JP2023510961A - マイクロ流体ビーズトラッピング装置および次世代配列決定ライブラリ調製のための方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、１つ以上の独立して動作可能な処理導管を有するマイクロ流体チップを含む自動化システムに関する。いくつかの実施形態では、自動化システムは、配列決定の前に行われる試料浄化および／または標的濃縮プロセスなどの試料浄化および／または標的濃縮プロセスにおける使用に適している。

Description

開示の背景
マイクロ流体システムは、非常に少量の液体を使用して化学的および生物学的情報を取得および分析するために重要な価値がある。マイクロ流体は、マイクロメータスケールチャネルを利用して少量の流体試料を操作および処理するシステムとして広く定義されることができる。マイクロ流体システムの使用は、反応の応答時間を増加させ、試料体積を最小にし、試薬および消耗品の消費を低減することができる。マイクロ流体体積内で反応を行うことはまた、揮発性または有害物質が使用または生成されるときに安全性を高め、廃棄量を減少させる。そのようなマイクロ流体デバイスは、例えば、医療診断、ゲノム分析、ＤＮＡ法医学、および「ラボオンチップ」化学分析器に使用される。それらは、フォトリソグラフィなどの一般的な微細加工技術を使用して製造されることができる。

マイクロ流体粒子分離は、不純または複雑な試料からの標的粒子の捕捉、単離、および収集を伴い、細胞生物学、創薬、および臨床診断における細胞の選別、精製、濃縮、および検出に広く使用されている。磁気活性化分離を含む、マイクロ流体プラットフォーム上での粒子分離のためのいくつかの方法が現在存在する。例えば、磁気制御に基づく方法は、特異的結合によって標的粒子を捕捉し、次いで磁気操作によって標的粒子を分離するために表面官能化磁気ビーズを利用する。この分離スキームは、粒子の幾何学的または物理的特性ではなく化学結合の相互作用に依存しており、したがって非常に特異的且つ選択的な粒子分離を可能にする。

一般に、磁気ベースのマイクロ流体粒子分離のための２つの動作モード、すなわち、バッチモードおよび連続フローモードがある。バッチモードでは、液相で非標的粒子を除去した後、標的結合磁気ビーズが固体表面に保持され、続いて放出される。磁気ビーズ床およびふるいは、例えば、この目的のために開発されたが、分離効率が限られている。いくつかの装置は、４重電磁石、平面電磁石、ニッケルポストなどを含む様々な磁石設計によってこの問題に対処しようと試みてきた。さらに、平面電磁石は、流体作動および粒子混合などの完全に自動化された機能を可能にするために、マイクロバルブおよびマイクロポンプとオンチップで一体化されることができる。残念なことに、バッチモード設計は、長時間の動作、複雑な流体ハンドリング、および最も重要なことには、ビーズに捕捉された不純物の非特異的捕捉による著しい汚染を含む、いくつかの固有の制限を被る。

開示の簡単な概要
本開示は、入力試料内の核酸などの標的分子を精製するための１つ以上の独立して動作可能な処理導管を含むマイクロ流体デバイスであって、処理導管がいかなる機械的に移動する構成要素も含まない、マイクロ流体デバイスに関する。さらに、本開示のマイクロ流体デバイスおよび処理導管は、磁気分離技術に依存しない。さらに、本開示のマイクロ流体デバイスは、機械的に移動する部品を使用するマイクロ流体デバイスと比較して複雑さが低減されている。さらに、本開示のマイクロ流体デバイスは、試料の汚染を軽減する閉鎖システムを使用する。さらに、本開示のマイクロ流体デバイスの独立して動作可能な処理導管の設計を考慮すると、ビーズ損失、したがって標的分子損失が有利に軽減される。これらおよび他の利点は、本明細書に記載されている。

本開示の第１の態様は、複数のビーズを含むチャンバを有する処理導管であって、チャンバの壁の第１の部分が、入口チャネルと流体連通する第１の開口部を含み、チャンバの壁の第２の部分が、出口チャネルと流体連通する第２の開口部を含み、チャンバの壁の第３の部分は、ダクトと流体連通するダクト開口部を含む、処理導管を含み、第１の開口部および第２の開口部が、チャンバ内の複数のビーズの平均直径よりも小さく、ダクト開口部が、チャンバ内の複数のビーズの平均直径よりも大きい、マイクロ流体チップである。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、機械的に移動する部品を備えない。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、非磁性材料から構成される。いくつかの実施形態では、複数のビーズは、非磁性ビーズである。

いくつかの実施形態では、チャンバは、約０．１μＬから約５ｍＬの間の範囲の体積を含む。いくつかの実施形態では、体積は、約０．１ｍＬから約１ｍＬの間の範囲である。いくつかの実施形態では、チャンバは、１つのポストから約１００万個のポストを備える。いくつかの実施形態では、ポストは、チャンバの天井または床のいずれかから延在する。いくつかの実施形態では、ポストは、チャンバの天井と床とを橋渡しする。いくつかの実施形態では、少なくとも入口チャネルは、１から約１００万個のポストを備える。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、１つの処理導管を備える。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、２から５０個の独立して動作可能な処理導管を備える。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、２から２０個の独立して動作可能な処理導管を備える。

本開示の第２の態様は、２つ以上のチャンバを有する処理導管であって、２つ以上のチャンバのうちの任意の２つの隣接するチャンバが、移送チャネルを介して互いに流体的に結合され、２つ以上のチャンバのうちの少なくとも１つが、複数のビーズを含む、処理導管を含み、２つ以上のチャンバのうちの第１のチャンバの壁の一部が、入口チャネルと流体連通する第１の開口部を含み、２つ以上のチャンバのうちの第２のチャンバの壁の一部が、出口チャネルと流体連通する第２の開口部を備え、２つ以上のチャンバのうちの少なくとも１つが、ダクトと流体連通するダクト開口部を備え、第１の開口部および第２の開口部が、２つ以上のチャンバのうちの少なくとも１つの内部の複数のビーズの平均直径よりも小さく、ダクト開口部が、２つ以上のチャンバのうちの少なくとも１つの内部の複数のビーズの平均直径よりも大きい、マイクロ流体チップである。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、機械的に移動する部品を備えない。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、非磁性材料から構成される。いくつかの実施形態では、複数のビーズは、非磁性ビーズである。

いくつかの実施形態では、移送導管は、蛇行形状を備える。いくつかの実施形態では、移送チャネルは、複数のビーズの平均直径よりも大きい断面の高さおよび幅を有する。いくつかの実施形態では、複数のビーズは、移送導管を通って流動可能である。

いくつかの実施形態では、処理導管は、２つのチャンバを含む。いくつかの実施形態では、２つのチャンバは、蛇行チャネルを介して互いに流体的に結合される。いくつかの実施形態では、複数のビーズは、蛇行移送チャネルを通って第１のチャンバから第２のチャンバに流動可能である。

いくつかの実施形態では、処理導管は、３つのチャンバを含む。いくつかの実施形態では、３つのチャンバのうちの第１のチャンバは、入口チャネルに流体的に結合され、３つのチャンバのうちの中央（第２のチャンバ）は、２つの移送チャネルを介して第１のチャンバおよび第３のチャンバのそれぞれに流体的に結合され、第３のチャンバは、出口チャネルに流体的に結合される。

いくつかの実施形態では、２つ以上のチャンバは、それぞれ、１から約１００万個のポストを備える。いくつかの実施形態では、ポストは、チャンバの天井または床のいずれかから延在する。いくつかの実施形態では、少なくとも入口チャネルは、１から約１００万個のポストを備える。いくつかの実施形態では、２つ以上のチャンバは、それぞれ、約０．１μＬから約５ｍＬの間の範囲の体積を含む。いくつかの実施形態では、体積は、約０．１ｍＬから約１ｍＬの間の範囲である。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、１つの処理導管を備える。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、２から５０個の独立して動作可能な処理導管を備える。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、２から２０個の独立して動作可能な処理導管を備える。

本開示の第３の態様は、配列決定のための標的核酸配列の集団を得る方法であって、（ａ）得られたゲノム試料を断片化して核酸断片の集団を提供することと、（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブのプールを核酸断片の集団に導入して標的－プローブ複合体を形成することであって、オリゴヌクレオチドプローブのプールが、核酸断片の集団内の相補的核酸配列にハイブリダイズすることができる参照核酸配列を含み、オリゴヌクレオチドプローブが、一対の特異的結合体の第１のメンバーを含む、オリゴヌクレオチドプローブのプールを核酸断片の集団に導入して標的－プローブ複合体を形成することと、（ｃ）形成された標的－プローブ複合体を含む溶液をマイクロ流体チップの処理導管に流すことであって、処理導管が複数のビーズを含むチャンバを備え、複数のビーズが一対の特異的結合体の第２のメンバーによって官能化される、形成された標的－プローブ複合体を含む溶液をマイクロ流体チップの処理導管に流すことと、（ｄ）オフターゲット断片を除去するために処理導管を介して少なくとも１つの緩衝液を流すことと、（ｅ）少なくとも１つの試薬を処理導管に流して、標的核酸配列を得ることと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、第１の部分は、ビオチンである。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ストレプトアビジンである。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの緩衝液を流すことは、少なくとも２回連続して繰り返される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの緩衝液を流すことは、少なくとも３回連続して繰り返される。いくつかの実施形態では、順次流される各緩衝液は同じである。いくつかの実施形態では、順次流される各緩衝液は異なる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの試薬は、約８０℃から約１０５℃の間の範囲の温度を有する緩衝液である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの試薬は緩衝液であり、処理導管は、約９０℃から約１００℃の間の範囲の温度に加熱される。いくつかの実施形態では、試薬は酵素である。

いくつかの実施形態では、本方法は、得られたゲノム試料の断片化後に、アダプタを核酸断片の集団にライゲーションすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、標的核酸配列の集団を配列決定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、複数のビーズは、非磁性ビーズである。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、機械的に移動する部品を備えない。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、非磁性材料から構成される。

本開示の第４の態様では、配列決定のための標的核酸配列の集団を得る方法であって、（ａ）オリゴヌクレオチドプローブのプールを得られたゲノム試料に導入して標的－プローブ複合体を形成することであって、オリゴヌクレオチドプローブのプールが、得られたゲノム試料内の相補的核酸配列にハイブリダイズすることができる参照核酸配列を含み、オリゴヌクレオチドプローブが、一対の特異的結合体の第１のメンバーを含む、オリゴヌクレオチドプローブのプールを得られたゲノム試料に導入して標的－プローブ複合体を形成することと、（ｂ）形成された標的－プローブ複合体を含む溶液をマイクロ流体チップの処理導管に流すことであって、処理導管が複数のビーズを含むチャンバを備え、複数のビーズが一対の特異的結合体の第２のメンバーによって官能化される、形成された標的－プローブ複合体を含む溶液をマイクロ流体チップの処理導管に流すことと、（ｃ）オフターゲット核酸を除去するために前記処理導管を介して少なくとも１つの流体を流すことと、（ｄ）少なくとも１つの試薬を前記処理導管に流して、前記標的核酸配列を得ることと、を含む、方法。

いくつかの実施形態では、第１の部分は、ビオチンである。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ストレプトアビジンである。

いくつかの実施形態では、得られたゲノム試料は、哺乳動物対象、例えばヒト対象に由来する試料である。いくつかの実施形態では、得られたゲノム試料は、哺乳動物対象、例えばヒト対象から得られた血液試料または血漿試料である。いくつかの実施形態では、得られたゲノム試料は、無細胞核酸（例えば、約１８０ｂｐから約１５０ｂｐの間の範囲のサイズを有する）の形態である。いくつかの実施形態では、無細胞核酸の形態の得られたゲノム試料は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、オリゴヌクレオチドプローブプールの導入前に、得られたゲノム試料を断片化することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの流体を流すことは、少なくとも２回連続して繰り返される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの流体を流すことは、少なくとも３回連続して繰り返される。いくつかの実施形態では、順次流される各流体は同じである。いくつかの実施形態では、順次流される各流体は異なる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの流体は、緩衝液である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの試薬は、ウラシル特異的切除試薬酵素である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの試薬は、約８０℃から約１０５℃の間の範囲の温度を有する緩衝液である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの試薬は緩衝液であり、処理導管は、約９０℃から約１００℃の間の範囲の温度に加熱される。いくつかの実施形態では、試薬は酵素である。

いくつかの実施形態では、複数のビーズは、非磁性ビーズである。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、機械的に移動する部品を備えない。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、非磁性材料から構成される。

本開示の特徴の一般的な理解のために、図面を参照する。図面では、同一の要素を特定するために、全体を通して同様の参照符号が使用されている。

本開示の一実施形態にかかる、流体モジュールと連通するマイクロ流体チップおよび制御システムを含むシステムを示している。 本開示の一実施形態にかかる、流体モジュールと連通する複数の独立して動作可能な処理導管を含むマイクロ流体チップと、制御システムとを含むシステムを示している。 本開示の一実施形態にかかる、処理導管を含むマイクロ流体チップであって、処理導管が、ポンプ、複数の流体および／または試薬リザーバ、廃液／試薬容器、標的収集容器、および１つ以上の導管と流体連通している、マイクロ流体チップを含むシステムを示している。 本開示の一実施形態にかかる、積層構成の複数の独立して動作可能な処理導管を有するマイクロ流体チップを示している。 本開示の一実施形態にかかる、２つのポンプおよび複数の流体および／または試薬リザーバと流体連通するマイクロ流体チップを含むシステムを示している。 本開示の一実施形態にかかる、流体入口および流体出口に流体結合されたチャンバを有する処理導管の平面図である。 本開示の一実施形態にかかる、少なくともチャンバが１つ以上のポストを含む、流体入口および流体出口に流体結合されたチャンバを有する処理導管の平面図である。 図２Ａの処理導管の側断面図である。 図２Ｄは、本開示の一実施形態にかかる、流体入口および流体出口に流体結合されたチャンバを有する処理導管の側面図である。図２Ｅは、図２Ｄの処理導管のチャンバの拡大図である。 本開示の一実施形態にかかる、流体の流れを可能にする開口部を有するチャンバ壁の側断面図である。 複数のビーズを含むチャンバを有するマイクロ流体チップの側断面図を示しており、ビーズは、チャンバの１つ以上の壁内の１つ以上の開口部よりも大きい直径を有する。 本開示の一実施形態にかかる、チャンバ天井および／またはチャンバ床のうちの１つから延在する１つ以上のポストを有する処理導管のチャンバの断面図である。 本開示の一実施形態にかかる、チャンバ天井とチャンバ床とを橋渡しする１つ以上のポストを有する処理導管のチャンバの断面図である。 本開示の一実施形態にかかる、流体入口および流体出口に流体結合されたチャンバを有する処理導管を示している。 本開示の一実施形態にかかる、少なくともチャンバが１つ以上のポストを含む、流体入口および流体出口に流体結合されたチャンバを有する処理導管を示している。 本開示の一実施形態にかかる、流体入口および流体出口に流体結合されたチャンバを有する処理導管を示している。 本開示の一実施形態にかかる、少なくともチャンバが１つ以上のポストを含む、流体入口および流体出口に流体結合されたチャンバを有する処理導管を示している。 図４Ａの処理導管の側断面図である。 本開示の一実施形態にかかる、移送チャネルを介して互いに流体的に結合された２つのチャンバを有する処理導管を示しており、２つのチャンバは、流体入口および流体出口と流体連通している。 図５Ａのマイクロ流体チップの側断面図を示している。 本開示の一実施形態にかかる、蛇行移送チャネルを介して互いに流体的に結合された２つのチャンバを有する処理導管を示しており、２つのチャンバは、流体入口および流体出口と流体連通している。 図６Ａのマイクロ流体チップの側断面図を示している。 複数の独立して動作可能な処理導管を含むマイクロ流体チップを示しており、各処理導管は、流体入口および流体出口と流体連通している。 複数の独立して動作可能な処理導管を含むマイクロ流体チップを示しており、各処理導管は、流体入口および流体出口と流体連通しており、処理導管の少なくともチャンバは、本開示の一実施形態にかかる１つ以上のポストを含むものとして示されている。 複数の独立して動作可能な処理導管を含むマイクロ流体チップを示しており、各処理導管は、流体入口および流体出口と流体連通しており、処理導管の少なくともチャンバは、本開示の一実施形態にかかる１つ以上のポストを含むものとして示されている。 複数の独立して動作可能な処理導管を含むマイクロ流体チップを示しており、各処理導管は、２つのチャンバを含み、２つのチャンバは、蛇行移送チャネルを介して互いに流体的に結合されている。 本開示のマイクロ流体デバイスを使用して１つ以上の種類の分子を精製する方法を提供するフローチャートを示している。 本開示のマイクロ流体デバイスを使用して１つ以上の種類の分子を精製する方法を提供するフローチャートを示している。 本開示の一実施形態にかかる、標的分子によって溶液を濃縮する方法を示すフローチャートを示している。 本開示のマイクロ流体デバイスを通って流れた後に収集された流体の電気泳動図を提供している。 ビオチン化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした標的分子のビーズ捕捉および温度媒介放出の方法を示している。 流体がマイクロ流体デバイスを通って流れたとき（ＦＴ）、１つ以上の洗浄溶液がマイクロ流体デバイスを通って流れた後（Ｗ）、および溶離液が収集された後（Ｅ）の（定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＯＣＲ）によって決定された）回収された標的の量を示している。 ウラシル結合ビオチン化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした標的分子のビーズ捕捉および酵素放出の方法を示している。 流体がマイクロ流体デバイスを通って流れたとき（ＦＴ）、１つ以上の洗浄溶液がマイクロ流体デバイスを通って流れた後（Ｗ）、および溶離液が収集された後（Ｅ）に回収された（ｑＰＣＲによって決定された）標的の量を示している。

詳細な説明
反対に明確に示されない限り、複数のステップまたは行為を含む本明細書において特許請求の範囲に記載される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が記載される順序に限定されないことも理解されたい。

本明細書における「一実施形態、」、「実施形態、」、「例示的な実施形態」などへの言及は、記載された実施形態が特定の特徴、構造、または特性を含むことができることを示すが、全ての実施形態は、その特定の特徴、構造、または特性を含んでも必ずしも含まなくてもよい。さらに、そのような句は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性が実施形態に関連して記載されている場合、明示的に記載されているか否かにかかわらず、他の実施形態に関連してそのような特徴、構造、または特性に影響を及ぼすことは、当業者の知識の範囲内であると考えられる。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という単語は、文脈が別途明確に指示しない限り、「および」を含むことを意図している。「含む」という用語は、「ＡまたはＢを含む」がＡ、Ｂ、またはＡおよびＢを含むことを意味するように、包括的に定義される。

ここで明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有することを理解されたい。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は、包括的であり、例えば、少なくとも１つまたは複数の数または要素のリストを含み、必要に応じて追加のリストに記載されていない項目を含むと解釈される。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」など、反対に明確に示される用語のみは、数または要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、特許請求の範囲で使用される場合、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」「から本質的になる」など、排他的な用語が先行する場合にのみ、排他的な代替案（例えば、「一方または他方であるが双方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとし、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。

「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などの用語は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」などは、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、各用語は、「備える」という一般的な米国特許法の定義と一致して定義されているため、「少なくとも以下」を意味するオープンな用語として解釈され、また、追加の特徴、限定事項、態様などを除外しないように解釈される。したがって、例えば、「構成要素ａ、ｂ、およびｃを有する装置」は、装置が少なくとも構成要素ａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。同様に、句：「ステップａ、ｂ、およびｃを含む方法」は、その方法が少なくともステップａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。さらに、ステップおよびプロセスは、本明細書において特定の順序で概説されることができるが、当業者は、順序付けのステップおよびプロセスが変化し得ることを認識するであろう。

ここで明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という句は、要素のリストの任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的にリスト化されているありとあらゆる要素の少なくとも１つを含まなくてもなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外するものではない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定されるそれらの要素に関連するかどうかにかかわらず、必要に応じて存在することができることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（および必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）を指すことができ、別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない（および必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）を指すことができ、さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて２つ以上のＡを含み、少なくとも１つ、必要に応じて２つ以上のＢを含む（および必要に応じて、他の要素を含む）を指すことができるなどである。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、所望の生物学的活性または結合活性を示す任意の形態の抗体を指す。したがって、それは最も広い意味で使用され、具体的には、限定されないが、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化完全ヒト抗体、キメラ抗体およびラクダ化単一ドメイン抗体を包含する。

本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体分子またはＴ細胞受容体などの特異的体液性または細胞性免疫の産物によって特異的に結合されることができる化合物、組成物または物質を指す。抗原は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝産物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質、およびホルモン、ならびに複合炭水化物（例えば、多糖類）、リン脂質、およびタンパク質などの高分子を含む任意の種類の分子とすることができる。

本明細書で使用される場合、「チャネル」という用語は、流体が流れることができるマイクロ流体チップ内の密閉された通路を指す。チャネルは、流体を導入するための１つ以上の開口部を有することができる。各チャネルは、コーティング、例えば親水性または疎水性コーティングを含むことができる。

本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、より大きな構築物に共有結合している２つ以上の分子（および／またはナノ粒子などの材料）を指す。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、１つ以上の他の分子、例えば１つ以上の他の生体分子に共有結合した１つ以上の生体分子（例えば、ペプチド、タンパク質、酵素、糖、多糖、脂質、糖タンパク質、およびリポタンパク質など）を含む。

本明細書で使用される場合、「濃縮」という用語は、処理前の試料中に最初に存在する分子の総量に対する試料中の分子、例えば核酸分子の集団の相対的存在量を増加させるプロセスを指す。したがって、濃縮ステップは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応などの増幅方法としての目的の核酸配列のコピー数を直接増加させるのではなく、パーセンテージまたは僅かな増加を提供する。

本明細書で使用される場合、「流体」という用語は、水、溶媒、緩衝液、溶液（例えば、極性溶媒、非極性溶媒）、および／または混合物を含む任意の液体または液体組成物を指す。流体は、水性または非水性であってもよい。流体の非限定的な例は、洗浄液、すすぎ溶液、酸性溶液、アルカリ性溶液、移送溶液、および炭化水素（例えば、アルカン、イソアルカンおよび芳香族化合物、例えばキシレン）を含む。

いくつかの実施形態では、洗浄液は、スライドの検体を有する表面上への洗浄液の拡散を容易にするための界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、酸性溶液は、脱イオン水、酸（例えば、酢酸）、および溶媒を含む。いくつかの実施形態では、アルカリ溶液は、脱イオン水、塩基、および溶媒を含む。いくつかの実施形態では、移送溶液は、１つ以上のグリコールエーテル、例えば１つ以上のプロピレン系グリコールエーテル（例えば、プロピレングリコールエーテル、ジ（プロピレングリコール）エーテルおよびトリ（プロピレングリコール）エーテル、エチレン系グリコールエーテル（例えば、エチレングリコールエーテル、ジ（エチレングリコール）エーテルおよびトリ（エチレングリコール）エーテル）およびそれらの官能性類似体を含む。

緩衝剤の非限定的な例は、クエン酸、リン酸二水素カリウム、ホウ酸、ジエチルバルビツール酸、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）、ジメチルアルシン酸、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（ＴＲＩＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、およびそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（ＴＲＩＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、またはそれらの組み合わせから構成されることができる。追加の洗浄溶液、移送溶液、酸性溶液、およびアルカリ性溶液は、米国特許出願公開第２０１６／０２８２３７４号明細書に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「マイクロ流体」は、一般にミリメートルからナノメートルスケールで製造される１つ以上の流体チャネル、導管、またはチャンバを有するシステムまたは装置を指す。したがって、本明細書で使用される「マイクロ流体デバイス」は、少なくとも１つの寸法（幅、長さ、高さ）が１ｍｍ未満とすることができる構造に幾何学的に拘束された流体の正確な制御および操作を可能にする任意の装置を指す。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、１つ以上のチャネルおよび／または導管を含むマイクロ流体チップを含む。

本明細書で使用される場合、「次世代配列決定（ＮＧＳ）」という語句は、従来のサンガー電気泳動およびキャピラリー電気泳動に基づくアプローチと比較してハイスループット配列決定を有する配列決定技術を指し、配列決定プロセスは並行して実行され、例えば一度に数千または数百万の比較的小さな配列リードを生成する。次世代配列決定技術のいくつかの例は、これらに限定されないが、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、およびハイブリダイゼーションによる配列決定を含む。これらの技術は、より短いリード（約２５から約５００ｂｐのどこか）を生成するが、比較的短い時間で数十万または数百万のリードを生成する。「次世代配列決定」という用語は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、およびＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって現在採用されている、いわゆる合成による並列配列決定またはライゲーションによる配列決定プラットフォームと呼ばれるものを指す。次世代配列決定法は、電子検出を用いたナノポア配列決定法（Ｏｘｆｏｒｄ ＮａｎｏｐｏｒｅおよびＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）も含むことができる。

本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、遺伝情報を伝達するヌクレオチド鎖から構成される高分子量生化学高分子を指す。最も一般的な核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）である。核酸が構築されるモノマーは、ヌクレオチドと呼ばれる。各ヌクレオチドは、３つの成分：窒素複素環塩基、プリンまたはピリミジン（核酸塩基としても知られる）のいずれか、およびペントース糖からなる。異なる核酸タイプは、それらのヌクレオチドにおける糖の構造が異なり、ＤＮＡは、２－デオキシリボースを含み、ＲＮＡはリボースを含む。

本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２つ以上、例えば３つ以上、４つ以上、５つ以上などを指す。

本明細書で使用される場合、任意の２つの異なる反応基（試薬および粒子の任意の２つの反応基など）の間の「反応」は、２つの反応基（または２つの反応性官能基）の間に共有結合が形成されることを意味することができ、または、２つの反応性基（または２つの反応性官能基）が互いに会合し、互いに相互作用し、互いにハイブリダイズし、互いに水素結合することなどを意味することができる。いくつかの実施形態では、「反応」は、結合事象、例えば、反応性官能基間の結合事象または特異的結合体の対の第１のメンバーおよび第２のメンバー間の結合事象を含む。

本明細書中で使用される場合、用語「試薬」とは、別の実体と共有結合的または非共有結合的に反応すること、別の実体と結合すること、別の実体と相互作用すること、または別の実体にハイブリダイズすることができる１つ以上の作用物質を含む溶液または懸濁液を指す。そのような作用物質の非限定的な例は、特異的結合体、抗体（一次抗体、二次抗体、または抗体コンジュゲート）、核酸プローブ、オリゴヌクレオチド配列、検出プローブ、反応性官能基または保護された官能基を有する化学部分、酵素、色素分子または染色分子の溶液または懸濁液を含む。

本明細書で使用される場合、「配列決定」という用語は、ＤＮＡオリゴヌクレオチド中のヌクレオチド塩基、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンの順序を決定するための生化学的方法を指す。配列決定は、この用語が本明細書で使用される場合、限定されないが、並列配列決定または当業者に公知の任意の他の配列決定法、例えば、鎖終結法、迅速ＤＮＡ配列決定法、遊走スポット分析、Ｍａｘａｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、色素ターミネーター配列決定、または任意の他の最新の自動ＤＮＡ配列決定装置を使用することを含むことができる。

本明細書で使用される場合、「特異的結合体」という用語は、特異的結合対のメンバーを指す。特異的結合対は、他の分子への結合を実質的に排除して互いに結合することを特徴とする分子の対である（例えば、特異的結合対は、生物学的試料中の他の分子との結合対の２つのメンバーのいずれかの結合定数よりも少なくとも１０^３Ｍ^－１大きい、１０^４Ｍ^－１大きいまたは１０^５Ｍ^－１大きい結合定数を有することができる）。特異的結合部分の特定の例は、特異的結合タンパク質（例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジンなどのアビジン、およびプロテインＡ）を含む。特異的結合部分はまた、そのような特異的結合タンパク質によって特異的に結合される分子（またはその部分）を含むことができる。

本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、関心対象の特徴または特性の全体的またはほぼ全体的な程度または度合いを呈する定性的な条件を意味する。いくつかの実施形態では、「実質的に」は、約５％以内を意味する。いくつかの実施形態では、「実質的に」は、約１０％以内を意味する。いくつかの実施形態では、「実質的に」は、約１５％以内を意味する。いくつかの実施形態では、「実質的に」は、約２０％以内を意味する。

本明細書で使用される場合、「ターゲット」または「標的配列」という用語は、目的の核酸配列、例えばオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする核酸配列を指す。

概要

本開示は、１つ以上の独立して動作可能な処理導管を有するマイクロ流体チップを含む自動化システムに関する。いくつかの実施形態では、自動化システムは、次世代配列決定を使用して試料を配列決定する前に行われる試料浄化および／または標的濃縮プロセスなどの試料浄化および／または標的濃縮プロセスにおける使用に適している。いくつかの実施形態では、自動化システムはまた、溶液の精製および／または固相合成の実行にも適している。本明細書で述べるように、いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、磁気分離プロセスに依存せず、磁気ビーズを利用せず、および／または磁気成分を含まない。

マイクロ流体デバイス

本開示の一態様は、１つ以上の独立して動作可能な処理導管を有するマイクロ流体チップを含むマイクロ流体デバイスである。図１Ａ～Ｅを参照すると、本開示の一態様では、流体モジュール１０２、制御システム１０４、およびマイクロ流体チップ１０１を含むマイクロ流体デバイス１００がある。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１００は、１つ以上の流体および／または試薬リザーバに流体的に結合される。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１００は、１つ以上のセンサ、加熱および／または冷却モジュール、ならびに／あるいは上流および／または下流の処理システム、例えば配列決定デバイス、ポリメラーゼ連鎖反応を行うための機器、化学分析器、検出器などとさらに連通する。マイクロ流体デバイスおよび任意のマイクロ流体デバイスを構成する構成要素（例えば、制御システム、ポンプ、バルブなど）は、本明細書でさらに詳細に説明される。

マイクロ流体チップ

本開示のマイクロ流体デバイス１００は、１つ以上の独立して動作可能な処理導管１０５を有するマイクロ流体チップ１０１を含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１０１は、１から６００個の間の独立して動作可能な処理導管１０５を含む。他の実施形態では、マイクロ流体チップ１０１は、１から５００個の間の独立して動作可能な処理導管１０５を含む。さらに他の実施形態では、マイクロ流体チップ１０１は、１から４００個の間の独立して動作可能な処理導管１０５を含む。さらなる実施形態では、マイクロ流体チップ１０１は、１から３００個の間の独立して動作可能な処理導管１０５を含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１０１は、１つの独立して動作可能な処理導管１０５を含む。他の実施形態では、マイクロ流体チップ１０１は、２つ以上の独立して動作可能な処理導管１０５を含む。さらに他の実施形態では、マイクロ流体チップ１０１は、３つ以上の独立して動作可能な処理導管１０５を含む。さらなる実施形態では、マイクロ流体チップ１０１は、５つ以上の独立して動作可能な処理導管１０５を含む。またさらなる実施形態では、マイクロ流体チップ１０１は、１０個以上の独立して動作可能な処理導管１０５を含む。

２つ以上の独立して動作可能な処理導管１０５が任意のマイクロ流体チップ内に含まれる実施形態では、処理ユニットは、同じ平面内に配置されてもよい。例えば、図１Ｂは、互いに平行に同じ平面内に配置された３つの独立して動作可能な処理導管１０５を示している。同様に、図７Ａ～図７Ｄは、互いに平行に且つ同じ平面内に配置された複数の独立して動作可能な処理導管１０５を示している。他の実施形態では、２つ以上の処理導管１０５は、異なる平面に配置されることができる。例えば、いくつかの実施形態では、２つ以上の独立して動作可能な処理導管１０５は、任意のマイクロ流体チップ１０１内で互いに少なくとも部分的に積み重ねられてもよい（例えば、図１Ｄを参照）。

いくつかの実施形態では、各独立して動作可能な処理導管は、それ自体のリザーバ、導管、ポンプなどのセットに連結されてもよいことが当業者には理解されよう。他の実施形態では、２つ以上の独立して動作可能な処理導管は、共有流体リザーバおよび／または共有試薬リザーバに結合されてもよい。本明細書に記載されるように、リザーバ自体内に、またはリザーバを独立して動作可能な処理導管に結合するチャネルもしくは導管内に配置された１つ以上のバルブを制御することによって、共有リザーバからの流体は、各独立して動作可能な処理導管に供給されることができる。同様に、共有リザーバからの流体は、各独立して動作可能な処理導管と流体連通する１つ以上のポンプの作用によって、独立して動作可能な処理導管に供給されることができる。

処理導管

異なる構成を有する独立して動作可能な処理導管の例が本明細書に記載される。異なる構成が記載されているが、各処理導管は、入口に導入された流体および／または試薬が入口チャネルを通過し、入口チャネルと流体連通する１つ以上のチャンバに入ることを可能にする目的を果たす。次いで、導入された流体および／または試薬は、１つ以上のチャンバから流出し、それと連通する出口チャネルを通って流れることができる。最終的に、処理導管を通って流れた流体および／または試薬は、出口チャネルに流体的に結合された出口を通過した後に収集および／または分析される。

本明細書に記載されるように、処理導管を通る流体の流れは、処理導管と流体連通する１つ以上のバルブおよび／または１つ以上のポンプを使用して制御されることができる（バルブおよびポンプは、本明細書でさらに説明される）。いくつかの実施形態では、処理導管は、いかなる可動部品も含まない。磁石、磁気ストリップ、および／または磁気構成要素に結合された処理導管もない。したがって、処理導管の１つ以上のチャンバ内に設けられた任意の非磁性ビーズは、（例えば、それに連通可能に結合された１つ以上のポンプの動作を介して）流体および／または試薬の移動（例えば、流れ）のみによって処理導管を通って移動される（例えば、流される）。いくつかの実施形態では、処理導管は、磁気分離に依存しない。

独立して動作可能な処理導管のそれぞれは、１つ以上のチャンバを含む。いくつかの実施形態では、独立して動作可能な処理導管は、１から約１００個のチャンバを含む。いくつかの実施形態では、独立して動作可能な処理導管は、１から約５０個のチャンバを含む。いくつかの実施形態では、独立して動作可能な処理導管は、１から約２０個のチャンバを含む。いくつかの実施形態では、独立して動作可能な処理導管は、１から約１０個のチャンバを含む。他の実施形態では、独立して動作可能な処理導管は、１から５個のチャンバを含む。さらに他の実施形態では、独立して動作可能な処理導管は、１から３個のチャンバを含む。

いくつかの実施形態では、処理導管１０５は、単一のチャンバを含む。例示として、図２Ａは、入口チャネル１２および出口チャネル１３に流体的に結合されたチャンバ１４を有する処理導管１０５を示している。いくつかの実施形態では、入口チャネル１２は、入口１０と流体連通しており、出口チャネル１３は、出口１１と連通している。

他の実施形態では、処理導管１０５は、２つ以上のチャンバを含む。例示として、図５Ａおよび図６Ａは、チャネル１４Ａおよび１４Ｂを有する処理導管１０５を示しており、チャネル１４Ａおよび１４Ｂは、移送チャネルを介して互いに結合される。移送チャネルは、任意のサイズまたは形状を有することができる。例えば、図５Ａに示すように、移送チャネル１８は、直線状であってもよい。別の例として、図６Ａに示すように、移送チャネル１７は、直線移送チャネルと比較して表面積の増加を可能にすると考えられる蛇行形状を有してもよい。いくつかの実施形態では、第１のチャンバ１４Ａは、入口チャネル１２と流体連通している。一方、第２のチャンバ１４Ｂは、出口チャネル１３と流体連通している。いくつかの実施形態では、入口チャネル１２は、入口１０と流体連通しており、出口チャネル１３は、出口１１と連通している。

処理導管１０５のチャンバ１４は、任意のサイズまたは形状を有することができる。いくつかの実施形態では、チャンバは円形である（例えば、図２Ａを参照）。他の実施形態では、チャンバは、卵形または実質的に卵形である（例えば、図７Ｃを参照）。さらに他の実施形態では、チャンバは、長方形または実質的に長方形である（例えば、図３Ａを参照）。

いくつかの実施形態では、チャンバの体積は、約０．１μＬから約１０ｍＬの間の範囲である。他の実施形態では、チャンバの体積は、約０．１μＬから約７．５ｍＬの間の範囲である。他の実施形態では、チャンバの体積は、約０．１μＬから約５ｍＬの間の範囲である。さらに他の実施形態では、チャンバの体積は、約０．１μＬから約２．５ｍＬの間の範囲である。いくつかの実施形態では、チャンバの底面の面積は、約１ｍｍ^２から約１００ｃｍ^２の間の範囲である。いくつかの実施形態では、チャンバの底面の面積は、約１ｃｍ^２から約１００ｃｍ^２の間の範囲である。いくつかの実施形態では、チャンバの底面の面積は、約１ｃｍ^２から約５０ｃｍ^２の間の範囲である。他の実施形態では、チャンバの底面の面積は、約１ｍｍ^２から約５００ｍｍ^２の間の範囲である。他の実施形態では、チャンバの底面の面積は、約１ｍｍ^２から約１００ｍｍ^２の間の範囲である。

いくつかの実施形態では、チャンバは、複数のビーズの導入および／または除去を可能にするように構成される。いくつかの実施形態では、ビーズは、非磁性ビーズである。適切な非磁性ビーズの例は、シリカビーズ、アルギネートヒドロゲルビーズ、アガロースヒドロゲルビーズ、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＭ）ゲルビーズ、セルロースビーズ、ポリエチレン（ＰＥ）ビーズ、ポリプロピレン（ＰＰ）ビーズ、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズ、ナイロン（ＰＡ）ビーズ、ポリウレタンビーズ、アクリレートコポリマービーズ、ポリクオタニウムビーズ、ポリソルベートビーズ、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ビーズを含む（これらのいずれも、チャンバへの導入前または導入後に官能化されてもよく、またはさらに誘導体化されていてもよい）。いくつかの実施形態では、ビーズは、約０．１μｍから約５ｍｍの間の範囲の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ビーズは、約０．１ｍｍから約１ｍｍの間の範囲の平均直径を有する。さらに他の実施形態では、ビーズは、約０．１ｍｍから約１ｍｍの間の範囲の平均直径を有する。

いくつかの実施形態では、チャンバは、チャンバからの複数のビーズの導入および／または除去を容易にする１つ以上のダクトと流体連通していてもよい。いくつかの実施形態では、チャンバは、２つのダクトと流体連通している。他の実施形態では、チャンバは、３つ以上のダクトと流体連通している。さらに他の実施形態では、チャンバは、４つ以上のダクトと流体連通している。

図２Ａ、図３Ａ、および図４Ａは、２つのダクト１５と流体連通するチャンバ１４を示しており、２つのダクト１５は、互いに約１８０度に配置されている。いくつかの実施形態では、２つのダクト１５のうちの一方は、ビーズの導入を可能にするように構成され、２つのダクト１５のうちの他方は、ビーズの除去を可能にするように構成される。いくつかの実施形態では、ダクト１５のそれぞれは、ビーズ移送導管、ビーズ供給源（ビーズ貯蔵容器またはビーズ収集容器など）、１つ以上のバルブ、および／または１つ以上のポンプと流体連通してもよい。

２つ以上のチャンバを含む実施形態では、２つ以上のチャンバのそれぞれは、１つ以上のダクトと流体連通してもよい（例えば、図５Ａおよび図６Ａを参照）。いくつかの実施形態では、ダクトは、ダクトを閉じることを可能にする１つ以上のドアまたはバルブを含む。いくつかの実施形態では、チャンバに所定数のビーズが予め充填されると、ダクト内のドアまたはバルブは、ビーズがチャンバ内でシールされるように閉じられてもよい。ドアまたはバルブは、ビーズを回収するために後で開かれてもよい。

図２Ｅを参照すると、ダクト１５は、チャンバ１４の外部にあってもよい。いくつかの実施形態では、チャンバ１４の壁２０は、１つ以上のダクト１５からチャンバ１４へのビーズの通過を可能にするダクト開口部２２を含むことができる。いくつかの実施形態では、ダクト開口部２２は、少なくとも１つのビーズがチャンバに出入りすることを可能にする限り、任意のサイズおよび／または形状を有することができる。

いくつかの実施形態では、チャンバは、導入された任意のビーズがチャンバ内を移動するがチャンバから出ないように適合される。図２Ｄおよび図２Ｅを参照すると、いくつかの実施形態では、チャンバ１５の壁２０は、流体および／または試薬が流れることができるが、チャンバ１４に導入されたビーズのいずれも流れない第１の開口部および第２の開口部２１Ａおよび２１Ｂを含む。図２Ｅは、壁２０および壁内の開口部２１を示すチャンバ１４の断面図を示している。図２Ｆおよび図２Ｇは、処理導管１０５の断面図を示しており、壁２０の高さ「ｘ」よりも小さいが開口部２１の高さ「ｙ」よりも大きい平均直径「ｗ」をそれぞれ有する複数のビーズ３０を示している。このようにして、流体および／または試薬（および任意の標的分子および／または粒子）は、処理導管１０５を通って入口チャネル１２からチャンバ１４に流入し、出口チャネル１３から流出することができるが、流体および／または試薬の流れの間、複数のビーズ３０は、チャンバ１４内に保持される。

図２Ｃを参照すると、いくつかの実施形態では、チャンバの高さは、入口チャネルまたは出口チャネルのうちの少なくとも一方の高さよりも大きい。例えば、図２Ｃおよび図４Ｃに示すように、チャンバ１４の高さ「ｘ」は、入口チャネル１２の高さ「ｙ」または出口チャネル１３の高さ「ｙ」よりも大きくてもよい。いくつかの実施形態では、チャンバ１４の高さ「ｘ」は、０．１μｍから約１０ｃｍの間の範囲である。他の実施形態では、チャンバ１４の高さ「ｘ」は、０．１ｍｍから約１ｃｍの間の範囲である。さらに他の実施形態では、チャンバ１４の高さ「ｘ」は、０．１ｍｍから約１ｍｍの間の範囲である。いくつかの実施形態では、出口チャネル１３および／または入口チャネル１２の高さ「ｘ」は、０．１μｍから約１０ｃｍの間の範囲である。他の実施形態では、出口チャネル１３および／または入口チャネル１２の高さ「ｘ」は、０．１ｍｍから約１ｃｍの間の範囲である。さらに他の実施形態では、出口チャネル１３および／または入口チャネル１２の高さ「ｘ」は、０．１ｍｍから約１ｍｍの間の範囲である。

２つ以上のチャネルが移送チャネルを介して互いに流体的に結合される実施形態では、第１のチャンバに導入された任意のビーズは、第１のチャンバから１つ以上の追加のチャンバに流れることができる。さらに、ビーズは、第１のチャンバから１つ以上の追加のチャンバのうちの別のチャンバに流れた後、第１のチャンバに逆流することが可能にされることができる。これらの実施形態では、移送チャネルと連通するチャンバ壁は、チャンバから移送チャネルへのビーズの移送を可能にする開口部を含む。あるいは、チャンバは、チャンバが移送チャネルに接合する領域に壁を含まなくてもよく、これもまた、チャンバから移送チャネルへのビーズの移送を可能にする。

例えば、図５Ａを参照すると、処理導管１０５は、（ｉ）第１の開口部２１Ａを含む第１の壁２０Ａを有する第１のチャンバ１４Ａであって、第１の壁２０Ａが、入口チャネル１２と連通している、第１のチャンバと、（ｉｉ）出口チャネル１３と連通する第２の開口部２１Ｂｉｎを含む第２の壁２０Ｂを有する第２のチャンバ１４Ｂとを含むことができ、チャンバ１４Ａおよび１４Ｂは、チャンバの移送チャネル１８と連通する領域に壁または壁部分を含まない。

いくつかの実施形態では、入口チャネル１２および出口チャネル１３は、それぞれ、任意のサイズおよび／または形状を有することができる。いくつかの実施形態では、入口チャネル１２は、図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、および図３Ｂに示すような直線状の側壁を含む。他の実施形態では、入口チャネル１２および出口チャネル１３は、それぞれ、図２Ｄ、図４Ａ、および図４Ｃに示すような曲線状または弓形の側壁を含む。

いくつかの実施形態では、入口チャネル１２および出口チャネル１３は、それぞれ、チャンバを接合する第１の幅から、入口１０と出口１１を接合する第２の幅まで先細になっている。いくつかの実施形態では、入口チャネル１２は、チャンバ１４に接合する第１の幅から、入口１０に接合する第２の幅まで先細になっており、第１の幅は、第２の幅よりも大きい。例えば、図２Ａ、図３Ａ、および図４Ａは、それぞれ、入口１０からチャンバ１４まで幅が次第に先細になっている入口チャネル１２を示している。

図２Ａおよび図３Ａを参照すると、いくつかの実施形態では、入口チャネル１２の幅「ａ」は、０．１μｍから約１０ｃｍの間の範囲である。他の実施形態では、入口チャネル１２の幅「ａ」は、１ｍｍから約１０ｃｍの間の範囲である。他の実施形態では、入口チャネル１２の幅「ａ」は、１ｍｍから約１ｃｍの間の範囲である。他の実施形態では、入口チャネル１２の幅「ａ」は、１ｍｍから約５ｍｍの間の範囲である。いくつかの実施形態では、入口チャネル１２の幅「ｂ」は、０．１μｍから約１０ｃｍの間の範囲である。他の実施形態では、入口チャネル１２の幅「ｂ」は、１ｍｍから約１０ｃｍの間の範囲である。他の実施形態では、入口チャネル１２の幅「ｂ」は、１ｍｍから約１ｃｍの間の範囲である。他の実施形態では、入口チャネル１２の幅「ｂ」は、１ｍｍから約５ｍｍの間の範囲である。先細状チャネルは、空気の捕捉を実質的に緩和し、および／または流体プロファイルの安定化および／または発現を助けると考えられる。

いくつかの実施形態では、出口チャネル１３は、チャンバ１４に接合する第１の幅から出口１１に接合する第２の幅まで先細になっている。例えば、図２Ａ、図３Ａ、および図４Ａは、それぞれ、チャンバ１４から出口１１まで幅が徐々に先細になっている出口チャネル１３を示している。いくつかの実施形態では、出口チャネル１３の幅「ａ」は、０．１μｍから約１０ｃｍの間の範囲である。他の実施形態では、出口チャネル１３の幅「ａ」は、１ｍｍから約１０ｃｍの間の範囲である。いくつかの実施形態では、出口チャネル１３の幅「ａ」は、１ｍｍから約５０ｍｍの間の範囲である。他の実施形態では、出口チャネル１３の幅「ａ」は、１ｍｍから約１０ｍｍの間の範囲である。いくつかの実施形態では、出口チャネル１３の幅「ｂｂは、０．１μｍから約１０ｃｍの間の範囲である。他の実施形態では、出口チャネル１３の幅「ｂ」は、１ｍｍから約１０ｃｍの間の範囲である。いくつかの実施形態では、出口チャネル１３の幅「ｂ」は、１ｍｍから約５０ｍｍの間の範囲である。他の実施形態では、出口チャネル１３の幅「ｂ」は、１ｍｍから約１０ｍｍの間の範囲である。

いくつかの実施形態では、処理導管の１つ以上のチャンバ、入口チャネル、および／または出口チャネルのうちの少なくとも１つは、１つ以上のポストを含む。１つ以上のポストを含むことは、チャンバ、入口チャネル、および出口チャネルを通過する流体および／または試薬の流れに乱流を導入し、それによって導入された流体、試薬、および／またはビーズの間の混合を容易にすると考えられる。そのようなカオス的微小環境は、２つ以上の異なる対象間に移流分子移送および交換を導入することによって混合速度を高めると考えられる。

いくつかの実施形態では、チャンバ内のポストの数は、１から約１００万の間の範囲である。他の実施形態では、チャンバ内のポストの数は、１から約１０，０００の間の範囲である。いくつかの実施形態では、チャンバ内のポストの数は、１から約１，０００の間の範囲である。他の実施形態では、チャンバ内のポストの数は、１から約１００の間の範囲である。いくつかの実施形態では、入口チャネルおよび／または出口チャネル内のポストの数は、１から約５００の間の範囲である。他の実施形態では、入口チャネルおよび／または出口チャネル内のポストの数は、１から約２５０の間の範囲である。他の実施形態では、入口チャネルおよび／または出口チャネル内のポストの数は、１から約１００の間の範囲である。

例えば、図２Ｂおよび図４Ｂに示すように、チャンバ１４は、複数のポスト１６を含む。別の例として、図３Ｂに示すように、チャンバ１４、入口チャネル１２、および出口チャネル１３は、それぞれ、複数のポスト１６を含む。さらに別の例として、図５Ａは、移送チャネル１８を介して互いに流体的に結合された第１のチャンバおよび第２のチャンバ１４Ａおよび１４Ｂを含む処理導管１０５を示しており、第１のチャンバ１４Ａ、第２のチャンバ１４Ｂ、および移送チャネル１８は、それぞれ、複数のポストを含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上のポストは、チャンバ、入口チャネル、および／または出口チャネルの床または天井から延在している（例えば、図２Ｈを参照）。他の実施形態では、１つ以上のポストは、チャンバ、入口チャネル、および／または出口チャネルの床から天井まで延在している（例えば、図２Ｉを参照）。いくつかの実施形態では、ポストは、円筒形または多角形などの任意のサイズおよび形状を有することができる。いくつかの実施形態では、ポストは、任意のサイズおよび／または形状を有することができる。例えば、ポストは、円筒形または長方形であってもよい。いくつかの実施形態では、ポストは、約０．１μｍから約１ｍｍの間の範囲の直径を有する。いくつかの実施形態では、ポストは、約０．５μｍから約１ｍｍの間の範囲の直径を有する。

リザーバおよび容器

マイクロ流体デバイス１００は、任意の数の試薬リザーバ、ビーズ貯蔵容器、ビーズ収集容器、流体リザーバ、廃棄物収集リザーバなどに流体結合されることができる。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、処理導管１０５に導入するための各異なる流体および／または試薬用の別個の流体および／または試薬リザーバを含む。本明細書で述べるように、リザーバは、２つ以上の独立して動作可能な処理導管の間で共有されてもよい。

いくつかの実施形態では、リザーバのそれぞれは、本明細書に記載の導管を介してマイクロ流体デバイス１００に流体的に結合されてもよい。例えば、図１Ｃは、処理導管１０５の入口に流体的に結合された４つの流体および／または試薬リザーバ２０２Ａ～２０２Ｄを示している。当業者は、図１Ｃに示す４つの流体および／または試薬リザーバ２０２Ａ～２０２Ｄのうちの１つが、精製または濃縮される試料が処理導管１０５への導入前に貯蔵される試料リザーバとすることができることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、流体および／または試薬リザーバの体積は、約１０μＬから約１０ｍＬの間の範囲である。いくつかの実施形態では、流体および／または試薬リザーバの体積は、約１ｍＬから約５ｍＬの間の範囲である。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１００は、１つ以上のビーズ貯蔵器２０９Ａまたは収集容器２０９Ｂに流体的に結合されてもよい。いくつかの実施形態では、ビーズは、ビーズ貯蔵容器を処理導管の第１のダクトに結合する導管を介して処理導管の１つ以上のチャンバに導入されることができる。同様に、いくつかの実施形態では、ビーズは、ビーズ収集容器を処理導管の第２のダクトに結合する導管を介して処理導管の１つ以上のチャンバから移送されることができる。いくつかの実施形態では、ビーズ貯蔵または回収容器の体積は、約０．１μＬから約５ｍＬの間の範囲である。他の実施形態では、ビーズ貯蔵または回収容器の体積は、約０．１ｍＬから約１ｍＬの間の範囲である。いくつかの実施形態では、ビーズは、ピペットまたはシリンジを使用してビーズ貯蔵容器に接続されたビーズ充填入口を介してマイクロ流体デバイスに導入されることができる。あるいは、出口側に存在するチャンバの壁に１つの開口部しかない場合、流体入口を介してビーズが導入されることができる。この特定の実施形態では、これは、１つ以上のダクトの排除を可能にする。

流体モジュール

本開示のマイクロ流体デバイス１００はまた、１つ以上の導管、１つ以上のポンプ、１つ以上のバルブなどを備える流体モジュールを含む。

導管

マイクロ流体デバイス１００は、マイクロ流体デバイス１００の処理導管１０５の入口１０、出口１２、および／またはダクト１５への流体、試薬、および／またはビーズの移送を容易にするための任意の数の導管を含むことができる。いくつかの実施形態では、処理導管１０５に導入するための各流体および／または試薬は、別個の流体リザーバおよび／または試薬リザーバに貯蔵されてもよく、各流体リザーバおよび／または試薬リザーバは、処理導管１０５の入口１０と流体連通する流体移送導管または試薬移送導管に独立して結合される。このようにして、単一の試薬リザーバからの試薬は、試薬移送導管を介して処理導管１０５に移送されることができる。同様に、単一の流体リザーバからの流体は、流体移送導管を介して処理導管１０５に移送されることができる。いくつかの実施形態では、流体および／または試薬リザーバおよび／または流体および／または試薬移送導管のそれぞれは、本明細書に記載のように、流体および／または試薬を処理導管１０５に流されることができるように、バルブ、例えば二方向バルブを含むことができる。

いくつかの実施形態では、図１Ｃを参照すると、処理導管１０５の入口は、分岐導管２０５Ａに流体的に結合されてもよく、分岐導管２０５Ａの各分岐は、流体移送導管２０５Ｂに流体的に結合される。いくつかの実施形態では、各流体移送導管２０５Ｂは、流体および／または試薬リザーバ２０２に結合される。図１Ｃでは、処理導管は、４つの流体および／または試薬リザーバ２０２Ａ～２０２Ｄと流体連通しているものとして示されている。当業者が理解するように、図１Ｃの４つの流体および／または試薬リザーバ２０２Ａ～２０２Ｄのそれぞれは、異なる流体および／または異なる試薬を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１００は、１つ以上のポンプ導管２１０を含むことができ、そのようなポンプ導管は、１つ以上のポンプを処理導管２０５に流体的に結合するのに役立つ。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１００は、（ｉ）処理導管１０５の出口、（ｉｉ）廃棄流体／試薬容器２０３および／または試料収集容器２０４と流体連通する廃棄物移送導管２０６を含むことができる。

バルブ

本開示のマイクロ流体デバイス１００は、１つ以上のバルブおよび／またはマイクロバルブを含むことができる。いくつかの実施形態では、バルブは、マイクロ流体デバイス１００の任意の導管内、マイクロ流体デバイス１００の導管の任意の部分、またはマイクロ流体デバイス１００の任意の２つの導管の接合部に配置されることができる。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１００のバルブのそれぞれは、１つ以上のポート、例えば１ポート、２ポート、または３ポートを含む。

例えば、流体の流れを開始／停止し、流体の流れの量を制御するなど、バルブがマイクロ流体デバイス１００全体の流体、試薬、および／またはビーズの流れを調整することを可能にする限り、任意のタイプのバルブが利用されることができる。いくつかの実施形態では、バルブは、制御システム１０４からの信号に基づいて制御され、例えば、制御システム１０４は、流体、試薬、および／またはビーズの移送が調整されることができるように、第１の位置、第２の位置、または第３の位置に作動するようにバルブに命令することができる。適切なマイクロ流体バルブの非限定的な例は、米国特許第１０，１９７，１８８号明細書、米国特許出願公開第２００８／０２３６６６８号明細書および米国特許出願公開第２００６／０１８０７７９号明細書、およびＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１８／１０４５１６号パンフレットに記載されており、それらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、再び図１Ｃを参照すると、リザーバからの流体および／または試薬の流れが独立して制御されることができるように、１つ以上のバルブ２０７Ａ、２０７Ｂ、および２０７Ｃは、分岐導管２０５Ａおよび／または流体移送導管２０５Ｂに配置されることができる。あるいは、他の実施形態では、流体および／または試薬リザーバのそれぞれは、リザーバからの流体および／または試薬の流れが独立して制御されることができるようにバルブを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のバルブが廃棄物移送導管２０６内に配置されることができる。

ポンプ

いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１００は、１つ以上のポンプと流体連通している。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、２つのポンプと流体連通している。他の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、３つのポンプと流体連通している。さらに他の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、４つ以上のポンプと流体連通している。

いくつかの実施形態では、１つ以上のポンプは、マイクロ流体デバイスのチャンバ、チャネル、および／または導管内の流体、試薬、および／またはビーズの移動を容易にする。選択されたポンプがマイクロ流体デバイスに充填されるまたはマイクロ流体デバイスから排出される体積の制御を可能にする限り、本開示のマイクロ流体デバイス内で任意のポンプが利用されることができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のポンプは、圧力ポンプである。他の実施形態では、１つ以上のポンプは、圧電ポンプである。いくつかの実施形態では、１つ以上のポンプは、蠕動ポンプである。いくつかの実施形態では、１つ以上のポンプは、シリンジポンプである。いくつかの実施形態では、１つ以上のポンプは、容積式ポンプである。

いくつかの実施形態では、本開示の１つ以上のポンプは、約１ｍＬから約１００ｍＬの間の範囲の体積を有する。他の実施形態では、本開示の１つ以上のポンプは、約１０ｍＬから約１００ｍＬの間の範囲の体積を有する。いくつかの実施形態では、本開示の１つ以上のポンプは、約１μＬ／分から約１０００ｍＬ／分の流量を送達することができる。他の実施形態では、本開示の１つ以上のポンプは、約１０μＬ／分から約５００ｍＬ／分の流量を送達することができる。さらに他の実施形態では、本開示の１つ以上のポンプは、約１０μＬ／分から約１００ｍＬ／分の流量を送達することができる。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１００の１つ以上のポンプのそれぞれは、単一の目的、例えば流体の注入、流体の引き出し、ビーズの１つ以上のチャンバへのおよび／またはチャンバからの移送のために提供される。他の実施形態では、任意の単一のポンプが複数の目的に使用されることができる。例えば、１つのポンプは、流体の注入および回収の双方を容易にすることができる。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、「流体噴射ポンプ」または「流体取出ポンプ」の１つ以上と連通する。本明細書で使用される「流体注入ポンプ」は、本開示のマイクロ流体デバイスのチャンバ、チャネル、または導管のいずれかを含む、流体および／または試薬がマイクロ流体デバイスに導入されることができる任意のデバイスを指す。したがって、流体注入ポンプが使用されて、任意のチャンバ、チャネル、および／または導管に任意の流体および／または試薬を送達することができ、および／または流体内に含まれる任意のビーズは、流体注入ポンプの作用によってマイクロ流体デバイス１００の一方のチャンバから他方のチャンバに（移送チャネルなどを介して）移動されることができる。

本明細書で使用される「流体取出ポンプ」は、本開示のマイクロ流体デバイスのチャンバ、チャネル、もしくは導管のいずれかから、またはそれと流体連通する流体リザーバおよび／または試薬リザーバのいずれか１つ以上からを含む、マイクロ流体デバイスから流体が除去されることができる任意のデバイスを指す。したがって、流体取出ポンプが使用されて、任意のチャンバ、チャネル、導管および／またはリザーバから任意の流体または試薬を除去することができ、流体内に含まれる任意のビーズは、流体取出ポンプの作用によってマイクロ流体デバイス１００の一方のチャンバから他方のチャンバに（移送チャネルなどを介して）移動されることができる。

いくつかの実施形態では、１つ以上のポンプは、マイクロポンプである。いくつかの実施形態では、マイクロポンプは、機械式ポンプ（例えば、ダイアフラムマイクロポンプおよび蠕動マイクロポンプ）である。いくつかの実施形態では、マイクロポンプは、非機械式ポンプ（例えば、バルブレスマイクロポンプ、キャピラリーポンプ、および化学動力ポンプ）である。少量の流体を圧送するための装置が知られている。例えば、米国特許第５，０９４，５９４号明細書、米国特許第５，７３０，１８７号明細書および米国特許第６，０３３，６２８号明細書は、ナノリットルまたはピコリットル範囲の流体体積を圧送することができる装置を開示しており、それらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

マイクロ流体デバイスによる使用に適した他のポンプは、米国特許第１０，２０８，７３９号明細書、および米国特許出願公開第２０１５／００５０１７２号明細書および米国特許出願公開第２０１７／０１６７４８１号明細書に開示されており、それらの開示は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

制御システムおよび他のモジュール

本開示のマイクロ流体デバイスは、制御システム１０４に通信可能に結合される。いくつかの実施形態では、制御システム１０４は、マイクロ流体チップを通過する任意の流体および／または試薬の流体流（例えば、流体および／または試薬の流れの方向、流体の流れの体積、または流量）を調整するために、様々なポンプおよび／またはバルブに命令を送るために使用される。いくつかの実施形態では、制御システム１０４は、リザーバ内、導管内、および／または流路内に配置された１つ以上のバルブを含む、１つ以上のバルブを作動させて開閉する命令を送信するように構成される。いくつかの実施形態では、制御システムは、ポンプに流体、試薬を注入させるかもしくは取り出させ、および／または処理導管１０５もしくはその任意の部分からビーズを移送させるなど、マイクロ流体チップと流体連通する１つ以上のポンプの動作を調整するための命令を送信するように構成される。

いくつかの実施形態では、制御モジュール１０４は、処理導管１０５を通る第１の経路、例えば、入口１０から入口チャネル１２、チャンバ１４、出口チャネル１３、および出口１１への流体流路に第１の流体流を導くことができる。他の実施形態では、制御モジュール１０４は、処理導管内の第１の経路および第２の経路に第１の流体流を導くことができ、第１の経路および第２の経路は、互いに対向している。例えば、１つ以上のポンプの作用によって、流体、試薬、および／またはビーズは、移送チャネルを介して第１のチャンバから第２のチャンバに流れることができ、次いで、第２のチャンバから第１のチャンバに戻ることができる。

マイクロ流体デバイスを通る流体および／または試薬の流れの制御は、図１Ｃを参照して示されることができる。いくつかの実施形態では、ポンプ２０１は、緩衝溶液内に供給された試料などの試料を試料リザーバ２０２Ａから取り出すように制御システムによって最初に命令されることができる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、１つ以上の界面活性剤を含むことができる。ここで、制御システムは、試料が試料リザーバ２０２Ａから流体移送導管２０５Ｂ、分岐導管２０５Ａ、および処理導管１０５に流れることを可能にする位置に作動するようにバルブ２０７Ａおよび２０７Ｂに命令する。いくつかの実施形態では、制御システムはまた、廃棄物収集容器２０３への流体の流れを可能にする位置に作動するようにバルブ２０８に命令する。本明細書でさらに説明するように、適切な第１の反応性官能基を有する試料内の分子は、処理導管１０５のチャンバ内に提供され、対応する第２の反応性官能基を有する官能化ビーズと反応することができる。官能化ビーズと反応しない分子は、緩衝液中で、処理導管１０５を通って、ポンプ導管２１０を通って、廃棄物移送導管２０６を通って、廃棄物収集容器２０３に流されてもよい。最後に、制御システムは、バルブ２０７Ａおよび２０７Ｂに作動するように命令して、試料がリザーバ２０２Ａから流れるのを防ぐ。

このプロセスは、１つ以上の追加の流体および／または試薬について繰り返されてもよい。例えば、リザーバ２０２Ｂに貯蔵された洗浄緩衝液は、次に処理導管１０５に導入されることができる。制御システムは、バルブ２０７Ａおよび２０７Ｂに、洗浄緩衝液の第１のアリコートが（ポンプ２０１を介して）洗浄緩衝液リザーバ２０２Ｂから流体移送導管２０５Ｂ、分岐導管２０５Ａ、および処理導管１０５に流れることを可能にする位置に作動するように命令する。いくつかの実施形態では、制御システムはまた、廃棄物収集容器２０３への洗浄緩衝液の流れを可能にする位置に作動するようにバルブ２０８に命令する。いくつかの実施形態では、本明細書にさらに記載されるように、洗浄緩衝液は、リザーバ２０２Ａに貯蔵された試料溶液に導入された未結合分子および／または成分を除去するように処理導管のチャンバを通って流れる。いくつかの実施形態では、洗浄液は、処理導管１０５を通って、ポンプ導管２１０を通って、廃棄物移送導管２０６を通って、廃棄物収集容器２０３に流入される。最後に、制御システムは、追加の洗浄緩衝液がリザーバ２０２Ｂから流れるのを防ぐために作動するようにバルブ２０７Ａおよび２０７Ｂに命令することができる。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液のさらなるアリコートが処理導管１０５を介して流されることができる。例えば、同じまたは異なる洗浄緩衝液の２つのさらなるアリコートが処理導管を介して流されることができる。

いくつかの実施形態では、試薬（例えば、加熱緩衝液または酵素）を導入してビーズに結合した分子を放出するように、上記のプロセスが繰り返されてもよい。例えば、制御システムは、バルブ２０７Ａおよび２０７Ｂに、試薬がリザーバ２０２Ｄから流体移送導管２０５Ｂ、分岐導管２０５Ａ、および処理導管１０５に流れることを可能にする位置に作動するように命令する。いくつかの実施形態では、制御システムはまた、試料収集容器２０４への流体の流れを可能にする位置に作動するようにバルブ２０８に命令する。結合分子がビーズから放出されると、放出された分子は、処理導管１０５を通って流れる試薬に供給され、最終的に試料収集容器２０４に流入される。

いくつかの実施形態では、システムは、１つ以上の圧力センサ、温度センサおよび／または流量センサをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、センサは、マイクロ流体システムのフィードバック制御を可能にするために制御システムに結合されてもよい。いくつかの実施形態では、制御システムは、センサ（例えば、流量センサ、温度センサ、圧力センサ、化学分析器）からデータを受信し、受信したデータを処理し、受信し処理されたデータに基づいて流体、流体流、温度、圧力などを調整するように構成される。

いくつかの実施形態では、フィードバック制御は、本マイクロ流体システムにおいて発生する１つ以上の事象またはプロセスの検出を含む。いくつかの実施形態では、検出は、例えば、流体の少なくとも１つの特性、流体内の成分、マイクロ流体チップの領域内、特定の処理導管１０５内の成分間の相互作用、またはマイクロ流体デバイスの領域内または単一の処理導管１０５の一部内の状態（例えば、温度、圧力など）の判定を含むことができる。例として、制御システム１０４は、いくつかの実施形態では、一連の命令を実行して、１つ以上の動作、例えば予めプログラムされた動作またはルーチンを実行するように１つ以上のシステム構成要素を制御または動作させるか、またはシステムに通信可能に結合された１つ以上のセンサからフィードバックを受信し、受信したセンサフィードバックに応じて動作する（または動作を停止する）ように１つ以上のシステム構成要素に命令するように構成されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の予めプログラムされた動作またはルーチンは、受信したセンサフィードバックデータまたはイメージングデータを操作し、その受信したフィードバックに基づいてシステム構成要素に命令することを含む、動作を実行するための１つ以上のコンピュータプログラムを実行する１つ以上のプログラマブルプロセッサによって実行されることができる。

したがって、いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスまたは任意の構成要素は、１つ以上の加熱モジュール、冷却モジュール、および／または混合モジュールに通信可能に結合される。このようにして、各処理導管１０５は、独立して加熱および／または冷却されることができる。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ、処理導管、試薬リザーバ、流体リザーバ、チャネル、および／または任意の導管は、それぞれ独立して、別個の加熱および／または冷却モジュールと熱的に連通している。例えば、各処理導管１０５は、異なる加熱および／または冷却モジュールと熱的に連通してもよい。他の実施形態では、加熱および／または冷却モジュールは、マイクロ流体デバイスの構成要素間で共有される。

適切な加熱および／または冷却モジュールは、加熱ブロック、ペルチェ素子、および／または熱電モジュールを含む。適切なペルチェ素子の例は、米国特許第４，６８５，０８１号明細書、米国特許第５，０２８，９８８号明細書、米国特許第５，０４０，３８１号明細書、および米国特許第５，０７９，６１８号に記載されているものを含み、これらの開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。いくつかの実施形態では、制御システムは、１つ以上の加熱および／または冷却モジュールに通信可能に結合され、マイクロ流体チップ、処理導管、試薬リザーバ、流体リザーバ、および／または導管を所定の時間にわたって所定の温度に加熱および／または冷却するように作動するように加熱および／または冷却モジュールに命令するように構成されてもよい。例えば、制御モジュール１０４は、所定の温度に到達するおよび／または所定の時間にわたって維持されるように、少なくとも１つの加熱モジュールからマイクロ流体チップに加熱を指示することができる。所定の温度は、ユーザによって制御システムに入力されてもよく、予めプログラムされた命令またはルーチン内で提供されてもよい。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップまたは個々の処理導管のいずれかは、１つ以上の混合モジュールと連通してもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の混合モジュールは、トランスデューサなどの音響波発生器を含む。いくつかの実施形態では、トランスデューサは、機械的トランスデューサである。他の実施形態では、トランスデューサは、圧電トランスデューサである。いくつかの実施形態では、トランスデューサは、機械的振動を発生させる圧電ウェハから構成される。いくつかの実施形態では、表面トランスデューサが使用されて、流体体積をスライド上で分配または混合する。非接触で混合するための適切な装置および方法は、ＰＣＴ公開である国際公開第２０１８／２１５８４４号パンフレットに記載されており、その開示は、参照により組み込まれる。

制御システム１０４は、いくつかの実施形態では、１つ以上のメモリと、プログラム可能なプロセッサとを含む。情報を記憶するために、制御システム１０４は、限定されるものではないが、揮発性メモリ、不揮発性メモリ、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）などの１つ以上の記憶素子を含むことができる。いくつかの実施形態では、制御システム１０４は、システムの外部にあるスタンドアロンコンピュータである。記憶装置および／またはメモリ装置は、一時的または永続的にデータまたはプログラムを記憶するために使用される１つ以上の物理装置とすることができる。場合によっては、装置は、揮発性メモリであり、記憶された情報を維持するために電力を必要とする。他の例では、装置は、不揮発性メモリであり、デジタル処理装置に電力が供給されていないときに記憶された情報を保持する。さらに他の例では、不揮発性メモリは、フラッシュメモリを含む。不揮発性メモリは、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）を含むことができる。不揮発性メモリは、強誘電体ランダムアクセスメモリ（ＦＲＡＭ）を含むことができる。不揮発性メモリは、相変化ランダムアクセスメモリ（ＰＲＡＭ）を含むことができる。装置は、非限定的な例として、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリデバイス、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、およびクラウドコンピューティングベースの記憶装置を含む記憶装置とすることができる。

いくつかの実施形態では、制御システム１０４は、システムの遠隔制御を可能にするネットワークコンピュータである。「プログラムされたプロセッサ」という用語は、データを処理するためのあらゆる種類の装置、装置、および機械を包含し、プログラム可能なマイクロプロセッサ、コンピュータ、システムオンチップ、もしくは前述の複数のもの、またはそれらの組み合わせを例として含む。装置は、ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）またはＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）などの特別な目的のロジック回路を含むことができる。装置はまた、ハードウェアに加えて、当該コンピュータプログラムの実行環境を作成するコード、例えば、プロセッサファームウェア、プロトコルスタック、データベース管理システム、オペレーティングシステム、クロスプラットフォームランタイム環境、仮想マシン、またはそれらの１つ以上の組み合わせを構成するコードを含むことができる。装置および実行環境は、ウェブサービス、分散コンピューティング、グリッドコンピューティングインフラストラクチャなど、様々な異なるコンピューティングモデルインフラストラクチャを実現することができる。

いくつかの実施形態では、システムは、１つ以上の化学分析器および／または検出器をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の化学分析器が使用されて、収集された流体流（例えば、廃棄物流）内の細胞成分、試薬、副産物などを検出することができる。いくつかの実施形態では、化学分析器は、ＮＡのサイズ分布のための核酸定量バイオアナライザ用のＱｕｂｉｔ、核酸定量用のＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ ｑＰＣＲ機器、分子同定および／または定量用のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＣＥ－ＭＳなどの質量分析計から選択される。光学顕微鏡法（明視野、蛍光）、（ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン）などの分光法も利用されることができる。いくつかの実施形態では、本開示の任意のマイクロ流体デバイスをＣＥ－ＭＳなどの機器とインライン結合することによってフィードバック制御が容易にされることができる。他の実施形態では、マイクロ流体システム１００は、レーザ源およびＣＣＤまたはＣＭＯＳベースのイメージングセンサおよび／またはカメラを含むものなどの蛍光顕微鏡装置にさらに結合されてもよい。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体システム１００は、配列決定装置にさらに結合されてもよい。いくつかの実施形態では、配列決定装置は、「次世代配列決定」装置である。

マイクロ流体チップ製造

本開示のマイクロ流体チップは、当業者に知られている任意の方法にしたがって製造されることができる。適切な製造方法は、リソグラフィ、３Ｄ印刷、レーザエッチング、およびエンボス加工を含む。

マイクロ流体チップは、チャネルおよび／または導管を形成するのに適した任意の材料から製造されることができる。材料の非限定的な例は、ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリ（ジメチルシロキサン）、ＰＴＦＥ、ＰＥＴ、およびシクロオレフィンコポリマー）、ガラス、石英、およびケイ素を含む。マイクロ流体チップおよび任意の関連する構成要素（例えば、カバー）を形成する材料は、硬質または可撓性であってもよい。当業者は、例えば、その剛性、それを通過する流体に対するその不活性（例えば、それによる劣化からの解放）、特定の装置が使用される温度におけるその堅牢性、光（例えば、紫外領域および可視領域における）に対するその透過性／不透明性、および／または材料内の特徴を製造するために使用される方法に基づいて、適切な材料を容易に選択することができる。例えば、射出成形品または他の押出成形品の場合、使用される材料は、熱可塑性樹脂（例えば、ポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン、ナイロン６）、エラストマー（例えば、ポリイソプレン、イソブテン－イソプレン、ニトリル、ネオプレン、エチレン－プロピレン、ハイパロン、シリコーン）、熱硬化性樹脂（例えば、エポキシ、不飽和ポリエステル、フェノール類）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。

本明細書に開示されるマイクロ流体チップは、典型的には、単層および多層のソフトリソグラフィ（ＭＬＳＬ）技術および／または犠牲層カプセル化方法によって構築される。ＭＬＳＬ技術は、制御チャネルおよび流路の双方を含むマイクロ流体デバイスを製造するためのいくつかの実施形態において特に有用である。一般に、ＭＬＳＬ技術は、微細加工された型上に一連のエラストマー層を成型し、型から層を除去し、次いで層を互いに融着させることを含む。犠牲層カプセル化手法では、チャネルが所望される場合はいつでもフォトレジストのパターンが堆積される。マイクロ流体デバイスの要素を製造するためのこれらの技術の使用は、例えば、Ｕｎｇｅｒら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１１３－１１６、Ｃｈｏｕら（２０００）「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｌａｂ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ－Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ａｎｄ ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」，ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ Ａｃｔｕａｔｏｒ ａｎｄ Ｓｅｎｓｏｒ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｈｉｌｔｏｎ Ｈｅａｄ，Ｓ．Ｃ．、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／０１０２５号パンフレット、２０００年１０月３日に出願された米国特許出願第０９／６７９，４３２号によって記載されており、それらの開示の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

ＭＬＳＬは、確立されたフォトリソグラフィ技術およびマイクロエレクトロニクス製造技術の進歩を利用すると考えられる。ＭＬＳＬの第１のステップは、後に、高解像度マスク上に印刷される、コンピュータドラフティングソフトウェアを使用して設計を描画することである。フォトレジストにおいて覆われたシリコンウェハは、紫外光にさらされ、マスクによって特定の領域においてフィルタリング除去される。フォトレジストがネガ型であるかポジ型であるかに応じて、露光された領域（ネガ型）または露光されていない領域（ポジ型）のいずれかが架橋し、レジストが重合する。未重合レジストは、現像液に可溶であり、その後に洗い流される。異なるフォトレジストと異なる速度でのスピンコーティングとを組み合わせることにより、ウェハが様々な異なる形状および高さでパターニングされることができる。

いくつかの実施形態では、次いで、ウェハは、パターンをポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）に転写するための型として使用される。ＭＳＬでは、異なる型から成型されたＰＤＭＳの異なる層を互いの上に積み重ねることが使用されて、重なり合う「流れ」層および「制御」層にチャネルを形成する。２つ（またはそれ以上）の層は、ポッティングプレポリマー成分と硬化剤成分とを相補的な化学量論比で混合して加硫を達成することによって互いに結合される。単純なマイクロ流体チップを形成するために、流れ層を含む型から「厚い」層が成型され、制御層を含む型から「薄い」層が成型される。双方の層を部分的に加硫した後、流れ層が型から剥離され、手動で制御層に位置合わせされる。これらの層は、結合することが可能にされ、次いでこの二重スラブが制御型から剥離され、次いで入口および出口用の孔が開けられ、二重スラブがＰＤＭＳのブランク層に結合される。より多くの時間をかけて結合した後、完成したデバイスがガラススライドに取り付けられる。

いくつかの実施形態では、複数のプレートまたはシートが切断され（例えば、レーザカッターを使用して）、両面接着剤を使用して組み立ておよび／または積層されて、多層マイクロ流体デバイスを形成することができる。いくつかの実施形態では、プレートまたはシートは、ポリカーボネート、アクリル、ポリプロピレンなどのプラスチックとすることができる。

方法

本開示はまた、本開示のマイクロ流体デバイスを使用して、試料を精製し、所望の標的分子で試料を濃縮し、および／または固相化学反応を実行する方法に関する。本方法は、いくつかの実施形態では、非磁性官能化ビーズなどの官能化ビーズが予め充填された処理導管を使用する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、磁気分離処理または技術を必要としない。いくつかの実施形態では、本方法は、交差汚染および／または試料損失のリスクを軽減する閉鎖系で実行される。

マイクロ流体デバイスに導入された溶液を精製する一般的な方法

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のマイクロ流体デバイス１００のいずれかを使用して試料を精製する方法に関する。いくつかの実施形態では、試料は、官能基化表面を有するビーズが予め充填された処理導管１０５を含む本開示のマイクロ流体デバイス１００によって精製されることができる。いくつかの実施形態では、処理導管に約１０から約１０，０００個の官能化ビーズが予め充填されることができる。他の実施形態では、処理導管に約１０から約１０００個の官能化ビーズが予め充填されてもよい。さらに他の実施形態では、処理導管に約１０から約１５０個の官能化ビーズが予め充填されてもよい。いくつかの実施形態では、予め充填された官能化ビーズは、非磁性官能化ビーズである。

いくつかの実施形態では、ビーズの官能基化表面は、精製される試料内の分子（または分子を含むコンジュゲート）の第２の部分（例えば、第２の反応性官能基）と反応性である第１の部分（例えば、第１の反応性官能基）を含む。いくつかの実施形態では、第１の部分と第２の部分との間の「反応」は、２つの部分の２つの反応性基または２つの反応性官能基の間に共有結合が形成されることを意味することができ、または、２つの部分の２つの反応性基または２つの反応性官能基が互いに会合し、互いに相互作用し、互いにハイブリダイズし、互いに水素結合することなどを意味することができる。したがって、いくつかの実施形態では、「反応」は、ハプテンと抗ハプテン抗体との結合、またはビオチンとストレプトアビジンとの結合などの結合事象を含む。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの処理チャンバに導入されたビーズの官能基化表面は、精製される試料内のビオチン化分子（例えば、ビオチンにコンジュゲートした分子）に結合するアビジンまたはストレプトアビジンを含むことができる。別の例として、いくつかの実施形態では、チオール化分子が金表面に結合されてもよい。さらに別の例として、アミン末端分子がＮＨＳ活性化ビーズ表面に結合されてもよい。

いくつかの実施形態では、ビーズの官能基化表面は、特定の抗原性分子を含むかまたはそれにコンジュゲートされた分子に結合するために使用されることができる固定化抗体を含む。さらに他の実施形態では、ビーズの官能基化表面は、特定の酵素基質を含むかまたはそれにコンジュゲートされた分子に結合するために使用されることができる酵素を含む。さらなる実施形態では、ビーズの官能基化表面は、特定の受容体リガンドを含むかまたはそれにコンジュゲートされた分子に結合するために使用されることができる受容体を含む。またさらなる実施形態では、ビーズの官能基化表面は、特定の多糖類を含むかまたはそれにコンジュゲートされた分子に結合するために使用されることができるレクチンを含む。なおさらなる実施形態では、ビーズの官能基化表面は、相補的な塩基配列を含むかまたはそれにコンジュゲートされた分子に結合するために使用されることができる核酸を含む。いくつかの実施形態では、ビーズ表面にテザリングされたＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーは、小分子、ペプチド、タンパク質、細胞などのその標的分析物に特異的に結合することができる。

いくつかの実施形態では、ビーズの表面がどのように官能化されるかにかかわらず、ビーズ自体は非磁性とすることができる。適切な非磁性ビーズは、米国特許第５，３２８，６０３号明細書に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

一般に、本開示のマイクロ流体デバイスを使用して試料を精製する方法は、（ｉ）精製される入力試料内の適切に官能化された分子のサブセットを処理導管のチャンバ内に存在する官能化ビーズに結合することと、（ｉｉ）処理導管を介して１つ以上の洗浄溶液を流して、入力試料内に含まれる未結合分子、試薬、および／または不純物を除去することと、（ｉｉｉ）処理導管を介して溶液を流して、官能化ビーズから結合分子を放出させることと、を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬が必要に応じて処理導管に導入されて、官能化ビーズに結合した分子のサブセットを誘導体化してもよい。いくつかの実施形態では、本方法は、精製のために磁気ビーズまたは磁気分離に依存しない。むしろ、精製は、一連の流体および／または試薬を処理導管に流すことによって達成される。

いくつかの実施形態では、適切に官能化された分子のサブセットは、官能化ビーズが予め充填された処理導管に入力試料を導入することによって官能化ビーズに結合され、入力試料は、適切に官能化された分子のサブセットを含む。いくつかの実施形態では、入力試料内の適切に官能化された分子のサブセットは、官能化ビーズの第２の部分と反応することができる第１の部分を含む。いくつかの実施形態では、適切に官能化された分子のサブセットは、処理導管への入力試料の導入前に生成される。いくつかの実施形態では、適切に官能化された分子のサブセットは、入力試料を、入力試料内の分子のサブセットと選択的に反応する試薬と接触させることによって生成される。例として、試薬は、官能化ビーズと反応することができる部分を有するオリゴヌクレオチド配列とすることができる。いくつかの実施形態では、反応は、官能化ビーズと反応することができる部分が分子のサブセットに導入されるコンジュゲーション反応である。いくつかの実施形態では、導入された部分は、官能化ビーズの第２の部分と反応することができる第１の部分である。

入力試料の精製方法が図８Ａおよび図８Ｂに示されている。いくつかの実施形態では、官能基化表面を有する複数のビーズが予め充填されたチャンバを有する処理導管が最初に得られる（ステップ３２０）。いくつかの実施形態では、チャンバには、官能基化表面を有する複数の非磁性ビーズが予め充填されている。いくつかの実施形態では、官能基化表面は、一対の特異的結合実体の第１のメンバーを含む。いくつかの実施形態では、官能基化表面は、アビジン、ストレプトアビジン、および抗体、酵素、受容体、レクチン、核酸配列などから選択される第１の部分を含む。いくつかの実施形態では、官能化ビーズは、ビーズ貯蔵容器からチャンバと流体連通する１つ以上のダクトにビーズを圧送することによって導入されることができる。いくつかの実施形態では、チャンバは、ビーズが導入された後に封止される。

いくつかの実施形態では、次いで、精製される分子のサブセットを含む入力試料は、ビーズ－分子複合体が形成されることができるように複数のビーズが予め充填されたチャンバを有する処理導管に導入される（ステップ３１０）。いくつかの実施形態では、ビーズ－分子複合体は、精製される分子のサブセットを含む入力試料を処理導管のチャンバに流入させ、チャンバを通過させることによって形成される（ステップ３２１）。例えば、入力試料は、流体または緩衝溶液中に提供され、流体または緩衝溶液を処理導管の入口に圧送し、流体または緩衝溶液を処理導管の入口チャネルを介して、予め充填されたビーズを有するチャンバに流すことによって導入されることができる。

いくつかの実施形態では、入力試料は、第１の部分および第２の部分が互いに反応することができるように、官能化ビーズの第１の部分と反応することができる第２の部分を有する分子のサブセットを含む。いくつかの実施形態では、第２の部分を有する分子のサブセットは、入力試料を、入力試料内の分子のサブセットと選択的に反応する試薬と接触させることによって生成される。

いくつかの実施形態では、入力試料は、第２の部分時間を有する分子が官能化ビーズと反応することを可能にする速度で処理導管を介して流される。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、約０．１ｍＬ／分から約１０００ｍＬ／分の速度で処理導管を介して流されることができる。他の実施形態では、試料は、約０．１ｍＬ／分から約１００ｍＬ／分の速度で処理導管を介して流されてもよい。

いくつかの実施形態では、第２の部分を有し、精製されるサブセット分子は、官能化ビーズとインキュベートする時間が許容される。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は、約１５秒から約９０分の間の範囲とすることができる。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は、約１分から約６０分の間の範囲とすることができる。他の実施形態では、インキュベーション期間は、約１分から約２０分の間の範囲とすることができる。インキュベーション時間を必要とするそれらの実施形態では、入力試料が処理導管のチャンバに流されると、処理導管に流体的に結合された１つ以上のポンプは、所定のインキュベーション時間の間オフにする（または流体の流量を遅くする）ように命令されることができる。

精製される分子のサブセットのビーズへの結合（すなわち、ビーズ－分子複合体の形成後）に続いて、いくつかの実施形態では、次いで、処理導管のチャンバから未結合分子および／または不純物を除去する（ステップ３１１）ために、１つ以上の流体が処理導管を介して流される（ステップ３２２）。例えば、処理導管の入口に流体を圧送し、処理導管の入口チャネルを介して処理導管のチャンバに流体を流すことによって、流体（例えば、緩衝溶液）が導入されることができる。いくつかの実施形態では、流体（例えば、第１の種類の緩衝液）は、１回チャンバを通って流される（例えば、所定量の単一種類の緩衝液がチャンバに１回流される）。他の実施形態では、同じまたは異なる流体がチャンバを２回以上流される（例えば、所定の第１の体積の第１の流体がチャンバを通って流され、次いで所定の体積の第２の流体がチャンバを通って流される）。さらに他の実施形態では、異なる流体、例えば異なる緩衝液が、チャンバを３回以上連続して流される。

いくつかの実施形態では、チャンバに流入した流体（例えば、緩衝液）は、所定の時間、例えば約１分から約６０分の間の範囲の時間、チャンバ内に保持される。他の実施形態では、処理導管内に導入された流体は、例えば処理導管内に振動を導入することによって（例えば、処理導管と連通するトランスデューサを介して）、または処理導管から少量の流体を繰り返し注入および回収するように１つ以上のポンプに指示することによって撹拌される。

いくつかの実施形態では、チャンバから流出し、出口チャネルを通り、出口を通って流れる流体廃棄物流は、実質的に全ての未結合分子および／または不純物が除去されたかどうかを判定するために、カメラ、例えば蛍光カメラなどによって監視される。いくつかの実施形態では、レーザ源を備えた蛍光カメラが出口において利用されて、未結合分子および／または不純物から放出される蛍光信号を監視することができ、この信号を制御システムにフィードバックしてバルブおよび／またはポンプの動作を命令することができる。他の実施形態では、２つの金属ワイヤを含む導電率検出器もまた使用されて、分子組成によって引き起こされる局所的なｐＨ変化を局所的に検出することもでき、この場合も、この取得されたｐＨデータは、フィードバック制御に使用されることができる。

例えば、流体がチャンバを通って出口導管に流入され、出口を通って流されるとき、それと連通する検出器（例えば、蛍光検出器）が使用されて、廃棄物流内の未結合分子および／または不純物を検出および／または定量することができる。処理導管の出口と連通する蛍光検出器もまた使用されて、標的分子が失われているかどうかを判定することもでき、失われている場合、そのような損失を緩和するように処理パラメータが調整されることができる。いくつかの実施形態では、蛍光検出器によって決定されるように、未結合分子および／または不純物の実質的に全てがチャンバから除去されるまで、流体が繰り返しおよび／または順次導入される。他の実施形態では、流体は、廃棄物流中の未結合分子および／または１つ以上の不純物の量が所定の不純物閾値未満になるまで、繰り返しおよび／または順次導入される。

処理導管のチャンバから実質的に全ての未結合分子および／または不純物を除去した後、ビーズに結合した分子のサブセットがビーズから放出され（ステップ３１２）、続いて収集される（ステップ３１３および３２４）。いくつかの実施形態では、分子のサブセットは、ビーズから分子を放出するのに適した処理導管に流体または試薬を流すことによって放出される（ステップ３２３）。いくつかの実施形態では、流体は、所定の温度までその場で予熱または加熱された緩衝流体である。いくつかの実施形態では、流体は、約８５℃から約１０５℃の間の範囲の温度に加熱される。他の実施形態では、流体は、約９０℃から約１００℃の間の範囲の温度に加熱される。いくつかの実施形態では、予熱された流体は、リザーバと熱連通する１つ以上の加熱モジュールに、流体を所定の温度に導くように命令することによって加熱されてもよい。いくつかの実施形態では、処理導管と熱連通するヒータは、導入された流体を所定の温度に加熱するように命令されることができる。いくつかの実施形態では、分子のサブセットの放出を達成するために試薬が導入される。いくつかの実施形態では、試薬は、酵素、例えば、分子を所定の位置または特定の結合において切断することができる酵素である。いくつかの実施形態では、次いで、放出された分子のサブセットは、１つ以上の下流プロセス、例えばさらなる化学反応、配列決定などにおいて使用されることができる。

マイクロ流体デバイスを使用した標的濃縮

本開示はまた、核酸試料中の特定の核酸標的配列を濃縮することによって核酸試料の複雑性を低減する方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、オリゴヌクレオチドプローブライブラリを使用して核酸試料中の特定の標的配列を濃縮する方法に関する。次いで、特異的標的配列が濃縮された核酸試料は、下流配列決定動作において使用されることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の標的濃縮の方法は、磁気ビーズまたは磁気分離技術を利用しない。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスのいずれか１つを使用する標的濃縮の方法に関する。本開示はまた、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスのいずれか１つを使用して調製された標的濃縮試料などの標的濃縮試料を使用して配列決定する方法に関する。いくつかの実施形態では、標的化配列決定は、一般に、遺伝子またはゲノム領域の選択されたセットにおける既知および新規の変異体の検出を可能にする。いくつかの実施形態では、標的濃縮試料は、次世代配列決定を使用した配列決定である。例えば、目的の核酸配列を含む試料溶液が、複数の官能化ビーズが予め充填された処理導管のチャンバに流されると、目的の核酸は、様々な化学作用によってビーズ表面に結合される。いくつかの実施形態では、続いて、緩衝液（例えば洗浄緩衝液）が処理導管を介して、その中に配置されたビーズの周りに流されて、未結合の非標的核酸および不純物を除去する。いくつかの実施形態では、次いで、溶離剤がチャンバに導入されて、温度変化または酵素的切断を介して標的核酸を放出させる。いくつかの実施形態では、次いで、放出された核酸が、出口を介して回収され、下流プロセスに移送される。

いくつかの実施形態では、標的濃縮は、ゲノム試料を得ることを含む。いくつかの実施形態では、得られたゲノム試料は、哺乳動物対象、例えばヒト対象に由来する試料である。いくつかの実施形態では、得られたゲノム試料は、哺乳動物対象から得られた血液試料または血漿試料、例えば、ヒト対象から得られた血液試料または血漿試料である。いくつかの実施形態では、得られたゲノム試料は、無細胞核酸の形態である。いくつかの実施形態では、無細胞核酸の形態の得られたゲノム試料は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡは、典型的には、約２００ｂｐから約１３０ｂｐの間の範囲のサイズである。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡは、典型的には、約１９０ｂｐから約１４０ｂｐの間の範囲のサイズである。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡは、典型的には、約１８０ｂｐから約１５０ｂｐの間の範囲のサイズである。無細胞核酸の非限定的な例は、母体の血液および血漿中に存在する循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）および胎児無細胞ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、様々なタイプの無細胞ＲＮＡの単離も包含する。

あるいは、図９を参照すると、いくつかの実施形態では、標的濃縮は、ゲノム試料、例えばヒト患者から取得されたゲノムＤＮＡ試料を得ることを含む（ステップ４１０）。いくつかの実施形態では、得られたゲノム試料は、核酸断片の集団を提供するために断片に剪断される（ステップ４１１）。いくつかの実施形態では、得られたゲノム試料の剪断は、機械的断片化（例えば噴霧または音波処理）および／または酵素的断片化（例えば制限エンドヌクレアーゼ）を使用して達成される。

いくつかの実施形態では、生成された核酸断片は、ランダムなサイズである。いくつかの実施形態では、生成された核酸断片は、約１０００塩基対未満の長さを有する。他の実施形態では、生成された核酸断片は、長さが約１００から約１０００塩基対の間の範囲の配列サイズを有する配列断片を含む。さらに他の実施形態では、生成された核酸断片は、長さが約５００から約７５０塩基対の間の範囲の配列サイズを有する配列断片を含む。いくつかの実施形態では、次いで、特定のバーコード配列を含むものなどのアダプタが、ライゲーション反応を介して核酸の集団に付加される。

ゲノム試料の取得（および／または得られたゲノム試料の任意の断片化）に続いて、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブのプール、例えば一対の特異的結合体の第１のメンバーにコンジュゲートさせたオリゴヌクレオチドプローブが、得られたゲノム試料または核酸断片の集団に導入される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブプールは、得られたゲノム試料または核酸断片の集団を含む緩衝液に導入される（ステップ４１３）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ゲノム試料または集団核酸断片内の相補的核酸配列にハイブリダイズすることができる核酸配列の参照集団である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ゲノム試料または核酸断片の集団内の所望の遺伝子、エクソンおよび／または目的の他のゲノム領域を標的とするように設計される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブが、非限定的な例として、目的の遺伝子のセット、ゲノムの全てのエクソン、特定の目的の遺伝子領域、疾患または生理学的状態などに関連するように選択される。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡ捕捉プローブである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ捕捉プローブは、Ｒｏｃｈｅ ＳｅｑＣａｐ ＥＺプローブ（インディアナ州インディアナポリスのＲｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）のプールを含む。いくつかの実施形態では、Ｒｏｃｈｅ ＳｅｑＣａｐ ＥＺプローブのプールは、それぞれが特定の配列を有する溶液中の異なるビオチン化一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの混合物を含み、個々のオリゴヌクレオチドの長さは、約５０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの範囲とすることができ、典型的なサイズは約７５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、Ｒｏｃｈｅ ＳｅｑＣａｐ ＥＺプローブプールは、配列捕捉実験において、ＤＮＡ配列決定ライブラリの標的化された相補的断片にハイブリダイズし、したがって、配列決定の前に同じＤＮＡ配列決定ライブラリの標的化されていない断片と比較してそれらを捕捉および濃縮するために使用されることができる。ＤＮＡ配列決定ライブラリは、ゲノム分析のためのゲノムＤＮＡから、またはトランスクリプトーム分析のためのＲＮＡもしくはｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡから構築されることができ、これらの核酸を抽出することができる任意の生物種のＤＮＡまたはｃＤＮＡから構築されることができる。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ゲノム試料内の相補的核酸の第１のサブセットまたは所望の遺伝子、エクソンおよび／または目的の他のゲノム領域を含む核酸断片の集団内の核酸断片にハイブリダイズして、特異的結合体の対の第１のメンバーを有する標的－プローブ複合体を形成する。いくつかの実施形態では、所望の遺伝子、エクソンおよび／または他の目的のゲノム領域を含まない、それぞれ得られたゲノム試料または核酸断片の溶液内の核酸または核酸断片の第２のサブセットは、標的－プローブ複合体を形成せず、「オフターゲット核酸」または「オフターゲット断片」と呼ばれる。したがって、オリゴヌクレオチドプローブの導入後、濃縮のための任意の溶液は、形成された標的－プローブ複合体、オフターゲット核酸もしくはオフターゲット断片、および／または遊離プローブを含むことができる（過剰量のオリゴヌクレオチドプローブが、アダプタ連結ＤＮＡ断片を含む任意の溶液に提供されると仮定する）。いくつかの実施形態では、濃縮のための溶液は、緩衝溶液中で提供される。

その後、形成された標的－プローブ複合体、オフターゲット核酸および／またはオフターゲット断片を含む濃縮用溶液は、マイクロ流体デバイスの処理導管のチャンバに導入され、チャンバには複数のビーズが予め充填される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスのいずれかが標的濃縮のために利用されることができる。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、可動部品、例えば可動機械部品を有しない処理導管を含む。いくつかの実施形態では、チャンバに予め充填された複数のビーズは非磁性であり、マイクロ流体デバイスの処理導管は、磁気ストリップを含まない。いくつかの実施形態では、標的濃縮に利用されるマイクロ流体デバイスは、磁気分離に依存しない。

いくつかの実施形態では、処理導管には、約１０から約１０，０００個以上の官能化ビーズが予め充填されてもよい。他の実施形態では、処理導管には、約１０から約１０００個の官能化ビーズが予め充填されてもよい。さらに他の実施形態では、処理導管には、約１０から約１５０個の官能化ビーズが予め充填されてもよい。いくつかの実施形態では、複数のビーズは、特異的結合体の対の複数の第２のメンバーによって官能化される。いくつかの実施形態では、特異的結合体の対の第２のメンバーは、アビジンまたはストレプトアビジンを含む。

いくつかの実施形態では、濃縮用溶液は、処理導管の入口に、処理導管の入口導管を介して、複数の官能化ビーズが予め充填されたチャンバに流される。いくつかの実施形態では、濃縮のための溶液内の標的－プローブ複合体が処理導管のチャンバ内のビーズに結合されるように、標的－プローブ複合体の特異的結合体の対の第１のメンバーは、官能化ビーズの特異的結合体の対の第２のメンバーと反応する（ステップ４１４）。同様に、いくつかの実施形態では、濃縮のための溶液中の任意の遊離プローブの特異的結合体の対の第１のメンバーは、官能化ビーズに結合されるようになる。このようにして、標的－プローブ複合体および／または遊離プローブは、チャンバ内のビーズに結合されるようになる。したがって、チャンバ内のビーズは、固定化（すなわち、ビーズが結合している）標的－プローブ複合体および遊離プローブを含む。いくつかの実施形態では、未結合のオフターゲット核酸またはオフターゲット断片も反応チャンバ内に含まれる。

いくつかの実施形態では、標的－プローブ複合体は、官能化ビーズとインキュベートする時間が許容される。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は、約１分から約６０分の間の範囲とすることができる。他の実施形態では、インキュベーション期間は、約１分から約４０分の間の範囲とすることができる。さらに他の実施形態では、インキュベーション期間は、約１分から約２０分の間の範囲とすることができる。インキュベーション時間が利用される実施形態では、入力試料が処理導管のチャンバに流されると、処理導管に流体的に結合された１つ以上のポンプは、所定のインキュベーション時間の間オフになるように命令されることができる。

標的－プローブ複合体の官能化ビーズへの結合および／または遊離プローブのビーズへの結合に続いて、次いで、未結合の標的外核酸、標的外断片、試薬および／または不純物が処理導管のチャンバから除去される（ステップ４１５）。いくつかの実施形態では、濃縮のために溶液に導入されたオリゴヌクレオチドプローブのいずれにも相補的でなかったオフターゲット断片の除去は、残りの固定化された標的ゲノム材料を濃縮する。

例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上の流体が処理導管に流されて、処理導管のチャンバからオフターゲット核酸またはオフターゲット断片、試薬、および／または不純物を除去する。いくつかの実施形態では、処理導管の入口に流体を圧送し、処理導管の入口チャネルを介して処理導管のチャンバに流体を流すことによって、流体（例えば、緩衝溶液）が導入されることができる。いくつかの実施形態では、流体（例えば、第１の種類の緩衝液）は、１回チャンバを通って流される（例えば、所定量の単一種類の緩衝液がチャンバに１回流される）。他の実施形態では、同じまたは異なる流体がチャンバを２回以上流される（例えば、所定の第１の体積の第１の流体がチャンバを通って流され、次いで所定の体積の第２の流体がチャンバを通って流される）。さらに他の実施形態では、異なる流体、例えば異なる緩衝液が、チャンバを３回以上連続して流される。

いくつかの実施形態では、処理導管のチャンバ内に配置されたビーズは、３回以上連続して洗浄される。いくつかの実施形態では、処理導管のチャンバ内に配置されたビーズは、約１から約１４の間の範囲のｐＨを有する緩衝液によってさらに３回連続して洗浄される。他の実施形態では、処理導管のチャンバ内に配置されたビーズは、約３から約１２の間の範囲のｐＨを有する緩衝液によってさらに３回洗浄される。さらに他の実施形態では、処理導管のチャンバ内に配置されたビーズは、約５から約８の間の範囲のｐＨを有する緩衝液によってさらに３回洗浄される。いくつかの実施形態では、ビーズは、リン酸緩衝生理食塩水によって順次洗浄される。

いくつかの実施形態では、チャンバに流入された流体（例えば、緩衝液）は、所定の時間、例えば約１分から約６０分の間の範囲の時間、チャンバ内に保持される。他の実施形態では、処理導管内に導入された流体は、例えば処理導管内に振動を導入することによって（例えば、処理導管と連通するトランスデューサを介して）、または処理導管から少量の流体を繰り返し注入および回収するように１つ以上のポンプに指示することによって撹拌される。

処理導管のチャンバから実質的に全てのオフターゲット核酸、オフターゲット断片、試薬、および／または不純物を除去した後、標的分子がチャンバから除去され（ステップ４１６）（すなわち、ビーズから放出される）、続いて収集される（ステップ４１７）。いくつかの実施形態では、標的分子または標的分子複合体は、粒子またはビーズから標的分子または標的分子複合体を放出するのに適した処理導管に流体または試薬を流すことによって放出される。いくつかの実施形態では、標的分子は、処理導管を通して加熱された流体を流すことによってチャンバから除去される。

例えば、予熱された流体がチャンバに導入されて、放出をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、予熱された流体の温度は、約４℃から約１５０℃の範囲とすることができる。他の実施形態では、予熱された流体の温度は、約２０℃から約９５℃の範囲とすることができる。さらに他の実施形態では、予熱された流体の温度は、約３７℃から約６５℃の範囲とすることができる。いくつかの実施形態では、加熱された流体は、標的－プローブ複合体の変性を可能にする。いくつかの実施形態では、流体は加熱緩衝液である。緩衝剤の非限定的な例は、クエン酸、リン酸二水素カリウム、ホウ酸、ジエチルバルビツール酸、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）、ジメチルアルシン酸、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（ＴＲＩＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、およびそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、マスキング解除剤は水である。他の実施形態では、緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（ＴＲＩＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、またはそれらの組み合わせから構成されることができる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約５から約９の範囲のｐＨを有する。

いくつかの実施形態では、流体がチャンバに導入され、次いで加熱される。いくつかの実施形態では、流体、ビーズ、および／または処理導管は、約８５℃から約１０５℃の範囲の温度に加熱される。他の実施形態では、流体、ビーズ、および／または処理導管は、約９０℃から約１００℃の範囲の温度に加熱される。さらに他の実施形態では、流体、ビーズ、および／または処理導管は、約８５℃から約１０５℃の範囲の温度に加熱される。

他の実施形態では、放出を達成するために試薬（例えば、酵素）が導入される。好適な酵素の例は、（リジン残基およびアルギニン残基のカルボキシル末端でペプチド結合を切断する）トリプシンおよび（アルギニン残基のカルボキシル側で切断する）クロストリパインを含む。

いくつかの実施形態では、試薬は、ビーズに結合した標的－プローブ複合体および／またはビーズに結合した遊離プローブとインキュベーションする時間が許容される。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は、約１分から約６０分の間の範囲とすることができる。他の実施形態では、インキュベーション期間は、約１分から約４０分の間の範囲とすることができる。さらに他の実施形態では、インキュベーション期間は、約１分から約２０分の間の範囲とすることができる。

次いで、放出された標的分子は、１つ以上の下流プロセス、例えば、配列決定、増幅、さらなるカップリングなどにおいて使用されることができる。いくつかの実施形態では、配列決定は、当業者に公知の任意の方法にしたがって行われることができる。いくつかの実施形態では、配列決定法は、サンガー配列決定法および色素ターミネーター配列決定法、ならびにパイロ配列決定法、ナノポア配列決定法、マイクロポアに基づく配列決定法、ナノボール配列決定法、ＭＰＳＳ、ＳＰＬｉＤ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｓｔａｒｌｉｔｅ、ＳＭＲＴ、ｔＳＭＳ、合成による配列決定法、ライゲーションによる配列決定法、質量分析配列決定法、ポリメラーゼ配列決定法、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）配列決定法、顕微鏡に基づく配列決定法、マイクロ流体サンガー配列決定法、顕微鏡に基づく配列決定法、ＲＮＡＰ配列決定法などの次世代配列決定技術を含む。配列決定の装置および方法は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４１４４４７８号パンフレット、ＷＯ２０１５０５８０９３号パンフレット、ＷＯ２０１４１０６０７６号パンフレットおよびＷＯ２０１３０６８５２８号パンフレットに開示されており、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

標的濃縮の方法ならびにマイクロ流体デバイスを通る流体および／または試薬の流れは、図１Ｅを参照して例示されることができる。いくつかの実施形態では、標的－プローブ複合体、オフターゲット核酸、オフターゲット断片、および／または遊離プローブを含む濃縮される溶液は、例えばリザーバ２６４に保存される。いくつかの実施形態では、濃縮される溶液は緩衝液を含む。次いで、制御システムは、ポンプ２５０Ａおよび２５０Ｂの一方または双方によって濃縮される溶液の引き出しを可能にするために開くために、バルブ２５７および２５５に信号を送信することができる。次いで、制御装置は、濃縮のために取り出された溶液が次いで処理導管１０５に注入されることができるように作動させるためにバルブ２５７および２５５にさらなる信号を送信することができ、処理導管には官能化ビーズが予め充填されている。いくつかの実施形態では、予め充填されたビーズは非磁性である。いくつかの実施形態では、処理導管１０５は、可動部品を含まない。上記のように、標的－プローブ複合体および遊離プローブは、官能化ビーズに結合されるようになることができる。

その後、制御システムは、バルブ２５５および２５８に信号を送信して、リザーバ２６０からポンプ２５０Ａおよび２５０Ｂの一方または双方への第１の緩衝液の引き出しを可能にすることができる。次いで、制御システムは、オフターゲット核酸またはオフターゲット断片がチャンバから除去されるように、第１の緩衝液が処理導管１０５に注入されるように作動するようにバルブ２５５、２５８、２５７に命令することができる。これらのステップは、同じ第１の緩衝液がリザーバ２６０から引き出され、処理導管１０５に注入されるように、１回以上繰り返されてもよい。

次に、制御システムは、バルブ２５５および２５６に信号を送信して、リザーバ２６３からポンプ２５０Ａおよび２５０Ｂの一方または双方への第２の緩衝液の引き出しを可能にすることができる。次いで、制御システムは、オフターゲット核酸またはオフターゲット断片がチャンバから除去されるように、第２の緩衝液が処理導管１０５に注入されるように作動するようにバルブ２５５、２５６、２５７に命令することができる。これらのステップは、同じ第２の緩衝液がリザーバ２６３から引き出され、処理導管１０５に注入されるように、１回以上繰り返されてもよい。

次いで、制御システムは、バルブ２５５および２５６に信号を送信して、リザーバ２６２からポンプ２５０Ａおよび２５０Ｂの一方または双方への第３の緩衝液の引き出しを可能にすることができる。次いで、制御システムは、オフターゲット核酸またはオフターゲット断片がチャンバから除去されるように、第３の緩衝液が処理導管１０５に注入されるように作動するようにバルブ２５５、２５６、２５７に命令することができる。これらのステップは、同じ第３の緩衝液がリザーバ２６２から引き出され、処理導管１０５に注入されるように、１回以上繰り返されてもよい。

最後に、制御システムは、バルブ２５５および２５８に信号を送信して、リザーバ２６１からポンプ２５０Ａおよび２５０Ｂの一方または双方への試薬の引き出しを可能にすることができる。次いで、制御システムは、結合された標的－プローブ複合体および結合された遊離プローブがビーズから放出されるように、試薬が処理導管１０５に注入されるようにバルブ２５５、２５８および２５７に作動するように命令することができる。試薬が緩衝液である実施形態では、制御システムは、処理導管１０５と熱連通するヒータに、導入された試薬を導くように命令することができる。次いで、放出された標的－プローブ複合体および放出遊離プローブを含む溶離液が回収され、下流処理、例えば次世代配列決定に使用されることができる。

マイクロ流体デバイスの処理導管内で行われる反応／固体状態合成

本開示は、いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの処理導管内で１つ以上の固相反応を行う方法を提供する。一般に、本開示のマイクロ流体デバイスの処理導管内で１つ以上の固相反応を実施する方法は、（ｉ）入力試料内の適切に官能化された分子のサブセットを処理導管のチャンバ内に存在する官能化ビーズに結合することと、（ｉｉ）処理導管を介して１つ以上の洗浄溶液を流して、入力試料内に含まれる未結合分子、試薬、および／または不純物を除去することと、（ｉｉｉ）１つ以上の試薬を処理導管に流すことと、（ｉｖ）処理導管を介して溶液を流して、官能化ビーズから結合分子を放出させることと、を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬が必要に応じて処理導管に導入されて、官能化ビーズに結合した分子のサブセットを誘導体化してもよい。

いくつかの実施形態では、適切に官能化された分子のサブセットを含む入力試料を、官能化ビーズが予め充填された処理導管に導入することによって、適切に官能化された分子のサブセットが官能化ビーズに結合される。いくつかの実施形態では、入力試料内の適切に官能化された分子のサブセットは、官能化ビーズの第２の部分と反応することができる第１の部分を含む。いくつかの実施形態では、適切に官能化された分子のサブセットは、処理導管への入力試料の導入前に生成される。いくつかの実施形態では、次いで、さらに反応させる分子のサブセットを含む入力試料は、ビーズ－分子複合体が形成されることができるように複数のビーズが予め充填されたチャンバを有する処理導管に導入される。いくつかの実施形態では、ビーズ－分子複合体は、さらに反応させる分子のサブセットを含む入力試料を処理導管のチャンバに流入させ、チャンバを通過させることによって形成される。

ビーズにさらに反応させる分子のサブセットの結合に続いて（すなわち、ビーズ－分子複合体の形成後）、いくつかの実施形態では、次いで、１つ以上の流体が処理導管に流されて、未結合分子および／または不純物を処理導管のチャンバから除去する。未結合分子および／または不純物を除去するこのステップは、１回以上、例えば２回以上、３回以上、４回以上など繰り返されてもよい。

その後、１つ以上の試薬が処理導管に流されることができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬は、ビーズに結合した分子と反応性である。例えば、ビーズに結合した分子は、オリゴヌクレオチドとすることができ、試薬は、コンジュゲーションのためのヌクレオチドまたは短いオリゴヌクレオチドを含むことができる。別の例として、ビーズに結合した分子は、ペプチドとすることができ、試薬は、コンジュゲーションのためのアミノ酸または短いペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、ビーズに結合した分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーとすることができ、試薬は、表面固定化アプタマー分子に特異的に結合する小分子、ペプチド、タンパク質または細胞を含むことができる。第１の導入された試薬との第１の反応の後、流体が処理導管に導入されて、過剰な試薬および／または任意の不純物を除去することができる。この洗浄ステップは、１回以上行われてもよい。１つ以上の試薬を導入し、および／または１つ以上の流体を導入して過剰な試薬および／または不純物を除去するプロセスは、１回以上、例えば２回以上、３回以上、４回以上など、繰り返されてもよい。

全ての所望の反応が行われた後、ビーズに結合した分子のサブセットは、次いでビーズから放出され、続いて収集される。いくつかの実施形態では、分子のサブセットは、ビーズから分子を放出するのに適した処理導管に流体または試薬を流すことによって放出される。いくつかの実施形態では、流体は、所定の温度までその場で予熱または加熱された緩衝流体である。いくつかの実施形態では、流体は、約８５℃から約１０５℃の間の範囲の温度に加熱される。他の実施形態では、流体は、約９０℃から約１００℃の間の範囲の温度に加熱される。いくつかの実施形態では、分子のサブセットの放出を達成するために試薬が導入される。いくつかの実施形態では、試薬は酵素である。いくつかの実施形態では、次いで、放出された分子のサブセットは、１つ以上の下流プロセスにおいて使用されることができる。

実施例

実施例１－ビオチン化オリゴヌクレオチドの捕捉

デバイス中の標的捕捉を試験するために、ストレプトアビジン官能化ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ製のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐｌｕｓ ＵｌｔｒａＬｉｎｋ Ｒｅｓｉｎ）を充填した２つのマイクロ流体ビーズ捕捉デバイスを調製した。ビオチン化オリゴヌクレオチドを入れた５０μＬの試料をマイクロ流体デバイスのうちの１つに流し、フロースルー溶離液を分析のために収集した。対照実験として、非ビオチン化オリゴヌクレオチドを第２のマイクロ流体デバイスを通して並行して処理した。次いで、処理前のフロースルー（Ｆｆ）および試料入力量（Ｉ）をバイオアナライザＤＮＡ１０００キットを用いて分析した。ビオチン化オリゴヌクレオチド試料の場合、オリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用を介してビーズ上に捕捉され、したがってフロースルーは、オリゴを表す検出可能なピークを示さなかった（図１０の右パネル）。非ビオチン化オリゴヌクレオチドは、ビーズ表面に結合しなかったが、ビーズ充填チャンバを通過し、試料入力とフロースルーとの間で同等の電気泳動図が得られた（図１０の左パネル）。これは、本開示のマイクロ流体デバイスによるビオチン化オリゴヌクレオチドの非常に効率的な捕捉が達成されることができることを実証した。

実施例２－標的の捕捉および温度媒介放出

標的プローブ複合体の捕捉とそれに続く標的オリゴヌクレオチドの温度媒介放出を試験した。標的オリゴヌクレオチドを最初に、相補的配列を含有するビオチン化プローブとアニーリングした。全ての標的をビオチン化プローブと複合体化させるために、１０倍過剰量のプローブを使用した。次いで、標的－プローブ複合体（５００ｐｍｏｌ）を含む５０μＬの試料入力を、ストレプトアビジン被覆ビーズが充填されたマイクロ流体デバイスに流した。合計５画分（各１０μＬ×５回）のフロースルー（Ｆｆ）を回収した。次いで、マイクロ流体デバイスをＰＢＳ緩衝液によって洗浄し、洗浄緩衝液を回収した（Ｗ）。最後に、マイクロ流体デバイスのビーズ充填チャンバを約９５℃に加熱して、ビーズ表面に付着したプローブから標的オリゴを変性させ、溶出液を回収した（Ｅ）。続いて、標的オリゴに特異的なプライマーを使用して、１つの試料入力物（Ｉ）およびデバイスからの３つの収集物（Ｆｆ、Ｗ、Ｅ）に対してｑＰＣＲを実行した。結果を図１１に示すが、これは、標的－プローブ複合体がマイクロ流体デバイス内のビーズによって９８％の捕捉効率で捕捉され、洗浄による損失が最小であった（＜１％）ことを実証している。温度媒介放出後の総回収率は約２４％と計算された。このような低い放出効率は、９５℃でビーズ充填チャンバ内で発生した気泡によって妨げられることが観察された非効率的な液体収集に起因した。

実施例３－標的の捕捉および酵素放出

次に、標的－プローブ複合体の捕捉および酵素放出を試験した。特異的な酵素的切断のために、ウラシルをプローブ配列とビオチンとの間に配置した（図１２）。次いで、標的オリゴヌクレオチドを、ウラシルを組み込んだビオチン化プローブとアニーリングした。全ての標的をビオチン化プローブと複合体化させるために、１０倍過剰量のプローブを使用した。次いで、標的－プローブ複合体（５００ｐｍｏｌ）を含有する試料入力５０μＬを、ストレプトアビジン被覆ビーズが充填されたマイクロ流体デバイスに流した。フロースルー（Ｆｆ）の合計５画分（各１０μＬ×５回）を回収した。次いで、デバイスをＰＢＳ緩衝液によって洗浄し、洗浄緩衝液を回収した（Ｗ）。最後に、ビーズ充填チャンバをウラシル特異的切除試薬（「ＵＳＥＲ」）酵素とともにインキュベートして、ウラシル部位を切断し、ビーズ表面から標的－プローブ複合体を放出させ、溶出液を回収した（Ｅ）。ここで、ウラシルは、プローブ配列とビオチンとの間に位置する。続いて、標的オリゴヌクレオチドに特異的なプライマーを使用して、１つの試料入力（Ｉ）および装置からの３つの収集物（Ｆｆ、Ｗ、Ｅ）に対してｑＰＣＲを実行した。標的－プローブ複合体の捕捉効率は、緩衝液洗浄による最小損失（＜１％）で約７５％であると計算された。酵素的切断による放出効率は約７２％であり、５３．６％の総回収率（溶出液／入力量）が得られた。

本明細書中で言及されるおよび／または出願データシートにおいてリスト化される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、様々な特許、出願、および刊行物の概念を使用してさらに別の実施形態を提供するように変更されることができる。

本開示は、いくつかの例示的な実施形態を参照して説明されてきたが、本開示の原理の精神および範囲内に含まれるであろう多くの他の変更および実施形態が当業者によって考案されることができることを理解されたい。より具体的には、合理的な変形および変更は、本開示の精神から逸脱することなく、前述の開示、図面、および添付の特許請求の範囲内の主題の組み合わせ構成の構成部品および／または配置において可能である。構成部品および／または配置の変形および変更に加えて、代替の使用法も当業者にとって明らかであろう。

Claims (15)

1. マイクロ流体チップであって、複数のビーズを含むチャンバを備える処理導管であって、前記チャンバの壁の第１の部分が、入口チャネルと流体連通する第１の開口部を備え、前記チャンバの前記壁の第２の部分が、出口チャネルと流体連通する第２の開口部を備え、前記チャンバの前記壁の第３の部分が、ダクトと流体連通するダクト開口部を備え、前記第１および第２の開口部が、前記チャンバ内の前記複数のビーズの平均直径よりも小さく、前記ダクト開口部が、前記チャンバ内の前記複数のビーズの前記平均直径よりも大きい、前記マイクロ流体チップ。
2. 前記マイクロ流体チップが機械的に移動する部品を備えない、請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
3. 前記マイクロ流体チップが非磁性材料からなる、請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
4. 前記複数のビーズが非磁性ビーズである、請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
5. 前記マイクロ流体チップが１つの処理導管を備える、請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
6. 前記マイクロ流体チップが、２～２０個の間の独立して動作可能な処理導管を備える、請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
7. マイクロ流体チップであって、２つ以上のチャンバを備える処理導管であって、前記２つ以上のチャンバのうちの任意の２つの隣接するチャンバが移送チャネルを介して互いに流体的に結合され、前記２つ以上のチャンバのうちの少なくとも１つが複数のビーズを含み、前記２つ以上のチャンバのうちの第１のチャンバの壁の一部が、入口チャネルと流体連通する第１の開口部を備え、前記２つ以上のチャンバのうちの第２のチャンバの壁の一部が、出口チャネルと流体連通する第２の開口部を備え、前記２つ以上のチャンバのうちの少なくとも１つが、ダクトと流体連通するダクト開口部を備え、前記第１および第２の開口部が、前記２つ以上のチャンバのうちの前記少なくとも１つの内部の前記複数のビーズの平均直径よりも小さく、前記ダクト開口部が、前記２つ以上のチャンバのうちの前記少なくとも１つの内部の前記複数のビーズの前記平均直径よりも大きい、前記マイクロ流体チップ。
8. 前記移送導管が蛇行形状を含む、請求項７に記載のマイクロ流体チップ。
9. 請求項１～６のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップを備えるシステムであって、流体モジュールおよび制御システムをさらに備える、前記システム。
10. 配列決定装置をさらに備える、請求項９に記載のシステム。
11. 配列決定のための標的核酸配列の集団を得る方法であって、（ａ）オリゴヌクレオチドプローブのプールを得られたゲノム試料に導入して標的－プローブ複合体を形成すること、ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブのプールが、前記得られたゲノム試料内の相補的核酸配列にハイブリダイズすることができる参照核酸配列を含み、前記オリゴヌクレオチドプローブが、一対の特異的結合実体の第１のメンバーを含む、（ｂ）形成された前記標的－プローブ複合体を含む溶液をマイクロ流体チップの処理導管に流すこと、ここで、前記処理導管が複数のビーズを含むチャンバを備え、前記複数のビーズが前記一対の特異的結合実体の第２のメンバーによって官能化される、（ｃ）オフターゲット核酸を除去するために前記処理導管を介して少なくとも１つの流体を流すこと、および（ｄ）少なくとも１つの試薬を前記処理導管に流して、前記標的核酸配列を得ること、を含む、前記方法。
12. 前記少なくとも１つの試薬が緩衝液であり、前記処理導管が約９０℃～約１００℃の範囲の温度に加熱される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記少なくとも１つの流体を流すことが、少なくとも２回または少なくとも３回連続して繰り返される、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 標的核酸配列の前記集団を配列決定することをさらに含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記得られたゲノム試料が無細胞核酸を含む、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
    

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