塩化ピバロイル（１９８ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ、２０２μＬ、１当量）を０℃で加え、得られた混合物を０℃で１時間撹拌した。混合物を濃縮して、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ジクロロメタン：メタノール＝１００：１から１０：１、ＴＬＣ：ジクロロメタン：メタノール＝１０：１、Ｒｆ＝０．４）で精製し、表題化合物（１１０ｍｇ、１８．２％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．７９ （ｓ， １ Ｈ） ７．７５ （ｓ， １ Ｈ） ６．７０ （ｂｒ ｓ， ２ Ｈ） ４．６０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １ Ｈ） ４．３５ （ｂｒ ｓ， ２ Ｈ） ３．３９ （ｑ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２ Ｈ） ２．４２ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２ Ｈ） ２．２６ （ｓ， ３ Ｈ） ２．０８ （ｓ， ３ Ｈ） １．０７ （ｓ， ９ Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ３６７．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１５（Ｍ２９）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－メトキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000057
ナトリウム（Ｚ）－２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－チオラート（０．５０ｇ、１．６４ｍｍｏｌ、１．００当量）及びＮａＯＨ（６５．７ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ、１．００当量）の混合物のＨ２Ｏ溶液（４ｍＬ）に、化合物４－メトキシベンゾイルクロリド（２８０ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ、２２６ｕＬ、１．００当量）を０℃で加え、得られた混合物を０℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、出発物質が消費され、所望の質量を有する生成物が検出されたことを示した。その後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００：０から２０：１ジクロロメタン：メタノール）で精製して表題化合物（６０．０ｍｇ、９％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８７ （ｓ， １ Ｈ）， ７．８１ （ｓ， １ Ｈ）， ７．７２ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．０５ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ６．６４ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．６４ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ）， ４．３７ （ｂｒ ｓ， ２ Ｈ）， ３．８４ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．４６ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ４．０ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ２．５８ （ｍ， ２ Ｈ）， ２．１９ （ｓ， ３ Ｈ）， ２．１２ （ｓ， ３ Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４１７．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１６（Ｍ３０）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２，６－ジクロロベンゾチオアート
Figure 2023519266000058
ナトリウム（Ｚ）－２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－チオラート（０．５０ｇ、１．６４ｍｍｏｌ、１．００当量）及びＮａＯＨ（６５．７ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ、１．００当量）の混合物のＨ２Ｏ溶液（４．００ｍＬ）に、２，６－ジクロロベンゾイルクロリド（３４４ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ、２３５μＬ、１．００当量）を０℃で加えた。得られた混合物を０℃で１時間撹拌し、その後、濃縮して残渣を得た。残渣を分取ＨＰＬＣで精製し、表題化合物（１５０ｍｇ、２０．１％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９６ （ｓ， １ Ｈ）， ７．８４ （ｓ， １ Ｈ）， ７．６０ － ７．５４ （ｍ， ３ Ｈ）， ６．６８ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．６８ － ４．７５ （ｍ， １ Ｈ）， ４．４１ （ｂｒ ｓ， ２ Ｈ）， ３．４６ － ３．５２ （ｍ， ２ Ｈ）， ２．６２ － ２．６９ （ｍ， ２ Ｈ）， ２．２６ （ｓ， ３ Ｈ）， ２．１４ （ｓ， ３ Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４５５．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１７（Ｍ３１）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－（ホスホノオキシ）ペンタ－２－エン－３－イル）２，２－ジメチルプロパンチオアート
Figure 2023519266000059
ステップ１
３－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）－４－メチル－５－（２－（ホスホノオキシ）エチル）チアゾール－３－イウムクロリド
Figure 2023519266000060
１３０℃のポリリン酸（１５０ｇ、４９．８ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、ビタミンＢ１（１５．０ｇ、４９．８ｍｍｏｌ、１．００当量）を少しずつ加えた。混合物を１００～１３０℃で２時間撹拌した。水（２５０ｍＬ）を加え、混合物を１００℃でさらに２時間撹拌し、２５℃に冷却し、トリオクチルアミン／ＭＴＢＥ（１：１、２５０ｍＬで２回）により抽出した。水層を分離し、４００ｍＬのＥｔＯＨで希釈し、２５℃で２時間撹拌した。形成された白色固体をろ過により回収し、ＥｔＯＨ（２００ｍＬで２回）で洗浄して乾燥させ、表題化合物（１７．０ｇ、９８．７％）を得た。
ステップ２
ナトリウム（Ｚ）－４－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－３－スルフィドペンタ－３－エン－１－イルホスファート
Figure 2023519266000061
３－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）－４－メチル－５－（２－（ホスホノオキシ）エチル）チアゾール－３－イウム（２．００ｇ、５．７９ｍｍｏｌ、１．００当量）の混合物のＨ２Ｏ溶液（２０ｍＬ）に、ＮａＯＨ（５．６４ｇ、４２．３ｍｍｏｌ、７．３０当量）を０～５℃でゆっくりと加えた。混合物を５～１０℃で０．５時間撹拌し、濃縮して、表題化合物（２．４０ｇ、９７％）を黄色固体として得、これをそれ以上精製せずに次ステップの反応に直接使用した。
ステップ３
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－（ホスホノオキシ）ペンタ－２－エン－３－イル）２，２－ジメチルプロパンチオアート
Figure 2023519266000062
ナトリウム（Ｚ）－４－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－３－スルフィドペンタ－３－エン－１－イルホスファート（０．８００ｇ、１．８７ｍｍｏｌ、１．００当量）の混合物のＮａＯＨ溶液（１Ｍ、３．７４ｍＬ、２．００当量）に、塩化ピバロイル（８４０ｍｇ、６．９７ｍｍｏｌ、８５７μＬ、３．７３当量）を加えた。得られた混合物を２５℃で２時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ジクロロメタン＝２：１）は、出発物質が消費され、新たなスポットが形成されたことを示した。反応混合物を濃縮し、逆相ＨＰＬＣで精製して表題化合物（１３２ｍｇ、１５．７％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ） δ ７．９９ （ｓ， １ Ｈ）， ７．７９ （ｓ， １ Ｈ）， ３．９３ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ２．５６ （ｓ， ３ Ｈ）， ２．２５ （ｓ， ３ Ｈ）， １．１４ （ｓ， ９ Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４４７．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１８（Ｍ３２）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－（ホスホノオキシ）ペンタ－２－エン－３－イル）４－メトキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000063
ナトリウム（Ｚ）－４－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－３－スルフィドペンタ－３－エン－１－イルホスファート（０．８０ｇ、１．８７ｍｍｏｌ、１．００当量）の混合物のＮａＯＨ溶液（１Ｍ、３．７４ｍＬ、２．００当量）に、４－メトキシベンゾイルクロリド（１．１９ｇ、６．９７ｍｍｏｌ、９５８μＬ、３．７３当量）を加えた。得られた混合物を２５℃で２時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ジクロロメタン＝２：１）は、出発物質が消費され、新たなスポットが形成されたことを示した。混合物を濃縮し、逆相ＨＰＬＣで精製して表題化合物（１７４ｍｇ、１８．１％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ） δ ８．０４ （ｓ， １ Ｈ）， ７．９９ （ｓ， １ Ｈ）， ７．７５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．００ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ４．７４ － ４．３５ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．０３ （ｑ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ３．８８ （ｓ， ３ Ｈ）， ２．８１ （ｍ， ２ Ｈ）， ２．４０ （ｓ， ３ Ｈ）， ２．３０ （ｓ， ３ Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４９７．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１９（Ｍ３３）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－（ホスホノオキシ）ペンタ－２－エン－３－イル）２，６－ジクロロベンゾチオアート
Figure 2023519266000064
ナトリウム（Ｚ）－４－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－３－スルフィドペンタ－３－エン－１－イルホスファート（０．８００ｇ、１．８７ｍｍｏｌ、１．００当量）の混合物のＮａＯＨ溶液（１Ｍ、３．７４ｍＬ、２．００当量）に、２，６－ジクロロベンゾイルクロリド（３９１ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ、２６８μＬ、１．００当量）を加えた。混合物を２５℃で２時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ジクロロメタン＝２：１）は、出発物質が消費され、新たなスポットが形成されたことを示した。混合物を濃縮し、逆相ＨＰＬＣで精製して表題化合物（７２．０ｍｇ、７．２０％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ） δ ８．０６ （ｓ， １ Ｈ）， ８．０２ （ｓ， １ Ｈ）， ７．４４ （ｓ， ３ Ｈ）， ４．０７ － ４．０４ （ｍ， ２ Ｈ）， ２．４９ （ｓ， ３ Ｈ）， ２．３２ （ｓ， ３ Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５３５．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例２０～５９：以下の化合物を、適切な出発物質を用いてＭ３４（実施例１１）の調製手順に従って合成した。
実施例２０（Ｍ３７）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－メチルナフタレン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000065
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．３０ － ８．２５ （ｍ， １Ｈ）， ８．１３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ３．２， ６．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９８ （ｓ， １Ｈ）， ７．８８ － ７．８０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６９ － ７．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７１ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．６９ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．５５ － ３．４７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．６６ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１３ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４５１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例２１（Ｍ３８）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－エトキシナフタレン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000066
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．０６ － ７．９２ （ｍ， ４Ｈ）， ７．５７ － ７．４２ （ｍ， ４Ｈ）， ６．６７ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．７３ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４２ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．２３ （ｑ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６２ － ３．５１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ２．２３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１３ （ｓ， ３Ｈ）， １．３２ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）．ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４８１ （Ｍ＋Ｈ）＋。
実施例２２（Ｍ３９）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－ブロモナフタレン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000067
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．２７ － ８．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ８．０２ － ７．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．８６ － ７．７８ （ｍ， ４Ｈ）， ６．７２ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ １．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４４ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．５３ （ｑ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６７ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０８ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５１５ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例２３（Ｍ４０）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）フェナントレン－９－カルボチオアート
Figure 2023519266000068
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．９２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．８８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２６－８．１９ （ｍ， ３Ｈ）， ８．０３ （ｓ， １Ｈ）， ７．９０ （ｓ， １Ｈ）， ７．８０－７．７５ （ｍ， １Ｈ）， ７．８０－７．７７ （ｍ， ２Ｈ）， ７．７４－７．７２ （ｍ， １Ｈ）， ６．８０ （ｓ， ２Ｈ）， ４．７４ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５８ （ｑ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．１７ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２１ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０９ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４８７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例２４（Ｍ４３）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）フェナントレン－９－カルボチオアート
Figure 2023519266000069
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８８ － ７．８３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３２ － ７．２０ （ｍ， ３Ｈ）， ６．７３ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ １．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．６６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４０ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．４７ （ｑ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ２．６７ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ２．５８ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２１ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１３ （ｓ， ３Ｈ）， １．７０ （ｍ， ４Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４４１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例２５（Ｍ４４）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－フルオロナフタレン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000070
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．３３ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１６ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０８ － ７．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．８７ （ｓ， １Ｈ）， ７．８２ － ７．７０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， １０．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７１ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．６９ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．６６ － ３．４７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６６ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２５ － ２．１５ （ｍ， ３Ｈ）， ２．１３ － １．９６ （ｍ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４５５ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例２６（Ｍ４５）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）８－フルオロナフタレン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000071
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．２０ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９８ （ｓ， １Ｈ）， ７．９１ － ７．８３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．７３ － ７．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５６ － ７．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ６．８１ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．７３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．４６ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ２．６９ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４５５ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例２７（Ｍ４６）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）８－メチルナフタレン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000072
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．１４ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ １．６， Ｊ２ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９８ （ｓ， １Ｈ）， ７．９１ － ７．８６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５９ － ７．４７ （ｍ， ４Ｈ）， ６．８３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．７５ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４６ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．５４ （ｑ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７０ － ２．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１９ （ｄ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ６Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４５１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例２８（Ｍ４７）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－メトキシナフタレン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000073
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．４２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２６ （ｄ， Ｊ ＝ ０．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９６ （ｓ， １Ｈ）， ７．８７ （ｓ， １Ｈ）， ７．６８ － ７．６５ （ｍ， １Ｈ）， ７．６５ － ７．６１ （ｍ， １Ｈ）， ７．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７１ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．６９ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．０８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．５５ － ３．５０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６６ － ２．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１４ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４６７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例２９（Ｍ４９）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）ナフタレン－２－カルボチオアート
Figure 2023519266000074
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．４１ （ｓ， １Ｈ）， ８．１８ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０６ － ８．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．９５ （ｓ， １Ｈ）， ７．８５ （ｓ， １Ｈ）， ７．７６ － ７．６４ （ｍ， ３Ｈ）， ６．６４ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．６７ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４１ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．５２ （ｑ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６２ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１４ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４３７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例３０（Ｍ５０）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）５，５，８，８－テトラメチル－５，６，７，８－テトラヒドロナフタレン－２－カルボチオアート
Figure 2023519266000075
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８４ （ｄ， Ｊ ＝ １４．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５１－７．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ６．６３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６３ （ｔ， Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４５ （ｄ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２０ （ｓ， ２Ｈ）， ２．１３ （ｓ， ２Ｈ）， １．６５ （ｓ， ３Ｈ）， １．２５ （ｓ， １２Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４９７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例３１（Ｍ５１）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）１－ブロモナフタレン－２－カルボチオアート
Figure 2023519266000076
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．２８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．１２－８．０９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．９８ （ｓ， １Ｈ）， ７．８８ （ｓ， １Ｈ）， ７．８０－７．７６ （ｍ， １Ｈ）， ７．７４－７．７２ （ｍ， １Ｈ）， ７．４６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７５ （ｓ， ２Ｈ）， ４．７２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｑ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１７ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５１６ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例３２（Ｍ５２）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）６－メトキシナフタレン－２－カルボチオアート
Figure 2023519266000077
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．３３ （ｄ， Ｊ ＝ １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９４ － ７．８３ （ｍ， ３Ｈ）， ７．７０ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ １．６， Ｊ２ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４３ （ｄ， Ｊ ＝ ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２８ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ２．４， Ｊ２ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７６ － ６．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４０ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．９２ （ｓ， ３Ｈ）， ３．５３ － ３．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６０ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１４ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４６７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例３３（Ｍ５３）
Ｓ－（（Ｚ）－２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）（３ｒ，５ｒ，７ｒ）－アダマンタン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000078
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．７９ （ｓ， １Ｈ）， ７．７４ （ｓ， １Ｈ）， ６．７５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．６０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．４４ － ３．３８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０８ （ｓ， ３Ｈ）， １．９８ （ｂｒ ｓ， ３Ｈ）， １．８４ － １．７５ （ｍ， １Ｈ）， １．７１ － １．６２ （ｍ， １１Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４４５ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例３４（Ｍ５４）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－フェニルプロパンチオアート
Figure 2023519266000079
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．７７ （ｓ， １Ｈ）， ７．７３ （ｓ， １Ｈ）， ７．３４ － ７．２４ （ｍ， ５Ｈ）， ６．６４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４０－４．２４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８２ （ｍ， １Ｈ）， ３．２９ － ３．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４８ － ２．３９ （ｍ， １Ｈ）， ２．３２ － ２．２８ （ｍ， １Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）， １．３４－１．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４１５ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例３５（Ｍ５５）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２，２－ジメチル－３－フェニルプロパンチオアート
Figure 2023519266000080
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．７８ （ｓ， １Ｈ）， ７．６８ （ｓ， １Ｈ）， ７．２７ － ７．２０ （ｍ， ３Ｈ）， ７．０９ （ｍ， ２Ｈ）， ６．７１ （ｓ， １Ｈ）， ４．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３４ （ｓ， １Ｈ）， ３．４２ －３．３６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７３ （ｓ， ２Ｈ）， ２．４３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２５ （ｓ， ２Ｈ）， ２．０７ （ｓ， ３Ｈ）， １．０２ （ｓ， ６Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４４３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例３６（Ｍ５７）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）１－メチルシクロヘキサン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000081
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．７９ （ｓ， １Ｈ）， ７．７５ （ｓ， １Ｈ）， ６．７０ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３４ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４５ － ３．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４３ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０８ （ｓ， ３Ｈ）， １．７８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．８， ９．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４９ － １．２４ （ｍ， ８Ｈ）， １．０５ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４０７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例３７（Ｍ５８）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２，２－ジフェニルプロパンチオアート
Figure 2023519266000082
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．７７ （ｄ， Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３５ － ７．２５ （ｍ， ６Ｈ）， ７．１６ － ７．０８ （ｍ， ４Ｈ）， ６．７３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．５８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３１ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．３２ － ３．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４１ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０５ （ｓ， ３Ｈ）， １．８４ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４９１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例３８（Ｍ５９）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）３－メチル－２－フェニルブタンチオアート
Figure 2023519266000083
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．７７ （ｓ， １Ｈ）， ７．７３ （ｓ， １Ｈ）， ７．３５ － ７．３０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２９ － ７．２１ （ｍ， ３Ｈ）， ６．６４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４５ － ３．４１ （ｍ， １Ｈ）， ３．２９ － ３．１７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４８ － ２．３９ （ｍ， １Ｈ）， ２．２７－２．２０ （ｍ， ５Ｈ）， １．９９ （ｓ， ３Ｈ）， ０．９２ （ｄ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．６１ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４４３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例３９（Ｍ６２）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－メチル－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデン－２－カルボチオアート
Figure 2023519266000084
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．７９ （ｓ， ２Ｈ）， ７．２１ － ７．１３ （ｍ， ４Ｈ）， ６．７２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６２－４．５９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ （ｓ， １Ｈ）， ３．４３ － ３．３８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２０ （ｄ， Ｊ ＝ １６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７３ （ｄ， Ｊ ＝ １６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０９ （ｓ， ３Ｈ）， １．２１ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４４１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例４０（Ｍ６３）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－メチル－２－（ナフタレン－２－イル）プロパンチオアート
Figure 2023519266000085
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９０－７．８９ （ｍ， １Ｈ）， ７．８８－７．８５ （ｍ， ３Ｈ）， ７．７７ （ｓ， １Ｈ）， ７．７３ （ｓ， １Ｈ）， ７．５３－７．５１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３５－７．３３ （ｍ， １Ｈ）， ６．７１ （ｓ， ２Ｈ）， ４．５０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３１ （ｓ， ２Ｈ）， ３．２６ （ｑ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０４ （ｓ， ３Ｈ）， １．５３ （ｓ， ６Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４７９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例４１（Ｍ６４）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２，２－ジフェニルエタンチオアート
Figure 2023519266000086
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．７７ （ｄ， Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３９ － ７．２３ （ｍ， １２Ｈ）， ６．７８ － ６．５７ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２９ （ｓ， １Ｈ）， ４．６３ － ４．５１ （ｍ， １Ｈ）， ４．３１ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ２．２１ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０２ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４７７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例４２（Ｍ６５）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）１－（３－ブロモフェニル）シクロプロパン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000087
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．７４ （ｓ， １Ｈ）， ７．７１ （ｓ， １Ｈ）， ７．５５－７．５２（ｍ， ２Ｈ）， ７．３９－７．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ６．７１ （ｓ， ２Ｈ）， ４．５５－４．５２ （ｍ， １Ｈ）， ４．３１ （ｓ， ２Ｈ）， ３．３７－３．３５ （ｍ， １Ｈ）， ２．４１－２．３４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０４ （ｓ， ３Ｈ）， １．４０－１．３７ （ｍ， ２Ｈ）， １．２２－１．１９ （ｓ， ２Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５０６ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例４３（Ｍ６６）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）３，５－ジクロロ－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボチオアート
Figure 2023519266000088
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９８ （ｓ， １Ｈ）， ７．８９ （ｓ， ３Ｈ）， ７．７８ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ １．６， Ｊ２ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．５８ － ７．４５ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９２ （ｍ， ２Ｈ）， ４．７４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．５５ － ３．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６７ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ １．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１５ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５３２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例４４（Ｍ６７）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２，６－ジメチルベンゾチオアート
Figure 2023519266000089
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９５ （ｓ， １Ｈ）， ７．８３ （ｓ， １Ｈ）， ７．１３－７．０８（ｍ， ２Ｈ）， ６．７５ （ｓ， ２Ｈ），４．７５－４．７２ （ｍ， １Ｈ）， ４．４０ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４９－３．４４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６８ （ｍ， １Ｈ）， ２．２６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２０ （ｓ， ６Ｈ）， ２．１５ （ｓ， ３Ｈ）， １．２４ （ｓ， ９Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４７１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例４５（Ｍ６８）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）３－クロロ－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボチオアート
Figure 2023519266000090
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９２ （ｓ， １Ｈ）， ７．９０ － ７．８４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．８０ － ７．７３ （ｍ， ３Ｈ）， ７．６５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５７ － ７．４５ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９６ － ６．５６ （ｍ， ２Ｈ）， ４．７０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．５３ － ３．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６１ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２１ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１６ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４９８ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例４６（Ｍ７０）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）３，５－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルベンゾチオアート
Figure 2023519266000091
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８８ （ｓ， １Ｈ）， ７．８３ （ｓ， １Ｈ）， ７．７４ （ｔ， Ｊ ＝ ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５５ （ｄ， Ｊ ＝ ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６０ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３９ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５７ － ３．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１５ （ｓ， ３Ｈ）， １．３２ （ｓ， １８Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４９９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例４７（Ｍ７２）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）［１，１’－ビフェニル］－３－カルボチオアート
Figure 2023519266000092
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９８ （ｍ， １Ｈ）， ７．９３ （ｓ， １Ｈ）， ７．９１－７．９０ （ｍ， １Ｈ）， ７．８４ （ｓ， １Ｈ）， ７．７３－７．７１ （ｍ， ３Ｈ）， ７．６３ （ｍ， １Ｈ）， ７．５５－７．５１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４４ （ｍ， １Ｈ）， ６．６４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６４－４．６５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４０ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５２－３．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６１－２．５１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２１ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１３ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４６３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例４８（Ｍ７３）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－フェノキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000093
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８７ （ｓ， １Ｈ）， ７．８２ （ｓ， １Ｈ）， ７．７７ （ｓ， １Ｈ）， ７．７５ （ｓ， １Ｈ）， ７．５０－７．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２７ （ｍ， １Ｈ）， ７．１５ （ｄ， Ｊ ＝ ８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．０４ （ｄ， Ｊ ＝ ８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．６４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６４－４．６１ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４８－３．４３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５８－２．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１３ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４６３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例４９（Ｍ７６）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン－２－カルボチオアート
Figure 2023519266000094
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．５７ （ｓ， １Ｈ）， ８．３５－８．３４ （ｄ， Ｊ ＝ ４Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９６ －７．９０ （ｍ， ５Ｈ）， ７．７９－７．７７ （ｍ， １Ｈ）， ７．６１－７．４８ （ｍ， １Ｈ）， ６．６５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．７０ （ｍ， １Ｈ）， ４．４１ （ｓ， １Ｈ）， ３．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１６ （ｓ， ６Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４７７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例５０（Ｍ７９）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）ベンゾ［ｂ］チオフェン－５－カルボチオアート
Figure 2023519266000095
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．３１ （ｓ，１ Ｈ）， ８．１５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９４－７．９３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．８４ （ｓ， １Ｈ）， ７．６７－７．６５ （ｍ， ２Ｈ）， ６．６３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６７－４．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４０ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５１－３．４７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６７－２．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１４ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４４３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例５１（Ｍ８２）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－（２－メトキシエトキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000096
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８８ （ｓ， １Ｈ）， ７．８３ （ｓ， １Ｈ）， ７．７３－７．６９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．０８－７．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ６．６４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６６－４．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３８ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２１－４．１８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６９－３．６８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．５６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２０ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４６１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例５２（Ｍ８８）
Ｓ－（（Ｚ）－２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）（Ｅ）－３－（ナフタレン－２－イル）プロパ－２－エンチオアート
Figure 2023519266000097
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．２６ （ｓ， １Ｈ）， ８．００－７．９４ （ｍ， ４Ｈ）， ７．９０ （ｓ， １Ｈ）， ７．８４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５９－７．５６ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９５ （ｄ， Ｊ ＝ １５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６８ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６９ （ｓ， １Ｈ）， ４．３９ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１２ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４６３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例５３（Ｍ１０８）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）６－メトキシナフタレン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000098
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．１３ （ｄ， Ｊ ＝ ９．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９７ （ｓ， １Ｈ）， ７．８７ （ｓ， １Ｈ）， ７．７４ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４５ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２９ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ２．８ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．７１ （ｓ， １Ｈ）， ４．４３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．８９ （ｓ， ３Ｈ）， ３．５２ （ｓ， ２Ｈ）， ２．６６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１３ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４６７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例５４（Ｍ１０９）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－エトキシナフタレン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000099
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．４２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９６ （ｓ， １Ｈ）， ７．８７ （ｓ， １Ｈ）， ７．６７ （ｔ， Ｊ ＝ １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６５－７．６０ （ｍ， １Ｈ）， ７．０５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７０ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６８ （ｔ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４２ （ｓ， １Ｈ）， ４．３２ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５１ （ｑ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１３ （ｓ， ３Ｈ）， １．５０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４８１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例５５（Ｍ１１０）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－エチルナフタレン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000100
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．２８－８．２６ （ｍ， １Ｈ）， ８．１９－８．１８ （ｍ，１Ｈ）， ７．９７ （ｓ， １Ｈ）， ７．８７－７．８５ （ｍ， １Ｈ）， ７．６７－７．６４ （ｍ， １Ｈ）， ７．４８ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．７０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４３ （ｓ， １Ｈ）， ３．５２ （ｑ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．１４ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１４ （ｓ， ３Ｈ）， １．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４６５ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例５６（Ｍ１１１）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）５－ブロモナフタレン－１－カルボチオアート
Figure 2023519266000101
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．４４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０６ － ７．９５ （ｍ， ３Ｈ）， ７．８８ （ｓ， １Ｈ）， ７．７９ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ７．２， Ｊ２ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５８ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ７．６， Ｊ２ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７４ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．７０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．５６ － ３．４９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６８ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２１ － ２．１６ （ｍ， ３Ｈ）， ２．１１ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５１６ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例５７（Ｍ１１４）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－（ｔｅｒｔ－ブチル）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000102
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９０ － ７．８２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．５９ － ７．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ６．８４ － ６．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６７ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．３８ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．０３ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ２．５６ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２７ － ２．０７ （ｍ， ６Ｈ）， １．３０ （ｓ， ９Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４４３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例５８（Ｍ１１５）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－エトキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000103
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８３－７．８２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０６－７．０３ （ｍ， ２Ｈ）， ６．６８ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３６ （ｓ， １Ｈ）， ４．１７ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４４ （ｑ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５４－２．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１０ （ｓ， ３Ｈ）， １．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．２８ （ｓ， ９Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４８７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例５９（Ｍ１４８）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン－４－カルボチオアート
Figure 2023519266000104
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．４７ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２２ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９５ （ｓ， １Ｈ）， ７．９０ － ７．８６ （ｍ， ３Ｈ）， ７．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５８ － ７．４７ （ｍ， ２Ｈ）， ６．６４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５４ － ３．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１３ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４７７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例６０～６８：以下の化合物を、適切な出発物質を用いてＭ１９（実施例６）の調製手順に従って合成した。
実施例６０（Ｍ９７）
（Ｚ）－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）メチル１－ナフトアート
Figure 2023519266000105
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．７５ （ｄ， １Ｈ）， ８．２９ － ８．２２ （ｍ， １Ｈ）， ８．１４ － ８．１２ （ｍ， １Ｈ）， ８．１２ － ８．０５ （ｍ， １Ｈ）， ７．９４ （ｓ， １Ｈ）， ７．８１ （ｓ， １Ｈ）， ７．６９ － ７．６３ （ｍ， ３Ｈ）， ６．７４ － ６．７１ （ｍ， ２Ｈ）， ５．３７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．７３ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３４ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．５７ － ３．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７３ － ２．６９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２５ （ｓ， ３Ｈ）， １．９５ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４６７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例６１（Ｍ９８）
（Ｚ）－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）メチルフェナントレン－９－カルボキシラート
Figure 2023519266000106
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．９７ － ８．８７ （ｍ， ２Ｈ）， ８．７７ － ８．７０ （ｍ， １Ｈ）， ８．５２ （ｓ， １Ｈ）， ８．１９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９８ （ｓ， １Ｈ）， ７．９０ － ７．８１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．８０ － ７．７３ （ｍ， ３Ｈ）， ６．７４ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ４．７８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．６３ － ３．５０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７４ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２４ （ｓ， ３Ｈ）， １．９８ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５１７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例６２（Ｍ９９）
（Ｚ）－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）メチル５，５，８，８－テトラメチル－５，６，７，８－テトラヒドロナフタレン－２－カルボキシラート
Figure 2023519266000107
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９３ （ｓ， １Ｈ）， ７．８９ － ７．８５ （ｍ， １Ｈ）， ７．７７ （ｓ， １Ｈ）， ７．６６ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ２．０， １Ｈ）， ７．５１ － ７．４６ （ｍ， １Ｈ）， ６．７３ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４４ － ４．１８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５７ － ３．４４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６７ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２９ － ２．２４ （ｍ， ３Ｈ）， １．９４ （ｓ， ３Ｈ）， １．６６ （ｓ， ４Ｈ）， １．２５ （ｓ， １２Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５２７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例６３（Ｍ１００）
（Ｚ）－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）メチル２－エトキシ－１－ナフトアート
Figure 2023519266000108
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．０７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９５ － ７．９０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．８０ （ｓ， １Ｈ）， ７．６２ － ７．４９ （ｍ， ３Ｈ）， ７．４３ （ｍ， １Ｈ）， ６．７３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ５．３３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．２７ － ４．２１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５５ － ３．４４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６１ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）， １．９５ （ｓ， ３Ｈ）， １．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５１１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例６４（Ｍ１０１）
（Ｚ）－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）メチル２，２－ジメチル－３－（ナフタレン－２－イル）プロパノアート
Figure 2023519266000109
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９０ （ｓ， １Ｈ）， ７．８８ － ７．７８ （ｍ， ４Ｈ）， ７．６４ － ７．５８ （ｍ， １Ｈ）， ７．５１ － ７．４４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２８ － ７．１９ （ｍ， １Ｈ）， ６．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．９５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．６６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．５０ － ３．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０１ － ２．９２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４８ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ２．２８ （ｍ， ３Ｈ）， １．９１ （ｓ， ３Ｈ）， １．１６ － １．１２ （ｍ， ６Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５２３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例６５（Ｍ１０３）
（Ｚ）－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）メチル２，２－ジフェニルプロパノアート
Figure 2023519266000110
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．７８ （ｓ， １Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．２８ － ７．３４ （ｍ， ６Ｈ）， ７．１２ － ７．３６ （ｍ， ４Ｈ）， ６．７２ － ６．７０ （ｍ， ２Ｈ）， ５．０４ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．６０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２７ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．２８ － ３．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３８ － ２．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２７ （ｓ， ３Ｈ）， １．８８ － １．８５ （ｍ， ６Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５２１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例６６（Ｍ１０５）
（Ｚ）－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）メチル２，２，２－トリフェニルアセタート
Figure 2023519266000111
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８９ （ｓ， １Ｈ）， ７．８０ （ｓ， １Ｈ）， ７．３４ － ７．２８ （ｍ， １１Ｈ）， ７．１１ － ７．０９ （ｍ， ７Ｈ）， ６．７７ － ６．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．３９ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．５６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．２０ － ３．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０８ － １．９９ （ｍ， ２Ｈ）， １．８９ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５８３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例６７（Ｍ１０７）
（Ｚ）－（（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）チオ）メチル２－メチル－２－（ナフタレン－２－イル）プロパノアート
Figure 2023519266000112
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９２ － ７．８２ （ｍ， ４Ｈ）， ７．７６ （ｓ， １Ｈ）， ７．７０ － ７．６４ （ｍ， １Ｈ）， ７．５３ － ７．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４４ － ７．３７ （ｍ， １Ｈ）， ６．６９ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．９６ （ｓ， ２Ｈ）， ４．５９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ － ４．１２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３２ － ３．２５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３４ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２９ － ２．２０ （ｍ， ３Ｈ）， １．７７ （ｓ， ３Ｈ）， １．６４ － １．５７ （ｍ， ６Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５０９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例６８（Ｍ１２６）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－フルオロ－６－フェノキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000113
ステップ１． ２－フルオロ－６－フェノキシ安息香酸
Figure 2023519266000114
２－ブロモ－６－フルオロ安息香酸（５．００ｇ、２２．８ｍｍｏｌ、１．００当量）及びフェノール（３．８７ｇ、４１．１ｍｍｏｌ、３．６１ｍＬ、１．８０当量）のＤＭＦ溶液（１００ｍＬ）に、ＣｕＩ（４３４ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ、０．１０当量）及びＣｓ２ＣＯ３（２２．３ｇ、６８．５ｍｍｏｌ、３．００当量）を加えた。混合物をＮ２下、１００℃で１０時間撹拌し、室温に冷却し、水（３００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで洗浄した（２００ｍＬで２回）。水相をＨＣｌ（２Ｍ）でｐＨ約１に調整し、酢酸エチルで抽出した（３００ｍＬで２回）。合わせた有機相をブラインで洗浄し（１００ｍＬで２回）、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、ろ過し、真空下で濃縮して粗生成物を得、それを逆相ＨＰＬＣ（５％～５５％アセトニトリル含有水、０．１％ＨＣｌ）で精製し、真空下で濃縮してアセトニトリルを除去した。残渣を酢酸エチルで抽出した（３００ｍＬで２回）。合わせた有機相をブラインで洗浄し（１００ｍＬで２回）、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、ろ過し、真空下で濃縮して、表題化合物（１．１０ｇ、４．７４ｍｍｏｌ、収率２１％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．４７ － ７．３６ （ｍ， ３Ｈ）， ７．２０ － ７．１６ （ｍ， １Ｈ）， ７．１３ － ７．０６ （ｍ， １Ｈ）， ７．０３ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ０．８０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．８０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ２３３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
ステップ２． ２－フルオロ－６－フェノキシベンゾイルクロリド
Figure 2023519266000115
２－フルオロ－６－フェノキシ安息香酸（５００ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）のＤＣＭ（１０．０ｍＬ）及びＤＭＦ（１．５７ｍｇ、２１．５ｕｍｏｌ、１．６６ｕＬ、０．０１当量）の溶液に、（ＣＯＣｌ）２（３２８ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ、２２６ｕＬ、１．２０当量）を２５℃で滴加した。反応混合物を２５℃で０．５時間撹拌した。反応を無水ＭｅＯＨでクエンチし、減圧下で濃縮して、表題化合物（５４０ｍｇ、粗）を黄色の油として得、それをそれ以上精製せずに次ステップに直接使用した。
ステップ３． （Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－フルオロ－６－フェノキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000116
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９３ （ｓ， １Ｈ）， ７．８３ （ｓ， １Ｈ）， ７．５８ － ７．４８ （ｍ， １Ｈ）， ７．４６ － ７．３９ （ｍ， １Ｈ）， ７．２４ － ７．１７ （ｍ， １Ｈ）， ７．１３ － ７．０２ （ｍ， １Ｈ）， ６．７８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．４７ － ４．２５ （ｍ， １Ｈ）， ３．４７ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ５．２０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．５８ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．２９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０５ （ｓ， １Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４９７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例６９～９９：以下の化合物を、Ｍ１２６の調製と本質的に同じ手順及び適切な出発物質を用いて合成した。
実施例６９（Ｍ１１３）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－フェノキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000117
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８３ （ｓ， １Ｈ）， ７．７９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６６ － ７．５６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４３ － ７．３６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２７ （ｄｔ， Ｊ１ ＝ ０．８， Ｊ２ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１９ － ７．１２ （ｍ， １Ｈ）， ７．０１ － ６．９５ （ｍ， ３Ｈ）， ６．７８ － ６．５９ （ｍ， ２Ｈ）， ４．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３４ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．３６ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０８ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４７９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例７０（Ｍ１２７）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－クロロ－６－フェノキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000118
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９１ （ｓ， １Ｈ）， ７．８１ （ｓ， １Ｈ）， ７．５３ － ７．４５ （ｍ， １Ｈ）， ７．４４ － ７．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３３ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１９ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０８ － ６．９７ （ｍ， ２Ｈ）， ６．９０ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８３ － ６．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６２ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ５．２０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．４１ － ３．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５９ － ２．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０７ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５１４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例７１（Ｍ１２８）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－メチル－６－フェノキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000119
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９１ （ｓ， １Ｈ）， ７．７９ （ｓ， １Ｈ）， ７．４０ － ７．３１ （ｍ， ３Ｈ）， ７．１６ － ７．０５ （ｍ， ２Ｈ）， ６．９８ － ６．９２ （ｍ， ２Ｈ）， ６．８０ － ６．６０ （ｍ， ３Ｈ）， ４．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３４ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．３７ － ３．３３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５３ － ２．５１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０６ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４９３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例７２（Ｍ１２９）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（ベンジルオキシ）－６－フルオロベンゾチオアート
Figure 2023519266000120
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９１ （ｓ， １Ｈ）， ７．８０ （ｓ， １Ｈ）， ７．５０ － ７．２５ （ｍ， ７Ｈ）， ７．０４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ８．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７７ － ６．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２１ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６３ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４３ － ３．３８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５９ － ２．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０５ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５１１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例７３（Ｍ１３０）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（３－クロロフェノキシ）－６－フルオロベンゾチオアート
Figure 2023519266000121
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８６ （ｓ， １Ｈ）， ７．８０ （ｓ， １Ｈ）， ７．６３ － ７．５５ （ｍ， １Ｈ）， ７．４６ － ７．４０ （ｍ， １Ｈ）， ７．２８ － ７．１８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１３ （ｔ， Ｊ ＝ ２．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９８ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ２．００ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７３ － ６．５７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３４ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ２．６０ － ２．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０６ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５３２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例７４（Ｍ１３１）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）５－クロロ－２－フェノキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000122
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８５ （ｓ， １Ｈ）， ７．８０ （ｓ， １Ｈ）， ７．６１ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５８ （ｄ， Ｊ ＝ ４．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４５ － ７．３９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２２ － ７．１６ （ｍ， １Ｈ）， ７．０４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．９７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７６ － ６．７３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６１ － ４．５６ （ｍ， １Ｈ）， ４．３５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４３ － ３．３８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４９ － ２．４５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１０ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５１４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例７５（Ｍ１３３）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（２－クロロフェノキシ）－４－メチルベンゾチオアート
Figure 2023519266000123
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８２ （ｓ， １Ｈ）， ７．７８ （ｓ， １Ｈ）， ７．６０ － ７．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３５ （ｄｔ， Ｊ１ ＝ １．６０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２１ （ｄｔ， Ｊ ＝ １．６０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９９ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ １．６０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７０ － ６．６０ （ｍ， ３Ｈ）， ４．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．４３ － ３．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４５ － ２．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０６ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５２８ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例７６（Ｍ１３４）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）５－クロロ－２－（４－フルオロフェノキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000124
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８４ （ｓ， １Ｈ）， ７．７９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６５ － ７．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２９ － ７．２４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１３ － ７．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ６．６６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６４（ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ５．６０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４２ － ３．３９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５６ － ２．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１１ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５３２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例７７（Ｍ１３５）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（３－シアノフェノキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000125
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８１ （ｓ， １Ｈ）， ７．７８ （ｓ， １Ｈ）， ７．７２ － ７．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６１ － ７．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４６ － ７．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２８ － ７．２０ （ｍ， １Ｈ）， ７．１４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６９ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．５８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３４ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．４５－３．３８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４２ － ２．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０８ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５０４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例７８（Ｍ１３６）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（２－クロロフェノキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000126
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８５ （ｓ， １Ｈ）， ７．８０ （ｓ， １Ｈ）， ７．６４ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ １．６０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ７．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６１ － ７．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４０ － ７．３３ （ｍ， １Ｈ）， ７．３１ － ７．２５ （ｍ， １Ｈ）， ７．２４ － ７．１９ （ｍ， １Ｈ）， ７．０６ － ７．００ （ｍ， １Ｈ）， ６．８６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６７ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．５９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．４２ － ３．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４６ － ２．４４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０８ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５１４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例７９（Ｍ１３７）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（２－ブロモフェノキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000127
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８５ （ｓ， １Ｈ）， ７．８０ （ｓ， １Ｈ）， ７．７３ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ １．６０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６４ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ １．６０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６０ － ７．５４ （ｍ， １Ｈ）， ７．４４ － ７．３７ （ｍ， １Ｈ）， ７．２８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１８ － ７．１２ （ｍ， １Ｈ）， ７．００ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ １．６０ Ｈｚ， ， Ｊ２ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７５ － ６．６０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．５９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｑ， Ｊ ＝ ６．８０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４７ － ２．４３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０８ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５５８ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例８０（Ｍ１３８）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（２，６－ジクロロフェノキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000128
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．３０ － ８．２５ （ｍ， １Ｈ）， ８．１３ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ３．２０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９８ （ｓ， １Ｈ）， ７．８８ － ７．８０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６９ － ７．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７１ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．６９ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．５５ － ３．４７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．６６ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１３ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４５７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例８１（Ｍ１３９）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（３－（ｔｅｒｔ－ブチル）フェノキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000129
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８６ （ｓ， １Ｈ）， ７．８０ （ｓ， １Ｈ）， ７．６６ － ７．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３４ － ７．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１９ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０５ － ６．９３ （ｍ， ２Ｈ）， ６．７９ － ６．５６ （ｍ， ３Ｈ）， ４．５８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３４ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．４０ － ３．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４４ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０７ （ｓ， ３Ｈ）， １．２６ （ｓ， ９Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５３５ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例８２（Ｍ１４０）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（ナフタレン－２－イルオキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000130
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９１ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８６ － ７．８１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．７７ （ｓ， １Ｈ）， ７．７２ － ７．６５ （ｍ， １Ｈ）， ７．６５ － ７．５８ （ｍ， １Ｈ）， ７．５４ － ７．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３７ － ７．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２６ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ２．４０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７０ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．５０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３２ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．２３ （ｑ， Ｊ ＝ ６．４０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３５ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．４０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０５ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５２９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例８３（Ｍ１４１）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（キノリン－８－イルオキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000131
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８６ （ｓ， １Ｈ）， ７．８４ － ７．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６８ － ７．５９ （ｍ， １Ｈ）， ７．４９ － ７．３２ （ｍ， ３Ｈ）， ７．３２ － ７．１７ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１１ － ６．８４ （ｍ， １Ｈ）， ６．８３ － ６．４７ （ｍ， ３Ｈ）， ６．４４ － ６．０６ （ｍ， １Ｈ）， ４．６４ － ４．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．１３ － ３．９５ （ｍ， １Ｈ）， ３．５６ － ３．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８０ － ２．７０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）， １．８３ （ｂｒ ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５３０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例８４（Ｍ１４２）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（２－クロロフェノキシ）－６－フルオロベンゾチオアート
Figure 2023519266000132
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８９ （ｓ， １Ｈ）， ７．８０ （ｓ， １Ｈ）， ７．５８ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ １．６０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５１ － ７．４５ （ｍ， １Ｈ）， ７．４１ － ７．３６ （ｍ， １Ｈ）， ７．２９ － ７．２３ （ｍ， １Ｈ）， ７．１８ － ７．０８ （ｍ， ２Ｈ）， ６．８７ － ６．６１ （ｍ， ２Ｈ）， ６．５５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４２ － ３．３８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５７ － ２．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０６ （ｄ， Ｊ ＝ １．６０ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５３２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例８５（Ｍ１４３）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－エトキシ－２－（３－フルオロフェノキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000133
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．７９ （ｓ， １Ｈ）， ７．７７ （ｓ， １Ｈ）， ７．６９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４４ － ７．３６ （ｍ， １Ｈ）， ６．９８ （ｄｔ， Ｊ１ ＝ ２．４０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９１ － ６．８５ （ｍ， １Ｈ）， ６．７６ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ２．００ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６５ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ２．００ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．５４ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３１ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．０６ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３７ － ３．３３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４０ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．１７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０６ （ｓ， ３Ｈ）， １．３０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８０ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５４１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例８６（Ｍ１４５）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－フェノキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000134
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８９ （ｓ， １Ｈ）， ７．８３ （ｓ， １Ｈ）， ７．６４ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４０ － ７．３６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３２ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ７．２０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１９ － ７．０８ （ｍ， １Ｈ）， ７．０１ （ｓ， １Ｈ）， ６．９６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．３０ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．３５ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２１ － ４．０６ （ｍ， １Ｈ）， ３．５０ － ３．４３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ２．２５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０６ （ｓ， ３Ｈ）， １．２６ （ｓ， ９Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５３５ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例８７（Ｍ１４６）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（（６－（トリフルオロメチル）ピリジン－３－イル）オキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000135
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．５０ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８５ － ７．６３ （ｍ， ４Ｈ）， ７．５０ － ７．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３９ － ７．２７ （ｍ， １Ｈ）， ６．７１ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．５９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ２．５９ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ６．８０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４０ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．４０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０９ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５４８ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例８８（Ｍ１４７）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）オキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000136
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８５ （ｓ， １Ｈ）， ７．８０ （ｓ， １Ｈ）， ７．６５ － ７．５１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６７ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ６．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４８ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ２．８０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６７ － ４．５４ （ｍ， １Ｈ）， ４．３５ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．２５ － ４．２３ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ２．４０ Ｈｚ， ４Ｈ）， ３．４１ （ｑ， Ｊ ＝ ６．４０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４８ － ４．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０９ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５３７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例８９（Ｍ１４９）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－クロロ－４－フェノキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000137
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８８ （ｓ， １Ｈ）， ７．８４ （ｓ， １Ｈ）， ７．６１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５０ （ｔ， Ｊ ＝ ８．００ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３３ － ７．２８ （ｍ， １Ｈ）， ７．２２ － ７．１５ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９８ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ２．４０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７９ － ６．６８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４５ － ４．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４９ － ３．４５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６０ － ２．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１５ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５１４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例９０（Ｍ１５０）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－フルオロ－６－メチル－４－フェノキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000138
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９１ （ｓ， １Ｈ）， ７．８３ （ｓ， １Ｈ）， ７．４９ － ７．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２９ － ７．２２ （ｍ， １Ｈ）， ７．１４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．００ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７９ － ６．５７ （ｍ， ４Ｈ）， ４．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３９ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．４９ － ３．４３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６０ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ２．２６ （ｍ， ３Ｈ）， ２．１９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１２ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５１１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例９１（Ｍ１５１）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－（３－クロロフェノキシ）－２－メチルベンゾチオアート
Figure 2023519266000139
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８８ （ｓ， １Ｈ）， ７．８３ （ｓ， １Ｈ）， ７．６７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４７ （ｔ， Ｊ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３０ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ０．８０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２３ （ｔ， Ｊ ＝ ２．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０９ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ ２．００ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．００ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ２．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９０ （ｂｒ ｄｄ， Ｊ ＝ ２．４０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８２ － ６．５９ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６５ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４０ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．４６ （ｑ， Ｊ ＝ ６．４０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５８ － ２．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１４ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５２８ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例９２（Ｍ１５２）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２，４－ジフェノキシベンゾチオアート
Figure 2023519266000140
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．１３ （ｓ， １Ｈ）， ７．９３ （ｓ， １Ｈ）， ７．７１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４３ － ７．４１ （ｍ， ５Ｈ）， ７．２８ － ７．１８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．０９ （ｍ， ５Ｈ）， ６．７９ － ６．７７ （ｍ， １Ｈ）， ６．３８ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７０ （ｓ， １Ｈ）， ４．４８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．００ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４４８ － ２．４４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１６ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５７１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例９３（Ｍ１５３）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（フェニルチオ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000141
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９２ （ｓ， １Ｈ）， ７．８５ （ｓ， １Ｈ）， ７．６９ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ １．２０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５３ － ７．４０ （ｍ， ７Ｈ）， ７．３４ － ７．２８ （ｍ， １Ｈ）， ６．９０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８６ － ６．６０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４４ － ４．３３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４９ － ３．４４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６２ － ２．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１４ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ４９５ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例９４（Ｍ１５５）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（４－（２－オキソピロリジン－１－イル）フェノキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000142
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８４ （ｓ， １Ｈ）， ７．７９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６９ － ７．６３ （ｍ， ３Ｈ）， ７．６２ － ７．５４ （ｍ， １Ｈ）， ７．３１ － ７．２２ （ｍ， １Ｈ）， ７．０４ － ６．９９ （ｍ， ２Ｈ）， ６．９６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６９ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．５９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３４ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．８２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４２ － ３．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４９ － ２．４４ （ｍ， ４Ｈ）， ２．１７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１１ － ２．０２ （ｍ， ５Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５６２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例９５（Ｍ１５６）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－（３－（ｔｅｒｔ－ブチル）フェノキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000143
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８３ （ｓ， １Ｈ）， ７．７９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３９ － ７．３０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９９ （ｓ， ２Ｈ）， ６．７４ － ６．６６ （ｍ， ３Ｈ）， ４．６２ － ４．５４ （ｍ， １Ｈ）， ４．４２ － ４．３９ （ｓ， ２Ｈ）， ２．４５ － ２．４０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．１７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０６ （ｓ， ３Ｈ）， １．２４ （ｓ， ９Ｈ）， １．２１ （ｓ， ９Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５９１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例９６（Ｍ１５７）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（ナフタレン－１－イルオキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000144
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．０９ － ８．０４ （ｍ， １Ｈ）， ８．０１ － ７．９６ （ｍ， １Ｈ）， ７．８４ （ｓ， １Ｈ）， ７．８０ － ７．７１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６８ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ １．６０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６２ － ７．５２ （ｍ， ３Ｈ）， ７．４７ （ｔ， Ｊ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３２ － ７．２４ （ｍ， １Ｈ）， ６．９７ － ６．８８ （ｍ， ２Ｈ）， ６．６９ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ４．５２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３３ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．２９ － ３．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３９ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．４０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０５ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５２９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例９７（Ｍ１５８）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）５－クロロ－２－（２－クロロフェノキシ）ベンゾチオアート
Figure 2023519266000145
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８７ （ｓ， １Ｈ）， ７．８１ （ｓ， １Ｈ）， ７．６４ － ７．５８ （ｍ， ３Ｈ）， ７．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１４ （ｔ， Ｊ ＝ ８．００ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６３ － ４．５９ （ｍ， １Ｈ）， ４．３５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４６ － ３．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４６ － ２．４４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１０ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５４８ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例９８（Ｍ１５９）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（２－ブロモフェノキシ）－５－クロロベンゾチオアート
Figure 2023519266000146
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８７ （ｓ， １Ｈ）， ７．８１ （ｓ， １Ｈ）， ７．７８ － ７．７４ （ｍ， １Ｈ）， ７．６５ － ７．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４８ － ７．４２ （ｍ， １Ｈ）， ７．２５ － ７．１８ （ｍ， １Ｈ）， ７．１６ － ７．１３ （ｍ， １Ｈ）， ６．８６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６２ － ４．５８ （ｍ， １Ｈ）， ４．３５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４５ － ３．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４６ － ２．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ２．１７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１０ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５９２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例９９（Ｍ１６０）
（Ｚ）－Ｓ－（２－（Ｎ－（（４－アミノ－２－メチルピリミジン－５－イル）メチル）ホルムアミド）－５－ヒドロキシペンタ－２－エン－３－イル）２－（２－ブロモフェノキシ）－６－フルオロベンゾチオアート
Figure 2023519266000147
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８９ （ｓ， １Ｈ）， ７．８１ （ｓ， １Ｈ）， ７．７５ （ｄｄ， Ｊ１ ＝ １．２０ Ｈｚ， Ｊ２ ＝ ７．６０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５６ － ７．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２３ － ７．１９ （ｍ， １Ｈ）， ７．１８ － ７．０８ （ｍ， ２Ｈ）， ６．６３ － ６．６１ （ｍ， ２Ｈ）， ６．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６４ － ４．６１ （ｍ， １Ｈ）， ４．３５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４７ － ３．３６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０６ （ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ （ＥＳ＋） ｍ／ｅ ５７６ （Ｍ＋Ｈ）＋．
実施例１００：結果
哺乳類細胞においてこれらのチアミン類似体リボスイッチをオンにすることがより強力である化合物、及び／または薬物動態パラメータの改善等の他の特性を有する化合物を同定するため、追加の化合物（例えば、式ＩＶ～ＶＩＩＩの化合物）を作り、チアミン類似体リボスイッチの調節におけるそれらの活性について、１５Ｄ１０リボスイッチを有するルシフェラーゼコンストラクト（Ｌｕｃｉ－１５Ｄ１０、配列番号９３）を使用して試験した。
１５Ｄ１０リボスイッチをルシフェラーゼレポーター遺伝子に挿入することにより、配列番号９３を得た。大文字は、ルシフェラーゼコード配列を示す。小文字は、イントロン／選択的エクソン／イントロンとリボスイッチの配列を示す。１５Ｄ１０アプタマーコード配列（配列番号２６）には下線が引かれている。
配列番号９３：
Figure 2023519266000148
Figure 2023519266000149
式ＩＶの化合物を最初にＨＥＫ２９３細胞で試験した。図９Ａに示すように、ルシフェラーゼ遺伝子発現は、ＨＥＫ２９３細胞において化合物Ｍ１０、Ｍ１６、Ｍ１８、Ｍ１９またはＭ２１による処理時、用量依存的に増加した。フルスルチアミンの活性と比較すると、Ｍ１９は、ルシフェラーゼ発現を誘導する上でより強力であり、ＨＥＫ２９３細胞において、１２．５μＭの濃度でのルシフェラーゼ発現の１６８．７倍の増加を生じた。さらに、これらの新たな化合物をマウス肝細胞株ＡＭＬ１２細胞で試験した。図９Ｂに示すように、ＨＥＫ２９３細胞からの所見と一致して、すべての化合物が、１５Ｄ１０リボスイッチを有するコンストラクトからのルシフェラーゼ発現を用量依存的に増加させた。リボスイッチ１５Ｄ１０に対するフルスルチアミンの活性と比較すると、化合物Ｍ１０、Ｍ１６、Ｍ１９及びＭ２１はフルスルチアミンよりも強力である。Ｍ１９及びＭ２１は、この種の細胞でリボスイッチ１５Ｄ１０により調節されたルシフェラーゼ発現の誘導において同程度強力である。
式Ｖ及び式ＶＩの化合物を、対照化合物としてのベンフォチアミンと共に、ＨＥＫ２９３細胞及びＡＭＬ１２細胞の両方で試験した。図９Ｃに示すように、化合物Ｍ３０、Ｍ３１、Ｍ３２及びＭ３３、ならびにベンフォチアミンには、ルシフェラーゼ発現に対する効果はなかったが、Ｍ２６、Ｍ２７、Ｍ２８、Ｍ２９及びＭ３４は、Ｌｕｃｉ－１５Ｄ１０コンストラクトからのルシフェラーゼ発現を増加させ、ＨＥＫ２９３細胞ではＭ３４が最も強力な化合物であった。対照的に、ＡＭＬ１２細胞では、Ｍ３０及びＭ３３を除くすべての化合物が、Ｌｕｃｉ－１５Ｄ１０コンストラクトからのルシフェラーゼ発現を増加させた。これらの２つの細胞型内で一貫して、リボスイッチをオンにする上で、これらの２群の化合物中でＭ３４が最も強力な誘導物質である（図９Ｄ）。
比較的強力な化合物を、リボスイッチの調節におけるそれらの活性について、追加のヒト細胞株でさらに試験した。図９Ｅに示すように、ヒトＡＲＰＥ－１９細胞では、ベンフォチアミンとＭ３２の両方とも、リボスイッチ１５Ｄ１０により調節されたルシフェラーゼ発現の増加における活性を示さなかったが、Ｍ１０、Ｍ１９及びＭ２１には、Ｌｕｃｉ－１５Ｄ１０コンストラクトからのルシフェラーゼ発現の増加においてフルスルチアミンと同等の効力がある。同様に、ベンフォチアミン及びＭ３２にはＨｅｐ Ｇ２細胞での活性はないが、Ｍ１９、Ｍ２１及びＭ１０には、１２．５μＭの濃度で同様の効力がある（図９Ｆ）。
化合物Ｍ３４～Ｍ１２３及び化合物Ｍ１２６～Ｍ１６０を、１５Ｄ１０リボスイッチを有するルシフェラーゼコンストラクト（Ｌｕｃｉ－１５Ｄ１０、配列番号９３）を使用するチアミン類似体リボスイッチの調節におけるそれらの活性について、フルスルチアミンを対照化合物として用いてＨＥＫ２９３細胞とＡＭＬ１２細胞の両方で試験した。これらの化合物に応答した、Ｌｕｃｉ－１５Ｄ１０コンストラクトからのルシフェラーゼ発現の増加を表２及び表３に示す。
Figure 2023519266000150
Figure 2023519266000151

Claims (55)

  1. 小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含む、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットであって、前記アプタマーコード配列が、
    ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＸ２ＴＸ３ＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＸ４ＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号１）を含み、ここで、
    Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
    Ｘ２は、Ｃであるかまたはヌクレオチドがなく、
    Ｘ３は、Ｔであるかまたはヌクレオチドがなく、
    Ｘ４は、ＡまたはＧであり、
    Ｘ５は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ６は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ７は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ９は、Ｃ、Ｇ、またはＴであり、
    Ｘ１０は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ１１は、ＡまたはＴであり、
    Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
    Ｘ１３は、ＣまたはＴである、前記ポリヌクレオチドカセット。
  2. 小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含む、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットであって、前記アプタマーコード配列が、
    ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＸ２ＴＸ３ＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号２）を含み、ここで、
    Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
    Ｘ２は、Ｃであるかまたはヌクレオチドがなく、
    Ｘ３は、Ｔであるかまたはヌクレオチドがなく、
    Ｘ５は、ＧまたはＴであり、
    Ｘ６は、ＣまたはＴであり、
    Ｘ７は、ＣまたはＴであり、
    Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ９は、ＧまたはＴであり、
    Ｘ１０は、Ａ、Ｇ、またはＴであり、
    Ｘ１１は、ＡまたはＴであり、
    Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
    Ｘ１３は、ＣまたはＴである、前記ポリヌクレオチドカセット。
  3. 小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含む、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットであって、前記アプタマーコード配列が、
    ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ配列番号３）を含み、ここで、
    Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
    Ｘ１３は、ＣまたはＴである、前記ポリヌクレオチドカセット。
  4. 小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含む、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットであって、前記アプタマーコード配列が、
    ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＴＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号４）を含み、ここで、
    Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
    Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ９は、ＧまたはＴであり、
    Ｘ１０は、Ａ、Ｇ、またはＴであり、かつ
    Ｘ１１は、ＡまたはＴである、前記ポリヌクレオチドカセット。
  5. 小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含む、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットであって、前記アプタマーコード配列が、
    ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＴＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号５）を含み、ここで、
    Ｘ５は、ＧまたはＴであり、
    Ｘ６は、ＣまたはＴであり、かつ
    Ｘ７は、ＣまたはＴである、前記ポリヌクレオチドカセット。
  6. 小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含む、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットであって、前記アプタマーコード配列が、
    ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＸ４ＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０ＡＣＣＴＧＴＴＣＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号６）を含み、ここで、
    Ｘ４は、ＡまたはＧであり、
    Ｘ５は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ６は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ７は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ９は、ＣまたはＧであり、かつ
    Ｘ１０は、任意のヌクレオチドである、前記ポリヌクレオチドカセット。
  7. 小分子に結合するアプタマーをコードする配列を含む、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットであって、前記アプタマーコード配列が、配列番号７～３６からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、前記ポリヌクレオチドカセット。
  8. 前記アプタマーコード配列が、配列番号７～３６からなる群から選択される、請求項７に記載のポリヌクレオチドカセット。
  9. 前記アプタマーコード配列が、配列番号８、９、１４～１８、２１、２５、２６、及び３０からなる群から選択される、請求項８に記載のポリヌクレオチドカセット。
  10. 前記アプタマーコード配列が、配列番号９、１４、及び２６からなる群から選択される配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチドカセット。
  11. 小分子に結合するアプタマーをコードする核酸配列であって、前記アプタマーコード配列が、
    ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＸ２ＴＸ３ＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＸ４ＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号１）を含み、ここで、
    Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
    Ｘ２は、Ｃであるかまたはヌクレオチドがなく、
    Ｘ３は、Ｔであるかまたはヌクレオチドがなく、
    Ｘ４は、ＡまたはＧであり、
    Ｘ５は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ６は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ７は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ９は、Ｃ、Ｇ、またはＴであり、
    Ｘ１０は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ１１は、ＡまたはＴであり、
    Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
    Ｘ１３は、ＣまたはＴである、前記核酸配列。
  12. 前記アプタマーコード配列が、Ｘ１がＡではない；Ｘ２がＣではない；Ｘ３がＴではない；Ｘ４がＧではない；Ｘ５がＧではない；Ｘ６がＣではない；Ｘ７がＣではない；Ｘ８がＴではない；Ｘ９がＧではない；Ｘ１０がＡではない；Ｘ１１がＡではない；Ｘ１２がＴではない；及びＸ１３がＣではない、という特性のうちの１つ以上を有する、請求項１１に記載の核酸配列。
  13. Ｘ１がＡである；Ｘ２がＣである；Ｘ３がＴである；Ｘ４がＧである；Ｘ５がＧである；Ｘ６がＣである；Ｘ７がＣである；Ｘ８がＴである；Ｘ９がＧである；Ｘ１０がＡである；Ｘ１１がＡである；Ｘ１２がＴである；及びＸ１３がＣである、の全てが前記アプタマーコード配列中に同時に存在することはない、請求項１１に記載の核酸配列。
  14. 小分子に結合するアプタマーをコードする核酸配列であって、前記アプタマーコード配列が、
    ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＸ２ＴＸ３ＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号２）を含み、ここで、
    Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
    Ｘ２は、Ｃであるかまたはヌクレオチドがなく、
    Ｘ３は、Ｔであるかまたはヌクレオチドがなく、
    Ｘ５は、ＧまたはＴであり、
    Ｘ６は、ＣまたはＴであり、
    Ｘ７は、ＣまたはＴであり、
    Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ９は、ＧまたはＴであり、
    Ｘ１０は、Ａ、Ｇ、またはＴであり、
    Ｘ１１は、ＡまたはＴであり、
    Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
    Ｘ１３は、ＣまたはＴである、前記核酸配列。
  15. 前記アプタマーコード配列が、Ｘ１がＡではない；Ｘ２がＣではない；Ｘ３がＴではない；Ｘ４がＧではない；Ｘ５がＧではない；Ｘ６がＣではない；Ｘ７がＣではない；Ｘ８がＴではない；Ｘ９がＧではない；Ｘ１０がＡではない；Ｘ１１がＡではない；Ｘ１２がＴではない；及びＸ１３がＣではない、という特性のうちの１つ以上を有する、請求項１４に記載の核酸配列。
  16. Ｘ１がＡである；Ｘ２がＣである；Ｘ３がＴである；Ｘ５がＧである；Ｘ６がＣである；Ｘ７がＣである；Ｘ８がＴである；Ｘ９がＧである；Ｘ１０がＡである；Ｘ１１がＡである；Ｘ１２がＴである；及びＸ１３がＣである、の全てが前記アプタマーコード配列中に同時に存在することはない、請求項１４に記載の核酸配列。
  17. 小分子に結合するアプタマーをコードする核酸配列であって、前記アプタマーコード配列が、
    ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＸ１２ＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＸ１３ＧＣＡＧＧＧＡＧＴ配列番号３）を含み、ここで、
    Ｘ１２は、ＣまたはＴであり、かつ
    Ｘ１３は、ＣまたはＴである、前記核酸配列。
  18. 前記アプタマーコード配列が、Ｘ１２がＴではない；及びＸ１３がＣではない、という特性のうちの１つ以上を有する、請求項１７に記載の核酸配列。
  19. Ｘ１２がＴである、及びＸ１３がＣである、の全てが前記アプタマーコード配列中に同時に存在することはない、請求項１７に記載の核酸配列。
  20. 小分子に結合するアプタマーをコードする核酸配列であって、前記アプタマーコード配列が、
    ＡＣＸ１ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＣＣＴＧＴＴＴＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号４）を含み、ここで、
    Ｘ１は、ＡまたはＧであり、
    Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ９は、ＧまたはＴであり、
    Ｘ１０は、Ａ、Ｇ、またはＴであり、かつ
    Ｘ１１は、ＡまたはＴである、前記核酸配列。
  21. 前記アプタマーコード配列が、Ｘ１がＡではない；Ｘ８がＴではない；Ｘ９がＧではない；Ｘ１０がＡではない；Ｘ１１がＡではない、という特性のうちの１つ以上を有する、請求項２０に記載の核酸配列。
  22. Ｘ１がＡである；Ｘ８がＴである；Ｘ９がＧである；Ｘ１０がＡである；Ｘ１１がＡである；Ｘ１２がＴである；及びＸ１３がＣである、の全てが前記アプタマーコード配列中に同時に存在することはない、請求項２０に記載の核酸配列。
  23. 小分子に結合するアプタマーをコードする核酸配列であって、前記アプタマーコード配列が、
    ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＴＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号５）を含み、ここで、
    Ｘ５は、ＧまたはＴであり、
    Ｘ６は、ＣまたはＴであり、かつ
    Ｘ７は、ＣまたはＴである、前記核酸配列。
  24. 前記アプタマーコード配列が、Ｘ５がＧではない；Ｘ６がＣではない；及びＸ７がＣではない、という特性のうちの１つ以上を有する、請求項２３に記載の核酸配列。
  25. Ｘ５がＧである；Ｘ６がＣである；及びＸ７がＣである、の全てが前記アプタマーコード配列中に同時に存在することはない、請求項２３に記載の核酸配列。
  26. 小分子に結合するアプタマーをコードする核酸配列であって、前記アプタマーコード配列が、
    ＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＣＸ４ＣＣＧＧＴＧＡＧＡＸ５Ｘ６ＡＸ７ＡＣＣＣＴＴＸ８Ｘ９Ｘ１０ＡＣＣＴＧＴＴＣＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴ（配列番号６）を含み、ここで、
    Ｘ４は、ＡまたはＧであり、
    Ｘ５は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ６は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ７は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ８は、任意のヌクレオチドであり、
    Ｘ９は、ＣまたはＧであり、かつ
    Ｘ１０は、任意のヌクレオチドである、前記核酸配列。
  27. 小分子に結合するアプタマーをコードする核酸配列であって、前記アプタマーコード配列が、配列番号７～３６からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、前記核酸配列。
  28. 前記アプタマーコード配列が、配列番号７～３６からなる群から選択される、請求項２７に記載の核酸配列。
  29. 前記アプタマーコード配列が、配列番号８、９、１４～１８、２１、２５、２６、及び３０からなる群から選択される、請求項２８に記載の核酸配列。
  30. 前記アプタマーコード配列が、配列番号９、１４、及び２６からなる群から選択される配列を含む、請求項２９に記載の核酸配列。
  31. 前記アプタマーが、
    ａ）式Ｉ
    Figure 2023519266000152
     ［式中、
    Ｒ１は、ＯＨ、アミノ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホスファート、ピロホスファート、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－フェニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－複素環、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－フェニル、及び－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－複素環からなる群から選択される］、
    ｂ）式ＩＩ
    Figure 2023519266000153
     ［式中、
    Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－（ＣＨ２）ｎ－Ｒ６、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ４、－ＣＨＲ５－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｓ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｓ－Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｓ－複素環、及び－Ｓ－ＣＨ２－複素環からなる群から選択されるか、
    または、Ｒ２は、前記化合物が、ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）結合を介して接続されている２つの式ＩＩの分子の二量体を形成するよう－Ｓ－［式ＩＩ］であり、
    Ｒ３は、ＯＨ、アミノ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホスファート、ピロホスファート、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－フェニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－複素環、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－フェニル、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－複素環からなる群から選択され、
    Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
    Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
    Ｒ６は、ヒドロキシル、アミノ、アミド、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシルリル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルであり、かつ
    ｎは、１～８であり、
    前記アルキル基、前記アルケニル基、前記シクロアルキル基、前記ビシクリル基、前記トリシクリル基、前記アリール基、前記ヘテロアリール基及び前記ヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい］、
    ｃ）式ＩＩＩ
    Figure 2023519266000154
     ［式中、
    Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－（ＣＨ２）ｎ－Ｒ６、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ４、－ＣＨＲ５－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ４、－Ｓ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｓ－Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｓ－複素環、及び－Ｓ－ＣＨ２－複素環からなる群から選択され、
    Ｒ３１は、ＯＨ及びホスファートからなる群から選択され、
    Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
    Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
    Ｒ６は、ヒドロキシル、アミノ、アミド、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシルリル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルであり、かつ
    ｎは、１～８であり、
    前記アルキル基、前記アルケニル基、前記シクロアルキル基、前記ビシクリル基、前記トリシクリル基、前記アリール基、前記ヘテロアリール基及び前記ヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい］、
    ｄ）式ＩＶ
    Figure 2023519266000155
     ［式中、
    Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
    Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
    前記アルキル基、前記アルケニル基、前記シクロアルキル基、前記ビシクリル基、前記トリシクリル基、前記アリール基、前記ヘテロアリール基及び前記ヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい］、
    ｅ）式Ｖ
    Figure 2023519266000156
     ［式中、
    Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
    前記アルキル基、前記アルケニル基、前記シクロアルキル基、前記ビシクリル基、前記トリシクリル基、前記アリール基、前記ヘテロアリール基及び前記ヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい］、
    ｆ）式ＶＩ
    Figure 2023519266000157
     ［式中、
    Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ９－Ｃ１４トリシクリル、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－（Ｃ２－Ｃ６アルケニル）－アリール、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択され、
    前記アルキル基、前記アルケニル基、前記シクロアルキル基、前記ビシクリル基、前記トリシクリル基、前記アリール基、前記ヘテロアリール基及び前記ヘテロシクリル基の各々は、非置換であっても、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群から選択される１～３つの置換基により置換されてもよい］、
    ｇ）式ＶＩＩ
    Figure 2023519266000158
     ［式中、
    各Ｒ７は、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択され、
    追加または別法として、２つの隣接するＲ７基が一緒になって５員または６員の芳香族または非芳香族の縮合環を形成してよく、これが、０～２個の環ヘテロ原子を含有し、かつ、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択される最大４つの置換基により置換されており、
    ｍは、０、１、２、３または４である］、及び
    ｈ）式ＶＩＩＩ
    Figure 2023519266000159
     ［式中、
    各Ｒ８は、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択され、
    追加または別法として、２つの隣接するＲ８基が一緒になって５員または６員の芳香族または非芳香族の縮合環を形成してよく、これが、０～２個の環ヘテロ原子を含有し、かつ、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択される最大４つの置換基により置換されており、
    各Ｒ９は、独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択され、
    追加または別法として、２つの隣接するＲ９基が一緒になって５員または６員の芳香族または非芳香族の縮合環を形成してよく、これが、０～２個の環ヘテロ原子を含有し、かつ、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、アミド、スルホンアミド、ニトロ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０ビシクリル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｏ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、アリール、－Ｏ－アリール、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｓ－（Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６ペルハロアルキル）、－Ｓ－アリール、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルから選択される最大４つの置換基により置換されており、
    ｘは、０、１、２または３であり、
    ｙは、０、１、２、３、または４である］、
    のうちのいずれか１つによる構造を有する小分子に結合するか、そうでなければその存在に応答する、請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドカセットまたは請求項１１～３０のいずれか１項に記載の核酸配列。
  32. 前記アプタマーが、アセフルチアミン、アセチアミン、アリチアミン、アンプロリウム、ベクロチアミン、ベンフォチアミン、ベンチアミン、ビスベンチアミン、セトチアミン、シコチアミン、フルスルチアミン、モノホスホチアミン、オクトチアミン、オキシチアミン、プロスルチアミン、スルブチアミン、チアミン、チアミンピロリン酸、及びビンチアモールからなる群から選択される小分子に結合するか、そうでなければその存在に応答する、請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドカセットまたは請求項１１～３０のいずれか１項に記載の核酸配列。
  33. 前記アプタマーが、ベンフォチアミン、フルスルチアミン、及びプロスルチアミンからなる群から選択される小分子に結合するか、そうでなければその存在に応答する、請求項３２に記載のポリヌクレオチドカセットまたは核酸配列。
  34. 前記アプタマーが、ベンフォチアミンに結合するか、そうでなければその存在に応答する、請求項３３に記載のポリヌクレオチドカセットまたは核酸配列。
  35. 前記アプタマーが、フルスルチアミンに結合するか、そうでなければその存在に応答する、請求項３３に記載のポリヌクレオチドカセットまたは核酸配列。
  36. 前記アプタマーが、プロスルチアミンに結合するか、そうでなければその存在に応答する、請求項３３に記載のポリヌクレオチドカセットまたは核酸配列。
  37. 前記アプタマーが、等モル量のフルスルチアミン、ベンフォチアミンまたはプロスルチアミンと比較してチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）に対して低結合性を有する、及び／または低応答性を示す、請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドカセットまたは請求項１１～３０のいずれか１項に記載の核酸配列。
  38. 前記アプタマーが、標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットの一部としてコードされるリボスイッチとの関連にある、請求項３７に記載の、ポリヌクレオチドカセットまたは核酸配列。
  39. 小分子に応答した、標的遺伝子発現の調節のためのリボスイッチであって、請求項１～３８のいずれか１項に記載のアプタマーを含む、前記リボスイッチ。
  40. 前記リボスイッチが配列番号３７の配列を含む、請求項３９に記載のリボスイッチ。
  41. 小分子に応答した、標的遺伝子の発現の調節のためのポリヌクレオチドカセットであって、
    （ｃ）リボスイッチと、
    （ｄ）５’イントロン及び３’イントロンが隣接する選択的にスプライスされるエクソンと、
    を含み、
    ここで、前記リボスイッチが、（ｉ）前記３’イントロンの５’スプライス部位配列が含まれるステムを含むエフェクター領域、及び（ｉｉ）請求項１～３８のいずれか１項に記載のアプタマーを含み、かつ
    前記選択的にスプライスされるエクソンが、前記選択的にスプライスされるエクソンがスプライスされて前記標的遺伝子のｍＲＮＡとなる際に、前記標的遺伝子と共にインフレームにある終止コドンを含む、前記ポリヌクレオチドカセット。
  42. 前記リボスイッチが、配列番号３７の配列を含む、請求項［００４０］に記載のポリヌクレオチドカセット。
  43. 前記ポリヌクレオチドカセットが、前記標的遺伝子のタンパク質コード配列中に位置する、請求項［００４０］に記載のポリヌクレオチドカセット。
  44. 前記ポリヌクレオチドカセットが、前記標的遺伝子の非翻訳領域内または前記標的遺伝子のイントロン内に位置する、請求項［００４０］に記載のポリヌクレオチドカセット。
  45. 請求項１～１０、３１～３８もしくは４１～４４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドカセット、請求項１１～３８のいずれか１項に記載の核酸、または請求項３９もしくは４０のいずれか１項に記載のリボスイッチ、を含むベクター。
  46. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項４５に記載のベクター。
  47. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項４６に記載のベクター。
  48. 目的の化合物に応答して標的遺伝子発現を調節するアプタマーを同定するための方法であって、
    （ｉ）親アプタマーを選択するステップ、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）で選択されたアプタマーをコードする配列を含むリボスイッチライブラリーを生成するステップであって、前記アプタマーコード配列が、前記アプタマーの１つ以上の不対領域において１つ以上のランダムに変異させたヌクレオチドを含み、前記変異アプタマー配列が、レポーター遺伝子の発現を制御するリボスイッチとの関連にある、前記リボスイッチライブラリー生成ステップ、
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）からの前記ライブラリーを、式Ｉ～ＶＩＩによる化合物の付加に応答した前記標的遺伝子発現の調節が親アプタマー配列と比較して増大しているアプタマーについてスクリーニングするステップ、
    （ｉｖ）（ステップ（ｉｉｉ）で同定されたアプタマーで）ステップ（ｉｉ）及びｉｉｉを任意選択で繰り返すステップ、を含む、前記方法。
  49. 前記親アプタマーがＴＰＰアプタマーであり、かつ、前記目的の化合物がチアミンの類似体または誘導体である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記ＴＰＰアプタマーは、Ｒｆａｍ ＴＰＰリボスイッチファミリーＲＦ０００５９から選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記チアミンの類似体または誘導体が式Ｉ～ＶＩＩＩからなる群から選択される、請求項４９または請求項５０に記載の方法。
  52. 前記アプタマー配列の前記１つ以上の不対領域が接合部領域を含む、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記不対領域がループ領域を含む、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記アプタマーコード配列が、対領域に１つ以上の変異ヌクレオチドをさらに含む、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記アプタマーコード配列が、不対領域に隣接する１つ以上の変異ヌクレオチドをさらに含む、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の方法。
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