JP2023504263A - 体液耐性組織接着剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】体液で覆われた組織表面上でも高速及びロバストな接着を提供する組織接着剤材料。【解決手段】組織接着剤材料は、疎水性マトリックスと、疎水性マトリックス内に分散された複数のバイオ接着剤マイクロ粒子とから形成され、流体で覆われた表面上に接着剤材料を直接配設し、及び接着剤材料に圧力を加えることが、（ａ）疎水性マトリックスが流体を撥くこと、（ｂ）バイオ接着剤粒子が圧縮して接着剤層を形成すること、及び（ｃ）バイオ接着剤粒子が一時的架橋を形成し、その後、表面との共有結合架橋を形成することを引き起こすように構成される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本願は、「Body Fluid Resistant Tissue Adhesives」という名称の２０１９年１２月３日出願の米国仮特許出願第６２／９４２，８７４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
本願は、「Body Fluid Resistant Tissue Adhesives」という名称の２０１９年１２月３日出願の米国仮特許出願第６２／９４２，８７４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
政府支援の記述
本発明は、国立科学財団（National Science Foundation）（ＮＳＦ）により授与された助成金番号ＣＭＭＩ１６６１６２７の下、陸軍研究局（Army Research Office）（ＡＲＯ）により授与された助成金番号Ｗ９１１ＮＦ－１３Ｄ－０００１の下及び海軍研究局（Office of Naval Research）（ＯＮＲ）により授与された助成金番号Ｎ０００１４－１７－１－２９２０の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に関する一定の権利を有する。
本発明は、国立科学財団（National Science Foundation）（ＮＳＦ）により授与された助成金番号ＣＭＭＩ１６６１６２７の下、陸軍研究局（Army Research Office）（ＡＲＯ）により授与された助成金番号Ｗ９１１ＮＦ－１３Ｄ－０００１の下及び海軍研究局（Office of Naval Research）（ＯＮＲ）により授与された助成金番号Ｎ０００１４－１７－１－２９２０の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に関する一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、概して、組織を接着するための接着剤材料及び方法に関し、接着剤材料は、流体で覆われている組織を急速及びロバストに接着する能力がある。接着剤材料は、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子がその中に分散されている疎水性マトリックス材料を含む。
本発明は、概して、組織を接着するための接着剤材料及び方法に関し、接着剤材料は、流体で覆われている組織を急速及びロバストに接着する能力がある。接着剤材料は、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子がその中に分散されている疎水性マトリックス材料を含む。
発明の背景
組織及び器官の外傷性傷害は、かなり時間的制約があるうえに複雑な性質を有するため、生命にかかわるが、治療の取組みが困難なこともある（R. R. Rodrigues, M. J. C. Carmona, J. O. C. Junior, Bleeding and damage control surgery. Current Opinion in Anesthesiology 29, 229-233 (2016)）。例えば、外傷後の制御不能な出血は、世界中の死亡率の主な原因の１つであり、年間２００万人を超える生命を犠牲にしている（R. Pfeifer, I. S. Tarkin, B. Rocos, H.-C. Pape, Patterns of mortality and causes of death in polytrauma patients - has anything changed? Injury 40, 907-911 (2009)、M. El Sayad, H. Noureddine, Recent advances of hemorrhage management in severe trauma. Emergency Medicine International 2014, (2014)）。外傷性傷害の外科的縫合は、最も一般的には、止血後に縫合糸又はステープルにより行われるが、外傷性傷害後に現場でこのプロセスの実施に速やかに及び効果的に取り組むことは、困難である。
組織及び器官の外傷性傷害は、かなり時間的制約があるうえに複雑な性質を有するため、生命にかかわるが、治療の取組みが困難なこともある（R. R. Rodrigues, M. J. C. Carmona, J. O. C. Junior, Bleeding and damage control surgery. Current Opinion in Anesthesiology 29, 229-233 (2016)）。例えば、外傷後の制御不能な出血は、世界中の死亡率の主な原因の１つであり、年間２００万人を超える生命を犠牲にしている（R. Pfeifer, I. S. Tarkin, B. Rocos, H.-C. Pape, Patterns of mortality and causes of death in polytrauma patients - has anything changed? Injury 40, 907-911 (2009)、M. El Sayad, H. Noureddine, Recent advances of hemorrhage management in severe trauma. Emergency Medicine International 2014, (2014)）。外傷性傷害の外科的縫合は、最も一般的には、止血後に縫合糸又はステープルにより行われるが、外傷性傷害後に現場でこのプロセスの実施に速やかに及び効果的に取り組むことは、困難である。
組織接着剤は、創傷閉鎖及び組織修復に対する縫合糸及びステープルの有望な代替手段を提供するが（T. B. Reece, T. S. Maxey, I. L. Kron, A prospectus on tissue adhesives. The American Journal of Surgery 182, S40-S44 (2001)、P. Coulthard etal., Tissue adhesives for closure of surgical incisions. Cochrane Database of Systematic Reviews 5, CD004287 (2010)、B. Sharma et al ., Human cartilage repair with a photoreactive adhesive-hydrogel composite. Science Translational Medicine 5, 167ral66-167ral66 (2013)、N. Annabi, K. Yue, A. Tamayol, A. Khademhosseini, Elastic sealants for surgical applications. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 95, 27-39 (2015)、E. T. Roche et al. , A light-reflecting balloon catheter for atraumatic tissue defect repair. Science Translational Medicine 7, 306ral49-306ral49 (2015)）、既存の組織接着剤は、いくつかの限界を抱える。市販の組織接着剤は、血液及び粘液などの体液により覆われた組織表面との接着を提供しないか、又はごく弱い脆性の接着を提供するにすぎない（N. Lang et al. , A blood-resistant surgical glue for minimally invasive repair of vessels and heart defects. Science Translational Medicine 6, 218ra216-218ra216 (2014)、Y. Hong etal. , A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications 10, 2060 (2019)）。改善された接着性能を備えた少数の血液耐性組織接着剤が開発されてきたが、接着の形成に紫外線（ＵＶ）照射及び／又は長時間定常圧力適用（例えば、５分）が必要であるため、実用的適用では、それらの有用性が実質的に限定される（Lang et al; Y. Hong et al; N. Annabi et al. , Engineering a highly elastic human protein-based sealant for surgical applications. Science Translational Medicine 9, eaai7466 (2017)、J. Li et al. , Tough adhesives for diverse wet surfaces. Science 357, 378-381 (2017)）。
そのため、接着材料及び使用方法の両方におけるさらなる改善が大いに必要とされている。
発明の概要
本発明は、湿潤環境に特に有用な組織接着剤材料を提供する。組織接着剤材料は、体液で覆われた組織表面でも急速及びロバストな接着を提供するため、現場での急速及び信頼できる創傷閉鎖及び組織修復を必要とする外傷性傷害をはじめとして、様々な用途に大きい利点を提供する。
本発明は、湿潤環境に特に有用な組織接着剤材料を提供する。組織接着剤材料は、体液で覆われた組織表面でも急速及びロバストな接着を提供するため、現場での急速及び信頼できる創傷閉鎖及び組織修復を必要とする外傷性傷害をはじめとして、様々な用途に大きい利点を提供する。
一態様によれば、本発明は、流体で覆われた１つ以上の表面を接着するための接着剤材料であって、疎水性マトリックスと、疎水性マトリックス内に分散された複数のバイオ接着剤マイクロ粒子とを含む接着剤材料を提供する。バイオ接着剤マイクロ粒子は、（ｉ）１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーと、（ｉｉ）１つ以上のアミンカップリング基と、（ｉｉｉ）１つ以上の架橋剤とを含む。疎水性マトリックスは、分散されたバイオ接着剤マイクロ粒子の周りに、流体からバイオ接着剤マイクロ粒子を保護する保護マトリックスの形態で存在する。接着剤材料は、流体で覆われた表面上に接着剤材料を直接配設し、及び接着剤材料に圧力を加えることが、（ａ）疎水性マトリックスが流体を撥くこと、（ｂ）バイオ接着剤粒子が圧縮して接着剤層を形成すること、及び（ｃ）バイオ接着剤粒子が一時的架橋を形成し、その後、表面との共有結合架橋を形成することを引き起こすように構造化される。
これらの態様に係る実施形態は、下記の特徴の１つ以上を含み得る。接着剤材料は、注射用接着剤材料の形態である。１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーは、乾燥状態で水を吸収する親水性ポリマー又はコポリマーから選択される。１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーは、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギネート、酸化アルギネート、セルロース、酸化セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリスチレンスルホネート、コラーゲン、アルギン酸、ペクチン及びそれらの組合せから選択される。１つ以上のアミンカップリング基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、アルデヒド、イミドエステル、エポキシド、イソシアネート、カテコール及びそれらの組合せから選択される。１つ以上の架橋剤は、ゼラチンメタクリレート、ヒアルロン酸メタクリレート、酸化メタクリル系アルギネート、ポリカプロラクトンジアクリレート、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート及びそれらの組合せから選択される。疎水性マトリックスは、シリコーン油、鉱油、精油、パーフルオロポリエーテル油、ラノリン油及びそれらの組合せから選択される。接着剤材料は、（ｉ）ポリ（アクリル酸）に、（ｉｉ）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルをグラフトして（ＰＡＡｃ－ｃｏ－ＮＨＳエステル）、（ｉｉｉ）バイオ分解性ゼラチンメタクリレートで架橋したものと、（ｉｖ）バイオ分解性キトサンとから作製された複数のバイオ接着剤マイクロ粒子をシリコーン油疎水性マトリックス中に分散して含む。接着剤材料は、バイオ適合性である。接着剤材料は、少なくとも約１００Ｊｍ－２の界面靭性、少なくとも約３０ｋＰａの剪断強度及び少なくとも約１０ｋＰａの引張り強度で接着する。バイオ接着剤マイクロ粒子は、分子間結合によって一時的架橋を形成するカルボン酸基を含有し、及びアミンカップリング基は、表面との共有結合架橋を形成する。バイオ接着剤マイクロ粒子は、約１０μｍ～約２００μｍの範囲の粒子サイズを有する。バイオ接着剤マイクロ粒子と疎水性マトリックスとの比は、約１：３～約１：０．５の範囲である。１つ以上の流体は、血液、唾液、胃腸液、粘液、汁液及びそれらの組合せから選択される生理学的体液である。接着剤材料は、バイオ分解性であり、及び架橋されたバイオ接着剤マイクロ粒子中への細胞浸透と、下側の組織傷害の治癒とを可能にするように構成される。下側の組織傷害の治癒は、組織細胞がバイオ分解性バイオ接着剤マイクロ粒子と置き換わって下側の組織傷害を治癒することを含む。
他の一態様によれば、本発明は、１つ以上の流体で覆われた１つ以上の組織表面を接着する方法であって、（ａ）流体で覆われた組織表面の１つ以上に接着剤材料を直接適用することであって、接着剤材料は、疎水性マトリックスと、疎水性マトリックス内に分散された複数のバイオ接着剤マイクロ粒子とを含み、バイオ接着剤マイクロ粒子は、（ｉ）１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーと、（ｉｉ）１つ以上のアミンカップリング基と、（ｉｉｉ）１つ以上の架橋剤とを含む、適用することと、（ｂ）接着剤材料に約１ｋＰａ～５０ｋＰａの範囲の圧力を加えることと、（ｃ）疎水性マトリックスが１つ以上の流体を撥き、及びそれを組織表面から除去することを可能にすることと、（ｄ）バイオ接着剤マイクロ粒子中の物理的結合形成基が分子間結合によって一時的架橋を形成することを可能にすることと、（ｅ）バイオ接着剤マイクロ粒子中のアミンカップリング基が組織表面との共有結合架橋を形成することを可能にすることとを含む方法を提供する。
これらの態様に係る実施形態は、下記の特徴の１つ以上を含み得る。圧力は、約５秒間～約３０秒間にわたって加えられる。接着剤材料は、注射用接着剤材料であり、及び接着剤材料は、シリンジを用いて適用される。１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーは、乾燥状態で水を吸収する親水性ポリマー又はコポリマーから選択される。１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーは、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギネート、酸化アルギネート、セルロース、酸化セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリスチレンスルホネート、コラーゲン、アルギン酸、ペクチン及びそれらの組合せから選択される。１つ以上のアミンカップリング基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、アルデヒド、イミドエステル、エポキシド、イソシアネート、カテコール及びそれらの組合せから選択される。１つ以上の架橋剤は、ゼラチンメタクリレート、ヒアルロン酸メタクリレート、酸化メタクリル系アルギネート、ポリカプロラクトンジアクリレート、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート及びそれらの組合せから選択される。疎水性マトリックスは、シリコーン油、鉱油、精油、パーフルオロポリエーテル油、ラノリン油及びそれらの組合せから選択される。接着剤は、（ｉ）ポリ（アクリル酸）に、（ｉｉ）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルをグラフトして（ＰＡＡｃ－ｃｏ－ＮＨＳエステル）、（ｉｉｉ）バイオ分解性ゼラチンメタクリレートで架橋したものと、（ｉｖ）バイオ分解性キトサンとから作製された複数のバイオ接着剤マイクロ粒子をシリコーン油疎水性マトリックス中に分散して含む。接着剤材料は、少なくとも約１００Ｊｍ－２の界面靭性、少なくとも約３０ｋＰａの剪断強度及び少なくとも約１０ｋＰａの引張り強度で接着する。バイオ接着剤マイクロ粒子中の物理的結合形成基は、分子間結合によって一時的架橋を形成するカルボン酸基である。バイオ接着剤マイクロ粒子は、約１０μｍ～約２００μｍの範囲の粒子サイズを有する。接着剤材料は、約１：３～約１：０．５の範囲の、バイオ接着剤マイクロ粒子と疎水性マトリックスとの比を含む。１つ以上の流体は、血漿、間質液、リンパ液、脳脊髄液、胃腸液及びそれらの組合せから選択される生理学的体液である。（ａ）流体で覆われた組織表面の１つ以上に接着剤材料を直接適用した後、及び（ｂ）圧力を加える前に、本方法は、接着剤材料にバッキング材料を適用することをさらに含み、（ｂ）圧力を加えることは、バッキング材料を介して接着剤材料に圧力を加えることを含む。バッキング材料は、湿潤表面に接着しないバイオ適合性材料から作製される。バッキング材料は、酸化セルロース、シリコーンエラストマー、ポリウレタン、ハイドロゲル、湿潤組織に接着しないいずれかの他のバイオ適合性材料及びそれらの組合せから作製される。１つ以上の組織表面は、組織傷害を含み得、及び本方法は、架橋されたバイオ接着剤マイクロ粒子中への細胞浸透と、下側の組織傷害の治癒とを可能にすることをさらに含む。
他の一態様によれば、本発明は、組織傷害を治癒する方法であって、（ａ）組織傷害に接着剤材料を直接適用することであって、組織傷害は、流体で覆われた１つ以上の組織表面を含み、接着剤材料は、疎水性マトリックスと、疎水性マトリックス内に分散された複数のバイオ接着剤マイクロ粒子とを含み、バイオ接着剤マイクロ粒子は、（ｉ）１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーと、（ｉｉ）１つ以上のアミンカップリング基と、（ｉｉｉ）１つ以上の架橋剤とを含む、適用することと、（ｂ）接着剤材料に約１ｋＰａ～５０ｋＰａの範囲の圧力を加えることと、（ｃ）疎水性マトリックスが１つ以上の流体を撥き、及びそれを組織表面から除去することを可能にすることと、（ｄ）バイオ接着剤マイクロ粒子中の物理的結合形成基が分子間結合によって一時的架橋を形成することを可能にすることと、（ｅ）バイオ接着剤マイクロ粒子中のアミンカップリング基が組織表面との共有結合架橋を形成することを可能にすることと、（ｆ）架橋されたバイオ接着剤マイクロ粒子中への細胞浸透と、下側の組織傷害の治癒とを可能にすることとを含む方法を提供する。
これらの態様に係る実施形態は、下記の特徴の１つ以上を含み得る。接着剤材料は、バイオ分解性であり、及び細胞は、バイオ分解性バイオ接着剤マイクロ粒子と置き換わって下側の組織傷害を治癒する。圧力は、約５秒間～約３０秒間にわたって加えられる。接着剤材料は、注射用接着剤材料であり、接着剤材料は、シリンジを用いて適用される。１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーは、乾燥状態で水を吸収する親水性ポリマー又はコポリマーから選択される。１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーは、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギネート、酸化アルギネート、セルロース、酸化セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリスチレンスルホネート、コラーゲン、アルギン酸、ペクチン及びそれらの組合せから選択される。１つ以上のアミンカップリング基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、アルデヒド、イミドエステル、エポキシド、イソシアネート、カテコール及びそれらの組合せから選択される。１つ以上の架橋剤は、ゼラチンメタクリレート、ヒアルロン酸メタクリレート、酸化メタクリル系アルギネート、ポリカプロラクトンジアクリレート、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート及びそれらの組合せから選択される。疎水性マトリックスは、シリコーン油、鉱油、精油、パーフルオロポリエーテル油、ラノリン油及びそれらの組合せから選択される。接着剤は、（ｉ）ポリ（アクリル酸）に、（ｉｉ）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルをグラフトして（ＰＡＡｃ－ｃｏ－ＮＨＳエステル）、（ｉｉｉ）バイオ分解性ゼラチンメタクリレートで架橋したものと、（ｉｖ）バイオ分解性キトサンとから作製された複数のバイオ接着剤マイクロ粒子をシリコーン油疎水性マトリックス中に分散して含む。接着剤材料は、少なくとも約１００Ｊｍ－２の界面靭性、少なくとも約３０ｋＰａの剪断強度及び少なくとも約１０ｋＰａの引張り強度で接着する。バイオ接着剤マイクロ粒子中の物理的結合形成基は、分子間結合によって一時的架橋を形成するカルボン酸基である。バイオ接着剤マイクロ粒子は、約１０μｍ～約２００μｍの範囲の粒子サイズを有する。接着剤材料は、約１：３～約１：０．５の範囲の、バイオ接着剤マイクロ粒子と疎水性マトリックスとの比を含む。１つ以上の流体は、血漿、間質液、リンパ液、脳脊髄液、胃腸液及びそれらの組合せから選択される生理学的体液である。（ａ）流体で覆われた組織表面の１つ以上に接着剤材料を直接適用した後、及び（ｂ）圧力を加える前に、本方法は、接着剤材料にバッキング材料を適用することをさらに含み、（ｂ）圧力を加えることは、バッキング材料を介して接着剤材料に圧力を加えることを含む。バッキング材料は、湿潤表面に接着しないバイオ適合性材料から作製される。バッキング材料は、酸化セルロース、シリコーンエラストマー、ポリウレタン、ハイドロゲル、湿潤組織に接着しないいずれかの他のバイオ適合性材料及びそれらの組合せから作製される。
本発明の他のシステム、方法及び特徴は、下記の図面及び詳細な説明を調べることで当業者に明らかであるか又は明らかになるであろう。かかる追加のシステム、方法及び特徴は、すべて本明細書に含まれ、本発明の範囲内にあり、及び添付の特許請求の範囲により保護されることが意図される。
図面の簡単な説明
添付の図面は、本発明のさらなる理解を提供するために含まれており、本明細書に組み込まれてその一部を構成する。図面の構成要素は、必ずしも原寸通りとは限らず、代わりに本発明の原理を明確に例示することに重点が置かれる。図面は、本発明の実施形態を例示するとともに、記載内容と合わせて本発明の主要部分を説明する役割を果たす。
添付の図面は、本発明のさらなる理解を提供するために含まれており、本明細書に組み込まれてその一部を構成する。図面の構成要素は、必ずしも原寸通りとは限らず、代わりに本発明の原理を明確に例示することに重点が置かれる。図面は、本発明の実施形態を例示するとともに、記載内容と合わせて本発明の主要部分を説明する役割を果たす。
詳細な説明
下記の定義は、本明細書に開示される実施形態の特徴に適用される用語を解釈するのに有用であり、本開示の範囲内の要素を単に定義するにすぎないことを意味する。
下記の定義は、本明細書に開示される実施形態の特徴に適用される用語を解釈するのに有用であり、本開示の範囲内の要素を単に定義するにすぎないことを意味する。
本明細書で用いられる場合、組織接着剤により形成される接着を記述するときの「靭性」という用語は、少なくとも約１００Ｊｍ－２、１２０Ｊｍ－２、１４０Ｊｍ－２、１６０Ｊｍ－２、１８０Ｊｍ－２、２００Ｊｍ－２、２２０Ｊｍ－２、２４０Ｊｍ－２、少なくとも約２５０Ｊｍ－２、少なくとも約２６０Ｊｍ－２、少なくとも約２７０Ｊｍ－２、少なくとも約２８０Ｊｍ－２、少なくとも約２９０Ｊｍ－２、さらには少なくとも約３００Ｊｍ－２の値の界面靭性を意味する。
本明細書で用いられる場合、組織接着剤により形成される接着を記述するときの「強力」という用語は、少なくとも約１０ｋＰａ、少なくとも約２０ｋＰａ、少なくとも約３０ｋＰａ、少なくとも約４０ｋＰａ、少なくとも約５０ｋＰａ、少なくとも約６０ｋＰａ及び少なくとも約７０ｋＰａの剪断強度又は引張り強度を意味する。
本明細書で用いられる場合、組織接着剤により形成される接着を記述するときの「ロバスト」という用語は、１００Ｊｍ－２超の界面靭性、３０ｋＰａ超の剪断強度及び１０ｋＰａ超の引張り強度、好ましい実施形態では少なくとも約２４０Ｊｍ－２の界面靭性、少なくとも約７０ｋＰａの剪断強度及び少なくとも約５０ｋＰａの引張り強度の測定値を含めて、接着の靭性及び強度をまとめて意味する。
本明細書で用いられる場合、組織接着剤により提供される瞬間／高速接着を記述するために用いられるときの「瞬間」及び「高速」という用語は、３０秒以下、より好ましくは２５秒以下、より好ましくは２０秒以下、より好ましくは１５秒以下、より好ましくは１０秒以下、より好ましくは９秒以下、より好ましくは８秒以下、より好ましくは７秒以下、より好ましくは６秒以下、さらにより好ましくは５秒以下の時間を意味する。この時間は、組織接着剤が組織表面に適用されて穏やかな圧力が加えられた瞬間から、組織接着剤中のバイオ接着剤マイクロ粒子が表面と架橋してロバスト接着を形成する時間まで、測定される。接着の形成は、牽引されたときに接着組織が分離しないことで、単純牽引試験及び目視検査により実験的に決定可能である。
本明細書で用いられる場合、接着剤材料に加えられる圧力を記述するために用いられるときの「穏やか」という用語は、約５０ｋＰａ以下、例えば約１ｋＰａ～約５０ｋＰａの範囲の圧力を意味する。例えば、穏やかな圧力は、約４５ｋＰａ以下、約４０ｋＰａ以下、約３５ｋＰａ以下、約３０ｋＰａ以下、約２５ｋＰａ以下、約２０ｋＰａ以下、約１５ｋＰａ以下、約１０ｋＰａ以下、約８ｋＰａ以下、約６ｋＰａ以下、約５ｋＰａ以下、約４ｋＰａ以下、約３ｋＰａ以下、約２ｋＰａ以下、さらには約１ｋＰａ程度の低い圧力を意味するであろう。例示的な実施形態によれば、好適な穏やかな圧力は、約１０ｋＰａである。
本明細書で用いられる場合、流体で「覆われた」として接着剤材料が適用される表面を記述するために用いられるときの「覆われた」という用語は、部分的又は完全に流体で覆われた表面を意味する。このため、「覆われた」とは、接着剤材料の適用時及び流体の反撥前、流体層が表面から全接着剤材料を分離するように、接着剤材料が適用される表面上に全流体層が配設される構成を含み得る。「覆われた」とは、接着剤材料の１つ以上の部分が流体により表面から分離され、及び接着剤材料の１つ以上の部分が流体の反撥前に表面に直接接触するように、接着剤材料が適用される表面の一部分のみ（１００％未満ただし５０％超）がそれに配設された流体層を有する構成も含み得る。
本明細書で用いられる場合、本発明のバイオ接着剤マイクロ粒子を記述するときの「乾燥」という用語は、使用時の材料の平衡含湿率未満の材料を意味する。このため、本発明の乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子をそれが接着する湿潤組織又は他の湿潤した若しくは湿潤された（例えば、生理食塩水により湿潤された）表面に接触して配置したとき、材料は、湿潤した又は湿潤された表面から水、生理食塩水、湿分、間質液及び細胞内液を吸収するであろう。一般に、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子は、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子の合計重量を基準にして液体成分の約５０重量％未満を有するであろう。
本明細書で用いられる場合、「体液」という用語は、血液、唾液、胃腸液、粘液及び汁液をはじめとする水性生理学的流体を意味する。
本明細書で用いられる場合、「湿潤組織」という用語は、水、生理食塩水、間質液及び細胞内液をはじめとする水性溶媒を含有する生物学的組織を意味する。
本明細書で用いられる場合、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子が、接触して配置された湿潤組織表面から、水、生理食塩水、湿分、間質液及び細胞内液をはじめとする水性媒体を吸収する機序を記述するときの「吸収」という用語は、湿潤表面の液体から原子又は分子が乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子の表面を横切ってそれに入ることを意味する。
本明細書で用いられる場合、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子を記述するために用いられるときの「バイオ接着剤」という用語は、生物学的組織の表面上への接着を形成する材料の能力を意味する。
本明細書で用いられる場合、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子を記述するために用いられるときの「マイクロ粒子」という用語は、約２００μｍ以下、例えば、約５μｍ～約２００μｍの範囲のいずれかの値の平均直径を有する微粒子形態の材料を意味する。例えば、マイクロ粒子という用語は、約１８０μｍ以下、約１６０μｍ以下、約１４０μｍ以下、約１２０μｍ以下、約１００μｍ以下、約８０μｍ以下、約６０μｍ以下、約４０μｍ以下、約２０μｍ以下及び約１０μｍ以下の平均直径を有する微粒子形態の材料を意味し得る。しかしながら、接着剤材料の究極的使用及び接着剤材料の所望のレオロジー性などの他の因子に依存して、約５μｍ～約２００μｍの範囲のいずれの粒子サイズも好適に選択可能である。模範的実施形態によれば、好適なマイクロ粒子は、約１０μｍのサイズを有する。
本明細書で用いられる場合、バイオ接着剤マイクロ粒子により形成される一時的架橋を記述するために用いられるときの「一時的」という用語は、分子間結合によって一時的架橋を形成するバイオ接着剤マイクロ粒子中のカルボン酸基などの物理的結合形成基を意味するとともに、瞬間一時的架橋が形成される時間と、ＮＨＳエステル基などのアミンカップリング基とそれ自体の及び接着表面の第１級アミン基との間で安定共有結合架橋が形成される時間と、の間の時間にわたる時間範囲を意味する。
本明細書で用いられる場合、水性溶媒の乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子による吸収を記述するために用いられるときの「膨潤」及び１つ以上の湿潤組織表面との接触時の膨潤とは、一般に、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子のサイズ増加を意味する。
本明細書で用いられる場合、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子を記述するために用いられるときの「バイオ分解性」とは、動物内の内因性酵素及び／又は水による生存動物内の植込み材料の部分的又は全体的な分解及び／又は後続の除去を意味する。
本発明は、一般に、流体の存在下でさえも、様々な材料との瞬間、靭性及び強力接着を形成可能な接着剤材料を提供する。特定的には、接着剤材料は、流体の存在下でさえも、各種組織表面に接着する能力があるとともに各種組織表面に接着して一体化する能力がある。かかる流体としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、湿分並びに血液、唾液、胃腸液、粘液及び汁液をはじめとする生理学的体液が挙げられ得る。
接着剤材料は、反撥－架橋機序を提供するように、バイオ接着剤マイクロ粒子を分散して含む疎水性油マトリックスから作製される。流体で覆われた表面に接着剤材料を適用して穏やかな圧力を加えると、疎水性油マトリックスは、流体を撥いて表面を清浄化し、続いて、バイオ接着剤マイクロ粒子は、互いに及び下側の清浄化湿潤組織表面と架橋を形成する。接着剤材料は、流体で覆われた表面の広範囲に約５秒間～約３０秒間の範囲内の時間にわたり穏やかな圧力（約５０ｋＰａ以下、例えば、約１ｋＰａ～約５０ｋＰａの範囲の圧力）を加えると、靭性（すなわち、少なくとも約１００Ｊｍ－２、さらには少なくとも約２４０Ｊｍ－２程度の高い界面靭性）及び強力（すなわち、少なくとも約３０ｋＰａ、さらには少なくとも約７０ｋＰａ程度の高い剪断強度及び少なくとも約１０ｋＰａ、さらには少なくとも約５０ｋＰａ程度の高い引張り強度）接着を提供する。このため、本発明の接着剤材料は、迅速及びロバストなシーリング／接着（例えば、著しく出血する大動脈の止血シーリング）が必要な救急外傷状況を含めて、様々な用途に特に有用である。本発明の接着剤材料は、接着形成にＵＶ照射も長時間定常圧力適用も必要としないため、既存の接着剤材料の限界を克服する。
次に、本発明の実施形態を詳細に参照する。その例は、添付の図面に示される。可能であれば、同一又は類似の部分を参照するために、図面及び説明で同一参照番号を使用する。
一態様によれば、本発明は、疎水性マトリックス２、特に疎水性油マトリックスと、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３と、の組合せを含む接着剤材料１を提供する。乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３は、疎水性マトリックス２が保護マトリックスとして作用するように、疎水性マトリックス２内に一様に分散される（図１Ａ参照）。使用前、好ましくは、接着剤材料１は、激しく振とう又は撹拌するなどにより疎水性マトリックス２内に分散された乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３の均一混合物であることが保証されるであろう。図１Ａ～Ｃに描かれるように、流体で覆われた組織表面１００（この場合、血液で覆われたブタ皮膚組織）に接着剤材料１を適用して穏やかな圧力を加えると（図１Ｅに描かれるように、ゼラチン被覆ガラス基材により押圧する）、疎水性マトリックス２は、体液から乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３を保護し、体液を撥くことにより、表面を清澄化する（図１Ｂ）。これにより、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３を互いに接触させるとともに湿潤組織表面１００と接触させることが可能である。このため、本発明の接着剤材料１は、流体（例えば、水、生理食塩水、湿分、間質液及び体液、例えば、血液、唾液、胃腸液、粘液及び汁液）により覆われた組織の瞬間ロバスト接着を達成する流体耐性を提供する。
本発明の実施形態によれば、接着剤材料１は、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３を分散して含む疎水性マトリックス２を含む注射用材料の形態である（例えば、図１Ａ、３Ｅ、４、８Ｂ、８Ｄ、８Ｆ、８Ｈ、８Ｊを参照されたい）。穏やかな圧力（例えば１０ｋＰａ）を加えると、疎水性マトリックス２が体液を撥いて、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３は、互いに接触可能になるとともに清浄化湿潤組織表面と接触可能になる（例えば、図１Ｂ、１Ｅ、４を参照されたい）。続いて、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３は、互いに及び湿潤組織表面１００と架橋して、ＵＶ照射などの追加刺激を必要とすることなく約５秒以内にロバスト接着を形成する（例えば、図１Ｃ、１Ｆ、２を参照されたい）。例えば、図２Ａ～Ｄに描かれるように、２つのブタ心臓臓組織を血液で覆い（図２Ａ）、血液で覆われた組織に本発明の組織接着剤を適用し（図２Ｂ）、その後、穏やかな圧力を５秒間にわたって加えたところ（図５Ｃ）、血液で覆われた２つの組織表面間にロバスト接着が形成された（図２Ｄ）。
一態様によれば、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３は、（ｉ）１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーと、（ｉｉ）１つ以上のアミンカップリング基と、（ｉｉｉ）１つ以上の架橋剤と、の組合せを含む乾燥バイオ接着剤材料から形成される。
本発明の実施形態によれば、（ｉ）親水性ポリマー又はコポリマーは、乾燥状態で水を吸収するいずれかの従来の親水性ポリマー又はコポリマーから選択される。かかる好適な親水性ポリマー又はコポリマーとしては、限定されるものではないが、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリスチレンスルホネート、ポリウレタン、カゼイン、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギネート、酸化アルギネート、ペクチン、セルロース及び酸化セルロース並びにそれらの組合せが挙げられる。本接着剤材料は、多種多様なバイオメディカル用途に使用可能であるため、本発明に使用されるポリマーは、好ましくはバイオ適合性である（ただし、非バイオメディカル用途では、バイオ適合性ポリマー材料のみを利用する必要はないであろう）。
本発明の実施形態によれば、（ｉ）１つ以上の疎水性ポリマー又はコポリマーは、（ｉｉ）１つ以上のアミンカップリング基でグラフトされる。好適なアミンカップリング基は、限定されるものではないが、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、アルデヒド、イミドエステル、エポキシド、イソシアネート、カテコール及びそれらの組合せをはじめとする従来のアミンカップリング基から選択される。本接着剤材料は、多種多様なバイオメディカル用途に使用可能であるため、本発明に使用されるアミンカップリング基は、好ましくはバイオ適合性である（ただし、非バイオメディカル用途では、バイオ適合性アミンカップリング基のみを利用する必要はないであろう）。アミンカップリング基は、１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーに１つ以上のアミンカップリング基をグラフトできるように、続いて、１つ以上のアミンカップリング基が、接着剤材料が接着される表面との共有結合架橋を形成するように構成される。
本発明の実施形態によれば、親水性ポリマー又はコポリマーは、好ましくは、（ｉｉｉ）従来の架橋剤から選択される１つ以上の架橋剤で架橋される。かかる架橋剤としては、限定されるものではないが、ゼラチンメタクリレート、ヒアルロン酸メタクリレート、酸化メタクリル系アルギネート、ポリカプロラクトンジアクリレート、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート及びそれらの組合せが挙げられる。本接着剤材料は、多種多様なバイオメディカル用途に使用可能であるため、本発明に使用される架橋剤は、好ましくはバイオ適合性である（ただし、非バイオメディカル用途では、バイオ適合性架橋剤のみを利用する必要はないであろう）。
好ましい実施形態によれば、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３は、（ｉ）１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーと、（ｉｉ）１つ以上のアミンカップリング基と、（ｉｉｉ）１つ以上の架橋剤と、脱イオン水と、の組合せから作製されるバイオ接着剤材料を最初に作製することにより調製される。本発明のある実施形態によれば、バイオ接着剤材料の調製に使用される各種成分の好適量は、その調製したまま（乾燥前）の形態で、（ｉ）約２０ｗ／ｗ％～約５５ｗ／ｗ％の１つ以上の親水性ポリマー、（ｉｉ）約０．５ｗ／ｗ％～約１．５ｗ／ｗ％の１つ以上のアミンカップリング基及び（ｉｉｉ）約０．０５ｗ／ｗ％～約０．１５ｗ／ｗ％の１つ以上の架橋剤並びに残りの部分の脱イオン水の範囲内であろう。
模範的実施形態によれば、バイオ接着剤材料は、その調製したまま（乾燥前）の形態で、約３０ｗ／ｗ％のポリ（アクリル酸）、約２ｗ／ｗ％のキトサン、約１ｗ／ｗ％のＰＡＡｃ－ＮＨＳエステル、約０．１ｗ／ｗ％のゼラチンメタクリレート及び残りの部分の脱イオン水を含む。
次いで、調製したままのバイオ接着剤材料は、脱水され、脱水されたバイオ接着剤材料は、所望の平均粒子サイズの乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３を生成するようにクライオジェニック粉砕に付される。例えば、図３Ａ～Ｅに描かれるように、乾燥バイオ接着剤は、最初に小片に切断され（図３Ａ）、次いで、乾燥バイオ接着剤は、ステンレス鋼ボールの入ったステンレス鋼容器に添加され（図３Ｂ）、次いで、乾燥バイオ接着剤は、クライオジェニックボールミルを用いることによりクライオジェニック条件下で粉砕されて（図３Ｃ）、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３を生成する（図３Ｄ）。こうして形成された乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３は、次いで、接着剤材料１を調製するために所望の比で所望の疎水性マトリックス２と混合され、これは、血液で覆われたブタ心臓上にシリンジを介して注射されるものとして描かれる（図３Ｅ）。接着剤材料１を組織接着剤として使用するとき、疎水性マトリックス２は、バイオ適合性マトリックス材料である。好適な疎水性マトリックス２材料としては、限定されるものではないが、シリコーン油、鉱油、精油、パーフルオロポリエーテル油及び／又はラノリン油が挙げられる。
模範的実施形態によれば、接着剤材料１は、（ｉ）ポリ（アクリル酸）にＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＰＡＡｃ－ｃｏ－ＮＨＳエステル）をグラフトして、バイオ分解性ゼラチンメタクリレートで架橋したものと、（ｉｉ）医療グレードのシリコーン油疎水性マトリックス中に分散されたバイオ分解性キトサンとから作製された乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子を含む。
本発明の実施形態によれば、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３の平均サイズは、クライオジェニック粉砕条件により制御可能である。特定的には、図７に示されるように、粉砕時間を２分間に固定し、粉砕周波数を１０Ｈｚ～３０Ｈｚ（特に１０Ｈｚ、１５Ｈｚ、２０Ｈｚ、２５Ｈｚ及び３０Ｈｚ）で変動させた。図７で実証されるように、粉砕周波数が高いほど、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子の平均サイズは小さくなった（１０Ｈｚで約２００μｍ及び３０Ｈｚで約１０μｍ）。このため、バイオ接着剤マイクロ粒子３の所望の平均サイズは、接着剤材料１の使用及び仕様に応じて達成可能である。
図８Ａ～Ｊに描かれるように、得られたクライオジェニック粉砕バイオ接着剤マイクロ粒子３は、こうしたバイオ接着剤マイクロ粒子３を疎水性マトリックス材料２に添加することにより接着剤材料１を作製するために使用され、得られた接着剤材料１の注射性は、シリンジを介して注射により実証された。特定的には、１０Ｈｚクライオジェニック粉砕周波数での乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３のＳＥＭ画像（図８Ａ）及び直径２．５ｍｍシリンジを介して加圧された対応する接着剤材料１（図８Ｂ）、１５Ｈｚクライオジェニック粉砕周波数での乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子のＳＥＭ画像（図８Ｃ）及び直径１．２ｍｍノズルを介して加圧された対応する接着剤材料１（図８Ｄ）、２０Ｈｚクライオジェニック粉砕周波数での乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子のＳＥＭ画像（図８Ｅ）及び直径１．２ｍｍノズルを介して加圧された対応する接着剤材料１（図８Ｆ）、２５Ｈｚクライオジェニック粉砕周波数での乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子のＳＥＭ画像（図８Ｇ）及び直径１．２ｍｍノズルを介して加圧された対応する接着剤材料１（図８Ｈ）並びに３０Ｈｚクライオジェニック粉砕周波数での乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子のＳＥＭ画像（図８Ｉ）及び直径１．２ｍｍノズルを介して加圧された対応する接着剤材料１（図８Ｊ）が例示される。接着剤材料１のいずれでも、クライオジェニック粉砕時間をすべての場合に２分とし、同一疎水性マトリックス材料２をすべての接着剤材料１に使用した。
本発明の実施形態によれば、接着剤材料１のレオロジー性（すなわち、流動挙動、粘度、剪断降伏応力）は、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３と疎水性マトリックス２との混合比を制御することにより調整された。図８Ｂ、８Ｄ、８Ｆ、８Ｈ、８Ｊ及び９Ａ～Ｅで実証されるように、接着剤材料１は、粘性流体から安定チキソトロピックペーストまでに及んだ。接着剤材料１の流動性を可視化するために、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３と疎水性シリコーン油マトリックス２との質量比を１：３（図９Ａ）、１：２（図９Ｂ）、１：１（図９Ｃ）及び１：０．５（図９Ｄ）に設定して、様々な混合比の接着剤材料１の写真撮影を行った。流動性をさらに実証するために垂直基材上に注射して、混合比１：１、１：２及び１：３の接着剤材料１の写真撮影を図９Ｅで行った。
乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３を形成し、本明細書に記載されるように使用したときに所望の表面上及び／又はそれ自体間で瞬間強力接着が形成されるように疎水性マトリックス２内に分散する。例えば、図４に概略的に描かれるように、接着剤材料１は、他の調製又は清浄化プロセスをなんら用いることなく流体で覆われた所望の表面（例えば、体液により覆われた組織表面）上に直接適用可能である（図４の工程１～２）。穏やかな圧力を加えると（図４の工程３～４）、疎水性マトリックスは、体液を撥いて組織表面から除去する（この場合、体液で覆われた２つの組織表面間に接着剤材料が配設される）。同時に、バイオ接着剤マイクロ粒子中のカルボン酸基などの物理的結合形成基は、分子間結合によって一時的架橋を形成し（図４の工程５）、続いて、ＮＨＳエステル基などのアミンカップリング基と、それ自体の及び清浄化湿潤組織表面の第１級アミン基と、の安定な共有結合架橋を形成する（図４の工程６）。湿潤組織表面への／その間での接着後、膨潤及び架橋された接着剤材料は、組織間のロバスト接着を提供するハイドロゲル薄層を形成する（図４の工程７）。
本発明の接着剤材料１により接着された２つの血液で覆われたブタ心臓組織の断面図の写真は、図５に示されており、左の写真は、５分後の接着を示し、右の写真は、適用２４時間後の接着を示す（サンプルは、実験全体を通して湿潤環境で保存される）。図６に描かれるように、共焦点顕微鏡画像は、適用３０分後の２つのゼラチンハイドロゲル間の接着剤材料の膨潤及び架橋された接着層を示す。特定的には、本明細書に記載されるように、接着剤材料は、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子の形態であり、湿潤組織表面と接触したきに湿潤した生物学的組織から水性溶媒を吸収して乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子を膨潤させる。こうした水性溶媒の吸収及び乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子の膨潤は、接着剤材料と湿潤表面との間に瞬間一時的架橋を提供するとともに、さらには接着剤材料と湿潤表面との後続の高速共有結合カップリング又は架橋を可能にする。
組織接着での接着剤材料１の成分の構造及び機能を実証するために、図１０Ａに例示されるプルオフ試験のセットアップ及び手順を用いて、プルオフ試験を実施した。接着されたブタ心臓組織の表面積は、１ｃｍ２であった。疎水性シリコーン油マトリックスを含まない及び含む乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３により接着されたブタ心臓組織間のプルオフ力を試験した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）浴中で実施されたプルオフ試験の結果は、シリコーン油マトリックス２を含まない及び含む乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３間で同様に高いプルオフ力（ｐ＝０．４８）を示す（図１０Ｂ）。こうした結果から、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子は、単独で、体液の不在下で湿潤組織間の瞬間強力接着を提供可能であることが示唆される。一方、ブタ血液浴中で実施されたプルオフ試験は、シリコーン油マトリックスと混合された乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子では高いプルオフ力を呈するが、シリコーン油マトリックスを含まない乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子では、有意により低いプルオフ力をもたらした（図１０Ｃ）。
組織表面への接着における加えられた圧力及びシリコーン油マトリックスの性質の役割を例示するために、様々な加えられた圧力、さらにはシリコーン油マトリックスの粘度を用いて本発明の接着剤材料により接着されたブタ心臓組織間のプルオフ力を試験した（図１０Ｅ）。示されるように、加えられた圧力の増加に伴って、最初にプルオフ力が増加し、次いで、加えられた圧力がある特定の閾値を超えるとプラトーに達した（例えば、５ｃＳｔの動粘度を有するシリコーン油では１０ｋＰａ）。そのうえ、より高い粘度を有するシリコーン油は、加えられた圧力のより高い閾値を示し（例えば、１００ｃＳｔの動粘度を有するシリコーン油では１６ｋＰａ）、文献の顆粒懸濁理論と一致する（E. Guazzelli, O. Pouliquen, Rheology of dense granular suspensions. Journal of Fluid Mechanics 852, (2018)）。
さらに、図１０Ｄに描かれるように、３つの構成：ｉ）下に体液の層が面して乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子が完全にシリコーン油により湿潤された構成１（保護状態Ｅ１）、ｉｉ）下にシリコーン油の層が面して乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子が完全に体液により湿潤された構成２（非保護状態Ｅ２）、及びｉｉｉ）体液を含まずに乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子が完全にシリコーン油により湿潤された構成３（反撥状態Ｅ３）の合計表面エネルギーを用いて、組織表面上の体液に対する乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３の保護マトリックスとしての疎水性マトリックス２の役割を実証した。乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子のエネルギー的に安定な保護及びシリコーン油マトリックスによる体液の反撥を保証するために、ΔＥＡ＝Ｅ２－Ｅ１＞０及びΔＥＢ＝Ｅ１－Ｅ３＞０を満足するべきである。これは以下のように表すことが可能である。
Ｒ（γoil／air cosθ oil／ａｄ－γｂｆ／air cosθ ｂｆ／ａｄ）＋γｂｆ／air cosθ ｂｆ／tissue－γoil／air cosθ oil／issue＞０ （１）
γoil／ｂｆ＋γoil／air cosθ oil／tissue－γｂｆ／air cosθ ｂｆ／tissue＞０ （２）
式中、Ｒは、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子の実際の表面積と投影表面積との比を表す粗さ係数であり、γＡ／Ｂは、ＡとＢとの界面エネルギーを表し、及びθＡ／Ｂは、Ｂ上のＡの接触角を表す（下付き文字「ａｄ」は、バイオ接着剤マイクロ粒子を表し、「ｂｆ」は、体液を表す）。同一直径を有する密に配置された球状粒子の１次近似に基づいて接着剤材料中の乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子に対してＲをπとすることに留意されたい。対応する値を式（１～２）に代入することにより（Ｒ＝π、γoil／air＝２０．９ｍＮｍ－１、γｂｆ／air＝７２．０ｍＮｍ－１、γoil／ｂｆ＝４０ｍＮｍ－１、θoil／ａｄ＝４．５°、θｂｆ／ａｄ＝９６°、θoil／tissue＝４．２°、θｂｆ／tissue＝８４°）、接着剤材料がこれらの不等式を満足することは明らかである。そのため、シリコーン油マトリックスは、体液から乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子を保護し、組織表面から体液を撥くため、本発明の接着剤材料の設計及び機序が実証される。
Ｒ（γoil／air cosθ oil／ａｄ－γｂｆ／air cosθ ｂｆ／ａｄ）＋γｂｆ／air cosθ ｂｆ／tissue－γoil／air cosθ oil／issue＞０ （１）
γoil／ｂｆ＋γoil／air cosθ oil／tissue－γｂｆ／air cosθ ｂｆ／tissue＞０ （２）
式中、Ｒは、乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子の実際の表面積と投影表面積との比を表す粗さ係数であり、γＡ／Ｂは、ＡとＢとの界面エネルギーを表し、及びθＡ／Ｂは、Ｂ上のＡの接触角を表す（下付き文字「ａｄ」は、バイオ接着剤マイクロ粒子を表し、「ｂｆ」は、体液を表す）。同一直径を有する密に配置された球状粒子の１次近似に基づいて接着剤材料中の乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子に対してＲをπとすることに留意されたい。対応する値を式（１～２）に代入することにより（Ｒ＝π、γoil／air＝２０．９ｍＮｍ－１、γｂｆ／air＝７２．０ｍＮｍ－１、γoil／ｂｆ＝４０ｍＮｍ－１、θoil／ａｄ＝４．５°、θｂｆ／ａｄ＝９６°、θoil／tissue＝４．２°、θｂｆ／tissue＝８４°）、接着剤材料がこれらの不等式を満足することは明らかである。そのため、シリコーン油マトリックスは、体液から乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子を保護し、組織表面から体液を撥くため、本発明の接着剤材料の設計及び機序が実証される。
そのため、保護疎水性マトリックス２の不在下では、体液は、簡単に乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３中に浸透して相互作用可能であるため、マイクロ粒子間の及び／又は組織表面とのロバスト接着の形成が妨害される。これらの結果から、本発明の接着剤材料１の疎水性マトリックス２は、体液の存在下で乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３を効果的に保護し保存することが示唆される。特定的には、図１１に例示されるように、（ｉ）疎水性マトリックスを含まない乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子の層で覆われたブタ大動脈の上に血液で覆われたゼラチンハイドロゲルを配置し、次いで（ｉｉ）血液で覆われたゼラチンハイドロゲルを組織に押圧すると、（ｉｉｉ）血液は、バイオ接着剤マイクロ粒子中に浸透し始め、（ｉｖ～ｖ）浸透した血液は、バイオ接着剤マイクロ粒子を膨潤させて不活性化し、（ｖｉ）乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子による接着は、ゼラチンハイドロゲルとブタ大動脈との間に形成されなかった。
一方、疎水性マトリックス２内に分散された乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３を含有する本発明の接着剤材料による血液反撥プロセスは、図１２で実証される。示されるように、（ｉ）本発明の接着剤材料の層で覆われたブタ大動脈の上に血液で覆われたゼラチンハイドロゲルを配置し、次いで（ｉｉ）血液で覆われたゼラチンハイドロゲルを組織に押圧すると、（ｉｉｉ）血液は、接着剤材料により撥かれ始め、（ｉｖ）組織表面上の血液は、接着剤材料により組織表面から除去され、（ｖ）ゼラチンハイドロゲルと清浄化ブタ大動脈との間に接着剤材料によるロバスト接着が形成された。特定的には、穏やかな圧力を加えると、接着剤材料１中の乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子３は、緻密に圧密化され、非流動性の詰め込まれた接着剤層を形成する。この圧密化プロセスでは、疎水性マトリックス２は、接着剤材料１から押し出され、体液を撥いて組織表面から除去される（図１２）。そのため、加えられた圧力及びシリコーン油マトリックスの疎水性は、バイオ接着剤マイクロ粒子３による接着剤材料の接着形成を可能にする。
接着剤材料１の接着性能をさらに評価するために、３つの異なるタイプの機械的試験を実施して、（ｉ）１８０剥離試験規格（ASTM F2256）に準拠した試験セットアップを用いて界面靭性を測定し（図１３Ａ）、（ｉｉ）ラップ剪断試験規格（ASTM F2255）に準拠した試験セットアップを用いて剪断強度を測定し（図１３Ｂ）、及び（ｉｉｉ）引張り試験規格（ASTM F2258）に準拠した試験セットアップを用いて引張り強度を測定した（図１３Ｃ）。次いで、接着された血液で覆われたブタ皮膚組織で界面靭性対押圧時間をプロットすることにより（図１４Ａ）、及び接着された血液で覆われたブタ皮膚組織で界面靭性対貯蔵時間をプロットすることにより（図１４Ｂ）、接着剤材料１の接着性能をグラフで描いた。本発明の接着剤材料１は、接触させて穏やかな圧力（１０ｋＰａ）を５ｓ未満加えると、血液で覆われたブタ皮膚組織との間で２４０Ｊｍ－２を超える界面靭性でロバスト接着を形成することが実証されたことから、迅速体液耐性接着能力が実証される（図１４Ａ）。接着剤材料１により接着された組織は、初期押圧後の４８時間貯蔵にわたり測定された界面靭性（ｐ＝０．７８）の有意な劣化も示さなかった（図１４Ｂ）。さらに、血液で覆われたブタ皮膚組織上での本発明の接着剤材料１と各種市販の組織接着剤及びグルーとの接着性能の比較から（図１４Ｃ）、本発明の接着剤材料１は、ゼラチン系止血シーラント（例えば、Surgiflo（登録商標））、フィブリン系止血シーラント（例えば、Tisseel、TachoSil（登録商標））、アルブミン系接着剤（例えば、BioGlue（登録商標））、ＰＥＧ系接着剤（例えば、Coseal）及びシアノアクリレート接着剤（Histoacryl（登録商標））をはじめとする既存の市販の組織接着剤及びグルーと比較して、優れた接着性能を有することが示される。図１４Ｃに示されるように、これらの市販の組織接着剤及びグルーは、血液で覆われたブタ皮膚組織上で相対的に遅い接着形成（１分よりも長い）及び限られた接着性能（３０Ｊｍ－２未満の界面靭性及び２０ｋＰａ未満の剪断／引張り強度）を呈する。これとは対照的に、本発明の接着剤材料１は、５ｓ未満で２４０Ｊｍ－２を超える界面靭性、７０ｋＰａを超える剪断強度及び５０ｋＰａを超える引張り強度を有するロバスト接着を実証するため、市販の組織接着剤及びグルーよりも有意に優れている。
図１４Ｄ～Ｅ及び１５でさらに実証されるように、本発明の接着剤材料は、５秒未満で高い界面靭性（皮膚に対して２４０Ｊｍ－２、大動脈に対して１５０Ｊｍ－２、心臓に対して１４０Ｊｍ－２、筋肉に対して３３０Ｊｍ－２及び血液で覆われたハイドロゲルに対して１７０Ｊｍ－２を超え、胃に対して１２０Ｊｍ－２並びに粘液及び胃液で覆われた小腸に対して１００Ｊｍ－２を超える）、剪断及び引張り強度（皮膚に対して７０ｋＰａ、大動脈に対して５５ｋＰａ、心臓に対して４５ｋＰａ、筋肉に対して５０ｋＰａ及び血液で覆われたハイドロゲルに対して４５ｋＰａを超え、胃に対して３０ｋＰａ並びに粘液及び胃液で覆われた小腸に対して３５ｋＰａを超える）を有してロバスト接着が形成されるように、広範囲にわたる体液で覆われた組織及びハイドロゲルに適用可能である。
追加の装置（例えば、ＵＶ）を必要とすることなく、又は接着剤材料１の適用前に最初に表面から流体を除去する必要もなく、体液により覆われた組織及び器官上で瞬間強力接着を形成する接着剤材料１のユニークな能力は、各種臨床及びバイオメディカル用途に利益を提供するであろう。接着剤材料の潜在的用途を探究するために、接着剤材料１を用いてエクスビボブタ大動脈及びインビボラット心臓モデルの止血シーリングを調べた。図１６Ａで実証されるように、市販の酸化セルロースバッキング（Surgicel（登録商標）、２．５ｃｍ×２．５ｃｍサイズ）と組み合わせた接着剤材料１は、５秒未満で出血ブタ大動脈（３ｍｍの穴、１５０ｍｍＨｇの血流圧力）のロバスト止血シールを形成した。接着剤材料１によりシールされた大動脈は、持続血流下で接着を維持し、接着剤材料１の初期押圧後６時間にわたり漏れを生じることなく高い生理学的圧力（２５０ｍｍＨｇ）に耐えた。さらに、試験後、出血ブタ大動脈から血液を採取してメッシュ（１００μｍメッシュサイズ）で濾過した（６時間にわたる閉ループフロー）。図１７に描かれるように、メッシュ上にバイオ接着剤マイクロ粒子は観測されなかったことから、塞栓の潜在的リスクに対して接着剤材料１により形成された止血シールのロバスト性が実証される。接着剤材料１を用いて形成された止血シールの強度を定量的に評価するために、ブタ大動脈組織を用いることにより接着剤材料１の破裂圧力を測定した（ASTM F2392-04）（図１６Ｃ）。接着剤材料１は、ヒトの正常収縮期動脈血圧（約１２０ｍｍＨｇ）並びに縫合糸及び市販の止血シーラント（例えば、Surgiflo（登録商標）及びTisseel）の性能を有意に超える３５０ｍｍＨｇ超の高い破裂圧力を実証した。
注射された接着剤材料１に対する非組織接着剤カバーを提供するために、この例では酸化セルロースバッキング材料が導入されたことに留意されたい。この例では、注射用ペースト状又はグルー状材料の形態で接着剤材料１を標的組織部位に提供し、続いて、標的生物学的組織上への押圧を容易にするために、堆積された接着剤材料１の上にバッキングを配置した。同様に、バッキング材料は、他の接着剤材料１堆積方法、例えば、組織部位上への接着剤材料１の塗布又はさもなければ展延のためにも使用され得る。同様に、各種他のバッキング材料組成物を好適に使用可能である。好適なバッキング材料組成物としては、酸化セルロース、シリコーンエラストマー、ポリウレタン、ハイドロゲル、湿潤組織に接着しないいずれかの他のバイオ適合性材料及びそれらの組合せが挙げられる。接着剤材料１を２つの表面（例えば、２つの組織表面）間に配置し、それらの間に挟んで表面を接着一体化する実施形態では、バッキング材料は必要ないであろう。
そのため、表面を前清浄化し、追加の装置（例えば、ＵＶ）を使用し、及び／又は接着が形成されるように長時間定常圧力を適用する必要なく、接着剤材料は、流体により覆われた組織及び器官などの表面上に瞬間強力接着を形成するユニークな能力を提供する。このため、接着剤材料は、各種臨床及びバイオメディカル用途に使用するのに有益であり得る。流体により覆われた表面に急速に、正確に及びロバストに接着する接着剤材料の能力はさらに、かなり時間的制約のある本質的に複雑な組織及び器官の外傷性の命にかかわる傷害を現場で治療する必要性に対処可能である。接着剤材料により提供されるユニークな能力は、既存の組織接着剤の一群の長期にわたる課題に対処し、組織工学、薬剤送達及びバイオインテグレートデバイスの将来的発展の新しい機会を提供し得る。湿潤接着に対する新しい反撥－架橋機序はさらに、湿潤及び水中環境での将来的接着剤の設計の着想を与え得る。
実験データ
材料
化学品は、特に記載がない限り、すべてSigma-Aldrichから入手し、さらなる精製を行うことなく使用した。乾燥バイオ接着剤を調製するために、アクリル酸、ゼラチンメタクリレート（ｇｅｌＭＡ、６０％置換を有するブタ皮膚由来のタイプＡブルーム９０～１００）、アクリル酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＡＡｃ－ＮＨＳエステル）、α－ケトグルタル酸及びキトサン（７５～８５％脱アセチル化）を使用した。乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子のマトリックス用に、異なる粘度（５ｃＳｔ及び１００ｃＳｔ）を有するシリコーン油を使用した。接着剤材料の可視化のために、共焦点顕微鏡画像用としてＦＩＴＣ－キトサン（KITO-8、PolySciTech（登録商標））を使用した。ハイドロゲルを調製するために、アクリルアミド、ゼラチン（ブタ皮膚由来のタイプＡブルーム３００）、ｇｅｌＭＡ及びIrgacure 2959を使用した。ブタ血液は、Lampire Biological Laboratories, Inc.から購入した。エクスビボ実験用のブタ組織は、すべて研究グレードのブタ組織のベンダー（Sierra Medical Inc.）から購入した。
材料
化学品は、特に記載がない限り、すべてSigma-Aldrichから入手し、さらなる精製を行うことなく使用した。乾燥バイオ接着剤を調製するために、アクリル酸、ゼラチンメタクリレート（ｇｅｌＭＡ、６０％置換を有するブタ皮膚由来のタイプＡブルーム９０～１００）、アクリル酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＡＡｃ－ＮＨＳエステル）、α－ケトグルタル酸及びキトサン（７５～８５％脱アセチル化）を使用した。乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子のマトリックス用に、異なる粘度（５ｃＳｔ及び１００ｃＳｔ）を有するシリコーン油を使用した。接着剤材料の可視化のために、共焦点顕微鏡画像用としてＦＩＴＣ－キトサン（KITO-8、PolySciTech（登録商標））を使用した。ハイドロゲルを調製するために、アクリルアミド、ゼラチン（ブタ皮膚由来のタイプＡブルーム３００）、ｇｅｌＭＡ及びIrgacure 2959を使用した。ブタ血液は、Lampire Biological Laboratories, Inc.から購入した。エクスビボ実験用のブタ組織は、すべて研究グレードのブタ組織のベンダー（Sierra Medical Inc.）から購入した。
方法
体液耐性接着剤材料の調製。バイオ接着剤を調製するために、３０ｗ／ｗ％のアクリル酸、２ｗ／ｗ％のキトサン、１ｗ／ｗ％のＡＡｃ－ＮＨＳエステル、０．１ｗ／ｗ％のｇｅｌＭＡ及び０．５ｗ／ｗ％のα－ケトグルタル酸を脱イオン水に溶解した。次いで、混合物を０．４μｍ無菌シリンジフィルターで濾過し、５００μｍスペーサーを備えたガラス成形型上に注加した。バイオ接着剤をＵＶチャンバー（２８４ｎｍ、１０Ｗパワー）内で６０分硬化し、２４時間窒素流動下で完全乾燥させた。乾燥バイオ接着剤をプラスチックバッグでシールし、使用前、－２０℃で貯蔵した。共焦点顕微鏡画像用に接着剤材料の可視化に役立てるために、０．２ｗ／ｗ％のＦＩＴＣ－キトサンを硬化前に前駆体溶液中にさらに添加した。
体液耐性接着剤材料の調製。バイオ接着剤を調製するために、３０ｗ／ｗ％のアクリル酸、２ｗ／ｗ％のキトサン、１ｗ／ｗ％のＡＡｃ－ＮＨＳエステル、０．１ｗ／ｗ％のｇｅｌＭＡ及び０．５ｗ／ｗ％のα－ケトグルタル酸を脱イオン水に溶解した。次いで、混合物を０．４μｍ無菌シリンジフィルターで濾過し、５００μｍスペーサーを備えたガラス成形型上に注加した。バイオ接着剤をＵＶチャンバー（２８４ｎｍ、１０Ｗパワー）内で６０分硬化し、２４時間窒素流動下で完全乾燥させた。乾燥バイオ接着剤をプラスチックバッグでシールし、使用前、－２０℃で貯蔵した。共焦点顕微鏡画像用に接着剤材料の可視化に役立てるために、０．２ｗ／ｗ％のＦＩＴＣ－キトサンを硬化前に前駆体溶液中にさらに添加した。
乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子を調製するために、乾燥バイオ接着剤を小片に切断し、クライオジェニックグラインダー（CryoMill, Retsch）の容器内に添加し、続いて、クライオジェニック粉砕プロセス（周波数３０Ｈｚ、２分）を行った。乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子とシリコーン油マトリックスとを十分に混合することにより、接着剤材料を調製した。調製された接着剤材料を乾燥剤（シリカゲルパケット）入りのプラスチックバッグでシールし、使用前、－２０℃で貯蔵した。特に明記されていない限り、５ｃＳｔの粘度及び乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子とシリコーン油との質量比１：１（体積分率＝０．４と等価）を有するシリコーン油を使用した。
機械的試験。機械的試験前１０分超貯蔵した組織サンプルに対して、サンプルを多量の０．０１ｗ／ｖ％のアジ化ナトリウム溶液（ＰＢＳ中）スプレーで覆い、組織の分解及び脱水を防止するためにプラスチックバッグでシールした。特に指示がない限り、組織及びハイドロゲルは、すべて体液（血液又は胃液）で覆ってから５秒押圧し（機械的試験機又は等価錘のどちらかにより加えられる１０ｋＰａの圧力）、接着剤材料により接着した。特に指示がない限り、接着サンプル上での機械的試験のすべては、接着された接着剤材料の平衡膨潤を湿潤生理学的環境で確保するために初期押圧６時間後に実施した。市販の組織接着剤及びグルーの適用は、各製品に対して提供されたマニュアルに従った。
プルオフ試験では、ブタ心臓組織を１ｃｍ２の表面積及び５ｍｍの厚さで切断した。一方、シアノアクリレートグルー（Krazy Glue（商標））を用いることにより、ＰＢＳ又はブタ血液浴で満たされたガラス容器にブタ心臓組織を接着した。他方、シアノアクリレートグルーを用いてブタ心臓組織をアルミニウム固定具に接着するとともに、異なる粘度（５ｃＳｔ又は１００ｃＳｔ）のシリコーン油マトリックスを用いずに又は用いて乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子により組織の表面を覆った。機械的試験機（２．５ｋＮロードセル、Zwick/Roell Z2.5）を用いることにより異なる圧力で、接着剤で覆われたブタ心臓組織を浴中に浸漬された組織に５秒押圧した。次いで、アルミニウム固定具を持ち上げることにより、接着組織を牽引し、最大引張り力をプルオフ力として測定した。
界面靭性を測定するために、幅２．５ｃｍの接着されたサンプルを作製し、機械的試験機で１８０度剥離試験規格（ASTM F2256）により試験した。試験は、すべて５０ｍｍ 分－１の一定剥離スピードで行った。測定された力は、剥離プロセスが定常状態に入るとプラトーに達した。界面靭性は、プラトー力（１８０度剥離試験）の２倍を組織サンプルの幅で除算することにより決定された（図１３Ａ）。シアノアクリレートグルーを用いることにより、組織及びハイドロゲルに対する剛性バッキングとしてポリ（メチルメタクリレート）フィルム（厚さ５０μｍ、Goodfellow）を適用した。
剪断強度を測定するために、幅２．５ｃｍ及び長さ１ｃｍの接着領域を有する接着されたサンプルを作製し、機械的試験機を用いてラップ剪断試験規格（ASTM F2255）により試験した（図１３Ｂ）。試験は、すべて５０ｍｍ 分－１の一定引張りスピードで行った。剪断強度は、最大力を接着面積で除算することにより決定された。シアノアクリレートグルーを用いて、組織及びハイドロゲルに対する剛性バッキングとしてポリ（メチルメタクリレート）フィルムを適用した。
引張り強度を測定するために、幅２．５ｃｍ及び長さ２．５ｃｍの接着領域を有する接着されたサンプルを作製し、機械的試験機を用いて引張り試験規格（ASTM F2258）により試験した（図１３Ｃ）。試験は、すべて５０ｍｍ 分－１の一定引張りスピードで行った。引張り強度は、最大力を接着面積で除算することにより決定された。引張り試験用のグリップを提供するために、シアノアクリレートグルーを用いることによりアルミニウム固定具を適用した。
ハイドロゲルの調製。接着試験用のハイドロゲルを調製するために、２０ｗ／ｗ％のアクリルアミド、１０ｗ／ｗ％のゼラチン、０．２ｗ／ｗ％のｇｅｌＭＡ及び０．２ｗ／ｗ％のIrgacure 2959を脱イオン水に溶解した。次いで、混合物を０．４μｍ無菌シリンジフィルターで濾過し、３ｍｍスペーサーを備えたガラス成形型上に注加した。ＵＶチャンバー（２８４ｎｍ、１０Ｗパワー）内でハイドロゲルを６０分硬化させた。
顕微鏡イメージング。画像コントラストを増強するために５ｎｍ金スパッタリングを施してＳＥＭ設備（JSM-6010LA, JEOL）を用いることにより、クライオジェニック粉砕乾燥バイオ接着剤マイクロ粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を得た。ＦＩＴＣに対して４９０ｎｍ励起波長を用いて、正立共焦点顕微鏡（SP8, Leica）により接着剤材料の共焦点顕微鏡画像を得た。
接触角測定。乾燥バイオ接着剤又はブタ皮膚組織をガラス基材上に結合し、接触角装置（Rame-Hart）を用いることにより、シリコーン油及びブタ血液の接触角を測定した。接触角測定は、相対湿度３５％、室温で（２３～２６℃）行われた。
エクスビボ試験。エクスビボ実験は、すべてマサチューセッツ工科大学（Massachusetts Institute of Technology）の動物管理委員会（Committee on Animal Care）により精査され承認された。出血大動脈の止血シーリングのために、シリコーンチューブを介してブタ大動脈をブタ血液浴及びポンプに接続し、圧力１５０ｍｍＨｇの閉ループ血流を発生させた（図１６Ａ）。生検パンチ（Dynarex）により直径３ｍｍの穴をブタ大動脈に開けた。止血シールを形成するために、幅２．５ｃｍ及び長さ２．５ｃｍの面積の市販の分解性外科用ガーゼ（Surgicel（登録商標）, Ethicon）上に１ｍＬの接着剤材料を注射し、穿刺穴上に穏やかに５秒押圧した。シールされたブタ大動脈を持続血流により室温で６時間保存して、接着剤材料により作製された止血シーリングをモニターした。組織の脱水及び分解を回避するために、０．０１ｗ／ｖ％のアジ化ナトリウム溶液（ＰＢＳ中）をブタ大動脈上にスプレーした。試験後、血液中の自由浮遊バイオ接着剤マイクロ粒子の存在をチェックするために、１００μｍメッシュを用いることにより血液浴を濾過した。
破裂圧力を測定するために、幅２．５ｃｍ及び長さ２．５ｃｍの面積を有するブタ大動脈を作製し、破裂圧力試験規格（ASTM F2392-04）により試験した（図１６Ｂ）。生検パンチ（Dynarex）を用いることにより、３ｍｍの穴をブタ大動脈に導入した。次いで、穿刺されたブタ大動脈をブタ血液で覆い、各種接着剤（接着剤材料とSurgicel（登録商標）バッキング、縫合糸（Ethicon 4-0 vicryl）、Surgiflo（登録商標）及びTisseelとの併用）を用いることによりシールした。シーリング３０分後、２ｍｌ／分の流量でシリンジポンプを用いてＰＢＳをポンプ移送することにより、シールされたブタ大動脈に圧力を加えた。圧力ゲージ（Omega）を用いることにより、最大圧力を破裂圧力として記録した。
バイオ適合性及びバイオ分解性
組織グルーのバイオ適合性及びバイオ分解性を評価するために、ラットモデルに基づいてインビトロ及びインビボ特徴付けを実施した（図１８Ａ～Ｌ）。組織グルーで馴化された細胞培養培地（ＤＭＥＭ）は、２４時間培養後、コントロール（本来のＤＭＥＭ）と同程度のラット心筋細胞のインビトロ細胞傷害性を呈した（図１８Ａ）。１日間～２週間の各種時点でラットモデルの背側皮下植込みに基づいて、組織グルーのインビボバイオ適合性を評価した（図１８Ｂ～Ｃ及び図１９Ａ～Ｂ）。盲検病理学者による組織学的アセスメントでは、組織グルーは、すべての時点で市販の米国食品医薬品局（U.S. Food and Drug Administration）（ＦＤＡ）承認組織接着剤Cosealに匹敵する非常に軽度～軽度の炎症を誘発することが実証された（１日間ではｐ＝０．３９、３日間ではｐ＝０．５４、１週間ではｐ＝０．６７、２週間ではｐ＝０．２１、図１８Ｄ）。組織グルーのインビボバイオ適合性をさらに調べるために、炎症性反応及び異物反応に関連する線維芽細胞（αＳＭＡ）、１型コラーゲン（コラーゲンＩ）、Ｔ細胞（ＣＤ３）及びマクロファージ（ＣＤ６８）に対する各種マーカーの免疫蛍光染色を実施した（図１８Ｅ～Ｈ及び図１９Ｃ～Ｆ）。規格化免疫蛍光強度分析では、組織グルーは、Cosealと比較してすべての時点でαＳＭＡ、コラーゲンＩ、ＣＤ３及びＣＤ６８の発現の有意差を生じないことが実証された（図１８Ｉ～Ｌ）。とりわけ、組織グルーは、マクロファージによる再吸収を介してより長期の植込みにわたり漸進的バイオ分解を呈し（図２０Ａ～Ｃ）、バイオ分解の速度は、ゼラチンなどのより高速分解性材料を用いてバイオ接着剤マイクロ粒子中のキトサンを置き換えることにより加速可能である（図２０Ｄ）。
組織グルーのバイオ適合性及びバイオ分解性を評価するために、ラットモデルに基づいてインビトロ及びインビボ特徴付けを実施した（図１８Ａ～Ｌ）。組織グルーで馴化された細胞培養培地（ＤＭＥＭ）は、２４時間培養後、コントロール（本来のＤＭＥＭ）と同程度のラット心筋細胞のインビトロ細胞傷害性を呈した（図１８Ａ）。１日間～２週間の各種時点でラットモデルの背側皮下植込みに基づいて、組織グルーのインビボバイオ適合性を評価した（図１８Ｂ～Ｃ及び図１９Ａ～Ｂ）。盲検病理学者による組織学的アセスメントでは、組織グルーは、すべての時点で市販の米国食品医薬品局（U.S. Food and Drug Administration）（ＦＤＡ）承認組織接着剤Cosealに匹敵する非常に軽度～軽度の炎症を誘発することが実証された（１日間ではｐ＝０．３９、３日間ではｐ＝０．５４、１週間ではｐ＝０．６７、２週間ではｐ＝０．２１、図１８Ｄ）。組織グルーのインビボバイオ適合性をさらに調べるために、炎症性反応及び異物反応に関連する線維芽細胞（αＳＭＡ）、１型コラーゲン（コラーゲンＩ）、Ｔ細胞（ＣＤ３）及びマクロファージ（ＣＤ６８）に対する各種マーカーの免疫蛍光染色を実施した（図１８Ｅ～Ｈ及び図１９Ｃ～Ｆ）。規格化免疫蛍光強度分析では、組織グルーは、Cosealと比較してすべての時点でαＳＭＡ、コラーゲンＩ、ＣＤ３及びＣＤ６８の発現の有意差を生じないことが実証された（図１８Ｉ～Ｌ）。とりわけ、組織グルーは、マクロファージによる再吸収を介してより長期の植込みにわたり漸進的バイオ分解を呈し（図２０Ａ～Ｃ）、バイオ分解の速度は、ゼラチンなどのより高速分解性材料を用いてバイオ接着剤マイクロ粒子中のキトサンを置き換えることにより加速可能である（図２０Ｄ）。
バイオ適合性及びバイオ分解性の評価方法
インビトロバイオ適合性評価。細胞培養のために組織グルー馴化培地を用いることにより、インビトロバイオ適合性試験を行った。組織グルー馴化培地又はCoseal馴化培地を調製するために、１０ｖ／ｖ％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１００Ｕｍｌ－１のペニシリン－ストレプトマイシンが補充された１０ｍＬのＤＭＥＭ中で、０．５ｍｌの組織グルー又はCosealを３７℃で２４時間インキュベートした。組織グルーのインキュベーションを伴わない補充ＤＭＥＭをコントロールとして使用した。０．５×１０５細胞（各群当たりｎ＝４）の密度で共焦点ディッシュ（直径２０ｍｍ）にラット胚性心筋細胞（H9c2(2-1), ATCC）をプレーティングした。次いで、細胞を組織グルー馴化培地で処理し、５％ＣＯ２中３７℃で２４時間インキュベートした。哺乳動物細胞用のLIVE/DEAD生存率／細胞傷害性キット（Thermo Fisher Scientific）により細胞生存率を決定した。レーザー共焦点顕微鏡（SP 8, Leica）を用いて、４９５ｎｍ／５１５ｎｍの励起／発光で生細胞を、４９５ｎｍ／６３５ｎｍで死細胞を、それぞれイメージングした。ImageJ（version 2.1.0）を用いることにより生細胞（緑色蛍光）及び死細胞（赤色蛍光）の数をカウントして、細胞生存率を計算した。
インビトロバイオ適合性評価。細胞培養のために組織グルー馴化培地を用いることにより、インビトロバイオ適合性試験を行った。組織グルー馴化培地又はCoseal馴化培地を調製するために、１０ｖ／ｖ％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１００Ｕｍｌ－１のペニシリン－ストレプトマイシンが補充された１０ｍＬのＤＭＥＭ中で、０．５ｍｌの組織グルー又はCosealを３７℃で２４時間インキュベートした。組織グルーのインキュベーションを伴わない補充ＤＭＥＭをコントロールとして使用した。０．５×１０５細胞（各群当たりｎ＝４）の密度で共焦点ディッシュ（直径２０ｍｍ）にラット胚性心筋細胞（H9c2(2-1), ATCC）をプレーティングした。次いで、細胞を組織グルー馴化培地で処理し、５％ＣＯ２中３７℃で２４時間インキュベートした。哺乳動物細胞用のLIVE/DEAD生存率／細胞傷害性キット（Thermo Fisher Scientific）により細胞生存率を決定した。レーザー共焦点顕微鏡（SP 8, Leica）を用いて、４９５ｎｍ／５１５ｎｍの励起／発光で生細胞を、４９５ｎｍ／６３５ｎｍで死細胞を、それぞれイメージングした。ImageJ（version 2.1.0）を用いることにより生細胞（緑色蛍光）及び死細胞（赤色蛍光）の数をカウントして、細胞生存率を計算した。
インビボバイオ適合性及びバイオ分解性の評価。動物手術は、すべてマサチューセッツ工科大学（Massachusetts Institute of Technology）の動物管理委員会（Committee on Animal Care）により精査され承認された。雌スプラーグドーリーラット（２２５～２５０ｇ、Charles River Laboratories）をすべてのインビボ試験に使用した。
植込み前、無菌技術を用いて組織グルーを調製し、さらにＵＶ光下で３時間滅菌した。背側皮下腔への植込みのために、麻酔チャンバー内でイソフルラン（酸素中１～２％イソフルラン）を用いてラットを麻酔した。ノーズコーンを用いて麻酔を維持した。背部毛を除去し、手術時間にわたり動物を加熱パッド上に配置した。動物背部の中心の１～２ｃｍ皮膚切開／インプラントにより、皮下腔にアクセスした。インプラント留置用の腔を設けるために、動物肩甲骨に向かって切開し、鈍的郭清を実施した。切開の上に形成された皮下ポケットに、０．５ｍｌの組織グルー（各エンドポイントに対してｎ＝４）又は同程度の体積の市販の組織接着剤（Coseal、各エンドポイントに対してｎ＝４）のどちらかを配置した。断続縫合（4-0 Vicryl, Ethicon）を用いて切開を閉じ、３～６ｍｌの生理食塩水を皮下注射した。形成された各皮下ポケット間でオーバーラップしないように、各動物当たり４つまでのインプラントを留置した。植込み１日後、３日後、１週間後又は２週間後、ＣＯ２吸入により動物を安楽死させた。皮下対象領域を切除し、組織学的分析及び免疫蛍光分析のために１０％ホルマリン中で２４時間固定した。
瞬間止血組織シーリング。
血液で覆われた組織上で瞬間ロバスト接着を形成する本発明の組織接着剤のユニークな能力は、臨床用途及びバイオメディカル用途での各種組織の迅速及び凝固非依存止血シーリングに有利であり得る。インビボで組織グルーの止血シーリング能力を定量的に評価するために、ラット肝及び心止血モデルに基づいて、止血時間及び止血までの血液損失を測定した（図２１及び２２）。組織接着剤は、出血する肝臓（直径５ｍｍ及び深さ２ｍｍ傷害）及び心臓（直径２ｍｍ心室壁傷害）の止血シーリングを５秒以内に達成し（図２１Ａ及び２２Ａ）、傷害群（止血を行わない）並びに市販の止血剤Surgicel及びCoseal（図２３及び２４）と比較して、有意に少ない止血時間（図２１Ｃ及び２２Ｃ）及び止血までの血液損失（図２１Ｄ及び２２Ｄ）を与えることが示された。とりわけ、心室傷害による高圧及び大量出血が理由でSurgicel及びCosealの群では心臓の止血シーリングを形成できない傷害があるが（図２２Ｃ～Ｄ及び２４）、一方、本発明の組織接着剤は、心室傷害の瞬間止血シーリングを５秒以内に形成し、止血直後に正常心室内血圧を回復する（図２２Ｅ）。
血液で覆われた組織上で瞬間ロバスト接着を形成する本発明の組織接着剤のユニークな能力は、臨床用途及びバイオメディカル用途での各種組織の迅速及び凝固非依存止血シーリングに有利であり得る。インビボで組織グルーの止血シーリング能力を定量的に評価するために、ラット肝及び心止血モデルに基づいて、止血時間及び止血までの血液損失を測定した（図２１及び２２）。組織接着剤は、出血する肝臓（直径５ｍｍ及び深さ２ｍｍ傷害）及び心臓（直径２ｍｍ心室壁傷害）の止血シーリングを５秒以内に達成し（図２１Ａ及び２２Ａ）、傷害群（止血を行わない）並びに市販の止血剤Surgicel及びCoseal（図２３及び２４）と比較して、有意に少ない止血時間（図２１Ｃ及び２２Ｃ）及び止血までの血液損失（図２１Ｄ及び２２Ｄ）を与えることが示された。とりわけ、心室傷害による高圧及び大量出血が理由でSurgicel及びCosealの群では心臓の止血シーリングを形成できない傷害があるが（図２２Ｃ～Ｄ及び２４）、一方、本発明の組織接着剤は、心室傷害の瞬間止血シーリングを５秒以内に形成し、止血直後に正常心室内血圧を回復する（図２２Ｅ）。
本発明の組織接着剤は、初期止血適用２週間後、傷害肝臓及び傷害心臓上のシールを維持することが実証された（図２１Ｂ及び２２Ｂ）。さらに、シールされた肝組織及び心臓組織の組織学的分析では、組織接着剤は、架橋されたバイオ接着剤マイクロ粒子中への細胞浸透と、下側の傷害の治癒とを可能にすることが示唆された（図２１Ｅ及び２２Ｆ～Ｇ）。炎症性反応マーカー及び異物反応マーカー（Ｔ細胞に対してＣＤ３、マクロファージに対してＣＤ６８）の免疫蛍光分析では、本発明の組織接着剤は、Cosealに匹敵するＣＤ３及びＣＤ６８の発現を誘発し、Surgicelよりも有意に低いことが示される（図２２Ｆ～Ｉ）。さらに、止血シーリング２週間後の動物の全血球数（ＣＢＣ）及び血液化学分析では、組織接着剤は、健常動物と比較して炎症関連血液細胞及び器官特異的疾患に対するマーカーで有意差を示さないことが実証された（図２５及び２６）。
肝臓のインビボ止血シーリング。肝傷害の止血シーリングのために、麻酔チャンバー内でイソフルラン（酸素中１～３％イソフルラン）を用いて動物を麻酔した。腹部毛を除去し、手術時間にわたり動物を加熱パッド上に配置した。開腹手術により肝臓を露出させた。生検パンチ（Dynarex）を用いることにより、直径５ｍｍ及び深さ２ｍｍの傷害を心臓に作製した。止血シーリングを形成するために、０．５ｍｌの組織グルーを出血部位上に注射し、次いで、外科用スパチュラを用いて穿刺穴の上を穏やかに５秒押圧した（ｎ＝４）。市販品では、長さ２０ｍｍ及び幅２０ｍｍのサイズを有するSurgicel（Ethicon）（ｎ＝４）又は２ｍｌのCoseal（Baxter）（ｎ＝４）を使用した。傷害群では、止血を実施しなかった（ｎ＝４）。各群に対して、止血までの血液損失量及び止血時間を記録した。止血シーリングを確認した後、断続縫合（4-0 Vicryl, Ethicon）を用いて切開を閉じ、３～６ｍｌの生理食塩水を皮下注射した。植込み２週間後、血液分析のために血液を採取し、ＣＯ２吸入により動物を安楽死させた。インプラントを有する肝臓を切除し、組織学的分析及び免疫蛍光分析のために１０％ホルマリン中で２４時間固定した。
心臓のインビボ止血シーリング。十分な厚さの心室傷害の止血シーリングのために、麻酔チャンバー内でイソフルラン（酸素中１～３％イソフルラン）を用いて動物を麻酔した。胸毛を除去した。気管内挿管を実施し、動物を人工呼吸器（Model 683, Harvard Apparatus）に接続し、手術時間にわたり加熱パッド上に配置した。開胸により心臓を露出させ、精密フォーセプスを用いて心膜を除去した。心室内血圧測定のために、尖端スティックを介して圧力－容積（ＰＶ）カテーテル（SPR-838, Millar）を左心室（ＬＶ）内に挿入し、試験時にＬＶ血圧をモニターした。生検パンチ（Dynarex）を用いることにより、直径２ｍｍの傷害を心臓の左心室壁又は右心室壁に作製した。止血シーリングを形成するために、０．２５ｍｌの本発明の組織接着剤を出血部位上に注射し、次いで、外科用スパチュラを用いて穿刺穴の上を穏やかに５秒押圧した（ｎ＝５）。市販品では、長さ２０ｍｍ及び幅２０ｍｍのサイズを有するSurgicel 25（Ethicon）（ｎ＝４）又は２ｍｌのCoseal（Baxter）（ｎ＝４）を使用した。傷害群では、止血を実施しなかった（ｎ＝４）。各群に対して、止血までの血液損失量及び止血時間を３００秒まで記録した。止血シーリングを確認した後、断続縫合（4-0 Vicryl, Ethicon）を用いて切開を閉じ、３～６ｍｌの生理食塩水を皮下注射した。３００秒までに止血を形成できなかった群では、動物を瀉血により安楽死させた。植込み２週間後、血液分析のために血液を採取し、ＣＯ２吸入により動物を安楽死させた。インプラントを有する心臓を切除し、組織学的分析及び免疫蛍光分析のために１０％ホルマリン中で２４時間固定した。
免疫蛍光分析。採取組織の免疫蛍光染色後、標的タンパク質（αＳＭＡ、コラーゲンＩ、ＣＤ６８、ＣＤ３）の発現を分析した。免疫蛍光分析前、パラフィン包埋固定組織をスライスしてスライドとして作製した。スライドを脱パラフィンし、脱イオン水で再水和した。スチーム法を用いて抗原回復を実施した。その際、IHC-Tek Epitope Retrieval Solution（IW-1100）中でスライドを３５分スチームし、次いで、２０分冷却した。次いで、各サイクルについて５分でＰＢＳを３回交換してスライドを洗浄した。洗浄後、IHC-Tek Antibody Diluentで希釈された一次抗体（線維芽細胞に対して１：２００マウス抗αＳＭＡ（ab7817, Abcam）、マクロファージに対して１：２００マウス抗ＣＤ６８（ab201340, Abcam）、Ｔ細胞に対して１：１００ウサギ抗ＣＤ３（ab5690, Abcam）、コラーゲンに対して１：２００ウサギ抗コラーゲン－Ｉ（ab21286, Abcam））中でスライドを室温で１時間インキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳ中で３回洗浄し、Alexa Fluor 488標識抗ウサギ又は抗マウス二次抗体（１：２００、Jackson Immunoresearch）とともに３０分インキュベートした。スライドをＰＢＳ中で洗浄し、次いで、ヨウ化プロピジウム溶液を用いて２０分対比染色した。画像取得のためにレーザー共焦点顕微鏡（SP 8, Leica）を使用した。ImageJ（version 2.1.0）を用いて発現抗体の蛍光強度を定量した。すべての画像を８ビット２値画像に変換し、規格化分析で蛍光強度を計算した。分析は、すべて実験条件に関して盲検であった。
Claims (36)
- 流体で覆われた１つ以上の表面を接着するための接着剤材料であって、
疎水性マトリックスと、
前記疎水性マトリックス内に分散された複数のバイオ接着剤マイクロ粒子と
を含み、前記バイオ接着剤マイクロ粒子は、
（ｉ）１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーと、
（ｉｉ）１つ以上のアミンカップリング基と、
（ｉｉｉ）１つ以上の架橋剤と
を含み、
前記疎水性マトリックスは、前記分散されたバイオ接着剤マイクロ粒子の周りに、流体から前記バイオ接着剤マイクロ粒子を保護する保護マトリックスを形成し、前記流体で覆われた表面上に前記接着剤材料を直接配設し、及び前記接着剤材料に圧力を加えることは、（ａ）前記疎水性マトリックスが前記流体を撥くこと、（ｂ）前記バイオ接着剤マイクロ粒子が圧縮して接着剤層を形成すること、及び（ｃ）前記バイオ接着剤マイクロ粒子が一時的架橋を形成し、その後、前記表面との共有結合架橋を形成することを引き起こす、接着剤材料。 - 注射用接着剤材料の形態である、請求項１に記載の接着剤材料。
- 前記（ｉ）１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーは、乾燥状態で水を吸収する親水性ポリマー又はコポリマーから選択される、請求項１に記載の接着剤材料。
- 前記（ｉ）１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーは、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギネート、酸化アルギネート、セルロース、酸化セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリスチレンスルホネート、コラーゲン、アルギン酸、ペクチン及びそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の接着剤材料。
- 前記（ｉｉ）１つ以上のアミンカップリング基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、アルデヒド、イミドエステル、エポキシド、イソシアネート、カテコール及びそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の接着剤材料。
- 前記（ｉｉｉ）１つ以上の架橋剤は、ゼラチンメタクリレート、ヒアルロン酸メタクリレート、酸化メタクリル系アルギネート、ポリカプロラクトンジアクリレート、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート及びそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の接着剤材料。
- 前記疎水性マトリックスは、シリコーン油、鉱油、精油、パーフルオロポリエーテル油、ラノリン油及びそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の接着剤材料。
- （ｉ）ポリ（アクリル酸）に、（ｉｉ）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルをグラフトして（ＰＡＡｃ－ｃｏ－ＮＨＳエステル）、（ｉｉｉ）バイオ分解性ゼラチンメタクリレートで架橋したものと、（ｉｖ）バイオ分解性キトサンとから作製された複数のバイオ接着剤マイクロ粒子をシリコーン油疎水性マトリックス中に分散して含む、請求項１に記載の接着剤材料。
- バイオ適合性である、請求項１に記載の接着剤材料。
- 少なくとも約１００Ｊｍ－２の界面靭性、少なくとも約３０ｋＰａの剪断強度及び少なくとも約１０ｋＰａの引張り強度で接着する、請求項１に記載の接着剤材料。
- 前記バイオ接着剤マイクロ粒子は、分子間結合によって前記一時的架橋を形成するカルボン酸基を含有し、及び前記アミンカップリング基は、前記表面との共有結合架橋を形成する、請求項１に記載の接着剤材料。
- 前記バイオ接着剤マイクロ粒子は、約１０μｍ～約２００μｍの範囲の粒子サイズを有する、請求項１に記載の接着剤材料。
- 約１：３～約１：０．５の範囲の、前記バイオ接着剤マイクロ粒子と前記疎水性マトリックスとの比を含む、請求項１に記載の接着剤材料。
- 前記１つ以上の流体は、血漿、間質液、リンパ液、脳脊髄液、胃腸液及びそれらの組合せから選択される生理学的体液である、請求項１に記載の接着剤材料。
- バイオ分解性であり、及び架橋された前記バイオ接着剤マイクロ粒子中への細胞浸透と、下側の組織傷害の治癒とを可能にするように構成される、請求項１に記載の接着剤材料。
- 前記接着剤材料は、組織細胞が前記バイオ分解性の前記バイオ接着剤マイクロ粒子と置き換わって下側の組織傷害を治癒するように構成される、請求項１５に記載の接着剤材料。
- １つ以上の流体で覆われた１つ以上の組織表面を接着する方法であって、
（ａ）前記流体で覆われた組織表面の１つ以上に接着剤材料を直接適用することであって、前記接着剤材料は、疎水性マトリックスと、前記疎水性マトリックス内に分散された複数のバイオ接着剤マイクロ粒子とを含み、前記バイオ接着剤マイクロ粒子は、（ｉ）１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーと、（ｉｉ）１つ以上のアミンカップリング基と、（ｉｉｉ）１つ以上の架橋剤とを含む、適用することと、
（ｂ）前記接着剤材料に約１ｋＰａ～５０ｋＰａの範囲の圧力を加えることと、
（ｃ）前記疎水性マトリックスが前記１つ以上の流体を撥き、及びそれを前記組織表面から除去することを可能にすることと、
（ｄ）前記バイオ接着剤マイクロ粒子中の物理的結合形成基が分子間結合によって一時的架橋を形成することを可能にすることと、
（ｅ）前記バイオ接着剤マイクロ粒子中のアミンカップリング基が前記組織表面との共有結合架橋を形成することを可能にすることと
を含む方法。 - 圧力は、約５秒間～約３０秒間にわたって加えられる、請求項１７に記載の方法。
- 前記接着剤材料は、注射用接着剤材料であり、及び前記接着剤材料は、シリンジを用いて適用される、請求項１７に記載の方法。
- 前記（ｉ）１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーは、乾燥状態で水を吸収する親水性ポリマー又はコポリマーから選択される、請求項１７に記載の方法。
- 前記（ｉ）１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーは、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギネート、酸化アルギネート、セルロース、酸化セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリスチレンスルホネート、コラーゲン、アルギン酸、ペクチン及びそれらの組合せから選択される、請求項１７に記載の方法。
- 前記（ｉｉ）１つ以上のアミンカップリング基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、アルデヒド、イミドエステル、エポキシド、イソシアネート、カテコール及びそれらの組合せから選択される、請求項１７に記載の方法。
- 前記（ｉｉｉ）１つ以上の架橋剤は、ゼラチンメタクリレート、ヒアルロン酸メタクリレート、酸化メタクリル系アルギネート、ポリカプロラクトンジアクリレート、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート及びそれらの組合せから選択される、請求項１７に記載の方法。
- 前記疎水性マトリックスは、シリコーン油、鉱油、精油、パーフルオロポリエーテル油、ラノリン油及びそれらの組合せから選択される、請求項１７に記載の方法。
- 前記接着剤材料は、（ｉ）ポリ（アクリル酸）に、（ｉｉ）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルをグラフトして（ＰＡＡｃ－ｃｏ－ＮＨＳエステル）、（ｉｉｉ）バイオ分解性ゼラチンメタクリレートで架橋したものと、（ｉｖ）バイオ分解性キトサンとから作製された複数のバイオ接着剤マイクロ粒子をシリコーン油疎水性マトリックス中に分散して含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記接着剤材料は、少なくとも約１００Ｊｍ－２の界面靭性、少なくとも約３０ｋＰａの剪断強度及び少なくとも約１０ｋＰａの引張り強度で接着する、請求項１７に記載の方法。
- 前記バイオ接着剤マイクロ粒子中の前記物理的結合形成基は、分子間結合によって一時的架橋を形成するカルボン酸基である、請求項１７に記載の方法。
- 前記バイオ接着剤マイクロ粒子は、約１０μｍ～約２００μｍの範囲の粒子サイズを有する、請求項１７に記載の方法。
- 前記接着剤材料は、約１：３～約１：０．５の範囲の、前記バイオ接着剤マイクロ粒子と前記疎水性マトリックスとの比を含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記１つ以上の流体は、血漿、間質液、リンパ液、脳脊髄液、胃腸液及びそれらの組合せから選択される生理学的体液である、請求項１７に記載の方法。
- （ａ）前記流体で覆われた組織表面の１つ以上に接着剤材料を直接適用した後、及び（ｂ）圧力を加える前に、前記接着剤材料にバッキング材料を適用することをさらに含み、（ｂ）圧力を加えることは、前記バッキング材料を介して前記接着剤材料に圧力を加えることを含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記バッキング材料は、湿潤表面に接着しないバイオ適合性材料から作製される、請求項３１に記載の方法。
- 前記バッキング材料は、酸化セルロース、シリコーンエラストマー、ポリウレタン、ハイドロゲル、湿潤組織に接着しないいずれかの他のバイオ適合性材料及びそれらの組合せから作製される、請求項３２に記載の方法。
- 前記１つ以上の組織表面は、組織傷害を含み、前記方法は、（ｆ）架橋された前記バイオ接着剤マイクロ粒子中への細胞浸透と、下側の前記組織傷害の治癒とを可能にすることをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
- 組織傷害を治癒する方法であって、
（ａ）前記組織傷害に接着剤材料を直接適用することであって、前記組織傷害は、流体で覆われた１つ以上の組織表面を含み、前記接着剤材料は、疎水性マトリックスと、前記疎水性マトリックス内に分散された複数のバイオ接着剤マイクロ粒子とを含み、前記バイオ接着剤マイクロ粒子は、（ｉ）１つ以上の親水性ポリマー又はコポリマーと、（ｉｉ）１つ以上のアミンカップリング基と、（ｉｉｉ）１つ以上の架橋剤とを含む、適用することと、
（ｂ）前記接着剤材料に約１ｋＰａ～５０ｋＰａの範囲の圧力を加えることと、
（ｃ）前記疎水性マトリックスが前記１つ以上の流体を撥き、及びそれを前記組織表面から除去することを可能にすることと、
（ｄ）前記バイオ接着剤マイクロ粒子中の物理的結合形成基が分子間結合によって一時的架橋を形成することを可能にすることと、
（ｅ）前記バイオ接着剤マイクロ粒子中のアミンカップリング基が前記組織表面との共有結合架橋を形成することを可能にすることと、
（ｆ）架橋された前記バイオ接着剤マイクロ粒子中への細胞浸透と、下側の前記組織傷害の治癒とを可能にすることと
を含む方法。 - 前記接着剤材料は、バイオ分解性であり、細胞は、前記バイオ分解性の前記バイオ接着剤マイクロ粒子と置き換わって前記下側の組織傷害を治癒する、請求項３５に記載の方法。
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