JP2023517997A - 負荷誘発性筋肥大を増強するための新規栄養素 - Google Patents

Abstract

例えば、SIRT1を阻害する天然産物の新規の組み合わせの投与を介して、筋肥大を増加させるための方法および組成物を提供する。TIFF2023517997000009.tif61128

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年3月10日に出願された、米国仮特許出願第62/987,807号に対する優先権を主張し、この出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

背景
個人の死亡率は低い筋量(17)および筋力(14、15)の両方と相関しているため、筋量および筋力はヒトの健康の重要な側面である。また、筋量および筋機能が低いと、手術後の回復および可動性が制限され、糖尿病、心血管疾患、およびがんなどの疾患の影響やリスクが高まる(2)。したがって、筋量および筋力を改善することは長寿の重要な部分である(8)。

筋量および筋力はまた、ヒトの美学および性能の重要な要素である。毎年、筋量および筋力の増加をもたらすとされるサプリメントに大金が費やされている。これらの製品の多くは、筋量および筋力の真正な改善をもたらす製品についての大規模なスクリーンはまれであるため、科学的価値が疑わしい。トレーニングの結果としての筋量増大を増加させるための臨床的に確認された一つの方法は、筋力トレーニングとタンパク質補給を組み合わせることである(3)。しかし、トレーニングに応答して筋量を増加させるための科学的に確認された他の栄養的方法はほとんど報告されていない。

サーチュイン1(SIRT1)は、細胞エネルギーフラックスの変化に応答して筋肉内で活性化されるNAD⁺依存性脱アセチル化酵素である。カロリー制限(6)および持久運動(3)中の代謝ストレスは、SIRT1を直接活性化することが知られている。カロリー制限および持久運動はまた筋成長を遅らせることも知られているため(1、7)、本発明者らはSIRT1が筋成長を阻害するという仮説を立てた。タンパク質アセチル化もまた、筋成長に関連付けられている。リボソームS6プロテインキナーゼ(S6K1)は、そのリン酸化および活性が、増加した筋タンパク質合成および筋肥大と関連していることが以前に示されている(1)が、このキナーゼは、アセチルトランスフェラーゼp300によってアセチル化され、SIRT1によって脱アセチル化され得る(9)。S6K1以外に、リボソーム内のほぼ全てのタンパク質が、アセチル化によって調節される(4)。これらのデータは、アセチル化がタンパク質合成を調節する新規な方法であり得ることを示唆している。負荷および栄養摂取は筋成長において重要な役割を果たすと考えられている筋タンパク質合成の一時的な増加をもたらすため、本発明者らは、アセチル化を変えることが肥大刺激に応答しての筋線維断面積の増加を増強できるかどうかを決定しようとした。

したがって、筋肥大を促進し、筋量および筋力を増加させるための、新しく、科学的に有効で、効果的で、かつ安全な方法および組成物が当技術分野において必要とされている。本開示は、この必要性を満たし、さらに他の利点を提供する。

概要
一局面において、本開示は、以下の工程を含む、筋肉負荷を受けている哺乳動物における骨格筋成長を増強する方法を提供する：治療有効量の(i)1つまたは複数のカテキンおよび(ii)セラストロールまたはその誘導体を含む組成物を、該哺乳動物へ投与する工程。

いくつかの態様において、1つまたは複数のカテキンは、エピカテキンモノガラートまたはエピガロカテキン-3-モノガラートを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のカテキンは、エピカテキンモノガラートおよびエピガロカテキン-3-モノガラートを含む。いくつかの態様において、セラストロール誘導体はジヒドロセラストロールである。いくつかの態様において、組成物は、エピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールを含む。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物における少なくとも1つの骨格筋の筋線維断面積の増加をもたらす。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物の体重または心臓もしくは肝臓の重量を実質的に変化させない。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物の1つまたは複数の筋肉におけるSIRT1の活性を低下させる。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物の1つまたは複数の筋肉における1つまたは複数のリボソームタンパク質のアセチル化を増加させる。

いくつかの態様において、組成物を哺乳動物へ経口投与する。いくつかの態様において、組成物は栄養補助食品または食品添加物として製剤化されている。いくつかの態様において、栄養補助食品または食品添加物は、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、エネルギーバー、プロテインバー、またはグミである。いくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.7～1.3 mg/kg/日のエピカテキンモノガラートを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンモノガラートを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約6～20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.2～0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンモノガラート、約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラート、および約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物によって受容されるエピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対重量比がそれぞれ約0.7 : 20 : 0.5となるように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物によって受容されるエピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対モル比がそれぞれ約1.6 : 43.6 : 1.1となるように製剤化および投与される。いくつかの態様において、方法は、筋肉負荷および組成物の投与と同時に、哺乳動物におけるカロリー摂取量および／または筋成長促進アミノ酸の摂取量を増加させる工程をさらに含む。いくつかの態様において、組成物は、ロイシン、分岐鎖アミノ酸、または高ロイシン含有量を有するタンパク質をさらに含む。

別の局面において、本開示は、治療有効量の(i)1つまたは複数のカテキンおよび(ii)セラストロールまたはその誘導体を含む、筋肉負荷を受けている哺乳動物における筋成長を増強するための組成物を提供する。

いくつかの態様において、1つまたは複数のカテキンは、エピカテキンモノガラートまたはエピガロカテキン-3-モノガラートを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のカテキンは、エピカテキンモノガラートおよびエピガロカテキン-3-モノガラートを含む。いくつかの態様において、セラストロール誘導体はジヒドロセラストロールである。いくつかの態様において、組成物は、エピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールを含む。いくつかの態様において、組成物は経口投与用に製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は栄養補助食品または食品添加物として製剤化されている。いくつかの態様において、栄養補助食品または食品添加物は、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、エネルギーバー、プロテインバー、またはグミである。いくつかの態様において、組成物は、ロイシン、分岐鎖アミノ酸、または高ロイシン含有量を有するタンパク質をさらに含む。

いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.7～1.3 mg/kg/日のエピカテキンモノガラートを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンモノガラートを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約6～20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.2～0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンモノガラート、約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラート、および約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物中のエピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対重量比はそれぞれ約0.7 : 20 : 0.5である。いくつかの態様において、組成物中のエピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対モル比はそれぞれ約1.6 : 43.6 : 1.1である。

本開示の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図から当業者には明らかであろう。

図1A～1B. 天然産物対筋肉断面積のボックス-ベンケンモデルの開発。3つの天然産物の18個の別々の組み合わせおよび濃度を、不完全要因計画を用いて研究した。組み合わせのうち13個はユニークであったが、5個はシステム内の生物学的変動性を決定するために同一であった。図1A：14日間の過負荷の後の18の異なる処理群のそれぞれについての線維断面積の平均変化。図1B：一定レベルのセラストロール(500μg/kg/日)でのCSAとエピカテキンおよびエピガロカテキン-3-ガラートの量との関係についての応答曲面プロット。 図1Aの説明を参照のこと。 図2A～2H. 天然産物と筋線維断面積との関係のボックス-ベンケンモデルの検証。異なるレベルの天然産物を伴う14日間の過負荷後の、(図2A)体重、(図2B)心臓重量/体重、(図2C)肝臓重量/体重、(図2D)筋量。図2E：左から右へ、対照、最小に有効な、中程度に有効な、および最も有効な天然産物の組み合わせにおける線維断面積変化の分布。図2F：14日間の過負荷後の筋線維CSAと筋量との関係。このモデルでは、平均線維CSAの測定可能な変化が起こる前に筋量が約80%増加することに注意されたい。図2G：過負荷および処理の関数としての平均線維CSA。図2H：ボックス-ベンケンモデルからの線維CSAの変化の予測と、14日間の過負荷後の線維CSAの実際の測定された変化との関係。データは1処置群当たりn=5匹の動物についての平均値±SEMである。*は対照筋肉との有意差を示す。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Aの説明を参照のこと。 図3A～3C. 過負荷および天然産物処置によるSIRT1レベルおよびアセチル化。図3A：過負荷および天然産物処置後のSIRT1タンパク質のレベル。図3B：過負荷および天然産物での処置の両方によるK382におけるp53のアセチル化。天然産物処置によるp53アセチル化のより大きな増加に注意されたい。しかし、各群内の変動性は統計的有意性を排除する。最後に、図3Cは、筋肉ホモジネート全体におけるリジンのアセチル化のレベルを示す。データは1処置群当たりn=5匹の動物についての平均値±SEMであり、各点が示されている。*は対照筋肉との有意差を示す。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図4A～4G. 過負荷および天然産物処置によるタンパク質合成およびリボソームマーカー。図4A：SUnSETによって推定されるタンパク質合成。ブロットおよび定量化データの両方を示す。リボソーム質量の推定は、(図4B)全RNA(その約80%がリボソームRNAである)、(図4C)内部転写スペーサー1(ITS1)、および(図4D)5'外部転写スペーサー(5'ETS)を測定することによって行った。Akt-mTORC1シグナル伝達のアイデアを得るために、(図4E)Akt Ser473、(図4F)S6K1 Thr389、および(図4G)eEF2リン酸化を測定した。データは1処置群当たりn=5匹の動物についての平均値±SEMであり、各点が示されている。*は対照筋肉との有意差を示す。 図4-1の説明を参照のこと。 図5A～5B. 過負荷および天然産物処置によるタンパク質代謝回転のマーカー。(図5A)MuRFおよび(図5B)MaFBx mRNAを測定した。データは1処置群当たりn=5匹の動物についての平均値±SEMであり、各点が示されている。*は対照筋肉との有意差を示す。 図6A～6C. 過負荷および天然産物処置によるリボソームタンパク質および調節因子のアセチル化。リボソームアセチル化の推定値を得るために、大きい(L13A)(図6A)および小さい(S6)(図6B)リボソームサブユニットからの代表的なタンパク質を、アセチル-リジン抗体による免疫沈降に続いてブロットした。図6C：S6K1アセチル化のレベルも同様に決定した。2つの尺度の正反対のパターンに注意されたい。データは1処置群当たりn=5匹の動物についての平均値±SEMであり、各点が示されている。*は対照筋肉との有意差を示す。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。

詳細な説明
1．導入
本開示は、対象における負荷誘発性筋肥大を増強するための方法および組成物を提供する。特に、本開示は、自然界には存在せず、かつ、対象における筋肥大を安全かつ効果的に増強し、それによって対象における骨格筋の質量および他の特徴を増加させるために使用することができる、新規な組み合わせを生じさせるために、特定の天然産物を特定の方法で組み合わせることができるという驚くべき発見に基づいている。本方法および組成物は、負荷へ供されたが組成物を受けていない筋肉と比べて筋量の実質的な増加をもたらすことができる。例えば、標準化された負荷プログラムの上に天然産物の本組み合わせを追加することは、負荷のみで見られる増加と比べて少なくとも30%より大きい筋量の増加をもたらすことができる。以下の理論によって束縛されるものではないが、本天然産物は、サーチュイン1タンパク質(SIRT1)を阻害し、リボソームタンパク質および他のタンパク質のアセチル化の増加、リボソーム機能の増強、および筋成長の増強をもたらすと考えられる。

いくつかの態様において、組成物は、1つまたは複数のカテキンならびにセラストロールまたはその誘導体を含む天然化合物の組み合わせを含む。特定の態様において、組成物は、セラストロール、エピカテキンモノガラート、およびエピガロカテキンモノガラートを含む。

本明細書に記載される天然産物は、多数の方法のいずれかで対象へ投与することができる。特定の態様において、天然産物は、例えば、栄養補助食品または食品添加物として経口投与される。いくつかの態様において、栄養補助食品または食品添加物は、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、エネルギーバー、プロテインバー、またはグミである。特定の態様において、組み合わせに含まれる天然産物は、一般に安全と認められる(GRAS)と認定されており、これは、それらがヒトの消費のために、例えば食品添加物として容易に製剤化され得ることを意味する。

2．定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に指定のない限り、それらに帰属させた意味を有する。

本明細書で使用される用語「1つの（a）」、「1つの（an）」、または「その（the）」は、1つのメンバーを有する局面を含むだけでなく、1つを超えるメンバーを有する局面も含む。例えば、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「薬剤（the agent）」への言及は、当業者に公知の1つまたは複数の薬剤への言及を含むなどである。

用語「約」および「およそ」は、本明細書で使用される場合、一般に、測定の性質または精度を前提として、測定された量についての許容可能な誤差の程度を意味するものとする。典型的には、例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の20パーセント(%)以内、好ましくは10%以内、より好ましくは5%以内である。「約X」へのいかなる言及も、具体的には、少なくとも値X、0.8X、0.81X、0.82X、0.83X、0.84X、0.85X、0.86X、0.87X、0.88X、0.89X、0.9X、0.91X、0.92X、0.93X、0.94X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、1.05X、1.06X、1.07X、1.08X、1.09X、1.1X、1.11X、1.12X、1.13X、1.14X、1.15X、1.16X、1.17X、1.18X、1.19X、および1.2Xを示す。したがって、「約X」は、例えば「0.98X」のクレーム限定についての記載された明細書裏付けを教示および提供するように意図される。

用語「発現」および「発現された」は、例えば、タンパク質(例えば、SIRT1)をコードする核酸配列の、転写産物および／または翻訳産物の産生を指す。いくつかの態様において、この用語は、遺伝子(例えば、ヒトSIRT1遺伝子)またはその一部によってコードされる転写産物および／または翻訳産物の産生を指す。細胞内でのDNA分子の発現レベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量、または細胞によって産生されたそのDNAによってコードされたタンパク質の量のいずれかに基づいて評価され得る。

本明細書で使用される場合、「カテキン」は、フラバノール、またはフラバン-3-オール、およびそれらの誘導体のファミリーを指す。カテキンはフラボノイドファミリーのメンバーであり、ココアパウダー、チョコレート、茶、ブドウなどに天然に存在する。カテキンは、2つのベンゼン環と炭素3上にヒドロキシル基を有するジヒドロピラン複素環とを有する。カテキンは4つのジアステレオ異性体を有し、そのうちの2つはトランス配置(「カテキン」と呼ばれる)にあり、2つはシス配置(「エピカテキン」と呼ばれる)にある。本明細書で使用される場合、用語「カテキン」は、エピカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、およびこれらの各々のガラート誘導体を含む、任意のタイプのカテキンを総称的に指すことができる。いくつかの態様において、本組成物中に含まれるカテキンはエピカテキンである。「エピカテキン」は、本明細書で使用される場合、両方のジアステレオ異性体、即ち、(-)-エピカテキン(例えば、PubChem CID 72276を参照のこと)または(+)-エピカテキン(例えば、PubChem CID 182232を参照のこと)、ならびにそれらの誘導体を指す。例えば、「エピカテキン」は、エピガロカテキン(例えば、PubChem CID 72277を参照のこと)、フラバン-3,3’,4’,5,5’,7-ヘキソール、即ち、(-)-エピガロカテキンまたは(+)-エピガロカテキン、ならびにエピカテキンまたはエピガロカテキンと没食子酸とのエステル、例えば、エピガロカテキンガラート、エピガロカテキン-3-ガラート、エピガロカテキンモノガラート、エピカテキンガラート、エピカテキンモノガラート、およびその他を指すことができる。特定の態様において、カテキンは、エピカテキンガラート(またはエピカテキンモノガラート)(例えば、PubChem CID 107905を参照のこと；分子量442.4 g/mol)および／またはエピガロカテキンガラート(またはエピガロカテキンモノガラート、またはエピガロカテキン-3-ガラート、またはエピガロカテキン-3-モノガラート)(例えば、PubChem CID 65064を参照のこと；分子量458.4 g/mol)である。

本明細書で使用される場合、「セラストロール」は、トリプテリギウム・レゲリイ（Tripterygium regelii）から元々単離された五環式トリテルペノイドを指し、PubChem CID 122724(分子量450.6 g/mol)に示されるような例示的な構造を有する。本組成物はまた、セラストロール誘導体、例えば、セラストロールの水素化を介して合成される化合物である、ジヒドロセラストロール(例えば、PubChem CID 10411574を参照のこと)を含む。

「SIRT1」または「サーチュイン1」または「サイレント交配型情報制御2ホモログ1（Silent Mating Type Information Regulation 2 Homolog 1）」は、酵母Sir2タンパク質のホモログである、サーチュインタンパク質ファミリーのクラス1のメンバーである。SIRT1はNAD⁺依存性脱アセチル化酵素であり、細胞エネルギーフラックスの変化に応答して筋肉内で活性化される。SIRT1は、p53およびリボソームS6プロテインキナーゼ(S6K1)などのタンパク質を脱アセチル化することができる。SIRT1タンパク質の機能、構造、局在化などに関する情報は、とりわけ、UniProt Q96EB6 (SIR1_HUMAN)で見つけることができ；SIRT1遺伝子は、例えば、NCBI遺伝子ID番号:23411に対応する。

「SIRT1阻害剤」はSIRT1の発現、安定性、または活性の任意の局面を任意の方法で阻害する、低減する、減少させる、弱める、消失させる、排除する、遅らせる、または妨害することができる、任意の薬剤、例えば、セラストロール、またはエピカテキンモノガラートもしくはエピガロカテキン-3-モノガラートなどのカテキンなどの、天然産物を指す。SIRT1阻害剤は、例えば、発現の任意の局面、例えば、SIRT1をコードする遺伝子、例えばヒトSIRT1遺伝子の転写、RNAプロセシング、RNA安定性、または翻訳を、インビトロまたはインビボで、対照（例えば阻害剤の非存在下）と比較して、例えば、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上低減することができる。同様に、SIRT1阻害剤は、例えば、SIRT1酵素の活性、例えば、p53またはS6K1などの基質に対するデアセチラーゼ活性などの酵素活性を、インビトロまたはインビボで、対照（例えば阻害剤の非存在下）と比較して、例えば、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上低減することができる。さらに、SIRT1阻害剤は、SIRT1酵素の安定性を、インビトロまたはインビボで、対照（例えば阻害剤の非存在下）と比較して、例えば、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上低減することができる。特定の態様において、SIRT1阻害剤は、セラストロール、セラストロール誘導体、またはカテキンもしくはエピカテキン、例えば、エピカテキンモノガラートもしくはエピガロカテキン-3-モノガラートなどの、天然産物である。

用語「誘導体」は、化合物の文脈において、所与の化合物のアミド、エーテル、エステル、アミノ、カルボキシル、アセチル、および／またはアルコール誘導体を含むが、これらに限定されない。

用語「投与する」、「投与すること」、または「投与」は、本明細書に記載される化合物などの薬剤または組成物を所望の生物学的作用部位へ送達することを可能にするために使用され得る方法を指す。これらの方法としては、非経口投与(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、動脈内、血管内、心臓内、くも膜下腔内、鼻腔内、皮内、硝子体内など)、経粘膜注射、経口投与、坐剤としての投与、および局所投与が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の特定の態様において、組成物、例えば、SIRT1阻害化合物の組み合わせは、天然産物であり、また、例えば、経口消費のための健康補助食品もしくは栄養補助食品または食品添加物として製剤化される。

本明細書で使用される場合、「天然産物」とは、天然に存在する、即ち、生きている供給源によって産生される化合物、ならびにそれらの誘導体を指す。本方法において使用される天然産物は、例えば抽出物として、天然源から単離される得るか、または化学的に合成(完全に合成または半合成)され得る。本方法および組成物において使用される「天然産物」は、天然産物自体(例えば、セラストロール)またはその誘導体(例えば、セラストロールの水素化を介して合成される、ジヒドロセラストロール)のいずれかであり得る。本方法および組成物において使用される天然産物の組み合わせは新規であり、自然界では生じない。

筋肉「肥大」は、負荷の増加に応答して骨格筋細胞のサイズの増加を介して起こる筋成長を指し、筋線維の数の付随する増加を伴わない。筋肥大は、例えば、線維断面積、筋量、筋肉性能、または他のパラメータの増加によって検出することができる。

用語「処置する」または「処置」は、以下のいずれか1つを指す：疾患または状態の1つまたは複数の症状を改善すること；そのような症状が発生する前に症状の発現を予防すること；疾患または状態の進行を遅らせるかまたは完全に防ぐこと(再発エピソード間のより長い期間によって明らかであり得るように、症状の悪化の減速または防止など)；寛解期間の開始を強化すること；疾患または状態(一次および二次段階の両方)の進行-慢性期において引き起こされる不可逆的損傷を遅らせること；前記進行期の開始を遅らせること；またはそれらの任意の組み合わせ。本開示の文脈において、本方法および組成物は、例えば、筋成長、筋力、筋量、または状態もしくは疾患の処置についてのパフォーマンスを増加させるために、例えば、手術後の回復、不動、糖尿病、心血管疾患、およびがんなどの状態または疾患から生じる筋萎縮を処置するために、使用することができる。

いくつかの態様において、方法および組成物は、健常人において、例えば、筋萎縮の非存在下で、例えば、審美的、運動的、フィットネス関連、健康関連、または他の理由のために筋量を増加させることを望む個体において、筋成長、筋力、筋量、または筋機能を増強するために使用される。

用語「有効量」もしくは「有効用量」または「治療有効量」もしくは「治療有効用量」は、有利なまたは所望の臨床的または生理学的効果をもたらすために十分である化合物(例えば、SIRT1阻害剤)の量を指す。例えば、本開示において、化合物または天然産物の治療有効量または用量は、対象における筋機能、筋量、筋肥大、筋力、筋性能、または他の特徴の1つまたは複数の局面を増加させるかまたは増強する任意の量または用量であり得る。有効量または用量は、対象の年齢、サイズ、体力のレベル、食事、遺伝的背景、任意の疾患または状態の存在、投与経路、使用される任意の補充療法の種類または程度などを含むがこれらに限定されない、各対象に対する個々の因子に基づいてもよい。いくつかの態様において、化合物または天然産物の有効量は、本明細書に記載されるように、例えば、細胞培養もしくはインビトロアッセイ(例えば、SIRT1阻害を決定することによって)または動物モデル(例えば、筋成長、筋機能、筋量、筋力などを評価することによって)から最初に推定することができる。

用語「対象」および「個体」、ならびに「患者」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために本明細書において互換的に使用される。哺乳動物としては、マウス、ラット、サル、ヒト、ブタ、ウシ、およびヒツジなどのヒト消費のための農業動物または家畜、ならびにスポーツ動物およびペットが挙げられるが、これらに限定されない。

用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)およびそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。特に示されない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列だけでなく、保存的に改変されたそれらの変異体(例えば、縮重コドン置換)、対立遺伝子、オルソログ、SNP、および相補配列も暗黙的に包含する。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において互換的に使用される。3つの用語はすべて、天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用されるだけでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応の天然アミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本明細書で使用される場合、用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結されている、全長タンパク質を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。

3．態様の詳細な説明
本開示は、天然産物の特定の組み合わせが骨格筋の肥大を促進し、それによって、質量、力、持久力、線維CSA(断面積)、性能、および機能を含む筋肉の様々な特徴を増加させることができるという驚くべき発見に基づく。産物は、経口的に、例えば栄養補助食品または食品添加物として、を含む、任意の経路によって投与することができる。いくつかの態様において、化合物の投与は、SIRT1レベルもしくは活性の減少、および／またはp53もしくはリボソームS6プロテインキナーゼ(S6K1)などのSIRT1基質のアセチル化の増加をもたらす。

いくつかの態様において、肥大性筋肉は、例えばウェイトトレーニングまたはレジスタンストレーニングを介して、負荷へ供され、これは天然産物の投与と並行して行われる。骨格筋の負荷は、本化合物の非存在下においても、通常、肥大、ならびに、例えば、筋量、筋線維CSA、および筋力の増加をもたらすが、肥大、ならびに、例えば、筋量、筋線維CSA、および筋力の増加の程度は、それらの非存在下と比べて本化合物の存在下において実質的により大きい。いくつかの態様において、負荷を伴ってのかつ天然産物の存在下での肥大、筋量、筋力、または他の特徴の増加は、負荷を伴ってしかし天然産物の非存在下で見られる増加と比べて、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%またはそれ以上より大きい。いくつかの態様において、負荷は、有酸素活動なしに行われる。いくつかの態様において、天然産物は、筋成長促進アミノ酸またはタンパク質、例えば、ロイシン、分岐鎖アミノ酸、または高ロイシン含有量を有するタンパク質（例えば、乳清タンパク質）と並行して投与される。そのようなアミノ酸またはタンパク質は、天然産物と共にまたは別々に製剤化することができ、また、産物と同時に、または独立したレジメンに従って投与することができる。いくつかの態様において、対象のカロリー摂取量を、本化合物の投与および筋肉負荷と並行して増加させる。

対象
対象は、対象にとって筋肥大、筋成長、筋量、筋力、筋性能、または筋機能の増加が望ましいであろう、任意の対象、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物であることができる。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は成人である。いくつかの態様において、対象は小児である。いくつかの態様において、対象は青年である。いくつかの態様において、対象は女性である。いくつかの態様において、対象は男性である。

いくつかの態様において、対象は、筋量または機能の喪失(例えば、筋萎縮)に関連する疾患または状態、例えば、糖尿病、心血管疾患、不動、がん、悪液質、または手術後の回復を有し、天然産物は、対象における萎縮した筋肉の質量、機能、線維CSA、または他の特徴を回復または増加させるために投与される。一般に、骨格筋量もしくは機能の喪失を伴うか、または1つもしくは複数の骨格筋の質量もしくは機能の増加から何らかの方法で利益を得ることができる任意の疾患または状態を、本方法および組成物を用いて処置することができる。

いくつかの態様において、対象は、筋量または機能の喪失に関連する疾患または状態を有さず、また、萎縮した筋肉を有さないが、代わりに、別の理由から、例えば、力を増加させるために、協調を改善するために、運動能力を高めるために、骨密度を増加させるために、代謝を改善するために、靭帯および腱を強化するために、怪我のリスクを減らすために、または審美的理由から、筋量または機能の増加を望む。

特定の態様において、本組成物は、骨格筋の負荷、例えば、有酸素活動の非存在下での骨格筋の負荷と共に投与される。負荷は、例えば、ウェイトトレーニング(例えば、フリーウェイト)、ウェイトマシン、レジスタンスバンド、または抵抗のために対象の体重を使用するエクササイズを通じて行うことができる。負荷は、連続的または間欠的な、高負荷または低負荷であり得、例えば、それぞれ、1セット当たりのより少ないまたはより多い繰り返しを伴う。負荷は、1つまたは少数の筋肉に、またはより一般的には身体全体の筋肉に集中させることができる。

任意の骨格筋が、本方法および組成物によって影響を受けることができ、これらとしては、胸筋複合体（musculi pectoralis complex）、広背筋、大円筋および肩甲下筋、腕橈骨筋、二頭筋、上腕筋、方形回内筋、円回内筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、浅指屈筋、深指屈筋、短母指屈筋、母指対立筋、母指内転筋、短母指屈筋、腸腰筋、腰筋、腹直筋、大腿直筋、大臀筋、中臀筋、内側ハムストリング、腓腹筋、外側ハムストリング、四頭筋機構、長内転筋、短内転筋、大内転筋、内側腓腹筋、外側腓腹筋、ヒラメ筋、後脛骨筋、前脛骨筋、長趾屈筋、短趾屈筋、長母趾屈筋、長母趾伸筋、眼筋、咽頭筋、括約筋、手筋、腕筋、足筋、脚筋、胸筋、腹筋、背筋、臀部筋、肩筋、頭頸部筋などが挙げられる。

いくつかの態様において、組成物は、対象の筋肉におけるSIRT1活性の減少をもたらす。いくつかの態様において、組成物は、対象における1つまたは複数のリボソームタンパク質のアセチル化の増加をもたらす。いくつかの態様において、組成物は、対象の体重または心臓もしくは肝臓の重量を実質的に変化させない。

SIRT1レベルの評価
例えば、SIRT1の阻害剤の有効性を評価する場合に、または対象におけるSIRT1のレベルまたは活性を評価する場合に、筋肉におけるSIRT1のレベルまたは活性を評価するために、多数の方法のいずれかを使用することができる。例えば、SIRT1のレベルは、SIRT1をコードする遺伝子(例えば、SIRT1遺伝子)の転写を調べることによって、SIRT1タンパク質のレベルを調べることによって、SIRT1酵素活性を測定することによって、または間接的に、例えば、p53などのSIRT1基質のアセチル化を測定することによって、評価することができる。

いくつかの態様において、方法は、例えば、適切な反応緩衝液(例えば、過剰のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含有する)中でSIRT1およびp53の存在下で候補化合物をインキュベートすること、および、例えば、Caliper EZ Readerなどの装置を用いて読み取られた、蛍光標識基質からの生成物の電気泳動分離の前後の電荷差に基づく移動度シフトアッセイによって脱アセチル化をモニタリングすることなどの標準的な方法を用いる、SIRT1酵素活性の測定を含む(例えば、実施例1を参照のこと)。

いくつかの態様において、方法は、SIRT1コードポリヌクレオチド(例えば、mRNA)発現の検出を含み、これは、RT-PCR、リアルタイムRT-PCR、半定量的RT-PCR、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、定量的RT-PCR(qRT-PCR)、多重化分岐DNA(bDNA)アッセイ、マイクロアレイハイブリダイゼーション、または配列解析(例えば、RNAシーケンシング(「RNA-Seq」))などの日常的な技術を用いて分析することができる。ポリヌクレオチド発現を定量化する方法は、例えば、Fassbinder-Orth, Integrative and Comparative Biology, 2014, 54:396-406; Thellin et al., Biotechnology Advances, 2009, 27:323-333; およびZheng et al., Clinical Chemistry, 2006, 52:7 (doi: 10/1373/clinchem.2005.065078)に記載されている。いくつかの態様において、リアルタイムまたは定量的PCRまたはRT-PCRは、生体試料中のポリヌクレオチド(例えば、mRNA)のレベルを測定するために使用される。例えば、Nolan et al., Nat. Protoc, 2006, 1:1559-1582; Wong et al., BioTechniques, 2005, 39:75-75を参照のこと。遺伝子発現を測定するための定量的PCRおよびRT-PCRアッセイも市販されている(例えば、TaqMan（登録商標）Gene Expression Assays, ThermoFisher Scientific)。

いくつかの態様において、方法は、例えば、当業者に公知であるイムノアッセイ、二次元ゲル電気泳動、および定量的質量分析などの日常的な技術を用いる、SIRT1タンパク質発現または安定性の検出を含む。タンパク質定量化技術は、一般に、“Strategies for Protein Quantitation,” Principles of Proteomics, 2nd Edition, R. Twyman, ed., Garland Science, 2013に記載されている。いくつかの態様において、タンパク質発現または安定性は、イムノアッセイ、例えば、しかしこれらに限定されないが、酵素免疫測定法(EIA)、例えば、酵素多重免疫測定法(EMIT)、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、IgM抗体捕捉ELISA(MAC ELISA)、および微粒子酵素免疫測定法(MEIA)；キャピラリー電気泳動イムノアッセイ(CEIA)；ラジオイムノアッセイ(RIA)；免疫放射定量測定法(IRMA)；免疫蛍光法(IF)；蛍光偏光免疫測定法(FPIA)；ならびに化学発光アッセイ(CL)によって検出される。所望により、このようなイムノアッセイを自動化することができる。イムノアッセイは、レーザー誘起蛍光と組み合わせて使用することもできる(例えば、Schmalzing et al., Electrophoresis, 18:2184-93 (1997); Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci., 699:463-80 (1997)を参照のこと)。

質量、力、線維断面積(CSA)、タンパク質含有量、線維体積、筋肉効率、性能などを含む、筋肉の多くの特徴のいずれかを、天然産物によって増強することができる。筋成長および性能は、多数の方法のいずれかを用いて、例えば、画像化(例えば、X線、MRI、CT、超音波)、例えば対象生検から採取された筋生検における、分子もしくは細胞分析によって、またはグリップテスト、歩行速度、筋力テスト、抵抗テスト、トレッドミル、または他の機能テストなどの任意の機能テストによって、測定することができる。

化合物
本開示は、天然産物の特定の組み合わせが、骨格筋、例えば、負荷を受けている骨格筋における肥大を促進し得るという驚くべき発見に基づいている。本明細書に記載される組み合わせは、1つまたは複数のカテキン、およびセラストロールまたはその誘導体を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のカテキンおよびセラストロールまたはその誘導体は、SIRT1を阻害し、例えば、インビボまたはインビトロで、対照レベル（例えば阻害剤の非存在下）と比べて、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、またはそれ以上の、SIRT1の発現、安定性、または活性の低下をもたらす。一態様において、SIRT1の活性は、例えば、実施例1に記載されるように、例えば、SIRT1デアセチラーゼ活性から生じる移動度シフトについてアッセイすることにより、例えば、リジン382のアセチル化を調べることによって、p53を基質として用いてインビトロで評価される。

いくつかの態様において、1つまたは複数のカテキン、およびセラストロールまたはその誘導体は、対照レベルと比較して、例えば、1つまたは複数のカテキンおよびセラストロールまたはセラストロール誘導体の非存在下でのレベルと比較して、例えば、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれ以上の、対象における1つまたは複数の筋肉の1つまたは複数の特性の、例えば、成長、質量、力、性能、線維体積、線維断面積の増加をもたらす。

いくつかの態様において、組み合わせに含まれる1つまたは複数のカテキンは、エピカテキンである。特定の態様において、組み合わせに含まれる1つまたは複数のエピカテキンは、エピカテキンモノガラートおよびエピガロカテキン-3-モノガラートである。組み合わせは、任意の様々な量のそれぞれの天然産物を含むことができる。例えば、組み合わせは、対象が約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 mg/kg/日またはそれ以上のいずれかの化合物を受容するように、製剤化および投与することができる。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が約0.7～1.3 mg/kg/日のエピカテキンモノガラートを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンモノガラートを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が約6～20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように製剤化および投与される。

いくつかの態様において、組み合わせは、セラストロール、またはジヒドロセラストロールなどのセラストロール誘導体を含む。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が約0.2～0.5 mg/kg/日のセラストロールまたはセラストロール誘導体を受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が約0.5 mg/kg/日のセラストロールまたはセラストロール誘導体を受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が、約0.7～1.3 mg/kg/日のエピカテキンモノガラート、約6～20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラート、および約0.2～0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化および投与される。特定の態様において、組み合わせは、対象が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンモノガラート、約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラート、および約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組み合わせは、組成物中の(かつ／または、例えば1投与当たりもしくは1日当たり、対象によって受容される)エピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対重量比がそれぞれ約0.7 : 20 : 0.5となるように製剤化される(かつ／または投与される)(即ち、組成物は、例えば、0.7 mgのエピカテキンモノガラート、20 mgのエピガロカテキン-3-モノガラート、および0.5 mgのセラストロール、または、3つの成分の相対重量比が約0.7 : 20 : 0.5のままである限りこれらの量の任意の倍数もしくは分数を含むことができる)。いくつかの態様において、組み合わせは、組成物中の(かつ／または、例えば1投与当たりもしくは1日当たり、対象によって受容される)エピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対モル比がそれぞれ約1.6 : 43.6 : 1.1となるように製剤化される(かつ／または投与される)(即ち、組成物は、例えば、1.6 mmolのエピカテキンモノガラート、43.6 mmolのエピガロカテキン-3-モノガラート、および1.1 mmolのセラストロール、または、3つの成分の相対モル比が約1.6 : 43.6 : 1.1のままである限りこれらの量の任意の倍数もしくは分数を含むことができる)。

いくつかの態様において、セラストロールまたはセラストロール誘導体は、単独でまたはカテキン以外の1つもしくは複数の追加の化合物と組み合わせて投与される。いくつかの態様において、セラストロールまたはセラストロール誘導体は、単独でまたは1つもしくは複数の非カテキン化合物と組み合わせて、インビボまたはインビトロで、対照レベル（例えば、セラストロール、セラストロール誘導体、またはセラストロールを含む組み合わせの非存在下）と比べて、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、またはそれ以上の、SIRT1の発現、安定性、または活性の低下をもたらす。いくつかの態様において、セラストロールまたはセラストロール誘導体は、単独でまたは1つもしくは複数の非カテキン化合物と組み合わせて、対照レベルと比較して、例えば、セラストロール、セラストロール誘導体、またはセラストロールを含む組み合わせの非存在下でのレベルと比較して、例えば、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれ以上の、対象における1つまたは複数の筋肉の1つまたは複数の特性、例えば、成長、質量、力、性能、線維体積、線維断面積の増加をもたらす。

単独でまたは1つもしくは複数の追加の非カテキン化合物と組み合わせて投与される場合、セラストロールまたはセラストロール誘導体は、対象が約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 mg/kg/日またはそれ以上のいずれかの化合物を受容するように、任意の様々な量で製剤化および投与することができる。いくつかの態様において、セラストロールまたはセラストロール誘導体は、対象が約0.2～0.5 mg/kg/日のセラストロールまたはセラストロール誘導体を受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、セラストロールまたはセラストロール誘導体は、対象が約0.5 mg/kg/日のセラストロールまたはセラストロール誘導体を受容するように製剤化および投与される。

本明細書に記載される天然産物は、天然源から、化学合成を通じて、および化学薬品供給業者からを含む、様々な供給源から得ることができる。例えば、エピカテキンモノガラートは、例えば、緑茶、ブドウから単離することができ、または、例えば、Aurora fine chemicals、Sigma-Aldrich、Combi-Blocks、ChemShuttleなどから入手することができる。エピガロカテキンモノガラートは、例えば、緑茶または紅茶から単離することができ、または、例えば、Sigma-Aldrich、Combi-Blocks、King Scientificなどから入手することができる。セラストロールは、例えば、トリプテリギウム・ウィルドルディ（Tripterygium wildordii）およびセラストラス・レゲリイ（Celastrus regelii）の根抽出物から単離することができ、または、例えば、Aurum Pharmatech、Achemtek、ChemShuttle、VWRなどから入手することができる。ジヒドロセラストロールは、例えば、セラストロールの水素化を介して合成することができ、または、例えば、AbovChem、Achemtek、Aurum Pharmatech、Sigma-Aldrichなどから入手することができるる。

製剤化および投与
本明細書に開示される化合物は、多数の方法のいずれかで製剤化および投与することができる。いくつかの態様において、化合物は、薬学的組成物として、即ち、薬学的に許容される担体を含んで、製剤化される。特定の局面において、薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。したがって、本化合物の薬学的組成物の多種多様な好適な製剤が存在する(例えば、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)を参照のこと)。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物を製剤化する際に当業者に公知の任意の標準的な薬学的に許容される担体を含む。したがって、化合物は、それ自体で（例えば、薬学的に許容される塩として存在する）、またはコンジュゲートとして、薬学的に許容される希釈剤；例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、水性エタノール、もしくはグルコースの溶液、マンニトール、デキストラン、プロピレングリコール、油(例えば、植物油、動物油、合成油など)、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、ゼラチン、ポリソルベート80など中の製剤として、または適切な賦形剤中の固形製剤として、調製され得る。

薬学的組成物は、しばしば、1つまたは複数の緩衝液(例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン)、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソールなど)、静菌剤、キレート剤、例えばEDTAまたはグルタチオン、製剤をレシピエントの血液と等張、低張または弱く高張にする溶質、懸濁化剤、増粘剤、保存剤、香味剤、甘味剤、および着色化合物を必要に応じてさらに含む。

本明細書に記載される薬学的組成物は、投薬製剤と適合する方法で、かつ治療上有効であろう量で投与される。投与される量は、例えば、個体の年齢、体重、身体活動、および食事、治療されるべき任意の状態または疾患、ならびに任意の潜在的な状態または疾患の段階または重症度を含む、様々な要因に依存する。特定の態様において、用量のサイズは、特定の個体における治療剤の投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によっても決定され得る。

しかしながら、任意の特定の患者に対する特定の用量レベルおよび投薬頻度は、変化してもよく、用いられる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用長さ、年齢、体重、遺伝的特徴、一般的な健康状態、性別、食事、投与の様式および時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、任意の特定の状態の存在および重症度、ならびに投与されている任意の他の潜在的な療法を含む、様々な要因に依存することが理解されよう。

特定の態様において、化合物の用量は、固体、半固体、凍結乾燥粉末、または液体剤形、例えば、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、停留浣腸剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、エアゾール剤、フォーム剤などの形態をとることができ、好ましくは正確な投与量の単純な投与に適した単位剤形である。

本明細書で使用される場合、用語「単位剤形」は、ヒトおよび他の哺乳動物のための単位投薬量として適した物理的に分離した単位を指し、各単位は、好適な薬学的賦形剤と関連して、所望の作用発現、忍容性、および／または治療効果を生じるように計算された所定量の治療剤を含有する(例えば、アンプル)。加えて、より濃縮された剤形が調製されてもよく、そこから、より希釈された単位剤形が次いで作られ得る。したがって、より濃縮された剤形は、治療用化合物の量よりも実質的に多く、例えば、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍、またはそれ以上を含有するであろう。

このような剤形を調製するための方法は、当業者に公知である(例えば、前出のREMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCESを参照のこと)。剤形は、典型的には、従来の薬学的担体または賦形剤を含み、さらに、他の医薬剤、担体、アジュバント、希釈剤、組織透過促進剤、可溶化剤などを含み得る。適切な賦形剤は、当技術分野で周知の方法によって特定の剤形および投与経路に合わせて調整することができる(例えば、前出のREMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCESを参照のこと)。

好適な賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリアクリル酸、例えばCarbopol、例えばCarbopol 941、Carbopol 980、Carbopol 981などが挙げられるが、これらに限定されない。剤形は、滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油；湿潤剤；乳化剤；懸濁化剤；保存剤、例えば、メチル-、エチル-、およびプロピル-ヒドロキシ-ベンゾアート(即ち、パラベン)；pH調整剤、例えば、無機および有機酸および塩基；甘味剤；ならびに香味剤をさらに含むことができる。剤形はまた、生分解性ポリマービーズ、デキストラン、およびシクロデキストリン包接錯体を含み得る。

特定の態様において、化合物は、経口、頬側、または舌下投与のために製剤化される。例えば、治療有効用量は、錠剤、カプセル剤、丸剤、ペレット、ゲルキャップ、グミ、乳剤、懸濁剤、液剤、シロップ、エリキシル、パスタ、ゲル、顆粒剤、ガム、液体、粉末、速溶性錠剤、発泡性製剤、サシェ、半固体、スプレー、トローチ剤、散剤、チンキ剤、および徐放性製剤の形態とすることができる。投与に好適な賦形剤としては、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。

特定の態様において、天然産物は、甘味剤、香味剤、着色剤、タンパク質、アミノ酸、例えばロイシンまたは他の分岐鎖アミノ酸などのような他の要素を任意で含む、栄養補助食品または食品添加物として、例えば、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、エネルギーバー、プロテインバー、グミ、チョコレート、キャンディー、ミントなどとして、製剤化される。

本明細書に記載される天然産物に加えて、経口投与のための組成物は、任意で、例えば、担体材料、例えば、トウモロコシデンプン、アカシア、ゼラチン、麦芽、トラガント、微結晶セルロース、カオリン、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、アルギン酸、ラクトース、グルコース、またはスクロース；崩壊剤、例えば、微結晶セルロースまたはアルギン酸；結合剤、例えば、アカシア、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース；および／または、滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリコーン液、タルク、オイル、ワックス、コロイダルシリカなどを含有してもよい。

天然産物は、凍結乾燥された形態で提供することもできる。このような剤形は、投与前の再構成のために、緩衝剤、例えば重炭酸塩を含んでもよく、または、緩衝剤は、例えば水での再構成のために凍結乾燥剤形中に含まれてもよい。凍結乾燥剤形は、好適な血管収縮剤、例えばエピネフリンをさらに含み得る。凍結乾燥剤形は、再構成された剤形が個体に直ちに投与され得るように、任意で再構成のための緩衝剤と組み合わせて包装された、注射器内で提供することができる。

いくつかの態様において、追加の化合物または薬物を対象に同時投与することができる。このような化合物または薬物は、処置される疾患の徴候または症状を緩和する、免疫応答の誘導によって引き起こされる副作用を低減するなどの目的のために同時投与することができる。いくつかの態様において、例えば、天然産物は、ロイシンもしくは分枝鎖アミノ酸などの筋成長促進アミノ酸と共に、またはロイシンリッチタンパク質と共に、および／または筋量、筋力、もしくは筋機能を増強することを目的とした任意の他の化合物、例えば別のSIRT1阻害剤と共に、投与される。

本化合物は、対象において局所的にまたは全身的に投与することができる。いくつかの態様において、化合物は、例えば、腹腔内に、筋肉内に、動脈内に、経口的に、静脈内に、頭蓋内に、くも膜下腔内に、脊髄内に、病巣内に、鼻腔内に、皮下に、脳室内に、局所的に、経皮的に、舌下に、頬側に、および／または吸入によって投与することができる。特定の態様において、化合物は、経口的に、例えば、食品添加物として投与される。

いくつかの態様において、化合物は、対象に1回投与される。他の例において、化合物は、ある時点で投与され、そして第2の時点で再び投与される。さらに他の例において、化合物は、限られた期間(例えば、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、1週間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月間、またはそれ以上)にわたって断続的な用量として繰り返し(例えば、1日1回または2回)対象に投与される。いくつかの場合において、化合物の投与間の時間は、約1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月、またはそれ以上である。他の態様において、化合物は、所望の期間にわたって連続的または慢性的に投与される。例えば、化合物は、化合物の量またはレベルが選択された期間にわたって実質的に一定となるように投与することができる。いくつかの態様において、化合物は、長期間にわたって、例えば、数ヶ月間またはそれ以上にわたって、例えば、不確定な期間のウェイトトレーニングプログラムと並行して投与される。

対象への化合物の投与は、当技術分野において一般的に用いられる方法によって達成することができる。導入される化合物の量は、性別、年齢、体重、疾患または状態の有無、筋萎縮の有無、筋量、筋力、または筋機能を増加させるための対象の特定の目標および動機、ならびに所望の結果をもたらすために必要な量などの要因を考慮に入れる。一般に、治療または他の目的について化合物を投与するために、化合物は、「有効用量」または「治療有効用量」で与えられる。「有効量」または「有効用量」とは、所望の生理学的効果をもたらすために十分な量、または所望の結果を達成することができる量であり、これは、状態または疾患を処置するため、例えば、状態または疾患の1つまたは複数の症状または症状発現を軽減または排除するため、ならびに疾患または状態の非存在下で筋量を改善するためを含む。

身体の任意の数の筋肉が、本明細書に記載される化合物の存在により肥大を起こし得る：例えば、二頭筋；三頭筋；腕橈骨筋（brachioradialus muscle）；上腕筋（brachialis muscle）(上腕筋（brachialis anticus）)；表在区画手関節屈筋；三角筋；ハムストリングの大腿二頭筋、薄筋、半腱様筋および半膜様筋；四頭筋の大腿直筋、外側広筋、内側広筋および中間広筋；ふくらはぎの腓腹筋(外側および内側)、前脛骨筋およびヒラメ筋；胸の大胸筋および小胸筋；上背部の広背筋；菱形筋(大菱形筋および小菱形筋)；首、肩、背中にまたがる僧帽筋；腹部の腹直筋；臀部の大臀筋、中臀筋および小臀筋；手筋；括約筋；眼筋;ならびに咽頭筋。

4．キット
本明細書に記載される組成物の他の態様は、本明細書に記載される化合物を含むキットである。キットは、典型的には、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る容器を含み、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含むことができる。ラベルが、典型的には、キットに付属し、キット内容物の使用のための指示または他の情報を提供する電子的またはコンピュータ読み取り可能な形態であり得る、任意の書面または記録された材料を含む。

いくつかの態様において、キットは、筋成長または肥大の促進のための1つまたは複数の試薬を含む。いくつかの態様において、キットは、1つまたは複数のカテキン、およびセラストロールまたはその誘導体を含む。いくつかの態様において、キットは、2つのカテキン、およびセラストロールまたはその誘導体を含む。いくつかの態様において、2つのカテキンはエピカテキンである。いくつかの態様において、エピカテキンは、エピカテキン-3-モノガラートおよびエピガロカテキンモノガラートである。いくつかの態様において、キットは、1つまたは複数の追加の薬剤、例えば、1つまたは複数の筋成長促進アミノ酸またはタンパク質、例えば、ロイシンもしくは分岐鎖アミノ酸、または乳清タンパク質などのロイシンリッチタンパク質をさらに含む。

いくつかの態様において、キットは、本方法の実施のための指示(即ち、プロトコル)を含む説明材料(例えば、萎縮または非萎縮筋における質量、力、または機能を増強するためにキットを使用するための説明書)をさらに含むことができる。説明材料は、典型的には、書面または印刷物で構成されているが、それらに限定されない。そのような説明書を記憶し、それらをエンドユーザに伝達することができる任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体としては、電子記憶媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光媒体(例えば、CD ROM)などが挙げられるが、これらに限定されない。そのような媒体は、そのような説明材料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含み得る。

5．実施例
実施例1．天然産物SIRT1阻害剤による筋肥大の増加
導入
SIRT1が筋成長を阻害したかどうかを決定するために、本発明者らのグループは、野生型および筋肉特異的SIRT1ノックアウトマウス(mKO)において腓腹筋およびヒラメ筋を予め除去し、足底(PLN)筋における代償性成長を決定した。SIRT1 mKOマウスでは、野生型(WT)マウスと比較した場合、2週間の過負荷にわたって筋量の113%のより大きな増加があった。さらに、SIRT1を過剰発現するマウスでは、WTマウスと比較して筋成長の小さいが有意な障害があった。これらのデータは、SIRT1が過負荷誘発性筋成長を阻害するという仮説を支持している。

本研究の目標は二つあり：第一に、本発明者らは、SIRT1を阻害し得る天然産物を同定しようとし；第二に、本発明者らは、これらの天然産物が最適な方法で組み合わされた場合に筋肥大を増強できるかどうかを決定しようとした。全体として、本発明者らの仮説は、筋線維断面積に対する過負荷の効果を高めることができる新規の栄養補助食品を発見できるということであった。

材料および方法
SIRT1阻害剤スクリーン
10枚のソースプレート中のNatProd Collectionライブラリー(MicroSource Discovery Systems, Inc. Gaylordsville, CT)を、2つの用量(反応混合物中50μMおよび5μM最終、各用量についてデュプリケート)でスクリーニングした。基質として3μMのp53を用いて、2 ng/μlの精製ヒトSIRT1に対して化合物の阻害活性を評価した。このアッセイは、Caliper EZ Reader (Perkin Elmer, Boston, MA)を用いて読み取られた蛍光標識基質からの生成物の電気泳動分離の前後の電荷差に基づく移動度シフトアッセイであった。全ての反応を過剰のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下で行い、既知のSIRT1阻害剤スラミンを対照として使用した。

ボックス-ベンケンモデル作成
天然産物スクリーンにおいて同定された阻害剤のうちの3つを、ヒトにおけるそれらの以前の使用および補完的な化学構造に基づいて選択した。次に、これらの阻害剤を使用して、Design-Expert（登録商標）ソフトウェアを使用して不完全多要因計画ボックス-ベンケンモデルを作成した。1つの中心点を有する3要因計画は13匹の動物を必要とした。さらに5匹の動物が、生物学的変動性を決定するために、3つの天然産物すべての中心用量を受容した。

シナジストアブレーション
全ての動物処置は、カリフォルニア大学デービス校のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。18匹のラットをDOEおよび検証実験の両方に使用した。動物を2.5%イソフルランを用いて麻酔し、剃毛し、無菌手術に備えた。ヒラメ筋全体と腓腹筋の下半分をアキレス腱にて除去し、足底(PLN)はそのまま残した。上を覆う筋膜および皮膚を縫合して閉じ、動物を回復のために温度調節された領域に移動した。左肢は対側の対照として機能した。動物を毎日監視し、動物が正常な活動に戻り、処置によるストレスに苦しんでいないことを確認した。動物に消灯の直前に毎日それぞれの処置群に従って胃管栄養法を施した。

筋肉採取
処置の14日目に続いて、動物を麻酔し、過負荷がかけられたおよび対側のPLN筋肉、心臓、および肝臓を採取した。除去時に、PLN筋肉を保存的にトリミングし、計量し、次いでコルク上に静止長にてピンで留め、液体窒素冷却イソペンタン中で急速凍結し、-80℃で保存した。

組織学
PLN筋肉をOTCを用いてコルク上にてクライオスタット中でブロッキングし、10μm切片をCSA定量化のためにスライド上にマウントした。PBST(1% Tweenを含む)中の5%正常ヤギ血清(NGS)中でブロッキングすることによってスライドを組織学的分析のために準備し、I型、IIa型、IIb型線維、および／またはラミニンについての一次抗体中で4℃にて一晩インキュベートした。翌日、スライドをPBST(0.1% Tweenを含む)で洗浄し、HRP結合二次抗体中で60分間インキュベートし、再度洗浄し、Prolong Gold(Dapi無し)を使用してマウントした。Fijiを用いたCSA定量化のために、各筋肉切片の4つのランダム画像を撮影した。

検証実験
シナジストアブレーションに続いて、動物を、対照(n=3)、最小(n=5)、中程度(n=5)、および最適(n=5)の4つの処置群のうちの1つに無作為に割り当てた。対照群はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を受容したが、最小、中程度、および最適群は、PBS中に溶解された単一のカクテルとして3つのSIRT1阻害剤の異なる組み合わせおよび濃度を受容した。すべての処置を、14日間、消灯の直前に経口胃管栄養法によって施した。

mRNA単離、逆転写およびqPCR
ブロッキングに続いて、PLN筋肉を、ハンマーおよび乳棒を用いて粉末化した。全RNAを、製造業者のプロトコルに従ってRNAzolを用いて粉末筋肉組織から抽出した。RNAを、吸光度によってBiotek Epochマイクロプレートリーダー(Biotek, Winooski, VT)を用いて定量化した。1.5マイクログラムの全RNAを、MultiScribe逆転写酵素およびオリゴ(DT)プライマーを用いてcDNAに変換した。cDNAをqPCRの前に1:10に希釈した。Quantified MastermixおよびBio-Rad Sybr Green Mix溶液およびBio-Rad 384ウェルPCRプレートと共に、CFX384 TouchリアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad, Hercules, CA)を使用して、qPCRを実施した。PCR反応を、以下のプライマー：

を用いて製造業者の指示に従って実施した。遺伝子発現を、デルタデルタ閾値サイクル法(Livak and Schmittgen, 2001)を用いて計算し、GAPDHをハウスキーピング遺伝子として用いた。

組織ホモジナイゼーションおよびウェスタンブロッティング
2スクープの粉末を、250μLのスクロース溶解緩衝液(1 M Tris、pH 7.5、1 Mスクロース、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、およびプロテアーゼ阻害剤コンプレックス)中でインキュベートした。溶液を4℃で60分間シェーカー上にセットし、8,000 gで10分間遠心沈殿させ、上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、次いでDCタンパク質アッセイ(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いてタンパク質濃度を決定した。750μgのタンパク質を4X Laemmliサンプルバッファー(LSB)で希釈し、5分間煮沸した。10μLのタンパク質サンプルをCriterion TGX Stain-Free Precast Gel上へロードし、200Vの定電圧で45分間泳動させた。メタノール中で活性化させ、100Vの定電圧にて60分間転写バッファー中でノーマライズした後、Immobilon-P PVDF膜にタンパク質を次いで転写した。膜をTBST(0.1%Tweenを含むトリス緩衝生理食塩水)中の1% Fish Skin Gelatin (FSG)中でブロッキングし、1:1,000でTBSTまたはFSGのいずれか中に希釈された適切な一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。翌日、膜をTBSTで5分間3回洗浄し、1:5,000での0.5% Nonfat Milk TBST溶液中のペルオキシダーゼ結合二次抗体と共に室温で引き続いてインキュベートした。結合した抗体を、化学発光HRP基質検出溶液(Millipore, Watford, UK)を用いて検出した。イメージングおよびバンド定量化は、BioRadを用いて決定した。

免疫沈降
筋肉粉末をホモジナイズし、上記のようにタンパク質を定量化し、500μgのタンパク質を25μLの抗体負荷Protein G-Dynaビーズを含むチューブに入れ、エッペンドルフチューブに小分けし、指示されたプロトコル(Thermo Scientific, Protein G-Dyna Beads)を用いて免疫沈降のために準備した。プルダウン用抗体を1:100の濃度で使用し、最終溶液を30μLの1X LSB中に沈め、5分間煮沸し、-80℃で保存した。1ウェル当たり6μLのサンプルをCriterion TGX Stain-Free Precast Gel上へロードし、上記のウェスタンブロッティングプロトコルで進めた。

抗体
ウェスタンブロッティングおよび免疫沈降のための一次抗体を、1:1000の濃度に希釈した。抗体は、Cell Signaling Technology (Danvers, MA, United States)製 - トータルeEF2 (CS-2332S)、p-53 (CS-2524S)、ホスホ-eEF2 (CS-2331S)、SIRT1 (CS-947S)、Ac-Lys (CS9441S)、ホスホ-S6 (CS-5364S)、Ac-p53 (CS-252S)、P-AKT (Ser473) (CS-4060S)、シトクロム-C (CS-4280S)；Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, United States)製 - rps6 (SC-13007)、rpL13a (SC-390131)、ジストロフィン(SC-465954)；Abcam (Cambridge, UK)製 - Total OxPhos (ab110413)；およびMillipore製 - ピューロマイシン(MABE343)であった。

統計
全てのデータは、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)を用いた二元配置分散分析を用いて分析した。Tukeyの事後分析を、相互作用が存在する場合の差異を決定するために使用した。統計的有意性をp＜0.05に設定した。全てのデータを平均値±標準誤差(SEM)として示す。

結果
SIRT1阻害剤スクリーン
800の天然産物のハイスループットスクリーンは、50μMの濃度でSIRT1を＞65%阻害する45の化合物を同定した。これらのうち、多くがSIRT1に対して用量依存的な効果を示し、35の化合物は5μMで少なくとも20%の阻害を示した。同定された35の阻害剤のうち、3つは既にヒトの食品に広く使用されており(表1)、3つの異なる化学クラス(キノンメチド、ポリフェノール、およびフラボノイドそれぞれ1つ)に由来した。これらの化合物(セラストロール、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびエピカテキンモノガラート)を、哺乳動物における筋肥大を改善することを目的として、さらなる研究のために選択した。

DOEモデル作成
上記で同定された3つの化合物を、これら異なる産物間の相互作用を迅速に評価するために、ボックス-ベンケン不完全要因計画に入れた。13匹のラットに3つの産物の異なる組み合わせ(0～2 mg/kg/日エピカテキン；0～10 mg/kg/日エピガロカテキン-3-ガラート；および0～500μg/kg/日セラストロール)を受容させ、一方、5匹の対照に、生物学的変動性を決定するために各産物の中間量を受容させた。14日間の過負荷は、処置に依存して-4.25%から115.8%までの範囲の筋線維断面積の変化をもたらし(図1)、対照の平均値は66.8±6.98%であった。これらのデータから、応答曲面プロットは、エピガロカテキン-3-ガラートが他の2つの産物の効果を調節できることを示し、各産物の最適な組み合わせおよび濃度を予測するモデルが作成された(図1B)。

モデル検証
モデルを検証するために、独立したラット群にシナジストアブレーションを受けさせ、次いで、生理食塩水対照、または、予測された最適、最小有効、もしくは他の2つの群の間での線維CSAの増加をもたらすと予測された3つの産物の組み合わせのいずれかを用いて、毎日胃管栄養法を施した。各群についての各産物の用量を表2に概説する。14日間の過負荷および処置の後、動物を犠牲にし、身体、心臓、肝臓および筋肉の重量を決定した(図2)。身体、心臓、または肝臓質量について、未処置群と処置群の間に統計的差異はなく、処置が急性毒性をもたらさなかったことを示唆している。中程度群および最適群の両方が、対照処置ラットと比べて筋量の有意な増加を示した。筋線維CSAの分析は、対照肢が処置に関係なく線維CSAの同様の分布を示すことを実証した。過負荷での線維CSAの右シフトがあり、これは最適群において最大であった。全群についてのシャム肢の平均線維CSAは、対照群、最小群、中程度群および最適群についてそれぞれ1847±114.6、1945±132.5、1883±114.6、および1730±60.0μm²であったのに対し、過負荷肢は、それぞれ各群について、1901±108.3、2348.1±172.8、2306.5±119.7、および2800±145.9μm²の平均値を示した(図2G)。ボックス-ベンケンモデルの予測力を検定するために、線維CSAの予測変化を各群の測定値に対してプロットした。得られた線は、筋肥大の変化を予測するモデルの能力を確認する0.9586のr²値を有していた(図2H)。

SIRT1レベルおよび活性
処置はSIRT1を阻害するためのものであったため、SIRT1のレベルおよびその酵素活性のゲージ(p53アセチル化)を決定した(図2)。以前に過剰提供された（overserved）ように、SIRT1のレベルは、対照群において過負荷後に有意に増加し(約2倍)、SIRT1レベルは、SIRT1阻害剤による処置後の対照肢および過負荷肢の両方でさらにより高かった。SIRT1活性の尺度として、本発明者らはリジン382におけるp53のアセチル化のレベルを決定した。他のSIRT1阻害剤について報告されたように(16)、天然産物カクテルによる処置と合わせての過負荷は、この残基でのp53アセチル化を増加させ；しかしながら、異なる用量でp53アセチル化に差はなかった。最後に、天然産物カクテルが全体的なタンパク質アセチル化を変化させたかどうかを決定するために、総アセチル化タンパク質を測定したところ、2週間の時点でいずれの処置においても総アセチル化タンパク質に統計的差はなかった。

タンパク質合成応答
天然産物が筋線維CSAを増加させていたメカニズムを理解し始めるために、タンパク質合成の速度をSuNSeTによって決定した。天然産物カクテルではベースラインタンパク質合成が増加する傾向があったにもかかわらず、過負荷ではタンパク質合成の増加は、すべての処置群で同様であった(図4A)。リボソーム質量は過負荷時などの極限状態でタンパク質合成を制御すると考えられているため、本発明者らは次に全RNAとリボソーム生合成の速度を決定した。本発明者らの仮説に反して、全RNAは対照から最適処置へ減少する傾向があった。さらに、リボソームRNA合成の速度を、内部転写スペーサー1(ITS1)および5'外部転写スペーサー(5'ETS)の発現を測定することによって決定したところ、リボソーム生合成のこれらのマーカーの発現は、対照から、最小へ、中程度へ、最適へ減少し、ここで、5'ETS値は対照処置筋肉よりも有意に低かった(図4C～4D)。天然産物群における成長の増加がより大きなAkt-mTORC1シグナル伝達の結果であるかどうかを決定するために、Akt、S6K1、およびeEF2のリン酸化を決定した。Aktリン酸化は、過負荷で増加し、天然産物において減少する傾向があり(図4E)；しかし、これらの効果のいずれも有意性に達しなかった。以前に報告されたように、S6K1リン酸化は、過負荷肢においてより高かった(図4F)。予想に反して、過負荷誘発性S6K1リン酸化が対照から最適天然産物組み合わせに向かって減少する傾向があり；しかし、S6K1の活性(eEF2リン酸化を介して決定される)は、いずれの過負荷群においても異ならなかった(図4G)。

タンパク質代謝回転／分解のマーカー
タンパク質合成に対する天然産物の効果がなかったため、MuRFおよびMafBxの発現を測定することによって、タンパク質代謝回転のマーカーの迅速な測定を行った。以前に報告されたように、MuRFおよびMafBx発現は過負荷と共に増加する傾向があり、天然産物処置によって影響されなかった(図5)。

リボソームタンパク質アセチル化
リボソームタンパク質はアセチル化によって調節される。SIRT1は脱アセチル化酵素であるため、大小のリボソームサブユニットを代表するタンパク質のアセチル化を免疫沈降後に決定した。天然産物カクテルの最適化と共に、リボソームタンパク質のアセチル化が増加する傾向があった(図6A～6B)。対照的に、S6K1アセチル化は、天然産物カクテルの最適化と共に減少する傾向があった(図6C)。

考察
本明細書において、本発明者らは、いくつかの天然産物がインビトロ活性アッセイにおいてSIRT1を阻害する能力を有することを示す。食品に添加される化学物質が専門家によって安全であるとみなされ、したがって連邦食品・医薬品・化粧品法の食品添加物許容要件を免除される食品医薬品局の指定である、一般に安全と認められる(GRAS)、これらの天然産物の3つを適切な量で組み合わせると、14日間の過負荷後に筋線維肥大の大幅な増加がもたらされる。筋線維CSAの有意な増加は、リボソーム質量の増加の結果ではなかった。実際、最適群は、有意により少ない5'ETS、ならびにより低いITS1レベルおよび全RNAへの強い傾向を示し、これはより少ないリボソームを示唆している。リボソームタンパク質のアセチル化は増加する傾向があり、これは、筋原線維タンパク質の増加が、リボソームの容量ではなく効率の増加の結果であり得ることを示唆している。重要なことに、天然産物カクテルは体重や心臓および肝臓の重量を変えず、これは、それが限られた毒性を有し、筋量の増加または維持に有用であり得ることを示唆している。

本発明者らは、以前、SIRT1を、シナジストアブレーションなどの極端な刺激に応答して筋成長を制限する一連の分子切断の1つとして同定した。本発明者らは、SIRT1の活性化が、47S rRNAの発現を駆動するSL-1転写因子の成分であるTAF68の脱アセチル化をもたらすという仮説を立てた。TAF68の脱アセチル化は、rRNA転写、したがってリボソーム質量を阻害することが以前に示されている。リボソーム質量はシナジストアブレーション後の成長を制限すると考えられているため(8, 11)、本発明者らは、SIRT1をブロックするとTAF68アセチル化が減少し、rRNAの発現が増加し、タンパク質合成能力が増加し、過負荷に応答して骨格筋肥大が大きくなるという仮説を立てた。この仮説と一致して、本発明者らは、以前、過負荷に応答しての筋肥大を、SIRT1のノックアウトは増加させ、SIRT1の過剰発現は減少させたことを示した。さらに、SIRT1の薬理学的阻害剤は、負荷誘発性筋肥大を増加させ得、これは、SIRT1阻害剤による急性処置が遺伝的に正常な動物において筋肥大を増加させる可能性があることを示唆している。このデータを用いて、本発明者らは、SIRT1を天然産物によって阻害し、成長において同じ改善をもたらすことができるかどうかを決定しようとした。

植物、動物および微生物源に由来する800個の純粋な天然産物およびそれらの誘導体を含むNatProd Collectionを用いて、本発明者らは、p53に対するSIRT1の活性を50μMの濃度で65%を超えて阻害した45個の化合物、および5μMで少なくとも20%阻害によってSIRT1を阻害した35個の化合物を同定した。これは化合物のユニークなリストを表しており、その多くはSIRT1を阻害するキノンおよびフラボノイドを含むポリフェノールである。SIRT1を阻害した化合物の大部分がポリフェノールであったという事実は、SIRT1の調節が、ポリフェノールがヒトの健康および疾患予防に対して大きな影響を有する1つの理由であり得ることを示唆している(13)。本発明者らは、これらのポリフェノールのうちの3つ、エピカテキン、エピガロカテキン-3-ガラート、およびセラストロールに焦点を当てることを選び、何故ならば、それらは合併症を伴わないヒトの医学的試験での使用歴を有し、また、摂取後に筋肉において消化、吸収、送達、および活性の異なる程度を示し得る異なる化学構造を有するためである。

不完全要因計画を用いて、本発明者らは、各天然産物が過負荷後の筋肉CSAの増加にどのように寄与するかについてのモデルを作成するために、天然産物の異なる濃度および組み合わせで動物を処置した。応答曲面プロットを用いて、各成分の相対的重要性およびカクテル中の他の天然産物との相互作用を決定した(図1B)。モデルを検証するために、過負荷後の筋線維CSAに対する予測効果に基づいて、本発明者らは天然産物の3つの異なる組み合わせを選択した。ラットの独立コホート(1処置当たりn=5)に、シナジストアブレーションを受けさせ、次いで天然産物の3つの組み合わせのうちの1つ、またはプラセボ対照を含む毎日の胃管栄養法を受容させた。線維CSAの増加に関するモデル予測がCSAの測定された変化に比例した(r² = 0.9586)という事実は、モデルが有効であり、エピカテキン、エピガロカテキン-3-ガラート、およびセラストロールの予測された組み合わせが筋肥大に最適であったことを示唆している。

エピカテキン、エピガロカテキン-3-ガラート、およびセラストロールの最適な組み合わせによる筋線維CSAの増加は、対照群における約4%と比較して、平均線維CSAの61.5%増加をもたらし；したがって、最適群におけるCSAの増加は、対照群の増加の1500%以上であった。この知見は、2つの理由で印象的である。第一に、図2Fに見られるように、過負荷後の筋量の増加は、線維CSAの平均増加に比例していなかった。実際、筋肉の質量は、平均線維CSAの増加が観察される前に約80%増加しなければならないようであった。しかし、本発明者らは、その期間にわたる線維数の有意な増加を観察しなかった。これらのデータは、14日間の機能的過負荷の後に起こる筋量の増加の大部分は平均線維CSAの増加によるものではないことを示唆している。足底筋において、非常に大きな線維の領域と比較的小さな線維の他の領域がある。線維CSAの領域差は、過負荷後の平均線維面積に対する明らかな効果を否定する可能性がある。しかし、筋肉が他の方法で成長している可能性もある。ヒラメ筋および腓腹筋の除去に続いて、ラットの足首はより背屈した位置に保持され、これは足底筋の静止長を増加させることが期待される。本発明者らは、足首の位置のシフト1つの結果は、足底筋の長さが約10%増加することであることを示す予備データを有する。他者が、最近、マウスにおいて同様の示唆をした(10)。これらのデータは、足底筋が、部分的には筋節を直列に付加することによって、機能的過負荷の結果として質量が増加する可能性があることを示唆している。

最適群が対照群の約4%と比較して平均線維CSAの61.5%増加を有したという知見はまた、天然産物カクテルで得られた肥大の差の大きさについて印象的である。ロイシンリッチタンパク質を消費するなど、筋肥大を増強する他の処置は、約5%の効果サイズを有する(3)。これらのデータは、天然産物カクテルの効果の根底にあるメカニズムが、骨格筋肥大において明確で可能性の高い速度制限であることを示唆している。マウスとヒトの両方における骨格筋肥大に対する1つの提案された制限は、タンパク質合成の容量；即ち、リボソーム質量である(8, 11, 18)。天然産物カクテルを与えた動物においてリボソーム質量が増加したかどうかを決定するために、本発明者らは筋肉内の全RNAを決定した。本発明者らの仮説に反して、全RNAは、ビヒクル対照よりも天然産物カクテルで増加が少ない傾向があった。この観察を裏付けるものとして、rRNAスペーサー(ITS1および5'ETS)が同じパターンを示し、5'ETSの変化は統計的有意性に達した。これらのデータは、天然産物カクテルは肥大を増加させたが、改善は翻訳容量の増加の結果ではなかったことを示唆している。

リボソーム質量の付随的な上昇を伴わない筋タンパク質の見かけ上の増加についての一つの可能な説明は、翻訳効率の増加である。リボソームタンパク質のアセチル化の役割と翻訳効率に関する最近の研究は乏しいが、肝切除術後、タンパク質合成速度が組織を再生するために増加するとき、リボソームタンパク質のアセチル化がタンパク質合成応答に先行することを初期の研究が示した(12)。このことは、リボソームタンパク質のアセチル化が翻訳効率を高め得ることを示唆している。Choudharyおよび共同研究者は、少なくとも136箇所でアセチル化された75個のリボソームタンパク質を同定した(4)。ミトコンドリアリボソームの場合、タンパク質MRPL10および19は、ミトコンドリアサーチュインSIRT3によって脱アセチル化される(19)。SIRT3が過剰発現すると、MRPL10および19は脱アセチル化され、これはタンパク質合成の減少に対応する。触媒的に不活性なSIRT3を使用する場合、アセチル化またはタンパク質合成に変化はない。さらに、SIRT3をshRNAで標的にすると、アセチル化とタンパク質合成の両方が増加する(19)。最後に、SIRT3ノックアウトマウスの肝臓から単離されたリボソームは、リボソームタンパク質の単位当たりのより多くのタンパク質合成を示す(19)。まとめると、これらのデータは、サーチュインがリボソームタンパク質を脱アセチル化できることを示唆しており、これは翻訳効率の低下に対応する。これらのデータと一致して、本発明者らは、本発明者らの推定SIRT1阻害性天然産物カクテルが2つのリボソームタンパク質のアセチル化を増加させる傾向があり、これは全RNAまたはリボソーム生合成(5'ETS)と比較してタンパク質合成のより大きな変化(ピューロマイシンの同様の増加)と関連していることを示し、これは翻訳効率の改善を示唆している。

リボソームタンパク質のアセチル化以外に、細胞サイズ調節因子S6K1もアセチル化され得(6, 7)、これは、mTORC1によってリン酸化されるその能力(9)およびメサンギウム細胞におけるリボソームタンパク質s6をリン酸化するその能力を低下させる(5, 9)。S6K1の脱アセチル化は、SIRT1または2のいずれかによって触媒され得る(9)。したがって、SIRT1の阻害は、S6K1アセチル化を増加させ、Thr389リン酸化を減少させることが予想されるであろう。興味深いことに、SIRT1の推定阻害剤で14日間処置された筋肉において、本発明者らはS6K1アセチル化とリン酸化の両方が減少する傾向を観察した。既存の文献で本発明者らのデータを修正しようとする場合は、以前の研究では、S6K1アセチル化に対するSIRT1の効果が、サーチュイン阻害剤ニコチンアミドによる3時間の処理後の培養において行われたことに注意することが重要である(9)。また、インビトロ研究の多くは、リジン427、484、485、および493でのS6K1アセチル化を特に調べたことに注意することも重要である。対照的に、本研究は、免疫沈降後のS6K1の全アセチル化を調べた。成長ストレスの存在下でのより長い期間のサーチュイン阻害は、427、484、485、および493のアセチル化につながるが、他の部位での脱アセチル化をもたらし、本研究で観察された正味の脱アセチル化をもたらしている可能性がある。

結論
インビトロアッセイを用いて、本発明者らは、SIRT1活性を阻害し得るいくつかの天然産物を同定した。これらの阻害剤のうち3つをインビボで組み合わせることによって、本発明者らは、異なる組み合わせが過負荷後の筋肥大にどのように寄与するかのモデルを開発することができた。モデルを検証したところ、天然産物の最適な組み合わせは、リボソームの生合成を有意に減少させ、過負荷で起こるリボソーム質量の増加を減少させる傾向があるにもかかわらず、負荷に応答して筋肥大を有意に増加させることができることを発見した。これは、本明細書に記載される天然産物が、おそらくリボソームタンパク質のアセチル化を介してリボソーム効率を高め、より大きな骨格筋肥大をもたし得ることを示唆している。

参考文献

（表１）実施例に記載される化合物についてのSIRT1阻害剤スクリーンの結果。表は、各化合物の名称、5μMまたは50μMでのパーセント阻害、および各化合物が属する分子のクラスを示す。

（表２）阻害化合物および検証研究中に用いられた用量

検証研究において用いられた各阻害剤の用量(mg/kg/日)のリスト

前述の発明は、理解の明確化の目的で説明および例によってある程度詳細に記載されたが、当業者は、ある一定の変更および改変が添付の特許請求の範囲の範囲内で実施され得ることを理解するであろう。加えて、本明細書に提供される各参考文献は、各参考文献が参照により個々に組み入れられた場合と同程度に、参照によりその全体が組み入れられる。

いくつかの態様において、1つまたは複数のカテキンは、エピカテキンまたはエピガロカテキン-3-モノガラートを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のカテキンは、エピカテキンおよびエピガロカテキン-3-モノガラートを含む。いくつかの態様において、セラストロール誘導体はジヒドロセラストロールである。いくつかの態様において、組成物は、エピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールを含む。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物における少なくとも1つの骨格筋の筋線維断面積の増加をもたらす。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物の体重または心臓もしくは肝臓の重量を実質的に変化させない。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物の1つまたは複数の筋肉におけるSIRT1の活性を低下させる。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物の1つまたは複数の筋肉における1つまたは複数のリボソームタンパク質のアセチル化を増加させる。

いくつかの態様において、組成物を哺乳動物へ経口投与する。いくつかの態様において、組成物は栄養補助食品または食品添加物として製剤化されている。いくつかの態様において、栄養補助食品または食品添加物は、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、エネルギーバー、プロテインバー、またはグミである。いくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.7～1.3 mg/kg/日のエピカテキンを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約6～20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.2～0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキン、約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラート、および約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物によって受容されるエピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対重量比がそれぞれ約0.7 : 20 : 0.5となるように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物によって受容されるエピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対モル比がそれぞれ約1.6 : 43.6 : 1.1となるように製剤化および投与される。いくつかの態様において、方法は、筋肉負荷および組成物の投与と同時に、哺乳動物におけるカロリー摂取量および／または筋成長促進アミノ酸の摂取量を増加させる工程をさらに含む。いくつかの態様において、組成物は、ロイシン、分岐鎖アミノ酸、または高ロイシン含有量を有するタンパク質をさらに含む。

いくつかの態様において、1つまたは複数のカテキンは、エピカテキンまたはエピガロカテキン-3-モノガラートを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のカテキンは、エピカテキンおよびエピガロカテキン-3-モノガラートを含む。いくつかの態様において、セラストロール誘導体はジヒドロセラストロールである。いくつかの態様において、組成物は、エピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールを含む。いくつかの態様において、組成物は経口投与用に製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は栄養補助食品または食品添加物として製剤化されている。いくつかの態様において、栄養補助食品または食品添加物は、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、エネルギーバー、プロテインバー、またはグミである。いくつかの態様において、組成物は、ロイシン、分岐鎖アミノ酸、または高ロイシン含有量を有するタンパク質をさらに含む。

いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.7～1.3 mg/kg/日のエピカテキンを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約6～20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.2～0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物は、哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキン、約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラート、および約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化されている。いくつかの態様において、組成物中のエピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対重量比はそれぞれ約0.7 : 20 : 0.5である。いくつかの態様において、組成物中のエピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対モル比はそれぞれ約1.6 : 43.6 : 1.1である。

本開示の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図から当業者には明らかであろう。
[本発明1001]
以下の工程を含む、筋肉負荷を受けている哺乳動物における骨格筋成長を増強する方法：
治療有効量の
(i)1つまたは複数のカテキン、および
(ii)セラストロールまたはその誘導体
を含む組成物を、該哺乳動物へ投与する工程。
[本発明1002]
1つまたは複数のカテキンが、エピカテキンまたはエピガロカテキン-3-モノガラートを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
1つまたは複数のカテキンが、エピカテキンおよびエピガロカテキン-3-モノガラートを含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
セラストロール誘導体がジヒドロセラストロールである、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
組成物が、エピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールを含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
組成物が、哺乳動物における少なくとも1つの骨格筋の筋線維断面積の増加をもたらす、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
組成物が、哺乳動物の体重または心臓もしくは肝臓の重量を実質的に変化させない、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
組成物が、哺乳動物の1つまたは複数の筋肉におけるSIRT1の活性を低下させる、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
組成物が、哺乳動物の1つまたは複数の筋肉における1つまたは複数のリボソームタンパク質のアセチル化を増加させる、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
組成物を哺乳動物へ経口投与する、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
組成物が栄養補助食品または食品添加物として製剤化されている、本発明1010の方法。
[本発明1012]
栄養補助食品または食品添加物が、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、エネルギーバー、プロテインバー、またはグミである、本発明1011の方法。
[本発明1013]
哺乳動物がヒトである、本発明1001～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
哺乳動物が約0.7～1.3 mg/kg/日のエピカテキンを受容するように、組成物が製剤化および投与される、本発明1001～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンを受容するように、組成物が製剤化および投与される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
哺乳動物が約6～20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように、組成物が製剤化および投与される、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
哺乳動物が約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように、組成物が製剤化および投与される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
哺乳動物が約0.2～0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように、組成物が製剤化および投与される、本発明1001～1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
哺乳動物が約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように、組成物が製剤化および投与される、本発明1018の方法。
[本発明1020]
哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキン、約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラート、および約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように、組成物が製剤化および投与される、本発明1001～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
哺乳動物によって受容されるエピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対重量比がそれぞれ約0.7 : 20 : 0.5となるように、組成物が製剤化および投与される、本発明1001～1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
哺乳動物によって受容されるエピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対モル比がそれぞれ約1.6 : 43.6 : 1.1となるように、組成物が製剤化および投与される、本発明1001～1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
筋肉負荷および組成物の投与と同時に、哺乳動物におけるカロリー摂取量および／または筋成長促進アミノ酸の摂取量を増加させる工程をさらに含む、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
組成物が、ロイシン、分岐鎖アミノ酸、または高ロイシン含有量を有するタンパク質をさらに含む、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
治療有効量の
(i)1つまたは複数のエピカテキン、および
(ii)セラストロールまたはその誘導体
を含む、筋肉負荷を受けている哺乳動物における筋成長を増強するための組成物。
[本発明1026]
1つまたは複数のエピカテキンが、エピカテキンまたはエピガロカテキン-3-モノガラートを含む、本発明1025の組成物。
[本発明1027]
1つまたは複数のエピカテキンが、エピカテキンおよびエピガロカテキン-3-モノガラートを含む、本発明1026の組成物。
[本発明1028]
セラストロール誘導体がジヒドロセラストロールである、本発明1025～1027のいずれかの組成物。
[本発明1029]
エピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールを含む、本発明1025～1028のいずれかの組成物。
[本発明1030]
経口投与用に製剤化されている、本発明1025～1029のいずれかの組成物。
[本発明1031]
栄養補助食品または食品添加物として製剤化されている、本発明1030の組成物。
[本発明1032]
栄養補助食品または食品添加物が、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、エネルギーバー、プロテインバー、またはグミである、本発明1031の組成物。
[本発明1033]
ロイシン、分岐鎖アミノ酸、または高ロイシン含有量を有するタンパク質をさらに含む、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
哺乳動物が約0.7～1.3 mg/kg/日のエピカテキンを受容するように、前記組成物が製剤化されている、本発明1025～1033のいずれかの組成物。
[本発明1035]
哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンを受容するように、前記組成物が製剤化されている、本発明1034の組成物。
[本発明1036]
哺乳動物が約6～20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように、前記組成物が製剤化されている、本発明1025～1035のいずれかの組成物。
[本発明1037]
哺乳動物が約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように、前記組成物が製剤化されている、本発明1036の組成物。
[本発明1038]
哺乳動物が約0.2～0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように、前記組成物が製剤化されている、本発明1025～1037のいずれかの組成物。
[本発明1039]
哺乳動物が約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように、前記組成物が製剤化されている、本発明1038の組成物。
[本発明1040]
哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキン、約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラート、および約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように、前記組成物が製剤化されている、本発明1025～1039のいずれかの組成物。
[本発明1041]
前記組成物中のエピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対重量比がそれぞれ約0.7 : 20 : 0.5である、本発明1025～1040のいずれかの組成物。
[本発明1042]
前記組成物中のエピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対モル比がそれぞれ約1.6 : 43.6 : 1.1である、本発明1025～1041のいずれかの組成物。

いくつかの態様において、組成物は、1つまたは複数のカテキンならびにセラストロールまたはその誘導体を含む天然化合物の組み合わせを含む。特定の態様において、組成物は、セラストロール、エピカテキン、およびエピガロカテキンモノガラートを含む。

「SIRT1阻害剤」はSIRT1の発現、安定性、または活性の任意の局面を任意の方法で阻害する、低減する、減少させる、弱める、消失させる、排除する、遅らせる、または妨害することができる、任意の薬剤、例えば、セラストロール、またはエピカテキンもしくはエピガロカテキン-3-モノガラートなどのカテキンなどの、天然産物を指す。SIRT1阻害剤は、例えば、発現の任意の局面、例えば、SIRT1をコードする遺伝子、例えばヒトSIRT1遺伝子の転写、RNAプロセシング、RNA安定性、または翻訳を、インビトロまたはインビボで、対照（例えば阻害剤の非存在下）と比較して、例えば、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上低減することができる。同様に、SIRT1阻害剤は、例えば、SIRT1酵素の活性、例えば、p53またはS6K1などの基質に対するデアセチラーゼ活性などの酵素活性を、インビトロまたはインビボで、対照（例えば阻害剤の非存在下）と比較して、例えば、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上低減することができる。さらに、SIRT1阻害剤は、SIRT1酵素の安定性を、インビトロまたはインビボで、対照（例えば阻害剤の非存在下）と比較して、例えば、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上低減することができる。特定の態様において、SIRT1阻害剤は、セラストロール、セラストロール誘導体、またはカテキンもしくはエピカテキン、例えば、エピカテキンもしくはエピガロカテキン-3-モノガラートなどの、天然産物である。

いくつかの態様において、組み合わせに含まれる1つまたは複数のカテキンは、エピカテキンである。特定の態様において、組み合わせに含まれる1つまたは複数のエピカテキンは、エピカテキンおよびエピガロカテキン-3-モノガラートである。組み合わせは、任意の様々な量のそれぞれの天然産物を含むことができる。例えば、組み合わせは、対象が約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 mg/kg/日またはそれ以上のいずれかの化合物を受容するように、製剤化および投与することができる。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が約0.7～1.3 mg/kg/日のエピカテキンを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が約6～20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように製剤化および投与される。

いくつかの態様において、組み合わせは、セラストロール、またはジヒドロセラストロールなどのセラストロール誘導体を含む。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が約0.2～0.5 mg/kg/日のセラストロールまたはセラストロール誘導体を受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が約0.5 mg/kg/日のセラストロールまたはセラストロール誘導体を受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組み合わせは、対象が、約0.7～1.3 mg/kg/日のエピカテキン、約6～20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラート、および約0.2～0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化および投与される。特定の態様において、組み合わせは、対象が約0.7 mg/kg/日のエピカテキン、約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラート、および約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように製剤化および投与される。いくつかの態様において、組み合わせは、組成物中の(かつ／または、例えば1投与当たりもしくは1日当たり、対象によって受容される)エピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対重量比がそれぞれ約0.7 : 20 : 0.5となるように製剤化される(かつ／または投与される)(即ち、組成物は、例えば、0.7 mgのエピカテキン、20 mgのエピガロカテキン-3-モノガラート、および0.5 mgのセラストロール、または、3つの成分の相対重量比が約0.7 : 20 : 0.5のままである限りこれらの量の任意の倍数もしくは分数を含むことができる)。いくつかの態様において、組み合わせは、組成物中の(かつ／または、例えば1投与当たりもしくは1日当たり、対象によって受容される)エピカテキン、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対モル比がそれぞれ約1.6 : 43.6 : 1.1となるように製剤化される(かつ／または投与される)(即ち、組成物は、例えば、1.6 mmolのエピカテキン、43.6 mmolのエピガロカテキン-3-モノガラート、および1.1 mmolのセラストロール、または、3つの成分の相対モル比が約1.6 : 43.6 : 1.1のままである限りこれらの量の任意の倍数もしくは分数を含むことができる)。

本明細書に記載される天然産物は、天然源から、化学合成を通じて、および化学薬品供給業者からを含む、様々な供給源から得ることができる。例えば、エピカテキンは、例えば、緑茶、ブドウから単離することができ、または、例えば、Aurora fine chemicals、Sigma-Aldrich、Combi-Blocks、ChemShuttleなどから入手することができる。エピガロカテキンモノガラートは、例えば、緑茶または紅茶から単離することができ、または、例えば、Sigma-Aldrich、Combi-Blocks、King Scientificなどから入手することができる。セラストロールは、例えば、トリプテリギウム・ウィルドルディ（Tripterygium wildordii）およびセラストラス・レゲリイ（Celastrus regelii）の根抽出物から単離することができ、または、例えば、Aurum Pharmatech、Achemtek、ChemShuttle、VWRなどから入手することができる。ジヒドロセラストロールは、例えば、セラストロールの水素化を介して合成することができ、または、例えば、AbovChem、Achemtek、Aurum Pharmatech、Sigma-Aldrichなどから入手することができる。

結果
SIRT1阻害剤スクリーン
800の天然産物のハイスループットスクリーンは、50μMの濃度でSIRT1を＞65%阻害する45の化合物を同定した。これらのうち、多くがSIRT1に対して用量依存的な効果を示し、35の化合物は5μMで少なくとも20%の阻害を示した。同定された35の阻害剤のうち、3つは既にヒトの食品に広く使用されており(表1)、3つの異なる化学クラス(キノンメチド、ポリフェノール、およびフラボノイドそれぞれ1つ)に由来した。これらの化合物(セラストロール、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびエピカテキン)を、哺乳動物における筋肥大を改善することを目的として、さらなる研究のために選択した。

（表１）実施例に記載される化合物についてのSIRT1阻害剤スクリーンの結果。表は、各化合物の名称、5μMまたは50μMでのパーセント阻害、および各化合物が属する分子のクラスを示す。

（表２）阻害化合物および検証研究中に用いられた用量

検証研究において用いられた各阻害剤の用量(mg/kg/日)のリスト

Claims (42)

1. 以下の工程を含む、筋肉負荷を受けている哺乳動物における骨格筋成長を増強する方法：
   治療有効量の
   (i)1つまたは複数のカテキン、および
   (ii)セラストロールまたはその誘導体
   を含む組成物を、該哺乳動物へ投与する工程。
2. 1つまたは複数のカテキンが、エピカテキンモノガラートまたはエピガロカテキン-3-モノガラートを含む、請求項1記載の方法。
3. 1つまたは複数のカテキンが、エピカテキンモノガラートおよびエピガロカテキン-3-モノガラートを含む、請求項2記載の方法。
4. セラストロール誘導体がジヒドロセラストロールである、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
5. 組成物が、エピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールを含む、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
6. 組成物が、哺乳動物における少なくとも1つの骨格筋の筋線維断面積の増加をもたらす、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
7. 組成物が、哺乳動物の体重または心臓もしくは肝臓の重量を実質的に変化させない、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。
8. 組成物が、哺乳動物の1つまたは複数の筋肉におけるSIRT1の活性を低下させる、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
9. 組成物が、哺乳動物の1つまたは複数の筋肉における1つまたは複数のリボソームタンパク質のアセチル化を増加させる、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
10. 組成物を哺乳動物へ経口投与する、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
11. 組成物が栄養補助食品または食品添加物として製剤化されている、請求項10記載の方法。
12. 栄養補助食品または食品添加物が、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、エネルギーバー、プロテインバー、またはグミである、請求項11記載の方法。
13. 哺乳動物がヒトである、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。
14. 哺乳動物が約0.7～1.3 mg/kg/日のエピカテキンモノガラートを受容するように、組成物が製剤化および投与される、請求項1～13のいずれか一項記載の方法。
15. 哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンモノガラートを受容するように、組成物が製剤化および投与される、請求項14記載の方法。
16. 哺乳動物が約6～20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように、組成物が製剤化および投与される、請求項1～15のいずれか一項記載の方法。
17. 哺乳動物が約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように、組成物が製剤化および投与される、請求項16記載の方法。
18. 哺乳動物が約0.2～0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように、組成物が製剤化および投与される、請求項1～17のいずれか一項記載の方法。
19. 哺乳動物が約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように、組成物が製剤化および投与される、請求項18記載の方法。
20. 哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンモノガラート、約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラート、および約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように、組成物が製剤化および投与される、請求項1～19のいずれか一項記載の方法。
21. 哺乳動物によって受容されるエピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対重量比がそれぞれ約0.7 : 20 : 0.5となるように、組成物が製剤化および投与される、請求項1～20のいずれか一項記載の方法。
22. 哺乳動物によって受容されるエピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対モル比がそれぞれ約1.6 : 43.6 : 1.1となるように、組成物が製剤化および投与される、請求項1～21のいずれか一項記載の方法。
23. 筋肉負荷および組成物の投与と同時に、哺乳動物におけるカロリー摂取量および／または筋成長促進アミノ酸の摂取量を増加させる工程をさらに含む、請求項1～22のいずれか一項記載の方法。
24. 組成物が、ロイシン、分岐鎖アミノ酸、または高ロイシン含有量を有するタンパク質をさらに含む、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
25. 治療有効量の
    (i)1つまたは複数のエピカテキン、および
    (ii)セラストロールまたはその誘導体
    を含む、筋肉負荷を受けている哺乳動物における筋成長を増強するための組成物。
26. 1つまたは複数のエピカテキンが、エピカテキンモノガラートまたはエピガロカテキン-3-モノガラートを含む、請求項25記載の組成物。
27. 1つまたは複数のエピカテキンが、エピカテキンモノガラートおよびエピガロカテキン-3-モノガラートを含む、請求項26記載の組成物。
28. セラストロール誘導体がジヒドロセラストロールである、請求項25～27のいずれか一項記載の組成物。
29. エピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールを含む、請求項25～28のいずれか一項記載の組成物。
30. 経口投与用に製剤化されている、請求項25～29のいずれか一項記載の組成物。
31. 栄養補助食品または食品添加物として製剤化されている、請求項30記載の組成物。
32. 栄養補助食品または食品添加物が、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、エネルギーバー、プロテインバー、またはグミである、請求項31記載の組成物。
33. ロイシン、分岐鎖アミノ酸、または高ロイシン含有量を有するタンパク質をさらに含む、請求項32記載の組成物。
34. 哺乳動物が約0.7～1.3 mg/kg/日のエピカテキンモノガラートを受容するように、前記組成物が製剤化されている、請求項25～33のいずれか一項記載の組成物。
35. 哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンモノガラートを受容するように、前記組成物が製剤化されている、請求項34記載の組成物。
36. 哺乳動物が約6～20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように、前記組成物が製剤化されている、請求項25～35のいずれか一項記載の組成物。
37. 哺乳動物が約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラートを受容するように、前記組成物が製剤化されている、請求項36記載の組成物。
38. 哺乳動物が約0.2～0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように、前記組成物が製剤化されている、請求項25～37のいずれか一項記載の組成物。
39. 哺乳動物が約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように、前記組成物が製剤化されている、請求項38記載の組成物。
40. 哺乳動物が約0.7 mg/kg/日のエピカテキンモノガラート、約20 mg/kg/日のエピガロカテキン-3-モノガラート、および約0.5 mg/kg/日のセラストロールを受容するように、前記組成物が製剤化されている、請求項25～39のいずれか一項記載の組成物。
41. 前記組成物中のエピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対重量比がそれぞれ約0.7 : 20 : 0.5である、請求項25～40のいずれか一項記載の組成物。
42. 前記組成物中のエピカテキンモノガラート、エピガロカテキン-3-モノガラート、およびセラストロールの相対モル比がそれぞれ約1.6 : 43.6 : 1.1である、請求項25～41のいずれか一項記載の組成物。

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