JP2023510026A - インキュベーター - Google Patents
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Abstract
Description
多くの場合、インキュベーター内には大気圧よりも高い圧力がかかっておらず、また、定圧に設定されている場合が多い。公開番号がCN102978112Aである特許出願では、高圧環境下で、筐体内の細胞培養に必要な一定の圧力を維持しつつ、通常のバルブを用いるとガスの流入が速くなり過ぎて筐体内のガスの圧力が大きくなり過ぎるのを避けるため、第1バルブと第2バルブはいずれもニードルバルブを採用し、かつ前記第1バルブを通る筐体内のガスと前記第2バルブを通る大気は順次に高圧酸素減圧弁、流量計を経て前記ガス分析計に入り、サンプリングガスの量が制御される、高圧細胞インキュベーターが開示されている。
好ましくは、前記電動シリンダーは、電動プッシュロッドであり、前記電動プッシュロッドは、前記ピストンを移動させて動かすことが可能である。
前記増圧ガスラインには、増圧ポンプ及び増圧制御弁が設けられ、前記増圧ポンプは、前記ガスタンクから前記筐体へガスを送るために用いられ、前記増圧制御弁は、前記増圧ガスラインの開放及び遮断を制御するために用いられる。
前記減圧ガスラインには、減圧ポンプ及び減圧制御弁が設けられ、前記減圧ポンプは、前記筐体から前記ガスタンクへガスを送るために用いられ、前記減圧制御弁は、前記減圧ガスラインの開放及び遮断を制御するために用いられる。
図1に示すように、筐体16は、チャンバー3を含み、筐体16はさらに、上部に位置する給気口4、底部に位置する排気口5を含み、チャンバー3にはホルダー8が設けられ、ホルダー8は、微生物培養皿などの器具を置くのに用いられる。図2に示すように、変圧装置9は、シリンダー90とピストン91とを含む。シリンダー90は、筐体16に接続されている。筐体16は、図示されていない変圧継ぎ手を有している。この変圧継ぎ手を介して、シリンダー90内の空間がチャンバー3と連通することにより、ピストン91を動かすことで、シリンダー90内のガスを圧縮し、チャンバー3内にガス圧を送り込むことができる。ガス圧を送り込む場合、正圧を送り込んでもよく、又は負圧を送り込んでもよい。図2に示すように、ピストン91を左方向に移動させると正圧が送り込まれ、右方向に移動させると負圧が送り込まれる。変圧継ぎ手は、シリンダー90の断面とほぼ同じ大きさに設置されてもよく、こうすれば、シリンダー90とチャンバー3の内の空間がほぼ同じ空間となり、ピストン91の移動に同期して内部のガス圧が変化可能となる。別の実施形態では、変圧継ぎ手が小さく設置され、シリンダー90とチャンバー3との間で、ガス圧の変化の遅延が生じ、ピストン91の動きが一定期間停止してから、両者の内部のガス圧はやっと等しくなる。
「異なる条件」又は「異なる培養条件」という用語は、比較に関与する細胞の培養条件同士は、以下に示す特別なガス環境特性のみが異なることを示し、これらの一連の比較用の異なる培養条件は、「4種類の条件」と称される。
常酸素(20%):酸素濃度20%であり、1気圧(1atm)を超える追加的な加圧はしない。
低酸素(5%):酸素濃度5%であり、1気圧を超える追加的な加圧はしない。
低酸素静圧(5%+静):酸素濃度5%であり、1気圧において追加的に95mmHgの一定の圧力を加えて、変圧装置9により筐体16に加圧を行い、追加で加える圧力が95mmHgに達する時に、ガス補充して加圧することを止めないという前提で、筐体16の給気と排気が動的平衡になるようにして、筐体16のガスを1気圧+95mmHgに維持させる。
低酸素動圧(5%+動):酸素濃度5%であり、1気圧において追加的に圧力を加えて、筐体16内の圧力は1気圧+75~115mmHgの範囲で正弦波状に、14回/分の頻度で周期的に変動する。
1) 完全な人体毛包組織を入手し、顕微ピンセットを用いて、毛包組織を1.5mL EPチューブの底に丁寧に配置した。1毛包毎に酵素分解液TripLE (Gibco-12604021) を5μL添加し、37℃、5% CO2、インキュベーター内で3時間放置し、1時間ごとにチューブの底を丁寧にはじき、穏やかに混合した。
2) 3時間の酵素分解の結果、毛包の外毛根鞘層は完全に酵素分解されたが、毛幹部分は完全には酵素分解できないことは鏡下で見える。酵素分解されなかった部分を取り出すことなく、100~1000μLのピペッターで10回軽く吸い込み吐き出し、酵素分解液を完全に混和した。1分間静置し、酵素分解されなかった毛幹がEPチューブの底に沈んでから、上層の酵素分解懸濁液を吸引し、これが初代間葉系幹細胞となる。
6ウェルプレートの1ウェルに、毛包5本をまとめた、酵素分解によって得られた初代間葉系幹細胞懸濁液25μLを添加してから、羊水培地(広州白雲山拜迪生物医薬有限公司より購入)2mLを加えて再懸濁させる。6ウェルプレートは、それぞれ常酸素(20%)、低酸素(5%)、低酸素静圧(5%+静圧)、低酸素動圧(5%+動圧)の4種類の条件で37℃で培養が行なわれ、3日ごとに液交換する。
3) 10~12日まで培養し、6ウェルプレート内において細胞密度が80%以上に達することが見えるところで培地を捨てることができ、6ウェルプレートの底に0.5mLの TryplE消化液を加えてから37℃のインキュベーター内に置いて3分間消化し、その後6ウェルプレートに1mLの羊水培地を加えて消化を終了し、上清を取り出して15mLの遠心管の中に置き、1mLの羊水培地でウェルプレートを1回リンスし、リンスした液を前記遠心管の中に加えた。遠心分離機で1500r.p.m.で5分間遠心分離し、上清を捨て、羊水培地1mLを加えて再懸濁し、計数してT25培養フラスコに接種し、P1継代毛包間葉系幹細胞を得た。
4) 細胞を、P12継代になるまで継代培養し続け、4種類の条件下で、細胞について常にそれぞれの培養条件を維持した。増幅倍数=継代するたびに取得した細胞数/接種した細胞数。本実施例では、厳密に5,000細胞/cm2の密度で継代を行い、1つのT25培養フラスコの面積が25 cm2、すなわち1つのT25培養フラスコに毎回1.25 × 105個の細胞を接種し、この場合、増幅倍数の計算式は「増幅倍数=毎回取得した細胞数/(1.25 x 105)」となる。
その結果を図5、図6に示す。結果として、低酸素で培養した間葉系幹細胞の増幅倍数は常酸素の場合よりも高く、加圧によって、更に増幅倍数が上昇し、低酸素動圧の条件下で、間葉系幹細胞の増幅倍数が最も高くなることがわかった。
Claims (17)
- 筐体を備えるインキュベーターであって、変圧装置をさらに備え、前記筐体は変圧継ぎ手を有し、前記変圧装置は前記変圧継ぎ手を介して前記筐体に接続され、前記変圧装置は前記筐体に変動するガス圧又は一定のガス圧を送り込むために用いられることを特徴とするインキュベーター。
- 前記変圧装置は、シリンダーとピストンを備え、前記シリンダーは、前記変圧継ぎ手を介して前記筐体に接続され、前記ピストンは、前記ピストンの移動により前記ガス圧が送り込まれるように前記シリンダー内に移動可能に設置されていることを特徴とする請求項1に記載のインキュベーター。
- 前記シリンダーは、前記変圧継ぎ手に直接接続され又はパイプを介して接続されていることを特徴とする請求項2に記載のインキュベーター。
- 前記シリンダーは、前記変圧継ぎ手に直接接続され、前記変圧継ぎ手は、前記ピストンの移動に同期して前記シリンダー及び前記筐体がガス圧を変化できるように十分な大きさを有することを特徴とする、請求項2に記載のインキュベーター。
- 前記シリンダーが前記筐体に固定して接続されおり、好ましくは、前記シリンダーが前記筐体の上部に固定して接続されていることを特徴とする請求項2に記載のインキュベーター。
- 前記変圧装置は、電動シリンダー、ガスシリンダー、油圧シリンダーのいずれかをさらに備え、
好ましくは、前記電動シリンダーは、サーボモータと動力伝達機構とを備え、前記動力伝達機構は、前記サーボモータと前記ピストンとを接続して前記サーボモータの回転を前記ピストンの移動に変換し、
好ましくは、前記電動シリンダーは、電動プッシュロッドであり、前記電動プッシュロッドは、前記ピストンを移動させて動かすことが可能であることを特徴とする、請求項2に記載のインキュベーター。 - 前記変圧装置は、増圧ガスライン及び減圧ガスラインを介して前記筐体に接続されるガスタンクを備え、
前記増圧ガスラインには、増圧ポンプ及び増圧制御弁が設けられ、前記増圧ポンプは、前記ガスタンクから前記筐体へガスを送るために用いられ、前記増圧制御弁は、前記増圧ガスラインの開放及び遮断を制御するために用いられ、
前記減圧ガスラインには、減圧ポンプ及び減圧制御弁が設けられ、前記減圧ポンプは、前記筐体から前記ガスタンクへガスを送るために用いられ、前記減圧制御弁は、前記減圧ガスラインの開放及び遮断を制御するために用いられることを特徴とする、請求項1記載のインキュベーター。 - 前記筐体は、さらに安全弁を備え、前記筐体内の圧力が安全閾値を超えると、前記安全弁が開弁することを特徴とする、請求項1に記載のインキュベーター。
- 前記筐体が、前記変圧継ぎ手とは独立した、開閉可能な給気口と開閉可能な排気口とをさらに備えることを特徴とする、請求項1に記載のインキュベーター。
- 前記インキュベーター内には、滅菌装置又は/及び加湿装置又は/及び電気加熱装置が設けられていることを特徴とする、請求項1に記載のインキュベーター。
- 前記滅菌装置が、紫外線放射装置又は蒸気滅菌装置であることを特徴とする、請求項10に記載のインキュベーター。
- 前記インキュベーター内のガスは、1種又は複数種であり、好ましくは3ガスインキュベーターにされ、より好ましくは、前記ガスは、二酸化炭素、窒素及び酸素であることを特徴とする、請求項1に記載のインキュベーター。
- 前記インキュベーターは、さらにガス補充システムを備え、
前記ガス補充システムは、
前記筐体内のガスを排出するための圧力リリーフ装置と、
前記圧力リリーフ装置が排出を行うと同時に、プロセスパラメータが安定したガスを前記筐体に供給するガス供給システムと、を備えることを特徴とする、請求項1から12のいずれか一項に記載のインキュベーター。 - 筐体内のガスが乱流状態になるようにしてガスの均一度を維持するためのガス混合装置が前記筐体内に設けられていることを特徴とする、請求項13に記載のインキュベーター。
- 前記ガス供給システムは予混合タンクを備え、前記予混合タンクは送り込みラインによって1種又は複数種のガスを受け取り、前記予混合タンクは送り出しラインによって前記筐体と接続され、前記予混合タンク内にガス混合装置が設置され、前記送り込みラインには、ガス源に対してガス源制御装置が設置され、前記送り出しラインには、前記筐体に対して給気制御装置が設置されていることを特徴とする、請求項13に記載のインキュベーター。
- 前記予混合タンク内には、さらにガス制御装置が設けられ、前記ガス制御装置は、ガス濃度検出器、加熱装置、加湿装置及び/又は温度・湿度検出装置を備えることを特徴とする、請求項15に記載のインキュベーター。
- 前記ガス源制御装置及び/又は前記給気制御装置は、加熱装置、加湿装置又は/及びガスフィルターを備えることを特徴とする、請求項16に記載のインキュベーター。
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