JP2023519101A - Ｒｐ１関連網膜変性症のハプロタイプに基づく処置 - Google Patents
Ｒｐ１関連網膜変性症のハプロタイプに基づく処置 Download PDFInfo
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Abstract
ＲＰ１突然変異関連の常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）の処置を目的として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用するための方法および組成物。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年２月１２日出願の米国仮特許出願第６２／９７５、６３６号明細書の優先権および利益を主張する。同号明細書の全内容および開示は本明細書において参照により組み込まれている。
本出願は、２０２０年２月１２日出願の米国仮特許出願第６２／９７５、６３６号明細書の優先権および利益を主張する。同号明細書の全内容および開示は本明細書において参照により組み込まれている。
網膜色素変性１タンパク質（ＲＰ１）突然変異関連の常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）の処置を目的として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用するための方法および組成物が、本明細書に記載される。
網膜色素変性症（ＲＰ）は、年齢を問わずすべての人々の視力喪失の重要な原因である。この疾患は、集団的に、網膜における光感応性視細胞（視覚に必要とされる）の進行性の死により特徴付けられる。ＲＰは遺伝的にきわめて不均質性であり、ＲＰ遺伝子内の突然変異は常染色体劣性、常染色体優性、またはＸ連鎖の複数の遺伝様式で親から子に受け継がれる可能性がある。現在のところ、６０を超える遺伝子内の突然変異が非症候性のＲＰを引き起こすことが知られており、さらに７３遺伝子における突然変異がＲＰの症候性の形態、例えばＵｓｈｅｒ症候群およびＢａｒｄｅｔ－Ｂｉｅｄｌ症候群等を引き起こす。ＲＰの劣性の形態では、遺伝子増強療法の開発に有意な進歩がみられ、疾患遺伝子の正常なコピーを用いた網膜細胞補充が治療効果を有する可能性がある。しかしながら、優性ＲＰ（全ＲＰ症例の約４０％を占める）の場合、有効な治療法が未開発である。ほとんどの優性ＲＰ遺伝子は、細胞を損傷させる突然変異体タンパク質を生成し、遺伝子増強療法を無効にする。したがって、優性ＲＰまたは遺伝性網膜変性症（ＩＲＤ）の任意の優性形態を恒久的に治癒させるには、突然変異体タンパク質の生成を是正または抑制する必要がある。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連のタンパク質９）ゲノム編集技術は、哺乳動物細胞および多くの生物内で遺伝子コードを編集するための有効なツールであることが明らかにされている。病原性タンパク質の生成を排除し、したがって優性ＲＰ患者において視細胞が死滅するのを防止するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を介して優性ＲＰ遺伝子の突然変異体コピーを特異的に無効化する方法が本明細書に記載される。したがって、ＲＰ１突然変異関連の常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）を処置するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の使用が本明細書に記載される。
したがって、Ｃａｓ９タンパク質、ならびに第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および第２のｇＲＮＡをコードする配列を含む核酸であって、第１および／または第２のＲＮＡが、対象のＲＰ１遺伝子の突然変異した対立遺伝子内に一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列に対して標的化されており、該突然変異した対立遺伝子が、常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）と関連する、核酸が本明細書に提示される。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、イントロン１もしくは３内の標的配列を含み、および／または第２のｇＲＮＡは、イントロン３またはエクソン４内の標的配列を含み、好ましくはｇＲＮＡの一方または両方は表６に示す配列を含む。いくつかの実施形態では、第１または第２のｇＲＮＡは、例えばイントロン３内の二対立遺伝子配列に対して標的化されているが、他方のｇＲＮＡは、ＳＮＰを含む配列に対して標的化されている。
Ｃａｓ９タンパク質、および任意選択的にイントロン１もしくは３、またはエクソン４内に一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列に対して標的化されている少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする配列を含み、任意選択的に第２のｇＲＮＡをコードする配列を含む核酸であって、任意選択的に、第１および第２のｇＲＮＡが、イントロン１もしくは３、および／またはイントロン３もしくはエクソン４内の配列に対して標的化されており、第２のｇＲＮＡが、ヒト対象のＲＰ１遺伝子のＳＮＰを含む二対立遺伝子配列または配列に対して標的化されている、核酸も本明細書に提示される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは表６に示す標的配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｃａｓ９、またはＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｃａｓ９をコードする。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、核局在化シグナル、任意選択的にＣ末端核局在化シグナルおよび／またはＮ末端核局在化シグナルを含み；ならびに／あるいはＣａｓ９をコードする配列は、ポリアデニル化シグナルを含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１もしくは配列番号２（国際公開第２０１８／０２６９７６号パンフレットの配列番号７もしくは配列番号８にそれぞれ対応する）を含む単分子黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｇＲＮＡ、または対応する２パートモジュラー黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｇＲＮＡであり、ｃｒＲＮＡコンポーネントは、配列番号３または配列番号４（配列番号１または配列番号２の太字セクション）を含み、およびｔｒａｃｒＲＮＡコンポーネントは、配列番号５または配列番号６（配列番号１または配列番号２の下線付きのセクション）を含む。
配列番号１：黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｇＲＮＡコンポーネント
［Ｎ］１６～２４ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴ
配列番号２：黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｇＲＮＡコンポーネント
［Ｎ］１６～２４ＧＴＴＡＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＴＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴ
配列番号３：ｃｒＲＮＡコンポーネント
ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧ
配列番号４：ｃｒＲＮＡコンポーネント
ＧＴＴＡＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧ
配列番号５：ｔｒａｃｒＲＮＡコンポーネント
ＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴ
配列番号６：ｔｒａｃｒＲＮＡコンポーネント
ＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＴＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴ
［Ｎ］１６～２４ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴ
配列番号２：黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｇＲＮＡコンポーネント
［Ｎ］１６～２４ＧＴＴＡＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＴＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴ
配列番号３：ｃｒＲＮＡコンポーネント
ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧ
配列番号４：ｃｒＲＮＡコンポーネント
ＧＴＴＡＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧ
配列番号５：ｔｒａｃｒＲＮＡコンポーネント
ＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴ
配列番号６：ｔｒａｃｒＲＮＡコンポーネント
ＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＴＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴ
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号７～１６（国際公開第２０１４／１４４５９２号パンフレットの配列番号２４０４、２４０７、２４０８、および１～７に対応する）に定める配列の任意の１つを含むＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡである。
配列番号７：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ；
配列番号８：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ
配列番号９：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ
配列番号１０：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ
配列番号１１：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ
配列番号１２：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ
配列番号１３：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ
配列番号１４：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ
配列番号１５：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ
配列番号１６：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ
式中、Ｘ１７～２０は、選択された標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側直近に位置する標的配列の相補鎖の１７～２０の連続したヌクレオチドに対して相補的である相補性領域である。
配列番号７：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ；
配列番号８：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ
配列番号９：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ
配列番号１０：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ
配列番号１１：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ
配列番号１２：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ
配列番号１３：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ
配列番号１４：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ
配列番号１５：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ
配列番号１６：Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡ
（Ｘ１７～２０）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ
式中、Ｘ１７～２０は、選択された標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側直近に位置する標的配列の相補鎖の１７～２０の連続したヌクレオチドに対して相補的である相補性領域である。
いくつかの実施形態では、核酸は、ベクター、例えばウイルス送達ベクターを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス送達ベクターは、Ｃａｓ９用のプロモーター、例えばＣＭＶ、ＥＦＳ、またはｈＧＲＫｌプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス送達ベクターは、ｇＲＮＡ用のプロモーター、例えばＵ６プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス送達ベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。
いくつかの実施形態では、核酸は、（ｉ）ヒトＲＰ１遺伝子のイントロン１または３内のドメインを標的とする配列を含む第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびヒトＲＰ１遺伝子のイントロン３またはエクソン４内のドメインを標的とする配列を含む第２のｇＲＮＡ、または表６に列挙されている群から選択される配列を含むシングルガイドＲＮＡ；（ｉｉ）第１および第２の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）；（ｉｉｉ）第１および第２のｇＲＮＡの発現を駆動するプロモーター、例えばＵ６プロモーター；ならびに（ｉｖ）好ましくはＣＭＶ、ＥＦＳ、またはｈＧＲＫｌプロモーターからなる群から選択される、Ｃａｓ９の発現を駆動するプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの発現を駆動するプロモーターは、Ｈ１または７ＳＫプロモーターである。
治療で使用するための本明細書に記載される核酸、ならびに医薬の調製で使用するための、またはＲＰ１における突然変異と関連する状態を有する対象を処置する方法で使用するための、本明細書に記載される核酸も提供される。
いくつかの実施形態では、状態は、常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）である。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターが、注入により、例えば網膜下注入等により対象の網膜に送達される。
細胞のゲノムを変化させるための方法も本明細書に提示される。方法は、ＣＲＩＳＰＲ編集を使用して、ヒトＲＰ１遺伝子のイントロン１または３内に第１の二本鎖切断、およびヒトＲＰ１遺伝子のイントロン３または４内に第２の二本鎖を形成することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物、例えばヒトの眼の細胞である。
いくつかの実施形態では、第１および第２の二本鎖切断は、表６から選択される配列を含むｇＲＮＡのペアを使用して生成される。
いくつかの実施形態では、第１および第２の二本鎖切断は、第８染色体上ＲＰ１遺伝子の突然変異対立遺伝子の、エクソン２、エクソン３、およびエクソン４の全部または一部の除去を、当該対立遺伝子からのＲＰ１タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こすように、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される。
いくつかの実施形態では、第１および第２の二本鎖切断は、第８染色体上ＲＰ１遺伝子の突然変異対立遺伝子の、（ａ）エクソン２およびエクソン３のすべて；（ｂ）エクソン４の一部分；または（ｃ）エクソン２およびエクソン３のすべて、ならびにエクソン４の一部分の除去を、当該対立遺伝子からのＲＰ１タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こすように、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される。いくつかの実施形態では、第１および第２の二本鎖切断は、第８染色体上ＲＰ１遺伝子の突然変異対立遺伝子の、エクソン２およびエクソン３、またはエクソン４の全部または一部の除去を、当該対立遺伝子からのＲＰ１タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こすように、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される。
いくつかの実施形態では、第１および／または第２のｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子と複合体形成するように構成されている。
いくつかの実施形態では、細胞は、常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）に罹患した対象に由来する。
いくつかの実施形態では、細胞は網膜細胞または視細胞である。
いくつかの実施形態では、視細胞は、錐体視細胞もしくは錐体細胞、桿状視細胞もしくは桿状細胞、または黄斑性錐体視細胞である。
さらに、細胞を変化させるための方法が本明細書に提示される。該方法は、ヒトＲＰ１遺伝子のイントロン１または３内のドメインを標的とする配列、好ましくは表６に示すような配列を含む第１のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；ヒトＲＰ１遺伝子のイントロン３またはエクソン４内のドメインを標的とする配列、好ましくは表６に示すような配列を含む第２のｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列；およびＣａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列；を含む組換えウイルス粒子と、細胞を接触させることを含み、前記ウイルス粒子は、非分裂細胞への送達能力を有し、前記接触させることは、第８染色体上ＲＰ１遺伝子の突然変異対立遺伝子の、エクソン２、エクソン３、およびエクソン４の全部または一部の除去を、当該対立遺伝子からのＲＰ１タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こす。
いくつかの実施形態では、方法は、ヒトＲＰ１遺伝子のイントロン１または３内のドメインを標的とする配列、好ましくは表６に示すような配列を含む第１のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；ヒトＲＰ１遺伝子のイントロン３またはエクソン４内のドメインを標的とする配列、好ましくは表６に示すような配列を含む第２のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；ならびにＣａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列；を含む組換えウイルス粒子と、細胞を接触させることを含み、前記ウイルス粒子は、非分裂細胞への送達能力を有し、前記接触させることは、第８染色体上ＲＰ１遺伝子の突然変異対立遺伝子の、エクソン２、およびエクソン３、またはエクソン４の全部または一部の除去を、当該対立遺伝子からのＲＰ１タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こす。
いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のウイルス粒子である。
本明細書に記載される方法および核酸のいくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡが表６に示される。
別途定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。本発明で使用される方法および材料が本明細書に記載されているが、当技術分野において公知のその他の好適な方法および材料も使用可能である。材料、方法、および実施例は、例示目的に限定されており、限定するようには意図されない。本明細書に記載されるすべての公開資料、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、およびその他の参考資料は、参照によりそのまま組み込まれている。矛盾する場合、本明細書が、定義を含めコントロールする。
本発明のその他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明白である。
優性突然変異の効果は、機能獲得型、優性阻害型、またはハプロ不全型の機構を介して生じる可能性がある。常染色体優性ＲＰ（ａｄＲＰ）に対する遺伝子療法を開発するための第１の課題は、健常遺伝子の送達に付加して、突然変異体遺伝子も抑制する必要があり得るという点にある（Lewin, A.S., et al., (1998). Nat.Med. 4(8): p.967-971; O'Reilly, M., et al., (2008). Vision Research, 48(3): p.386-91;およびO'Reilly, M., et al., (2007) American Journal of Human Genetics, 81(1): p.127-35）。第２の課題は、多くのＩＲＤ遺伝子において、例えば、正常遺伝子が過剰発現すると網膜変性を引き起こすおそれがあるなどのように、治療投薬量が狭いウィンドウ内に限定されるという点にある（O'Reilly, M., et al., (2008) Vision Research. 48(3): p. 386-91; Wen, X.H., et al., (2009) Biophys J, 96(3): p.939-50;およびLiu, Q., et al., (2012) PLoS One, 7(8): p.e43251）。例えば、トランスジェニックＲｐ１マウス系統において、Ｒｐ１が生理学的正常レベルよりも５０％余分に発現すると、ＲＰ様の網膜変性を引き起こす（Liu, Q., et al., (2012) PLoS One,. 7(8): p. e43251）。したがって、優性ＲＰに対する最適な治療アプローチでは、突然変異体タンパク質を除去するだけでなく、野生型タンパク質発現レベルを内因性発現レベルに維持することも必要とされる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくゲノム編集ツールは、突然変異近傍に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することにより（それは次に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、または相同配列指向性修復（ＨＤＲ）（homology-directed repair）経路を通じて修復され、突然変異対立遺伝子の喪失または是正に至る）、哺乳動物細胞内の病因性突然変異を編集し得る信頼性および実用性のある手段を提供する（Yin, H., et al., (2014) Nat Biotechnol, 2014. 32(6): p.551-3; Ran, F.A., et al., (2015) Nature, 2015. 520(7546): p.186-91; Swiech, L., et al., (2015) Nat Biotechnol, 2015. 33(1): p. 102-6; Tabebordbar, M., et al., (2016) Science, 2016. 351(6271): p.407-11; Yang, Y., et al.,(2016). Nature Biotechnology, 2016. 34(3): p.334-8）。ゲノムＤＮＡを直接変化させることにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、編集された遺伝子をその内因性発現の化学量論下に維持し、これにより従来の遺伝子増強療法を用いた場合に生じ得る異所性発現および異常な遺伝子生成を回避する能力を有する。ａｄＲＰのＲＨＯ形態についての最近の研究は、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ系は、ロドプシン遺伝子の野生型と突然変異体Ｐ２３Ｈ対立遺伝子との間の一塩基対の相違を識別し、したがってマウス網膜における突然変異対立遺伝子の発現を特異的に破綻させる能力を有することを実証した。しかしながら、この突然変異に基づく遺伝子ノックアウトアプローチでは、所定の遺伝子内の病原性突然変異毎に個別のＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ標的系を開発することが必要とされ、より多数の患者を処置する場合、その適用が制限されてしまう。
ＲＰ１において今日までに同定された優性突然変異は、最終エクソン（エクソン４）のＮ末端側の半分においてクラスター化しているナンセンス突然変異またはフレームシフト突然変異のいずれかである（Gandra, M., et al., (2008). Mol.Vis., 14: p. 1105-1113; Chen, L.J., et al., (2009). Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 51(4): p. 2236-2242; Liu, Q., et al, (2009) Investigative ophthalmology & visual science 50(4): p. 1566-74; Liu, Q., et al., (2012). PLoS One, 7(8): p. e43251）。突然変異体ＲＰ１対立遺伝子は、光受容体において優性阻害的役割を演じているトランケートされたタンパク質をコードすることが予測される（Liu, Q., et al., (2012). PLoS One, 7(8): p. e43251; Liu, Q., A. et al (2009), Invest Ophthalmol Vis Sci, 50(4): p. 1566-74;およびLiu, Q., et al. (2004) J Neurosci, 24(29): p. 6427-36）。ＲＰ１内の最も一般的な突然変異であるＲ６７７Ｘは、ａｄＲＰを有する米国患者のおよそ３％に存在し、３番目に最も一般的なａｄＲＰ突然変異となっている（Jacobson, S.G., et al., (2000) Investigative ophthalmology & visual science, 41(7): p. 1898-908; Berson, E.L., et al., (2001) Investigative ophthalmology & visual science, 42(10): p. 2217-24; Schwartz, S.B., et al., (2003) Investigative Ophthalmology & Visual Science, 44(8): p. 3593-7;およびGamundi, M.J., et al., (2006) BMC.Med.Genet., 7: p.35）。優性ＲＰ１突然変異は、いずれも最終エクソン内に位置し、またそのような対立遺伝子に由来する転写物は、ナンセンス変異依存分解機構を逃れてトランケートされたタンパク質を生成する。したがって、Ｃａｓ９切断による突然変異の破壊およびＮＨＥＪ修復は、最終エクソン内に新たなフレームシフトまたはトランケート性のインデルを創出するのみであり、毒性遺伝子生成物の遷延を引き起こす。
本方法は、突然変異体ＲＰ１対立遺伝子の発現を破綻させるために、サロゲート標的部位としてコモンＳＮＰを使用するペアドｓｇＲＮＡ標的アプローチを採用する（図１）。この戦略は、ＲＰ１内の任意の常染色体優性突然変異に適用され得るが、野生型対立遺伝子はその内因性発現の化学量論下に留まり、５０％のＲＰ１発現であれば、正常な網膜完全性および機能にとって十分であるので、追加の遺伝子増強療法に対する必要性が回避される。３つの最も一般的なＲＰ１ハプロタイプの複合頻度は９３％であり、および３つの一般的なハプロタイプの総ホモ接合頻度は３５％である。これは、一般母集団のおよそ２／３が、ＲＰ１ハプロタイプについてヘテロ接合性であり、ＳＮＰに基づくＣＲＩＳＲＰ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術による特異的標的対象とされ得ることを示唆する。
したがって、ＲＰ１内に優性突然変異を有する対象を処置する際に使用するための方法および組成物が、本明細書に提示される。
ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）およびガイドＲＮＡ
本方法は、突然変異体ＲＰ１対立遺伝子の部分を調べ、またその発現を破綻させるために、ＲＰ１の突然変異対立遺伝子内のＳＮＰに対して標的化されているペアドＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）の使用を含む。方法は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、およびそのオルソログを含むＲＧＮの使用を含み得る。
本方法は、突然変異体ＲＰ１対立遺伝子の部分を調べ、またその発現を破綻させるために、ＲＰ１の突然変異対立遺伝子内のＳＮＰに対して標的化されているペアドＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）の使用を含む。方法は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、およびそのオルソログを含むＲＧＮの使用を含み得る。
Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼは、操作されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の１７～２０ヌクレオチド、例えばシングルガイドＲＮＡ、またはｃｒｉｓｐｒＲＮＡ／トランス活性化ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ）ペアと、目的とする標的ゲノムＤＮＡ配列の相補鎖（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、配列ＮＧＧまたはＮＡＧに適合するＰＡＭに隣接して延在する）との間の単純な塩基対相補性を介して誘導可能である（Shen et al., (2013) Cell Res ; Dicarlo et al., (2013) Nucleic Acids Res ; Jiang et al., (2013) Nat Biotechnol 31, 233-239 ; Jinek et al., (2013) Elife 2, e00471 ; Hwang et al., (2013) Nat Biotechnol 31, 227-229 ; Cong et al., (2013) Science 339, 819-823; Mali et al., (2013) Science 339, 823-826; Cho et al., (2013) Nat Biotechnol 31, 230-232; Jinek et al., (2012) Science 337, 816-821）。例えば、配列番号７～１６に定める配列を参照されたい。例えばZetsche et al., (2015) Cell 163, 759-771 ; Schunder et al., (2013) Int J Med Microbiol 303, 51-60; Makarova et al., (2015) Nat Rev Microbiol 13, 722-736 ; Fagerlund et al., (2015) Genome Biol 16, 251に記載されるように、プレボテラ属（Prevotella）およびフランシセラ属（Francisella）１（Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ａとしても知られている）ヌクレアーゼ由来の操作されたＣＲＩＳＰＲも使用可能である。ＳｐＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１／Ｃａｓ１２ａは、単一の４２ｎｔ ｃｒＲＮＡ（標的ＤＮＡ配列のプロトスペーサーに対して相補的である２３ｎｔをその３’末端に有する）のみを必要とする（Zetsche et al., (2015) Cell 163, 759-771）。さらに、ＳｐＣａｓ９は、プロトスペーサーの３’であるＮＧＧ ＰＡＭ配列を認識する一方、ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐ１は、プロトスペーサーの５’であることが判明しているＴＴＴＮ ＰＡＭを認識する（同上）。
いくつかの実施形態では、本システムは、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）もしくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来の野生型もしくはバリアントＣａｓ９タンパク質、またはアシダミノコッカス種（Acidaminococcus sp.）のＢＶ３Ｌ６もしくはラクノスピラ科（Lachnospiraceae）バクテリアＮＤ２００６由来の野生型もしくはバリアントＣｐｆ１タンパク質を利用し、いずれも細菌内でコードされ、または哺乳動物細胞内で発現させるためにコドン最適化され、ならびに／あるいはそのＰＡＭ認識特異性および／またはそのゲノム全域にわたる特異性において改変される。いくつかのバリアントが記載されており、例えば、特に国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット、ＰＣＴ／ＵＳ第２０１６／０４９１４７号明細書、Kleinstiver et al., (2016) Nat Biotechnol.Aug;34(8):869-74; Tsai and Joung, (2016) Nat Rev Genet. May;17(5):300-12; Kleinstiver et al., (2016) Nature. Jan 28;529(7587):490-5; Shmakov et al., (2015) Mol Cell. Nov 5;60(3):(2015) 385-97; Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. Dec;33(12):1293-1298; Dahlman et al., (2015) Nat Biotechnol. Nov;33(11):1159-61; Kleinstiver et al., (2015) Nature. Jul 23;523(7561):481-5; Wyvekens et al., (2015) Hum Gene Ther. Jul;26(7):425-31; Hwang et al., (2015) Methods Mol Biol. 1311:317-34; Osborn et al., (2015) Hum Gene Ther. Feb;26(2):114-26; Konermann et al., (2015) Nature. Jan 29;517(7536):583-8; Fu et al., (2014) Methods Enzymol. 546:21-45;およびTsai et al., (2014) Nat Biotechnol. Jun;32(6):569-76を参照されたい。黄色ブドウ球菌（S. aureus）と共に使用される代表的なガイドＲＮＡとして、配列番号１～６に定めるものが挙げられる。
Ｃａｓ９および類似体を表１に示し、また操作されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、またはハイフィデリテイバリアントを表２に示す。
いくつかの実施形態では、ＲＧＮ配列は、例えばＲＧＮタンパク質のＣおよび／またはＮ末端に位置する核局在化配列（ＮＬＳ）、およびミニポリアデニル化シグナル（またはポリＡ配列）を含むように改変される。代表的なＮＬＳは、ＳＶ４０大Ｔ抗原ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号１７））；ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１８）；ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９）；およびヌクレオプラスミンＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２０））を含む。その他のＮＬＳが当技術分野において公知である；例えばCokol et al., (2000) EMBO Rep. Nov 15; 1(5):411-415; Freitas and Cunha, (2009) Curr Genomics. Dec; 10(8): 550-557;およびLeung et al (2003) Journal of Biol Chem. 278(43):41947-41953を参照されたい。代表的なポリアデニル化シグナルは、ＴＡＧＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＴＣＧＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＧＡＡＧＣＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＡＴＣＡＧＧＣＧＣＧ（配列番号２１））である。
ＲＧＮにふさわしいガイドＲＮＡを使用すべきである。いくつかの実施形態では、本開示で使用されるｇＲＮＡは、当技術分野において公知なように、単分子性またはモジュラー性であり得る。
ベクター
ＲＧＮおよびガイドＲＮＡをコードする配列は、例えばウイルスベクターを使用して網膜に送達され得る。網膜において、例えば光受容体において、例えば主に光受容体において、またはそれに限定して、本明細書に記載されるようなＲＧＮおよびガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを、ｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトし、および発現させるための標的化発現ベクターについて本明細書に記載される。そのようなコンポーネントの発現コンストラクトは、任意の有効な担体、例えば任意の処方物または組成物（コンポーネント遺伝子を細胞にｉｎ ｖｉｖｏで効率的に送達する能力を有する）に含めて投与可能である。アプローチとして、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、および単純ヘルペスウイルス－１、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、または組換え細菌プラスミドもしくは真核生物プラスミドを含むウイルスベクター内への遺伝子挿入が挙げられる；好ましいウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ８である。ウイルスベクターは細胞を直接トランスフェクトする；プラスミドＤＮＡは、そのまま、あるいは例えばカチオン性リポソーム（リポフェクタミン）もしくは誘導体化物（例えば、抗体コンジュゲート化物）、カチオン性デンドリマー、無機ベクター（例えば、酸化鉄マグネトフェクション）、リピドイド、細胞透過性ペプチド、シクロデキストリンポリマー（ＣＤＰ）、ポリリジンコンジュゲート、グラマシジンＳ（gramacidin S）、人工ウイルスエンベロープ、またはその他のそのような細胞内担体、ならびに遺伝子コンストラクトの直接注射、またはｉｎ ｖｉｖｏで実施されるＣａＰＯ４沈殿の支援を受けて送達可能である。
ＲＧＮおよびガイドＲＮＡをコードする配列は、例えばウイルスベクターを使用して網膜に送達され得る。網膜において、例えば光受容体において、例えば主に光受容体において、またはそれに限定して、本明細書に記載されるようなＲＧＮおよびガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを、ｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトし、および発現させるための標的化発現ベクターについて本明細書に記載される。そのようなコンポーネントの発現コンストラクトは、任意の有効な担体、例えば任意の処方物または組成物（コンポーネント遺伝子を細胞にｉｎ ｖｉｖｏで効率的に送達する能力を有する）に含めて投与可能である。アプローチとして、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、および単純ヘルペスウイルス－１、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、または組換え細菌プラスミドもしくは真核生物プラスミドを含むウイルスベクター内への遺伝子挿入が挙げられる；好ましいウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ８である。ウイルスベクターは細胞を直接トランスフェクトする；プラスミドＤＮＡは、そのまま、あるいは例えばカチオン性リポソーム（リポフェクタミン）もしくは誘導体化物（例えば、抗体コンジュゲート化物）、カチオン性デンドリマー、無機ベクター（例えば、酸化鉄マグネトフェクション）、リピドイド、細胞透過性ペプチド、シクロデキストリンポリマー（ＣＤＰ）、ポリリジンコンジュゲート、グラマシジンＳ（gramacidin S）、人工ウイルスエンベロープ、またはその他のそのような細胞内担体、ならびに遺伝子コンストラクトの直接注射、またはｉｎ ｖｉｖｏで実施されるＣａＰＯ４沈殿の支援を受けて送達可能である。
核酸を細胞内にｉｎ ｖｉｖｏ導入するための代表的なアプローチは、核酸、例えばｃＤＮＡを含有するウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターを用いた細胞の感染は、被標的細胞の大部分が核酸を取り込むことができるという利点を有する。さらに、ウイルスベクター内でコードされる分子は、例えばウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡにより、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞内で効率的に発現される。
ウイルスベクターは、外来遺伝子を、特にヒト中にｉｎ ｖｉｖｏで移送するための組換え遺伝子送達系として使用可能である。このようなベクターは、遺伝子の細胞中への効率的な送達を実現し、またいくつかのケースでは、移動した核酸は、宿主の染色体ＤＮＡ内に安定的に組み込まれる。組換えウイルスを生み出すため、および細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでそのようなウイルスに感染させるためのプロトコールは、Ausubel, et al., eds., Gene Therapy Protocols Volume 1: Production and In Vivo Applications of Gene Transfer Vectors, Humana Press, (2008), pp. 1-32、およびその他の標準的な研究室マニュアルに見出され得る。
核酸の送達に有用な好ましいウイルスベクター系は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ関連ウイルスは、効率的な複製および生産的なライフサイクルを行うために、ヘルパーウイルスとして別のウイルス、例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルス等を必要とする自然発生的な欠陥ウイルスである。（レビューについてはMuzyczka et al., Curr. Topics in Micro and Immunol.158:97-129 (1992)を参照されたい;またDomenger and Grimm, Human Molecular Genetics, 28(R1):R3-R14 (October 2019)も参照されたい）。ＡＡＶベクターは、様々な細胞型を有効に形質変換させ、またｉｎ ｖｉｖｏで導入遺伝子の長期発現もなし得る。ＡＡＶベクターゲノムはエピソームとして細胞内に存続し得るが、ベクターの組込みも観測されている（例えば、Deyle and Russell, Curr Opin Mol Ther. 2009 Aug; 11(4): 442-447; Asokan et al., Mol Ther. 2012 April; 20(4): 699-708; Flotte et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356 (1992); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989);およびMcLaughlin et al., J. Virol. 62:1963-1973 (1989)を参照されたい）。ＡＡＶベクター、特にＡＡＶ２が、遺伝子を増強または置換するために広範に使用されており、また一連の動物モデルならびにクリニックにおいて治療効果も明らかにされている；例えば、Mingozzi and High, (2011) Nature Reviews Genetics 12, 341-355 ; Deyle and Russell, (2009) Curr Opin Mol Ther. Aug; 11(4): 442-447; Asokan et al., (2012) Mol Ther. April; 20(4): 699-708を参照されたい。３００塩基対ほどの小さなＡＡＶを含有するＡＡＶベクターであれば、パッケージング可能であり、また、組換えタンパク質の発現もなし得る。外因性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限定される。例えば、ＡＡＶ１、２、４、５、または８ベクターは、ＤＮＡを網膜中、例えば光受容体、内部網膜細胞、またはＲＰＥ細胞（例えば、Maguire et al. (2008). N Engl J Med 358: 2240-2248; Maguire et al. (2009). Lancet 374: 1597-1605; Bainbridge et al. (2008). N Engl J Med 358: 2231-2239; Hauswirth et al. (2008). Hum Gene Ther 19: 979-990; Cideciyan et al. (2008). Proc Natl Acad Sci USA 105: 15112-15117; Cideciyan et al. (2009). N Engl J Med 361: 725-727; Simonelli et al. (2010). Mol Ther 18: 643-650; Acland, et al. (2005). Mol Ther 12: 1072-1082; Le Meur et al. (2007). Gene Ther 14: 292-303; Stieger et al. (2008). Mol Ther 16: 916-923;およびVandenberghe et al. (2011). Sci Transl Med 3: 88ra54に記載されているもの等）中に導入するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、国際公開第２０１５０５４６５３号パンフレットに記載されているＡＡＶカプシドポリペプチド；例えば国際公開第２０１５０５４６５３号パンフレットの配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＡＡＶカプシドポリペプチド、ならびに本明細書に記載されるようなＲＧＮおよびガイドＲＮＡコーディング配列を含むウイルス粒子を含む（またはそれをコードする配列を含む）可能性がある。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドポリペプチドは、国際公開第２０１５０５４６５３号パンフレットの表１に示す通りであり、それをここに転載する：
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドポリペプチドは、Ａｎｃ８０ポリペプチドであり、例えば代表的なポリペプチドは、国際公開第２０１５０５４６５３号パンフレットの配列番号１９（Ａｎｃ８０Ｌ２７）；配列番号２０（Ａｎｃ８０Ｌ５９）；配列番号２１（Ａｎｃ８０Ｌ６０）；配列番号２２（Ａｎｃ８０Ｌ６２）；配列番号２３（Ａｎｃ８０Ｌ６５）；配列番号２４（Ａｎｃ８０Ｌ３３）；配列番号２５（Ａｎｃ８０Ｌ３６）、および配列番号２６（Ａｎｃ８０Ｌ４４）に示される。
様々な核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞型に導入されている（例えば、上記で引用された参考文献、ならびにAsokan et al., (2012) Molecular Therapy ; 20 4, 699-708;およびHermonat et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al., (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al., (1984) J. Virol. 51:611-619;およびFlotte et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790において引用されたものを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、折り畳まれて二本鎖ＤＮＡを形成する逆向き反復配列を含有する自己相補性ＡＡＶが使用される。
レトロウイルスも使用可能である。複製欠陥レトロウイルスのみを生み出す特殊な細胞系（「パッケージング細胞」と呼ばれる）の開発によって、遺伝子療法用レトロウイルスの有用性が高まり、また欠陥レトロウイルスは、遺伝子療法を目的として遺伝子移入する際に使用するために特徴付けられる（レビューについては、Katz et al., (2013) Human Gene Therapy 24:914を参照されたい）。複製欠損レトロウイルスは、ビリオン中にパッケージングされてもよく、これを標準技術により、ヘルパーウイルスの使用を通じて標的細胞を感染させるのに使用可能である。適するレトロウイルスの例として、当業者にとって公知であるｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭが挙げられる。狭宿主性および広宿主性のレトロウイルス系の両方を調製するための好適なパッケージングウイルス系統の例として、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２、およびΨＡｍが挙げられる。レトロウイルスは、様々な遺伝子を、上皮細胞を含む多くの異なる細胞型内にｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで導入するのに使用されてきた（例えば、Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115;米国特許第４，８６８，１１６号明細書;同第４，９８０，２８６号明細書; ＰＣＴ出願国際公開第８９／０７１３６号パンフレット;同第８９／０２４６８号パンフレット;同第８９／０５３４５号パンフレット;および同第９２／０７５７３号パンフレットを参照されたい）。
本方法において有用な別のウイルス遺伝子送達系では、アデノウイルス由来のベクターが利用される。アデノウイルスのゲノムは、目的とする遺伝子産物をコードおよび発現するが、しかし通常の溶菌ウイルスライフサイクルにおいて複製するその能力に関して不活性化されるように操作され得る。例えば、Berkner et al., (1988) BioTechniques 6:616 ; Rosenfeld et al., (1991) Science 252:431-434;およびRosenfeld et al., (1992) Cell 68:143-155を参照されたい。アデノウイルス菌株Ａｄ５型ｄｌ３２４またはその他のアデノウイルスの菌株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、またはＡｄ７等）に由来する好適なアデノウイルスベクターは、当業者にとって公知である。組換えアデノウイルスは、特定の状況においては、それが非分裂細胞に感染する能力を有さないという点で有利であり得るが、また上皮細胞を含む多種多様な細胞型に感染させるのに使用可能である（Rosenfeld et al., (1992)、前出）。さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、また精製および濃縮しやすく、上記したように感染スペクトルに影響を及ぼすように改変可能である。それに加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含まれる外来ＤＮＡ）は宿主細胞のゲノムに組み込まれず、しかしエピソームなまま存続し、これにより、挿入時の突然変異誘発の結果としてｉｎ ｓｉｔｕで生じ得る潜在的問題（導入されたＤＮＡ（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）が宿主ゲノムに組み込まれることとなった場合）が回避される。その上、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの収容容量は、その他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい（最大８キロベース）（Berkner et al., supra; Haj-Ahmand and Graham, (1986) J. Virol. 57:267）。
いくつかの実施形態では、ＲＧＮおよびガイドＲＮＡをコードする配列は、その表面上に正電荷を担持するリポソーム（例えば、リポフェクチン）内に捕捉され、それは、標的組織の細胞表面抗原に対する抗体でタグ化され得る（Mizuno et al., (1992) No Shinkei Geka 20:547-551；ＰＣＴ国際公開公報第９１／０６３０９号パンフレット；日本国特許出願第１０４７３８１号明細書；および欧州特許公開第ＥＰ－Ａ－４３０７５号明細書）。
ベクターは、プロモーター、エンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー）、その他のｃｉｓ調節エレメント、および／またはカプシド血清型バリアントも含むことができる。プロモーターに関して、ベクターは、多くの細胞型において（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）、ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ＣＢｈ、伸長因子α１（ＥＦα１）、ＥＦ－１α短鎖（ＥＦＳ）、もしくはＣＡＳＩ）、または特に視細胞において（例えば、ＲＨＯ、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、網膜色素変性（ＲＰ１）、ロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）、および錐体アレスチン（ＣＡＲ））、発現を駆動するプロモーターを含み得る（例えば、Gray et al., (2011) Hum Gene Ther. Sep;22(9):1143-53; Alexopoulou et al., (2008) BMC Cell Biol. ; 9: 2; Esumi et al., (2004) Journal Biological Chemistry; 279:19064-73; Guziewicz et al., (2013) PLoS One.;8:e75666; Allocca et al., (2007) J Virol; 81:11372-80を参照されたい; Domenger and Grimm, (2019) Human Molecular Genetics, 28(R1):R3-R14 (October)も参照されたい）。その他のｃｉｓ調節エレメントは、光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子（ＩＲＢＰ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）、またはマウスのマイニュートウイルス（ＭＶＭ）イントロンに由来するエンハンサーエレメントを含み得る（Domenger and Grimm, (2019) Human Molecular Genetics, 28(R1):R3-R14 (October)を参照されたい）。
遺伝子療法コンストラクトの医薬製剤は、許容される希釈剤において、遺伝子送達系（ウイルスベクター、および任意の関連する薬剤、例えばヘルパーウイルス、タンパク質、脂質等）から本質的に構成され得る、または遺伝子送達媒体が埋め込まれた徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達系、例えばレトロウイルスベクターが組換え細胞からそのまま生成可能である場合、医薬製剤は遺伝子送達系を生成する１つまたは複数の細胞を含み得る。
あるいは、方法は、ＲＧＮおよびガイドＲＮＡを共に、例えば複合体として送達することを含み得る。例えば、ＲＧＮおよびｇＲＮＡは、宿主細胞において過剰発現され、精製され、次にガイドＲＮＡと複合体形成して（例えば、試験管内で）、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成し、細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、ＲＧＮは、細菌発現プラスミドの使用を通じて細菌内で発現され、それから精製され得る。例えば、Ｈｉｓタグ化デアミナーゼ融合タンパク質は細菌細胞内で発現され、次にニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得る。ＲＮＰを使用すれば、ヌクレアーゼもしくはガイドをコードするプラスミドＤＮＡを送達する、またはヌクレアーゼをｍＲＮＡとしてコードする必要性が回避される。おそらくはＲＮＰの半減期はより短く、またヌクレアーゼおよびガイドの発現において遷延性は認められないので、ＲＮＰ送達は特異性も改善し得る（プラスミドからの持続的な発現とは対照をなす）。ＲＮＰは、例えば脂質媒介式のトランスフェクションまたはエレクトロポレーションを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に送達され得る。例えば、Liang et al. (2015) Journal of biotechnology 208: 44-53; Zuris, John A., et al. (2015) Nature biotechnology 33.1: 73-80; Kim et al. (2014) Genome research 24.6: 1012-1019を参照されたい。
処置方法
ＲＰ１遺伝子における優性突然変異と関連する網膜色素変性症（ＲＰ）を有する対象（例えば、哺乳動物対象、例えばヒトまたはヒト以外の獣医学的対象）を処置する方法が、本明細書に提示される。適する対象は、当業者、および遺伝子検査（例えば、対象のＲＰ１遺伝子内に突然変異が存在するか、その有無を特定するシークエンシング）により確定された診断によって特定され得る。ＲＰ１の参照配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいてＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ ＩＤ ＮＧ＿００９８４０．２（Ｒａｎｇｅ ５０３０～１９７６８）として見出され得る。
ＲＰ１遺伝子における優性突然変異と関連する網膜色素変性症（ＲＰ）を有する対象（例えば、哺乳動物対象、例えばヒトまたはヒト以外の獣医学的対象）を処置する方法が、本明細書に提示される。適する対象は、当業者、および遺伝子検査（例えば、対象のＲＰ１遺伝子内に突然変異が存在するか、その有無を特定するシークエンシング）により確定された診断によって特定され得る。ＲＰ１の参照配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいてＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ ＩＤ ＮＧ＿００９８４０．２（Ｒａｎｇｅ ５０３０～１９７６８）として見出され得る。
方法は、ＲＧＮおよびペアドガイドＲＮＡ（突然変異体ＲＰ１対立遺伝子の部分を調べ、またその発現を破綻させる）を有効量投与することを含む。臨床現場において、ベクターが、いくつかの方法（そのそれぞれは当技術分野においてなじみ深い）のいずれかにより対象中に導入され得る。その他の方法も使用可能であるものの、いくつかの実施形態では、網膜に遺伝子療法ベクターを送達するのに一般的に選ばれる経路は、網膜下注入経由である。これは、網膜のＲＰＥおよび視細胞へのアクセスを可能にする。動物試験において、異なる血清型のＡＡＶが、網膜下注入後に、これらの細胞集団を効率的に形質変換することが明らかにされている（Vandenberghe et al., (2013) PLoS One. 8:e53463. PMCID: 3559681; Vandenberghe and Auricchio, (2012) Gene Therapy. 19:162-8; Vandenberghe et al., (2011) Science translational medicine. 3:88ra54; Dinculescu et al., (2005) HumGene Ther. 16:649-63; Boye et al., (2013) Mol Ther. 21:509-19;およびAlexander and Hauswirth, (2008) Adv Exp Med Biol. 2008;613:121-8）。網膜下注入アプローチは、ＲＰＥ６５およびＣＨＭ遺伝子内の突然変異により引き起こされた網膜変性症に対する遺伝子増強療法の現在継続中の臨床トライアルにおいて使用されている（Maguire et al., (2008) New England Journal of Medicine. 358:2240-8; Bainbridge et al., (2008) New England Journal of Medicine. 358:2231-9; Cideciyan et al., (2008) Proceedings National Academy Sciences USA. 105:15112-7; Maguire et al., (2009) Lancet. 374:1597-605; Jacobson et al., (2012) Archives Ophthalmology. 130:9-24; Bennett et al., (2012) Science translational medicine. 4:120ra15;およびMacLaren et al., (2014) Lancet. 383:1129-37）。網膜下注入は、標準的な外科学的アプローチ（例えば、Maguire et al., 2008（前出）; Bainbridge et al., 2008（前出）; Cideciyan et al., 2008（前出）; MacLaren et al., 2014（前出）に記載されるような）を用いて実施可能である。国際公開第２０１９／１８３６４１号パンフレットも参照されたい。
網膜の任意の領域が標的とされ得るが、特定の事例では、網膜中心窩（眼の中心から外側におよそ１度の範囲で延在する）が、中心視力におけるその役割、および網膜の周辺領域と比較して比較的高濃度の錐体光受容体が存在することに起因して選好され得る。代替的または付加的に、注入は、３種類の網膜視細胞すべてが存在することにより特徴付けられる傍中心窩領域（中心からおよそ２～１０度ずれて延在する）に対して標的化され得る。それに加えて、傍中心窩領域中への注入は、網膜の正中線を横切るニードルパスを使用して比較的鋭角になされ得る。例えば、注入パスは、角膜輪部近傍の強膜の鼻側から、硝子体房（vitreal chamber）を経由して、側頭よりの傍中心窩網膜中まで、強膜の側頭側から鼻よりの傍中心窩網膜まで、角膜に対して上方に位置する強膜の部分から傍中心窩下方の位置まで、および／または強膜の下方部分から傍中心窩上方の位置まで延在し得る。網膜表面に対して比較的小さい角度での注入を使用することが、濾過胞から硝子体にベクターが流出する可能性を有利に低下させまたは制限し、したがって送達期間中のベクターのロスを低下させる可能性がある。その他のケースでは、黄斑（網膜中心窩を含む）が標的とされ得るが、またその他のケースでは、追加の網膜領域が標的とされ得る、または過剰量の投与を受け得る。
ＡＡＶベクターを含む組成物は、非限定的に注入、例えば網膜下注入を含む、任意の適する手段により対象に投与可能である。組成物内のＡＡＶベクターの濃度は、注入装置内のデッドボリュームおよび安全に投与され得る比較的限定された容積を考慮に入れつつ、とりわけ、十分な用量のＡＡＶが対象の網膜に投与されることが確実になるように選択される。適する用量として、例えば１×１０１１個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、２×１０１１個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、３ｘ１０１１個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、４×１０１１個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、５×１０１１個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、６×１０１１個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、７×１０１１個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、８×１０１１個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、９×１０１１個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、１×１０１２個のｖｇ／ｍＬ、２×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、３×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、４×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、５×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、６×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、７×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、８×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、９×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、ｌ×１０１３個のｖｇ／ｍＬ、２×１０１３個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、３×１０１３個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、４×１０１３個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、５×１０１３個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、６×１０１３個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、７×１０１３個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、８×１０１３個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、または９×１０１３個のウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬを挙げることができる。任意の適する容積の組成物が、網膜下腔または蝸牛腔に送達され得る。いくつかの事例では、容積は、例えば１マイクロリッター、１０マイクロリッター、５０マイクロリッター、１００マイクロリッター、１５０マイクロリッター、２００マイクロリッター、２５０マイクロリッター、３００マイクロリッター等、濾過胞が網膜下腔内に形成されるように選択される。
さらに、本明細書に記載されるように、ＲＧＮおよびガイドＲＮＡをコードする配列を含むウイルスが、本明細書に提示される（例えば、１つまたは複数のウイルスは、ＲＧＮおよびペアドｇＲＮＡの１、２、または３つすべての配列を含み、例えば、１つのウイルスが、１、２（例えば、２つのｇＲＮＡ）、または３つすべてをコードする配列を含むが、ならびに組成物はそのようなウイルスの１つまたは複数を含む（例えば、組成物は、２つのｇＲＮＡをコードする配列を含む１つのウイルス、およびＲＧＮをコードする配列を含む別のウイルスを含む；組成物は、２つのｇＲＮＡおよびＲＧＮをコードする配列を含む１つのウイルスを含む；または組成物は、第１のｇＲＮＡをコードする配列を含む１つのウイルス、第２のｇＲＮＡをコードする配列を含む第２のウイルス、およびＲＧＮをコードする配列を含む第３のウイルスを含む））。ＲＧＮおよびｇＲＮＡを含むＲＮＰ、ならびにＲＧＮおよびｇＲＮＡのそれぞれを含むＲＮＰを含む組成物も提示される。
本発明は下記の実施例においてさらに記載されるが、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
ＲＰ１突然変異に対するＳＮＰに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集系
３つの最も一般的なＲＰ１ハプロタイプ（タンパク質コーディング領域の１０００ゲノムフェーズ１バリアントから同定されたＨ１、Ｈ２、およびＨ３）は、４２．５％、２７％、および２３．５％の頻度でそれぞれ生ずる（表３）。Ｈ１は参照配列である。Ｈ２上のコモンＳＮＰとして、ｒｓ７０２７６１におけるＧ、ｒｓ１４５２９０におけるＧ、ｒｓ４３６５２７におけるＡ、ｒｓ４２８８５４におけるＡ、ｒｓ４２４４９９におけるＣ、ｒｓ４２９６６８におけるＣ、ｒｓ４４４７７２におけるＡ、ｒｓ４４６２２７におけるＡ、ｒｓ４１４３５２におけるＣ、およびｒｓ４４１８００におけるＧが挙げられる。Ｈ３上のコモンＳＮＰとして、ｒｓ６２５１４６１６のＡ、ｒｓ２２９３８６９のＴ、およびｒｓ６１７３９５６７のＡが挙げられる。これらの３つの一般的なハプロタイプの複合頻度は９３％であり、また３つの一般的なハプロタイプの総ホモ接合頻度は３５％である。これから、一般母集団のおよそ２／３がＲＰ１ハプロタイプについてヘテロ接合性であることが示唆され、ＳＮＰに基づくＣＲＩＳＲＰ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術による特異的な標的となり得る。
３つの最も一般的なＲＰ１ハプロタイプ（タンパク質コーディング領域の１０００ゲノムフェーズ１バリアントから同定されたＨ１、Ｈ２、およびＨ３）は、４２．５％、２７％、および２３．５％の頻度でそれぞれ生ずる（表３）。Ｈ１は参照配列である。Ｈ２上のコモンＳＮＰとして、ｒｓ７０２７６１におけるＧ、ｒｓ１４５２９０におけるＧ、ｒｓ４３６５２７におけるＡ、ｒｓ４２８８５４におけるＡ、ｒｓ４２４４９９におけるＣ、ｒｓ４２９６６８におけるＣ、ｒｓ４４４７７２におけるＡ、ｒｓ４４６２２７におけるＡ、ｒｓ４１４３５２におけるＣ、およびｒｓ４４１８００におけるＧが挙げられる。Ｈ３上のコモンＳＮＰとして、ｒｓ６２５１４６１６のＡ、ｒｓ２２９３８６９のＴ、およびｒｓ６１７３９５６７のＡが挙げられる。これらの３つの一般的なハプロタイプの複合頻度は９３％であり、また３つの一般的なハプロタイプの総ホモ接合頻度は３５％である。これから、一般母集団のおよそ２／３がＲＰ１ハプロタイプについてヘテロ接合性であることが示唆され、ＳＮＰに基づくＣＲＩＳＲＰ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術による特異的な標的となり得る。
Ｈ２上の４つのコモンＳＮＰ（ｒｓ４４４７７２、ｒｓ４４６２２７、ｒｓ４１４３５２、およびｒｓ４４１８００）に関する対立遺伝子頻度は、１０００ゲノムプロジェクトに基づけば、欧米人において０．２５～０．２７である（表４）。Ｈ３における２つのＳＮＰ（ｒｓ２２９３８６９およびｒｓ６１７３９５６７）の対立遺伝子頻度は、欧米人において０．４４である。Ｈ２およびＨ３のノンコーディング領域におけるコモンＳＮＰを明らかにするために、ＨａｐｌｏＲｅｇ ｖ４．１を使用して連鎖不均衡（ＬＤ）分析を実施した。イントロン１内の３つのＳＮＰ（ｒｓ７０２７６１、ｒｓ１４５２９０、およびｒｓ４３６５２７）、およびイントロン３内の３つのＳＮＰ（ｒｓ４２８８５４、ｒｓ４２４４９９、およびｒｓ４２９６６８）が、Ｈ２上の４つのコモンＳＮＰと極めて緊密な関連性（Ｄ’＝０．９９または１）を有することが判明した（表４）。制御領域内のいくつかのＳＮＰもまた、Ｈ２と緊密に関連している。１つのＳＮＰ（ｒｓ６２５１４６１６）が、Ｈ３上の２つのコモンＳＮＰと緊密に関連している。これらのＳＮＰは、いずれも以下に記載する本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集アプローチに対する潜在的サロゲートである。
ＭＥＥＩのＩＲＤ Ｂｉｏｂａｎｋから、ＲＰ１遺伝子内に優性突然変異を有する３８家系の罹患した個人５０例を集めた。最も一般的な突然変異Ｒ６７７Ｘを、１３家系の患者１５例において検出した。所定のＲＰ１ハプロタイプのＳＮＰを有する突然変異のフェーズを決定するために、ＲＰ１患者２０例から入手可能な、ＮＧＳに基づくＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｙｅ Ｄｉｓｅａｓｅ（ＧＥＤｉ）テスト結果を使用して、ＲＰ１のディプロイド遺伝子型を最初に分析した。表５に示すように、患者２０例のうち１４例が、ＲＰ１遺伝子座においてヘテロ接合性であり、および６例が、３つの一般的なハプロタイプの１つについてホモ接合性である。本発明者らがＲＰ１の３８家系において見出した１９個の固有の優性突然変異は、いずれもエクソン４の開始部分の小さな領域においてクラスター化している（c.1199, p.Q400 - c.2287, p.N763）。ペアドエンド２×１５０ｂｐ ＮＧＳ読み取りを検査し、サンプル００４－２３５内の４ｂｐ欠損突然変異（ｃ．２２８０＿２２８４ｄｅｌ）は、Ｈａｐ２上のｒｓ４４４７７２とｉｎ ｔｒａｎｓであること（突然変異はＨａｐ３対立遺伝子と同じ対立遺伝子上にあることを示す）を同定した。したがって、Ｈａｐ３上のＳＮＰを標的とするように設計されたｓｇＲＮＡは、サンプル００４－２３５内の突然変異対立遺伝子を阻害することができる。しかしながら、ＧＥＤｉテストにおける短いＮＧＳ読み取りでは、距離に起因して、ｒｓ４４４７７２を有するその他の突然変異のフェーズを決定することができなかった。
ＲＰ１ハプロタイプ上ＳＮＰを標的とするためのＣａｓ９－ｓｇＲＮＡの設計
ＳＮＰ毎に、野生型ＳｐＣａｓ９（ＮＧＧ）、ＳｐＣａｓ９の操作されたＶＲＱＲバリアント（ＮＧＡＮ）、野生型黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９－ＷＴ、ＮＮＧＲＲＴ）、およびＳａＣａｓ９の操作されたＫＫＨバリアント（ＮＮＮＲＲＴ）について、利用可能なＰＡＭモチーフを調査した。１～７個のｓｇＲＮＡを、ＰＡＭの近傍１３ｂｐ以内の、または参照ハプロタイプ上のＰＡＭ（太字）に該当する各ＳＮＰ部位を標的とするように設計した（表６）。Ｈ２およびＨ３に対して標的化されたガイドの場合、参照ヌクレオチド（太字で示す）をＳＮＰヌクレオチドに切替えた。イントロン３内の野生型ゲノムを標的とする４つのｇＲＮＡも設計した。
ＳＮＰ毎に、野生型ＳｐＣａｓ９（ＮＧＧ）、ＳｐＣａｓ９の操作されたＶＲＱＲバリアント（ＮＧＡＮ）、野生型黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９－ＷＴ、ＮＮＧＲＲＴ）、およびＳａＣａｓ９の操作されたＫＫＨバリアント（ＮＮＮＲＲＴ）について、利用可能なＰＡＭモチーフを調査した。１～７個のｓｇＲＮＡを、ＰＡＭの近傍１３ｂｐ以内の、または参照ハプロタイプ上のＰＡＭ（太字）に該当する各ＳＮＰ部位を標的とするように設計した（表６）。Ｈ２およびＨ３に対して標的化されたガイドの場合、参照ヌクレオチド（太字で示す）をＳＮＰヌクレオチドに切替えた。イントロン３内の野生型ゲノムを標的とする４つのｇＲＮＡも設計した。
Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現コンストラクトのクローニング
すべてのＣａｓ９発現プラスミドを、ｐＳＱＴ８１７ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５３３７３）から改変されたＣＡＧ－Ｃａｓ９－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＰバックボーン中に構築した。ＥＧＦＰおよびＣａｓ９を、１つのタンパク質として同時発現させた後、自己開裂型Ｔ２Ａペプチドにより分離した；ＥＧＦＰは、被標的細胞に対するマーカー、および下流ＦＡＣＳソーティングのためのマーカーとしての役目を果した。野生型およびバリアントＳｐＣａｓ９に対するｓｇＲＮＡを発現ベクターＢＰＫ１５２０（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６５７７７）中にクローン化し、野生型およびバリアントＳａＣａｓ９に対するｓｇＲＮＡをＢＰＫ２６６０ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃７０７０９）中にクローン化した。
すべてのＣａｓ９発現プラスミドを、ｐＳＱＴ８１７ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５３３７３）から改変されたＣＡＧ－Ｃａｓ９－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＰバックボーン中に構築した。ＥＧＦＰおよびＣａｓ９を、１つのタンパク質として同時発現させた後、自己開裂型Ｔ２Ａペプチドにより分離した；ＥＧＦＰは、被標的細胞に対するマーカー、および下流ＦＡＣＳソーティングのためのマーカーとしての役目を果した。野生型およびバリアントＳｐＣａｓ９に対するｓｇＲＮＡを発現ベクターＢＰＫ１５２０（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６５７７７）中にクローン化し、野生型およびバリアントＳａＣａｓ９に対するｓｇＲＮＡをＢＰＫ２６６０ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃７０７０９）中にクローン化した。
ヒト細胞系の特徴付け
ホモ接合性およびヘテロ接合性のＲＰ１ハプロタイプとして機能するいくつかのヒト細胞系を入手し、遺伝子型を解析して、本発明のｓｇＲＮＡについて対立遺伝子標的特異性および有効性を評価した。これには、ＨＥＫ２９３Ｔ（Ｈ２／Ｈ３）、ＡＲＰＥ－１９（Ｈ１／Ｈ２）、ｈＴＥＲＴ ＲＰＥ－１（Ｈ３／Ｈ３）、Ｍｉｎ３８９３１線維芽細胞（ＲＰ１患者由来のＨ２／Ｈ２）、ＨＬ－６０（Ｈ１／Ｈ１）、ＨＴ－１０８０（Ｈ１／Ｈ２）、Ｃ３Ａ（Ｈ２／Ｈ３）、Ｙ７９（Ｈ１／Ｈ３）Ｗｅｒｉ－Ｒｂ１（Ｈ１／Ｈ２）、およびハプロイドヒト細胞系ＨＡＰ１（Ｈ１）が含まれる。
ホモ接合性およびヘテロ接合性のＲＰ１ハプロタイプとして機能するいくつかのヒト細胞系を入手し、遺伝子型を解析して、本発明のｓｇＲＮＡについて対立遺伝子標的特異性および有効性を評価した。これには、ＨＥＫ２９３Ｔ（Ｈ２／Ｈ３）、ＡＲＰＥ－１９（Ｈ１／Ｈ２）、ｈＴＥＲＴ ＲＰＥ－１（Ｈ３／Ｈ３）、Ｍｉｎ３８９３１線維芽細胞（ＲＰ１患者由来のＨ２／Ｈ２）、ＨＬ－６０（Ｈ１／Ｈ１）、ＨＴ－１０８０（Ｈ１／Ｈ２）、Ｃ３Ａ（Ｈ２／Ｈ３）、Ｙ７９（Ｈ１／Ｈ３）Ｗｅｒｉ－Ｒｂ１（Ｈ１／Ｈ２）、およびハプロイドヒト細胞系ＨＡＰ１（Ｈ１）が含まれる。
トランスフェクション効率、およびヘテロ接合性Ｈ２／Ｈ３ハプロタイプについて初期のスクリーニングステップを行うために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、すべてのｓｇＲＮＡがこれらの細胞においてテスト可能なように選択した（Ｈ３の位置において、Ｈ２ ＳＮＰはＨ１と同じであり、またその逆も真である。したがって、参照ハプロタイプＨ１は、１３個の標的となり得る部位を有し、Ｈ２は１０部位を有し、またＨ３は３部位を有する）。
各ｇＲＮＡの効率および特異性を評価するために、ＣＡＧ－Ｃａｓ９－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＰ、およびｓｇＲＮＡプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に、リポフェクタミン３０００を介して同時トランスフェクトした。Ｃａｓ９－ＥＧＦＰプラスミド単独のトランスフェクションを陰性対照として含めた。トランスフェクション後の２日目に細胞を収集し、ＦＡＣＳソーティングがそれに後続した。ゲノムＤＮＡをソート後のＥＧＦＰ陽性細胞から単離し、ＰＣＲ増幅し、ＮＧＳディープシークエンシングがそれに後続した。
標的命中率の測定
ＮＧＳディープシークエンシングを、ゲノム内の特異的ＤＳＢ－ＮＨＥＪイベントを定量的に分析し、また切断特異性を予測するのに利用した。要するに、標的対象部位にまたがるショートＰＣＲ産物を増幅および精製し、デュアルインデックス化ＴｒｕＳｅｑ ２５０ ｂｐペアドエンドシークエンシングをＭＧＨ ＣＣＩＢによりＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンサー上で実施した。ペアドエンド読み取りをヒトゲノム参照配列に照らしマップ化し、３０超の平均クオリティースコアを有する読み取りを意図した標的ヌクレアーゼ結合部位とオーバーラップするインデルについて分析した。インデル分析を、ＭＧＨ ＣＣＩＢにおいて自社製のアルゴリズムを使用して実施した。
ＮＧＳディープシークエンシングを、ゲノム内の特異的ＤＳＢ－ＮＨＥＪイベントを定量的に分析し、また切断特異性を予測するのに利用した。要するに、標的対象部位にまたがるショートＰＣＲ産物を増幅および精製し、デュアルインデックス化ＴｒｕＳｅｑ ２５０ ｂｐペアドエンドシークエンシングをＭＧＨ ＣＣＩＢによりＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンサー上で実施した。ペアドエンド読み取りをヒトゲノム参照配列に照らしマップ化し、３０超の平均クオリティースコアを有する読み取りを意図した標的ヌクレアーゼ結合部位とオーバーラップするインデルについて分析した。インデル分析を、ＭＧＨ ＣＣＩＢにおいて自社製のアルゴリズムを使用して実施した。
３つのハプロタイプすべてに対するＳｐＣａｓ９野生型およびバリアントガイドを、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＡＲＰＥ１９、ｈＴｅｒｔ－ＲＰＥ１、Ｕ２ＯＳ、ＨＡＰ１、およびＷｅｒｉ－Ｒｂ１細胞系においてテストし、対立遺伝子毎に編集済みおよび未編集の読み取りについて分析した。編集効率を、（編集後の対立遺伝子）／（１対立遺伝子当たりの総読み取り）からなる比として計算し、下記の表７ならびに図２Ａおよび図２Ｂに示す。
Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡによるＲＰ１対立遺伝子の特異的ノックアウト
最も高い標的効率および特異性を有するｓｇＲＮＡを選択し、ヘテロ接合またはハプロイド細胞系において、ペアドｓｇＲＮＡ指向性編集を介してＲＰ１対立遺伝子を標的とし、ノックアウトするその能力を評価した。Ｈ１に対するペアドガイド欠損戦略を最初にテストした。イントロン領域に対して標的化された単一のｇＲＮＡによる編集はＮＨＥＪにより修復され、ＲＰ１発現に影響を及ぼさず（図４、シングルガイド１４Ｎ２のみ）、したがって任意の対立遺伝子内に存在するイントロン３の複数の領域を標的とするきわめて効率的なガイドを、イントロン１またはエクソン４内に存在するＨ１ ＳＮＰを標的とする対立遺伝子特異的ｓｇＲＮＡとペア化した。二対立遺伝子標的ガイドは野生型および突然変異対立遺伝子の両方を編集するが、しかしイントロン１またはエクソン４内の対立遺伝子特異的ガイドとペア化したときには、突然変異対立遺伝子のみからゲノム部分を大きく削除することに留意されたい。より大きな欠損も、イントロン１およびエクソン４対立遺伝子特異的ガイドのペア化を介してやはり可能である（表８および表９）。
最も高い標的効率および特異性を有するｓｇＲＮＡを選択し、ヘテロ接合またはハプロイド細胞系において、ペアドｓｇＲＮＡ指向性編集を介してＲＰ１対立遺伝子を標的とし、ノックアウトするその能力を評価した。Ｈ１に対するペアドガイド欠損戦略を最初にテストした。イントロン領域に対して標的化された単一のｇＲＮＡによる編集はＮＨＥＪにより修復され、ＲＰ１発現に影響を及ぼさず（図４、シングルガイド１４Ｎ２のみ）、したがって任意の対立遺伝子内に存在するイントロン３の複数の領域を標的とするきわめて効率的なガイドを、イントロン１またはエクソン４内に存在するＨ１ ＳＮＰを標的とする対立遺伝子特異的ｓｇＲＮＡとペア化した。二対立遺伝子標的ガイドは野生型および突然変異対立遺伝子の両方を編集するが、しかしイントロン１またはエクソン４内の対立遺伝子特異的ガイドとペア化したときには、突然変異対立遺伝子のみからゲノム部分を大きく削除することに留意されたい。より大きな欠損も、イントロン１およびエクソン４対立遺伝子特異的ガイドのペア化を介してやはり可能である（表８および表９）。
ゲノム編集の定量化－ｑＰＣＲ戦略
ゲノムレベルで編集効率およびＲＰ１対立遺伝子欠損効率を定量化するためのｑＰＣＲ戦略を開発した。ｑＰＣＲプライマーを、予測された欠損内の領域を増幅するために設計した。「内部」アンプリコンを残存する「未削除」対立遺伝子からのみ生成させ、別の染色体上の参照遺伝子に対して標準化した後、残存する「未削除」対立遺伝子を未編集細胞と比較して定量化した（図３）。テストしたｓｇＲＮＡについてすべての組合せが、編集細胞において、ＲＰ１対立遺伝子含有量を減少させることが可能であった（１４Ｎ２＋１２Ａ２のｇＲＮＡペアについて最大５８％）。しかしながら、この定量化戦略はすべての編集イベントを捕捉するわけではない。例えば、デュアルＤＳＢ後に反転化すると、「内部」アンプリコンが編集により損傷を受けなかった場合には、その増幅はなおも可能となり得る。ＲＰ１発現低下の定量化が、以下に記載するように、対立遺伝子破綻のより正確な指標である。
ゲノムレベルで編集効率およびＲＰ１対立遺伝子欠損効率を定量化するためのｑＰＣＲ戦略を開発した。ｑＰＣＲプライマーを、予測された欠損内の領域を増幅するために設計した。「内部」アンプリコンを残存する「未削除」対立遺伝子からのみ生成させ、別の染色体上の参照遺伝子に対して標準化した後、残存する「未削除」対立遺伝子を未編集細胞と比較して定量化した（図３）。テストしたｓｇＲＮＡについてすべての組合せが、編集細胞において、ＲＰ１対立遺伝子含有量を減少させることが可能であった（１４Ｎ２＋１２Ａ２のｇＲＮＡペアについて最大５８％）。しかしながら、この定量化戦略はすべての編集イベントを捕捉するわけではない。例えば、デュアルＤＳＢ後に反転化すると、「内部」アンプリコンが編集により損傷を受けなかった場合には、その増幅はなおも可能となり得る。ＲＰ１発現低下の定量化が、以下に記載するように、対立遺伝子破綻のより正確な指標である。
デュアルｓｇＲＮＡによる編集後のＲＰ１発現の定量化
デュアルｓｇＲＮＡを、ＲＰ１発現細胞系Ｗｅｒｉ－Ｒｂ１中にトランスフェクトした。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＧＦＰ＋細胞分画から抽出し、ｃＤＮＡライブラリーをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘを用いてｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）用としてサンプル毎に生成した。ＲＰ１に対するｃＤＮＡ特異的プライマーおよび参照遺伝子ＧＡＰＤＨの配列をＯｒｉＧｅｎｅ社から取得し、ＲＰ１発現を編集サンプル内で非トランスフェクトコントロール細胞と比較して定量化した（図４）。４３％のＲＰ１発現低下が、１４Ｎ１＋７Ｇ１ ｇＲＮＡで編集した細胞に認められた。ユニバーサルイントロン３標的ガイド１４Ｎ２を個別にテストしたとき、ＲＰ１発現変化は観察されなかった。
デュアルｓｇＲＮＡを、ＲＰ１発現細胞系Ｗｅｒｉ－Ｒｂ１中にトランスフェクトした。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＧＦＰ＋細胞分画から抽出し、ｃＤＮＡライブラリーをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘを用いてｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）用としてサンプル毎に生成した。ＲＰ１に対するｃＤＮＡ特異的プライマーおよび参照遺伝子ＧＡＰＤＨの配列をＯｒｉＧｅｎｅ社から取得し、ＲＰ１発現を編集サンプル内で非トランスフェクトコントロール細胞と比較して定量化した（図４）。４３％のＲＰ１発現低下が、１４Ｎ１＋７Ｇ１ ｇＲＮＡで編集した細胞に認められた。ユニバーサルイントロン３標的ガイド１４Ｎ２を個別にテストしたとき、ＲＰ１発現変化は観察されなかった。
ＲＰ１発現細胞系の生成
ＲＰ１は特殊な有糸分裂後光受容体において特異的に発現しているので、ＲＰ１発現に対する本発明の編集戦略の効果をテストするための市販細胞系がいくつか存在する。網膜芽細胞腫細胞系Ｗｅｒｉ－Ｒｂ１は、低レベルのＲＰ１を発現するが、しかしトランスフェクトするには困難である。したがって、ＲＰ１転写開始部位（ＴＳＳ）の上流にプロモーターを挿入することにより、ＲＰ１の外因性発現を用いて細胞系を生み出した。１００ｂｐホモロジーアーム、およびＥＦ１ａプロモーターと後続するネオマイシン耐性遺伝子、およびＰ２Ａペプチド切断モチーフをコードするプラスミドを、ＲＰ１標的ｓｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９を発現するプラスミドと共に、野生型Ｈａｐ１細胞に同時トランスフェクトした。５０μｇ／ｍＬでＧ４１８選択してから３週間後に、１５個の個別コロニーを取り出し、半定量ＲＴ－ＰＣＲによりプロモーターカセットの標的ゲノム統合およびＲＰ１発現について分析した。次に、クローン５を単一の細胞から安定な細胞系を生み出すために選択し、１２個のクローンをｑＲＴ－ＰＣＲにより相対的ＲＰ１発現量についてテストした（図５Ａ）。３つの細胞系を、次にＲＰ１発現量について、内因的発現細胞系Ｗｅｒｉ－Ｒｂ１と比較して定量した（図５Ｂ）。クローン５－１が、Ｗｅｒｉ－Ｒｂ１と比較して４倍のＲＰ１発現量増加を示したが、またそれはｓｇＲＮＡペアの編集効率、およびＲＰ１発現に対するその効果を評価するのに使用される。
ＲＰ１は特殊な有糸分裂後光受容体において特異的に発現しているので、ＲＰ１発現に対する本発明の編集戦略の効果をテストするための市販細胞系がいくつか存在する。網膜芽細胞腫細胞系Ｗｅｒｉ－Ｒｂ１は、低レベルのＲＰ１を発現するが、しかしトランスフェクトするには困難である。したがって、ＲＰ１転写開始部位（ＴＳＳ）の上流にプロモーターを挿入することにより、ＲＰ１の外因性発現を用いて細胞系を生み出した。１００ｂｐホモロジーアーム、およびＥＦ１ａプロモーターと後続するネオマイシン耐性遺伝子、およびＰ２Ａペプチド切断モチーフをコードするプラスミドを、ＲＰ１標的ｓｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９を発現するプラスミドと共に、野生型Ｈａｐ１細胞に同時トランスフェクトした。５０μｇ／ｍＬでＧ４１８選択してから３週間後に、１５個の個別コロニーを取り出し、半定量ＲＴ－ＰＣＲによりプロモーターカセットの標的ゲノム統合およびＲＰ１発現について分析した。次に、クローン５を単一の細胞から安定な細胞系を生み出すために選択し、１２個のクローンをｑＲＴ－ＰＣＲにより相対的ＲＰ１発現量についてテストした（図５Ａ）。３つの細胞系を、次にＲＰ１発現量について、内因的発現細胞系Ｗｅｒｉ－Ｒｂ１と比較して定量した（図５Ｂ）。クローン５－１が、Ｗｅｒｉ－Ｒｂ１と比較して４倍のＲＰ１発現量増加を示したが、またそれはｓｇＲＮＡペアの編集効率、およびＲＰ１発現に対するその効果を評価するのに使用される。
ｉＰＳＣも、ＭＥＥＩにおいて、ＩＲＤバイオバンク内の発端者から選択された、優性突然変異を有するＲＰ１患者２例（ＯＧＩ１５５７－００２７７１、およびＯＧＩ１７８１－００３１０９）から取得した線維芽細胞から生成した。患者ＯＧＩ１５５７－００２７７１は、Ｈ１／Ｈ３ハプロタイプについてヘテロ接合性であり、またＨ３のＳＮＰとｃｉｓでｃ．２１０３ｄｅｌＡＡＴＡ突然変異を担持する。患者ＯＧＩ１７８１－００３１０９は、Ｈ２／Ｈ３についてヘテロ接合性であり、またＨ２のＳＮＰとｃｉｓで突然変異ｃ．２０２９Ｃ＞Ｔを担持する。細胞には、Ｈａｒｖａｒｄ ｉＰＳＣ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて、非組み込み型センダイウイルス法によるリプログラミングが施された。このｉＰＳ細胞および分化後の網膜オルガノイドは、リードＣａｓ９／デュアルｓｇＲＮＡペアを、その有効性および安全性について評価するのに使用される。
その他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、上記説明は、本発明を例証するように意図されており、またその範囲（添付の特許請求の範囲により定義される）を限定しないものと理解される。その他の態様、利点、および改変は、下記の特許請求の範囲内にある。
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、上記説明は、本発明を例証するように意図されており、またその範囲（添付の特許請求の範囲により定義される）を限定しないものと理解される。その他の態様、利点、および改変は、下記の特許請求の範囲内にある。
Claims (28)
- Ｃａｓ９タンパク質、ならびに第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および第２のｇＲＮＡをコードする配列を含む核酸であって、第１および／または第２のｇＲＮＡが、対象のＲＰ１遺伝子の突然変異した対立遺伝子内に一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列に対して標的化されており、前記突然変異した対立遺伝子が、常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）と関連する、核酸。
- 第１のｇＲＮＡが、イントロン１または３内の標的配列を含み、および／または第２のｇＲＮＡが、イントロン３またはエクソン４内の標的配列を含み、好ましくはｇＲＮＡの一方または両方が、表６に示す配列を含む、請求項１に記載の核酸。
- Ｃａｓ９タンパク質、およびイントロン１もしくは３、またはエクソン４内に一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列に対して標的化されている少なくとも第１のｇＲＮＡをコードする配列を含み、任意選択的に第２のｇＲＮＡをコードする配列を含む核酸であって、任意選択的に、第１および第２のｇＲＮＡが、イントロン１もしくは３、および／またはイントロン３もしくはエクソン４内の配列に対して標的化されており、第２のｇＲＮＡが、ヒト対象のＲＰ１遺伝子のＳＮＰを含む二対立遺伝子配列または配列に対して標的化されている、
核酸。 - 前記ｇＲＮＡが、表６に示す標的配列を含む、請求項３に記載の核酸。
- 黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｃａｓ９、またはＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｃａｓ９をコードする、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記Ｃａｓ９が、核局在化シグナル、任意選択的にＣ末端核局在化シグナルおよび／またはＮ末端核局在化シグナルを含み、ならびに／あるいはＣａｓ９をコードする配列が、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項５に記載の核酸。
- 前記Ｃａｓ９タンパク質が、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｃａｓ９であり、および前記ｇＲＮＡが、配列番号１もしくは配列番号２を含む単分子黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｇＲＮＡ、または対応する２パートモジュラー黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｇＲＮＡであり、ｃｒＲＮＡコンポーネントが、配列番号３または配列番号４を含み、およびｔｒａｃｒＲＮＡコンポーネントが、配列番号５または配列番号６を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｃａｓ９であり、および前記ｇＲＮＡが、配列番号７から１６に定める配列の任意の１つを含むＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）ｇＲＮＡである、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸。
- ウイルス送達ベクターを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記ウイルス送達ベクターが、Ｃａｓ９用のプロモーター、好ましくはＣＭＶ、ＥＦＳ、またはｈＧＲＫｌプロモーターを含む、請求項９に記載の核酸。
- 前記ウイルス送達ベクターが、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、請求項９に記載の核酸。
- （ｉ）ヒトＲＰ１遺伝子のイントロン１または３内のドメインを標的とする配列を含む第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびヒトＲＰ１遺伝子のイントロン３またはエクソン４内のドメインを標的とする配列を含む第２のｇＲＮＡ、または少なくとも表６に列挙されている群から選択される配列を含むシングルガイドＲＮＡ、
（ｉｉ）第１および第２の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、
（ｉｉｉ）第１および第２のｇＲＮＡの発現を駆動するプロモーター、好ましくはＵ６プロモーター、ならびに
（ｉｖ）好ましくはＣＭＶ、ＥＦＳ、またはｈＧＲＫｌプロモーターからなる群から選択される、前記Ｃａｓ９の発現を駆動するプロモーター
を含む、請求項９から１１に記載の核酸。 - 治療で使用するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸。
- 医薬の調製で使用するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸。
- ＲＰ１における突然変異と関連する状態を有する対象を処置する方法で使用するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記状態が、常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）である、請求項１５に記載の使用のための核酸。
- 前記ＡＡＶベクターが、注入により、例えば網膜下注入等により対象の網膜に送達される、請求項１４または１５に記載の使用のための核酸。
- 細胞のゲノムを変化させる方法であって、ＣＲＩＳＰＲ編集を使用して、ヒトＲＰ１遺伝子のイントロン１または３内に第１の二本鎖切断、およびヒトＲＰ１遺伝子のイントロン３または４内に第２の二本鎖を形成することを含む方法。
- 前記細胞が、哺乳動物の眼の細胞である、請求項１８に記載の方法。
- 第１および第２の二本鎖切断が、表６から選択される配列を含むｇＲＮＡのペアを使用して生成される、請求項１８に記載の方法。
- 第１および第２の二本鎖切断が、第８染色体上ＲＰ１遺伝子の突然変異対立遺伝子の、（ａ）エクソン２およびエクソン３のすべて、（ｂ）エクソン４の一部分、または（ｃ）エクソン２およびエクソン３のすべて、ならびにエクソン４の一部分の除去を、当該対立遺伝子からのＲＰ１タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こすように、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される、請求項１８から２０に記載の方法。
- 第１および／または第２のｇＲＮＡが、Ｃａｓ９分子と複合体形成するように構成されている、請求項１８から２０に記載の方法。
- 前記細胞が、常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）に罹患した対象に由来する、請求項１８から２０に記載の方法。
- 前記細胞が、網膜細胞または視細胞である、請求項１８から２０に記載の方法。
- 前記視細胞が、錐体視細胞もしくは錐体細胞、桿状視細胞もしくは桿状細胞、または黄斑性錐体視細胞である、請求項２４に記載の方法。
- 細胞を変化させる方法であって、
ヒトＲＰ１遺伝子のイントロン１または３内のドメインを標的とする配列、好ましくは表６に示すような配列を含む第１のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、
ヒトＲＰ１遺伝子のイントロン３またはエクソン４内のドメインを標的とする配列、好ましくは表６に示すような配列を含む第２のｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、および
Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列
を含む組換えウイルス粒子と、前記細胞を接触させることを含み、
前記ウイルス粒子が、非分裂細胞への送達能力を有し、
前記接触させることが、第８染色体上ＲＰ１遺伝子の突然変異対立遺伝子の、（ａ）エクソン２およびエクソン３のすべて、（ｂ）エクソン４の一部分、または（ｃ）エクソン２およびエクソン３のすべて、ならびにエクソン４の一部分の除去を、当該対立遺伝子からのＲＰ１タンパク質の発現を破綻させるのに十分なほどに引き起こす、方法。 - 前記ウイルス粒子が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ウイルス粒子である、請求項２６に記載の方法。
- 第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡが、表６に示されている、請求項１から１７のいずれか一項に記載の核酸、または請求項１８から２７に記載の方法。
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