JP2023518375A - 治療方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、FosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはERK1/2リン酸化阻害剤の有効量を投与することを含む、血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖の低減方法、ならびにFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはERK1/2リン酸化阻害剤を含む医薬組成物およびキットを提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖を低減させるための、方法、化合物および医薬組成物、ならびにFosB/ΔFosB発現および／またはERK1/2リン酸化および／またはVCAM-1発現を阻害する方法にも関する。
背景
血管透過性および血管新生は、糖尿病性網膜症(DR)および新生血管(湿性/滲出性)－加齢黄斑変性(nAMD)の両方において、炎症、創傷治癒、腫瘍増殖、黄斑浮腫を確証する重要な特徴である。DRは、20歳から74歳までの患者の視力喪失の世界的な主要原因となっている。AMDは、世界的な有病率1億7000万人を有し、米国では約1100万人がAMDに罹患している。網膜血管の漏出は通常ホメオスタシスを維持する血液網膜関門(BRB)が破壊されることにより起こる。これは、内皮機能障害、血管新生および炎症のプロセスによって促進され、網膜毛細血管の間質空間への漏出および浸透圧の上昇を通じて浮腫を起こす。血管透過性因子としては、血管内皮増殖因子 (VEGF)、腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、ヒスタミン、血小板活性化因子、セロトニンおよびインターロイキン-1β (IL-1β)などが挙げられる。
抗VEGF療法は、DRの治療に臨床上広く使用されている。しかしながら、硝子体内注射を繰り返すことが必要であり、多くの患者は最適に反応しないか、改善された反応が持続しない。VEGFだけでなくnAMD/DRの病態に関与する他の重要なメディエーターを標的とする薬剤は、対処されていない臨床のニーズのこの領域で特に医薬的なアピールを有するだろう。
血管透過性は、炎症促進性のサイトカインを介するプロセスである、関節リウマチ (RA)の病態に対して重要でもある。RAは、米国だけでも約１３００万人に 影響を与えている。
過去10年にわたり、抗TNF製剤や可溶性TNF受容体などの生物学的製剤を用いたRAの管理にはかなりの改善があった。しかし、かなりの割合の患者は、現在の治療上のオプションでは臨床的寛解に到達せず、進行性の関節破壊や機能障害のリスクにさらされている。
世界的な高齢人口、RAおよびnAMD/DRの両方に対する重要な対処されていない臨床のニーズおよびこれらの慢性疾患の影響力に代表される世界的な経済的負担を考えると、代替治療のアプローチが必要である。
要約
アクチベータータンパク質－１(AP-1またはAP1)は、様々な病的刺激に応答して遺伝子発現を調節することに関与するヘテロ二量体転写因子である。AP-1依存性遺伝子発現を阻害することができる化合物が、血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態を治療または予防する際に有用であるかもしれないと発明者は推論している。
発明者は、AP-1依存性遺伝子発現を阻害する化合物を同定した。発明者は、これらの化合物の活性を検討し、これらの化合物がFosB/ΔFosB発現を阻害することを見出した。発明者は、かかる化合物が、血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および細胞増殖を低減させ得ることを見出した。
従って、第一態様は、有効量のFosB/ΔFosB発現阻害剤を投与することを含む、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖の低減方法を提供する。
第一の代替的態様としては、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖の低減に使用するためのFosB/ΔFosB発現阻害剤;あるいは対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖の低減に使用するための医薬の製造におけるFosB/ΔFosB発現阻害剤の使用を提供する。
第二の態様としては、対象に有効量のFosB/ΔFosB発現阻害剤を投与することを含む、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態の治療または予防方法を提供する。
第二の代替的な態様としては、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態の治療または予防に使用するためのFosB/ΔFosB発現阻害剤;あるいは対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態の治療または予防するための医薬の製造におけるFosB/ΔFosB発現阻害剤の使用を提供する。
第三の態様としては、有効量のFosB/ΔFosB発現、および／または細胞外シグナル制御キナーゼ1/2(ERK1/2)リン酸化および／または血管細胞接着分子－1(VCAM-1もしくはVCAM1)発現の阻害剤を投与することを含む、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖の低減方法を提供する。
第三の代替的な態様としては、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖の低減に使用するためのFosB/ΔFosB発現、および／またはERK1/2リン酸化および／またはVCAM-1発現阻害剤;あるいは対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖を低減させるための医薬の製造における、FosB/ΔFosB発現、および／またはERK1/2リン酸化および／またはVCAM-1発現阻害剤の使用を提供する。
第四の態様としては、有効量のERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現、および／またはVCAM-1発現阻害剤を投与することを含む、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態の治療または予防方法を提供する。
第四の代替的な態様としては、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態の治療または予防に使用するためのFosB/ΔFosB発現、および／またはERK1/2リン酸化および／またはVCAM-1発現阻害剤;あるいは対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態を治療または予防するための医薬の製造におけるFosB/ΔFosB発現、および／またはERK1/2リン酸化および／またはVCAM-1発現阻害剤の使用を提供する。
第五の態様としては、化学式I:
Figure 2023518375000001
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;
Gが、C=OもしくはC=N-OH; および
Aが:
Figure 2023518375000002
（式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）;
またはAが:
Figure 2023518375000003
（式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）;
もしくは化学式II:
Figure 2023518375000004
（式中、
R3が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;および
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル、
またはR4が
Figure 2023518375000005
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）の化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を投与することを含む対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖を低減させる方法を提供する。
第五の代替的な態様としては、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖の低減に使用するための化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩;あるいは対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖を低減させる医薬の製造における化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の使用を提供する。
第六の態様としては、化学式I:
Figure 2023518375000006
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;
Gが、C=OもしくはC=N-OH; および
Aが:
Figure 2023518375000007
（式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）;
あるいはAが:
Figure 2023518375000008
（式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）;
もしくは化学式II:
Figure 2023518375000009
（式中、
R3が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;および
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）、
またはR4が
Figure 2023518375000010
)）の化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を対象に投与することを含む、AP-1および／またはERK1//2を介する疾患または状態の治療または予防方法を提供する。
第六の代替的な態様としては、対象におけるAP-1、および／またはERK1/2を介する疾患または状態を治療または予防するための化学式IもしくはIIの化合物またはその医薬上許容し得る塩;あるいは対象におけるAP-1、および／またはERK1/2を介する疾患または状態の治療または予防するための医薬の製造における化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の使用を提供する。
第七の態様としては、化学式I:
Figure 2023518375000011
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;
Gが、C=OもしくはC=N-OH; および
Aが:
Figure 2023518375000012
（式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）;
またはAが:
Figure 2023518375000013
（式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）;
もしくは化学式II：
Figure 2023518375000014
（式中、
R3が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;および
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル、
またはR4が、
Figure 2023518375000015
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）
の化合物またはその医薬上許容し得る塩の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるAP-1、および／またはFosB/ΔFosBおよび／またはERK1/2および／またはVCAM-1および／またはVEGF-Aおよび／またはIL-1βを介する疾患または状態の治療または予防方法を提供する。
第七の代替的な態様としては、対象におけるAP-1、FosB/ΔFosBおよび／またはERK1/2および／またはVCAM-1および／またはVEGF-Aおよび／またはIL-1βを介する疾患または状態の治療または予防に使用するための化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩;あるいは対象におけるAP-1、および／またはFosB/ΔFosBおよび／またはERK1/2および／またはVCAM-1および／またはVEGF-Aおよび／またはIL-1βを介する疾患または状態を治療または予防するための医薬の製造における化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の使用を提供する。
第八の態様としては、化学式I:
Figure 2023518375000016
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;
Gが、C=OもしくはC=N-OH; および
Aが:
Figure 2023518375000017
（式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）;
またはAが:
Figure 2023518375000018
（式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）;
もしくは化学式II：
Figure 2023518375000019
（式中、
R3が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;および
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル、
またはR4が、
Figure 2023518375000020
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）の化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を対象に投与することを含む、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態の治療または予防方法を提供する。
第八の代替的な態様としては、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態の治療または予防に使用するための化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩;あるいは対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態を治療または予防するための医薬の製造における、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の使用を提供する。
第九の態様としては、対象に有効量の以下:
Figure 2023518375000021
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖の低減方法を提供する。
第九の代替的な態様としては、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖の低減に使用するための、以下:
Figure 2023518375000022
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩；あるいは対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖を低減させる医薬の製造における、以下：
Figure 2023518375000023
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩の使用を提供する。
第十の態様としては、対象に有効量の以下:
Figure 2023518375000024
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、対象におけるAP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2-依存性の遺伝子発現の低減方法を提供する。
第十の代替的な態様としては、対象におけるAP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2-依存性の遺伝子発現の低減に使用するための以下:
Figure 2023518375000025
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩;あるいは対象におけるAP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2-依存性の遺伝子発現を低減させる医薬の製造における、以下:
Figure 2023518375000026
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩の使用を提供する。
第十一の態様としては、対象に有効量の以下:
Figure 2023518375000027
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、対象者のAP-1および／またはFosB/ΔFosB、および／またはERK1/2および／またはVCAM-1、および／またはVEGF-A、および／またはIL-1βを介した疾患または状態の治療または予防方法を提供する。
第十一の代替的な態様として、対象におけるAP-1および／またはFosB/ΔFosB、および／またはERK1/2および／またはVCAM-1、および／またはVEGF-A、および／またはIL-1βを介する疾患または状態の治療または予防に使用するための以下:
Figure 2023518375000028
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩;あるいは対象におけるAP-1および／またはFosB/ΔFosB、および／またはERK1/2および／またはVCAM-1、および／またはVEGF-A、および／またはIL-1βを介した疾患または状態を治療または予防するための医薬の製造における、以下:
Figure 2023518375000029
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩の使用を提供する。
第十二の態様としては、対象に有効量の以下:
Figure 2023518375000030
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する状態の治療または予防方法を提供する。
第十二の代替的な態様としては、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する状態の治療または予防に使用するための以下:
Figure 2023518375000031
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩;あるいは対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する状態を治療または予防するための医薬の製造における、以下:
Figure 2023518375000032
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩の使用を提供する。
第十三の態様として、有効量の化学式I:
Figure 2023518375000033
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;
Gが、C=OもしくはC=N-OH; および
Aが:
Figure 2023518375000034
（式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）;
またはAが:
Figure 2023518375000035
（式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）;
もしくは化学式II:
Figure 2023518375000036
（式中、
R3が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;および
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル、
またはR4が、
Figure 2023518375000037
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）の化合物、またはその医薬上許容し得る塩を細胞に接触させることを含む、細胞中のERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現、および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現を低減させる方法を提供する。
第十四の態様としては、有効量の以下:
Figure 2023518375000038
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩を細胞に接触させることを含む、細胞中のERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現を低減させる方法を提供する。
第十五の態様としては、有効量の化学式I:
Figure 2023518375000039
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;
Gが、C=OもしくはC=N-OH; および
Aが:
Figure 2023518375000040
（式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）;
またはAが:
Figure 2023518375000041
（式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）;
もしくは化合物II：
Figure 2023518375000042
（式中、
R3が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;および
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル、
またはR4が、
Figure 2023518375000043
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）の化合物またはその医薬上許容し得る塩と一緒にERK1/2をインキュベートすることを含む、ERK1/2リン酸化の阻害方法を提供する。
第十六の態様としては、有効量の以下:
Figure 2023518375000044
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩と一緒にERK1/2をインキュベートすることを含む、ERK1/2リン酸化の阻害方法を提供する。
第十七の態様としては、FosB/ΔFosB発現阻害剤である化合物、および任意にERK1/2リン酸化および／またはVCAM-1発現阻害剤、ならびに医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
第十八の態様としては、下記一般式:
Figure 2023518375000045
の化合物またはその医薬上許容し得る塩、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
第十九の態様として、有効量のFosB/ΔFosB発現阻害剤;および任意にERK1/2リン酸化および／またはVCAM-1発現阻害剤を投与することを含む、以下:
関節炎;
関節リウマチ;
骨破壊;
加齢黄斑変性;
糖尿病性網膜症;
黄斑浮腫;
血管漏出;
血管透過性;
網膜血管の透過性;
血管新生;
内皮細胞機能不全;
アテローム性動脈硬化症;
脳卒中;
心筋梗塞;
末梢血管疾患;
狭窄;
再狭窄;
炎症;
サイトカインストーム;
肺炎症;
肺繊維症、
から選択される対象における疾患または状態の治療または予防方法を提供する。
第十九の代替的な態様において、以下:
関節炎;
関節リウマチ;
骨破壊;
加齢黄斑変性;
糖尿病性網膜症;
黄斑浮腫;
血管漏出;
血管透過性;
網膜血管の透過性;
血管新生;
内皮細胞機能不全;
アテローム性動脈硬化症;
脳卒中;
心筋梗塞;
末梢血管疾患;
狭窄;
再狭窄;
炎症;
サイトカインストーム;
肺炎症;
肺繊維症、
から選択される対象における疾患または状態の治療または予防に使用するためのFosB/ΔFosB発現阻害剤;および任意にERK1/2リン酸化および／またはVCAM-1発現阻害剤;あるいは以下:
関節炎;
関節リウマチ;
骨破壊;
加齢黄斑変性;
糖尿病性網膜症;
黄斑浮腫;
血管漏出;
血管透過性;
網膜血管の透過性;
血管新生;
内皮細胞機能不全;
アテローム性動脈硬化症;
脳卒中;
心筋梗塞;
末梢血管疾患;
狭窄;
再狭窄;
炎症;
サイトカインストーム;
肺炎症;
肺繊維症、
から選択される対象における疾患または状態を治療または予防するための医薬の製造における、FosB/ΔFosB発現阻害剤;および任意にERK1/2リン酸化および／またはVCAM-1発現阻害剤の使用を提供する。
第二十の態様として、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を投与することを含む、以下:
関節炎;
関節リウマチ;
骨破壊;
加齢黄斑変性;
糖尿病性網膜症;
黄斑浮腫;
血管漏出;
血管透過性;
網膜血管の透過性;
血管新生;
内皮細胞機能不全;
アテローム性動脈硬化症;
脳卒中;
心筋梗塞;
末梢血管疾患;
狭窄;
再狭窄;
炎症;
サイトカインストーム;
肺炎症;
肺繊維症、
から選択される対象における状態または疾患の治療または予防方法を提供する。
第二十の代替的な態様としては、以下:
関節炎;
関節リウマチ;
骨破壊;
加齢黄斑変性;
糖尿病性網膜症;
黄斑浮腫;
血管漏出;
血管透過性;
網膜血管の透過性;
血管新生;
内皮細胞機能不全;
アテローム性動脈硬化症;
脳卒中;
心筋梗塞;
末梢血管疾患;
狭窄;
再狭窄;
炎症;
サイトカインストーム;
肺炎症;
肺繊維症、
から選択される対象における状態または疾患の治療または予防に使用するための化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩;あるいは以下:
関節炎;
関節リウマチ;
骨破壊;
加齢黄斑変性;
糖尿病性網膜症;
黄斑浮腫;
血管漏出;
血管透過性;
網膜血管の透過性;
血管新生;
内皮細胞機能不全;
アテローム性動脈硬化症;
脳卒中;
心筋梗塞;
末梢血管疾患;
狭窄;
再狭窄;
炎症;
サイトカインストーム;
肺炎症;
肺繊維症、
から選択される対象における状態または疾患を治療または予防するための医薬の製造における、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の使用を提供する。
第二十一の態様としては、以下:
関節炎;
関節リウマチ;
骨破壊;
加齢黄斑変性;
糖尿病性網膜症;
黄斑浮腫;
血管漏出;
血管透過性;
網膜血管の透過性;
血管新生;
内皮細胞機能不全;
アテローム性動脈硬化症;
脳卒中;
心筋梗塞;
末梢血管疾患;
狭窄;
再狭窄;
炎症;
サイトカインストーム;
肺炎症;
肺繊維症、
から選択される対象における状態または疾患の治療または予防方法を提供し、この方法は、有効量の以下:
Figure 2023518375000046
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩を対象に投与することを含む。
第二十の態様については、下記一般式:
Figure 2023518375000047
を有する化合物またはその医薬上許容し得る塩を提供する。
第二十一の代替的な態様としては、以下:
Figure 2023518375000048
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩であって、以下:
関節炎;
関節リウマチ;
骨破壊;
加齢黄斑変性;
糖尿病性網膜症;
黄斑浮腫;
血管漏出;
血管透過性;
網膜血管の透過性;
血管新生;
内皮細胞機能不全;
アテローム性動脈硬化症;
脳卒中;
心筋梗塞;
末梢血管疾患;
狭窄;
再狭窄;
炎症;
サイトカインストーム;
肺炎症;
肺繊維症、
から選択される対象における状態または疾患の治療または予防に使用するための化合物またはその医薬上許容し得る塩;あるいは以下:
Figure 2023518375000049
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩の使用であって、以下:
関節炎;
関節リウマチ;
骨破壊;
加齢黄斑変性;
糖尿病性網膜症;
黄斑浮腫;
血管漏出;
血管透過性;
網膜血管の透過性;
血管新生;
内皮細胞機能不全;
アテローム性動脈硬化症;
脳卒中;
心筋梗塞;
末梢血管疾患;
狭窄;
再狭窄;
炎症;
サイトカインストーム;
肺炎症;
肺繊維症、
から選択される対象における状態または疾患を治療または予防するための医薬の製造における使用を提供する。
第二十二の態様は、化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
第二十三の態様は、下記一般式:
Figure 2023518375000050
の化合物またはその医薬上許容し得る塩、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
第二十四の態様は、インビトロでのERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現、および／またはVCAM-1発現、および／またはVEGF-A発現を低減するための化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の使用を提供する。
第二十五の態様は、インビトロでのERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現、および／またはVCAM-1発現、および／またはVEGF-A発現の低減に使用するための、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩を提供する。
第二十六の態様は、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を細胞に接触させることを含む、インビトロでの細胞中ERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現の低減方法を提供する。
第二十七の態様は、インビトロでのERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現、および／またはVCAM-1発現、および／またはVEGF-A発現を低減させるための、下記一般式：
Figure 2023518375000051
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩の使用を提供する。
第二十八の態様は、インビトロでのERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現、および／またはVCAM-1発現、および／またはVEGF-A発現の低減に使用するための、下記一般式：
Figure 2023518375000052
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩を提供する。
第二十九の態様は、有効量の下記一般式：
Figure 2023518375000053
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩を細胞に接触させることを含む、インビトロでの細胞中ERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現の低減方法を提供する。
第三十の態様は、化学式I:
Figure 2023518375000054
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;
Gが、C=OもしくはC=N-OH;および
Aが:
Figure 2023518375000055
（式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）;
またはAが:
Figure 2023518375000056
（式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）;
もしくは化学式II：
Figure 2023518375000057
（式中、
R3が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;および
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル、
またはR4が、
Figure 2023518375000058
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）
の化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を投与することを含む、表3A、3Bおよび／または3Cで参照される遺伝子、典型的には、表3A、3Bおよび／または3Cで参照されるIL-1βにより誘導される遺伝子、より典型的には、表3Bで参照されIL-1βにより誘導される遺伝子の発現の低減方法を提供する。
第三十一の態様は、化学式I:
Figure 2023518375000059
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;
Gが、C=OもしくはC=N-OH; および
Aが:
Figure 2023518375000060
（式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）;
またはAが:
Figure 2023518375000061
（式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）;
もしくは化学式II:
Figure 2023518375000062
（式中、
R3が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;および
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル、
またはR4が、
Figure 2023518375000063
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）
の化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を投与することを含む、表3A、3Bおよび／または3Cで参照される遺伝子、典型的には、表3A、3Bおよび／または3Cで参照されるIL-1βにより誘導される遺伝子、より典型的には、表3Bで参照されIL-1βにより誘導される遺伝子の発現を介する対象者の状態の治療または予防方法を提供する。
第三十一の代替的な態様は、表3A、3Bおよび／または3Cで参照される遺伝子、典型的には、表3A、3Bおよび／または3Cで参照されるIL-1βにより誘導される遺伝子、より典型的には、表3Bで参照されIL-1βにより誘導される遺伝子の発現を介する対象における状態の治療または予防に使用されるための化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩;あるいは表3A、3Bおよび／または3Cで参照される遺伝子、典型的には、表3A、3Bおよび／または3Cで参照されるIL-1βにより誘導される遺伝子、より典型的には、表3Bで参照されIL-1βにより誘導される遺伝子の発現を介する状態を治療または予防するための医薬の製造における、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の使用を提供する。
第三十二の態様は、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩を細胞に接触させることを含む、細胞中のICAM-1、c-Fos、Egr-1、CXCL2、KLF5、および／またはVCAM-1の発現の低減方法を提供する。
第三十三の態様は、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を細胞に接触させることを含む、表3A、3Bおよび／または3Cで参照されるIL-1βにより誘導される遺伝子、より典型的には、表3Bで参照されIL-1βにより誘導される遺伝子の発現の低減方法を提供する。
図の簡単な記載
本発明の好ましい実施形態は、添付図面を参照しながら、例示的にのみ説明する。
図1Aは、FosB/ΔFosBおよびc-Fosの発現に対する化合物BT2、T4およびT6の効果を示すウエスタンブロットの画像である。HMEC-1を6ウェルプレート（EGFおよびヒドロコルチゾンを含む10％FBS中）で増やし、20ｈ血清アレストさせた後、37℃で無血清培地（EGFまたはヒドロコルチゾンなし）中30μM化合物（T4、T6、T7、BT2およびBT3）により4ｈ処理した。培地を１ｈ同濃度の化合物と一緒に10％FBS（EGFとヒドロコルチゾン入り）に変えた。ライセートはSDS-PAGEで分離し、FosBまたはc-Fosについてウェスタンブロッティングを行った。実験は指示された場合生物学的に独立して二回行われた。分子量マーカーのおおよその位置が示されている。データは3回の生物学的に独立した実験を表す。 図1Bは、血清誘導性内皮細胞増殖に対するBT2、T4およびT6の経時的な効果を示す。血清欠乏HMEC-1を5%FBS含有培地（EGFおよびヒドロコルチゾン含有）中で化合物により処理し、xCELLigenceシステムを用いて細胞増殖をモニターした。上図、xCELLigenceシステムを用いた1つの実験からの代表的なリアルタイムプロファイルで、濃度は示されている。Cell indexは、細胞増殖の定量的な指標である。下図、xCELLigenceデータは、79ｈ後の5～8個の独立した実験の平均±SEMを表す。統計的有意性は、一元配置分散分析により評価した。 図1Cは、内皮遊走に対するBT2、T4およびT6の効果を示す。10%FBSを含むDMEM中のBAECを、0.8μmのTranswellインサートを装着した24ウェルプレートに播種した。48ｈ培地を0.01%FBS含有DMEMに変えた。上部チャンバーには0.01%FBSを含むDMEM中に1μMの化合物を添加し、下部チャンバーの培地は10%FBSと50ng/ml VEGF-A165を含むDMEMに変えた。細胞は24ｈ放置した。核はNIH ImageJソフトウェアで定量化した。データは4～5回の独立した実験による平均±SEMを表す。統計的有意性は、Kruskal-Wallis多重比較検定により評価した。 図1Dは、スクラッチアッセイを用いた、インビトロでの機械的損傷後の内皮細胞再生に対するBT2、T4およびT6の効果を示している。滅菌つまようじで削ったHMEC-1モノレイヤーを、5%FBSを含む培地中で0.6μMの化合物で処理した。削り取った部分の再生は、削り取りから48ｈ後に観察した。再成長面積はImage-Pro Plusソフトウェア(Cybernetics)を用いて求めた。データは5回の独立した実験の平均±SEMを表す。統計的有意性は一元配置分散分析により評価した。 図1Eは、マトリゲル上の内皮ネットワーク（管）形成に対するBT2、T4およびT6の効果を示す。1%FBSおよび50ng/ml FGF-2を含有する培地中のHMEC-1を化合物（最終3μM）と混合し、マトリゲルでコートしたウェルに播種した。ネットワーク形成は、24ｈかけて評価した。ネットワークはImage-Pro Plusソフトウェアを用いて定量化した。データは5～6回の独立した実験による平均±SEMを表す。統計的な有意性は、Kruskal-Wallis多重比較検定により評価した。 図2Aは、BT2が、脈絡膜レーザー損傷後のラットの網膜透過性を阻害することを示す。BT2、T4、T6（示された用量）またはビヒクル（対照）を、網膜の6回のレーザー火傷の当日（0日目）および7日後に、両目にIVTで注射した。ケナコルトは0日目にIVT投与した。あるいは、ビヒクル（生理食塩水）中のアフリベルセプト／エイレアを6回（0、3、7、10、14、17日目）IVT注射した。14日目と21日目に、フルオレセインナトリウムを皮下注射し、10min後にハイデルベルグ網膜血管造影法（HRA）を用いて眼蛍光を記録し、スコア化した。HRAスコアは、14日目と21日目のデータを組み合わせる。データは平均±SEMを表す。統計的有意性は、一元配置分散分析（左のプロット）またはt検定（右のプロット、左のプロットではBT2対ケナコルト比較）を用いて評価した。１群あたりn=5～29。 図2Bは、BT2がrhVEGF-A165によって誘導されたウサギの網膜血管透過性を阻害することを示す。BT2またはBT3（600μg）またはビヒクルを、500ng rhVEGF-A165を50μlでIVT注射して血管漏出を誘導する5ｄ前にウサギの右眼にIVT注射した。誘導の2日後にフルオレセインナトリウムを静脈内注射し、1ｈ後に眼蛍光光度計で右目（R）と左目（L）の眼蛍光を測定し、各ウサギの比率（R/L）で表した。活性化合物BT2に対する比較のため、両条件とも不活性で統計的に差がないため、ビヒクル群およびBT3群の比率データをプールした（対照）。データは平均±SEMを表す。統計的有意性はt-検定により評価した。１群あたりn=6-8。 図２C～Eは、ラット網膜病変部における（C）CD31、（D）VEGF-A165、（E）VEGF-A165の免疫組織化学染色を傷に対して100μmの枠で囲んだ増大を示す。未処置とは、レーザー照射やビヒクルまたは薬剤を注射しなかった眼球を指す。陽性染色（赤色色素）のIODは、Image-Pro Plusソフトウェアを用いて評価した。スライドは10×または20×の対物レンズで撮影し、拡大図を示した。CD31については1群当たりn=4～6、VEGF-A165については1群当たりn=3～6、またはVEGF-A165勾配分析については1群当たりn=3～5。データは、動物ごとの平均±SEMを表す。統計的有意性は、適宜、一元配置分散分析、Mann-Whitneyまたはt-検定により評価した。矢印は、陽性染色の例を提供する。 図2Fは、BT2がマウスのマトリゲルプラグにおける血管新生を阻害することを示す。VEGF-A165 (100ng/ml)、ヘパリン(10U)およびBT2またはBT3(2.5 mg/マウス)またはビヒクルを含むマトリゲル(500μl)を8週齢の雄C57BL/6マウスの左脇腹に皮下注射した。7日後、マウスを犠牲にし、プラグをCD31抗体で染色した。10×対物レンズで撮影した染色されたCD31の代表的な免疫組織化学的画像と、拡大図（40×対物レンズで撮影）を提供する挿入図を伴う。CD31染色はImage-Pro Plusソフトウェアで定量化した。データは、動物ごとの平均±SEMを表す。統計的有意性は、Kruskal-Wallis多重比較検定により評価した。１群当たりn=10～11。 図3Aは、BT2がERKリン酸化、FosB/ΔFosBおよびVCAM-1発現を阻害することを示すウエスタンブロットの画像である。30μM BT2または30μM PD98059で処理したHMECを、20ng/ml IL-1βで最大4ｈまで様々な時間刺激した。Westernは、生物学的に独立した2～3回の実験の代表的なものであり、時間は時間（hour）（示されている場合）で示し、それぞれ別のレーンに生物学的に独立した2つの複製を実行した。同じブロットでのIL-β1誘導性VCAM-1およびERKリン酸化のBT2阻害は、図3Dに示されている。 図3Bは、BT2がVCAM-1発現を阻害することをフローサイトメトリーにより示す。フローサイトメトリーは、BD FACSCanto IIを使用して、30μM BT2またはBT3および20ng／ml IL-1βで処理したHMEC-1を用いて行った。データは3回の独立した実験による平均±SEMを表す。統計的有意性は一元配置分散分析で評価した。１群あたりn=3。 図3Cは、BT2がFosB、c-Fos、VCAM-1、ICAM-1、および細胞増殖、遊走、血管新生および／または炎症に関与するその他の遺伝子を阻害することを示している。30μM BT2で前処理したHMEC-1と20ng/ml IL-1βで4ｈインキュベーションして調製した全RNAでRNA-seqが実施された。PCAプロット（左上）は、条件UT、IL-1β、IL-1β+BT2における生物学的複製間の密接な関連と、条件間の明確な分離を示す。ヒートマップ（中央、1579遺伝子）は、IL-1β対UTの比較で、すべてのアップレギュレーションされた遺伝子について作成された。Counts per million (cpm) 値を使用し、FosBとVCAM-1のcpmで階層的クラスタリングを用いて遺伝子（行）をグループ化し、プロットした。ヒートマップ（右）は、log 倍率変化(FC) ≧2の325遺伝子を示す。FosB、c-Fos、VCAM-1（本研究の対象）は、BT2によって阻害される他のいくつかの遺伝子とともに図に示す。また、BT2によってさらに誘導される遺伝子の小さなサブセット（赤で示す）も図に示す。BHLHE40, basic helix-loop-helix family member e40（塩基性ヘリックスループヘリックスファミリーメンバー40）; CCL20, C-C motif chemokine ligand 20(C-X-Cモチーフケモカインリガンド20); CXCL2, C-X-C motif chemokine ligand 2(C-X-Cモチーフケモカインリガンド2); DUSP1, dual specificity phosphatase 1(二重特異性ホスファターゼ1); EGR1, early growth response 1(初期増殖応答タンパク質1); ETS1, ETS proto-oncogene(ETS癌原遺伝子) 1; FOS, FOS proto-oncogene(FOS癌原遺伝子); FOSB, FosB proto-oncogene(FOSB癌原遺伝子); ICAM1, intercellular adhesion molecule 1(細胞間接着分子1); IL6, interleukin 6(インターロイキン6); KLF5, Kruppel like factor 5(クルッペル様因子5); MMP25, matrix metallopeptidase 25(マトリックスメタロペプチダーゼ25); NFKBIA, NFKB inhibitor α(NFKB阻害剤α); THBS1, thrombospondin 1(トロンボスポンジ1); TNIP, TNFAIP3 interacting protein 1(TNFAIP3相互作用タンパク質1); PLAT, plasminogen activator, tissue type(組織型プラスミノーゲン活性化因子); VCAM1, vascular cell adhesion molecule 1(血管性細胞接着分子1). 図3Dは、BT2がPD98059よりも強力にIL-1β誘導性VCAM-1発現とERKリン酸化を阻害することを示す。BT2およびPD98059の濃度（1～30μM）を示す。データは3回の生物学的に独立した実験を表す。 図3Eは、VCAM-1発現がFosBに依存していることを示すsiRNAを用いたウエスタンブロットの画像である。0.6μM siRNAまたは対照siRNAで処理したHMEC-1を20ng/ml IL-1βで2ｈまたは4ｈ刺激した。ウェスタンブロッティングは、示された抗体を用いて行った。データは2回の生物学的に独立した実験の代表値である。分子量マーカーのおおよその位置が示されている。 図4A-Eは、BT2が網膜およびマトリゲルプラグにおけるERKリン酸化、FosB/ΔFosBおよびVCAM-1発現を阻害することを示す。網膜病変部における免疫組織化学的染色は、（A）pERK、（B）FosBおよび（C）VCAM-1について行った。陽性染色（赤色色素）のIODは、Image-Pro Plusソフトウェアを用いて評価した。スライドは、20×または40×の対物レンズで撮影し拡大図を示す。pERKとFosBは1群当たりn=3～5、VCAM-1は１群当たりn=4～6。データは動物ごとの平均±SEMを表す。統計的有意性は、適宜、一元配置分散分析、Kruskal-Wallis、Mann-Whitneyまたはt-検定により評価した。矢印は陽性染色の例を示す。INL, inner nuclear layer（内側核層）; OPL, outer plexiform layer（外側叢状層）; ONL, outer nuclear layer（外側核層）; OLM, outer limiting membrane（外側辺縁膜）。あるいは、マトリゲルプラグを（D）FosBまたは（E）VCAM-1について染色した。代表的なFosBまたはVCAM-1染色はそれぞれ40×または20×の対物レンズで撮影され、拡大図を提供する挿入図を伴う。染色はImage-Pro Plusソフトウェアを用いて定量化した。データは平均±SEMを表す。統計的有意性は、Kruskal-Wallis多重比較検定（FosB、１群当たりn=9～11）または一元配置分散分析（VCAM-1、１群当たりn=10～11）により評価された。矢印は、陽性染色の例を示す。IODはintegrated optical density（積算光学密度）を示す。 図5A～Dは、BT2のカルバメート部位がMEK1との相互作用と機能的効果に重要であることを示す。図5Aは、血清欠乏HMEC-1を5%FBS含有培地中で化合物（0.4または0.8μM）で処理し、xCELLigenceシステム（Roche）を使用して細胞増殖をモニターした増殖実験を示す。左、1つの実験から得られた代表的な増殖プロファイル。右、79ｈ後の3つの独立した実験による平均±SEMを表すxCELLigenceのデータ。統計的有意性は一元配置分散分析またはMann-Whitney検定により評価した。 図5Bは、1% FBSと50ng/ml FGF-2を含む培地で化合物（最終1μM）を組み合わせ、マトリゲルでコートしたウェルに播種したHMEC-1ネットワーク形成を示す。ネットワークは、NIH ImageJソフトウェアを用いて定量化した。データは、3～4回の独立した実験による平均±SEMを表す。統計的有意性はKruskal-Wallis多重比較検定により評価した。 図5Cは、PD98059、BT2およびBT2類縁体とHis-MEK1（左パネル）およびHis-MEK2（右パネル）の相互作用を試験したSPR分析を示す。測定は、20mM HEPES、150mM NaCl、5% DMSO pH7.4を含む緩衝液中、15℃でBiacore T200で行われた。データは2つの独立した実験の代表である。 図5Dでは、HMEC-1を37℃の無血清培地中で1μMの化合物（BT2および類縁体）で4ｈ処理した。培地を化合物とともに20ng/ml IL-1βに15min変更した。ライセートはSDS-PAGEで分離し、pERKまたは総ERKについてウェスタンブロッティングを行った。データは、2つの生物学的に独立した実験の代表である。分子量マーカーのおおよその位置を示す。 図6Aは、ハイスループット化合物スクリーニングの模式図を示す。ルシフェラーゼベースのハイスループットスクリーニングは、PAINS frequent hitter filterの使用を含むヒットの同定に使用された。BT2およびCpd B/X/LK001の平均IC50データおよび典型的な11点滴定曲線を示す。 図6Bは、Cpd B/X/LK001またはBT2類縁体の化学合成における反応物質を示す。 図7A～Bは、BT2、T4およびT6が内皮のFosB/ΔFosBおよびc-Fosの発現を阻害し、細胞増殖をブロックすることを示す。図7Aは、NIH ImageJソフトウェアを用いて測定したウェスタンブロット分析からのバンド強度（対応する対照に対する画素強度）を示す。FosB/△FosBバンド強度は合算した。プロットされたデータは、生物学的に独立した3回の実験の値または平均（独立した生物学的デュープリケートが1つのブロットに使用された場合）±SEMを表す。 図7Bは、Countess II Automated Cell Counterを用いたトリパンブルー排除により決定された、全細胞数および全細胞の割合としての%生細胞を示す。Countessのデータは、4回の独立した実験による平均±SEMを表す。統計的有意性は、Kruskal-Wallis多重比較検定によって評価した。 図8A-Cは、一次抗体を省略した免疫組織化学染色を示す。図8Aは、病変のない領域または病変のある領域（矢印）において、一次抗体を省略したMACH3 AP-Polymer検出系による免疫組織化学染色（ビヒクル群）を示す。Vitr, vitreous（硝子体）。ILM, inner limiting membrane（内境界膜）; GCL, ganglion cell layer（神経節細胞層）; IPL, inner plexiform layer（内叢状層）; INL, inner nuclear layer（内核層）; OPL, outer plexiform layer（外叢状層）; ONL, outer nuclear layer（外核層）; OLM, outer limiting membrane（外境界膜）; IS, inner segment（内節）; OS, outer segment（外節）; RPE, retinal pigment epithelium（網膜色素上皮）; Chor, choroid（脈絡膜）。 図8Bは、マトリゲルプラグ中の一次抗体を省略したDAB発色検出システムを用いた免疫組織化学染色（ビヒクル群）を示す。 図8Cは、マトリゲルプラグ中の一次抗体を省略したMACH3 AP-Polymer検出システムを用いた免疫組織化学染色 (ビヒクル群)を示す。No 1o Abは一次抗体を省略したことを示す。 図9は、BT2がERKリン酸化、FosB/ΔFosBおよびVCAM-1発現を阻害することを示す。ウェスタンブロット解析からのバンド強度（対応する対照に対する画素強度）は、NIH ImageJソフトウェアを使用して測定した。FosB/ΔFosBバンド強度は合算した。プロットされたデータは、生物学的に独立した2～3回の実験の値または平均（独立した生物学的デュープリケートが1つのブロットに使用された場合）±SEMを表している。 図10は、フローサイトメトリーによるVCAM-1+細胞およびVCAM-1-細胞のゲーティングを示す。VCAM-1+細胞とVCAM-1-細胞は、それぞれ一次VCAM-1抗体（非特異的染色）ありまたはなしでのフローサイトメトリー（FACSDiva v6.1.3）を行うことによりゲーティングされた。後者（すなわち陰性対照）の代表的なゲーティングを図に示す。 図11A～Cは、BT2に曝露したHMEC-1またはプラスミドをトランスフェクトしたHMEC-1の抽出物を用いたウェスタンブロッティング実験を示す。図11Aは、IL-1β誘導性VCAM-1発現およびERKリン酸化に対するBT2およびPD98059の比較効果を示す。ウェスタンブロット分析からのバンド強度（対応する対照に対する画素強度）は、NIH ImageJソフトウェアを用いて測定した。プロットされたデータは、3回の生物学的に独立した実験の平均±SEMを表す。 図11Bは、IL-1β誘導性のp-SAPK/JNKまたはp-p38に対するBT2およびPD98059（1～30μM）の比較効果を示す。データは、3回の生物学的に独立した実験の平均±SEMを表す。分子量マーカーのおおよその位置を示す。 図11Cは、ウェスタンブロッティングによるFosBおよびVCAM-1発現の徴候におけるERKリン酸化の必要性を示す。6ウェルプレート中血清欠乏（およびEGFまたはヒドロコルチゾンなし）により増殖を休止させたHMEC-1を、ERK1 変異体 1 (NM_002746.2)、ERK1 変異体 2 (NM_001040056.3)、FosB 変異体 1 (NM_006732.2)、FosB 変異体 2 (NM_001114171.2)またはΔFosB (XM_005258691.1)を挿入した6μgの示されたpcDNA3. 1+/C-(K)DYKベースのプラスミドでトランスフェクションさせた。ウェスタンブロッティングは、全タンパク質ライセート（プラスミドトランスフェクションの18、24、48、72ｈ後に採取）を用いて、示した抗体を用いて行った。Lは軽い曝露を示す。分子量マーカーのおおよその位置を示す。データは2回の独立した実験の代表である。 図12は、BT2が、マトリゲル上の内皮ネットワーク形成を阻害することにおいてクルクミンよりも強力であることを示す。1％FBSおよび50ng／ml FGF-2を含む培地中のHMEC-1を、種々の濃度のBT2またはクルクミン化合物と組み合わせ、マトリゲルでコーティングしたウェルに播種した。4ｈ後のネットワークは、NIH ImageJソフトウェアを用いて定量化した。データは3～4回の独立した実験による平均±SEMを表す。統計的有意性は、Kruskal-Wallis多重比較検定により評価した。 図13A～Bは、BT2の構造類縁体の生物活性を示す。図13Aでは、HMEC-1を37℃の無血清培地で3μMの化合物（BT2および類似化合物）で4ｈ処理した。培地を化合物とともに20ng/ml IL-1βに15min変更した。ライセートはSDS-PAGEで分離し、リン酸化ERKまたは全ERKについてウェスタンブロッティングを行った。分子量マーカーのおおよその位置を示す。 図13Bは、1％FBSおよび50ng／ml FGF-2と化合物（最終3μM）を組み合わせた培地中で、マトリゲルでコートしたウェルに播種したHMEC-1ネットワーク形成を示す。ネットワークは、NIH Image Jソフトウェアを使用して定量化した。データは3～4回の独立した実験の平均±SEMを表す。統計的有意性はKruskal-Wallis多重比較検定により評価した。 図14A～Fは、BT2が煮沸またはオートクレーブ後も安定性および生物学的活性を保持することを示す。図14Aおよび14Bは、BT2（0.5％Tween 80および0.01％DMSOを含む生理食塩水中）の加熱処理（100℃ウォーターバス、10min、DL20170921-H）または非加熱処理（DL20170921）超音波処理製剤のRRLC-MS／MS分析が、製剤の調製から1週間または6週間後にトリプリケートで行われたことを示す。代表的なクロマトグラム（各セットの右側に重水素化(d3)-BT2対照を示す）を示す。 図14Cおよび14Dは、ビヒクル（0.01% DMSOおよび0.5% Tween 80を含む生理食塩水、超音波処理）中のBT2またはBT3を含むチューブを22℃で保存（非加熱処理）、または100℃のウォーターバスに10min入れた後22℃まで冷却（加熱処理、+H）、そして作り立てで使用するか暗所で6週間または少なくとも10ヶ月保存（D、黒いバーは11ヶ月を表す、青いバーは10ヶ月を表す、赤いバーは16ヶ月を表す）したことを示す。血清欠乏HMEC-1を5%FBS含有培地中で加熱処理または非加熱処理BT2またはBT3(0.4、0.8μM)で処理し、xCELLigenceシステム(Roche)を用いて増殖をモニターした。データは、79h後の3回の独立した実験による平均±SEMを表す。統計的有意性は一元配置分散分析で評価した。 図14Eおよび14Fは、BT2の加熱処理（100℃、10min）または非加熱処理超音波処理製剤（0.5％Tween 80および0.01％DMSOを含む生理食塩水中）のRRLC-MS/MS分析が、製剤調製の10、11または16ヶ月後にトリプリケートで実施されたことを示す。代表的なクロマトグラムを示す。 図14Gは、作り立てで使用するかオートクレーブ（121℃、15 psi、20min；+A）して暗所で4ヶ月間保存した（オレンジ色のバー）、BT2をビヒクル（0.01% DMSOと0.5% Tween 80を含む生理食塩水、超音波処理）中に含むチューブを示す。血清欠乏HMEC-1を5%FBS含有培地中でオートクレーブ処理または作り立てのBT2(0.4、0.8μM)で処理し、xCELLigenceシステム(Roche)を用いて増殖をモニターした。増殖データは、79ｈ後の4回の独立した実験による平均±SEMを表している。統計的有意性は一元配置分散分析で評価した。また、調製したばかりのBT2、またはオートクレーブで4ヶ月間暗所に保存したBT2のLC/MS分析結果を示す。図は、各スペクトルのピーク強度を積分した総イオンクロマトグラム（上、黒）と、プロトン化前駆体（m/z 327.1319-327.1361）のピーク強度を積分した抽出イオンクロマトグラム（下、茶）を示す。 表3は、対照（UT）に対してIL-1βによって誘導される遺伝子（logFC≧2）（表3C）、およびIL-1βに対してBT2によって阻害される遺伝子（logFC≧2）（表3A）を提供する。表3Bは、IL-1βによって誘導され、BT2によって阻害される遺伝子を示す。RNA-seqは、30μM BT2で処理したHMEC-1と20ng/ml IL-1βで4ｈインキュベートして調製した全RNAで実施した。これらのデータは、別の場所でヒートマップによって表された同じ実験から得られた。 図15Aは、インビトロでIL-1β処理した内皮への単球細胞接着に対する様々な濃度のBT2およびBT3の効果を示すグラフである。インビトロでのHMECへのTHP-1接着を、96ウェルプレートにおいて、最初にHMECを様々な濃度のBT2またはBT3で1ｈ処理することによって評価した。HMECを20ng/mlのIL-1βで1ｈ刺激した。その後、細胞を加えてから30min後にHMEC単層に接着したカルセイン標識THP-1の蛍光強度を蛍光プレートリーダーで測定した。データは3回の実験の代表値であり、平均±SEMで表した。統計的有意性は、一元配置分散分析により評価した。 図15Bは、インビトロでのMCP-1に対する単球経内皮細胞遊走に対する様々な濃度のBT2の効果を示すグラフである。THP-1経内皮細胞のインビトロでの遊走は、ゼラチンコートされた培養インサート中で様々な濃度のBT2でHMECを1ｈ処理することにより評価した。HMECは20ng/mlのIL-1βで1ｈ処理した。24ｈ後にMCP-1に向かって経内皮遊走を行ったTHP-1細胞をCoulterカウンターで測定した。データは3回の実験の代表値であり、平均値±SEMとして表した。統計的有意性は一元配置分散分析により評価した。 図16Aは、コラーゲン抗体誘導関節炎マウスモデルにおける後足蹠厚みに対するビヒクルまたは3mg／kgもしくは30mg／kgのBT2の効果を示すグラフを提供する。動物に、0日目に抗体カクテルを、3日目にLPSプラスBT2（ビヒクル中3または30mg／kg）をi.p.注射した。後足蹠の厚みは、9日目にデジタルノギスを用いて測定した。データは、各肢（左および右）の後足蹠厚み（mm）として表した。１群当たりn=8～10。データは平均±SEMで表した。統計的有意性は、Kruskal-Wallis多重比較検定により評価した。 図16Bは、14日目におけるコラーゲン抗体誘導関節炎マウスモデルにおける後足蹠厚みに対するビヒクルまたはBT2の効果を示す画像（肉眼標本）を提供する。 図16Cは、14日目における、コラーゲン抗体誘導関節炎マウスモデルにおける、無処理、またはビヒクルもしくはBT2によるマウスの処理後のマウス足蹠のH＆E染色を示す画像を提供する。 図16Dは、コラーゲン抗体誘導関節炎マウスモデルにおける、無処理、またはビヒクルもしくはBT2による処理の骨破壊に対する効果を示す画像を提供する。14日目の後肢の3D Micro-CT解析は、スコア0＝骨破壊なし、およびスコア1＝破壊がそれぞれ個々の肢に与えられた場合で定量化した。データは、後肢（左右）当たりの平均骨破壊スコア±SEMとして表した１群当たりn=8～10。統計的有意性は、Firthの罰則付き尤度法検定を用いて評価した。 図16Eは、無処置、またはビヒクルもしくはBT2での処置後の、コラーゲン抗体誘導関節炎マウスモデルにおける14日目の後肢のMicro-CT画像を示す。矢印は、骨浸食および／またはリモデリングを示す。 図16Fは、未処理、またはビヒクルもしくはBT2で処理したコラーゲン抗体誘導関節炎モデルマウスの関節からの14日目の後肢破骨細胞における酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（TRAP）染色を示すグラフおよび画像を示す。矢印は陽性染色の例を示す。スライドは20×または40×の対物レンズで撮影した。陽性染色（赤色色素）のIODは、Image-Pro Plusソフトウェアで評価した。あるいは破骨細胞の数をNIH Image Jを用いてカウントした。データは平均± SEMで表す。統計的有意性はWilcoxon符号順位検定で評価した。１群当たりn=6～10。 図16Gは、14日目の後肢におけるVCAM-1またはICAM-1の免疫組織化学的染色を示す。20×の対物レンズ下でのIOD/μm2をImage-Pro Plusソフトウェアを用いて評価した。データは平均値の平均±SEMを表す。１群当たりn=3～5。統計的有意性は、一元配置分散分析により評価した。
詳細な記載
AP-1は、サイトカイン、増殖因子、ストレス、ウイルスおよび細菌感染などの様々な病的刺激に応答して遺伝子発現を制御する転写因子である。AP-1は、c-Fos、c-Jun、ATF(activating transcription factor（活性化転写因子)）および／またはJDP(Jun dimerization protein 2)タンパク質ファミリーに属するタンパク質が二量体化することで形成されるヘテロ二量体である。AP-1ファミリーメンバーであるc-fosやc-junの発現やDNA結合活性は、ヒトリウマチ滑膜で観察され、疾患活動性と関連しており、血管新生に関与する遺伝子産物を制御することが示されている一方、IL-1βは関節リウマチの骨・軟骨障害のメディエータである。さらに、AP-1因子は網膜剥離後の網膜細胞で発現し、糖尿病性ヒト網膜で上昇する。したがって、AP-1は様々な疾患に対する重要な治療ターゲットを表す。
実施例に記載されているように、本発明者は、AP-1依存性遺伝子発現を阻害する能力を有する式IおよびIIの化合物を同定し、合成した。本発明者は、さらに、これらの化合物がERK1/2のリン酸化を阻害し、したがって、ERK1/2依存性の遺伝子発現を阻害することを見出した。
実施例にさらに記載されているように、本発明者は、式IおよびIIの化合物が以下を阻害することを示した：血清誘導性内皮細胞増殖および遊走；インビトロ損傷後の内皮創傷修復；および再構成基底膜マトリックス上の微小管形成。本発明者は、さらに、これらの化合物がFosB/ΔFosBおよびc-Fosの発現を阻害することを見出した。
したがって、1つの態様は、有効量のFosB/ΔFosB発現阻害剤を投与することを含む、対象における血管透過性、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖の低減方法を提供する。一実施形態では、阻害剤は、FosB/ΔFosB発現を阻害する化合物である。
別の態様は、有効量のFosB/ΔFosB発現阻害剤を投与することを含む、血管透過性、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する状態の治療または予防方法を提供する。一実施形態では、阻害剤は、FosB/ΔFosB発現を阻害する化合物である。
実施例に記載されているように、本発明者は、さらに化合物BT2(化学式IIの化合物)が、FosB/ΔFosB発現の阻害に加えて、ERK1およびERK2(ERK1/2)のリン酸化を阻害、ならびにVCAM-1発現およびVEGF-A発現を阻害することを見出した。
したがって、別の態様は、有効量のERK1/2リン酸化および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現阻害剤を投与することを含む、対象における血管透過性、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖を低減する方法を提供する。一実施形態では、阻害剤は、ERK1/2リン酸化およびFosB/ΔFosB発現およびVCAM-1発現を阻害する化合物である。FosBは、c-Junタンパク質ファミリーのタンパク質と二量体化してAP-1を形成することができるFosタンパク質ファミリーのロイシンジッパータンパク質ファミリーメンバーである。ΔFosBは、FosBの切断型（truncated）スプライスバリアントである。ERK1とERK2は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPキナーゼ）で、表面チロシンキナーゼなどの表面受容体の活性化に応答して細胞機能に関与している。ERK1およびERK2は、Ras-Ras-MEK-ERKシグナル伝達カスケードに参加する関連セリン／スレオニンキナーゼである。MEK1/2は、ERK1/2のアミノ酸残基Tyr204と187およびThr202と185でのリン酸化を触媒する。ERK1/2は、活性化された後、何百もの細胞質および核タンパク質のリン酸化を触媒している。Ras-Ras-MEK-ERKシグナル伝達カスケードは、細胞増殖、接着、遊走、分化、血管新生などの多数の細胞プロセスを制御する上で中心的な役割を果たすと考えられている。
VCAM-1（CD106としても知られている）は、サイトカイン刺激により血管に発現する細胞接着分子である。特に、VCAM-1は、例えばTNF-アルファやIL-1βなどの刺激に応答して内皮細胞で発現がアップレギュレートする。
本明細書で使用する場合、FosB/ΔFosB発現阻害剤は、化合物または薬剤と接触していない細胞または組織が産生するFosB/ΔFosBタンパク質の量に対して、化合物または薬剤との接触後に細胞または組織が産生するFosB/ΔFosBタンパク質の量を減少させる、化合物または薬剤である。ERK1/2リン酸化阻害剤は、化合物または薬剤と接触していない細胞または組織におけるERK1/2リン酸化の程度に対して、化合物または薬剤との接触後に細胞または組織におけるERK1/2リン酸化の程度を低減させる、化合物または薬剤である。VCAM-1発現阻害剤は、化合物または薬剤と接触していない細胞または組織が産生するVCAM-1タンパク質に対して、化合物または薬剤との接触後に細胞または組織が産生するVCAM-1タンパク質の量を減少させる、化合物または薬剤である。VEGF-A発現阻害剤は、化合物または薬剤と接触していない細胞または組織が産生するVEGF-Aタンパク質の量に対して、化合物または薬剤との接触後に細胞または組織が産生するVEGF-A、典型的にはVEGF-A165のタンパク質の量を減少させる、化合物または薬剤である。
一実施形態では、化合物は、FosB/ΔFosB発現阻害剤である。
一実施形態では、化合物は、VCAM-1発現阻害剤である。
一実施形態では、化合物は、ERK1/2リン酸化阻害剤である。
一実施形態では、化合物は、FosB/ΔFosB発現およびERK1/2リン酸化の阻害剤である。
一実施形態では、化合物は、FosB/ΔFosBおよびVCAM-1発現の阻害剤である。
一実施形態では、化合物は、ERK1/2リン酸化、FosB/ΔFosB発現およびVCAM-1発現の阻害剤である。
一実施形態では、化合物は、ERK1/2リン酸化、FosB/ΔFosB発現、VCAM-1発現およびVEGF-A 発現の阻害剤である。
一実施形態では、化合物は、ERK1/2リン酸化、FosB/ΔFosB発現、VCAM-1発現、およびVEGF-A発現の阻害剤である。
一実施形態では、化合物は、SAPK/JNKまたはp38リン酸化を阻害しない。
典型的には、化合物は、低分子阻害剤である。
一実施形態では、化合物は、カルバメート部位を含む。
一実施形態では、化合物は、ジベンゾオキサゼピノンまたはベンゾフェノンである。
一実施形態では、化合物は、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩である。化学式Iの化合物は:
Figure 2023518375000064
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;
Gが、C=OもしくはC=N-OH; および
Aが:
Figure 2023518375000065
（式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）;
またはAが:
Figure 2023518375000066
（式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）である。
化学式IIの化合物は:
Figure 2023518375000067
（式中、
R3が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;および
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル、
あるいはR4が、
Figure 2023518375000068
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）である。
いくつかの実施形態では、AP-1依存性遺伝子の発現および／またはMEK1-依存性遺伝子の発現および／またはERK1/2依存性遺伝子の発現および／またはERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現を低減させる化合物は、化学式I:
Figure 2023518375000069
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;
Gが、C=OもしくはC=N-OH; および
Aが:
Figure 2023518375000070
（式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）;
またはAが:
Figure 2023518375000071
（式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）の化合物またはその医薬上許容し得る塩である。
式（I)のいくつかの実施形態では、XはFである。式（I)のいくつかの実施形態では、XはClである。式（I)のいくつかの実施形態では、XはBrである。式（I)のいくつかの実施形態では、XはIである。典型的には、Xは、FまたはClである。
式（I)のいくつかの実施形態では、GはC=Oである。式（I)のいくつかの実施形態では、GはC=N-OHである。
式（I)のいくつかの実施形態では、Aは、
Figure 2023518375000072
（式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）である。いくつかの実施形態では、pは2である。いくつかの実施形態では、R1は-CH3である。いくつかの実施形態では、pは2かつR1は-CH3である。
式（I)のいくつかの実施形態では、Aは、
Figure 2023518375000073
（式中、R2は直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）である。いくつかの実施形態では、R2は-CH3である。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物は、式（I-1):
Figure 2023518375000074
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI; および
Aが:
Figure 2023518375000075
（式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）; またはAが:
Figure 2023518375000076
（式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）の化合物、またはその医薬上許容し得る塩であってもよい。
いくつかの実施形態では、式（I-1)の化合物は、式（I-1a):
Figure 2023518375000077
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;
pが1、2、3もしくは4; および
R1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）の化合物であってもよい。
例えば、式（I-1a)の化合物は:
Figure 2023518375000078
であってもよい。
いくつかの実施形態では、式（I-1)の化合物は、式（I-1b):
Figure 2023518375000079
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;および
R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）の化合物であってもよい。
一実施形態では、式（I-1b)の化合物は、
Figure 2023518375000080
(本明細書ではT6とも称する)である。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物は、式（I-2):
Figure 2023518375000081
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;および
Aが:
Figure 2023518375000082
（式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）;
またはAが:
Figure 2023518375000083
（式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）の化合物であってもよい。
いくつかの実施形態では、式（I-2)の化合物は、式（I-2a):
Figure 2023518375000084
（式中、
Xが、F、Cl、BrもしくはI;
pが1、2、3もしくは4;および
R1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）の化合物であってもよい。
一実施形態では、式（I-2a)の化合物は:
Figure 2023518375000085
(本明細書ではT4とも称する)である。
いくつかの実施形態では、AP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2依存性遺伝子の発現および／またはERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現を低減させる化合物は、式（II):
Figure 2023518375000086
（式中、
R3が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル; および
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル、
またはR4が
Figure 2023518375000087
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキルである)）の化合物またはその医薬上許容し得る塩である。
式（II)のいくつかの実施形態では、R3は、直鎖状C1-C6アルキルまたは分枝状C1-C6アルキルである。式（II)のいくつかの実施形態では、R3は、-CH2CH3または-CH2CH(CH3)2である。
式（II)のいくつかの実施形態では、R4は、直鎖状C1-C6アルキルまたは分枝状C1-C6アルキルである。式（II)のいくつかの実施形態では、R4は、-CH2CH3または-CH2CH(CH3)2である。
式（II)のいくつかの実施形態では、R4は、
Figure 2023518375000088
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5は、直鎖状C1-C6アルキルまたは分枝状C1-C6アルキルである）である。式（II)のいくつかの実施形態では、qが2である。式（II)のいくつかの実施形態では、R5は、-CH3である。式（II)のいくつかの実施形態では、qは2およびR5は、-CH3である。
いくつかの実施形態では、式（II)の化合物は、式（II-1):
Figure 2023518375000089
（式中、
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;
またはR4が:
Figure 2023518375000090
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）の化合物であってもよい。
例えば、式（II-1)の化合物は、以下:
Figure 2023518375000091
から選択されてもよい。
いくつかの実施形態では、式（II)の化合物は、式（II-2):
Figure 2023518375000092
（式中、
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;または
R4が:
Figure 2023518375000093
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）の化合物であってもよい。
例えば、式（II-2)の化合物は:
Figure 2023518375000094
であってもよい。
一実施形態では、式（II)の化合物は:
Figure 2023518375000095
(本明細書ではBT2とも称する)である。
いくつかの実施形態では、AP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2依存性遺伝子の発現および／またはERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現を低減させる化合物は、以下:
Figure 2023518375000096
またはその医薬上許容し得る塩から選択される。
別の形態では、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を投与することを含む、対象者における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖の低減方法を提供する。
別の態様は、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を投与することを含む、血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する状態の治療または予防方法を提供する。
一態様において、以下:
Figure 2023518375000097
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩の有効量を投与することを含む、血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する状態の治療または予防方法を提供する。
一実施形態では、化合物は、式：
Figure 2023518375000098
の化合物またはその医薬上許容し得る塩である。
一実施形態では、化合物は、式：
Figure 2023518375000099
の化合物またはその医薬上許容し得る塩である。
一実施形態では、化合物は、式：
Figure 2023518375000100
の化合物またはその医薬上許容し得る塩である。
別の態様は、下記一般式:
Figure 2023518375000101
の化合物またはその医薬上許容し得る塩を提供する。
一態様において、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を投与することを含む、細胞中のAP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2依存性遺伝子の発現および／またはERK1/2リン酸化および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現を低減させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は対象の細胞である。
別の態様は、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を細胞に接触させることを含む、細胞中のAP-1依存性遺伝子発現および／またはERK1/2依存性遺伝子の発現および／またはERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現を低減させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は対象の細胞である。
別の態様は、以下:
Figure 2023518375000102
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩の有効量を細胞に接触させることを含む、細胞中のAP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2依存性遺伝子の発現および／またはERK1/2リン酸化および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現を低減させる方法を提供する。
一実施形態では、AP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2依存性遺伝子の発現および／またはERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現を低減させる化合物は、
Figure 2023518375000103
またはその医薬上許容し得る塩である。
一実施形態では、対象の細胞中のAP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2依存性遺伝子の発現および／またはERK1/2リン酸化および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現は低減した。別の実施形態では、インビトロでの細胞中のAP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2依存性遺伝子の発現および／またはERK1/2リン酸化および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現は低減した。
医薬上許容される塩の例としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、アルキルアンモニウムなどの医薬上許容されるカチオンの塩；塩酸、正リン酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸、臭化水素酸などの医薬上許容される無機酸の酸付加塩、または酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、クエン酸、乳酸、ムチン酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、トリハロ酢酸（例、トリフルオロ酢酸）、メタンスルホン酸、トリハロメタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、サリチル酸、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸および吉草酸などの医薬上許容される有機酸の酸付加塩が挙げられる。
一実施形態では、化学式IまたはIIの化合物またはその医薬上許容し得る塩は、重水素化されている。
一実施形態では、化学式IまたはIIの化合物またはその医薬上許容し得る塩は、E異性体である。
一実施形態では、化学式IまたはIIの化合物またはその医薬上許容し得る塩は、Z異性である。
一実施形態では、化学式IまたはIIの化合物またはその医薬上許容し得る塩は、E異性体およびZ異性体の混合物である。
本明細書に記載されているのは、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩を含む医薬組成物である。
一実施形態では、下記一般式:
Figure 2023518375000104
の化合物またはその医薬上許容し得る塩を含む医薬組成物を提供する。
一実施形態では、医薬組成物は、化合物:
Figure 2023518375000105
またはその医薬上許容し得る塩を含む。
別の実施形態では、医薬組成物は、化合物:
Figure 2023518375000106
またはその医薬上許容し得る塩を含む。
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の発明の方法において使用してもよい。
薬学的に組成物は、典型的に医薬上許容される担体を含む。
式IおよびIIの化合物は、AP-1および／またはERK1/2および／またはFosB/ΔFosB、および／またはVCAM-1、および／またはVEGF-A、および／またはIL-1βを介するいかなる疾患または状態の治療に使用してもよい。疾患または状態は、そのタンパク質またはタンパク質複合体の活性が、疾患または状態の発症、および／または維持に必要である場合、そのタンパク質またはタンパク質複合体に介される。
式IおよびIIの化合物は、血管透過性、新血管形成、血管新生、炎症、細胞移動および／または細胞増殖に関連する疾患または状態を治療または予防するために使用することができる。
一実施形態では、疾患または状態は、血管透過性に関連している。血管透過性は、急性および慢性炎症、創傷治癒および病的血管新生中の癌などの多くの疾患プロセスにおける重要な特徴である。血管透過性は、糖尿病性網膜症における黄斑浮腫につながる網膜漏出や関節リウマチにおける炎症を引き起こす。
いくつかの実施形態では、血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態は、AP-1、および／またはFosB/ΔFosBおよび／またはERK1/2および／またはVCAM-1および／またはVEGF-Aおよび／またはIL-1βを介する疾患または状態である。
血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態としては、例えば、網膜血管の透過性、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、関節リウマチ、組織浮腫、炎症(急性および慢性)、狭窄、心筋梗塞における組織損傷、加齢黄斑変性、肺繊維症、肺炎症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、末梢血管疾患、脳卒中などが挙げられる。
従って、いくつかの実施形態では、血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態は、以下:
関節炎;
関節リウマチ;
骨破壊;
加齢黄斑変性;
糖尿病性網膜症;
黄斑浮腫;
血管漏出;
網膜血管の透過性;
内皮細胞機能不全;
アテローム性動脈硬化症;
脳卒中;
心筋梗塞;
末梢血管疾患;
狭窄;
再狭窄;
サイトカインストーム;
肺炎症;
肺繊維症、からなる群より選択される。
実施例で説明するように、本発明者は、化合物BT2の投与が、VEGFA165によって誘発される血管透過性を抑制または低減させ、レーザー誘発眼血管漏出を抑制または低減させることを示した。さらに、本発明者は、BT2の投与が、コラーゲン抗体誘発関節炎モデルにおける炎症および骨破壊を低減することを示した。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩の有効量を投与することを含む、血管透過性に関連する疾患または状態の治療または予防方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、網膜血管の透過性の治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、糖尿病性網膜症の治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、黄斑浮腫の治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、加齢黄斑変性の治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、骨破壊および／または関節炎の治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、関節リウマチの治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、慢性または急性炎症の治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、血管新生の低減を必要とする対象におけるその低減方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、内皮細胞機能不全の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、組織浮腫の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、狭窄の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、肺繊維症の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、肺炎症の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、アテローム性動脈硬化症の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、心筋梗塞の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、末梢血管疾患の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一態様において、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、脳卒中の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
いくつかの実施形態では、式（II)の化合物は、式（II-1):
Figure 2023518375000107
（式中、
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;
またはR4が:
Figure 2023518375000108
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）の化合物であってもよい。
例えば、式（II-1)の化合物は、以下:
Figure 2023518375000109
から選択されてもよい。
いくつかの実施形態では、式（II)の化合物は、式（II-2):
Figure 2023518375000110
（式中、
R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;
またはR4が:
Figure 2023518375000111
（式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）の化合物であってもよい。
例えば、式（II-2) の化合物は以下:
Figure 2023518375000112
であってもよい。
典型的には、式（II)の化合物が以下:
Figure 2023518375000113
またはその医薬上許容し得る塩であってもよい。
一態様において、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、血管透過性に関連する眼の疾患または状態の治療または予防方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、網膜血管の透過性の治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、糖尿病性網膜症の治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、黄斑浮腫の治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、加齢黄斑変性の治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、骨破壊および／もしくは関節炎の治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、関節リウマチの治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、慢性もしくは急性炎症の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、血管新生の低減を必要とする対象におけるその低減方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、内皮細胞機能不全の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、組織浮腫の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、狭窄の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、肺繊維症の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、肺炎症の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、アテローム性動脈硬化症の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、心筋梗塞の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一実施形態では、有効量のBT2の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、末梢血管疾患の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
一実施形態では、有効量の化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与することを含む、脳卒中の治療または低減を必要とする対象におけるその治療または低減方法を提供する。
本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の化合物またはその医薬上許容し得る塩および医薬上許容される担体を含む医薬組成物の投与を含んでもよい。
本明細書に記載のものは、化学式IもしくはIIの化合物またはその医薬上許容し得る塩および医薬上許容される担体を含む医薬組成物である。
一実施形態では、化学式IまたはIIの化合物は、BT2、T4およびT6から選択される。
いくつかの実施形態では担体は、非天然起源の担体である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物またはその医薬上許容し得る塩は、1つ以上の他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。
本明細書に記載の化合物またはその医薬上許容し得る塩を1つ以上の他の薬剤との併用投与は、同時投与、順次投与または別個の投与であってもよいことが理解されよう。
「組成物」という用語は、活性成分と従来の担体および賦形剤とを含む製剤、ならびに活性成分（他の担体を含むまたは含まない）がカプセル化担体によって囲まれているカプセルを提供するために担体としてカプセル化材料を含む製剤も包含する。医薬組成物において、担体は、組成物の他の成分と相溶しうる、対象に対して劇的に変化しないことを意味する「医薬上許容される」ものである。本発明の医薬組成物は、上記のような他の薬剤またはさらなる活性剤を含んでもよく、例えば、従来の固体または液体のビヒクルまたは希釈剤、ならびに所望の投与様式に適したタイプの医薬添加物（例えば、賦形剤、結合剤、保存剤、安定化剤、香料など）を、医薬製剤の当技術分野で周知の技術に従って用いることにより、製剤化してもよい(参照、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., 2005, Lippincott Williams & Wilkins)。
医薬組成物は、硝子体内、経口、直腸、鼻腔、局所（皮膚、頬、舌下を含む）、膣または非経口（筋肉内、皮下、静脈内を含む）投与に適していてもよいし、吸入またはガス注入による投与に適した形態であってもよい。
このようにして、本明細書に記載の化合物またはその医薬上許容し得る塩は、医薬上許容される担体と一緒に、医薬組成物およびその単位剤形の形態にすることができる。医薬組成物は、経口投与のための、錠剤や充填カプセル剤などの固体であってもよいし、溶液、懸濁液、乳剤、エリキシル剤、またはそれらを充填したカプセル剤などの液体であってもよい。医薬組成物は、硝子体内投与のための、溶液、懸濁液、または乳剤などの液体であってもよい。また、医薬組成物は、直腸投与のための坐剤の形態であってもよく、非経口（皮下など）使用のための無菌注射用溶液の形態であってもよい。
かかる医薬組成物およびその単位剤形は、従来の割合で従来の成分を含み、追加の活性化合物または有効成分があってもなくてもよく、かかる単位剤形は、採用される意図された一日投与量範囲に見合った活性成分の任意の適切な有効量を含むことができる。
本明細書に記載の化合物から医薬組成物を調製するために、医薬上許容される担体は、固体または液体のいずれであってもよい。固体形態の製剤としては、粉末、錠剤、丸薬、カプセル剤、カシェ剤、ロザンジ（固体またはチュアブル）、坐剤、および調剤可能な顆粒が挙げられる。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤、またはカプセル化材料としても作用し得る1つ以上の物質であり得る。
好適な担体としては、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバター等を挙げることができる。経口投与に適した固体形態としては、錠剤、粉末、カプセル剤、丸薬、カシェ剤、トローチなどを用いることができる。
液体形態製剤としては、溶液、懸濁液および乳剤、例えば、水または水－プロピレングリコール溶液が挙げられる。例えば、非経口注射用液体製剤は、ポリエチレングリコール水溶液の溶液として製剤化することができる。
無菌性液体形態組成物としては、無菌性溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。活性成分は、滅菌水、滅菌有機溶媒または両者の混合物などの医薬上許容される担体中に溶解または懸濁させることができる。
したがって、本発明による医薬組成物は、非経口投与（例えば、注射、例えばボーラス注射または持続注入による）のために製剤化され、アンプル、プレフィルドシリンジ、少量注入または防腐剤を添加したマルチ用量容器中の単位剤形で提示され得る。医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳剤などの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含むことができる。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば無菌、パイロジェンフリー水で構成されるための無菌性固体の無菌分離または溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態であってもよい。
注射用の用途に適した医薬的形態としては、無菌性注射用の溶液または分散液、および無菌性注射用の溶液を即座に調製するための無菌性粉末が挙げられる。これらは、製造および保存の条件下で安定的に保存されるべきであり、酸化および細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護されうる。
注射用の溶液または分散液の溶媒または分散媒は、従来の注射用の溶液または分散液の溶媒または担体系のいずれを含んでもよく、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適当な混合物および植物油などを含んでもよい。
注射用の用途に適した医薬品の形態は、静脈内、筋肉内、脳内、くも膜下腔内、硬膜外注射または注入などの任意の適切な経路で送達することができる。
無菌注射用の溶液は、必要な量の活性成分を、必要に応じて上記に列挙したような種々の他の成分とともに適切な溶媒中に組み入れ、次いでろ過滅菌することにより調製される。一般的には、分散液は、基本的な分散媒と上記に列挙したものから必要な他の成分を含む無菌性ビヒクルに、滅菌した種々の活性成分を組み入れることにより調製される。無菌性注射用溶液の調製のための無菌性粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望成分との予め無菌ろ過された溶液の真空乾燥または凍結乾燥である。
本明細書に記載の化合物は、経口投与に適した組成物、例えば、同化可能な食用担体と共に、またはハードもしくはソフトシェルゼラチンカプセルに封入し、または錠剤に圧縮し、または食餌と直接組み入れて製剤化することができる。経口治療上の投与の場合、活性化合物は賦形剤と共に組み入れられ、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウエハ剤などの形態で使用することができる。
治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な投与量が得られるのに十分な量であるべきである。
また、本発明の錠剤、トローチ、ピル、カプセル、トローチ剤、インプラント等は、以下に列挙するような成分を含んでもよい：ガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；ショ糖、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤、ペパーミント、ウィンターグリーン、サクラ香料などの香味剤などが添加されていても良い。投与単位形態がカプセル剤の場合、上記の種類の材料に加えて、液体担体を含んでもよい。
他の様々な材料は、コーティングとして、または他の方法で投与単位の物理的形態を変更するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、シェラック、糖またはその両方でコーティングされてもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素、およびチェリーまたはオレンジ風味などの香料を含むことができる。もちろん、任意の投与単位形態の調製に使用される材料は、採用される量において、薬学的に純粋であり、実質的に無毒であるべきである。さらに、活性成分は、腸の特定領域への活性成分の特定の送達を可能にするものなど、徐放性製剤および製剤に組み入れることができる。
経口使用に適した水溶液は、活性成分を水に溶解し、所望により適当な着色剤、香料、安定化剤および増粘剤を添加することにより調製することができる。経口使用に適した水性懸濁剤は、細かく分割した活性成分を、天然または合成ガム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、または他の公知の懸濁化剤などの粘性材料とともに水中に分散させることにより作製することができる。
医薬上許容される担体としては、医薬上許容されるあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤などが挙げられる。
また、使用直前に経口投与用液体形態の製剤に変換することを意図した固体形態製剤も挙げられる。かかる液体形態としては、溶液、懸濁剤および乳剤が挙げられる。これらの製剤は、活性成分に加えて、着色剤、香料、安定剤、緩衝液、人工および天然の甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含んでもよい。
局所投与のために、本明細書に記載の化合物は、適切な増粘剤および／またはゲル化剤の添加により、水性または油性基剤として製剤化されてもよい。ローションは、水性または油性基剤で製剤化されてもよく、一般的に、1つ以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤または着色剤も含有するだろう。
口腔内への局所投与に適した製剤としては、活性剤をフレーバー基剤、通常はスクロースとアカシアまたはトラガカントを含むロゼンジ；活性剤をゼラチンとグリセリンまたはスクロースとアカシアなどの不活性基剤中に含むパスティル；および活性剤を適切な液体担体中に含む洗口剤などが挙げられる。
点鼻投与のための溶液または懸濁剤は、従来の手段、例えばスポイト、ピペットまたはスプレーを用いて、鼻腔に直接適用することができる。製剤は、単回投与または多回投与の形態で提供することができる。スポイトまたはピペットの場合、これは、患者が適切な所定量の溶液または懸濁剤を投与することによって達成され得る。スプレーの場合、これは例えば計量噴霧スプレーポンプによって達成することができる。鼻腔への送達および保持を改善するために、本発明の化合物はシクロデキストリンでカプセル化されてもよいし、鼻腔粘膜への送達および保持を強化すると期待される他の薬剤で製剤化されてもよい。
気道への投与は、活性成分が、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、またはジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスなど、クロロフルオロカーボン（CFC）などの適切な噴射剤と共に加圧パックで提供されるエアゾール製剤によって達成することもできる。
エアロゾルは、都合のいいことにレシチンなどの界面活性剤を含むこともできる。活性成分の用量は、計量バルブの提供によって制御されてもよい。
あるいは、活性成分は、乾燥粉末、例えば、ラクトース、デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドン（PVP）などのデンプン誘導体などの適切な粉末基剤中の化合物の粉末混合物の形態で提供されてもよい。好都合なことに、粉末担体は、鼻腔内でゲルを形成する。粉末組成物は、例えば、ゼラチンのカプセルまたはカートリッジ、またはブリスターパックにおいて単位剤形で提示されてもよく、そこから吸入器によって粉末を投与することができる。
鼻腔内製剤など気道への投与を意図した製剤においては、活性成分は一般的に、例えば5から10ミクロン以下のオーダーの小さな粒子径を有するだろう。かかる粒子径は、当技術分野で周知の手段、例えば微粉化によって得ることができる。
本明細書に記載の化合物は、眼球、眼内、硝子体内、または結膜下注射用の組成物に製剤化することができる。本明細書に記載の化合物は、点眼剤、コンタクトレンズ、またはインプラントによる投与のために製剤化することができる。インプラントは、眼球に硝子体内に注射されてもよい。インプラントは、化合物の一定の治療レベルを送達することを可能にし得る。かかる徐放性インプラントは、典型的には、シリコン、エチレンビニルアセテート（EVA）、またはポリビニルアルコール（PVA）などの非反応性物質で囲まれたペレット状の化合物コアで作られ、これらのインプラントは生分解性ではなく、数ヶ月から数年の間継続量の化合物を送達できる。マトリックスインプラントも使用され得る。マトリックスインプラントは、典型的には、ローディングドーズを送達し、その後、1日から6ヶ月の間に化合物を漸増投与するために使用される。ポリ乳酸（PLA）および／またはポリ乳酸グリコール酸（PLGA）のコポリマーから作られるのが最も一般的で、これらは水と二酸化炭素に分解される。
硝子体内投与用製剤は、1つ以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、浸透剤または懸濁化剤を含む水性基剤として製剤化することができる。
所望により、活性成分の徐放性を付与するように適合させた製剤を採用することもできる。
医薬製剤は、好ましくは単位剤形である。かかる形態では、製剤は、活性成分の適切な量を含む単位用量に細分化される。単位剤形は、包装製剤とすることができ、包装は、包装された錠剤、カプセル剤、およびバイアルまたはアンプル内の散剤などの製剤の個別の量を含む。また、単位用量は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤、またはロゼンジそのものであってもよいし、これらのいずれかの適当な数を包装した形態であってもよい。
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を用量単位形態で製剤化することが特に有利である。非経口組成物は、治療すべき対象への単位用量として適した物理的に個別の単位の形態であってもよく、各単位は、医薬的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性成分を含有する。
また、化合物が単位剤形である場合、担体の非存在下で投与することもできる。
「有効量」という用語は、所望の反応を達成するのに有効な化合物の量を意味する。
本明細書に記載の化合物またはその医薬上許容し得る塩の有効量は、特定の化合物に関心を有する当業者によって決定することができる。
任意の特定の対象に対する特定の用量レベルおよび投与頻度は変化し得、採用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用時間、対象の年齢、体重、一般的健康、性別および食事、投与の様式および時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、ならびに特定の状態の重症度など多様な因子に依存することが理解されるであろう。
本明細書に記載の化合物または本明細書に記載の化合物と組み合わせて投与されるさらなる活性剤の適切な投与量は、選択された本発明の特定の化合物またはさらなる活性剤に関心を有する当業者によって容易に決定することができる。
本明細書に記載の化合物が、1つ以上の剤、または他の活性剤と組み合わせて投与される場合、剤形およびレベルは、同時投与、順次投与、または別個の投与のいずれか、またはそれらの組み合わせのために製剤化され得ることがさらに理解されるであろう。
本発明の方法は、本発明の方法の利点を経験し得る任意の対象への使用を意図している。したがって、用語「対象」は、ヒトだけでなく、非ヒト哺乳類も含む。対象は、例えば、飼育動物、動物園の動物、または家畜であってもよい。
本発明者はまた、式IおよびIIの化合物が、例えば実験室用途において、インビトロでのAP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2依存性遺伝子の発現および／またはERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現の阻害に使用できることを想定している。
一つの態様は、有効量の式IまたはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩を細胞に接触させることを含む、インビトロでの細胞におけるAP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2-依存性の遺伝子発現を低減させる方法を提供する。
別の態様は、有効量の、以下:
Figure 2023518375000114
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩を細胞に接触させることを含む、インビトロでの細胞におけるAP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2-依存性の遺伝子発現の低減方法を提供する。
別の態様は、有効量の式IまたはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩を細胞に接触させることを含む、インビトロでの細胞におけるERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現の低減方法を提供する。
別の態様は、有効量の以下:
Figure 2023518375000115
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩を細胞に接触させることを含む、インビトロでの細胞中のERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現の低減方法を提供する。
別の態様は、有効量の式IまたはIIの化合物またはその医薬上許容し得る塩と一緒にERK1/2をインキュベートすることを含む、ERK1/2リン酸化の阻害方法を提供する。
別の態様は、有効量の以下:
Figure 2023518375000116
から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩と一緒にERK1/2をインキュベートすることを含む、ERK1/2リン酸化の阻害方法を提供する。
また式IまたはIIの化合物またはその医薬上許容し得る塩の製造方法を提供する。
本明細書において他に定義されない限り、以下の用語は、以下に続く一般的な意味を有するものと理解されるだろう。以下で参照される用語は、特に断りのない限り、その用語が単独で使用される場合、およびその用語が他の用語と組み合わせて使用される場合に、後に続く一般的な意味を有する。したがって、例えば、「アルキル」の定義は、「アルキル」ならびに「ハロアルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリールアルキル」等にも適用される。
用語「アルキル」は、直鎖または分岐鎖の飽和ヒドロカルビル基を指す。他に示されない限り、好ましいのは、C1-6アルキル基およびC1-4アルキル基である。用語「Cx-yアルキル」は、xおよびyを整数としたとき、xからy個の炭素原子を有するアルキル基を指す。例えば、用語「C1-6アルキル」は、1から6個の炭素原子を有するアルキル基を指す。C1-6アルキルの例としては、メチル（Me）、エチル（Et）、プロピル（Pr）、イソプロピル（i-Pr）、ブチル（Bu）、イソブチル（i-Bu）、secブチル（s-Bu）、tertブチル（t-Bu）、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「アルキル」は、基が2つの位置を介して結合しているような、1つ少ない水素原子を含むアルキル基、すなわち2価のものも包含する。
本明細書で使用する場合、「治療する」とは、対象、組織または細胞に影響を与え、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味し、状態を阻害する、すなわちその発症をアレストすること、または状態の影響を緩和または改善する、すなわち状態の影響の反転または後退を引き起こすことを含む。本明細書で使用する場合、「予防する」とは、状態を有する危険性のある細胞または対象に状態が生じるのを防ぐことを意味するが、必ずしもその状態が最終的に発症しないこと、または対象が状態を最終的に発症しないことを意味しない。予防は、細胞または対象における状態の発症を遅らせることも含む。
用語「有効量」とは、研究者、獣医師、医師または他の臨床医が求めている組織、システム、動物またはヒトの生物学的または医学的反応を引き出す化合物の量を指す。
Figure 2023518375000117
Figure 2023518375000118
本明細書に記載の化合物は、当技術分野で周知の方法により合成できる。本明細書においてBT2およびT6として参照される化合物は市販されている。例えば、BT2は、Aurora Building Blocks, USAまたはLife Chemicals HTS Compounds, Canadaから購入できる。T6は、例えばSigma-Aldrich, USAから購入できる。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、さらに以下に説明される。
転写因子、特に即時型遺伝子にコードされる転写因子は、細胞外環境からの合図とシグナル伝達および転写制御を統合している。転写因子が疾患を制御していることは明らかである一方、医薬品開発パイプラインは好調だが(Miyoshi, et al., J Invest Dermatol 131, 108-117 (2011); Cho, E.A., et al., The Lancet 381, 1835-1843 (2013)）、そのような因子を直接標的とする薬剤は市場に出ていない（Mappら、Nature Chemical Biology 11, 891-894 (2015)）。AP-1を含む塩基性領域ロイシンジッパー（bZIP）因子は、サイトカイン、増殖因子、ストレス、ウイルス・細菌感染などの様々な病的刺激に応答して遺伝子発現を制御する(Hess, et al., Journal of Cell Science 117, 5965-5973 (2004)）。FosB/ΔFosBなどのAP-1ファミリーメンバー（Chen, G., et al, Front Neurosci 11, 112 (2017)）は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）（Karin, M. J Biol Chem 270, 16483-16486 (1995)） の制御下にあり、サイトカイン、増殖因子、種々のストレス、ウイルス・細菌感染などの様々な病的刺激に応答して遺伝子発現を制御する（Hess, et al., Journal of Cell Science 117, 5965-5973 (2004)）。AP-1メンバーは、糖尿病性ヒト網膜で上昇（Oshitari, T. at el. Current Eye Research 39, 527-531 (2014)）、網膜剥離後の網膜細胞で発現している(Geller, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 42, 1363-1369 (2001)）。AP-1のDNA結合活性もヒトリウマチ滑膜で観察され、疾患活動性と関連している（Asahara, H., et al., Arthritis Rheum 40, 912-918 (1997)）一方でIL-1βはRAの骨および軟骨損傷のメディエータとして知られている（Duff, G.W. Cytokines and Rheumatoid Arthritis.IN CINICAL APPLICATIONS OF CUTOKINE: Role in Pathogenesis, Diagnosis, and Therapy (eds. Oppenheim, J.J., Rossio, J.L. & Gearing, A.J.H.) (Oxford University Press, Oxfrd, 1993)。AP-1阻害剤を臨床に移す試みがなされているが、有効な薬が少ないため、患者の使用には支障がある。
我々は、ハイスループットアプローチを採用し～10万化合物をスクリーニングし、これまで検討されていなかったBT2と名付けた新規のジベンゾオキサゼピノンを同定した。我々は、BT2が様々な増殖、遊走性血管新生および炎症プロセスを阻害することを見出した。BT2は、MEK1と直接優先的に相互作用してERKの活性化を阻害し、AP-1タンパク質FosB/ΔFosBならびにVCAM-1およびVEGF-A165の誘導性発現を抑制する。BT2はCD31と酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（tartrate-resistant acid phosphatase）(TRAP)の染色を抑制する。また、BT2は、ラットやウサギでは網膜血管の漏出を抑制し、マウスでは炎症と骨破壊を抑制する。BT2は煮沸に耐え、最大16ヶ月間生物学的に安定である。このように、BT2は血管新生、血管透過性、炎症の新しい薬理学的阻害剤であり、nAMD/DRやRA患者に対する可能性のある新治療手段を提示する。
材料および方法
化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニング。Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research (WEHI, Bundoora, Vic) の HTS Facility で、～10 万化合物の Lead Discovery Library から、384-ウェル マイクロタイタープレートのAP-1応答エレメント(293/AP-1-luc cell, Panomics, Fremont, CA)のマルチコピーでホタルルシフェラーゼ（Firefly luciferase）がドライブされるように市販のヒト胚性腎臓 (HEK)-293細胞ベースのアッセイを用いてヒットを選択した。簡単に言うと、細胞ベースのアッセイは、10% FBSを含むpH7.4のDMEM中の384ウェルプレートに5x103細胞をプレーティングすることを含んでいた。試験化合物の非存在下または存在下で、10ng/ml 2-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート(TPA)(Sigma, St Louis, MO)で細胞を誘導し、～18ｈ後、ルミノメーターを使用してルシフェラーゼ活性を測定した。一次スクリーニングのヒット率は2.4%であった。ヒット化合物を選び、3回シングルポイント再試験を行い、931個の試験化合物が50%以上阻害されることが再確認された。次に、パンアッセイ干渉化合物を除去するために部分構造フィルターを適用し (Baell, J.B., et al., J Med Chem 53, 2719-2740 (2010)）、最もストリンジェントな基準を用いて、さらなる研究のために256のヒットが選択された。用量反応試験の後、分子量<400 Daの24の化合物がサプライヤーから再注文され、二次アッセイで試験された。
化合物合成および精製。BT2、Cpd B/X/LK001および構造類縁体をAdvanced Molecular Technologies Pty Ltd (Scoresby, Vic)において合成および精製(>95%)または下記に示すような市販で入手した。
ジメチルホルムアミド（DMF）100ml中の2-アミノ-10-メチル-10H-ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11-オン (BT3) (35.0g, 137mmol)にジエチルピロカーボネート(22.2 ml, 24.43 g, 151 mmol)を加え、混合物を22℃で窒素雰囲気下1ｈ撹拌した。固体をろ過し、酢酸エチル(EtOAc)(100 ml)で洗浄し、純粋な初収穫物を得た。合わせた溶媒（DMFおよびEtOAc）を除去し、混合物をジクロロメタン（DCM）（200ml）中に溶解し、次いで水（100ml）で2回洗浄した。有機層を分離し、MgSO4で乾燥し、ろ過し、溶媒を除去して、黄色固体を得た。この固体をEtOAc中でスラリー化し、ろ過して純粋な無色固体を得た。収穫物を合わせて、35.0g（収率79％）の純粋な無色固体を得た。1H-NMR (400 MHz, D6-DMSO): δ=1.15-1.4 (m, 6H); 4.05-4.25 (m, 4H); 7.2 (m, 3H); 7.3 (d, 1H); 7.48 (d, 1H); 7.55 (d, 1H); 7.5 (bs, 1H); 9.7 (s, 1H) ppm.
イソブチル(10-エチル-11-オキソ-10,11-ジヒドロジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-2-イル) カルバメート (BT2-IC)。窒素雰囲気下、DMF50ml中の2-アミノ-10-メチル-10H-ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11-オン(1.5g, 5.89mmol, 1.0eq)に、ジイソブチルジカーボネート(1.55g, 7.08mmol, 1.2eq)を添加した。混合物を40℃（外部）で一晩撹拌した。溶媒を除去し、混合物をDCM（200ml）に溶解させ、水（150ml）で2回洗浄した。次に有機層をMgSO4で乾燥し、焼結漏斗上でろ過し、溶媒を除去して、粗生成物として3.0gの褐色固体を得た。この固体をシリカゲルとヘキサン：酢酸エチルの混合溶媒（ヘキサン中10％酢酸エチルから開始し、その後極性を20％に増加）でのカラムクロマトグラフィーにより精製し、微黄色固体として生成物を1.55g（74％）得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ=0.93 (s, 3H); 0.95 (s, 3H); 1.35 (t, 3H); 1.90-2.10 (m, 1H); 3.93 (d, 2H); 4.15 (q, 2H); 6.87 (s, 1H); 7.11-7.21 (m, 3H); 7.23-7.26 (m, 1H); 7.28-7.32 (m, 1H); 7.61 (d, 1H); 7.75 (brs, 1H).
N-(10-エチル-11-オキソ-10,11-ジヒドロ-ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-2-イル)-2-メトキシ-アセトアミド (BT2-MeOA)。窒素雰囲気下、DMF 60ml中のメトキシ酢酸(1.169g, 0.996ml, 12.9mmol, 1.1eq)に、カルボニルジイミダゾール(2.487g, 15.0mmol, 1.3eq)を添加した。混合物を30min撹拌した。次に、2-アミノ-10-メチル-10H-ジベンゾ[b,f][1,4] オキサゼピン-11-オン(3.0g, 11.8mmol, 1.0eq)を加え、反応物を30℃(外部)で一晩撹拌反応した。溶媒を除去し、水(200ml)およびDCM (200ml)を混合物に加え、2M HClでpH 6に酸性化した。有機相を50mlの水で2回洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、焼結漏斗上でろ過し、溶媒を除去して3.7gの粘着性黄色固体を得た。粗生成物をヘキサン中50%酢酸エチルのカラムクロマトグラフィーで精製し、生成物3.26g(85%)を微褐色固体として得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ=1.22 (t, 3H); 3.35 (s, 3H); 3.95 (s, 2H), 4.1 (m, 2H); 7.2-7.3 (m, 3H); 7.35 (d, 1H); 7.52 (d, 1H); 7.8 (d, 1H); 8.03 (s, 1H); 9.9 (s, 1H) ppm.
(11-オキソ-10-プロピル-10,11-ジヒドロ-ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-2-イル)-カルバミン酸エチルエステル (BT2-Pr)。窒素雰囲気下、DMF70ml中の2-アミノ-10-プロピル-10H-ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11-オン (2.4g, 9.43mmol, 1.0eq)に、ジエチルピロカーボネート(2.30g, 14.16mmol, 1.5eq)を添加した。混合物を40℃（外部）で一晩撹拌した。溶媒を除去し、混合物をDCM(200ml)に溶解し、水(150ml)で2回洗浄した。有機層を分離し、MgSO4で乾燥し、焼結漏斗上でろ過し、溶媒を除去して、粗生成物として3.0gの褐色固体を得た。この固体をヘキサン中20%酢酸エチルでのカラムクロマトグラフィーにより精製し、微黄色固体として純粋な化合物2.2g(72%)を得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ=1.30 (t, 3H); 3.40 (s, 3H); 3.80(t, 2H); 4.20-4.25 (m, 4H); 6.60 (s, 1H); 7.13-7.26 (m, 5H); 7.55-7.60 (m, 2H); 7.68 (s, 1H) ppm.
[10-(2-メトキシ-エチル)-11-オキソ-10,11-ジヒドロ-ジベンゾ[b,f][1,4] オキサゼピン-2-イル]-カルバミン酸エチルエステル (BT2-EOMe)。窒素雰囲気下、DMF90ml中の2-アミノ-10-(2-メトキシ-エチル)-10H-ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11-オン(2.9g, 10.2mmol, 1.0eq)にジエチルピロカーボネート(1.82g, 11.22mmol, 1.1eq)を加えた。混合物を40℃（外部）で一晩撹拌した。溶媒を除去し、混合物をDCM(200ml)に溶解し、有機相を水(150ml)で2回洗浄した。有機層を分離し、MgSO4で乾燥し、焼結漏斗上でろ過し、溶媒を除去して、粗生成物として3.6gの褐色固体を得た。この固体をヘキサン中30% EtOAcでカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色固体として純粋な化合物3.5g(96%)を得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ=1.30 (t, 3H); 3.40(s, 3H); 3.80(t, 2H); 4.20-4.25 (m, 4H); 6.60 (s, 1H); 7.13-7.26 (m, 5H); 7.55-7.60 (m, 2H); 7.68 (s, 1H) ppm.
エチル (11-(オキセタン-3-イルメチル)ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-2-イル)-カルバメートおよび(BT2-IMO)およびエチル (10-(オキセタン-3-イルメチル)-11-オキソ-10,11-ジヒドロ-ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-2-イル)-カルバメート (BT2-MO)。窒素雰囲気下、2-ニトロ-10H-ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11-オン(3)(図 6B、スキーム3)(7.5g, 0.029mol, 1.0eq)を100 mlのDMFに加え、5min撹拌した。その後、NaH(1.4g,油中2.34g (60%), 0.058mol, 2.0eq)を少量ずつ加えた（発熱が確認された）。混合物を40℃（外部）で35min撹拌した。次に、オキセタン-3-イルメチルメタンスルホネート(9.73g, 0.058mol, 2.0eq)を加え、反応は40℃(外部)で3h撹拌した。反応完了後、ヘキサン中20%酢酸エチルでTLCを行った。反応が完了したら、溶媒をクーゲル（100℃、完全真空）で除去し（または、浴温を70℃以下に保つ強力なポンプを使用したロータリーエバポレーターで）、水（300ml）を添加した。固体をスパチュラで撹拌し、水中に沈殿させた。ろ過後、固体を80℃一晩真空オーブンで乾燥させた。粗生成物混合物をシリカゲルとヘキサン：酢酸エチルの混合物（ヘキサン中20％酢酸エチルから開始し、その後極性を40％に増加）上のカラムクロマトグラフィーによって精製した。最初のバンドはO-アルキル化化合物(RF=0.65)であった。
O-アルキル化化合物収量1.0g(収率13%)を微黄色固体として得た。融点は135～137℃(補正後)である。1H-NMR (400 MHz, D6-DMSO): δ=3.42-3.57 (m, 1H); 4.53 (t, 2H); 4.65 (d, 2H); 4.74-4.79 (app. dd, 2H); 7.19-7.27 (m, 3H); 7.32-7.36 (m, 1H); 7.62 (d, 1H); 8.38 (d, 1H); 8.47 (dd, 1H) ppm.
次に、O-アルキル。2-ニトロ-11-(オキセタン-3-イルメチル)ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11(10H)-オン (1.5g, 4.6mmol, 1.0eq)に50ml MeOHを添加した。混合物を40℃(外部)で15min撹拌し、固形分をすべて溶解させた。反応混合物を22℃に冷却し、フラスコを窒素でフラッシングした。10%Pd/C(200mg)を添加し、H2雰囲気下、40℃(外部)で1ｈ水素化反応させた。溶媒を除去して1.2g(収率 98%)の黄色固体を得、これをさらに精製せずに次の工程に使用した(純度≧97%)。融点：150～152℃(補正後)。1H-NMR (400 MHz, D6-DMSO): 4.48-4.60 (m, 4H); 4.72-4.78 (app. dd, 2H); 5.2 (s, 2H), 6.71-6.75 (m, 2H); 6.95-6.99 (m, 1H); 7.07-7.20 (m, 4H) ppm.
最後に、O-アルキル。2-アミノ-10-(オキセタン-3-イルメチル)ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11(10H)-オン (1.2g, 4.05mmol, 1.0eq)にジエチルピロカーボネート（0.98g、6.07mmol、1.5eq）を添加した。混合物を40℃(外部)で一晩撹拌した。溶媒を除去し、混合物をDCM（150ml）に溶解させ、水（150ml）で2回洗浄した。次に、有機層をMgSO4で乾燥し、焼結漏斗上でろ過し、溶媒を除去して、粗生成物として1.31gの微黄色固体を得た。粗生成物（1.3g）を、ヘキサン：酢酸エチルの混合溶媒（ヘキサン中20％酢酸エチルから開始し、その後極性を35％に増加）を用いたシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによって精製した。
BT2-IMO。第一に0.5g (34% 収率)を無色固体として得た。融点は、159～162℃である(補正後)。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ=1.30 (t, 3 H); 3.47-3.59 (m, 1 H), 4.22 (q, 2H); 4.63-4.68 (m, 4H); 4.88-4.93 (m, 2 H); 6.60 (s, 1 H); 7.07-7.260 (m, 5 H); 7.50-7.59 (m, 2 H) ppm.
3.5gのN-アルキル化化合物(48% 収率)を微黄色固体として得た(RF= 0.45)。融点は、106～109℃である(補正後)。1H-NMR (400 MHz, D6-DMSO) δ=3.17-3.28 (m, 1 H); 4.29 (t, 2 H); 4.47 (br d, 2H); 4.53-4.58 (app. dd, 2H); 7.26-7.37 (m, 2H); 7.46 (dd, 1H); 7.57-7.64 (m, 2H); 8.40 (dd, 1 H); 8.46 (d, 1 H) ppm.
次に、N-アルキル。水素添加用にセットした250mlのRBFに、2-ニトロ-10-(オキセタン-3-イルメチル)ジベンゾ[b,f][1,4] オキサゼピン-11(10H)-オン (2.5g, 6.12 mmol, 1.0 eq)および50mlのMeOHを加えた。混合物を40℃（外部）で15min撹拌し、すべての固形物を溶解させた。フラスコを22℃に冷却し、再び窒素でフラッシングした。10％Pd/C（200mg）を加え、混合物を水素雰囲気下、40℃（外部）、1h、大気圧で撹拌した。混合物をセライトでろ過し、溶媒を除去して、さらに精製することなく次の工程に使用する純粋な無色固体(1.8g, 99% 収率)を得た。融点: 62～72℃(補正後)。1H-NMR (400 MHz, D6-DMSO) δ=3.1１－３個の.22 (m, 1H); 4.26 (t, 2H); 4.53 (app. dd, 2H); 5.17 (br s, 2H), 7.67 (dd, 1H); 6.85 (d, 1H); 6.95 (d, 1H); 7.17-7.29 (m, 3H); 7.49 (dd, 1H) ppm.
最後に、N-アルキル。2-アミノ-10-(オキセタン-3-イルメチル)ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11(10OH)-オン (1.6g, 5.49mmol, 1.0eq)とジエチルピロカーボネート(1.44g, 8.91mmol, 1.5eq)を50mlのDMF中に添加した。混合物を40℃（外部）で1ｈ撹拌した。溶媒を除去し、混合物をDCM(150ml)に溶解し、水(150ml)で2回洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、焼結漏斗上でろ過し、溶媒を除去して、ヘキサン中50％EtOAcを用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した粗生成物を得た。BT2-MO (1.91g, 87%収率)を無色固体として得た。融点：161～162℃(補正後)。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ=1.30 (t, 3H); 3.36-3.48 (m, 1H), 4.20 (q, 2H); 3.80 (t, 2H); 4.31-4.55 (m, 4 H); 4.70-4.76 (m, 2H); 6.65 (s, 1H); 7.13-7.26 (m, 5H); 7.57 (d, 1H); 7.70 (s, 1H) ppm.
2-メトキシエチル[[[4-(4-クロロベンゾイル)フェニル]アミノ]カルボニル]カルバメート (Cpd B/X/LK001)。DCM（150ml）中の(4-アミノ-フェニル)-(4-クロロ-フェニル)-メタノン(49.1g, 210mmol)の溶液を氷／NaCl浴で～0℃（内部温度）に冷却した。DCM（150ml）中の2-メトキシエチルカーボンイソシアナチデート（2-methoxyethyl carbonisocyanatidate）（40g、276mmol）を、内部温度を5℃以下に保ちながら滴下ロートを介して添加した。氷浴を除去し、溶液を窒素下22℃で1ｈ撹拌した。溶液をろ過し、固体をメタノールで洗浄し、所望の生成物の純粋な微黄色収穫物を得た。ろ液を濃縮し（DCMとMeOHの混合物）、ろ過し、メタノールで洗浄することにより、さらなる収穫物が得られた。画分を合わせて49g(62%)の所望の生成物を得た。1H-NMR (400 MHz, D6-DMSO) δ=10.52 (s, 1H, NH), 10.10 (s, 1H, NH), 7.75-7.68 (m, 6H), 7.62 (d, 2H), 4.80 (t, 2H), 3.58 (t, 2H), 3.28 (s, 3H) ppm.
2-メトキシエチル[[[4-(4-クロロフェニル)(ヒドロキシイミノ)メチル) フェニル]アミノ]カルボニル]カルバメート(T4)。2-メトキシエチル[[[4-(4-クロロベンゾイル)フェニル]アミノ]カルボニル]カルバメート (20.7g, 55mmol)、塩酸ヒドロキシルアミン (11.4g, 165mmol)および酢酸ナトリウム(13.5g, 165mmol)を窒素雰囲気下還流で4ｈ撹拌した。反応混合物を熱時ろ過し、塩類を除去した。ろ液を冷却し、生成物をろ過した。ろ液を三分の二に濃縮し、22℃に冷却してろ過し、第二の収穫物を得た。この固体を60℃で真空乾燥し、所望の生成物(15.8g, 73%)を得た。EおよびZ異性体の混合物(～1:1)として1H-NMR (400 MHz, D6-DMSO) δ=11.43 (s, 0.46H, OH), 11.32 (s, 0.62H, OH), 10.42 (bs, 1H, NH), 9.90 (s, 0.49H, NH), 9.88 (s, 0.63H, NH), 7.59 (d, 0.94H), 7.52 (t, 2.44H), 7.42 (q, 1.92H), 7.35-7.25 (m, 3.44H), 4.28 (m, 2H), 3.58 (m, 2H), 3.27 (s, 1.28H), 3.28 (s, 1.72H) ppm.
エチル (10-エチル(2',2',2'-d3)-11-オキソ-10,11-ジヒドロジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-2-イル)カルバメート (BT2-deut)。まず、2-ニトロ-10H-ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11-オン(1 g, 3.9 mmol, 1 eq)を10 mlのDMFに加え、窒素下で5min撹拌した。次に、NaH (187 mg, 油中0.32 g, 7.8 mmol, 2 eq) を少量ずつ添加した。混合物を外部40℃で35min撹拌した。次に、エチルヨード-2,2,2-d3 (1.24g, 0.62mL, 7.8mmol, 2 eq)を加え、反応物を外部40℃で3ｈ撹拌した。溶媒を蒸発させて除去し、水で3回トリチュレーションすると濃厚なペーストに変化し、これをヘキサン中15％EtOAcを用いて溶出するクロマトグラフィーにかけて、10-(エチル-2,2,2-d3)-2-nitroジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11(10H)-オンを黄色固体として得た（0.42g、38％）。融点は142.3℃から145.6℃（補正後）である。1H-NMR (400 MHz, D6-DMSO): δ = 4.12 (app s, 2H), 7.25 to 7.38 (m, 2H), 7.45 (dd, 1H), 7.60 (dおよびdd, 2H), 8.41 (dd, 1H),および8.45 (d, 1H) ppm.
次に、10-(エチル-2,2,2-d3)-2-ニトロジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11(10H)-オン (0.4 g, 1.41 mmol, 1 eq)およびSnCl2 （0.8 g，4.2 mmol，3 eq）を10 ml の EtOH 中に溶解させた。混合物を還流で2ｈ撹拌した。溶媒を除去し、混合物をEtOAc (100 ml)および1N NaOH aq. (50 ml)に溶解させた。有機相を分離し、水（2×50ml）で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、溶媒を蒸発させた。ヘキサン中50％EtOAcで溶出するクロマトグラフィーにより、生成物2-アミノ-10-(エチル-2,2,2-d3)ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11(10H)-オンを淡ベージュ色の固体（287mg、80％）として得た。融点は165.5℃から167.0℃（補正後）である。1H-NMR (400 MHz, D6-DMSO): δ = 4.0 (bq, 2H), 5.15 (s, 2H), 6.65 (dd, 1H), 6.84 (d, 1H), 6.95 (d, 1H), 7.15 to 7.30 (m, 3H),および7.45 (dd, 1H) ppm.
最後に、DMF（3 ml）中の2-アミノ-10-(エチル-2,2,2-d3)ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11(10H)-オン (0.287 g, 1.2 mmol, 1 eq)にジエチルピロカーボネート(0.183 ml, 0.201 g, 1.24 mmol, 1.1 eq)を添加した。混合物を窒素下、外部25℃で1ｈ撹拌した。反応混合物からDMFを除去し、残留する固体をEtOAcで3回トリチュレートして、BT2-deutを無色固体として得た（260 mg, 66 %）。融点は184.3℃から185.7℃（補正後）である。1H-NMR (400 MHz, D6-DMSO): δ =1.22 (t, 3H), 4.00 to 4.15 (qおよびbr q, 4H), 7.2-7.3 (m, 3H), 7.35 (dd, 1H), 7.50 (dd, 1H), 7.58 (dd, 1H), 7.80 (d, 1H),および9.75 (s, 1H) ppm.
フルベンダゾール (T6), 2-アミノ-10-エチルジベンゾ[b,f][1,4] オキサゼピン-11 (10H)-オン (BT3)および(4-アミノフェニル)(4-フルオロフェニル)メタノン (T7)は、AK Scientific Inc.から市販で入手できる。
細胞培養。HMEC-1はATCC（Rockville，MD）から入手し、10％FBS、ヒドロコルチゾン（1μg／ml）、上皮増殖因子（10ng／ml）、L-グルタミン（2mM）およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したMCDB131培地（Invitrogen，MD）、pH7.4で増殖させた。ウシ大動脈内皮細胞（BAEC）は、Cell Applications（San Diego, CA）から初代細胞として入手し、10％FBSおよび抗生物質を補充したDMEM、pH7.4で増殖させた。BAECは4～6期の間の実験に使用された。細胞は0.05%トリプシン/5mM EDTAで剥離後、定期的に継代し、5%CO2の加湿雰囲気、37℃に維持した。
血清で処理した細胞の抽出物を用いたウェスタンブロット解析。HMEC-1（80～90%コンフルエント）をEGFまたはヒドロコルチゾンを含まない無血清MCDB131培地で20ｈアレストさせた。細胞を無血清MCDB131培地で30μMの化合物で4ｈ処理し、培地を30μMの化合物を含む完全培地（EGFおよびヒドロコルチゾンを含む10％FBS入り）に変えて1ｈ処理した。プロテアーゼ阻害剤を含む放射性免疫沈降法（RIPA）溶解緩衝液中で前述のように全タンパク質を採取した（Li, Y., et al., Int J Cardiol 220, 185-191 (2016)）。タンパク質を4～20％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）－ポリアクリルアミド勾配ゲル（Bio-Rad Mini-PROTEAN TGX）で分離し、Immobilon-P PVDF膜（Millipore、米国）に移した。膜を5％スキムミルクでブロックし、ウサギモノクローナルFosB（cat. 2251, 1:1000, Cell Signaling, USA）、ウサギモノクローナルc-Fos抗体（cat. 2250, 1:1000, Cell Signaling, USA）で4℃一晩インキュベートする、またはマウスモノクローンβ－アクチン抗体（cat. A5316, 1:30000, Sigma-Aldrich）を22℃で15minインキュベートし、西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ（cat. P0448, 1:1000, DAKO Cytomation, Denmark）またはヤギ抗マウス（cat. P0447, 1:1000, DAKO Cytomation, Denmark）抗体で1hインキュベートした。化学発光は、Western Lightning Chemiluminescence system (PerkinElmer, USA)およびImageQuantTM LAS 4000 biomolecular imager (GE Healthcare Life Sciences, USA)を用いて検出した。LAS 4000で感度／解像度を高く設定し、自動露光で作成した画像のバンド強度をNIH ImageJで定量化した。
IL-1βで処理した細胞の抽出物を用いたウェスタンブロット解析。HMEC-1（80～90％コンフルエント）を増殖因子を含まない無血清MCDB131培地（Invitrogen, MD）で48ｈアレストさせた。細胞を無血清培地中で30μMの化合物で4ｈ処理し、特に断りのない限り、同濃度の化合物を含む無血清培地中で20ng/ml IL-1β (Sigma, cat. SRE3083) とともに最大4ｈインキュベートした。全タンパク質は、プロテアーゼ阻害剤を含むRIPA緩衝液を用いて、前述のように採取した。タンパク質は4～20% (w/v) SDS-ポリアクリルアミド勾配ゲルで分離し、Immobilon-P PVDF膜に移した。膜を5%スキムミルクでブロックし、ウサギモノクローナルFosB (cat. 2251S, 1:1000, Cell Signaling, USA)、ウサギモノクローナルVCAM-1 (cat. 13662S, 1:1000, Cell Signaling, USA)、ウサギモノクローナル p44/42 MAPK (cat. 4695S, 1:1000, Cell Signaling, USA)、ウサギポリクローナル p38 MAPK (cat. 9212S, 1:1000, Cell Signaling, USA), ウサギポリクローナル SAPK/JNK (cat. 9252S, 1:1000, Cell Signaling, USA)、ウサギモノクローナルホスホ－SAPK/JNK (cat. 4671S, 1:1000, Cell Signaling, USA)、ウサギモノクローナルホスホ－p38 MAPK (cat. 4511S, 1:1000, Cell Signaling, USA)、もしくはマウスモノクローナルホスホ－p44/42 MAPK 抗体 (cat. 9106S, 1:2000, Cell Signaling, USA)と共に4℃で一晩、またはマウスモノクローナルβ－アクチン抗体(cat. A5316, 1:10000, Sigma-Aldrich)と共に22℃で1ｈインキュベートした。次に、膜を、西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次ヤギ抗ウサギ (cat. P0448, 1:1000, DAKO Cytomation, Denmark)またはヤギ抗マウス (cat. P0447, 1:1000, DAKO Cytomation, Denmark)抗体と共に1ｈインキュベートした。化学発光は、Western Lightning Chemiluminescence systemおよびImageQuantTM LAS 4000 biomolecular imagerを使用して検出した。LAS 4000で同じ設定で作成した画像のバンド強度を、NIH ImageJで定量化した。
iRNA実験。HMEC-1（70～80％コンフルエント）をハイドロコルチゾンまたはEGFを含まない無血清MCDB131培地で24ｈアレストし、ノンターゲッティングsiRNA（cat. D-001810-10-50, Dharmacon, USA）またはFosB siRNA（cat. L-010086-01-0020, Dharmacon, USA）またはVCAM-1 siRNA（cat. L-013351-00-0020, Dharmacon, USA）とDharma FECT1 トランスフェクション試薬（cat. T-2001-03, Dharmacon, USA）を24ｈ混合した。siRNA実験（0.6μM FosB, 0.6μM VCAM-1を使用）を、同じ濃度のノンターゲッティング負荷コントロールsiRNAで並べて実施した。無血清完全MCDB131培地中、20ng/mlのIL-1βで細胞をさらに2ｈまたは4ｈ刺激した。プロテアーゼ阻害剤と共にRIPA緩衝液を用いて全タンパク質を採取し、4～20% (w/v) SDS-ポリアクリルアミド勾配ゲルで分離し、Immobilon-P PVDF膜に移した。膜を5%スキムミルクでブロックし、ウサギモノクローナルFosB (cat. 2251S, 1:1000, Cell Signaling, USA)、ウサギモノクローナルVCAM-1(cat. 13662S, 1:1000, Cell Signaling, USA)抗体とともに4℃で一晩インキュベート、またはマウスモノクローナルβ－アクチン(cat. A5316, 1:10000, Sigma-Aldrich)抗体と共に22℃で1ｈインキュベーションした。膜を、西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次ヤギ抗ウサギ(cat. P0448, 1:1000, DAKO Cytomation, Denmark)またはヤギ抗マウス(cat. P0447, 1:1000, DAKO Cytomation, Denmark)Igと共に1ｈインキュベートした。化学発光は、Western Lightning Chemiluminescence systemおよびImageQuantTM LAS 4000 biomolecular imager を用いて検出した。
プラスミド過剰発現。HMEC-1を6ウェルプレートに播種し、70～80％のコンフルエントで、細胞を一晩血清（またはEGFおよびヒドロコルチゾン）を欠失させた。細胞を製造者のプロトコルに従って、Fugene 6（Promega）を用いて、6μgの示されたプラスミド（pcDNA3.1+/C-(K)DYK中）（GenScript、米国）でトランスフェクトさせた。プロテアーゼ阻害剤を含むRIPA緩衝液中のプラスミドトランスフェクションの18、24、48および72ｈ後に、全タンパク質ライセートを回収した。タンパク質は4～20% (w/v) SDS-ポリアクリルアミド勾配ゲルで分離し、Immobilon-P PVDF膜に移した。膜を5％スキムミルクでブロックし、ウサギモノクローナル p44/42 MAPK (cat. 4695S, 1:1000, Cell Signaling)、マウスモノクローナルホスホ－p44/42 MAPK抗体 (cat. 9106S, 1:2000, Cell Signaling)、ウサギモノクローナルFosB(cat. 2251S, 1:1000, Cell Signaling, USA)、ウサギモノクローナルVCAM-1 (cat. 13662S, 1:1000, Cell Signaling)またはマウスモノクローナルα－チューブリン(cat. T5168, 1:40000, Sigma)と共に4℃一晩インキュベートした。次に、膜を、西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次ヤギ抗ウサギ(cat. P0448, 1:1000, DAKO Cytomation, Denmark)またはヤギ抗マウス(cat. P0447, 1:1000, DAKO Cytomation, Denmark)抗体と共に1ｈインキュベートした。化学発光は、Western Lightning Chemiluminescence systemおよびImageQuantTM LAS 4000 biomolecular imagerを用いて検出した。
RNA-seq。HMEC-1は、10%FBSを含む完全MCDB131培地を用いて100mmシャーレ9枚に播種した。70～80%のコンフルエントな状態で、ヒドロコルチゾンやEGFを含まない無血清MCDB131培地で44ｈ増殖アレストさせた。細胞は、同じ培地中で30μM BT2で4ｈ前処理した後、20ng/mL IL-1βでさらに4ｈ刺激した。RNeasy Mini Kit(Qiagen, Amtsgericht Dusseldorf)を用いて全RNAを抽出した。簡単に言うと、細胞を予め冷却した1x PBSで2回洗浄し、TRIzol(Thermo Fisher Sci, Waltham, MA)を加えて細胞を溶解させた。クロロホルムを加え、13000rpm、15min、4℃で遠心分離を行った。全RNAを含む上層の水層を新しいマイクロチューブに移し、イソプロパノールを加えてRNeasyカラムにロードした。バッファーRW1およびRPEでカラムを洗浄した。無RNAse水を使用して全RNAをカラムから溶出した。サンプルはRamaciotti Centre for Genomics(UNSW, Australia)に提出し、TruSeq Stranded mRNA-seq preparationとOne NextSeq 500 1X75bp High Output flowcellによるシーケンス（400M reads までデータ出力）を実施した。サンプルの品質管理は、1x75bpでQ30より80%より高い値に設定した。
RNA-seqリードは、まずツールFastQC (v0.11.8) (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)を用いて品質を評価した。RNA-seqリードからの転写物量の定量化には、ツールSalmonを使用した（Patro, R., et al., Nat Methods 14, 417-419 (2017)）。そして、カウントデータの差分解析の方法を組み入れたRパッケージDESeq2 (Love, M.I., et al., Genome Biol 15, 550 (2014)） を用いて、特定の比較対象間で差分発現した遺伝子を同定した。Rパッケージgplots v3.0.1.1のheatmap.2関数を使用して、関心のある遺伝子のセットについてcounts per million（cpm）値を使用してヒートマップを生成した。WebベースのオンラインバイオインフォマティクスリソースであるDatabase for annotation, visualization and integrated discovery (DAVID) (Jiao, X., et al., Bioinformatics 28, 1805-1806 (2012)）を用いて、特定の比較対象の差分発現遺伝子リストに濃縮されていることが判明したバイオプロセス(BP)などの遺伝子オントロジーを同定する。
フローサイトメトリー。HMEC-1（80～90%コンフルエント）をEGFやヒドロコルチゾンを含まない無血清MCDB131培地で40hアレストさせ、30μM BT2またはBT3で4h処理した。この細胞を無血清培地でインキュベートし、同じ濃度のBT2またはBT3とともに20ng/mlのIL-1βにさらに4ｈ曝露した。細胞をPBSで洗浄した後、アキュターゼ（Stem Cell Technologies, cat.07920）を用いて剥離した。細胞を300gで5min遠心分離し、BT2またはBT3を含む5x106細胞/mlで再懸濁した。細胞をBV421－共役マウス抗ヒトCD106 (VCAM-1)(BD, cat. 744309)またはBV421―共役マウスIgG1 (BD, cat. 562438)と共に22℃で45minインキュベートした。細胞は染色緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリー BD FACSCanto IIの前にペレットを0.5 mlの1%パラホルムアルデヒドに再懸濁した。
VCAM-1+細胞とVCAM-1-細胞は、それぞれ一次VCAM-1抗体（非特異的染色）を用いた、または用いないフローサイトメトリーを行うことによってゲーティングされた。後者（すなわち陰性対照）からの代表的なゲーティングを最小限の非特異的染色を示す図10として示す。ゲーティング戦略は、488nmレーザーと405nmレーザーの両方から蛍光励起し、発光フィルター670LPで488nmを、450/50で405nmをオフにすることに基づいている。自家蛍光を持つ細胞または陰性細胞（青い集団）は、両方のチャンネルで同じ割合の蛍光を持ち、VCAM-1陽性細胞（赤）は450/50フィルターで発光した。
SPR。SPRはBiacore T200で実施した。Xantec NIHMC Niセンサーチップのアクティブフローセルとリファレンスフローセルを、固定化緩衝液（20mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4）中の0.5M NaEDTAと5mM NiCl2でコンディショニングした。リコンビナントヒトHis-MEK1およびHis-MEK2(500nM, ThermoFisher Scientific, cat. PV3303およびPV3615,それぞれ)を別々のアクティブフローセル上に10μl min-1で15min注入した。すべての固定化は25℃で行われた。固定化後、温度を15℃に下げ、緩衝液を20mM HEPES、150mM NaCl、5% DMSO pH7.4に変更した。PD98059 (実施緩衝液中2.5～30μM)とBT2(1.25～15μM)のサンプルを、固定化したMEK1とMEK2上に30μl min-1の流速で注入し、DMSO標準曲線を用いて溶媒補正をデータに適用した。データはBiacore T200 Evaluationソフトウェアで解析した。SPRの前に、1H 1D NMRを用いて化合物の溶解度の限界を測定した。
xCELLigenceシステムを用いた内皮増殖アッセイ。HMEC-1の増殖は、xCELLigenceシステム（Roche、Castle Hill）を用いて評価した。簡単に言うと、HMEC-1（5x103細胞／ウェル）を96ウェルEプレートに播種し、xCELLigence RTCAステーション（Roche）に挿入した。10ng/ml EGF(Sigma-Aldrich)と1μg/mlヒドロコルチゾン(Sigma-Aldrich)を含むMCDB131培地で24h血清を除去した後、5%FBS、10ng/ml EGF(Sigma-Aldrich)および1μg/ml ヒドロコルチゾン(Sigma-Aldrich)を含む培地で化合物 (0.2～1μM)で処理した。細胞増殖は、xCELLigenceシステムによって15分ごとに自動的にモニターされた。Cell Index (CI)は、各ウェルの細胞増殖の定量的な指標を示す。このシステムでは、CIは、付着した細胞によって引き起こされる電子の流れのインピーダンスを報告する単位なしのパラメータである。
Countessシステムを用いた内皮増殖アッセイ。Countess II Automated Cell Counter（ThermoFisher Scientific）を用いて、HMEC-1の増殖を評価した。簡単に言うと、HMEC-1（3x105細胞/ウェル）を12ウェルプレートに播種した。細胞は、10ng/ml EGFと1μg/mlヒドロコルチゾンを含むMCDB131培地で24h血清を除去した後、5% FBS、10ng/ml EGFおよび1μg/mlヒドロコルチゾンを含む培地で化合物（0.1～0.6μM）で処理した。24h後に細胞をトリプシン処理し、完全培地に再懸濁し、10μlのアリコートを等量の4%トリパンブルーと合わせ、総細胞数および総細胞数に占めるトリパンブルー排除細胞の割合をCountessを用いて測定した。
内皮デュアルチャンバー遊走アッセイ。10%FBS添加DMEMに懸濁したBAEC（6x103細胞/ウェル）をMillicell細胞培養インサート（cat. PI8P01250, Millipore）を装着した24ウェルプレートの上部チャンバーに播種した。48h後、培地を0.01%FBS含有DMEMに交換し、48hインキュベートした。0.01% FBS含有DMEMで調製した化合物を上部チャンバーに添加した。10%FBS含有培地中のVEGF-A165(50ng/ml, Sigma, cat. V7259)を下部チャンバーに添加した。24ｈ後、上部チャンバーから培地を除去し、綿棒で非遊走細胞や余分な液体を除去した。インサートを70%エタノールに10min浸して細胞を固定し、膜を10～15min乾燥させた。フィルターが切り取られ、スライド上に置かれた。封入剤（DAPI入りFluoroshieldTM, Sigma, cat. 6057）を加え、EVOS FL顕微鏡で標本が可視化された。
インビトロ損傷後の内皮修復。6ウェルプレートのHMEC-1（90～100％コンフルエント）をPBSで洗浄し、5％FBS含有MCDB131中で0.6μM化合物で処理した。滅菌した先の尖った爪楊枝で細胞単層を削り、0ｈと48ｈに4x対物レンズでウェルを撮影した。Image-Pro Plus (Cybernetics, USA)を用いて、変性領域での細胞再増殖を測定した。
RRLC-MS/MSを用いたBT2製剤の分析。Agilent 1200 Triple Quad G6410Bを用いて、Iris PharmaがGLP下で開発した高速液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析（RRLC-MS/MS）法により、室温で調製後1週間（T1週）または6週間（T6週）における加熱処理または非加熱処理BT2製剤のBT2含有量を測定した。製剤は、加熱（H）処理（100℃のウォーターバスに10 min置いたチューブ）または非加熱処理（BT2を0.5% Tween 80および0.01% DMSO含有生理食塩水中で超音波処理した製剤）したものを使用した。標準曲線は、定量下限（LLOQ）と定量上限（ULOQ）の間の8濃度で作成した。評価は、同一希釈の3つの製剤で行った。クロマトグラムはMassHunterソフトウェアを用いて統合された。BT2含有量解析（T1週およびT6週）については、平均値、SD、CV（％）および偏り（％）の算出を以下のように行った。T1では、理論濃度（すなわち供給された秤量／製剤）を基準として、試験試料を含む各製剤の偏り（%）を算出した:
Figure 2023518375000119
標準曲線はExcel（R）version 2011を使用し適合させた。各ランについて、標準曲線とQCの逆算濃度の偏りを求め，校正用標準の逆算濃度を理論値の±15%以内とした（ただし、LLOQは±20%以内とした）。校正用標準の少なくとも75%、最低6本がこの基準を満たす必要があり、決定係数（r2）は≧0.98に設定した。
液体クロマトグラフィー質量分析計（LC/MS）を用いたBT2製剤の分析。MSO (100μl)とサンプル(～50μl)をギ酸(1μl)と共に合わせた。これらの溶液（10μl）をさらにH2O：CH3CN（1：1）0.1％ギ酸（90μl）で希釈し、LC/MS分析を行った。サンプルは、HPG-3400RS UPLCポンプ、オートサンプラー、カラムコンパートメントシステム（Thermo Scientific, CA）を用いてUPLCにより分離した。サンプル（0.1μl）は、1.9μ培養液を含むHypersil Gold aQカラム（2.1 x 50 mm）（Thermo Scientific）にロードされた。化合物は、H2O:CH3CNの線形グラジエントを用いて溶出され、AはH2O(0.1% ギ酸)を含み、BはH2O:CH3CN(1:4, 0.1% ギ酸)を含んでいた。グラジエントは：T=0min 2% B, T=20min 75% B, T=23min 95% B, T=25min, 95% B, T=25.2min 2% B, T=30min, 2% 200μl/min で30分以上かけた。カラムオーブンを45℃に加熱した。ポジティブイオンはエレクトロスプレーで生成し、QExactive Plus 質量分析計 (Thermo Fisher, Bremen, Germany)はデータ依存の取得モード(DDA)で動作させた。加熱エレクトロスプレーソース(HESI)を使用し、高電圧3.8 kVを印加し、気化器温度250℃、シースガス20、補助ガス5、加熱キャピラリーはT=290℃に設定した。ロックマス（m/z 391.28429）を有効にして、m/z 140～800 のサーベイスキャンを行った（分解能はm/z 200で70,000、AGC目標値は3x106イオン、最大ITは250msec）。2つのマイクロスキャンを組み合わせた最も豊富な10個までのイオン（最小AGC目標値5x104、最大IT 110 msec）を順次分離し（幅m/z 1.8）、HCD（NCE = 20, 30, 50）で2x105のイオン（m/z 200で分解能= 17,500）を目標値に断片化した。MS/MSに選択されたM/Z比は12sec動的に除外され、電荷状態の除外は有効ではなかった。LC/MSのクロマトグラムはXcalibur Qual Browserで処理した。
内皮ネットワーク形成アッセイ。1％FBS含有MCDB131中のHMEC-1（4x104細胞／ウェル）と化合物（1または3μM）またはクルクミン（1～40μM）および50ng／ml FGF-2を、増殖因子還元再構成基底膜マトリックス（(Matrigel, cat. 354230, Corning, NY)100μlで4℃で一晩コーティングした96ウェルプレートに添加した。ネットワーク形成はその後数時間にわたって観察され、Olympus CKX41顕微鏡を用いて4xまたは10x対物レンズで撮影された。
マトリゲルプラグアッセイ。VEGF-A165 (100ng/ml)、ヘパリン(10U)、BT2もしくはBT3(2.5 mg/マウス)またはそのビヒクル(0.01% DMSOおよび0.5% Tween 80を含む生理食塩水)を含むマトリゲル(500μl)を8週齢C57BL/6雄マウスの左脇腹に皮下注射した。7日後、マウスはCO2窒息によって犠牲にされ、プラグは慎重に除去された。免疫組織学的評価のために、マトリゲルプラグからホルマリン固定パラフィン包埋切片を作製した。熱によるエピトープ回収を、クエン酸緩衝液、pH6で110℃、5min、すべての脱パラフィンした切片（4μm Superfrostスライド）に適用した。全群の免疫染色は、与えられた抗体で同時に行われ、展開時間は同一であった。動物実験は、ニューサウスウェールズ大学の動物愛護・倫理委員会の承認を得た。
CD31染色のため、切片を内因性酵素ブロッキング剤（cat. S2003, DAKO）で10minブロックし、その後2%スキムミルクで20minブロックした。スライドを一次抗体ウサギポリクローナルCD31抗体、1:25希釈(cat. ab28364, Abcam)と共に室温で1hインキュベートした。スライドは、緩衝液で洗浄後、二次抗体（ヤギ抗ウサギ (cat. P0448, DAKO)）を30minインキュベートし、緩衝液で洗浄後、ジアミノベンジジン(DAB)クロマゲン（chromagen）(cat. K3468, DAKO)で5minインキュベートし、ヘマトキシリンとスコットブルーで対比染色した。スライドは100%エタノールとキシレンで脱水し、カバーガラスをした。
FosBまたはVCAM-1染色のため、切片を内因性酵素ブロッキング剤（cat. S2003, DAKO）で10minブロックし、その後2%スキムミルクで20minブロックした。スライドを一次ウサギモノクローナルFosB(cat. 2251, Cell Signaling, USA)またはウサギポリクローナルVCAM-1 (cat. sc-8304, Santa Cruz)と共に室温で1hインキュベートし、次にMACH3 Rabbit AP-Polymer Detection(Biocare Medical, M3R533 G, H, L)のプローブ成分と10minインキュベートした。スライドは、緩衝液で洗浄後、MACH3 Rabbit AP-Polymer Detection (Biocare Medical, M3R533 G, H, L)のポリマー成分と共にさらにインキュベートした。スライドを赤色色素（Warp RedTM Chromogen Kit）で7minインキュベートし、ヘマトキシリンとスコットブルーで対比染色した。スライドはろ紙で乾燥させ、キシレンで脱水した後、カバーガラスをした。
スライドは、Aperio ScanScope XT スライドスキャナー（Leica Biosystems, Mt Waverley, Vic Australia）を用いてスキャンし、ImageScope ソフトウェア（Leica Biosystems）を用いて画像を取得した。プラグ内の陽性染色を、10x（CD31）、20x（VCAM-1）および40x（FosB）対物レンズ下で撮影した各プラグの5～12個のランダムに選択した視野においてImage-Pro Plusソフトウェア（(Cybernetics, Bethesda, MD)を用いて評価し、積算光学密度（IOD、校正強度（光学密度）と面積との積、すなわちIOD＝強度（平均）×面積）として表現した(Media Cybernetics) (Liu, H., et al., Sci Rep 6, 21319 (2016)）。また、陽性免疫染色をプラグ面積の割合（％）で表した（Kim, J.Y., et al., Biomolecules 10, pii: E11 (2019)）。
ウサギの網膜血管透過性亢進モデル。雄のHY79b色素性ウサギ（8～12週齢）をRompun（R）（キシラジン）/Imalgene（R）（ケタミン）の筋肉内注射により麻酔した。rhVEGF-A165誘導の5d前に、化合物（100μlビヒクル中に600μg BT2、BT3または0.5% Tween 80および10% DMSOを含む生理食塩水ビヒクル）を右眼に注射した。注射は、手術用顕微鏡下で、250μlのハミルトン注射器（30G針を装着）を用いて、麻酔した動物に行った。網膜血管透過性は、500ng rhVEGF-A165（キャリアタンパク質を含むPBSで希釈）の50μl IVT注射を右眼に1回行うことにより誘導した。誘導から47時間（±3ｈ）後、フルオレセインナトリウム（生理食塩水中10％、50mg/kg）を耳縁静脈に注射した。フルオレセイン注入の1ｈ後に動物を麻酔し、0.5%トロピカミドを1滴点眼して瞳孔を拡張させた。両目の眼球蛍光をFM-2 Fluorotron Master眼球蛍光光度計で測定した。動物はペントバルビタールの注射により安楽死させた。本研究は、Iris Pharma（La Gaude, France）の動物倫理委員会およびニューサウスウェールズ大学の動物愛護・倫理委員会の承認を得て実施された。
ラット脈絡膜レーザー損傷モデル。Brown Norway色素性ラットの雄（8～14週齢）をRompun（R）（キシラジン）/Imalgene（R）（ケタミン）の筋肉内注射により麻酔した。レーザー照射前に0.5％トロピカミドを1滴点眼し、瞳孔を拡張した。スリットランプとコンタクトレンズを通して、170mWの532nmレーザー光（Viridis laser, Quantel, France）を、網膜主血管分岐の間にある視神経周囲の75μmスポットに0.1s照射し、0日目に両眼で6回の火傷を作成した。レーザー照射時に気泡が発生することで、ブルッフ膜の破裂を確認した。ビヒクル（0.01％DMSOと0.5％Tween 80を含む生理食塩水、超音波処理）中の化合物を2～5μl、100μlハミルトンシリンジに取り付けられた30G針を用いて手術顕微鏡下で0日目と7日目にIVT注射を行った。ケナコルトは0日目に各眼にIVT投与された。あるいは、ビヒクル（生理食塩水）中のアフリベルセプト／アイリーアを6回（0、3、7、10、14、17日目）IVT注射した。フルオレセイン血管造影法はハイデルベルグ網膜血管造影法を使用して行った。麻酔後、10％フルオレセインナトリウム（250μl/100g体重）を皮下注射し、色素注入10min後に眼球の蛍光を記録した。14日目と21日目の血管造影で、試験群にマスクされた2人の検査員によって蛍光の漏れが評価され、蛍光の強さが次のように評定された：スコア0：漏れなし、1：わずかに染色、2：中程度に染色、3：強く染色。本研究は，Iris Pharma（La Gaude, France）の動物倫理委員会およびニューサウスウェールズ大学の動物愛護・倫理委員会の承認を得て実施された。
ラット網膜の免疫組織化学的染色。ウサギモノクローナル抗CD31(cat. ab182981)、ウサギモノクローナル抗VCAM-1(cat. ab134047)およびウサギポリクローナル抗VEGF-A(cat. ab46154)はAbcam から入手した。ウサギモノクローナルホスホ－p44/42 MAPK (pERK1/2, Thr202/Tyr204)(cat. 4370)およびウサギモノクローナルFosB (cat. 2251)をCell Signalingから入手した。ラット眼球を切除し、ホルマリン固定、パラフィン包埋切片を作製した。熱によるエピトープ回収は、すべての脱パラフィン切片（4μm Superfrostスライド）にクエン酸緩衝液、pH6 (VEGF-A, pERK, VCAM-1)またはEDTA緩衝液、pH9 (CD31)で110℃、5min行われた。切片を併用（dual）内因性酵素ブロッキング剤(cat. S2003, DAKO)で10minブロックし、2%スキムミルクで20minブロックした。MACH3 Rabbit AP-Polymer Detection (Biocare Medical, cat. M3R533 G, H, L)を用いて10minインキュベートした。緩衝液で洗浄後、スライドをMACH3 Rabbit AP-Polymer Detection (Biocare Medical, M3R533 G, H, L)のポリマー成分でさらに10minインキュベートした。スライドを赤色発色剤（Warp RedTM Chromogen Kit）で7minインキュベートし、ヘマトキシリンとスコットブルーで対比染色した。スライドをろ紙で乾燥させ、キシレンで脱水した後、カバーガラスをした。所定の抗体による免疫染色は、全群に対して同時に行った。免疫染色されたスライドは、Aperio ScanScope XT スライドスキャナー (Leica Biosystems, Mt Waverley, Vic, Australia) でスキャンし、ImageScope ソフトウェア (Leica Biosystems)で画像をキャプチャした。CD31、VEGF-A165、pERK、FosB、VCAM-1の陽性染色（赤色色素）のIODを、Image-Pro Plusソフトウェア（Cybernetics、Bethesda、MD）を用いて評価した。IPLとINLのIODはCD31、VEGF-A165はOPLからOS、pERKはINLからONL、FosBはGCLからOS、VCAM-1はOLMについて、Image-Pro Plusを用いて定量化した。また、網膜組織面積に対する陽性免疫染色の面積（％）で表した（Kim, J.Y., et al., Biomolecules 10, pii E11 (2019)）。定量化のための画像選択では、ビヒクル群およびBT2群については、2～4切片／眼のすべての傷を確認し、20x対物レンズで撮影した。傷のない無処置群では、1～3切片/眼の写真を20x対物レンズで撮影した。染色は各群n=3～6で定量化した。VEGF-A165の勾配染色を創傷に対して評価する場合、創傷中心から150μm（両頭矢印）から連続する10個の100μmボックスで免疫染色を評価し、各ボックスのIODをImage-Pro Plusで定量化した。
内皮細胞-単球細胞接着アッセイ。96ウェルプレートのHMEC（80～90％コンフルエント）を24h無血清にし、表示濃度の化合物で1h処理した後、IL-1β（20 ng/ml）と4hインキュベートした。一方、THP-1は5μMカルセイン（5x106細胞/ml, BD Bioscience）で37℃、30min標識し、その後PBSで3回洗浄した。その後、THP-1(2.5x105 細胞/ウェル)を30min添加し、結合しなかった細胞をPBSで3回洗浄除去した。カルセイン標識THP-1の内皮層への接着は、蛍光プレートリーダーで励起485 nm、発光530 nmで測定した。
単球－経内皮遊走アッセイ。Millicell 8 μm ポリカーボネート化培養プレートインサート(Millipore)を0.1% ブタゼラチンA型(Sigma)でコーティングし、24－ウェルプレートに設置した。HMEC (5x104細胞/ウェル)をインサートに播種し、一晩付着させた。その後、細胞を24h無血清にし、様々な化合物で1h処理した。IL-1β（20ng/ml）を添加して4h細胞を刺激し、無血清培地500μlを化合物とともに24ウェルプレートの底に添加した。THP-1(100μl中5x105細胞)をインサートに加え、100 ng/ml MCP-1(Sigma)を下のウェルに添加した。24h後、内皮層を遊走した細胞数を、Coulterセルカウンター（Beckman Coulter）を用いて下部チャンバー内の懸濁液100μlを数えることによって評価した。
コラーゲン抗体誘発関節炎。関節炎は、II型コラーゲンに対する5つのモノクローナル抗体の市販のカクテル（Chondrex，Inc． Redmond，WA）2mg／マウスを用いて、先に記載したように雌Balb／cマウス（6～8週齢）において誘発し、次にDMSOビヒクル中のBT2（3または30mg／kgマウス）を伴うまたは伴わないLPS（50μg／マウス）を3日目にi.p.投与した。後足蹠の厚みは、デジタルノギスを用いて9日目に測定した。マウスは14日目に犠牲にし、後肢のマイクロCTスキャンを実施した。動物実験は、ニューサウスウェールズ大学の動物愛護・倫理委員会により承認された。
マイクロCTスキャンと解析。ホルマリン－エタノールで固定した後肢を、Siemens Inveon マイクロ-CTスキャナー(Victoria, Australia)を用いて組織学的処理の前にマイクロCTスキャンを行った。データは、Inveon Acquisition Workplaceを用いて、16.84μmピクセルサイズ、360投影、4100ms積分時間、80keV光子エネルギーおよび140μA電流で取得した。3Dモデルを可視化し、四肢のスナップショットをInveon Research Workplaceソフトウェアで取得した。データは、個々の四肢について、それぞれ、0＝骨破壊なし、1＝骨破壊ありの2値で定量化した。
酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（TRAP）染色。破骨細胞をTRAPキット(Cosmo Bio, Japan, cat. PMC-AK04F-COS)を用いて染色した。切片を脱脂前に65℃で1h加熱した。組織切片を100%キシレンで脱パラフィンし、100、70および30%エタノールで再水和した後、蒸留水で5min洗浄した。切片を50 mlの酒石酸緩衝液あたり3mgの酒石酸を含むTRAP染色液でカバーした。切片を37℃で1hインキュベートした後、蒸留水で3回洗浄し反応を停止させた．切片をヘマトキシリンで5s対比染色し、透明になるまで流水で洗浄し、乾燥させた。切片はキシレンで脱水し、風乾した後、水性パーマネントマウントメディウムでマウントした。各動物の関節内側の滑膜の中から、20xの対物レンズで撮影した無作為の6つの領域を盲検下で選択した。破骨細胞の数はNIH Image Jでカウントし、TRAP染色はIOD(Image-Pro Plus)で定量化した。
後肢のVCAM-1およびICAM-1に対する免疫組織化学的(Immmunohistochemical)染色と解析。後肢のホルマリン固定、パラフィン包埋を切片化した（5μm）。VCAM-1およびICAM-1の免疫組織化学的(Immmunohistochemical)染色には、Dako EnVision Rabbit Kit(cat. K4011, Dako)を使用した。簡単に言うと、切片をペルオキシダーゼで30minブロックし、次にウサギモノクローナルVCAM-1（cat. ab134047、1：100、Abcam）、またはウサギポリクローナルICAM-1（cat. ab124759、1：100、Abcam）で4℃、一晩免疫染色をした。染色は、標識ポリマー西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）（抗ウサギ）とジアミノベンジジン（DAB）システムを用いて可視化し、ヘマトキシリンとスコットブルーで対比染色を行った。免疫染色されたスライドは、Aperio ScanScope XTスライドスキャナー(Leica Biosystems, Mt Waverley, Vic, Australia)でスキャンし、ImageScopeソフトウェア(Leica Biosystems)で画像を取り込んだ。足首関節（脛骨および距骨）の関節軟骨における陽性染色の統合光学密度（IOD）を、Image-Pro Plusソフトウェア（Cybernetics, Bethesda, MD, USA）を用いて、VCAM-1およびICAM-1について評価した。足関節の関節軟骨の面積（μm2）は、Image-Pro Plusソフトウェアを用いて測定した。足首関節の関節軟骨の総細胞数および陽性染色細胞数は、Image-Pro Plusソフトウェアを用いて手動で計数した。データはIOD/μm2と20x対物レンズ視野あたりの陽性染色細胞の割合で表した。
毒性学。雌のBalb/cマウス（8～9週齢）に3または30 mg/kgのBT2（DMSOビヒクル）を腹腔内注射（DMSOで0および5日目）、強制経口投与（DMSO/メチルセルロースで0～4日目）または関節内注射（DMSOで0日目）で投与した。組織は10％ホルマリンで固定し、ルーチンに処理し、4μmで切片化し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。切片は、American College of Veterinary Pathologists の認定医により、毒性の兆候について組織学的に検査された。動物実験は、ニューサウスウェールズ大学の動物愛護および倫理委員会の承認を得た。
統計学．統計解析はPRISM v7.0dを用い、説明文にあるように行い、差はP<0.05のとき有意差とみなした。示された場合、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。
結果
BT2、T4、T6の同定。AP-1の新規低分子阻害剤を同定するため、～10万化合物からなるWEHIリードディスカバリーライブラリーを、ホタルルシフェラーゼがAP-1応答エレメントの複数コピーで駆動する293細胞ベースのアッセイを使用してスクリーニングした。AP-1阻害剤クルクミン（Nelson, K.M., et al., J Med Chem 60, 1620-1637 (2017)）を典型的に捕らえるパンアッセイ干渉化合物（PAINS）（Bael, J.B., et al., J Med Chem 53, 2719-2740 (2010)）を除去するためスクリーニング中に部分構造フィルターを適用した。これにより、ジベンゾオキサゼピノンBT2を含む、11点滴定曲線を用いて決定されたマイクロモルまたはサブマイクロモル範囲のIC50を有する24の利用可能なヒットが得られた。これは、ベンゾフェノンCpd B/X/LK001を得た960化合物のDIVERSetライブラリ（ChemBridge）の以前のスクリーニングに続くものである（図6A）。T4、T6およびT7はCpd B/X/LK001の構造類縁体であり、BT3はBT2の類縁体である（表1）。BT2は、市販の2-アミノ-10-エチルジベンゾ[b,f][1,4] オキサゼピン-11 (10H)-オン（BT3）をジエチルピロカーボネートと反応させることによりスクリーニング後に合成した（図6B、スキーム1）。Cpd B/X/LK001は、2-メトキシエチルカーボンイソシアナチデート（2-methoxyethyl carbonisocyanatidate）（2）（Krebs, A, et al., European Patent Office EP0230224B1 (1991)）と市販の（4-アミノフェニル）（4-クロロフェニル）メタノン（1）を反応させて製造した（図6B、スキーム4)）。Cpd B/X/LK001を塩酸ヒドロキシルアミンで処理すると、EおよびZ異性体の～1：1混合物としてT4が得られた（図6B、スキーム4）。フルベンダゾール（T6）および（4-アミノフェニル）（4-フルオロフェニル）メタノン（T7）は、市販のものを入手した。
BT2、T4およびT6は、血清誘導性の内皮FosB/ΔFosBおよびc-Fos発現を阻害し、インビトロでの増殖、遊走およびネットワーク形成をブロックする。我々は、培養ヒト微小血管内皮細胞（HMEC-1）における2種類のAP-1サブユニットの血清誘導性発現に対するBT2、T4およびT6の影響を測定した。内皮細胞は、流れる血液と組織の間に重要なバリアを提供しているが、活性化やストレスを受けると透過性が高くなる(van Hinsbergh, V.W., et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 17, 1018-1023 (1997)）。BT2はFosBとΔFosBの誘導性発現をブロックした（図1A & 7A）。T4およびT6はあまり強力に阻害せず、BT3およびT7は阻害を示さなかった（図1A）。BT2はまた、血管新生の公知のメディエーターであるc-Fosの誘導性発現をブロックした（Marconcini, L., et al., Proc Natl Acad Sci USA 96, 9671-9676 (1999)）（図1Aおよび図7A）。
次に、我々は、細胞増殖をリアルタイムでモニターするxCELLigenceシステムを用いて、これらの化合物が内皮細胞増殖に及ぼす効果を調べた。その結果、BT2、T4およびT6がそれぞれ用量依存的に血清誘導性増殖を抑制することがわかった（図1B）。一方、BT3やT7は抑制効果を示さなかった。増殖阻害が単に細胞死によるものではないことを確認するために、これらの化合物の1つ（BT2）を、Countessシステムとトリパンブルー排除を組み合わせた全細胞増殖アッセイでテストした。BT2は、トリパンブルーの取り込みに影響を与えることなく、血清誘導性の増殖を阻害した（図7B）。デュアルチャンバートランスウェルシステムにおいて、BT2、T4およびT6は、血清含有培地中のVEGF-A165に対するウシ大動脈内皮細胞（BAEC）の遊走を阻害した（図1C）。HMEC-1細胞はVEGFR-2（Flk/KDR）を欠き、VEGFに対して弱い遊走しかしないため、この目的のためにBAECを用いた（Shao, R., et al., Biochem Biophys Res Commun 321, 788-794 (2004)）。一方、BAECは、VEGFR-2を発現し（Lamy, S., et al., Cancer Res 62, 381-385 (2002)）、VEGF-Aに遊走する（Hussain, S., et al., BMC Cell Biol 9, 7 (2008)）。一方、BT3も、PD98059（アロステリックMEK阻害剤）、イマチニブ（チロシンキナーゼ阻害剤）、トファシチニブ（ヤヌスキナーゼ阻害剤）も同濃度で阻害効果を示さなかった（図1C）。
インビトロでの機械的損傷後の内皮細胞修復は、増殖および遊走性応答を誘発する。BT2、T4およびT6はこの修復反応を48ｈ以内にブロックしたが、BT3またはT7はかかる効果を示さなかった（図1D）。我々はまた、血管新生因子およびプロセスを特徴付けるために典型的に使用される再構成基底膜マトリックスの上で内皮ネットワーク形成アッセイ（管形成としても知られている）においてこれらの化合物の効果を評価した（Arnaoutova, I., et al, Angiogenesis 12, 267-274 (2009)）。このアッセイにおける内皮細胞は、数時間以内に毛細血管様ネットワークを最大に形成し、その後退行する。BT2、T4およびT6は、2、4、6および24h後にネットワークの形成を阻害した（図1E）。
BT2は、網膜血管の透過性と血管新生を抑制する。網膜血管透過性は、nAMDおよびDME/DRにおける重要な病理学的特徴であるため（Campochiaro, P.A., et al, J Mol Med (Berl) 91, 311-321 (2013)）、我々は、視神経周囲のブルッフ膜を複数回レーザー焼灼した後にBrown Norway色素性ラットの眼に誘発されるフルオレセイン漏出に対するBT2、T4およびT6の効果を測定しようとした(Grossniklaus, H.E., et al., Prog Retin Eye Res 29, 500-519 (2010)）。BT2（192μg）は網膜透過性を～50％低下させ、その効果はアフリベルセプト／エイレア（200μgを21日間にわたり6回（0、3、7、10、14、17日目）硝子体内（IVT）注射で投与、BT2の2回注射（0、7日目）と比較）またはトリアムシノロンアセトニド（ケナコルト（登録商標）200μg IVT、0日）と同様だった(図2A）。一方、BT2に対して送達されたT4およびT6には阻害効果はなかった（図2A）。アフリベルセプトは、米国、欧州、アジア太平洋地域におけるnAMDおよびDMEの第一選択療法であり（Parikh, R., et al., Ophthalmol Retina 3, 16-26 (2019)）、ケナコルトはDMEの治療によく用いられる副腎皮質ホルモン剤である（Karacorlu, M., Eye (Lond) 19, 382-386 (2005)）。BT2はまた、フルオレセイン漏出を引き起こす色素性ウサギのrhVEGF-A165によって誘導される血管透過性を減少させた。BT2（600μg）の単回静脈内投与は、2日後の網膜漏出を～50％抑制した（図2B）。損傷から21日後にレーザー照射したラット眼の免疫組織化学染色により、BT2は、レーザー損傷後にCD31が発現するIPLおよびINL（図2Cおよび8A）において誘導性CD31染色を阻害した（Ju，X，ら、Clin Exp Pharmacol Physiol 46，75-85（2019)）。また、BT2はVEGF-A165の誘導性発現を抑制し（図2D）、主に網膜外側でVEGFが発現するという知見と一致した（Wang, X., et al, Int J Mol Sci 8, 61-69 (2007); Foureaux, G., et al, Braz J Med Biol Res 48, 1109-1114 (2015)）。VEGF-A165は、BT2によって阻害された創傷に対して勾配をつけて染色した（図2E）。マウスマトリゲルプラグアッセイにより、BT2の抗血管新生作用が確認された。VEGF-A165、ヘパリン、化合物を含むマトリゲルをC57BL/6マウスに皮下移植し、7日後のプラグのCD31染色を定量化した。BT2は新生血管の形成を抑制したが、BT3は効果を示さなかった（図2F & 8B）。
BT2は、ERKリン酸化、FosB/ΔFosBおよびVCAM-1発現を阻害する。IL-1βに曝露された内皮細胞は、ERKのリン酸化が急速に進行する。IL-1βは内皮細胞の透過性を引き起こし（Puhlmann, M., et al., J Transl Med 3, 37 (2005)）、網膜の白血球増加を引き起こす（Vinores, S.A., et al., J Neuroimmunol 182, 73-79 (2007)）。黄斑浮腫を有する糖尿病患者は、他のサイトカインおよびVEGFのうちIL-1βの濃度が、房水中で有意に高い（Dong, N., et al., PLoS ONE 10, e0125329 (2015)）。IL-1βをHMEC-1とのモデルアゴニストとしてウェスタンブロッティング実験に使用した。BT2は、IL-1β誘導性のERKリン酸化、FosB/ΔFosBおよびVCAM-1の発現を阻害した（図3Aおよび図9）。BT2によるVCAM-1の阻害は、フローサイトメトリーによってさらに実証された（図3B & 10）。
RNA配列解析により、BT2がIL-1β誘導性のFosBとVCAM-1の発現を抑制することが確認された（図3C）。33379の遺伝子IDのプールから、IL-1βによって2倍以上（logFC≧2）誘導される325の遺伝子があり（表3C）、そのうちの89（27.5%）がBT2によって阻害された（logFC≧2）（表3B）。主成分分析（PCA）（図3C、左上）により、生物学的複製物間の密接な関連性が示された。BT2は、ICAM-1、CXCL2、KLF5、Egr-1およびFosを含む、細胞増殖、移動、血管新生および炎症に関与する他の調節遺伝子の範囲も阻害した（図3C）。
用量漸増およびウェスタンブロッティング実験により、BT2はPD98059よりも強力にVCAM-1およびERKのリン酸化を阻害した（図3D & 11A）。対照的に、BT2はPD98059と同様に、IL-1β誘導性のp-SAPK/JNKまたはp-p38に影響を与えなかった（図11B）。VCAM-1発現のFosB/ΔFosBに対するこれまで認識されていなかった依存性を探るために、我々はsiRNAノックダウン実験を実施した。FosB siRNAはFosB/ΔFosBとVCAM-1の両方を阻害したが、VCAM-1 siRNAはVCAM-1を阻害したが、FosB/ΔFosBを阻害しなかった（図3E）。ERK1の過剰発現は、IL-1β刺激と比較して、リン酸化ERKのレベルを増加させず、FosB、ΔFosBまたはVCAM-1のレベルも増加させなかった（図11C）。同様に、FosBまたはΔFosBの過剰発現は、IL-1β刺激と比較してVCAM-1の発現を増加させなかった（図11C）。これらの知見は、ERKがリン酸化されないこのアゴニストなしの系では、FosBとVCAM-1はERK1過剰発現によって直接活性化されず、VCAM-1はFosBあるいはΔFosBの過剰発現によって直接活性化されないことを示す。これらのデータは、ERKのリン酸化を防ぐBT2がインビトロ（図3A-D）およびインビボ（図4A-E）でのFosB/ΔFosBおよびVCAM-1の誘導を無効にするという我々の実証（アゴニスト刺激条件下）を補足するものである。実際、BT2はERKをリン酸化するMEK1と物理的に相互作用している（図5C）（Qi, M., et al., Journal of Cell Science 118, 3569-3572 (2005)）。
これらの知見は、VCAM-1のIL-1β誘導がFosB siRNAでブロックされるという我々の実証（図3E）と共に、FosBがサイトカイン誘導性VCAM-1発現に必要である一方で、FosBの過剰発現だけではサイトカイン刺激なしにVCAM-1を誘導するには不十分であることを示唆するものであった。FosBはサイトカイン刺激条件下で補因子（または翻訳後修飾）に依存していると考えられる。
ラット網膜の免疫組織化学的染色により、BT2はINL、OPLおよびONLにおける誘導性pERK染色を抑制した（図4A）この近傍におけるpERK発現と一致した（Takeda, M, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 43, 907-911 (2002); Caicedo, A, et al., Exp Eye Res 81, 38-47 (2005)）。また、BT2は網膜のFosB免疫染色を抑制した（図4B）。さらに、BT2は、他の人がVCAM-1が発現していることを発見したOLM（図4C）において、誘導性VCAM-1の発現を抑制した（Makhoul, M., et al., Exp Eye Res 101, 27-35 (2012)）。BT2はまた、マトリゲルプラグにおけるFosB（(図 4D & 8C）およびVCAM-1（図4E）免疫活性を阻害した。
さらなる実験では、内皮ネットワーク形成アッセイにおいて、BT2の生物学的効力をクルクミン（Ye, N., et al., J Med Chem 57, 6930-6948 (2014)）と比較した。BT2は1μMで4h後にネットワーク形成を消失させたが、クルクミンではこの濃度では阻害は観察されなかった（図12）。クルクミンは、30μMで～25％、40μMで～50％ネットワーク形成を阻害するように見え（図12）、BT2がこのアッセイにおいてクルクミンよりも40倍以上強力であることが示された。
BT2構造類縁体は、BT2の生物学的効力を持たない。次に、我々は、BT2の生物学的効力や溶解性が構造修飾によって改善されるかどうかを検討した。ジベンゾオキサゼピノンは一般的に水に難溶性である。BT3を除く6種類のBT2類縁体（BT2-MeOA, BT2-EOMe, BT2-Pr, BT2-IC, BT2-MO, BT2-IMO）を作成した（表1）。BT2-MeOAはメトキシ酢酸と2-アミノ-10-エチルジベンゾ[b,f][1,4] オキサゼピン-11 (10H)-オン(BT3)のカップリングにより合成し，BT2-IC はジイソブチルジカーボネートを使用して合成した（図6B、スキーム1）。BT2-PrおよびBT2-EOMeは市販の(1)および(2)からBT2の調製と同じプロトコルで合成した(図6B、スキーム2)。また、BT2-PrおよびBT2-EOMeは、市販の(1)および(2)からBT2を調製した。安定性解析のために、2-ニトロ-10H-ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11-オン（3）をd3-ヨードエタンでアルキル化し、ニトロ基を還元してBT2の三重水素化誘導体を合成した（図6B、スキーム3）。この中間体をジエチルピロカーボネートと反応させ、目的の生成物を得た。2-ニトロ-10H-ジベンゾ[b,f][1,4]オキサゼピン-11-オン（3）をオキセタン-3-イルメチルメタンスルホネートでアルキル化すると、カラムクロマトグラフィー後にO-およびN-アルキル化生成物がそれぞれ13％および48％の収率で得られた（図6B、スキーム3）。O-およびN-アルキル化生成物を還元して対応するアニリン（5）および（6）を得（図6B、スキーム3）、次にジエチルピロカーボネートを用いて通常の方法で目的生成物BT2-IMOおよびBT2-MOに変換した。
これらの化合物を血清を含む培地で希釈したところ、これらの類縁体（BT2-MeOA）のみがBT2よりも溶解度が高く、BT3はこれらすべてのジベンゾオキサゼピノンの中で最も溶解度が高いことが判明した。希釈剤に血清を加えるとBT2の溶解度が上昇し、血清アルブミンが組合せる薬物の溶解度を高めることができるという報告（Khoder, M., et al., Pharm Dev Technol 23, 732-738 (2018)）と一致した。BT2-MeOAおよび他のBT2アナログのいずれも、BT2と同様に、またはBT2よりも強力に、血清誘導性増殖（図5A）またはマトリゲル上のネットワーク形成（図5B）を阻害する能力を有しなかった。BT2-ICは、より高い濃度でネットワーク形成のいくらかの阻害を示した（図13B）。
BT2はERKのリン酸化を抑制したことから、BT2はMEK1またはMEK2と相互作用しているのではないかと仮定した。BT2とPD98059の組換えHis-MEK-1またはHis-MEK2への結合を表面プラズモン共鳴（SPR）でテストした。アッセイ可能な濃度範囲において、BT2はHis-MEK1に対してHis-MEK2よりも有意に良好に結合した（図5C）。対照的に、そして予想通り、PD98059はHis-MEK1およびHis-MEK2の両方に結合した(Dudley, D.T., et al., Proc Natl Acad Sci U S A 92, 7686-7689 (1995))(図5C)。同等の濃度範囲では、BT3、BT2-MeOAまたはBT2-PrのMEK1またはMEK2への顕著な結合は見られなかった。BT2-ICはMEK1（ただしMEK2ではない）といくらかの相互作用を示した。高濃度での相互作用の低下は、BT2-ICの不溶性（1H 1D NMR分光法による溶解度限界8±2μM）によるものと思われる。ウェスタンブロッティングの結果、BT2-ICは3μMではERKリン酸化（図13A）とネットワーク形成（図13B）の両方を阻害したが（BT2よりも強力ではないものの）、1μMでは阻害しなかった（図5B & D）。
BT2は超音波処理および100℃処理またはオートクレーブ後も安定性と生物学的効力活性を維持している。最終的に、BT2の医薬品としての可能性を考慮し、この化合物（0.01% DMSOと0.5% Tween 80を含む生理食塩水で超音波処理した製剤として）が極度の熱処理後も生物学的効力および安定性を保持するかどうかを検討した。高速液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析（RRLC-MS/MS）により、BT2は加熱処理（100℃、10min）の有無にかかわらず安定であり、22℃で6週間保存しても、非加熱処理と加熱処理した製剤のBT2含有量はそれぞれわずか0.2%と1%の違いだった（図14A-B）。BT2は、これらの条件下でも、血清誘導性内皮増殖抑制能を保持していた（図14C）。さらに驚くべきことに、最大16ヶ月経っても生物学的効果の喪失や分解はなかった（図14D-F）。驚くべきことに、BT2製剤は、標準的なオートクレーブと22℃での保管の4カ月後も安定で生物学的活性を維持していた（図14G）。現在のすべてのnAMD/DME治療薬を構成する抗体および他のタンパク質は、典型的には極端な熱によって不活性化される（Jones, F.S., J Exp Med 46, 291-301 (1927)）。
BT2は、インビトロでIL-1β処理した内皮への単球細胞の接着と、インビトロでMCP-1に向かう単球性経内皮遊走を抑制する。VCAM-1は、ヒト臍帯静脈内皮細胞において単球の接着を媒介する（Gerszten, R.E., et al., Circ Res 82, 871-878 (1998)）。カルセイン標識したTHP-1単球細胞とIL-1βで前処理した内皮細胞を含むインビトロモデルにおいて、内皮細胞へのTHP-1の接着はBT2により抑制される（図15A）。BT2はまた、MCP-1に向かうTHP-1単球の上部チャンバーから下部チャンバーへの経内皮遊走も抑制する（図15B）。
BT2の腹腔内投与は、関節炎マウスの足蹠の腫脹、骨破壊、VCAM-1およびICAM-1の発現を阻止する。BT2のインビトロでの抗血管新生作用と抗炎症作用を確立したことから、BT2はコラーゲン抗体による関節炎のような複雑な炎症性の環境でも有用であると仮定した（Khachigian, L.M. Nature Protocols 1, 2512-2516 (2006)）。このモデルで誘導された後足蹠厚みは、30mg／kgのBT2の単回投与によって抑制される（図16AおよびB）。H&E染色により、注入されたCAIAマウスの著しい炎症が、BT2により軽減されることが明らかになった（図16C）。後肢の3DマイクロCT解析により、BT2が骨破壊を抑制していることが明らかになった（図16DおよびE）。これらの知見を支持するために、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（TRAP）活性が骨分解破骨細胞の重要な組織化学的マーカーであることを利用した（Ballanti, P., et al., Osteoporosis International 7, 39-43 (1997)）。BT2は、関節のTRAP染色を減少させた（図16F）。BT2は、骨におけるVCAM-1およびICAM-1の発現を抑制することが判明した（図16G）。さらに、BT2（30mg／kg）は、IL-1β、IL-2およびIL-6の血漿レベルを正常レベルまで低下させたが、IL-4またはIL-10は変化させなかった。
腹腔内投与、関節内投与、強制経口投与でBT2の毒性の証拠なし。BT2（3または30mg/kg）をBalb/cマウスに3つの経路（腹腔内注射、関節内注射または強制経口投与）のいずれかで投与し、組織を毒性の兆候について評価した。BT2による毒性障害を示す病理組織学的な証拠はなかった（表2）。すべての群のほとんどのマウスの肝臓は、最小から軽度の、まれな炎症病巣を含み、時には個々の肝細胞または肝細胞の小集団の壊死を伴っていた。これは実験用マウスによく見られる自然発生的な背景病変（Taylor, I. Mouse. in Background lesions in laboratory animals (ed. McInnes, E.F.) 45-75 (Saunders Elsevier, Edinburgh, 2012)）と考えられ、試験項目とは無関係であった。i.p. 投与群のほとんどのマウスの肝臓は、被膜上に最小から軽度の炎症を示し、注射に対する非特異的な腹膜反応と一致し、その影響は試験品目とは無関係であった。コントロールマウス5匹中1匹、BT2投与マウス30匹中4匹の腎臓に、まれに炎症巣が見られた。これも実験用マウスによく見られる自然発生的な背景病変であり、試験項目とは無関係である。腎臓の骨盤を含む炎症は、尿路の上行性細菌感染に起因するものと思われる。肝臓と肺では、治療群とは関係ない、非常にまれで最小の変化が他に見られた。要約すると、BT2の腹腔内投与、関節内投与または強制経口投与後には、病理組織学的に毒性を示す証拠はなかった。
最後に、Iris Pharma（フランス）が実施したGLPに準拠した薬物動態および眼内耐性試験において、ウサギでの単回硝子体内注射(10μg/50μl BT2)は、28日後の眼内半減期（t1/2）は3.3日と、マクロ的にも組織的にも耐容性が良いことが明らかになった。
表2. BT2の関節内、腹腔内または強制経口投与後の病理組織学的所見の重症度評価。 病変の重症度は、組織学的に以下のように等級付けされた。0=異常なし、1=最小変化、2=軽度変化、3=中等度変化、4=重度変化、NA=評価なし。群あたりn=5マウス。IAは関節内、IPは腹腔内を示す。ビヒクルはDMSOであった。
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考察
nAMD/DRに対する既存のVEGFベースの戦略を補完する新しい治療アプローチが必要とされている（Apte, R.S., et al., Cell 176, 1248-1264 (2019)）。IVT抗VEGFは依然として網膜漏出の第一選択療法であるが、多くの患者が最適な反応を示さない、あるいは反応が持続しないため、代替療法が必要である。ラニビズマブまたはベバシズマブで治療したnAMD患者647人を対象としたComparison of AMD Treatments Trials（CATT）試験では、最初の2年間の視力向上が5年後に維持されないことが示された（Maguire, M.G., et al., Ophthalmology 123, 1751-1761 (2016); Pedrosa, A.C., et al., Clin Ophthalmol 10, 541-546 (2016)）。また、欧州8カ国のnAMD患者2227人を対象としたAURAiv試験では、抗VEGF療法により視力は初期に改善したものの、その向上は長期的に維持されず、主に治療不足により低下することが明らかになった（Holz, F.G., et al., Br J Ophthalmol 99, 220-226 (2015)）。
本明細書では、～10万化合物のハイスループット・スクリーニングから得られた新規ジベンゾオキサゼピノンの発見とその生物学的特性について報告する。BT2は、インビトロで細胞の増殖、遊走、創傷修復、ネットワーク形成をブロックする。この化合物は、血管漏出と血管新生の動物モデルにおいて有効性を示し（Carneiro, A., et al., Acta Ophthalmol 87, 517-523 (2009); Ameri, H., et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 48, 5708-5715 (2007); Pan, C.K., et al., J Ocul Pharmacol Ther 27, 219-224 (2011)）、これらは今日数百万の人々に使用されているnAMD/DR療法の開発の主要プラットフォームとしての役割を果たしてきた。BT2は、ラットの脈絡膜レーザー損傷後の網膜血管透過性を、nAMDおよびDMEに対する第一選択療法と同等の効果を示し、アフリベルセプト6回投与とBT2の２回投与の同用量比較で、網膜血管透過性を抑制した。BT2はIPLおよびINLにおけるCD31染色を減少させ、Ptf1a-Creマウスとフロックス（floxed）Vhl（Vhlf/f）マウスを交配して疑似低酸素症を誘発した研究でIPLおよびINLにおける大規模な新生血管が明らかになった後、アマクリンおよび水平細胞におけるVEGF-A 機能獲得研究と一致した（Usui，Y，他，J Clin Invest 125，2335-2346 （2015年)）。ウサギでは、BT2がVEGF-A165によって誘導される網膜血管の漏出を抑制することを見出した。
BT2はVEGF-A165の誘導性発現を抑制したが、網膜におけるその効果はVEGFに限られたものでなかった。BT2は、nAMDおよびDRの病態に関与するERK活性化およびVCAM-1発現の両方を抑制した（Kyosseva, S.V., et al., Ophthalmol Eye Dis 8, 23-30 (2016); Ye, X, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 53, 3481-3489 (2012); Jonas, J.B., et al., Arch Ophthalmol 128, 1281-6 (2010); Barile, G.R., et al., Curr Eye Res 19, 219-227 (1999)）。我々の知見は、サイトカイン刺激条件下でのpERK-FosB/ΔFosB-VCAM-1カスケードの存在を示唆する。また、BT2は、細胞増殖、遊走、血管新生および炎症に関与する他の様々な遺伝子を抑制した。BT2は、PD98059よりも強力であり、AP-1を阻害する黄金スパイスのターメリックの主な有効成分であるクルクミンよりも40倍以上強力であり（Ye, N., et al., J Med Chem 57, 6930-6948 (2014)、クルクミンの二重盲検プラセボ対照臨床試験が成功しなかったにもかかわらず薬用に広く使用されている(Nelson, K.M., et al., J Med Chem 60, 1620-1637 (2017)））。
我々は、2-アミノ-ジベンゾ[b,f][1,4] オキサゼピン-11(10H)-オン環系の2位と10位に様々な置換基を有するBT2類縁体を合成した。カルバミン酸部分のマイナーチェンジ（BT2-MeOAとBT2-IC）は10位の修飾(BT2-Pr, BT2-EOMe, BT2-MOおよびBT2-IMO)と同様に活性に著しい影響を及ぼした。BT2-EOMe、BT2-MOおよびBT2-IMOはいずれも計算上のlog Psが低く、水溶性が向上すると我々は予想した。BT2-MeOA（およびBT3）はBT2よりも溶解度が高かったが、2種類のアッセイを行った結果、BT2がこれらの化合物の中で最も生物学的活性が高いことに変わりはなく、2位と10位の置換基が大きければ良いというわけではないことが示された。BT2とBT2の異性体であるBT2-MeOA（アミド結合）を比較すると、BT2の2-位のカルバメート部位はBT2の機能にとって重要であることがわかる。BT2は、難水溶性薬物の経口吸収を改善し、高用量毒性試験を容易にしてきた自己乳化送達法などの脂質ベースの薬物送達システムに適合する可能性がある（Chen, X.Q., et al., J Pharm Sci 107, 1352-1360 (2018)）。
ゲッ歯動物およびウサギのモデルは、ヒトの網膜疾患の特定の特徴を再現するのに有用だが、nAMDやDRは複雑で多因子性の慢性疾患であり、単一の刺激による急性実験では正確に再現できないため、ヒトの状態を完全に再現することはできない（Robinson, R., et al, Dis Model Mech 5, 444-456 (2012)）。ラットは病気の進行が早く、比較的安価であるという利点があるが、ラット（マウスと同様）は黄斑を持たない（Pennesi, M.E., et al., Mol Aspects Med 33, 487-509 (2012)）。ウサギの目の大きさは人間の目に近いが、後眼部の血行が霊長類やゲッ歯類と異なり、ウサギも黄斑を持たない（Chen, S., et al., Expert Rev Opthalmol 9, 285-295 (2014)）。BT2は、動物モデルにおけるヒト化試薬や種特異的試薬の幅広い使用を妨げてきた翻訳可能性（translatability）の限界を克服することができる（Lu, F., et al., Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 247, 171-177 (2009)）。
BT2の網膜外への効果。新しく効果的な抗炎症剤や抗関節炎剤も求められている。TNF阻害剤で治療した患者の約3分の1は、米国リウマチ学会の基準に基づく20％の改善を達成しない（Klak, A., et al., Rheumatologia 54, 177-186 (2016); Rubbert-Roth, A. & Finckh, A. Arthritis Research & Therapy 11 Suppl 1, S1 (2009)）が、これは血清IFN-β／α比に関係すると思われる（Wampler Muskardin, T, ら、Annals of the Rheumatic Diseases 75, 1757-1762 (2016)）。RA患者の滑膜組織では、正常者と比較してp-ERKレベルが上昇している（Thiel, M.J., et al., Arthritis Rheum 56, 3347-3357 (2007)）。さらに、血清sVCAM1値はRAにおける臨床状態を反映し（Navarro-Hernandez, R.E. et al., Disease Markers 26, 119-126 (2009)）、RA患者では症状の緩和とともに減少する（Wang, L., et al., Experimental and Therapeutic Medicine 10, 1229-1233 (2015)）。我々は、CAIAマウスにBT2を全身投与することで、関節の炎症と骨浸食が抑制されることを見いだした。また、BT2はインビトロで単球の内皮細胞への接着と単球のMCP-1への経内皮遊走を抑制した。さらに、マウスにBT2を全身投与すると、足蹠の腫脹、TRAP染色、骨破壊が抑制される。また、炎症は、動脈硬化の開始から進行、最終的にはプラークの破裂や梗塞を引き起こし、さらなる炎症を引き起こすなど、アテローム性動脈硬化症のすべての局面を促進すると考えられている。近年のCANTOS（Hansson, G.K. Circulation 136, 1875-7 (2017); Ridker, P.M., et al. N Engl J Med 377, 1119-31 (2017)）、COLCOT (Tardif, J.C., et al. N Engl J Med 381:2497-2505 (2019)）およびトシリズマブ (Kleveland, O, et al. Eur Heart J 37, 2406-13 (2016)）の臨床試験から炎症が循環器疾患において治療できる機構であることが判明している。しかし、既存の抗炎症アプローチ（カナキヌマブやコルヒチンなど）で治療された患者は、スタチンや抗血小板療法が広く使用されていても、主要な心臓有害事象のかなりのリスクが残っている（Ridker, P.M., et al. N Engl J Med 377, 1119-31 (2017); Tardif, J.C., et al. N Engl J Med 381:2497-2505 (2019); Thompson, P.L. Clin Ther. 41, 41:8-10 (2019)。また、スタチン以外の心血管疾患に対する臨床的に有効な抗炎症性低分子薬剤は不足している（Collins, R. et al. Lancet 388, 2532-61 (2016)）。このことは、RAをはじめとする炎症性疾患におけるBT2の治療的可能性を示している。
結論として、BT2は、血管透過性、血管新生および炎症性の徴候を標的とした医療設備における新たな手段を提供する。BT2は、血管透過性を媒介するERK-FosB-VCAM1軸を確立するための分子ツールとして機能した。BT2は、ERK-FosB-VCAM1軸を介した血管透過性を確立する分子ツールとなり、良好な毒性プロファイルとともに、網膜疾患やリウマチに対する本化合物の臨床的有用性が示唆される。BT2は、VEGFを主な標的とする抗体やタンパク質を用いた現在の臨床治療とは異なり、VEGFに限らず血管新生や炎症反応の基盤となる複数の遺伝子の誘導性発現を抑制する。また、煮沸やオートクレーブおよび室温での数カ月の保管後も生物学的活性が維持されることから、医薬的魅力も加わっている。トリアムシノロンアセトニドと同様に、BT2は水に難溶性であり、そのため、ボーラス注射が注射部位に徐放を促進するデポ剤を形成しうるさらなる利点を提供する可能性がある（Yang, Y., et al, Retina 35, 2440-2449 (2015)）。さらに、BT2は、持続的な放出を促進する体内リザーバーまたはインプラント戦略および眼球送達システムにおいて使用され得る（Kang-Mieler, J.J., et al. Eye (Lond) 34, 1371-1379 (2021)）。
以下の特許請求の範囲および本発明の先行する明細書において、文脈が明示的な言語または必要な含意により別のものを要求する場合を除き、単語「comprise」または「comprises」もしくは「comprising」などの変形は、包括的な意味で、すなわち、述べられた特徴の存在を特定するが本発明の種々の実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除しない意味で使用される。
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Claims (59)

  1. FosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはERK1/2リン酸化阻害剤の有効量を投与することを含む、血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖の低減方法。
  2. 阻害剤が、FosB/ΔFosB発現を阻害する化合物である、請求項１の方法。
  3. 化合物が、ERK1/2リン酸化阻害剤でもある、請求項2の方法。
  4. 化合物が、VCAM-1発現阻害剤でもある、請求項2または3の方法。
  5. 化合物が、ERK1/2リン酸化、FosB/ΔFosB発現およびVCAM-1発現の阻害剤である、請求項2の方法。
  6. 化合物が、限定されないが、ICAM-1、CXCL2、KLF5、Egr-1およびc-Fosなどの細胞増殖、遊走、血管新生および／または炎症に関与する制御遺伝子の阻害剤である、請求項１～５のいずれか１項の方法。
  7. 化合物が、SAPK/JNKまたはp38リン酸化を阻害しない、請求項１～６のいずれか1項の方法。
  8. 化合物が、カルバメート部位を含む、請求項１～７いずれか１項の方法。
  9. 化合物が、ジベンゾオキサゼピノンまたはベンゾフェノンである、請求項１～８のいずれか1項の方法。
  10. 化合物が、化学式I:
    Figure 2023518375000205
     （式中、
    Xが、F、Cl、BrもしくはI;
    Gが、C=OもしくはC=N-OH; および
    Aが:
    Figure 2023518375000206
    （式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状 C1-C6アルキル）;
    またはAが:
    Figure 2023518375000207
    （式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)）; もしくは式II：
    Figure 2023518375000208
     （式中、
    R3が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;および
    R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル、または
    R4が
    Figure 2023518375000209
    （式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキルである)）
    の化合物、またはその医薬上許容し得る塩である、請求項１～９のいずれか１項の方法。
  11. Xが、FまたはClである、請求項１０の方法。
  12. 式(I)の化合物が、式（I-1):
    Figure 2023518375000210
     （式中、
    Xが、F、Cl、BrもしくはI; および
    Aが:
    Figure 2023518375000211
    （式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）;
    またはAが:
    Figure 2023518375000212
    （式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキルである)）の化合物である、請求項１０または１１の方法。
  13. 式（I-1)の化合物が、式（I-1a):
    Figure 2023518375000213
     （式中、
    Xが、F、Cl、BrもしくはI;
    pが1、2、3もしくは4; および
    R1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキルである）の化合物である、請求項１２の方法。
  14. 式（I-1a)の化合物が:
    Figure 2023518375000214
    である、請求項１３の方法。
  15. 式(I)の化合物が、式（I-2):
    Figure 2023518375000215
     (式中、
    Xが、F、Cl、BrもしくはI;および
    Aが:
    Figure 2023518375000216
    （式中、pが1、2、3もしくは4;およびR1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）;
    またはAが:
    Figure 2023518375000217
    （式中、R2が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル）である)）の化合物である、請求項１０の方法。
  16. 式（I-2)の化合物が、式（I-2a):
    Figure 2023518375000218
     (式中、
    Xが、F、Cl、BrもしくはI;
    pが1、2、3もしくは4;および
    R1が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル)
    の化合物である、請求項１５の方法。
  17. 式（I-2a)の化合物が:
    Figure 2023518375000219
    である、請求項１６の方法。
  18. 化合物が、式（II):
    Figure 2023518375000220
     (式中、
    R3が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;および
    R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル、
    またはR4が
    Figure 2023518375000221
    （式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキルである)）の化合物である、請求項１０の方法。
  19. R3が、直鎖状C1-C6アルキルまたは分枝状C1-C6アルキルである、請求項１８の方法。
  20. R3が、-CH2CH3または-CH2CH(CH3)2である、請求項１８の方法。
  21. R4が、直鎖状C1-C6アルキルまたは分枝状C1-C6アルキルである、請求項１８の方法。
  22. R4が、-CH2CH3 または-CH2CH(CH3)2である、請求項１８の方法。
  23. R4が、
    Figure 2023518375000222
    （式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖状C1-C6アルキルまたは分枝状C1-C6アルキルである）である、請求項１８の方法。
  24. qが2である、請求項２３の方法。
  25. R5が-CH3である、請求項２３の方法。
  26. qが2およびR5が-CH3である、請求項２３の方法。
  27. 式（II)の化合物が、式（II-1):
    Figure 2023518375000223
     （式中、
    R4が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキル;
    またはR4が:
    Figure 2023518375000224
    （式中、qが、1、2、3もしくは4;およびR5が、直鎖もしくは分枝状C1-C6アルキルである)）の化合物である、請求項１８の方法。
  28. 式（II-1)の化合物が:
    Figure 2023518375000225
    から選択される、請求項１８の方法。
  29. 式（II)の化合物が:
    Figure 2023518375000226
    である、請求項２８の方法。
  30. 化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を投与することを含む、対象における血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態の治療方法。
  31. 化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるAP-1、および／またはFosB/ΔFosBおよび／またはERK1/2および／またはVCAM-1および／またはVEGF-Aおよび／またはIL1-βを介する疾患または状態の治療または予防方法。
  32. 化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を対象に投与することを含む、AP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2-依存性の遺伝子発現の低減方法。
  33. 化学式IまたはIIの化合物が:
    Figure 2023518375000227
     からなる群から選択される化合物、またはその医薬上許容し得る塩、
    である、請求項３０～３２のいずれか１項の方法。
  34. 血管透過性、新生血管形成、血管新生、炎症、細胞遊走および／または細胞増殖に関連する疾患または状態が、AP-1、および／またはFosB/ΔFosBおよび／またはERK1/2および／またはVCAM-1および／またはVEGF-Aおよび／またはIL1-βを介する疾患または状態である、請求項３０または３３に記載の方法。
  35. 疾患または状態が、以下からからなる群より選択される請求項３０、３１または３３または３４のいずれか１項の方法：
    ・関節炎;
    ・関節リウマチ;
    ・骨破壊;
    ・加齢黄斑変性;
    ・糖尿病性網膜症;
    ・黄斑浮腫;
    ・血管漏出;
    ・血管透過性;
    ・網膜血管の透過性;
    ・血管新生;
    ・内皮細胞機能不全;
    ・アテローム性動脈硬化症;
    ・脳卒中;
    ・心筋梗塞;
    ・末梢血管疾患;
    ・狭窄;
    ・再狭窄;
    ・炎症;
    ・サイトカインストーム;
    ・肺炎症;
    ・肺繊維症。
  36. 以下:
    Figure 2023518375000228
     から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩の有効量を細胞に接触させることを含む、細胞中のAP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2-依存性の遺伝子発現および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現の低減方法。
  37. 有効量の:
    Figure 2023518375000229
    またはその医薬上許容されるその塩と一緒にERK1/2分子をインキュベートすることを含む、ERK1/2リン酸化の阻害方法。
  38. 方法が、インビトロで実施される、請求項３６～３７のいずれか１項の方法。
  39. 化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩を含む、AP-1依存性の遺伝子発現および／またはERK1/2-依存性の遺伝子発現および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現の低減用キット。
  40. 化合物が、以下:
    Figure 2023518375000230
     から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩である、請求項３９のキット。
  41. 下記一般式:
    Figure 2023518375000231
    を有する化合物またはその医薬上許容し得る塩。
  42. 化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を投与することを含む、対象における以下からなる群より選択される状態または疾患の治療または予防方法:
    ・関節炎;
    ・関節リウマチ;
    ・骨破壊;
    ・加齢黄斑変性;
    ・糖尿病性網膜症;
    ・黄斑浮腫;
    ・血管漏出;
    ・血管透過性;
    ・網膜血管の透過性;
    ・血管新生;
    ・内皮細胞機能不全;
    ・アテローム性動脈硬化症;
    ・脳卒中;
    ・心筋梗塞;
    ・末梢血管疾患;
    ・狭窄;
    ・再狭窄;
    ・炎症;
    ・サイトカインストーム;
    ・肺炎症;
    ・肺繊維症。
  43. 化合物が以下:
    Figure 2023518375000232
     から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩である、請求項４２の方法。
  44. 化合物が、
    Figure 2023518375000233
    である、請求項４２の方法。
  45. 化合物が、
    Figure 2023518375000234
    である、請求項４２の方法。
  46. 化学式IIの化合物またはその医薬上許容し得る塩、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
  47. 下記一般式:
    Figure 2023518375000235
    の化合物またはその医薬上許容し得る塩、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
  48. インビトロでのERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現、および／またはVCAM-1発現、および／またはVEGF-A発現の低減のための、化学式IもしくはIIの化合物またはその医薬上許容し得る塩の使用。
  49. インビトロでのERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現、および／またはVCAM-1発現、および／またはVEGF-A発現の低減に使用するための、化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩。
  50. 化学式IもしくはIIの化合物、またはその医薬上許容し得る塩の有効量を細胞に接触させることを含む、インビトロでの細胞中のERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現の低減方法。
  51. インビトロでのERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現、および／またはVCAM-1発現、および／またはVEGF-A発現の低減のための、下記一般式
    Figure 2023518375000236
    から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩の使用。
  52. インビトロでのERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現、および／またはVCAM-1発現、および／またはVEGF-A発現の低減に使用するための下記一般式
    Figure 2023518375000237
     から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩。
  53. 下記一般式
    Figure 2023518375000238
    から選択される化合物またはその医薬上許容し得る塩の有効量を細胞に接触させる工程を含む、インビトロでの細胞中のERK1/2リン酸化、および／またはFosB/ΔFosB発現および／またはVCAM-1発現および／またはVEGF-A発現の低減方法。
  54. 化学式IまたはIIの化合物が、E異性体もしくはZ異性体またはE異性体およびZ異性体の混合物である、請求項１０～３８、４２～４５または５０または５３のいずれか１項の方法。
  55. 化学式IまたはIIの化合物が、E異性体もしくはZ異性体またはE異性体およびZ異性体の混合物である、請求項３９または４０のキット。
  56. 化合物が、E異性体もしくはZ異性体またはE異性体およびZ異性体の混合物である、請求項４１または５２の化合物。
  57. 化学式IまたはIIの化合物が、重水素化されている、請求項１０～３８、４２～４５または５０のいずれか１項の方法。
  58. 化学式IまたはIIの化合物が重水素化されている、請求項３９または４０のキット。
  59. 化合物が、重水素化されている、請求項４１または５２の化合物。
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