JP2023512683A - 操作されたロイシンデカルボキシラーゼ - Google Patents

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ケリン マクラスキー，
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Abstract

本発明は、操作されたロイシンデカルボキシラーゼ（ＬＤＣ）ポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたロイシンデカルボキシラーゼ（ＬＤＣ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、触媒活性の増強、ならびにタンパク質分解に対する感受性の低減および／または低ｐＨ環境に対する耐性の増加を提供するように最適化される。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、貯蔵安定性の改善を提供するように最適化される。本発明は、治療目的および工業目的のための操作されたＬＤＣポリペプチドを含む組成物の使用のための方法も提供する。

Description

本出願は、２０２０年２月４日に出願された米国仮出願第６２／９７０，０３９号に対する優先権を主張し、すべての目的のために、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、操作されたロイシンデカルボキシラーゼ（ＬＤＣ）ポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたロイシンデカルボキシラーゼ（ＬＤＣ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、触媒活性の増強、ならびにタンパク質分解に対する感受性の低減および／または低ｐＨ環境に対する耐性の増加を提供するように最適化される。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、貯蔵安定性の改善を提供するように最適化される。本発明は、治療目的および工業目的のための操作されたＬＤＣポリペプチドを含む組成物の使用のための方法も提供する。
ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された「配列表」、表、またはコンピュータプログラムリスト付録に対する言及
サイズが２．０６メガバイトの、マシンフォーマットＩＢＭ－ＰＣ、ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）オペレーティングシステムで２０２１年２月３日に作成された、ファイルＣＸ７－１９８ＷＯ２＿ＳＴ２５．ＴＸＴに書かれた配列表は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
発明の背景
「ロイシネウリア（leucineuria）」、「分岐鎖アルファ－ロイシンデヒドロゲナーゼ欠乏症」および「ＢＣＫＤ欠乏症」とも称されるメープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ）は、ロイシン、イソロイシンおよびバリン（すなわち、分岐鎖アミノ酸）の異化経路に関与する分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）複合体における機能障害に続発する稀な遺伝性アミノ酸代謝異常症である。これは、Menkes et al. (Menkes et al., Pediatrics 14:462-467 [1954])によって１９５４年に最初に記載され、罹患新生児の尿の独特の甘い匂いに起因して名付けられた。これは、食欲不振、嘔吐、倦怠感、異常な動き（例えば、筋緊張亢進または筋緊張低下）、および発育の遅延によっても特徴付けられる。処置しないと、疾患は、脳障害、けいれん、昏睡、永続的な神経損傷、および死亡に進行し得る。以後の人生で、発育遅延、学習上の問題、けいれん、および運動困難が一般的である。疾患の徴候および症状に基づいて分類される４つの一般的な形態がある。最も一般的で重度の型が、「古典」型であり、これは、出生後２週間以内に明らかになる。他の型は、中間ＭＳＵＤ、間欠ＭＳＵＤ、およびチアミン反応性ＭＳＵＤである。古典形態では、疾患は、新生児がタンパク質を含有するミルクを摂取した後に明らかになる。これは、身体中でイソロイシン、ロイシンおよびバリンの増加をもたらし、脳に対して毒性になる。間欠形態では、脳損傷は、身体的ストレス（例えば、感染、発熱、または長期間にわたって食べない）の時間の間に起こり、代謝代償不全に至る。
新生児におけるＭＳＵＤについての診断検査は、それらの体液中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシンおよびバリンの濃度を決定する血液および尿のアミノ酸検査を含む。ＭＳＵＤが同定されると、ケトーシスおよびアシドーシスの徴候が存在するだろう。診断の際および症候性エピソードの間、処置は、タンパク質不含飲食物を食べることを含み、代謝結果の是正はアミノ酸レベルの上昇に関連する。特別な静脈注射用溶液の使用は、ロイシンレベル（最も毒性が高い）を減少させ、エネルギー欠損を是正する。
現在の処置は、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の食事制限を含む。ＢＣＫＤＨ複合体酵素の不十分なレベルは、脳脊髄液、血液および組織中のＢＣＡＡおよびそれらの関連する代謝産物の有毒な付着をもたらす。処置または一定の集中したケアなしでは、これは、多数の深刻な副作用（例えば、神経学的機能障害、けいれん、および乳児死亡）をもたらす。一部のＢＣＡＡは腎クリアランス（罹患患者の尿の典型的な甘いメープルシロップの匂いをもたらす）を介して反転するが、身体中の毒性アミノ酸のレベルの蓄積から軽減を提供するには十分ではない（Schadewalt and Wendel, Eur. J. Pediatr., 156(Suppl. 1): S62-66 [1997]；およびSkvorak, J. Inherit. Metab. Dis., 32(2):229-46 [2009]を参照されたい）。
Menkes et al., Pediatrics 14:462-467 [1954] Schadewalt and Wendel, Eur. J. Pediatr., 156(Suppl. 1): S62-66 [1997] Skvorak, J. Inherit. Metab. Dis., 32(2):229-46 [2009]
発明の概要
本発明は、操作されたロイシンデカルボキシラーゼ（ＬＤＣ）ポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたロイシンデカルボキシラーゼ（ＬＤＣ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、触媒活性の増強、ならびにタンパク質分解に対する感受性の低減および／または低ｐＨ環境に対する耐性の増加を提供するように最適化される。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、貯蔵安定性の改善を提供するように最適化される。本発明は、治療目的および工業目的のための操作されたＬＤＣポリペプチドを含む組成物の使用のための方法も提供する。
本発明は、本質的に同じ条件下で野生型ＬＤＣ酵素または参照ＬＤＣポリペプチドと比較した場合に、改善された性質を有する操作されたＬＤＣポリペプチドならびにその生物学的に活性な断片およびアナログを対象とする。本発明は、さらに、治療用組成物および／または工業用組成物において操作されたＬＤＣポリペプチドならびにその生物学的に活性な断片およびアナログを使用する方法、ならびに治療目的および／または工業目的のためのそのような組成物を使用する方法を対象とする。
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６の少なくとも１つに対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドであって、前記アミノ酸配列のアミノ酸位置が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６のアミノ酸配列を参照して番号付けられている、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを提供する。
本発明は、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドであって、前記ポリペプチド配列が、配列番号２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドも提供する。本発明は、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドであって、前記ポリペプチド配列が、配列番号４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをさらに提供する。本発明は、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドであって、前記ポリペプチド配列が、配列番号６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをさらに提供する。本発明は、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドであって、前記ポリペプチド配列が、配列番号８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをさらに提供する。本発明は、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドであって、前記ポリペプチド配列が、配列番号１０に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをさらに提供する。本発明は、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドであって、前記ポリペプチド配列が、配列番号１４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをさらに提供する。
一部のさらなる実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド配列は、配列番号１２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、５、１４、１４／３４／３８／３９／１０２／２６７／２７５／３５０／３５７、１４／３９／１０２／１２７／２４５／２６７／２７５／３４９／３５０、３４／３８／３９／１０２／１２７／２７５／３５７、３４／３８／３９／１０２／２７５／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３４９／３５０／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３５０／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２７５／３４９／３５７、３４／３９／１０２／２６４／２７５／３５０／３５７、３４／３９／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６４／２６７／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６７／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３５０、３８／３９／１０２／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／２４５／２６７／３５７、３８／３９／１２７／２６４／２７５、３８／３９／１２７／２６４／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５７、３８／３９／２４５／２７５／３５７、３８／３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３８／３９／２６４／２７５／３５７、３８／３９／２７５、３８／３９／２７５／３５０、３９、３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６７／２７５／３５７、３９／１２７／２４５／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／１２７／２４５／２６４／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２４５／３５７、３９／１２７／２６７／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２６７／３５０／３５７、３９／１２７／３５７、３９／２４５／２６４／２６７／２７５／３５７、３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／２７５／３５０／３５７、４８、１３９、１６４、１９６、２５５、２９９、３１８、３２４、３３９、３４３、３５０、３５３、３５７、３６４、３６５、３７９、３８１、３８６、３８９、３９１、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、および４０５から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号１２を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、５Ｍ、１４Ｉ、１４Ｔ／３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、１４Ｔ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／１０２Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／３５０Ｅ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６７Ｉ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／２４５Ｍ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３８Ｖ／３９Ｎ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／２７５Ｓ、３８Ｖ／３９Ｎ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１０２Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１０２Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２６７Ｉ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／２４５Ｍ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３９Ｎ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｓ、４８Ｆ、１３９Ｇ、１６４Ａ、１６４Ｃ、１９６Ｄ、１９６Ｒ、２５５Ｇ、２５５Ｎ、２５５Ｐ、２９９Ａ、２９９Ｖ、３１８Ｋ、３２４Ｍ、３２４Ｓ、３２４Ｔ、３３９Ａ、３３９Ｄ、３４３Ａ、３４３Ｅ、３５０Ｓ、３５３Ｄ、３５３Ｅ、３５３Ｌ、３５３Ｎ、３５３Ｓ、３５３Ｗ、３５７Ｃ、３５７Ｍ、３６４Ｋ、３６４Ｒ、３６５Ｅ、３７９Ｄ、３７９Ｐ、３８１Ｄ、３８１Ｅ、３８６＊、３８９Ｅ、３８９Ｇ、３８９Ｐ、３８９Ｑ、３９１＊、３９１Ｅ、３９３Ｔ、３９４Ｅ、３９５Ａ、３９５Ｄ、３９５Ｇ、３９５Ｋ、３９５Ｓ、３９７Ａ、３９８＊、４０５Ｄ、４０５Ｅ、４０５Ｈ、および４０５Ｌから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号１２を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｋ５Ｍ、Ｈ１４Ｉ、Ｈ１４Ｔ／Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｈ１４Ｔ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｖ２６７Ｉ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｉ２４５Ｍ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｓ、Ｌ４８Ｆ、Ｎ１３９Ｇ、Ｉ１６４Ａ、Ｉ１６４Ｃ、Ｋ１９６Ｄ、Ｋ１９６Ｒ、Ｈ２５５Ｇ、Ｈ２５５Ｎ、Ｈ２５５Ｐ、Ｋ２９９Ａ、Ｋ２９９Ｖ、Ｒ３１８Ｋ、Ｒ３２４Ｍ、Ｒ３２４Ｓ、Ｒ３２４Ｔ、Ｑ３３９Ａ、Ｑ３３９Ｄ、Ｈ３４３Ａ、Ｈ３４３Ｅ、Ｎ３５０Ｓ、Ｒ３５３Ｄ、Ｒ３５３Ｅ、Ｒ３５３Ｌ、Ｒ３５３Ｎ、Ｒ３５３Ｓ、Ｒ３５３Ｗ、Ｉ３５７Ｃ、Ｉ３５７Ｍ、Ｌ３６４Ｋ、Ｌ３６４Ｒ、Ｑ３６５Ｅ、Ｋ３７９Ｄ、Ｋ３７９Ｐ、Ａ３８１Ｄ、Ａ３８１Ｅ、Ｄ３８６＊、Ｋ３８９Ｅ、Ｋ３８９Ｇ、Ｋ３８９Ｐ、Ｋ３８９Ｑ、Ａ３９１＊、Ａ３９１Ｅ、Ｋ３９３Ｔ、Ｋ３９４Ｅ、Ｒ３９５Ａ、Ｒ３９５Ｄ、Ｒ３９５Ｇ、Ｒ３９５Ｋ、Ｒ３９５Ｓ、Ｔ３９７Ａ、Ｐ３９８＊、Ｔ４０５Ｄ、Ｔ４０５Ｅ、Ｔ４０５Ｈ、およびＴ４０５Ｌから選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号１２を参照して番号付けられている。
一部のさらなる実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド配列は、配列番号３８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、４８／６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、４８／６４／１６４／３２４／３４３／３６４、４８／６４／１６４／３５３／３５７／３６４、４８／６４／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５７／３６４、６４／１６４／３５３／３５７、６４／３１８／３２４／３５７／３６４、６４／３２４／３５３／３５７／３６４、１３２／２５５／３３９／３７９／３９５、１６４／１９６／３２４／３５７／３６４、１６４／３１８／３２４／３４３／３５３／３５７、１６４／３１８／３２４／３５７／３６４、１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、１６４／３２４／３５７／３６４、１６４／３５３／３５７／３６４、１６４／３６４、１９６／３１８／３２４／３５３／３５７／３６４、３１８／３４３／３５７、３２４／３４３／３５７／３６４、３２４／３５３／３５７／３６４、３２４／３５７／３６４、３３９／３７９／３８９／３９４／３９５、３３９／３８９／３９５、３３９／３９１、３３９／３９４／３９５／４０５、３５７／３６４、３７９／３８６、３７９／３９４／３９５／３９７／４０４／４０５、３７９／３９４／３９５／３９７／４０５、３８９／３９４／３９５／３９７／４０５、および３９４／３９７から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３８を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、４８Ｆ／６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｅ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、４８Ｆ／６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３６４Ｒ、４８Ｆ／６４Ｅ／１６４Ｃ／３５３Ｎ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、４８Ｆ／６４Ｅ／３５７Ｍ／３６４Ｋ、６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｋ、６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、６４Ｅ／１６４Ｃ／３５３Ｄ／３５７Ｖ、６４Ｅ／３１８Ｋ／３２４Ｓ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、６４Ｅ／３２４Ｍ／３５３Ｎ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１３２Ｆ／２５５Ｐ／３３９Ａ／３７９Ｄ／３９５Ｄ、１６４Ａ／１９６Ｄ／３２４Ｍ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、１６４Ａ／３１８Ｋ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｄ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１６４Ａ／３２４Ｍ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、１６４Ａ／３５３Ｗ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１６４Ａ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３１８Ｋ／３２４Ｓ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｋ、１６４Ｃ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３５３Ｗ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１９６Ｄ／３１８Ｋ／３２４Ｍ／３５３Ｎ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、３１８Ｋ／３４３Ｅ／３５７Ｃ、３１８Ｋ／３４３Ｅ／３５７Ｍ、３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５７Ｖ／３６４Ｋ、３２４Ｍ／３５７Ｍ／３６４Ｒ、３２４Ｎ／３５３Ｗ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、３３９Ａ／３７９Ｄ／３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ、３３９Ａ／３８９Ｇ／３９５Ｋ、３３９Ａ／３９１＊、３３９Ａ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／４０５Ｄ、３５７Ｖ／３６４Ｒ、３７９Ｄ／３８６＊、３７９Ｄ／３９４Ｅ／３９５Ｄ／３９７Ａ／４０４Ｉ／４０５Ｈ、３７９Ｄ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ／４０５Ｄ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ／３９７Ａ／４０５Ｄ、および３９４Ｅ／３９７Ａから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３８を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｌ３６４Ｒ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｎ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ３５７Ｍ／Ｌ３６４Ｋ、Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｋ、Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ、Ａ６４Ｅ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｓ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ａ６４Ｅ／Ｒ３２４Ｍ／Ｒ３５３Ｎ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｙ１３２Ｆ／Ｈ２５５Ｐ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３７９Ｄ／Ｒ３９５Ｄ、Ｉ１６４Ａ／Ｋ１９６Ｄ／Ｒ３２４Ｍ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３５３Ｗ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ａ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｓ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｋ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｗ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｋ１９６Ｄ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｍ／Ｒ３５３Ｎ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｒ３１８Ｋ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ、Ｒ３１８Ｋ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｍ、Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｋ、Ｒ３２４Ｍ／Ｉ３５７Ｍ／Ｌ３６４Ｒ、Ｒ３２４Ｎ／Ｒ３５３Ｗ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｑ３３９Ａ／Ｋ３７９Ｄ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｒ３９５Ｋ、Ｑ３３９Ａ／Ａ３９１＊、Ｑ３３９Ａ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ４０５Ｄ、Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｋ３７９Ｄ／Ｄ３８６＊、Ｋ３７９Ｄ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ／Ｒ４０４Ｉ／Ｔ４０５Ｈ、Ｋ３７９Ｄ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ／Ｔ４０５Ｄ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ／Ｔ４０５Ｄ、およびＫ３９４Ｅ／Ｔ３９７Ａから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３８を参照して番号付けられている。
一部のさらなる実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド配列は、配列番号２３４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、２、３、３３、４８／６４／２５５、４８／２５５／３３９、４８／２５５／３７９、６４、６４／２５５、６９、１６１、１９３、２５５、２５５／３１８／３７９、２５９、２６３、３１８／３３９／３７９、３２４、３２４／３８９／３９４、３２４／３８９／３９４／３９５、３２４／３８９／３９４／３９７、３２４／３９４、３２４／３９４／３９５、３２４／３９４／３９５／３９７、３２４／３９５、３３９、３４０、３８０、３８２、３８９、３８９／３９４、３８９／３９４／３９５、３８９／３９４／３９５／３９７、３８９／３９４／３９７、３８９／３９５、３８９／３９７、３９０、３９４、３９４／３９５、３９４／３９５／３９７、３９５、３９５／３９７、３９７、４０１、および４０５から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２３４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、２Ｅ、３Ｍ、３３Ｌ、４８Ｆ／６４Ｅ／２５５Ｐ、４８Ｆ／２５５Ｐ／３３９Ａ、４８Ｆ／２５５Ｐ／３７９Ｄ、６４Ｅ、６４Ｅ／２５５Ｐ、６４Ｓ、６９Ｉ、１６１Ｖ、１９３Ｉ、２５５Ｐ、２５５Ｐ／３１８Ｋ／３７９Ｄ、２５９Ｌ、２６３Ｔ、２６３Ｖ、３１８Ｋ／３３９Ａ／３７９Ｄ、３２４Ｎ、３２４Ｎ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３２４Ｎ／３９５Ｄ、３２４Ｓ／３８９Ｇ／３９４Ｅ、３２４Ｓ／３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ、３２４Ｓ／３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９７Ａ、３２４Ｓ／３９４Ｅ、３２４Ｓ／３９４Ｅ／３９５Ｋ、３２４Ｓ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３２４Ｓ／３９５Ｋ、３３９Ａ、３４０Ｔ、３４０Ｖ、３８０Ｅ、３８２Ｓ、３８９Ｇ、３８９Ｇ／３９４Ｅ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ／３９７Ａ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｋ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９７Ａ、３８９Ｇ／３９５Ｄ、３８９Ｇ／３９５Ｋ、３８９Ｇ／３９７Ａ、３９０＊、３９０Ａ、３９０Ｅ、３９０Ｓ、３９４Ｅ、３９４Ｅ／３９５Ｄ、３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３９５Ｄ／３９７Ａ、３９５Ｋ、３９７Ａ、４０１＊、４０１Ｙ、および４０５Ｈから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２３４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｇ２Ｅ、Ｎ３Ｍ、Ｆ３３Ｌ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｈ２５５Ｐ、Ｌ４８Ｆ／Ｈ２５５Ｐ／Ｑ３３９Ａ、Ｌ４８Ｆ／Ｈ２５５Ｐ／Ｋ３７９Ｄ、Ａ６４Ｅ、Ａ６４Ｅ／Ｈ２５５Ｐ、Ａ６４Ｓ、Ｖ６９Ｉ、Ｔ１６１Ｖ、Ｍ１９３Ｉ、Ｈ２５５Ｐ、Ｈ２５５Ｐ／Ｒ３１８Ｋ／Ｋ３７９Ｄ、Ｒ２５９Ｌ、Ｓ２６３Ｔ、Ｓ２６３Ｖ、Ｒ３１８Ｋ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３７９Ｄ、Ｍ３２４Ｎ、Ｍ３２４Ｎ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｍ３２４Ｎ／Ｒ３９５Ｄ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｔ３９７Ａ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３９４Ｅ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｍ３２４Ｓ／Ｒ３９５Ｋ、Ｑ３３９Ａ、Ｓ３４０Ｔ、Ｓ３４０Ｖ、Ａ３８０Ｅ、Ａ３８２Ｓ、Ｋ３８９Ｇ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｔ３９７Ａ、Ｋ３８９Ｇ／Ｒ３９５Ｄ、Ｋ３８９Ｇ／Ｒ３９５Ｋ、Ｋ３８９Ｇ／Ｔ３９７Ａ、Ｐ３９０＊、Ｐ３９０Ａ、Ｐ３９０Ｅ、Ｐ３９０Ｓ、Ｋ３９４Ｅ、Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ、Ｒ３９５Ｋ、Ｔ３９７Ａ、Ａ４０１＊、Ａ４０１Ｙ、およびＴ４０５Ｈから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２３４を参照して番号付けられている。
一部のさらなる実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド配列は、配列番号２８４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、２／６４／６９／３２４／３８０／３８２／３８８／３８９、３／６４／６９／２６３／３３９／３８０／３８８、３／６４／６９／３８９、３／６４／６９／３９０、３／６４／３７９／３８０／３９０、３／６９／２６３／３８０、３／６９／３２４、３／６９／３２４／３８０／３８２／３８９／３９０、１２／１３５／２５９／２６３、１２／１３５／２６３／３８２、１２／２５９／２６３／３０４、４８／６４／２５５、６４／６９、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、６４／６９／２２３／３８８、６４／６９／２２３／３８８／３８９／３９０、６４／６９／３０４／３７９／３８２、６４／６９／３２４、６４／６９／３２４／３３９／３８０／３８９／３９０、６４／６９／３３９、６４／６９／３３９／３８２／３８８／３８９、６４／６９／３３９／３８９／３９０、６４／６９／３７９／３８０、６４／６９／３８０／３８８／３９０、６４／６９／３８９、６４／６９／３９０、６４／２５５／２６３、６４／２６３、６４／３２４／３３９／３８９／３９０、６９／２２３／２６３／３２４／３８２／３８８／３９０、６９／２２３／３２４／３７９／３８０／３８２／３８８／３９０、６９／２６３、６９／２６３／３２４、６９／２６３／３３９、６９／２６３／３８８、６９／２６３／３８９／３９０、６９／３２４／３７９／３８０／３８８、６９／３２４／３８０、６９／３３９／３９０、６９／３８２／３９０、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、２６３／３３９／３８９／３９０、２６３／３９０、および３０４／３４０／３７９／３８０／３８２から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２８４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、２Ｅ／６４Ｓ／６９Ｉ／３２４Ｓ／３８０Ｅ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３８９Ｇ、３Ｍ／６４Ｓ／６９Ｉ／２６３Ｔ／３３９Ａ／３８０Ｅ／３８８Ａ、３Ｍ／６４Ｓ／６９Ｉ／３８９Ｇ、３Ｍ／６４Ｓ／６９Ｉ／３９０＊、３Ｍ／６４Ｓ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３９０＊、３Ｍ／６９Ｉ／２６３Ｔ／３８０Ｅ、３Ｍ／６９Ｉ／３２４Ｓ、３Ｍ／６９Ｉ／３２４Ｓ／３８０Ｅ／３８２Ｓ／３８９Ｇ／３９０＊、１２Ｇ／１３５Ｖ／２５９Ｋ／２６３Ｔ、１２Ｇ／１３５Ｖ／２６３Ｔ／３８２Ｇ、１２Ｇ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、４８Ｌ／６４Ａ／２５５Ｈ、６４Ａ／２５５Ｈ／２６３Ｔ、６４Ｓ／６９Ｉ、６４Ｓ／６９Ｉ／１８９Ａ／２５９Ｑ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３３９Ａ／３４０Ｔ／３７９Ｎ、６４Ｓ／６９Ｉ／１８９Ｄ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、６４Ｓ／６９Ｉ／２２３Ｍ／３８８Ａ、６４Ｓ／６９Ｉ／２２３Ｍ／３８８Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３０４Ｒ／３７９Ｅ／３８２Ｇ、６４Ｓ／６９Ｉ／３２４Ｓ、６４Ｓ／６９Ｉ／３２４Ｓ／３３９Ａ／３８０Ｅ／３８９Ｇ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３３９Ａ、６４Ｓ／６９Ｉ／３３９Ａ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３８９Ｇ、６４Ｓ／６９Ｉ／３３９Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３７９Ｄ／３８０Ｅ、６４Ｓ／６９Ｉ／３８０Ｅ／３８８Ａ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３８９Ｇ、６４Ｓ／６９Ｉ／３９０＊、６４Ｓ／２６３Ｔ、６４Ｓ／３２４Ｓ／３３９Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、６９Ｉ／２２３Ｍ／２６３Ｔ／３２４Ｓ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３９０＊、６９Ｉ／２２３Ｍ／３２４Ｓ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３９０＊、６９Ｉ／２６３Ｔ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３２４Ｓ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３３９Ａ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３８８Ａ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３８９Ｇ／３９０＊、６９Ｉ／３２４Ｓ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３８８Ａ、６９Ｉ／３２４Ｓ／３８０Ｅ、６９Ｉ／３３９Ａ／３９０＊、６９Ｉ／３８２Ｓ／３９０＊、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３３９Ａ／３４０Ｔ／３７９Ｎ、２６３Ｔ／３３９Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、２６３Ｔ／３９０＊、および３０４Ｒ／３４０Ｔ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３８２Ｇから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２８４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｇ２Ｅ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｋ３８９Ｇ、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８０Ｅ／Ｑ３８８Ａ、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｋ３８９Ｇ、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｐ３９０＊、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ｐ３９０＊、Ｎ３Ｍ／Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３８０Ｅ、Ｎ３Ｍ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｓ１２Ｇ／Ｌ１３５Ｖ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ、Ｓ１２Ｇ／Ｌ１３５Ｖ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３８２Ｇ、Ｓ１２Ｇ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｆ４８Ｌ／Ｅ６４Ａ／Ｐ２５５Ｈ、Ｅ６４Ａ／Ｐ２５５Ｈ／Ｓ２６３Ｔ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｔ１８９Ａ／Ｒ２５９Ｑ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｑ３３９Ａ／Ｓ３４０Ｔ／Ｋ３７９Ｎ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｔ１８９Ｄ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｑ３８８Ａ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｑ３８８Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ３０４Ｒ／Ｋ３７９Ｅ／Ａ３８２Ｇ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８０Ｅ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｋ３８９Ｇ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ３８０Ｅ／Ｑ３８８Ａ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｋ３８９Ｇ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｓ２６３Ｔ、Ｅ６４Ｓ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｍ３２４Ｓ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３３９Ａ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３８８Ａ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ｑ３８８Ａ、Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８０Ｅ、Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ａ３８２Ｓ／Ｐ３９０＊、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｑ３３９Ａ／Ｓ３４０Ｔ／Ｋ３７９Ｎ、Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｓ２６３Ｔ／Ｐ３９０＊、およびＡ３０４Ｒ／Ｓ３４０Ｔ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｇから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２８４を参照して番号付けられている。
一部のさらなる実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド配列は、配列番号４８４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、３／１９４／３０４、３／２５９／２６３／３０４、３／２５９／３０４、３／２５９／３０４／３２４／３３９、３／２５９／３０４／３２４／３８２、３／２５９／３０４／３８２、３／２６３／３０４／３２４、３／２６３／３０４／３２４／３３９、３／２６３／３０４／３２４／３８２、３／３０４、３／３０４／３２４、１６、６３、７７、８０、８７／２７０、８７／２７０／３６５、８７／３２８／３６５、９１、９２、１２６、１４０、１５６、１６８／２７０／３２８／３３８、１８１、１９４、２０１、２５６、２５９、２５９／２６３、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３２４、２５９／２６３／３０４／３２４／３８２、２５９／２６３／３０４／３７９、２５９／２６３／３０４／３８２、２５９／３０４、２５９／３０４／３２４、２５９／３０４／３２４／３３９、２５９／３０４／３２４／３３９／３８２、２５９／３０４／３８２、２６２、２６３／３０４、２６３／３０４／３２４、２６３／３０４／３２４／３３９、２６３／３０４／３２４／３８２、２６３／３２４、２７０、２７０／３１９、２７０／３２８／３３８、２７０／３２８／３３８／３６５、３０４、３０４／３２４、３２４、３２８、３５２、３６５、３６６、および３８２から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号４８４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、３Ｍ／１９４Ｌ／３０４Ｒ、３Ｍ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ／３８２Ｓ、３Ｍ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、３Ｍ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、３Ｍ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、３Ｍ／３０４Ｒ、３Ｍ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、１６Ｑ、１６Ｖ、６３Ｃ、７７Ｌ、８０Ｇ、８０Ｋ、８７Ｒ／２７０Ｒ、８７Ｒ／２７０Ｒ／３６５Ｅ、８７Ｒ／３２８Ｎ／３６５Ｅ、９１Ａ、９１Ｑ、９２Ｋ、１２６Ａ、１２６Ｔ、１４０Ｖ、１５６Ａ、１５６Ｓ、１６８Ｋ／２７０Ｒ／３２８Ｎ／３３８Ｓ、１８１Ｋ、１８１Ｒ、１８１Ｖ、１９４Ｃ、１９４Ｌ、２０１Ｄ、２５６Ｗ、２５９Ｋ、２５９Ｋ／２６３Ｔ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３７９Ｄ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３８２Ｓ、２５９Ｋ／３０４Ｒ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ／３８２Ｓ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３８２Ｓ、２６２Ｄ、２６２Ｇ、２６２Ｈ、２６２Ｉ、２６２Ｓ、２６２Ｔ、２６３Ｔ／３０４Ｒ、２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、２６３Ｔ／３２４Ｓ、２７０Ｒ、２７０Ｒ／３１９Ａ、２７０Ｒ／３２８Ｎ／３３８Ｓ、２７０Ｒ／３２８Ｎ／３３８Ｓ／３６５Ｅ、３０４Ｒ、３０４Ｒ／３２４Ｓ、３２４Ｓ、３２８Ｎ、３５２Ａ、３６５Ｅ、３６６Ａ、３６６Ｌ、３６６Ｍ、３６６Ｑ、３６６Ｔ、３６６Ｖ、および３８２Ｓから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号４８４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｎ３Ｍ／Ｆ１９４Ｌ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ａ３８２Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｎ３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ、Ｒ１６Ｖ、Ａ６３Ｃ、Ｅ７７Ｌ、Ａ８０Ｇ、Ａ８０Ｋ、Ｈ８７Ｒ／Ｌ２７０Ｒ、Ｈ８７Ｒ／Ｌ２７０Ｒ／Ｑ３６５Ｅ、Ｈ８７Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｑ３６５Ｅ、Ｅ９１Ａ、Ｅ９１Ｑ、Ｅ９２Ｋ、Ｄ１２６Ａ、Ｄ１２６Ｔ、Ｍ１４０Ｖ、Ｇ１５６Ａ、Ｇ１５６Ｓ、Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｐ３３８Ｓ、Ｔ１８１Ｋ、Ｔ１８１Ｒ、Ｔ１８１Ｖ、Ｆ１９４Ｃ、Ｆ１９４Ｌ、Ｅ２０１Ｄ、Ｙ２５６Ｗ、Ｒ２５９Ｋ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｋ３７９Ｄ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２６２Ｄ、Ｒ２６２Ｇ、Ｒ２６２Ｈ、Ｒ２６２Ｉ、Ｒ２６２Ｓ、Ｒ２６２Ｔ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｓ２６３Ｔ／Ｍ３２４Ｓ、Ｌ２７０Ｒ、Ｌ２７０Ｒ／Ｉ３１９Ａ、Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｐ３３８Ｓ、Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｐ３３８Ｓ／Ｑ３６５Ｅ、Ａ３０４Ｒ、Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｍ３２４Ｓ、Ｃ３２８Ｎ、Ｄ３５２Ａ、Ｑ３６５Ｅ、Ｈ３６６Ａ、Ｈ３６６Ｌ、Ｈ３６６Ｍ、Ｈ３６６Ｑ、Ｈ３６６Ｔ、Ｈ３６６Ｖ、およびＡ３８２Ｓから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号４８４を参照して番号付けられている。
一部のさらなる実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド配列は、配列番号５９４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、１６／６３／８０／１２６／１６８／３６６、１６／６３／８０／１２６／１８１／１９４／２５９／３２４／３２８／３６６、１６／６３／１２６／１６８／２７０／３２８／３６６、１６／８０／１２６／３２４／３６６、１６／８０／１２６／３６６、１６／８０／１６８、１６／８０／１６８／２７０／３６６、１６／８０／１６８／３２４、１６／８０／１６８／３６６、１６／８０／３２４、１６／９１／１２６／１６８／３２４／３６６、１６／１２６／１６８／３６６、１６／１６８／２５９／３６６、１６／１６８／２７０／３２４／３６６、１６／１６８／３２４／３２８／３６６、１６／１６８／３２４／３６６、１６／１６８／３６６、１６／２５９／２６３／３２８、１６／３２４／３２８／３６６、１６／３２８／３６６、８０／１２６／１６８／２７０／３６６、８０／１２６／１６８／３６６、８０／１２６／１８１／２７０／３２４／３６６、８０／１６８／２７０／３６６、および１６８／３６６から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号５９４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、１６Ｑ／６３Ｃ／８０Ｋ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／６３Ｃ／８０Ｋ／１２６Ｔ／１８１Ｒ／１９４Ｃ／２５９Ｋ／３２４Ｓ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／６３Ｃ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１２６Ｔ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１２６Ｔ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ／３２４Ｓ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／３２４Ｓ、１６Ｑ／９１Ａ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／２５９Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／３２４Ｓ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３２８Ｎ、１６Ｑ／３２４Ｓ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１２６Ｔ／１８１Ｒ／２７０Ｒ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３６６Ｍ、および１６８Ｋ／３６６Ｍから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号５９４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｒ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｔ１８１Ｒ／Ｆ１９４Ｃ／Ｒ２５９Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ／Ｅ９１Ａ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｒ２５９Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ｃ３２８Ｎ、Ｒ１６Ｑ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｔ１８１Ｒ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、およびＣ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号５９４を参照して番号付けられている。
一部のさらなる実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド配列は、配列番号６８６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、６６／７６／１１８／１４１／２０１／３００、６６／７６／１９８／２００／２９６／３０３、６６／７６／１９８／２００／３００、６６／１１８／２００／２９６／３０３／３１７、６６／１１８／２９６、６６／１１８／２９６／３００、６６／２００、７６／１１８／１４１／２００／２９６、７６／１４１／１９８／２００／２０１／３００、８０／２０１／２７０、８０／２７０、８０／２７０／３２４、８９／１１８／２００、１０６／２７０／３２４／３５２、１１８／１４１／２００、１２６、１２６／２０１／２７０／３２４、１２６／２７０、１４１／１４４／１９８／２００／３００、１５６／２７０、１５６／２７０／３２４、２０１／２７０、２０１／２７０／３５２、２７０、および２７０／３２４から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８６を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、６６Ｎ／７６Ｖ／１１８Ｄ／１４１Ｐ／２０１Ｒ／３００Ｋ、６６Ｎ／７６Ｖ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２９６Ｅ／３０３Ｑ、６６Ｎ／７６Ｖ／１９８Ｇ／２００Ｓ／３００Ｋ、６６Ｎ／１１８Ｄ／２００Ｓ／２９６Ｅ／３０３Ｑ／３１７Ｑ、６６Ｎ／１１８Ｄ／２９６Ｅ、６６Ｎ／１１８Ｄ／２９６Ｅ／３００Ｋ、６６Ｎ／２００Ｓ、７６Ｖ／１１８Ｄ／１４１Ｐ／２００Ｓ／２９６Ｅ、７６Ｖ／１４１Ｐ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２０１Ｒ／３００Ｋ、８０Ｋ／２０１Ｄ／２７０Ｒ、８０Ｋ／２７０Ｒ、８０Ｋ／２７０Ｒ／３２４Ｓ、８９Ｐ／１１８Ｄ／２００Ｓ、１０６Ｍ／２７０Ｒ／３２４Ｓ／３５２Ａ、１１８Ｄ／１４１Ｐ／２００Ｓ、１２６Ｔ、１２６Ｔ／２０１Ｄ／２７０Ｒ／３２４Ｓ、１２６Ｔ／２７０Ｒ、１４１Ｐ／１４４Ｖ／１９８Ｇ／２００Ｓ／３００Ｋ、１５６Ａ／２７０Ｒ、１５６Ａ／２７０Ｒ／３２４Ｓ、２０１Ｄ／２７０Ｒ、２０１Ｄ／２７０Ｒ／３５２Ａ、２７０Ｒ、および２７０Ｒ／３２４Ｓから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８６を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｓ６６Ｎ／Ｒ７６Ｖ／Ｔ１１８Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｅ２０１Ｒ／Ｒ３００Ｋ、Ｓ６６Ｎ／Ｒ７６Ｖ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｄ２９６Ｅ／Ａ３０３Ｑ、Ｓ６６Ｎ／Ｒ７６Ｖ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｒ３００Ｋ、Ｓ６６Ｎ／Ｔ１１８Ｄ／Ｈ２００Ｓ／Ｄ２９６Ｅ／Ａ３０３Ｑ／Ｋ３１７Ｑ、Ｓ６６Ｎ／Ｔ１１８Ｄ／Ｄ２９６Ｅ、Ｓ６６Ｎ／Ｔ１１８Ｄ／Ｄ２９６Ｅ／Ｒ３００Ｋ、Ｓ６６Ｎ／Ｈ２００Ｓ、Ｒ７６Ｖ／Ｔ１１８Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｈ２００Ｓ／Ｄ２９６Ｅ、Ｒ７６Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｅ２０１Ｒ／Ｒ３００Ｋ、Ａ８０Ｋ／Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ、Ａ８０Ｋ／Ｌ２７０Ｒ、Ａ８０Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ａ８９Ｐ／Ｔ１１８Ｄ／Ｈ２００Ｓ、Ｌ１０６Ｍ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｄ３５２Ａ、Ｔ１１８Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｈ２００Ｓ、Ｄ１２６Ｔ、Ｄ１２６Ｔ／Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｄ１２６Ｔ／Ｌ２７０Ｒ、Ｒ１４１Ｐ／Ｍ１４４Ｖ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｒ３００Ｋ、Ｇ１５６Ａ／Ｌ２７０Ｒ、Ｇ１５６Ａ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ、Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ／Ｄ３５２Ａ、Ｌ２７０Ｒ、およびＬ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８６を参照して番号付けられている。
一部のさらなる実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド配列は、配列番号６８６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、１９、１０９、１２３、１３４、１７０、１７３、１８７、２１１、および３１２から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８６を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、１９Ｉ、１０９Ｇ、１２３Ｆ、１２３Ｍ、１２３Ｖ、１３４Ａ、１３４Ｓ、１７０Ａ、１７３Ａ、１７３Ｉ、１７３Ｔ、１８７Ｌ、２１１Ｓ、および３１２Ａから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８６を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｌ１９Ｉ、Ｌ１０９Ｇ、Ｙ１２３Ｆ、Ｙ１２３Ｍ、Ｙ１２３Ｖ、Ｎ１３４Ａ、Ｎ１３４Ｓ、Ｐ１７０Ａ、Ｆ１７３Ａ、Ｆ１７３Ｉ、Ｆ１７３Ｔ、Ｖ１８７Ｌ、Ａ２１１Ｓ、およびＴ３１２Ａから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８６を参照して番号付けられている。
一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、５、１４、１４／３４／３８／３９／１０２／２６７／２７５／３５０／３５７、１４／３９／１０２／１２７／２４５／２６７／２７５／３４９／３５０、３４／３８／３９／１０２／１２７／２７５／３５７、３４／３８／３９／１０２／２７５／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３４９／３５０／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３５０／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２７５／３４９／３５７、３４／３９／１０２／２６４／２７５／３５０／３５７、３４／３９／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６４／２６７／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６７／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３５０、３８／３９／１０２／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／２４５／２６７／３５７、３８／３９／１２７／２６４／２７５、３８／３９／１２７／２６４／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５７、３８／３９／２４５／２７５／３５７、３８／３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３８／３９／２６４／２７５／３５７、３８／３９／２７５、３８／３９／２７５／３５０、３９、３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６７／２７５／３５７、３９／１２７／２４５／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／１２７／２４５／２６４／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２４５／３５７、３９／１２７／２６７／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２６７／３５０／３５７、３９／１２７／３５７、３９／２４５／２６４／２６７／２７５／３５７、３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／２７５／３５０／３５７、４８、１３９、１６４、１９６、２５５、２９９、３１８、３２４、３３９、３４３、３５０、３５３、３５７、３６４、３６５、３７９、３８１、３８６、３８９、３９１、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、および４０５から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号１２を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、５Ｍ、１４Ｉ、１４Ｔ／３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、１４Ｔ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／１０２Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／３５０Ｅ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６７Ｉ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／２４５Ｍ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３８Ｖ／３９Ｎ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／２７５Ｓ、３８Ｖ／３９Ｎ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１０２Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１０２Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２６７Ｉ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／２４５Ｍ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３９Ｎ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｓ、４８Ｆ、１３９Ｇ、１６４Ａ、１６４Ｃ、１９６Ｄ、１９６Ｒ、２５５Ｇ、２５５Ｎ、２５５Ｐ、２９９Ａ、２９９Ｖ、３１８Ｋ、３２４Ｍ、３２４Ｓ、３２４Ｔ、３３９Ａ、３３９Ｄ、３４３Ａ、３４３Ｅ、３５０Ｓ、３５３Ｄ、３５３Ｅ、３５３Ｌ、３５３Ｎ、３５３Ｓ、３５３Ｗ、３５７Ｃ、３５７Ｍ、３６４Ｋ、３６４Ｒ、３６５Ｅ、３７９Ｄ、３７９Ｐ、３８１Ｄ、３８１Ｅ、３８６＊、３８９Ｅ、３８９Ｇ、３８９Ｐ、３８９Ｑ、３９１＊、３９１Ｅ、３９３Ｔ、３９４Ｅ、３９５Ａ、３９５Ｄ、３９５Ｇ、３９５Ｋ、３９５Ｓ、３９７Ａ、３９８＊、４０５Ｄ、４０５Ｅ、４０５Ｈ、および４０５Ｌから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号１２を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｋ５Ｍ、Ｈ１４Ｉ、Ｈ１４Ｔ／Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｈ１４Ｔ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｖ２６７Ｉ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｉ２４５Ｍ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｓ、Ｌ４８Ｆ、Ｎ１３９Ｇ、Ｉ１６４Ａ、Ｉ１６４Ｃ、Ｋ１９６Ｄ、Ｋ１９６Ｒ、Ｈ２５５Ｇ、Ｈ２５５Ｎ、Ｈ２５５Ｐ、Ｋ２９９Ａ、Ｋ２９９Ｖ、Ｒ３１８Ｋ、Ｒ３２４Ｍ、Ｒ３２４Ｓ、Ｒ３２４Ｔ、Ｑ３３９Ａ、Ｑ３３９Ｄ、Ｈ３４３Ａ、Ｈ３４３Ｅ、Ｎ３５０Ｓ、Ｒ３５３Ｄ、Ｒ３５３Ｅ、Ｒ３５３Ｌ、Ｒ３５３Ｎ、Ｒ３５３Ｓ、Ｒ３５３Ｗ、Ｉ３５７Ｃ、Ｉ３５７Ｍ、Ｌ３６４Ｋ、Ｌ３６４Ｒ、Ｑ３６５Ｅ、Ｋ３７９Ｄ、Ｋ３７９Ｐ、Ａ３８１Ｄ、Ａ３８１Ｅ、Ｄ３８６＊、Ｋ３８９Ｅ、Ｋ３８９Ｇ、Ｋ３８９Ｐ、Ｋ３８９Ｑ、Ａ３９１＊、Ａ３９１Ｅ、Ｋ３９３Ｔ、Ｋ３９４Ｅ、Ｒ３９５Ａ、Ｒ３９５Ｄ、Ｒ３９５Ｇ、Ｒ３９５Ｋ、Ｒ３９５Ｓ、Ｔ３９７Ａ、Ｐ３９８＊、Ｔ４０５Ｄ、Ｔ４０５Ｅ、Ｔ４０５Ｈ、およびＴ４０５Ｌから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号１２を参照して番号付けられている。
一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、４８／６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、４８／６４／１６４／３２４／３４３／３６４、４８／６４／１６４／３５３／３５７／３６４、４８／６４／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５７／３６４、６４／１６４／３５３／３５７、６４／３１８／３２４／３５７／３６４、６４／３２４／３５３／３５７／３６４、１３２／２５５／３３９／３７９／３９５、１６４／１９６／３２４／３５７／３６４、１６４／３１８／３２４／３４３／３５３／３５７、１６４／３１８／３２４／３５７／３６４、１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、１６４／３２４／３５７／３６４、１６４／３５３／３５７／３６４、１６４／３６４、１９６／３１８／３２４／３５３／３５７／３６４、３１８／３４３／３５７、３２４／３４３／３５７／３６４、３２４／３５３／３５７／３６４、３２４／３５７／３６４、３３９／３７９／３８９／３９４／３９５、３３９／３８９／３９５、３３９／３９１、３３９／３９４／３９５／４０５、３５７／３６４、３７９／３８６、３７９／３９４／３９５／３９７／４０４／４０５、３７９／３９４／３９５／３９７／４０５、３８９／３９４／３９５／３９７／４０５、および３９４／３９７から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３８を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、４８Ｆ／６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｅ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、４８Ｆ／６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３６４Ｒ、４８Ｆ／６４Ｅ／１６４Ｃ／３５３Ｎ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、４８Ｆ／６４Ｅ／３５７Ｍ／３６４Ｋ、６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｋ、６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、６４Ｅ／１６４Ｃ／３５３Ｄ／３５７Ｖ、６４Ｅ／３１８Ｋ／３２４Ｓ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、６４Ｅ／３２４Ｍ／３５３Ｎ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１３２Ｆ／２５５Ｐ／３３９Ａ／３７９Ｄ／３９５Ｄ、１６４Ａ／１９６Ｄ／３２４Ｍ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、１６４Ａ／３１８Ｋ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｄ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１６４Ａ／３２４Ｍ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、１６４Ａ／３５３Ｗ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１６４Ａ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３１８Ｋ／３２４Ｓ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｋ、１６４Ｃ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３５３Ｗ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１９６Ｄ／３１８Ｋ／３２４Ｍ／３５３Ｎ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、３１８Ｋ／３４３Ｅ／３５７Ｃ、３１８Ｋ／３４３Ｅ／３５７Ｍ、３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５７Ｖ／３６４Ｋ、３２４Ｍ／３５７Ｍ／３６４Ｒ、３２４Ｎ／３５３Ｗ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、３３９Ａ／３７９Ｄ／３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ、３３９Ａ／３８９Ｇ／３９５Ｋ、３３９Ａ／３９１＊、３３９Ａ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／４０５Ｄ、３５７Ｖ／３６４Ｒ、３７９Ｄ／３８６＊、３７９Ｄ／３９４Ｅ／３９５Ｄ／３９７Ａ／４０４Ｉ／４０５Ｈ、３７９Ｄ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ／４０５Ｄ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ／３９７Ａ／４０５Ｄ、および３９４Ｅ／３９７Ａからの１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３８を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｌ３６４Ｒ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｎ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ３５７Ｍ／Ｌ３６４Ｋ、Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｋ、Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ、Ａ６４Ｅ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｓ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ａ６４Ｅ／Ｒ３２４Ｍ／Ｒ３５３Ｎ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｙ１３２Ｆ／Ｈ２５５Ｐ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３７９Ｄ／Ｒ３９５Ｄ、Ｉ１６４Ａ／Ｋ１９６Ｄ／Ｒ３２４Ｍ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３５３Ｗ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ａ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｓ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｋ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｗ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｋ１９６Ｄ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｍ／Ｒ３５３Ｎ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｒ３１８Ｋ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ、Ｒ３１８Ｋ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｍ、Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｋ、Ｒ３２４Ｍ／Ｉ３５７Ｍ／Ｌ３６４Ｒ、Ｒ３２４Ｎ／Ｒ３５３Ｗ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｑ３３９Ａ／Ｋ３７９Ｄ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｒ３９５Ｋ、Ｑ３３９Ａ／Ａ３９１＊、Ｑ３３９Ａ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ４０５Ｄ、Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｋ３７９Ｄ／Ｄ３８６＊、Ｋ３７９Ｄ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ／Ｒ４０４Ｉ／Ｔ４０５Ｈ、Ｋ３７９Ｄ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ／Ｔ４０５Ｄ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ／Ｔ４０５Ｄ、およびＫ３９４Ｅ／Ｔ３９７Ａからの１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３８を参照して番号付けられている。
一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、２、３、３３、４８／６４／２５５、４８／２５５／３３９、４８／２５５／３７９、６４、６４／２５５、６９、１６１、１９３、２５５、２５５／３１８／３７９、２５９、２６３、３１８／３３９／３７９、３２４、３２４／３８９／３９４、３２４／３８９／３９４／３９５、３２４／３８９／３９４／３９７、３２４／３９４、３２４／３９４／３９５、３２４／３９４／３９５／３９７、３２４／３９５、３３９、３４０、３８０、３８２、３８９、３８９／３９４、３８９／３９４／３９５、３８９／３９４／３９５／３９７、３８９／３９４／３９７、３８９／３９５、３８９／３９７、３９０、３９４、３９４／３９５、３９４／３９５／３９７、３９５、３９５／３９７、３９７、４０１、および４０５から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２３４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、２Ｅ、３Ｍ、３３Ｌ、４８Ｆ／６４Ｅ／２５５Ｐ、４８Ｆ／２５５Ｐ／３３９Ａ、４８Ｆ／２５５Ｐ／３７９Ｄ、６４Ｅ、６４Ｅ／２５５Ｐ、６４Ｓ、６９Ｉ、１６１Ｖ、１９３Ｉ、２５５Ｐ、２５５Ｐ／３１８Ｋ／３７９Ｄ、２５９Ｌ、２６３Ｔ、２６３Ｖ、３１８Ｋ／３３９Ａ／３７９Ｄ、３２４Ｎ、３２４Ｎ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３２４Ｎ／３９５Ｄ、３２４Ｓ／３８９Ｇ／３９４Ｅ、３２４Ｓ／３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ、３２４Ｓ／３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９７Ａ、３２４Ｓ／３９４Ｅ、３２４Ｓ／３９４Ｅ／３９５Ｋ、３２４Ｓ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３２４Ｓ／３９５Ｋ、３３９Ａ、３４０Ｔ、３４０Ｖ、３８０Ｅ、３８２Ｓ、３８９Ｇ、３８９Ｇ／３９４Ｅ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ／３９７Ａ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｋ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９７Ａ、３８９Ｇ／３９５Ｄ、３８９Ｇ／３９５Ｋ、３８９Ｇ／３９７Ａ、３９０＊、３９０Ａ、３９０Ｅ、３９０Ｓ、３９４Ｅ、３９４Ｅ／３９５Ｄ、３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３９５Ｄ／３９７Ａ、３９５Ｋ、３９７Ａ、４０１＊、４０１Ｙ、および４０５Ｈから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２３４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｇ２Ｅ、Ｎ３Ｍ、Ｆ３３Ｌ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｈ２５５Ｐ、Ｌ４８Ｆ／Ｈ２５５Ｐ／Ｑ３３９Ａ、Ｌ４８Ｆ／Ｈ２５５Ｐ／Ｋ３７９Ｄ、Ａ６４Ｅ、Ａ６４Ｅ／Ｈ２５５Ｐ、Ａ６４Ｓ、Ｖ６９Ｉ、Ｔ１６１Ｖ、Ｍ１９３Ｉ、Ｈ２５５Ｐ、Ｈ２５５Ｐ／Ｒ３１８Ｋ／Ｋ３７９Ｄ、Ｒ２５９Ｌ、Ｓ２６３Ｔ、Ｓ２６３Ｖ、Ｒ３１８Ｋ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３７９Ｄ、Ｍ３２４Ｎ、Ｍ３２４Ｎ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｍ３２４Ｎ／Ｒ３９５Ｄ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｔ３９７Ａ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３９４Ｅ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｍ３２４Ｓ／Ｒ３９５Ｋ、Ｑ３３９Ａ、Ｓ３４０Ｔ、Ｓ３４０Ｖ、Ａ３８０Ｅ、Ａ３８２Ｓ、Ｋ３８９Ｇ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｔ３９７Ａ、Ｋ３８９Ｇ／Ｒ３９５Ｄ、Ｋ３８９Ｇ／Ｒ３９５Ｋ、Ｋ３８９Ｇ／Ｔ３９７Ａ、Ｐ３９０＊、Ｐ３９０Ａ、Ｐ３９０Ｅ、Ｐ３９０Ｓ、Ｋ３９４Ｅ、Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ、Ｒ３９５Ｋ、Ｔ３９７Ａ、Ａ４０１＊、Ａ４０１Ｙ、およびＴ４０５Ｈから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２３４を参照して番号付けられている。
一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、２／６４／６９／３２４／３８０／３８２／３８８／３８９、３／６４／６９／２６３／３３９／３８０／３８８、３／６４／６９／３８９、３／６４／６９／３９０、３／６４／３７９／３８０／３９０、３／６９／２６３／３８０、３／６９／３２４、３／６９／３２４／３８０／３８２／３８９／３９０、１２／１３５／２５９／２６３、１２／１３５／２６３／３８２、１２／２５９／２６３／３０４、４８／６４／２５５、６４／６９、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、６４／６９／２２３／３８８、６４／６９／２２３／３８８／３８９／３９０、６４／６９／３０４／３７９／３８２、６４／６９／３２４、６４／６９／３２４／３３９／３８０／３８９／３９０、６４／６９／３３９、６４／６９／３３９／３８２／３８８／３８９、６４／６９／３３９／３８９／３９０、６４／６９／３７９／３８０、６４／６９／３８０／３８８／３９０、６４／６９／３８９、６４／６９／３９０、６４／２５５／２６３、６４／２６３、６４／３２４／３３９／３８９／３９０、６９／２２３／２６３／３２４／３８２／３８８／３９０、６９／２２３／３２４／３７９／３８０／３８２／３８８／３９０、６９／２６３、６９／２６３／３２４、６９／２６３／３３９、６９／２６３／３８８、６９／２６３／３８９／３９０、６９／３２４／３７９／３８０／３８８、６９／３２４／３８０、６９／３３９／３９０、６９／３８２／３９０、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、２６３／３３９／３８９／３９０、２６３／３９０、および３０４／３４０／３７９／３８０／３８２から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２８４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、２Ｅ／６４Ｓ／６９Ｉ／３２４Ｓ／３８０Ｅ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３８９Ｇ、３Ｍ／６４Ｓ／６９Ｉ／２６３Ｔ／３３９Ａ／３８０Ｅ／３８８Ａ、３Ｍ／６４Ｓ／６９Ｉ／３８９Ｇ、３Ｍ／６４Ｓ／６９Ｉ／３９０＊、３Ｍ／６４Ｓ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３９０＊、３Ｍ／６９Ｉ／２６３Ｔ／３８０Ｅ、３Ｍ／６９Ｉ／３２４Ｓ、３Ｍ／６９Ｉ／３２４Ｓ／３８０Ｅ／３８２Ｓ／３８９Ｇ／３９０＊、１２Ｇ／１３５Ｖ／２５９Ｋ／２６３Ｔ、１２Ｇ／１３５Ｖ／２６３Ｔ／３８２Ｇ、１２Ｇ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、４８Ｌ／６４Ａ／２５５Ｈ、６４Ａ／２５５Ｈ／２６３Ｔ、６４Ｓ／６９Ｉ、６４Ｓ／６９Ｉ／１８９Ａ／２５９Ｑ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３３９Ａ／３４０Ｔ／３７９Ｎ、６４Ｓ／６９Ｉ／１８９Ｄ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、６４Ｓ／６９Ｉ／２２３Ｍ／３８８Ａ、６４Ｓ／６９Ｉ／２２３Ｍ／３８８Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３０４Ｒ／３７９Ｅ／３８２Ｇ、６４Ｓ／６９Ｉ／３２４Ｓ、６４Ｓ／６９Ｉ／３２４Ｓ／３３９Ａ／３８０Ｅ／３８９Ｇ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３３９Ａ、６４Ｓ／６９Ｉ／３３９Ａ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３８９Ｇ、６４Ｓ／６９Ｉ／３３９Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３７９Ｄ／３８０Ｅ、６４Ｓ／６９Ｉ／３８０Ｅ／３８８Ａ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３８９Ｇ、６４Ｓ／６９Ｉ／３９０＊、６４Ｓ／２６３Ｔ、６４Ｓ／３２４Ｓ／３３９Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、６９Ｉ／２２３Ｍ／２６３Ｔ／３２４Ｓ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３９０＊、６９Ｉ／２２３Ｍ／３２４Ｓ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３９０＊、６９Ｉ／２６３Ｔ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３２４Ｓ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３３９Ａ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３８８Ａ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３８９Ｇ／３９０＊、６９Ｉ／３２４Ｓ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３８８Ａ、６９Ｉ／３２４Ｓ／３８０Ｅ、６９Ｉ／３３９Ａ／３９０＊、６９Ｉ／３８２Ｓ／３９０＊、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３３９Ａ／３４０Ｔ／３７９Ｎ、２６３Ｔ／３３９Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、２６３Ｔ／３９０＊、および３０４Ｒ／３４０Ｔ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３８２Ｇから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２８４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｇ２Ｅ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｋ３８９Ｇ、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８０Ｅ／Ｑ３８８Ａ、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｋ３８９Ｇ、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｐ３９０＊、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ｐ３９０＊、Ｎ３Ｍ／Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３８０Ｅ、Ｎ３Ｍ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｓ１２Ｇ／Ｌ１３５Ｖ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ、Ｓ１２Ｇ／Ｌ１３５Ｖ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３８２Ｇ、Ｓ１２Ｇ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｆ４８Ｌ／Ｅ６４Ａ／Ｐ２５５Ｈ、Ｅ６４Ａ／Ｐ２５５Ｈ／Ｓ２６３Ｔ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｔ１８９Ａ／Ｒ２５９Ｑ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｑ３３９Ａ／Ｓ３４０Ｔ／Ｋ３７９Ｎ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｔ１８９Ｄ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｑ３８８Ａ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｑ３８８Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ３０４Ｒ／Ｋ３７９Ｅ／Ａ３８２Ｇ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８０Ｅ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｋ３８９Ｇ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ３８０Ｅ／Ｑ３８８Ａ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｋ３８９Ｇ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｓ２６３Ｔ、Ｅ６４Ｓ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｍ３２４Ｓ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３３９Ａ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３８８Ａ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ｑ３８８Ａ、Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８０Ｅ、Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ａ３８２Ｓ／Ｐ３９０＊、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｑ３３９Ａ／Ｓ３４０Ｔ／Ｋ３７９Ｎ、Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｓ２６３Ｔ／Ｐ３９０＊、およびＡ３０４Ｒ／Ｓ３４０Ｔ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｇから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２８４を参照して番号付けられている。
一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、３／１９４／３０４、３／２５９／２６３／３０４、３／２５９／３０４、３／２５９／３０４／３２４／３３９、３／２５９／３０４／３２４／３８２、３／２５９／３０４／３８２、３／２６３／３０４／３２４、３／２６３／３０４／３２４／３３９、３／２６３／３０４／３２４／３８２、３／３０４、３／３０４／３２４、１６、６３、７７、８０、８７／２７０、８７／２７０／３６５、８７／３２８／３６５、９１、９２、１２６、１４０、１５６、１６８／２７０／３２８／３３８、１８１、１９４、２０１、２５６、２５９、２５９／２６３、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３２４、２５９／２６３／３０４／３２４／３８２、２５９／２６３／３０４／３７９、２５９／２６３／３０４／３８２、２５９／３０４、２５９／３０４／３２４、２５９／３０４／３２４／３３９、２５９／３０４／３２４／３３９／３８２、２５９／３０４／３８２、２６２、２６３／３０４、２６３／３０４／３２４、２６３／３０４／３２４／３３９、２６３／３０４／３２４／３８２、２６３／３２４、２７０、２７０／３１９、２７０／３２８／３３８、２７０／３２８／３３８／３６５、３０４、３０４／３２４、３２４、３２８、３５２、３６５、３６６、および３８２から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号４８４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、３Ｍ／１９４Ｌ／３０４Ｒ、３Ｍ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ／３８２Ｓ、３Ｍ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、３Ｍ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、３Ｍ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、３Ｍ／３０４Ｒ、３Ｍ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、１６Ｑ、１６Ｖ、６３Ｃ、７７Ｌ、８０Ｇ、８０Ｋ、８７Ｒ／２７０Ｒ、８７Ｒ／２７０Ｒ／３６５Ｅ、８７Ｒ／３２８Ｎ／３６５Ｅ、９１Ａ、９１Ｑ、９２Ｋ、１２６Ａ、１２６Ｔ、１４０Ｖ、１５６Ａ、１５６Ｓ、１６８Ｋ／２７０Ｒ／３２８Ｎ／３３８Ｓ、１８１Ｋ、１８１Ｒ、１８１Ｖ、１９４Ｃ、１９４Ｌ、２０１Ｄ、２５６Ｗ、２５９Ｋ、２５９Ｋ／２６３Ｔ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３７９Ｄ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３８２Ｓ、２５９Ｋ／３０４Ｒ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ／３８２Ｓ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３８２Ｓ、２６２Ｄ、２６２Ｇ、２６２Ｈ、２６２Ｉ、２６２Ｓ、２６２Ｔ、２６３Ｔ／３０４Ｒ、２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、２６３Ｔ／３２４Ｓ、２７０Ｒ、２７０Ｒ／３１９Ａ、２７０Ｒ／３２８Ｎ／３３８Ｓ、２７０Ｒ／３２８Ｎ／３３８Ｓ／３６５Ｅ、３０４Ｒ、３０４Ｒ／３２４Ｓ、３２４Ｓ、３２８Ｎ、３５２Ａ、３６５Ｅ、３６６Ａ、３６６Ｌ、３６６Ｍ、３６６Ｑ、３６６Ｔ、３６６Ｖ、および３８２Ｓから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号４８４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｎ３Ｍ／Ｆ１９４Ｌ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ａ３８２Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｎ３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ、Ｒ１６Ｖ、Ａ６３Ｃ、Ｅ７７Ｌ、Ａ８０Ｇ、Ａ８０Ｋ、Ｈ８７Ｒ／Ｌ２７０Ｒ、Ｈ８７Ｒ／Ｌ２７０Ｒ／Ｑ３６５Ｅ、Ｈ８７Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｑ３６５Ｅ、Ｅ９１Ａ、Ｅ９１Ｑ、Ｅ９２Ｋ、Ｄ１２６Ａ、Ｄ１２６Ｔ、Ｍ１４０Ｖ、Ｇ１５６Ａ、Ｇ１５６Ｓ、Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｐ３３８Ｓ、Ｔ１８１Ｋ、Ｔ１８１Ｒ、Ｔ１８１Ｖ、Ｆ１９４Ｃ、Ｆ１９４Ｌ、Ｅ２０１Ｄ、Ｙ２５６Ｗ、Ｒ２５９Ｋ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｋ３７９Ｄ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２６２Ｄ、Ｒ２６２Ｇ、Ｒ２６２Ｈ、Ｒ２６２Ｉ、Ｒ２６２Ｓ、Ｒ２６２Ｔ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｓ２６３Ｔ／Ｍ３２４Ｓ、Ｌ２７０Ｒ、Ｌ２７０Ｒ／Ｉ３１９Ａ、Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｐ３３８Ｓ、Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｐ３３８Ｓ／Ｑ３６５Ｅ、Ａ３０４Ｒ、Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｍ３２４Ｓ、Ｃ３２８Ｎ、Ｄ３５２Ａ、Ｑ３６５Ｅ、Ｈ３６６Ａ、Ｈ３６６Ｌ、Ｈ３６６Ｍ、Ｈ３６６Ｑ、Ｈ３６６Ｔ、Ｈ３６６Ｖ、およびＡ３８２Ｓから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号４８４を参照して番号付けられている。
一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、１６／６３／８０／１２６／１６８／３６６、１６／６３／８０／１２６／１８１／１９４／２５９／３２４／３２８／３６６、１６／６３／１２６／１６８／２７０／３２８／３６６、１６／８０／１２６／３２４／３６６、１６／８０／１２６／３６６、１６／８０／１６８、１６／８０／１６８／２７０／３６６、１６／８０／１６８／３２４、１６／８０／１６８／３６６、１６／８０／３２４、１６／９１／１２６／１６８／３２４／３６６、１６／１２６／１６８／３６６、１６／１６８／２５９／３６６、１６／１６８／２７０／３２４／３６６、１６／１６８／３２４／３２８／３６６、１６／１６８／３２４／３６６、１６／１６８／３６６、１６／２５９／２６３／３２８、１６／３２４／３２８／３６６、１６／３２８／３６６、８０／１２６／１６８／２７０／３６６、８０／１２６／１６８／３６６、８０／１２６／１８１／２７０／３２４／３６６、８０／１６８／２７０／３６６、および１６８／３６６から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号５９４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、１６Ｑ／６３Ｃ／８０Ｋ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／６３Ｃ／８０Ｋ／１２６Ｔ／１８１Ｒ／１９４Ｃ／２５９Ｋ／３２４Ｓ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／６３Ｃ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１２６Ｔ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１２６Ｔ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ／３２４Ｓ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／３２４Ｓ、１６Ｑ／９１Ａ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／２５９Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／３２４Ｓ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３２８Ｎ、１６Ｑ／３２４Ｓ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１２６Ｔ／１８１Ｒ／２７０Ｒ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３６６Ｍ、および１６８Ｋ／３６６Ｍから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号５９４を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｒ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｔ１８１Ｒ／Ｆ１９４Ｃ／Ｒ２５９Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ／Ｅ９１Ａ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｒ２５９Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ｃ３２８Ｎ、Ｒ１６Ｑ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｔ１８１Ｒ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、およびＣ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号５９４を参照して番号付けられている。
一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、６６／７６／１１８／１４１／２０１／３００、６６／７６／１９８／２００／２９６／３０３、６６／７６／１９８／２００／３００、６６／１１８／２００／２９６／３０３／３１７、６６／１１８／２９６、６６／１１８／２９６／３００、６６／２００、７６／１１８／１４１／２００／２９６、７６／１４１／１９８／２００／２０１／３００、８０／２０１／２７０、８０／２７０、８０／２７０／３２４、８９／１１８／２００、１０６／２７０／３２４／３５２、１１８／１４１／２００、１２６、１２６／２０１／２７０／３２４、１２６／２７０、１４１／１４４／１９８／２００／３００、１５６／２７０、１５６／２７０／３２４、２０１／２７０、２０１／２７０／３５２、２７０、および２７０／３２４から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８６を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、６６Ｎ／７６Ｖ／１１８Ｄ／１４１Ｐ／２０１Ｒ／３００Ｋ、６６Ｎ／７６Ｖ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２９６Ｅ／３０３Ｑ、６６Ｎ／７６Ｖ／１９８Ｇ／２００Ｓ／３００Ｋ、６６Ｎ／１１８Ｄ／２００Ｓ／２９６Ｅ／３０３Ｑ／３１７Ｑ、６６Ｎ／１１８Ｄ／２９６Ｅ、６６Ｎ／１１８Ｄ／２９６Ｅ／３００Ｋ、６６Ｎ／２００Ｓ、７６Ｖ／１１８Ｄ／１４１Ｐ／２００Ｓ／２９６Ｅ、７６Ｖ／１４１Ｐ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２０１Ｒ／３００Ｋ、８０Ｋ／２０１Ｄ／２７０Ｒ、８０Ｋ／２７０Ｒ、８０Ｋ／２７０Ｒ／３２４Ｓ、８９Ｐ／１１８Ｄ／２００Ｓ、１０６Ｍ／２７０Ｒ／３２４Ｓ／３５２Ａ、１１８Ｄ／１４１Ｐ／２００Ｓ、１２６Ｔ、１２６Ｔ／２０１Ｄ／２７０Ｒ／３２４Ｓ、１２６Ｔ／２７０Ｒ、１４１Ｐ／１４４Ｖ／１９８Ｇ／２００Ｓ／３００Ｋ、１５６Ａ／２７０Ｒ、１５６Ａ／２７０Ｒ／３２４Ｓ、２０１Ｄ／２７０Ｒ、２０１Ｄ／２７０Ｒ／３５２Ａ、２７０Ｒ、および２７０Ｒ／３２４Ｓから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８６を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｓ６６Ｎ／Ｒ７６Ｖ／Ｔ１１８Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｅ２０１Ｒ／Ｒ３００Ｋ、Ｓ６６Ｎ／Ｒ７６Ｖ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｄ２９６Ｅ／Ａ３０３Ｑ、Ｓ６６Ｎ／Ｒ７６Ｖ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｒ３００Ｋ、Ｓ６６Ｎ／Ｔ１１８Ｄ／Ｈ２００Ｓ／Ｄ２９６Ｅ／Ａ３０３Ｑ／Ｋ３１７Ｑ、Ｓ６６Ｎ／Ｔ１１８Ｄ／Ｄ２９６Ｅ、Ｓ６６Ｎ／Ｔ１１８Ｄ／Ｄ２９６Ｅ／Ｒ３００Ｋ、Ｓ６６Ｎ／Ｈ２００Ｓ、Ｒ７６Ｖ／Ｔ１１８Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｈ２００Ｓ／Ｄ２９６Ｅ、Ｒ７６Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｅ２０１Ｒ／Ｒ３００Ｋ、Ａ８０Ｋ／Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ、Ａ８０Ｋ／Ｌ２７０Ｒ、Ａ８０Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ａ８９Ｐ／Ｔ１１８Ｄ／Ｈ２００Ｓ、Ｌ１０６Ｍ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｄ３５２Ａ、Ｔ１１８Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｈ２００Ｓ、Ｄ１２６Ｔ、Ｄ１２６Ｔ／Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｄ１２６Ｔ／Ｌ２７０Ｒ、Ｒ１４１Ｐ／Ｍ１４４Ｖ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｒ３００Ｋ、Ｇ１５６Ａ／Ｌ２７０Ｒ、Ｇ１５６Ａ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ、Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ／Ｄ３５２Ａ、Ｌ２７０Ｒ、およびＬ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８６を参照して番号付けられている。
一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、１９、１０９、１２３、１３４、１７０、１７３、１８７、２１１、および３１２から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８６を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、１９Ｉ、１０９Ｇ、１２３Ｆ、１２３Ｍ、１２３Ｖ、１３４Ａ、１３４Ｓ、１７０Ａ、１７３Ａ、１７３Ｉ、１７３Ｔ、１８７Ｌ、２１１Ｓ、および３１２Ａから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８６を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｌ１９Ｉ、Ｌ１０９Ｇ、Ｙ１２３Ｆ、Ｙ１２３Ｍ、Ｙ１２３Ｖ、Ｎ１３４Ａ、Ｎ１３４Ｓ、Ｐ１７０Ａ、Ｆ１７３Ａ、Ｆ１７３Ｉ、Ｆ１７３Ｔ、Ｖ１８７Ｌ、Ａ２１１Ｓ、およびＴ３１２Ａから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８６を参照して番号付けられている。
一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２００／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２１１、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１７０／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１９８／２００／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１７０／１７３／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／２１１／２７０／３１２、１０９／１７０／２１１／２７０／３１２、および１０９／２１１／２７０／３１２から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８８を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｆ／１７０Ａ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｆ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｖ／１４１Ｐ／１７０Ａ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｖ／１４１Ｐ／１７０Ａ／１９８Ｇ／２１１Ｓ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｖ／１４１Ｐ／１７０Ａ／１９８Ｇ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１７０Ａ／１７３Ｉ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１０９Ｇ／１７０Ａ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、および１０９Ｇ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８８を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｆ／Ｐ１７０Ａ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｆ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ｐ１７０Ａ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ｐ１７０Ａ／Ａ１９８Ｇ／Ａ２１１Ｓ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ｐ１７０Ａ／Ａ１９８Ｇ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｐ１７０Ａ／Ｆ１７３Ｉ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１０９Ｇ／Ｐ１７０Ａ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、およびＬ１０９Ｇ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６８８を参照して番号付けられている。
一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、５／４１、５／４１／２２８、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１２６、２６５、２６７、２７０、３３１、３５３、３５７、および３８４から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号７６６を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、５Ｖ／４１Ｄ、５Ｖ／４１Ｄ／２２８Ｄ、３３Ｌ、４１Ｄ、４７Ｆ、５１Ｅ、５１Ｑ、５５Ｉ、６４Ｎ、１２６Ａ、１２６Ｔ、２６５Ｐ、２６７Ｌ、２７０Ａ、２７０Ｔ、３３１Ｖ、３５３Ｅ、３５３Ｉ、３５３Ｌ、３５７Ｓ、および３８４Ｗから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号７６６を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｔ２２８Ｄ、Ｆ３３Ｌ、Ｈ４１Ｄ、Ｌ４７Ｆ、Ｌ５１Ｅ、Ｌ５１Ｑ、Ｖ５５Ｉ、Ｓ６４Ｎ、Ｄ１２６Ａ、Ｄ１２６Ｔ、Ｅ２６５Ｐ、Ｉ２６７Ｌ、Ｒ２７０Ａ、Ｒ２７０Ｔ、Ｔ３３１Ｖ、Ｄ３５３Ｅ、Ｄ３５３Ｉ、Ｄ３５３Ｌ、Ｃ３５７Ｓ、およびＰ３８４Ｗから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号７６６を参照して番号付けられている。
一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、６６、６６／１１８、６６／１１８／２９６、６６／１１８／２９６／３００、６６／１１８／３００、６６／２９６、６６／２９６／３００、６６／３００、１１８、１１８／２９６、１１８／２９６／３００、１１８／３００、２９６、２９６／３００、および３００から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号７６６を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、６６Ｓ、６６Ｓ／１１８Ｔ、６６Ｓ／１１８Ｔ／２９６Ｄ、６６Ｓ／１１８Ｔ／２９６Ｄ／３００Ｒ、６６Ｓ／１１８Ｔ／３００Ｒ、６６Ｓ／２９６Ｄ、６６Ｓ／２９６Ｄ／３００Ｒ、６６Ｓ／３００Ｒ、１１８Ｔ、１１８Ｔ／２９６Ｄ、１１８Ｔ／２９６Ｄ／３００Ｒ、１１８Ｔ／３００Ｒ、２９６Ｄ、２９６Ｄ／３００Ｒ、および３００Ｒから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号７６６を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、Ｎ６６Ｓ、Ｎ６６Ｓ／Ｄ１１８Ｔ、Ｎ６６Ｓ／Ｄ１１８Ｔ／Ｅ２９６Ｄ、Ｎ６６Ｓ／Ｄ１１８Ｔ／Ｅ２９６Ｄ／Ｋ３００Ｒ、Ｎ６６Ｓ／Ｄ１１８Ｔ／Ｋ３００Ｒ、Ｎ６６Ｓ／Ｅ２９６Ｄ、Ｎ６６Ｓ／Ｅ２９６Ｄ／Ｋ３００Ｒ、Ｎ６６Ｓ／Ｋ３００Ｒ、Ｄ１１８Ｔ、Ｄ１１８Ｔ／Ｅ２９６Ｄ、Ｄ１１８Ｔ／Ｅ２９６Ｄ／Ｋ３００Ｒ、Ｄ１１８Ｔ／Ｋ３００Ｒ、Ｅ２９６Ｄ、Ｅ２９６Ｄ／Ｋ３００Ｒ、およびＫ３００Ｒから選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号７６６を参照して番号付けられている。
一部の追加の実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいはその機能的断片を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいはその機能的断片を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、および／または１１－２のいずれかに提供されるバリアントロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドである。一部のさらなる実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ細菌種のバリアント酵素である。一部の実施形態では、ロイシンデカルボキシラーゼは、野生型Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ細菌種のロイシンデカルボキシラーゼと比較して、少なくとも１つの改善された性質を示す。一部の実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、野生型Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ種のロイシンデカルボキシラーゼよりもロイシンに対してより高い活性を示す。さらに一部の追加の実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、野生型Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ細菌種のロイシンデカルボキシラーゼよりも高い熱安定性である。さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、野生型Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ細菌種のロイシンデカルボキシラーゼよりもタンパク質分解に対してより高い抵抗性である。一部の追加の実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、野生型Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ細菌種のロイシンデカルボキシラーゼよりも免疫原性が低い。なお一部の追加の実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、野生型Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ細菌種のロイシンデカルボキシラーゼよりも高い血清安定性である。一部の実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号１６～８５２の偶数の配列のいずれかに対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高く同一の配列を含む。一部の実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号１６～８５２の偶数の配列のいずれかに対して、少なくとも９０％同一の配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、配列番号１６～８５２の偶数の配列のいずれかを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドは、精製されている。本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを含む組成物も提供する。本発明は、本明細書に提供される１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを含む組成物も提供する。
本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、本明細書に提供される操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１５～８５１の奇数の配列のいずれかに対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高く同一の配列を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１５～８５１の奇数の配列のいずれかに対して、少なくとも９０％またはそれよりも高く同一の配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１５～８５１の奇数の配列のいずれかを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。一部の実施形態では、発現ベクターは、少なくとも１つの制御配列をさらに含む。一部の実施形態では、制御配列は、プロモーターを含む。一部のさらなる実施形態では、プロモーターは、異種プロモーターである。
本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞、および／または本明細書に提供される発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列で形質転換されている。一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列で形質転換されている。一部の追加の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む。一部のさらなる実施形態では、宿主細胞は、本明細書に提供される発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
本発明は、宿主細胞において操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを産生する方法であって、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／または本明細書に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および／または本明細書に提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドが産生するような適切な培養条件下で培養するステップを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、宿主細胞において操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを産生する方法は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドが産生するような適切な培養条件下で培養するステップを含む。一部の追加の実施形態では、宿主細胞において操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを産生する方法は、本明細書に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドが産生するような適切な培養条件下で培養するステップを含む。一部の実施形態では、宿主細胞において操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを産生する方法は、本明細書に提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドが産生するような適切な培養条件下で培養するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを培養物および／または宿主細胞から回収するステップをさらに含む。一部の追加の実施形態では、方法は、前記少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを精製するステップをさらに含む。
本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、医薬組成物である。一部の追加の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または担体をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、メープルシロップ尿症の処置のために適切である。一部の追加の実施形態では、組成物は、遺伝子療法における使用のために適切である。なお一部のさらなる実施形態では、組成物は、メープルシロップ尿症、ならびに／またはイソロイシン、ロイシン、アロイソロイシンおよび／もしくはバリンの血中レベルの上昇を処置する遺伝子療法における使用のために適切である。一部の追加の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡ療法における使用のために適切である。さらに一部の追加の実施形態では、組成物は、ヒトへの経口投与のために適切である。一部の実施形態では、組成物は、丸剤、錠剤、カプセル剤、ジェルキャップ、液剤または乳剤の形態である。一部のさらなる実施形態では、丸剤、錠剤、カプセル剤、またはジェルキャップは、腸溶コーティングをさらに含む。さらに一部の追加の実施形態では、組成物は、動物への非経口注射のために適切である。さらに一部の追加の実施形態では、組成物は、ヒトへの非経口注射のために適切である。一部の実施形態では、注射は、毎日、毎週、または毎月の基準で投与される。一部の追加の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの追加の治療的に有効な化合物とともに共投与される。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの追加の治療的に有効な化合物を含む。
本発明は、対象におけるメープルシロップ尿症の症状を処置および／または予防するための方法であって、メープルシロップ尿症を有する対象を提供するステップ、ならびに本明細書に提供される組成物を前記対象に提供するステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、メープルシロップ尿症の症状は、回復する。一部の追加の実施形態では、対象は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの組成物が提供されていない対象によって必要とされる飲食物よりも、イソロイシン、ロイシンおよび／またはバリン含有量が少なく制限されている飲食物を食べることが可能である。一部の実施形態では、対象は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを含む少なくとも１つの組成物が提供されていない対象によって必要とされる飲食物よりも、イソロイシン、ロイシンおよび／またはバリン含有量が少なく制限されている飲食物を食べることが可能である。
一部の実施形態では、対象は、乳児、小児、若年成人または成人である。一部の実施形態では、対象は、乳児である。一部の実施形態では、対象は、小児である。
一部の実施形態では、対象は、若年成人である。一部の実施形態では、対象は、成人である。本発明は、本明細書に提供される組成物の使用も提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に提供される操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に提供される操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に提供される少なくとも２つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをコードする少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に提供される少なくとも２つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に提供される操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
発明の説明
本発明は、操作されたロイシンデカルボキシラーゼ（ＬＤＣ）ポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたロイシンデカルボキシラーゼ（ＬＤＣ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、触媒活性の増強、ならびにタンパク質分解に対する感受性の低減および／または低ｐＨ環境に対する耐性の増加を提供するように最適化される。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、貯蔵安定性の改善を提供するように最適化される。本発明は、治療目的および工業目的のための操作されたＬＤＣポリペプチドを含む組成物の使用のための方法も提供する。本発明は、操作されたＬＤＣポリペプチド、その突然変異体、生物学的に活性な断片およびアナログ、ならびにそれを含む医薬組成物および工業用組成物を提供する。
略語および定義：
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに下記に記載される細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験手順は、周知のものであり、当技術分野で一般に用いられている。そのような技法は周知であり、当業者に周知の多数のテキストおよび参考文献に記載されている。標準的な技法、またはその変形が、化学合成および化学分析のために使用される。上記および下記の両方で、本明細書で言及されるすべての特許、特許出願、論文および刊行物は、これにより参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の適切な方法および材料は、本発明の実施において使用されるが、一部の方法および材料は、本明細書に記載される。それらは当業者によって使用される文脈に応じて変わり得るので、本発明は、記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されないことが理解されるべきである。したがって、直下に定義される用語は、本出願を全体として参照することにより、より完全に記載される。上記および下記の両方で、本明細書で言及されるすべての特許、特許出願、論文および刊行物は、これにより参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
また、本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
数値範囲は、範囲を定義する数を含む。そのため、本明細書に開示されるすべての数値範囲は、そのようなより狭い数値範囲が本明細書にすべて明示的に書かれているかのように、そのようなより広い数値範囲内にあるすべてのより狭い数値範囲を包含することが意図される。本明細書に開示されるすべての最大（または最小）の数値限定は、そのようなより低い（またはより高い）数値限定が本明細書に明示的に書かれているかのように、すべてのより低い（またはより高い）数値限定を含むことも意図される。
「約」という用語は、特定の値に対する許容誤差を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％、または２．０％以内を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値の１、２、３、または４標準偏差以内を意味する。
さらにまた、本明細書に提供される見出しは、本発明のさまざまな態様または実施形態の限定ではなく、これは、本出願を全体として参照することによって行われ得る。したがって、直下に定義される用語は、本出願を全体として参照することにより、より完全に定義される。それにもかかわらず、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語が下記に定義される。
他に指示されない限り、それぞれ、核酸は、５’から３’の方向に左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向に左から右に書かれる。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびその同語源語は、それらの包含的意味で使用される（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語およびその対応する同語源語と同等）。
「ＥＣ」番号は、国際生化学分子生物学連合の命名委員会（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、酵素が触媒する化学反応に基づく酵素についての数値分類体系である。
「ＡＴＣＣ」は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関を指し、そのバイオレポジトリーコレクションは、遺伝子および株を含む。
「ＮＣＢＩ」は、国立生物工学情報センター、およびそこで提供される配列データベースを指す。
本明細書で使用される場合、「ロイシンデカルボキシラーゼ（ＬＤＬ）ポリペプチド」という用語は、バリンデカルボキシラーゼ酵素のクラスのメンバーを指す（ＥＣ４．１．１．１４）。これらの酵素は、ピリドキサール（pyridoxial）５’－リン酸（ＰＬＰ）補助因子を使用して、バリンおよびロイシンなどのアミノ酸から脱カルボキシル化し、二酸化炭素を放出する間に、それぞれ、２－メチルプロパンアミンおよびイソペンチルアミンをもたらす。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを表すために本明細書で互換的に使用される。
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかである少なくとも２つのヌクレオチドを含むポリマーを表すために本明細書で使用される。
「アミノ酸」は、それらの一般に公知の３文字記号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字記号のいずれかによって、本明細書で言及される。同様に、ヌクレオチドは、示されるように、それらの一般に許容されている一文字コードによって言及され得る。遺伝的にコードされるアミノ酸のために使用される略語は、従来のものであり、以下の通りである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。
細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、「操作された」、「組換え」、「天然に存在しない」、および「バリアント」という用語は、そうでなければ天然には存在しないであろう様式で改変されているか、あるいはこれらと同一であるが、合成材料からおよび／もしくは組換え技法を使用する操作によって生成されるか、またはそれに由来する、材料、または材料の天然もしくはネイティブ形態に対応する材料を指す。
本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、天然で見出される形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の供給源から単離することができ、ヒトの操作によって意図的に改変されていない、生物体中に存在する配列である。
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。
「配列同一性パーセント（％）」という用語は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの間の比較を指すために本明細書で使用され、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列のための参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中で生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウ中の位置の合計数で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算されてもよい。あるいは、パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で生じるか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとともに整列される位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウ中の位置の合計数で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算されてもよい。当業者は、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。比較のための最適な配列の整列は、例えば、Smith and Waterman （Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]）の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970])の相同性整列アルゴリズムによって、Pearson and Lipman (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988])の類似性についての検索の方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター実装（例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または当技術分野で公知の目視検査によって、実施することができる。配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの例としては、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズム（例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990]；およびAltschul et al., Nucleic Acids Res., 3389-3402 [1977]を参照されたい）が挙げられる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトを通じて公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に一致するか、またはある正の値の閾値スコア「Ｔ」を満たす、クエリー配列中の長さ「Ｗ」の短いワードを同定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と称される（Altschul et al.、上記を参照されたい）。これらの初期の近傍ワードヒットは、これらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、ワードヒットは、累積整列スコアが増加することができる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーター「Ｍ」（一対の一致する残基に対する報酬スコア；常に＞０）および「Ｎ」（一致しない残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列について、スコアリング行列を使用して、累積スコアが計算される。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積整列スコアが、その最大到達値から量「Ｘ」だけ低下する場合；１つもしくは複数のマイナススコアの残基の整列の蓄積に起因して、累積スコアがゼロもしくはそれより下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長（Ｗ）１１、予想（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長（Ｗ）３、予想（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列をデフォルトとして使用する（例えば、Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989]を参照されたい）。配列の整列および配列同一性％の例示的な決定は、提供されるデフォルトパラメーターを使用して、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）におけるＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。
「参照配列」は、配列の比較のための基準として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、全長の遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであってもよい。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長もしくはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、少なくとも１００残基長、または全長の核酸もしくはポリペプチドである。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、（１）２つの配列間で類似する配列（すなわち、完全配列の一部）を含んでいてもよく、（２）２つの配列間で相違する配列をさらに含んでいてもよいので、２つの（またはそれよりも多くの）ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって行われる。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくことができ、ここで、参照配列は、一次配列における１つまたは複数の変化を有し得る配列である。例えば、「Ｘ１２３に対応する残基にバリンを有する配列番号６８６に基づく参照配列」という語句は、配列番号６８６中のＸ１２３位の対応する残基（例えば、チロシン）が、バリンに変更されている参照配列を指す。
「比較ウィンドウ」は、配列が、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較されてもよく、および比較ウィンドウ中の配列の部分が、２つの配列の最適な整列について、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい、少なくとも約２０個の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指す。比較ウィンドウは、２０個の連続する残基より長くあり得、必要に応じて、３０、４０、５０、１００個、またはそれよりも長いウィンドウを含む。
「に対応する」、「を参照して」、および「と比べて」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合に特定された参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値位置によってよりはむしろ、参照配列に関して指定される。例えば、操作されたＬＤＣのアミノ酸配列などの所与のアミノ酸配列は、ギャップを導入して２つの配列間の残基の一致を最適化することによって、参照配列に対して整列させることができる。これらの場合では、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、それが整列されている参照配列に関して行われる。
「アミノ酸の相違」および「残基の相違」は、参照配列における対応する位置のアミノ酸残基と比べた、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の相違を指す。アミノ酸の相違の位置は、一般に、本明細書では「Ｘｎ」（ここで、ｎは、残基の相違が基づく参照配列における対応する位置を指す）と称される。例えば、「配列番号６８６と比較したＸ１２３位の残基の相違」は、配列番号６８６の１２３位に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の相違を指す。そのため、配列番号６８６の参照ポリペプチドが１２３位にチロシンを有する場合、その結果、「配列番号６８６と比較したＸ１２３位における残基の相違」は、配列番号６８６の１２３位に対応するポリペプチドの位置における、チロシン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書のほとんどの例では、ある位置における特定のアミノ酸残基の相違は「ＸｎＹ」（ここで、「Ｘｎ」は、参照ポリペプチドの対応する残基および位置を特定し（上記に記載の通り）、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドにおいて見出されるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中とは異なる残基）の一文字識別子である）として示される。一部の例では、元のアミノ酸は、示されない（例えば、１０９Ｇ）。一部の例では（例えば、表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、および／または１１－２では）、本開示は、従来の表記「ＡｎＢ」（ここで、Ａは、参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列における残基置換の一文字識別子である）によって表される特定のアミノ酸の相違も提供する。一部の例では、本開示のポリペプチドは、参照配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を含むことができ、これは、参照配列と比べて残基の相違が存在する特定された位置のリストによって示される。一部の実施形態では、２個以上のアミノ酸がポリペプチドの特定の残基位置において使用され得る場合、使用され得るさまざまなアミノ酸残基は、「／」によって分離される（例えば、Ｘ１２３Ｆ／Ｘ１２３Ｍ／Ｘ１２３ＶまたはＸ１２３Ｆ／Ｍ／Ｖまたは１２３Ｆ／Ｍ／Ｖ）。本開示は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換のいずれか／または両方を含む、１つまたは複数のアミノ酸の相違を含む操作されたポリペプチド配列を含む。
「アミノ酸置換セット」および「置換セット」という用語は、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換の群を指す。一部の実施形態では、置換セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれよりも多くのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、置換セットは、実施例における表（例えば、表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、および／または１１－２）のいずれかに列挙されるバリアントＬＤＣポリペプチドのいずれかに存在するアミノ酸置換セットを指す。
「保存的アミノ酸置換」は、残基の、類似する側鎖を有する異なる残基による置換を指し、そのため、典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸の、アミノ酸の同じまたは類似するクラス内のアミノ酸による置換を含む。例として、かつ限定するものではなく、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）で置換されてもよく；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）で置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）で置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）で置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換され；疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ、別の疎水性または親水性アミノ酸で置き換えられる。例示的な保存的置換としては、Ａ、Ｌ、Ｖ、もしくはＩの他の脂肪族残基（例えば、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ）もしくは他の非極性残基（例えば、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｍ）による置換；ＧもしくはＭの他の非極性残基（例えば、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｍ）による置換；ＤもしくはＥの他の酸性残基（例えば、Ｄ、Ｅ）による置換；ＫもしくはＲの他の塩基性残基（例えば、Ｋ、Ｒ）による置換；Ｎ、Ｑ、Ｓ、もしくはＴの他の極性残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ）による置換；Ｈ、Ｙ、Ｗ、もしくはＦの他の芳香族残基（例えば、Ｈ、Ｙ、Ｗ、Ｆ）による置換；またはＣもしくはＰの他の非極性残基（例えば、Ｃ、Ｐ）による置換が挙げられる。
「非保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸の、著しく異なる側鎖の性質を有するアミノ酸による置換を指す。非保存的置換は、定義された群内ではなくむしろ群間のアミノ酸を使用してもよく、（ａ）置換（例えば、グリシンに対するプロリン）の領域におけるペプチド骨格の構造；（ｂ）電荷もしくは疎水性；および／または（ｃ）側鎖のかさ高さに影響を及ぼし得る。例として、かつ限定するものではなく、例示的な非保存的置換としては、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸；小さなアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸が挙げられる。
「欠失」は、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドに対する改変を指す。欠失は、酵素活性を保持しながら、および／または操作されたロイシンデカルボキシラーゼ酵素の改善された性質を保持しながら、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大で１０％まで、またはアミノ酸の総数の最大２０％まで、１個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、２個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、５個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、１０個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、１５個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、または２０個もしくはそれよりも多くのアミノ酸の除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分に対してであり得る。さまざまな実施形態では、欠失は、連続するセグメントを含むことができ、または不連続であり得る。
「挿入」は、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドに対する改変を指す。挿入は、ポリペプチド内部部分において、またはカルボキシもしくはアミノ末端に対してであり得る。挿入は、本明細書で使用される場合、当技術分野において公知の融合タンパク質を含む。挿入は、天然に存在するポリペプチドにおけるアミノ酸の連続するセグメントであり得るか、または１つもしくは複数のアミノ酸によって分離され得る。
「機能的断片」および「生物学的に活性な断片」という用語は、本明細書で互換的に使用され、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失および／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、比較される配列（例えば、本発明の全長の操作されたＬＤＣ）における対応する位置と同一であり、全長ポリペプチドの活性のすべてを実質的に保持するポリペプチドを指す。
「単離されたポリペプチド」は、それに天然に付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から除去または精製されているポリペプチドを包含する。組換えＬＤＣポリペプチドは、細胞内に存在していてもよく、細胞培地中に存在していてもよく、または溶解物もしくは単離された調製物などのさまざまな形態で調製されてもよい。そのため、一部の実施形態では、本明細書で提供される組換えＬＤＣポリペプチドは、単離されたポリペプチドである。
「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、存在する優勢な種である（すなわち、モルまたは重量基準で、それが組成物中の任意の他の個々の高分子種より豊富である）組成物を指し、一般には、目的の種が、モルまたは重量％で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを含む場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なＬＤＣ組成物は、モルまたは重量％で、組成物中に存在するすべての高分子種の約６０％またはそれよりも多く、約７０％またはそれよりも多く、約８０％またはそれよりも多く、約９０％またはそれよりも多く、約９５％またはそれよりも多く、および約９８％またはそれよりも多くを含む。一部の実施形態では、目的の種は、本質的に均質であるように精製され（すなわち、夾雑物種が、従来の検出方法によって組成物中で検出することができない）、ここで、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種と見なされない。一部の実施形態では、単離された組換えＬＤＣポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
「改善された酵素の性質」は、野生型ＬＤＣポリペプチド（例えば、配列番号２を有する野生型ＬＤＣ）または別の操作されたＬＤＣポリペプチドなどの参照ＬＤＣポリペプチドと比較して、任意の酵素の性質の改善を示す操作されたＬＤＣポリペプチドを指す。改善された性質としては、限定されるものではないが、タンパク質産生の増加、血清安定性の増加、ｉｎ ｖｉｖｏでの血清半減期の増加、熱活性の増加、熱安定性の増加、ｐＨ活性の増加、安定性の増加、酵素活性の増加、基質特異性および／または親和性の増加、比活性の増加、基質および／または最終産物阻害に対する抵抗性の増加、化学的安定性の増加、化学選択性の改善、溶媒の安定性の改善、酸性ｐＨに対する耐性の増加、タンパク質分解活性に対する耐性の増加（すなわち、タンパク質分解に対する感受性の低減）、凝集の低減、溶解度の増加、免疫原性の低減（すなわち、免疫応答を誘導および／または誘発する能力の低減）、ならびに温度プロファイルの変更が挙げられる。
「酵素活性の増加」および「酵素活性の増強」は、操作されたＬＤＣポリペプチドの改善された性質を指し、これは、参照ＬＤＣ酵素（例えば、野生型ＬＤＣおよび／または別の操作されたＬＤＣ）と比較した、比活性（例えば、産生される産物／時間／タンパク質の重量）における増加、および／または基質の産物への変換パーセントの増加（例えば、特定量のＬＤＣを使用して特定の時間における出発量の基質の産物への変換パーセント）によって表すことができる。酵素活性を決定する例示的な方法は、実施例に提供される。その変化が酵素活性の増加をもたらし得る、Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素の性質を含む、酵素活性に関する任意の性質が影響を及ぼされ得る。酵素活性の改善は、対応する野生型酵素の約１．１倍の酵素活性から、ＬＤＣポリペプチドが由来した天然に存在するＬＤＣまたは別の操作されたＬＤＣより２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、またはそれよりも高い酵素活性程度までであり得る。
一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、少なくとも０．０１μｍｏｌ／分－ｍｇ、少なくとも０．０２／μｍｏｌ／分－ｍｇ、少なくとも０．０３／μｍｏｌ／分－ｍｇ、少なくとも０．０５／μｍｏｌ／分－ｍｇ、少なくとも１．０／μｍｏｌ／分－ｍｇの比活性、一部の好ましい実施形態では２．０／μｍｏｌ／分－ｍｇより高い比活性を有する。一部の実施形態では、Ｋｍは、約１μｍ～約５ｍＭの範囲；約５μｍ～約２ｍＭの範囲；約１０μｍ～約２ｍＭの範囲；または約１０μｍ～約１ｍＭの範囲である。一部の具体的な実施形態では、操作されたＬＤＣ酵素は、参照ＬＤＣ酵素の酵素活性よりも１．５～１０倍、１．５～２５倍、１．５～５０倍、１．５～１００倍またはそれよりも高い範囲の酵素活性の改善を示す。ＬＤＣ活性は、当技術分野において公知の任意の標準的なアッセイによって（例えば、反応物の枯渇または産物の形成をモニタリングすることによって）測定することができる。一部の実施形態では、産生する産物の量または消費された基質の量は、ＵＶ吸光度または質量スペクトル検出と組み合わされた、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離によって測定される。一部の実施形態では、酵素活性の比較は、本明細書に詳細にさらに記載されるように、酵素の定義された調製、設定条件下の定義されたアッセイ、および１つまたは複数の定義された基質を使用して行われる。一般に、溶解物が比較される場合、宿主細胞によって産生され、溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小化するために、同一の発現系および同一の宿主細胞を使用するだけでなく、アッセイされる細胞の数およびタンパク質の量が決定される。
「貯蔵安定性の増加」という語句は、本発明による操作されたＬＤＣポリペプチドが、乾燥形態で生成され（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥によって）、室温より上の温度（例えば、３０℃、３７℃、４５℃、５５℃など）で数日～数か月の範囲の期間貯蔵された後、標準的なアッセイ（例えば、実施例に記載される通り）において、参照ＬＤＣと比較してより高い活性を保持することを意味する。
「変換」は、基質の対応する産物への酵素的変換（または、生体内変換）を指す。「変換パーセント」は、特定の条件下で一定の期間内に産物に変換される基質のパーセントを指す。そのため、ＬＤＣポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、特定の期間における基質の産物への「変換パーセント」として表すことができる。
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシー条件下で、それに続いて、異なるがより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という用語は、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、約８５％の同一性を有し、標的ポリヌクレオチドに対して約９０％よりも高い同一性を有する相補的な核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、５０％のホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ、４２℃でのハイブリダイゼーション、それに続いて０．２×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ、４２℃での洗浄と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、一般に、定義されたポリヌクレオチド配列についての溶液条件下で決定された熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれ未満である条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８ＭのＮａＣｌ、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが、０．０１８ＭのＮａＣｌ、６５℃で安定でない場合、本明細書で企図されるような高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％のホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ、４２℃と同等の条件でのハイブリダイゼーション、それに続く０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％のＳＤＳ、６５℃での洗浄によって提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）のＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ、６５℃でのハイブリダイジングと同等の条件でのハイブリダイジング、および０．１％のＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ、６５℃での洗浄である。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、および中程度にストリンジェントな条件は、上記で引用される参考文献に記載されている。
「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が特定の生物体においてより効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、その生物体において優先的に使用されるコドンへの変化を指す。ほとんどのアミノ酸が、「同義」または「同義の」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点で、遺伝コードは縮重するが、特定の生物体によるコドン使用頻度はランダムではなく、特定のコドントリプレットに偏っていることは周知である。このコドン使用頻度バイアスは、所与の遺伝子、共通の機能または先祖の遺伝子、高発現タンパク質対低コピー数タンパク質、および生物体のゲノムの凝集したタンパク質コード領域に関して、より高くあり得る。一部の実施形態では、ＬＤＣ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物体からの最適な産生のためにコドン最適化される。「制御配列」は、本明細書では、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現のために必要または有利なすべての構成成分を含むことを指す。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブであってもよく、またはそれに対して外来性であってもよい。そのような制御配列としては、限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列、および転写ターミネーターが挙げられる。最小限でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。一部の実施形態では、制御配列は、制御配列と、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的で、リンカーとともに提供される。
「作動可能に連結された」は、制御配列が、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を指示または調節するように、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対して相対的な位置に適当に置かれる（すなわち、機能的な関係で）立体配置として本明細書で定義される。
「プロモーター配列」は、目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列、例えば、コード配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、突然変異体プロモーター、切断プロモーター、およびハイブリッドプロモーターを含む、最適な宿主細胞における転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかの細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよい。
酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、ＬＤＣポリペプチドによって作用される化合物または分子を指す。酵素変換プロセスの文脈における「産物」は、基質に対するＬＤＣポリペプチドの作用から生じる化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、「培養する」という用語は、任意の適切な培地（例えば、液体、ゲル、または固体）を使用する適切な条件下での微生物細胞の集団の増殖を指す。
組換えポリペプチド（例えば、ＬＤＣ酵素バリアント）は、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して生成することができる。例えば、当業者に周知の多種多様な異なる突然変異誘発技法がある。加えて、突然変異誘発キットも多くの商業的分子生物学サプライヤーから入手可能である。定義されるアミノ酸における特異的置換（部位特異的）、遺伝子の局所領域における特異的もしくはランダム突然変異（領域特異的）、または遺伝子全体にわたるランダム突然変異誘発（例えば、飽和突然変異誘発）を行う方法が利用可能である。多数の適切な方法が、酵素バリアントを発生させるために当業者に公知であり、限定されるものではないが、ＰＣＲを使用する一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、および化学的飽和突然変異誘発、または当技術分野において公知の任意の他の適切な方法を含む。ＤＮＡおよびタンパク質操作のために使用される方法の非限定的な例は、以下の特許：米国特許第６，１１７，６７９号；米国特許第６，４２０，１７５号；米国特許第６，３７６，２４６号；米国特許第６，５８６，１８２号；米国特許第７，７４７，３９１号；米国特許第７，７４７，３９３号；米国特許第７，７８３，４２８号；および米国特許第８，３８３，３４６号に提供されている。バリアントが生成された後、バリアントは、任意の所望の性質（例えば、高活性もしくは活性の増加、または低活性もしくは活性の低減、熱活性の増加、熱安定性の増加、および／または酸性ｐＨ安定性など）についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換えＬＤＣポリペプチド」（本明細書では「操作されたＬＤＣポリペプチド」、「バリアントＬＤＣ酵素」、および「ＬＤＣバリアント」とも称される）が使用される。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドの適切な宿主中での発現をもたらすことができる適切な制御配列に作動可能に連結されている発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞での発現を駆動するためにＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含み、限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾を含む。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など）は、２つの配列が天然には関連しない場合、作動可能に連結される別の配列に対して「異種」である。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」および「宿主株」という用語は、本明細書で提供されるＤＮＡ（例えば、少なくとも１つのＬＤＣバリアントをコードするポリヌクレオチド配列）を含む発現ベクターのための適切な宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ技法を使用して構築されたベクターで形質転換またはトランスフェクトされている原核または真核細胞である。
「アナログ」という用語は、参照ポリペプチドと７０％より高い配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より高い配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、天然に存在しないアミノ酸残基を指し、限定されるものではないが、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリン、ならびに天然に存在するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、アナログは、１個または複数のＤ－アミノ酸残基、および２個またはそれよりも多くアミノ酸残基間の非ペプチド連結も含む。
「治療薬」という用語は、有益なまたは望ましい医学的効果を有する、病態の徴候または症状を示す対象に投与される化合物を指す。
「医薬組成物」という用語は、本発明により包含される薬学的有効量の操作されたＬＤＣポリペプチド、および許容される担体を含む、哺乳動物対象（例えば、ヒト）における薬学的使用のために適切な組成物を指す。
「遺伝子療法」という用語は、哺乳動物対象（例えば、ヒト）において疾患を処置および／または予防するための遺伝子（すなわち、遺伝物質）の使用に関して使用される。一部の実施形態では、遺伝物質は、哺乳動物対象の少なくとも一部の細胞に直接導入される。本発明が、遺伝子療法に有用な任意の特定の方法または組成物に限定されることを意図するものではない。
「ｍＲＮＡ療法」という用語は、哺乳動物対象（例えば、ヒト）において疾患を処置および／または予防するためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の使用に関して使用される。一部の実施形態では、遺伝物質は、哺乳動物対象の少なくとも一部の細胞に直接導入される。本発明が、ｍＲＮＡ療法に有用な任意の特定の方法または組成物に限定されることを意図するものではない。
「有効量」という用語は、所望の結果をもたらすのに十分な量を意味する。当業者は、日常的な実験を使用することによって有効量は何かを決定し得る。
「単離された」および「精製された」という用語は、天然で関連する少なくとも１つの他の構成成分から除去されている、分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチドなど）または他の構成成分を指すために使用される。「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ、相対的な定義として意図される。
「対象」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、コンパニオン動物、および実験動物（例えば、げっ歯類およびウサギ類）などの哺乳動物を包含する。この用語は、雌および雄を包含することが意図される。
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、疾患を評価されている、処置されている、または経験している任意の対象を意味する。
「乳児」という用語は、生後１か月からおよそ１歳までの期間の小児を指す。本明細書で使用される場合、「新生児」という用語は、出生から生後２８日までの期間の小児を指す。「未熟児」という用語は、一般に、出生時に約５００グラム～約２４９９グラムの体重の、妊娠満２０週の後であるが、満期前に生まれた乳児を指す。「超低出生体重児」は、出生の際に１５００ｇ未満の体重の乳児である。
本明細書で使用される場合、「小児」という用語は、処置または研究の手順に対する同意を得るための法定年齢に達していない人を指す。一部の実施形態では、この用語は、出生および青年の期間の間の人を指す。
本明細書で使用される場合、「成人」という用語は、関連する管轄の法定年齢（例えば、米国では１８歳）に達した人を指す。一部の実施形態では、この用語は、任意の完全に成長した成熟した生物体を指す。一部の実施形態では、「若年成人」という用語は、１８歳未満であるが、性的成熟に達した人を指す。
本明細書で使用される場合、「組成物」および「製剤」は、任意の適切な使用（例えば、医薬組成物、食事／栄養サプリメント、飼料など）のために意図される本発明の少なくとも１つの操作されたＬＤＣを含む生成物を包含する。
組成物の「投与」および組成物を「投与すること」という用語は、本発明の組成物を対象（例えば、ＭＳＵＤの影響に苦しんでいる人）に提供することを意味する。
「担体」という用語は、医薬組成物に関して使用される場合、標準的な医薬担体、緩衝液および賦形剤のいずれか、例えば、安定剤、保存剤および補助剤を意味する。
「薬学的に許容される」という用語は、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有する構成成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、対象に投与することができ、かつ所望の生物学的活性を持つ材料を意味する。
本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、医薬品有効成分（ＡＰＩ；例えば、本発明の操作されたＬＤＣポリペプチド）以外の、任意の薬学的に許容される添加剤、担体、希釈剤、補助剤、または他の成分を指す。賦形剤は、典型的には、製剤化および／または投与の目的のために含まれる。
「治療有効量」という用語は、疾患／状態の症状に関して使用される場合、疾患／状態の１つもしくは複数の症状を回復させる、弱める、もしくは排除するか、または症状（例えば、ＭＳＵＤ）の開始を防止する、もしくは遅延させる、化合物（例えば、操作されたＬＤＣポリペプチド）の量および／または濃度を指す。一部の実施形態では、この用語は、研究者、医師、獣医師、または他の臨床医によって求められる、組織、系、または動物対象による生物学的（例えば、医学的）応答を誘発する組成物の量に関して使用される。
「治療有効量」という用語は、疾患／状態に関して使用される場合、疾患／状態を回復する、弱める、または排除する組成物の量および／または濃度を指す。
「処置すること」、「処置する」および「処置」という用語は、予防（例えば、予防的）、および緩和的処置を包含することが意図される。
本明細書で使用される場合、「少なくとも１つ」という用語は、項目の任意の特定の数に本発明を限定することを意図するものではない。所望により、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多くの項目を包含することが意図される。
操作されたＬＤＣポリペプチド：
本発明の操作されたＬＤＣポリペプチドが由来する親ＬＤＣポリペプチドには、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科の細菌におけるものなどの細菌株が含まれる。
さらにまた、特定のＬＤＣバリアント（すなわち、操作されたＬＤＣポリペプチド）が野生型ＬＤＣまたは参照ＬＤＣの配列における特定のアミノ酸残基の改変への参照によって言及される場合、同等の位置（それぞれのアミノ酸配列間の必要に応じたアミノ酸配列整列から決定される通り）において改変された別のＬＤＣのバリアントが、本明細書に包含されることが理解されるべきである。
一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、少なくとも１つの操作されたＬＤＣポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む微生物を、操作されたＬＤＣポリペプチドの産生に貢献する条件下で培養することによって産生される。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、その後、得られた培養培地および／または細胞から回収される。
本発明は、ＬＤＣ活性を有する例示的な操作されたＬＤＣポリペプチドを提供する。実施例は、特定のアミノ酸配列の特徴を操作されたＬＤＣポリペプチドの機能活性と相関させる配列構造情報を示す表（すなわち、表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、および／または１１－２）を提供する。この構造－機能相関情報は、配列番号２の参照の操作されたポリペプチドと比べた特定のアミノ酸残基の相違、および例示的な操作されたＬＤＣポリペプチドについての関連する実験的に決定された活性データの形態で提供される。
一部の実施形態では、ＬＤＣ活性を有する本発明の操作されたＬＤＣポリペプチドは、ａ）参照配列の配列番号２に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）１つまたは複数のアミノ酸位置における、配列番号２と比較したアミノ酸残基の相違を含み、かつｃ）参照配列と比較して、ｉ）触媒活性の増強、ｉｉ）タンパク質分解感受性の低減、ｉｉｉ）凝集の低減、ｉｖ）凍結乾燥調製物としての高温に対する安定性の増加、ｖ）免疫原性の低減、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された性質を示す。
一部の実施形態では、本発明は、操作されたＬＤＣポリペプチドの機能的断片を提供する。一部の実施形態では、機能的断片は、それが由来した操作されたＬＤＣポリペプチド（すなわち、親の操作されたＬＤＣ）の活性の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む。一部の実施形態では、機能的断片は、操作されたＬＤＣの親配列の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む。一部の実施形態では、機能的断片は、５個未満、１０個未満、１５個未満、１０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満、および５０個未満のアミノ酸がトランケートされる。
一部の実施形態では、本発明は、操作されたＬＤＣポリペプチドの機能的断片を提供する。一部の実施形態では、機能的断片は、それが由来した操作されたＬＤＣポリペプチド（すなわち、親の操作されたＬＤＣ）の活性の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。一部の実施形態では、機能的断片は、操作されたＬＤＣの親配列の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。一部の実施形態では、機能的断片は、５個未満、１０個未満、１５個未満、１０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満、５０個未満、５５個未満、６０個未満、６５個未満、または７０個未満のアミノ酸がトランケートされる。
一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／もしくは７６６から選択される参照配列、または任意のバリアントのアミノ酸配列（例えば、実施例に提供されるもの）に対して、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６から選択される。
一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、参照配列の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／もしくは７６６に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６と比較して１つまたは複数の残基の相違を含む。
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞：
本発明は、本明細書に記載される操作されたＬＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作出するために、遺伝子発現を制御する１つまたは複数の異種調節配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物は、対応するＬＤＣポリペプチドを発現するための適当な宿主細胞に導入される。
当業者に明らかであるように、タンパク質配列およびさまざまなアミノ酸に対応するコドンの知識の利用可能性は、対象ポリペプチドをコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの記載を提供する。同じアミノ酸が、代替または同義のコドンによってコードされる遺伝コードの縮重は、そのすべてが操作されたＬＤＣポリペプチドをコードする、極めて多数の核酸が作製されるのを可能にする。そのため、本発明は、可能性があるコドン選択に基づいて組合せを選択することによって、本明細書に記載されるＬＤＣポリペプチドをコードする、作製され得るＬＤＣポリヌクレオチドのありとあらゆる可能性があるバリエーションを生成するための方法および組成物を提供し、すべてのそのようなバリエーションは、実施例において（例えば、表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、および／または１１－２において）提示されるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載される任意のポリペプチドについて具体的に開示されていると見なされるべきである。
一部の実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質産生のために選択された宿主細胞による利用のために最適化される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、典型的には、細菌における発現のために使用される。その結果、操作されたＬＤＣポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％よりも多くに好ましいコドンを含有する。
一部の実施形態では、ＬＤＣポリヌクレオチドは、本明細書に開示される性質を有するＬＤＣ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ここで、ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／もしくは７６６から選択される参照配列、または任意のバリアントのアミノ酸配列（例えば、実施例に提供されるもの）に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、３７、２３３、２８３、４８３、５９３、６８５、６８７、および／もしくは７６５の参照ポリヌクレオチド、または実施例に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多くのアミノ酸残基位置）と比較して１つもしくは複数の残基の相違を含む。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６から選択される。
一部の実施形態では、ＬＤＣポリヌクレオチドは、本明細書に開示される性質を有するＬＤＣ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、参照配列の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６と比較して１つまたは複数の残基の相違を含む。
一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、３７、２３３、２８３、４８３、５９３、６８５、６８７、および／または７６５から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、３７、２３３、２８３、４８３、５９３、６８５、６８７、および／または７６５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド残基同一性を有する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／もしくは７６６から選択される参照ポリヌクレオチド配列、またはその相補体、または本明細書に提供されるバリアントＬＤＣポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６と比較して１つまたは複数の残基の相違を有するアミノ酸配列を含むＬＤＣポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、本明細書の操作されたＬＤＣポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ＬＤＣポリペプチドの発現を容易にする各種の方法で操作される。一部の実施形態では、ＬＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の制御配列がＬＤＣポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために存在する発現ベクターを含む。単離されたポリヌクレオチドのベクターへのその挿入前の操作は、利用される発現ベクターに応じて、望ましくあり得るか、または必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技法は、当技術分野において周知である。一部の実施形態では、制御配列としては、とりわけ、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。一部の実施形態では、適切なプロモーターは、宿主細胞の選択に基づいて選択される。細菌宿主細胞について、本開示の核酸構築物の転写を指示するための適切なプロモーターとしては、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ オペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物ベータ－ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 75:3727-3731 [1978]を参照されたい）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、DeBoer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983]を参照されたい）から得られるプロモーターが挙げられる。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターとしては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、国際公開第９６／００７８７号を参照されたい）の遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ならびにその突然変異体、切断型およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子由来であり得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、当技術分野において公知である（例えば、Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992]を参照されたい）。
一部の実施形態では、制御配列は、適切な転写ターミネーター配列（すなわち、転写を終結させることが宿主細胞によって認識される配列）でもある。一部の実施形態では、ターミネーター配列は、ＬＤＣポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞において機能性である任意の適切なターミネーターが、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当技術分野において公知である（例えば、Romanos et al.、上記を参照されたい）。
一部の実施形態では、制御配列は、適切なリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳のために重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）でもある。一部の実施形態では、リーダー配列は、ＬＤＣポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞において機能性である任意の適切なリーダー配列が、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
一部の実施形態では、制御配列は、ポリアデニル化配列（すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結される配列であって、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）でもある。最適な宿主細胞において機能性である任意の適切なポリアデニル化配列が、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列としては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼの遺伝子が挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、公知である（例えば、Guo and Sherman, Mol. Cell. Bio., 15:5983-5990 [1995]を参照されたい）。
一部の実施形態では、制御配列は、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向付けるコード領域）でもある。一部の実施形態では、核酸配列のコード配列の５’末端は、翻訳リーディングフレーム中で分泌ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を本質的に含有する。あるいは、一部の実施形態では、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード領域を含有する。発現されたポリペプチドを最適な宿主細胞の分泌経路に方向付ける任意の適切なシグナルペプチドコード領域が、操作されたポリペプチドの発現のために使用される。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、シグナルペプチドコード領域であり、限定されるものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ １１８３７マルトジェニックアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ－アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ－ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から得られるものが挙げられる。さらなるシグナルペプチドが、当技術分野において公知である（例えば、Simonen and Palva, Microbiol. Rev., 57:109-137 [1993]を参照されたい）。一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞のために有用なシグナルペプチドとしては、限定されるものではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子由来のものが挙げられる。
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもある。得られるポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」、または「チモーゲン」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって、成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域としては、限定されるものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子を含む任意の適切な起源から得てもよい（例えば、国際公開第９５／３３８３６号を参照されたい）。シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
一部の実施形態では、調節配列も利用される。これらの配列は、宿主細胞の増殖に対して、ポリペプチドの発現の調節を容易にする。調節系の例は、調節性化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して、遺伝子の発現のオンまたはオフを引き起こすものである。原核生物宿主細胞では、適切な調節配列としては、限定されるものではないが、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞では、適切な調節系としては、限定されるものではないが、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌では、適切な調節配列としては、限定されるものではないが、ＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
別の態様では、本発明は、操作されたＬＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにプロモーターおよびターミネーター、複製起点などのような１つまたは複数の発現調節領域を、それらが導入される宿主の種類に応じて含む組換え発現ベクターを対象とする。一部の実施形態では、本明細書に記載されるさまざまな核酸および制御配列は、組換え発現ベクターを生成するように接合され、これは、そのような部位でのＬＤＣポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする１つまたは複数の好都合な制限部位を含む。あるいは、一部の実施形態では、本発明の核酸配列は、配列を含む核酸配列または核酸構築物を発現のための適当なベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターの作出を含む一部の実施形態では、コード配列が発現のための適当な制御配列と作動可能に連結されるように、コード配列はベクター中に位置する。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に付され、ＬＤＣポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意の適切なベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状または閉環状プラスミドであってもよい。
一部の実施形態では、発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、その複製が染色体の複製とは無関係である染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有していてもよい。一部の代替の実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と一緒に複製されるものである。さらにまた、一部の実施形態では、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含有する単一のベクターもしくはプラスミド、または２つもしくはそれよりも多くのベクターもしくはプラスミド、および／またはトランスポゾンが利用される。
一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１つまたは複数の選択マーカーを含有する。「選択マーカー」は、その産物が、殺生物剤またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌の選択マーカーの例としては、限定されるものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン抵抗性などの抗生物質抵抗性を付与するマーカーが挙げられる。酵母宿主細胞のための適切なマーカーとしては、限定されるものではないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が挙げられる。糸状菌宿主細胞における使用のための選択マーカーとしては、限定されるものではないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの等価物が挙げられる。別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの操作されたＬＤＣポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチドは、宿主細胞における操作されたＬＤＣ酵素の発現のための１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現における使用のために適切な宿主細胞は、当技術分野において周知であり、限定されるものではないが、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。例示的な宿主細胞としては、さまざまなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）も挙げられる。
したがって、別の態様では、本発明は、操作されたＬＤＣポリペプチドを産生する方法であって、操作されたＬＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を、ポリペプチドの発現のために適切な条件下で培養するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるように、ＬＤＣポリペプチドを単離および／または精製するステップをさらに含む。
宿主細胞のための適当な培養培地および増殖条件は、当技術分野において周知である。ＬＤＣポリペプチドの発現のためにポリヌクレオチドを細胞に導入するための任意の適切な方法が、本発明において使用されることが企図される。適切な技法としては、限定されるものではないが、電気穿孔、微粒子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。
本明細書に開示される性質を有する操作されたＬＤＣポリペプチドは、天然に存在するＬＤＣポリペプチドまたは操作されたＬＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野において公知のおよび／もしくは本明細書に記載される任意の適切な突然変異誘発ならびに／または定向進化法に付すことによって得ることができる。例示的な定向進化技法は、突然変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングである（例えば、Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 [1994]；国際公開第９５／２２６２５号；国際公開第９７／００７８号；国際公開第９７／３５９６６号；国際公開第９８／２７２３０号；国際公開第００／４２６５１号；国際公開第０１／７５７６７号および米国特許第６，５３７，７４６号を参照されたい）。使用され得る他の定向進化手順は、とりわけ、ねじれ型伸長プロセス（ＳｔＥＰ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Zhao et al., Nat. Biotechnol., 16:258-261 [1998]を参照されたい）、変異原性ＰＣＲ（例えば、Caldwell et al., PCR Methods Appl., 3:S136-S140 [1994]を参照されたい）、およびカセット突然変異誘発（例えば、Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3525-3529 [1996]を参照されたい）が挙げられる。
突然変異誘発および定向進化法は、発現され、スクリーニングされ、およびアッセイされ得るバリアントライブラリーを作成するために、ＬＤＣコードポリヌクレオチドに容易に適用することができる。任意の適切な突然変異誘発および定向進化法が、本発明において使用され、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２６５，２０１号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３３７，１８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８３，０１１号、同第６，４８４，１０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５００，６１７号、同第６，５００，６３９号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１８，０６５号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６０５，４３０号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，６８６，５１５号、同第６，７０３，２４０号、同第６，７１６，６３１号、同第６，８２５，００１号、同第６，９０２，９２２号、同第６，９１７，８８２号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２２０，５６６号、同第７，２８８，３７５号、同第７，３８４，３８７号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，４６２，４６９号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，８７３，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９８１，６１４号、同第８，０１４，９６１号、同第８，０２９，９８８号、同第８，０４８，６７４号、同第８，０５８，００１号、同第８，０７６，１３８号、同第８，１０８，１５０号、同第８，１７０，８０６号、同第８，２２４，５８０号、同第８，３７７，６８１号、同第８，３８３，３４６号、同第８，４５７，９０３号、同第８，５０４，４９８号、同第８，５８９，０８５号、同第８，７６２，０６６号、同第８，７６８，８７１号、同第９，５９３，３２６号、同第９，６６５，６９４号、同第９，６８４，７７１号、ならびにすべての関連する米国および米国以外の対応物；Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]；Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]；Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]；Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]；Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]；Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]；Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]；Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]；Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]；Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]；Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]；Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]；Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]；Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]；Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]；国際公開第９５／２２６２５号；国際公開第９７／００７８号；国際公開第９７／３５９６６号；国際公開第９８／２７２３０号；国際公開第００／４２６５１号；国際公開第０１／７５７６７号；国際公開第２００９／１５２３３６号；ならびに米国特許出願公開第２０１１／００８２０５５号、同第２０１４／０００５０５７号、同第２０１４／０２１４３９１号、同第２０１４／０２２１２１６号、同第２０１５／０１３３３０７号、同第２０１５／０１３４３１５号、および同第２０１５／００５０６５８号を参照されたい；それらのすべては、参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、突然変異誘発処理後に得られる酵素クローンは、酵素調製物を定義された温度（または、他のアッセイ条件）に付すこと、および熱処理または他の適切なアッセイ条件後に残っている酵素活性の量を測定することによって、スクリーニングされる。次いで、ＬＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンは、遺伝子から単離され、ヌクレオチド配列変化（もしあれば）を同定するために配列決定され、宿主細胞において酵素を発現させるために使用される。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、当技術分野において公知の任意の適切な方法（例えば、ＨＰＬＣ分析などの標準的な生化学的技法）を使用して行うことができる。
公知の配列の操作されたポリペプチドについて、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成方法に従って、標準的な固相法によって調製することができる。一部の実施形態では、最大で約１００塩基の断片を、個々に合成し、次いで、任意の所望の連続配列を形成するように（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション法、またはポリメラーゼ媒介法によって）接合することができる。例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、典型的には自動合成法において実施されるように、古典的ホスホラミダイト法を使用する化学合成によって調製することができる（例えば、Beaucage et al., Tet. Lett., 22:1859-69 [1981]; and Matthes et al., EMBO J., 3:801-05 [1984]を参照されたい）。ホスホラミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドが合成される（例えば、自動ＤＮＡ合成装置において、精製され、アニーリングされ、ライゲートされ、適当なベクターにクローニングされる）。
したがって、一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）本明細書に記載される任意のバリアントのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップ、および（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされるＬＤＣポリペプチドを発現させるステップを含み得る。方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、必要に応じて、１つまたはいくつか（例えば、最大で３、４、５個、または最大で１０個の）のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有することができる。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、または１～５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換である。
発現された操作されたＬＤＣポリペプチドは、任意の所望の改善された性質または性質の組合せ（例えば、活性、選択性、安定性など）について、本明細書に記載されるアッセイおよび条件を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の適切なアッセイを使用して評価することができる。
一部の実施形態では、宿主細胞において発現される操作されたＬＤＣポリペプチドのいずれかは、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製のための周知の技法のいずれか１つまたは複数を使用して、細胞および／または培養培地から回収される。
ＬＤＣポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー法としては、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、一部では、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などのような因子に依存し、当業者に明らかであろう。一部の実施形態では、アフィニティー技法が、改善されたＬＤＣ酵素を単離するために使用され得る。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、目的のＬＤＣポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用してもよい。抗体の産生のために、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含むさまざまな宿主動物が、ＬＤＣポリペプチドまたはその断片を含む注射によって免疫される。一部の実施形態では、ＬＤＣポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基または側鎖官能基に結合したリンカーを用いて、ＢＳＡなどの適切な担体に結合される。
一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、本明細書に記載される操作されたＬＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株）を、操作されたＬＤＣポリペプチドの産生につながる条件下で培養するステップ、ならびに操作されたＬＤＣポリペプチドを細胞および／または培養培地から回収するステップを含む方法によって、宿主細胞において産生される。一部の実施形態では、宿主細胞は、２つ以上の操作されたＬＤＣポリペプチドを産生する。
一部の実施形態では、本発明は、操作されたＬＤＣポリペプチドを産生する方法であって、本明細書で提供される、参照配列の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６と比較して１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を有する操作されたＬＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え細菌細胞を、操作されたＬＤＣポリペプチドの産生を可能にする適切な培養条件下で培養するステップ、ならびに必要に応じて、操作されたＬＤＣポリペプチドを培養物および／または培養された細菌細胞から回収するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、２つ以上の操作されたＬＤＣポリペプチドを産生する。
一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、組換え宿主細胞および／または培養培地から回収されると、それらは、当技術分野において公知の任意の適切な方法によってさらに精製される。一部の追加の実施形態では、精製されたＬＤＣポリペプチドは、他の成分および化合物と組み合わされて、必要に応じて異なる適用および使用（例えば、医薬組成物）のための操作されたＬＤＣポリペプチドを含む組成物および製剤を提供する。
組成物：
本発明は、多数の組成物における使用のために適切な操作されたＬＤＣポリペプチドを提供する。これらの組成物は、限定されるものではないが、医薬品、食事／栄養サプリメント、食品、飼料、および精密化学生産を含む多くの分野において使用される。例えば、一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの操作されたＬＤＣバリアントおよび／または少なくとも１つのＬＤＣバリアントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む食品および／または飼料を提供する。一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの操作されたＬＤＣバリアントを含む飲料を提供する。
一部の実施形態では、食品、飼料、および／または栄養／栄養補助食品中の操作されたＬＤＣバリアントは、グリコシル化されている。さらにまた、操作されたＬＤＣバリアントは、任意の適切な食用酵素送達マトリックスにおいて使用される。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣバリアントは、バリアントの摂取の際に動物の消化管内でＬＤＣバリアントの迅速な分散のために設計された食用酵素送達マトリックス中に存在する。
本発明は、精密化学製品および他の工業的に重要な化合物の生産における使用のために適切な操作されたＬＤＣポリペプチドも提供する（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０３４０１１９号、同第２０１３／０００５０１２号および同第２００５／０２６０７２４号、ならびに国際公開第２０１２／１２２３３３号を参照されたい）。
医薬組成物および他の組成物：
本発明は、食事／栄養サプリメントなどの医薬組成物および他の組成物における使用のために適切な操作されたＬＤＣポリペプチドを提供する。
投与の様式に応じて、治療有効量の本発明による操作されたＬＤＣを含むこれらの組成物は、固体、半固体、または液体の形態である。一部の実施形態では、組成物は、希釈剤、緩衝液、賦形剤、塩、乳化剤、保存剤、安定剤、フィラー、および他の成分などの他の薬学的に許容される構成成分を含む。製剤化および投与のための技法に対する詳細は、当技術分野において周知であり、文献に記載されている。
一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、経口医薬組成物における使用のために製剤化される。限定されるものではないが、丸剤、錠剤、ジェルタブ、カプセル剤、ロゼンジ、糖衣錠、散剤、ソフトゲル、ゾル－ゲル、ゲル、エマルジョン、インプラント、パッチ、噴霧剤、軟膏、リニメント剤、クリーム、ペースト、ゼリー、塗布剤、エアロゾル、チューインガム、粘滑剤、スティック、懸濁剤（限定されるものではないが、油系懸濁剤、水中油型エマルジョンなどを含む）、スラリー、シロップ剤、放出制御製剤、坐剤などを含む、操作されたＬＤＣポリペプチドの送達における使用のための任意の適切なフォーマットが、本発明において使用される。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、注射のために適切なフォーマット（すなわち、注射用製剤）で提供される。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、シリカ系（例えば、オキシシラン）のゾル－ゲルを含む、ゾル－ゲルなどの生体適合性マトリックス中で提供される。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、カプセル化される。一部の代替の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、ナノ構造（例えば、ナノチューブ、ナノチューブル、ナノカプセル、またはマイクロカプセル、ミクロスフェア、リポソームなど）でカプセル化される。実際に、本発明は、任意の特定の送達製剤および／または送達の手段に限定されることを意図するものではない。操作されたＬＤＣポリペプチドは、限定されるものではないが、非経口、経口、局所、経皮、鼻腔内、眼内、髄腔内、インプラントを介してなどを含む、当技術分野において公知の任意の適切な手段によって投与されることが意図される。
一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化（すなわち、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］または活性化ＰＥＧなどで修飾される）、または他の化合物によって化学的に修飾される（例えば、Ikeda, Amino Acids 29:283-287 [2005]；米国特許第７，５３１，３４１号、同第７，５３４，５９５号、同第７，５６０，２６３号、および同第７，５５３，６５３号；米国特許出願公開第２０１３／００３９８９８号、同第２０１２／０１７７７２２号などを参照されたい）。実際に、本発明は、任意の特定の送達方法および／または機構に限定されることを意図するものではない。
一部の追加の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、マトリックス安定化酵素結晶を含む製剤で提供される。一部の実施形態では、製剤は、架橋結晶性の操作されたＬＤＣ酵素、および酵素結晶に接着する反応性部分を有するポリマーを含む。本発明は、ポリマー中の操作されたＬＤＣポリペプチドも提供する。
一部の実施形態では、本発明の操作されたＬＤＣポリペプチドを含む組成物は、限定されるものではないが、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、および／またはソルビトール）、デンプン（例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物性デンプン）、セルロース（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ガム（例えば、アラビア、トラガカント、グアーなど）、および／またはタンパク質（例えば、ゼラチン、コラーゲンなど）を含む、１つまたは複数の一般に使用される担体化合物を含む。経口製剤における追加の構成成分としては、着色剤および／または甘味剤（例えば、グルコース、スクロース、およびマンニトール）および滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、ならびに腸溶コーティング（例えば、メタクリレートポリマー、ヒドロキシルプロピルメチルセルロースフタレート、および／または当技術分野において公知の任意の他の適切な腸溶コーティング）が挙げられ得る。一部の実施形態では、崩壊剤または可溶化剤が含まれる（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウム）。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、特に、液体製剤において、限定されるものではないが、保存剤、懸濁化剤、増粘剤、湿潤剤、アルコール、脂肪酸、および／または乳化剤を含む、さまざまな追加の構成成分と組み合わされる。
一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、特に、液体製剤において、限定されるものではないが、保存剤、懸濁化剤、増粘剤、湿潤剤、アルコール、脂肪酸、および／または乳化剤を含む、さまざまな追加の構成成分と組み合わされる。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、ＭＳＵＤの処置において使用される他の化合物、および任意の他の適切な化合物と組み合わせて対象に投与される。
一部の実施形態では、本発明は、ＭＳＵＤの徴候および／もしくは症状の減少、回復、または排除における使用のために適切な操作されたＬＤＣポリペプチドを提供する。患者に投与される操作されたＬＤＣポリペプチドの投薬量は、患者の遺伝子型、患者の全身状態、および当業者に公知の他の因子に依存する。一部の実施形態では、組成物は、患者への単回投与または反復投与が意図される。一部の実施形態では、患者に投与される組成物中の操作されたＬＤＣポリペプチドの濃度は、疾患の症状を有効に処置、回復および／または予防するのに十分であることが企図される。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、他の医薬および／または食事組成物と組み合わせて投与される。
工業用組成物：
本発明の操作されたＬＤＣポリペプチドは、食品香味料（例えば、チーズ）などの領域を含む工業用組成物において使用されることが企図される。
一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、食品および／または飼料工業における使用のために製剤化される。一部の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、追加の酵素（例えば、セルラーゼ、ラッカーゼ、およびアミラーゼ）などの動物飼料構成成分と混合される顆粒化製品またはペレット化製品に製剤化される。一部の代替の実施形態では、操作されたＬＤＣポリペプチドは、液体動物飼料組成物（例えば、水性または油系スラリー）において使用される。そのため、一部の実施形態では、本発明の操作されたＬＤＣバリアントは、ペレットおよび他の加工飼料／食品を生産するために使用される処理に耐えるのに十分に熱耐性および熱安定性である。
本発明の前述のおよび他の態様は、以下の非限定的な実施例に関連してより良く理解され得る。実施例は、例示の目的のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。
実験
実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のためにのみ提供され、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
下記の実験の開示では、以下の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（μモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）；ｈ（ｓ）およびｈｒ（ｓ）（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（ポンド／平方インチ）；℃（摂氏温度）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＡＵＣ（曲線下面積）；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴから入手可能な一般に使用される実験室Ｅ．ｃｏｌｉ株）；ｉＭＳＵＤ（中間メープルシロップ尿症）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＬＣ（液体クロマトグラフィー）；ＭＳ（質量分析）；ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（２回の質量分析を伴う液体クロマトグラフィー）；ＳＰＥ（固相抽出）；ＫＩＣ（ケトイソカプロエート）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）；ＰＬＰ（ピリドキサール５’－リン酸）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＢＷ（体重）；ＭＳＵＤ（メープルシロップ尿症）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する倍数改善）；ＬＢ（ルリアブロス）；ＴＢ（テリフィックブロス）；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｏｖｉ、ＭＩ）；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）；Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ、Ｈｏｌｌａｎｄ、ＭＩ）；Ｗａｔｅｒｓ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）；Ｉｎｆｏｒｓ（Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒｐ．、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹの一部）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡの一部）；Ｇｉｂｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡのＧｉｂｃｏ部門）；Ｋｈｕｎｅｒ（Ｋｈｕｎｅｒ Ｓｈａｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；ＢＮ Ｌａｂｓ（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎｓ，ＬＬＣ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；ならびにＣｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。
（実施例１）
ロイシンデカルボキシラーゼ活性を有するアミノ酸デカルボキシラーゼ酵素の合成およびアッセイ
この実施例では、ロイシンデカルボキシラーゼ（ＬＤＣ）活性のためのアミノ酸デカルボキシラーゼ酵素の合成およびアッセイにおいて使用される方法が記載される。
アミノ酸デカルボキシラーゼ遺伝子の取得および発現ベクターの構築
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＰ５５（配列番号２；Ａｃｃ番号ＷＰ＿１０１３８４４７２．１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ ｓｐ．ＳＴ－８８８（配列番号４；Ａｃｃ番号ＷＰ＿０５２６８１８２５．１）、およびＫｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ｓｐ．ＭＢＴ６３（配列番号６；Ａｃｃ番号ＷＰ＿０５１８１２３９４．１）、Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ｓｐ．ＭＭＳ６１－ＢＨ０１５（配列番号８；Ａｃｃ番号ＷＰ＿１０４８１８０７８．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＮＲＲＬ Ｆ－６１３１（配列番号１０；Ａｃｃ番号ＷＰ＿０５１７６９１１３．１）、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ細菌（配列番号１２；Ａｃｃ番号ＲＰＩ６３０６６．１）、ならびにＬａｒｋｉｎｅｌｌａ ａｒｂｏｒｉｃｏｌａ（配列番号１４；Ａｃｃ番号Ａ０Ａ３２７ＷＰＢ０）由来のアミノ酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号１、３、５、７、９、１１、および１３の遺伝子として合成した。これらの合成遺伝子を、ｐＣＫ１１０９００ベクター系（例えば、米国特許第７，６２９，１５７号および米国特許出願公開第２０１６／０２４４７８７号を参照されたい、それらの両方とも、これにより参照により本明細書に組み込まれる）にクローニングし、その後、Ｗ３１１０に由来するＥ．ｃｏｌｉ株において発現させた。一部の実施形態では、抗菌剤抵抗性マーカーを欠く発現ベクターを使用する。
振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）の生成
アミノ酸デカルボキシラーゼを含有するプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ培養物を、１％のグルコース、および一部の例では３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを有するルリアブロス－寒天プレート上に蒔き、３７℃で終夜増殖させた。各培養物由来の単一のコロニーを、適切な場合、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを有する５ｍＬのルリアブロス（ＬＢ）に移した。培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間増殖させ、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを有する２５０ｍｌのテリフィックブロス（ＴＢ）に、およそ１：５０で継代培養した。培養物を、０．６～０．８のＯＤ６００まで、３０℃、２５０ｒｐｍでおよそ３～４時間増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間増殖させた。細胞を、遠心分離（７０００ｒｐｍ×１０分、４℃）によって収集し、上清を廃棄した。ペレットを、３０ｍＬの１ｍＭのＰＬＰを有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に再懸濁させ、１１０ｐｓｉでのマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）の単回通過を使用して溶解させた。溶解物をペレット化し（１０，０００×ｒｐｍ、３０分、４℃）、得られた上清を凍結および凍結乾燥して、発現した酵素を含有する粉末を作成した。
異なるｐＨでのロイシンに対するデカルボキシラーゼ活性についてのＳＦＰ特性評価アッセイ
振とうフラスコ粉末を再構成して、４０ｇ／Ｌ粉末を準備し、２．５～４０ｇ／Ｌに連続希釈した。次いで、これらのストックの２５μＬを、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、またはマッキルベイン緩衝液、ｐＨ４．６中の１０ｍＭのロイシンおよび０．１ｍＭのＰＬＰの最終濃度のために、７５μＬの反応ミックスに添加した。反応物を、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカー中、３７℃、２５０ｒｐｍで３～４時間インキュベートした後、０．１％のギ酸を有する３体積のアセトニトリルでクエンチした。得られた試料を、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を、ロイシンの脱カルボキシル化産物であるイソペンチルアミンについてＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置およびパラメーターの例を表１－１に示し、配列番号２～１４についての結果を表１－２に示す。
Figure 2023512683000001
 ｐＨ耐性についてのＳＦＰ特性評価アッセイ
酸性ｐＨに対する酵素の相対的耐性を評価するために、ＳＦＰを再構成して、２０ｇ／Ｌ粉末を準備し、マッキルベイン緩衝液、ｐＨ２．８～８．０に２倍希釈した。混合物を、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカー中、３７℃、２５０ｒｐｍで１．５時間インキュベートした。インキュベーション後、２０μＬの酵素溶液を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の５ｍＭのロイシンの最終濃度のために、９０μＬの反応ミックスに添加した。反応物を、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカー中、３７℃、２５０ｒｐｍで２時間インキュベートした後、水に２倍希釈し、０．１％のギ酸を有する３体積のアセトニトリルでクエンチした。得られた試料を上記に記載されるようにして処理し、上清をイソペンチルアミンについてＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。配列番号２～１４について得られた結果を表１－２に示す。
熱安定性についてのＳＦＰ特性評価アッセイ
改善された熱安定性は、酵素治療薬の製造および貯蔵において有用な価値のある形質であり、多くの場合、他の安定化の試みの副産物として生じる。本発明の開発の間に生成したバリアントの相対的安定性を評価するために、酵素の熱安定性を以下の通り評価した：１００μＬの１０ｇ／Ｌのアミノ酸デカルボキシラーゼＳＦＰを、サーモサイクラー中、３０～７０℃で１．５時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を短時間遠心分離し、１０μＬの熱処理されたＳＦＰを、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の５ｍＭのロイシンの最終濃度のために、９０μＬの反応ミックスに添加した。反応物を、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレート中、３７℃、２５０ｒｐｍで２時間インキュベートし、処理し、上記に記載されるようにしてＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。配列番号２～１４についての結果を表１－２に示す。
プロテアーゼに対する抵抗性についてのＳＦＰ特性評価アッセイ
代表的な腸プロテアーゼに対する酵素の相対的安定性を評価するために、ブタトリプシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびウシキモトリプシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）のミックスを、それぞれ３ｇ／Ｌの濃度に、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に溶解し、２倍連続希釈した。次いで、１０ｇ／Ｌのアミノ酸デカルボキシラーゼＳＦＰを、０～１．５ｇ／Ｌのトリプシン／キモトリプシンとともに、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカー中、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。インキュベーション後、１０μＬのプロテアーゼ処理されたＳＦＰを、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の３ｍＭのロイシンの最終濃度のために、９０μＬの反応ミックスに添加した。反応物を、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレート中、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした後、水に５倍希釈し、０．１％のギ酸を有する３体積のアセトニトリルでクエンチした。得られた試料を、上記に記載されるようにして処理し、上清を、上記に記載されるようにしてＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。配列番号２および１２についての結果を表１－２に示す。
Figure 2023512683000002
 （実施例２）
配列番号１２のＬＤＣバリアント
この実施例では、ロイシン活性の改善、低ｐＨ耐性、およびプロテアーゼ抵抗性について、配列番号１２に由来するＬＤＣバリアントの進化およびスクリーニングのための実験を記載する。配列番号１１によってコードされるＬＤＣの定向進化を、バリアント遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーを、下記に記載される方法を使用して、蒔き、増殖させ、スクリーニングした。
ＬＤＣ酵素を発現する培養物のハイスループット（ＨＴＰ）増殖
形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞を、１％のグルコースを含有するＬＢ寒天プレート上に蒔くことによって選択した。３７℃での終夜インキュベーション後、コロニーを、１％のグルコースが補充された１８０μＬ／ウェルのＬＢ培地で満たされたＮＵＮＣ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）９６ウェルシャロー平底プレートにおいて選んだ。培養物を、Ｋｕｈｎｅｒシェーカー（２００ｒｐｍ、３０℃、および８５％相対湿度）中、終夜、１８～２０時間増殖させた。終夜増殖させた試料（２０μＬ）を、３８０μＬのＴＢで満たされたＣＯＳＴＡＲ（登録商標）９６ウェルディーププレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。培養物を、Ｋｕｈｎｅｒシェーカー（２５０ｒｐｍ、３０℃、および８５％相対湿度）中、２～３時間インキュベートし、次いで、滅菌水中４０μＬの１０ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、Ｋｕｈｎｅｒシェーカー（２５０ｒｐｍ、３０℃、および８５％相対湿度）中、終夜、２０～２４時間インキュベートした。細胞をペレット化し（４０００ｒｐｍ×１０分）、上清を廃棄し、細胞を分析の前に－８０℃で凍結した。
ＨＴＰ細胞ペレットの溶解
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ペレットを、４００μＬの溶解緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７中の１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム＋０．５ｇ／ＬのＰＭＢＳ）で溶解した。混合物を、室温で１．５時間撹拌し、ペレット化し（４０００ｒｐｍ×１０分）、その後、清澄化溶解物を、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカー（４００ｒｐｍ）中、６０℃で１時間プレインキュベートした。熱処理された溶解物をペレット化し（４０００ｒｐｍ×１０分）、上清をＨＴＰアッセイにおいて使用した。
酸性緩衝液およびプロテアーゼで前処理された清澄化溶解物のＨＴＰ活性分析
ＬＤＣバリアントを含有する熱処理された溶解物を、胃の環境をシミュレーションする酸性緩衝液でチャレンジした。最初に、熱処理された清澄化溶解物を、ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、マッキルベイン緩衝液、ｐＨ３．６とともに、１：１で、プレインキュベートした。プレートを、密封し、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカー（２５０ｒｐｍ）中、３７℃で１時間インキュベートした。その後、得られた酸性緩衝液で処理された溶解物を、０．０２ｇ／Ｌのトリプシンおよびキモトリプシン（１：１）の最終濃度で、１：１で、振とうしながら３７℃で１時間プレインキュベートした。インキュベーション後、得られた試料を遠心分離し、５０μＬの試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の３ｍＭのロイシンおよび１０μＭのＰＬＰの最終濃度のために、５０μＬの反応ミックスに添加した。一部の実験では、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中のイソロイシンの代わりに、イソロイシン－ｄ１０を有する０．６～３ｍＭの全２０アミノ酸（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および１０μＭのＰＬＰの最終濃度をもたらす反応ミックスを使用した。反応物を、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレート中、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした後、０．１％のギ酸を有する３体積のアセトニトリルでクエンチし、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、水に５０倍希釈した。得られた試料を、実施例１に記載されるようにしてＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。これらのアッセイの結果を表２－１に示す。
Figure 2023512683000003
Figure 2023512683000004
Figure 2023512683000005
 （実施例３）
配列番号３８のＬＤＣバリアント
この実施例では、ロイシン活性の改善、低ｐＨ耐性、およびプロテアーゼ抵抗性について、配列番号３８に由来するＬＤＣバリアントの進化およびスクリーニングのための実験を記載する。配列番号３８によってコードされるＬＤＣの定向進化を、バリアント遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーを、下記に記載される方法を使用して、蒔き、増殖させ、スクリーニングした。
酸性緩衝液およびプロテアーゼで前処理された清澄化溶解物のＨＴＰ活性分析
ＨＴＰ増殖、およびＬＤＣバリアントを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の溶解を、実施例２に記載されるようにして行った。ＬＤＣバリアントを含有する熱処理された溶解物を、実施例２に記載されるようにして酸性緩衝液でチャレンジした。その後、酸性緩衝液で処理された溶解物を、０．１ｇ／Ｌのトリプシンおよびキモトリプシン（１：１）の最終濃度で、１：１で、振とうしながら３７℃で１時間プレインキュベートした。インキュベーション後、試料を遠心分離し、５０μＬの試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の３ｍＭのロイシンおよび１０μＭのＰＬＰの最終濃度のために、５０μＬの反応ミックスに添加した。一部の実験では、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中のイソロイシンの代わりに、イソロイシン－ｄ１０を有する０．６～３ｍＭの全２０アミノ酸（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および１０μＭのＰＬＰの最終濃度をもたらす反応ミックスを使用した。反応物を、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレート中、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした後、０．１％のギ酸を有する３体積のアセトニトリルでクエンチし、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、水に５０倍希釈した。得られた試料を、実施例１に記載されるようにＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって、または表３－１に示されるパラメーターを使用してＲＡＰＩＤＦＩＲＥ（登録商標）質量分析（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって分析した。これらのアッセイの結果を表３－２に示す。
Figure 2023512683000006
Figure 2023512683000007
Figure 2023512683000008
 （実施例４）
配列番号２３４のＬＤＣバリアント
この実施例では、ロイシン活性の改善、低ｐＨ耐性、およびプロテアーゼ抵抗性について、配列番号２３４に由来するＬＤＣバリアントの進化およびスクリーニングのための実験を記載する。配列番号２３４によってコードされるＬＤＣの定向進化を、バリアント遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーを、下記に記載される方法を使用して、蒔き、増殖させ、スクリーニングした。
酸性緩衝液およびプロテアーゼで前処理された清澄化溶解物のＨＴＰ活性分析
ＨＴＰ増殖、およびＬＤＣバリアントを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の溶解を、実施例２に記載されるようにして行った。ＬＤＣバリアントを含有する熱処理された溶解物を、以下の条件で、実施例２に記載されるようにして酸性緩衝液でチャレンジした：熱処理された清澄化溶解物を、マッキルベイン緩衝液、ｐＨ３．３とともに、１：１で、プレインキュベートした。次いで、得られた酸性で緩衝液処理された溶解物を、０．５ｇ／Ｌのトリプシンおよびキモトリプシン（１：１）の最終濃度で、１：１で、振とうしながら３７℃で１時間プレインキュベートした。インキュベーション後、試料を遠心分離し、４０μＬの試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の３ｍＭのロイシンおよび１０μＭのＰＬＰの最終濃度のために、６０μＬの反応ミックスに添加した。一部の実験では、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中のイソロイシンの代わりに、イソロイシン－ｄ１０を有する０．６～３ｍＭの全２０アミノ酸（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および１０μＭのＰＬＰの最終濃度をもたらす反応ミックスを使用した。反応物を、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレート中、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした後、０．１％のギ酸を有する３体積のアセトニトリルでクエンチし、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、水に１０または５００倍希釈した。得られた試料を、実施例１に記載されるようにしてＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって、または実施例３に記載されるようにしてＲＡＰＩＤＦＩＲＥ（登録商標）－ＭＳによって分析した。
Figure 2023512683000009
Figure 2023512683000010
 （実施例５）
配列番号２８４のＬＤＣバリアント
この実施例では、ロイシン活性の改善、低ｐＨ耐性、およびプロテアーゼ抵抗性について、配列番号２８４に由来するＬＤＣバリアントの進化およびスクリーニングのための実験を記載する。配列番号２８４によってコードされるＬＤＣの定向進化を、バリアント遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーを、下記に記載される方法を使用して、蒔き、増殖させ、スクリーニングした。
酸性緩衝液、ペプシンおよびプロテアーゼで前処理された清澄化溶解物のＨＴＰ活性分析
ＨＴＰ増殖、およびＬＤＣバリアントを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の溶解を、実施例２に記載されるようにして行った。ＬＤＣバリアントを含有する熱処理された溶解物を、胃の環境をシミュレーションするペプシンを含有する酸性緩衝液でチャレンジした。最初に、熱処理された清澄化溶解物を、ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、１：１で、０．０５ｇ／Ｌのブタ胃粘膜由来ペプシン（Ｓｉｇｍａ）を含有するマッキルベイン緩衝液、ｐＨ３．２とともにプレインキュベートした。プレートを、密封し、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカー（２５０ｒｐｍ）中、３７℃で１時間インキュベートした。その後、試料を短時間遠心分離し、得られた上清を、１：１で、０．５ｇ／Ｌのトリプシンおよびキモトリプシン（１：１）の最終濃度で、振とうしながら３７℃で１時間プレインキュベートした。インキュベーション後、４０μＬの試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の３ｍＭのロイシンおよび１０μＭのＰＬＰの最終濃度のために、６０μＬの反応ミックスに添加した。反応物を、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレート中、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした後、０．１％のギ酸を有する３体積のアセトニトリルでクエンチし、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、水に５００倍希釈した。得られた試料を、実施例３に記載されるようにしてＲＡＰＩＤＦＩＲＥ（登録商標）－ＭＳによって分析した。
Figure 2023512683000011
Figure 2023512683000012
 （実施例６）
配列番号４８４のＬＤＣバリアント
この実施例では、ロイシン活性の改善、低ｐＨ耐性、およびプロテアーゼ抵抗性について、配列番号４８４に由来するＬＤＣバリアントの進化およびスクリーニングのための実験を記載する。配列番号４８４によってコードされるＬＤＣの定向進化を、バリアント遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーを、下記に記載される方法を使用して、蒔き、増殖させ、スクリーニングした。
酸性緩衝液およびプロテアーゼで前処理された清澄化溶解物のＨＴＰ活性分析
ＨＴＰ増殖、およびＬＤＣバリアントを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の溶解を、溶解緩衝液が４０μＭのＰＬＰを含有した以外は、実施例２に記載されるようにして行った。ＬＤＣバリアントを含有する熱処理された溶解物を、実施例５に記載されるようにして、ペプシンを含有する酸性緩衝液でチャレンジし、その後、プロテアーゼでチャレンジした。具体的には、熱処理された清澄化溶解物を、マッキルベイン緩衝液、ｐＨ３中の０．３７５ｇ／Ｌのペプシンの最終濃度で、１：１で、３７℃で１時間プレインキュベートし、得られた上清を、２００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８に溶解された０．７５ｇ／Ｌのトリプシンおよびキモトリプシン（１：１）の最終濃度で、１：１で、３７℃で１時間プレインキュベートした。インキュベーション後、４０μＬの試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の３ｍＭのロイシンの最終濃度のために、６０μＬの反応ミックスに添加した。ＲＡＰＩＤＦＩＲＥ（登録商標）－ＭＳによる分析の前に試料を水に５０倍希釈した以外は、反応物を、実施例５に記載されるようにして、インキュベートし、クエンチし、分析した。これらのアッセイの結果を表６－１に示す。
Figure 2023512683000013
Figure 2023512683000014
Figure 2023512683000015
 （実施例７）
配列番号５９４のＬＤＣバリアント
この実施例では、ロイシン活性の改善、低ｐＨ耐性、およびプロテアーゼ抵抗性について、配列番号５９４に由来するＬＤＣバリアントの進化およびスクリーニングのための実験を記載する。配列番号５９４によってコードされるＬＤＣの定向進化を、バリアント遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーを、下記に記載される方法を使用して、蒔き、増殖させ、スクリーニングした。
酸性緩衝液およびプロテアーゼで前処理された清澄化溶解物のＨＴＰ活性分析
ＨＴＰ増殖、およびＬＤＣバリアントを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の溶解を、溶解緩衝液が４０μＭのＰＬＰを含有した以外は、実施例２に記載されるようにして行った。ＬＤＣバリアントを含有する熱処理された溶解物を、実施例５に記載されるようにして、ペプシンを含有する酸性緩衝液でチャレンジし、その後、プロテアーゼでチャレンジした。具体的には、熱処理された清澄化溶解物を、マッキルベイン緩衝液、ｐＨ２．８中の０．２ｇ／Ｌのペプシンの最終濃度で、１：１で、３７℃で１時間プレインキュベートし、得られた上清を、４００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８に溶解された１．５ｇ／Ｌのトリプシンおよびキモトリプシン（１：１）の最終濃度で、１：１で、３７℃で１時間プレインキュベートした。インキュベーション後、４０μＬの試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の２．５ｍＭのロイシンの最終濃度のために、６０μＬの反応ミックスに添加した。反応物を、実施例６に記載されるようにして、インキュベートし、クエンチし、希釈し、分析した。これらのアッセイの結果を表７－１に示す。
Figure 2023512683000016
 （実施例８）
配列番号６８６のＬＤＣバリアント
この実施例では、ロイシン活性の改善、低ｐＨ耐性、およびプロテアーゼ抵抗性について、配列番号６８６に由来するＬＤＣバリアントの進化およびスクリーニングのための実験を記載する。配列番号６８６によってコードされるＬＤＣの定向進化を、バリアント遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーを、下記に記載される方法を使用して、蒔き、増殖させ、スクリーニングした。
酸性緩衝液およびプロテアーゼで前処理された清澄化溶解物のＨＴＰ活性分析
ＨＴＰ増殖、およびＬＤＣバリアントを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の溶解を、溶解緩衝液が４０μＭのＰＬＰを含有した以外は、実施例２に記載されるようにして行った。ＬＤＣバリアントを含有する熱処理された溶解物を、実施例５に記載されるようにして、ペプシンを含有する酸性緩衝液でチャレンジし、その後、プロテアーゼでチャレンジした。具体的には、熱処理された清澄化溶解物を、マッキルベイン緩衝液、ｐＨ２．８中の０．４ｇ／Ｌのペプシンの最終濃度で、１：１で、３７℃で１～１．５時間プレインキュベートし、得られた上清を、４００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８に溶解された２～４ｇ／Ｌのトリプシンおよび１．５ｇ／Ｌのキモトリプシンの最終濃度で、１：１で、３７℃で１～２時間プレインキュベートした。インキュベーション後、４０μＬの試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の２．５ｍＭのロイシンの最終濃度のために、６０μＬの反応ミックスに添加した。一部の実験では、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の２．５ｍＭのロイシン、イソロイシン－ｄ１０、バリン、アスパラギン、メチオニン、およびシステインの最終濃度をもたらす反応ミックスを使用した。反応物を、実施例６に記載されるようにして、インキュベートし、クエンチし、希釈し、分析した。これらのアッセイの結果を表８－１および８－２に提供する。
Figure 2023512683000017
Figure 2023512683000018
 （実施例９）
ＬＤＣバリアントのアミノ酸活性分析
この実施例では、全２０アミノ酸に対する配列番号１２および５９４の活性を評価するための実験を記載する。
振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）の生成
ＬＤＣバリアントの振とうフラスコ粉末を、以下の変更を用いて、実施例１に記載されるようにして調製した：細胞ペレットを、２００μＭのＰＬＰを有する３０ｍＬの５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に再懸濁させた。１１０ｐｓｉでのマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）の単回通過を使用する溶解の後、溶解物をペレット化し（１０，０００×ｒｐｍ、３０分、４℃）、得られた上清を、水浴中、６０℃で１時間熱処理した。次いで、試料を遠心分離した（１０，０００×ｒｐｍ、１時間、４℃）後、得られた上清を凍結および凍結乾燥して、発現した酵素を含有する粉末を作成した。
異なるアミノ酸に対するデカルボキシラーゼ活性についてのＳＦＰ特性評価アッセイ
振とうフラスコ粉末をリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４中で再構成して、１０ｇ／Ｌ粉末のストック溶液を準備した。次いで、２０μＬのこれらのＳＦＰ溶液を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０に溶解された、イソロイシンの代わりにイソロイシンｄ－１０を有する２ｍＭの全２０アミノ酸（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する１８０μＬの反応ミックスに添加した。反応物を、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカー中、３７℃、４００ｒｐｍで１．５～２時間インキュベートした後、０．１％のギ酸を有する２体積のアセトニトリルでクエンチした。得られた試料を、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を、０．１％のギ酸を有するアセトニトリルに最高で６倍希釈した。試料を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって、全２０アミノ酸について分析し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置およびパラメーターの例を表９－１および９－２に示す。それぞれのアミノ酸の変換（すなわち、枯渇）を陰性対照に対して計算し、配列番号１２および５９４についての結果を表９－２に示す。
Figure 2023512683000019
Figure 2023512683000020
Figure 2023512683000021
 （実施例１０）
配列番号６８８のＬＤＣバリアント
この実施例では、ロイシン活性の改善、低ｐＨ耐性、およびプロテアーゼ抵抗性について、配列番号６８８に由来するＬＤＣバリアントの進化およびスクリーニングのための実験を記載する。配列番号６８８によってコードされるＬＤＣの定向進化を、バリアント遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーを、下記に記載される方法を使用して、蒔き、増殖させ、スクリーニングした。
酸性緩衝液およびプロテアーゼで前処理された清澄化溶解物のＨＴＰ活性分析
ＨＴＰ増殖、およびＬＤＣバリアントを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の溶解を、溶解緩衝液が２０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび４０μＭのＰＬＰを含有した以外は、実施例２に記載されるようにして行った。ＬＤＣバリアントを含有する熱処理された溶解物を、実施例５に記載されるようにして、ペプシンを含有する酸性緩衝液でチャレンジし、その後、プロテアーゼでチャレンジした。具体的には、熱処理された清澄化溶解物を、マッキルベイン緩衝液、ｐＨ３中の０．４ｇ／Ｌのペプシンの最終濃度で、１：１で、３７℃で１．５時間プレインキュベートし、得られた上清を、４００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８に溶解された４ｇ／Ｌのトリプシンおよび１．５ｇ／Ｌのキモトリプシンの最終濃度で、１：１で、３７℃で２時間プレインキュベートした。インキュベーション後、４０μＬの試料を、６０μＬの反応ミックスに添加して、模擬腸液中の２．５ｍＭのロイシン、イソロイシン－ｄ１０、バリン、アスパラギン、メチオニン、およびシステインの最終濃度を得た。反応物を、実施例６に記載されるようにして、インキュベートし、クエンチし、希釈し、分析した。これらのアッセイの結果を表１０－１に提供する。
Figure 2023512683000022
 （実施例１１）
配列番号７６６のＬＤＣバリアント
この実施例では、ロイシン活性の改善、低ｐＨ耐性、およびプロテアーゼ抵抗性について、配列番号７６６に由来するＬＤＣバリアントの進化およびスクリーニングのための実験を記載する。配列番号７６６によってコードされるＬＤＣの定向進化を、バリアント遺伝子のライブラリーを構築することによって行った。次いで、これらのライブラリーを、下記に記載される方法を使用して、蒔き、増殖させ、スクリーニングした。
酸性緩衝液およびプロテアーゼで前処理された清澄化溶解物のＨＴＰ活性分析
ＨＴＰ増殖、およびＬＤＣバリアントを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の溶解を、実施例１０に記載されるようにして行った。ＬＤＣバリアントを含有する熱処理された溶解物を、実施例５に記載されるようにして、ペプシンを含有する酸性緩衝液でチャレンジし、その後、プロテアーゼでチャレンジした。具体的には、熱処理された清澄化溶解物を、マッキルベイン緩衝液、ｐＨ２．６～２．８中の０．８ｇ／Ｌのペプシンの最終濃度で、１：１で、３７℃で２時間プレインキュベートし、得られた上清を、４００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８に溶解された４ｇ／Ｌのトリプシンおよび１．５ｇ／Ｌのキモトリプシンの最終濃度で、１：１で、３７℃で２時間プレインキュベートした。インキュベーション後、４０μＬの試料を、６０μＬの反応ミックスに添加して、模擬腸液中の２～３ｍＭのロイシン、イソロイシン－ｄ１０、バリン、アスパラギン、メチオニン、およびシステインの最終濃度を得た。反応物を、実施例６に記載されるようにして、インキュベートし、クエンチし、希釈し、分析した。これらのアッセイの結果を表１１－１および１１－２に提供する。
ロイシンに対する清澄化溶解物のＨＴＰ活性分析
ＨＴＰ増殖、およびＬＤＣバリアントを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の溶解を、実施例１０に記載されるようにして行った。熱処理された溶解物を、水に２０倍希釈し、２０μＬの試料を、８０μＬの反応ミックスに添加して、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７中の３ｍＭのロイシンの最終濃度を得た。反応物を、実施例６に記載されるようにして、インキュベートし、クエンチし、希釈し、分析した。ロイシンに対する活性を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって決定された熱処理された清澄化溶解物中のロイシンデカルボキシラーゼの濃度によって正規化した。これらのアッセイの結果を表１１－２に提供する。
Figure 2023512683000023
Figure 2023512683000024
 （実施例１２）
健康なカニクイザルにおけるＬＤＣバリアントのｉｎ ｖｉｖｏ特性評価
ｉｎ ｖｉｖｏ薬力学研究を、健康なカニクイザル（ｎ＝１２、雄、ＢＷ３～４ｋｇ）において実施して、３つのＬＤＣバリアント（配列番号４８４；配列番号６８６；および配列番号７６６）を特性評価した。それぞれのバリアントを、２５、５０、または１００ｍｇ／ｋｇのいずれかで投薬した。１週間の休薬期間によってそれぞれ分けられた４回の投薬日からなる研究を４週間にわたって行った。動物が同じ用量を２回受けないように、投薬群をローテーションした。投薬の１日前に、動物を、個々のケージに分け、終夜絶食させた。それぞれの投薬日に、２０ｍＬ／動物の最終体積のために水で製剤化された１０ｇのホエイタンパク質粉末（ＢＮ Ｌａｂｓ Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ；９．１４％ロイシン）を、強制経口によって与えた。ホエイタンパク質懸濁液の直後に、媒体（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．４ｍＭのピリドキサールリン酸、ｐＨ７．２）または適当な用量のＬＤＣのいずれかを、２．５ｍＬ／ｋｇで与え、続いて、４ｍＬの水のすすぎを行って、同じ経管栄養管を使用するすべての材料の効率的な送達を確実にした。投薬日において、動物に、血液採取の直後に、８時間でそれらの通常の食事を提供した。血液試料を、摂食の９０分前および３０分前、ならびに摂食の５分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１２時間後、および２４時間後に得た（２４時間の時点は、翌日、給餌前に、採取した）。試料を、抗凝固剤のＫ２ＥＤＴＡを含有する管に移し、処理を待つ間、湿った氷上に置き、２５００ｒｐｍ、およそ４℃で１０分間遠心分離した。得られた血漿を回収し、分析まで凍結保存した（≦－６０℃）。血漿ロイシン、フェニルアラニン、チロシンおよびメチオニンを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して定量化して、有効性を評価した。血漿ロイシンの著しい増加が、摂取前のベースラインと比較して、食事チャレンジ単独で観察された。すべての用量のすべてのＬＤＣバリアントは、ホエイタンパク質食事チャレンジに応答して、血漿ロイシンの著しい抑制をもたらした。配列番号４８４および配列番号６８６は、用量応答性の様式で、有効性を実証した。配列番号７６６のすべての用量は、類似の有効性を示し、これは、配列番号４８４および配列番号６８６の両方よりも優れていた。ＬＤＣは、血漿フェニルアラニン、チロシンまたはメチオニンに対する効果を有さなかった。表１２－１は、媒体と比較した処置による血漿ロイシンの上昇曲線下面積（ｉＡＵＣ）の低減パーセントをまとめる。ｉＡＵＣは、それぞれの動物についてのそれぞれの摂食後の時点から摂食前のロイシン値（絶食バックグラウンド）を最初に減算し、次いで、ＡＵＣ計算を行うことによって報告した。統計的計算および有意性をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して決定した。
Figure 2023512683000025
 （実施例１３）
疾患のマウスモデルにおけるＬＤＣバリアントのｉｎ ｖｉｖｏ特性評価
ｉｎ ｖｉｖｏ薬力学研究を、中間メープルシロップ尿症のマウスモデル（ｉＭＳＵＤ；（Ｄｂｔｔｍ１Ｇｅｈ Ｔｇ（Ｃｅｂｐｂ－ｔＴＡ）５Ｂｊｄ Ｔｇ（ｔｅｔＯ－ＤＢＴ）Ａ１Ｇｅｈ／Ｊ；ＪＡＸ ストック番号６９９９））において実施して、３つのＬＤＣバリアント（配列番号４８４；配列番号６８６；および配列番号７６６）を特性評価した。それぞれのバリアントを、２００ｍｇ／ｋｇで投薬した。投薬および離乳の開始前に、ｉＭＳＵＤマウスを、成長をサポートし、生存を延長するために、ロイシン不含マウス固形飼料と飲料水に補充されたロイシン（５．７５ｇロイシン／Ｌ）とで維持した。少なくとも２月齢でＢＷ２０ｇの動物を実験のために使用した。動物を、投薬前に終夜絶食させた（約１５時間）。それぞれの投薬日に、１００ｍＬ／動物の総体積のために水で製剤化された４５ｍｇのホエイタンパク質粉末（ＢＮ Ｌａｂｓ Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ；９．１４％ロイシン）を、強制経口によって与えた。ホエイタンパク質懸濁液の直後に、媒体（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．４ｍＭのピリドキサールリン酸、ｐＨ７．２）または適当なＬＤＣバリアントのいずれかを、５ｍＬ／ｋｇで与えた。血液試料を、摂食の１５分前、ならびに摂食の１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、および２４０分後に得た。試料を、抗凝固剤のＫ２ＥＤＴＡを含有する管に移し、処理を待つ間、湿った氷上に置き、２５００ｒｐｍ、およそ４℃で１０分間遠心分離した。得られた血漿を回収し、分析まで凍結保存した（≦－６０℃）。血漿ロイシンを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して定量化して、有効性を評価した。血漿ロイシンの著しい増加が、摂取前のベースラインと比較して、食事チャレンジ単独で観察された。すべてのＬＤＣバリアントは、ホエイタンパク質食事チャレンジに応答して、血漿ロイシンの著しい抑制をもたらした。配列番号４８４および配列番号６８６は、類似の有効性を実証したが、配列番号７６６は、優れた有効性をもたらした。表１３－１は、媒体と比較した処置によるｉＡＵＣ血漿ロイシンの低減パーセントをまとめる。ｉＡＵＣは、それぞれの動物についてのそれぞれの摂食後の時点から摂食前のロイシン値（絶食バックグラウンド）を最初に減算し、次いで、ＡＵＣ計算を行うことによって報告した。統計的計算および有意性をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して決定した。
Figure 2023512683000026
本発明を、具体的な実施形態を参照して記載したが、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスの１つまたは複数のステップに適合するように、さまざまな変更を行うことができ、等価物を置換することができ、それによって、特許請求の範囲に記載された範囲から逸脱することなく、本発明の利益を達成することができる。
米国におけるすべての目的のために、本開示に引用されたありとあらゆる刊行物および特許文献は、そのような刊行物または文献のそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれることが具体的および個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文献の引用は、任意のそのような文献が関連する先行技術であることを示すものとしても、またはその内容もしくは日付に関する自白を構成するものとしても、意図するものはない。

Claims (62)

  1. 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６の少なくとも１つに対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドであって、前記アミノ酸配列のアミノ酸位置が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６のアミノ酸配列を参照して番号付けられている、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  3. 前記ポリペプチド配列が、配列番号４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  4. 前記ポリペプチド配列が、配列番号６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  5. 前記ポリペプチド配列が、配列番号８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  6. 前記ポリペプチド配列が、配列番号１０に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  7. 前記ポリペプチド配列が、配列番号１４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  8. 前記ポリペプチド配列が、配列番号１２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドの前記ポリペプチド配列が、５、１４、１４／３４／３８／３９／１０２／２６７／２７５／３５０／３５７、１４／３９／１０２／１２７／２４５／２６７／２７５／３４９／３５０、３４／３８／３９／１０２／１２７／２７５／３５７、３４／３８／３９／１０２／２７５／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３４９／３５０／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３５０／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２７５／３４９／３５７、３４／３９／１０２／２６４／２７５／３５０／３５７、３４／３９／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６４／２６７／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６７／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３５０、３８／３９／１０２／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／２４５／２６７／３５７、３８／３９／１２７／２６４／２７５、３８／３９／１２７／２６４／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５７、３８／３９／２４５／２７５／３５７、３８／３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３８／３９／２６４／２７５／３５７、３８／３９／２７５、３８／３９／２７５／３５０、３９、３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６７／２７５／３５７、３９／１２７／２４５／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／１２７／２４５／２６４／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２４５／３５７、３９／１２７／２６７／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２６７／３５０／３５７、３９／１２７／３５７、３９／２４５／２６４／２６７／２７５／３５７、３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／２７５／３５０／３５７、４８、１３９、１６４、１９６、２５５、２９９、３１８、３２４、３３９、３４３、３５０、３５３、３５７、３６４、３６５、３７９、３８１、３８６、３８９、３９１、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、および４０５位から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号１２を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  9. 前記ポリペプチド配列が、配列番号３８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドの前記ポリペプチド配列が、４８／６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、４８／６４／１６４／３２４／３４３／３６４、４８／６４／１６４／３５３／３５７／３６４、４８／６４／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５７／３６４、６４／１６４／３５３／３５７、６４／３１８／３２４／３５７／３６４、６４／３２４／３５３／３５７／３６４、１３２／２５５／３３９／３７９／３９５、１６４／１９６／３２４／３５７／３６４、１６４／３１８／３２４／３４３／３５３／３５７、１６４／３１８／３２４／３５７／３６４、１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、１６４／３２４／３５７／３６４、１６４／３５３／３５７／３６４、１６４／３６４、１９６／３１８／３２４／３５３／３５７／３６４、３１８／３４３／３５７、３２４／３４３／３５７／３６４、３２４／３５３／３５７／３６４、３２４／３５７／３６４、３３９／３７９／３８９／３９４／３９５、３３９／３８９／３９５、３３９／３９１、３３９／３９４／３９５／４０５、３５７／３６４、３７９／３８６、３７９／３９４／３９５／３９７／４０４／４０５、３７９／３９４／３９５／３９７／４０５、３８９／３９４／３９５／３９７／４０５、および３９４／３９７位から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号３８を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  10. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２３４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドの前記ポリペプチド配列が、２、３、３３、４８／６４／２５５、４８／２５５／３３９、４８／２５５／３７９、６４、６４／２５５、６９、１６１、１９３、２５５、２５５／３１８／３７９、２５９、２６３、３１８／３３９／３７９、３２４、３２４／３８９／３９４、３２４／３８９／３９４／３９５、３２４／３８９／３９４／３９７、３２４／３９４、３２４／３９４／３９５、３２４／３９４／３９５／３９７、３２４／３９５、３３９、３４０、３８０、３８２、３８９、３８９／３９４、３８９／３９４／３９５、３８９／３９４／３９５／３９７、３８９／３９４／３９７、３８９／３９５、３８９／３９７、３９０、３９４、３９４／３９５、３９４／３９５／３９７、３９５、３９５／３９７、３９７、４０１、および４０５位から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２３４を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  11. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２８４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドの前記ポリペプチド配列が、２／６４／６９／３２４／３８０／３８２／３８８／３８９、３／６４／６９／２６３／３３９／３８０／３８８、３／６４／６９／３８９、３／６４／６９／３９０、３／６４／３７９／３８０／３９０、３／６９／２６３／３８０、３／６９／３２４、３／６９／３２４／３８０／３８２／３８９／３９０、１２／１３５／２５９／２６３、１２／１３５／２６３／３８２、１２／２５９／２６３／３０４、４８／６４／２５５、６４／６９、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、６４／６９／２２３／３８８、６４／６９／２２３／３８８／３８９／３９０、６４／６９／３０４／３７９／３８２、６４／６９／３２４、６４／６９／３２４／３３９／３８０／３８９／３９０、６４／６９／３３９、６４／６９／３３９／３８２／３８８／３８９、６４／６９／３３９／３８９／３９０、６４／６９／３７９／３８０、６４／６９／３８０／３８８／３９０、６４／６９／３８９、６４／６９／３９０、６４／２５５／２６３、６４／２６３、６４／３２４／３３９／３８９／３９０、６９／２２３／２６３／３２４／３８２／３８８／３９０、６９／２２３／３２４／３７９／３８０／３８２／３８８／３９０、６９／２６３、６９／２６３／３２４、６９／２６３／３３９、６９／２６３／３８８、６９／２６３／３８９／３９０、６９／３２４／３７９／３８０／３８８、６９／３２４／３８０、６９／３３９／３９０、６９／３８２／３９０、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、２６３／３３９／３８９／３９０、２６３／３９０、および３０４／３４０／３７９／３８０／３８２位から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２８４を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  12. 前記ポリペプチド配列が、配列番号４８４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドの前記ポリペプチド配列が、３／１９４／３０４、３／２５９／２６３／３０４、３／２５９／３０４、３／２５９／３０４／３２４／３３９、３／２５９／３０４／３２４／３８２、３／２５９／３０４／３８２、３／２６３／３０４／３２４、３／２６３／３０４／３２４／３３９、３／２６３／３０４／３２４／３８２、３／３０４、３／３０４／３２４、１６、６３、７７、８０、８７／２７０、８７／２７０／３６５、８７／３２８／３６５、９１、９２、１２６、１４０、１５６、１６８／２７０／３２８／３３８、１８１、１９４、２０１、２５６、２５９、２５９／２６３、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３２４、２５９／２６３／３０４／３２４／３８２、２５９／２６３／３０４／３７９、２５９／２６３／３０４／３８２、２５９／３０４、２５９／３０４／３２４、２５９／３０４／３２４／３３９、２５９／３０４／３２４／３３９／３８２、２５９／３０４／３８２、２６２、２６３／３０４、２６３／３０４／３２４、２６３／３０４／３２４／３３９、２６３／３０４／３２４／３８２、２６３／３２４、２７０、２７０／３１９、２７０／３２８／３３８、２７０／３２８／３３８／３６５、３０４、３０４／３２４、３２４、３２８、３５２、３６５、３６６、および３８２位から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号４８４を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  13. 前記ポリペプチド配列が、配列番号５９４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドの前記ポリペプチド配列が、１６／６３／８０／１２６／１６８／３６６、１６／６３／８０／１２６／１８１／１９４／２５９／３２４／３２８／３６６、１６／６３／１２６／１６８／２７０／３２８／３６６、１６／８０／１２６／３２４／３６６、１６／８０／１２６／３６６、１６／８０／１６８、１６／８０／１６８／２７０／３６６、１６／８０／１６８／３２４、１６／８０／１６８／３６６、１６／８０／３２４、１６／９１／１２６／１６８／３２４／３６６、１６／１２６／１６８／３６６、１６／１６８／２５９／３６６、１６／１６８／２７０／３２４／３６６、１６／１６８／３２４／３２８／３６６、１６／１６８／３２４／３６６、１６／１６８／３６６、１６／２５９／２６３／３２８、１６／３２４／３２８／３６６、１６／３２８／３６６、８０／１２６／１６８／２７０／３６６、８０／１２６／１６８／３６６、８０／１２６／１８１／２７０／３２４／３６６、８０／１６８／２７０／３６６、および１６８／３６６位から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号５９４を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  14. 前記ポリペプチド配列が、配列番号６８６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドの前記ポリペプチド配列が、６６／７６／１１８／１４１／２０１／３００、６６／７６／１９８／２００／２９６／３０３、６６／７６／１９８／２００／３００、６６／１１８／２００／２９６／３０３／３１７、６６／１１８／２９６、６６／１１８／２９６／３００、６６／２００、７６／１１８／１４１／２００／２９６、７６／１４１／１９８／２００／２０１／３００、８０／２０１／２７０、８０／２７０、８０／２７０／３２４、８９／１１８／２００、１０６／２７０／３２４／３５２、１１８／１４１／２００、１２６、１２６／２０１／２７０／３２４、１２６／２７０、１４１／１４４／１９８／２００／３００、１５６／２７０、１５６／２７０／３２４、２０１／２７０、２０１／２７０／３５２、２７０、および２７０／３２４位から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号６８６を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  15. 前記ポリペプチド配列が、配列番号６８６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドの前記ポリペプチド配列が、１９、１０９、１２３、１３４、１７０、１７３、１８７、２１１、および３１２位から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号６８６を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  16. 前記ポリペプチド配列が、配列番号６８８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドの前記ポリペプチド配列が、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２００／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２１１、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１７０／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１９８／２００／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１７０／１７３／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／２１１／２７０／３１２、１０９／１７０／２１１／２７０／３１２、および１０９／２１１／２７０／３１２位から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号６８８を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  17. 前記ポリペプチド配列が、配列番号７６６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドの前記ポリペプチド配列が、５／４１、５／４１／２２８、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１２６、２６５、２６７、２７０、３３１、３５３、３５７、および３８４位から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号７６６を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  18. 前記ポリペプチド配列が、配列番号７６６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドの前記ポリペプチド配列が、６６、６６／１１８、６６／１１８／２９６、６６／１１８／２９６／３００、６６／１１８／３００、６６／２９６、６６／２９６／３００、６６／３００、１１８、１１８／２９６、１１８／２９６／３００、１１８／３００、２９６、２９６／３００、および３００位から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号７６６を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  19. 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  20. 請求項１～１９のいずれかに提供される操作されたポリペプチドを含む、操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  21. 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、および／または７６６に対して、少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  22. 表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、および／または１１－２のいずれかに提供されるバリアントロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドである、請求項１～１８のいずれかに記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  23. Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅのバリアント酵素である、請求項１～２２のいずれかに記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  24. 野生型Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ種のロイシンデカルボキシラーゼよりもロイシンに対してより高い活性を示す、請求項１～２３のいずれかに記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  25. 野生型Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ種のロイシンデカルボキシラーゼよりもタンパク質分解に対してより高い抵抗性である、請求項１～２４のいずれかに記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  26. 野生型Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ種のロイシンデカルボキシラーゼよりも高い熱安定性である、請求項１～２５のいずれかに記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  27. 配列番号１６～８５２の偶数の配列のいずれかに対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高く同一の配列を含む、請求項１～２６のいずれかに記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  28. 配列番号１６～８５２の偶数の配列のいずれかに対して、少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２７に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  29. 配列番号１６～８５２の偶数の配列のいずれかを含む、請求項２８に記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  30. 精製されている、請求項１～２９のいずれかに記載の操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチド。
  31. 請求項１～３０のいずれかに提供される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを含む組成物。
  32. 請求項１～３１のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド配列。
  33. 配列番号１５～８５１の奇数の配列のいずれかに対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高く同一の配列を含む、請求項３２に記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
  34. 配列番号１５～８５１の奇数の配列のいずれかに対して、少なくとも９０％またはそれよりも高く同一の配列を含む、請求項３２に記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
  35. 配列番号１５～８５１の奇数の配列のいずれかを含む、請求項３２に記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
  36. 制御配列に作動可能に連結されている、請求項３２～３５のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
  37. 前記ポリヌクレオチドが、コドン最適化されている、請求項３２～３６のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
  38. 請求項３２～３７のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチド配列、および少なくとも１つの制御配列を含む発現ベクター。
  39. 前記制御配列が、プロモーターを含む、請求項３８に記載の発現ベクター。
  40. 前記プロモーターが、異種プロモーターである、請求項３９に記載の発現ベクター。
  41. 請求項３２～３７のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞、および／または請求項３８～４０のいずれかに記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  42. Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項４１に記載の宿主細胞。
  43. 宿主細胞において操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを産生する方法であって、請求項１～３０のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／または請求項３２～３７のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および／または請求項３８～４０のいずれかに記載の少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドが産生するような適切な培養条件下で培養するステップを含む、方法。
  44. 請求項１～３０のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドが産生するような適切な培養条件下で培養するステップを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを培養物および／または宿主細胞から回収するステップをさらに含む、請求項４３および／または４４に記載の方法。
  46. 前記少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを精製するステップをさらに含む、請求項４３～４５のいずれかに記載の方法。
  47. 請求項３２～３７のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含む組成物。
  48. 医薬組成物である、請求項４７に記載の組成物。
  49. 少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または担体をさらに含む、請求項４８に記載の組成物。
  50. メープルシロップ尿症の処置のために適切である、請求項３１、４８および４９のいずれかに記載の組成物。
  51. ヒトへの経口投与のために適切である、請求項３１および４７～５０のいずれかに記載の組成物。
  52. 丸剤、錠剤、カプセル剤、ジェルキャップ、液剤または乳剤の形態である、請求項３１および４７～５１のいずれかに記載の組成物。
  53. 前記丸剤、錠剤、カプセル剤、またはジェルキャップが、腸溶コーティングをさらに含む、請求項５２に記載の組成物。
  54. ヒトへの非経口注射のために適切である、請求項３１および４７～５２のいずれかに記載の組成物。
  55. 少なくとも１つの追加の治療的に有効な化合物と共投与される、請求項３１および４７～５４のいずれかに記載の組成物。
  56. 少なくとも１つの追加の治療的に有効な化合物を含む、請求項５５に記載の組成物。
  57. 対象におけるメープルシロップ尿症の症状を処置および／または予防するための方法であって、メープルシロップ尿症を有する対象を提供するステップ、ならびに請求項３１および４７～５６のいずれかに記載の組成物を前記対象に提供するステップを含む方法。
  58. メープルシロップ尿症の前記症状が、回復する、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記対象が、請求項１～３０に記載される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを含む少なくとも１つの組成物が提供されていない対象によって必要とされる飲食物よりも、イソロイシン、ロイシンおよび／またはバリン含有量が少なく制限されている飲食物を食べることが可能である、請求項５７および／または５８に記載の方法。
  60. 前記対象が、請求項４３～４６に記載される方法を使用して産生される少なくとも１つの操作されたロイシンデカルボキシラーゼポリペプチドを含む少なくとも１つの組成物が提供されていない対象によって必要とされる飲食物よりも、イソロイシン、ロイシンおよび／またはバリン含有量が少なく制限されている飲食物を食べることが可能である、請求項５７～５９のいずれかに記載の方法。
  61. 前記対象が、乳児、小児、若年成人または成人である、請求項５７～６０のいずれかに記載の方法。
  62. 請求項３１および／または４７～５６のいずれかに提供される組成物の使用。

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