JP2023507599A - 流体を収容するための収容ユニット、収容ユニットを製造するための方法および装置、収容ユニットを操作するための方法および装置、ならびに収容装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、流体を収容するための収容ユニット（１０５）であって、収容要素（１２５）であって、収容面（１３０）と、流体を収容するために、収容要素（１２５）において収容面（１３０）に配置かつ形成された少なくとも１つのマイクロキャビティ（１３５）とを有する収容要素（１２５）を備える、収容ユニット（１０５）に関する。収容面（１３０）は、少なくとも１つのマイクロキャビティ（１３５）に隣接する少なくとも１つの部分領域に親水性の表面性質をさらに有する。

Description

背景技術
本発明は、独立請求項に係る、流体を収容するための収容ユニット、収容ユニットを製造するための方法および装置、収容ユニットを操作するための方法および装置、ならびに収容装置に関する。コンピュータプログラムも本発明の主題である。

いわゆるポイントオブケアでの分子診断試験には、患者試料の完全に自動化された分析を可能にするマイクロ流体分析システム、いわゆるラボオンチップが特に適している。複雑な試験では、検査対象の試料中の様々な標的に対処するために、複数の互いに独立した検出反応を行う必要があることが多い。

発明の概要
こうした背景の下、本明細書に提示するアプローチにより、主請求項による改良された収容ユニット、改良された方法、さらには、この方法を用いる改良された装置、そして、最後に対応するコンピュータプログラムが提示される。従属請求項に記載の手段により、独立請求項に記載の装置の有利な更なる開発および改良が可能である。

本明細書に提示するアプローチにより、従来技術とは対照的に、マイクロキャビティ内で乾燥させた試薬を簡単に導入し、予め配置することと組み合わせて、マイクロキャビティの確実な充填が可能となり、マイクロキャビティへの流体、例えば試料液体の制御された充填時にマイクロキャビティに予め配置した試薬のキャリーオーバーのリスクが回避される。同様に、流体が充填されたマイクロキャビティにおいて起こる反応のクロストークは、例えばマイクロキャビティにおいて異なる互いに独立した増幅反応を、例えば様々なＤＮＡ標的の検出のために実行するために、試料液体を充填したマイクロキャビティを第２の流体、すなわち適切な封止液で封止することによって阻止される。

流体を収容するための収容ユニットであって、この収容ユニットは収容要素を有し、この収容要素は収容面を備え、この収容面は、流体を収容するために、収容要素において収容面に配置かつ形成された少なくとも１つのマイクロキャビティを有し、収容面の、少なくとも１つのマイクロキャビティに隣接する少なくとも１つの部分領域が、親水性の表面性質を有する、収容ユニットが提示される。

例えば、収容ユニットは、例えば試料を試験するために構成された収容装置に使用することができる。例えば、流体は液体、例えば試料液体として実現され得る。試料液体は、例えば水溶液、例えば体液、塗抹標本、分泌物、痰、組織試料、または試料物質を付着させたデバイス等の、例えばヒト由来の生体物質から得られるものであってもよい。試料液体には、例えば医学、臨床、診断または治療に関連する種、例えば細菌、ウイルス、細胞、循環腫瘍細胞、セルフリーＤＮＡ、タンパク質もしくは他のバイオマーカー、または特に上記の物体の成分が含まれる。例えば、試料液体は、例えば分子レベルでのＤＮＡ検出、例えば等温増幅反応またはポリメラーゼ連鎖反応等のために、例えば収容要素において少なくとも１つの増幅反応を行うためのマスターミックスまたはその成分である。収容要素は、特に試料キャリアとして形成され、その収容面は、例えば少なくとも１つのマイクロキャビティに隣接する部分領域において少なくとも親水性である。収容面に配置されたマイクロキャビティは、例えばキャビティまたは凹部と称されることもあり、特にサブミリメートル範囲の寸法を有するキャビティとして特徴付けられる。マイクロキャビティは、それに応じて、流体を収容することができるように空洞を有していてもよい。さらに、マイクロキャビティは、例えば分子ＤＮＡ検出反応、例えば等温増幅反応またはポリメラーゼ連鎖反応をその中で行うために、不活性であり、高い生体適合性を有する表面性質を有していてもよい。装置の機能性、特にマイクロキャビティ内に存在する水相と第２の非混和性相との重層には、例えば毛細管力および表面力が重要である。大きなマクロキャビティでは、この機能性を保証することができない。

収容ユニットは、特に有利な実施形態によると、流体を収容するために、収容要素において収容面に配置かつ形成することができる複数の更なるマイクロキャビティを有する。その際、マイクロキャビティおよび複数の更なるマイクロキャビティは、収容面の配置領域、特に正方形、円形、長方形または楕円形の領域に、特に収容面の端部から所定の距離で、特に六角形、正方形または長方形のパターンに従って配置することができ、特にマイクロキャビティと複数の更なるマイクロキャビティとの間に、収容面が、親水性の表面性質を有する。配置領域の外側境界から収容面の端部、すなわち収容ユニットの外縁までの所定の距離によって、自動配置機（ピックアンドプレースロボット）が、収容ユニットの機能性に特に関連するマイクロキャビティの配置領域と接触し、そこで表面またはマイクロキャビティの起こり得る汚染を引き起こすことなく、外側の領域、いわゆる間隔領域を、例えば自動配置機（ピックアンドプレースロボット）による収容ユニットの取り扱いのために製造時に使用することができる。マイクロキャビティを六角形のパターンに従って配置することで、隣接するマイクロキャビティ間に一定の距離を保ちながらマイクロキャビティの特に高い表面密度を達成することができる。キャビティを正方形または長方形のパターンに配置することで、特に簡単なキャビティの割り当てを行うことができる。有利な実施形態では、収容ユニットは、特にキャビティの配置領域の外側にも、マイクロキャビティの割り当てまたは参照に役立つ、収容面に隣接する構造をさらに有する。その際、これらは、例えばアレイスポッティングシステム、例えば圧電ベースの微細分注システムを用いたマイクロキャビティへの試薬の標準的な導入、または例えば収容ユニットのマイクロキャビティにおける検出反応から発せられる蛍光信号を検出する光学読取り装置におけるキャビティの割り当てのための位置合わせマークである。さらに、異なるマイクロキャビティに異なる試薬を導入または保持することで、例えばマイクロキャビティにおいて異なる検出反応を行い得ることも考えられる。

一実施形態によると、マイクロキャビティは、収容面に対して実質的に垂直に向けられた少なくとも１つの側壁を有し得る。有利には、マイクロキャビティの全ての側壁を収容面に対して実質的に垂直に向けることもできる。これにより、例えば収容要素の特に簡単な製造が可能となる。実質的に垂直に向けられた側壁は、例えば収容面に対して８０°～１００°の角度を有し得る。有利には、これにより、マイクロキャビティの所定の適切なアスペクト比と組み合わせて、かつ／またはマイクロキャビティに導入された添加剤を用いて、充填時に、例えばマイクロキャビティに予め配置した試薬のキャリーオーバーまたは排出を、例えばマイクロキャビティ内に保持される量の１０％未満に低減することができる。特に、例えばＤＮＡ標的特異的プライマーおよび／またはプローブを少なくとも１つのマイクロキャビティに予め配置し、その中で少なくとも１つの特異的検出反応を行うことができる。

一実施形態によると、マイクロキャビティは、少なくとも１つの予め配置された試薬および／または添加剤を含む。「試薬」とは、マイクロキャビティ内で特定の反応を行うために使用される物質と理解することができる。一方、「添加剤」とは、概して複数のキャビティ内に存在し、マイクロキャビティの充填および／または予め配置した試薬のキャリーオーバーの低減を可能にする物質と理解することができる。したがって、「添加剤」は、特に流体の機能性に決定的であり、「試薬」は、特に正確な検出反応に決定的である。有利には、マイクロキャビティを試料液体で濡らし、充填する際に、特に添加剤をマイクロキャビティに予め配置することによって、マイクロキャビティ内、特にマイクロキャビティの底部への望ましくない空気の封入を回避することができる。さらに、少なくとも１つの予め配置した試薬により、流体、すなわち特に試料液体、特に試料液体の特定の成分、いわゆる標的との所定の所望される反応を引き起こすことができ、試料液体を特定の徴標の存在について検査することができる。

特に有利には、収容ユニットは、少なくとも２つの異なる標的を検出するために、少なくとも２つの異なる検出反応をその中で行うことができる複数のマイクロキャビティを備える。このようにして、多数の異なる検出反応によって多数の異なる標的に対処する高度に複雑な分子診断試験を収容ユニットにおいて行うことができる。特に、この場合、マルチプレックス性能を低下させた検出反応を用いて、マイクロキャビティの個々の流体パーティションにおいて、シングルプレックス形式の検出を実行し得ることも有利である（幾何学的多重化）。特に有利には、マイクロキャビティ内で互いに独立した等温ＤＮＡ検出反応を行うことができ、これは一方では高い反応速度を有するが、他方では低いマルチプレックス適合性（例えばプライマーおよび／またはプローブの間の望ましくない相互作用による）しか有しない可能性がある。このようにして、複数のキャビティを備える収容ユニットを特に有利に使用して、その中で等温検出反応を用いた迅速なＤＮＡ高マルチプレックス試験をシングルプレックス形式で実行することができる。特に、試料分析の感度を高めるためにシングルプレックス形式のアレイベースの検出の前に、特にポリメラーゼ連鎖反応によるマルチプレックス前増幅が行われる。特に、収容ユニット内でのマルチプレックス前増幅および複数のＤＮＡ標的のシングルプレックス検出の検出時間は、この場合、６０分未満であり、収容ユニット内での複数のＤＮＡ標的のシングルプレックス検出の検出時間は、３０分未満である。

まとめると、本発明による収容ユニットにより、特にマルチプレックス能が制限された検出反応を用いたとしても、個々の装置での多数の異なる標的に対する試料液体の極めて簡単かつ迅速な検査が可能である。有利には、収容ユニットのマイクロキャビティ内での検出反応は、互いに独立して行われ、それに応じて、複数のマイクロキャビティにおいて使用される異なるプライマーおよびプローブの間で顕著な相互作用が生じ得ないため、収容ユニットの使用によって、同様にマルチプレックス試験の簡単な適合、すなわち、特にマルチプレックス試験への検出反応の追加が可能である。

収容面は、少なくとも部分的に窒化ケイ素層および／または酸化ケイ素層および／またはシラン層、例えばポリエチレングリコール－シラン層として構成することができる。有利には、収容面の親水性によって、少なくとも１つのマイクロキャビティへの流体の浸透を可能にする、または明らかに改善することができ、そのようなタイプの収容面は、技術的に簡単な低コストの成熟した方法で製造することができる。さらに、マイクロキャビティへの流体の浸透の改善により、特に少なくとも１つの試薬、特に添加剤をマイクロキャビティに予め配置することと組み合わせて、かつ／またはマイクロキャビティの親水性コーティングにより、収容要素をマイクロ流体装置と組み合わせて用いて、収容ユニットの少なくとも１つのマイクロキャビティへの流体の完全に自動化された導入を可能にすることができる。

また、更なる実施形態によると、収容要素および／または収容ユニットをシリコン基板から構成することができる。シリコン基板は、例えばシリコンウェーハとして実現することができる。例えば、このような基板は、既に半導体技術に使用されており、本明細書に提示するアプローチの製造に半導体技術の製造方法を起用することができるため、例えば、これにより製造時の材料費を削減することができる。特に、シリコンウェーハを加工することで、複数の収容ユニットを並行して製造することができる。さらに、下記の収容ユニットの製造方法の範囲内で、マイクロキャビティのエッチングと同時に所定の破断点をシリコン基板に加工することができる。このようにして、シリコン基板の機械的破壊により、複数の収容ユニットへのシリコン基板の特に簡単な低コストの分離、ひいては収容ユニットの低コストの製造が可能である。さらに、シリコンが高い熱伝導率を有することから、シリコンを収容ユニットの基板材料として使用することで、マイクロキャビティの特に均一かつ迅速な温度制御を特に達成することができる。このようにして、個々の検出反応の高い比較可能性および迅速な実行可能性がもたらされる。

一実施形態によると、収容ユニットは、流体を収容するために、収容要素において収容面に配置かつ形成することができる更なる複数のマイクロキャビティを備えてもよく、更なる複数のマイクロキャビティは、収容面の更なる配置領域、特に正方形、円形、長方形または楕円形の領域に、特に収容面の端部から所定の距離で、特に六角形、正方形または長方形のパターンに従って配置することができる。その際、配置領域と更なる配置領域との間に、マイクロキャビティが設けられない間隔領域を配置してもよい。ここでも、例えば異なる試薬が保持される個々のマイクロキャビティを準備する場合に、複数のマイクロキャビティ群をマルチプレックス試験の実行に使用することができる。有利には、これにより、更なる複数のマイクロキャビティに、例えば更なる試薬を予め配置することで、例えば複数の試験を同時に行うことができる。

一実施形態によると、間隔領域は、例えば配置領域または更なる配置領域の隣接するマイクロキャビティの最小距離の少なくとも２倍に相当し得る幅を有することができる。有利には、これにより、配置領域を互いに明らかに認識可能に区別することができ、個々のマイクロキャビティ群の評価が容易になる。さらに、間隔領域により、収容ユニットの分離後のチップの取り扱いが容易になる。

一実施形態によると、マイクロキャビティまたはマイクロキャビティ群は、異なる寸法および／または異なる容量を有する。個々のマイクロキャビティ、すなわち反応コンパートメント内の試料液体の容量が異なることで、異なるサイズのコンパートメントには統計的に異なる数の標的単位、例えばＤＮＡコピーが存在する。それに応じて、検出特性が異なる特定の検出反応を用いて試料液体中の異なる標的の確実な検出を達成するために、高感度の検出反応にはより小さな反応コンパートメント、一方で低感度の検出反応にはより大きな反応コンパートメントが使用される。加えて、このようにして、デジタル検出法を用いることで、より大きな定量範囲を達成することができる。

収容面は、一実施形態によると、少なくとも１つのマイクロキャビティの配置に対して所定の位置を有することができる光学的に認識可能な徴標を有していてもよく、特に光学的に認識可能な徴標は、そのサイズおよび／または光学特性に関して所定の性質を有することができる。有利には、これにより、例えば基準点をマークすることができるため、自動可読性を改善することができる。

さらに、上に提示した変形形態の１つの収容ユニットと、収容ユニットを収容するためのハウジングと、少なくとも１つの流体、例えば試料液体を収容ユニットの少なくとも１つのマイクロキャビティに導入し、任意にその後に、試料液体と混和しない、または僅かにしか混和せず、収容装置のマイクロキャビティに封入された試料液体の被覆／封止を可能にする第２の流体、すなわち封止流体を導入するためのチャンバと、試料液体を収容ユニットのマイクロキャビティに供給し、続いてマイクロキャビティを封止流体で被覆し、かつ／または排気を可能にし、かつ／または過剰な試料液体および封止流体を排出するように構成された少なくとも１つの通路とを備える収容装置が提示される。

ハウジングは例えば、収容ユニットおよび試料液体を環境の影響から保護し、かつ／または逆に試料液体による環境の汚染を防ぐように形成することができる。通路は、例えば管状またはホース状に実現することができ、例えばほぼ長方形の断面を有し得る。収容装置は、例えばポリマー材料、例えばポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＰ、ＣＯＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、またはポリウレタン（ＴＰＵ）もしくはスチレンブロックコポリマー（ＴＰＳ）等の熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）、またはポリマー材料の組合せから低コストで製造することができ、例えば射出成形、熱成形、打ち抜き等のハイスループット技術によって、かつ／または例えばレーザ透過溶着等の接合技術を用いて製造することができる。

任意に、収容装置は、少なくとも１つの流体、例えば試料液体および／または封止流体を、通路を介して圧送するように構成され得るポンプ装置を備えていてもよい。有利には、これにより完全に自動化されたマイクロ流体の処理が可能となり得る。ポンプ装置は、例えば処理ユニットによって空気圧インタフェースを介して駆動することができる。ポンプ装置は特に、収容装置に組み込まれ、収容装置内の凹部に正圧または負圧をかけることで偏向することができ、それにより試料または封止流体の制御された排除を達成することができる弾性メンブレンをベースとする。このようにして、ポンプチャンバーおよびバルブ等のマイクロ流体要素を実現することができる。ポンプ装置の複数の要素を適切に連続的に作動させることで、特に蠕動ポンプ機構を用いて試料液体および封止流体の制御された輸送を達成することができる。さらに、収容装置は特に、試料を投入するための少なくとも１つの開口部と、任意にベントとして働く更なる開口部とを備える。有利な実施形態では、収容装置は、液体または固体の試薬を予め配置するための更なる凹部と、収容装置内の試薬の処理に役立つマイクロ流体ネットワークとを備える。

さらに、上に提示した変形形態の１つで収容ユニットを製造する方法が提示され、この方法は、準備するステップと加工するステップとを含む。準備するステップでは、収容要素の収容面を準備する。加工するステップでは、収容ユニットを製造するために、少なくとも１つのマイクロキャビティを、流体を収容するための収容面に加工する。

代替的または付加的には、さらに、加工するステップのサブステップにおいて感光レジスト層／フォトレジストを塗布してもよく、かつ／またはリソグラフィーのサブステップを設けてもよく、マイクロキャビティ（および／または更なる光学的に検出可能な徴標）の加工のために深掘り反応性イオンエッチング（ボッシュプロセス）を用いて構造化を行ってもよい。感光レジストを、例えばスピンコーティングし、リソグラフィーステップにおいて露光することができ、その後、過剰な材料を除去することができる。例えば、少なくとも１つのマイクロキャビティを加工した後、収容要素を、例えば過剰な感光レジストを除去し得るように処理することができる。代替的または付加的には、任意のステップにおいて、収容面および／またはマイクロキャビティのコーティングを行い、収容面および／またはマイクロキャビティの親水性の表面性質を形成することもできる。

したがって、本方法では任意に、収容面および／またはマイクロキャビティの表面性質を、例えば窒化ケイ素表面または酸化ケイ素表面および／またはシラン層、例えばポリエチレングリコール－シラン層として形成することで、親水性となるように変更することができる。代替的または付加的に、更なる任意のステップにおいて、試薬が収容ユニットのマイクロキャビティに導入されると特に好ましい。任意に、本方法は、例えば収容要素を分割することができる、分割するステップを含んでいてもよい。分割は特に、所定の破断点を収容要素の収容面に加工することで達成することができ、これは有利には、マイクロキャビティの加工とともに行われ、続いて機械的破壊が達成される。

さらに、前述の変形形態の１つで収容ユニットを操作するための方法が提示され、この方法は、充填および封止するステップと、実行するステップと、評価するステップとを含む。充填および封止するステップでは、少なくとも１つのマイクロキャビティに初めに試料液体を充填し、続いて第２の流体として封止流体を重層することで、少なくとも１つのマイクロキャビティにおいて試料液体のパーティションが流体反応コンパートメントとして存在する。封止流体は例えば、試料液体との望ましくない混合を防ぐために水溶性が低く、かつ／または高い流動性、すなわち、例えば装置の熱処理の際に形成される気泡の良好な除去を達成するために粘度が低く、かつ／または熱温度制御時に生じる寄生熱損失を可能な限り低く抑えるために伝導率が低く、かつ／または例えばポリメラーゼ連鎖反応の実行時に処理される熱質量を可能な限り小さく抑えるために熱容量が低く、かつ／または試料液体との界面を安定化するために界面活性剤を含む液体である。封止流体は、例えばフッ素化炭化水素である。

実行するステップでは、少なくとも１つのマイクロキャビティ内で少なくとも１つの反応を実行し、反応結果を得る。少なくとも１つの反応を実行するために、収容要素、特に少なくとも１つのマイクロキャビティ内に存在する反応コンパートメントは、反応、例えば等温増幅反応の進行を可能にする所定の温度を特に有する。場合により、実行するステップでは、例えば少なくとも１つの反応コンパートメントにおいてポリメラーゼ連鎖反応を実行するために収容装置の熱サイクルを行う。特に、実行するステップでは、少なくとも１つの反応コンパートメントから発せられる蛍光信号も記録し、これにより反応の進行について結論を導き出すことができる。

評価するステップでは、反応結果を評価する。特に実行するステップにおいて記録された蛍光信号に基づいて評価するステップを行う。有利には、反応結果の評価を、既に少なくとも１つの反応の実行と並行して蛍光信号プロファイルに基づいて行い、反応結果を十分な精度で決定することができるようになれば、反応の実行を停止させる。

互いに独立した、特に異なる検出反応をマイクロキャビティ内で実行する、本明細書に提示する方法の実施例が特に好ましい。代替的または付加的には、試料物質のマルチプレックス前増幅のステップ、およびその後のシングルプレックスアレイ形式での標的の検出を、本明細書に提示する収容ユニットの変形形態において実行することができる。

本明細書に提示する方法の変形形態は、例えばソフトウェアおよび／もしくはハードウェアで、またはソフトウェアとハードウェアとの混合形態で、例えば制御装置に実装することができる。

さらに、本明細書に提示するアプローチでは、本明細書に提示する方法の変形形態のステップを対応する装置において実行、制御または実装するように構成された装置を作製する。この装置の形態での本発明の実施形態によっても、本発明の基礎をなす課題を迅速かつ効率的に解決することができる。

このために、装置は、信号もしくはデータを処理するための少なくとも１つの計算ユニット、信号もしくはデータを記憶するための少なくとも１つの記憶ユニット、センサからセンサ信号を読み取るか、もしくはデータ信号もしくは制御信号をアクチュエータに出力するためのセンサもしくはアクチュエータに対する少なくとも１つのインタフェース、および／または通信プロトコルに組み込まれたデータを読み取るか、もしくは出力するための少なくとも１つの通信インタフェースを備え得る。計算ユニットは、例えば信号プロセッサ、マイクロコントローラ等とすることができ、記憶ユニットはフラッシュメモリ、ＥＥＰＲＯＭ、または磁気記憶ユニットとすることができる。通信インタフェースは、データを無線および／または有線で読み込む、または出力するように構成することができ、有線データを読み込む、または出力することができる通信インタフェースは、このデータを、例えば電気的または光学的に対応するデータ伝送線から読み込む、または対応するデータ伝送線に出力することができる。

この場合の装置は、センサ信号を処理し、それに応じて制御信号および／またはデータ信号を出力する電気機器と理解することができる。装置は、ハードウェアおよび／またはソフトウェアベースで構成され得るインタフェースを有することができる。ハードウェアベースの構成の場合、インタフェースを、例えば装置の様々な機能を有する、いわゆるシステムＡＳＩＣの一部とすることができる。しかしながら、インタフェースがそれ自体の集積回路である、または少なくとも部分的に個別の部品からなることも可能である。ソフトウェアベースの構成の場合、インタフェースは、例えば他のソフトウェアモジュールと並んでマイクロコントローラ上に存在するソフトウェアモジュールであってもよい。

有利な設計では、装置により収容ユニットを操作する方法の制御を行う。このために、装置は、例えば読み取られた情報を表す読取り信号、および／または方法のいずれかのステップを制御するための制御信号等のセンサ信号にアクセスすることができる。制御は、読取りユニット、評価ユニットおよび／または提供ユニット等のアクチュエータによって行われる。

半導体メモリ、ハードディスクメモリまたは光メモリ等の機械可読のキャリアまたは記憶媒体に格納することができ、特にプログラム製品またはプログラムがコンピュータまたは装置上で実行される場合に、上述の実施形態の１つによる方法のステップを実行、実装および／または制御するために使用される、プログラムコードを有するコンピュータプログラム製品またはコンピュータプログラムも有利である。

本明細書に提示するアプローチの実施例を図面に示し、以下の記載でより詳細に説明する。

一実施例による収容装置の概略側面図である。 一実施例による収容ユニットの概略側面図である。 一実施例による収容ユニットの概略上面図である。 一実施例による収容ユニットの概略側面図である。 一実施例による収容ユニットの考え得る製造プロセスの中間製品の異なる段階の概略図である。 一実施例による収容ユニットを製造する方法の流れ図である。 一実施例による収容ユニットの斜視図である。 更なる実施例による収容ユニットの斜視図である。 一実施例による収容ユニットにおいて得られるポリメラーゼ連鎖反応の反応結果を決定する手順を説明する図である。 キャリーオーバー試験後に一実施例による収容ユニットにおいて得られる反応結果の図である。 一実施例による収容ユニットにおいて得られるマルチプレックス試験の反応結果を決定する手順を説明する図である。 一実施例による収容ユニットを操作する方法の流れ図である。 一実施例による装置のブロック図である。

以下の本発明の好ましい実施例の説明において、様々な図面に示され、同様の作用を有する要素には、同じまたは同様の参照符号が使用され、これらの要素の説明の繰り返しは省かれる。

図１は、一実施例による収容装置１００の概略側面図を示す。収容装置１００は、流体を収容ユニット１０５に導入し、かつ／または収容面１３０の収容ユニット１０５を少なくともその部分領域、特にキャビティの配置領域で、特に流体を収容ユニット１０５に導入した後に更なる流体、いわゆる封止流体で被覆するように構成されている。このために、収容装置１００は、流体を収容するための収容ユニット１０５と、収容ユニット１０５を収容するためのハウジング１１０と、流体を収容ユニット１０５に導入するように構成されたチャンバ１１５と、流体を収容ユニット１０５に供給し、かつ／または収容ユニット１０５から排出し、かつ／またはチャンバ１１５およびマイクロキャビティ１３５、１５０の排気を可能にするように構成された少なくとも１つの通路１２０とを備える。任意に、収容装置１００は、流体および場合により封止流体を少なくとも１つの通路１２０を介して圧送するように構成されたポンプ装置を備える。収容ユニット１０５は、親水性の表面性質を形成した収容面１３０を有する収容要素１２５と、流体を収容するために、収容要素１２５の収容面１３０に配置かつ形成された少なくとも１つのマイクロキャビティ１３５とを備える。

本実施例によると、収容要素１２５は、例えばシリコン基板から構成されている。収容面１３０は、例えば少なくとも部分的に窒化ケイ素層、酸化ケイ素層および／またはシラン層、例えばポリエチレングリコール－シラン層として構成され、例えばマイクロキャビティ１３５への流体の浸透を容易にする。マイクロキャビティ１３５は、本実施例によると、収容面１３０に対して実質的に垂直に向けられた、例えば収容面１３０に対して８０°～１００°の角度１４５で向けられた側壁１４０を有する。代替的な実施例によると、マイクロキャビティ１３５は、ほぼ円筒形に形成される。さらに任意に、収容ユニット１０５は、本実施例によると、流体を収容するために、収容要素１２５において収容面１３０に配置かつ形成された複数の更なるマイクロキャビティ１５０を備える。その際、マイクロキャビティ１３５および複数の更なるマイクロキャビティ１５０は、ここには示されない配置領域、特に収容面の正方形、円形、長方形または楕円形の領域に、特に収容面の端部から所定の距離で、特に六角形、正方形または長方形のパターンに従って配置されるため、特にマイクロキャビティ１３５と複数の更なるマイクロキャビティ１５０との間で、収容面１３０が親水性の表面性質を有する。さらに任意に、本実施例による収容ユニット１０５は、少なくとも１つのマイクロキャビティ１３０の配置に対して規定された位置を有する光学的に認識可能な徴標１５５を有する。すなわち、本実施例による光学的に認識可能な徴標１５５は、サイズおよび光学特性に関して所定の性質を有する。

換言すると、試料液体とも称される流体を分注し、すなわち収容面１３０を試料液体で濡らし、収容面１３０を封止流体で連続的に濡らすことによって、試料液体が収容ユニットのマイクロキャビティ１３５、１５０内に少なくとも部分的に留まるように、収容ユニット１０５内のマイクロキャビティ１３５、１５０に試料液体を充填し、それぞれマイクロキャビティ１３５、１５０に予め配置された特定の試薬を含んでいてもよいアリコート、すなわち試料液体の分注後にマイクロキャビティ１３５、１５０内に存在する試料液体のパーティションにおいて互いに独立した反応を実行するためのマイクロキャビティアレイチップ、すなわち収容ユニット１０５と、収容ユニット１０５を製造する方法とが提示される。したがって、本明細書に提示するアプローチは、マイクロキャビティ１３５、１５０とも称される多数のコンパートメントに試料液体を分配する装置、ならびにマイクロキャビティ１３５、１５０における多数の互いに独立した反応の実行に関する。特に、流体の分配および反応の実行は、例えば、本実施例によると収容装置１００と称されるマイクロ流体システムにおいて自動的に行われる。

したがって、本明細書に記載のアプローチにより、本実施例によると、収容ユニット１０５によって、例えば乾燥試薬をマイクロキャビティ１３５、１５０に簡単に導入し、予め配置することができ、マイクロキャビティ１３５、１５０への流体の制御された分配の間の予め配置した試薬のキャリーオーバーが十分に低下し、異なるマイクロキャビティ１３５、１５０の間の反応のクロストークがごく僅かであり、マイクロキャビティ１３５、１５０への流体の（自動化可能な）マイクロ流体分注が可能になり、低コストで製造可能であり、かつ／または完全に自動化されたマイクロ流体処理が達成されるように収容装置１００に組み入れることが可能である解決策が生み出される。

収容装置１００は、本実施例によると、流体をマイクロキャビティ１３５、１５０に導入し、かつ／またはマイクロキャビティ１３５、１５０を流体と混和しない第２の流体で封止するために設けられる、有利な所定の寸法１６０を有するチャンバ１１５を特に備える。マイクロ流体チャンバ１１５は、本実施例によると、供給および／または排出通路とも称され、収容ユニット１０５への流体の制御された供給または排出のために設けられる少なくとも１つの通路１２０を備える。収容装置１００の有利な設計では、収容装置１００は、収容ユニット１０５の完全に自動化されたマイクロ流体処理を可能にするために、ここには示されない通路システムおよび／または示されないポンプ装置をさらに備える。

この場合、収容ユニット１０５は、本実施例によると、平面とも称され、基板材料から形成される収容要素１２５に加工されたマイクロキャビティ１３５、１５０の配置を有する収容面１３０を有する。その際、本実施例によると、収容面１３０は、特にマイクロキャビティ１３５、１５０のごく周辺に親水性の濡れ性を有する。マイクロキャビティ１３５、１５０は、本実施例によると、特にほぼ垂直の側壁１４０を特徴とし、特に、収容面１３０は、マイクロキャビティ１３５、１５０またはその開口部に、マイクロキャビティ１３５、１５０の側壁１４０に対してほぼ９０°の角度１４５を伴う。マイクロキャビティ１３５、１５０は任意に、試薬または添加剤とも称される少なくとも１つの予め配置された物質を特に含む。マイクロキャビティ１３５、１５０は、任意にほぼ円筒形の形状を有し、これにより収容ユニット１０５を特に簡単に製造することができる。マイクロキャビティ１３５、１５０の配置は、特にアレイスポッティングシステム、特に圧電ベースの微細分注システムを用いたマイクロキャビティへの試薬の標準的な導入を任意に可能にするために、特に正方形、六角形または長方形のパターンに従う。単に任意に、本実施例による収容面１３０は、例えばマイクロキャビティ（２０）の配置に対して規定された位置を有し、サイズおよび光学特性に関して適切な性質を有する、光学的に認識可能な徴標１５５を付加的に有する。このため、徴標１５５は、特にアレイスポッティングシステムのカメラ等の光学感応装置によって検出可能であり、マイクロキャビティ１３５、１５０の配置への試薬の、規定され、完全に自動化された導入に適用可能である。代替的または付加的には、徴標１５５は、特にマイクロキャビティ１３５、１５０内で行われる反応の光学的評価を行う場合に、マイクロキャビティ１３５、１５０の相対位置決定に適用可能である。

要約すると、本明細書に提示するアプローチは、収容ユニット１０５を、マイクロキャビティ１３５、１５０の充填のために流体が少なくとも部分領域で接触する親水性の収容面１３０、特にマイクロキャビティ１３５、１５０に予め配置された試薬のキャリーオーバーに対抗する、マイクロキャビティ１３５、１５０の少なくとも部分的に垂直の側壁１４０、マイクロキャビティ１３５、１５０における異なる特定の検出反応の実行を可能にする予め配置された試薬、および／または少なくとも１つの予め配置された添加剤、例えばマイクロキャビティ１３５、１５０を濡らし、空気がマイクロキャビティ１３５、１５０内に封入されないよう、完全に充填することを確実にし、かつ／またはマイクロキャビティ１３５、１５０に予め配置された上記の試薬のキャリーオーバーの低減をもたらす物質、ならびに固体底面を有するキャビティ１３５、１５０の使用と組み合わせて説明する。これは、穿孔がないことを意味し、試薬および／または少なくとも１つの添加剤をキャビティ１３５、１５０に予め配置することが容易になる。

本明細書に提示するアプローチは、本実施例によると、反応コンパートメントの充填および／または封止に関するマイクロ流体機能性に加えて、コンパートメント、すなわちマイクロキャビティ１３５、１５０内で行われる反応の低いクロストークを保証する。さらに、本明細書に提示するアプローチは、マイクロキャビティ１３５（例えば、ポリエチレングリコールを乾燥添加剤として含み、分子ＤＮＡ検出反応用のプライマーおよびプローブを乾燥試薬として含み、かつ／または酸化ケイ素層、窒化ケイ素層またはシラン層を親水性表面として有する）および例えばポリマー、例えばポリカーボネートからなるフローセルの、例えば窒化ケイ素、酸化ケイ素または親水性シラン層、特にポリエチレングリコール－シラン層からなる収容面１３０の濡れ性を説明する。

代替的には、本明細書に言及される機能性をもたらすために、例えば本明細書に記載されない代替方法において製造された部材を同様に用いることができるが、この場合、収容ユニット１０５は、本明細書に記載のアプローチに従って製造された収容ユニット１０５よりも製造がいくらか複雑となり、例えば２回のリソグラフィーステップを伴う。

隣接するコンパートメント間の流体クロストークを防止または低減するために、従来技術ではコンパートメント間に疎水性の表面性質を有する装置が特に使用される。しかしながら、これには、疎水性の上面により、基板内のコンパートメントへの充填が困難になるという不利点がある。特に、従来技術では、上面が疎水性であり、コンパートメントのサイズが小さい場合、例えばコンパートメントの横寸法／直径がサブミリメートル範囲である場合、コンパートメントへの水相の簡単な充填が可能となるように、傾斜した側壁もしくは穿孔を有するキャビティ、または低いアスペクト比の形態が使用される。しかしながら、傾斜した側壁を有するキャビティは、その表面積に対して比較的小さな体積を有する。これは、一方では、並行して進められる反応の表面密度が可能な限り高いことが望ましく、他方では、コンパートメントの容量が小さいことから、比較的弱い蛍光信号しか生じず、光学的評価の際に信号対雑音比が低下するため、高度に多重化された増幅反応の実行、特に反応を光学的に評価する場合には不利である。また、傾斜した側壁を有するキャビティは、コンパートメントに試料液体を充填した際に形成される流れプロファイルが、予め配置された試薬の望ましくないキャリーオーバーを引き起こす傾向があることから、試薬をその中に予め配置することが困難である。この場合も、穿孔は、穿孔の側壁にしか試薬の堆積が可能でないため、試薬を個々の反応コンパートメントに導入し、予め配置することが困難になるという不利点がある。

図２Ａは、一実施例による収容ユニット１０５の概略側面図を示す。ここに示す収容ユニット１０５は、図１に説明した収容ユニット１０５に相当または類似するものであってもよい。本実施例によると、収容ユニット１０５を、単に本実施例による少なくとも１つの予め配置された試薬２００がマイクロキャビティ１３５内に見えるように拡大して示す。すなわち、本実施例による収容ユニット１０５は、少なくとも１つの予め配置された試薬を含む。さらに、本実施例によると、マイクロキャビティ１３５、１５０の中心が、隣接するマイクロキャビティ１３５、１５０に対し、光学的に認識可能な要素１５５の中心と隣接するそれぞれのマイクロキャビティ１３５、１５０の中心との距離と同じ距離２０５を有することが明らかに示される。

換言すると、流体をマイクロキャビティ１３５、１５０へと分配し、マイクロキャビティ１３５、１５０内で多数の互いに独立した反応を行うことを可能にする収容ユニット１０５が記載され、マイクロキャビティ１３５、１５０には乾燥試薬２００が予め配置される。さらに、以下の図面の１つで説明する収容ユニット１０５の製造方法を提示する。特に、収容ユニット１０５は、マイクロキャビティ１３５、１５０への試薬２００の確実な導入を可能にし、流体をマイクロキャビティ１３５、１５０に分配する際にマイクロキャビティ１３５、１５０内に予め配置された試薬２００のキャリーオーバーを十分に、例えば＜１０％に低下させ、収容ユニット１０５は、適切な封止流体によるマイクロキャビティの封止後に、異なるマイクロキャビティ１３５、１５０間の反応の極めて低い（＜１％）クロストークしか有さず、マイクロキャビティ１３５、１５０内での流体の自動化可能なマイクロ流体分注を可能にし、収容装置１００等のマイクロ流体システムに組み入れることが可能である。

したがって、収容ユニット１０５は、本実施例によると、マイクロ流体コンパートメントの構成に役立つマイクロキャビティ１３５、１５０を有する。マイクロキャビティ１３５、１５０は、この場合、特に収容ユニット１０５の流体と接触する側との界面でほぼ垂直の側壁を有し、特に、例えばマイクロキャビティ１３５、１５０に流体を充填する際のマイクロキャビティ１３５、１５０への望ましくない空気の封入を防ぎ、マイクロキャビティ１３５、１５０への流体の完全な充填を可能にするために、予め配置された試薬２００および限定されたアスペクト比を有する。流体と接触し、マイクロキャビティ１３５、１５０の充填が行われる収容ユニット１０５の収容面は、本実施例によると、マイクロキャビティ１３５、１５０への流体の浸透を可能にするために、特にマイクロキャビティ１３５、１５０のごく周辺で親水性の表面性質を有する。収容ユニット１０５は、特に有利には、完全に自動化されたマイクロ流体処理および場合によりマイクロキャビティ１３５、１５０内での反応の実行を可能にするために、図１に説明したような収容装置の一部とすることができる。本実施例によると、これにより、マイクロキャビティ１３５、１５０に隣接する収容ユニット１０５の収容面の親水性の表面性質による確実な充填、マイクロキャビティ１３５、１５０に試薬２００および／または添加剤を予め配置すること、ならびに適切に得られた流体を含むマイクロキャビティ１３５、１５０の適切なアスペクト比が可能となる。

さらに、マイクロキャビティ１３５、１５０の（ほぼ）垂直の側壁は、例えば適切な添加剤と組み合わせて、流体による充填時の予め配置された試薬２００のキャリーオーバーを、例えば＜１０％に最小化することができる。これは、傾斜した側壁を有するマイクロキャビティ１３５、１５０と比較して特に当てはまり、その形状は、形成される流れプロファイルに関連して、原則としてマイクロキャビティ１３５、１５０に予め配置された試薬２００のより大きなキャリーオーバーを引き起こす。さらに、本明細書に提示するアプローチでは、例えばマイクロキャビティ１３５、１５０を、例えばマイクロキャビティ１３５、１５０に流体と混和しない適切な第２の流体を充填した後に封止することで、マイクロキャビティ１３５、１５０内で化学反応を実行する際に、隣接する反応コンパートメントの間で僅かな、例えば＜１％のクロストークを達成することができる。このため、マイクロキャビティ１３５、１５０内で互いに独立した、空間的に分離された反応を行うことができる。得られる幾何学的多重化により、例えば適切な標的特異的検出試薬をマイクロキャビティ１３５、１５０に予め配置する場合、多数の様々な標的について流体を検査することができる。さらに、本実施例によると、特に有利には、収容装置によって完全に自動化されたマイクロ流体処理が可能となる。特に、収容ユニット１０５の処理に使用される収容装置は、ポリマーまたはポリマー材料の組合せから低コストで製造することができる。このようにして、収容ユニット１０５によってもたらされる機能性が、分子実験室診断に使用することができる小型のラボオンチップシステムにおいて実現される。

図２Ｂは、一実施例による収容ユニット１０５の概略上面図を示す。収容ユニット１０５は、円形の配置領域６００に六角形のパターンに従って配置されたマイクロキャビティ１３５、１５０を備える。さらに、マイクロキャビティ１３５、１５０の配置領域６００の外側境界（点鎖線によって示す）は、収容ユニット１０５の収容面の端部に対して所定の最小距離を有する。この端部領域は特に、自動配置機（ピックアンドプレースロボット）による収容ユニット１０５の簡単な取り扱いを可能にし、例えば、それにより、例えば上記の収容装置１００の簡単な製造性を可能にするために用いることができる。さらに、収容ユニット１０５は、本実施例では、他に参照標識とも称される光学的に認識可能な徴標１５５を有し、これは例えばマイクロキャビティ１３５、１５０の明確な割り当ておよび／もしくは記号的指定に使用することができ、かつ／または例えば光学検出システムを有する処理装置における収容ユニット１０５の位置決定、例えばマイクロキャビティ１３５、１５０への試薬の自動化された導入のための微細分注システムにおける位置決定、および／または例えば光学系を用いて、特に蛍光信号の検出に使用することができ、例えばマイクロキャビティ１３５、１５０における、例えば生化学反応の蛍光信号プロファイルを検出することができる処理装置における位置決定に使用することができる。

図３は、一実施例による収容ユニット１０５の概略側面図を示す。ここに示す収容ユニット１０５は、図１または図２に説明した収容ユニット１０５に相当または類似するものであってもよい。本実施例による拡大図で光学的に認識可能な要素を示していないことのみが異なる。

図４は、一実施例による収容ユニット１０５の考え得る製造プロセス４００の中間製品の異なる段階の概略図を示す。収容ユニット１０５は、この場合、図１～図３に説明した収容ユニット１０５に相当または類似するものであってもよく、このため、図１に説明したような収容装置にも適用可能である。

この場合、本実施例によると、シリコンウェーハとも称されるシリコンからなる収容要素１２５が基板材料として用いられる。初めに、収容面１３０上に基板材料の親水性の表面性質を形成する。その際、本実施例によると、これは特に、例えば低圧化学蒸着（ＬＰＣＶＤ、英語：low pressure chemical vapour deposition）とも称される酸化ケイ素、窒化ケイ素およびポリシリコン、ならびに金属を蒸着する方法を用いてシリコン基板上に生成することができる窒化ケイ素表面である。特に、この際、本実施例によると、例えば５０ｎｍのＳｉＯ_２および１４０ｎｍのＳｉ_３Ｎ_４からなる層系が、シリコン基板との接着性が良好な低歪みのＳｉ_３Ｎ_４層を製造するのに適している。本実施例によると、窒化ケイ素は、特に親水性の濡れ性を有するため、表面コーティングとして適している。例えば、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）による前処理後に、フォトレジスト（Photoresist）とも称され、シリコン基板へのマイクロキャビティのエッチングのためのマスクとなる感光レジスト（Fotolack）４０５を塗布する。本実施例によると、エッチングすべき構造を画定するための感光レジスト４０５の露光４１０後にレジストを現像する。続いて、本実施例によると、例えばＣＦ_４ドライエッチング４１５を用いて、露出領域４２０のＳｉ_３Ｎ_４およびＳｉＯ_２を除去する。例えば、深掘り反応性イオンエッチング４２５を用いてマイクロキャビティ１３５、１５０をシリコン基板に加工する。有利には、深掘り反応性イオンエッチング４２５は、ほぼ垂直の側壁を有する微細構造の製造にプロセス技術的に最適化されている。例えば酸素プラズマ４３０中での処理によって、残りの感光レジスト４０５を除去する。マイクロキャビティ１３５への１つ以上の試薬２００の導入は、本実施例によると、例えば圧電ベースの微細分注システムまたはアレイスポッティングシステムを用いて行われる。特に有利には、かかる製造プロセス４００をウェーハレベルで行うことができ、収容ユニット１０５の特に低コストの並列製造が可能となる。並列製造された収容ユニット１０５の分離は、特に試薬２００をマイクロキャビティ１３５に導入した後に、例えば鋸引き、破断、または別の、例えばレーザベースの分離方法、例えばいわゆるマホダイシング（Mahoh-Dicing）を用いて行うことができる。

図５は、一実施例による収容ユニットを製造する方法５００の流れ図を示す。ここに示す方法５００は、図４に説明した製造プロセス４００によると、８つのサブステップ５０２を含み、図１～図３のいずれかに説明したように収容ユニットを製造することができる。方法５００は、本実施例によると、収容面を準備するステップ５０５と、収容ユニットを製造するために、流体を収容するための少なくとも１つのマイクロキャビティを収容面に加工するステップ５１０とを含む。

一実施例によると、方法５００のステップ５０５、５１０および／またはサブステップ５０２は、有利な実施形態では省略してもよく、かつ／または順序を変更して行ってもよい。

図６Ａは、一実施例による収容ユニット１０５の製造における半製品の斜視図を示す。ここに示す収容ユニット１０５は、図１～図３のいずれかに説明した収容ユニット１０５に相当または類似するものであってもよい。本実施例によると、流体を収容するために、複数の更なるマイクロキャビティ１５０が形成される。その際、本実施例によると、マイクロキャビティ１３５および複数の更なるマイクロキャビティ１５０は、ほぼ正方形の配置領域６００に正方形のパターンに従うように配置される。この場合、収容面１３０は、特にマイクロキャビティ１３５と複数の更なるマイクロキャビティ１５０との間に親水性の表面性質を有する。

本実施例によると、収容ユニット１０５が、マイクロキャビティ１３５および複数の更なるマイクロキャビティ１５０に加えて、流体を収容するために形成される更なる複数のマイクロキャビティ６０５を備えることがさらに明らかである。本実施例によると、更なる複数のマイクロキャビティ６０５は、正方形、長方形または六角形の形状を形成するように更なる配置領域６１０に配置され、特に配置領域６００と更なる配置領域６１０との間に、マイクロキャビティ１３５、１５０、６０５が設けられない間隔領域６１５が配置される。本実施例によると、間隔領域６１５は、例えば配置領域６００または更なる配置領域６１０の隣接するマイクロキャビティの最小距離の少なくとも２倍に相当する幅を有する。

換言すると、本実施例によると、例えば図５に説明した収容ユニット１０５の製造方法を行った後のマイクロキャビティ１３５、１５０、６０５を有する処理済みのシリコンウェーハの図が示される。

図６Ｂは、基板を分離する前に複数の収容ユニットを形成するための所定の破断点を加工したシリコン基板の斜視図を示す。収容ユニットは、（ほぼ）円形の配置領域に六角形のパターンに従って配置された、マイクロキャビティおよび複数の更なるマイクロキャビティをそれぞれ備える。さらに、収容ユニットは、例えば微細分注システムを用いたマイクロキャビティへの試薬の導入、および／または検出装置における収容ユニットの位置決定、および／またはマイクロキャビティの明確な指定のための光学的に認識可能な徴標をそれぞれ有する。

図７は、一実施例による収容ユニット１０５において得られるポリメラーゼ連鎖反応の反応結果７００を決定する手順を説明する図を示す。かかる反応結果７００は、先に提示した図１～図３のいずれかに説明したような収容ユニット１０５において得ることができる。

換言すると、例えば、流体とも称される試料液体として、１マイクロキャビティ（２５ｎｌ）当たり１０初期コピーの濃度で標的遺伝子を含有する、いわゆるＰＣＲマスターミックスを使用した。ＰＣＲマスターミックスは、標的遺伝子の増幅を示す標的特異的ＴａｑＭａｎ蛍光プローブ（Ｃｙ３）をさらに含有していた。

図７ａに、ポリメラーゼ連鎖反応を行うための温度サイクルの間に撮影した、装置とも称され得る収容ユニット１０５のマイクロキャビティに分配された流体の蛍光顕微鏡写真を概略的に示す。既に相当量のＰＣＲ産物が生成している流体を含むマイクロキャビティは、例えば蛍光プローブの切断により明るく見える。相当量のＰＣＲ産物を含まないマイクロキャビティは、本実施例によると暗く見える。

図７ｂは、このマイクロキャビティ内で起こるポリメラーゼ連鎖反応に起因するＳ字状の増加を有するマイクロキャビティ「Ｆ３」に固有の信号プロファイルを示す。

図７ｃは、グラフにまとめた個々のマイクロキャビティの正規化したＳ字状近似増幅曲線を示す。本実施例によると、９６個のマイクロキャビティのうち８９個が蛍光信号の増加を示し、平均ｃｉ値、すなわちＳ字状信号増加の変曲点におけるＰＣＲサイクルが３１．５３であり、標準偏差が０．８１温度サイクルである。４個のマイクロキャビティは、本実施例によると、５０回の温度サイクルの間に蛍光信号の顕著な増加を示さない。残り３個のマイクロキャビティは、ｃｉ値＞４５温度サイクルで蛍光信号の増加を有する。図７ｄには、これをｃｉ値のヒストグラムによって示す。

図７ｅは、ｃｉ値の空間分布を適切な疑似カラー表示で示すマップによってこれを示す。図７ｃ、図７ｄ、図７ｅによると、マイクロキャビティの大部分（９２．７１％）において３０～３４温度サイクルのｃｉ値範囲で増幅が起こることが明らかである。測定されたｃｉ値の変動は、最初にマイクロキャビティ内に存在するコピー数の統計的変動に一部起因する可能性がある。二項分布に基づいて、１マイクロキャビティ当たり１０コピーの平均初期コピー数の場合、上記の４回のＰＣＲサイクルにほぼ相当する、１マイクロキャビティ当たり約２～１６の初期コピーの変動を推定することができる。一方、陰性キャビティの数は、二項分布に基づくキャビティ内のコピー数の統計的変動のみに起因するものではない。ここでは、検出反応の増幅特性、特に感度、検出下限が決定的な役割を果たす。陰性信号プロファイルを有するマイクロキャビティは、マイクロキャビティ内に最初に存在するコピー数が少ない場合に増幅が必ずしも起こるとは限らないことに起因する。選択した検出反応の感度は、これには低すぎる。付加的な測定では、ここで使用される反応の統計的検出限界は、１マイクロキャビティ当たり約２．５初期コピーの、いわゆる検出下限と決定された。さらに、陰性信号プロファイルを有するマイクロキャビティは、本実施例によると、隣接するマイクロキャビティにおいて増幅反応が進行した後であっても、ＰＣＲによって生成する顕著なコピー数がその中に見られないことを示す。その結果、これらのマイクロキャビティは、隣接する反応コンパートメント間のクロストークの指標として使用することができる。特に、遅延ＰＣＲが起こる３つのマイクロキャビティが、これに関連する可能性がある。すなわち、１０回のＰＣＲサイクルを超えるＳ字状増加の遅延は、本実施例によると、コピー数の最初の統計的変動に起因するものではない。むしろ、この場合、これらは隣接するマイクロキャビティにおける増幅反応のクロストークによって開始した可能性がある遅延陽性または偽陽性の増幅反応である可能性がある。アレイが陰性信号プロファイルを有するマイクロキャビティを有すること、および偽陽性反応の増加が１０回のＰＣＲサイクルの遅延によってのみ生じることに基づき、本実施例によると、隣接するマイクロキャビティにおいて行われる反応間のクロストークは、１増幅サイクル当たり

０．１％であると結論付けることができる。したがって、実験から、更なる同等の試験と一致して、収容ユニット１０５が、マイクロキャビティとも称される隣接する反応コンパートメント間の顕著なクロストークなしに、（幾何学的）マルチプレックス増幅反応を実行するのに適していることが例示的に示される。

図８は、キャリーオーバー試験後に一実施例による収容ユニット１０５において得られる反応結果８００の概略図を示す。かかる反応結果８００は、先に提示した図１～図３のいずれかに説明したような収容ユニット１０５において得ることができる。

本実施例によると、収容ユニット１０５のいわゆるマイクロ流体処理の間、すなわちマイクロキャビティへの流体の制御された充填およびその後の第２の流体によるマイクロキャビティの制御された封止の際に生じる可能性がある、マイクロキャビティに予め配置した試薬のキャリーオーバーを検査する。このために、本実施例によると、（ほぼ）１つおきのマイクロキャビティにおいて市松模様の形で標的遺伝子、例えばＡＢＬ遺伝子のコピーを、微細分注システム／アレイスポッティングシステムを用いて導入し、例えば添加剤としてのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とともに乾燥形態で予め配置した（図８ａを参照されたい）。

図８ｂは、温度サイクルの間に撮影した蛍光顕微鏡写真の概略図を示す。幾つかのマイクロキャビティにおいて、ＰＣＲ産物の生成を示す蛍光信号の顕著な増加が既に認められた後に撮影を行った。標的遺伝子の約１００コピーの鋳型ＤＮＡを予め配置したマイクロキャビティ（図８ａのパターン化充填）では、鋳型ＤＮＡを予め配置していないマイクロキャビティよりも強い蛍光信号が観察される（図８ａの充填なし）。したがって、これは選択的な増幅、ひいてはマイクロ流体処理中の予め配置した試薬の僅かなキャリーオーバーを示す。

図８ｃには、本実施例によるｃｉ値の付加的な空間分布が示される。それぞれ１００コピーの鋳型ＤＮＡを予め配置したマイクロキャビティでは、２６．８～２８．８の温度サイクルのｃｉ値で確実な増幅が観察される。一方、残りのマイクロキャビティでは、殆どの場合、５０温度サイクルのうちに増幅を観察することができない。４温度サイクルを超える遅延を有する遅延増幅は、８つのマイクロキャビティでのみ起こる。その結果、収容ユニット１０５のマイクロ流体処理の間に生じる、収容ユニット１０５のマイクロキャビティに予め配置した試薬のキャリーオーバーは、最大約１／２^４＝１／１６＝６．２５％に定量化することができる。このため、収容ユニット１０５は、標的特異的試薬、例えばプライマーおよびプローブをマイクロキャビティに予め配置するマルチプレックス増幅反応の実行にも適している。

図９は、一実施例による収容ユニット１０５において得られるマルチプレックス試験の反応結果９００を決定する手順を説明する図を示す。かかる反応結果９００は、先に提示した図１～図３のいずれかに説明したような収容ユニット１０５において得ることができる。本実施例によると、予め配置したプライマーおよびプローブを用いたマルチプレックス試験から得られた反応結果９００が示される。このために、本実施例によると、収容ユニット１０５のそれぞれ１２個のマイクロキャビティに、２つの標的遺伝子「ＡＢＬ」および「ｅ１３ａ２」に対処する標的特異的プライマーおよびプローブを、例えば添加剤としてのポリエチレングリコールとともに乾燥形態で予め配置した。プローブは、図９ａに概略を示すように「Ｃｙ３」および「Ｃｙ５」に対応するフルオロフォアを有していた。試料液体として１マイクロキャビティ、例えば２５ｎｌ当たり１００コピーのＡＢＬ鋳型ＤＮＡの濃度のＰＣＲマスターミックスを投入し、処理を行った。

図９ｂ、図９ｃは、熱サイクルの前後に撮影した２つの蛍光画像を概略的に示す。示される図は、横模様で示されるフルオロフォアＣｙ３および縦模様で示されるフルオロフォアＣｙ５に対応するフィルターセットで撮影した、それぞれ２つの個別の蛍光顕微鏡写真からなる。マイクロキャビティに予め配置した試薬の顕著なキャリーオーバー、または隣接するマイクロキャビティにおいて起こる反応のクロストークは、画像には見られない。プライマーおよびプローブが予め配置されたマイクロキャビティのみが明らかな蛍光信号を有する。したがって、本実施例によると、画像により、マイクロ流体処理中の低いキャリーオーバー、および本明細書に提示する装置の隣接するマイクロキャビティ間の無視し得るクロストークに関して、図８に説明した以前の実験が確認される。

図９ｄには、ポリメラーゼ連鎖反応によって試料液体中のＡＢＬ鋳型ＤＮＡの陽性検出が示されるマイクロキャビティ「Ｇ４」のＳ字状信号プロファイルを示す。

図９ｅは、ｃｉ値の空間分布のマップを示す。ＡＢＬ標的遺伝子に対するプライマーおよびプローブが予め配置された正確に１２個のマイクロキャビティにおいて、２７．３～２９．６の範囲のｃｉ値で増幅を観察することができる。

図９ｆは、１２個のマイクロキャビティの正規化した増幅曲線に対応するグラフを示す。まとめると、測定により、分子診断増幅法を用いて幾何学的に高度に多重化された試料分析を実行するための収容ユニット１０５の極めて高い適性が強調される。

図１０は、一実施例による収容ユニットを操作する方法１０００の流れ図を示す。方法１０００は、図１に説明したような収容装置に対して用いることができる。方法１０００は、この場合、流体、または例えば流体と混和しないか、もしくはごく僅かにしか混和しない第２の（封止）流体を用いて少なくとも１つのマイクロキャビティを充填および封止するステップ１００５と、反応結果を得るために少なくとも１つの考え得る反応を少なくとも１つのマイクロキャビティにおいて実行するステップ１０１０と、反応結果を評価するステップ１０１５とを含む。

換言すると、流体による収容ユニットのマイクロキャビティの充填を行う。続いて、流体により先で既に充填されたマイクロキャビティを、流体と混和しないか、もしくはごく僅かにしか混和しない第２の（封止）流体で封止する。特に、封止流体とも称される第２の流体は、フッ素化炭化水素である。さらに、本実施例によると、例えば収容ユニットのマイクロキャビティ内で少なくとも１つの標的遺伝子を検出するために、互いに独立した反応、特に増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応または等温増幅反応を実行する。場合により、これに適切な反応条件を外的影響、例えば入熱または放熱によって確立する。特に好ましい実施形態では、ステップ１００５、１０１０、１０１５を収容装置の処理のために設けられた処理ユニットにおいて自動的に行う。

一実施例によると、方法１０００のステップは、有利な実施形態では省略してもよく、かつ／または順序を変更して行ってもよい。

図１１は、一実施例による装置１１００のブロック図を示す。本実施例によると、装置１１００は、図５または図１０に説明した方法のいずれかを実行または制御するように構成されている。装置１１００は、例えば読取りユニット１１１０を用いて入力信号１１０５を読み取り、提供ユニット１１２０を用いて制御信号１１１５を提供するように構成されている。本実施例によると、装置は任意に、読取り信号１１０５によって表される情報を評価するように構成された評価ユニット１１２５を備える。

実施例が第１の特徴と第２の特徴との間に「および／または」あるいは「かつ／または」の接続を含む場合、これは、一実施形態による実施例が第１の特徴および第２の特徴の両方を有し、更なる実施形態による実施例が第１の特徴のみまたは第２の特徴のみを含むと読み取るべきである。

例示的な仕様を以下に示す：
収容要素（１２５）の厚さ：
１００μｍ～３０００μｍ、好ましくは３００μｍ～１０００μｍ
収容要素（１２５）または収容面（１３０）の横寸法：
３ｍｍ×３ｍｍ～３０ｍｍ×３０ｍｍ、好ましくは５ｍｍ×５ｍｍ～１５ｍｍ×１５ｍｍ
マイクロキャビティ（１３５）および更なるマイクロキャビティ（１５０）の数：
２～２０００、好ましくは５０～５００
マイクロキャビティ（１３５）の容量：
１ｎｌ～１００ｎｌ、好ましくは５ｎｌ～４０ｎｌ
マイクロキャビティ（１３５）の直径：
１００μｍ～５００μｍ、好ましくは２５０μｍ～４００μｍ
マイクロキャビティ（１３５）の深さ：
１００μｍ～５００μｍ、好ましくは２００μｍ～３００μｍ
マイクロキャビティ（１３５）のアスペクト比（深さと直径との比）：
０．３～１．０、好ましくは０．６～０．７
マイクロキャビティ（１３５）の端部とマイクロキャビティ（１３５）に隣接する少なくとも１つの更なるマイクロキャビティ（１５０）の端部との距離：
７０μｍ～３００μｍ、好ましくは１００μｍ～２００μｍ
収容面（１３０）での水の接触角：
＜１０°～７５°、好ましくは＜１０°～４０°
マイクロキャビティ（１３５、１５０）に予め配置した試薬：
標的特異的プライマーおよびプローブ、鋳型ＤＮＡ；
添加剤：分子量が例えば６０００または２０００、溶液中の濃度が２～５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
流体（試料液体）：
ＰＣＲもしくは等温増幅法等の増幅反応のためのマスターミックス、またはその成分、特にマイクロキャビティ（１３５、１５０）内に存在するプライマーおよび／またはプローブを含まないマスターミックス
第２の流体（封止流体）：
3MのＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ ＦＣ－４０、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ ＦＣ－７０またはＮｏｖｅｃ ７５００等のフッ素化炭化水素
チャンバ（１１５）が７ｍｍ×７ｍｍ×１ｍｍ（容量約５０μｌ）等の適切な寸法を有する、直径３５０μｍおよび深さ２４０μｍのマイクロキャビティ（１３５、１５０）用の収容装置（１００）内の収容ユニット（１０５）のマイクロキャビティ（１３５、１５０）の充填および封止のための流量：
５～１０μｌ／ｓ

Claims (14)

1. 流体を収容するための収容ユニット（１０５）であって、
   収容要素（１２５）であって、収容面（１３０）と、前記流体を収容するために、前記収容要素（１２５）において前記収容面（１３０）に配置かつ形成された少なくとも１つのマイクロキャビティ（１３５）と、を有する収容要素（１２５）を備え、
   前記収容面（１３０）は、前記少なくとも１つのマイクロキャビティ（１３５）に隣接する少なくとも１つの部分領域に親水性の表面性質を有する、
   収容ユニット（１０５）。
2. 前記マイクロキャビティ（１３５）は、前記収容面（１３０）に対して実質的に垂直に向けられた側壁（１４０）を有する、請求項１記載の収容ユニット（１０５）。
3. 前記収容面（１３０）は、少なくとも部分的に窒化ケイ素層または酸化ケイ素層またはシラン層として構成されている、請求項１または２記載の収容ユニット（１０５）。
4. 前記収容要素（１２５）は、シリコン基板から構成されている、請求項１から３までのいずれか１項記載の収容ユニット（１０５）。
5. 前記流体を収容するために、前記収容要素（１２５）において前記収容面（１３０）に配置かつ形成された複数の更なるマイクロキャビティ（１５０）を備え、前記マイクロキャビティ（１３５）および前記複数の更なるマイクロキャビティ（１５０）は、配置領域（６００）に正方形、長方形、丸形、楕円形、円形または六角形の形状で整列されており、特に前記マイクロキャビティ（１３５）と前記複数の更なるマイクロキャビティ（１５０）との間に、前記収容面（１３０）は、親水性の表面性質を有する、請求項１から４までのいずれか１項記載の収容ユニット（１０５）。
6. 前記マイクロキャビティ（１３５）は、少なくとも１つの予め配置された試薬（２００）および／または添加剤を含む、請求項１から５までのいずれか１項記載の収容ユニット（１０５）。
7. 前記収容面（１３０）は、前記少なくとも１つのマイクロキャビティ（１３５）の配置に対して所定の位置を有する光学的に認識可能な徴標（１５５）を有し、特に前記光学的に認識可能な徴標（１５５）は、そのサイズ、形状および／または光学特性に関して所定の性質を有する、請求項１から６までのいずれか１項記載の収容ユニット（１０５）。
8. 収容装置（１００）であって、
   請求項１から７までのいずれか１項記載の収容ユニット（１０５）と、
   前記収容ユニット（１０５）を収容するためのハウジング（１１０）と、
   流体を前記収容ユニット（１０５）に導入するように構成されたチャンバ（１１５）と、
   前記流体を前記収容ユニット（１０５）に供給し、かつ／または前記収容ユニット（１０５）から排出するように構成された少なくとも１つの通路（１２０）と、
   を備える、収容装置（１００）。
9. 請求項１から７までのいずれか１項記載の収容ユニット（１０５）を製造するための方法（５００）であって、
   収容要素（１２５）の収容面（１３０）を準備するステップ（５０５）と、
   収容ユニット（１０５）を製造するために、流体を収容するためのマイクロキャビティ（１３５）を前記収容面（１３０）に加工するステップ（５１０）と、
   を含む、収容ユニット（１０５）を製造するための方法（５００）。
10. 前記加工するステップ（５１０）において深掘り反応性イオンエッチング法を用いる、請求項９記載の、収容ユニット（１０５）を製造するための方法（５００）。
11. 請求項１から９までのいずれか１項記載の収容ユニット（１０５）を操作するための方法（１０００）であって、
    少なくとも１つのマイクロキャビティ（１３５）に流体を充填するとともに、充填された前記マイクロキャビティ（１３５）を第２の流体で封止するステップ（１００５）と、
    前記マイクロキャビティ（１３５）内での少なくとも１つの反応を可能にし、反応結果（７００；８００；９００）を得るために実行するステップ（１０１０）と、
    前記反応結果（７００；８００；９００）を評価するステップ（１０１５）と、
    を含む、収容ユニット（１０５）を操作するための方法（１０００）。
12. 請求項１１または１２記載の方法（５００；１０００）のうちの一方の方法のステップ（５０５、５１０；１００５、１０１０、１０１５）を対応するユニット（１１１０、１１２５、１１２０）において実行および／または制御するように構成された装置（１１００）。
13. 請求項９から１１までのいずれか１項記載の方法のうちの１つの方法のステップを実行および／または制御するように構成されたコンピュータプログラム。
14. 請求項１３記載のコンピュータプログラムが格納された機械可読の記憶媒体。

Images