JP2023519101A - Rp1関連網膜変性症のハプロタイプに基づく処置 - Google Patents
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Abstract
RP1突然変異関連の常染色体優性網膜色素変性症(adRP)の処置を目的として、CRISPR/Cas9技術を使用するための方法および組成物。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年2月12日出願の米国仮特許出願第62/975、636号明細書の優先権および利益を主張する。同号明細書の全内容および開示は本明細書において参照により組み込まれている。
本出願は、2020年2月12日出願の米国仮特許出願第62/975、636号明細書の優先権および利益を主張する。同号明細書の全内容および開示は本明細書において参照により組み込まれている。
網膜色素変性1タンパク質(RP1)突然変異関連の常染色体優性網膜色素変性症(adRP)の処置を目的として、CRISPR/Cas9技術を使用するための方法および組成物が、本明細書に記載される。
網膜色素変性症(RP)は、年齢を問わずすべての人々の視力喪失の重要な原因である。この疾患は、集団的に、網膜における光感応性視細胞(視覚に必要とされる)の進行性の死により特徴付けられる。RPは遺伝的にきわめて不均質性であり、RP遺伝子内の突然変異は常染色体劣性、常染色体優性、またはX連鎖の複数の遺伝様式で親から子に受け継がれる可能性がある。現在のところ、60を超える遺伝子内の突然変異が非症候性のRPを引き起こすことが知られており、さらに73遺伝子における突然変異がRPの症候性の形態、例えばUsher症候群およびBardet-Biedl症候群等を引き起こす。RPの劣性の形態では、遺伝子増強療法の開発に有意な進歩がみられ、疾患遺伝子の正常なコピーを用いた網膜細胞補充が治療効果を有する可能性がある。しかしながら、優性RP(全RP症例の約40%を占める)の場合、有効な治療法が未開発である。ほとんどの優性RP遺伝子は、細胞を損傷させる突然変異体タンパク質を生成し、遺伝子増強療法を無効にする。したがって、優性RPまたは遺伝性網膜変性症(IRD)の任意の優性形態を恒久的に治癒させるには、突然変異体タンパク質の生成を是正または抑制する必要がある。
CRISPR/Cas9(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連のタンパク質9)ゲノム編集技術は、哺乳動物細胞および多くの生物内で遺伝子コードを編集するための有効なツールであることが明らかにされている。病原性タンパク質の生成を排除し、したがって優性RP患者において視細胞が死滅するのを防止するために、CRISPR/Cas9系を介して優性RP遺伝子の突然変異体コピーを特異的に無効化する方法が本明細書に記載される。したがって、RP1突然変異関連の常染色体優性網膜色素変性症(adRP)を処置するためのCRISPR/Cas9技術の使用が本明細書に記載される。
したがって、Cas9タンパク質、ならびに第1のガイドRNA(gRNA)、および第2のgRNAをコードする配列を含む核酸であって、第1および/または第2のRNAが、対象のRP1遺伝子の突然変異した対立遺伝子内に一塩基多型(SNP)を含む配列に対して標的化されており、該突然変異した対立遺伝子が、常染色体優性網膜色素変性症(adRP)と関連する、核酸が本明細書に提示される。いくつかの実施形態では、第1のgRNAは、イントロン1もしくは3内の標的配列を含み、および/または第2のgRNAは、イントロン3またはエクソン4内の標的配列を含み、好ましくはgRNAの一方または両方は表6に示す配列を含む。いくつかの実施形態では、第1または第2のgRNAは、例えばイントロン3内の二対立遺伝子配列に対して標的化されているが、他方のgRNAは、SNPを含む配列に対して標的化されている。
Cas9タンパク質、および任意選択的にイントロン1もしくは3、またはエクソン4内に一塩基多型(SNP)を含む配列に対して標的化されている少なくとも1つのgRNAをコードする配列を含み、任意選択的に第2のgRNAをコードする配列を含む核酸であって、任意選択的に、第1および第2のgRNAが、イントロン1もしくは3、および/またはイントロン3もしくはエクソン4内の配列に対して標的化されており、第2のgRNAが、ヒト対象のRP1遺伝子のSNPを含む二対立遺伝子配列または配列に対して標的化されている、核酸も本明細書に提示される。いくつかの実施形態では、gRNAは表6に示す標的配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸は、黄色ブドウ球菌(S. aureus)Cas9、またはS.ピオゲネス(S. pyogenes)Cas9をコードする。
いくつかの実施形態では、Cas9は、核局在化シグナル、任意選択的にC末端核局在化シグナルおよび/またはN末端核局在化シグナルを含み;ならびに/あるいはCas9をコードする配列は、ポリアデニル化シグナルを含む。
いくつかの実施形態では、gRNAは、配列番号1もしくは配列番号2(国際公開第2018/026976号パンフレットの配列番号7もしくは配列番号8にそれぞれ対応する)を含む単分子黄色ブドウ球菌(S. aureus)gRNA、または対応する2パートモジュラー黄色ブドウ球菌(S. aureus)gRNAであり、crRNAコンポーネントは、配列番号3または配列番号4(配列番号1または配列番号2の太字セクション)を含み、およびtracrRNAコンポーネントは、配列番号5または配列番号6(配列番号1または配列番号2の下線付きのセクション)を含む。
配列番号1:黄色ブドウ球菌(S. aureus)gRNAコンポーネント
[N]16~24GTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT
配列番号2:黄色ブドウ球菌(S. aureus)gRNAコンポーネント
[N]16~24GTTATAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTATAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT
配列番号3:crRNAコンポーネント
GTTTTAGTACTCTG
配列番号4:crRNAコンポーネント
GTTATAGTACTCTG
配列番号5:tracrRNAコンポーネント
CAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT
配列番号6:tracrRNAコンポーネント
CAGAATCTACTATAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT
[N]16~24GTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT
配列番号2:黄色ブドウ球菌(S. aureus)gRNAコンポーネント
[N]16~24GTTATAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTATAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT
配列番号3:crRNAコンポーネント
GTTTTAGTACTCTG
配列番号4:crRNAコンポーネント
GTTATAGTACTCTG
配列番号5:tracrRNAコンポーネント
CAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT
配列番号6:tracrRNAコンポーネント
CAGAATCTACTATAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT
いくつかの実施形態では、gRNAは、配列番号7~16(国際公開第2014/144592号パンフレットの配列番号2404、2407、2408、および1~7に対応する)に定める配列の任意の1つを含むS.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNAである。
配列番号7:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUA;
配列番号8:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG
配列番号9:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAUGCU
配列番号10:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG
配列番号11:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC
配列番号12:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC
配列番号13:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC
配列番号14:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC
配列番号15:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC
配列番号16:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC
式中、X17~20は、選択された標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5’側直近に位置する標的配列の相補鎖の17~20の連続したヌクレオチドに対して相補的である相補性領域である。
配列番号7:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUA;
配列番号8:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG
配列番号9:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAUGCU
配列番号10:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG
配列番号11:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC
配列番号12:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC
配列番号13:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC
配列番号14:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC
配列番号15:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC
配列番号16:S.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNA
(X17~20)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC
式中、X17~20は、選択された標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5’側直近に位置する標的配列の相補鎖の17~20の連続したヌクレオチドに対して相補的である相補性領域である。
いくつかの実施形態では、核酸は、ベクター、例えばウイルス送達ベクターを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス送達ベクターは、Cas9用のプロモーター、例えばCMV、EFS、またはhGRKlプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス送達ベクターは、gRNA用のプロモーター、例えばU6プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス送達ベクターは、アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターを含む。
いくつかの実施形態では、核酸は、(i)ヒトRP1遺伝子のイントロン1または3内のドメインを標的とする配列を含む第1のガイドRNA(gRNA)、およびヒトRP1遺伝子のイントロン3またはエクソン4内のドメインを標的とする配列を含む第2のgRNA、または表6に列挙されている群から選択される配列を含むシングルガイドRNA;(ii)第1および第2の末端逆位反復配列(ITR);(iii)第1および第2のgRNAの発現を駆動するプロモーター、例えばU6プロモーター;ならびに(iv)好ましくはCMV、EFS、またはhGRKlプロモーターからなる群から選択される、Cas9の発現を駆動するプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、gRNAの発現を駆動するプロモーターは、H1または7SKプロモーターである。
治療で使用するための本明細書に記載される核酸、ならびに医薬の調製で使用するための、またはRP1における突然変異と関連する状態を有する対象を処置する方法で使用するための、本明細書に記載される核酸も提供される。
いくつかの実施形態では、状態は、常染色体優性網膜色素変性症(adRP)である。
いくつかの実施形態では、AAVベクターが、注入により、例えば網膜下注入等により対象の網膜に送達される。
細胞のゲノムを変化させるための方法も本明細書に提示される。方法は、CRISPR編集を使用して、ヒトRP1遺伝子のイントロン1または3内に第1の二本鎖切断、およびヒトRP1遺伝子のイントロン3または4内に第2の二本鎖を形成することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物、例えばヒトの眼の細胞である。
いくつかの実施形態では、第1および第2の二本鎖切断は、表6から選択される配列を含むgRNAのペアを使用して生成される。
いくつかの実施形態では、第1および第2の二本鎖切断は、第8染色体上RP1遺伝子の突然変異対立遺伝子の、エクソン2、エクソン3、およびエクソン4の全部または一部の除去を、当該対立遺伝子からのRP1タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こすように、非相同末端結合(NHEJ)により修復される。
いくつかの実施形態では、第1および第2の二本鎖切断は、第8染色体上RP1遺伝子の突然変異対立遺伝子の、(a)エクソン2およびエクソン3のすべて;(b)エクソン4の一部分;または(c)エクソン2およびエクソン3のすべて、ならびにエクソン4の一部分の除去を、当該対立遺伝子からのRP1タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こすように、非相同末端結合(NHEJ)により修復される。いくつかの実施形態では、第1および第2の二本鎖切断は、第8染色体上RP1遺伝子の突然変異対立遺伝子の、エクソン2およびエクソン3、またはエクソン4の全部または一部の除去を、当該対立遺伝子からのRP1タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こすように、非相同末端結合(NHEJ)により修復される。
いくつかの実施形態では、第1および/または第2のgRNAは、Cas9分子と複合体形成するように構成されている。
いくつかの実施形態では、細胞は、常染色体優性網膜色素変性症(adRP)に罹患した対象に由来する。
いくつかの実施形態では、細胞は網膜細胞または視細胞である。
いくつかの実施形態では、視細胞は、錐体視細胞もしくは錐体細胞、桿状視細胞もしくは桿状細胞、または黄斑性錐体視細胞である。
さらに、細胞を変化させるための方法が本明細書に提示される。該方法は、ヒトRP1遺伝子のイントロン1または3内のドメインを標的とする配列、好ましくは表6に示すような配列を含む第1のgRNAをコードするヌクレオチド配列;ヒトRP1遺伝子のイントロン3またはエクソン4内のドメインを標的とする配列、好ましくは表6に示すような配列を含む第2のgRNA分子をコードするヌクレオチド配列;およびCas9分子をコードするヌクレオチド配列;を含む組換えウイルス粒子と、細胞を接触させることを含み、前記ウイルス粒子は、非分裂細胞への送達能力を有し、前記接触させることは、第8染色体上RP1遺伝子の突然変異対立遺伝子の、エクソン2、エクソン3、およびエクソン4の全部または一部の除去を、当該対立遺伝子からのRP1タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こす。
いくつかの実施形態では、方法は、ヒトRP1遺伝子のイントロン1または3内のドメインを標的とする配列、好ましくは表6に示すような配列を含む第1のgRNAをコードするヌクレオチド配列;ヒトRP1遺伝子のイントロン3またはエクソン4内のドメインを標的とする配列、好ましくは表6に示すような配列を含む第2のgRNA分子および第2のgRNAをコードするヌクレオチド配列;ならびにCas9分子をコードするヌクレオチド配列;を含む組換えウイルス粒子と、細胞を接触させることを含み、前記ウイルス粒子は、非分裂細胞への送達能力を有し、前記接触させることは、第8染色体上RP1遺伝子の突然変異対立遺伝子の、エクソン2、およびエクソン3、またはエクソン4の全部または一部の除去を、当該対立遺伝子からのRP1タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こす。
いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、アデノ関連ウイルス(AAV)のウイルス粒子である。
本明細書に記載される方法および核酸のいくつかの実施形態では、第1のgRNAおよび第2のgRNAが表6に示される。
別途定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。本発明で使用される方法および材料が本明細書に記載されているが、当技術分野において公知のその他の好適な方法および材料も使用可能である。材料、方法、および実施例は、例示目的に限定されており、限定するようには意図されない。本明細書に記載されるすべての公開資料、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、およびその他の参考資料は、参照によりそのまま組み込まれている。矛盾する場合、本明細書が、定義を含めコントロールする。
本発明のその他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明白である。
優性突然変異の効果は、機能獲得型、優性阻害型、またはハプロ不全型の機構を介して生じる可能性がある。常染色体優性RP(adRP)に対する遺伝子療法を開発するための第1の課題は、健常遺伝子の送達に付加して、突然変異体遺伝子も抑制する必要があり得るという点にある(Lewin, A.S., et al., (1998). Nat.Med. 4(8): p.967-971; O'Reilly, M., et al., (2008). Vision Research, 48(3): p.386-91;およびO'Reilly, M., et al., (2007) American Journal of Human Genetics, 81(1): p.127-35)。第2の課題は、多くのIRD遺伝子において、例えば、正常遺伝子が過剰発現すると網膜変性を引き起こすおそれがあるなどのように、治療投薬量が狭いウィンドウ内に限定されるという点にある(O'Reilly, M., et al., (2008) Vision Research. 48(3): p. 386-91; Wen, X.H., et al., (2009) Biophys J, 96(3): p.939-50;およびLiu, Q., et al., (2012) PLoS One, 7(8): p.e43251)。例えば、トランスジェニックRp1マウス系統において、Rp1が生理学的正常レベルよりも50%余分に発現すると、RP様の網膜変性を引き起こす(Liu, Q., et al., (2012) PLoS One,. 7(8): p. e43251)。したがって、優性RPに対する最適な治療アプローチでは、突然変異体タンパク質を除去するだけでなく、野生型タンパク質発現レベルを内因性発現レベルに維持することも必要とされる。CRISPR/Cas9に基づくゲノム編集ツールは、突然変異近傍に二本鎖切断(DSB)を導入することにより(それは次に非相同末端結合(NHEJ)、または相同配列指向性修復(HDR)(homology-directed repair)経路を通じて修復され、突然変異対立遺伝子の喪失または是正に至る)、哺乳動物細胞内の病因性突然変異を編集し得る信頼性および実用性のある手段を提供する(Yin, H., et al., (2014) Nat Biotechnol, 2014. 32(6): p.551-3; Ran, F.A., et al., (2015) Nature, 2015. 520(7546): p.186-91; Swiech, L., et al., (2015) Nat Biotechnol, 2015. 33(1): p. 102-6; Tabebordbar, M., et al., (2016) Science, 2016. 351(6271): p.407-11; Yang, Y., et al.,(2016). Nature Biotechnology, 2016. 34(3): p.334-8)。ゲノムDNAを直接変化させることにより、CRISPR/Cas9系は、編集された遺伝子をその内因性発現の化学量論下に維持し、これにより従来の遺伝子増強療法を用いた場合に生じ得る異所性発現および異常な遺伝子生成を回避する能力を有する。adRPのRHO形態についての最近の研究は、Cas9-sgRNA系は、ロドプシン遺伝子の野生型と突然変異体P23H対立遺伝子との間の一塩基対の相違を識別し、したがってマウス網膜における突然変異対立遺伝子の発現を特異的に破綻させる能力を有することを実証した。しかしながら、この突然変異に基づく遺伝子ノックアウトアプローチでは、所定の遺伝子内の病原性突然変異毎に個別のCas9-sgRNA標的系を開発することが必要とされ、より多数の患者を処置する場合、その適用が制限されてしまう。
RP1において今日までに同定された優性突然変異は、最終エクソン(エクソン4)のN末端側の半分においてクラスター化しているナンセンス突然変異またはフレームシフト突然変異のいずれかである(Gandra, M., et al., (2008). Mol.Vis., 14: p. 1105-1113; Chen, L.J., et al., (2009). Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 51(4): p. 2236-2242; Liu, Q., et al, (2009) Investigative ophthalmology & visual science 50(4): p. 1566-74; Liu, Q., et al., (2012). PLoS One, 7(8): p. e43251)。突然変異体RP1対立遺伝子は、光受容体において優性阻害的役割を演じているトランケートされたタンパク質をコードすることが予測される(Liu, Q., et al., (2012). PLoS One, 7(8): p. e43251; Liu, Q., A. et al (2009), Invest Ophthalmol Vis Sci, 50(4): p. 1566-74;およびLiu, Q., et al. (2004) J Neurosci, 24(29): p. 6427-36)。RP1内の最も一般的な突然変異であるR677Xは、adRPを有する米国患者のおよそ3%に存在し、3番目に最も一般的なadRP突然変異となっている(Jacobson, S.G., et al., (2000) Investigative ophthalmology & visual science, 41(7): p. 1898-908; Berson, E.L., et al., (2001) Investigative ophthalmology & visual science, 42(10): p. 2217-24; Schwartz, S.B., et al., (2003) Investigative Ophthalmology & Visual Science, 44(8): p. 3593-7;およびGamundi, M.J., et al., (2006) BMC.Med.Genet., 7: p.35)。優性RP1突然変異は、いずれも最終エクソン内に位置し、またそのような対立遺伝子に由来する転写物は、ナンセンス変異依存分解機構を逃れてトランケートされたタンパク質を生成する。したがって、Cas9切断による突然変異の破壊およびNHEJ修復は、最終エクソン内に新たなフレームシフトまたはトランケート性のインデルを創出するのみであり、毒性遺伝子生成物の遷延を引き起こす。
本方法は、突然変異体RP1対立遺伝子の発現を破綻させるために、サロゲート標的部位としてコモンSNPを使用するペアドsgRNA標的アプローチを採用する(図1)。この戦略は、RP1内の任意の常染色体優性突然変異に適用され得るが、野生型対立遺伝子はその内因性発現の化学量論下に留まり、50%のRP1発現であれば、正常な網膜完全性および機能にとって十分であるので、追加の遺伝子増強療法に対する必要性が回避される。3つの最も一般的なRP1ハプロタイプの複合頻度は93%であり、および3つの一般的なハプロタイプの総ホモ接合頻度は35%である。これは、一般母集団のおよそ2/3が、RP1ハプロタイプについてヘテロ接合性であり、SNPに基づくCRISRP/Cas9遺伝子編集技術による特異的標的対象とされ得ることを示唆する。
したがって、RP1内に優性突然変異を有する対象を処置する際に使用するための方法および組成物が、本明細書に提示される。
RNAガイド型ヌクレアーゼ(RGN)およびガイドRNA
本方法は、突然変異体RP1対立遺伝子の部分を調べ、またその発現を破綻させるために、RP1の突然変異対立遺伝子内のSNPに対して標的化されているペアドRNAガイド型ヌクレアーゼ(RGN)の使用を含む。方法は、Cas9、Cpf1、およびそのオルソログを含むRGNの使用を含み得る。
本方法は、突然変異体RP1対立遺伝子の部分を調べ、またその発現を破綻させるために、RP1の突然変異対立遺伝子内のSNPに対して標的化されているペアドRNAガイド型ヌクレアーゼ(RGN)の使用を含む。方法は、Cas9、Cpf1、およびそのオルソログを含むRGNの使用を含み得る。
S.ピオゲネス(S. pyogenes)由来のCas9ヌクレアーゼは、操作されたガイドRNA(gRNA)の17~20ヌクレオチド、例えばシングルガイドRNA、またはcrisprRNA/トランス活性化crisprRNA(crRNA/tracrRNA)ペアと、目的とする標的ゲノムDNA配列の相補鎖(プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、例えば、配列NGGまたはNAGに適合するPAMに隣接して延在する)との間の単純な塩基対相補性を介して誘導可能である(Shen et al., (2013) Cell Res ; Dicarlo et al., (2013) Nucleic Acids Res ; Jiang et al., (2013) Nat Biotechnol 31, 233-239 ; Jinek et al., (2013) Elife 2, e00471 ; Hwang et al., (2013) Nat Biotechnol 31, 227-229 ; Cong et al., (2013) Science 339, 819-823; Mali et al., (2013) Science 339, 823-826; Cho et al., (2013) Nat Biotechnol 31, 230-232; Jinek et al., (2012) Science 337, 816-821)。例えば、配列番号7~16に定める配列を参照されたい。例えばZetsche et al., (2015) Cell 163, 759-771 ; Schunder et al., (2013) Int J Med Microbiol 303, 51-60; Makarova et al., (2015) Nat Rev Microbiol 13, 722-736 ; Fagerlund et al., (2015) Genome Biol 16, 251に記載されるように、プレボテラ属(Prevotella)およびフランシセラ属(Francisella)1(Cpf1、Cas12aとしても知られている)ヌクレアーゼ由来の操作されたCRISPRも使用可能である。SpCas9とは異なり、Cpf1/Cas12aは、単一の42nt crRNA(標的DNA配列のプロトスペーサーに対して相補的である23ntをその3’末端に有する)のみを必要とする(Zetsche et al., (2015) Cell 163, 759-771)。さらに、SpCas9は、プロトスペーサーの3’であるNGG PAM配列を認識する一方、AsCpf1およびLbCp1は、プロトスペーサーの5’であることが判明しているTTTN PAMを認識する(同上)。
いくつかの実施形態では、本システムは、S.ピオゲネス(S. pyogenes)もしくは黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来の野生型もしくはバリアントCas9タンパク質、またはアシダミノコッカス種(Acidaminococcus sp.)のBV3L6もしくはラクノスピラ科(Lachnospiraceae)バクテリアND2006由来の野生型もしくはバリアントCpf1タンパク質を利用し、いずれも細菌内でコードされ、または哺乳動物細胞内で発現させるためにコドン最適化され、ならびに/あるいはそのPAM認識特異性および/またはそのゲノム全域にわたる特異性において改変される。いくつかのバリアントが記載されており、例えば、特に国際公開第2016/141224号パンフレット、PCT/US第2016/049147号明細書、Kleinstiver et al., (2016) Nat Biotechnol.Aug;34(8):869-74; Tsai and Joung, (2016) Nat Rev Genet. May;17(5):300-12; Kleinstiver et al., (2016) Nature. Jan 28;529(7587):490-5; Shmakov et al., (2015) Mol Cell. Nov 5;60(3):(2015) 385-97; Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. Dec;33(12):1293-1298; Dahlman et al., (2015) Nat Biotechnol. Nov;33(11):1159-61; Kleinstiver et al., (2015) Nature. Jul 23;523(7561):481-5; Wyvekens et al., (2015) Hum Gene Ther. Jul;26(7):425-31; Hwang et al., (2015) Methods Mol Biol. 1311:317-34; Osborn et al., (2015) Hum Gene Ther. Feb;26(2):114-26; Konermann et al., (2015) Nature. Jan 29;517(7536):583-8; Fu et al., (2014) Methods Enzymol. 546:21-45;およびTsai et al., (2014) Nat Biotechnol. Jun;32(6):569-76を参照されたい。黄色ブドウ球菌(S. aureus)と共に使用される代表的なガイドRNAとして、配列番号1~6に定めるものが挙げられる。
Cas9および類似体を表1に示し、また操作されたプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、またはハイフィデリテイバリアントを表2に示す。
いくつかの実施形態では、RGN配列は、例えばRGNタンパク質のCおよび/またはN末端に位置する核局在化配列(NLS)、およびミニポリアデニル化シグナル(またはポリA配列)を含むように改変される。代表的なNLSは、SV40大T抗原NLS(PKKKRRV(配列番号17));PKKKRKV(配列番号18);KRTADGSEFESPKKKRKV(配列番号19);およびヌクレオプラスミンNLS(KRPAATKKAGQAKKKK(配列番号20))を含む。その他のNLSが当技術分野において公知である;例えばCokol et al., (2000) EMBO Rep. Nov 15; 1(5):411-415; Freitas and Cunha, (2009) Curr Genomics. Dec; 10(8): 550-557;およびLeung et al (2003) Journal of Biol Chem. 278(43):41947-41953を参照されたい。代表的なポリアデニル化シグナルは、TAGCAATAAAGGATCGTTTATTTTCATTGGAAGCGTGTGTTGGTTTTTTGATCAGGCGCG(配列番号21))である。
RGNにふさわしいガイドRNAを使用すべきである。いくつかの実施形態では、本開示で使用されるgRNAは、当技術分野において公知なように、単分子性またはモジュラー性であり得る。
ベクター
RGNおよびガイドRNAをコードする配列は、例えばウイルスベクターを使用して網膜に送達され得る。網膜において、例えば光受容体において、例えば主に光受容体において、またはそれに限定して、本明細書に記載されるようなRGNおよびガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを、in vivoでトランスフェクトし、および発現させるための標的化発現ベクターについて本明細書に記載される。そのようなコンポーネントの発現コンストラクトは、任意の有効な担体、例えば任意の処方物または組成物(コンポーネント遺伝子を細胞にin vivoで効率的に送達する能力を有する)に含めて投与可能である。アプローチとして、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、および単純ヘルペスウイルス-1、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、または組換え細菌プラスミドもしくは真核生物プラスミドを含むウイルスベクター内への遺伝子挿入が挙げられる;好ましいウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス2型(AAV2)、AAV5、またはAAV8である。ウイルスベクターは細胞を直接トランスフェクトする;プラスミドDNAは、そのまま、あるいは例えばカチオン性リポソーム(リポフェクタミン)もしくは誘導体化物(例えば、抗体コンジュゲート化物)、カチオン性デンドリマー、無機ベクター(例えば、酸化鉄マグネトフェクション)、リピドイド、細胞透過性ペプチド、シクロデキストリンポリマー(CDP)、ポリリジンコンジュゲート、グラマシジンS(gramacidin S)、人工ウイルスエンベロープ、またはその他のそのような細胞内担体、ならびに遺伝子コンストラクトの直接注射、またはin vivoで実施されるCaPO4沈殿の支援を受けて送達可能である。
RGNおよびガイドRNAをコードする配列は、例えばウイルスベクターを使用して網膜に送達され得る。網膜において、例えば光受容体において、例えば主に光受容体において、またはそれに限定して、本明細書に記載されるようなRGNおよびガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを、in vivoでトランスフェクトし、および発現させるための標的化発現ベクターについて本明細書に記載される。そのようなコンポーネントの発現コンストラクトは、任意の有効な担体、例えば任意の処方物または組成物(コンポーネント遺伝子を細胞にin vivoで効率的に送達する能力を有する)に含めて投与可能である。アプローチとして、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、および単純ヘルペスウイルス-1、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、または組換え細菌プラスミドもしくは真核生物プラスミドを含むウイルスベクター内への遺伝子挿入が挙げられる;好ましいウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス2型(AAV2)、AAV5、またはAAV8である。ウイルスベクターは細胞を直接トランスフェクトする;プラスミドDNAは、そのまま、あるいは例えばカチオン性リポソーム(リポフェクタミン)もしくは誘導体化物(例えば、抗体コンジュゲート化物)、カチオン性デンドリマー、無機ベクター(例えば、酸化鉄マグネトフェクション)、リピドイド、細胞透過性ペプチド、シクロデキストリンポリマー(CDP)、ポリリジンコンジュゲート、グラマシジンS(gramacidin S)、人工ウイルスエンベロープ、またはその他のそのような細胞内担体、ならびに遺伝子コンストラクトの直接注射、またはin vivoで実施されるCaPO4沈殿の支援を受けて送達可能である。
核酸を細胞内にin vivo導入するための代表的なアプローチは、核酸、例えばcDNAを含有するウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターを用いた細胞の感染は、被標的細胞の大部分が核酸を取り込むことができるという利点を有する。さらに、ウイルスベクター内でコードされる分子は、例えばウイルスベクターに含まれるcDNAにより、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞内で効率的に発現される。
ウイルスベクターは、外来遺伝子を、特にヒト中にin vivoで移送するための組換え遺伝子送達系として使用可能である。このようなベクターは、遺伝子の細胞中への効率的な送達を実現し、またいくつかのケースでは、移動した核酸は、宿主の染色体DNA内に安定的に組み込まれる。組換えウイルスを生み出すため、および細胞をin vitroまたはin vivoでそのようなウイルスに感染させるためのプロトコールは、Ausubel, et al., eds., Gene Therapy Protocols Volume 1: Production and In Vivo Applications of Gene Transfer Vectors, Humana Press, (2008), pp. 1-32、およびその他の標準的な研究室マニュアルに見出され得る。
核酸の送達に有用な好ましいウイルスベクター系は、アデノ関連ウイルス(AAV)である。アデノ関連ウイルスは、効率的な複製および生産的なライフサイクルを行うために、ヘルパーウイルスとして別のウイルス、例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルス等を必要とする自然発生的な欠陥ウイルスである。(レビューについてはMuzyczka et al., Curr. Topics in Micro and Immunol.158:97-129 (1992)を参照されたい;またDomenger and Grimm, Human Molecular Genetics, 28(R1):R3-R14 (October 2019)も参照されたい)。AAVベクターは、様々な細胞型を有効に形質変換させ、またin vivoで導入遺伝子の長期発現もなし得る。AAVベクターゲノムはエピソームとして細胞内に存続し得るが、ベクターの組込みも観測されている(例えば、Deyle and Russell, Curr Opin Mol Ther. 2009 Aug; 11(4): 442-447; Asokan et al., Mol Ther. 2012 April; 20(4): 699-708; Flotte et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356 (1992); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989);およびMcLaughlin et al., J. Virol. 62:1963-1973 (1989)を参照されたい)。AAVベクター、特にAAV2が、遺伝子を増強または置換するために広範に使用されており、また一連の動物モデルならびにクリニックにおいて治療効果も明らかにされている;例えば、Mingozzi and High, (2011) Nature Reviews Genetics 12, 341-355 ; Deyle and Russell, (2009) Curr Opin Mol Ther. Aug; 11(4): 442-447; Asokan et al., (2012) Mol Ther. April; 20(4): 699-708を参照されたい。300塩基対ほどの小さなAAVを含有するAAVベクターであれば、パッケージング可能であり、また、組換えタンパク質の発現もなし得る。外因性DNAのためのスペースは約4.5kbに限定される。例えば、AAV1、2、4、5、または8ベクターは、DNAを網膜中、例えば光受容体、内部網膜細胞、またはRPE細胞(例えば、Maguire et al. (2008). N Engl J Med 358: 2240-2248; Maguire et al. (2009). Lancet 374: 1597-1605; Bainbridge et al. (2008). N Engl J Med 358: 2231-2239; Hauswirth et al. (2008). Hum Gene Ther 19: 979-990; Cideciyan et al. (2008). Proc Natl Acad Sci USA 105: 15112-15117; Cideciyan et al. (2009). N Engl J Med 361: 725-727; Simonelli et al. (2010). Mol Ther 18: 643-650; Acland, et al. (2005). Mol Ther 12: 1072-1082; Le Meur et al. (2007). Gene Ther 14: 292-303; Stieger et al. (2008). Mol Ther 16: 916-923;およびVandenberghe et al. (2011). Sci Transl Med 3: 88ra54に記載されているもの等)中に導入するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、AAVベクターは、国際公開第2015054653号パンフレットに記載されているAAVカプシドポリペプチド;例えば国際公開第2015054653号パンフレットの配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、および17からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するAAVカプシドポリペプチド、ならびに本明細書に記載されるようなRGNおよびガイドRNAコーディング配列を含むウイルス粒子を含む(またはそれをコードする配列を含む)可能性がある。いくつかの実施形態では、AAVカプシドポリペプチドは、国際公開第2015054653号パンフレットの表1に示す通りであり、それをここに転載する:
いくつかの実施形態では、AAVカプシドポリペプチドは、Anc80ポリペプチドであり、例えば代表的なポリペプチドは、国際公開第2015054653号パンフレットの配列番号19(Anc80L27);配列番号20(Anc80L59);配列番号21(Anc80L60);配列番号22(Anc80L62);配列番号23(Anc80L65);配列番号24(Anc80L33);配列番号25(Anc80L36)、および配列番号26(Anc80L44)に示される。
様々な核酸が、AAVベクターを使用して異なる細胞型に導入されている(例えば、上記で引用された参考文献、ならびにAsokan et al., (2012) Molecular Therapy ; 20 4, 699-708;およびHermonat et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al., (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al., (1984) J. Virol. 51:611-619;およびFlotte et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790において引用されたものを参照されたい)。
いくつかの実施形態では、折り畳まれて二本鎖DNAを形成する逆向き反復配列を含有する自己相補性AAVが使用される。
レトロウイルスも使用可能である。複製欠陥レトロウイルスのみを生み出す特殊な細胞系(「パッケージング細胞」と呼ばれる)の開発によって、遺伝子療法用レトロウイルスの有用性が高まり、また欠陥レトロウイルスは、遺伝子療法を目的として遺伝子移入する際に使用するために特徴付けられる(レビューについては、Katz et al., (2013) Human Gene Therapy 24:914を参照されたい)。複製欠損レトロウイルスは、ビリオン中にパッケージングされてもよく、これを標準技術により、ヘルパーウイルスの使用を通じて標的細胞を感染させるのに使用可能である。適するレトロウイルスの例として、当業者にとって公知であるpLJ、pZIP、pWE、およびpEMが挙げられる。狭宿主性および広宿主性のレトロウイルス系の両方を調製するための好適なパッケージングウイルス系統の例として、ΨCrip、ΨCre、Ψ2、およびΨAmが挙げられる。レトロウイルスは、様々な遺伝子を、上皮細胞を含む多くの異なる細胞型内にin vitroおよび/またはin vivoで導入するのに使用されてきた(例えば、Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115;米国特許第4,868,116号明細書;同第4,980,286号明細書; PCT出願国際公開第89/07136号パンフレット;同第89/02468号パンフレット;同第89/05345号パンフレット;および同第92/07573号パンフレットを参照されたい)。
本方法において有用な別のウイルス遺伝子送達系では、アデノウイルス由来のベクターが利用される。アデノウイルスのゲノムは、目的とする遺伝子産物をコードおよび発現するが、しかし通常の溶菌ウイルスライフサイクルにおいて複製するその能力に関して不活性化されるように操作され得る。例えば、Berkner et al., (1988) BioTechniques 6:616 ; Rosenfeld et al., (1991) Science 252:431-434;およびRosenfeld et al., (1992) Cell 68:143-155を参照されたい。アデノウイルス菌株Ad5型dl324またはその他のアデノウイルスの菌株(例えば、Ad2、Ad3、またはAd7等)に由来する好適なアデノウイルスベクターは、当業者にとって公知である。組換えアデノウイルスは、特定の状況においては、それが非分裂細胞に感染する能力を有さないという点で有利であり得るが、また上皮細胞を含む多種多様な細胞型に感染させるのに使用可能である(Rosenfeld et al., (1992)、前出)。さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、また精製および濃縮しやすく、上記したように感染スペクトルに影響を及ぼすように改変可能である。それに加えて、導入されたアデノウイルスDNA(およびその中に含まれる外来DNA)は宿主細胞のゲノムに組み込まれず、しかしエピソームなまま存続し、これにより、挿入時の突然変異誘発の結果としてin situで生じ得る潜在的問題(導入されたDNA(例えば、レトロウイルスDNA)が宿主ゲノムに組み込まれることとなった場合)が回避される。その上、外来DNAに対するアデノウイルスゲノムの収容容量は、その他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい(最大8キロベース)(Berkner et al., supra; Haj-Ahmand and Graham, (1986) J. Virol. 57:267)。
いくつかの実施形態では、RGNおよびガイドRNAをコードする配列は、その表面上に正電荷を担持するリポソーム(例えば、リポフェクチン)内に捕捉され、それは、標的組織の細胞表面抗原に対する抗体でタグ化され得る(Mizuno et al., (1992) No Shinkei Geka 20:547-551;PCT国際公開公報第91/06309号パンフレット;日本国特許出願第1047381号明細書;および欧州特許公開第EP-A-43075号明細書)。
ベクターは、プロモーター、エンハンサー(例えば、CMVエンハンサー)、その他のcis調節エレメント、および/またはカプシド血清型バリアントも含むことができる。プロモーターに関して、ベクターは、多くの細胞型において(例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、ニワトリβ-アクチン(CBA)、ニワトリβ-アクチンプロモーター(CAG)に融合したサイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー、CBh、伸長因子α1(EFα1)、EF-1α短鎖(EFS)、もしくはCASI)、または特に視細胞において(例えば、RHO、βホスホジエステラーゼ(PDE)、網膜色素変性(RP1)、ロドプシンキナーゼ(hGRK1)、および錐体アレスチン(CAR))、発現を駆動するプロモーターを含み得る(例えば、Gray et al., (2011) Hum Gene Ther. Sep;22(9):1143-53; Alexopoulou et al., (2008) BMC Cell Biol. ; 9: 2; Esumi et al., (2004) Journal Biological Chemistry; 279:19064-73; Guziewicz et al., (2013) PLoS One.;8:e75666; Allocca et al., (2007) J Virol; 81:11372-80を参照されたい; Domenger and Grimm, (2019) Human Molecular Genetics, 28(R1):R3-R14 (October)も参照されたい)。その他のcis調節エレメントは、光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子(IRBP)、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント(WPRE)、またはマウスのマイニュートウイルス(MVM)イントロンに由来するエンハンサーエレメントを含み得る(Domenger and Grimm, (2019) Human Molecular Genetics, 28(R1):R3-R14 (October)を参照されたい)。
遺伝子療法コンストラクトの医薬製剤は、許容される希釈剤において、遺伝子送達系(ウイルスベクター、および任意の関連する薬剤、例えばヘルパーウイルス、タンパク質、脂質等)から本質的に構成され得る、または遺伝子送達媒体が埋め込まれた徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達系、例えばレトロウイルスベクターが組換え細胞からそのまま生成可能である場合、医薬製剤は遺伝子送達系を生成する1つまたは複数の細胞を含み得る。
あるいは、方法は、RGNおよびガイドRNAを共に、例えば複合体として送達することを含み得る。例えば、RGNおよびgRNAは、宿主細胞において過剰発現され、精製され、次にガイドRNAと複合体形成して(例えば、試験管内で)、リボヌクレオタンパク質(RNP)を形成し、細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、RGNは、細菌発現プラスミドの使用を通じて細菌内で発現され、それから精製され得る。例えば、Hisタグ化デアミナーゼ融合タンパク質は細菌細胞内で発現され、次にニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得る。RNPを使用すれば、ヌクレアーゼもしくはガイドをコードするプラスミドDNAを送達する、またはヌクレアーゼをmRNAとしてコードする必要性が回避される。おそらくはRNPの半減期はより短く、またヌクレアーゼおよびガイドの発現において遷延性は認められないので、RNP送達は特異性も改善し得る(プラスミドからの持続的な発現とは対照をなす)。RNPは、例えば脂質媒介式のトランスフェクションまたはエレクトロポレーションを使用して、in vivoまたはin vitroで細胞に送達され得る。例えば、Liang et al. (2015) Journal of biotechnology 208: 44-53; Zuris, John A., et al. (2015) Nature biotechnology 33.1: 73-80; Kim et al. (2014) Genome research 24.6: 1012-1019を参照されたい。
処置方法
RP1遺伝子における優性突然変異と関連する網膜色素変性症(RP)を有する対象(例えば、哺乳動物対象、例えばヒトまたはヒト以外の獣医学的対象)を処置する方法が、本明細書に提示される。適する対象は、当業者、および遺伝子検査(例えば、対象のRP1遺伝子内に突然変異が存在するか、その有無を特定するシークエンシング)により確定された診断によって特定され得る。RP1の参照配列は、NCBI GenBankにおいてRefSeqGene ID NG_009840.2(Range 5030~19768)として見出され得る。
RP1遺伝子における優性突然変異と関連する網膜色素変性症(RP)を有する対象(例えば、哺乳動物対象、例えばヒトまたはヒト以外の獣医学的対象)を処置する方法が、本明細書に提示される。適する対象は、当業者、および遺伝子検査(例えば、対象のRP1遺伝子内に突然変異が存在するか、その有無を特定するシークエンシング)により確定された診断によって特定され得る。RP1の参照配列は、NCBI GenBankにおいてRefSeqGene ID NG_009840.2(Range 5030~19768)として見出され得る。
方法は、RGNおよびペアドガイドRNA(突然変異体RP1対立遺伝子の部分を調べ、またその発現を破綻させる)を有効量投与することを含む。臨床現場において、ベクターが、いくつかの方法(そのそれぞれは当技術分野においてなじみ深い)のいずれかにより対象中に導入され得る。その他の方法も使用可能であるものの、いくつかの実施形態では、網膜に遺伝子療法ベクターを送達するのに一般的に選ばれる経路は、網膜下注入経由である。これは、網膜のRPEおよび視細胞へのアクセスを可能にする。動物試験において、異なる血清型のAAVが、網膜下注入後に、これらの細胞集団を効率的に形質変換することが明らかにされている(Vandenberghe et al., (2013) PLoS One. 8:e53463. PMCID: 3559681; Vandenberghe and Auricchio, (2012) Gene Therapy. 19:162-8; Vandenberghe et al., (2011) Science translational medicine. 3:88ra54; Dinculescu et al., (2005) HumGene Ther. 16:649-63; Boye et al., (2013) Mol Ther. 21:509-19;およびAlexander and Hauswirth, (2008) Adv Exp Med Biol. 2008;613:121-8)。網膜下注入アプローチは、RPE65およびCHM遺伝子内の突然変異により引き起こされた網膜変性症に対する遺伝子増強療法の現在継続中の臨床トライアルにおいて使用されている(Maguire et al., (2008) New England Journal of Medicine. 358:2240-8; Bainbridge et al., (2008) New England Journal of Medicine. 358:2231-9; Cideciyan et al., (2008) Proceedings National Academy Sciences USA. 105:15112-7; Maguire et al., (2009) Lancet. 374:1597-605; Jacobson et al., (2012) Archives Ophthalmology. 130:9-24; Bennett et al., (2012) Science translational medicine. 4:120ra15;およびMacLaren et al., (2014) Lancet. 383:1129-37)。網膜下注入は、標準的な外科学的アプローチ(例えば、Maguire et al., 2008(前出); Bainbridge et al., 2008(前出); Cideciyan et al., 2008(前出); MacLaren et al., 2014(前出)に記載されるような)を用いて実施可能である。国際公開第2019/183641号パンフレットも参照されたい。
網膜の任意の領域が標的とされ得るが、特定の事例では、網膜中心窩(眼の中心から外側におよそ1度の範囲で延在する)が、中心視力におけるその役割、および網膜の周辺領域と比較して比較的高濃度の錐体光受容体が存在することに起因して選好され得る。代替的または付加的に、注入は、3種類の網膜視細胞すべてが存在することにより特徴付けられる傍中心窩領域(中心からおよそ2~10度ずれて延在する)に対して標的化され得る。それに加えて、傍中心窩領域中への注入は、網膜の正中線を横切るニードルパスを使用して比較的鋭角になされ得る。例えば、注入パスは、角膜輪部近傍の強膜の鼻側から、硝子体房(vitreal chamber)を経由して、側頭よりの傍中心窩網膜中まで、強膜の側頭側から鼻よりの傍中心窩網膜まで、角膜に対して上方に位置する強膜の部分から傍中心窩下方の位置まで、および/または強膜の下方部分から傍中心窩上方の位置まで延在し得る。網膜表面に対して比較的小さい角度での注入を使用することが、濾過胞から硝子体にベクターが流出する可能性を有利に低下させまたは制限し、したがって送達期間中のベクターのロスを低下させる可能性がある。その他のケースでは、黄斑(網膜中心窩を含む)が標的とされ得るが、またその他のケースでは、追加の網膜領域が標的とされ得る、または過剰量の投与を受け得る。
AAVベクターを含む組成物は、非限定的に注入、例えば網膜下注入を含む、任意の適する手段により対象に投与可能である。組成物内のAAVベクターの濃度は、注入装置内のデッドボリュームおよび安全に投与され得る比較的限定された容積を考慮に入れつつ、とりわけ、十分な用量のAAVが対象の網膜に投与されることが確実になるように選択される。適する用量として、例えば1×1011個のウイルスゲノム(vg)/mL、2×1011個のウイルスゲノム(vg)/mL、3x1011個のウイルスゲノム(vg)/mL、4×1011個のウイルスゲノム(vg)/mL、5×1011個のウイルスゲノム(vg)/mL、6×1011個のウイルスゲノム(vg)/mL、7×1011個のウイルスゲノム(vg)/mL、8×1011個のウイルスゲノム(vg)/mL、9×1011個のウイルスゲノム(vg)/mL、1×1012個のvg/mL、2×1012個のウイルスゲノム(vg)/mL、3×1012個のウイルスゲノム(vg)/mL、4×1012個のウイルスゲノム(vg)/mL、5×1012個のウイルスゲノム(vg)/mL、6×1012個のウイルスゲノム(vg)/mL、7×1012個のウイルスゲノム(vg)/mL、8×1012個のウイルスゲノム(vg)/mL、9×1012個のウイルスゲノム(vg)/mL、l×1013個のvg/mL、2×1013個のウイルスゲノム(vg)/mL、3×1013個のウイルスゲノム(vg)/mL、4×1013個のウイルスゲノム(vg)/mL、5×1013個のウイルスゲノム(vg)/mL、6×1013個のウイルスゲノム(vg)/mL、7×1013個のウイルスゲノム(vg)/mL、8×1013個のウイルスゲノム(vg)/mL、または9×1013個のウイルスゲノム(vg)/mLを挙げることができる。任意の適する容積の組成物が、網膜下腔または蝸牛腔に送達され得る。いくつかの事例では、容積は、例えば1マイクロリッター、10マイクロリッター、50マイクロリッター、100マイクロリッター、150マイクロリッター、200マイクロリッター、250マイクロリッター、300マイクロリッター等、濾過胞が網膜下腔内に形成されるように選択される。
さらに、本明細書に記載されるように、RGNおよびガイドRNAをコードする配列を含むウイルスが、本明細書に提示される(例えば、1つまたは複数のウイルスは、RGNおよびペアドgRNAの1、2、または3つすべての配列を含み、例えば、1つのウイルスが、1、2(例えば、2つのgRNA)、または3つすべてをコードする配列を含むが、ならびに組成物はそのようなウイルスの1つまたは複数を含む(例えば、組成物は、2つのgRNAをコードする配列を含む1つのウイルス、およびRGNをコードする配列を含む別のウイルスを含む;組成物は、2つのgRNAおよびRGNをコードする配列を含む1つのウイルスを含む;または組成物は、第1のgRNAをコードする配列を含む1つのウイルス、第2のgRNAをコードする配列を含む第2のウイルス、およびRGNをコードする配列を含む第3のウイルスを含む))。RGNおよびgRNAを含むRNP、ならびにRGNおよびgRNAのそれぞれを含むRNPを含む組成物も提示される。
本発明は下記の実施例においてさらに記載されるが、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
RP1突然変異に対するSNPに基づくCRISPR/Cas9遺伝子編集系
3つの最も一般的なRP1ハプロタイプ(タンパク質コーディング領域の1000ゲノムフェーズ1バリアントから同定されたH1、H2、およびH3)は、42.5%、27%、および23.5%の頻度でそれぞれ生ずる(表3)。H1は参照配列である。H2上のコモンSNPとして、rs702761におけるG、rs145290におけるG、rs436527におけるA、rs428854におけるA、rs424499におけるC、rs429668におけるC、rs444772におけるA、rs446227におけるA、rs414352におけるC、およびrs441800におけるGが挙げられる。H3上のコモンSNPとして、rs62514616のA、rs2293869のT、およびrs61739567のAが挙げられる。これらの3つの一般的なハプロタイプの複合頻度は93%であり、また3つの一般的なハプロタイプの総ホモ接合頻度は35%である。これから、一般母集団のおよそ2/3がRP1ハプロタイプについてヘテロ接合性であることが示唆され、SNPに基づくCRISRP/Cas9遺伝子編集技術による特異的な標的となり得る。
3つの最も一般的なRP1ハプロタイプ(タンパク質コーディング領域の1000ゲノムフェーズ1バリアントから同定されたH1、H2、およびH3)は、42.5%、27%、および23.5%の頻度でそれぞれ生ずる(表3)。H1は参照配列である。H2上のコモンSNPとして、rs702761におけるG、rs145290におけるG、rs436527におけるA、rs428854におけるA、rs424499におけるC、rs429668におけるC、rs444772におけるA、rs446227におけるA、rs414352におけるC、およびrs441800におけるGが挙げられる。H3上のコモンSNPとして、rs62514616のA、rs2293869のT、およびrs61739567のAが挙げられる。これらの3つの一般的なハプロタイプの複合頻度は93%であり、また3つの一般的なハプロタイプの総ホモ接合頻度は35%である。これから、一般母集団のおよそ2/3がRP1ハプロタイプについてヘテロ接合性であることが示唆され、SNPに基づくCRISRP/Cas9遺伝子編集技術による特異的な標的となり得る。
H2上の4つのコモンSNP(rs444772、rs446227、rs414352、およびrs441800)に関する対立遺伝子頻度は、1000ゲノムプロジェクトに基づけば、欧米人において0.25~0.27である(表4)。H3における2つのSNP(rs2293869およびrs61739567)の対立遺伝子頻度は、欧米人において0.44である。H2およびH3のノンコーディング領域におけるコモンSNPを明らかにするために、HaploReg v4.1を使用して連鎖不均衡(LD)分析を実施した。イントロン1内の3つのSNP(rs702761、rs145290、およびrs436527)、およびイントロン3内の3つのSNP(rs428854、rs424499、およびrs429668)が、H2上の4つのコモンSNPと極めて緊密な関連性(D’=0.99または1)を有することが判明した(表4)。制御領域内のいくつかのSNPもまた、H2と緊密に関連している。1つのSNP(rs62514616)が、H3上の2つのコモンSNPと緊密に関連している。これらのSNPは、いずれも以下に記載する本発明のCRISPR/Cas9編集アプローチに対する潜在的サロゲートである。
MEEIのIRD Biobankから、RP1遺伝子内に優性突然変異を有する38家系の罹患した個人50例を集めた。最も一般的な突然変異R677Xを、13家系の患者15例において検出した。所定のRP1ハプロタイプのSNPを有する突然変異のフェーズを決定するために、RP1患者20例から入手可能な、NGSに基づくGenetic Eye Disease(GEDi)テスト結果を使用して、RP1のディプロイド遺伝子型を最初に分析した。表5に示すように、患者20例のうち14例が、RP1遺伝子座においてヘテロ接合性であり、および6例が、3つの一般的なハプロタイプの1つについてホモ接合性である。本発明者らがRP1の38家系において見出した19個の固有の優性突然変異は、いずれもエクソン4の開始部分の小さな領域においてクラスター化している(c.1199, p.Q400 - c.2287, p.N763)。ペアドエンド2×150bp NGS読み取りを検査し、サンプル004-235内の4bp欠損突然変異(c.2280_2284del)は、Hap2上のrs444772とin transであること(突然変異はHap3対立遺伝子と同じ対立遺伝子上にあることを示す)を同定した。したがって、Hap3上のSNPを標的とするように設計されたsgRNAは、サンプル004-235内の突然変異対立遺伝子を阻害することができる。しかしながら、GEDiテストにおける短いNGS読み取りでは、距離に起因して、rs444772を有するその他の突然変異のフェーズを決定することができなかった。
RP1ハプロタイプ上SNPを標的とするためのCas9-sgRNAの設計
SNP毎に、野生型SpCas9(NGG)、SpCas9の操作されたVRQRバリアント(NGAN)、野生型黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9-WT、NNGRRT)、およびSaCas9の操作されたKKHバリアント(NNNRRT)について、利用可能なPAMモチーフを調査した。1~7個のsgRNAを、PAMの近傍13bp以内の、または参照ハプロタイプ上のPAM(太字)に該当する各SNP部位を標的とするように設計した(表6)。H2およびH3に対して標的化されたガイドの場合、参照ヌクレオチド(太字で示す)をSNPヌクレオチドに切替えた。イントロン3内の野生型ゲノムを標的とする4つのgRNAも設計した。
SNP毎に、野生型SpCas9(NGG)、SpCas9の操作されたVRQRバリアント(NGAN)、野生型黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9-WT、NNGRRT)、およびSaCas9の操作されたKKHバリアント(NNNRRT)について、利用可能なPAMモチーフを調査した。1~7個のsgRNAを、PAMの近傍13bp以内の、または参照ハプロタイプ上のPAM(太字)に該当する各SNP部位を標的とするように設計した(表6)。H2およびH3に対して標的化されたガイドの場合、参照ヌクレオチド(太字で示す)をSNPヌクレオチドに切替えた。イントロン3内の野生型ゲノムを標的とする4つのgRNAも設計した。
Cas9およびsgRNA発現コンストラクトのクローニング
すべてのCas9発現プラスミドを、pSQT817ベクター(Addgene #53373)から改変されたCAG-Cas9-T2A-EGFPバックボーン中に構築した。EGFPおよびCas9を、1つのタンパク質として同時発現させた後、自己開裂型T2Aペプチドにより分離した;EGFPは、被標的細胞に対するマーカー、および下流FACSソーティングのためのマーカーとしての役目を果した。野生型およびバリアントSpCas9に対するsgRNAを発現ベクターBPK1520(Addgene #65777)中にクローン化し、野生型およびバリアントSaCas9に対するsgRNAをBPK2660ベクター(Addgene #70709)中にクローン化した。
すべてのCas9発現プラスミドを、pSQT817ベクター(Addgene #53373)から改変されたCAG-Cas9-T2A-EGFPバックボーン中に構築した。EGFPおよびCas9を、1つのタンパク質として同時発現させた後、自己開裂型T2Aペプチドにより分離した;EGFPは、被標的細胞に対するマーカー、および下流FACSソーティングのためのマーカーとしての役目を果した。野生型およびバリアントSpCas9に対するsgRNAを発現ベクターBPK1520(Addgene #65777)中にクローン化し、野生型およびバリアントSaCas9に対するsgRNAをBPK2660ベクター(Addgene #70709)中にクローン化した。
ヒト細胞系の特徴付け
ホモ接合性およびヘテロ接合性のRP1ハプロタイプとして機能するいくつかのヒト細胞系を入手し、遺伝子型を解析して、本発明のsgRNAについて対立遺伝子標的特異性および有効性を評価した。これには、HEK293T(H2/H3)、ARPE-19(H1/H2)、hTERT RPE-1(H3/H3)、Min38931線維芽細胞(RP1患者由来のH2/H2)、HL-60(H1/H1)、HT-1080(H1/H2)、C3A(H2/H3)、Y79(H1/H3)Weri-Rb1(H1/H2)、およびハプロイドヒト細胞系HAP1(H1)が含まれる。
ホモ接合性およびヘテロ接合性のRP1ハプロタイプとして機能するいくつかのヒト細胞系を入手し、遺伝子型を解析して、本発明のsgRNAについて対立遺伝子標的特異性および有効性を評価した。これには、HEK293T(H2/H3)、ARPE-19(H1/H2)、hTERT RPE-1(H3/H3)、Min38931線維芽細胞(RP1患者由来のH2/H2)、HL-60(H1/H1)、HT-1080(H1/H2)、C3A(H2/H3)、Y79(H1/H3)Weri-Rb1(H1/H2)、およびハプロイドヒト細胞系HAP1(H1)が含まれる。
トランスフェクション効率、およびヘテロ接合性H2/H3ハプロタイプについて初期のスクリーニングステップを行うために、HEK293T細胞を、すべてのsgRNAがこれらの細胞においてテスト可能なように選択した(H3の位置において、H2 SNPはH1と同じであり、またその逆も真である。したがって、参照ハプロタイプH1は、13個の標的となり得る部位を有し、H2は10部位を有し、またH3は3部位を有する)。
各gRNAの効率および特異性を評価するために、CAG-Cas9-T2A-EGFP、およびsgRNAプラスミドをHEK293T細胞中に、リポフェクタミン3000を介して同時トランスフェクトした。Cas9-EGFPプラスミド単独のトランスフェクションを陰性対照として含めた。トランスフェクション後の2日目に細胞を収集し、FACSソーティングがそれに後続した。ゲノムDNAをソート後のEGFP陽性細胞から単離し、PCR増幅し、NGSディープシークエンシングがそれに後続した。
標的命中率の測定
NGSディープシークエンシングを、ゲノム内の特異的DSB-NHEJイベントを定量的に分析し、また切断特異性を予測するのに利用した。要するに、標的対象部位にまたがるショートPCR産物を増幅および精製し、デュアルインデックス化TruSeq 250 bpペアドエンドシークエンシングをMGH CCIBによりIllumina MiSeqシーケンサー上で実施した。ペアドエンド読み取りをヒトゲノム参照配列に照らしマップ化し、30超の平均クオリティースコアを有する読み取りを意図した標的ヌクレアーゼ結合部位とオーバーラップするインデルについて分析した。インデル分析を、MGH CCIBにおいて自社製のアルゴリズムを使用して実施した。
NGSディープシークエンシングを、ゲノム内の特異的DSB-NHEJイベントを定量的に分析し、また切断特異性を予測するのに利用した。要するに、標的対象部位にまたがるショートPCR産物を増幅および精製し、デュアルインデックス化TruSeq 250 bpペアドエンドシークエンシングをMGH CCIBによりIllumina MiSeqシーケンサー上で実施した。ペアドエンド読み取りをヒトゲノム参照配列に照らしマップ化し、30超の平均クオリティースコアを有する読み取りを意図した標的ヌクレアーゼ結合部位とオーバーラップするインデルについて分析した。インデル分析を、MGH CCIBにおいて自社製のアルゴリズムを使用して実施した。
3つのハプロタイプすべてに対するSpCas9野生型およびバリアントガイドを、HEK293T、ARPE19、hTert-RPE1、U2OS、HAP1、およびWeri-Rb1細胞系においてテストし、対立遺伝子毎に編集済みおよび未編集の読み取りについて分析した。編集効率を、(編集後の対立遺伝子)/(1対立遺伝子当たりの総読み取り)からなる比として計算し、下記の表7ならびに図2Aおよび図2Bに示す。
Cas9-sgRNAによるRP1対立遺伝子の特異的ノックアウト
最も高い標的効率および特異性を有するsgRNAを選択し、ヘテロ接合またはハプロイド細胞系において、ペアドsgRNA指向性編集を介してRP1対立遺伝子を標的とし、ノックアウトするその能力を評価した。H1に対するペアドガイド欠損戦略を最初にテストした。イントロン領域に対して標的化された単一のgRNAによる編集はNHEJにより修復され、RP1発現に影響を及ぼさず(図4、シングルガイド14N2のみ)、したがって任意の対立遺伝子内に存在するイントロン3の複数の領域を標的とするきわめて効率的なガイドを、イントロン1またはエクソン4内に存在するH1 SNPを標的とする対立遺伝子特異的sgRNAとペア化した。二対立遺伝子標的ガイドは野生型および突然変異対立遺伝子の両方を編集するが、しかしイントロン1またはエクソン4内の対立遺伝子特異的ガイドとペア化したときには、突然変異対立遺伝子のみからゲノム部分を大きく削除することに留意されたい。より大きな欠損も、イントロン1およびエクソン4対立遺伝子特異的ガイドのペア化を介してやはり可能である(表8および表9)。
最も高い標的効率および特異性を有するsgRNAを選択し、ヘテロ接合またはハプロイド細胞系において、ペアドsgRNA指向性編集を介してRP1対立遺伝子を標的とし、ノックアウトするその能力を評価した。H1に対するペアドガイド欠損戦略を最初にテストした。イントロン領域に対して標的化された単一のgRNAによる編集はNHEJにより修復され、RP1発現に影響を及ぼさず(図4、シングルガイド14N2のみ)、したがって任意の対立遺伝子内に存在するイントロン3の複数の領域を標的とするきわめて効率的なガイドを、イントロン1またはエクソン4内に存在するH1 SNPを標的とする対立遺伝子特異的sgRNAとペア化した。二対立遺伝子標的ガイドは野生型および突然変異対立遺伝子の両方を編集するが、しかしイントロン1またはエクソン4内の対立遺伝子特異的ガイドとペア化したときには、突然変異対立遺伝子のみからゲノム部分を大きく削除することに留意されたい。より大きな欠損も、イントロン1およびエクソン4対立遺伝子特異的ガイドのペア化を介してやはり可能である(表8および表9)。
ゲノム編集の定量化-qPCR戦略
ゲノムレベルで編集効率およびRP1対立遺伝子欠損効率を定量化するためのqPCR戦略を開発した。qPCRプライマーを、予測された欠損内の領域を増幅するために設計した。「内部」アンプリコンを残存する「未削除」対立遺伝子からのみ生成させ、別の染色体上の参照遺伝子に対して標準化した後、残存する「未削除」対立遺伝子を未編集細胞と比較して定量化した(図3)。テストしたsgRNAについてすべての組合せが、編集細胞において、RP1対立遺伝子含有量を減少させることが可能であった(14N2+12A2のgRNAペアについて最大58%)。しかしながら、この定量化戦略はすべての編集イベントを捕捉するわけではない。例えば、デュアルDSB後に反転化すると、「内部」アンプリコンが編集により損傷を受けなかった場合には、その増幅はなおも可能となり得る。RP1発現低下の定量化が、以下に記載するように、対立遺伝子破綻のより正確な指標である。
ゲノムレベルで編集効率およびRP1対立遺伝子欠損効率を定量化するためのqPCR戦略を開発した。qPCRプライマーを、予測された欠損内の領域を増幅するために設計した。「内部」アンプリコンを残存する「未削除」対立遺伝子からのみ生成させ、別の染色体上の参照遺伝子に対して標準化した後、残存する「未削除」対立遺伝子を未編集細胞と比較して定量化した(図3)。テストしたsgRNAについてすべての組合せが、編集細胞において、RP1対立遺伝子含有量を減少させることが可能であった(14N2+12A2のgRNAペアについて最大58%)。しかしながら、この定量化戦略はすべての編集イベントを捕捉するわけではない。例えば、デュアルDSB後に反転化すると、「内部」アンプリコンが編集により損傷を受けなかった場合には、その増幅はなおも可能となり得る。RP1発現低下の定量化が、以下に記載するように、対立遺伝子破綻のより正確な指標である。
デュアルsgRNAによる編集後のRP1発現の定量化
デュアルsgRNAを、RP1発現細胞系Weri-Rb1中にトランスフェクトした。RNAをRNeasy Micro Plus(Qiagen社)を用いてGFP+細胞分画から抽出し、cDNAライブラリーをSuperscript III First-Strand Synthesis SuperMixを用いてqRT-PCR(Invitrogen社)用としてサンプル毎に生成した。RP1に対するcDNA特異的プライマーおよび参照遺伝子GAPDHの配列をOriGene社から取得し、RP1発現を編集サンプル内で非トランスフェクトコントロール細胞と比較して定量化した(図4)。43%のRP1発現低下が、14N1+7G1 gRNAで編集した細胞に認められた。ユニバーサルイントロン3標的ガイド14N2を個別にテストしたとき、RP1発現変化は観察されなかった。
デュアルsgRNAを、RP1発現細胞系Weri-Rb1中にトランスフェクトした。RNAをRNeasy Micro Plus(Qiagen社)を用いてGFP+細胞分画から抽出し、cDNAライブラリーをSuperscript III First-Strand Synthesis SuperMixを用いてqRT-PCR(Invitrogen社)用としてサンプル毎に生成した。RP1に対するcDNA特異的プライマーおよび参照遺伝子GAPDHの配列をOriGene社から取得し、RP1発現を編集サンプル内で非トランスフェクトコントロール細胞と比較して定量化した(図4)。43%のRP1発現低下が、14N1+7G1 gRNAで編集した細胞に認められた。ユニバーサルイントロン3標的ガイド14N2を個別にテストしたとき、RP1発現変化は観察されなかった。
RP1発現細胞系の生成
RP1は特殊な有糸分裂後光受容体において特異的に発現しているので、RP1発現に対する本発明の編集戦略の効果をテストするための市販細胞系がいくつか存在する。網膜芽細胞腫細胞系Weri-Rb1は、低レベルのRP1を発現するが、しかしトランスフェクトするには困難である。したがって、RP1転写開始部位(TSS)の上流にプロモーターを挿入することにより、RP1の外因性発現を用いて細胞系を生み出した。100bpホモロジーアーム、およびEF1aプロモーターと後続するネオマイシン耐性遺伝子、およびP2Aペプチド切断モチーフをコードするプラスミドを、RP1標的sgRNAおよびSpCas9を発現するプラスミドと共に、野生型Hap1細胞に同時トランスフェクトした。50μg/mLでG418選択してから3週間後に、15個の個別コロニーを取り出し、半定量RT-PCRによりプロモーターカセットの標的ゲノム統合およびRP1発現について分析した。次に、クローン5を単一の細胞から安定な細胞系を生み出すために選択し、12個のクローンをqRT-PCRにより相対的RP1発現量についてテストした(図5A)。3つの細胞系を、次にRP1発現量について、内因的発現細胞系Weri-Rb1と比較して定量した(図5B)。クローン5-1が、Weri-Rb1と比較して4倍のRP1発現量増加を示したが、またそれはsgRNAペアの編集効率、およびRP1発現に対するその効果を評価するのに使用される。
RP1は特殊な有糸分裂後光受容体において特異的に発現しているので、RP1発現に対する本発明の編集戦略の効果をテストするための市販細胞系がいくつか存在する。網膜芽細胞腫細胞系Weri-Rb1は、低レベルのRP1を発現するが、しかしトランスフェクトするには困難である。したがって、RP1転写開始部位(TSS)の上流にプロモーターを挿入することにより、RP1の外因性発現を用いて細胞系を生み出した。100bpホモロジーアーム、およびEF1aプロモーターと後続するネオマイシン耐性遺伝子、およびP2Aペプチド切断モチーフをコードするプラスミドを、RP1標的sgRNAおよびSpCas9を発現するプラスミドと共に、野生型Hap1細胞に同時トランスフェクトした。50μg/mLでG418選択してから3週間後に、15個の個別コロニーを取り出し、半定量RT-PCRによりプロモーターカセットの標的ゲノム統合およびRP1発現について分析した。次に、クローン5を単一の細胞から安定な細胞系を生み出すために選択し、12個のクローンをqRT-PCRにより相対的RP1発現量についてテストした(図5A)。3つの細胞系を、次にRP1発現量について、内因的発現細胞系Weri-Rb1と比較して定量した(図5B)。クローン5-1が、Weri-Rb1と比較して4倍のRP1発現量増加を示したが、またそれはsgRNAペアの編集効率、およびRP1発現に対するその効果を評価するのに使用される。
iPSCも、MEEIにおいて、IRDバイオバンク内の発端者から選択された、優性突然変異を有するRP1患者2例(OGI1557-002771、およびOGI1781-003109)から取得した線維芽細胞から生成した。患者OGI1557-002771は、H1/H3ハプロタイプについてヘテロ接合性であり、またH3のSNPとcisでc.2103delAATA突然変異を担持する。患者OGI1781-003109は、H2/H3についてヘテロ接合性であり、またH2のSNPとcisで突然変異c.2029C>Tを担持する。細胞には、Harvard iPSC Core Facilityにおいて、非組み込み型センダイウイルス法によるリプログラミングが施された。このiPS細胞および分化後の網膜オルガノイドは、リードCas9/デュアルsgRNAペアを、その有効性および安全性について評価するのに使用される。
その他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、上記説明は、本発明を例証するように意図されており、またその範囲(添付の特許請求の範囲により定義される)を限定しないものと理解される。その他の態様、利点、および改変は、下記の特許請求の範囲内にある。
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、上記説明は、本発明を例証するように意図されており、またその範囲(添付の特許請求の範囲により定義される)を限定しないものと理解される。その他の態様、利点、および改変は、下記の特許請求の範囲内にある。
Claims (28)
- Cas9タンパク質、ならびに第1のガイドRNA(gRNA)、および第2のgRNAをコードする配列を含む核酸であって、第1および/または第2のgRNAが、対象のRP1遺伝子の突然変異した対立遺伝子内に一塩基多型(SNP)を含む配列に対して標的化されており、前記突然変異した対立遺伝子が、常染色体優性網膜色素変性症(adRP)と関連する、核酸。
- 第1のgRNAが、イントロン1または3内の標的配列を含み、および/または第2のgRNAが、イントロン3またはエクソン4内の標的配列を含み、好ましくはgRNAの一方または両方が、表6に示す配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- Cas9タンパク質、およびイントロン1もしくは3、またはエクソン4内に一塩基多型(SNP)を含む配列に対して標的化されている少なくとも第1のgRNAをコードする配列を含み、任意選択的に第2のgRNAをコードする配列を含む核酸であって、任意選択的に、第1および第2のgRNAが、イントロン1もしくは3、および/またはイントロン3もしくはエクソン4内の配列に対して標的化されており、第2のgRNAが、ヒト対象のRP1遺伝子のSNPを含む二対立遺伝子配列または配列に対して標的化されている、
核酸。 - 前記gRNAが、表6に示す標的配列を含む、請求項3に記載の核酸。
- 黄色ブドウ球菌(S. aureus)Cas9、またはS.ピオゲネス(S. pyogenes)Cas9をコードする、請求項1から4のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記Cas9が、核局在化シグナル、任意選択的にC末端核局在化シグナルおよび/またはN末端核局在化シグナルを含み、ならびに/あるいはCas9をコードする配列が、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項5に記載の核酸。
- 前記Cas9タンパク質が、黄色ブドウ球菌(S. aureus)Cas9であり、および前記gRNAが、配列番号1もしくは配列番号2を含む単分子黄色ブドウ球菌(S. aureus)gRNA、または対応する2パートモジュラー黄色ブドウ球菌(S. aureus)gRNAであり、crRNAコンポーネントが、配列番号3または配列番号4を含み、およびtracrRNAコンポーネントが、配列番号5または配列番号6を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記Cas9タンパク質が、S.ピオゲネス(S. pyogenes)Cas9であり、および前記gRNAが、配列番号7から16に定める配列の任意の1つを含むS.ピオゲネス(S. pyogenes)gRNAである、請求項1から4のいずれか一項に記載の核酸。
- ウイルス送達ベクターを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記ウイルス送達ベクターが、Cas9用のプロモーター、好ましくはCMV、EFS、またはhGRKlプロモーターを含む、請求項9に記載の核酸。
- 前記ウイルス送達ベクターが、アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターを含む、請求項9に記載の核酸。
- (i)ヒトRP1遺伝子のイントロン1または3内のドメインを標的とする配列を含む第1のガイドRNA(gRNA)、およびヒトRP1遺伝子のイントロン3またはエクソン4内のドメインを標的とする配列を含む第2のgRNA、または少なくとも表6に列挙されている群から選択される配列を含むシングルガイドRNA、
(ii)第1および第2の末端逆位反復配列(ITR)、
(iii)第1および第2のgRNAの発現を駆動するプロモーター、好ましくはU6プロモーター、ならびに
(iv)好ましくはCMV、EFS、またはhGRKlプロモーターからなる群から選択される、前記Cas9の発現を駆動するプロモーター
を含む、請求項9から11に記載の核酸。 - 治療で使用するための、請求項1から12のいずれか一項に記載の核酸。
- 医薬の調製で使用するための、請求項1から12のいずれか一項に記載の核酸。
- RP1における突然変異と関連する状態を有する対象を処置する方法で使用するための、請求項1から12のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記状態が、常染色体優性網膜色素変性症(adRP)である、請求項15に記載の使用のための核酸。
- 前記AAVベクターが、注入により、例えば網膜下注入等により対象の網膜に送達される、請求項14または15に記載の使用のための核酸。
- 細胞のゲノムを変化させる方法であって、CRISPR編集を使用して、ヒトRP1遺伝子のイントロン1または3内に第1の二本鎖切断、およびヒトRP1遺伝子のイントロン3または4内に第2の二本鎖を形成することを含む方法。
- 前記細胞が、哺乳動物の眼の細胞である、請求項18に記載の方法。
- 第1および第2の二本鎖切断が、表6から選択される配列を含むgRNAのペアを使用して生成される、請求項18に記載の方法。
- 第1および第2の二本鎖切断が、第8染色体上RP1遺伝子の突然変異対立遺伝子の、(a)エクソン2およびエクソン3のすべて、(b)エクソン4の一部分、または(c)エクソン2およびエクソン3のすべて、ならびにエクソン4の一部分の除去を、当該対立遺伝子からのRP1タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こすように、非相同末端結合(NHEJ)により修復される、請求項18から20に記載の方法。
- 第1および/または第2のgRNAが、Cas9分子と複合体形成するように構成されている、請求項18から20に記載の方法。
- 前記細胞が、常染色体優性網膜色素変性症(adRP)に罹患した対象に由来する、請求項18から20に記載の方法。
- 前記細胞が、網膜細胞または視細胞である、請求項18から20に記載の方法。
- 前記視細胞が、錐体視細胞もしくは錐体細胞、桿状視細胞もしくは桿状細胞、または黄斑性錐体視細胞である、請求項24に記載の方法。
- 細胞を変化させる方法であって、
ヒトRP1遺伝子のイントロン1または3内のドメインを標的とする配列、好ましくは表6に示すような配列を含む第1のgRNAをコードするヌクレオチド配列、
ヒトRP1遺伝子のイントロン3またはエクソン4内のドメインを標的とする配列、好ましくは表6に示すような配列を含む第2のgRNA分子をコードするヌクレオチド配列、および
Cas9分子をコードするヌクレオチド配列
を含む組換えウイルス粒子と、前記細胞を接触させることを含み、
前記ウイルス粒子が、非分裂細胞への送達能力を有し、
前記接触させることが、第8染色体上RP1遺伝子の突然変異対立遺伝子の、(a)エクソン2およびエクソン3のすべて、(b)エクソン4の一部分、または(c)エクソン2およびエクソン3のすべて、ならびにエクソン4の一部分の除去を、当該対立遺伝子からのRP1タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こす、方法。 - 前記ウイルス粒子が、アデノ関連ウイルス(AAV)ウイルス粒子である、請求項26に記載の方法。
- 第1のgRNAおよび第2のgRNAが、表6に示されている、請求項1から17のいずれか一項に記載の核酸、または請求項18から27に記載の方法。
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