JP2023516312A - タンパク質ナノ粒子の設計および適用 - Google Patents

タンパク質ナノ粒子の設計および適用 Download PDF

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Abstract

少なくとも１種の結合ポリペプチドと少なくとも１種の非構造化ポリペプチドとを含む融合タンパク質を含むタンパク質ナノ粒子を本明細書に記載する。一態様では、ナノ粒子は、コアポリペプチドの繰り返しおよびコロナポリペプチドの繰り返しのジブロック、ならびに１種以上の結合タンパク質を含む。ナノ粒子は、治療剤、標的送達剤、分離剤、または精製剤として使用することができる。

Description

本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０２０年３月４日に出願された米国仮特許出願第６２／９８５，１７４号の優先権を主張している。
連邦政府に支援された研究
本発明は、米国国立科学財団助成金番号ＤＭＲ－１７－２９６７１の下で米国政府の支援を受けて作製された。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
配列表
本出願は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１（ｃ）に従って、配列表のコンピュータ可読形態で出願される。ＥＦＳによって提出されたテキストファイル「０２８１９３－９３３９－ＷＯ０１＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿２－ＭＡＲ－２０２１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」は、２０２１年３月２日に作成され、１２１個の配列を含み、２９４キロバイトのファイルサイズを有し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
技術分野
本明細書に記載されるのは、少なくとも１つの結合ポリペプチドと少なくとも１つの非構造化ポリペプチドとを含む融合タンパク質を含むタンパク質ナノ粒子である。一態様では、ナノ粒子は、コアポリペプチドの繰り返しおよびコロナポリペプチドの繰り返しのジブロック、ならびに１種以上の結合タンパク質を含む。ナノ粒子は、治療剤、標的送達剤、分離剤、または精製剤として使用することができる。
ここ数十年で、薬物送達のためのナノ粒子キャリアの開発に対する関心が爆発的に高まり、その多くは固形腫瘍の処置のためのものである。無機ナノ粒子デンドリマー、ポリマーナノ粒子、および自己集合したナノ構造－ミセル、ならびにポリマーおよび脂質のポリマーソーム／リポソームを含む多くの異なる種類のナノ粒子が、がん療法のための前臨床モデルにおいて合成され、評価されている。
この分野の一般的な関心は、負の副作用なしで意図されたとおりに強力に作用する薬物、比喩的にいえば「魔法の弾丸」を達成することである。この理想に伴う問題は、ほとんどの薬剤が、ヒトの生理学によってもたらされる送達障害に対して効力のバランスをとらなければならないことである。ナノ粒子は、２つの理由から、この課題に対する答えになり得るため、「ナノ医学」コミュニティから多くの注目を集めている。第一に、多様な物理化学的特性を有する幅広い低分子を積載することができ、低分子薬物および画像診断剤のほぼユニバーサルなキャリアになることである。第二に、適切に設計されたナノ粒子は、血液中で良好なコロイド安定性を示し、長期間循環することができることである。したがって、ナノキャリアの有望性は、ナノスケールの材料特性が、開発された薬物の負の特性をいかに変化させ、それらに所望の特性を付与することができるかを理解することである。他の所望の特性としては、薬物クリアランス／分解に対する耐性、組織特異的標的化、細胞内在化の増加、および血清中の溶解性の増加が挙げられ得る。
過去２０年間に、多くの異なる薬物送達系が生まれ、いくつかは、今日では承認されている治療に進歩している。最も広く使用されている系は、リポソーム製剤であり、リポソームのコアには薬物が積載され、したがって、封入されたカーゴにリポソーム製剤の特性が付与されている。リポソームは、その生体適合性、合成の容易さ、および高い積載容量のため、優れた送達ビヒクルである。
しかしながら、より疎水性の部分を封入するためには、高分子ミセル系がより有利であり、その理由は、高分子ミセルが、リポソームと比較して、疎水性であり、より形態を制御する、より大きな体積／ｇを有するためである。しかしながら、合成、集合集団の多分散性の制御、追加の機能性の組み込み、インビボでの薬物の破裂放出、および全体的な生体適合性の課題により、それらの臨床的可能性は制限されている。
文献では、２つの用語「能動性」および「受動性」標的化がよく使用される。受動性標的化は、ナノ粒子の形状、サイズ、および表面電荷の最適化によって強化され、強化された透過性および保持効果に起因して腫瘍蓄積を向上させる。最近では、フィロミセルと称される高いアスペクト比および高い可撓性を有する粒子が、その長い循環時間、高い腫瘍浸透性および蓄積、ならびに増強された活性標的送達により、多くの研究上の関心を集めている。これらの粒子は、自己集合またはパターン形成を介して生成され、これらは、精密な粒子形状を生成するのに便利であるが、それらの合成に使用される条件がタンパク質を変性させ、それらを体内で不活性にする可能性があるため、タンパク質薬物またはタンパク質標的化リガンドの提示と幾分、不適合である。
受動性標的化は、固形腫瘍の局所標的化に有用なアプローチであるが、薬物または画像化剤の最終目的である腫瘍細胞を直接標的化するものではない。がん治療または画像化のための標的ナノ粒子を作製する根拠は、多くの腫瘍が、過剰発現しているか、またはいくつかの事例で、正常な健康な細胞と比較して、腫瘍細胞の表面上に固有に発現している表面タンパク質を有するという事実に由来する。腫瘍選択的または腫瘍特異的マーカーに特異的なリガンドで装飾することによって、ナノ粒子を腫瘍細胞にホーミングすることは、キャリアが腫瘍の局所環境で十分に高い濃度に蓄積された場合、腫瘍細胞特異的標的化の第二段階をもたらすことができる。
能動性標的化は、目的の細胞上の特異的な結合モチーフおよび標的化構造を利用して、生物物理学的シグナルを有する薬物または画像化剤が積載された粒子を局在化させる。標的ナノキャリアを合成するための一般的なアプローチは、共有結合によってナノ粒子の表面をペプチドまたはタンパク質で機能化することである。しかしながら、このアプローチは、リガンド価の制御が制限されており、典型的には、反応を駆動するために過剰なリガンドを必要とし、したがって、スケールアップが高価であり、品質管理および生成物検証が依然として重大な課題である。
必要とされるのは、細胞標的化、薬物送達、および生体分子精製のためのナノ粒子を形成することができる融合タンパク質である。
本明細書に記載される一実施形態は、少なくとも１つの結合ポリペプチドと少なくとも１つの非構造化ポリペプチドとを含む融合タンパク質を含むタンパク質ナノ粒子を含む組成物である。一態様では、融合タンパク質は、複数の非構造化ポリペプチドを含む。別の態様では、融合タンパク質は、複数の標的化ポリペプチドを含む。別の態様では、非構造化ポリペプチドは、ジブロックペプチドを含む。別の態様では、非構造化ポリペプチドは、コアポリペプチドおよびコロナポリペプチドのジブロックを含む。別の態様では、非構造化ポリペプチドは、コアn－コロナmを含み、ｎは、２０～２００の繰り返し数であり、ｍは、４０～２００の繰り返し数である。別の態様では、コアポリペプチドは、配列ＱＹＰＳＤＧＲＧ（配列番号１）、ＧＲＧＤＱＰＹＱ（配列番号２）、ＧＲＧＤＳＰＹＱ（配列番号３）、ＧＲＧＤＳＰＹＳ（配列番号４）、ＧＲＧＤＱＰＹＳ（配列番号５）、ＧＲＧＤＳＰ［３Ｙ：Ｖ］Ｓ（配列番号６）、ＧＲＧＤＳＰ（Ｙ：Ｖ］Ｓ（配列番号７）、またはこれらの組合せを含む。別の態様では、コロナポリペプチドは、配列ＶＰＧ［Ａ：Ｇ］Ｇ（配列番号８）、ＶＰＧＳＧ（配列番号９）、ＶＰＧＶＧ（配列番号１０）、ＶＰＱＱＧ（配列番号１１）、ＧＲＧＤＳＰＡＳ（配列番号１２）、ＧＲＧＤＳＰＩＳ（配列番号１３）、ＧＲＧＤＳＰＶＳ（配列番号１４）、ＧＲＧＤＱＰＨＮ（配列番号１５）、ＧＲＧＤＮＰＨＱ（配列番号１６）、ＧＲＧＤＳＰＶ（配列番号１７）、またはそれらの組合せを含む。別の態様では、コアポリペプチドは、配列（ＲＬＰ）n（配列番号１）を含み、ｎは２０～２００の繰り返し数である。別の態様では、コロナポリペプチドは、配列（ＥＬＰ）ｍ（配列番号８）を含み、ｍは４０～２００の繰り返し数である。別の態様では、ジブロックは、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ４０（配列番号８３）、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ１６０（配列番号８２）、ＲＬＰ６０－ＥＬＰ８０（配列番号８５）、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ１６０（配列番号８６）、またはＲＬＰ１００－ＥＬＰ８０（配列番号８８）を含む。別の態様では、標的化ポリペプチドは、２ｋＤａ～１００ｋＤａのポリペプチドを含む。別の態様では、標的化ポリペプチドは、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）（配列番号６０）由来のＩＩＩ型ドメイン、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）（配列番号６２）由来のａＦｎ３ドメイン、またはブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）タンパク質Ａ（配列番号６４）のＺドメインを含む。別の態様では、標的化ポリペプチドは、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）（配列番号６０）由来のＩＩＩ型ドメインを含む。別の態様では、標的化ポリペプチドは、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）（配列番号６２）由来のＦｎ３ドメインを含む。別の態様では、標的化ポリペプチドは、（配列番号６４）を含む配列を有するブドウ球菌タンパク質ＡのＺドメインを含む。別の態様では、コアポリペプチドは、架橋される。
本明細書に記載される別の実施形態は、少なくとも１つの結合ポリペプチドと少なくとも１つの非構造化ポリペプチドとを含む融合タンパク質を含むタンパク質ナノ粒子である。一態様では、融合タンパク質は、複数の非構造化ポリペプチドを含む。別の態様では、融合タンパク質は、複数の結合ポリペプチドを含む。別の態様では、非構造化ポリペプチドは、ジブロックペプチドを含む。別の態様では、非構造化ポリペプチドは、コアポリペプチドおよびコロナポリペプチドのジブロックを含む。別の態様では、非構造化ポリペプチドは、コアn－コロナmを含み、ｎは、２０～２００の繰り返し数であり、ｍは、４０～２００の繰り返し数である。別の態様では、コアポリペプチドは、配列ＱＹＰＳＤＧＲＧ（配列番号１）、ＧＲＧＤＱＰＹＱ（配列番号２）、ＧＲＧＤＳＰＹＱ（配列番号３）、ＧＲＧＤＳＰＹＳ（配列番号４）、ＧＲＧＤＱＰＹＳ（配列番号５）、ＧＲＧＤＳＰ［３Ｙ：Ｖ］Ｓ（配列番号６）、ＧＲＧＤＳＰ（Ｙ：Ｖ］Ｓ（配列番号７）、またはこれらの組合せを含む。別の態様では、繰り返しコアポリペプチド配列には、アジドフェニルアラニン、アセチルフェニルアラニン、プロパルギルオキシフェニルアラニン、アセチルフェニルアラニン、またはアジドホモアラニンから選択される少なくとも１～１０個の非標準的アミノ酸が散在している。別の態様では、コロナポリペプチドは、配列ＶＰＧ［Ａ：Ｇ］Ｇ（配列番号８）、ＶＰＧＳＧ（配列番号９）、ＶＰＧＶＧ（配列番号１０）、ＶＰＱＱＧ（配列番号１１）、ＧＲＧＤＳＰＡＳ（配列番号１２）、ＧＲＧＤＳＰＩＳ（配列番号１３）、ＧＲＧＤＳＰＶＳ（配列番号１４）、ＧＲＧＤＱＰＨＮ（配列番号１５）、ＧＲＧＤＮＰＨＱ（配列番号１６）、ＧＲＧＤＳＰＶ（配列番号１７）、またはそれらの組合せを含む。別の態様では、コアポリペプチドは、配列（ＲＬＰ）n（配列番号１）を含み、ｎは２０～２００の繰り返し数である。別の態様では、コロナポリペプチドは、配列（ＥＬＰ）ｍ（配列番号８）を含み、ｍは４０～２００の繰り返し数である。別の態様では、ジブロックは、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ４０（配列番号８３）、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ１６０（配列番号８２）、ＲＬＰ６０－ＥＬＰ８０（配列番号８５）、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ１６０（配列番号８６）、またはＲＬＰ１００－ＥＬＰ８０（配列番号８８）を含む。別の態様では、標的化ポリペプチドは、２ｋＤａ～１００ｋＤａのポリペプチドを含む。別の態様では、結合ポリペプチドは、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）（配列番号６０）由来のＩＩＩ型ドメイン、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）（配列番号６２）由来のａＦｎ３ドメイン、またはブドウ球菌タンパク質Ａ（配列番号６４）のＺドメインを含む。別の態様では、結合ポリペプチドは、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）からのＩＩＩ型ドメインを含む（配列番号６０）。別の態様では、結合ポリペプチドｃは、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）（配列番号６２）由来のＦｎ３ドメインを含む。別の態様では、結合ポリペプチドは、（配列番号６４）を含む配列を有するブドウ球菌タンパク質ＡのＺドメインを含む。別の態様では、コアは、光または他のクリックケミストリーに適合するリンカーを使用して共有結合的に架橋される。別の態様では、コアポリペプチドは、架橋される。別の態様では、ナノ粒子は、その内部に１種以上の低分子薬物を封入する。別の態様では、融合タンパク質は、治療用タンパク質をさらに含む。別の態様では、組成物は、治療剤、標的送達剤、分離剤、または精製剤である。別の態様では、結合ポリペプチドは、ＥｒｂＢ２受容体結合タンパク質（ＡＮＨＰ）（配列番号７４）を含む。別の態様では、結合ポリペプチドは、細胞結合ペプチド（ＧＲＧＤＳＰＡＳ）（配列番号７６）を含む。別の態様では、結合ポリペプチドは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）結合タンパク質（ＰＫＤ２）（配列番号１１２）を含む。別の態様では、結合ポリペプチドは、アデノウイルス（ＡｄＶ）結合タンパク質（ＣＡＲ）（配列番号１１４）を含む。別の態様では、結合ポリペプチドは、レンチウイルス（ＬＶ）結合タンパク質（ＣＲ２）（配列番号１１６）または（ＣＲ３）（配列番号１１８）を含む。別の態様では、結合ポリペプチドは、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）（配列番号１２０）を含む。
本明細書に記載される別の実施形態は、本明細書に記載されるタンパク質ナノ粒子を含む治療剤である。
本明細書に記載される別の実施形態は、治療薬を細胞に標的化する方法であって、本明細書に記載されるタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、方法である。
本明細書に記載される別の実施形態は、治療薬を細胞に送達する方法であって、本明細書に記載されるタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、方法である。
本明細書に記載される別の実施形態は、治療薬を細胞に標的化するための手段であって、本明細書に記載されるタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、手段である。
本明細書に記載される別の実施形態は、治療薬を細胞に送達するための手段であって、本明細書に記載されるタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、手段である。
本明細書に記載の別の実施形態は、生体分子を同定するための方法であって、生体分子に結合する本明細書に記載のタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、方法である。
本明細書に記載される別の実施形態は、生体分子を精製する方法であって、生体分子に結合する本明細書に記載されるタンパク質ナノ粒子を使用して、培地から生体分子を単離することを含む、方法である。別の態様では、の結合ポリペプチドの相分離をトリガーして、汚染物質から生体分子を単離することをさらに含み、ここで、トリガーは、温度、塩分、光、ｐＨ、圧力、結合ポリペプチドの濃度もしくは生体分子の濃度の調節、電磁波もしくは音響波の適用、または補因子、界面活性剤、クラウディング試薬、還元剤、酸化剤、変性剤、もしくは酵素のうちの１種以上を含む１種以上の賦形剤の添加から選択される。別の態様では、遠心分離を使用して、生体分子に結合した高密度相分離タンパク質を汚染生体分子から分離することをさらに含む。別の態様では、遠心分離を使用して、生体分子に結合した相分離タンパク質を汚染生体分子から分離することをさらに含む。別の態様では、相分離液滴のサイズを使用して、汚染物質種から生体分子を単離することをさらに含み、生体分子に結合する結合ポリペプチドのサイズは、直径が少なくとも２０ｎｍおよび１００μｍ以下である。別の態様では、本方法は、フロー濾過、膜クロマトグラフィー、分析的超遠心分離、高速液体クロマトグラフィー、膜クロマトグラフィー、正常フロー濾過、音波分離、遠心分離、カウンターフロー遠心分離、および高速タンパク質液体クロマトグラフィーを使用して、生体分子－結合ポリペプチド複合体をサイズに基づいて汚染物質種から単離することを含む。
本明細書に記載される別の実施形態は、脂質、細胞、タンパク質、核酸、炭水化物またはウイルス粒子のうちの少なくとも１種を含む生体分子であり、核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり、ウイルス粒子は、アデノウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス粒子、レンチウイルス粒子、レトロウイルス粒子、ポックスウイルス粒子、麻疹ウイルス粒子、またはヘルペスウイルス粒子から選択され、タンパク質は、ヒトアルブミン、モノクローナルＩｇＧ抗体、またはＦｃ融合抗体から選択される。
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面による本特許または特許出願発行物のコピーは、申請および必要な料金の支払いを行った上で特許庁から提供される。
図１は、インビボでのナノ粒子の運命に影響を与える主要なパラメータを示す。 図２Ａ～Ｃは、バルク中のＡＢジブロックポリマーの予測される平衡形態を示す。図２Ａは、ＳおよびＳ’＝体心立方球、ＣおよびＣ’＝六方稠密円柱（ｈｅｘａｇｏｎａｌｌｙ ｐａｃｋｅｄ ｃｙｌｉｎｄｅｒ）、ＧおよびＧ’＝二連ジャイロイド（ｂｉｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｇｙｒｏｉｄ）、およびＬ＝ラメラを示す。図２Ｂは、ブロックの体積分率（ｆ）および分離パラメータχＮに応じて、自己整合平均場理論によって予測されるＡＢジブロックの理論的位相図を示し、ｗはＦｌｏｒｙ－Ｈｕｇｇｉｎｓセグメント間相互作用エネルギーであり、Ｎは重合度であり、ＣＰＳおよびＣＰＳ’＝最密充填球である。図２Ｃは、ポリイソプレン－ブロック－ポリスチレンコポリマーの実験相図を示し、ｆＡは、ポリイソプレンの体積分画を表し、ＰＬ＝有孔ラメラである。 図３は、ＲＬＰ－ＥＬＰタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。１．ＲＬＰ２０－ＥＬＰ８０（配列番号８１）、２．ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）、３．ＲＬＰ６０－ＥＬＰ８０（配列番号８５）、４．ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）、５．ＲＬＰ１００－ＥＬＰ８０（配列番号８８）、６．ＲＬＰ４０－ＥＬＰＳ８０（配列番号８９）、７．ＲＬＰ８０－ＥＬＰＳ８０（配列番号９１）、８．ＲＬＰ４０－ＥＬＰＶ８０（配列番号９２）、９．ＲＬＰ８０－ＥＬＰＶ８０（配列番号９４）、１０．ＲＬＰ２０－ＥＬＰ４０（配列番号８０）、１１．ＲＬＰ４０－ＥＬＰ４０（配列番号８３）、１２．ＲＬＰ４０－ＥＬＰ１６０（配列番号８２）、１３．ＲＬＰ８０－ＥＬＰ１６０（配列番号８６）。 図４は、ＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ８０（配列番号８４、８５、８７）ブロックコポリペプチドのクライオＴＥＭ画像を示す。コアブロックのサイズを小さくすることにより、親水性質量分画を全体的に増加させると、自己集合がワーム状から球状にシフトする。データは、１４０ｍＭ ＰＢＳ中１０μＭで収集した。スケールバー＝５００ｎｍ。 図５は、体積分画の増加におけるＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）のクライオＴＥＭ画像を示し、増加は、観察された集合状態に影響を及ぼさないように見える。データは、１４０ｍＭ ＰＢＳ中、それぞれ１０、１００および１０００μＭで収集した。スケールバー＝５００ｎｍ。 図６は、ＲＬＰＸＸ－ＥＬＰＹブロックコポリペプチド（配列番号８０～８７）のクライオＴＥＭ画像を示す。データは、１４０ｍＭ ＰＢＳ中１０μＭで収集した。スケールバー＝５００ｎｍ。 図７は、ＲＬＰＸＸ－ＥＬＰＳＹＹ（配列番号８９～９１）およびＲＬＰＸＸ－ＥＬＰＶＹＹ（配列番号９２～９４）ブロックコポリペプチドのクライオＴＥＭ画像を示す。データは、１４０ｍＭ ＰＢＳ中１０μＭで収集した。スケールバー＝５００ｎｍ。 図８は、様々なコア疎水性を有するＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドのクライオＴＥＭ画像を示す。スケールバー＝５００ｎｍ。データは、１４０ｍＭ ＰＢＳ中１ｍｇ・ｍＬ-1で収集した。 図９は、１４０ｍＭ ＰＢＳおよび蒸留Ｈ2Ｏ中の（ＧＲＧＤＳＰ［Ｙ：Ｖ］Ｓ）８０－ＥＬＰ８０（配列番号１１０）ブロックコポリペプチドのクライオＴＥＭ画像を示す。データは、１ｍｇ・ｍＬ-1および１５℃で収集した。 図１０は、２０℃の１４０ｍＭ ＰＢＳ中の様々な濃度のＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ８０（配列番号８４、８６）ブロックコポリペプチドにおけるピレンピーク（Ｉ１およびＩ３）の蛍光測定値を示す。 図１１は、コア配列が様々な量のＳｅｒおよびＧｌｕを含有するＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０ブロックコポリペプチドのクライオＴＥＭ画像である。データは、１５℃で１４０ｍＭ ＰＢＳ中１ｍｇ・ｍＬ-1で収集した。 図１２は、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）ミセルのパクリタキセル積載および分析手順の概略図である。 図１３は、分析的高速液体クロマトグラフィーによって決定される、パクリタキセル（ＰＴＸ）対ＲＬＰ－ＥＬＰの相対モル比を示す。各分子の吸収ピーク（ＰＴＸについては２３０ｎｍ、ＲＬＰ－ＥＬＰ８０については２７５ｎｍ）を使用して各分子の面積を導出した後、このピークを分子の吸光係数に正規化し、次いで互いに比較した。 図１４は、ＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９５～９７）のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。ラダーの単位は、キロダルトンである。ウェルは、ゲル中の適切なタンパク質で標識されている。全ての構築物は、ゲル充填緩衝液の存在下で、主バンドの分子量の約２倍のバンドを有し、二量体の形成を示している可能性が高い。このバンドを除き、全ての材料は９５％以上の純度である。 図１５は、ＲＬＰ－ＥＬＰ－Ｆｎ３ミセルの熱安定性を示す。球状（ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３）（配列番号９６）およびワーム状ミセル（ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３）（配列番号９７）は、室温（２０℃）と生理学的温度（３７℃）との間での安定性。データは、１４０ｍＭ ＰＢＳ中１０μＭで収集した。０．４５μｍフィルターで濾過した。 図１６は、ブロックコポリペプチドミセルの熱安定性を示す。球状（ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０）（配列番号８４）およびワーム状ミセル（ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０）（配列番号８７）は、室温（２０℃）と生理学的温度（３７℃）との間での安定性。データは、１４０ｍＭ ＰＢＳ中１０μＭで収集した。０．４５μｍフィルターで濾過した。 図１７Ａ～Ｄは、ＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドの静的および動的光散乱生データを示す。報告されたＲhについて０°に外挿したＲh対角度のプロットを、図１７Ａ：ＲＬＰ２０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９５）、図１７Ｂ：ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３－１０（配列番号９６）、および図１７Ｃ：ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７）に示す。図１７Ｄ～Ｅは、静的光散乱によって得られた部分的なＺｉｍｍプロットを示す。図１７Ｄ：ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９６）、図１７Ｅ：ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７）。 図１８Ａ～Ｄは、ＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ８０およびＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３のクライオＴＥＭ顕微鏡写真を示す。図１８Ａは、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）によって形成された球状ミセルを示す。図１８Ｂは、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）によって形成されたワーム状ミセルを示し、図１８Ｃは、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９６）によって形成された球状ミセルを示す。図１８Ｄは、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７）によって形成された球状ならびにワーム状および球状ミセルを示す。全てのスケールバーは、２００ｎｍを表す。全てのデータは、１５℃で１４０ｍＭ ＰＢＳ中１０μＭで収集した。 図１９は、ＲＬＰＸＸ－ＥＬＰＹＹ－Ｆｎ３（配列番号９５～９７）の観察されたアスペクト比のヒストグラムを示す。図１８からのデータ、特に個々の粒子の最長直線および対応する垂直測定を用いて、観察された粒子のアスペクト比を記載した。分析には、明確に個別の粒子である粒子のみを使用した（粒子の周囲の等しいコントラストは、カメラの正規の向きを示唆する）。ｎ＝５０。 図２０は、ＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９５～９７）の形状依存性アビディティを示す。多価性は、観察されたＫDを増加させるとともに、ミセルのアスペクト比を増加させる。上部に示される代表的なＳＰＲセンサーグラムは、ユニマーと、球状およびワーム状ミセルとの間のｋoffの顕著な減少を示す。対照的に、ｋonは全ての目的の構築物について同様である。ＳＰＲセンサーグラムデータは、ＰＢＳ中１０μＭで収集した。 図２１Ａ～Ｂは、装飾されていないブロックコポリペプチドの細胞内取り込みを示す。図２１Ａは、無血清最小培地中１０μＭで２．５時間のインキュベーション後、ＤＩＣ画像（灰色）に重ねた、Ａｌｅｘａ４８８フルオロフォア（緑色）で標識された、Ｆｎ３ドメインを含まないＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ８０（配列番号８１、８４、８７）ブロックコポリペプチドの細胞取り込みの代表的な画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。図２１Ｂは、共焦点顕微鏡画像からの細胞内粒子数の定量を示す。ｎ＞１００、*＝ｐ＜０．０５、**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。 図２２は、無血清最小培地中１０μＭで２．５時間のインキュベーション後、ＤＩＣ画像（灰色）に重ねた、Ａｌｅｘａ４８８フルオロフォア（緑色）で標識されたＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ（配列番号８４、８７）ブロックコポリペプチドの細胞取り込みの代表的な画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。 図２３Ａ～Ｄは、αｖβ３陰性Ｋ５６２細胞株におけるＲＬＰＸＸ－ＥＬＰＹＹ－Ｆｎ３（配列番号９５～９７）ポリペプチドの細胞取り込みを示す。Ａ～Ｄは、無血清最小培地中１０μＭで２．５時間のインキュベーション後、ＤＩＣ画像（灰色）に重ねた、Ａｌｅｘａ４８８フルオロフォア（緑色）で標識されたブロックポリペプチドの細胞取り込みの代表的な画像である。Ａ．ＬＭ６０９抗体；Ｂ．ＲＬＰ２０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９５）、Ｃ．ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９６）、Ｄ．ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７）。スケールバー＝２０μｍ。 図２４は、ナイーブ細胞、ＬＭ６０９抗体、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９６）－球状ミセル、およびＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７）－ワーム状ミセルのフローサイトメトリーデータを示す。 図２５は、フローサイトメトリーによる細胞取り込みの定量化を示す。***＝ｐ＜０．００１。ボックスは、２５番目および７５番目のパーセンタイルを示し、バーは１０番目および９０番目のパーセンタイルを示す。 図２６Ａ～Ｄは、αｖβ３トランスフェクト細胞株における可変アスペクト比を有するＲＬＰＸＸ－ＥＬＰＹＹ－Ｆｎ３（配列番号９６～９９）ポリペプチドの細胞取り込みを示す。Ａ～Ｄは、無血清最小培地中１０μＭで１．５時間のインキュベーション後、ＤＩＣ画像（灰色）に重ねた、Ａｌｅｘａ４８８フルオロフォア（緑色）で標識されたブロックポリペプチドの細胞取り込みの代表的な画像である。Ａ．ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７；Ｂ．ＲＬＰ８０－ＥＬＰ１６０－Ｆｎ３（配列番号９８）、Ｃ．ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９６）Ｄ．ＲＬＰ４０－ＥＬＰ４０－Ｆｎ３（配列番号９９）。細長い形態を有する粒子（Ａ、Ｄ）に対して、球状形態を有する全ての構築物（Ｂ、Ｃ）の取り込みのレベルは、はるかに低い。スケールバー＝２０μｍ。 図２７Ａ～Ｂは、「形状制御」ＲＬＰＸＸ－ＥＬＰＹＹ－Ｆｎ３のクライオＴＥＭ特徴付けを示す。Ａ．ＲＬＰ８０－ＥＬＰ１６０－Ｆｎ３（配列番号９８）によって形成された球状ミセル、Ｂ．ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３によって形成された球状およびワーム状ミセル。全てのデータは、１５℃で１４０ｍＭ ＰＢＳ中１０μＭで収集した。 図２８は、経時的なブロックコポリペプチドの細胞取り込みを示す。抗体（ＬＭ６０９）、ＲＬＰ２０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９５）、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９９）、およびＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７）取り込みの時間の関数としての代表的な共焦点画像。スケールバー＝２０μｍ。 図２９Ａ～Ｂは、画像解析による細胞取り込みの定量を示す。図２９Ａは、経時的な細胞内粒子の数の定量化を示す。図２９Ｂは、経時的な細胞内粒子の面積の定量化を示す。*＝ｐ＜０．０５、**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。エラーバーは標準偏差を表す。 図３０Ａ～Ｄ。Ａ．［Ｓ］－４０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１００）クライオＴＥＭ画像。スケールバー５００ｎｍ。Ｂ．［Ｓ］－８０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１０１）クライオＴＥＭ画像。スケールバー５００ｎｍ。Ｃ．［Ｓ］－４０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１００）クライオＴＥＭ画像。スケールバー２００ｎｍ。Ｄ．［Ｓ］－８０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１０１）クライオＴＥＭ画像。スケールバー２００ｎｍ。全ての構築物を、１４０ｍＭ ＰＢＳ中２ｍｇ・ｍＬ-1、１００％湿度、３７℃でガラス化した。 図３１Ａ～Ｂ。図３１Ａは、紫外可視分光光度測定によって決定される、［Ｓ］－４０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１００）および［Ｓ］－８０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１０１）ブロックコポリペプチドのＵＣＳＴ相挙動を示す。図３１Ｂは、温度依存性ＤＬＳを介して観察されるＲＬＰ－ＲＬＰブロックコポリペプチドのＵＣＳＴ挙動に対するｐＨの影響を示す。データを１４０ｍＭ ＰＢＳ中２ｍｇ・ｍＬ-1で得ると、両方のブロックコポリペプチドのＵＣＳＴは非常に類似しており、したがって、同様のｐＨ誘発ＵＣＳＴ偏向が観察される。 図３２Ａは、ピレン蛍光のＩ１／Ｉ３のシフトによる、それぞれ３μＭおよび０．４μＭと決定された［Ｓ］－４０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１００）および［Ｓ］－８０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１０１）の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を示す。データを３つに分割するためのシグモイド適合を示す。ＣＭＣは、シグモイド適合の屈曲点によって決定される。図３２Ｂは、［Ｓ］－４０－［ＱＨＮ］－４０および（配列番号１００）［Ｓ］－８０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１０１）の完全な熱特性評価を示し、コアブロックを増加させることにより、分解ＵＣＳＴ相の挙動がシフトすることを示す。 図３３Ａ～Ｂは、［Ｓ］－４０－［Ｖ］－４０（配列番号１０５）および［Ｓ］－４０－［Ｙ：３Ｖ］－４０（配列番号１０４）ブロックコポリペプチドの紫外可視分光光度測定および動的光散乱を示す。 図３４は、［Ｓ］－４０－［Ｖ］－２０（配列番号１０５）、［Ｓ］－４０－［Ｖ］－４０（配列番号１０６）、［Ｓ］－４０－［Ｖ］－６０（配列番号１０７）のクライオＴＥＭ画像を示す。データは、１４０ｍＭ ＰＢＳ中、１５℃で収集した。スケールバー＝５００ｎｍ。 図３５は、［Ｓ］－４０－［Ａ］－４０（配列番号１０８）、［Ｓ］－４０－［Ｖ］－４０（配列番号１０６）、［Ｓ］－４０－［Ｉ］－４０（配列番号１０９）のクライオＴＥＭ画像を示す。データは、１５℃で１４０ｍＭ ＰＢＳ中で収集した。スケールバー＝５００ｎｍ。 図３６は、本検討で調査した２つのｐＡｚＦ含有球状形成ジブロック構築物の安定性比較を示す。構築物を、ｐＡｚＦ非含有ＤＢ－４０ジブロックと異なる比率で混合し、７μＭで架橋し、その流体力学的半径を、７．２Ｍ ＧｕＨＣｌ中７００ｎＭで、ＤＬＳを使用して記録した。なお、両方のｐＡｚＦ構築物が、ｐＡｚＦ対ポリペプチド比率が１を下回ると、安定した架橋粒子を生成することができなかった。 図３７Ａ～Ｃは、ｐＡｚＦ含有構築物ＵＡＡ５－４０およびＵＡＡ４－８０のクライオＴＥＭ分析を示す。図３７Ａは、ＵＡＡ５－４０構築物について成功した架橋が実証したＧｕＨＣｌ中の可視粒子の存在を示す。スケールバーは、１００ｎｍを表す。図３７Ｂは、ＵＡＡ５－４０粒子のコア半径の画像分析を示し、コア半径はＧｕＨＣｌ曝露後に有意な腫脹を示した。崩壊したＲＬＰコアのみがＴＥＭに十分な高い電子密度を有するため、粒子は小さく見える。１００個の粒子を条件ごとに測定した。図３７Ｃは、ＧｕＨＣｌの存在下でも、それらの形態を保持した架橋後に、ＵＡＡ４－８０構築物が高度に細長い可撓性のワームとして存在したことを示す。スケールバーは、３００ｎｍを表す。 図３８Ａ～Ｂは、ＤＬＳを使用した球体形成構築物およびワーム形成構築物の両方のＣＡＣ決定を示す。架橋された試料が、ＤＬＳ装置の検出の推定限界である低ナノモル範囲まで安定したナノ粒子の測定値を示したのに対し、他の試料は全て、その閾値を超えて分解するように見えた。全体的に、ワーム形成構築物（図３８Ｂ）は、それらの球状類似体（図３８Ａ）よりも低いＣＡＣを有し、ｐＡｚＦを含有する構築物も、類似のｐＡｚＦ非含有ポリペプチドと比較して同様であった。なお、全ての試料はＰＢＳ中で調製し、エラーバーは、２０回の測定にわたる標準偏差に相当する。 図３９Ａ～Ｂは、本研究の全てのＵＡＡ５－４０－Ｋ８Ｄ４－リガンド構築物の発現および精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（図３９Ａ）およびタンパク質収率（図３９Ｂ）を示す。ＴＲＡＩＬ試料（ピンク）を除き、全てのレーンに標的質量のバンドが表示されることに留意されたい。また、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに二量体に対応する微かなバンドが見られるため、ＡＨＮＰおよびＴＲＡＩＬペプチドリガンドの両方がシステイン残基を含有することにも留意されたい。 図４０Ａ～Ｂは、ポリビア－ＭＰＩ、Ｔｎ３およびＴＲＡＩＬペプチドリガンドの細胞傷害性を試験する細胞生存率アッセイを示す。全てのリガンドを架橋ＵＡＡ５－４０ナノ粒子に対して試験し、Ｃｏｌｏ２０５（リガンドはＴｎ３またはＴＲＡＩＬペプチドのいずれかである）およびＫ５６２細胞（リガンドはポリビア－ＭＰＩである）とそれぞれ２４時間にわたって共インキュベートした。 図４１は、７μＭの濃度の架橋ＵＡＡ５－４０－Ｋ８Ｄ４－リガンドナノ粒子を使用した、乳がん細胞株ＳＫ－ＢＲ－３の細胞取り込み研究の共焦点画像を示す。Ｆｎ３足場以外の全てのリガンドは、非機能化対照と比較して、細胞取り込みの有意な増加を示した。理論的には、ＳＫ－ＢＲ－３細胞上のＥｒｂＢ２受容体を標的とするため、ＡＨＮＰリガンドに対してのみこの効果が生じると予想された。プレート上の細胞接着により、明視野コントラストは非常に悪いが、各画像に２０個前後の細胞があることに注意されたい。スケールバーは３０μｍを表す。 図４２Ａ～Ｂは、ＡＦ４８８タグ付き架橋ＵＡＡ５－４０－Ｋ８Ｄ４－リガンドナノ粒子との共インキュベーション後の、天然およびαｖβ３トランスフェクトＫ５６２細胞の共焦点画像を示す。スケールバーは２０μｍを表す。図４２Ａは、球を形成するＥＬＰ／ＲＬＰジブロック構築物のＣＡＣを上回る細胞取り込み試験を示す。天然細胞株とαｖβ３トランスフェクト細胞株との比較は、Ｆｎ３およびＧＲＧＤＳＰＡＳリガンドについて観察される取り込みの増加が、細胞膜上のインテグリン提示によって引き起こされたことを示す。なお、細胞取り込みは、以前に報告されたこの細胞株３０のインテグリン発現レベルの変動に起因する集団に対して均質ではなかった。一方、ポリビア－ＭＰＩは、両方の細胞株で増加した取り込みを示したが、天然バリアントではより増加した。図４２Ｂは、ＥＬＰ／ＲＬＰキャリアのＣＡＣ未満の濃度での類似の実験を示し、ポリビア－ＭＰＩ構築物以外のＦｎ３－およびＧＲＧＤＳＰＡＳ－構築物の両方が、非機能化対照と比較して依然として増加した細胞取り込みを有することを示した。なお、全体的に取り込みレベルが低下したため、図４２Ａと比較して、これらの画像の輝度を調整した。 図４３Ａ～Ｆは、ＤＬＳ（図４３Ａ）およびＴＥＭ（図４３Ｂ～Ｅ）を使用した３つの異なるＵＡＡ４－８０－Ｋ８Ｄ４－リガンド構築物の特徴付けを示す。ＵＡＡ４－８０構築物の機能化は、架橋後の粒子形態に実質的な影響を及ぼした。非機能化ＵＡＡ４－８０構築物についても球状構造が観察されたが（図４３Ｅ）、それらは少量の副産物にすぎなかった。しかしながら、機能化構築物は、この種の構造のみを形成した。図４２Ｆは、画像Ｊを介して測定したときのクライオＴＥＭコア半径を示す。なお、全ての試料を７μＭで架橋した。全てのスケールバーは、２００ｎｍを表す。 図４４Ａ～Ｆは、Ｋ８Ｄ４－リンカーの除去後の機能化ＵＡＡ４－８０構築物の特徴付けを示す。ＤＬＳ（図４４Ａ）およびクライオＴＥＭ（図４４Ｂ～Ｅ）の両方が、架橋後に得られるナノ粒子が、細長いワームではなく、依然として球状形態を有することを示した。ＵＡＡ４－８０－Ｋ８Ｄ４構築物の特徴付け（図４４Ａ、Ｅ、Ｆ）は、それにもかかわらず、リンカー単独の結合も球状形態をもたらすことを示した。なお、全ての試料を７μＭで架橋した。全てのスケールバーは、２００ｎｍを表す。 図４５Ａ～Ｂは、Ｋ８Ｄ４リンカー有りまたは無しの架橋構築物ＵＡＡ５（図４５Ａ）およびＵＡＡ４（図４５Ｂ）の効力を比較する細胞生存率プロットを示す。リンカー導入時の効力の強力な増加に加えて、プロットはまた、Ｋ８Ｄ４含有構築物のうち、より小さいＵＡＡ５－４０基礎を有するものの方が、有意に効力が強かったことを示した。 図４６Ａは、天然状態および架橋状態における類似の構築物の直接比較を示し、架橋が、それぞれのナノ製剤の効力を数桁増加させたことを明確に示した。図４６Ｂは、ｐＡｚＦ非含有ジブロックおよびｐＡｚＦ含有ジブロックの両方についてのＣＡＣデータとの細胞生存曲線の比較を示し、決定されたＥＣ５０値が、ｐＡｚＦ非含有ＤＢ－４０／８０構築物のＣＡＣとほぼ完全に一致したことを示す。したがって、ＣＡＣ未満の粒子分解は、緩く自己集合したナノ粒子の、効力の観点での制限因子であると思われる。 図４７は、異なる程度のＴｎ３機能化を有する架橋ＵＡＡ５－４０ナノ粒子の細胞傷害性の比較を示す。ナノ粒子は、効力の大幅な低下なしに、少なくとも５０％まで部分的な機能化に耐えることができた。 図４８Ａは、抗αｖβ３抗体のＰＢＳまたは３５０ｎＭのいずれかとの９０分間の共インキュベーション後の、本試験で使用した２つのＫ５６２細胞株のフローサイトメトリーデータを示す。なお、トランスフェクト細胞株は、蛍光が著しく増加した二次小集団を観察する。この小集団は、分析した全ての細胞の１２．６％を占める。図４８Ｂ～Ｃ。Ａにおける観察に基づいて、ボックスプロット図において２つの細胞株をより明確に分化させることができる全細胞集団の最も強力に蛍光性の１０％にのみ焦点を当てることにした。「全範囲」図（図４８Ｂ）では、ボックスは、２５番目および７５番目のパーセンタイルを表し、バーは１０番目および９０番目のパーセンタイルを表す。「上位１０パーセント」図（図４８Ｃ）では、ボックスは、９３番目／９７番目のパーセンタイルを、バーは９１番目／９９番目のパーセンタイルを表す。 図４９Ａ～Ｂは、ＵＡＡ５（図４９Ａ）およびＵＡＡ４（図４９Ｂ）の本研究の２つの異なるＫ５６２細胞株を比較する細胞取り込み実験のフローサイトメトリーデータを示す。全ての細胞を、架橋ＡＦ４８８タグ付きナノ粒子と９０分間共インキュベートした。Ｆｎ３およびＧＲＧＤＳＰＡＳリガンドを担持する粒子のみが、αｖβ３提示細胞株に対する選択的取り込みを示した。ボックスプロットダイアグラムのボックスは、９３番目および９７番目のパーセンタイルを表し、バーは９１番目および９９番目のパーセンタイルを表す。 図５０Ａ～Ｂは、αｖβ３トランスフェクトＫ５６２細胞での多価実験についてのフローサイトメトリーデータを示す。両方のジブロックアーキテクチャについて、架橋は、サブＣＡＣレジームにおいて、Ｆｎ３およびＧＲＧＤＳＰＡＳ装飾ナノ粒子の細胞取り込みを著しく増加させた。なお、ＵＡＡ４－８０構築物の選択濃度は、そのＣＡＣ（約３０～５０ｎＭ）とアッセイの検出限界（約１０ｎＭ）との間の妥協であった。したがって、架橋時の改善は、ＵＡＡ５－４０（Ａ）ジブロックと同様に、ＵＡＡ４－８０（Ｂ）構築物にとってはそれほど重大ではなかった。ボックスプロットダイアグラムのボックスは、９３番目および９７番目のパーセンタイルを表し、バーは９１番目および９９番目のパーセンタイルを表す。 図５１Ａ～Ｃは、ＵＡＡ５－４０ジブロック構築物のαｖβ３インテグリン結合のＳＰＲ分析を示す。図５１Ａ。架橋状態において、Ｆｎ３－およびＧＲＧＤＳＰＡＳ機能化粒子は、αｖβ３インテグリンに対する非常に高い結合親和性を示した。比較として、Ｄｚｕｒｉｃｋｙらの天然Ｆｎ３構築物は、７９ｎＭ３０の報告されたＫDを有した。図５１Ｂ。天然状態では、ＧＲＧＤＳＰＡＳ構築物は、ＣＡＣ未満の濃度で結合を示さなかった。一方、それらの天然Ｆｎ３類似体については、架橋されたナノ粒子よりも低いレベルで結合が観察された。図５１Ｃ。ＣＡＣを上回る濃度で、天然および架橋構築物は、αｖβ３インテグリンと同等の結合親和性を示した。なお、垂直の点線は緩衝液を交換した点を表す。 図５２Ａ～Ｃは、インテグリン標的化ＵＡＡ４－８０構築物のＳＰＲ特徴付けを示す。図５２Ａ。ＧＲＧＤＳＰＡＳ機能化構築物は、１５０ｎＭ未満の希釈時にＳＰＲシグナルが急速に低下するため、αｖβ３インテグリンへの結合のための急激なカットオフを有しているように思われた。図５２Ｂ。Ｆｎ３機能化構築物について、ＳＰＲデータは、６８ｎＭで良好な結合を示したが、その値を上回る濃度および下回る濃度ではいずれも結合を示さなかったため、さらに混乱している。図５２Ｃ。したがって、計算することができる唯一のＫD値は、約１７０ｎＭの狭い濃度範囲の架橋ＧＲＧＤＳＰＡＳ構築物についてのものであった。なお、垂直の点線は緩衝液を交換した点を示す。 図５３Ａ～Ｂは、ＤＲ５標的化ＵＡＡ５－４０構築物のＳＰＲ特徴付けを示す。図５３Ａおよび図５３ＢにおけるＳＰＲデータの比較は、Ｔｎ３－リガンドの結合親和性が、図５２のインテグリン標的化構築物と比較して、多価提示からわずかしか利益を得られないようであることを示した。次いで、このことは、Ｔｎ３作用に対する多価性の要件が、主として、受容体の結合後の下流効果に由来し、ＤＲ５結合自体に由来するものではないことを示した。なお、垂直の点線はＳＰＲ実験中に緩衝液を交換した点を示す。 図５４は、細胞培養回収物からの抗体治療薬の捕捉および放出のＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像を示す。ジブロック物質は、一本鎖ＥＬＰユニマーよりも純粋なｍＡｂ生成物を溶出する。溶出された最終生成物の比較は、ウェル２－１１、４－１３、および６－１５の間である。 図５５は、次いでナノ粒子構造に架橋され得る非天然アミノ酸を含有するタンパク質を産生する純度データの例である。本方法は、様々なリガンドサイズおよびアーキテクチャに適用可能であり、本明細書に記載の単純な精製スキームを用いて高純度で製造することができる。 図５６は、ナノ粒子のコロナでの様々なタンパク質ドメインを有する架橋ポリペプチド足場の細胞取り込みを示す。タンパク質は、視覚化のために緑色蛍光分子で標識されている。細胞表面にαｖβ３受容体を含む操作細胞株において、受容体に対して特異性を有するＦｎ３およびＧＲＧＤＳＰＡＳリガンドは、試験した両方の濃度（７０ｎＭおよび７μＭ）で内在化することができる。ポリビア－ＭＰＩは、リガンドの異なる動態により、より高い濃度でのみ内在化される。これは、多価の急速な細胞内在化が達成可能であることを示している。 図５７は、プロテインＡ（ＺＤ）のセグメントに融合された結合ポリペプチドによるｍＡｂのインキュベーションを示す。塩を使用して、結合ポリペプチド－ｍＡｂ複合体の相分離をトリガーし、遠心分離により分離する。この溶液は、沈殿物中にｍＡｂ結合ポリペプチド複合体を含有するタンパク質リッチペレットおよび捕捉上清（ＳＮ）の２つの相を形成する。ペレットは、ｍＡｂを結合ポリペプチドから解離する溶出緩衝液中に再懸濁される。溶液を再び遠心分離し、結合ポリペプチドを沈殿させて、溶出ＳＮ中に懸濁したままのｍＡｂから分離する。この実験では、数種のｍＡｂタンパク質（ｍＡｂ１、２、３）を結合させ、溶出させた。
特に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を表す。矛盾する場合には、定義を含めた本明細書が優先する。好ましい方法および材料を下記に記載しているが、本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参考として組み込まれる。本明細書で開示される材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、およびそれらの変形は、本明細書で使用される場合、追加の行為または構造の可能性を排除しない、オープンエンドの移行句、用語、または単語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が明確に指示していない限り、複数形の言及を含む。本開示はまた、明示的に記載されるか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、それ「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、およびそれ「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
本明細書の数値範囲の特定について、その間の各中間の数値が、同程度の精度で明示的に企図されている。例えば、６～９の範囲については、数字７および８が、６および９に加えて企図されており、６．０～７．０の範囲については、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に企図されている。
本明細書で使用される用語「約」は、１つ以上の目的の値に適用されているとき、記載されている参照値に類似する値を指す。ある特定の態様では、用語「約」は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、記載された基準値のいずれかの方向において（それより大きいまたは小さい）、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に該当する値の範囲（そのような数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）を指す。
「親和性」とは、その標的（すなわち、結合パートナー）に対する結合ポリペプチドの結合強度を指す。
「アゴニスト」とは、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的応答を生ずる実体を指す。「アンタゴニスト」は、アゴニストの作用またはシグナル伝達を遮断または阻害する。「逆アゴニスト」は、アゴニストとは反対の作用を引き起こす。アゴニスト、アンタゴニスト、および逆アゴニストの活性は、インビトロ、インサイチュ、インビボ、またはそれらの組合せで決定され得る。
本明細書で使用される「アミノ酸」とは、天然および非天然の合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は遺伝子コードによってコードされるものである。アミノ酸は、本明細書では、それらの一般的に知られている３文字の記号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字の記号のいずれかによって参照され得る。アミノ酸には、側鎖およびポリペプチド骨格部分が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「バイオマーカー」は、疾患または状態の同定および／または分類に有用な、様々な濃度で対象に存在する天然に存在する生体分子を指す。バイオマーカーは、遺伝子、タンパク質、ポリヌクレオチド、核酸、リボ核酸、ポリペプチド、または疾患の指標もしくはマーカーとして使用される他の生物学的分子を含むことができる。一部の実施形態では、バイオマーカーは、疾患マーカーを含む。例えば、バイオマーカーは、疾患を有する対象において上方調節または下方調節される遺伝子であり得る。別の例として、バイオマーカーは、疾患または疾患を発症するリスクを有する対象において、レベルが増加または低下するポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、バイオマーカーは、低分子を含む。一部の実施形態では、バイオマーカーは、ポリペプチドを含む。
用語「対照」、「参照レベル」、および「参照」は、本明細書において互換的に使用される。参照レベルは、測定結果を評価するためのベンチマークとして用いられる所定の値または範囲であってもよい。「対照群」は、本明細書で使用される場合、対照対象の群を指す。所定レベルは、対照群からのカットオフ値であり得る。所定レベルは、対照群からの平均であってもよい。カットオフ値（または所定のカットオフ値）は、適応指標モデル（ＡＩＭ）方法論によって決定され得る。カットオフ値（または所定のカットオフ値）は、患者群の生体試料からのレシーバ動作曲線（ＲＯＣ）分析によって決定され得る。ＲＯＣ分析は、生物学的分野で一般的に知られているように、１つの状態を別の状態と区別する、例えば、ＣＲＣを有する患者の同定における各マーカーの性能を決定する、試験能力の判定である。ＲＯＣ分析の説明は、参照によりその開示の全体が本明細書に組み込まれるＰ．Ｊ．Ｈｅａｇｅｒｔｙら（Biometrics 2000, 56, 337-44）に示されている。あるいは、カットオフ値は、患者群の生体試料の四分位分析によって決定され得る。例えば、カットオフ値は、２５番目～７５番目のパーセンタイルの範囲の任意の値に対応する値、好ましくは２５番目のパーセンタイル、５０番目のパーセンタイルまたは７５番目のパーセンタイルに対応する値、より好ましくは７５番目のパーセンタイルに対応する値を選択することによって決定され得る。このような統計分析は、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して実施され得、任意の数の市販のソフトウェアパッケージを通じて実装され得る（例えば、Analyse-it Software Ltd., Leeds, UK; StataCorp LP, College Station, TX;SAS Institute Inc., Cary, NCから）。標的またはタンパク質活性の健常または正常なレベルまたは範囲は、標準的な慣行に従って定義され得る。
用語「発現ベクター」は、所望のタンパク質をコードするための核酸配列が挿入または導入され得る、当該技術分野で公知のプラスミド、ウイルス、または他の媒体を示す。
用語「宿主細胞」は、核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入、コンジュゲーション等の影響を受けやすい細胞である。宿主細胞は、植物、細菌、酵母、真菌、昆虫、動物等に由来し得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）を含む。
本明細書で使用される場合、「ポリマー」は、ホモポリマー、ヘテロポリマー、ブロックポリマー、コポリマー、ｔｅｒポリマー等、およびそれらのブレンド、組合せ、および混合物を包含することが意図される。ポリマーとしては、例えば、５－ビニルテトラゾールモノマー単位を含み、かつ２．０未満の分子量分布を有するポリマー等の機能化ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマーは、スターブロックコポリマー、直鎖状ポリマー、分岐状ポリマー、多分岐ポリマー、樹状ポリマー、櫛状ポリマー、グラフトポリマー、ブラシポリマー、ボトルブラシコポリマー、および架橋構造、例えば、５－ビニルテトラゾールモノマー単位のブロックを含むブロックコポリマーのうちの１種以上であってもよく、またはそれらを含んでもよい。ポリマーとしては、限定されないが、ポリエステル、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリレート、ポリエーテル、ポリスチレン、ポリノルボルネン、および不飽和結合を有するモノマーが挙げられる。例えば、両親媒性櫛状ポリマーは、Ｍａｙｅｓらの米国特許出願公開第２００７／００８７１１４号および米国特許第６，２０７，７４９号に記載されており、これらの各々の開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。両親媒性櫛型ポリマーは、疎水性の水不溶性ポリマーから形成される骨格および短い親水性非細胞結合ポリマーから形成される側鎖を含有するコポリマーの形態で存在してもよい。他のポリマーとしては、例えば、ポリエチレンおよびポリプロピレン等のポリアルキレン；ポリクロロプレン；ポリビニルエーテル；ポリ酢酸ビニル等のポリビニルエーテル；ポリ塩化ビニル等のポリハロゲン化ビニル；ポリシロキサン；ポリスチレン；ポリウレタン；ポリ（メチル（メタ）アクリレート）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ｎ－ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ｔｅｒｔ－ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、およびポリ（オクタデシルアクリレート）等のポリアクリレート類；ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（エチルアクリルアミド）、ポリ（エチルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ｎ、イソ、およびｔｅｒｔ－ブチルアクリルアミド）等のポリアクリルアミド；ならびにこれらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。これらのポリマーには、置換；化学基、例えばアルキル基、アルキレン基の付加；ヒドロキシル化；酸化；および当業者によって日常的に行われる他の修飾を有するポリマーを含む有用な誘導体が含まれてもよい。ポリマーは、例えば、ポリホスホリコリン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｃｈｏｌｉｎｅ）、ポリカルボキシベタイン、およびポリスルホベタインなどの両性イオン性ポリマーを含んでもよい。ポリマーは、ベタイン、カルボキシベタイン、スルホベタイン、オリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）、サルコシン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の側鎖を有してもよい。例えば、ポリ（オリゴエチレングリコールメタクリレート）（ポリ（ＯＥＧＭＡ））を用いてもよい。ポリ（ＯＥＧＭＡ）は、ＯＥＧ側鎖に起因して、親水性、水溶性、非汚染性、無毒性、および非免疫原性であってもよい。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、一本鎖もしくは二本鎖であってよく、または二本鎖および一本鎖の両方の配列の部分を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、核酸、天然または合成のＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよい。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組合せを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、化学合成法または組換え法によって、得ることができる。
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸の連結配列である。ポリペプチドは、天然、合成、または天然および合成の修飾もしくは組合せのものであってもよい。ペプチドおよびポリペプチドは、結合タンパク質、受容体、および抗体等のタンパク質を含む。「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に順序付けられた三次元構造を指す。これらの構造は、ドメイン、例えば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細孔ドメイン、および細胞質尾部ドメインとして一般的に知られている。ドメインは、ポリペプチドのコンパクトユニットを形成するポリペプチドの部分であり、典型的には、１５～３５０アミノ酸長である。例示的なドメインとしては、酵素活性またはリガンド結合活性を有するドメインが挙げられる。典型的なドメインは、βシートおよびαヘリックスのストレッチなどの小さな組織のセクションで構成されている。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」とは、独立した三次元単位の非共有結合によって形成される三次元構造をいう。
「レポーター」、「レポーター基」、「標識」、および「検出可能な標識」は、本明細書において互換的に使用される。レポーターは、検出可能なシグナルを生成することができる。標識は、視覚的手段または機器的手段によって検出可能なシグナルを生成することができる。シグナル伝達の物理的性質（例えば、蛍光、電気化学、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、および電子常磁性共鳴（ＥＰＲ））、ならびにレポーター基の化学的性質が異なる様々なレポーター基を使用することができる。様々なレポーターとしては、シグナル生成物質、例えば、クロマゲン、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合物などが挙げられる。一部の実施形態では、レポーターは、放射性標識を含む。レポーターは、光を生成する部分、例えば、アクリジニウム化合物、および蛍光を生成する部分、例えば、フルオレセインを含み得る。一部の実施形態では、レポーターからのシグナルは、蛍光シグナルである。レポーターは、フルオロフォアを含み得る。フルオロフォアの例としては、アクリロダン（６－アクリロイル（ａｃｒｙｌｏｙ）１－２－ジメチルアミノナフタレン）、バダン（６－ブロモ－アセチル－２－ジメチルアミノ－ナフタレン）、ローダミン、ナフタレン、ダンジルアジリジン、４－［Ｎ－［（２－ヨードアセトキシ）エチル］－Ｎ－メチルアミノ］－７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、４－［Ｎ－［（２－ヨードアセトキシ）エチル］－Ｎ－メチルアミノ－７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）、フルオレセイン、ジピロメテンボロンジフルオリド（ＢＯＤＩＰＹ）、４－ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール（ＮＢＤ）、Ａｌｅｘａ蛍光色素、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。フルオレセイン誘導体としては、例えば、５－フルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン、３’６－カルボキシフルオレセイン、５（６）－カルボキシフルオレセイン、６－ヘキサクロロフルオレセイン、６－テトラクロロフルオレセイン、フルオレセイン、およびイソチオシアネートが挙げられ得る。
本明細書で使用される場合、「試料」または「試験試料」は、標的の存在および／またはレベルが検出または決定される任意の試料を意味することができる。試料としては、液体、溶液、エマルション、または懸濁液を挙げることができる。試料は、医学的試料を含んでもよい。試料は、血液、全血、血漿および血清等の血液分画、筋肉、間質液、汗、唾液、尿、涙、滑液、骨髄、脳脊髄液、鼻分泌物、痰、羊水、気管支肺胞洗浄液、胃洗浄液、嘔吐物、糞便、肺組織、末梢血単核球、全白血球、リンパ節細胞、脾臓細胞、扁桃細胞、がん細胞、腫瘍細胞、胆汁、消化液、皮膚、またはそれらの組合せ等の任意の生体液または組織を含んでもよい。一部の実施形態では、試料は、アリコートを含む。他の実施形態では、試料は、生物学的流体を含む。試料は、当該分野で公知の任意の手段によって取得することができる。試料は、患者から得られたものとして直接使用されてもよく、または、例えば、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉成分の不活性化、試薬の添加等により、本明細書で論じられているかまたは当該技術分野で公知である何らかの方法で試料の性質を改変するために予め処理されてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「感度」は、真陽性の数を真陽性の数＋偽陰性の数で割った数を指し、感度（「ｓｅｎｓ」）は、０＜ｓｅｎｓ＜１の範囲内であり得る。理想的には、本明細書における方法の実施形態は、ゼロに等しいかまたはゼロに近い偽陰性の数を有するため、対象が実際に疾患を有するときに疾患を有しないと誤って識別されない。逆に、予測アルゴリズムが陰性を正しく分類する能力についての、感度に対する補完的な測定である評価がしばしば行われる。
本明細書で使用される場合、用語「特異性」は、真陰性の数を真陰性の数＋偽陽性の数で割った数を指し、特異性（「ｓｐｅｃ」）は、０＜ｓｐｅｃ＜１の範囲内であり得る。理想的には、本明細書に記載される方法は、ゼロに等しいかまたはゼロに近い偽陽性の数を有し、その結果、対象が実際に疾患を有しないときに疾患を有すると誤って識別されない。したがって、感度および特異度の両方が、１、または１００％に等しい方法が好ましい。
「特異的に結合する」とは、一般に、ポリペプチドへの標的への結合が、ランダムで無関係な標的に結合するよりも、その標的により容易に結合する場合を意味する。
本明細書で使用される場合、「対象」とは、１種以上の融合タンパク質を含む本明細書に記載のナノ粒子を望んでいるかまたはそれを必要とする哺乳動物を意味し得る。対象は、ヒトであってもよく、非ヒト動物であってもよい。対象は、哺乳動物であってもよい。哺乳動物は、霊長類であってもよく、非霊長類であってもよい。哺乳動物は、ヒト等の霊長類、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット等の非霊長類、または例えば、サル、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、ギボン等の非ヒト霊長類であってもよい。対象は、任意の年齢または発達段階であってもよく、例えば、成人、青少年、または乳児であってもよい。
「転移」または「相転移」とは、熱応答性ポリペプチドの凝集を指す。相転移は、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）または逆転移温度Ｔ＾と呼ばれる特定の温度で急激かつ可逆的に生じる。転移温度未満では、熱応答性ポリペプチド（または熱応答性ポリペプチドを含むポリペプチド）は非常に可溶性である。転移温度を超えて加熱すると、熱応答性ポリペプチドは疎水的に崩壊して凝集し、別個のゲル状相を形成する。「逆転移サイクリング」とは、熱応答性ポリペプチド（または熱応答性ポリペプチドを含むポリペプチド）のためのタンパク質精製方法を指す。タンパク質精製方法は、熱応答性ポリペプチドの可逆相転移挙動を使用して、溶液を可溶性および不溶性相を通して循環させ、それによって汚染物質を除去することを含み得る。
「処置」または「処置すること」は、疾患からの対象の保護を指す場合、疾患を予防、抑制、抑圧、改善、または排除することを意味する。疾患を予防することは、疾患の発症前に、対象に本発明の組成物を投与することを伴う。疾患を抑制することは、疾患の誘発後、臨床的に発現する前に、対象に本発明の組成物を投与することを伴う。疾患を抑圧または改善することは、疾患の臨床的発現後に、対象に本発明の組成物を投与することを伴う。
「実質的に同一」とは、第１および第２のアミノ酸配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００またはそれを超える数のアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であることを意味し得る。
本明細書で使用される場合、「価数」とは、潜在的な結合単位または結合部位を指す。用語「多価」は、複数の潜在的結合単位を指す。用語「多量体」および「多価」は、本明細書において互換的に使用される。
ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用される「バリアント」とは、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の一部または断片、（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列またはその一部の相補体、（ｉｉｉ）参照されるポリヌクレオチドまたはその相補体と実質的に同一であるポリヌクレオチド、または（ｉｖ）参照されるポリヌクレオチド、その相補体、またはそれと実質的に同一である配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを意味する。
「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドとしてさらに定義することができる。「生物活性」の代表的な例としては、特定の抗体もしくはポリペプチドによって結合される能力、または免疫応答を促進する能力が挙げられる。バリアントは、実質的に同一の配列を意味し得る。バリアントは、その機能断片を意味し得る。バリアントはまた、ポリペプチドの複数のコピーを意味し得る。複数のコピーは、タンデムであってもよく、またはリンカーによって分離されていてもよい。バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味することができる。アミノ酸の保存的置換、つまりアミノ酸を同様の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸に置き換えることは、典型的に、軽微な変化を伴うものとして認識されている。これらの軽微な変化は、部分的に、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することによって同定することができる。Kyte et al., J. Mol. Biol. 1982, 757, 105-132参照。アミノ酸のヒドロパシー指数は、その疎水性および電荷の考慮に基づく。類似のヒドロパシー指数のアミノ酸は、置換されて依然としてタンパク質機能を保持できることが知られている。一態様では、±２のヒドロパシー指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の疎水性も、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにするために使用することができる。ポリペプチドの文脈でアミノ酸の親水性を考慮することは、そのポリペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。最大局所平均親水性は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号で考察されているように、抗原性および免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該技術分野で理解されているように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性指数および親水性値の両方が、アミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能に適合するアミノ酸置換は、アミノ酸、特にアミノ酸側鎖の、疎水性、親水性、電荷、大きさおよび他の特性によって明らかにされる相対的類似性に依存すると理解される。
バリアントは、完全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一であるポリヌクレオチド配列であり得る。ポリヌクレオチド配列は、遺伝子配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。バリアントは、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
近年、ポリマー合成技術の進歩により、ナノ材料の特定の生物物理的特性を調査する能力が多くの研究で注目されている。ナノ粒子の設計のほぼ全ての態様は、ある次元（生体適合性、ｐＫ、組織外遊走など）に沿って改善される有効性について試験される。パラメータの簡単なリストを図１で強調して示しており、最適設計仕様の要約が含まれる。
サイズ：大きな粒子（＞１μｍ）は、マクロファージ、好中球、樹状細胞によって内在化される。１μｍ未満では、ピノサイトーシスまたは受容体媒介性エンドサイトーシスを介して内在化される。４０～５０ｎｍの範囲の粒子は、最大の取り込みを示す。１０～１００ｎｍの粒子は、生体分布およびクリアランスの最適化のための典型的なサイズ範囲である。５．５ｎｍより小さいものは、腎臓によって急速に排除される。コロナ鎖の曲率とコンフォメーションは、インビボでの運命を決定するために特に重要と考えられる。
形状：ロッド状の設計は、球状のものよりも細胞に取り込まれやすい。非球状粒子は球状粒子よりも循環時間が長いようである。
表面化学：荷電ナノ粒子は、血液循環時間が短く、非常に非特異的な細胞取り込みを有する。これはほとんどの合成ポリマー系で容易に調整することができるが、一般に中性電荷がほとんどの用途に最適である。
コロナ疎水性：コロナ疎水性が増加したブロックコポリマーは、細胞によって取り込まれやすくなるが、オプソニン化のレベルも高くなる。インビボ適用について、最適な製剤は、特に標的療法が関係する場合に、変動する。
コアの安定性：ミセルの半減期は、ピレンＩ１／Ｉ３蛍光を介して測定されるコア安定性を介して制御することができる。他の研究において、ポリマーのミセルのコアを架橋することで、インビボで観察される半減期も増加させることができることが示されている。
粒子の剛性：変形可能な構造は、剛性のものよりも最大３０倍長く循環する。
標的化／刺激応答性要素：標的化は、非標的化システムと比較して、概して改善されたナノキャリアを有する。しかしながら、標的化リガンドまたは環境に敏感な部分の組み込みは、表面電荷、形態、またはその両方を変化させることが多い。ある研究は、腫瘍標的化に対するリガンド密度の効果を調べ、その特定のがん表現型に最適な比率が存在することを見出した。この結果はオプソニン化対標的化のトレードオフが存在することを示し、標的化リガンドを導入するときに考慮しなければならない。
合成ポリマー系において、これらを制御するためのパラメータのうち最も困難なものは、標的化／応答性要素およびジオメトリである。これらの設計パラメータは、多くの場合、ワンポット合成で制御することができないため、複数段階の構築が必要である。多段階プロセスは、ほぼ必然的に多分散性／不均一性を持ち込み、特定の設計選択に関する結論を不透明にし得る。実際、最近の研究は、１０～２０ｎｍの逸脱が、体内のナノ粒子の挙動に著しく影響を及ぼす可能性があることを実証した。したがって、ポリマーミセル合成のあらゆる進歩にもかかわらず、最適なミセルキャリアを設計することは依然として困難である。理想的なシナリオでは、設計段階で特定の用途に最適な設計要素を事前に組み込むことができる。
ブロックコポリマーの形態制御：ジブロックコポリマーの微相分離は、以下の３つのパラメータに依存する：合わせた両ブロックの体積分率、全重合度、およびＦｌｏｒｙ－Ｈｕｇｇｉｎｓパラメータ（χ）。カイ（Ｃｈｉ）パラメータは、両ブロックの混和性、または両親媒性ブロックコポリマーの場合の不混和性を指定する。カイパラメータは温度の関数でもある。ブロック共重合体のみからなる系では、カイパラメータは、ブロックＡ－Ｂ、Ａ－Ａ、Ｂ－Ｂ間の相互作用エネルギーを含む。温度を上昇させるか、またはカイを低下させることにより、ブロック間の適合性が向上し、コンビナトリアルエントロピーが増加し、コポリマーが秩序から無秩序への転移を受ける。
Figure 2023516312000002
 各ブロックは、自身、他のブロック、および水と相互作用することができるため、系に水が導入されると、カイパラメータの数は６に跳ね上がる。しかしながら、水溶液中の形態を制御することは、ブロック（エンタルピー）、コアの鎖ストレッチ（エントロピー）、およびコロナにおける鎖反発の間での３つのポリマー一次変数－界面エネルギーの関数に単純化することができる。反発するコロナ－コロナ相互作用と、鎖の伸長のためのコンフォメーションエントロピーペナルティとのバランスが、コロナ鎖の実際のコンフォメーションを決定する。このバランスは、自己集合形態によって影響を受けることに留意することが重要である。コアブロック伸長も形態の影響を受ける。コア鎖は、球状の形態で最も伸長し、ロッド状の形態では最もコンパクトである。
微細構造が形成されると、ブロックは、系の総界面エネルギーを最小限に抑えようとする。このプロセスの間、それらは単鎖を形成するエントロピーの利得を犠牲にし、疎水性－水相互作用のより大きなペナルティを支払うことを防ぐ。これにより系の総自由エネルギーが低下する。コアブロック（Ａ）のサイズを大きくすると、鎖の全長のコロナ体積分率が小さくなる。その結果、ポリマー鎖の界面では、より小さい曲率が観察される。
興味深い主要なパラメータは、コロナ形成ブロックの親水性、コアブロックの親水性、コポリペプチドの全長、および２つのブロックの比である。評価のパラメータは、サイズ、形態、安定性、および熱応答性挙動である。全ての測定は、特に断らない限り、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液、３ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４で行った。サイズは、それぞれ動的光散乱（ＤＬＳ）および静的光散乱（ＳＬＳ）による、流体力学的半径（Ｒh）および回転半径（Ｒg）によって評価した。ＲgおよびＲhを組み合わせると、散乱体の形態の大まかな指標を示す形状因子ρ＝Ｒg／Ｒhが得られる。形状因子の１．５０５はガウスポリマー鎖を示唆し、１．０は中空球体またはベシクルを示唆し、０．７７５は中実球体を示唆する。細長い散乱体の場合、形状因子はアスペクト比に依存する。温度依存性濁度およびＤＬＳの組合せを利用して、ブロックコポリペプチドの相挙動を決定した。低温透過型電子顕微鏡法（クライオＴＥＭ）を用いて形態を評価し、コア／コロナ鎖の水和に関する重要な洞察を得た。集合ナノ構造の安定性は、前述のように、ピレンのＩ１／Ｉ３蛍光バンドのシフトによって決定した。
本研究の第２の部分に選択される標的ドメインの１つは、ヒトαｖβ３インテグリンを標的とするヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）由来の第１０のＩＩＩ型ドメインであり、この受容体は、多くの腫瘍の内皮で上方制御され、膠芽腫、腎細胞癌、卵巣癌、および乳がん転移などのいくつかの腫瘍細胞でも過剰発現される。αｖβ３インテグリンに低親和性（ＫD＞１×１０-7Ｍ）で結合するＦｎ３バリアントを選択し、Ｆｎ３ドメインがＥＬＰ等の繰り返しのポリペプチドへの融合体として大腸菌で発現され得ることを以前に示した。本質的に高い親和性を有するリガンドではおそらく可能でないそのアビディティの増幅が多価提示では増幅可能であり、親Ｆｎ３ドメインの低い親和性は、結合アビディティおよび細胞取り込みに対する自己集合および多価性の影響について試験することができるため、重要である。
融合タンパク質
本明細書に記載の用語「融合タンパク質」は、少なくとも１つの非構造化ポリペプチドと少なくとも１つの結合ポリペプチドとを含む。融合タンパク質は、任意に、少なくとも１つのリンカーを含み得る。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、２つ以上の非構造化ポリペプチドを含む。融合タンパク質は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の非構造化ポリペプチドを含んでもよい。融合タンパク質は、３０個未満、２５個未満、または２０個未満の非構造化ポリペプチドを含んでもよい。融合タンパク質は、１～３０個、１～２０個、または１～１０個の非構造化ポリペプチドを含んでもよい。そのような実施形態では、非構造化ポリペプチドは、互いに同一であっても異なっていてもよい。一部の実施形態では、融合タンパク質は、互いにタンデムに配置される２つ以上の非構造化ポリペプチドを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、様々な繰り返しの２つの個々の非構造化ポリペプチドを有する２つの非構造化ポリペプチドのジブロックを含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、２つ以上の結合ポリペプチドを含む。融合タンパク質は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の結合ポリペプチドを含んでもよい。融合タンパク質は、３０個未満、２５個未満、２０個未満、１０個未満、または５つ未満の結合ポリペプチドを含んでもよい。融合タンパク質は、１～３０個、１～２０個、または１～１０個の結合ポリペプチドを含んでもよい。そのような実施形態では、結合ポリペプチドは、互いに同一であっても異なっていてもよい。一部の実施形態では、融合タンパク質は、互いにタンデムで配置される２つ以上の結合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、２～６つの結合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、２つの結合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、３つの結合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、４つの結合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、５つの結合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、６つの結合ポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、モジュラー直鎖ポリペプチドとして配置されてもよい。例えば、モジュラー線状ポリペプチドは、以下の構造の１つに配置され得る：
［ＵＰＸ］n－［ＵＰＹ］m－［ＢＰ］p；
［ＵＰＹ］m－［ＵＰＸ］n－［ＢＰ］p；
［ＢＰ］p－［ＵＰＸ］n－［ＵＰＹ］m；
［ＢＰ］p－［ＵＰＹ］m－ＵＰＸ］n；
［ＵＰＸ］n－［ＢＰ］p－［ＵＰＹ］m；
［ＵＰＹ］m－［ＢＰ］p－［ＵＰＸ］n；
［ＢＰ］p－［ＵＰＸ］n－［ＵＰＹ］m－［ＢＰ］p；
［ＢＰ］p－［ＵＰＹ］m－［ＵＰＸ］n－［ＢＰ］p；
［ＢＰ］p－［ＵＰＸ］n－［ＢＰ］p－［ＵＰＹ］m－［ＢＰ］p；
［ＢＰ］p－［ＵＰＹ｝m－［ＢＰ］p－［ＵＰＸ］n－［ＢＰ］p；
ここで、ＵＰＸは、非構造化タンパク質Ｘを指し、ＵＰＹは、非構造化タンパク質Ｙを指し、ＢＰは、結合ポリペプチドを指し、非構造化ポリペプチドＸは、非構造化ポリペプチドＹとは異なる非構造化ポリペプチドであり、ｎ、ｍ、およびｐは、それぞれ独立して、１以上の整数であり、「－」は、結合またはリンカー部分を表す。一部の実施形態では、ｎは、２０～２００の整数である。一態様では、ｎは、４０～２００である。一部の実施形態では、ｍは、２０～２００の整数である。一態様では、ｎは、４０～２００である。一部の実施形態では、ｐは、１０以下の整数である。一部の実施形態では、ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０に等しい整数である。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合ポリペプチドは、少なくとも１つの非構造化ポリペプチドに対してＮ末端に配置される。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合ポリペプチドは、少なくとも１つの非構造化ポリペプチドのＣ末端に配置される。示されるモチーフの他の繰り返しが企図されており、本開示の範囲内である。
融合タンパク質は、当業者により、宿主細胞内で組換え的に発現され得る。融合タンパク質は、当業者に公知の任意の手段によって精製されてもよい。例えば、融合タンパク質は、液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィー、またはそれらの組合せなどのクロマトグラフィーを使用して精製され得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、クロマトグラフィーなしで精製される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、逆転移サイクルを使用して精製される。
一実施形態では、融合タンパク質は、結合ポリペプチドに連結されたコアn－コロナmジブロックを含み、ｎは、２０～２００の繰り返し数であり、ｍは、４０～２００の繰り返し数である。一態様では、結合ポリペプチドは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）タンパク質ＡのＦｎ３、Ｔｎ３、αヘリックスＺドメイン、１種以上の標的化ペプチド、抗ＥＧＦＲ結合タンパク質、ＤＡＲＰＩＮＳ、ノッティン、またはｓｃＦｖを含む。
一実施形態では、融合タンパク質は、結合ポリペプチドに連結されたＲＬＰn－ＥＬＰmジブロックを含み、ｎは、２０～２００の繰り返し数であり、ｍは、４０～２００の繰り返し数である。一態様では、結合ポリペプチドは、黄色ブドウ球菌タンパク質ＡのＦｎ３、Ｔｎ３、αヘリックスＺドメイン、１種以上の標的化ペプチド、抗ＥＧＦＲ結合タンパク質、ＤＡＲＰＩＮＳ、ノッティン、またはｓｃＦｖを含む。
非構造化ポリペプチド
非構造化ポリペプチドは、ＣＤによって観察されるように、最小限の二次構造を有するかまたは二次構造を有さず、その下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）未満の温度および／またはその上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を超える温度で可溶性であり、かつ繰り返しのアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドを含んでもよい。ＬＣＳＴは、それを下回る温度でポリペプチドが混和性である温度ある。ＵＣＳＴは、それを超える温度でポリペプチドが混和性である温度である。一部の実施形態では、非構造化ポリペプチドは、ＵＣＳＴ挙動のみを有する。一部の実施形態では、非構造化ポリペプチドは、ＬＣＳＴ挙動のみを有する。一部の実施形態では、非構造化ポリペプチドは、ＵＣＳＴおよびＬＣＳＴ挙動の両方を有する。非構造化ポリペプチドは、繰り返しのアミノ酸配列を含んでもよい。非構造化ポリペプチドは、約０℃～約１００℃、約１０℃～約５０℃、または約２０℃～約４２℃のＬＣＳＴを有し得る。非構造化ポリペプチドは、約０℃～約１００℃、約１０℃～約５０℃、または約２０℃～約４２℃のＵＣＳＴを有し得る。一部の実施形態では、非構造化ポリペプチドは、室温（約２５℃）と体温（約３７℃）の間で転移温度を有する。一部の実施形態では、１種以上の熱応答性ポリペプチドを含む融合タンパク質は、室温（約２５℃）と体温（約３７℃）との間で転移温度を有する。一部の実施形態では、非構造化ポリペプチドは、ＬＣＳＴまたはＵＣＳＴ挙動を有しない。非構造化ポリペプチドは、１種以上の融合タンパク質を含むナノ粒子が対象に投与される濃度で、体温を下回るまたは体温を上回るＬＣＳＴまたはＵＣＳＴを有し得る。
一部の実施形態では、非構造化ポリペプチドは、１種以上の熱応答性ポリペプチドを含む。熱応答性ポリペプチドは、例えば、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）およびレジリン様タンパク質（ＲＬＰ）を含んでもよい。
一部の実施形態では、非構造化ポリペプチドは複数の非構造化ポリペプチドを含む。一態様では、非構造化ポリペプチドは、２つ以上の非構造化ポリペプチドのジブロックを含む。一態様では、非構造化ポリペプチドは、レジリン様タンパク質（ＲＬＰ）およびエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）のジブロックを含む。
一実施形態では、非構造化ポリペプチドは、１種以上のコアポリペプチドを含む。一態様では、コアポリペプチドは、レジリン様ポリペプチド（ＲＬＰ）である。ＲＬＰは、節足動物Ｒｅｃ１－レシリンに由来する。Ｒｅｃ１－レシリンは環境応答性であり、二重相転移挙動を示す。熱応答性ＲＬＰは、ＬＣＳＴおよびＵＣＳＴを有することができる（Li et al., Macromol. Rapid Commun. 2015, 36, 90-95）。好適な熱応答性ポリペプチドのさらなる例は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０１２１７０９号および米国特許出願公開第２０１５／０１１２０２２号に記載されている。一実施形態では、ＲＬＰポリペプチドは、配列ＱＹＰＳＤＧＲＧ（配列番号１）を含む。非構造化ポリペプチドは、（ＱＹＰＳＤＧＲＧ）nを含むアミノ酸配列を含んでもよく、ここでｎは２０～２００である。一部の実施形態では、ｎは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００である。一部の実施形態では、ｎは、５００未満、４００未満、３００未満、２００未満、または１００未満であってもよい。一部の実施形態では、ｎは、１～５００、１～４００、１～３００、または１～２００であってもよい。一部の実施形態では、ｎは、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１６０、１８０または２００である。一態様では、ｎは、ＲＬＰの２０～２００の繰り返し数である。ＲＬＰは、組換えで発現し得る。
別の実施形態では、非構造化ポリペプチドは、１種以上のコロナポリペプチドを含む。一態様では、コロナポリペプチドは、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）を含む。エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）は、配列ＶＰＧ［Ａ：Ｇ］Ｇ（配列番号８）を含むポリペプチドを指す。非構造化ポリペプチドは、（ＶＰＧ［Ａ：Ｇ］Ｇ）n（式中、ｎは４０～２００である）からなるアミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ｎは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００である。一部の実施形態では、ｎは、５００未満、４００未満、３００未満、２００未満、または１００未満であってもよい。一部の実施形態では、ｎは、１～５００、４０～４００、１～３００、または４０～２００であってもよい。一部の実施形態では、ｎは、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１６０、１８０または２００である。一態様では、ｎは、ＥＬＰの４０～２００の繰り返し数である。ＥＬＰは、組換えで発現し得る。
非構造化ポリペプチドは、ＥＬＰまたはＲＬＰモチーフのＣ末端またはＮ末端に追加のアミノ酸をさらに含んでもよい。モチーフを取り囲むこれらのアミノ酸は、全体的に繰り返されるモチーフの一部であってもよい。モチーフを取り囲むアミノ酸は、非構造化ポリペプチドのＬＣＳＴまたはＵＣＳＴ挙動を制御するために、全体的な疎水性および／または電荷のバランスをとり得る。
一実施形態では、非構造化ポリペプチドは、ＲＬＰn－ＥＬＰmを含み、ｎは２０～２００の繰り返し数であり、ｍは、４０～２００の繰り返し数である。一態様では、非構造化ポリペプチドは、ＲＬＰ40－ＥＬＰ40（配列番号８３）、ＲＬＰ40－ＥＬＰ80（配列番号８４）、ＲＬＰ80－ＥＬＰ80（配列番号８７）、またはＲＬＰ80－ＥＬＰ160（配列番号８６）を含む。
熱応答性ポリペプチド、例えば、ＥＬＰおよびＲＬＰは、相転移を有し得る。熱応答性ポリペプチドは、非構造化ポリペプチドまたは融合タンパク質に相転移特性を付与し得る。「相転移」または「転移」は、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）または逆転移温度（Ｔt）と呼ばれる特定の温度で急激にかつ可逆的に生じる熱応答性ポリペプチドの凝集を指し得る。転移温度（ＬＣＳＴまたはＴt）未満では、熱応答性ポリペプチド（または熱応答性ポリペプチドを含むポリペプチド）は、高度に可溶性であり得る。転移温度を超えて加熱すると、熱応答性ポリペプチドは疎水的に崩壊して凝集し、分離したゲル状相を形成し得る。
熱応答性ポリペプチドは、様々な温度および濃度で相転移し得る。熱応答性ポリペプチド、例えばＥＬＰは、結合ポリペプチドの結合または効力に影響を有しなくてもよい。熱応答性ポリペプチドは、ユーザが、融合タンパク質を、任意の数の所望の転移温度、分子量、およびフォーマットに調節することを可能にし得る。
熱応答性ポリペプチドは逆相転移挙動を示す場合があり、したがって熱応答性ポリペプチドを含む融合タンパク質は逆相転移挙動を示す場合がある。融合タンパク質の制御された放出（徐放）のために、逆相転移挙動を使用して、対象の組織内に薬物デポーを形成してもよい。逆相転移挙動はまた、逆相転移サイクルを使用して融合タンパク質の精製を可能にし、それによってクロマトグラフィーの必要性を排除し得る。
結合ポリペプチド
結合ポリペプチド（または「標的化ポリペプチド」）は、少なくとも１つの標的に結合することができる任意のポリペプチドを含んでもよい。結合ポリペプチドは、少なくとも１つの標的に結合し得る。「標的」は、結合ポリペプチドによって結合可能な実体であってもよい。標的は、例えば、別のポリペプチド、細胞表面受容体、炭水化物、抗体、低分子、またはそれらの組合せを含んでもよい。標的は、バイオマーカーであってもよい。標的は、アゴニズムを介して活性化されてもよく、またはアンタゴニズムを介してブロックされてもよい。結合ポリペプチドは、標的に特異的に結合してもよい。標的に結合することによって、結合ポリペプチドは、標的部分、アゴニスト、アンタゴニスト、またはそれらの組合せとして作用し得る。一部の実施形態では、結合ポリペプチドドメインは、ＴＲＡＩＬＲ－２に結合する。「ＴＲＡＩＬ受容体２」または「ＴＲＡＩＬＲ－２」は、ＴＮＦ関連のアポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体２タンパク質を指す。ＴＲＡＩＬＲ－２は、ＴＲＡＩＬまたは他のアゴニストと結合すると、腫瘍細胞におけるアポトーシスまたはプログラム細胞死を活性化する。一部の実施形態では、結合ポリペプチドドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する。上皮成長因子（ＥＧＦ）および他の成長因子リガンドが結合すると、ＥＧＦＲは、細胞の増殖を促進するシグナル伝達経路を活性化する。
結合ポリペプチドは、標的に結合するモノマーであってもよい。モノマーは、１つ以上の標的に結合し得る。結合ポリペプチドは、オリゴマーを形成してもよい。結合ポリペプチドは、同じ結合ポリペプチドまたは異なる結合ポリペプチドを有するオリゴマーを形成してもよい。オリゴマーは標的に結合し得る。オリゴマーは、１つ以上の標的に結合し得る。オリゴマー内の１つ以上のモノマーは、１つ以上の標的に結合し得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、多価である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、複数の標的に結合する。一部の実施形態では、結合ポリペプチド単独の活性は、融合タンパク質の一部である場合の結合タンパク質の活性と同じである。
一部の実施形態では、結合ポリペプチドは、１種以上の足場タンパク質を含む。本明細書で使用される場合、「足場タンパク質」は、比較的安定であり、定義された三次元構造を有する１種以上のポリペプチドドメインを指す。足場タンパク質は、親和性操作のための容量をさらに有し得る。一部の実施形態では、足場タンパク質は、特定の標的に結合するように操作されている。足場タンパク質は同一であっても異なっていてもよい。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、フィブロネクチンドメインを含む。フィブロネクチンは、インテグリンと呼ばれる膜スパニング受容体タンパク質に結合する細胞外マトリクスの高分子量糖タンパク質である。フィブロネクチンは、コラーゲン、フィブリン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンなどの細胞外マトリクス成分に結合する。ヒトフィブロネクチンは、一対のＣ末端ジスルフィド結合によって連結された２つのほぼ同一のポリペプチド鎖を含む、タンパク質二量体として存在する。各ヒトフィブロネクチンサブユニットは、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型の３つのドメインを含む。フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）は、ヒトフィブロネクチンにおける３種類の内部繰り返しのうちの３つ目を指す。このドメインは、分子生物学的技術を使用して目的タンパク質に結合するように操作され得る３つのＣＤＲ様（相補性決定領域）ループを含有するため、しばしば足場タンパク質と呼ばれる。一部の実施形態では、フィブロネクチンドメインは、Ｔｎ３を含む。「Ｔｎ３」または「Ｔｎ３足場」は、ヒトテネイシンＣ由来のＦｎ３ドメインを指す。Ｔｎ３は、配列番号６２からなるアミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態では、Ｔｎ３は、ＴＲＡＩＬ受容体２（配列番号６８）に結合する。一実施形態では、結合タンパク質は、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）（配列番号６０）由来のＩＩＩ型ドメインを含む。別の実施形態では、結合タンパク質は、Ｔｎ３（配列番号６２）を含む。別の実施形態では、結合タンパク質は、黄色ブドウ球菌タンパク質Ａ（配列番号６４）のαヘリックスＺドメインを含む。他の実施形態では、結合ポリペプチドは、例えば、抗ＥＧＦＲ結合タンパク質、ＤＡＲＰＩＮＳ、ノッティン、またはｓｃＦｖから選択される１種以上のタンパク質を含み得る。
一部の実施形態では、結合ポリペプチドは、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ（ＲＧＤＳ）を含むアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、結合ポリペプチドは、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｓｅｒ（ＧＲＧＤＳＰＡＳ；配列番号７６）を含む。一部の実施形態では、結合ポリペプチドは、配列番号６０～６４、７４～７８からなる複数のアミノ酸配列を含む。配列番号６０～６４、７４～７８のアミノ酸配列は、結合ポリペプチド内の任意の場所に存在し得る。一部の実施形態では、配列番号６０～６４、７４～７８のアミノ酸配列は、結合ポリペプチド内で連続して繰り返されてもよい。
結合タンパク質の他の例としては、配列番号７４の配列を有するＥｒｂＢ２受容体結合タンパク質（ＡＮＨＰ）、配列番号７６の配列を有する細胞結合ペプチド（ＧＲＧＤＳＰＡＳ）、配列番号１１２の配列を有するアデノウイルス（ＡＡＶ）結合タンパク質（ＰＫＤ２）、配列番号１１４の配列を有するアデノウイルス（ＡｄＶ）結合タンパク質（ＣＡＲ）、配列番号１１６の配列を有するレンチウイルス（ＬＶ）結合タンパク質ＣＲ２、配列番号１１８の配列を有するレンチウイルス（ＬＶ）結合タンパク質ＣＲ３、または配列番号１２０の配列を有するアルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）の１種以上が挙げられる。
リンカー
一部の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、２つ以上のリンカーを含む。そのような実施形態では、リンカーは互いに同一であっても異なっていてもよい。融合タンパク質は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、または少なくとも１００個のリンカーを含み得る。融合タンパク質は、５００個未満、４００個未満、３００個未満、または２００個未満のリンカーを含んでもよい。融合タンパク質は、１～１０００個、１０～９００個、１０～８００個、または５～５００個のリンカーを含み得る。
リンカーは、結合ポリペプチドと非構造化ポリペプチドとの間、結合ポリペプチド間、非構造化ポリペプチド間、またはそれらの組合せにおいて配置され得る。複数のリンカーは、互いに隣接して配置され得る。複数のリンカーが、結合ポリペプチドと非構造化ポリペプチドとの間に互いに隣接して配置されてもよい。
リンカーは、任意のアミノ酸配列および長さのポリペプチドであり得る。リンカーは、スペーサーペプチドとして作用してもよい。リンカーは、ポリペプチドドメイン間にあってもよい。リンカーは、結合ドメインの活性を保持しながら、結合ポリペプチドの結合ドメインを十分に分離し得る。一部の実施形態では、リンカーは、荷電アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは可撓性である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのグリシンおよび少なくとも１つのセリンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3（配列番号６６）からなるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのプロリンを含む。
ポリヌクレオチド
本明細書に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドがさらに提供される。ベクターが、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。ポリペプチドの発現を得るために、典型的には、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写を指示するプロモータと、転写／翻訳ターミネータと、タンパク質をコードする核酸の場合は翻訳開始のためのリボソーム結合部位とを含む発現ベクターにサブクローニングする。ベクターの例は、ｐＥＴ２４（配列番号１２１）である。適切な細菌プロモータは、当該技術分野で周知である。さらに、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。タンパク質を発現するための細菌発現系は、例えば、大腸菌、バチルス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）において利用可能である（Paiva et al., Gene 1983, 22, 229-235;Mosbach et al. Nature 1983, 302, 543-545）。このような発現系のキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞の真核生物発現系は、当該技術分野で周知であり、市販されている。本発明では、レトロウイルス発現系を使用することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、６２、６４、７４、７６、または７８のうちの１つ以上の繰り返しまたは単一の配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、または７９のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上のポリペプチドの繰り返しまたは単一配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８０～１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
ナノ粒子
本明細書に記載の融合タンパク質の１種以上を含むナノ粒子は、融合タンパク質の自己集合によって生成することができる。本明細書に記載されるように、ジブロックの同一性および繰り返し数は、ナノ粒子形成に影響を及ぼす。
架橋剤
一態様では、ナノ粒子は、架橋されて、生体培地におけるその安定性および半減期を向上させる。架橋は、一級アミン、カルボキシル、スルフヒドリル、またはカルボニル部分を標的とする化学的方法によって達成することができる。例示的な架橋剤としては、カルボジイミド（例えば、ＥＤＣ）、ＮＨＳエステル、イミドエステル（ペンタフルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィン）、マレイミド、ハロアセチル（例えば、ブロモまたはヨードアセチル）、ピリジルジスルフィド、チオスルホネート、ビニルスルホン、ヒドラジン、アルコキシアミン、ジアジリン、アリールアジド、イソシアネート、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド等が挙げられる。他の態様では、架橋は、架橋可能な天然アミノ酸（シスチンを形成するシステイン）、または修飾アミノ酸、または活性化されて架橋を形成できる化学反応性アミノ酸を組み込むことによって達成できる。
本明細書（ｈｅｒｉｎ）で使用される典型的な架橋剤は、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡｚＦ）である。架橋は、任意のペプチド結合で挿入することができるか、または別のラジカルＮ３基の存在下で分解可能なフリーラジカルを生成するＮ３結合の光活性化によって達成される。溶液は、ペプチドを凍結乾燥粉末から作業濃度、典型的には５０ｎＭを超える濃度に再懸濁し、高強度の紫外線に０．１～３０秒間曝露することによって調製される。化学的架橋も使用することができ、化学的リンカーがジブロックペプチドと共に凍結乾燥されるかまたは再懸濁後に添加される。
投与
本明細書に記載される１種以上の融合タンパク質を含むナノ粒子は、治療剤または標的送達剤を形成するために、当業者に周知の標準技術に従って製剤化することができる。１種以上の融合タンパク質を含むナノ粒子を含むそのような組成物は、特定の対象の年齢、性別、体重、および状態、ならびに投与経路などの要因を考慮して、当業者に周知の投与量および技術で投与することができる。
１種以上の融合タンパク質を含むナノ粒子は、予防的または治療的に投与され得る。予防的投与において、ナノ粒子は、応答を誘発するのに十分な量で投与されてもよい。治療適用において、ナノ粒子は、治療効果を誘発するために十分な量で、それを必要とする対象に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」と定義される。この使用に有効な量は、例えば、投与されるナノ粒子レジメンの特定の組成、投与方法、疾患の病期および重症度、患者の一般的な健康状態、ならびに処方医の判断に依存する。
ナノ粒子は、それぞれ参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれるDonnelly et al., Ann. Rev. Immunol. 1997, 75, 617-648；Ｆｅｉｇｎｅｒらの米国特許第５，５８０，８５９号、Ｆｅｉｇｎｅｒの米国特許第５，７０３，０５５号、およびＣａrｓｏｎらの米国特許第５，６７９，６４７号に記載されているように、当該技術分野において周知の方法によって投与され得る。ナノ粒子は、例えばワクチン銃を使用して個体に投与できる粒子またはビーズに複合体化されてもよい。当業者であれば、生理学的に許容される化合物を含む薬学的に許容されるキャリアの選択が、例えば投与経路に依存することを知っているであろう。
ナノ粒子は、様々な経路を介して送達することができる。典型的な送達経路としては、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、または皮下送達が挙げられる。他の経路としては、経口投与、鼻腔内、膣内、経皮、静脈内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、および表皮経路が挙げられる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、対象に、静脈内、動脈内、または腹腔内投与される。
ナノ粒子は、懸濁液、シロップ、またはエリキシル剤等の液体調製物であってもよい。ナノ粒子は、リポソーム、マイクロスフィア、または他のポリマーマトリックスに組み込むことができる（例えば、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれるＦｅｉｇｎｅrらの米国特許第５，７０３，０５５号；Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. I to III(2nd ed. 1993)に記載の方法により）。リポソームは、リン脂質または他の脂質からなることができ、作製および投与が比較的簡単な、無毒で生理学的に許容され、代謝可能なキャリアであることができる。
ナノ粒子は、ワクチンとして使用し得る。ワクチンは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６６４，５４５号に記載の方法などのエレクトロポレーションを介して投与することができる。エレクトロポレーションは、参照により、それぞれの内容が全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，３０２，８７４号、同第５，６７６，６４６号、同第６，２４１，７０１号、同第６，２３３，４８２号、同第６，２１６，０３４号、同第６，２０８，８９３号、同第６，１９２，２７０号、同第６，１８１，９６４号、同第６，１５０，１４８号、同第６，１２０，４９３号、同第６，０９６，０２０号、同第６，０６８，６５０号および同第５，７０２，３５９号に記載されている方法または装置によって行うことができる。エレクトロポレーションは、低侵襲性デバイスを介して実施することができる。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、制御放出製剤で投与される。一部の実施形態では、ナノ粒子は、１種以上の熱応答性ポリペプチドを含み、熱応答性ポリペプチドは、ナノ粒子が投与前に可溶性のままであり、かつナノ粒子が対象におけるゲル状デポーへの投与に際して転移するような転移温度を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、１種以上の熱応答性ポリペプチドを含む１種以上の融合タンパク質を含み、熱応答性ポリペプチドは、融合タンパク質が室温で可溶性のままであり、かつ融合タンパク質が対象におけるゲル状デポーへの投与に際して転移するような転移温度を有する。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質は、１種以上の熱応答性ポリペプチドを含み、熱応答性ポリペプチドは、室温（約２５℃）と体温（約３７℃）との間に、融合タンパク質が投与されてデポーを形成することができる転移温度を有する。本明細書で使用される場合、「デポー」とは、融合タンパク質を経時的に放出する融合タンパク質を含むゲル状組成物を指す。一部の実施形態では、ナノ粒子は、皮下または腫瘍内に注入されて、デポー（コアセルベート）を形成することができる。デポーは、ナノ粒子の制御された放出（徐放）を提供し得る。デポーは、例えば、ナノ粒子の循環または腫瘍への徐放を提供し得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、デポーから、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１週間、少なくとも約１．５週間、少なくとも約２週間、少なくとも約２．５週間、少なくとも約３．５週間、少なくとも約４週間、または少なくとも約１カ月の期間にわたって放出され得る。
検出
本明細書で使用される場合、「検出する」または「存在を決定する」という用語は、標的に結合した１つ以上のナノ粒子、標的、またはナノ粒子の検出不能、低い、正常な、または高濃度の定性的測定を指す。検出には、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ検出が含まれ得る。検出は、１つ以上のナノ粒子または標的の非存在に対して、１つ以上のナノ粒子または標的を含む１つ以上のナノ粒子の存在を検出することを含み得る。検出はまた、１つ以上のナノ粒子または標的のレベルの定量化を含んでもよい。「定量化する」または「定量化」という用語は、互換的に使用され得、相対的または絶対的であるかどうかにかかわらず、物質（例えば、ナノ粒子または標的）の量または存在量を決定するプロセスを参照し得る。任意の好適な検出方法は、本開示の一般的な範囲に含まれる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、検出のためにそれに付けたレポーターを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、レポーターで標識される。一部の実施形態では、標的に結合したナノ粒子の検出は、限定されないが、ウエスタンブロット上のバンド強度、フローサイトメトリー、放射標識イメージング、細胞結合アッセイ、活性アッセイ、ＳＰＲ、イムノアッセイを含むがこれらに限定されない方法、または当該技術分野で公知の様々な他の方法を含む方法によって決定され得る。
一部の実施形態では、ナノ粒子が標的に結合および／または検出するための抗体を模倣するものを含む場合、任意のイムノアッセイを利用してもよい。イムノアッセイは、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合阻害アッセイ、例えば、順方向または逆方向の競合阻害アッセイ、蛍光偏光アッセイ、または競合結合アッセイであってもよい。ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡであってもよい。ｆナノ粒子の標的への特異的な免疫学的結合は、ナノ粒子に付けた直接標識を介して、またはアルカリホスファターゼもしくはホースラディッシュペルオキシダーゼ等の間接標識を介して検出することができる。固定化ｆナノ粒子の使用は、イムノアッセイに組み込むことができる。ナノ粒子は、磁性またはクロマトグラフィーのマトリックス粒子、アッセイプレート（マイクロタイターウェルなど）の表面、固体基質材料の片などの様々な支持体上に固定化され得る。アッセイストリップは、固体支持体上のアレイにナノ粒子または複数のナノ粒子をコーティングすることによって調製することができる。次に、このストリップを試験生体試料に浸漬し、洗浄および検出ステップを通じて迅速に処理して、着色されたスポット等の測定可能な信号を生成してもよい。
疾患を処置する方法
本発明は、疾患の処置を必要とする対象において疾患を処置する方法を対象とする。本方法は、対象に、本明細書に記載の１種以上のナノ粒子を含む有効量のナノ粒子を投与することを含んでもよい。疾患は、がん、代謝性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、および整形外科障害から選択され得る。一部の実施形態では、疾患は、少なくとも１種の結合ポリペプチドの標的に関連する疾患である。
代謝性疾患は、体内の異常な化学反応が正常な代謝過程を変化させる場合に生じ得る。代謝性疾患としては、例えば、インスリン抵抗性、非アルコール性脂肪肝疾患、２型糖尿病、インスリン抵抗性疾患、心血管疾患、動脈硬化症、脂質関連代謝障害、高血糖症、高インスリン血症、高脂血症、およびグルコース代謝障害が挙げられ得る。
自己免疫疾患は、体内に通常存在する物質および組織に対する身体の異常な免疫応答から生じる。自己免疫疾患としては、ループス、関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、グレイブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、紫斑病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、急性リウマチ熱、連鎖球菌後糸球体腎炎、結節性多発動脈炎、心筋炎、乾癬、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、および線維筋痛症が挙げられるが、これらに限定されない。
心血管疾患は、心臓または血管に関与する疾患の一種である。心血管疾患としては、例えば、狭心症および心筋梗塞（心臓発作）などの冠動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心不整脈、先天性心疾患、弁膜性心疾患、心炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、および静脈血栓症が挙げられ得る。
整形外科障害または筋骨格系障害は、体の関節、靭帯、筋肉、神経、腱、および手足、首、および背中を支える構造物の損傷または痛みである。整形外科障害は、疼痛を引き起こし、正常な活動を損なう変性疾患および炎症性状態を含んでもよい。整形外科障害としては、例えば、手根管症候群、上顆炎、および腱炎が挙げられ得る。がんとしては、乳がん、結腸直腸がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、精巣がん、脳がん、皮膚がん、直腸がん、胃がん、食道がん、肉腫、気管がん、頭頸部がん、膵臓がん、肝臓がん、卵巣がん、リンパ系がん、子宮頸がん、外陰がん、黒色腫、中皮腫、腎臓がん、膀胱がん、甲状腺がん、骨がん、癌腫、肉腫、および軟組織がんが挙げられ得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、がんは結腸直腸がんである。一部の実施形態では、がんは結腸直腸腺癌である。
タンパク質治療薬の１つの用途は、がんの処置である。特定の実施形態では、本発明は、目的の腫瘍標的のための抗体模倣物の開発における足場タンパク質の使用方法を提供する。足場タンパク質工学の出現により、立体的およびアーキテクチャの制限から妨げられない強力なタンパク質薬物を設計する可能性が生まれた。強力なタンパク質薬物は、診断または処置に貴重であり得るが、標的領域への送達の成功は、大きな課題を提示し得る。
疾患を診断する方法
本明細書には、疾患を診断する方法が提供される。方法は、本明細書に記載の１種以上の融合タンパク質を含むナノ粒子を対象に投与すること、およびナノ粒子の標的への結合を検出して、対象における標的の存在を決定することを含み得る。標的の存在は、対象における疾患を示し得る。他の実施形態では、本方法は、対象からの試料を、本明細書に記載されるナノ粒子と接触させること、試料中の標的のレベルを決定すること、および試料中の標的のレベルを標的の対照レベルと比較することを含み得、対照レベルとは異なる標的のレベルは、対象における疾患を示す。一部の実施形態では、疾患は、上記で詳述したがん、代謝性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、および整形外科障害から選択される。一部の実施形態では、標的は、疾患マーカーまたはバイオマーカーを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、標的に結合するか、または標的を検出するための抗体模倣物として機能し得る。
標的の存在を決定する方法
本明細書では、試料中の標的の存在を決定する方法が提供される。本方法は、試料中のナノ粒子と標的との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で、本明細書に記載の１種以上の融合タンパク質を含むナノ粒子と試料を接触させること、および複合体の存在を検出することを含んでもよい。複合体の存在は、試料中の標的を示すことができる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、検出のためにレポーターで標識される。
一部の実施形態では、試料は、対象から取得され、本方法は、対象の処置の有効性を診断、予後予測、または評価することをさらに含む。本方法が対象の処置の有効性を評価することを含む場合、本方法は、有効性を改善するために必要に応じて対象の処置を変更することをさらに含み得る。
処置の有効性を決定する方法
疾患に対する処置の有効性の決定を必要とする対象において、疾患に対する処置の有効性を決定する方法が本明細書に提供される。本方法は、対象からの試料を、本明細書に記載される融合タンパク質を含むナノ粒子と、試料中のナノ粒子と標的との間に複合体が形成されることを可能にする条件下で接触させること、試料中の標的のレベルを示す試料中の複合体のレベルを決定すること、および、標的のレベルが対照レベルと異なる場合、処置が、疾患の処置において有効であるかまたは有効でないと判定される、試料中の標的のレベルを標的の対照レベルと比較することを含んでもよい。
時点は、疾患の発症前、治療の投与前、治療の投与中、および治療が終了した後の様々な時点、またはそれらの組合せを含み得る。１種以上の融合タンパク質を含むナノ粒子を対象に投与すると、ナノ粒子は標的に結合することができ、ここで標的の存在は、様々な時点での対象における疾患の存在を示す。一部の実施形態では、標的は、疾患マーカーまたはバイオマーカーを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、標的に結合するおよび／または標的を検出するための抗体模倣物として作用し得る。様々な時点でのナノ粒子の標的への結合の比較は、疾患が進行しているかどうか、疾患が発達したかどうか、治療が疾患の処置または予防に働いているかどうか、またはそれらの組合せを示すことができる。
一部の実施形態では、対照レベルは、対象が処置を開始した期間の前または期間中の時点での対象におけるレベルに対応し、試料は、後の時点で対象から採取される。一部の実施形態では、試料は、対象が処置を受けている期間中の時点で対象から採取され、対照レベルは、無病レベルまたは対象が処置を開始した期間の前の時点のレベルに対応する。一部の実施形態では、本方法は、処置が疾患の処置に有効でないと決定されたときに、処置を変更することまたは異なる処置を対象に投与することをさらに含む。
当業者には、本明細書に記載の組成物、配合物、方法、プロセス、および用途に対する好適な変更および適合が、任意の実施形態またはその態様の範囲から逸脱することなく行われ得ることが明らかである。提供される組成物および方法は、例示的なものであり、特定の実施形態のいずれかの範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載されている様々な実施形態、態様、および選択肢はいずれも、あらゆる変形または繰り返しで組み合わせることができる。本明細書に記載される組成物、製剤、方法、およびプロセスの範囲には、本明細書に記載される実施形態、態様、選択肢、実施例、および選好の全ての実際のまたは潜在的な組合せが含まれる。本明細書に記載される例示的な組成物および製剤は、本明細書に開示される任意の構成要素を省略してもよく、任意の構成要素を置き換えてもよく、または本明細書の他の場所に開示される任意の構成要素を含んでもよい。万一、参照により組み込まれている特許または刊行物のいずれかにある用語の意味が、本開示で使用されている用語の意味と矛盾する場合、本開示における用語または語句の意味が優先する。さらに、前述の説明は、例示的な実施形態を開示し、説明するにすぎない。本明細書に引用されている全ての特許および文献は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される発明の様々な実施形態および態様は、以下の項によって要約される。
項１．少なくとも１種の結合ポリペプチドと少なくとも１種の非構造化ポリペプチドとを含む融合タンパク質を含むタンパク質ナノ粒子を含む、組成物。
項２．前記融合タンパク質が、複数の非構造化ポリペプチドを含む、項１に記載の組成物。
項３．前記融合タンパク質が、複数の標的化ポリペプチドを含む、項１または２に記載の組成物。
項４．前記非構造化ポリペプチドが、ジブロックペプチドを含む、項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
項５．前記非構造化ポリペプチドが、コアポリペプチドおよびコロナポリペプチドのジブロックを含む、項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
項６．前記非構造化ポリペプチドが、コアn－コロナmを含み、ｎが２０～２００の繰り返し数であり、ｍが４０～２００の繰り返し数である、項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
項７．前記コアポリペプチドが、配列ＱＹＰＳＤＧＲＧ（配列番号１）、ＧＲＧＤＱＰＹＱ（配列番号２）、ＧＲＧＤＳＰＹＱ（配列番号３）、ＧＲＧＤＳＰＹＳ（配列番号４）、ＧＲＧＤＱＰＹＳ（配列番号５）、ＧＲＧＤＳＰ［３Ｙ：Ｖ］Ｓ（配列番号６）、ＧＲＧＤＳＰ（Ｙ：Ｖ］Ｓ（配列番号７）、またはこれらの組合せを含む、項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
項８．前記コロナポリペプチドが、配列ＶＰＧ［Ａ：Ｇ］Ｇ（配列番号８）、ＶＰＧＳＧ（配列番号９）、ＶＰＧＶＧ（配列番号１０）、ＶＰＱＱＧ（配列番号１１）、ＧＲＧＤＳＰＡＳ（配列番号１２）、ＧＲＧＤＳＰＩＳ（配列番号１３）、ＧＲＧＤＳＰＶＳ（配列番号１４）、ＧＲＧＤＱＰＨＮ（配列番号１５）、ＧＲＧＤＮＰＨＱ（配列番号１６）、ＧＲＧＤＳＰＶ（配列番号１７）、またはこれらの組合せを含む、項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
項９．前記コアポリペプチドが、配列（ＲＬＰ）n（配列番号１）を含み、ｎが２０～２００の繰り返し数である、項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
項１０．前記コロナポリペプチドが、配列（ＥＬＰ）ｍ（配列番号８）を含み、ｍが４０～２００の繰り返し数である、項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
項１１．前記ジブロックが、
ＲＬＰ４０－ＥＬＰ４０（配列番号８３）、
ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）、
ＲＬＰ４０－ＥＬＰ１６０（配列番号８２）、
ＲＬＰ６０－ＥＬＰ８０（配列番号８５）、
ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）、
ＲＬＰ８０－ＥＬＰ１６０（配列番号８６）、または
ＲＬＰ１００－ＥＬＰ８０（配列番号８８）
を含む、項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
項１２．前記標的化ポリペプチドが、２ｋＤａ～１００ｋＤａのポリペプチドを含む、項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
項１３．前記標的化ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）（配列番号６０）由来のＩＩＩ型ドメイン、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）（配列番号６２）由来のａＦｎ３ドメイン、またはブドウ球菌タンパク質Ａ（配列番号６４）のＺドメインを含む、項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
項１４．前記標的化ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）（配列番号６０）由来のＩＩＩ型ドメインを含む、項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
項１５．前記標的化ポリペプチドが、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）（配列番号６２）由来のＦｎ３ドメインを含む、項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
項１６．前記標的化ポリペプチドが、（配列番号６４）を含む配列を有するブドウ球菌タンパク質ＡのＺドメインを含む、項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
項１７．前記コアポリペプチドが架橋されている、項１～１６のいずれか１項に記載の組成物。
項１８．少なくとも１種の結合ポリペプチドと少なくとも１種の非構造化ポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む、タンパク質ナノ粒子。
項１９．前記融合タンパク質が、複数の非構造化ポリペプチドを含む、項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
項２０．前記融合タンパク質が、複数の結合ポリペプチドを含む、項１８または１９に記載のタンパク質ナノ粒子。
項２１．前記非構造化ポリペプチドが、ジブロックペプチドを含む、項１８～２０のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項２２．前記非構造化ポリペプチドが、コアポリペプチドおよびコロナポリペプチドのジブロックを含む、項１８～２１のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項２３．前記非構造化ポリペプチドが、コアn－コロナmを含み、ｎが２０～２００の繰り返し数であり、ｍが４０～２００の繰り返し数である、項１８～２２のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項２４．前記コアポリペプチドが、配列ＱＹＰＳＤＧＲＧ（配列番号１）、ＧＲＧＤＱＰＹＱ（配列番号２）、ＧＲＧＤＳＰＹＱ（配列番号３）、ＧＲＧＤＳＰＹＳ（配列番号４）、ＧＲＧＤＱＰＹＳ（配列番号５）、ＧＲＧＤＳＰ［３Ｙ：Ｖ］Ｓ（配列番号６）、ＧＲＧＤＳＰ（Ｙ：Ｖ］Ｓ（配列番号７）、またはこれらの組合せを含む、項１８～２３のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項２５．前記繰り返しコアポリペプチド配列には、アジドフェニルアラニン、アセチルフェニルアラニン、プロパルギルオキシフェニルアラニン、アセチルフェニルアラニン、またはアジドホモアラニンから選択される少なくとも１～１０個の非古典的アミノ酸が散在している、項１８～２４のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項２６．前記コロナポリペプチドが、配列ＶＰＧ［Ａ：Ｇ］Ｇ（配列番号８）、ＶＰＧＳＧ（配列番号９）、ＶＰＧＶＧ（配列番号１０）、ＶＰＱＱＧ（配列番号１１）、ＧＲＧＤＳＰＡＳ（配列番号１２）、ＧＲＧＤＳＰＩＳ（配列番号１３）、ＧＲＧＤＳＰＶＳ（配列番号１４）、ＧＲＧＤＱＰＨＮ（配列番号１５）、ＧＲＧＤＮＰＨＱ（配列番号１６）、ＧＲＧＤＳＰＶ（配列番号１７）、またはこれらの組合せを含む、項１８～２５のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項２７．前記コアポリペプチドが、配列（ＲＬＰ）n（配列番号１）を含み、ｎが２０～２００の繰り返し数である、項１８～２６のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項２８．前記コロナポリペプチドが、配列（ＥＬＰ）ｍ（配列番号８）を含み、ｍが４０～２００の繰り返し数である、項１８～２７のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項２９．前記ジブロックが、
ＲＬＰ４０－ＥＬＰ４０（配列番号８３）、
ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）、
ＲＬＰ４０－ＥＬＰ１６０（配列番号８２）、
ＲＬＰ６０－ＥＬＰ８０（配列番号８５）、
ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）、
ＲＬＰ８０－ＥＬＰ１６０（配列番号８６）、または
ＲＬＰ１００－ＥＬＰ８０（配列番号８８）
を含む、項１８～２８のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項３０．前記標的化ポリペプチドが、２ｋＤａ～１００ｋＤａのポリペプチドを含む、項１８～２９のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項３１．前記結合ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）（配列番号６０）由来のＩＩＩ型ドメイン、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）（配列番号６２）由来のＦｎ３ドメイン、またはブドウ球菌タンパク質Ａ（配列番号６４）のＺドメインを含む、項１８～３０のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項３２．前記結合ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）（配列番号６０）由来のＩＩＩ型ドメインを含む、項１８～３０のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項３３．前記結合ポリペプチドが、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）（配列番号６２）由来のＦｎ３ドメインを含む、項１８～３０のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項３４．前記結合ポリペプチドが、（配列番号６４）を含む配列を有するブドウ球菌タンパク質ＡのＺドメインを含む、項１８～３０のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項３５．前記結合ポリペプチドが、ＥｒｂＢ２受容体結合タンパク質（ＡＮＨＰ）（配列番号７４）を含む、項１８～３０のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項３６．前記結合ポリペプチドが、細胞結合ペプチド（ＧＲＧＤＳＰＡＳ）（配列番号７６）を含む、項１８～３０のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項３７．前記結合ポリペプチドが、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）結合タンパク質（ＰＫＤ２）（配列番号１１２）を含む、項１８～３０のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項３８．前記結合ポリペプチドが、アデノウイルス（ＡｄＶ）結合タンパク質（ＣＡＲ）（配列番号１１４）を含む、項１８～３０のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項３９．前記結合ポリペプチドが、レンチウイルス（ＬＶ）結合タンパク質（ＣＲ２）（配列番号１１６）または（ＣＲ３）（配列番号１１８）を含む、項１８～３０のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項４０．前記結合ポリペプチドが、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）（配列番号１２０）を含む、項１８～３０のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項４１．前記コアが、光または他のクリックケミストリーに適合するリンカーを使用して共有結合的に架橋される、項２２～４０のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項４２．前記コアポリペプチドが架橋されている、項２２～４１のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項４３．前記ナノ粒子が、その内部に１種以上の低分子薬物を封入している、項１８～４２のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項４４．前記融合タンパク質が、治療用タンパク質をさらに含む、項１８～４３のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項４５．前記組成物が、治療剤、標的送達剤、分離剤、または精製剤である、項１８～４４のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
項４６．項１８～４５のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子を含む治療剤。
項４７．項１８～４５のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、治療薬を細胞に標的化する方法。
項４８．項１８～４５のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、治療薬を細胞に送達する方法。
項４９．項１８～４５のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、治療薬を細胞に標的化するための手段。
項５０．項１８～４５のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、治療薬を細胞に送達するための手段。
項５１．生体分子を同定するための方法であって、項１８～４５のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子が、前記生体分子を含有する溶液に添加され、前記タンパク質ナノ粒子が前記生体分子に特異的に結合する、方法。
項５２．生体分子を精製する方法であって、前記生体分子に結合する項１８～４５のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子を使用して、前記生体分子を培地または複合体マトリックスから単離することを含む、方法。
項５３．前記結合ポリペプチドの相分離をトリガーして、前記生体分子を汚染物質から単離することをさらに含み、前記トリガーが、温度、塩分、光、ｐＨ、圧力、前記結合ポリペプチドの濃度もしくは前記生体分子の濃度の調節、電磁波もしくは音響波の適用、または補因子、界面活性剤、クラウディング試薬、還元剤、酸化剤、変性剤、もしくは酵素のうちの１種以上を含む１種以上の賦形剤の添加から選択される、項５２に記載の方法。
項５４．遠心分離を使用して、前記生体分子に結合した高密度相分離タンパク質を汚染生体分子から分離することをさらに含む、項５２に記載の方法。
項５５．遠心分離を使用して、前記生体分子に結合した相分離タンパク質を汚染生体分子から分離することをさらに含む、項５２または５４に記載の方法。
項５６．相分離液滴のサイズを使用して、前記生体分子を汚染物質種から単離することをさらに含み、前記生体分子に結合した前記結合ポリペプチドのサイズが、直径で少なくとも２０ｎｍおよび１００μｍ以下である、項５２～５５のいずれか１項に記載の方法。
項５７．フロー濾過、膜クロマトグラフィー、分析的超遠心分離、高速液体クロマトグラフィー、膜クロマトグラフィー、正常フロー濾過、音波分離、遠心分離、カウンターフロー遠心分離、および高速タンパク質液体クロマトグラフィーを使用して、前記生体分子－結合ポリペプチド複合体をサイズに基づいて汚染物質種から単離することを含む、項５２～５６のいずれか１項に記載の方法。
項５８．脂質、細胞、タンパク質、核酸、炭水化物またはウイルス粒子のうちの少なくとも１種を含む生体分子であって、前記核酸が、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり、前記ウイルス粒子が、アデノウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス粒子、レンチウイルス粒子、レトロウイルス粒子、ポックスウイルス粒子、麻疹ウイルス粒子、またはヘルペスウイルス粒子であり、前記タンパク質が、ヒトアルブミン、モノクローナルＩｇＧ抗体、またはＦｃ融合抗体から選択される、生体分子。
（実施例１）
遺伝子合成
プラスミド遺伝子は、αｖβ３インテグリンに結合するＲＬＰ２０（配列番号１８－１９）、ＲＬＰ２０－ＥＬＰ８０（配列番号８１）、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）、ＲＬＰ１００－ＥＬＰ８０（配列番号８８）およびＦｎ３ドメイン（配列番号６０）について以前の研究から入手可能であった。次いで、この遺伝子を、Ｆｎ３ドメインをコードする遺伝子と融合させた。同様に、ＲＬＰ２０－ＥＬＰ８０（配列番号８１）、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）をコードする遺伝子を、同方向ライゲーション法でＦｎ３（配列番号６０）のＮ末端にクローニングした。サンガー蛍光ＤＮＡ配列決定による遺伝子アセンブリの確認に成功した後、各構築物を保有するプラスミドを単離し、大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）発現株に形質転換させた。細胞ストックのアリコートを、さらなる使用まで－８０℃で保存した。
タンパク質の精製
各ブロックポリペプチドを、以前に公表された過剰発現プロトコルを使用して、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌で発現させた。５ｍＬの細菌培養物を凍結グリセロールストックから一晩増殖させ、これを使用して、４５μｇ／ｍＬのカナマイシンを補足したＴＢドライの１Ｌフラスコに接種した。次に、フラスコを３７℃で２４時間、１９０ｒｐｍでインキュベートした。各構築物を、逆相転移サイクリング（ＩＴＣ）を用いて精製した。簡潔に述べると、細胞懸濁液を４℃で１０分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離し、細胞ペレットをＰＢＳ中に再懸濁した後、氷上で２分間超音波処理により溶解させた（１０秒オン、４０秒オフ）（Ｍｉｓｏｎｉｘ Ｓ－４０００；Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）０．７％ｗ／ｖを溶解物に添加し、核酸汚染物質を沈殿させた。次いで、上清を、以下のように複数ラウンドのＩＴＣに通した：溶液を氷上に保持し、３ＭのＮａＣｌを添加して、ＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドの相転移を等温的にトリガーした。次いで、コアセルベートを３０℃で２０分間、１４，０００×ｇで遠心分離し、上清をデカントして廃棄し、ペレットをリン酸緩衝液中に再懸濁した。溶解生成物を４℃まで冷却した後、４℃で１０分間、１５，０００×ｇで遠心分離し、不溶性汚染物質を除去した。精製したタンパク質溶液から過剰の塩を除去するために、試料を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（商標）Ｌａｂｓ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（商標）２ １２－１４標準ＲＣ乾燥透析キット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、４℃で少なくとも２４時間、ｄｄＨ2Ｏに対して透析した。次に、タンパク質を凍結乾燥し、－２０℃で保存した。ブロックポリペプチドの純度を、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって評価した。
相分離の特徴付け
温度依存性紫外可視分光光度測定法
温度制御紫外可視分光光度計（Ｃａｒｙ３００Ｂｉｏ；Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）で温度（１℃／分 ランプ）の関数として光学密度を記録することによって、各構築物について濁度プロファイルを得た。転移温度（Ｔt）を、濁度プロファイルの変曲点として定義した。試料をＰＢＳ中１０μＭで測定した。可溶性の場合、より大きなミセルを形成するブロックコポリペプチドの一部はわずかに濁っていたため、全ての測定は、ＰＢＳでゼロ化した後に行った。
静的および動的光散乱
静的および動的光散乱測定（ＳＬＳ／ＤＬＳ）は、ＡＬＶ／ＣＧＳ－３ゴニオメーターシステム（Ｌａｎｇｅｎ、ドイツ国）を用いて実施した。ＡＬＶ／ＣＧＳ－３ゴニオメーターシステム用の試料をＰＢＳ中１０μＭの濃度で調製し、０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘ－ＧＶフィルターを通して１０ｍｍの使い捨てホウケイ酸ガラスチューブ（Ｆｉｓｃｈｅｒ）に濾過した。５°刻みで３０°～１５０°の角度について、ＥＬＰの１５℃でＳＬＳおよびＤＬＳの同時測定を行い、各角度は１５秒間３回のランで構成した。ＳＬＳ実験は、単一ブロックコポリペプチド鎖の分子量は既知であり、単一鎖のＲgはＳＬＳ機器の検出限界以下である可能性が高いため、自己集合ブロックコポリペプチドに対してのみ実施した。示差屈折率（ｄn／ｄc）は、Ａｂｂｅｍａｔ５００屈折計（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ、Ｇｒａｚ、オーストリア国）を用いて異なる濃度で屈折率を測定することによって決定した。内蔵のＡＬＶソフトウェアを用いて、自己相関関数をキュムラント適合に適合させることにより、ＤＬＳデータを分析した。流体力学的半径（Ｒh）を角度に対してプロットし、ゼロに外挿した。Ｒgおよび分子量（ＭＷ）を決定するために、ＡＬＶＳＴＡＴソフトウェアを使用して部分ＺｉｍｍプロットによりＳＬＳデータを分析した。
温度プログラムされた動的光散乱
０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘ－ＧＶフィルターを通して濾過した試料を用いて、ＤｙｎａｐＲｏプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して、温度プログラムされた動的光散乱実験を行った。データを１℃単位で収集し、キュムラント適合流体力学的半径を半径とした。Ｔtは、数百ナノメートルのサイズの凝集体が形成された温度として定義された。
低温透過型電子顕微鏡検査法
クライオＴＥＭ実験は、デューク大学のＳｈａｒｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）で実施した。レース状穴開カーボングリッド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）をＰＥＬＣＯ ＥａｓｉＧｌｏｗ Ｃｌｅａｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）内でグロー排出した。３μＬのドロップ（１０μＭ ＲＬＰｎ－ＥＬＰ８０）をグリッド上に堆積させ、－３ｍｍのオフセットで３秒間ブロットし、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＩＩ（ＦＥＩ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、オランダ国）を使用して液体エタン中でガラス化した。ガラス化の前に、試料の蒸発を防止するために、試料チャンバーを１５℃および１００％相対湿度に維持した。グリッドをＧａｔａｎ６２６クライオホルダー（Ｇａｔａｎ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）に移し、８０ｋｅＶで動作するＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｔｗｉｎ ＴＥＭ（ＦＥＩ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、オランダ国）で撮像した。特徴サイズおよび間隔距離は、ＩｍａｇｅＪで少なくとも２５個の粒子を手動で測定することによって測定した。
表面プラズモン共鳴分光光度測定法
表面プラズモン共鳴実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用して実施した。精製したヒトαｖβ３インテグリン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を、アミンカップリングキット（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、研究グレードのＣＭ５センサーチップ上で固定化した。インテグリンを１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中で希釈し、約６００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度でコンジュゲーションした。結合事象の測定は、２．５～１０μＭの範囲のブロックコポリペプチド濃度を使用して行った。ブロックポリペプチドを、２ｍＭ ＣａＣｌ2を補足したＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、ｐＨ７．４）中で希釈し、３０μＬ・分-1の流速で４分間フローセル中に注入した。複合体を１０分間解離させた。表面を１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を用いて流速３０μＬ・分-1で４５秒間、続いて１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．０）を用いて流速３０μＬ・分-1で３０秒間再生した。表面を、１０ｍＭグリシン－ＨＣＬ（ｐＨ２．０）を使用して再生した。動態モデリングおよびシミュレーションは、自己集合タンパク質のための不均一リガンドモデルおよびユニメリックタンパク質のための１：１リガンドモデル（ＲＬＰ２０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３）を用いて、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して実施した。各実験の平衡結合定数（ＫD1およびＫD2）を、動力学的解離速度（ｋoff）を会合速度（ｋon）で除して算出し、ここから平均ＫD1/2を導出した。全てのＳＰＲ測定は２５℃で実施した。ＳＰＲ測定は、２．５～１０μＭの範囲のポリペプチド濃度を用いて実施した。残差プロットと残差二乗和を解析して適合度を評価した。
フローサイトメトリー
約１×１０6個の細胞を、Ｋ５６２またはＫ５６２＋ αｖβ３細胞株のいずれかから採取し、様々なＦｎ３装飾および対照ブロックポリペプチドを１０μＭ含有する１ｍＬの無血清培地に再懸濁した。ＬＭ６０９抗体もまた、無血清培地中に１０μＭで再懸濁した。モル基準で約１０％のＡｌｅｘａ４８８色素標識ＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドおよび９０％の非標識ポリペプチドの混合物から、ミセルを調製した。細胞を、３７℃で、標識ミセルと共に所定の時間インキュベートし、次いで１ｍＬのＨａｎｋｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）で濯ぎ、５００ＲＣＦで５分間、２０℃で遠心分離して回収し、ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁した。細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ５）によって分析するまで氷上で維持した。Ａｌｅｘａ４８８（緑色）の細胞蛍光強度を、未染色の対照試料上の細胞破片を除去するゲーティング後に定量化した。
共焦点顕微鏡
約１×１０6個の細胞を、Ｋ５６２またはＫ５６２＋ αｖβ３細胞株のいずれかから採取し、様々な修飾および未修飾ブロックポリペプチドを１０μＭ含有する１ｍＬの無血清培地に再懸濁した。細胞を３７℃で様々な時間（２０～２４０分）インキュベートした。ＨＢＳＳで３回洗浄した後、２０μＬの細胞懸濁液を底部に＃１．５カバースリップを有する３８４ウェルプレートに添加した。細胞を、３７℃で維持された生細胞チャンバーを備えたＺｅｉｓｓ７１０反転共焦点（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ国）で、４０×油浸対物レンズを使用して撮像した。
共焦点画像解析
ポリペプチドの取り込みを示す細胞の割合の解析のために、蛍光チャネルおよびＤＩＣチャネルを単離し、独立して解析した。蛍光チャネルでは、ナイーブＫ５６２細胞からの自己蛍光を排除するために、細胞蛍光の下位１０％を除去した。このカットオフを使用して、緑色蛍光の位置および面積を、蛍光チャネルのみを使用して同定した。次いで、ＤＩＣチャネルを使用して、細胞の総数をカウントした。
フルオロフォア標識
ＲＬＰ－ＥＬＰ－Ｆｎ３融合体におけるＮ末端およびリジン残基を、Ａｌｅｘａ４８８のＮＨＳ－エステル誘導体で標識した。反応をＮ末端標識に偏らせるために、反応混合物のｐＨを８．３に調整した。０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解したＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドを、モル過剰の色素（リジン残基およびＮ末端を含むタンパク質中の反応性基の総数に応じた色素対タンパク質モル比（例えば、色素：ＲＬＰ20＝２：１、色素：ＲＬＰ20－Ｆｎ３は５：１）を有する）と共に、室温で２時間、連続攪拌しながらインキュベートした。過剰の色素を、反応混合物のミリＱ水に対する１：５００の体積比で、４℃で３日間にわたって３ラウンド透析して除去した。試料を凍結乾燥し、－２０℃で保存した。
（実施例２）
ＵＣＳＴおよびＬＣＳＴ相の挙動を有するブロックコポリペプチドを組み合わせて、予測可能なナノスケール集合を有するミセルを生成することができる。
第１の調査領域は、ＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドの親水性質量分画の効果であった。コアブロック配列は（Ｇｌｎ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ）－ＸＸ（ＲＬＰＸＸ）（配列番号１）であり、コロナ配列（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－［Ａｌａ／Ｇｌｙ］－Ｇｌｙ）－ＹＹ（ＥＬＰＹＹ）（配列番号８）であり、ゲスト比はＡｌａとＧｌｙとの間で５０／５０であった。コアブロックのサイズは、（Ｇｌｎ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ）の２０、４０、６０または８０繰り返し単位であるように制御し、コロナブロックは、（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－［Ａｌａ／Ｇｌｙ］－Ｇｌｙ）－ＹＹ（配列番号８１、８４、９３、８７）の８０繰り返しであった。
散乱実験から、これらのポリペプチドの集合について、いくつかの詳細が理解される（表１）。まず、ＲＬＰ２０－ＥＬＰ８０は、完全に可溶性の約４７ｋＤａのポリマー鎖に従って、５．５ｎｍの流体力学的半径を有するため、自己集合しない。第二に、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０とＲＬＰ６０－ＥＬＰ８０は共に、Ｒhが５０ｎｍ未満、Ｒgが４０ｎｍ未満、形状因子が１未満、凝集数が２５０未満の構造に自己集合する。半径、形状因子および凝集数の組合せは、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０およびＲＬＰ６０－ＥＬＰ８０の両方が球状ミセル内に自己集合する可能性が高いことを示している。第３に、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０は、１００ｎｍを超える流体力学的半径、１４０ｎｍを超える回転半径、約１．２の形状因子、および数千の鎖の凝集数を有する、はるかに大きな構造に自己集合する。これらの結果は、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０が、はるかに大きな非球状構造に自己集合することを示している。
Figure 2023516312000003

クライオＴＥＭの結果は、動的および静的光散乱の両方の疑問を確認する（図４）。全ての構築物のいくつかの重要な観察は、ナノ構造が互いに空間的に非常に近接していることであり、これらの構造がオーバーラップレジームの近くにあることを示している。試料調製は、理論的には、希釈レジームにおいて、１０μＭであった。したがって、これらの構造の濃度は、ガラス化プロセスによって人工的に増加する。
しかしながら、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０の調製濃度を１００μＭおよび１ｍＭに上げることは、クライオＴＥＭによって観察された構造に影響を及ぼさなかったようである（図５）。したがって、自己集合形態は広範囲の濃度独立性を有し、クライオＴＥＭで観察される形状が光散乱データと一致することが期待される。最後に、おそらくは水分量が多く、水とのコントラストが低いことに起因して、サンプリングされたいずれのＲＬＰ－ＥＬＰについてもコロナ鎖を視覚化することができなかった。
ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）およびＲＬＰ６０－ＥＬＰ８０（配列番号９３）（図４）は共に、球状ミセル内に自己集合する。この結果は、ＤＬＳデータおよびＳＬＳによって示唆され、クライオＴＥＭによって確認された。コア半径の測定は、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）およびＲＬＰ６０－ＥＬＰ８０（配列番号９３）コアが、より大きなミセルコアにつながるより大きなコア形成ブロックと一致する約１２．８ｎｍおよび１７．５ｎｍであることを示す。これは、ＲhとＲgがミセルのコア部分とコロナ部分の両方を組み込むのに対し、クライオＴＥＭによってミセルコアのみが直接観察されるため、より大きな値が光散乱によって報告されることと一致する。間隔は、両方とも２９．５ｎｍで同様であり、これは、両方のブロックコポリペプチドが、同じ形態および同じコロナ形成ＥＬＰブロックを有するため、一貫している。
クライオＴＥＭは、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）（図４）が異なるナノ構造を形成することを明らかにする。これらのブロックコポリペプチドは、長い円筒構造を形成する。再び、コアブロックのサイズが１７．５ｎｍから１９．９ｎｍに明らかに増加し、２８．９ｎｍから３４．７ｎｍへ間隔が増加することは、コアブロックのサイズの増加と一致する（ただし、コアサイズの増加は有意ではない）。これらの重なり合った構造は、ラメラ形成とより一貫しており、したがって、この濃度では、円筒のアスペクト比は、クライオＴＥＭでは観察できない。
Figure 2023516312000004

全親水性質量分画またはブロック長がミセル形態の主な駆動力であるかどうかを試験するために、特定の親水性質量分画を維持しながら全長を変化させた。これにより、６４．７％（ＲＬＰ２０－ＥＬＰ８０（配列番号８１）およびＲＬＰ４０－ＥＬＰ－１６０（配列番号８２）），４７．４％（ＲＬＰ２０－ＥＬＰ－４０（配列番号８０）、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ－１６０（配列番号８６））および３０．９％（ＲＬＰ４０－ＥＬＰ－４０（配列番号８３）、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７））の全親水性質量分画の比較が行われた。
前述のように、親水性質量が６４．７％のＲＬＰ２０－ＥＬＰ８０は集合しなかった。しかしながら、コロナおよびコア（ＲＬＰ４０－ＥＬＰ１６０）（配列番号８２）のブロック長を２倍にすると、Ｒgが７０．８ｎｍ、Ｒhが９２．３ｎｍ、形因子が０．８の集合構造となり、球状ミセル形態を示す。この結果は、クライオＴＥＭで確認され、これにより、平均コア半径が１１．０ｎｍであり、粒子コア間の間隔が２２．３ｎｍである球体が明らかになった。
Figure 2023516312000005

ＲＬＰ２０－ＥＬＰ４０（配列番号８０）、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ１６０（配列番号８６）は共に、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）を有する球状ミセルを示した４７．４％の全親水性質量分画に起因して、球状ミセルに集合することが予想される。しかしながら、ＲＬＰ２０－ＥＬＰ４０は集合せず、３２ｋＤａ鎖と一致する５．３ｎｍの可溶性Ｒhを有した。これは、十分な集合ドメインサイズを有さない３２ｋＤａ鎖として説明することができる。ＲＬＰ８０－ＥＬＰ１６０（配列番号８６）は、Ｒgが７８．２ｎｍ、Ｒhが９３．３ｎｍおよび形因子０．８で集合し、球状ミセルを示す。
クライオＴＥＭ撮像によりこの結果が確認され、興味深いナノ構造情報が得られた（図６）。これらのミセルのコアは、２９．３ｎｍの半径を有し、コア内間隔は５９．０ｎｍであった。このコア寸法は、円筒形のミセル形成をとったＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）よりもはるかに大きく、より大きな球のコアが円筒形のミセルよりも球状のミセルでより膨張していることを示す。この結果は、球の鎖はロッド状コンフォメーションよりも伸長されると予想されるため、合成ポリマーミセルの理論から直接予測され得る。加えて、ＥＬＰ鎖のサイズが２倍になるため、コア内の間隔がはるかに大きくなることが観察される。
Figure 2023516312000006

最後に、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ４０（配列番号８３）は、Ｒgが５６．２ｎｍ、Ｒhが５２．６ｎｍであり、形因子が１より大きい非球状ジオメトリを採用する可能性が高い。これは、同様のコンフォメーションをとったＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０と同等である。コア半径（１１．８ｎｍ）および間隔（１９．５ｎｍ）はいずれも、より大きなポリマーよりも小さく、これは、より小さいコアおよびコロナ鎖と一致する。コアサイズは、形態が異なる他の集合構造のコア半径とほぼ同じサイズである。
親水性質量分画の効果以外のもう一つの重要な設計パラメータは、コロナ親水性の効果である。したがって、より疎水性のゲスト残基Ｖａｌ（Ｖ）およびより親水性のゲスト残基Ｓｅｒ（Ｓ）を、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０、ＲＬＰ６０－ＥＬＰ８０、およびＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８９～９４）に置換した。我々の仮説は、Ｖａｌの導入が、より球状からよりロッド状の集合につながるコロナ鎖反発を減少させるというものである。Ｓｅｒは、より多くの鎖反発をもたらし、ロッド状から球状への転移を駆動するであろう。
Ａｌａ／ＧｌｙのＶａｌへの置換は、光散乱データの球状からワームへのシフトをもたらす（表５）。ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）（球状）およびＲＬＰ４０－ＥＬＰＶ８０（配列番号９２）を比較すると、ＲＬＰ４０－ＥＬＰＶ８０（配列番号９２）の凝集数が多く、Ｒg値が大きくなり、結果、ρ＞１となる。これらの２つのポリマーは、ほぼ同一の分子量および全く同一の鎖長を有するため、ＲＲＬＰ４０－ＥＬＰＶ８０（配列番号９２）は、より細長い構造を形成していると推測することができる。同様の増加は、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ－８０（配列番号８４）と比較して、ＲＬＰ４０－ＥＬＰＶ８０で見られる。Ａｌａ／Ｇｌｙ構築物と同様に、Ｎagg、Ｒg、およびＲhは、コアブロック長が増加するにつれて増加するが、形因子は＞１のままであり、これは、全てのＶａｌ構築物が、ワーム状ミセルであることを示す。
Figure 2023516312000007

一方、ＲＬＰ４０－ＥＬＰＳ８０（配列番号８９）は、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）とほぼ同じＮagg、ＲgおよびＲhを有する。これは、両方の構築物が球状ミセルであることを示すであろう。興味深いことに、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０中のアラニンおよびグリシンに対するセリンの置換は、Ｎagg、Ｒg、Ｒhを減少させ、これにより形因子が１未満となると思われる。これは、この置換が、ワーム状のミセルから球状への形態のシフトをもたらしたことを示すであろう。Ａｌａ／Ｇｌｙ構築物およびＶａｌ構築物と同様に、Ｎagg、Ｒg、およびＲhは、コアブロック長が増加するにつれて増加するが、形因子は１未満に留まり、全てのセリン構築物が球状であることを示す。
光散乱データによって疑われるように、Ａｌａ／ＧｌｙからＶａｌへの置換は、クライオＴＥＭ撮像に従って球状からワーム状ミセルへのシフトをもたらした。図７では、親水性質量分画を増加させると、ワームは漸進的に長くなるが、コア半径はほぼ同じサイズのままであり（表６）、最終的に相互接続ネットワークとなることが分かる。ＳｅｒによるＡｌａ／Ｇｌｙ置換は、球状ミセルしか形成できないほどコロナ反発を増加させるようである。
Figure 2023516312000008

鎖間の反発を増加または減少させる（またはおそらく鎖の占有体積を変更させる）コロナ配列への変化に加えて、同じ実験を、今度は、コア配列で実施を試みた。以前の研究から分かっているように、ＶａｌをＴｙｒに置換すると、飽和濃度が上昇し、高密度相の密度が低下する。したがって、この同じ置換が粒子のコアに同様の効果を生み出し、コア占有体積を増加または減少させ、おそらく自己集合構造を変化させるだろうと仮定した。ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）およびＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号９１）コア繰り返し配列に変異を生じさせ、（ＱＹＰＳＤＧＲＧ）（配列番号１）を（ＧＲＧＤＳＰ［Ｙ］Ｓ）（配列番号６～７）に置き換え、新たな繰り返し単位におけるＴｙｒを、系統的にＶａｌに置き換えた。骨格に沿ったＴｙｒの系統的な置き換えが、より球状の粒子からより細長い散乱構造への転移をもたらすことが、両方のコア分子量について観察された（図８）。具体的には、コアの繰り返し数８０で、３つ全ての転移状態、ワーム状ミセルに転移する球状ミセルまたはラメラおよびベシクル構造を観察する。特に、このベシクル構造については、様々なクライオＴＥＭ撮像フレーム全体にわたって追加的なコントラスト領域が存在するため、ワーム状構造との二相平衡にあるように見える。これらのベシクルの集合もかなり広範囲であり、繰り返し単位の単分散性にもかかわらず、様々な形状、サイズ、および多層構造が同時に形成される。
ブロックアーキテクチャの変更に加えて、これらの動的分子の集合に影響を及ぼし得るものは、溶媒の品質に影響を及ぼし得る。この影響の劇的な例は、図９に見ることができ、（ＧＲＧＤＳＰ［Ｙ：Ｖ］Ｓ）８０－ＥＬＰ８０（配列番号１１０）の緩衝液を、１４０ｍＭ ＰＢＳから、コアにとって貧溶媒でコロナにとって優れた溶媒である水に変更することは、集合をベシクル／ワーム状ミセルから球状ミセルに変化させる。これは、化学配列の変化が鎖の体積に影響を及ぼし、したがって疎水性の改変が鎖レベルでの物理的改変ももたらすという我々の仮説を裏付けるさらなる証拠である。
コア鎖およびコロナ鎖に対するこれらの改変は全て、これらのミセル構築物の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の測定を促した。したがって、粒子のコア内のＣＭＣカプセル化ピレンを測定するために、実験室で十分に開発された技術を採用した。溶液の極性に応じて、ピレンは、ピーク１および３（Ｉ１およびＩ３）の異なる蛍光シグナルを示す。ＣＭＣを上回る濃度になると、ピレンは粒子のコアによって隔離され、このＩ１およびＩ３の比率を調節する。ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）およびＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号９１）について、これらのミセルが以前に測定されたブロックコポリペプチドよりもわずかに安定であることを示唆するＩ１／Ｉ３比の減少点（図１０）に従って、１００～５００ｎＭのＣＭＣを近似させる。興味深いことに、このＩ１／Ｉ３比を種々の溶媒について表にまとめると、粒子の内部の極性が水（１．８）よりもアセトン（１．４）に近いことが示唆される。したがって、これらのミセルがブロックコポリマーミセルと同様の疎水性部分を隔離することができると仮定した。この目的のために、類似した集合寸法を有するが異なるコア化学を有することを意図した一連のＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０タンパク質を設計した。コア配列について、いずれも類似のＵＣＳＴバイノーダル線を有するが、強度が異なるＨ結合を薬物と形成し得る様々な非荷電極性残基を有する（ＧＲＧＤＳＰＹＳ）（配列番号２４）、（ＧＲＧＤＳＰＹＱ）（配列番号２２）および（ＧＲＧＤＱＰＹＱ）（配列番号２０）を選択した。低分子薬物については、水性溶媒に不溶性であり、その送達ビヒクルに関連する副作用を受けるパクリタキセルを選択した。
これらの粒子を使用して、Ｈ2Ｏまたは３０％アセトン＋Ｈ2Ｏ混合物中の１０×モル過剰のパクリタキセル（ＰＴＸ）の存在下で、ポリペプチド鎖を４℃で一晩インキュベートし、可溶性の集合ミセルを、大過剰の不溶性ＰＴＸの存在下で維持した（図１２）。次に、Ｈ2Ｏ試料中の不溶性ＰＴＸを遠心分離し、アセトンをミリＱ Ｈ2Ｏに透析し、遠心分離により透析後の不溶性ＰＴＸも除去した。次いで、１００％アセトニトリルを終濃度３０％ｖ／ｖで添加して、ミセルを完全に溶解させ、ＰＴＸをＰＴＸ＋タンパク質の均質な混合物に再懸濁した。この試料を、Ｃ12分析ＨＰＬＣカラムにかけて、タンパク質ピークおよびＰＴＸピークを分離する。２３０ｎｍおよび２７５ｎｍそれぞれにおけるＰＴＸおよびタンパク質のピークの相対サイズおよび既知の吸光係数を用いて、非ビヒクル対照から減算した後に可溶性のままであったタンパク質に対するＰＴＸのモル比を決定することができる。本質的に、この経験は、様々なミセル系の存在下でのＰＴＸの溶解度の増加の程度を示す。この懸濁液濃度の増加は、粒子のコアへの隔離によるものであると推測される。
結果は、様々なＲＬＰ－ＥＬＰミセルが、通常不適切な溶媒中のＰＴＸの観察される溶解度を増加させることができるという結論を支持する。アセトンを共溶媒として使用した場合、アセトンと同様の極性を持つ粒子のコアに容易に拡散できるため、積載量が飛躍的に増加することが観察される。また、一次アミノ酸配列がこの分割係数を２～３倍制御できることが示唆される、微妙な粒子化学間の劇的な違いも観察された（図１１および図１３）。最も優れたパフォーマンスのケースである、Ｓｅｒに対して１００％のＧｌｎ置換では、ＰＴＸ対タンパク質で達成された類似のコンジュゲーション効率に対応するＰＴＸ／タンパク質モル比が観察された（１００％のＧｌｎ置換のケースでは、タンパク質鎖あたり約８ＰＴＸ）。したがって、この物理的積載手順により、ＬｙｓまたはＣｙｓ残基への直接的な化学コンジュゲーションとは対照的な代替的送達スキームを提供し得ることが示唆される。
（実施例３）
ＵＣＳＴおよびＬＣＳＴ相の挙動を有するブロックコポリペプチドは、タンパク質およびペプチドリガンドの多価提示のために組み合わせることができる
このＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドプラットフォームを用いて、多価提示が可能なミセルの開発を試みた。ヒトαｖβ３インテグリンを標的とするヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）からの第１０のタイプＩＩＩドメインを標的ドメインに選択した。このドメインは、多くの腫瘍の内皮で上方調節され、神経膠芽腫、腎細胞癌、卵巣癌および乳がん転移などのいくつかの腫瘍細胞で過剰発現されている受容体である。我々は、低親和性（ＫD＞１×１０-7Ｍ）でαｖβ３インテグリンに結合し、ＥＬＰ等の繰り返しのポリペプチドへの融合体として大腸菌で発現させることができるＦｎ３バリアントを選択した。親Ｆｎ３ドメインの低親和性は、多価提示が、本質的に高い親和性を有するリガンドでは不可能であり得るそのアビディティを増幅することができ、結合アビディティおよび細胞取り込みに対する自己集合および多価性の影響について試験することができるため、重要である。
発現ベクターでの遺伝子の集合後、各ベクターを大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、以前に公開されたプロトコルによって過剰発現させた。ブロックコポリペプチドを細胞溶解物の可溶性分画から単離し、非クロマトグラフィー法である逆相転移サイクルにより、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定される純度＞９５％まで精製した（図１４）。全てのポリペプチドの収率は、発現プロトコルの任意の最適化なしに、＞２０ｍｇ・Ｌ-1シェーカーフラスコ培養物であった。他のＦｎ３発現および精製スキームの典型は５～２０ｍｇ・Ｌ-1である。
各ブロックコポリペプチドを、４℃～３７℃のいくつかの温度での動的光散乱（ＤＬＳ）によって解析して、ミセルの熱安定性を決定し、それらの水和半径（Ｒh）を決定した。ＲＬＰ２０－ＥＬＰ８０（配列番号８１）およびＲＬＰ２０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９５）のＲhは約７ｎｍであり、そのＲhは、類似の分子量を有する変性タンパク質および類似のサイズの他のエラスチン様ポリペプチドのもの（Ｒh約８ｎｍ）に類似しているため、これらの構築物がこの温度範囲内で集合せず、可溶性の無秩序ポリペプチドとして存在することが示された。対照的に、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）およびＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９６）は、２０～３７℃でそれぞれ３０および３２ｎｍのＲhでミセル内に自己集合した（図１５）。
同様に、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）（１１２ｎｍ）およびＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７）（４７ｎｍ）は、同じ温度範囲にわたって安定なミセルを形成した（図１６）。
興味深いことに、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）のＲhは、ブロックコポリペプチドの親水性Ｃ末端上のＦｎ３ドメインの提示によって劇的に影響を受ける（表７）。
Figure 2023516312000009

この結果は、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）が、球状およびワーム状のミセルを分離する相境界の縁に存在するため、理にかなっている。したがって、小さな折り畳まれたタンパク質を組み込むことは、形状の変化をもたらす可能性があり得る。また、３６～４０℃でＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９６）のＲhに急速な増加があるため、Ｆｎ３ドメインは３７℃を超える温度では安定していないようである。この結果に基づき、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡検査の前に試料を氷上に維持した。
以前の結果から、３０～４０ｎｍの範囲のＲhを有するミセルは球状である可能性が高いが、Ｒh＞１００ｎｍのミセルは構造が円筒状またはワーム状である可能性が高いと推測した。これらの粒子の形態を推測し、それらの凝集数（Ｎagg）を計算するために、次に静的光散乱（ＳＬＳ）測定を行った。コア形成ブロックのサイズを（ＱＹＰＳＤＧＲＧ）（配列番号１）の繰り返し数を４０から８０へ増加させると、ミセルあたり、回転半径（Ｒg）が２９ｎｍから３９ｎｍへ、Ｒhが２９ｎｍから４９ｎｍへ、Ｎaggが２０１鎖から６３０鎖に増大する（表７＆図１７）。
これらの結果は、より大きな粒子は、より小さい粒子よりも高いアスペクト比を有することを示唆する。残念ながら、形因子（ρ＝Ｒg／Ｒh）は、推定的に異なる形態を有する粒子間で劇的に変化しなかったため、ＳＬＳの結果は決定的ではなかった。典型的には、ρは、０．７前後の球の典型的な値を有する粒子の形態に依存し、散乱分子がより細長くなる（すなわち、円盤形、円筒構造）につれて増加する。したがって、次に、クライオＴＥＭで粒子を直接可視化して、その形態を確認した。
ＥＬＰベースのミセルの以前の研究により、ミセルの脱溶媒和コアは、周囲の水よりも有意な差別化コントラストを有するため、クライオＴＥＭによって可視化され得ることが実証されているが、コロナは溶媒和しすぎて可視化できない。コア形成ＲＬＰブロックサイズを、Ｆｎ３ドメインを含まずに４０から８０単位に増加させる（それぞれ図１８Ａ、Ｂ）ことにより、形態が、球状ミセルからワーム状ミセルに転移したことが先に報告されている。これらのミセルのコアは、直径が２４ｎｍから５９ｎｍに増加し、粒子間の間隔が２７ｎｍから４２ｎｍに変化し、コロナＥＬＰ鎖の伸長を示した（表８）。ＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９５～９７）も同様に挙動する。コアサイズを増加させることにより、ミセルのコア直径が２７ｎｍから５１ｎｍに、コア間隔が２７ｎｍから４２ｎｍに増加した（それぞれ図１８Ｃ、Ｄ）。
Figure 2023516312000010

画像分析により、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９６）がアスペクト比＜２で９０％超の粒子を有するのに対し、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７）はアスペクト比＜２で４５％のミセルを有する（図１９）ので、集合へのシフトが示唆される。
これらの結果は、いずれも、形態が、球状ミセルから、球状ミセルおよびワーム状ミセルの混合物にシフトしていることを示している。これらの結果はまた、コアブロック長の増加がミセル形態を伸長させ、コロナにおける鎖の密度を増加させ、親ブロックコポリペプチドの全体的な形状を維持することを示すＤＬＳおよびＳＬＳ実験測定値を裏付けている。
次に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ヒトαｖβ３インテグリンのエクトドメインに対するＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９５～９７）融合物のアビディティを特徴付ける。ＳＰＲセンサーグラムを、２．５～１０μＭの範囲の濃度でのＦｎ３機能化ＲＬＰ－ＥＬＰ８０ブロックコポリペプチドの結合のために生成した。動態会合および（ｋon）および解離定数（ｋoff）を図２０に要約する。コアブロックのサイズが増加するにつれて、ｋonの大きさが増加し、ｋoffの大きさが減少し、いずれも結合単位（ユニマーまたはより大きな直径のミセル）のサイズの増加と一致する。以前の研究に見られるように、Ｆｎ３装飾球状ミセルは、自己集合しないＲＬＰ２０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９５）構築物と比較して、αｖβ３インテグリンに対する１０倍のアビディティの増加を示し、したがって、Ｆｎ３ドメインの単一のコピーのみを提示する。興味深いことに、粒子を球状からワーム状のジオメトリに細長くすると、モノマーリガンドと比較してインテグリンのアビディティが約１０００倍増加し、アビディティをピコモル濃度に駆動することができる（図２０）。この結果は、αｖβ３インテグリンのマイクロモル範囲にＫDを有するＦｎ３の非最適化性質を考えると顕著である。ＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３ワーム状ミセルの有効ＫDは、実際に、約２０ｎＭのＫDを有する臨床的に関連する治療抗体－ＬＭ６０９－よりも、かなりの桁数低いものである。文脈上、これらの結合定数は、標的がん治療標的化のために使用される抗体の上位閾値にあり、それらの臨床的関連性を強調する。
これらの粒子の細胞内取り込みを評価するために、αｖβ３インテグリンで安定的にトランスフェクトした細胞株を使用した。天然細胞株Ｋ５６２は、この受容体の発現レベルが内因的に低いため、受容体陰性対照として機能し、未装飾のＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ８０ミセルは、各種－サイズおよび形状－のミセルについてのリガンド陰性対照として機能する。細胞を１０μＭ溶液の種々のブロックコポリペプチド溶液と共に３７℃で２時間インキュベートした。この濃度は、全てのミセルのＣＭＣおよびＫDを大きく上回っている。共焦点顕微鏡法を最初に使用して、αｖβ３インテグリントランスフェクト細胞株によるブロックコポリペプチドの内在化を研究した。リガンド陰性球状ミセルは、低レベルの取り込みを示し、一方、リガンド陰性ワーム状ミセルの取り込みは、ナノ粒子の非特異的取り込みを制御する役割を果たす以前の観察と一致して、わずかに高いレベルであった（図２１Ａ）。
しかしながら、Ｆｎ３装飾ミセルについては、はるかに劇的な違いが見られた。ＷＴ－非トランスフェクト－細胞株の自己蛍光のレベルをわずかに上回る低レベルの取り込みを示した親の球状ミセル（図２１Ａ）と比較して、球状ミセルを形成するＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ８０ブロックコポリペプチド上のＦｎ３ドメインの提示は、細胞膜内の粒子の数（図２１Ｂ）および細胞の平均蛍光によって定量化されるように、その取り込みを有意に増加させた（ｐ＜０．００１の対応のないスチューデントｔ検定）。
Ｆｎ３リガンド装飾ワーム状ミセルは、同様に、親ワーム状ミセルと比較して、はるかに高いレベルの細胞取り込みを示した（図２２）。対照的に、Ｋ５６２細胞上のαｖβ３インテグリンの過剰発現なしでは、球状およびＦｎ３装飾ミセルの内在化および取り込みのレベルが低く、リガンド装飾ミセルの内在化のほとんどがリガンド－レセプター係合によって駆動されることが示された（図２３）。
ＬＭ６０９抗体は、ＲＬＰ－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３ミセルとは全く異なる細胞取り込みを示した。高レベルの蛍光を有するが（図２２）、蛍光の多くは細胞膜に局在し、特にＦｎ３装飾ミセルと比較して細胞内蛍光のレベルがはるかに低く、この抗体－インテグリン結合事象が内在化をトリガーしないことを示す。
次に、フローサイトメトリーを用いて、細胞取り込みの定量を行った。未染色のＫ５６２細胞は、２９１２±３２３６（幾何平均±標準偏差）の細胞蛍光バックグラウンドを有していたが、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）球状ミセルと共にインキュベートすると、８６８６±８７８７に増加し、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０球状ミセルの場合は２４９０４±１３８８４に増加し（図２４）、ミセルの低レベルではあるが形状依存的な非特異的取り込みがあることを示した（ｐ＜０．００１、対応のないスチューデントｔ検定）（図３Ｂ）。
陽性対照であるＬＭ６０９抗体は、αｖβ３インテグリンに対するその既知の特異性と一致する３６７０８±２５５１７５の統計的に有意に高い取り込みを有した（図２５）。フローサイトメトリーデータを詳しく見ると、図２４の２つの異なるピークによって見られるように、細胞集団を発現する高レベルおよび低レベルの受容体が存在することが示される。興味深いことに、ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９６）によって形成された球状ミセルおよびＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７）によって形成されたワーム状ミセルは、装飾されていない対照よりも２倍および３倍大きい１５５３９±２８６２２９および７１３８２±２５１９１９の幾何学的蛍光強度平均を有する（図２４）。
明らかに、受容体媒介性エンドサイトーシスは、ワーム状ミセルによって示される、球状ミセルと比較して有意に高い細胞取り込みによって見られるように、形状に依存しており、これは、インテグリンに対するそれらの高いアビディティと一致する。Ｆｎ３装飾球状およびワーム状ミセルもまた、細胞取り込みの二峰性分布を有するＬＭ６０９とは異なり、単一のフローサイトメトリーピークのみを示した。この結果は、おそらく、複数のリガンドが細胞表面上の受容体と係合することを可能にする一定の閾値を受容体の発現が超えている限り、高価数ミセルが受容体の発現の不均一性により影響を受けないことを意味する。したがって、高価数ミセルは、抗体よりも、不均一なレベルの受容体発現を有する細胞を標的とするためのより堅牢な戦略を提供し得る。
ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７）と同じ親水性質量分画を有するがサイズの小さいワーム状ミセルは、同等サイズの球状ミセル－ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９６）よりも高いレベルの細胞取り込みを示すため、形態は、サイズよりも重要であると考えられる（図２７）。同様に、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７）のワーム状ミセルと同様の大きさの球状粒子は、非常に低いレベルの取り込みを示す（図２６）。これらのデータは、ワーム状ミセルの細長い形状および可撓性が、受容体に結合するために利用可能なアクセス可能なＦｎ３リガンドの数を増加させたことを示す。
次に、インキュベーション後２０、４５、９０、１２０、および２４０分で細胞を画像化することによって、内在化の動態を可視化することにした（図２８）。Ａｌｅｘａ４８８色素の粒子および面積分析を、少なくとも３つの別個の画像について視野の全ての細胞に対して実施し、各試料について約５０個の個別の測定値を得た。蛍光の非内在化領域を排除するために、分析領域をゲートして細胞膜を除外した。
ＬＭ６０９抗体は、細胞膜とほとんど会合したままであり、後の点で細胞内にわずかに単離された蛍光輝点があったが、これと比較して、球状（ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３）（配列番号９６）およびワーム状ミセル（ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３）（配列番号９７）は、より速く内在化され、全ての時点で細胞内により多くの粒子をもたらす（図２９Ａ）。
時間、形状、および装飾状態（Ｆｎ３±）に三元配置分散分析を使用して、細胞内の粒子の数およびそれらが覆う面積の両方について、形状、装飾状態、および時間の主な影響を観察した。一対の相互作用は、ミセル形状が、球状ミセルとワーム状ミセルとの間の細胞あたりの粒子数（ｐ＜０．０１）および球状ミセルと陽性抗体対照との間の細胞あたりの粒子数（ｐ＜０．０５）に有意な影響があることを示す。これらの粒子が細胞内に占める面積には、球状ミセルと抗体対照との間の経時的な差（ｐ＜０．０５）と、ワーム状ミセルと抗体対照との間の経時的な差（ｐ＜０．０５）があった（図２９Ｂ）。時間の経過とともに、球状ミセルとワーム状ミセルとの間の粒子面積との間には経時的な有意差はなかった。蛍光シグナルを含有した細胞集団の全体的な割合を評価したが、経時的に有意な効果は生じなかった。この配置分散分析の唯一の有意な効果は、経時的なミセル形状の対効果（ｐ＜０．００１）および経時的な装飾状態（ｐ＜０．０１）であった。まとめると、これらのデータは、次のことを示す：（１）粒子形態に関して、細胞取り込みが統計的に有意に増加し、（２）インテグリン結合Ｆｎ３ドメインを提示するミセルによる細胞取り込みが統計的に有意に増加する。
（実施例４）
ナノスケールの自己集合をもたらす２つのＵＣＳＴタンパク質ブロック
以前に生成されたＲＬＰの大規模なライブラリおよび観察された転移温度の大差を考慮して、２つのＵＣＳＴブロックから作製された第１のブロックコポリペプチドの作製に着手した。ＥＬＰブロックコポリペプチドおよびＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドについての以前の研究から、各ブロックが互いに影響し合い、各ブロックの転移をより近くに駆動するため、２つのブロックの転移温度に大きな差があることが分かっている。まず、Ｔtに大きな差を有する２つのＲＬＰ、（ＧＲＧＤＳＰＹＳ）［Ｓ］、［Ｓ］－４０、８０（配列番号１００－１０１）およびＧＲＧＤＱＰＨＮ（［ＱＨＮ］－４０）を融合した。以前の実験では、集合した形態に対する親水性質量分画全体の重要性が示されていたため、コア形成ブロックのブロック長を変化させた。また、ＧＲＧＤＱＰＨＮをＧＲＧＤＮＰＨＱ（［ＮＨＱ］－４０）（配列番号１０２－１０３）に変更することにより、コアブロックを変化させた。これは疎水性変化であるが、全体的に同じポリペプチド組成を維持する。
第１の注目すべき観察は、これら２つのＲＬＰ配列の選択が、可変自己集合をもたらしたことである。ＲＬＰＳＳ－４０－ＲＬＰＱＨＮ－４０（配列番号１００）は、Ｒgが３５．１ｎｍ、Ｒhが２８．４ｎｍ、およびＮaggが４３で、同定可能なナノスケール形態へと集合した（表９）。形因子（Ｒg／Ｒh）は、［Ｓ］－４０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１００）は、ワーム状ミセルに集合することを示唆する。コアブロックの分子量を増加させることにより、Ｒg、Ｒh、Ｎaggが劇的に増加する。［Ｓ］－８０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１０１）は、［Ｓ］－８０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１０１）がワーム状ミセルに集合する可能性が高いことを示す、１を超える形因子を有する。
Figure 2023516312000011

別の興味深い観察は、［Ｓ］－ＸＸ－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１００－１０１）および［Ｓ］－ＸＸ－［ＮＨＱ］－４０（配列番号１０２－１０３）との間の単純な変化が分解をもたらしたことである。この結果は、［ＱＨＮ］と［ＮＨＱ］との間の疎水性の差がかなり小さいため、予想外であった。しかしながら、この結果は、２つのブロックが十分に類似したＴtを有するように、この小さな変化がＴtギャップを狭めるという意味で理解することができる。２つのブロックの間の十分に類似したＴtは、ＵＣＳＴ温度が１つのみであり、ユニマー単位として振る舞うコポリペプチドをもたらす。
ＵＣＳＴ－ＵＣＳＴ構築物の形態についてより深い洞察を得るために、試料をクライオＴＥＭのために調製した。以前の研究から、ガラス化プロセスが、溶液の濃度を増加させることが分かっている。これらの画像では、試料ポリペプチドが濃度上昇により液体様相分離を受けていることが観察される。この相分離により、２つの構築物のナノ構造を識別することができなくなる。しかし、興味深いのは、液滴のような液体の中に、相互につながった構造があるように見えることである（図３０）。また、３つの異なるコントラスト領域、つまり、液滴を取り囲む水／緩衝液、液滴自体のコントラスト、次いで内部微細構造のさらなるコントラストもあるようである。これは、異なるＲＬＰが相転移時に異なるコントラストを有することを示し、コアに異なるＲＬＰを有するＲＬＰ－ＥＬＰおよびＲＬＰ－ＲＬＰが、コアコントラストにおいて測定可能な差異を有する可能性があることを示す。［Ｓ］－４０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１００）（図３０Ａ、Ｃ）および［Ｓ］－８０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１０１）（図３０Ｂ、Ｄ）の両方が、この微細構造を形成する。
前述のように、温度依存性濁度は、紫外可視分光光度測定法で決定した。この方法を使用して、冷却時に可溶性から集合体への明瞭な転移を可視化することができなかった。さらに、［Ｓ］－４０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１０１）は、明確なＵＣＳＴ凝集温度を有した。両方について、このＵＣＳＴ凝集の濃度依存性を決定した（図３１Ａ）。両構築物は、コロナブロックだけで予測されるよりもはるかに高いＵＣＳＴ値を有し、より疎水性のＲＬＰへの融合が、観察されるＵＣＳＴ挙動を、２つのユニマーブロック間のどこかのみにもたらすことを示す。ＲＬＰのサイズを増加させることにより、ＵＣＳＴが高くなり、結合したコアポリペプチドのサイズによりコロナが影響を受けることを示す。ＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドと比較して、ＲＬＰ－ＲＬＰブロックコポリペプチドは、その濃度依存性の多くを保持しており、このことはクライオＴＥＭの結果を説明している。また、２つのうちでよりワーム状であると予測される［Ｓ］－８０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１０１）は、より高い濃度依存性を有することも興味深い。これもまた、以前に観察されたＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドの傾向とは異なる。
ＲＬＰ－ＲＬＰブロックコポリペプチドは、コロナユニマーの固有のｐＨ応答性を保持する。異なる緩衝ｐＨ条件における温度依存性のＤＬＳ測定は、再びＨｉｓの等電点付近に、実測ＵＣＳＴ凝集温度の最大値を示した（図３１Ｂ）。両方の構築物のＵＣＳＴが、ｐＨ８．４からｐＨ６．４にほぼ直線的に高くなり、次いでｐＨ６．４から３．４で低下する。先に観察されたことの内容において、この結果は理にかなっている。ｐＨがＨｉｓの等電点に向かって減少すると、コロナがより疎水性を示すため、Ｔtが高くなる。この過程は理解されていないが、以前の観察結果と一致している。等電位点に到達した後、Ｔtは低下する。これは、コロナ鎖における膨大な量の正電荷が鎖反発を劇的に増加させるためである。これらの集計ＤＬＳ曲線のそれぞれにおいて、安定したミセルレジームが観察されたことに留意することが重要である。［Ｓ］－４０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１００）は、ｐＨが等電点まで低下した場合、Ｒhに大きな変化はなかったようであり、構造の形態に変化がなかった可能性が高いことを示している。［Ｓ］－８０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１０１）は、ｐＨが等電点に向かって低下するとき、サイズ変化を示し、次いでｐＨ３．４で、ｐＨ７．４で測定した元のサイズを実際に下回った。これは、中性ｐＨでのワームから、ｐＨ５．４ではより細長いワーム、次いでおそらくはｐＨ３．４で球状への形態変化を示す。
紫外可視測定では、温度依存分解に関する重要な疑問に対する答えは出なかった。したがって、より正確な画像を得るために、溶液をゆっくりと冷却しながら、Ｒhを監視した。２つの異なる全体的な挙動を観察した。冷却時に、［Ｓ］－４０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１００）は、約５５℃で明確なユニマーからミセルへ転移し、２８℃で明確なミセルから凝集体へ転移した（図３２Ｂ）。温度に依存したユニマーからミセルへの転移は、臨界ミセル化温度（ＣＭＴ）として知られる。以前から分かっているように、このＵＣＳＴ凝集温度は溶液濃度に依存する。［Ｓ］－８０－［ＱＨＮ］－４０（配列番号１０１）は、機器で測定できる最高温度でミセルのままであった。冷却すると、凝集体のサイズは、１８℃で透明な凝集体の転移が生じるまでわずかに増加した。これらの２つの結果は、コアブロック配列を制御することが、凝集体ＵＣＳＴおよびＣＭＴに対する制御を提供することを示す。
これらのブロックコポリペプチドに加えて、ＵＣＳＴ－ＵＣＳＴミセルの集合に必要なＴtの差異の理解を試みた。繰り返しＩＤＰのライブラリを使用して、Ｔｙｒ残基をＶａｌで置き換える（配列番号１０４）ことによって、より親水性の高いブロックをコア配列［Ｓ］－４０に漸進的に融合させた。これは、芳香族残基に対して脂肪族残基という最も効率的な置換であることが分かっている。さらに、［Ｓ］－４０が集合に必要な最小コアブロックサイズを超えていることが分かっている。したがって、まず、約５０質量％の親水性分画を有する３つのブロックコポリペプチドを生成した。ここで、意図されるコロナ鎖は、［Ｙ：Ｖ］－４０（つまり、配列番号３０の２回の繰り返し）、［Ｙ：３Ｖ］－４０（つまり、配列番号２８の２回の繰り返し）および［Ｖ］－４０（つまり、配列番号３６の２回の繰り返し）を含み、コアが［Ｓ］－４０（つまり、配列番号２４の２回の繰り返し）を含む。
紫外可視分光光度測定および動的光散乱（ＤＬＳ）測定は、自己集合に必要な最小差の決定にかなり有益であった。これらの実験では、［Ｙ：Ｖ］と［Ｙ：３Ｖ］を含むコロナは、集合するのではなく、液体－液体コアセルベーションに近似した方法で凝集する粒子系をもたらすにすぎないことが分かった。Ｔｙｒが完全にＶａｌに置き換えられたときだけ、自己集合した構造が観察される。ＤＬＳおよび紫外可視分光光度測定法は、冷却時に、ユニマー配列（約１０ｎｍ）が、安定した３０ｎｍのミセルに落ち着く前に、約５００ｎｍの粒子に転移する、集合の中間相が存在することを示す（図３３）。ここでは、［Ｓ］－４０および［ＱＨＮ］－４０、８０構築物とは異なり、ＤＬＳとの単一集合モードのみが観察され、コアは崩壊することを示唆しているが、コロナ鎖は温度範囲全体にわたって可溶性のままである。これらの結果はまた、コアブロックの最小差は１２．５％であり、Ｔtのおよその差は８０～１００℃であることも示唆している。
これらの実験は、集合に必要なコアとコロナの概念を与える。ＵＣＳＴおよびＬＣＳＴジブロックの実験から、相対ブロックサイズがミセルの集合に影響を与えることが分かっている。したがって、集合サイズを検討するために、コロナサイズを変更し、クライオＴＥＭによって集合を評価した。クライオＴＥＭ画像は、最初の構築物［Ｓ］－４０－［Ｖ］－４０（配列番号１０６）が、小さなミセルと大きな相分離ドメインの混合物に集合したことを示す。これらの大きな相分離ドメインは、コロナサイズが減少するにつれて増大する（図３４）。同様に、コロナサイズを増加させると、相分離ドメインのサイズが減少し、視野の割合が大きくなり、約３０ｎｍのＲhの小さな球状粒子が形成される。
最後に、これらの２つの洞察を組み合わせて、脂肪族アミノ酸でコロナ鎖の約１０％を変化させるが、他の疎水性スケールによって予測されるように疎水性を変化させる、第３の系統的ライブラリを作製した。Ａｌａ、Ｉｓｅ、Ｖａｌはいずれも、ポリペプチドのＵＣＳＴ相分離挙動に類似の効果を示し、これらの各アミノ酸の間の唯一の違いは、側基上の余分な炭化水素である。したがって、［Ｓ］－４０－［Ｉ］－４０（配列番号１０９）および［Ｓ］－４０－［Ａ］－４０（配列番号１０８）のタンパク質を、［Ｓ］－４０－［Ｖ］－４０（配列番号１０６）に加えて作製した。
これらのクライオＴＥＭ画像は、鎖の疎水性を低下させることにより、相分離ドメインの存在が排除され、いくつかのベシクルの存在を含むワーム状ミセルおよび球状ミセルの混合物に集合相がシフトすることを示唆している。コロナの疎水性を増加させると、相分離ドメインのサイズと疎水性が増加し、炭化水素グリッドと会合するようになる。
コアＵＣＳＴブロックの採用により、予測可能な自己集合ブロックコポリペプチドを生成することに全体的に非常に成功した。追究した変異の経路は、高分子物理からの単純なジブロック集合の原理によって支配され、理論によって予測される効果を全体的にもたらした。事前予測よりも挙動が困難な以前のタンパク質集合系とは異なり、ＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドの自己集合は、親水性質量分画、ポリペプチド－ポリペプチド、およびポリペプチド－溶媒相互作用によって理解され得る。この知見は、第一原理から多種多様な形状およびサイズへの、所望のナノスケール形態の新規設計のためのルートを提供するため、非常に重要である。
これらのブロックコポリペプチドを集合のための足場として使用することにより、ＲＬＰＸＸ－ＥＬＰ８０ブロックコポリペプチドが、自己集合を介したＦｎ３ドメインの多価表示のための堅牢なプラットフォームであることを、結果は明確に示す。コアのブロック比および分子量を調節することにより、親ミセルの形態を、球状対ワーム状で調節することができる。親水性質量分画を約０．７から約０．４６へ、約０．３０へと減少させると、形態がユニマーから球状ミセルへ、ワーム状ミセルへとそれぞれ変化する。重要なことに、ブロックＲＬＰ－ＥＬＰコポリペプチドの親水性Ｃ末端のαｖβ３インテグリンを標的とするＦｎ３ドメインの遺伝子レベルの融合は、自己集合を妨げず、ミセルのコロナ上でのＦｎ３ドメインの高密度提示を可能にする。しかしながら、球状ミセルとワーム状ミセルとの間の相境界上に存在する親ミセルＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０は、ブロックコポリペプチドのコロナ上にＦｎ３ドメインを提示すると、ワーム状ミセルに変換されるため、Ｆｎ３提示は、形態に影響を及ぼす。
αｖβ３過剰発現細胞株を有するＦｎ３提示ＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドの細胞取り込み研究は、４つの顕著な結果をもたらした：第１に、親リガンド陰性ミセルと比較して、最良の場合で、ワーム状ミセルは２時間で３倍の細胞取り込みを有し、多価性が、単にアビディティ効果によって、リガンドの標的化効力を大幅に増強し得ることを実証する。第２に、ミセル内に自己集合せず、したがってαｖβ３インテグリンを標的とするＦｎ３ドメインの単一コピーのみを提示するＲＬＰn－ＥＬＰ－Ｆｎ３融合体と比較して、多価の球状およびワーム状ミセルがより高いアビディティおよびより高い細胞取り込みを有することが見出された。このことは、ナノスケール足場上での複数コピーの提示によるリガンドのアビディティを増幅する多価性の重要性を示す。第３に、Ｆｎ３装飾ワーム状ミセルは、球状ミセルと比較して、細胞取り込みの５倍の増加を示すという、機能ミセル形態としての細胞取り込みの劇的な違いを観察した。第４に、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７）と同じ親水性質量分画を有するが、サイズが小さいワーム状ミセルが、同等のサイズの球状ミセル（ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３）（配列番号９６）よりも高いレベルの細胞取り込みを示すため、形態がサイズよりも重要であると考える。同様に、ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０－Ｆｎ３（配列番号９７）のワーム状ミセルと同様のサイズの球状粒子は、非常に低いレベルの取り込みを示す。これらのデータは、ワーム状ミセルの細長い形状および可撓性が、受容体に結合するために利用可能な、アクセス可能なＦｎ３リガンドの数を増加させたことを示す。第５に、最も優れたパフォーマンスを示すワーム状ミセルのアビディティおよび細胞取り込みは、同じ受容体を標的とする治療関連抗体よりも大きい。
このクラスの自己集合ＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドは、他のＥＬＰベースのナノ構造と比較して、以下の理由により、薬物および画像化剤の送達のためのミセルの分子設計および組換え合成のための極めて堅牢で汎用性の高いシステムを提供する。まず、ＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリペプチドは、ＥＬＰブロックコポリペプチドとは異なり、遺伝子コード配列を介したポリマー自己集合の正準規則に従い、これにより、特定の用途のためにそれらの形態を新規にプログラムすることが容易になる。第２に、これらのミセルは、ＥＬＰミセルの５～１０μＭのＣＭＣと比較して、０．１μＭ以下の範囲のＣＭＣを有するため、ＥＬＰミセルよりも有意に高い熱力学的安定性を有する。第３に、これらのミセルは、Ｆｎ３足場が非常に変異可能な標的化足場であり、多様な標的に対するライブラリスクリーニングアプローチによってバリアント体を発見することができるため、標的化リガンドとして魅力的な選択である、ミセルのコロナ上のＦｎ３ドメインの提示を可能にする。第４に、これらの標的化ミセルは、以前のＥＬＰミセルと同様の様式で、コア形成疎水性ドメイン内への低分子薬物のコンジュゲーションによって単純に薬物を積載することができることが留意される。最後に、それらの製造、したがって臨床転換は、バイオ医薬品業界の細菌発酵および下流の精製能力に影響力を与える。
（実施例５）
ｐＡｚＦ導入ならびにナノ粒子架橋がナノ粒子自己集合に及ぼす影響を徹底的に検討することとした。このために、Ｃ末端機能化なしに、５つの異なるＥＬＰ／ＲＬＰジブロックアーキテクチャのみを特徴付けることから始めた。ＩＴＣを使用してジブロック構築物を発現および精製した後、ＵＶ照射に曝露することによってｐＡｚＦ含有構築物を溶液中で架橋し、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して特徴付けた。測定した流体力学的半径（Ｒh）は、非天然アミノ酸のポリペプチド配列への導入、および特に架橋プロセス自体の両方が、粒子の一般的なサイズに影響を及ぼすことを示した（表１０）。全体的に、両方のプロセスは測定半径を増加させたようであり、この効果は、ワーム形成構築物に対してより顕著である。
Figure 2023516312000012
ナノ粒子形態の変化とは別に、ｐＡｚＦ架橋がそれらの安定性に及ぼす影響に特に着目した。架橋プロセスが実際に安定性の著しい増加をもたらしたかどうかを評価するために、粒子を塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）に曝露した。ＧｕＨＣｌは、任意の分子間および分子内静電力を破壊し、かつほとんどの既知のタンパク質の四次、三次および二次構造を完全に分解する、周知の変性剤である。しかしながら、ｐＡｚＦ架橋によって形成される結合などの共有結合はＧｕＨＣｌの影響を受けないままであり、したがって、この変性剤の添加により、架橋ナノ粒子の安定性に関する洞察を得ることが期待された。さらなるＤＬＳ実験は、架橋が所望の安定性増加を確実にもたらしたことを証明した。ＧｕＨＣｌ中の全ての架橋試料は、以前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で測定されたものと同じ一般的な範囲のＲh値を示した。一方、全ての天然試料は、ＧｕＨＣｌへの曝露時に、ユニマー化を完了させた。ＧｕＨＣｌ中の架橋粒子のＲh値は全体的にＢＳ中よりも大きかったため、ＤＬＳデータはさらに、変性剤の存在下での膨潤挙動を示す。これは、おそらく、ＰＢＳ内で完全に崩壊すると仮定されるが、ＧｕＨＣｌの存在下で細長いランダムコイル形態に到達しようとしているＲＬＰコアに起因すると考えられる。
最後に、データセットはまた、ＵＡＡ２－４０およびＵＡＡ５－４０構築物が、粒子形態および安定性の両方に関して同一であることも示した。ポリペプチド鎖あたり２つのｐＡｚＦ残基が、安定した架橋を達成するのに十分であると思われた。安定した架橋に必要な最小のｐＡｚＦ密度を決定するために、ＵＡＡ２／５－４０構築物をｐＡｚＦ非含有ＤＢ－４０ジブロックと混合し、５０、６０、７０、８０および９０パーセントのＤＢ－４０分画で架橋させた。次いで、それに続く７．２ＭのＧｕＨＣｌにおけるＤＬＳの特徴付けは、カットオフが、ＥＬＰ／ＲＬＰ鎖あたり約１個のｐＡｚＦ残基であることを示し、これは原理的に、非常に直感的な結果である（図３６）。平均ＤＬＳの読み取り値は、かなり急激な転移であることを示しているように思われたが、より詳しく調べると、実際にはそうではないことが示された。１ジブロックあたり１～２個のｐＡｚＦ部位の範囲で、ｐＡｚＦ密度が増加するにつれてサイズが連続的に減少するユニマー分画に対応する二次集団が観察された。
ＤＬＳは、ナノ粒子の一般的なサイズについての洞察のみを提供し、ある試料から他の試料への形態の潜在的な変化については何も教示しないため、低温透過型電子顕微鏡（クライオＴＥＭ）イメージングを行って、ほぼ天然の状態での粒子を撮像することにした。球体形成ジブロックアーキテクチャ（ＵＡＡ５バリアント）に関して、クライオＴＥＭは、球状粒子が、架橋されたレジームにおいてＧｕＨＣｌに曝露するとわずかに大きくなり、事前の架橋なしでは完全に分解するという光散乱データを支持する（図３７）。さらに、画像は、架橋プロセス自体が粒子サイズの有意な増加を既にもたらしているという以前の観察も確認する。次いで、画像解析により、粒子半径がＤＬＳ値を有意に下回った（図３７Ｃ）。これは、崩壊したミセルコアのみが、ＴＥＭによって撮像されるのに十分に高い電子密度を有するという以前の観察によって説明することができる。対応Ｒｈ値から測定されたコア半径をＤＬＳから差し引くと、実際にＧｕＨＣｌ曝露時の粒子サイズの変化はＥＬＰコロナではなくＲＬＰコアの膨張に起因することも分かる。
ワーム形成構築物のクライオＴＥＭ画像は、架橋後のワームの長さが数マイクロメートルで、やや予想外の状況を示した（図３７Ｃ）。天然条件下で撮影された画像中の粒子は、架橋状態の粒子ほど細長くなく、堆積時のグリッド表面における粒子の再編成のアーチファクトを示唆していた。このデータは、ｐＡｚＦ架橋がポリペプチド再配列のものよりも大きいタイムスケールで生じ得ることを示し、粒子が形成される架橋に応答して新しい形態を採用することを可能にする。いずれの場合も、これらの細長い構造は、それらの球状の対応物に対して変性条件に対して堅牢であった。
最後に、個々の構築物の臨界集合濃度（ＣＡＣ）を決定することにした。Ｒh値を、中間マイクロモルから低ナノモル範囲までの希釈系列にわたってＤＬＳで測定した。得られた流体力学的半径は、球体形成構築物が、それぞれ低マイクロモルおよび中間ナノモル濃度で分解するＤＢ－４０およびＤＢ－８０構築物を有するワーム形成類似体よりも概して安定であることを示した（図３８）。不思議なことに、架橋部位を導入するだけで、ＣＡＣは劇的に減少するようである。全体的に、ワーム形成構築物は、それらの球状類似体よりも低いＣＡＣを有し、ｐＡｚＦ含有構築物も、類似のｐＡｚＦ非含有ポリペプチドと比較して、同様であった。
特定の細胞受容体を標的とすることができる粒子を生成するために、タンパク質リガンドを、架橋性粒子の外側に遺伝子融合させた。ナノ粒子－リガンド融合物は、他の非天然発現系と比較して顕著に強力な発現を示す（図３９Ａ、Ｂ）。１つを除いて全ての培養物が１リットルあたり１０ミリグラム以上の液体培養物を作製した。
特徴付けプロセスの第１の工程は、機能化ジブロック構築物のための架橋粒子を生成すること、およびリガンドの結合が粒子サイズの有意な変化を引き起こしたかどうかを分析することであった。続くＤＬＳ分析は、機能化が、ナノ粒子アーキテクチャのほとんどに、いかなる実質的な影響も及ぼさなかったことを示した（表１１）。２つの例外は、ＡＨＮＰおよびＴＲＡＩＬペプチドリガンドを担持する構築物であり、それぞれ、著しく増大した流体力学的半径および減少した流体力学的半径を示した。最も理にかなった説明は、これが、溶液中の実際の濃度を著しく変化させた可能性がある、これらの構築物の両方について観察された溶解度の低下によって引き起こされたということである。理由が何であれ、ＧｕＨＣｌ曝露後も粒子は依然として安定していたため、架橋プロセスに影響はなかった。
Figure 2023516312000013

架橋がリガンド取り込みに及ぼす効果を決定するために、一連の細胞実験を行った。より具体的には、リガンドの種類に応じて、４つの異なる細胞株に対して実験を行った：大腸がん細胞株Ｃｏｌｏ２０５を、アポトーシス誘導ＤＲ５標的化リガンド（Ｔｎ３およびＴＲＡＩＬペプチド）に使用し、乳がん細胞株ＳＫ－ＢＲ－３を選択して、ＥｒｂＢ２結合ＡＨＮＰリガンドの効力を決定し、白血病細胞株Ｋ５６２の２つの異なるバリアント（天然およびαｖβ３－インテグリンについての遺伝子でトランスフェクトしたもの、Ｄｚｕｒｉｃｋｙら参照）を使用して、インテグリン標的化構築物を特徴付けた。また、白血球細胞株を使用して、Ｋ５６２細胞９８に対して細胞傷害性が報告されているポリビア－ＭＰＩを試験した。
異なる濃度でそれぞれの細胞株に細胞生存率アッセイを行うことによって、Ｔｎ３、ＴＲＡＩＬペプチドおよびポリビア－ＭＰＩの３つの細胞傷害性リガンドの効力を評価した。続いて収集されたデータは、Ｔｎ３機能化ナノ粒子への曝露のみが任意の細胞死をもたらしたことを示した（図４０）。他の２つの構築物については、細胞は、調査した濃度範囲内で完全な生存を示した。４７０ｐＭのＥＣ５０値で、Ｔｎ３試料は、ＵＡＡ５－４０構築物のＣＡＣを著しく下回る濃度で、依然として細胞死を誘導した。
また、非特異的取り込みの可能性を調査するために、６つのリガンド全てに非機能化構築物を加えて、ＳＫ－ＢＲ－３細胞上で試験した。７μＭの濃度で架橋ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８タグ付きナノ粒子と２時間共インキュベーションした後の得られた共焦点画像を図４１に示す。画像は、ＡＨＮＰ機能化が、他のリガンドと比較して、細胞取り込みの増加をもたらさなかったことを明確に示し、リガンドが多価提示に異なる応答をすること、したがって、多価提示の操作は、操作機能にとって重要であることを示唆する。
最後に、他の２つの細胞株において細胞取り込み実験を行った。ここでは、以下の３つの異なるリガンドを試験した：インテグリン標的化リガンドＦｎ３およびＧＲＧＤＳＰＡＳならびにポリビア－ＭＰＩ。７μＭでの２時間の共インキュベーション後に撮影された共焦点画像は、架橋ポリビア－ＭＰＩ粒子が実際に、３つ全ての機能化構築物の中で最も効率的に内部化されたことを示した（図４２Ａ）。さらに、２つのインテグリン標的化リガンドは、いずれも、ａｖβ３提示Ｋ５６２バリアントの取り込みレベルの増加を示したが、一方で、非機能化対照と比較して、天然Ｋ５６２細胞について有意な増加は観察されなかった。上記ＣＡＣレジームにおけるこれらの陽性結果に直面して、３つのリガンド全てを、７０ｎＭの濃度でも試験した－今回はαｖβ３陽性細胞株のみで試験した。この濃度は依然として構築物のＣＡＣを上回る可能性があるが、細胞取り込みアッセイの検出限界（約１０ｎＭ）により、これ以上希釈することはできなかった。次いで、得られた共焦点画像は、ＧＲＧＤＳＰＡＳおよびＦｎ３担持ナノ粒子の両方が依然として有意な量で取り込まれたが、ポリビア－ＭＰＩについて細胞取り込みの増加は観察されなかったことを示した（図４２Ｂ）。
ワーム状ＵＡＡ４－８０－Ｋ８Ｄ４－リガンド構築物でナノスケール形状の効果を試験する前に、それらの自己集合を特徴付けた：これらの３つのリガンドの添加は、球状ナノ粒子のＤＬＳ読み取り値に何ら顕著な影響を及ぼさなかったが（表１０）、ワーム状構築物について、流体力学的半径の約２０ｎｍの系統的減少が観察された（図４４Ａ）。これらの結果と、Ｒｈ値が細長い形態を持つ粒子を非常に正確に表していないという事実に直面して、この系統的な変化を引き起こした可能性のあるものをよりよく理解するために、次いでクライオＴＥＭに取組んだ。得られた画像は、Ｋ８Ｄ４－リンカーおよび３つの異なるリガンドがＥＬＰ／ＲＬＰジブロックのコロナに添加されたことにより、タンパク質がワーム状形態ではなく球状形態をとることを明確に示した（図４４Ｂ～Ｄ）。クライオＴＥＭ画像における粒子の半径を、溶媒和された、したがって不可視のＥＬＰコロナも含む場合のＤＬＳ読み取り値に従う、２０～４０ｎｍに決定した（図４４Ｆ）。このような球状ミセルは、装飾されていないＵＡＡ４－８０構築物についてのクライオＴＥＭ画像の一部において既に観察されていたが、それらはわずかな副産物にすぎなかった（図４４Ｅ）。これらの構築物の機能化は、この平衡を低アスペクト比分画に強くシフトさせたと思われる。
この粒子形態の変化は、短いＧＲＧＤＳＰＡＳリガンドについては、より大きなＦｎ３およびＴｎ３タンパク質足場についても同様に顕著であったため、この効果の主な原因がＫ８Ｄ４リンカーの導入であった可能性が高いと思われる。このリンカーの電荷および親水性により、かかるペプチドのコロナへの結合は、一般的にアスペクト比を低めることが合理的であると思われる。しかしながら、リンカーを含まないＵＡＡ４－８０構築物のＤＬＳ特徴付けは、不変の流体力学的半径を示した（図４５Ａ）。続いて記録されたＴＥＭ画像は、Ｋ８Ｄ４リンカーを含まない構築物が、依然としてワーム状粒子ではなく球状粒子を形成していることも確認した（図４５Ｂ～Ｅ）。しかしながら、これは、リンカーの添加が粒子形態に影響を及ぼさなかったことを意味しない：実際、ＵＡＡ４－８０－Ｋ８Ｄ４ナノ粒子は、リガンド担持構築物よりもさらに大きなサイズの減少を示した（図４５Ｆ）。これは、コロナタンパク質、ペプチド配列の存在下での自己集合の決定が困難であることを示唆する。
Ｋ８Ｄ４リンカーの除去は、最終的にワーム状形態を促進することはなかったが、得られた粒子はまた、リンカーを担持する粒子よりもワーム状であった。したがって、架橋ナノ粒子の多価性の利点を評価する最初の実験は、リンカーを含まないリンカー構築物とリンカー担持構築物との間の結合親和性に差異がないかどうかを決定することであった。このため、Ｔｎ３機能化構築物の架橋バージョンを用いて細胞生存率実験を行った。得られたデータは、ＵＡＡ５－４０およびＵＡＡ４－８０構築物の両方について、Ｋ８Ｄ４含有構築物がそれらのリンカーを含まない類似体よりも有意に強力であることを示した（図４６）。Ｔｎ３リガンドは１０４－ａａタンパク質足場であり、したがって、一般的に疎水性埋没の危険性は予想されないため、リンカーの除去が粒子の効力にこのような劇的な影響を及ぼしたことは非常に予想外であると思われる。１つの代替仮説は、この高電荷リンカーが、一般に、細胞膜との静電相互作用を通じて細胞標的化に役立つことである。細胞膜、特に腫瘍組織において、負に帯電しているため、正味電荷が＋４であるＫ８Ｄ４リンカーが細胞取り込みを促進する可能性があることは、妥当であるように思われる。
図４６の細胞生存プロットもまた、ＵＡＡ５－４０基礎を有する粒子が、ＵＡＡ４－８０ジブロックから構築された粒子よりも概してわずかに強力であったことを示している。この観察はまた、一般に、より低い曲率を有するより大きな球が細胞膜とのより高い接触領域を有し、したがってより効率的に表示されたレセプターに結合すると期待されるため、幾分、直感に反するものであった。しかしながら、図４４のＴＥＭ画像は、ＵＡＡ４－８０基礎を有する粒子が完璧な球体ではないことを示した。このことは、次いで、これらの構築物の自己集合および／または架橋が、ＵＡＡ５－４０粒子よりも混沌としている可能性があり、したがって、リガンド露出を損なっている可能性もあることを示した。
最後に、図４６における架橋されたＵＡＡ５－４０－Ｋ８Ｄ４－Ｔｎ３粒子の細胞生存曲線は、以前のリガンドスクリーニング実験からのものとほぼ完全に一致した（図４３）。データが再現可能であることは満足することであったが、これはまた、１μＭ前後の濃度について観察された細胞生存率のわずかな増加が実際に事実であったことを意味した。この範囲の全ての濃度について、細胞生存率は依然として３０％未満であったが、これはかなり不可解な観察結果であった。特に混乱したのは、７μＭまでさらに濃度を上げた場合、細胞生存率が０％に戻ったことである。その結果、この効果は、ナノ粒子のクラスタリングのような高濃度現象では説明できず、１μＭ前後の濃度でのみ現れるものによって引き起こされた。
続いて、対応する天然構築物について類似の細胞生存率アッセイを行い、架橋時の多価性の利点を定量化した。これらの実験は、いくつかの有望な結果をもたらした。両方のジブロックアーキテクチャについて、架橋は、それぞれのナノ製剤の効力を著しく増加させた（図４６Ａ）。機能化ＵＡＡ５－４０構築物について、架橋は、ＥＣ５０値を３桁以上減少させた。さらに、これらの細胞生存率結果を、天然ＵＡＡ５／４－４０／８０およびＤＢ－４０／８０構築物について以前に記録されたＣＡＣと比較したところ、深い相関関係が示された：天然ＤＲ５標的化構築物のＥＣ５０値は、ＤＢ－４０およびＤＢ－８０構築物のＣＡＣとほぼ完全に一致した（図４６Ｂ）。ＵＡＡ５／４－４０／８０ジブロックについて決定されたＣＡＣが、それらのｐＡｚＦ非含有アナログとそれほど大きく異なる理由は依然としてほとんど不明であるが、これらの観察は、それらの違いが実際には事実でなかったことを強く示した。ＥＣ50値とＤＢ－４０／８０構築物のＣＡＣとのほぼ完璧な相関は、偶然の一致であり、ＣＡＣ依存性粒子分解に起因するものでないとする可能性は非常に低いと思われた。したがって、この結果は、ＣＡＣが自己集合ナノ粒子の多価の有益なリガンドの効力の制限因子であること、および化学的架橋がこの問題を克服するための強力な手段であることを示す。
次いで、追加のフォローアップ実験において、架橋されたナノ粒子の異なるリガンド密度が、全体的な効力にどのように影響するかを調査した。このため、非機能化ＵＡＡ５－４０ジブロックおよびＵＡＡ５－４０－Ｋ８Ｄ４－Ｔｎ３構築物の両方からなる架橋粒子を、モル比１：３、１：１および３：１で調製した。続いて、これらの構築物を用いて細胞生存率アッセイを行ったところ、ナノ粒子の機能化の５０％までの低下は、効力のわずかな変化のみをもたらすことが示された（図４７）。ナノ粒子内の機能化ＥＬＰ／ＲＬＰジブロックを２５％までさらに低減した場合にのみ、測定されたＥＣ５０値は、高ナノモル範囲に有意に増加した。観察された傾向の非線形性により、２つの構築物は容易に混合されること、および効力の変化が確かにナノ粒子表面上のリガンド密度の低下の結果であることをさらに推定することができる。また、ＵＡＡ５－４０－Ｋ８Ｄ４－Ｔｎ３構築物が、かなりの量の切断生成物を含有していたため、そもそも完全に純粋ではなかったと考えると（図３９Ａ）、これらの観察はさらに有望となる。完全に機能化されたナノ粒子上のＴｎ３リガンドの少なくとも半分は、配合物の効力を損なうことなく理論的に除去することができると思われる。したがって、これは、例えば、二重特異性ナノ粒子に対するこの系の追加の操作のための良好な出発点を示す。
より大きな細胞集団をフローサイトメトリーによって評価することに関心を持った。種々の架橋状態における種々の濃度で種々のサイズの種々のタンパク質ベースのリガンドの種々の実験を行った（図４８～５０）。この作業から、いくつかの結論が得られている。第一に、全ての場合において、タンパク質およびペプチド等を有する多価提示の効果の増加が見られる。このことは、タンパク質およびペプチド等が、細胞表面への結合のメカニズムが異なり、公称サイズが異なり、様々な経路によって内在化し得るため、予想外であり、自明なことではない。非特異的に標的化された架橋粒子であっても、コロナ表面に局所的な電荷が存在する場合、高いレベルの取り込みを示すことができるため、細胞の誘導された取り込みのこの多価効果が統計的に動機付けられることは明らかである（図４９）。しかしながら、ミセルの安定性は、非架橋粒子の濃度を減少させることにより、この非特異的取り込みが本質的に排除されるため、この細胞取り込みに劇的に影響を及ぼす（図５０）。この結果の効力は、先の実施例と一致して、ある程度リガンドおよび濃度に依存しているように見えるが、取り込みに対して粒子形状の同様の効果も観察される（図４８）。
架橋ナノ粒子による処置の下流効果に関心を持ったが、化学的架橋が細胞膜受容体自体への結合にどのように影響したかも着目した。このために、架橋および天然ジブロックアーキテクチャの結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価した。
インテグリン標的化構築物を特徴付けするために、ＵＡＡ５－４０ベースの構築物のＫD値を決定することから始めた。これにより、Ｆｎ３およびＧＲＧＤＳＰＡＳリガンドに対して、それぞれ３．３ｎＭおよび２０ｎＭの予想外に緊密な結合親和性が得られた（図５１Ａ）。具体的には、ペプチドリガンドについて、架橋ナノ粒子について記録されたＫD値も、類似のｐＡｚＦ非含有構築物についての値を著しく下回る。ＳＰＲセンソグラムの精査により、リガンドのＫD増加の主な理由が、ｋoffの差異ではなく、会合速度（ｋon）の極めて異なる結果である場合の、この効果のメカニズムを説明する。
それらの非架橋類似体について、ＧＲＧＤＳＰＡＳ構築物については結合が観察されなかったが、Ｆｎ３バリアントについては、いくつかの結合（架橋試料についてはそれよりも小さい程度）が測定された（図５１Ｂ）。細胞取り込み研究の結果に基づいて、天然Ｆｎ３構築物が、ＧＲＧＤＳＰＡＳバリアントと比較して、そのユニマー結合親和性の増加に起因して、いくつかの結合を示す可能性があることが予想された。ＣＡＣを上回る濃度では、架橋は結合親和性に有意な影響を及ぼさなかった（図５１Ｃ）。
より大きなＵＡＡ４－８０構築物を有するインテグリン標的化構築物については、ＳＰＲの結果は予想外であった：架橋ＧＲＧＤＳＰＡＳ機能化粒子のＳＰＲデータは１９０ｎＭの濃度で非常に強力な結合を示したが、シグナルはさらなる希釈にあたり急速に低下した（図５２Ａ）。一方、架橋されたＦｎ３構築物については、センソグラムは、濃度からある程度分離されているように見えた（図５２Ｂ）。６８ｎＭでは、ＳＰＲデータは強力な結合を示したが、その値を上回る濃度および下回る濃度の両方では、結合は検出されなかった。その結果、８５ｎＭで計算された中間ナノモル範囲のＧＲＧＤＳＰＡＳ粒子のＫDのみを決定することができた（図５２Ｃ）。２つの架橋粒子のいずれも、ＣＡＣ未満の希釈時に検出可能な結合を示さなかったため、これらのインテグリン標的化構築物のいずれについても、架橋時の多価性の利点を証明することができなかった。これは、おそらく、この二重ブロックアーキテクチャのナノ粒子に対する比較的低い結合親和性と、これらのＥＬＰ／ＲＬＰ構築物の低いＣＡＣとの組合せに起因する。
サブＣＡＣレジームにおけるＵＡＡ５－４０基礎を用いた架橋Ｔｎ３試料の初期の特徴付けは、ピコモル範囲で深いＫD値を得た（図５３Ａ）。この極めて良好な結合定数は、低くてＳＰＲ機器の検出限界以下である可能性を下回る可能性もある低いｋｏｆｆ速度に起因する可能性がある。しかしながら、インテグリン標的化ＵＡＡ５－４０粒子とは対照的に、同じ濃度範囲内の天然Ｔｎ３構築物に対する非常に強力な結合が観察された（図５３Ｂ）。２５０ｎＭでは、計算されたＫD値は、架橋試料と比較して１２倍しか増加しなかった。このことは、架橋が依然としてＤＲ５結合を改善することを示唆したが、これは非常に限定された程度でしか改善しなかった。ＤＲ５結合を介したアポトーシス誘導が、細胞膜内のリガンド結合ＤＲ５受容体の下流の三量体化を必要とすることは、原理的に既に分かっていたので、このことはあまり予期しない結果ではなかった。したがって、報告されたＴｎ３作用の多価性の要件は、ＤＲ５結合そのものではなく、少なくとも部分的にこの機械的効果に起因するものであると予想した。
（実施例６）
黄色ブドウ球菌（ＳｐＡ）プロテインＡ（ＺドメインまたはＺＤと称される）からの操作ドメインを、ＲＬＰ－ＥＬＰブロックコポリマーの外側に遺伝的に融合させ、大腸菌で発現させ、前述の方法で精製した。従来の対照ＥＬＰアプローチではなく、多価効果を用いて抗体を捕捉する有用性を実証するために、３つの異なる抗体（ｍＡｂ）を用いて、マイクロフュージ形式で捕捉および溶出実験を行った。まず、ｍＡｂを「捕捉する」。これは、抗体の存在下でＲＬＰ－ＥＬＰ－ＺＤジブロックを約１分間、室温でインキュベートすることを意味する。次に、３７℃に加熱するか、溶液にＮａＣｌを添加することによって相分離をトリガーする。ＲＬＰ－ＥＬＰ－ＺＤ－ｍＡｂの大規模な凝集体は、経時的に沈降するか、または遠心分離により速やかにペレット化することができる。次いで、この試料を低ｐＨ緩衝液中に再懸濁して、ｍＡｂをＲＬＰ－ＥＬＰ－ＺＤから解離し、溶出分画（溶出ＳＮ）中に放出する。したがって、溶出ＳＮおよび捕捉ＳＮにおける抗体の重鎖および軽鎖が、重鎖および軽鎖では不十分であることを予想する。対照ＥＬＰ症例に示すように、このプロセスの有効性は、３つの異なるモデル抗体化合物間で変動があり、３つのｍＡｂ間で捕捉および溶出のレベルに変動があることを意味する（図５４）。ＲＬＰ－ＥＬＰ－ＺＤ構築物では、捕捉ＳＮは、一貫して、非常に少ないｍＡｂを含有し、ｍＡｂに対するＺＤの結合親和性の増加および自己集合粒子の全体サイズを通じた高効率捕捉が、プロセスにおける変動を減少させ、ｍＡｂ生成物から汚染物質（レーン１、３、および５に見られる他のバンド）を効率的に分離することができることを示唆する。
（実施例７）
架橋性タンパク質ナノ粒子の動的光散乱を行った。７．２ＭのＧｕＨＣｌ中の０．７μＭで、非共有結合架橋ポリペプチドは、自己集合した形状を有しない小さなユニマー構造（半径約７～１０ｎＭ）に分解する。しかし、これらの架橋粒子は集合したままであり、実際には、この新しい緩衝液中のコアおよびコロナの鎖膨張に起因して、わずかに大きくなる。これらの新規の足場は、様々な標的化ドメインを支持し、流体力学的半径３２～５２ｎＭのほぼ同じサイズのナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｏｔｉｃｌｅ）に集合する。
Figure 2023516312000014

Claims (58)

  1. 少なくとも１種の結合ポリペプチドと少なくとも１種の非構造化ポリペプチドとを含む融合タンパク質を含むタンパク質ナノ粒子を含む、組成物。
  2. 前記融合タンパク質が、複数の非構造化ポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記融合タンパク質が、複数の標的化ポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記非構造化ポリペプチドが、ジブロックペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記非構造化ポリペプチドが、コアポリペプチドおよびコロナポリペプチドのジブロックを含む、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記非構造化ポリペプチドが、コアn－コロナmを含み、ｎが２０～２００の繰り返し数であり、ｍが４０～２００の繰り返し数である、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記コアポリペプチドが、配列ＱＹＰＳＤＧＲＧ（配列番号１）、ＧＲＧＤＱＰＹＱ（配列番号２）、ＧＲＧＤＳＰＹＱ（配列番号３）、ＧＲＧＤＳＰＹＳ（配列番号４）、ＧＲＧＤＱＰＹＳ（配列番号５）、ＧＲＧＤＳＰ［３Ｙ：Ｖ］Ｓ（配列番号６）、ＧＲＧＤＳＰ（Ｙ：Ｖ］Ｓ（配列番号７）、またはこれらの組合せを含む、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記コロナポリペプチドが、配列ＶＰＧ［Ａ：Ｇ］Ｇ（配列番号８）、ＶＰＧＳＧ（配列番号９）、ＶＰＧＶＧ（配列番号１０）、ＶＰＱＱＧ（配列番号１１）、ＧＲＧＤＳＰＡＳ（配列番号１２）、ＧＲＧＤＳＰＩＳ（配列番号１３）、ＧＲＧＤＳＰＶＳ（配列番号１４）、ＧＲＧＤＱＰＨＮ（配列番号１５）、ＧＲＧＤＮＰＨＱ（配列番号１６）、ＧＲＧＤＳＰＶ（配列番号１７）、またはこれらの組合せを含む、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記コアポリペプチドが、配列（ＲＬＰ）n（配列番号１）を含み、ｎが２０～２００の繰り返し数である、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記コロナポリペプチドが、配列（ＥＬＰ）ｍ（配列番号８）を含み、ｍが４０～２００の繰り返し数である、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記ジブロックが、
    ＲＬＰ４０－ＥＬＰ４０（配列番号８３）、
    ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）、
    ＲＬＰ４０－ＥＬＰ１６０（配列番号８２）、
    ＲＬＰ６０－ＥＬＰ８０（配列番号８５）、
    ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）、
    ＲＬＰ８０－ＥＬＰ１６０（配列番号８６）、または
    ＲＬＰ１００－ＥＬＰ８０（配列番号８８）
    を含む、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記標的化ポリペプチドが、２ｋＤａ～１００ｋＤａのポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  13. 前記標的化ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）（配列番号６０）由来のＩＩＩ型ドメイン、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）（配列番号６２）由来のａＦｎ３ドメイン、またはブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）タンパク質Ａ（配列番号６４）のＺドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記標的化ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）（配列番号６０）由来のＩＩＩ型ドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
  15. 前記標的化ポリペプチドが、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）（配列番号６２）由来のＦｎ３ドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
  16. 前記標的化ポリペプチドが、（配列番号６４）を含む配列を有するブドウ球菌タンパク質ＡのＺドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
  17. 前記コアポリペプチドが架橋されている、請求項１に記載の組成物。
  18. 少なくとも１種の結合ポリペプチドと少なくとも１種の非構造化ポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む、タンパク質ナノ粒子。
  19. 前記融合タンパク質が、複数の非構造化ポリペプチドを含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  20. 前記融合タンパク質が、複数の結合ポリペプチドを含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  21. 前記非構造化ポリペプチドが、ジブロックペプチドを含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  22. 前記非構造化ポリペプチドが、コアポリペプチドおよびコロナポリペプチドのジブロックを含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  23. 前記非構造化ポリペプチドが、コアn－コロナmを含み、ｎが２０～２００の繰り返し数であり、ｍが４０～２００の繰り返し数である、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  24. 前記コアポリペプチドが、配列ＱＹＰＳＤＧＲＧ（配列番号１）、ＧＲＧＤＱＰＹＱ（配列番号２）、ＧＲＧＤＳＰＹＱ（配列番号３）、ＧＲＧＤＳＰＹＳ（配列番号４）、ＧＲＧＤＱＰＹＳ（配列番号５）、ＧＲＧＤＳＰ［３Ｙ：Ｖ］Ｓ（配列番号６）、ＧＲＧＤＳＰ（Ｙ：Ｖ］Ｓ（配列番号７）、またはこれらの組合せを含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  25. 前記繰り返しコアポリペプチド配列には、アジドフェニルアラニン、アセチルフェニルアラニン、プロパルギルオキシフェニルアラニン、アセチルフェニルアラニン、またはアジドホモアラニンから選択される少なくとも１～１０個の非古典的アミノ酸が散在している、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  26. 前記コロナポリペプチドが、配列ＶＰＧ［Ａ：Ｇ］Ｇ（配列番号８）、ＶＰＧＳＧ（配列番号９）、ＶＰＧＶＧ（配列番号１０）、ＶＰＱＱＧ（配列番号１１）、ＧＲＧＤＳＰＡＳ（配列番号１２）、ＧＲＧＤＳＰＩＳ（配列番号１３）、ＧＲＧＤＳＰＶＳ（配列番号１４）、ＧＲＧＤＱＰＨＮ（配列番号１５）、ＧＲＧＤＮＰＨＱ（配列番号１６）、ＧＲＧＤＳＰＶ（配列番号１７）、またはこれらの組合せを含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  27. 前記コアポリペプチドが、配列（ＲＬＰ）n（配列番号１）を含み、ｎが２０～２００の繰り返し数である、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  28. 前記コロナポリペプチドが、配列（ＥＬＰ）ｍ（配列番号８）を含み、ｍが４０～２００の繰り返し数である、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  29. 前記ジブロックが、
    ＲＬＰ４０－ＥＬＰ４０（配列番号８３）、
    ＲＬＰ４０－ＥＬＰ８０（配列番号８４）、
    ＲＬＰ４０－ＥＬＰ１６０（配列番号８２）、
    ＲＬＰ６０－ＥＬＰ８０（配列番号８５）、
    ＲＬＰ８０－ＥＬＰ８０（配列番号８７）、
    ＲＬＰ８０－ＥＬＰ１６０（配列番号８６）、または
    ＲＬＰ１００－ＥＬＰ８０（配列番号８８）
    を含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  30. 前記標的化ポリペプチドが、２ｋＤａ～１００ｋＤａのポリペプチドを含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  31. 前記結合ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）（配列番号６０）由来のＩＩＩ型ドメイン、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）（配列番号６２）由来のＦｎ３ドメイン、またはブドウ球菌タンパク質Ａ（配列番号６４）のＺドメインを含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  32. 前記結合ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ３）（配列番号６０）由来のＩＩＩ型ドメインを含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  33. 前記結合ポリペプチドが、ヒトテネイシンＣ（Ｔｎ３）（配列番号６２）由来のＦｎ３ドメインを含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  34. 前記結合ポリペプチドが、（配列番号６４）を含む配列を有するブドウ球菌タンパク質ＡのＺドメインを含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  35. 前記結合ポリペプチドが、ＥｒｂＢ２受容体結合タンパク質（ＡＮＨＰ）（配列番号７４）を含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  36. 前記結合ポリペプチドが、細胞結合ペプチド（ＧＲＧＤＳＰＡＳ）（配列番号７６）を含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  37. 前記結合ポリペプチドが、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）結合タンパク質（ＰＫＤ２）（配列番号１１２）を含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  38. 前記結合ポリペプチドが、アデノウイルス（ＡｄＶ）結合タンパク質（ＣＡＲ）（配列番号１１４）を含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  39. 前記結合ポリペプチドが、レンチウイルス（ＬＶ）結合タンパク質（ＣＲ２）（配列番号１１６）または（ＣＲ３）（配列番号１１８）を含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  40. 前記結合ポリペプチドが、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）（配列番号１２０）を含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  41. 前記コアが、光または他のクリックケミストリーに適合するリンカーを使用して共有結合的に架橋される、請求項２２～４０のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
  42. 前記コアポリペプチドが架橋されている、請求項２２～４１のいずれか１項に記載のタンパク質ナノ粒子。
  43. 前記ナノ粒子が、その内部に１種以上の低分子薬物を封入している、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  44. 前記融合タンパク質が、治療用タンパク質をさらに含む、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  45. 前記組成物が、治療剤、標的送達剤、分離剤、または精製剤である、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子。
  46. 請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子を含む治療剤。
  47. 請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、治療薬を細胞に標的化する方法。
  48. 請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、治療薬を細胞に送達する方法。
  49. 請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、治療薬を細胞に標的化するための手段。
  50. 請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、治療薬を細胞に送達するための手段。
  51. 生体分子を同定するための方法であって、請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子が、前記生体分子を含有する溶液に添加され、前記タンパク質ナノ粒子が前記生体分子に特異的に結合する、方法。
  52. 生体分子を精製する方法であって、前記生体分子に結合する請求項１８に記載のタンパク質ナノ粒子を使用して、前記生体分子を培地または複合体マトリックスから単離することを含む、方法。
  53. 前記結合ポリペプチドの相分離をトリガーして、前記生体分子を汚染物質から単離することをさらに含み、前記トリガーが、温度、塩分、光、ｐＨ、圧力、前記結合ポリペプチドの濃度もしくは前記生体分子の濃度の調節、電磁波もしくは音響波の適用、または補因子、界面活性剤、クラウディング試薬、還元剤、酸化剤、変性剤、もしくは酵素のうちの１種以上を含む１種以上の賦形剤の添加から選択される、請求項５２に記載の方法。
  54. 遠心分離を使用して、前記生体分子に結合した高密度相分離タンパク質を汚染生体分子から分離することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
  55. 遠心分離を使用して、前記生体分子に結合した相分離タンパク質を汚染生体分子から分離することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
  56. 相分離液滴のサイズを使用して、前記生体分子を汚染物質種から単離することをさらに含み、前記生体分子に結合した前記結合ポリペプチドのサイズが、直径で少なくとも２０ｎｍおよび１００μｍ以下である、請求項５２に記載の方法。
  57. フロー濾過、膜クロマトグラフィー、分析的超遠心分離、高速液体クロマトグラフィー、膜クロマトグラフィー、正常フロー濾過、音波分離、遠心分離、カウンターフロー遠心分離、および高速タンパク質液体クロマトグラフィーを使用して、前記生体分子－結合ポリペプチド複合体をサイズに基づいて汚染物質種から単離することを含む、請求項５２に記載の方法。
  58. 前記生体分子が、脂質、細胞、タンパク質、核酸、炭水化物またはウイルス粒子のうちの少なくとも１種を含み、前記核酸が、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり、前記ウイルス粒子が、アデノウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス粒子、レンチウイルス粒子、レトロウイルス粒子、ポックスウイルス粒子、麻疹ウイルス粒子、またはヘルペスウイルス粒子であり、前記タンパク質が、ヒトアルブミン、モノクローナルＩｇＧ抗体、またはＦｃ融合抗体である、請求項５２に記載の方法。
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