JP2023512831A - 植物において使用される組換えアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
本開示は、アデノ随伴ウイルス(AAV)の構成要素(例えば、植物での発現用にコドン最適化された構成要素)をコードする核酸配列、およびこの核酸配列から発現されるタンパク質に関する。さらに、植物において前記核酸配列を使用することによって、機能性を持つAAV粒子を製造する方法を開示する。本明細書の開示に従った、植物におけるAAVの製造は、効率、コスト、収量、スケーラビリティ、安全性などの点において、従来の製造方法よりも数多くの利点がある。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/971,750号に基づく優先権の利益を主張するものであり、この出願は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
本出願は、2020年2月7日に出願された米国仮特許出願第62/971,750号に基づく優先権の利益を主張するものであり、この出願は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
配列表の参照
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SeqListingVCPRO002WO.TXTというファイル名で2021年2月3日に作成された115,770バイトのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載の情報は、引用によりその全体が本明細書に援用される。
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SeqListingVCPRO002WO.TXTというファイル名で2021年2月3日に作成された115,770バイトのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載の情報は、引用によりその全体が本明細書に援用される。
本開示は、アデノ随伴ウイルス(AAV)の構成要素(例えば、植物での発現用にコドン最適化された構成要素)をコードする核酸配列、およびこの核酸配列から発現されるタンパク質に関する。さらに、植物において前記核酸配列を使用することによって、機能性を持つAAV粒子を製造する方法を開示する。本明細書の開示に従った、植物におけるAAVの製造は、効率、コスト、純度、収量、スケーラビリティ、安全性などの点において、従来のウイルス製造方法よりも数多くの利点がある。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、その免疫原性が極めて低く、有効性が高く、比較的安全であることから、インビトロでのヒト細胞への形質導入や、遺伝子治療のためのインビボでの形質導入に頻繁に使用されている。AAV粒子は、一般に、哺乳動物細胞や昆虫細胞の培養系で製造されるが、このような細胞培養の維持、AAV粒子の精製および十分なウイルス力価の達成は困難であり、費用もかかる。AAV粒子を製造するための改良された方法が今なお求められている。
本明細書では、アデノ随伴ウイルス(AAV)タンパク質をコードする配列を含む核酸、アデノ随伴ウイルス(AAV)タンパク質をコードする配列から実質的になる核酸、またはアデノ随伴ウイルス(AAV)タンパク質をコードする配列からなる核酸に関する実施形態を開示する。いくつかの実施形態において、前記AAVは、血清型1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型、10型、11型または12型のAAVである。いくつかの実施形態において、前記AAVは、研究や臨床適用において一般に使用されている血清型2型のAAV(AAV2)である。AAVタンパク質として、REPタンパク質(REP78、REP68、REP52、REP40)、CAPタンパク質(VP1、VP2、VP3)またはAAPタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。また、アデノウイルスタンパク質によって、宿主細胞でのAAVの複製が増強されることがある。アデノウイルスタンパク質として、E4orf6、E1a、E2a、E2bおよびVAが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、AAVタンパク質をコードする配列を含む前記核酸、AAVタンパク質をコードする配列から実質的になる前記核酸、またはAAVタンパク質をコードする配列からなる前記核酸は、生きている宿主または無細胞系においてAAVタンパク質に転写され、翻訳される。別の実施形態において、AAVタンパク質をコードする配列を含む前記核酸、AAVタンパク質をコードする配列から実質的になる前記核酸、またはAAVタンパク質をコードする配列からなる前記核酸は、AAVタンパク質をコードする野生型配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記核酸は、野生型AAV2タンパク質をコードする野生型配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記核酸は、植物での発現が向上し、増加し、または増強するように、コドンが最適化されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、配列番号2~11と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の配列同一性を有し、AAV2のREPタンパク質(REP78、REP68、REP52もしくはREP48)をコードする核酸;配列番号15~24と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の配列同一性を有し、AAV2のCAPタンパク質(VP1、VP2もしくはVP3)をコードする核酸;配列番号28~37と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の配列同一性を有し、AAV2のAAPタンパク質をコードする核酸;または配列番号40~49と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の配列同一性を有し、Ad5 E4orf6タンパク質をコードする核酸である。いくつかの実施形態において、前記核酸は、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、タバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、アサ(Cannabis sativa)、ソバ(Fagopyrum esculentum)、イネ(Oryza sativa)、トウモロコシ(Zea mays)、ナス属野生種(Solanum lycopersicoides)、トマト(Solanum lycopersicum)またはレタス(Lactuca sativa)での発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、組換え核酸ベクター(pEAQベクターなどが挙げられるが、これに限定されない)、AAV粒子、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の菌体、植物細胞または植物体は、AAVタンパク質をコードする核酸を含む。さらに、植物体からAAV粒子を単離する方法であって、前記植物体が、タバコ属、シロイヌナズナ属、ナス属、アサ属、ソバ属、イネ属、アキノノゲシ属またはトウモロコシ属に属していてもよいことを特徴とする方法についても述べる。いくつかの実施形態において、前記AAV粒子は、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む方法によって植物体から単離される。
いくつかの実施形態において、精製されたAAV粒子は、医薬品として使用される。いくつかの実施形態において、精製されたAAV粒子は、医薬品の製造において使用される。いくつかの実施形態において、精製されたAAV粒子は、哺乳動物宿主細胞(ヒト宿主細胞)に感染させるために使用される。いくつかの実施形態において、精製されたAAV粒子は、疾患の治療に使用される。いくつかの実施形態において、精製されたAAV粒子は、治療用タンパク質または治療用ペプチドを必要とする患者(ヒト患者など)のための遺伝子治療に使用される。いくつかの実施形態において、精製されたAAV粒子は、先天性代謝異常症の治療に使用され、先天性代謝異常症としては、酵素欠損症、糖原病(GSD)、糖原病0型、糖原病I型、糖原病II型、ポンペ病、ダノン病、糖原病III型、糖原病IV型、糖原病V型、糖原病VI型、糖原病VII型、糖原病VIII型、糖原病IX型、先天性ラクターゼ欠損症、ショ糖不耐症、果糖尿症、果糖不耐症、ガラクトキナーゼ欠損症、ガラクトース血症、成人多糖体小体病、糖尿病、高インスリン性低血糖症、トリオースリン酸イソメラーゼ欠損症、ピルビン酸キナーゼ欠損症、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、フルクトースビスホスファターゼ欠損症、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、トランスアルドラーゼ欠損症、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、高シュウ酸尿症、五炭糖尿症、またはアルドラーゼA欠損症が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、精製されたAAV粒子は、神経疾患または神経変性疾患の治療に使用され、神経疾患または神経変性疾患としては、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、パーキンソン病、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ムコ多糖症IIIB型、または芳香族L-アミノ酸脱炭酸酵素欠損症が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、精製されたAAV粒子は、網膜変性疾患の治療に使用され、網膜変性疾患としては、網膜色素変性症、アッシャー症候群、シュタルガルト病、全脈絡膜萎縮、色盲またはX連鎖性網膜分離症が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、精製されたAAV粒子は血液疾患の治療に使用され、血液疾患としては、βサラセミア、鎌状赤血球症または血友病が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、精製されたAAV粒子は、難聴の遺伝的要因または先天的要因の治療に使用される。いくつかの実施形態において、精製されたAAV粒子は、ウィスコット・アルドリッチ症候群、X連鎖性慢性肉芽腫症、劣性栄養障害型表皮水疱症、ムコ多糖症I型、α1アンチトリプシン欠損症、またはホモ型家族性高コレステロール血症の治療に使用される。
いくつかの実施形態において、植物体は水耕法で栽培される。いくつかの実施形態において、発芽に適した湿度において、肥料溶液で浸したGrodan社のロックウールキューブに植物体の種子を播く。いくつかの実施形態において、発芽した種子または植物体は、例えば、16時間の明期/8時間の暗期、24時間の明期/0時間の暗期、12時間の明期/12時間の暗期、または18時間の明期/6時間の暗期などの明暗周期で維持する。いくつかの実施形態において、発芽した種子または植物体は、華氏50度、華氏55度、華氏60度、華氏65度、華氏70度、華氏75度、華氏80度、華氏85度、華氏90度、華氏95度もしくは華氏100度、またはこれらの温度のいずれか2つを上下限とする範囲内の温度などの適温で維持される。いくつかの実施形態において、種子は、1日以内、2日以内、3日以内、4日以内、5日以内、6日以内、7日以内、8日以内、9日以内、10日以内、11日以内、12日以内、13日以内、14日以内、15日以内、16日以内、17日以内、18日以内、19日以内、20日以内、21日以内、22日以内、23日以内、24日以内、25日以内、26日以内、27日以内、28日以内、29日以内または30日以内に発芽する。いくつかの実施形態において、茎が伸び始めたら、1日以内、2日以内、3日以内、4日以内、5日以内、6日以内、7日以内、8日以内、9日以内、10日以内、11日以内、12日以内、13日以内、14日以内、15日以内、16日以内、17日以内、18日以内、19日以内、20日以内、21日以内、22日以内、23日以内、24日以内、25日以内、26日以内、27日以内、28日以内、29日以内または30日以内に、生長過程の植物体を大きな容器に移すべきである。
いくつかの実施形態において、AAV2遺伝子を含む、核酸プラスミド、核酸コンストラクトまたは核酸ベクターが構築される。いくつかの実施形態において、AAV2遺伝子を含むこれらの核酸プラスミド、核酸コンストラクトまたは核酸ベクターは、pEAQ-HT-Ad5Orf6-OPT_AAV2-AAP-OPT、pEAQ-HT_CAPoptまたはpEAQ-HT-REPopt_AVGFPoptを含む。いくつかの実施形態において、これらのプラスミド、コンストラクトまたはベクターを用いて、A.ツメファシエンスを形質転換する。いくつかの実施形態において、形質転換したA.ツメファシエンスは、適切な規模の培養により増殖させ、例えば、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、1L、2L、3L、4L、5L、10L、20L、30L、40L、50L、100L、1000L、5000L、10000L、50000L、100000L、1000000L、またはこれらの容積のいずれか2つを上下限とする範囲内の容積の培養により増殖させる。いくつかの実施形態において、形質転換したA.ツメファシエンスの培養物を用いて、植物体のアグロインフィルトレーションを行う。いくつかの実施形態において、アグロインフィルトレーションを行った植物体は、その細胞内でAAV2粒子を生産する。いくつかの実施形態において、植物体の一部、例えば、葉、茎、花、根、果実などを採取して処理することによって、AAV2粒子を精製する。
いくつかの実施形態において、AAV2粒子は、遠心分離、クロマトグラフィー、濾過またはその他の方法を用いて、生物試料を処理することによって得られる。いくつかの実施形態において、1本の植物体から、少なくとも104個、105個、106個、107個、108個、109個、1010個、1011個、1012個、1013個または1014個のウイルス粒子またはウイルスゲノムが精製される。いくつかの実施形態において、精製された全ウイルス粒子のうち、少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が完全なウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子の純度は、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%である。いくつかの実施形態において、これらの精製されたウイルス粒子は、形質導入、研究、遺伝子治療または治療目的に使用される。
本発明の好ましい態様は、以下の付番された実施形態に関連する。
請求項1.AAV2のREPタンパク質をコードする配列を含む核酸分子であって、前記配列が、配列番号2~11と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、核酸分子。
請求項2.前記配列が、配列番号2と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、請求項1に記載の核酸分子。
請求項3.AAV2のCAPタンパク質をコードする配列を含む核酸分子であって、前記配列が、配列番号15~24と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、核酸分子。
請求項4.前記配列が、配列番号15と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、請求項3に記載の核酸分子。
請求項5.AAV2のAAPタンパク質をコードする配列を含む核酸分子であって、前記配列が、配列番号28~37と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、核酸分子。
請求項6.前記配列が、配列番号28と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、請求項5に記載の核酸分子。
請求項7.Ad5 E4orf6タンパク質をコードする配列を含む核酸分子であって、前記配列が、配列番号40~49と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、核酸分子。
請求項8.前記配列が、配列番号40と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、請求項7に記載の核酸分子。
請求項9.請求項1~8のいずれか1項に記載の核酸分子を含む組換え核酸ベクター。
請求項10.請求項1~8のいずれか1項に記載の核酸分子または請求項10に記載のベクターによってコードされるタンパク質。
請求項11.請求項1~8のいずれか1項に記載の少なくとも1つの核酸分子、請求項9に記載のベクターまたは請求項10に記載のタンパク質を含むAAV粒子。
請求項12.請求項1~8のいずれか1項に記載の少なくとも1つの核酸分子、請求項9に記載の組換え核酸ベクター、請求項10に記載のタンパク質または請求項11に記載のAAV粒子を含む植物細胞。
請求項13.請求項12に記載の植物細胞を含む植物体。
請求項14.タバコ属、シロイヌナズナ属、ナス属、アサ属、ソバ属、イネ属またはトウモロコシ属に属する、請求項12に記載の植物細胞または請求項13に記載の植物体。
請求項15.前記植物が、タバコ属に属する種である、請求項14に記載の植物細胞または植物体。
請求項16.前記植物が、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)またはタバコ(Nicotiana tabacum)である、請求項15に記載の植物細胞または植物体。
請求項17.請求項12~16に記載の植物細胞または植物体のいずれか1種の葉、茎、花または根。
請求項18.植物体においてAAVタンパク質を製造する方法であって、
植物体での発現用にコドン最適化されており、かつAAVタンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を植物体に接触させる工程;
前記少なくとも1つの組換え核酸ベクターを前記植物体の細胞に移入する工程;
前記植物体の細胞において前記AAVタンパク質を発現させる工程;および
任意で、前記植物体の細胞から前記AAVタンパク質を単離する工程
を含み、
前記接触工程において、請求項9に記載の組換え核酸ベクターを使用してもよい、
方法。
植物体での発現用にコドン最適化されており、かつAAVタンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を植物体に接触させる工程;
前記少なくとも1つの組換え核酸ベクターを前記植物体の細胞に移入する工程;
前記植物体の細胞において前記AAVタンパク質を発現させる工程;および
任意で、前記植物体の細胞から前記AAVタンパク質を単離する工程
を含み、
前記接触工程において、請求項9に記載の組換え核酸ベクターを使用してもよい、
方法。
請求項19.複数種のAAVタンパク質を同じ植物体において製造する、請求項18に記載の方法。
請求項20.前記植物体においてAAV粒子を製造し、該AAV粒子を任意で該植物体から単離することを特徴とする、請求項19に記載の方法。
請求項21.前記AAV粒子が、哺乳動物細胞への感染力を持ち、該哺乳動物細胞がヒト細胞であってもよく、HEK293T細胞であってもよい、請求項20に記載の方法。
請求項22.前記植物体が、タバコ属、シロイヌナズナ属、ナス属、アサ属、ソバ属、イネ属、アキノノゲシ属またはトウモロコシ属に属する、請求項18~21のいずれか1項に記載の方法。
請求項23.前記植物体が、タバコ属に属する種である、請求項22に記載の方法。
請求項24.前記植物体が、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)またはタバコ(Nicotiana tabacum)であり、前記核酸配列が、ベンサミアナタバコまたはタバコでの発現用にコドン最適化されている、請求項23に記載の方法。
請求項25.前記AAVタンパク質の単離工程が、遠心分離、濾過および/またはクロマトグラフィーを含む、請求項18~24のいずれか1項に記載の方法。
請求項26.前記クロマトグラフィーが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィーである、請求項25に記載の方法。
請求項27.前記少なくとも1つの組換え核酸ベクターが、配列番号2~11、15~24、28~37または40~49と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する少なくとも1つの配列を含む、請求項18~26のいずれか1項に記載の方法。
請求項28.前記植物体から、少なくとも107コピー、108コピー、109コピー、1010コピー、1011コピー、1012コピー、1013コピーまたは1014コピーのAAVタンパク質が得られる、請求項18~27のいずれか1項に記載の方法。
請求項29.前記植物体から、少なくとも1012コピー、1013コピーまたは1014コピーのAAVタンパク質が得られる、請求項28に記載の方法。
請求項30.遺伝子治療を行う方法であって、請求項18~29のいずれか1項に記載の方法によって製造され、単離されたAAV粒子を、遺伝子治療を必要とする対象の細胞に投与することを含む、方法。
請求項31.医薬品として使用するための、請求項9に記載の組換え核酸ベクター、請求項11に記載のAAV粒子、または請求項20もしくは21に記載の方法によって製造されたAAV粒子。
請求項32.ヒト疾患を治療するための遺伝子治療において使用するための、請求項9に記載の組換え核酸ベクター、請求項11に記載のAAV粒子、または請求項20もしくは21に記載の方法によって製造されたAAV粒子であって、該ヒト疾患が、例えば、先天性代謝異常症、酵素欠損症、ポンペ病、ダノン病、神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、網膜変性疾患、網膜色素変性症、アッシャー症候群、シュタルガルト病、または難聴の遺伝的要因である、組換え核酸ベクター、AAV粒子、または前記方法によって製造されたAAV粒子。
請求項33.植物体において機能性AAV粒子を製造する方法であって、
AAV粒子の構成要素またはAAV粒子の組み立てに関与する構成要素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸ベクターを用いて植物体を形質転換する工程;
前記AAV粒子が前記植物体において発現されて組み立てられる条件下で前記植物体を生長させる工程;および
前記植物体から前記AAV粒子を単離する工程
を含む方法。
AAV粒子の構成要素またはAAV粒子の組み立てに関与する構成要素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸ベクターを用いて植物体を形質転換する工程;
前記AAV粒子が前記植物体において発現されて組み立てられる条件下で前記植物体を生長させる工程;および
前記植物体から前記AAV粒子を単離する工程
を含む方法。
請求項34.前記植物体の形質転換工程が、アグロインフィルトレーションによって行われる、請求項33に記載の方法。
請求項35.前記AAV粒子の構成要素をコードする核酸配列が、前記植物体用にコドン最適化されている、請求項33または34に記載の方法。
請求項36.前記植物体が、タバコ属、シロイヌナズナ属、ナス属、アサ属、ソバ属、イネ属、アキノノゲシ属またはトウモロコシ属に属する、請求項33~35のいずれか1項に記載の方法。
請求項37.前記植物体が、タバコ属、アキノノゲシ属またはアサ属に属する種である、請求項33~36のいずれか1項に記載の方法。
請求項38.前記植物体が、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、タバコ(Nicotiana tabacum)、レタス(Lactuca sativa)またはアサ(Cannabis sativa)である、請求項33~37のいずれか1項に記載の方法。
請求項39.前記AAV粒子の構成要素または前記AAV粒子の組み立てに関与する構成要素が、REPタンパク質、CAPタンパク質、AAPタンパク質もしくはAd5 E4orf6タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項33~38のいずれか1項に記載の方法。
請求項40.前記REPタンパク質が、下流のインフレームのポリペプチドの翻訳を増強させる弱い植物コザック配列、および/または潜在的なORFの発現を阻止するための内部のメチオニンコドンの変異を含む核酸配列によってコードされる、請求項39に記載の方法。
請求項41.前記REPタンパク質が、配列番号1~11と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項39または40に記載の方法。
請求項42.前記REPタンパク質が、配列番号12または13と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するペプチド配列を含む、請求項39~41のいずれか1項に記載の方法。
請求項43.前記CAPタンパク質が、下流のインフレームのポリペプチドの翻訳を増強させる弱い植物コザック配列を含む核酸配列によってコードされる、請求項39~42のいずれか1項に記載の方法。
請求項44.前記CAPタンパク質が、配列番号14~24と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項39~43のいずれか1項に記載の方法。
請求項45.前記CAPタンパク質が、配列番号25または26と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するペプチド配列を含む、請求項39~44のいずれか1項に記載の方法。
請求項46.前記AAPタンパク質が、配列番号27~37と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項39~45のいずれか1項に記載の方法。
請求項47.前記AAPタンパク質が、配列番号38と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するペプチド配列を含む、請求項39~46のいずれか1項に記載の方法。
請求項48.前記Ad5 E4orf6タンパク質が、配列番号39~49と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項39~47のいずれか1項に記載の方法。
請求項49.前記Ad5 E4orf6タンパク質が、配列番号50と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するペプチド配列を含む、請求項39~48のいずれか1項に記載の方法。
請求項50.前記AAV粒子の単離工程が、遠心分離、濾過および/またはクロマトグラフィーを含む、請求項33~49のいずれか1項に記載の方法。
請求項51.前記クロマトグラフィーが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィーである、請求項50に記載の方法。
請求項52.前記植物体から、少なくとも107個、108個、109個、1010個、1011個、1012個、1013個または1014個のAAV粒子が単離される、請求項33~51のいずれか1項に記載の方法。
請求項53.前記植物体から、少なくとも1012個、1013個または1014個のAAV粒子が単離される、請求項33~52のいずれか1項に記載の方法。
請求項54.前記AAV粒子が、哺乳動物細胞への感染力を持ち、該哺乳動物細胞がヒト細胞であってもよく、HEK293T細胞であってもよい、請求項33~53のいずれか1項に記載の方法。
請求項55.前記AAV粒子を、ヒトなどの哺乳動物に投与する工程をさらに含む、請求項33~53のいずれか1項に記載の方法。
請求項56.疾患の治療に使用するための、請求項33~53のいずれか1項に記載の方法によって製造されたAAV粒子。
請求項57.医薬品の製造に使用するための、請求項33~53のいずれか1項に記載の方法によって製造されたAAV粒子。
前述した特徴以外のさらなる特徴や変形例は、以下の図面の説明および例示される実施形態から容易に理解できるであろう。以下の図面は代表的な実施形態を示したものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
以下の詳細な説明において、本明細書の一部を構成する添付の図面を参照しながら本発明を説明する。別段の記載がない限り、図面中の類似の記号は、通常、類似の構成要素を示す。詳細な説明、図面および請求項に記載の実施形態は説明を目的としたものであり、本発明をなんら限定するものではない。本明細書に記載の主題の要旨や範囲から逸脱することなく、その他の実施形態を採用してもよく、その他の変更を加えてもよい。本明細書に概説し、図面に示した本開示の態様は、様々な構成で配置、置換、合体、分離および設計できることは容易に理解され、このような態様はいずれも本明細書において明確に想定されている。
別段の記載がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。本開示を目的として、以下の用語を以下で定義する。
本明細書において、「a」および「an」という冠詞は、この冠詞の文法上の目的語となる1つまたは複数の(例えば、少なくとも1つの)ものを指すために使用される。例えば、「an element」は、1つの構成要素または複数の構成要素を意味する。
「約」は、特定の数量、レベル、数値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量または長さが、基準となる数量、レベル、数値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量または長さと比較して、30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%の範囲で変動することを意味する。
本明細書を通して、別段の記載がない限り、「含む」および「含んでいる」という用語は、本明細書に記載の工程もしくは構成要素または工程群もしくは構成要素群を包含することを意味するが、その他の工程もしくは構成要素または工程群もしくは構成要素群を除外するものではない。「からなる」は、この用語の前に挙げられたもののみを含むことを意味する。したがって、「からなる」という用語は、この用語の前に挙げられた構成要素が必要または必須であることを示し、その他の構成要素は含まれていなくてもよいことを意味する。「実質的に~からなる」は、この用語の前に挙げられた構成要素を含み、これらの構成要素の開示に関連して記載された活性または作用に対して妨害も寄与もしないその他の構成要素も含むことを意味する。したがって、「実質的に~からなる」という用語は、この用語の前に挙げられた構成要素が必要または必須であることを示すが、その他の構成要素は任意であり、この用語の前に挙げられた構成要素の活性または作用に実質的な影響を与えるかどうかに応じて含まれていてもよく、含まれていなくてもよい。
本開示の実施にあたって、別段の記載がない限り、当技術分野で従来公知の分子生物学的方法および組換えDNA技術が使用される。
本明細書において、「機能」や「機能的」という用語は、生物学的機能または酵素的機能を指す。
本明細書において、「単離された」は、天然の状態において通常付随する成分が実質的または本質的に除去された材料を意味する。例えば、「単離されたタンパク質」は、その天然の状態での環境または生物から精製されたタンパク質を含む。
本明細書において、「核酸」または「核酸分子」は、ポリヌクレオチドを指し、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得られる断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより得られる断片が挙げられる。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー(DNAやRNAなど)、もしくは天然のヌクレオチドの類似体(例えば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー)、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および/またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミンまたはアジド基による1つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、例えば、アザ糖および炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、およびその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)結合、ホスホロアニリデート(phosphoranilidate)結合およびホスホロアミデート結合が挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。「オリゴヌクレオチド」という用語は核酸と同じ意味で使用可能であり、二本鎖DNAまたは二本鎖RNAを指してもよく、一本鎖DNAまたは一本鎖RNAを指してもよい。核酸は、様々な生物系で核酸を増幅および/または発現させることができる核酸ベクターまたは核酸コンストラクト(例えば、プラスミド、ウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、バクテリオファージ、コスミド、フォスミド、ファージミド、細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)またはヒト人工染色体(HAC))に含まれていてもよい。通常、核酸ベクターまたは核酸コンストラクトは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、インデューサー、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、複製開始点、クローニング部位、マルチクローニング部位、制限酵素部位、エピトープ、レポーター遺伝子、選択マーカー、抗生物質選択マーカー、標的配列、ペプチド精製タグもしくはアクセサリー遺伝子またはこれらの任意の組み合わせなどのエレメントも含むが、これらに限定されない。
核酸または核酸分子は、複数の種類のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする1つ以上の配列を含んでいてもよい。これらの1つ以上の配列は、1つの核酸または核酸分子内で隣接して連結していてもよく、別の核酸を間に挟んで連結していてもよい。この別の核酸としては、例えば、リンカー、反復配列、もしくは制限酵素部位、または、1塩基長、2塩基長、3塩基長、4塩基長、5塩基長、6塩基長、7塩基長、8塩基長、9塩基長、10塩基長、11塩基長、12塩基長、13塩基長、14塩基長、15塩基長、16塩基長、17塩基長、18塩基長、19塩基長、20塩基長、25塩基長、30塩基長、35塩基長、40塩基長、45塩基長、50塩基長、55塩基長、60塩基長、65塩基長、70塩基長、75塩基長、80塩基長、85塩基長、90塩基長、95塩基長、100塩基長、150塩基長、200塩基長、300塩基長、400塩基長、500塩基長、1000塩基長、2000塩基長、3000塩基長、4000塩基長もしくは5000塩基長の配列、もしくはこれらの長さのいずれか2つを上下限とする範囲内の長さの配列が挙げられる。本明細書において、核酸に関する「下流」という用語は、核酸が二本鎖である場合はコード配列を含む鎖(センス鎖)上で、ある配列の3’末端側に位置する配列を意味する。本明細書において、核酸に関する「上流」という用語は、核酸が二本鎖である場合はコード配列を含む鎖(センス鎖)上で、ある配列の5’末端側に位置する配列を意味する。本明細書において、核酸に関する「グループ化されている」という用語は、直接連結している近接した2つ以上の配列、または別の核酸を間に挟んで連結している近接した2つ以上の配列を意味する。この別の核酸としては、例えば、リンカー、反復配列、もしくは制限酵素部位、または、1塩基長、2塩基長、3塩基長、4塩基長、5塩基長、6塩基長、7塩基長、8塩基長、9塩基長、10塩基長、11塩基長、12塩基長、13塩基長、14塩基長、15塩基長、16塩基長、17塩基長、18塩基長、19塩基長、20塩基長、25塩基長、30塩基長、35塩基長、40塩基長、45塩基長、50塩基長、55塩基長、60塩基長、65塩基長、70塩基長、75塩基長、80塩基長、85塩基長、90塩基長、95塩基長、100塩基長、150塩基長、200塩基長、300塩基長、400塩基長、500塩基長、1000塩基長、2000塩基長、3000塩基長、4000塩基長もしくは5000塩基長の配列、もしくはこれらの長さのいずれか2つを上下限とする範囲内の長さの配列が挙げられる。なお、配列の間に挟まれている核酸配列は、通常、機能性または触媒性のポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質ドメインをコードしていない。
本明細書において、核酸に関する「コドン最適化」という用語は、種特異的なコドン使用バイアスおよび標的細胞の細胞質における各アミノアシルtRNAの相対的利用率に基づいて、ポリペプチド配列を変更せずに特定の種の宿主における翻訳を促進または最大化するために核酸のコドン置換を行うことを意味する。コドン最適化およびコドン最適化技術は、当技術分野で公知である。さらに、合成コドン最適化配列は、DNAシーケンス受託サービス提供業者から商業的に入手することができる。当業者であれば、遺伝子の発現量が、プロモーター配列や調節エレメントなどの多くの因子によって決まることは理解できるだろう。多くの細菌で見られるように、コドンの小さなサブセットはtRNA種によって認識されるが、これが翻訳選択につながり、タンパク質の発現に重要な制限になることがある。この点で、多くの合成遺伝子は、そのタンパク質の発現量が増加するように設計することが可能である。いくつかの実施形態において、遺伝子を特定の生物での発現用にコドン最適化することにより、該遺伝子の発現量は、コドン最適化されていない遺伝子配列または野生型遺伝子配列の発現量の少なくとも100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、850%、900%、950%または1000%になる。
本明細書に記載の核酸は、核酸塩基を含む。基本の塩基、すなわち、標準の塩基、天然の塩基または非修飾塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルである。その他の核酸塩基としては、プリン類、ピリミジン類、修飾核酸塩基、5-メチルシトシン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、7-メチルグアノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、5,6-ジヒドロウラシル、5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ブロモウラシル、イソグアニン、イソシトシン、アミノアリル塩基、色素標識塩基、蛍光標識塩基、またはビオチン標識塩基などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸で構成される巨大分子を指す。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の機能として数多くのものが当技術分野で知られており、酵素、構造、輸送、防御、ホルモンまたはシグナル伝達といった機能があるが、これらに限定されない。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、核酸鋳型を利用したリボソーム複合体により生物学的に生成されることが多いが、常にこの方法で生成される訳ではなく、化学合成により作製することもできる。核酸鋳型を遺伝子操作することによって、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の変異を起こすことができ、この変異には、置換、欠失、切断、付加、重複、または2個以上のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の融合が含まれる。2個以上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の融合は、1つの分子内で隣接して連結するように行うことができ、あるいは別のアミノ酸を間に挟んで連結することもでき、この別のアミノ酸としては、例えば、リンカー、反復配列、エピトープもしくはタグ、または1塩基長、2塩基長、3塩基長、4塩基長、5塩基長、6塩基長、7塩基長、8塩基長、9塩基長、10塩基長、11塩基長、12塩基長、13塩基長、14塩基長、15塩基長、16塩基長、17塩基長、18塩基長、19塩基長、20塩基長、25塩基長、30塩基長、35塩基長、40塩基長、45塩基長、50塩基長、55塩基長、60塩基長、65塩基長、70塩基長、75塩基長、80塩基長、85塩基長、90塩基長、95塩基長、100塩基長、150塩基長、200塩基長もしくは300塩基長の配列もしくはこれらの長さのいずれか2つを上下限とする範囲内の長さの配列が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供され、実施例において使用される核酸配列またはペプチド配列は、植物用に最適化されているが、細菌、真菌、原虫、動物などのその他の生物においても機能するものであってもよい。別の実施形態において、本明細書で提供され、実施例において使用される核酸配列またはペプチド配列と0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の類似性、またはこれらの割合のいずれか2つを上下限とする範囲内の割合の類似性を有する核酸配列またはペプチド配列を使用した場合、生物系の配列の機能に対して効果が認められなくてもよく、わずかな効果しか認められなくてもよい。本明細書において、「類似性」は、基準となる核酸配列またはペプチド配列の全長と同じ順序で核酸またはアミノ酸が並んでおり、配列内に置換、欠失、反復、挿入などの特定の変化を有する核酸配列またはペプチド配列を指す。いくつかの実施形態において、0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%という低い類似性を持つ2つの核酸配列は、異なるコドンを含んでいても、翻訳時に同じアミノ酸にコードされることから、同じポリペプチドをコードすることができる。
本明細書において、「ビリオン」、「ウイルス」または「ウイルスベクター」および「ウイルス粒子」という用語は、別段の記載がない限り、同じ意味で使用される。
本明細書において、「パッケージング」は、一本鎖ウイルスゲノムの産生、外殻(カプシド)タンパク質の組み立て、ウイルスゲノムの封入などを含む事象を指す。適切な条件下でウイルスがパッケージングを行うことができる細胞株に適切なプラスミドベクター(通常、複数のプラスミド)を導入すると、組換えウイルス粒子(すなわち、ビリオンやウイルスベクター)が構築され、培養物中に分泌される。
パルボウイルス科に属するウイルスは、特定の宿主に対する感染力などを特徴とする小さなDNA型動物ウイルスである。より詳しく説明すると、パルボウイルス科は、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科と昆虫に感染するデンソウイルス亜科の2種類に分類される。パルボウイルス亜科(本明細書において、そのメンバーをパルボウイルスと呼ぶ)は、デペンドウイルス属を含み、デペンドウイルス属は、大抵の条件において、細胞培養中での増殖性感染に、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの同時感染を必要とする。デペンドウイルス属は、通常、ヒト(例えば、血清型2型、3A型、3B型、5型および6型)または霊長類(例えば、血清型1型、4型およびrh10型)に感染するアデノ随伴ウイルス(AAV)や、その他の温血動物に感染する関連ウイルス(例えばウシ、イヌ、ウマ、ヒツジのアデノ随伴ウイルスおよびボカウイルス)を含む。
AAVは、近年、遺伝子治療用のウイルスベクターとして好ましいことが見出されており、その理由として、無分裂細胞でも分裂細胞でも効率的に感染させることができること、哺乳動物細胞において、染色体に組み込まれないエピソーム型のAAVゲノムから導入遺伝子を長期間発現させることができること、およびヒトに対する病原性のリスクが比較的低いことがある。これらの利点を踏まえ、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を利用して、神経疾患、眼疾患、聴力障害、血友病B、悪性黒色腫、嚢胞性線維症などの疾患の遺伝子治療の臨床試験が現在行われており、最近では、網膜変性疾患であるレーバー先天性黒内障(LCA)と運動ニューロン疾患である脊髄性筋萎縮症I型(SMA1)の治療剤としてFDAの承認を受けており、生物製剤ライセンス申請(BLA)が受理された。
AAVは、様々な種類の哺乳動物細胞に感染することができる。さらに、AAVによるヒト滑膜線維芽細胞への形質導入は、類似のマウス細胞よりも有意に効率的であることから、AAVは、ヒトの遺伝子治療にとって特に魅力的な選択肢の1つになっている。AAVの指向性は血清型によって大きく異なることから、遺伝子治療の特定の標的に最も適した血清型のAAVを製造する必要がある。現在、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)は、バキュロウイルス発現ベクター系(BEVS)を用いて、HEK 293T細胞、COS細胞、HeLa細胞、KB細胞、その他の哺乳動物細胞株などの哺乳動物細胞、およびSf9細胞、Sf21細胞、その他の昆虫細胞株などの昆虫細胞において生産されている。例えば、米国特許第6,156,303号、米国特許第5,387,484号、米国特許第5,741,683号、米国特許第5,691,176号および米国特許第5,688,676号;米国特許公開第2002/0081721号;国際特許出願WO2000/047757、WO2000/024916、WO2003/042361およびWO1996/017947を参照されたい(これらの文献は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される)。哺乳動物細胞や無脊椎動物細胞ではない植物細胞または生物の体全体を使用した感染性AAVの製造は、これまでに知られていない。同様に、哺乳動物細胞や無脊椎動物細胞ではない植物細胞または生物の体全体を使用したパルボウイルスゲノム(特にデペンドウイルス属のゲノム)の複製もこれまでに知られていない。
高純度で強力な臨床グレードのAAVベクターを大量生産する現行の方法は、哺乳動物細胞培養または昆虫細胞培養を利用したプラットフォームの使用に依存している。これらのプラットフォームは、費用が高く、標準化やモジュール化もされておらず、AAV遺伝子治療用製剤に対する世界的な需要を充足するのに必要な、製法開発規模から生産規模へのスケールアップが難しいことから、AAVベクターの大量生産は困難なものとなっている。J. Fraser Wrightによれば、「様々な種類の組換えAAV製剤、特に、最も商業的に採算の合う疾患に適用することを目的とした組換えAAV製剤の後期臨床開発の要件および製剤ライセンス申請を充足するには、1016~1018個のウイルスゲノムを含むcGMP基準のロットが必要である」(J. F. Wright, “Adeno-associated viral vector manufacturing: keeping pace with accelerating clinical development,” Hum. Gene Ther., vol. 22, no. 8, pp. 913-914, Aug. 2011(この文献は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される))。植物における一過性の遺伝子発現を利用してAAVを製造することができれば、哺乳動物細胞または昆虫細胞を用いた従来の生産方法において現在問題となっている最も困難な課題を解決できると考えられる。すなわち、AAVを用いたあらゆるウイルスベクター製剤において、製造コストおよび施設コストを大幅に削減でき、モジュール化された製造が可能であり、製造のスケールアップが可能な、標準化された製造方法および製造プロセスを実現することができる。
過去20年で、植物は、細菌、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞などのその他の医薬品製造系の重要な競争相手になるまでになった。植物は、強健であり、生長コストが安く、哺乳動物細胞培養や昆虫細胞培養で問題になることがある内毒素や哺乳動物由来の病原体といった夾雑物のリスクが低い。また、植物は、原核生物の発現系とは異なり、糖鎖付加などの翻訳後修飾を導入することができる。昆虫細胞や酵母細胞での糖鎖付加では、非常に単純かつ不均一な高マンノース型の糖鎖修飾しか起こらない。医薬品成分(特にウイルスベクター)のあらゆる製造系は、急な需要の増加に迅速に対応できるものでなければならない。植物での一過性発現は、即座に調節可能であり、製造コストを非常に低く抑えることができ、複製可能な製造モジュールである個々の植物体を用いて直線的にスケールアップ可能であり、植物資源の生産とウイルスベクターの収量の点で非常に効率が高い。植物を一時的な生物工場とする利点として、操作が容易であること、迅速に行えること、低コストであること、植物組織の重量あたりのタンパク質の収量が、植物資源1kgあたり最大で1gという高い収量であることが挙げられる(Glebaら、2007;Thuenemannら、2013)。
臨床試験および商業化を目的として、現在の哺乳動物細胞または昆虫細胞による製造系を用いたrAAVの生産をスケールアップすることは、費用が極めて高くなければ可能ではあるが、課題が山積している。例えば、臨床試験では、1回の投与あたり1015個を超えるrAAV粒子が必要だと考えられ、これは、ライセンス許可された薬剤が使用される大きな患者群では、生産バッチあたり最大で1020個のrAAV粒子が必要であることを意味する。このような製剤の一例として、Sarepta Therapeutics社から販売されているデュシェンヌ型筋ジストロフィー治療用のSRP9001があるが、年齢が3ヶ月(平均重量6kg)から7歳(平均重量23kg)の小児患者の投与量は2×1014vg/kgであり、その世界的な有病率は約200,000人である(Stark, A.E. Ann Transl Med. 2015 Nov; 3(19): 287および臨床試験NCT03375164)。cGMPに準拠した製造にかかるコスト(上流工程、下流工程、QC、充填/最終製剤化)を含めて計算した臨床規模(200L)または生産規模(1000L)でのAAVの製造コストの分析では、接着細胞培養、シングルユースバイオリアクターまたは固定床バイオリアクターを用いて1×1014vgのAAVを製造した場合の製造コストは8000~25000ドルに及ぶとされている(Cameau, E. et al. Cell Gene Therapy Insights 2019; 5(11), 1663-1675)。これを踏まえると、SRP9001などの薬剤製品をcGMPに準拠して世界的に大規模生産する際の製造コストは、シングルユースの最適化された攪拌床/固定床哺乳動物細胞用バイオリアクターを使用したとしても、極端に高くなる。これに関連した問題点は、公知の哺乳動物細胞株を用いたAAVの製造においても生じることが当技術分野において認識されている。さらに、昆虫細胞を用いたBEVS系では、ゲノムが顕著に不安定となり、遺伝子浮動が起こることから、安定なウイルス産生細胞株を効果的に開発することはできない。また、哺乳動物細胞培養または昆虫細胞培養により製造された臨床用のベクターは、哺乳動物細胞や昆虫細胞に含まれる恐らくは病原性の望ましくない物質で汚染される恐れもある。このような問題やその他の問題もあることから、効率的、経済的かつ安全に、大量の感染性rAAV粒子を製造できる別の改良された方法が今なお必要とされている。
細胞培養を用いた製造系とは対照的に、植物資源を用いた製造系では、費用のかかる発酵施設の建造が必要とされないことから、施設を増設することなく製造をスケールアップすることができる。したがって、既に確立されている農業技術を利用した資本効率的な方法で、植物資源の生産能力と上流工程の処理能力を稼働させ、スケールアップすることができる。ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)における最適化された組換えタンパク質の製造実験での収量は、植物資源1kgあたり最大で1gであったことから、インフィルトレーション法/製造工程および精製工程を行った樹齢4~6週間の1本の幼植物体は、哺乳動物細胞懸濁液1Lに相当すると推定される。両者を比較してみると、哺乳動物細胞の培養には、多額のスタートアップ投資と高価な増殖培地が必要とされることから、植物から製造された生物学的薬剤は、現在の細胞培養を用いた系よりも有意に低いコストで済む(Lai H, Chen Q Plant Cell Rep. 2012 Mar; 31(3):573-84)。さらに、組換えタンパク質を発現する植物資源は、バイオリアクターや関連施設を増設することを必要とせずに、農業規模で製造することができることから、植物はその他の発現系と比べてスケーラビリティにも優れている(Chen Q. Biological Engineering Transactions. 2008;1:291-321)。また、細菌菌体とは対照的に、植物は、哺乳動物細胞や昆虫細胞と同様に、タンパク質の適切な翻訳後修飾(糖鎖付加や複数の異種サブユニットの組み立てなど)が必要な、様々な機能を持つ医薬用タンパク質を製造することができる(Lai H, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Feb 9; 107(6):2419-24.)。
本明細書では、迅速に行え、スケールアップ可能であり、高い費用対効果で、植物において臨床グレードの複製欠損型組換えアデノ随伴ウイルスベクターを製造する方法を開示する。さらに、本明細書では、植物において効率的に発現され、その機能が発揮されるようにコドンが最適化された、AAVタンパク質またはAAVゲノムをコードする核酸配列を開示する。
AAVは、直径約20nmの複製欠損型非エンベロープウイルスであり、約4.8キロベースの鎖長の一本鎖DNAゲノムを有する。100種類を超えるAAVの血清型が同定されており、そのうちの少なくとも12種類の血清型についてある程度その特性が評価されている。これらのAAV血清型は、様々な点で顕著に異なる特性を示し、例えば、細胞への侵入に使用する特定の宿主細胞受容体や一次受容体が異なっていたり、特定の宿主細胞の種類(例えば、筋肉細胞、神経細胞、アストロサイト、肝細胞)に対する選択性が異なる。例えば、AAV1、AAV4、AAV5およびAAV6は、N-結合型またはO-結合型のシアル化プロテオグリカンに結合し、AAV9はガラクトースに結合し、AAV2およびAAV3は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合する。AAV2は、これまでに最も研究され利用されてきたAAVであり、様々な血清型をその固有の特性に応じて利用することができる。AAVゲノムは、REP、CAPおよびAAPの3種類の遺伝子を含み、これらの遺伝子の内部のオープンリーディングフレームとプロモーターから、様々な種類のタンパク質やタンパク質断片が生じる。REP遺伝子は、REP78、REP68、REP52およびREP40をコードし、これらのタンパク質はいずれもゲノムの複製とウイルス粒子のパッケージングに関与している。CAP遺伝子は、VP1、VP2およびVP3をコードし、これらのタンパク質は、二十面体のウイルスカプシドを形成する。AAP遺伝子は、CAP配列内の別のリーディングフレームに存在し、集合活性化タンパク質(assembly-activating protein(AAP))をコードする。AAPは、少なくともAAV2において適切なカプシドの形成に必要とされるが、その他の血清型のAAVでは必要とされない。AAV粒子にパッケージされる核酸物質またはゲノムは、末端逆位反復配列(ITR)に挟まれた配列に相当する。野生型ウイルスでは、REP遺伝子配列とCAP遺伝子配列とAAP遺伝子配列がITRに挟まれている。組換えAAVでは、様々な導入遺伝子がITRに挟まれており、このような導入遺伝子として、酵素マーカー(例えばLacZ)をコードする遺伝子;蛍光タンパク質(例えばGFPやEGFP)をコードする遺伝子;光遺伝学タンパク質(例えば、Chr2、ArctT、C1V1)をコードする遺伝子;細胞代謝、カルシウムまたは電気的活性の遺伝子センサー(例えば、GCaMP、rCaMP、遺伝子にコードされた電圧センサー)をコードする遺伝子;薬剤選択マーカーをコードする遺伝子;遺伝子編集タンパク質またはRNA編集タンパク質(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、CRISPR-Casタンパク質、化膿レンサ球菌由来のCas9、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来のCas9、黄色ブドウ球菌由来のCas9、髄膜炎菌由来のCas9、フランシセラ・ノビシダ由来のCas12aまたはCas12b、プレボテラ属由来のp5-125 Cas13a、Cas13b、Cas13cまたはCas13d、ポルフィロモナス・グラエ由来のCas13a、Cas13b、Cas13cまたはCas13d、リエメレラ・アナティペスティファー由来のCas13a、Cas13b、Cas13cまたはCas13d)をコードする遺伝子;導入遺伝子の発現を調節または誘導する遺伝子(例えば、Dox誘導型遺伝子スイッチ、Cumate誘導型遺伝子スイッチ、PhyB-光調節型遺伝子スイッチ);および疾患治療用遺伝子(例えば、嚢胞性線維症のCFTR、血友病Bの第IX因子、レーバー先天性黒内障のRPE65、神経変性疾患のニューロトロフィン)が挙げられるが、これらに限定されない。ITRに挟まれた領域からREPタンパク質が切り出されることによって、導入遺伝子がエピソームとして存在することが可能となり、宿主のゲノムに組み込まれるのではなく、宿主において一過性に発現させることができる。2種以上の血清型を組み合わせたハイブリッド型のAAV粒子を作製することもでき、これによって、形質導入効率、特定の種類の細胞への指向性または宿主細胞の受容体への親和性を調節することができる。
複製欠損型ウイルスであるAAVは、効率的な複製にヘルパーウイルスを必要とする。これは、アデノウイルスを同時に感染させることで行えるが、精製過程でアデノウイルスによる汚染が起きる。これを避けるため、アデノウイルスゲノムのE1領域、E2A領域、E4領域およびVA領域を発現させることによって(AAV遺伝子を含む核酸ベクターから発現させるか、あらかじめ宿主細胞を組換えておく)、効率的なAAVの製造に必要な追加の構成要素のセットを提供する。いくつかの実施形態において、内因性AAVプロモーターを使用した場合、E1領域、E2A領域およびVA領域のみが、効率的なAAVの製造に必要とされる。いくつかの実施形態において、AAV遺伝子は別のプロモーターで誘導することができ、例えば、構成的プロモーター、誘導型プロモーター、その他のウイルスのプロモーター、哺乳動物のプロモーター、細菌のプロモーター、真菌のプロモーターまたは植物のプロモーターで誘導することができる。いくつかの実施形態において、E4領域のみがAAVの複製に必要とされる。いくつかの実施形態において、植物体の形質転換工程において、アデノウイルス5型のE4orf6遺伝子(Ad5 E4orf6)をAAV発現ベクターに提供することによって、AAVの収量を増加させる。
いくつかの実施形態において、AAV粒子は、無菌条件での制御された手順または管理された手順で製造される。無菌性を維持および確保する方法は、医薬品の製造管理および品質管理の基準(GMP)、再生医療製品の製造管理および品質管理の基準(good tissue practice(GTP))、優良試験所基準(GLP)および医薬品の適正流通基準(GDP)に準拠してもよい。無菌性を維持および確保する方法としては、HEPA(high-efficiency particulate air)フィルターによる濾過、湿熱処理もしくは乾熱処理、光線照射(例えば、X線、γ線、UV光など)、滅菌剤もしくは燻蒸剤(例えば、エチレンオキシド、二酸化窒素、オゾン、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、過酢酸、二酸化塩素、過酸化水素など)、滅菌容器への無菌充填、プラスチックフィルムもしくはプラスチックラップによる包装、または真空パックが挙げられるが、これらに限定されない。
様々な方法を利用してAAVを精製することによって、個体に害を与えうる潜在的な夾雑物を排除し、かつ機能性を持たない空のカプシドを精製から除外しつつ、最適化された収量の機能性ウイルス粒子を得ることができる。この目的を達成するため、当技術分野で公知の技術を使用してAAVを精製することができる。当技術分野で公知の精製技術としては、抽出法、凍結融解法、均質化、透過法、遠心分離法、密度勾配遠心分離法、塩化セシウム勾配遠心法、イオジキサノール勾配遠心分離法、超遠心分離法、分画法、沈殿法、SDS-PAGE、native PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫酸ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、シアル酸アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、金属結合クロマトグラフィー、ニッケルカラムクロマトグラフィー、エピトープタグによる精製、もしくは凍結乾燥法、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
その他の種類の生物と同様に、特定の植物は、その特性から研究または製造に好適に使用できることが見出されており、研究や製造に好適な特性としては、大きさ、生長速度、栽培の容易さ、利用可能な病原体やベクター、耐病性、外界条件への適応性、要光量、遺伝子操作の容易さ、産生されるフィトケミカルの種類、ゲノム配列の利用性などがある。このような特性またはその他の所望の特性を有することから有用な植物としては、タバコ属(Nicotiana)、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、タバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ナス属(Solanum)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、トマト(Solanum lycopersicum)、ナス属野生種(Solanum lycopersicoides)、アサ属(Cannabis)、アサ(Cannabis sativa)、ソバ属(Fagopyrum)、ソバ(Fagopyrum esculentum)、イネ属(Oryza)、イネ(Oryza sativa)、トウモロコシ属(Zea)、トウモロコシ(Zea mays)、オオムギ属(Hordeum)、オオムギ(Hordeum vulgare)、イワヒバ属(Selaginella)、イヌカタヒバ (Selaginella moellendorffii)、ヤマカモジグサ属(Brachypodium)、ミナトカモジグサ(Brachypodium distachyon)、ミヤコグサ属(Lotus)、ミヤコグサ(Lotus japonicus)、アオウキクサ属(Lemna)、イボウキクサ(Lemna gibba)、ウマゴヤシ属(Medicago)、タルウマゴヤシ(Medicago truncatula)、ミゾホオズキ属(Mimulus)、セイタカミゾホオズキ(Mimulus guttatus)、ニセツリガネゴケ属(Physcomitrella)、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)、ヤマナラシ属(Populus)、ブラックコットンウッド(Populus trichocarpa)、アキノノゲシ属(Lactuca)、もしくはレタス(Lactuca sativa)、またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)で形質転換することができるあらゆる植物種が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記植物はタバコ属に属する。いくつかの好ましい実施形態において、前記植物はベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)である。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、植物に対して病原性を持つ細菌であり、虫こぶ、根頭癌腫または植物腫瘍を植物に引き起こす。A.ツメファシエンスは、腫瘍誘導プラスミド(Tiプラスミド)を介して病原性を発揮する。Tiプラスミドは、宿主植物に移入されるT-DNA領域を含み、IV型分泌系をコードする遺伝子の病原性遺伝子アイランドすなわち毒性領域がこの移入を担っている。T-DNA領域は、オーキシンやサイトカイニンなどの植物ホルモンを合成するタンパク質をコードする遺伝子を含み、これらの植物ホルモンによって虫こぶや植物腫瘍の増殖が起こる。(これらの植物疾患の発症を防ぐために)この遺伝子を取り除き、発現用の所望の遺伝子を挿入することによって、植物を遺伝子組換えするための強力なツールとしてA.ツメファシエンスを利用することができる。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを発現させることによって、ネオマイシン、カナマイシンまたはG418(ジェネティシン)に対する耐性を付与し、これらの耐性を検出することによって、形質転換されたA.ツメファシエンスまたは植物体を選択してもよい。A.ツメファシエンスを用いた植物の形質転換に関するさらに詳しい情報は、米国特許公開第5,792,935号に記載されている(この文献は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される)。
本明細書において、「植物プロモーター」は、コード配列の上流に位置して、転写を開始させる非翻訳核酸配列を指す。植物は特定の環境条件に応答するプロモーターを有していてもよく、このようなプロモーターとして、光応答性プロモーター、ストレス応答性プロモーター、植物ホルモン応答性プロモーター、スクロース応答性プロモーター、低酸素応答性プロモーター、およびノパリンシンターゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。植物においてAAVもしくはその他のウイルスまたはタンパク質を製造し、その後これらを精製する場合、通常、強力な構成的プロモーターが望ましい。いくつかの実施形態において、この用途で使用される強力な構成的プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、ササゲモザイクウイルスプロモーター、オピンプロモーター、ユビキチンプロモーター、イネアクチン1プロモーター、およびトウモロコシアルコール脱水素酵素1プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、pEAQ-HTベクターを含むA.ツメファシエンスを用いて、一過性または安定に植物を形質転換する(アグロインフィルトレーション)。このpEAQベクターは、T-DNA領域内にササゲモザイクウイルスプロモーター配列(活性を増強するU162C変異を含む)を含むことから、植物におけるタンパク質の発現率が高く、外来ウイルスを産生しない。一方、別の実施形態では、pBINPLUS、pPZP3425、pPZP5025、pPZPTRBO、pJLTRBO、pBY030-2Rなどの別の種類の植物発現ベクターを使用することもできる。pEAQベクターについてのさらに詳しい情報は、米国特許公開第8,674,084号に記載されている(この文献は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される)。
本明細書において、「幼植物体」は若い植物を指す。幼植物体は、完全に生長した植物よりも小さいことから、取り扱いが容易であり、急速に生長し、急速な細胞活動を示す。いくつかの実施形態において、AAVの小規模精製は、少なくとも1本、2本、3本、4本、5本、6本、7本、8本、9本、10本、15本、20本、25本、30本、35本、40本、45本、50本、60本、70本、80本、90本または100本の幼植物体を使用することを含む。別の実施形態において、AAVの大規模精製は、少なくとも100本、200本、300本、400本、500本、600本、700本、800本、900本、1000本、2000本、5000本、10000本、20000本、30000本、40000本または50000本の植物体を使用する規模にまでスケールアップすることができる。
本明細書において、物質、化合物または材料の「純度」とは、その物質、化合物または材料の予想される存在量に対する実際の存在量を指す。例えば、物質、化合物または材料の純度は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%であってもよく、これらの数値の間のあらゆる小数値を含んでいてもよい。純度は、望ましくない不純物により影響を受けることがあり、望ましくない不純物としては、核酸、DNA、RNA、ヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、脂質、細胞膜、細胞残渣、低分子、分解産物、溶媒、担体、ビヒクルもしくは夾雑物、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、AAV産物に実質的に含まれていないものとして、宿主細胞由来のタンパク質、宿主細胞由来の核酸、プラスミドDNA、中空のウイルスベクター、不完全なタンパク質組成またはオリゴマー化した構造を有するAAV粒子、混入ウイルス(例えばAAV以外のウイルス)、脂質エンベロープウイルス、熱ショックタンパク質70(HSP70)、乳酸脱水素酵素(LDH)、プロテアソーム、AAV以外のウイルスによる汚染、宿主細胞の培養物の成分、処理に関連する成分、マイコプラズマ、発熱物質、菌体内毒素および外来性因子が挙げられる。純度は、様々な技術で測定することができ、純度の測定法としては、電気泳動、SDS-PAGE、キャピラリー電気泳動、PCR、rtPCR、qPCR、クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、分光分析法、紫外可視分光分析法、赤外分光分析法、質量分析、核磁気共鳴、重量測定もしくは力価測定、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
植物または植物材料において、アグロインフィルトレーションなどの技術を利用してAAV粒子を製造することによって、当技術分野で公知の技術(哺乳動物細胞や昆虫細胞における製造など)よりも高い純度のAAVを得ることができる。いくつかの実施形態において、植物を用いて製造されたAAV粒子は、動物または哺乳動物の細胞成分や、動物または哺乳動物に特異的な病原体を含んでおらず、具体的には、ウイルス、細菌、原虫もしくは真菌;血清、ウシ血清、抗生物質もしくはホルモン;またはこれらの任意の組み合わせを含んでいない。
本明細書において、物質、化合物または材料の「収量」とは、その物質、化合物または材料の予想される全体量に対する実際の全体量を指す。例えば、物質、化合物または材料の収量は、予想される全体量の少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%であってもよく、これらの数値の間のあらゆる小数値を含んでいてもよい。収量は、反応もしくは処理の効率;望ましくない副反応;分解;投入した物質、化合物もしくは材料の品質;または製造工程における所望の物質、化合物もしくは材料の損失の影響を受けることがある。
植物または植物材料において、アグロインフィルトレーションなどの技術を利用してAAV粒子を製造することによって、当技術分野で公知の技術(哺乳動物細胞や昆虫細胞における製造など)よりも高い収量のAAVを得ることができる。いくつかの実施形態において、4~6週齢の1本の幼植物体から、少なくとも107個、108個、109個、1010個、1011個、1012個、1013個または1014個のAAV粒子が得られる。
本発明の様々な実施形態を説明するため、本明細書では概して肯定的な表現により本発明を開示している。本発明は、物質または材料、方法の工程および条件、プロトコールまたは手順などの、本発明の主題のすべてまたはその一部が除外された実施形態も包含する。
AAV粒子およびその構成要素
本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、AAV2のREPタンパク質をコードする配列を含む核酸分子が開示される。いくつかの実施形態において、前記REPタンパク質は、REP78、REP68、REP52またはREP40を含む。いくつかの実施形態において、前記配列は、配列番号2~11と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記配列は、配列番号2と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。
本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、AAV2のREPタンパク質をコードする配列を含む核酸分子が開示される。いくつかの実施形態において、前記REPタンパク質は、REP78、REP68、REP52またはREP40を含む。いくつかの実施形態において、前記配列は、配列番号2~11と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記配列は、配列番号2と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。
また、本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、AAV2のCAPタンパク質をコードする配列を含む核酸分子が開示される。いくつかの実施形態において、前記CAPタンパク質は、VP1、VP2またはVP3を含む。いくつかの実施形態において、前記配列は、配列番号15~24と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記配列は、配列番号15と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。
また、本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、AAV2のAAPタンパク質をコードする配列を含む核酸分子が開示される。いくつかの実施形態において、前記配列は、配列番号28~37と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記配列は、配列番号28と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。
さらに、本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、Ad5 E4orf6タンパク質をコードする配列を含む核酸分子が開示される。いくつかの実施形態において、前記配列は、配列番号40~49と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記配列は、配列番号40と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。
さらに、本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、本明細書に開示された核酸分子のいずれか1つ以上を含む組換え核酸ベクターが開示される。また、本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、本明細書に開示された核酸分子および核酸ベクターのいずれか1つによってコードされるタンパク質が開示される。また、本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、本明細書に開示された核酸分子、核酸ベクターおよびタンパク質のいずれか1つ以上を含むAAV粒子が開示される。
さらに、本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、本明細書に開示された核酸分子、核酸ベクター、タンパク質およびAAV粒子のいずれか1つ以上を含む植物細胞が開示される。また、本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、本明細書に開示された植物細胞のいずれか1つを含む植物体が開示される。いくつかの実施形態において、前記植物細胞または植物体は、タバコ属、シロイヌナズナ属、ナス属、アサ属、ソバ属、イネ属またはトウモロコシ属に属する。いくつかの実施形態において、前記植物はタバコ属に属する種である。いくつかの実施形態において、前記植物は、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)またはタバコ(Nicotiana tabacum)である。
さらに、本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、本明細書に開示される植物細胞および植物体のいずれか1種の葉、茎、花または根が開示される。
製造方法および使用方法
本明細書において、植物体においてAAVタンパク質を製造する方法が開示される。
いくつかの実施形態において、この方法は、
少なくとも1つの組換え核酸ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を植物体に接触させる工程;
前記少なくとも1つの組換え核酸ベクターを前記植物体の細胞に移入する工程;
前記植物体の細胞においてAAVタンパク質を発現させる工程;および
任意で、前記植物体の細胞から前記AAVタンパク質を単離する工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記少なくとも1つの組換え核酸ベクターは、AAVタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、前記植物体での発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、本明細書に開示された核酸ベクターのいずれか1つの一部を構成している。いくつかの実施形態において、複数種のAAVタンパク質を同じ植物体において製造する。いくつかの実施形態において、前記植物体においてAAV粒子を製造し、該AAV粒子を任意で該植物体から単離する。いくつかの実施形態において、前記AAV粒子は、哺乳動物細胞への感染力を持ち、該哺乳動物細胞はヒト細胞であってもよく、HEK293T細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、前記植物体は、タバコ属、シロイヌナズナ属、ナス属、アサ属、ソバ属、イネ属、アキノノゲシ属またはトウモロコシ属に属する。いくつかの実施形態において、前記植物体はタバコ属に属する種である。いくつかの実施形態において、前記植物体は、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)またはタバコ(Nicotiana tabacum)であり、前記核酸配列は、ベンサミアナタバコまたはタバコでの発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記植物体は、アキノノゲシ属に属する種である。いくつかの実施形態において、前記植物体は、レタス(Lactuca sativa)であり、前記核酸配列は、レタスでの発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記植物体はアサ属に属する種である。いくつかの実施形態において、前記植物体は、アサ(Cannabis sativa)であり、前記核酸配列は、アサでの発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記AAVタンパク質の単離工程は、遠心分離、濾過および/またはクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、前記クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも1つの組換え核酸ベクターは、配列番号2~11、15~24、28~37または40~49と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する少なくとも1つの配列を含む。いくつかの実施形態において、前記植物体から、少なくとも104コピー、105コピー、106コピー、107コピー、108コピー、109コピー、1010コピー、1011コピー、1012コピー、1013コピーまたは1014コピーのAAVタンパク質が得られる。いくつかの実施形態において、前記植物体から、少なくとも1012コピー、1013コピーまたは1014コピーのAAVタンパク質が得られる。
本明細書において、植物体においてAAVタンパク質を製造する方法が開示される。
いくつかの実施形態において、この方法は、
少なくとも1つの組換え核酸ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を植物体に接触させる工程;
前記少なくとも1つの組換え核酸ベクターを前記植物体の細胞に移入する工程;
前記植物体の細胞においてAAVタンパク質を発現させる工程;および
任意で、前記植物体の細胞から前記AAVタンパク質を単離する工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記少なくとも1つの組換え核酸ベクターは、AAVタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、前記植物体での発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、本明細書に開示された核酸ベクターのいずれか1つの一部を構成している。いくつかの実施形態において、複数種のAAVタンパク質を同じ植物体において製造する。いくつかの実施形態において、前記植物体においてAAV粒子を製造し、該AAV粒子を任意で該植物体から単離する。いくつかの実施形態において、前記AAV粒子は、哺乳動物細胞への感染力を持ち、該哺乳動物細胞はヒト細胞であってもよく、HEK293T細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、前記植物体は、タバコ属、シロイヌナズナ属、ナス属、アサ属、ソバ属、イネ属、アキノノゲシ属またはトウモロコシ属に属する。いくつかの実施形態において、前記植物体はタバコ属に属する種である。いくつかの実施形態において、前記植物体は、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)またはタバコ(Nicotiana tabacum)であり、前記核酸配列は、ベンサミアナタバコまたはタバコでの発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記植物体は、アキノノゲシ属に属する種である。いくつかの実施形態において、前記植物体は、レタス(Lactuca sativa)であり、前記核酸配列は、レタスでの発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記植物体はアサ属に属する種である。いくつかの実施形態において、前記植物体は、アサ(Cannabis sativa)であり、前記核酸配列は、アサでの発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記AAVタンパク質の単離工程は、遠心分離、濾過および/またはクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、前記クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも1つの組換え核酸ベクターは、配列番号2~11、15~24、28~37または40~49と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する少なくとも1つの配列を含む。いくつかの実施形態において、前記植物体から、少なくとも104コピー、105コピー、106コピー、107コピー、108コピー、109コピー、1010コピー、1011コピー、1012コピー、1013コピーまたは1014コピーのAAVタンパク質が得られる。いくつかの実施形態において、前記植物体から、少なくとも1012コピー、1013コピーまたは1014コピーのAAVタンパク質が得られる。
さらに、本明細書において、植物体において機能性AAV粒子を製造する方法が開示される。いくつかの実施形態において、この方法は、
AAV粒子の構成要素またはAAV粒子の組み立てに関与する構成要素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸ベクターを用いて植物体を形質転換する工程;
前記AAV粒子が前記植物体において発現されて組み立てられる条件下で前記植物体を生長させる工程;および
前記植物体から前記AAV粒子を単離する工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記植物体の形質転換工程は、アグロインフィルトレーションによって行われる。いくつかの実施形態において、前記AAV粒子の構成要素をコードする核酸配列は、前記植物体用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記植物体は、タバコ属、シロイヌナズナ属、ナス属、アサ属、ソバ属、イネ属、アキノノゲシ属またはトウモロコシ属に属する。いくつかの実施形態において、前記植物体は、タバコ属、アキノノゲシ属またはアサ属に属する種である。いくつかの実施形態において、前記植物体は、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、タバコ(Nicotiana tabacum)、レタス(Lactuca sativa)またはアサ(Cannabis sativa)である。いくつかの実施形態において、前記AAV粒子の構成要素または前記AAV粒子の組み立てに関与する構成要素は、REPタンパク質、CAPタンパク質、AAPタンパク質もしくはAd5 E4orf6タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
AAV粒子の構成要素またはAAV粒子の組み立てに関与する構成要素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸ベクターを用いて植物体を形質転換する工程;
前記AAV粒子が前記植物体において発現されて組み立てられる条件下で前記植物体を生長させる工程;および
前記植物体から前記AAV粒子を単離する工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記植物体の形質転換工程は、アグロインフィルトレーションによって行われる。いくつかの実施形態において、前記AAV粒子の構成要素をコードする核酸配列は、前記植物体用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記植物体は、タバコ属、シロイヌナズナ属、ナス属、アサ属、ソバ属、イネ属、アキノノゲシ属またはトウモロコシ属に属する。いくつかの実施形態において、前記植物体は、タバコ属、アキノノゲシ属またはアサ属に属する種である。いくつかの実施形態において、前記植物体は、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、タバコ(Nicotiana tabacum)、レタス(Lactuca sativa)またはアサ(Cannabis sativa)である。いくつかの実施形態において、前記AAV粒子の構成要素または前記AAV粒子の組み立てに関与する構成要素は、REPタンパク質、CAPタンパク質、AAPタンパク質もしくはAd5 E4orf6タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
本明細書に開示された方法のいずれかの実施形態のいくつかにおいて、前記REPタンパク質は、下流のインフレームのポリペプチドの翻訳を増強させる弱い植物コザック配列、および/または潜在的なORFの発現を阻止するための内部のメチオニンコドンの変異を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記REPタンパク質は、配列番号1~11と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記REPタンパク質は、配列番号12または13と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するペプチド配列を含む。
本明細書に開示された方法のいずれかの実施形態のいくつかにおいて、前記CAPタンパク質は、下流のインフレームのポリペプチドの翻訳を増強させる弱い植物コザック配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記CAPタンパク質は、配列番号14~24と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記CAPタンパク質は、配列番号25または26と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するペプチド配列を含む。
本明細書に開示された方法のいずれかの実施形態のいくつかにおいて、前記AAPタンパク質は、配列番号27~37と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記AAPタンパク質は、配列番号38と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記Ad5 E4orf6タンパク質は、配列番号39~49と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記Ad5 E4orf6タンパク質は、配列番号50と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するペプチド配列を含む。
本明細書に開示された方法のいずれかにおいて、前記AAV粒子の単離工程は、遠心分離、濾過および/またはクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、前記クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態において、前記植物体から、少なくとも104個、105個、106個、107個、108個、109個、1010個、1011個、1012個、1013個または1014個のAAV粒子が単離される。いくつかの実施形態において、前記植物体から、少なくとも1012個、1013個または1014個のAAV粒子が単離される。いくつかの実施形態において、前記AAV粒子は、哺乳動物細胞への感染力を持ち、該哺乳動物細胞はヒト細胞であってもよく、HEK293T細胞であってもよい。
本明細書に開示された方法のいずれかにおいて、前記方法は、前記AAV粒子を哺乳動物に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、前記哺乳動物はヒトである。
さらに、本明細書において、遺伝子治療を行う方法を開示する。いくつかの実施形態において、この方法は、本明細書に開示された方法のいずれか1つによって製造され、単離されたAAV粒子を、遺伝子治療を必要とする対象の細胞に投与することを含む。
さらに、本明細書において、医薬品として使用するための、本明細書に開示された組換え核酸ベクターまたはAAV粒子が開示される。
さらに、本明細書において、ヒト疾患を治療するための遺伝子治療において使用するための、本明細書に開示された組換え核酸ベクターまたはAAV粒子が開示される。いくつかの実施形態において、前記ヒト疾患は、先天性代謝異常症、酵素欠損症、ポンペ病、ダノン病、神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、網膜変性疾患、網膜色素変性症、アッシャー症候群、シュタルガルト病、または難聴の遺伝的要因である。
さらに、本明細書において、疾患の治療に使用するための、本明細書に開示された方法のいずれかによって製造されたAAV粒子が開示される。
さらに、本明細書において、医薬品の製造に使用するための、本明細書に開示された方法のいずれかによって製造されたAAV粒子が開示される。
以下の実施例において、前述した本発明の実施形態の態様のいくつかをさらに詳細に開示するが、以下の実施例は本発明の開示の範囲をなんら限定するものではない。本明細書および請求項で述べるように、その他の多くの実施形態も本発明の範囲内に含まれることを当業者であれば十分に理解できるであろう。
実施例1:AAV配列
野生型AAV2 REP、野生型AAV2 CAP、野生型AAV2 AAPおよび野生型Ad5 E4orf6の核酸配列について、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、タバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、アサ(Cannabis sativa)、ソバ(Fagopyrum esculentum)、イネ(Oryza sativa)、トウモロコシ(Zea mays)、ナス属野生種(Solanum lycopersicoides)、トマト(Solanum lycopersicum)、レタス(Lactuca sativa)など(ただしこれらに限定されない)のいくつかの植物種での発現用にコドン最適化を行った。これらの核酸配列を表1に示す。各核酸配列の翻訳により得られるタンパク質配列を表2に示す。
野生型AAV2 REP、野生型AAV2 CAP、野生型AAV2 AAPおよび野生型Ad5 E4orf6の核酸配列について、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、タバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、アサ(Cannabis sativa)、ソバ(Fagopyrum esculentum)、イネ(Oryza sativa)、トウモロコシ(Zea mays)、ナス属野生種(Solanum lycopersicoides)、トマト(Solanum lycopersicum)、レタス(Lactuca sativa)など(ただしこれらに限定されない)のいくつかの植物種での発現用にコドン最適化を行った。これらの核酸配列を表1に示す。各核酸配列の翻訳により得られるタンパク質配列を表2に示す。
各種植物用にコドン最適化されたREPのcDNA配列の核酸配列(配列番号2~11)および各種植物用にコドン最適化されたCAPのcDNA配列の核酸配列(配列番号15~24)はいずれも、それぞれの野生型の配列(配列番号1または配列番号14)とは、いくつかのヌクレオチドが異なるように組換えたものである。組換えたREPの配列は、
で始まり、この配列は、下流のインフレームのポリペプチド(すなわち、REP52)の翻訳を増強させる弱い植物コザック配列を構成している。組換えたCAPの配列は、
で始まり、この配列は、下流のインフレームのポリペプチド(すなわちVP2、VP3)の翻訳を増強させる弱い植物コザック配列を構成している。野生型REPは、配列番号12の配列に翻訳され、野生型CAPは、配列番号25の配列に翻訳される。植物用にコドン最適化されたREPは、配列番号13の配列に翻訳され、植物用にコドン最適化されたCAPは、配列番号25の配列に翻訳される。植物用にコドン最適化されたAAPタンパク質(配列番号38)もE4orf6タンパク質(配列番号50)も、それぞれの野生型のタンパク質と同一である。
で始まり、この配列は、下流のインフレームのポリペプチド(すなわち、REP52)の翻訳を増強させる弱い植物コザック配列を構成している。組換えたCAPの配列は、
で始まり、この配列は、下流のインフレームのポリペプチド(すなわちVP2、VP3)の翻訳を増強させる弱い植物コザック配列を構成している。野生型REPは、配列番号12の配列に翻訳され、野生型CAPは、配列番号25の配列に翻訳される。植物用にコドン最適化されたREPは、配列番号13の配列に翻訳され、植物用にコドン最適化されたCAPは、配列番号25の配列に翻訳される。植物用にコドン最適化されたAAPタンパク質(配列番号38)もE4orf6タンパク質(配列番号50)も、それぞれの野生型のタンパク質と同一である。
植物用にコドン最適化されたREP配列は、インフレームのREP78、REP68、REP52、REP40の4つのタンパク質の発現量または発現率が高くなるように組換えられたものである。2番目のコドン(CCG、プロリン)を(ACT、スレオニンに)置換して弱いコザック配列を作り、リボソームによるmRNAの読み漏らしを利用して、内部開始コドンから始まるREP52とREP40の発現が加速されるようにした。さらに、内部のメチオニン残基(M43、M91、M103およびM172)をロイシンに変異させて、REP78のATG開始コドンとREP52のATG開始コドンの間にあるインフレームの開始コドンを消失させ、潜在的なORFの発現を阻止した。REP52とREP40は225番目のコドンから始まる。このような変異のうちいずれか1つ以上を任意で行ってもよい。
同様に、植物用にコドン最適化されたCAPの配列は、インフレームのVP1、VP2、VP3の3つのタンパク質の発現量または発現率が高くなるように組み換えたものである。CAPの野生型配列の最初の6個のアミノ酸(VP1の最初の6個のアミノ酸に相当)は、MAADGYである。植物用にコドン最適化された配列では、この6個のアミノ酸をMTAAGYに変更して弱いコザック配列を作り、リボソームによるmRNAの読み漏らしを利用して、内部開始コドンから始まるVP2とVP3の発現が加速されるようにした。VP2は、138番目のコドンである代替開始コドンACGから始まり、VP3は203番目のコドンであるATGから始まる。このような変異のうちいずれか1つ以上を任意で行ってもよい。
ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)を一例として、植物でAAVの生産を向上させるためのREPおよびCAPの核酸およびアミノ酸の変更について説明したが、ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)、タバコ(N. tabacum)、シロイヌナズナ(A. thaliana)、ジャガイモ(S. tuberosum)、アサ(C. sativa)、ソバ(F. esculentum)、イネ(O. sativa)、トウモロコシ(Z. mays)、ナス属野生種(S. lycopersicoides)、トマト(S. lycopersicum)およびレタス(L. sativa)においても、コドンの最適化と転写の最適化がなされたcDNA配列とそのタンパク質配列の具体例を示しているように、このような変更は、本明細書に記載のその他の植物やその他の遺伝子的に取り扱いやすい植物にも何の問題も制限もなく適用される。
ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)、シロイヌナズナ(A. thaliana)、ジャガイモ(S. tuberosum)、アサ(C. sativa)、ソバ(F. esculentum)、イネ(O. sativa)、トウモロコシ(Z. mays)、ナス属野生種(S. lycopersicoides)、トマト(S. lycopersicum)およびレタス(L. sativa)での発現用にコドン最適化された、AAV2 REP(図1)、AAV2 CAP(図2)、AAV2 AAP(図3)およびAd5 E4orf6(図4)のcDNA配列の核酸配列のアライメントの結果を添付の図面に示す。
必要な配列としての、コドン最適化されたAAV2配列とAd5配列を、植物へのインフィルトレーション用ベクターpEAQ-HTに挿入した。コドン最適化されたREPの核酸配列と、ITRに挟まれたコドン最適化された導入遺伝子(配列番号51)(強力な構成的サイトメガロウイルス(CMV)哺乳動物プロモーターによって誘導されるEGFPを含む)をベクターに挿入して、プラスミドpEAQ-HT-REPopt_AVGFPopt(図6)を作製した。コドン最適化されたAAPの核酸配列とE4orf6の核酸配列をベクターに挿入して、プラスミドpEAQ-HT-Ad5Orf6-OPT_AAV2-AAP-OPTを作製した(図7)。コドン最適化されたCAPの核酸配列をベクターに挿入して、プラスミドpEAQ-HT_CAPoptを作製した(図8)。これら3つのプラスミドを植物細胞内で同時発現させると、完全な形に組み立てられたAAV2-CMV-EGFPウイルス粒子が得られる。
実施例2:ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)の繁殖
発芽プロトコール
1.Grodan社のロックウールキューブ(2インチ×2インチ×1.5インチ)をpH5.8~6.2の80ppmの肥料溶液に5分間浸漬したものを準備した。肥料としては、例えば、0.2~2g/LのVEG+BLOOM RO/Soft(Hydroponic Research社)に、0.25mL/LのSUPERThrive(ビタミン液)を添加したものを使用することができる。
発芽プロトコール
1.Grodan社のロックウールキューブ(2インチ×2インチ×1.5インチ)をpH5.8~6.2の80ppmの肥料溶液に5分間浸漬したものを準備した。肥料としては、例えば、0.2~2g/LのVEG+BLOOM RO/Soft(Hydroponic Research社)に、0.25mL/LのSUPERThrive(ビタミン液)を添加したものを使用することができる。
2.準備した各ロックウールキューブの上にベンサミアナタバコ(N. benthamiana)の種子を播種した。
3.種子を播種したキューブを栽培トレイに入れ、栽培トレイの上に湿度ドームを被せた。通気口を少し開けて、空気が交換されるようにした。
4.湿度ドームを被せた栽培トレイを温室内に静置した。太陽光の下で発芽させた場合は、湿度ドームの上に遮光布を被せた。植物育成灯の下で発芽させた場合は、遮光の必要はなかった。明暗周期は、明期を16時間、暗期を8時間(16L/8D)とした。温室条件下では、補助光を追加して、十分な照射時間を確保し、タバコの開花が早まらないようにした。
5.発芽期は、温度を華氏75~80度で維持した。温度は華氏65度未満にならないようにする。低温に曝されると、苗の根の発育が著しく妨げられる可能性がある。
6.ロックウールの表面は常に湿らせた状態で維持した。湿潤状態の維持は、スプレーボトルで軽く霧吹きをかけることにより行った。一日おきに、ロックウールスターターキューブを1つずつ手に取り、触って湿り具合を確認した。乾燥している場合は、スプレーボトルで液を吹き付けて、触って湿り気を感じるまで噴霧した。水をやり過ぎないように注意した。水をやりすぎると、苗の根の発育が妨げられる。
7.苗を最適な条件で維持した場合は、7~14日で発芽が確認された。2つの種子が発芽した場合は、1つを選んで取り除き、1つのキューブに1つの植物体が含まれるようにした。
8.生育が確認された時点で、湿度ドームを取り外した。
9.キューブの底から根が出るまで、スプレーボトルで水分や栄養を補給した。
生育と刈込に関するガイドライン
Grodan社のキューブ(サイズ:2インチ×2インチ×1.5インチ)の底面から複数の根が出始めた時点で、Grodan社のDelta4キューブ(サイズ:3インチ×3インチ×2.5インチ)に移植した。Grodan社のDelta4キューブも、発芽プロトコールで説明した方法と同様にして準備した。発芽期と同じ条件で生長させた。湿度ドームは使用しなかった。典型的には、この工程は、ロックウールの苗の発芽から7~10日後に行った。
Grodan社のキューブ(サイズ:2インチ×2インチ×1.5インチ)の底面から複数の根が出始めた時点で、Grodan社のDelta4キューブ(サイズ:3インチ×3インチ×2.5インチ)に移植した。Grodan社のDelta4キューブも、発芽プロトコールで説明した方法と同様にして準備した。発芽期と同じ条件で生長させた。湿度ドームは使用しなかった。典型的には、この工程は、ロックウールの苗の発芽から7~10日後に行った。
植物が発芽期から栄養生長期へと移行し始めた時点で、頂芽を摘み取った。この処理は一般に摘心とも呼ばれる。摘心を行うことで、栄養生長が旺盛となり葉量が増える。摘心処理の直後に、インフィルトレーションプロトコールを実施した。
摘心後、サッカー(腋芽)と頂芽の量の増加が見られ、さらに萼(花芽)の量も増加したと見られた。このように生長部を取り除くことは、インフィルトレーションを行った葉に生長を集中させ、目的とするの葉からより多くの生物資源を得るのに非常に重要である。
この処理を、少なくとも2週間、あるいは実験によってウイルスカプシドが葉内で発現するのに必要とされている期間にわたり、毎日行った。
実施例3:AAV2-CMV-EGFPヘルパープラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を用いたベンサミアナタバコ(N. benthamiana)へのインフィルトレーション
AAV2-CMV-EGFPの製造用プラスミド(pEAQ-HT-Ad5Orf6-OPT_AAV2-AAP-OPT、pEAQ-HT_CAPoptまたはpEAQ-HT-REPopt_AVGFPopt)を用いて、メーカー推奨事項に詳述されている方法に従って、エレクトロポレーションにより、A.ツメファシエンスのAGL1株、GV3101株またはLBA4404株(Intact Genomics社)を形質転換した。簡単に説明すると、コンピテントセルを氷上で解凍し、その一方で、形質転換に用いるDNA(1μL)を、あらかじめ氷上で冷却しておいたチューブに添加した。解凍した細胞(25μL)を、氷上で冷却しておいたDNAに加え、タッピングして軽く混和した。この細胞とDNAの混合物(26μL)を、冷却しておいたエレクトロポレーション用キュベット(電極間隔1mm)に気泡が入らないようにピペットで移し、エレクトロポレーション(エクスポネンシャルモード、1800V、25μFD、200Ω)を行った。エレクトロポレーションを行った直後に、回復培地(976μL)を加え、回復培地中の細胞をエッペンドルフチューブに移し、200rpmで振盪しながら30℃で3時間インキュベートした後、選択培地に播種し、30℃で2日間培養を行った。それぞれ異なるヘルパープラスミドで形質転換されたA.ツメファシエンス株を、インフィルトレーション用に調製した。調製には、SainsburyおよびLomonossoff(Plant Physiol. 2008; 148(3):1212-8)によるプロトコールを一部変更したものを用いた。簡単に説明すると、カナマイシン(100mg/L)とリファンピシン(50mg/L)を含むLB液体培地(レノックスまたはミラー)に、組換えた細菌のシングルコロニーを植菌した。この培養液を振盪しながら28℃で一晩インキュベートした。遠心分離(14,000×g、5分間)を行って細菌をペレット状にし、最適化したインフィルトレーション用バッファー(100mM MES pH 5.6、10mM MgCl2、300μMアセトシリンゴン、5μMα-リポ酸、0.002%プルロニック F-68)にOD600=1.0の濃度で再懸濁した。この培養液を緩やかに振盪しながら室温で2~4時間インキュベートした。小規模実験では、先の鈍いプラスチックシリンジを用いて、軽く圧力をかけながら3~6週齢の幼植物体の葉の裏面に細菌を接種した。植物体全体へのインフィルトレーションを行う場合は、真空デシケーターユニット内で、ヘルパープラスミドで形質転換されたアグロバクテリウム株(上記で調製したもの)を含む1~3Lのインフィルトレーション用バッファーに3~6週齢の幼植物体を完全に浸漬させた。デシケーターユニットを密閉し、1分間100mBarの真空状態にした後、真空を解除することにより、幼植物体へのインフィルトレーションを行った。この操作を2回繰り返した。いずれの接種法においても、インフィルトレーションを行う直前に、それぞれ異なるヘルパープラスミドを含む組換え細菌株を、pEAQ-HT-Ad5Orf6-OPT_AAV2-AAP-OPT:pEAQ-HT_CAPopt:pEAQ-HT-REPopt_AVGFPopt=1:1:1の比率で混合した。一過性に発現させるヘルパータンパク質の量を増やすために、インフィルトレーションを行った2日後に、植物体全体に対してヒートショック処理(37℃、30分)を行った。
AAV2-CMV-EGFPの製造用プラスミド(pEAQ-HT-Ad5Orf6-OPT_AAV2-AAP-OPT、pEAQ-HT_CAPoptまたはpEAQ-HT-REPopt_AVGFPopt)を用いて、メーカー推奨事項に詳述されている方法に従って、エレクトロポレーションにより、A.ツメファシエンスのAGL1株、GV3101株またはLBA4404株(Intact Genomics社)を形質転換した。簡単に説明すると、コンピテントセルを氷上で解凍し、その一方で、形質転換に用いるDNA(1μL)を、あらかじめ氷上で冷却しておいたチューブに添加した。解凍した細胞(25μL)を、氷上で冷却しておいたDNAに加え、タッピングして軽く混和した。この細胞とDNAの混合物(26μL)を、冷却しておいたエレクトロポレーション用キュベット(電極間隔1mm)に気泡が入らないようにピペットで移し、エレクトロポレーション(エクスポネンシャルモード、1800V、25μFD、200Ω)を行った。エレクトロポレーションを行った直後に、回復培地(976μL)を加え、回復培地中の細胞をエッペンドルフチューブに移し、200rpmで振盪しながら30℃で3時間インキュベートした後、選択培地に播種し、30℃で2日間培養を行った。それぞれ異なるヘルパープラスミドで形質転換されたA.ツメファシエンス株を、インフィルトレーション用に調製した。調製には、SainsburyおよびLomonossoff(Plant Physiol. 2008; 148(3):1212-8)によるプロトコールを一部変更したものを用いた。簡単に説明すると、カナマイシン(100mg/L)とリファンピシン(50mg/L)を含むLB液体培地(レノックスまたはミラー)に、組換えた細菌のシングルコロニーを植菌した。この培養液を振盪しながら28℃で一晩インキュベートした。遠心分離(14,000×g、5分間)を行って細菌をペレット状にし、最適化したインフィルトレーション用バッファー(100mM MES pH 5.6、10mM MgCl2、300μMアセトシリンゴン、5μMα-リポ酸、0.002%プルロニック F-68)にOD600=1.0の濃度で再懸濁した。この培養液を緩やかに振盪しながら室温で2~4時間インキュベートした。小規模実験では、先の鈍いプラスチックシリンジを用いて、軽く圧力をかけながら3~6週齢の幼植物体の葉の裏面に細菌を接種した。植物体全体へのインフィルトレーションを行う場合は、真空デシケーターユニット内で、ヘルパープラスミドで形質転換されたアグロバクテリウム株(上記で調製したもの)を含む1~3Lのインフィルトレーション用バッファーに3~6週齢の幼植物体を完全に浸漬させた。デシケーターユニットを密閉し、1分間100mBarの真空状態にした後、真空を解除することにより、幼植物体へのインフィルトレーションを行った。この操作を2回繰り返した。いずれの接種法においても、インフィルトレーションを行う直前に、それぞれ異なるヘルパープラスミドを含む組換え細菌株を、pEAQ-HT-Ad5Orf6-OPT_AAV2-AAP-OPT:pEAQ-HT_CAPopt:pEAQ-HT-REPopt_AVGFPopt=1:1:1の比率で混合した。一過性に発現させるヘルパータンパク質の量を増やすために、インフィルトレーションを行った2日後に、植物体全体に対してヒートショック処理(37℃、30分)を行った。
実施例4:ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)の葉組織からのAAV2-CMV-EGFPの精製
アグロインフィルトレーションを行ったベンサミアナタバコ(N. benthamiana)の葉を、できるだけ植物体の葉脚に近いところから、滅菌した園芸ばさみを使って採取した。採取した葉を二酸化塩素燻蒸槽に入れて10分間除菌し、その後、滅菌脱イオン蒸留水で3回洗浄した。除菌した葉を抽出バッファー(25mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl、50mMアスコルビン酸ナトリウム、2mM PMSF、pH 5.75)とともにハミルトンブレンダーに入れて、メーカーの取扱説明書に従って均質化することにより、葉の全タンパク質を抽出した。植物の粗抽出物を14,000×g、4℃で10分間遠心分離し、清澄化した。
アグロインフィルトレーションを行ったベンサミアナタバコ(N. benthamiana)の葉を、できるだけ植物体の葉脚に近いところから、滅菌した園芸ばさみを使って採取した。採取した葉を二酸化塩素燻蒸槽に入れて10分間除菌し、その後、滅菌脱イオン蒸留水で3回洗浄した。除菌した葉を抽出バッファー(25mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl、50mMアスコルビン酸ナトリウム、2mM PMSF、pH 5.75)とともにハミルトンブレンダーに入れて、メーカーの取扱説明書に従って均質化することにより、葉の全タンパク質を抽出した。植物の粗抽出物を14,000×g、4℃で10分間遠心分離し、清澄化した。
4℃で1時間インキュベートした後、ホモジネートを6,000×g、4℃で30分間遠心分離し、葉の破片や多量に含まれる植物の光合成酵素であるリブロース1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RuBisCO)を除去した。上清を4℃で24時間インキュベートした後、6,000×g、4℃で30分間遠心分離し、インキュベート中に沈殿したRuBisCOをさらに除去した。この処理を計3回繰り返し、残留するRuBisCOを完全に除去した。上清を0.22μMフィルター(Millipore社)で濾過した。清澄化した上清を、100kDaのポリエーテルスルホン製タンジェンシャルフロー濾過(PES TFF)膜(Pall Corporation社)を用いた限外濾過/透析濾過(UF/DF)で濃縮し、組換えAAV2粒子を保持しながら、残留する植物由来の低分子を除去した。濾過して得られた、rAAV2粗粒子を含む清澄化上清を、アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーを順次行ってさらに精製した。簡単に説明すると、rAAVベクターを含む清澄化した細胞溶解液を、AVBセファロースHPカラム(GE Life Sciences社)に充填した。rAAV粒子が結合したカラムを洗浄バッファー(20mM Tris HCl、0.5M NaCl、pH 8.0)で洗浄して、未結合のタンパク質や夾雑物を吸光度A260とA280で測定しながら除去した。結合したrAAVを低pHバッファーで溶出した。なお、溶出されたrAAVを含む溶液が直ちに中和されるように、溶出する前に、画分量の1/10量の1M Tris-HCl(pH 8.7)を画分回収チューブに直接入れておいた。AVBアフィニティー精製を行った後、POROS 50HQ(ThermoFisher社)陰イオン交換カラムへの結合と溶出を行うことで、陰イオン交換クロマトグラフィーにより中空粒子と完全粒子(ゲノム含有粒子)を分離し、AAVベクターをさらに精製した。結合したAAVカプシドを10~300mMのTris-酢酸勾配(pH8)の存在下、伝導率を上げながら溶出させ、rAAV2の完全粒子が多量に含まれる連続した画分を回収してプールした。これを、Vivaspin 15R 30kD透析濾過カラムに通して3,000×gで遠心することで透析濾過を行い、フォーミュレーションバッファー(180mM NaCl、10mMリン酸ナトリウム、0.001%プルロニック F-68)に回収した。この操作を3回繰り返し、その都度フォーミュレーションバッファーを添加した。精製と濃縮を行ったrAAV2-CMV-EGFPウイルスベクターを、タンパク質低吸着チューブに分注し、-80℃で保存した。
実施例5:葉組織から精製したAAV2-CMV-EGFPのqPCRによる力価測定
精製したrAAV-CMV-EGFPウイルス粒子(2μL)と、ゲノム力価が既知のAAV2-CMV-EGFPの標準コントロールベクター(2μL)(ATCC #VR-1616)にそれぞれ50μLのAAV PCRアルカリ性消化バッファー(25mM NaOH、0.2mM EDTA)を加えて、100℃で10分間変性処理を行った。その後、サンプルを氷上で冷却し、50μLの中和バッファー(40mM Tris-HCl、pH5.0)を加えて中和した。各サンプルについては、SYBR Green qPCR Master Mix(Sigma社)と、保存されているITR配列によりEGFP導入遺伝子が増幅されるように設計されたプライマー(フォワード:5’-GGAACCCCTAGTGATGAGTT-3’(配列番号52)、リバース:5’-CGGCCCTAGGGGAG-3’(配列番号53))を用いて、N=3で定量的PCRを行った。AAV2の標準コントロールについても、同じMaster Mixを用いて同様に調製し、作製した1×109~1×104ウイルスゲノム/mL(vg/mL)の対数希釈系列から検量線を作成した。相対定量サイクル(Cq)値を標準コントロールの検量線に当てはめて、植物で生産されたAAV2-CMV-EGFPの力価を算出した。
精製したrAAV-CMV-EGFPウイルス粒子(2μL)と、ゲノム力価が既知のAAV2-CMV-EGFPの標準コントロールベクター(2μL)(ATCC #VR-1616)にそれぞれ50μLのAAV PCRアルカリ性消化バッファー(25mM NaOH、0.2mM EDTA)を加えて、100℃で10分間変性処理を行った。その後、サンプルを氷上で冷却し、50μLの中和バッファー(40mM Tris-HCl、pH5.0)を加えて中和した。各サンプルについては、SYBR Green qPCR Master Mix(Sigma社)と、保存されているITR配列によりEGFP導入遺伝子が増幅されるように設計されたプライマー(フォワード:5’-GGAACCCCTAGTGATGAGTT-3’(配列番号52)、リバース:5’-CGGCCCTAGGGGAG-3’(配列番号53))を用いて、N=3で定量的PCRを行った。AAV2の標準コントロールについても、同じMaster Mixを用いて同様に調製し、作製した1×109~1×104ウイルスゲノム/mL(vg/mL)の対数希釈系列から検量線を作成した。相対定量サイクル(Cq)値を標準コントロールの検量線に当てはめて、植物で生産されたAAV2-CMV-EGFPの力価を算出した。
実施例6:植物で生産されたAAV2-CMV-EGFPのqPCRによる定量
アグロバクテリウムに導入した、植物用にコドン最適化されたAAV2産生用プラスミドを用いて、一過性のバキュームインフィルトレーションを行い、AAV2-CMV-EGPFベクターを植物で生産させた。実験に使用した植物は、ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)、タバコ(N. tabacum)、レタス(L. sativa)およびアサ(C. sativa)であった。レタス(L. sativa)とアサ(C. sativa)のサンプルはN=2で実験を行った。インフィルトレーションから5日後に、本明細書に記載の方法と同様にして、植物の葉を採取し、抽出処理を行った後、植物タンパク質を低pH条件下で沈殿させ、次いで、遠心分離、濾過、濃縮を行い、AAV2-CMV-EGFP粒子を精製した。精製したAAV2-CMV-EGFPベクター調製物をDNase Iで処理して、カプシドに内包されていないDNAを除去した。各バッチにおいて、AAV2特異的ITRを標的とするプライマーを用いた定量的リアルタイムPCRにより、(実施例5と同様の方法で)力価測定を行った。植物体1本あたりの相対的なゲノム収量を、既知量の直鎖状のAAV2-CMV-EGFPプラスミドで作成した検量線を用いて算出した。植物体1本あたり1012~1014コピーのウイルスゲノムが検出され、ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)におけるウイルスゲノムの相対収量が最も多かった(図9)。
アグロバクテリウムに導入した、植物用にコドン最適化されたAAV2産生用プラスミドを用いて、一過性のバキュームインフィルトレーションを行い、AAV2-CMV-EGPFベクターを植物で生産させた。実験に使用した植物は、ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)、タバコ(N. tabacum)、レタス(L. sativa)およびアサ(C. sativa)であった。レタス(L. sativa)とアサ(C. sativa)のサンプルはN=2で実験を行った。インフィルトレーションから5日後に、本明細書に記載の方法と同様にして、植物の葉を採取し、抽出処理を行った後、植物タンパク質を低pH条件下で沈殿させ、次いで、遠心分離、濾過、濃縮を行い、AAV2-CMV-EGFP粒子を精製した。精製したAAV2-CMV-EGFPベクター調製物をDNase Iで処理して、カプシドに内包されていないDNAを除去した。各バッチにおいて、AAV2特異的ITRを標的とするプライマーを用いた定量的リアルタイムPCRにより、(実施例5と同様の方法で)力価測定を行った。植物体1本あたりの相対的なゲノム収量を、既知量の直鎖状のAAV2-CMV-EGFPプラスミドで作成した検量線を用いて算出した。植物体1本あたり1012~1014コピーのウイルスゲノムが検出され、ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)におけるウイルスゲノムの相対収量が最も多かった(図9)。
実施例7:葉組織で生産されたAAV2-CMV-EGFPのタンパク質含量と純度の評価
精製と濃縮を行ったrAAV粒子の純度を、SDS-PAGEと銀染色またはその他の適した染色により測定した。精製した2種類の量のrAAV調製物(例えば、2μLと6μL)に、それぞれ最終容量が15μLになるように、還元性トリスグリシンSDSサンプルバッファーを直接加えて変性処理を行い、95℃で5分間加熱した。AAV2標準品(ATCC)についても、一定の容積範囲(例えば、0.5μL、1μL、2μL、3μLおよび4μL)で同様に処理を行った。等量のサンプルをSDS-PAGEゲルにロードし、50~200Vで1~3時間、または泳動用色素がゲルから流れ出るまで泳動を行った。ゲルの銀染色は、メーカーの取扱説明書または当技術分野で公知のプロトコールに従って行った。精製したrAAVサンプルでは、VP1(87kDa)、VP2(73kDa)、VP3(62kDa)に対応する3つのバンドのみが検出される。
精製と濃縮を行ったrAAV粒子の純度を、SDS-PAGEと銀染色またはその他の適した染色により測定した。精製した2種類の量のrAAV調製物(例えば、2μLと6μL)に、それぞれ最終容量が15μLになるように、還元性トリスグリシンSDSサンプルバッファーを直接加えて変性処理を行い、95℃で5分間加熱した。AAV2標準品(ATCC)についても、一定の容積範囲(例えば、0.5μL、1μL、2μL、3μLおよび4μL)で同様に処理を行った。等量のサンプルをSDS-PAGEゲルにロードし、50~200Vで1~3時間、または泳動用色素がゲルから流れ出るまで泳動を行った。ゲルの銀染色は、メーカーの取扱説明書または当技術分野で公知のプロトコールに従って行った。精製したrAAVサンプルでは、VP1(87kDa)、VP2(73kDa)、VP3(62kDa)に対応する3つのバンドのみが検出される。
純度は、キャピラリー電気泳動や質量分析など、当技術分野で公知のその他の方法で測定することも可能である。
実施例8:AAV2-CMV-EGFP産生植物の葉の溶解物のSDS-PAGEによるAAV2 VP1/VP2/VP3カプシドタンパク質の検出
植物用にコドン最適化されたAAV2産生用プラスミドをアグロバクテリウムに導入し、これを用いて、ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)、レタス(L. sativa)(N=2)およびアサ(C. sativa)(N=2)にバキュームインフィルトレーションを行い、これらの植物でAAV2-CMV-EGFPベクターを生産させた。インフィルトレーションから5日後に、本明細書に記載の方法と同様にして、植物の葉を採取し、多量に含まれる植物タンパク質を低pH条件下で沈殿させ、次いで、遠心分離、0.45μmフィルターによる濾過、濃縮を行い、溶解物を調製した。葉の溶解物中の全タンパク質をBCAアッセイで定量し、5μgと15μgの異なる量の全タンパク質を4~12%勾配のBis-Tris SDS-PAGEゲルにロードし、190mVで1時間泳動を行った。Oriole蛍光タンパク質染色剤を用いてタンパク質を検出し、BioRad社のゲル撮影装置で可視化した。ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)とレタス(L. sativa)の葉の溶解物において、VP1タンパク質、VP2タンパク質およびVP3タンパク質に対応する明確なバンドが検出された(図10A)。
植物用にコドン最適化されたAAV2産生用プラスミドをアグロバクテリウムに導入し、これを用いて、ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)、レタス(L. sativa)(N=2)およびアサ(C. sativa)(N=2)にバキュームインフィルトレーションを行い、これらの植物でAAV2-CMV-EGFPベクターを生産させた。インフィルトレーションから5日後に、本明細書に記載の方法と同様にして、植物の葉を採取し、多量に含まれる植物タンパク質を低pH条件下で沈殿させ、次いで、遠心分離、0.45μmフィルターによる濾過、濃縮を行い、溶解物を調製した。葉の溶解物中の全タンパク質をBCAアッセイで定量し、5μgと15μgの異なる量の全タンパク質を4~12%勾配のBis-Tris SDS-PAGEゲルにロードし、190mVで1時間泳動を行った。Oriole蛍光タンパク質染色剤を用いてタンパク質を検出し、BioRad社のゲル撮影装置で可視化した。ベンサミアナタバコ(N. benthamiana)とレタス(L. sativa)の葉の溶解物において、VP1タンパク質、VP2タンパク質およびVP3タンパク質に対応する明確なバンドが検出された(図10A)。
精製後のベンサミアナタバコ(N. benthamiana)の葉の溶解物について、5μg、10μg、25μg、50μgの異なる量の全タンパク質を4~12%勾配のBis-Tris SDS-PAGEゲルにロードし、190mVで1時間泳動を行った。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、抗AAV2 VPモノクローナル一次抗体と抗マウスHRP二次抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを行い、AAV2のカプシドタンパク質VP1、VP2、VP3の検出の有無を確認した(図10B)。
実施例9:葉組織から精製したAAV2-CMV-EGFPの組織培養細胞への感染
各ウェルに1mLの増殖培地(高グルコース含有DMEM、1×GlutaMAX(Corning社)、10%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン)を含む12ウェル培養プレートに、HEK293T細胞(ATCC #CRL-11268)を5×104個/ウェルの密度で播種した。播種から6~8時間後、植物で生産されたrAAV2-CMV-EGFPを各ウェルに加えて、細胞1個あたりのウイルスゲノム数(vg)が500~5000となる多重感染度(MOI)で細胞に感染させた。感染させた細胞を37℃、5%CO2で36時間インキュベートした後、EGFPに適した励起フィルターと吸収フィルターを備えた倒立蛍光顕微鏡を用いて、各ウェルの感染率を測定した。
各ウェルに1mLの増殖培地(高グルコース含有DMEM、1×GlutaMAX(Corning社)、10%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン)を含む12ウェル培養プレートに、HEK293T細胞(ATCC #CRL-11268)を5×104個/ウェルの密度で播種した。播種から6~8時間後、植物で生産されたrAAV2-CMV-EGFPを各ウェルに加えて、細胞1個あたりのウイルスゲノム数(vg)が500~5000となる多重感染度(MOI)で細胞に感染させた。感染させた細胞を37℃、5%CO2で36時間インキュベートした後、EGFPに適した励起フィルターと吸収フィルターを備えた倒立蛍光顕微鏡を用いて、各ウェルの感染率を測定した。
実施例10:植物で生産されたAAV2-CMV-EGFPで処理したHEK293T細胞におけるEGFPの発現
植物用にコドン最適化されたAAV2産生用プラスミドをアグロバクテリウムに導入し、これを用いて、タバコ(N. tabacum)に一過性のバキュームインフィルトレーションを行い、この植物でAAV2-CMV-EGFPベクターを生産させた。インフィルトレーションから5日後に、本明細書に記載の方法と同様にして、植物の葉を採取し、抽出処理を行った後、植物タンパク質を低pH条件下で沈殿させ、次いで、遠心分離、濾過、濃縮を行い、AAV2-CMV-EGFP粒子を精製した。精製して力価測定したAAV2-CMV-EGFPベクターを、4チェンバースライドフラスコで培養したHEK293T細胞に、特定の多重感染度(HEK293T細胞1個あたりのウイルスゲノム数:2.7×104、2.7×103または2.7×102)で直接添加した。感染から4日後に、細胞を撮影して、EGFPの自然発現の有無を確認した。蛍光顕微鏡による観察により、感染させたHEK293T細胞において、MOI依存的にEGFPの陽性発現が見られることが確認された(図11)。
植物用にコドン最適化されたAAV2産生用プラスミドをアグロバクテリウムに導入し、これを用いて、タバコ(N. tabacum)に一過性のバキュームインフィルトレーションを行い、この植物でAAV2-CMV-EGFPベクターを生産させた。インフィルトレーションから5日後に、本明細書に記載の方法と同様にして、植物の葉を採取し、抽出処理を行った後、植物タンパク質を低pH条件下で沈殿させ、次いで、遠心分離、濾過、濃縮を行い、AAV2-CMV-EGFP粒子を精製した。精製して力価測定したAAV2-CMV-EGFPベクターを、4チェンバースライドフラスコで培養したHEK293T細胞に、特定の多重感染度(HEK293T細胞1個あたりのウイルスゲノム数:2.7×104、2.7×103または2.7×102)で直接添加した。感染から4日後に、細胞を撮影して、EGFPの自然発現の有無を確認した。蛍光顕微鏡による観察により、感染させたHEK293T細胞において、MOI依存的にEGFPの陽性発現が見られることが確認された(図11)。
実施例11:精製AAV2粒子の遺伝子治療への応用
上記の実施例で生産された組換えAAV2ウイルス粒子は、完全な粒子の状態で感染性を有している。この粒子は、遺伝子治療やその他の治療目的に使用することができる。このAAV2ウイルス粒子は、エクスビボまたはインビボの治療または用途に使用することができる。このAAV2ウイルス粒子は、腸内、非経口、経口、舌下、頬側、鼻腔内、眼内、耳内、硬膜外、経皮、動脈内、静脈内、門脈内、関節内、筋肉内、皮内、腹腔内もしくは皮下への投与、または臓器、組織、がんもしくは腫瘍への直接投与が可能である。また、このAAV2ウイルス粒子は、T細胞、ナチュラルキラー細胞、B細胞、マクロファージ、リンパ球、幹細胞、骨髄細胞または造血幹細胞などの、患者または対象から分離した細胞に投与することもできる。植物から精製したAAV2ウイルス粒子は、他の方法、例えば、哺乳動物細胞培養や昆虫細胞培養などで精製したウイルス粒子と比べて、安全性、収量および有効性の点で優れている。
上記の実施例で生産された組換えAAV2ウイルス粒子は、完全な粒子の状態で感染性を有している。この粒子は、遺伝子治療やその他の治療目的に使用することができる。このAAV2ウイルス粒子は、エクスビボまたはインビボの治療または用途に使用することができる。このAAV2ウイルス粒子は、腸内、非経口、経口、舌下、頬側、鼻腔内、眼内、耳内、硬膜外、経皮、動脈内、静脈内、門脈内、関節内、筋肉内、皮内、腹腔内もしくは皮下への投与、または臓器、組織、がんもしくは腫瘍への直接投与が可能である。また、このAAV2ウイルス粒子は、T細胞、ナチュラルキラー細胞、B細胞、マクロファージ、リンパ球、幹細胞、骨髄細胞または造血幹細胞などの、患者または対象から分離した細胞に投与することもできる。植物から精製したAAV2ウイルス粒子は、他の方法、例えば、哺乳動物細胞培養や昆虫細胞培養などで精製したウイルス粒子と比べて、安全性、収量および有効性の点で優れている。
前述の実施形態の少なくともいくつかにおいて、これらの実施形態において使用された1つ以上の構成要素は、技術的に不可能な場合を除き、別の実施形態の構成要素と入れ替えて使用することができる。請求項に記載された主題の範囲から逸脱することなく、前記の方法および構造に前述以外の様々な省略、付加および改変を行ってもよいことは、当業者であれば容易に理解できるであろう。このような改変や変更はいずれも、添付の請求項で定義されている本発明の主題の範囲内にあると見なされる。
本明細書で使用されている実質的に複数形および/または単数形の用語は、当業者であれば、本明細書の記載および/または用途に適するように、複数形の用語を単数のものとして、かつ/または単数形の用語を複数のものとして解釈することができる。本発明を明確なものとするために、様々な単数形/複数形の用語が意図的に使い分けられている。
当業者であれば、本明細書に記載の用語、特に添付の請求項(例えば、添付の請求項の本体部)に記載の用語は、通常、「オープンエンドな」用語であることを理解できるであろう(例えば、「含んでいる(including)」という用語は、「含んでいるが、これらに限定されない」と解釈されるべきであり、「有する(having)」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む(include)」という用語は「含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきである)。さらに、特定の数が請求項に記載されている場合、前述のような意図も請求項に明確に記載されており、特定の数が記載されていない場合はそのような意図も存在しないことも、当業者であれば理解できるであろう。理解を助けるために説明すれば、例えば、後述の特許請求の範囲では、請求項を定義するために、「少なくとも1つ」や「1つ以上」といった前置きが記載されている場合がある。しかしながら、このような前置きが記載されているからといって、不定冠詞「a」または「an」を使用して構成要素が記載された請求項を、1つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではなく、たとえ同じ請求項内に「1つ以上」または「少なくとも1つ」といった前置きと「a」または「an」といった不定冠詞とが含まれていたとしても、1つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではない(例えば、「a」および/または「an」は、「少なくとも1つ」または「1つ以上」を意味すると解釈すべきである)。これは、定冠詞を使用して記載された請求項でも同じである。また、請求項に特定の数が明確に記載されていたとしても、「少なくとも」記載されたその数であるということを当業者であれば理解できるであろう(例えば、修飾語を伴わない「2つ」という記載は、「少なくとも2つ」または「2つ以上」を意味する)。さらに、「A、BおよびCのうちの少なくとも1つ」といった慣用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている(例えば、「A、BおよびCのうちの少なくとも1つを有するシステム」は、Aのみを有するシステム、Bのみを有するシステム、Cのみを有するシステム、AとBを有するシステム、AとCを有するシステム、BとCを有するシステム、ならびに/またはA、BおよびCを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない)。また、「A、BまたはCのうちの少なくとも1つ」といった慣用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている(例えば、「A、BまたはCのうちの少なくとも1つを有するシステム」は、Aのみを有するシステム、Bのみを有するシステム、Cのみを有するシステム、AとBを有するシステム、AとCを有するシステム、BとCを有するシステム、ならびに/またはA、BおよびCを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない)。さらに、2つ以上の選択肢を表すための選言的用語および/または選言的語句は、明細書、特許請求の範囲または図面のいずれにおいても、記載された用語のうちの1つ、記載された用語のいずれか、または記載された用語の両方を含む場合があると当業者であれば理解できるであろう。例えば、「AまたはB」という表現は、「A」または「B」または「AおよびB」である可能性があることは理解できるであろう。
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ形式で記載されている場合、当業者であれば、マーカッシュ形式で記載された各メンバーまたはそれらからなるサブグループについても記載されていると理解できるであろう。
詳細な説明の提供などの何らかの目的で本明細書に開示された範囲はいずれも、あらゆる可能な部分範囲およびその組み合わせも包含することを、当業者であれば理解できるであろう。本明細書に記載の範囲はいずれも、この範囲を少なくとも等分、3等分、4等分、5等分、10等分などに分割したものも十分に記載されており、このような分割された範囲で本発明を実施可能であることも容易に理解できるであろう。例えば、本明細書に記載の範囲はいずれも、容易に、低域、中域、高域といった3等分などにすることができるが、これに限定されない。また、「以下」、「少なくとも」、「よりも大きい」、「未満」といった用語はいずれも、記載された数値を含むとともに、前述したように、部分範囲に分割可能な範囲も指すことを当業者であれば理解できるであろう。さらに、当業者であれば、本明細書に記載の範囲は各メンバーを含むことを理解できるであろう。したがって、例えば、1~3つのメンバーからなる群は、1つのメンバーからなる群、2つのメンバーからなる群または3つのメンバーからなる群を指す。同様に、1~5つのメンバーからなる群は、1つのメンバーからなる群、2つのメンバーからなる群、3つのメンバーからなる群、4つのメンバーからなる群、または5つのメンバーからなる群などを指す。
本明細書において様々な態様および実施形態を述べてきたが、当業者であればその他の態様および実施形態も容易に理解できるであろう。本明細書において開示された様々な態様および実施形態は本発明を説明することを目的としたものであり、本発明をなんら限定するものではなく、本発明の範囲および要旨は以下の請求項によって示される。
本明細書において引用された公開特許出願、非公開特許出願、特許および学術文献を含む(ただしこれらに限定されない)すべての参考文献は、引用によりその全体が本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する。引用により援用された文献、特許または特許出願が本明細書の開示内容と矛盾する場合、このような矛盾事項よりも本明細書の記載が採用および/または優先される。
Claims (57)
- AAV2のREPタンパク質をコードする配列を含む核酸分子であって、前記配列が、配列番号2~11と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、核酸分子。
- 前記配列が、配列番号2と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、請求項1に記載の核酸分子。
- AAV2のCAPタンパク質をコードする配列を含む核酸分子であって、前記配列が、配列番号15~24と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、核酸分子。
- 前記配列が、配列番号15と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、請求項3に記載の核酸分子。
- AAV2のAAPタンパク質をコードする配列を含む核酸分子であって、前記配列が、配列番号28~37と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、核酸分子。
- 前記配列が、配列番号28と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、請求項5に記載の核酸分子。
- Ad5 E4orf6タンパク質をコードする配列を含む核酸分子であって、前記配列が、配列番号40~49と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、核酸分子。
- 前記配列が、配列番号40と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する、請求項7に記載の核酸分子。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載の核酸分子を含む組換え核酸ベクター。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載の核酸分子または請求項10に記載のベクターによってコードされるタンパク質。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載の少なくとも1つの核酸分子、請求項9に記載のベクターまたは請求項10に記載のタンパク質を含むAAV粒子。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載の少なくとも1つの核酸分子、請求項9に記載の組換え核酸ベクター、請求項10に記載のタンパク質または請求項11に記載のAAV粒子を含む植物細胞。
- 請求項12に記載の植物細胞を含む植物体。
- タバコ属、シロイヌナズナ属、ナス属、アサ属、ソバ属、イネ属またはトウモロコシ属に属する、請求項12に記載の植物細胞または請求項13に記載の植物体。
- 前記植物が、タバコ属に属する種である、請求項14に記載の植物細胞または植物体。
- 前記植物が、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)またはタバコ(Nicotiana tabacum)である、請求項15に記載の植物細胞または植物体。
- 請求項12~16に記載の植物細胞または植物体のいずれか1種の葉、茎、花または根。
- 植物体においてAAVタンパク質を製造する方法であって、
植物体での発現用にコドン最適化されており、かつAAVタンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を植物体に接触させる工程;
前記少なくとも1つの組換え核酸ベクターを前記植物体の細胞に移入する工程;
前記植物体の細胞において前記AAVタンパク質を発現させる工程;および
任意で、前記植物体の細胞から前記AAVタンパク質を単離する工程
を含み、
前記接触工程において、請求項9に記載の組換え核酸ベクターを使用してもよい、
方法。 - 複数種のAAVタンパク質を同じ植物体において製造する、請求項18に記載の方法。
- 前記植物体においてAAV粒子を製造し、該AAV粒子を任意で該植物体から単離することを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、哺乳動物細胞への感染力を持ち、該哺乳動物細胞がヒト細胞であってもよく、HEK293T細胞であってもよい、請求項20に記載の方法。
- 前記植物体が、タバコ属、シロイヌナズナ属、ナス属、アサ属、ソバ属、イネ属、アキノノゲシ属またはトウモロコシ属に属する、請求項18~21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物体が、タバコ属に属する種である、請求項22に記載の方法。
- 前記植物体が、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)またはタバコ(Nicotiana tabacum)であり、前記核酸配列が、ベンサミアナタバコまたはタバコでの発現用にコドン最適化されている、請求項23に記載の方法。
- 前記AAVタンパク質の単離工程が、遠心分離、濾過および/またはクロマトグラフィーを含む、請求項18~24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィーである、請求項25に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの組換え核酸ベクターが、配列番号2~11、15~24、28~37または40~49と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する少なくとも1つの配列を含む、請求項18~26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物体から、少なくとも107コピー、108コピー、109コピー、1010コピー、1011コピー、1012コピー、1013コピーまたは1014コピーのAAVタンパク質が得られる、請求項18~27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物体から、少なくとも1012コピー、1013コピーまたは1014コピーのAAVタンパク質が得られる、請求項28に記載の方法。
- 遺伝子治療を行う方法であって、請求項18~29のいずれか1項に記載の方法によって製造され、単離されたAAV粒子を、遺伝子治療を必要とする対象の細胞に投与することを含む、方法。
- 医薬品として使用するための、請求項9に記載の組換え核酸ベクター、請求項11に記載のAAV粒子、または請求項20もしくは21に記載の方法によって製造されたAAV粒子。
- ヒト疾患を治療するための遺伝子治療において使用するための、請求項9に記載の組換え核酸ベクター、請求項11に記載のAAV粒子、または請求項20もしくは21に記載の方法によって製造されたAAV粒子であって、該ヒト疾患が、例えば、先天性代謝異常症、酵素欠損症、ポンペ病、ダノン病、神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、網膜変性疾患、網膜色素変性症、アッシャー症候群、シュタルガルト病、または難聴の遺伝的要因である、組換え核酸ベクター、AAV粒子、または前記方法によって製造されたAAV粒子。
- 植物体において機能性AAV粒子を製造する方法であって、
AAV粒子の構成要素またはAAV粒子の組み立てに関与する構成要素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸ベクターを用いて植物体を形質転換する工程;
前記AAV粒子が前記植物体において発現されて組み立てられる条件下で前記植物体を生長させる工程;および
前記植物体から前記AAV粒子を単離する工程
を含む方法。 - 前記植物体の形質転換工程が、アグロインフィルトレーションによって行われる、請求項33に記載の方法。
- 前記AAV粒子の構成要素をコードする核酸配列が、前記植物体用にコドン最適化されている、請求項33または34に記載の方法。
- 前記植物体が、タバコ属、シロイヌナズナ属、ナス属、アサ属、ソバ属、イネ属、アキノノゲシ属またはトウモロコシ属に属する、請求項33~35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物体が、タバコ属、アキノノゲシ属またはアサ属に属する種である、請求項33~36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物体が、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、タバコ(Nicotiana tabacum)、レタス(Lactuca sativa)またはアサ(Cannabis sativa)である、請求項33~37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記AAV粒子の構成要素または前記AAV粒子の組み立てに関与する構成要素が、REPタンパク質、CAPタンパク質、AAPタンパク質もしくはAd5 E4orf6タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項33~38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記REPタンパク質が、下流のインフレームのポリペプチドの翻訳を増強させる弱い植物コザック配列、および/または潜在的なORFの発現を阻止するための内部のメチオニンコドンの変異を含む核酸配列によってコードされる、請求項39に記載の方法。
- 前記REPタンパク質が、配列番号1~11と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項39または40に記載の方法。
- 前記REPタンパク質が、配列番号12または13と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するペプチド配列を含む、請求項39~41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CAPタンパク質が、下流のインフレームのポリペプチドの翻訳を増強させる弱い植物コザック配列を含む核酸配列によってコードされる、請求項39~42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CAPタンパク質が、配列番号14~24と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項39~43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CAPタンパク質が、配列番号25または26と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するペプチド配列を含む、請求項39~44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記AAPタンパク質が、配列番号27~37と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項39~45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記AAPタンパク質が、配列番号38と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するペプチド配列を含む、請求項39~46のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Ad5 E4orf6タンパク質が、配列番号39~49と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項39~47のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Ad5 E4orf6タンパク質が、配列番号50と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するペプチド配列を含む、請求項39~48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記AAV粒子の単離工程が、遠心分離、濾過および/またはクロマトグラフィーを含む、請求項33~49のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィーである、請求項50に記載の方法。
- 前記植物体から、少なくとも107個、108個、109個、1010個、1011個、1012個、1013個または1014個のAAV粒子が単離される、請求項33~51のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物体から、少なくとも1012個、1013個または1014個のAAV粒子が単離される、請求項33~52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、哺乳動物細胞への感染力を持ち、該哺乳動物細胞がヒト細胞であってもよく、HEK293T細胞であってもよい、請求項33~53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記AAV粒子を、ヒトなどの哺乳動物に投与する工程をさらに含む、請求項33~53のいずれか1項に記載の方法。
- 疾患の治療に使用するための、請求項33~53のいずれか1項に記載の方法によって製造されたAAV粒子。
- 医薬品の製造に使用するための、請求項33~53のいずれか1項に記載の方法によって製造されたAAV粒子。
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