JP2023516591A - 生体力学的特性の光学的測定を用いた生殖細胞構造体の非接触検査方法およびシステム - Google Patents

生体力学的特性の光学的測定を用いた生殖細胞構造体の非接触検査方法およびシステム Download PDF

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Abstract

生殖細胞構造体の少なくとも１つの生体力学的特性を測定する方法を提供する。本方法は、生殖細胞構造体に放射線を照射することと、照射された生殖細胞構造体から散乱した放射線の少なくとも一部を検出することと、検出された散乱放射線の周波数スペクトルを解析して、周波数スペクトルにおける少なくとも１つのブリルアン周波数シフトを同定することと、ブリルアン周波数シフトに基づいて少なくとも１つの生体力学的特性を決定することとを含む。本方法は、少なくとも１つの生体力学的特性に基づいて、生殖細胞構造体の生存率を決定することをさらに含む。【選択図】図７

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年２月２７日に出願された米国仮出願第６２／９８２，３６８号の優先権を主張し、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、生殖細胞構造体の検査に関し、より詳細には、生体力学的特性の光学的測定を使用した生殖細胞構造体の非接触検査に関する。
（関連技術）
体外受精（ＩＶＦ）は、不妊症および不妊の個人を支援するために行われる。
流産を２回以上経験した女性、３５歳以下の女性で１２ヶ月間避妊具なしで性交しても妊娠しない場合、３５歳以上の女性で６ヶ月間避妊具なしで性交しても妊娠しない場合、あるいは、男性の精液分析が良好ではない場合には、不妊治療クリニックに助けを求めることが推奨されている。不妊治療クリニックにおいて提供される一般的なサービスや治療には、予備検査、排卵誘発剤やホルモン剤の処方、手術および生殖補助技術法（子宮内人工授精（ＩＵＩ）やＩＶＦを含む。）が含まれる。
今日の体外受精技術に対する強い需要は、おそらく、シングルマザーの増加だけでなく、新しい潜在的な母親の平均年齢の上昇、女性のホルモンバランスの乱れや生殖に関する問題の原因となり得る肥満の増加（米国では成人の約３５％が肥満に苦しんでおり、妊娠の問題につながり得る。）、男性の精子の質の低下（精子の質の低下は、米国と欧州とで数十年にわたって観察および記録されており（Ｆｅｔｔｅｅｒｓ，２０１８）、近年では途上国でも観察されている（Ｈｕａｎｇ他，２０１７；Ｓｅｎｇｕｐｔａ他，２０１７）、女性の受胎能力の低下（世界的に、特に最も先進的な国々における受胎能力の低下は、十分に文書化されている（Ｓｋａｋｋｅｂａｅｋ他，２０１９）。米国の統計によると、３５歳以下の女性の出生成功率は約４０％だが、４２歳を超える女性では４％に激減する）、および、ＬＧＢＴ層が不妊治療を求める需要の増加などの多くの理由による。
米国における不妊治療クリニックの市場規模は、２０１２年に３０億ドルであったが、２０２２年には４５億ドルに達すると予想されている。２０１７年から２０２２年までの年間成長率は４．６％と予想されている（ＢＣＣ，２０１８）。２０１６年現在、米国のほとんどの不妊治療クリニックは、診断、手術および生殖補助医療（ＡＲＴ）を含む３大サービスをすべて提供している。ＡＲＴは、不妊治療クリニックが提供するサービスの約７０％のシェアを占め、市場規模は２４億ドルと推定されている。診断サービスおよび手術は、それぞれ９億ドル、２億ドルの推定値を有する（ＢＣＣ，２０１８）。ＡＲＴは、さらに、体外受精（ＩＶＦ）、卵管内移植（ＧＩＦＴ）、ドナー卵子、ドナー精子、代理母などに分けられる。このうち、ＩＶＦは８９．９％、金額にして２２億ドルという圧倒的なシェアを占めている。２０１６年には、米国だけで２３万件のＩＶＦが実施され、その数は増加している。これは、ＡＲＴの全シェアの半分近くを占めている。
本開示は、一般に、生殖細胞構造体の少なくとも１つ以上の生体力学的特性の光学的測定に基づく、生殖細胞構造体の非接触検査または監視のための方法およびシステムを提供する。
本開示の例示的な実施形態によれば、方法は、光学イメージング技術を使用して生殖細胞構造体の生体力学的特性を測定することと、測定された生体力学的特性に基づいて、成功する妊娠を達成するための生殖細胞構造体の可能性を評価することとを含んでいてもよい。
本方法は、以下の特徴のうちの少なくとも１つ以上を個別にまたはその任意の組み合わせで含んでもよい。光学イメージング技術は、ブリルアン分光法に基づいて生体力学的特性を測定してもよい。生体力学的特性は、弾性率または粘性率を含んでいてもよい。生殖細胞構造体は、胚、桑実胚、胞胚、原腸胚、受精卵、卵子、および卵母細胞からなる群から選択される１つを含んでいてもよい。
一例として、本方法は、雄性配偶子と受精させる卵子を選択するため、かつ／または、体外受精にさらに進む受精卵を選択するために実施されてもよい。本方法は、子宮に移植される胚を選択するために実施されてもよい。いくつかの実施形態においては、生殖細胞構造体の生体力学的特性は、細胞よりも小さい分解能で測定されてもよい。さらに、生体力学的特性は、生殖細胞構造体全体にわたるその空間分布をマッピングするように走査されてもよい。
本開示の例示的な実施形態によれば、生殖細胞構造体の少なくとも１つの生体力学的特性を測定する方法は、生殖細胞構造体に放射線を照射することと、照射された生殖細胞構造体から散乱した放射線の少なくとも一部を検出することと、検出された散乱放射線の周波数スペクトルを分析して周波数スペクトルにおける少なくとも１つのブリルアン周波数シフトを同定することと、ブリルアン周波数シフトに基づいて少なくとも１つの生体力学的特性を決定することとを含んでいてもよい。さらに、少なくとも１つの生体力学的特性に基づいて、生殖細胞構造体の生存率が決定されてもよい。
以下の特徴のうちの１つまたは２つ以上が、個別にまたはそれらの任意の組み合わせとして含まれてもよい。少なくとも１つの生体力学的特性は、生殖細胞構造体の少なくとも一部の弾性率、粘性率、またはその両方を含んでいてもよい。弾性率Ｍ´は、次式を用いて決定されてもよい。
Figure 2023516591000002
 ここで、△ｖＢはブリルアン周波数シフト、ρは生殖細胞構造体の少なくとも一部分の密度、λは放射線の真空波長、ｎは生殖細胞構造体の少なくとも一部の屈折率である。さらに、検出された散乱放射線の周波数スペクトルにおける少なくとも１つのブリルアンピークの幅が、次式を使用して粘性率Ｍ″を決定するために測定されてもよい。
Figure 2023516591000003
 ここで、ΓＢは、少なくとも１つのブリルアンピークの幅である。続いて、複素弾性率Ｍ＊が、次式を用いて決定されてもよい。
Ｍ＊＝Ｍ´＋ｉＭ″
散乱放射線の周波数スペクトルを得るために、分光器が利用されてもよい。さらに、照射放射線は、レーザ放射であってもよく、レーザ放射は、約４００ｎｍから約８００ｎｍの範囲内の真空波長に対応する少なくとも１つの周波数成分を含んでいてもよい。いくつかの実施形態においては、生殖細胞構造体から弾性的に散乱される放射線は、ブリルアン周波数シフトの検出を容易にするために、フィルタリングされてもよい。
いくつかの実施形態においては、生殖細胞構造体の少なくとも１つの生体力学的特性が、細胞よりも小さい分解能で決定されてもよく、したがって、少なくとも１つの生体力学的特性は、生殖細胞構造体の複数の細胞よりも小さい位置において決定されてもよい。
本開示の例示的な実施形態によれば、生殖細胞構造体の少なくとも１つの生体力学的特性を決定するためのシステムは、照射放射線を生成するための放射線源と、照射放射線を生殖細胞構造体の少なくとも一部に向けるための少なくとも１つの光学系と、生殖細胞構造体から散乱した放射線の少なくとも一部を検出するための検出器と、検出された散乱放射線の周波数スペクトルを生成するための分光器と、周波数スペクトルを処理して少なくとも１つのブリルアン周波数シフトを同定するためのアナライザとを含んでもよい。ブリルアン周波数シフトは、少なくとも１つの生体力学的特性を決定するために利用されてもよい。
以下の特徴の１つ以上は、個別にまたはその任意の組み合わせとして含まれていてもよい。システムは、散乱放射線の少なくとも一部を、光ファイバを経由して検出器に導くための少なくとも１つの放射線収集光学系をさらに備えていてもよい。システムは、焦点が合っていない光を遮断するために、少なくとも１つの放射線収集光学系の上流に配置されたピンホールを備えていてもよい。いくつかの実施形態においては、シングルモード光ファイバがピンホールとして機能するように採用されてもよいが、他の実施形態においては、マルチモード光ファイバが、散乱放射線を検出器に伝送するために使用されてもよい。
いくつかの実施形態においては、システムは、生殖細胞構造体の生体力学的特性を細胞よりも小さい分解能で光学的に特徴づけるように構成されていてもよい。そのような実施形態のために、システムは、生殖細胞構造体の少なくとも一部にわたって光線を走査して生殖細胞構造体の異なる位置におけるブリルアン周波数シフトを測定するアクチュエータを備えていてもよく、測定されたブリルアン周波数シフトを生殖細胞構造体にわたる生体力学的特性の空間分布に相関させてもよい。
特に、本開示は、上記のような要素の組み合わせに限定されず、本明細書に記載されるような要素の任意の組み合わせで組み立てられてもよい。本開示の他の態様は、本明細書に開示されている。
本開示の詳細な説明で使用される図面をより十分に理解するために、各図面の簡単な説明を提供する。
細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）を用いたＩＶＦ手順の概略図である。 ヒト胚の着床前発生を示す図である。 受精卵の構造および受精の手順を示す図である。 本開示の例示的な実施形態に係るブリルアン散乱測定を模式的に示す図である。 本開示の例示的な実施形態に係る生殖細胞構造体の生体力学的特性を光学的に特徴付けるためのフローチャートである。 生殖細胞構造体の位置において、ブリルアン周波数シフトを測定するためのフローチャートを示す図である。 本開示の例示的な実施形態に係る生殖細胞構造体の生体力学的特性を光学的に特徴付けるためのシステムを示す図である。
上記の図面は、必ずしも縮尺通りではなく、本開示の基本原理を例示する様々な好ましい特徴の幾分簡略化した表現を提示していることを理解されたい。例えば、特定の寸法、向き、位置、および形状を含む、本開示の特定の設計上の特徴は、特定の意図された用途および使用環境によって部分的に決定されるであろう。
本開示の様々な特徴は、添付の図面および以下に詳細に説明する実施形態を参照することにより明らかになるであろう。しかしながら、本開示は、開示された実施形態に限定されるものではなく、変形および修正されて具体化され得る。例示的な実施形態は、単に当業者が本開示の様々な特徴を理解できるように提供されるものであり、これらは請求の範囲によって定義される。したがって、いくつかの実施形態において、プロセスの周知の操作、周知の構造、および周知の技術は、本開示の不明瞭な理解を避けるために、詳細には説明されない。本明細書を通じて、同じ参照符号は同じ要素を指す。
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、本開示を限定することを意図するものではない。本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことが意図される。本明細書において使用される場合には、用語「含む」および／または「備える」は、述べられた特徴、整数、ステップ、操作、要素、および／または成分の存在を規定するが、少なくとも１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、成分、および／またはそれらの群の存在または追加を排除しないことがさらに理解されるであろう。本明細書において使用される場合には、用語「および／または」は、関連する列挙された項目の１つ以上の任意のおよび全ての組合せを含む。
特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される場合には、用語「約」は、当該技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内と理解される。「約」は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解され得る。文脈から明らかでない限り、本明細書において提供される全ての数値は、「約」という用語によって修飾される。
本明細書において使用される「生殖細胞構造体」という用語は、卵母細胞、卵子、受精卵などの融合前または融合後の任意の性細胞、ならびに生殖の異なる段階において形成される胚、桑実胚、胞胚、原腸胚などのより複雑な融合細胞構造を指す。
本明細書において使用される「分解能」という用語は、細胞構造において離散的な測定値を得ることができる最小の空間間隔（例えば、距離）を意味する。用語「分解能」は、文脈が示す場合には、最小の測定精度（例えば、ＭＨｚに関しては検出可能な最小の周波数シフト）を指すこともある。
「光」および「放射線」という用語は、可視放射線だけでなく、電磁スペクトルの他の部分、例えば、電磁スペクトルの赤外線部分に周波数を有する放射線も指すように、本明細書において互換的に使用される。
本開示の態様は、生殖補助技術（ＡＲＴ）において使用するための卵子および胚の選択またはスクリーニング手順を、生存率および出生率を高めるように改善するために、光照射放射線（ｏｐｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）を用いて生殖細胞構造体の少なくとも１つ以上の生体力学的特性を決定し、その生体力学的特性を利用することを含んでいてもよい。特に、いくつかの態様において、本開示は、ブリルアン分光法に基づいて、卵子および／または胚を選択またはスクリーニングする方法を提供する。
本開示は、少なくとも部分的に、ブリルアン分光法が、生殖細胞構造体の少なくとも１つ以上の生体力学的特性（本明細書では生体力学的パラメータとも呼ばれる。）を定量化するために採用され得るという認識に基づいている。本開示の実施形態においては、ブリルアン分光法に基づく方法およびシステムは、卵子および／または胚を監視および／または評価するために利用され得る。光学的方法を用いて、生殖細胞構造体が、局所的に、非接触で、リアルタイムで、誘導的に、検査または評価されてもよい。
ブリルアン分光法は、非弾性散乱光子（典型的には後方散乱光子）が、外部光源から入射した光子と比較して、周波数シフトを経験する、ブリルアン散乱に基づいている。後述するように、本開示は、生殖細胞構造体に照射放射線を照射することに応答して、生殖細胞構造体によって散乱された放射線に関連する少なくとも１つのブリルアン周波数シフトを測定することによって、生殖細胞構造体の１つまたは複数の生体力学特性を決定するための方法を提供する。
体外受精（ＩＶＦ）は、遺伝的問題を防止しながら妊娠を助けるために、生殖能力を助けるための複雑な一連の手順を含む。図１は、卵母細胞の細胞質に単一の精子細胞を直接注入する細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）による単一精子注入を用いたＩＶＦ手順の概略を示す図である。例示的な手順においては、卵巣から採取（例えば、回収）された成熟卵は、人工的に体外（すなわち、研究室環境）において精子によって受精させることができる。少なくとも１つ以上の受精卵、または、少なくとも１つ以上の胚は、前胚と呼ばれることがあり、その後、子宮に移されてもよい。
ＩＶＦの成功率（例えば、妊娠に至る。）は、多くの要因に左右される。Ｌｏｅｎｄｅｒｓｌｏｏｔ他の研究においては、著者らは、妊娠と、女性の年齢、不妊期間、基礎卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、回収された健康な卵子の数、移植胚の数および胚の質を含む様々な予測因子との間に相関を見出した（Ｌｏｅｎｄｅｒｓｌｏｏｔ他，２０１０； Ｌｏｅｎｄｅｒｓｌｏｏｔ他，２０１４年）。この結果は、胚の質自体が年齢に次ぐ重要な予測因子であると結論づけた他の研究（ＭｃＫｅｎｚｉｅ他，２００４）と一致する。
したがって、ＩＶＦにおいて、臨床医および患者は、しばしば、受精するための最良の卵子だけでなく、移植するための最良の胚を選択するという課題に直面する。正常な形態と染色体の存在にもかかわらず、多くの胚は着床の過程で失敗する。失敗を補うために、臨床医は通常６０％を超える症例において複数の胚を移植している（「Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｍｍａｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ」，２０１６）。しかし、これは、高い確率で多胎児出産と関連する合併症を引き起こし、予期せぬ経済的負担に加えて、周産期および母体の有害な転帰などのリスクをもたらす可能性がある（Ｇｅｒｒｉｓ他，１９９９）。現時点で最も信頼性の高い方法は、適切な年齢枠が与えられた場合、６０から７０％の確率でしか妊娠を予測できない（Ｆｏｒｍａｎ他，２０１３）。
卵子および胚の両方の発達の可能性について、客観的、定量的、かつ信頼性の高いマーカを同定するために、多くの努力が払われてきた。近年、拡張培養（Ｆｏｒｍａｎ他，２０１３）、着床前遺伝子スクリーニング（ＰＧＳ）（Ｇａｒｄｎｅｒ他，２０１５）、および細胞周期のタイムラプスイメージング（ＶｅｒＭｉｌｙｅａ他，２０１４）などの技術は、生存可能な胚を同定し、多胎妊娠の発生率を低減し、選択的単一胚移植の割合の増加に寄与してきた。胚盤胞期まで胚の培養を延長することが、より高い着床率を得るために導入された（Ｊｏｎｅｓ他，１９９９）。しかし、培養時間の延長はより多くの時間とリソースを必要とするため、この技術は一部の患者にしか使用されていない（Ｆｏｒｍａｎ他，２０１３）。さらに、関連する長期的なリスクは明確ではなく、胚盤胞移植後の一卵性双生児のリスクは増加している。ＰＧＳは、胚の染色体異常をスクリーニングすることができる。これは、自然流産においては異数性が高く（Ｈａｓｓｏｌｄ他，１９８０）、裂開期から胚盤胞期にかけて染色体異常の減少が観察された（Ａｔａ他，２０１２）という過去の知見に基づいている。その後の研究においては、異数性胚がＩＶＦサイクルの失敗の大部分、特に母体年齢の上昇に関連するものの原因であることが確認された（Ｈａｒｔｏｎ他，２０１３）。無作為対照試験により、ＰＧＳが着床と出産の成功率を高めることが確認されたが、それは侵襲的であり、体外生検を行うために高度な訓練を受けた胚培養士を必要とし、プロセスが高価で資源を必要とする原因となっている。
タイムラプスイメージングは、長期間にわたる運動パラメータの同定を可能にし、胚選択の成功率を高めるのに役立つ（ＶｅｒＭｉｌｙｅａ他，２０１４）。ヒトにおいては、透明帯（ｚｏｎａ）の厚さ、粒状性、囲卵腔、卵子形状を含む様々な卵子形態学的パラメータが、胚の発生および着床の可能性と相関することが発見された。形態学に基づく胚の選択は、臨床の場で最も広く用いられている方法の一つである。しかし、これらの特性は非常に主観的であり、その予測値は不確かである。染色体状態との相関もほとんどない（Ｗｅｒｎｅｒ他，２０１２）。いくつかの研究は、胚の運命は受精前の発生段階の早い段階において決定されることを示唆している（Ｓｔｉｔｚｅｌ他，２００７；Ｌｉ他，２０１０）。したがって、より高い着床率と出生率を実現し、望まない多胎妊娠を減らすために、卵子／胚の品質マーカを追求することは、ＩＶＦ分野における大きなトピックであり続けている。
機械的特性は、細胞の運命や機能を分子レベルで制御する上で重要な役割を果たし、細胞内部の状態はその機械的特性に反映されると考えられている（Ｘｕ他，２０１２；Ｓｕｒｅｓｈ他，２００５）。また、生体力学的特性は、卵子および胚の機能にも重要である。胚および卵子の生体力学は、ヒトにおいては妊娠と、マウスにおいては母体年齢と相関しており、力学と生存率との関係を示している（Ｅｂｎｅｒ他，２００３；Ｍｕｒａｙａｍａ他，２００８；Ｍｕｒａｙａｍａ他，２００６）。
例えば、受精卵の構造と受精との手順を示した図３に示すように、硫酸化糖タンパク質のネットワークである透明帯は、卵母細胞が受精卵への発達とともに異なる有糸分裂の段階を経由して移行する際に大きく変化する可能性がある。受精卵は成熟中に軟化することがあるが、これは精子の侵入を容易にするための機構であると考えられる（Ｐａｐｉ他，２０１０）。その後、受精卵は受精中に硬化することがある。これは、皮質顆粒がその内容物を囲卵腔に放出する皮質反応によるものである。この酵素を介した機構により、多精を防ぐことができる（Ｄｒｏｂｎｉｓ他，１９８８）。透明帯の構造および厚さの違いは、卵子の生殖能力と関連している。薄い透明帯あるいは区別できない内層は、受胎率や胚盤胞の発育率が低いことを示している可能性がある（Ｅｂｎｅｒ他，２０１０）。このように、卵子や胚の生体力学的特性は、卵子や胚の選別に有効な指標となる。
卵胞形成および成熟期における透明帯の物性の変化は、卵子細胞質の粘度に伴っている（Ｋｒａｕｓｅ他，２０１６）。粘度の高さ、または注入漏斗の持続性と、その後の着床前発達における予後不良との相関を見出した研究もある（Ｅｂｎｅｒ他，２００３）。
Ｙａｎｅｚ他（２０１６）は、ヒトおよびマウスの受精卵における胚盤胞形成の成功率予測におけるＺｅｎｅｒモデルベースの機械的パラメータ（Ｂａｕｓｃｈ他，１９９９）の可能性を研究した。彼らは、ヒト胚の胚盤胞を予測する分類器を用いて、９０％の精度、９５％の特異性、７５％の感度を達成した。したがって、受精卵の段階において、機械的パラメータは、胚の生存率に関する情報を提供することができる。
タイムラプスの細胞周期の形態学的パラメータを収集するために、さらに４８時間の培養が必要な場合がある。機械的パラメータと細胞周期パラメータとの最適な組み合わせは、９０％および９１％の感度と特異性とを達成することができる。また、著者らは、生存群は非生存群および有意に異なるトランスクリプトームを持っていることをも示した。これらの結果は、胚の可能性は受精前の卵子の品質と成熟度とによって大きく左右されることを示唆し、また、力学的指標に基づいて卵子の生存率を予測できる可能性を示している。
マイクロ流体を用いた卵母細胞の機械的特性測定のための技術開発への取り組みがなされている。卵母細胞および胚の機械的特性を定量化する現在の方法は、圧縮、インデンテーションおよび吸引などがある。
圧縮－この分野における最も初期の研究は、１９７０年代までさかのぼり、Ｎａｋａｍｕｒａ他（１９７８）およびＮｅｍｏｔｏ他（１９８０）によって行われた研究を含んでいる。これらの研究は、平行平板圧縮とマイクロピペット吸引による陰圧適用を用い、動物モデルにおける細胞の硬さ、膜表面張力および細胞内圧を含むパラメータを測定している。Ｎａｋａｈａｒａ他は、透明帯の硬化を観察するために、力センサを用いてタイムラプス逐次力学的測定を行った（Ｎａｋａｒａｈａ他，２０１８）。卵母細胞を圧縮する際の抵抗を測定するために、特殊なセンサシステムが設計された。フランスのグループは、細胞質内精子注入プロトコルで使用するものと同様の力検知プラットフォームを、注入ピペットをガラス圧子に置き換えて報告した（Ｇａｎａ他，２０１７）。ナノフォースを測定するための２つの受動的かつ直線的な磁気バネが卵子に適用された。彼らは未熟な卵子（メタフェーズＩ）からの予備的な結果のみを発表した。
インデンテーション－Ｌｉｕ他は、サブピクセルのコンピュータビジョントラッキングにより、外部から加えられた力に対する卵母細胞の抵抗を定量化するシステムを報告した（Ｌｉｕ他，２０１０）。このコンピュータビジョントラッキングシステムを用いることで、健康なマウス卵子を老化による細胞欠陥と区別することに成功した。
吸引－マイクロピペット吸引（ＭＰＡ）を用いて、Ｅｖａｎｓ他は、皮質張力、または、皮表面積対体積比を最小化する役割を果たす皮質およびその上の細胞膜における力を研究した（Ｅｖａｎｓ他，２０１８）。Ｙａｎｅｚ他は、ヒトおよびマウスの受精卵における胚盤胞形成の成功率の予測においてＺｅｎｅｒモデルベースの機械的パラメータの可能性を評価するために修正モデルを使用した。
その他の方法－Ｗａｎｇ他は、胚内ナビゲーションおよび測定のための３次元磁気ピンセットシステムを設計した（Ｗａｎｇ他，２０１７）。磁気ピンセットシステムを使用して、Ｗａｎｇ他は、マウス胚を調査した。マウス胚の内細胞塊（ＩＣＭ）上の複数の位置の力学的特性評価を行うことを目指し、胚内で磁気制御されたマイクロビーズを既知の力でナビゲートすることにより、胚内粘度が測定された。Ｗａｎｇ他の研究においては、胚内の５μｍの磁性ビーズに正確に力を加えられた。ビーズの３Ｄナビゲーションにより、細胞質の粘度が推定された。著者らは、マウス胚の粘度は水の粘度の８倍であると結論付けている。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）は、牛および未経産牛の卵子を用いて透明帯の機械的特性を測定するために使用された（Ｐａｐｉ他，２０１０）。この研究においては、研究者は卵子成熟中に透明帯の弾力性が失われることを報告した。Ａｎｄｏｌｆｉ他（２０１６）は、この方法を臨床研究へと押し進めた。彼らは１４人の患者の卵子を分析し、否定的な結果を伴う適切なメタフェーズＩＩは、妊娠を達成したものよりも柔らかい外層の透明帯を示すことを発見した。Ｈｏｒｎｉｃｋ他は、減数分裂の染色体の硬さを研究するために「硬質ピペット」法を使用した（Ｈｏｒｎｉｃｋ他，２０１５）。彼らは、２本のピペットを用いて、モデルマウスの分離した染色体の両端を正確に伸ばして抵抗を測定し、高年齢群と低年齢群との間に有意差があり、高年齢群の方が、力定数が大きく、異数性の確率が高い可能性があることを観察した。
上記の先行研究は、生体力学的特性のいくつかの例を報告しているが、これらの方法は、組織に直接接触する必要がある。一部の著者は、その方法が低侵襲であると主張しているが（Ｙａｎｅｚ他，２０１６）、力の付与に必要な接触による胚の後の発達への影響は、まだ未解明である。また、一部の方法は、侵襲性または破壊性が高く、基礎研究のための実験室環境での一回限りの測定にのみ実行可能であり（Ｇａｎａ他，２０１７；Ｈｏｒｎｉｃｋ他，２０１５）、実際のＩＶＦの手順では実行不可能である。さらに、これらの方法は、卵母細胞および胚の生体力学的特性をマクロレベルでしか定量化できず、細胞よりも小さいレベルでは定量化できない。したがって、局所的あるいは細胞よりも小さいレベルの生体力学的測定に対するニーズは依然として残っており、より高い分解能での生体力学的特性の測定を実現するための努力がなされている。例えば、ＤｉｔｔｍａｎおよびＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇは、細胞変形を逆有限要素法（ｉＦＥＭ）と組み合わせたが、この方法においては推定が簡略化され、細胞全体の圧縮性を付与して、透明帯の力－歪み挙動のみが推定された（Ｄｉｔｔｍａｎｎ他，２０１８）。
前述の技術的ニーズに鑑みて、本開示の主題は、生殖細胞構造体の少なくとも１つ以上の生体力学的特性の光学的測定に基づく生殖細胞構造体の非接触検査または監視のための方法およびシステムを提供することである。より具体的には、本開示の態様は、生殖細胞構造体の少なくとも１つ以上の生体力学的特性を決定し、任意に生体力学的特性を利用して、妊娠を成功に導く可能性がより高い生殖細胞構造体を選択するための光学イメージング技術を提供し得る。ここで、生殖細胞構造体は、胚、受精卵、卵子および卵母細胞などを含むことができる。しかしながら、本開示を用いて特徴付けられ得る生殖細胞構造体は、本明細書に明示的に開示されたものに限定されず、ＩＶＦ中の任意の段階における生殖細胞構造体の生存能力を評価するために採用されてもよい。いくつかの実施形態においては、光学イメージング技術は、細胞よりも小さい分解能を有するように実施されてもよい。例えば、光学イメージング技術は、ブリルアン分光法に基づいていてもよい。
いくつかの実施形態においては、光学イメージングシステムは、卵母細胞および胚のイメージング用のブリルアン顕微鏡イメージングシステムであってもよい。このシステムは、改善された精度（例えば、約１０ＭＨｚ以下）および向上した分解能（例えば、約３μｍ以下）の、細胞よりも小さいレベルでの卵母細胞および胚の３次元ブリルアン顕微鏡イメージングを得ることができる。ブリルアン顕微鏡イメージングシステムは、卵母細胞および胚の生体力学的特性を、その後の発育およびＩＶＦの後続の手順のために悪影響を与えることなく測定することができる。
いくつかの実施形態においては、生体力学的特性は、細胞よりも小さい分解能で測定されてもよく、細胞構造の生体力学的特性の空間的に分解された２Ｄまたは３Ｄマップを得るために走査式に測定されてもよい。２Ｄまたは３Ｄ走査を得るのに適した画像の光学分解能およびコントラストを高めるために、画像形成において焦点外光を遮断するために、少なくとも１つ以上の空間共焦点ピンホールがシステムに含まれてもよい。サンプル内の異なる深さにおいて、複数の２次元画像を取得する（例えば、光学的切片化）ことによって、３次元構造を改善された分解能および忠実度で再構築することができる。
本開示の態様は、ブリルアン指標に基づいて卵母細胞および胚の生存率を定量化することも含む。ブリルアン指標は、生存可能な生殖細胞構造体（例えば、受精卵）に対する生体力学的マーカとして機能し得る。さらに、ブリルアン測定値は、生体力学的特性を検出するために十分な感度を提供する指標として使用されてもよい。
さらに、本開示の態様は、動物またはヒトにおける実施および生着成功を予測するために、受精卵に関するブリルアン測定の価値を特徴付けることを含む。一例として、本開示に従ったブリルアン分光法に基づいて導出された指標は、卵子および胚の使用が生児出産の成功をもたらす可能性を予測するために使用されてもよい。言い換えれば、卵母細胞および／または胚の少なくとも１つ以上の生体力学的特性のブリルアン測定は、生児出産を予測するための生体力学的マーカとして機能し得る。
一例として、かつ、以下において、より詳細に議論するように、いくつかの実施形態においては、本開示に従ったブリルアン散乱放射線の分析を介して得られる弾性率が、卵母細胞、受精卵および／または胚の剛性または固さを評価するために使用することができ、卵母細胞、受精卵および／または胚の剛性または固さは妊娠成功と相関している可能性がある。いくつかのそのような実施形態においては、生体力学的測定は、動物またはヒトにおいて、受精卵段階における胚の可能性を予測し得る。
本開示の関連する態様によれば、本開示は、ＩＶＦの臨床管理の大幅な強化をもたらす可能性がある。例えば、ブリルアン・ベースの生体力学的指標は、生存卵子の選択についてよりよい決定を下すために利用され得る。ドナー卵子に対する卵子スクリーニングは、生存卵子を識別するために、より確実に実行され、受精プロセスを強化することができる。さらに、受精前の卵子および受精後の胚の定量的な生体力学的評価は、生存率および生児出産率をさらに向上させ、望まれない多胎妊娠の発生を減少させる可能性がある。先進的なブリルアン技術と光学機器は、卵母細胞および胚の機械的または生体力学的特性の基本的な理解を進めることにより、一般的に不妊治療クリニックに利益をもたらす。さらに、卵母細胞および胚のブリルアン計測は、ＡＲＴ分野における生体力学より積極的な探求につながる可能性がある。
以下、典型的なＩＶＦの手順について説明し、ＩＶＦの手順における本開示の主題の意義について説明する。典型的なＩＶＦにおいては、受精後２日間から３日間、管理された実験室環境下において胚が成長させられる。成長した胚は、次に、女性の子宮に移植されてもよい。
成功率を高めるために、胚は、着床可能な状態になるまで、体外で培養されてもよい。図２は、ヒト胚の着床前発生を示したものである。受精後約９０分で、受精卵は２つの細胞に分裂し、２細胞胚盤胞の状態になる。これは受精卵の最も早い有糸分裂産物であると考えられる。このような分裂が続き、胚盤胞と呼ばれる細胞の集団になる。受精卵が１６から３２個の細胞を含むと、それは桑実胚と呼ばれることがある。受精卵から胚盤胞が分裂することにより、単一の受胎可能な細胞が、胚盤胞が形成されるまで分裂および分化を続けることができる。
胚選択方法が、非侵襲的で、安価で、使いやすく、生存率を強く予測でき、卵子および胚の両方に適用可能である場合には、多くの利点がある。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、胚選択のための卵母細胞および胚の、ブリルアン顕微鏡を介した生体力学的評価を提供する。
上述のように、本開示の主題は、生殖細胞構造体の少なくとも１つ以上の生体力学的特性の非侵襲的測定のための方法を提供する。特に、本開示に係る方法は、生殖細胞構造体の生体力学的特性、例えば、その弾性率および／または粘度の非侵襲的かつ非接触的な特性付けのために、ブリルアン分光法を使用することができる。したがって、本開示のブリルアン分光法に基づく方法およびシステムは、卵子および／または胚をリアルタイムで局所的（例えば、細胞よりも小さい分解能で）、かつ、誘導的に、非侵襲で検査することを可能にし得る。
本開示に係る生殖細胞構造体のブリルアン分光法においては、生殖細胞構造体に入射した光子は、音響フォノンとの相互作用を介して散乱し、わずかに低いまたは高いエネルギで光子を生成し得る。したがって、散乱された光子のエネルギ（したがって周波数）シフトは、音響フォノンのエネルギに関連し、これは、生殖細胞構造体の弾性率に関連し得る。したがって、以下において、より詳細に議論するように、ブリルアン周波数シフトは、生殖細胞構造体の弾性率（例えば、複数の細胞よりも小さい値の平均値）の推定値を得るために利用され得る。
図４に示すように、被検体（例えば、生殖細胞構造体）は、中心光周波数ｖ０（緑で示す）を有する入射光線が照射されてもよい。被検体との相互作用により、光は、ブリルアン散乱放射線に対応する弾性散乱部分と非弾性散乱部分とに分割される。周波数ｖ０を有する妨害されていない弾性散乱部分は、例えば、少なくとも１つ以上の光学フィルタを用いて除去され、青色およびオレンジ色（または破線）で示される、それぞれ、周波数ｖ０＋ΔｖＢおよび周波数ｖ０－ΔｖＢを有する非弾性散乱ブリルアン成分を明らかにすることができる。周波数シフト成分ΔｖＢは、分光器を用いて測定することができる。入射光および散乱光（レーザ放射など）の周波数シフトの結果、ブリルアン・スペクトルが定義され、これは被検体のプローブ位置における縦弾性率に直接関連する。光源の周波数に応じて、測定分解能を調整することができる。さらに、ブリルアン・イメージングを用いて、被検体の機械的特性の空間分布をマッピングすることができる。
いくつかの実施形態においては、放射源は、約４００ｎｍから約８００ｎｍの間の真空波長、および約１ｍＷから約１００ｍＷの範囲の放射出力パワーを有する放射線を提供するレーザであり得る。一例として、レーザは、約４００ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４７５ｎｍ（青）、約５００ｎｍ、約５２５ｎｍ（緑）、約５５０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約６７５ｎｍ、約７００ｎｍ（赤）、約７２５ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７７５ｎｍ、または約７８０ｎｍの波長を有していてもよい。例として、レーザは、約１ｍＷ、約２．５ｍＷ、約５ｍＷ、約７．５ｍＷ、約１０ｍＷ、約２０ｍＷ、約３０ｍＷ、約４０ｍＷ、約５０ｍＷ、約７５ｍＷ、または約１００ｍＷの出力を有していてもよい。
本開示の方法に従って測定されるブリルアン散乱シフト△ｖＢは、約５ＧＨｚから約１５ＧＨｚまでの間であってもよい。一例として、ブリルアン散乱シフトΔｖＢは、例えば、検査中の生殖細胞構造体（例えば、卵母細胞または胚）に応じて、約５ＧＨｚ、約６ＧＨｚ、約７ＧＨｚ、約８ＧＨｚ、約９ＧＨｚ、約１０ＧＨｚ、約１１ＧＨｚ、約１２ＧＨｚ、約１３ＧＨｚ、約１４ＧＨｚ、または約１５ＧＨｚであってもよい。
本開示によれば、ブリルアン周波数シフトは、約０．０５ＧＨｚ（すなわち、５０ＭＨｚ）以下の最小検出分解能で測定されてもよい。一例として、検出分解能は、約１０ＭＨｚ以下であってもよい。このような精度のため、本開示に係る光測定技術は、ヒトの細胞に対して適用可能な信頼性の高い測定値を提供することができる。
測定されたブリルアン散乱シフト△ｖＢは、長手方向の歪みに対する長手方向の応力の比である（高周波）縦貯蔵弾性率（「弾性率」ともいう。）Ｍ´と、次式によって相関させることができる。
Figure 2023516591000004
 ここで、ｎは媒質、例えば、生殖細胞の屈折率、λは、光源光の真空波長、ρは、媒質、例えば、生殖細胞の密度、θは入射光と散乱光とのなす角である。後方散乱の場合には、θは約１８０°であり、ｓｉｎ（θ／２）は約１になる。従って、縦弾性率Ｍ´は次式により求めることができる。
Figure 2023516591000005
同様に、縦貯蔵弾性率Ｍ´は、次式によりヤング率Ｅ´と相関させることができる。
Figure 2023516591000006
 ここで、ａおよびｂは較正係数である。
完全な粘弾性構成モデルに対する複素縦弾性率Ｍ＊を得るために、ブリルアンピークの線幅ΓＢも測定されてもよい。貯蔵弾性率と同様に、縦損失弾性率（「粘性率」ともいう。）Ｍ″は、次式により求めることができる。
Figure 2023516591000007
粘弾性構成モデルの場合には、複素縦弾性率Ｍ＊は、次のように表すことができる。
Ｍ＊＝Ｍ´＋ｉＭ″
ここで、Ｍ´は貯蔵弾性率、Ｍ″は損失弾性率である。貯蔵弾性率は貯蔵されたエネルギ（弾性部分）を測定し、損失弾性率は熱として散逸したエネルギを測定し、これは複素縦弾性率の粘性部分を定量化する。自発的ブリルアン光散乱は、光子と音響フォノンとの相互作用によって発生する。この相互作用は、熱力学的揺らぎの圧力波の伝搬によって生じる媒質の屈折率の変調による光の散乱として理解することができる。揺らぎは確率的であるため、波は白色のスペクトル（すなわちすべての周波数成分）を持ち、音響波の速度であらゆる方向に伝播する。位相の揃った音響波から散乱された光は、力学的な波の周波数に等しい大きさのドップラ周波数シフトを経験し、通常５～１０ＧＨｚの範囲となる。この周波数は、ブリルアン分光法を用いて容易に測定することができる。一連の導出手順を経て、最終的な構成式は次式のように表される。
Figure 2023516591000008
 以上のように、弾性部分の貯蔵弾性率はブリルアン周波数シフトの関数（ΔｖＢ ２）であり、粘性部分の損失弾性率はブリルアン周波数シフトとブリルアンピーク線幅との関数（ΔｖＢΓＢ）である。ΔｖＢおよびΓＢは、共にブリルアン顕微鏡測定とそれに続く数値解析とによって測定できる。ブリルアン分光器を用いたブリルアン周波数シフトおよびピーク線幅の測定は、スペクトル上の光学分解能に影響されることがある。これら２つの変数の正確な測定は、２つの仮想的に画像化されたフェイズドアレイ（ＶＩＰＡ）分光器を用いて測定したシステム応答を用いて、スペクトルをデコンボリューションすることに行われ得る。
上述したように、空間的に分解された弾性率マップは、入射放射線の２Ｄおよび／または３Ｄ走査と、走査された位置からのブリルアン散乱放射線の検出とを介して得ることができる。空間的に分解されたおよび／または代表的な（例えば、全体的またはグローバルな）弾性率を用いて、卵子または胚の生存率が評価されてもよい。さらに、いくつかの実施形態においては、ブリルアン・ベースの生存率は、普遍的に適用されてもよい。他の実施形態においては、ブリルアン・ベースの生存率は、民族性、病歴などの個人的な要因と関連して評価されてもよい。
以下、生殖細胞構造体の生体力学的特性を測定し、測定された生体力学的特性を用いて、本開示による生存可能な生殖細胞構造体を同定、選択、またはスクリーニングするための方法およびシステムの例示的な実施形態が記載される。
図５は、本開示の例示的な実施形態に係る生殖細胞構造体の生体力学的特性を光学的に検査または特徴付けるためのフローチャートである。生殖細胞構造体の非接触検査方法は、生殖細胞構造体を取得（例えば、収集）すること（Ｓ１００）と、光学イメージング技術を使用して生殖細胞構造体の位置におけるブリルアン周波数シフトを測定すること（Ｓ２００）とを含んでいてもよい。図６を参照すると、ブリルアン周波数シフトの測定（Ｓ２００）は、生殖細胞構造体に放射線を照射すること（Ｓ２１０）、散乱（例えば、後方散乱）放射線を検出すること（Ｓ２２０）、および、検出された放射線を分析して、例えば、分光器を用いて少なくとも１つのブリルアン周波数シフトを同定することを含んでいてもよい（Ｓ２３０）。
その後、測定されたブリルアン・スペクトルは、生殖細胞構造体の生体力学的特性に相関させられてもよい（Ｓ３００）。いくつかの実施形態においては、ステップＳ２００およびＳ３００を繰り返して、生殖細胞構造体全体の生体力学的特性の２Ｄまたは３Ｄマップを得てもよい。生体力学的特性は、生殖細胞構造体の受胎能力にさらに相関させてもよい（Ｓ４００）。決定された受胎能力に基づいて、生殖細胞構造体は、ＩＶＦにおけるさらなる手順のために同定、選択、またはスクリーニングされてもよい（Ｓ５００）。
生殖細胞構造体の位置においてブリルアン周波数シフトを測定するステップ（Ｓ２００）は、図６を参照してより詳細に説明される。図６を参照すると、生殖細胞構造体は、少なくとも１つの所望の周波数成分を有する放射線を照射されてもよい（Ｓ２１０）。いくつかの実施形態においては、照射放射線は、レーザ放射であってもよい。次いで、生殖細胞構造体から散乱された放射線の少なくとも一部が検出されてもよい（Ｓ２２０）。その後、検出された散乱放射線の周波数スペクトルを解析して、周波数スペクトルにおける少なくとも１つのブリルアン周波数シフト（例えば、ダウンシフトまたはアップシフトした周波数成分）を同定してもよい（Ｓ２３０）。いくつかの実施形態においては、生殖細胞構造体から弾性的に散乱された放射線は、ブリルアン周波数シフトの検出を容易にするためにフィルタリングされてもよい。
いくつかの実施形態においては、生殖細胞構造体を提供するステップ（Ｓ１００）は、生殖細胞構造体を固定することをさらに含んでもいてよい。一例として、生殖細胞構造体は、機械的保持、電磁的保持、または流体力学的保持によって、光学的観察のために固定されてもよい。他の実施形態においては、観察される細胞が観察に最適な位置に配置されるように、サンプル容器および／またはブリルアン分光器の光学部品が移動されてもよい。一例として、画像認識技術に基づいてサンプル容器および／またはブリルアン分光器の光学部品を移動させるソフトウェアアルゴリズムが実装されてもよい。そのような実施形態において、画像認識は、細胞およびその範囲を特定するためのニューラルネットワークアルゴリズムに基づくものであってよい。サンプルは、一旦同定されると、電動ステージを使用して視野の中心に維持されてもよく、または走査設定が、サンプルの位置に基づいて動的に更新されてもよい。画像認識技術は、測定の最初のステップであるサンプルの初期位置特定を高速化することができる。
測定される生殖細胞構造体は、胚、受精卵、卵子または卵母細胞などを含んでいてもよい。いくつかの実施態様においては、複数の卵子の中から雄性配偶子と受精させるべき最も生存力の高い卵子を選択するために、卵子の生物力学的特性が測定される。いくつかの実施態様においては、胚の生体力学的特性は、子宮に移植するために最も生存力の高い胚（複数可）を選択するために測定されてもよい。しかしながら、本開示による光学的検査は、卵母細胞および胚の選択に限定されず、体外受精の様々な段階において適用されてもよい。
生殖細胞構造体の受胎可能性は、生存率、生着率および発育能などによって示され得る。しかし、生殖細胞構造体の受胎可能性はこれに限定されず、受胎が成功する確率を示す様々な指標を指してもよい。いくつかの実施形態においては、生殖能力は、生存率として定量化されてもよい。例えば、測定されたブリルアン周波数シフトが約５．０ＧＨｚから約６．２ＧＨｚまでの間に入るとき、生殖細胞は、生着のための高い生存能力を有すると判断され、したがって、生存率は最も高いと評価されてもよい。また、生存率は、例えば、上述したブリルアン分光法に基づく、ある時間帯に行われた一連の測定値を反映してもよい。生存率は、ブリルアン分光法だけでなく、化学的測定値などの他の測定値をさらに反映してもよい。
上述のように、空間的に分解されたおよび／または代表的な（例えば、全体的な）弾性率を用いて、最高の生存率（例えば、所定のヤング率範囲または所定のブリルアン散乱成分範囲に入る。）を示す卵母細胞が、精子注入を進めるために選択され得る。一例として、生存能力の可能性につながるヤング率範囲は、約２ＧＰａから約６ＧＰａまでの間であってもよく、これは、約５ＧＨｚから約１５ＧＨｚまでの間のブリルアン周波数シフトに対応し得る。いくつかの実施形態においては、最高の生存能力（例えば、所定のヤング率範囲に入る、または所定のブリルアン散乱成分範囲に入る。）を示す胚は、移植を進めるために選択されてもよい。
さらに、いくつかの実施形態においては、ブリルアン・ベースの生存率は、測定された生体力学的特性のみに基づいて適用されてもよい。他の実施形態においては、ブリルアン・ベースの生存率は、両親の年齢、民族性、病状／病歴などの個人的な要因と関連して評価されてもよい。一例として、いくつかの実施形態においては、従来の測定基準（例えば、親の年齢、民族性、病状／病歴など）を使用して卵子を少数に絞り込み、その後、本開示によるブリルアン散乱測定を採用して、受精のために従来のパラメータを介して最初に選択されたものの中から卵子を選択することが可能である。
図７は、本開示の例示的な実施形態に係る生殖細胞構造体の生体力学的特性を光学的に検査および／または特徴づけるためのシステム１０を示す図である。図７に示すように、本開示の例示的な実施形態による生殖細胞構造体の光学的検査のためのシステム１０は、サンプル２０（例えば、生殖細胞構造体）を照射するための放射線を生成する発光源（例えば、レーザ）１００を備えていてもよい。生成された放射線は、ダイクロイックミラー１５０によって（本実施形態においては対物レンズの形態である）光学系２００上に反射され、この光学系２００が、放射線をサンプル２０上に集束させてもよい。受光部品３００は、生殖細胞構造体によって散乱された光の少なくとも一部を受光してもよく、受光した光は光ファイバ３５０を介して伝送されてもよく、分光器４００が散乱光の周波数シフト成分を測定してもよい。
いくつかの実施形態においては、焦点外光を遮断するために、ピンホール２５０が受光部品３００の前（すなわち、上流）に配置されていてもよい。システム１０は、発光源１００の前方（すなわち、下流）に別のピンホール１２５をさらに備えていてもよい。ピンホール２５０および／またはピンホール１２５によれば、システム１０は、焦点面３０を調整することができ、したがって、２Ｄまたは３Ｄ走査のための光学的断面化および垂直走査を提供することができる。いくつかの実施形態においては、共焦点システムを使用して、垂直走査は、約５μｍ未満の分解能で得られてもよい。一例として、垂直走査の分解能は、約５μｍ、約４μｍ、約３μｍ、約２μｍ、または約１μｍであってもよい。いくつかの実施形態においては、シングルモード光ファイバが採用され得るが、他の実施形態においては、マルチモード光ファイバも光ファイバ３５０として使用され得る。そのコア径が小さいため、シングルモード光ファイバは、本質的にピンホールとして機能し、したがって、ピンホール２５０、受光部品３００、および光ファイバ３５０の機能を兼ね備えることができる。
アナライザ７００において、測定された周波数シフト成分は、生殖細胞構造体の生体力学的特性に相関させられ、その後、生殖細胞構造体の生体力学的特性が、生殖細胞構造体の受胎可能性に相関させられる。アナライザ７００は、本開示によって知らされるように、当技術分野で既知の方法でハードウェア、ソフトウェア、および／またはファームウェアで実装することができる。例えば、アナライザは、プロセッサと、プロセッサと通信している少なくとも１つ以上のメモリモジュールとを含むことができる。生殖細胞構造体の少なくとも１つ以上の測定された生体力学的特性を、それが成功するＩＶＦ結果につながり得る可能性と相関させるための本開示による命令は、実行中にプロセッサによってアクセスされるように、アナライザのメモリモジュールに格納することができる。
走査方式でサンプル２０を特徴付けるために、システムは、少なくとも１つ以上のアクチュエータ５００をさらに備えていてもよい。図７において、アクチュエータ５００は、サンプル２０を含むサンプルホルダ２５に結合され、サンプル２０内の様々な位置に照射放射線を照射するように、サンプルホルダ２５をテーブル６００に対して水平面上で並進移動させるように示されている。使用において、サンプルホルダ２５は、発生学のワークフローにおいて使用される様々なタイプのペトリ皿であってもよく、アクチュエータ５００およびテーブル６００は、様々なタイプのサンプルホルダ２５を収容するように設計されてもよい。
しかしながら、本開示はそのような構成に限定されず、アクチュエータ５００は、サンプルの異なる部分に照射するために、光学部品を並進移動させて、光学部品とサンプル２０との間に相対移動を生じさせてもよい。いくつかの実施形態においては、アクチュエータ５００は、走査を実行するために対物レンズ２００の位置および／または向きを動かしてもよい。いくつかの実施形態においては、サンプル２０とシステム１０の光学部品との間に相対的な水平移動を引き起こすことによって、約５μｍ未満の分解能で水平走査を得ることができる。一例として、水平走査の分解能は、約５μｍ、約４μｍ、約３μｍ、約２μｍ、または約１μｍであってもよい。
上述したように、システムは、細胞構造体が観察に最適な位置に配置されるように、サンプルホルダ２５をテーブル６００に対して、および／または光学部品（例えば、対物レンズ２００）をサンプル２０に対して相対的に移動させるための装置をさらに備えていてもよい。いくつかのそのような実施形態においては、アクチュエータは、例えば、画像認識技術に基づいて細胞構造体の相対位置を調整してもよい。
測定された周波数シフト成分は、ブリルアン・スペクトルに対応していてもよい。さらに、生体力学的特性は、生殖細胞構造体の弾性率または粘性率を含んでいてもよい。上述のように、本開示に係るシステムを用いて特徴付けられる生殖細胞構造体は、胚、受精卵、卵子または卵母細胞などを含んでいてもよい。システムが生殖細胞構造体をより効果的に特徴付けるために、光学システムは、細胞よりも小さい分解能を有していてもよい。したがって、特定の場所またはスポットの生体力学的特性が測定されてもよく、システムは、生殖細胞構造体を走査方式で検査し、その生体力学的特性が生殖細胞構造体全体にマッピングされることを可能にしてもよい。いくつかの実施形態においては、生殖細胞構造体を評価するために、生体力学特性の代表的なスポット測定が利用されてもよく、またはグローバルな生体力学特性（例えば、局所的生体力学特性を空間的に平均化することによって得られるもの）が利用されてもよい。
本明細書に記載されるように、本開示の主題は、弾性率および粘性率などの少なくとも１つ以上の生体力学的特性を光学的に特徴付けることによって、卵母細胞および胚などの生殖細胞構造体を検査する能力を提供する。したがって、生殖細胞構造体が、非侵襲的かつ非接触の方法で検査され、ＩＶＦの手順をさらに進めるために最も生存能力の高い被検体を選択することができ、ＩＶＦの成功確率を向上させる可能性がある。
以上、本開示を具体的な構成要素などの特定の事項によって説明したが、例示的な実施形態および図面は、単に本開示の全体の理解を補助するために提供されるものである。したがって、本開示は、本明細書に記載された例示的な実施形態に限定されるものではない。本開示が属する技術分野における当業者により、様々な修正および変更がなされ得る。本開示の精神は、上述した例示的な実施形態に限定されるべきではなく、以下の請求項、および請求項と同等または等価に変更された全ての技術精神は、本開示の範囲および精神に含まれると解釈されるべきである。
本明細書で言及された全ての刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。本開示で引用された文献のリストは、以下の通りである。
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Claims (20)

  1. 生殖細胞構造体の少なくとも１つの生体力学的特性を測定する方法であって、
    前記生殖細胞構造体に放射線を照射することと、
    照射された前記生殖細胞構造体から散乱した放射線の少なくとも一部を検出することと、
    検出された散乱放射線の周波数スペクトルを分析し、該周波数スペクトルにおける少なくとも１つのブリルアン周波数シフトを同定することと、
    該ブリルアン周波数シフトに基づき、前記少なくとも１つの生体力学的特性を決定することとを含む方法。
  2. 前記少なくとも１つの生体力学的特性に基づいて、前記生殖細胞構造体の生存率を決定することを含む請求項１に記載の方法。
  3. 前記少なくとも１つの生体力学的特性が、前記生殖細胞構造体の少なくとも一部の弾性率、粘性率、またはその両方を含む請求項１に記載の方法。
  4. 次式を用いて前記弾性率Ｍ´を導出することを含む請求項３に記載の方法。
    Figure 2023516591000009
     ここで、
    △ｖＢは、前記ブリルアン周波数シフト、
    ρは、前記生殖細胞構造体の少なくとも一部分の密度、
    λは、前記放射線の真空波長、
    ｎは、前記生殖細胞構造体の少なくとも一部分の屈折率
    である。
  5. 検出された前記散乱放射線の前記周波数スペクトルにおける少なくとも１つのブリルアン・ピークの幅を測定することと、
    ΓＢを前記少なくとも１つのブリルアンピークの幅として、次式を用いて、前記粘性率Ｍ″を導出することと、
    Figure 2023516591000010
     次式を用いて複素弾性率Ｍ＊を導出することとを含む請求項４に記載の方法。
    Ｍ＊＝Ｍ´＋ｉＭ″
  6. 照射する前記放射線がレーザ放射である請求項１記載の方法。
  7. 前記レーザ放射が、約４００ｎｍから約８００ｎｍの範囲の真空波長に対応する少なくとも１つの周波数成分を含む請求項６に記載の方法。
  8. 前記ブリルアン周波数シフトの検出を容易にするために、前記生殖細胞構造体から弾性的に散乱される前記放射線をフィルタリングすることを含む請求項１に記載の方法。
  9. 前記生殖細胞構造体の前記少なくとも１つの生体力学的特性が、細胞より小さい分解能によって決定される請求項１記載の方法。
  10. 前記生殖細胞構造体の複数の細胞内位置において、前記少なくとも１つの生体力学的特性を決定することを含む請求項９に記載の方法。
  11. 前記散乱放射線の前記周波数スペクトルを得るために分光器を使用することを含む請求項１に記載の方法。
  12. 生殖細胞構造体の少なくとも１つの生体力学的特性を決定するためのシステムであって、
    照射放射線を発生させるための放射線源と、
    前記生殖細胞構造体の少なくとも一部に前記照射放射線を照射するための少なくとも１つの光学系と、
    前記生殖細胞構造体から散乱した放射線の少なくとも一部を検出するための検出器と、
    検出された散乱放射線の周波数スペクトルを生成するための分光器と、
    前記周波数スペクトルを処理して、少なくとも１つのブリルアン周波数シフトを特定し、該ブリルアン周波数シフトを利用して前記少なくとも１つの生体力学的特性を決定するためのアナライザとを備えるシステム。
  13. 前記散乱放射線の少なくとも一部を、光ファイバを通して前記検出器に導くための少なくとも１つの放射線収集光学系を備える請求項１２に記載のシステム。
  14. 前記少なくとも１つの放射線収集光学系の上流に配置され、焦点のずれた光を遮断するピンホールを備える請求項１３に記載のシステム。
  15. ブリルアン分光法を用いて生殖細胞構造体の少なくとも１つの生体力学的特性を測定することと、
    測定された前記少なくとも１つの生体力学的特性に基づいて、前記生殖細胞構造体の生存率を決定することとを含む方法。
  16. 前記少なくとも１つの生体力学的特性が、弾性率、粘性率、またはその両方を含む請求項１５に記載の方法。
  17. 前記生殖細胞構造体が、胚、桑実胚、胞胚、原腸胚、受精卵、卵子、および卵母細胞からなる群から選択される１つを含む請求項１５に記載の方法。
  18. 雄性配偶子と受精させる卵子を選択するために実施される請求項１５に記載の方法。
  19. 体外受精にさらに進むための受精卵を選択するために実施される請求項１５に記載の方法。
  20. 子宮に移植される胚を選択するために実施される請求項１５に記載の方法。
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