JP2023503256A - 播種されたグラフトを生成するシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

足場またはグラフトへの患者の細胞の均一な播種を可能にする、改善された播種チャンバーを有する閉鎖型使い捨て播種システムが提供される。チャンバーの長さに沿って可変幅を、または足場とチャンバー壁との間に最小限の隙間を有する播種チャンバーは、グラフトおよび足場へのより早くより効率的かつ均一な播種を提供することによって、閉鎖型使い捨て播種システムの先行技術の播種チャンバーの改善をもたらす。グラフトが分解するにつれて狭窄および新生組織形成の自発的な反転を可能にし、足場のない新生血管をもたらす、生体力学的および構造的性質を有する足場についても記載する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１９年１１月１５日に出願された米国仮出願第６２／９３６，２２５号の利益および優先権を主張するものである。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所からの認可番号ＨＬ０９８２２８、ＨＬ１２８６０２、ＨＬ１２８８４７、ＨＬ１３９７９６、ＧＭ０６８４１２、および国防総省からのＷ８１ＸＷＨ－１８－１－０５１８の下、政府の支援によりなされた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。

発明の分野
本発明は一般に、組織工学的グラフト、特に細胞が播種され、患者自身の組織により吸収され置き換えられるように設計されたもの、および作製方法の分野にある。

発明の背景
多くの複合型先天性心奇形の外科的処置は、ＧＯＲＥ－ＴＥＸ（登録商標）およびＤＡＣＲＯＮ（登録商標）などの材料の合成足場の埋め込みを伴う。そのような適用の一般的な例は、単心室奇形に関する両大静脈肺動脈吻合術（ＴＣＰＣ）である。ある場合には、足場としてのこれらの合成グラフトの使用は、進行性閉塞、感染への感受性、および血栓塞栓性合併症のリスクにより複雑化する。全ての場合において、心血管再構築に対する著しい制約は、合成インプラントの成長可能性の欠如である。ＴＣＰＣの場合、このことは、患者のサイズによるＦｏｎｔａｎ循環の完了の延期、または足場の過剰な大きさのいずれかを含む、最適ではない管理戦略に繋がる可能性があり、その結果、呼気相逆流および流れのよどみの領域などの最適ではない流動特性をもたらす。

組織工学的血管グラフト（ＴＥＶＧ）は、足場ポリマーが分解するにつれて自家細胞が増殖し、生理学的に機能的な血管に成熟する生分解性足場を提供することによって、これらの問題を克服する可能性を提供する（Shin'oka, et al. N. Engl. J. Med. 344(7), 532-533 (2001); Hibino, et al. J Thorac Cardiovasc Surg. 139(2), 431-436.e432 (2010 Roh JD, et al. Biomaterials. 29(10), 1454-1463 (2008); Hibino, et al. FASEB J. 25(8), 2731-2739 (2011); Hibino, et al. FASEB J. 25(12), 4253-4263 (2011); Kurobe, et al. Tissue Eng Part C Methods 21(1), 88-93 (2015))。

ヒトの臨床試験は、ＴＥＶＧの成長能力を確認し、死亡またはグラフト不全に関わるグラフトがないことを実証した（Shin'oka, et al. J Thorac Cardiovasc Surg. 129(6), 1330-1338 (2005)）。しかしながらこの研究の結果は、狭窄が主なグラフト関連の合併症であり、グラフトレシピエントの２５％近くに影響を及ぼし、レシピエントの１６％が致命的な狭窄（内腔径の＞７５％の減少）を発症することも実証した（Hibino, et al. J Thorac Cardiovasc Surg. 139(2), 431-436.e432 (2010)）。先天性心疾患を有する患者の処置のためにＴＥＶＧを使用する将来性ある結果にも関わらず、臨床適用におけるグラフト狭窄の高い発生率は、この技術の広範な使用を妨げる（Fernandez, et al. Current opinion in chemical engineering 3, 83-90 (2014); Mcallister, et al. Lancet 373(9673), 1440-1446 (2009); Wystrychowski, et al. J Vasc Surg 60(5), 1353-1357 (2014)）。

さらに、ＴＥＶＧの日常的な臨床使用を推奨することができる前に、ＴＥＶＧのアセンブリを最適化して、グラフトを個人に合わせ、グラフトを作製するのに必要とされる時間を最小限に抑え、その全体的な有用性を改善しなければならない（Patterson, et al. Regenerative Medicine 7(3), 409-419 (2012)）。

米国特許第９，０９０，８６３号および米国特許出願公開第２０１８／０３５３６４９号は、足場およびグラフトに細胞を播種するための閉鎖型使い捨て播種システム（ＣＤＳＳ）について記載する。ＣＤＳＳは、足場およびグラフトに細胞を収容および播種するための播種チャンバーを含む。米国特許第９，０９０，８６３号および米国特許出願公開第２０１８／０３５３６４９号のＣＤＳＳを使用して足場およびグラフトに播種することは、足場およびグラフトの長さに沿って不均一な細胞播種密度をもたらす。

米国特許第９，０９０，８６３号明細書 米国特許出願公開第２０１８／０３５３６４９号明細書 米国特許第９，０９０，８６３号明細書 米国特許出願公開第２０１８／０３５３６４９号明細書

Shin'oka, et al. N. Engl. J. Med. 344(7), 532-533 (2001) Hibino, et al. J Thorac Cardiovasc Surg. 139(2), 431-436.e432 (2010 Roh JD, et al. Biomaterials. 29(10), 1454-1463 (2008) Hibino, et al. FASEB J. 25(8), 2731-2739 (2011) Hibino, et al. FASEB J. 25(12), 4253-4263 (2011) Kurobe, et al. Tissue Eng Part C Methods 21(1), 88-93 (2015) Shin'oka, et al. J Thorac Cardiovasc Surg. 129(6), 1330-1338 (2005) Hibino, et al. J Thorac Cardiovasc Surg. 139(2), 431-436.e432 (2010) Fernandez, et al. Current opinion in chemical engineering 3, 83-90 (2014) Mcallister, et al. Lancet 373(9673), 1440-1446 (2009) Wystrychowski, et al. J Vasc Surg 60(5), 1353-1357 (2014) Patterson, et al. Regenerative Medicine 7(3), 409-419 (2012)

足場およびグラフトの長さに沿って均一な細胞密度を有する、播種された足場およびグラフトの改善の必要性が依然としてある。埋め込み後に可逆的狭窄を誘発させる足場およびグラフトの必要性が依然としてある。

したがって本発明の目的は、埋め込み後の狭窄の率を低減させるまたは予防するように、足場およびグラフトの長さに沿った均一な細胞播種のためにＣＤＳＳと共に使用するための改善された播種チャンバーを提供することである。

本発明の別の目的は、埋め込み後に狭窄の率を低減させる、予防する、または反転させるよう、足場およびグラフト上に細胞を播種するための改善された播種チャンバーを備えたシステムを提供することである。

本発明のさらに別の目的は、埋め込み後に可逆的狭窄を誘発させる構造パラメーターを有する足場およびグラフトを提供することである。

本発明のさらに別の目的は、埋め込み後の狭窄の率を低減させる、予防する、または反転させるよう、足場およびグラフト上に細胞を播種するための方法を提供することである。

発明の要旨
足場またはグラフトの長さに沿って不均一な細胞播種密度を有する足場およびグラフトは、埋め込み後にグラフト狭窄の発生率の増加をもたらすことが、臨床試験中に発見された。閉鎖型使い捨て播種システムにおける使用のための、改善された播種チャンバーは、足場およびグラフトの長さに沿って播種された細胞の均一な密度をもたらすものが開発された。「フリップ」チャンバーおよび「キャパシタ」チャンバーと呼ばれる細胞播種チャンバーは、側方ポートを有するキャップを有する。フリップチャンバーは、典型的にはその長さに沿って可変の幅を有する。フリップチャンバーは、播種中に約半分（１８０°）播種チャンバーを反転させることにより操作されてもよい。キャパシタチャンバーは、典型的にはその長さに沿って均一な幅、ならびに足場およびチャンバー壁の間の狭い隙間を有する。

細胞播種チャンバーは一般に、ハウジング、１つまたは複数の側方ポートを有するキャップ、およびベース部を含む。キャップは典型的には、ハウジング内に挿入可能な吸引棒のための開口、および吸引棒上に位置決めされるマンドレルを有する。

キャップは、それぞれが側方ポートに接続している１つまたは複数の側方チューブを含んでいてもよい。側方チューブは、典型的には、側方入口ポートに接続している側方入口チューブ、側方出口ポートに接続している側方出口チューブ、および側方ベントポートに接続された側方ベントチューブを含む。キャップは典型的には、上方滑面および下方ねじ付き面を有する。ねじ付き面は、キャップをハウジングに固定する。キャップの上部分は一般に平らであり、キャップは、チャンバーを逆にした場合にベース部として働き得る。

マンドレルは、典型的には穿孔された多孔質マンドレルである。あるいは、または追加として、マンドレルは、互いに平行に走る、螺旋状に降下する、ダイヤモンドパターンに、円形に、ジグザグに、および／または波形に配置構成された、軸方向に配置構成された突起など、任意の適切な配置構成の突起を有していてもよい。

細胞播種チャンバーのハウジングは、その長さに沿って均一なまたは可変の幅を有していてもよい。細胞播種チャンバーは、約１ｍｍ～約３０ｍｍの間、より好ましくは約３ｍｍ～２０ｍｍの間の隙間を、吸引棒またはマンドレルとフリップチャンバーのハウジングとの間に有していてもよい。細胞播種チャンバーは、約１ｍｍ～約１０ｍｍの間、より好ましくは約１ｍｍ～５ｍｍの間の隙間を、吸引棒またはマンドレルとキャパシタのハウジングとの間に有していてもよい。ハウジングは、ハウジングの長さの約３０％～６０％の間に位置決めされた最大幅を有する領域を有していてもよい。例えば、最大幅を有する領域は、ハウジングの長さに沿って約５０％（中間）に位置決めされてもよい。ハウジングは典型的には、キャップのねじ付き面を受けるためのねじ付き部分を有する。「フリップ」播種チャンバーは、足場上のＭＮＣの分布のばらつきを排除する。デバイスの背後にある中心的前提は、その長さに沿って播種チャンバーの断面を変化させることである。チャンバーの形状は、砂時計を逆にしたものに似ており、膨らみ（最大断面）は、デバイスの高さの上からほぼ４０％下がったところにある。デバイスの上部および底部の両方は狭くなって、部分クリアランスおよび過剰な液体に関する非常に最小限に抑えられた体積と共に、足場が取り付けられたマンドレルを収容する。断面の変化の効果は、足場の最も少なく播種された部分へＭＮＣが引き込まれる速度を効果的に遅くすることである。

グラフトまたは足場に細胞を均一に播種する方法も、提供される。一部の態様では、方法は、ａ）播種チャンバーを、血液または富化細胞を有する流体が入っている槽を含有する閉鎖型使い捨て播種システムに接続するステップ、ｂ）グラフトまたは足場を播種チャンバーのマンドレル上に挿入するステップ、ｃ）播種チャンバーに、流体を、グラフトまたは足場の約半分まで、重力流および抽気により満たすステップ、ｄ）播種チャンバーに流体を満たして、グラフトまたは足場を覆うステップ、およびｅ）陰圧を導入して、全ての流体をグラフトまたは足場へ引き込むステップを含む。

他の態様では、方法は：ａ）播種チャンバーを、血液または富化細胞を有する流体が入っている槽を含有する閉鎖型使い捨て播種システムに接続するステップ、ｂ）グラフトまたは足場を播種チャンバーのマンドレル上に挿入するステップ、ｃ）播種チャンバーに流体を満たすステップ、ｄ）陰圧を下方マンドレル出口に印加し、チャンバーの約半分まで空にするステップ、ｅ）チャンバーを逆にするステップ、およびｆ）陰圧を印加し、上方出口ポートを通してチャンバーを空にするステップを含む。

典型的には、播種チャンバーを、側方入口ポートおよび側方出口ポートを介して閉鎖型使い捨て播種システムに接続する。陰圧は、シリンジ、ポンプ、または真空源を介して提供されてもよい。典型的には、グラフトまたは足場は、血液、骨髄吸引液、または単核細胞（ＭＮＣ）に富む流体の、約１０ｍｌ～２００ｍｌの間、好ましくは１０ｍｌ～１５０ｍｌの間の体積など、最小限の体積の細胞含有流体を使用して、均一に播種される。

図１Ａは、細胞および／またはグラフト、例えば米国特許第９，０９０，８６３号および米国出願公開第２０１８／０３５３６４９号に記載される組織グラフトを、播種および／または試験するための例示的な閉鎖型システム（１０００）を示す図である。図１Ｂは、図１Ａに示される播種チャンバー（１８）の代わりに使用することができる、先進播種チャンバー（１８０）の斜視図を示す図面である。図１Ｃは、図１Ａに示される播種チャンバー（１８）の代わりに使用することができる播種チャンバー（１８０）の断面斜視図を示す図面である。図１Ｄは、図１Ａに示される播種チャンバー（１８）の代わりに使用することができる一体型ねじ付きトップ（１７０）を含有する吸引棒（２３０）の斜視図を示す図面である。図１Ｅは、一体型ねじ付きトップ（１７０）を含有し、相応して成型されたクリップ（６００）を受けるように構成されたベース部（２３２）に窪みも含有する、吸引棒（２３０）の断面斜視図を示す図面である。同様の窪みが吸引棒の上部に設けられる。図１Ｆは、図１Ａに示される播種チャンバー（１００）内でＯ－リング（２２）の代わりに使用することができる、クリップ（６００）の斜視図を示す図面である。クリップ（６００）は、典型的には中空であり、中実壁（６２０）を有し、中空中心（６１０）を取り囲んでいる。必要に応じて、壁（６２０）は、クリップ（６００）の開閉を容易にするヒンジを含有する。図１Ｇは、図１Ａに示される播種チャンバー（１００）内のクリップ（６００）の断面斜視図を示す図面である。図１Ｈは、播種チャンバーアセンブリ（２００）の種々の構成要素のアセンブリを示す分解図であり、これは図１Ａに示される播種チャンバーアセンブリ（１００）の代わりに使用することができ、吸引棒（２３０）、足場（２０）、足場クリップ（６００）、および播種チャンバー（１８０）を含む。 同上。 同上。

図２Ａおよび２Ｂは、先行技術（米国特許第９，０９０，８６３Ｂ２号および米国出願公開第２０１８／０３５３６４９号）の標準的な閉鎖型使い捨て播種システムによる、５０ｍＬまたは１００ｍＬの骨髄を使用する足場の長さ（ｃｍ）に沿った細胞の播種勾配（細胞／ｍｍ^３、足場は１ｍｍの厚さであるので、値は細胞／ｍｍ^３として提示される）を示す棒グラフである。

図３Ａ～３Ｅは、フリップ設計の播種チャンバー－「フリップ」播種チャンバーのアセンブリおよび使用を示す図である。 同上。

図４Ａおよび４Ｂは、キャパシタ設計の播種チャンバー－「キャパシタ」播種チャンバーのアセンブリを示す図である。図４Ｃは、ＩＶバッグ、真空源、ドレイン、および抽気ラインを含む播種システムに接続された、組み立てられた播種チャンバーの図である。 同上。 同上。

図５は、フリップ播種チャンバー（「フリップ」、１）またはキャパシタ播種チャンバー（「キャパシタ」、２）内に播種された足場の長さ（ｃｍ）に沿った均一な播種密度（細胞／ｍｍ^３）を示す棒グラフである。

図６は、閉鎖型使い捨て播種システムと共に使用するためのマンドレルの種々の構造を示す図である。示される寸法は：全長１３０ｍｍ、播種領域の長さ１２０ｍｍ、幅１５ｍｍである。

図７Ａ～７Ｈは、４つの主要なパラメーター：δ、β、Κ^ｉ _ｈ、およびΚ^ｉ _{ｍａ ｘ}が変化する、経時的（週）な直径（図７Ａ～７Ｄ）または厚さ（図７Ｅ～７Ｈ）の変化を示す線グラフである。これらの４つの主要なパラメーターに関するパラメトリックスタディが示されており：δは、炎症応答の発生および持続時間をモジュレートし、βは、炎症時系変化の形状および歪みを決定づけ、Κ^ｉ _ｈは、炎症性新生組織の生成および分解のピーク速度を制御し、Κ^ｉ _ｍａｘは、新生組織の分解に対する炎症効果の規模を拡大縮小する。

図８Ａおよび８Ｂは、１年にわたる研究期間で獲得される水力直径の実際の血管内超音波実験測定にうまく適合するＴＥＶＧの、経時的（週）な内腔径（図８Ａ）または壁厚（図８Ｂ）に関するプロットされたモデルシミュレーション（実線）を示す、線グラフである（記号±ＳＤ）。

図９Ａ～９Ｆは、過剰な炎症推進型新生組織形成から生じる狭窄を示す、棒グラフである。定量的組織学的分析は、壁厚（図９Ａ）が埋め込み後６週間で最大であり、これは経時的なＴＥＶＧ壁厚のモデルシミュレーション（図９Ｂ）に相当することを実証する（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ：ａ＝０．０５、^＊ｐ＜０．０５）。図９Ｃは、経時的な血管新生組織内のａＳＭＡ＋面積の定量が、６週間で増加した平滑筋細胞密度のモデル予測（図９Ｄ）に一致することを示す（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ：ａ＝０．０５、^＊ｐ＜０．０５）。同様に、ＣＤ６８＋マクロファージ染色および定量（図９Ｅ）は、著しい炎症が、ＴＥＶＧ狭窄の発症に対応することを確認する（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ：ａ＝０．０５、^＊ｐ＜０．０５）。この観察は、炎症細胞密度の計算モデル予測（図９Ｆ）にも密接に一致する。プロットされたデータは、平均±ＳＥＭを表す。 同上。 同上。

図１０Ａ～１０Ｄは、計算モデル予測に正確に従う、埋め込まれたグラフトの生体力学的性質の変化を示すグラフである。図１０Ａは、未処理のＩＶＣ（最後の棒）と比較した、経時的なＰｉｃｒｏ－Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色からの全コラーゲン面積分率（％）の定量を示す棒グラフである（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ：ａ＝０．０５、^＊＊ｐ＜０．００５、^＊＊＊ｐ＜０．０００５、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、プロットは、平均±ＳＥＭを表す）。図１０Ｂは、未処理のＩＶＣ（最後の棒）と比較した、経時的なＴＥＶＧにおける太いコラーゲン線維の細いコラーゲン線維に対する比（％）を示す、棒グラフである（平均±ＳＥＭ）。図１０Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏ発症の１．５年後のｉｎ ｖｉｔｒｏ加圧に応答する、ＴＥＶＧ（正規化直径）の力学的挙動の実験測定値が（記号±ＳＤ）、計算モデル（実線）から予測された値に一致したこと示すグラフである。図１０Ｄは、シミュレートされた新生血管発生から２年にわたる２～３ｍｍＨｇの予測されたグラフトコンプライアンスを示し（実線）、１８カ月で、実験的に測定されたコンプライアンスに対する合理的な合意がある（記号±ＳＤ）。 同上。

図１１Ａおよび１１Ｂは、足場の埋め込みが、異物反応および力学的媒介型新生組織リモデリングを誘発させることを示す図である。図１１Ｃは、炎症推進型および力学的媒介型新生組織形成での足場分解の相互作用を示す、計算モデルのグラフである。ＴＥＶＧ発生の計算モデルにおける構成成分の変化する質量を推進させる因子は、ポリマー足場の損失（・・・・・・）ならびに炎症推進型（－・－）および力学生物学的媒介型（- - -）新生組織の獲得を含む。これらの構成成分のそれぞれの合計（－）は、新生組織の質量密度を決定する。

図１２は、先天性心臓外科手術における組織工学的血管グラフトの臨床使用を調査するパイロット研究を示す、流れ図である。

図１３Ａは、研究設計、およびヒツジ研究での各時点で分析した動物の数を示す、流れ図を示す。図１３Ｂは、術後の日数にわたる生存（％）を示す、ヒツジ研究に関する生存曲線である。 同上。

図１４Ａ～１４Ｄは、ヒツジ研究で埋め込まれたＴＥＶＧの種々のパラメーターの変化を示す、グラフである。ヒツジモデルにおけるＴＥＶＧの血管造影および血管内超音波を使用した。データは、埋め込み後１週、６週、６カ月、および１年での１頭のヒツジのＴＥＶＧの、代表的な連続血管造影およびＩＶＵＳの画像から得、６週での致命的な狭窄の発症、その後６カ月での、特許の新生血管へのリモデリングを実証している。１年にわたる連続血管造影および血管内超音波研究からのＴＥＶＧの１週間に対する倍率変化としての、相対内腔径（倍率変化、直径、図１４Ａ）および面積変化（（倍率変化、面積、図１４Ｂ）のプロットが提示され、ＴＥＶＧの狭小化は、６カ月までに自発的に反転することを実証している（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ：ａ＝０．０５、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、平均±ＳＤ）。１週間の平均値は、水平破線によって特定される。図１４Ｃおよび１４Ｄは、研究コホートにおける各動物からの、６週間の直径（図１４Ｃ）および圧力（図１４Ｄ）勾配測定値を示すグラフである。２頭の動物が無症候性腹水を経験し、２頭の動物が、研究の終点前に安楽死を必要とする症候性腹水を経験した（四角形）。 同上。

詳細な説明
Ｉ． 定義
「組織工学的血管グラフト（ＴＥＶＧ）」という用語は、動脈および静脈などの１種または複数の血管の修復または増強における使用のための、体内への挿入用に設計される血管グラフトまたは足場を指す。

「生体適合性」という用語は、主な免疫応答なしに身体が一般に受け入れる材料であって、過剰な線維症または拒絶反応を引き起こすことなしに生物システムでの埋め込み、例えば組織埋め込みが可能な材料を指す。
「生分解性」という用語は、水、酵素、またはｉｎ ｖｉｖｏ環境に曝露したときに物質または材料が崩壊する能力を指す。

本明細書で使用される「狭窄」は、埋め込みでの足場の内腔径に対して２５％またはそれよりも大きい、内腔径の低減を指す。

「マンドレル」という用語は、コアとして働く円筒形デバイスまたはチューブ、例えば金属棒を指し、その周りに、材料、例えば細胞を播種および成長させるための母材足場が流延され、成型され、鍛造され、曲げられ、またはその他の手法で成形され得る。マンドレルは、典型的には少なくとも一端が開放している。マンドレルは、その長軸に沿って（即ち、その長さに沿って）、穴または穿孔も含有し得る。

本明細書で使用される「多孔質」という用語は、液体および／もしくは気体によって満たされるかもしくは潅流され得る、またはその内部を通る液体および／もしくは気体の流れを可能にする、１つまたは複数の開口、細孔、穿孔、または穴を有することを指す。

本明細書で使用される、狭窄の反転という文脈における「自発的」という用語は、追加の侵襲的なまたは非侵襲的な手順なしに、例えば外科的介入または外科的補正なしに、生じる動作を指す。

本明細書で使用される、「狭窄の反転」という用語は、播種細胞のない、狭窄した埋め込まれたグラフトに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の狭窄の低減を指す。

本明細書で使用される「実質的に」という用語は、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の尺度を指す。

ＩＩ． ＴＥＶＧに播種するためのシステム
Ａ． 閉鎖型使い捨て播種システム
ＴＥＶＧに細胞を播種するためのシステムおよびその方法は、当技術分野で公知である。例示的なシステムは、米国特許第９，０９０，８６３号およびＵＳ２０１８／０３５３６４９（図１Ａ、先行技術）に記載されている。図１Ａに示されるデバイスは、細胞および／またはグラフト、例えば組織グラフトを播種、培養、貯蔵、輸送、および／または試験するための閉鎖型システム（１０００）である。以前の播種システムの操作、構造、および結果は、米国特許第９，０９０，８６３号およびTissue Engineering Part C: Methods. (1):88-93 (2014)でさらに論じられかつ示されている。

典型的には、細胞を組織工学的血管ブラフトに播種するためのシステムは、チャンバーまたは足場内に患者から生体材料を抽出するために患者に接続される、真空を創出するための手段を含む。足場はインキュベーターとして働き、生体材料の少なくとも一部分を足場に接触および相互作用させる。足場は、フィルター／スイッチの組合せに流体連絡し、選択可能な流体を生体材料から患者に戻し移送させる。患者に戻し移送される例示的な生体材料には、血清、赤血球、血小板、白血球、および組合せが含まれる。選択された生体材料を、足場に接触する流体から抽出することは、足場に所望の細胞型を播種するのに必要とされる時間を短縮させ、患者の治癒速度を増大させる。
ｃで記載される例示的なシステムの構成部品を、図１Ａ～１Ｈ（先行技術）に示す。一般に、構成要素には：
ポート（１）またはポート（２）
細胞単離流体容器（３）
弁（５）
流体ライン（５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８ａ～５８ｄ、および５９）
プレフィルター要素（４）
流動チャネル（７）
容器（１３）
入口ポート（１１）
出口ポート（１４）
弁（１０）
播種容器（１８）
容器（９）
弁（８）
ねじ付きキャップ（１７）
入口ポート（１６）
出口ポート（２４）
サンプリングポート（１９）
ベントポート（２６）
流体容器３５ａおよび３５ｂ
ポート（２５）
真空源、例えばポンプおよびレギュレーター（２８）
播種アセンブリ（１００）
多孔質チューブ（２０）
足場（２１）
クリップ（６０）が含まれる。

構成要素は、米国特許第９，０９０，８６３号およびＵＳ２０１８／０３５３６４９に記載されるように相互接続され使用される。

例えばシステムは、細胞単離物、例えば細胞単離流体を含有するための槽、例えば容器（３）を含む。例示的な容器は、滅菌することが可能なおよび／または気密封止される、媒体バッグまたは任意の軟質または硬質の容器を含む（例えば、Ｇｉｂｃｏ－ＢＦＬ １Ｌ媒体バッグ）。ある特定の実施形態では、細胞単離流体容器（３）は、滅菌することが可能な生体適合性の硬質材料、例えばＴＥＦＬＯＮ（登録商標）、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、またはステンレス鋼から形成される。容器（３）は、細胞単離流体を含有するための任意の適切な容積、典型的には２５０ｍｌ未満を有することができる。好ましい実施形態では、容器（３）は、流体、例えば骨髄吸引液の滅菌充填および／または分注に適した少なくとも１つのポートを有する。例えば、骨髄吸引液（例えば、５ｍｌ／ｋｇ体重）は、無菌で収集され、ポート（１）またはポート（２）を介して容器（３）内に通される、例えば注入される。

典型的には、容器（３）は、少なくとも１つの入口および１つの出口を有する。一部の実施形態では、容器（３）は、流体または気体の一方向流動を可能にする１つまたは複数の弁を有するポートを含む。例えば、参照のため図１Ａに示される実施形態を使用すると、ポート１は、無針アクセスポートなど、スワバブル弁を含む、および／またはその弁の形をとることができる。弁は、当業者に公知の任意の適切な連結または締結手段、例えばクランプ、ねじ、またはルアーコネクター、圧力嵌め、摩擦嵌め、または連結を使用して、容器（３）に接続することができる、および／または容器（３）に連絡する流体ラインに関連付けることができる。図１Ａに示されるシステム（１０００）の実施形態によれば、弁（５）は、足場、例えば容器（３）に連絡する流体ライン（５１）に関連付けられる。必要に応じて、例えば容器（３）は、例えば約４０～約１５０ミクロンの範囲の、例えば、開口または細孔構造を有するスクリーンまたは織布要素を含むプレフィルター要素（４）を含む。そのようなプレフィルター要素は、流体が容器から流れるにつれて、例えば骨砕片、凝血、および／または脂肪堆積物などの望ましくない材料を除去するのに使用することができる。

システムで使用され得る流体の例には、限定するものではないが、滅菌流体、造影剤流体、生体液、細胞を含有する流体、血液、血清、骨髄吸引液、または培養培地を含有する流体が含まれる。好ましい実施形態での試験、播種、および培養中、流体はヒトの体温で保持されてもよく、ヒト血液の粘度に近似する流体から構成されてもよいことを理解されたい。血液の粘度に近似する溶液の１つの例示的な例は、グリセロールを含む生理食塩液である。

容器（３）内の流体は、容器から、図１Ａの流体ライン（５１）を通過する。好ましい実施形態では、流体は、真空によって容器（３）から離れた方向に向かう。他の実施形態では、システムは、流体ポンプの使用を組み込む。流体ポンプは、多数の商業的供給元から入手可能である（例えば、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｄｒｉｖｅ蠕動ポンプ、Ｃｏｌｅ－Ｐａｌｍｅｒ製）。

流体ライン（５１）ならびにシステム内の他の全ての流体ライン（例えば、ライン５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８ａ～５８ｄ、および５９）は、使用中の流体または気体を輸送するのに適切な、任意のタイプの医療用の滅菌可能な耐久性管材で作製されてもよい。例えば流体ラインは、軟質または硬質のプラスチックとすることができる。

システムは、少なくとも１つの入口、少なくとも１つの出口、および間に少なくとも１つのフィルター媒体（例えば、フィルターハウジング内に配置される）を含む少なくとも１つのフィルターを含む流動チャネル（７）も含む。好ましい実施形態では、フィルターは、流動チャネル（７）を通る流動方向にほぼ垂直な角度で配置されるが、一部の実施形態では、フィルターは、流動方向にほぼ平行な角度で配置することができる、例えばタンジェンシャルフロー濾過。好ましい実施形態では、フィルターは、少なくとも２つの方向に流動することが可能なように適合され、例えば第１および第２の方向はほぼ反対であり、例えば流体は、フィルターの上流面から下流面を第１の方向に通過することができ、流体は、フィルターの下流面から上流面を第２の方向に通過することができる。この実施形態の例において、細胞単離流体は、適切な孔径（またはメッシュサイズ）を有するフィルターを第１の方向に通過し、フィルター媒体は、フィルターを通過するには大きすぎる細胞および／または生体材料をフィルターが保持するように、流動方向にほぼ垂直な角度である。第２の流体は、その後、フィルターを第２の方向に通過し、保持された細胞および／または生体材料をフィルター媒体から洗い落とすことができる。流動チャネルにおける使用に用いることができるフィルターは、当技術分野で周知であり、例えばＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを含む。他の実施形態では、フィルター（例えば、少なくとも１つのフィルター媒体）は、細胞、例えば骨髄由来単核細胞を保持するのに適した多孔度を有する。ある特定の実施形態では、フィルターは、例えば配位子－受容体相互作用に基づいて、目的の細胞を可逆的に結合および保持するよう設計された母材を含む。他の実施形態では、多数のフィルターを、本明細書に記載されるシステムにおける使用のため直列にまたは並列に組み立てることができる。システムおよび方法は、任意の数の所望の流路および遮断を有することができることが企図される。液体または気体は、シリンジ、ポンプ、または真空源を介してなど、陽圧または陰圧によってシステムを通じて供給することができる。

ある特定の実施形態では、システムは、収集流体を含有するための手段を含む。ある特定の実施形態では、手段は、容器（１３）、例えば、滅菌することが可能なおよび／または気密封止される、媒体バッグまたは任意の軟質もしくは硬質の容器（例えば、ＧＩＢＣＯ－ＢＦＬ １Ｌ媒体バッグ）である。ある特定の実施形態では、収集容器（１３）は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、ポリカーボネート、アクリル、ＰＶＣ、またはステンレス鋼など、滅菌することが可能な生体適合性の硬質材料から形成される。容器（１３）は、収集流体を含有するための任意の適切な容積を有することができる。

好ましい実施形態では、容器（１３）は、流体、例えば骨髄吸引濾液の滅菌充填および／または分注、あるいは流通に適した少なくとも１つのポートを有する。例えば、骨髄吸引液（例えば、５ｃｃ／ｋｇ体重）は、無菌で収集され、容器（３）内に通され、例えば注入され、その後通過する（例えば、必要に応じたプレフィルター（４）を通って、ならびにフィルターを含む流動チャネル（７）を通る流体流動ライン（５１）および（５２）を介して）。フィルターは、目的の細胞および／または生体材料を保持し、濾液が、流体ライン（５３）および（５４）ならびに入口ポート（１１）を通って容器（１３）に流れることを可能にする。別の好ましい実施形態では、容器（１３）は、少なくとも１つの流動ポート、例えば二方向流動ポートを有し；しかしながら典型的には、容器（１３）は、少なくとも２つのポートを有する。ある特定の実施形態では、容器（１３）は、入口ポートおよび／または出口ポートを含む。

図１Ａに示す実施形態では、容器（１３）は、入口ポート（１１）および出口ポート（１４）を含む。さらに別の実施形態では、容器（１３）は、流体または気体の一方向流動を可能にする１つまたは複数の弁を有するポートを含む。弁は、当業者に公知の任意の適切な連結または締結手段、例えばクランプ、ねじ、またはルアーコネクター、圧力嵌め、摩擦嵌めなどを使用して、容器（１３）に接続するおよび／または容器（１３）に連絡する流体ラインに関連付けることができる。図１Ａに示す実施形態によれば、システム（１０００）は、流体ライン（５４）に関連付けられた弁（１０）を含む。

ある特定の実施形態（例えば、以下にさらに詳細に述べるように、溶出後に流体が流動チャネル（７）を通過し、細胞が播種容器（１８）に入る）では、容器（１３）に含有される収集流体または濾液は、流体ライン（５９）および（５７）を通過して播種容器（１８）に入る（図１Ａ）。

好ましい実施形態では、流体は、真空によって容器（１３）から離れた方向に向かう。他の実施形態では、流体ポンプが使用される（例えば、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｄｒｉｖｅ蠕動ポンプ、Ｃｏｌｅ－Ｐａｌｍｅｒ製、しかし当業者なら、様々な市販のポンプから選択することができる）。

ある特定の実施形態では、システムは、溶出流体を含有するための手段を含む。ある特定の実施形態では、手段は、容器（９）、例えば、滅菌することが可能なおよび／または気密封止される、媒体バッグ、シリンジ、または任意の軟質もしくは硬質の容器（例えば、Ｇｉｂｃｏ－ＢＦＬ １Ｌ媒体バッグ）である。

図１Ａに示す実施形態によれば、システム（１０００）は、流体ライン（５５）に関連付けられた弁（８）を含む。弁は、当業者に公知の任意の適切な連結または締結手段、例えばクランプ、ねじ、またはルアーコネクター、圧力嵌め、摩擦嵌めなどを使用して、容器（９）に接続するおよび／または流体ラインに関連付けることができる。溶出または洗浄流体は、図１Ａにおいて弁（８）ならびに流体ライン（５３）、流動チャネル（７）、流体ライン（５２）、（５６）、および（５７）を通過し、播種容器（１８）に入る。

一実施形態では、容器（９）は、滅菌溶出または洗浄流体が満たされたシリンジである。溶出または洗浄流体は、図１Ａにおいて、流動チャネル７を通過し、弁（８）、流体ライン５３、５２、５６、および５７を通って播種容器（１８）に入る。この実施形態では、流体は、例えば手でまたは機械式および／もしくは電気式デバイスを介してシリンジプランジャーを押し下げることにより流体にかけられる圧力に起因して、容器９から離れた方向に向かう。あるいは、例えば容器（９）は、圧縮することができる軟質容器とすることができる。しかしながら、当業者なら容易に理解できるように、流体ポンプを使用することもできる（例えば、ＭＡＳＴＥＲＦＬＥＸ Ｌ／Ｓ ＤＩＧＩＴＡＬ ＤＲＩＶＥ蠕動ポンプ、ＣＯＬＥ－ＰＡＬＭＥＲ製であるが、当業者なら様々な市販のポンプから選択することができる）。

ある特定の実施形態では、システムは、細胞播種アセンブリを含有するための手段を含む。ある特定の実施形態では、手段は、播種容器（１８）、例えば、滅菌することが可能なおよび／または気密封止される、媒体バッグまたは任意の軟質もしくは硬質の容器である。例えば、ＧＩＢＣＯ－ＢＦＬ １Ｌ媒体バッグを使用することができる。ある特定の実施形態では、容器１８は、滅菌することが可能な任意の生体適合性の硬質材料、例えばＴｅｆｌｏｎ（登録商標）、ポリカーボネート、アクリル、ＰＶＣ、またはステンレス鋼から構成されてもよい。播種容器（１８）は、任意の適切な容積を有することができる。

図１Ａに示すように、播種容器（１８）は、ねじ山を含む本体セクションを含有する硬質材料、およびねじ付きキャップ（１７）を含む。容器（１８）は、少なくとも入口および出口ポート（図１Ａに示す実施形態では、播種容器（１８）は、入口ポート（１６）、出口ポート（２４）、サンプリングポート（１９）（例えば微生物汚染および／または幹細胞列挙を決定するための、例えば播種容器からの流体試料の無菌での獲得のため）、およびベントポート（２６）を含み、キャップ１７（図１Ａ）はポートを含む）。

播種容器１８は、入口ポート１６および出口ポート２４を含み、容器内へのおよび容器を通る流体の潅流および／または循環を可能にする。入口ポート１６および出口ポート２４は、容器１８を流体ライン５７および５８ａにそれぞれ付着するのにも使用される。流体ライン５８ａは、閉鎖型システムを維持しながら、播種容器１８を１つまたは複数の残留播種細胞流体容器３５ａおよび３５ｂに接続する。ただ１つの播種容器１８が図１Ａに示されるが、流体ライン、例えば流体ライン５７または５８ａは、１つよりも多い播種容器をシステムに平行に接続するように分岐してもよいことを理解されたい。

残留播種細胞流体を含有するための手段は、少なくとも１つの残留播種細胞流体容器３５ａ、３５ｂ、例えば、滅菌することが可能なおよび／または気密封止される、媒体バッグまたは任意の軟質もしくは硬質の容器である。例えば、Ｇｉｂｃｏ－ＢＦＬ １Ｌ媒体バッグを使用することができる。ある特定の実施形態では、容器３５ａ、３５ｂは、滅菌することが可能な任意の生体適合性の硬質材料、例えばＴＥＦＬＯＮ（登録商標）、ポリカーボネート、ＰＶＣ、またはステンレス鋼から構成されてもよい。

好ましい実施形態では、流体は、容器１８から引き出され、真空源を有する真空アセンブリ、例えばポンプ、およびレギュレーター２８の使用により、ポート２５および流体ライン５８ａを介して残留播種細胞流体容器３５ａ内に入り、ポンプからの陰圧は、残留播種細胞流体容器３５ａ、３５ｂ、および播種容器１８に接続された流体ラインを通って伝達される。

ある特定の実施形態では、播種容器（１８）は、多孔質チューブ（２０）および足場（２１）、例えば細胞または組織足場またはグラフト、例えば血管グラフト足場形成材を含有する、播種アセンブリ（１００）を収容する。多孔質チューブ（２０）は、流体透過性になり得る、任意の適切な硬質材料、例えばＴＥＦＬＯＮ（登録商標）、ＰＶＣ、ポリカーボネート、プラスチック、金属、例えばステンレス鋼を含んでいてもよい。またクリップ（６０）、Ｏ－リング、またはグロメットなどの１つまたは複数の保持要素が、チューブ上に、例えば足場形成材（２１）の両端に配置されて、播種、培養、貯蔵、輸送、または処置中にチューブ上の所定位置に足場形成材を保持してもよい。

ある特定の実施形態では、システムは使い捨てである。閉鎖型使い捨てシステムは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる前述の方法（Matsumura, et al., Biomaterials 2003; 24:2303-8;およびFDA IDE 14127）と比較して、同様の播種効率を実現しながら即座に行うことができる、組織工学的グラフト、例えば血管グラフトの構築のための手順を可能にする。さらに、システムの使用は、組織工学的グラフト、例えば血管グラフトを、診療現場（即ち、手術室で構築するのを可能にし、足場輸送の必要性を排除する。

播種システムは、播種容器１８の代わりに播種チャンバー７００（フリップ播種チャンバー）または播種チャンバー８００（キャパシタ播種チャンバー）を使用してもよい。
１．播種チャンバー

播種チャンバーは一般に、幅および長さを有するハウジング、１つまたは複数の側方ポートを有するキャップ、ならびにベース部を含む。キャップは、典型的には、ハウジング内に挿入可能な吸引棒、および吸引棒上に位置決めされるマンドレルを含む。典型的には、キャップは、その上面が平らである。キャップは一般に、弁、ポート、または付属品を上面に含まない。

例示的な実施形態では、播種チャンバーのベース部は、１０～１００ｍｍの間、例えば約３５ｍｍ～８０ｍｍの間の半径を有する。例示的な実施形態では、播種チャンバーの上部は、１０～１００ｍｍの間、約２５ｍｍ～６０ｍｍの間、例えば３８．１ｍｍの直径を有する。例示的な実施形態では、播種チャンバーのベース部は、２０～１０００ｍｍの間、約１２０ｍｍ～２００ｍｍの間、例えば１８０ｍｍの高さを有する。典型的には、播種チャンバーのアパーチャの内径は、５～９０ｍｍの間、例えば２５．８６ｍｍである。播種チャンバーの壁に関する典型的な厚さは、０．５～１０ｍｍの間、例えばほぼ２ｍｍである。播種チャンバーがねじ付きトップを有する場合、ねじ付きセクションの高さは典型的には、チャンバーの全長のほぼ１０％、例えば２０．５５ｍｍである。マンドレル、播種チャンバー、および１つまたは複数の足場クリップは、血管グラフト、播種チャンバーの所望のサイズに相応に、典型的にはサイズ決めされ、播種チャンバー内で一緒に適合するようにサイズ決めされる。
ａ．フリップ播種チャンバー

「フリップ」播種チャンバーは、その長さに沿って可変断面直径を有する。

チャンバーの形状は、砂時計を逆にしたものに似ており、最大断面は、デバイスの高さの上から下にほぼ３０％～６０％、好ましくは約４０％である。デバイスの上部および底部の両方は狭くなって、部分クリアランスおよび過剰な液体に関する非常に最小限に抑えられた体積と共に、足場が取り付けられたマンドレルを収容する。典型的には、その最も狭い部分でのフリップチャンバーの断面直径は、約２２～２５ｍｍの間であり、両端の値を含む。典型的には、その最も広い部分でのフリップチャンバーの断面直径は、約６０～８０ｍｍの間であり、両端の値を含む。

断面直径の変化の効果は、足場の最も少なく播種された部分へＭＮＣが引き込まれる速度を効果的に遅くすることである。

さらに、この設計のマンドレルは、２つの真空ナブを有し－１つは上向き方向に陰圧を引き出すため、および１つは逆方向に陰圧を引き出すためのものである。

例示的なフリップ播種チャンバーを、図３Ａ～３Ｅに提示する。フリップ播種チャンバー７００は、キャップ７１０、ハウジング７４０、およびベース部７３０を含む。キャップは、側方ポート、例えば入口チューブ７２２に接続された入口ポート７２２ａ、および出口チューブ７２４に接続された出口ポート７２４ａを含む。キャップ７１０は、平らな上面を有する。キャップ７１０は、任意の形状の上面を有していてもよい。典型的には、キャップの上面には、ポート、チューブ、またはベントがない。

ハウジング７４０は、その長さに沿って可変断面直径を有する。ハウジングの上方１０％は、キャップ７１０のねじ付き部分を受けるねじ山を含む。ハウジング７４０の底部セクションは、ベース部７３０に接続される。ハウジング７４０は、下方マンドレル出口７３２および７３４を含んでいてもよい。またＯ－リングの溝７６０が、マンドレルに足場を封止するようｏ－リングを位置決めするために存在していてもよい。

キャップ７１０は、吸引棒７２０に接続される。多孔質マンドレル７５０は、吸引棒７２０に付着される。付着は、クランプ、ねじ、またはルアーコネクター、圧力嵌め、摩擦嵌め、または連結を含む任意の手段によるものであってもよい。

典型的には、フリップ播種チャンバーは、そのベース部に位置決めされた場合またはそのキャップ上に位置決めされた場合、垂直位置に安定に保持するように構成される。これを図３Ｄおよび３Ｅに示す。
ｂ．キャパシタ播種チャンバー

キャパシタ播種チャンバーは、典型的には、チューブの長さに沿って一貫した断面直径を有する中空チューブである。典型的には、キャパシタチャンバーの断面直径は、約１０～２０ｍｍの間であり、両端の値を含む。キャパシタ播種チャンバーは、組み立てられたマンドレル／足場アセンブリと比較して、非常に狭い。最小限の体積の流体を保持するように設計される。足場とチャンバーの壁との間の最小および最大隙間は、約１ｍｍおよび約５ｍｍであってもよい。

例示的なキャパシタ播種チャンバーを、図４Ａ～４Ｃに提示する。キャパシタ播種チャンバー８００は、キャップ８１０、ハウジング８４０、およびベース部８３０を含む。キャップは、側方ポート、例えば入口チューブ８２２に接続された入口ポート８２２ａ、および出口チューブ８２４に接続された出口ポート８２４ａを含む。キャップ８１０は、平らな上面を有する。キャップ８１０は、任意の形状の上面を有していてもよい。典型的には、キャップの上面には、ポート、チューブ、またはベントがない。

ハウジング８４０は、その長さに沿って一定の断面直径を有する。ハウジングの上方１０％は、キャップ８１０のねじ付き部分を受けるねじ山を含む。Ｏ－リング８６０は、キャップ８１０とハウジング８４０との間に位置決めされてもよい。ハウジング８４０の底部セクションは、ベース部８３０に接続される。

キャップ８１０は、吸引棒８２０に接続される。多孔質マンドレル８５０は、吸引棒８２０に付着される。付属品は、クランプ、ねじ、またはルアーコネクター、圧力嵌め、摩擦嵌め、連結などを含む、任意の手段によるものであってもよい。
２．マンドレル

マンドレルは、典型的には、吸引棒に適合するようにサイズ決めされる。マンドレルは、吸引棒にまたはキャップに、任意の適切な付属品で固定されてもよい。例示的な付属品には、クリップ、フック、およびマンドレルの幅を受容するスロットが含まれる。マンドレルは、成型または粘着によって吸引棒に付着されてもよい。

マンドレルは、血管グラフトまたは足場を受けるのに適した任意の形状を有していてもよい。マンドレルは、典型的には穿孔された多孔質マンドレルである。あるいはまたは追加として、マンドレルは、互いに平行に走る、螺旋状に降下する、ダイヤモンドパターンに、円形に、ジグザグに、および／または波形に配置構成された、軸方向に配置構成された突起を有していてもよい。

マンドレルに関する例示的な寸法を、図６に提示する。例示的な実施形態では、１８０ｍｍの長さの播種チャンバー内に適合するマンドレルの長さは、約１２０ｍｍ～１４０ｍｍの間、例えば約１２８ｍｍである。
Ｂ．流体体積、細胞密度、および播種時間

グラフトまたは足場の播種は、典型的にはグラフトまたは足場を、細胞を含有する流体に接触させることを含む。流体は、血液、骨髄吸引液、または血液もしくは骨髄からの細胞抽出物であってもよい。流体は、約１０ｍｌ～２００ｍｌの間、例えば約２５ｍｌ、約５０ｍｌ、約７５ｍｌ、約１００ｍｌ、約１２５ｍｌ、約１５０ｍｌ、約１７５ｍｌ、および約２００ｍｌの体積のものであってもよい。流体は、典型的には、約１０^５細胞／ｍｌ～１０^８細胞／ｍｌの間、好ましくは約１０^６～１０^８細胞／ｍｌの間、より好ましくは約１０^６～１０^７細胞／ｍｌの間を有する白血球（ＷＢＣ）濃度を有する。

播種後、グラフトまたは足場は典型的には、足場の長さに沿って、両端の値を含んで、約０．１×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０^５細胞／ｍｍ^２の間、好ましくは足場の長さに沿って、両端の値を含んで、約０．１×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０^４細胞／ｍｍ^２の間、最も好ましくは足場の長さに沿って、両端の値を含んで、１×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０^４細胞／ｍｍ^２の間の、細胞密度を有する。

典型的には、グラフトは、約１分～１５分の間、好ましくは約１分～１０分の間、最も好ましくは約１分～７分の間の期間、流体に接触する。最も好ましい実施形態では、播種は、約１５分、約７分、または約１分で終了する。
Ｃ．可逆的狭窄を有するグラフトまたは足場

典型的には、グラフトまたは足場は、マンドレルとハウジングとの間に位置決めされる。グラフトまたは足場は一般に、生分解性ポリマーで作製されたポリマーおよび多孔質である。グラフトまたは足場は、狭窄の自発的な反転を誘発させるための内面構造および外面構造を有していてもよい。グラフトまたは足場は、その内面の平均孔径を有していてもよく、それは、その外面の平均孔径とは異なる。例えば、内面の平均孔径は、約３５μｍ～５０μｍの間、好ましくは約３８μｍ～５０μｍの間、最も好ましくは約３８μｍ～４５μｍの間であってもよい。外面の平均孔径は、約２５μｍ～４５μｍの間、好ましくは約２７μｍ～４３μｍの間、最も好ましくは約３０μｍ～４３μｍの間であってもよい。表面多孔度は、内面および／または外面の表面積の約０．６～０．９５の間、好ましくは約０．７～約０．９の間、最も好ましくは約０．８～約０．９の間であってもよい。

典型的には、グラフトまたは足場は、編まれたポリマー繊維から形成される。一部の態様では、繊維は、繊維束に編成されてもよい。繊維束は、編まれてもよく、例えば横糸パターンに編まれてもよい。繊維の直径は、約５ｎｍ～３０ｎｍの間であってもよい。典型的には、編まれたパターンは、軸方向に配置構成されたポリマー繊維層、および円周方向に配置構成されたポリマー繊維ピークを形成する。層間の距離は、約０．５ｍｍ～２ｍｍの間、好ましくは約０．５ｍｍ～１．５ｍｍの間、最も好ましくは約１ｍｍであってもよい。ピーク間の距離は、約０．５ｍｍ～２ｍｍの間、好ましくは約０．５ｍｍ～１．５ｍｍの間、最も好ましくは約１ｍｍであってもよい。

グラフトまたは足場は、繊維状ポリマーコーティングを含んでいてもよい。典型的には、ＴＥＶＧまたは足場は、約１４ｍｍ～２２ｍｍの間の内径、０．１ｍｍ～３ｍｍの間の厚さ、および約５ｃｍ～１５ｃｍの間の長さを有する。ＴＥＶＧまたは足場は、典型的には生分解性であり、埋め込み後、実質的に約６カ月以内に分解する。例えば埋め込み後６カ月以内に、グラフトは、足場の重量では約８０％よりも多く、表面積では約８０％よりも多く、または厚さでは約８０％よりも多く、低減されている。

ポリマー血管グラフトまたは足場は、典型的には、細胞なしのまたは少ない細胞を有するグラフトに対して、グラフトの術後狭窄を低減させまたは予防する有効量の生存細胞を含む。典型的には、グラフトは、ある量の生存細胞が、足場の長さに沿って、両端の値を含んで、約０．１×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０×１０^４細胞／ｍｍ^２の間、好ましくは足場の長さに沿って、両端の値を含んで、約０．１×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０×１０^３細胞／ｍｍ^２の間、最も好ましくは足場の長さに沿って、両端の値を含んで、１×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０×１０^３細胞／ｍｍ^２の間の細胞密度で付着している。

好ましい細胞は、患者の骨髄から得られる。好ましい実施形態では、血管グラフトには、自家生存細胞が播種される。特定の実施形態では、細胞は、ヒト骨髄単核細胞である。ポリマー血管グラフトまたは足場は、抗新生内膜剤、化学療法剤、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、従来の免疫療法剤、免疫抑制剤、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子からなる群から選択される１種または複数の追加の薬剤を含むことができる。
１．ポリマー

ＴＥＧＶ足場は、１種または複数のポリマーで形成することができる。一部の実施形態では、ポリマーは生分解性である。他の実施形態では、ポリマーは非生分解性である。一部の実施形態では、ＴＥＶＧは、単一ポリマーよりも多くの混合物から形成される。生分解性ポリマーが使用される場合、生分解性および非生分解性ポリマーの混合物は、例えば、望みに応じて長時間続くＴＥＶＧインプラントを提供するのに使用することができる。

ある特定の実施形態では、ＴＥＶＧは、織布または不織布メッシュに、ランダムまたは整列された構成に組み立てられた、ポリマー（ホモポリマーおよび／またはコポリマー）繊維で形成された三次元母材である。好ましくは、ナノ繊維材料は、ＦＤＡで承認された生分解性ナノ繊維材料である。

足場母材の繊維は、任意の所望のサイズのものとすることができるが、一般に約１．５ｍｍ～１ｎｍの間である。ある特定の実施形態では、繊維がナノスケール（即ち、約１ｎｍ～約１０００ｎｍ）および／またはマイクロスケール（約１μｍ～約１０００μｍ）である。

ＴＥＶＧの形成における使用のための足場を創出するのに有用なポリマーは、無機（例えば、シロキサン、硫黄鎖、黒リン、ホウ素－窒素、シリコーン）または有機（炭素を含有することを意味する）であってもよい。有機ポリマーは、天然（例えば多糖、例えばデンプン、セルロース、ペクチン、海藻ガム、植物ガム；ポリペプチド、例えばカゼイン、アルブミン、グロブリン、ケラチン、コラーゲン、核酸、および炭化水素）、合成（熱可塑性、非加硫エラストマー、ナイロン、ポリ塩化ビニル、直鎖状ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、アクリル酸樹脂など）；熱硬化性（例えば、加硫エラストマー、架橋ポリエチレン、フェノール、アルキド、ポリエステル）、および半合成（例えばセルロース、例えばレーヨン、メチルセルロース、酢酸セルロース；および変性デンプン））であってもよい。さらに、有用な足場は、水溶性または水不溶性セルロース化合物から形成されたヒドロゲルを含んでいてもよい。当業者に容易に理解され得るように、足場の特定のタイプおよび組成は、所望の適用に応じて変動する。しかしながら、足場におけるポリマー材料は、生体適合性である（即ち、望ましくない免疫反応を誘発しない）ことが一般に好ましい。ある特定の実施形態では、足場は生分解性である。例示的な分解性ポリマーには、ポリ（乳酸－グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスファゼン）、ポリカプロラクトン、またはポリアミドが含まれる。好ましい実施形態では、ポリマーは、ポリ（乳酸－グリコール酸）である。一実施形態では、ＴＥＶＧは、ポリグリコール酸繊維チューブから製作された生分解性チューブ状足場から形成される。チューブは、５０：５０のポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリ－カプロラクトンコポリマーなどのコポリマーで、コーティングすることができる。

一実施形態では、グラフトは、チューブ状足場に形成することができるポリマーのフェルトまたはシート状の材料から形成される。例えばデバイスは、押し出されたポリマー繊維からの、不織布、織布、または編まれた構造として製作することができる。典型的には、ポリマーシートは、織物、ニット、ブレード、またはフィラメントの巻取りを含むがこれらに限定されない任意のテキスタイル構築を使用して形成される。任意の適切な方法、例えばエレクトロスピニングは、不織布または織布ポリマーテキスタイルを製作するのに使用することができる。

ポリマー血管グラフトを製作するのに選択されるポリマーおよび製作方法は、血管足場としての使用に適した生体力学的性質を有するグラフトを生成するのに適している。血管グラフト機能に重要な生体力学的性質には、初期破裂圧力、縫合糸保持強度、および弾性が含まれる。一実施形態では、ポリマー血管グラフトの初期破裂圧力は、約１，５００ｍｍＨｇ～約５０，０００ｍｍＨｇの間、好ましくは約２，０００ｍｍＨｇ～約１０，０００ｍｍＨｇの間である。別の実施形態では、ポリマー血管グラフトは、約１Ｎ～約５Ｎの間、好ましくは約２Ｎ～約４Ｎの間の縫合糸保持強度を保有する。別の実施形態では、血管グラフトの固有弾性は、約１０ＭＰａ～約５０ＭＰａの間、好ましくは約１５ＭＰａ～約４０ＭＰａの間である。別の実施形態では、血管グラフトの初期引張り強さは、約１ＭＰａ～約１０ＭＰａの間、好ましくは約３ＭＰａ～約６ＭＰａの間である。
２．細胞

ある特定の実施形態では、ＴＥＶＧ足場は、１つまたは複数のタイプの細胞を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のタイプの細胞は、ＴＥＶＧの腔内に、ＴＥＶＧの壁全体にわたる多孔質空間内に、ＴＥＶＧの外部および表面に、または組合せに含まれる。典型的には、細胞は、ＴＥＶＧの表面に直接または１つもしくは複数の補助物質を通して付着される。一部の実施形態では、細胞は、細胞播種済みＴＥＶＧの意図されるレシピエントの１つまたは複数の組織に由来する自家細胞である。他の実施形態では、細胞は、グラフトの意図されるレシピエントに対して外因性である。細胞は、多能性幹細胞などの未分化細胞または分化細胞とすることができる。好ましい実施形態では、細胞は、ヒトの生存細胞である。ＴＥＶＧに含めるための例示的な細胞型には、白血球（ＷＢＣ）、例えば単球 リンパ球、好中球、好塩基級、好酸球；線維芽細胞 筋線維芽細胞、線維芽細胞；平滑筋細胞；骨髄前駆細胞；赤血球；胚性幹細胞；および組合せが含まれる。白血球は、骨髄で作製される。特定の実施形態では、自家骨髄単核細胞（ＢＭ－ＭＮＣ）がＴＥＶＧ内に含まれる。

ＴＥＶＧと共に使用するための細胞は、多数の供給源から得ることができる。細胞の混合物から１つまたは複数の細胞型を単離し必要に応じて操作するための方法は、当技術分野で公知である。例示的な実施形態では、骨髄は、対象（例えば、ＴＥＶＧの意図されるレシピエント）の１つまたは複数の長い骨（例えば、大腿骨および／または脛骨）から収集され、単核細胞は、密度遠心分離法を使用して単離される（Lee, et al. J Vis Exp. (88), (2014); Udelsman, et al. Tissue Eng Part C Methods. 17(7), 731-736 (2011)）。
ａ．播種用量

典型的には、播種チャンバーは、最小限の体積の細胞含有流体（血液、骨髄吸引液、または単核細胞（ＭＮＣ）に富む画分）で、グラフトまたは足場の長さに沿って最大均一播種密度を提供する。

典型的には、ＴＥＶＧに播種された細胞の量は、術後グラフト開存性に正比例する。したがって好ましい実施形態では、ＴＥＶＧに、開存性を高めまたはＴＥＶＧの術後狭窄の速度を低減させるのに有効な十分な量の細胞が播種される。細胞をＴＥＶＧに手作業で播種するための方法は、当技術分野で公知である（Udelsman, et al. Tissue Eng Part C Methods. 17(7), 731-736 (2011)）。

播種される細胞の最適な数は、細胞型、ならびにＴＥＶＧのサイズおよび形状、ならびに意図される使用に応じて変えることができる。ＴＥＶＧは、典型的には、両端の値を含んで、１．０×１０^６細胞～５００×１０^６細胞の間、好ましくは３．０×１０^６細胞～２５０×１０^６細胞の間の量の細胞に接触させる。

播種された場合、得られる播種密度は、足場の長さに沿って均一である。播種密度は、足場の長さに沿って約０．１×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０×１０^４細胞／ｍｍ^２の間であってもよい。好ましい実施形態では、ＴＥＶＧは、足場の長さに沿って約０．１×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０×１０^３細胞／ｍｍ^２の間であり両端の値を含む、好ましくは足場の長さに沿って１×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０×１０^３細胞／ｍｍ^２の間であり両端の値を含む密度で播種される。

一部の実施形態では、ＴＥＶＧは、両端の値を含んで、約０．１×１０^４細胞／ｍｌ～１０×１０^７細胞／ｍｌの間の濃度を有する溶液中で、細胞が播種される。細胞溶液の典型的な体積は、１ｍｌ～１００ｍｌの間であり両端の値を含む、好ましくは１０ｍｌ～１００ｍｌの間の範囲、例えば１０ｍｌ、５０ｍｌ、７５ｍｌ、または１００ｍｌである。

好ましくは、ＴＥＶＧに、０．１×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０．０×１０^４細胞／ｍｍ^２の間、好ましくは１．０×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０．０×１０^３細胞／ｍｍ^２の間の細胞密度をもたらすのに十分な量で細胞が播種される。したがって播種チャンバーは、患者から採取された最小量の骨髄を使用してグラフトまたは足場に播種され、グラフトまたは足場の長さに沿って均一な細胞密度を実現するのを可能にする。

自家骨髄単核細胞（ＢＭ－ＭＮＣ）細胞が、播種のために調製される場合、５ｍｌ／ｋｇの骨髄からの細胞は、典型的には十分な播種用量を提供する。臨床的観点から、著しい有害効果を引き起こすことなしに最大２０ｍｌ／ｋｇの骨髄を個体から採取することができ、骨髄移植用に骨髄を採取するため日常的に使用される。
３．追加の活性剤

骨髄由来の単核細胞が播種されたＴＥＶＧは、パラクリン効果を介して術後狭窄の発生を低減および予防することが、確立されている。細胞播種の利点には、フィードバックに関わらず薬物を放出する薬物溶出足場とは異なって、身体のフィードバックメカニズムに応答する放出シグナルが含まれる。したがって一部の実施形態では、細胞播種済みＴＥＶＧは、播種細胞のパラクリン効果を複製する１種または複数の非細胞ベースの合成または非合成化合物と組み合わせて使用される。

ＴＥＶＧは、追加の活性剤、例えば細胞の血管グラフトとの接着を高める、または挿入後のグラフトの術後狭窄の発生を低減させるものを含むことができる。活性剤には、限定するものではないが、抗新生内膜剤、化学療法剤、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、従来の免疫療法剤、免疫抑制剤、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子が含まれる。

骨髄成長を刺激するための成長因子の使用は、ＢＭ－ＭＮＣの収率を増大させるための追加の戦略となる。したがって一部の実施形態では、ＴＥＶＧは成長因子を含む。ＴＥＶＧに組み込むための例示的な成長因子には、組織傷害に対する生理学的応答で放出された成長因子が含まれ、これにより血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、強力な走化剤、および形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）などの細胞外基質の堆積が刺激される。
ＩＩＩ．作製方法
Ａ．播種チャンバー

播種システムの構成部品の１つまたは複数は、ＴＥＶＧの寸法に順応するようアセンブリが最適にサイズ決めされるように、注文設計される。好ましくは、システムまたはシステムの部品は、適切な材料の３Ｄ印刷を使用して製作される。例示的な実施形態では、図２Ａ～４Ｃに示すシステムの播種チャンバーの構成部品の１つまたは複数は、適切な材料の３Ｄ印刷によって製作される。特定の実施形態では、３Ｄ印刷された構成要素は、播種チャンバー（例えば、播種チャンバー７００および８００）、吸引棒、およびクリップ、キャップ、およびマンドレルの１つまたは複数を含む。構成要素は、製造された足場と共に播種チャンバーアセンブリに組み立てることができる。播種システムの構成部品の寸法は、例えば血管グラフトの寸法によって望まれるものに応じて変えることができる。

播種システムの種々の構成要素を形成するための適切な材料には、ポリマー、ならびに限定するものではないが、ステンレス鋼、イリジウム、白金、金、タングステン、タンタル、パラジウム、銀、ニオブ、ジルコニウム、アルミニウム、銅、インジウム、ルテニウム、モリブデン、ニオブ、スズ、コバルト、ニッケル、亜鉛、鉄、ガリウム、マンガン、クロム、チタン、アルミニウム、バナジウム、および炭素を含む金属、ならびにそれらの組合せ、合金、および／または積層体が含まれる。
Ｂ．マンドレル

ＴＥＶＧの形成における使用のためのマンドレルは、当技術分野で公知の手段を使用して製作することができる。マンドレルの製作のための例示的な方法には、３Ｄ印刷が含まれる。一部の実施形態では、最終的なマンドレルの設計は、３Ｄ製作に適切なコンピューター可読フォーマットに変換される。例示的なコンピューター可読フォーマットは、ＳＴＬフォーマットである。マンドレルモデルの３Ｄ印刷に適切な材料には、ポリマーおよび金属および炭素、ならびにそれらの組合せ、合金、および／または積層体が含まれる。一部の実施形態では、マンドレルは、液体化可能な材料で作製され、それによってグラフトからのマンドレルの放出が容易な手法で可能になる。液体化可能なマンドレルの使用は、グラフトの複雑な形状を形成することも可能にする。
Ｃ．ＴＥＶＧを作製する方法

注文設計されたマンドレルなど、鋳型構造をベースにしてＴＥＶＧを製作する方法が、提供される。ＴＥＶＧは、エレクトロスピニング、スタンピング、鋳型形成、成型、織込み、および組合せ 溶融加工、溶媒加工、浸出、発泡、押出し、射出成型、圧縮成型、ブロー成型、噴霧乾燥、押出しコーティング、および繊維紡糸など、任意の適切な方法を使用し、その後の織布、不織布、または編まれた構造への加工により、製作することができる。

一部の実施形態では、ＴＥＶＧは、グラフト内に細孔を含むように製作される。細孔は、塩の浸出、昇華、溶媒蒸発、噴霧乾燥、発泡、繊維への材料の加工、およびその後の織布または不織デバイスへの加工を含む、任意の適切な方法によって誘導することができる。好ましい実施形態では、足場の繊維母材は、細胞が接着し成長しおよび／または分化することが可能になる、適切なサイズの細孔を含む。細胞の直径はほぼ１０μｍ～２０μｍであるため、この範囲内の孔径が、ある特定の実施形態で望まれる。好ましくは、デバイスの細孔は、直径が５～５００μｍに間、より好ましくは５～２５０μｍの間、より好ましくは５～１００μｍの間である。ある特定の実施形態では、ポリマー足場は、播種細胞の成長および分化を促進させるため、ならびに足場またはそこで成長した細胞の移植および／または埋め込みを容易にするために、天然の細胞外基質の構造および組成により密接に模倣するために生成または製作される。

好ましい実施形態では、ＴＥＶＧは、１種または複数のポリマーを含有するストック溶液のエレクトロスピニングによって製作される。典型的には、ＴＥＶＧを製作するのに使用される１種または複数のポリマーは、生分解性ポリマーである。
Ｄ．ＴＥＶＧに播種する方法

典型的には、チャンバー７００または８００などの播種チャンバーは、細胞を含む流体を含有する閉鎖型使い捨て播種システムに接続される。

典型的には、グラフトまたは足場に接触するよう使用される細胞の数は、グラフトの表面積に比例してもよく、細胞の数は、両端の値を含んで、約１．０×１０^４細胞／ｍｍ^２グラフト～１．０×１０^６細胞／ｍｍ^２グラフトの間、好ましくは、両端の値を含んで、０．７×１０^５細胞／ｍｍ^２グラフト～７．０×１０^５細胞／ｍｍ^２グラフトの間である。一部の実施形態では、ポリマー血管グラフトまたは足場は、両端の値を含んで、０．５×１０^６細胞～５００×１０^６細胞の間、好ましくは１．０×１０^６細胞～１００×１０^６細胞の間の量の細胞に、接触する。好ましい実施形態では、グラフトは、３時間未満、好ましくは２時間未満、例えば約３０分、約２０分、約１５分、約７分、約５分、または約１分間、細胞に接触する。接触することは、典型的には滅菌の閉鎖型播種チャンバー内で実施される。

生存細胞の有効量をグラフトまたは足場上に投与して、グラフトへのマクロファージの浸潤を低減させ、グラフトへの宿主細胞の補充を促進させるか、または血小板活性化を低減させるかもしくは予防するステップを含む、ポリマー血管グラフトまたは足場の開存性を増大させるための方法も提供される。

対象における術後狭窄を低減させるか、または予防する方法が開発されている。対象は、再狭窄または他の血管増殖障害のリスクがあるかまたはそれを有する対象とすることができる。例えば、一部の実施形態では、対象は、血管外傷、血管形成術、血管外科手術、または移植動脈症を受けたことがある、受けている、または受けることになる。方法は、未処置の対照対象に対して、対象における新生内膜形成、狭窄もしくは再狭窄を低減させる、血栓症を低減させるかもしくは予防する、またはそれらの任意の組合せである。

再狭窄は、経時的な、処置された冠動脈狭窄の再発を意味する。再狭窄は、追跡調査血管造影（典型的には６または９カ月後）で、ステント内（ステント内再狭窄）、またはステント内でステントの端から５ｍｍの近位または遠位を含む（セグメント内再狭窄）での、５０％よりも大きい内腔の再狭小化（二分化血管造影再狭窄）と最も一般的に定義される。再狭窄は、ＰＣＩ（経皮的冠動脈形成術）後の１～６カ月の期間にわたり、臨床的に出現する可能性がある。

細胞を血管グラフトまたは足場に播種するためのカスタマイズ可能なシステムおよび組成物は、米国特許第９，０９０，８６３号および米国出願公開第２０１８／０３５３６４９号に記載されている。
ＩＶ．使用方法

典型的には、播種チャンバーは、グラフトおよび足場の素早く効率的な播種に使用される。次いで播種された足場は、損傷した血管を修復または置き換えるための心血管手術で使用される。
Ａ．播種チャンバーを使用する方法
１．フリップ播種チャンバー

フリップ播種チャンバーを使用する方法は、以下のステップを含む。チャンバーを満たし、陰圧をかけ、チャンバーが容積の５０％を排出し（その時点で、足場の底部から約５０％が単核細胞（ＭＮＣ）で飽和される）、陰圧を中断し、デバイスを逆にし、陰圧を再導入し、体積の残り５０％を足場の「上」半分へ引き込み、次いでこれもＭＮＣで飽和状態になる。したがって、足場の底部および上半分が逐次的に飽和され、その結果、最小限のＭＮＣ損失で完全に飽和した足場が得られる（高播種効率）。

陰圧を、シリンジ、ポンプ、または真空源によって提供してもよい。
２．キャパシタ播種チャンバー

キャパシタ播種チャンバーを使用する方法は、下記のステップを含む。マンドレルおよび足場アセンブリは、播種チャンバー内に慎重に配置される。播種チャンバーは、組み立てられたマンドレル／足場アセンブリと比較して、非常に狭い。最小限の体積のＭＮＣ溶液を保持するように設計される。細胞播種チャンバーは、約１ｍｍ～約１０ｍｍの間、より好ましくは約１ｍｍ～５ｍｍの間の隙間を、吸引棒またはマンドレルとハウジングとの間に有していてもよい。

マンドレルおよびチャンバーが一緒に固定された後、ＭＮＣがデバイス内に導入される。流体は素早くチャンバーを満たし、チャンバー上方に位置付けられたＩＶバッグ内に「オーバーフロー」する。ＭＮＣの全体積が播種チャンバーおよびオーバーフロー（キャパシタ）ＩＶバッグの両方に導入された後、陰圧をかける。ＭＮＣ流体は足場を通過し始め、足場全体は、流体レベルがＩＶバッグ内で低下するにつれてＭＮＣ中に浸されたままになる。播種プロセスの終了間際までは流体がＩＶバッグから完全に排出されることはなく、流体レベルは最終的に播種デバイスの上部を下回る。足場の底部が浸されたままで、足場の上部から流体が排出され、濾過された空気に足場が曝露される時間は、非常にわずかである。このように、足場の上部および底部は、播種プロセスの大部分の全体を通して浸されたままであった。ＭＮＣ溶液のわずかな部分に関してのみ、底部が浸されながら上部が曝露される。したがって播種勾配は、足場の長さに沿って最小限に抑えられる。

陰圧は、シリンジ、ポンプ、または真空源によって提供され得る。
Ｂ．グラフトまたは足場を使用する方法

組織工学的血管グラフト（ＴＥＶＧ）に対する細胞播種用量は、細胞インキュベーション時間とは無関係に、グラフトの性能および有用性を改善するための、効果依存的変数であることが確立されている。典型的には、ＴＥＶＧには、対象に埋め込まれる前に細胞が播種される。典型的には、細胞は、意図されるレシピエントからの自家細胞であり、播種方法は、細胞をレシピエントから採取するステップを含むことができる。１つまたは複数の細胞型は、当技術分野で公知の任意の技法を使用して、細胞の混合物から単離することができる。したがって方法は、適用（即ち、播種）する前に細胞を単離または精製するステップを含むこともできる。

ＴＥＶＧへの細胞の播種は、閉鎖型使い捨て播種システムなどの、キットまたはデバイスを使用して実施される。閉鎖型使い捨て播種システムは、グラフトまたは足場上に細胞を播種するためのフリップ播種チャンバーまたはキャパシタ播種チャンバーのいずれか１つを含んでいてもよい。好ましくは、キットまたはデバイスは、ＴＥＶＧへの制御可能な量の細胞の滅菌されたおよび効率的な播種を可能にする。
１．細胞が播種されたＴＥＶＧの使用方法

細胞が播種されたＴＥＶＧは、細胞の存在しない同等のＴＥＶＧにおける狭窄速度に対し、ＴＥＶＧの術後狭窄の速度を低減させるかまたは予防することができる。したがってＴＥＶＧは、炎症を含む術後狭窄の発症に関連した免疫プロセスの１つまたは複数を低減させるかまたは予防するための有効量の細胞を播種することができる。

組織修復は：ａ）凝血／凝固；ｂ）炎症；ｃ）線維芽細胞の遊走／増殖；およびｄ）正常組織のアーキテクチャが復元される最終リモデリング相を含む、４つの全く異なる段階を有する。組織損傷後の最も早い段階で、上皮細胞および／または内皮細胞は、炎症メディエーターを放出し、抗線維素溶解－凝固カスケードを開始し、凝血および仮の細胞外基質（ＥＣＭ）の発症を誘発させる。血小板の凝集および後続の脱顆粒は、血管拡張および増大した透過性を促進させ、好中球、マクロファージ、リンパ球、および好酸球などの炎症細胞の、損傷組織への効率的な補充を可能にする。好中球は、創傷治癒の最も早い段階での最も豊富な炎症細胞であるが、好中球の脱顆粒後にはマクロファージにより素早く置き換えられる。活性化マクロファージおよび好中球は、創傷を郭清し、いかなる侵入生物も排除し、炎症応答を増幅する様々なサイトカインおよびケモカインを生成すると共に、線維芽細胞増殖および補充を誘発させる。活性化により、線芽細胞は筋線維細胞に変換され、α－平滑筋アクチンおよびＥＣＭ構成要素を分泌する。最後に、リモデリング相では、上皮／内皮細胞が分裂し、一時的な母材上を遊走して、損傷組織を再生する。このように、治癒および新生組織発生は、過剰な肥厚および狭窄または線維症なしに、組織を再生し血管壁を厚くする必要性のバランスをとる、微細に調節されたプロセスである。
ａ．マクロファージ

循環単球および浸潤マクロファージの存在は、創傷治癒および新生組織発生に極めて重要であることが示されている（Arras, et al., J Clin Invest, 101(1): 40-50 (1998)）。しかしながら、組織損傷の部位でのマクロファージ浸潤の程度は、増殖調節不全および新生内膜形成にも相関していた（Hibino, et al., FASEB J. 25(12):4253-63 (2011)）。さらに、数多くの研究は、マクロファージおよび線維芽細胞が、線維症の病因に関わる主なエフェクター細胞であることを示している（Wynn, Nat Rev Immunol. 4(8):583-94 (2004)で再調査された）。

血管損傷後、炎症性単球細胞（ヒトにおけるＣＤ１６－ｈｉ、ＣＤ６４－ｈｉ、およびＣＤ１４－ｈｉ；マウスにおけるＣＤ１１５＋、ＣＤ１１ｂ＋、およびＬｙ６ｃ－ｈｉ）が損傷組織に補充され、局所成長因子、炎症促進性サイトカイン、および微生物化合物に曝露された後に活性化マクロファージ（ヒトにおけるＥｍｒ１－ｈｉ；マウスにおけるＦ４／８０－ｈｉ）に分化する（Geissmann et al., Science 327: 656-661 (2010)）。過剰なマクロファージ浸潤は狭窄をもたらし、それに対してマクロファージ浸潤の完全な阻害は、新生組織形成を予防する（Hibino, et al., FASEB J. 25(12):4253-63 (2011)。

マクロファージに関する分極活性化の２つの全く異なる状態が、定義されている：古典的に活性化した（Ｍ１）マクロファージ表現型および代替として活性化した（Ｍ２）マクロファージ表現型（Gordon and Taylor, Nat. Rev. Immunol. 5: 953-964 (2005); Mantovani et al., Trends Immunol. 23: 549-555 (2002)）。古典的に活性化した（Ｍ１）マクロファージの役割は、ＴＨ１細胞免疫応答におけるエフェクター細胞であり、それに対して代替として活性化した（Ｍ２）マクロファージは、免疫抑制および創傷治癒／組織修復に関わるように見える。Ｍ１およびＭ２マクロファージは、全く異なるケモカインおよびケモカイン受容体プロファイルを有し、Ｍ１はＴＨ１細胞誘引性ケモカインＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０を分泌し、Ｍ２マクロファージはケモカインＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、およびＣＣＬ２４を発現する。

Ｍ２マクロファージの存在は、新生内膜発生および狭窄に関連付けられている（Hibino, et al., FASEB J. 25(12):4253-63 (2011)）。組織グラフト埋め込み後のある特定の時点でのマクロファージ浸潤、新生組織形成、および狭窄の程度の間の相関は、マクロファージ活性のモジュレーションを通して狭窄を予防する手段を提供する。

さらにマクロファージは、コラーゲン生成筋線維細胞の近くに典型的には位置付けられ、単球由来マクロファージは、線維症の前提として傷害後の炎症応答を非常に長続きさせることが示されている（Wynn and Barron, Semin Liver Dis., 30(3):245-257 (2010)）。マクロファージは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、強力な走化剤、および形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－Ｂ）を含む、線維芽細胞を活性化する線維化促進メディエーターを生成する。特に、マクロファージの非古典的Ｍ２（ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋）サブセットの顕著な増大は、慢性肝疾患に罹患している患者の炎症促進性サイトカインおよび臨床的進行に相関していた。線維症の進行中、単球由来マクロファージは、慢性炎症を永続させると共に肝星細胞（ＨＳＣ）を直接活性化するサイトカインを放出し、その結果、それらの増殖およびコラーゲン生成筋線維芽細胞への分化転換がもたらされる（Zimmermann, et al., PLOS One, 5(6):e11049 (2010)）。
ｂ．血小板

凝集した血小板は、創傷を治癒させるために周囲の結合組織から、または調節不全炎症応答の場合は瘢痕組織から、創傷エリア内に線維芽細胞を引き付ける化学物質を分泌することによって、血管の修復を支援する。組織傷害に応答して、血小板は、活性化されるようになり、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、強力な走化剤、ならびに形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）などの細胞外基質の堆積を刺激するたくさんの成長因子を放出する。これらの成長因子の両方は、結合組織の修復および再生において重要な役割を演ずることが示されている。ＰＤＧＦは一次マイトジェンおよび化学誘引物質として機能し、線維芽細胞および炎症細胞の流入を著しく増大させると共に細胞増殖および遺伝子発現を刺激する。ＰＤＧＦは、白血球を血管壁にしっかりと付着させ、最終的には内皮細胞下組織内に遊出する。しかしながら血小板由来ケモカインは、平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖を誘発し、新生内膜増殖および臓器線維症において役割を演ずることも公知である（Chandrasekar, et al., J Am College Cardiology, Vol 35, No. 3, pp. 555-562 (2000)）。ＰＤＧＦおよびその受容体の増大した発現は、強皮症の肺および皮膚組織に関連付けられる。特に、強皮症の肺および皮膚線維芽細胞における自己分泌ＰＤＧＦ受容体媒介型シグナル伝達ループに関する証拠があり、強皮症の慢性線維症におけるＴＧＦ－βおよびＰＤＧＦの両方の経路を示している（Trojanowska, Rheumatology;47:v2-v4 (2008)）。さらに、ＰＤＧＦシグナル伝達の調節解除は、肺性高血圧症およびアテローム性動脈硬化症などの心血管の徴候に関連付けられる。

傷害誘発型ＰＤＧＦに応答した媒質層平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖および遊走は、新生内膜の肥厚に関与する必須の事象であり（Fingerle, et al., Proc Natl Acad Sci., 86:8412 (1989); Clowes, et al., Circ. Res., 56:139-145 (1985)）、最終的には血管の狭小化および狭窄に至る。

血小板によって放出される他の治癒関連成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子１、血小板由来上皮成長因子、および血管内皮成長因子を含む。

ＴＥＶＧには、創傷治癒を高め、狭窄を予防する再生促進免疫環境を創出するように、有効量の細胞を播種することができる。ＴＥＶＧには、血小板活性および機能をモジュレートするように、有効量の細胞を播種することもできる。このようにＴＥＶＧには、血小板の凝集および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の生成／発現など、血小板の生物学的機能を低減させるかまたは予防するように、有効量の細胞を播種することもできる。

グラフトの術後狭窄を低減するために細胞が播種された組織工学的血管グラフトを使用する方法は、細胞播種済みグラフトを患者の体内に外科的に埋め込むステップまたはその他の手法で投与するステップを含む。典型的には、埋め込む方法は、グラフトを、置き換えられるかまたは増強されることになる動脈セクションに付着するステップを含む。血管グラフトを付着する方法は、当技術分野で公知である。方法は、細胞が播種されていないかまたはより少ない細胞が播種されている同等のグラフトなどの対照と比較して、典型的にはマクロファージ細胞の浸潤もしくはＭ１からＭ２表現型へのマクロファージ細胞の変換または両方を低減させるかまたは阻害する。一部の実施形態では、方法は、血管新生組織の発生を低減させるかまたは阻害することなく、マクロファージ細胞の増殖を低減させるかまたは阻害する。対象は、狭窄、再狭窄もしくは他の血管増殖障害を有するか、または再狭窄もしくは他の血管増殖障害のリスクがあると特定され得、例えば対象は、血管外傷、血管形成術、外科手術、または移植動脈症などを受けたことがある、受けている、または受けることになるものである。記載される方法のいずれかは、処置の必要がある対象を特定するステップを含むことができる。

本発明は、以下の非限定的な実施例の参照によってさらに理解されよう。

（実施例１）
グラフトの均一な細胞播種のための播種チャンバー。
材料および方法

米国特許第９，０９０，８６３号は、埋め込み可能な足場上に単核細胞（ＭＮＣ）を播種するのに、閉鎖型使い捨て組織工学的血管グラフト播種デバイスをどのように使用するのかを記載する。

この方法を使用して播種された全ての足場は、グラフトの長手軸に沿ってＭＮＣの勾配（分布）を有した（グラフトの底部よりも、グラフトの上部に少ない細胞が播種されたことを意味する）。新しい濃度および播種体積により、播種された足場は、グラフトの底部３ｃｍに向かって飽和点に到達し（図２Ａおよび２Ｂ）、これはさらなる細胞播種を許容せず、その結果、骨髄の廃棄および患者に対する潜在的リスクをもたらした。

グラフト全体（長さ１３ｃｍ）は、上部から５ｍｍを保存し、底部グラフトに十分なＭＮＣを播いて放出基準を満たしたが、グラフトの上方セクションよりも下方セクションで多くのさらなるＭＮＣが見出された。この実施例は、この不均衡を排除する播種デバイスに関して、２つの播種チャンバー－フリップおよびキャパシタを提示する。
フリップ播種チャンバー

「フリップ」播種チャンバーは、足場上でのＭＮＣの分布のばらつきを排除する。デバイスの背後にある中心的前提は、播種チャンバーの長さに沿ってその断面を変えることである。

図３Ａ～３Ｅは、フリップ播種チャンバーの例を示す。チャンバーの形状は、砂時計を逆にしたものに似ており、膨らみ（最大断面）は、デバイスの高さの上からほぼ４０％下がったところにある。デバイスの上部および底部の両方は狭くなって、部分クリアランスおよび過剰な液体に関する非常に最小限に抑えられた体積と共に、足場が取り付けられたマンドレルを収容する。

断面の変化の効果は、足場の最も少なく播種された部分へＭＮＣが引き込まれる速度を効果的に遅くすることである。

チャンバーを満たし、真空をかけ、チャンバーは排出された容積の５０％を有し（その時点で、足場の底部の約５０％はＭＮＣで飽和される）、真空を中断し、デバイスを逆にし、真空を再導入し、容積の残り５０％を足場の「上」半分へ引き込み、次いでこれもＭＮＣで飽和状態になる。この方法を介して、足場の底部および上半分は逐次的に飽和され、その結果、最小限のＭＮＣ損失で完全に飽和した足場が得られる（高播種効率）。

さらにこの設計に関するマンドレルは、２つの真空ナブを有し－１つは上向き方向に陰圧を引き出すため、１つは逆方向に陰圧を引き出すためのものである。
フリップチャンバーでグラフトに播種する方法

１．足場をマンドレルに固定する（デバイスの上方部分）。
２．マンドレル（上方）を、デバイスのチャンバー（下方）部分に、封止ｏ－リングが圧縮されるまで反時計回りに回転させることによって固定する
３．全ての必要な取付け具、チューブ、および空気ベントをデバイス上に配置する
４．チャンバーにＭＮＣを満たす
５．陰圧を、下方マンドレル出口に導入する。
６．チャンバーは、その内部を経て容積の５０％が引き出される。
７．真空を中断する。
８．デバイスを逆にする
９．真空を再導入する
１０．容積の残り５０％を、足場の「上方」部分に引き込む。
１１．デバイスを分解し、ここで足場は、埋め込みができる状態になる。

全播種時間は７分（７：０．１±０．０３分）であった。

播種後、播種された足場を、足場の長さに沿って１ｃｍ幅の環に切断し、１２個の環を形成した。各環内の細胞の数をカウントし、そのデータを図５に示す。細胞を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイを使用してカウントし、総数を細胞／ｍｍ^３として提示する。
キャパシタ播種チャンバー

「キャパシタ」播種チャンバーは、足場上でのＭＮＣの分布のばらつきを排除する。デバイスの背後にある中心的前提は、足場全体を可能な限り長くＭＮＣ播種プロセスに曝露することによって、ＭＮＣ勾配を低減させることである。

図４Ａ～４Ｃは、キャパシタ播種チャンバーの例を示す。このチャンバーでは、マンドレルは、そこに取り付けられた足場を有する。次いで足場およびマンドレルのアセンブリを、播種チャンバー内に慎重に配置する。播種チャンバーは、組み立てられたマンドレル／足場アセンブリと比較して非常に狭い。最小限の体積のＭＮＣ溶液を保持するように設計する。均一な播種のための足場とチャンバーの壁との間の最小および最大隙間は、１ｍｍおよび１０ｍｍ、例えば１ｍｍおよび５ｍｍであってもよい。

マンドレルおよびチャンバーを一緒に固定した後、ＭＮＣをデバイス内に導入する。液体が素早くチャンバーを満たし、チャンバーの上方に位置付けられたＩＶバッグ内に「オーバーフロー」する。

ＭＮＣの全体積が播種チャンバーおよびオーバーフロー（キャパシタ）ＩＶバッグの両方に導入された後、真空を適用する。ＭＮＣ液体は足場を通過し始め、液体レベルがＩＶバッグ内で低下するにつれて足場全体がＭＮＣに浸されたままになる。播種プロセスの最後になってから、播種プロセスの終了間際までは、流体がＩＶバッグから完全に排出されることはなく、流体レベルは最終的に播種デバイスの上部を下回る。足場の底部が浸されたままで、足場の上部から流体が排出され、濾過された空気に足場が曝露される時間は、非常にわずかである。このように、足場の上部および底部は、播種プロセスの大部分の全体を通して浸されたままであった。ＭＮＣ溶液のわずかな部分に関してのみ、底部が浸されながら上部が曝露される。したがって播種勾配は、足場の長さに沿って最小限に抑えられる。

キャパシタチャンバーによるグラフトの播種方法
１．ＩＶバッグを満たす
２．チャンバーを満たす
３．チャンバーから空気を抽気する
４．チャンバーに血液を満たし、足場を覆う
５．真空を導入し、真空で足場に流体を引き込む
６．チャンバーから排出させる
７．播種された足場を取り出す

全播種時間は１分１５秒であった。

播種後、播種された足場を、足場の長さに沿って１ｃｍ幅の環に切断し、１２個の環を形成した。各環内の細胞の数をカウントし、データを図５に示す。
結果

結果は、図５にフリップ播種チャンバー（１）またはキャパシタ播種チャンバー（２）のいずれかで播種された足場の均一な播種を示す。

（実施例２）
狭窄の自発的な反転を提供する足場パラメーター。

新生血管形成をシミュレートする計算モデルを開発した。この計算モデルは、マウスモデルでのＴＥＶＧ開発の以前の研究で収集されたデータから、最初に定式化され、２年の期間にわたり新生血管形成について首尾良く記載および予測した。米国臨床試験からのデータの最初の分析、ならびに以前の臨床試験で観察された早期狭窄が介入なしに自然に反転した可能性があることを示唆する計算シミュレーションが提示される。ＴＥＶＧ狭小化の過渡期が発症し、その後に新生血管形成の自然経過の部分として自発的に解消され得るシミュレーション作成提案を試験するために確立された大型動物モデルを使用した実験も提示される。大型動物モデルでの埋め込み後、最長１．５年のＴＥＶＧの変化する幾何形状、組成、および生体力学的性質が特徴付けられる。データは、計算モデルの一次予測を検証した。ｉｎ ｖｉｖｏ観察の、計算モデルからの結果との比較は、モデルパラメーターの値の精密化し、それによって、自家細胞が播種された足場から、成長およびリモデリングが可能な生きている新生血管へのＴＥＶＧの変換の基礎となるメカニズムに対する、増大した洞察を収集することがさらに可能になった。
材料および方法
ＴＥＶＧ
足場の特徴付け

足場を、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して特徴付けた。非埋め込み型足場の試料を軸方向に沿って切断して、０．５ｃｍ平方を創出し、それをカーボンテープでＳＥＭステージ上に取り付けた。試料に、アルゴンガス中の真空下で金をスパッタコーティングして３ｎｍの厚さにし、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ４８００ ＳＥＭで、５ｋＶおよび１０ｍＡで撮像した。画像をＦＩＪＩ画像解析ソフトウェアで解析した。孔径を、１００×の７枚のＳＥＭ画像から計算した。繊維直径を、少なくとも５本のＰＧＡ繊維により平均して計算した。
放出基準およびプロセス後試験

試料を細胞（０．２ｍＬアリコート）から得、足場（５×５ｍｍセクション）に播種し、放出およびプロセス後モニタリングに供した。細胞のカウントおよび生存率を、トリパンブルー色素排除および血球計算盤を使用して行った。ＦＡＣＳを、ＦＩＴＣ－ＣＤ４５および７ＡＡＤを使用して行って、白血球の数および細胞生存率を決定した。播種効力は、血球計算盤を使用して播種前および播種後の溶液から得られた試料中の細胞の数を定量し、次いで播種前および播種後の溶液中の細胞の数の差を、播種前の溶液中の細胞の数で割って計算することにより決定した。
臨床試験
研究設計

このパイロット試験の一次的な目的は、単心室心奇形を持つ患者における心臓外修飾ＦｏｎｔａｎコンジットとしてのＴＥＶＧの安全性を評価することであった。二次的な目的は、ＴＥＶＧの成長の可能性を、その長さの変化を埋め込み後６カ月～３年の間で評価することにより決定することであった。当初の設計は、６名の患者を登録しそれらを連続心エコー検査およびＭＲＩで３年の期間にわたりモニターするためであった。
成長分析

ＴＥＶＧの成長能力を、埋め込み後６カ月および３年間行われた連続ＭＲＩ研究を使用して評価した。ＴＥＶＧの成長能力は、肺動脈吻合へのその最初の分岐から測定された患者のＧｌｅｎｎシャントＳＶＣに対する、長さの経時的な変化を比較することによって、推定した。
安全性の分析

患者を、初期入院中、およびＴＥＶＧ埋め込み後の全ての計画された追跡調査アポイントメント時（術後１、６、１２、２４、および３６カ月）、ならびに任意の計画されていない心臓病学または心臓外科手術のアポイントメントまたは入院で、研究チームが見て評価した。さらにスタディナースは、患者の両親または保護者と毎月、電話により接触して、それらの医学的状態を、標準化された調査を使用して再調査した。全ての有害事象を記録し、それらのグレードおよび帰属を研究チームが決定し、データ安全性モニタリングボードで再調査した。データを分析し、東京女子医大病院（日本）で行われた初期パイロット研究でのグラフト関連合併症の発生率と比較した。
血管形成術

ＴＥＶＧの内腔径の＞５０％の低減と定義される狭窄を発症した患者を、ステント留置なしの血管形成術で処置した。
計算モデル
拘束混合フレームワーク

α＝１、．．．、ｎの構造的に有意な構成成分は、生成および分解の個々の時間変化率ならびに材料特性を備えていたが、全体としてグラフトと共に変形するよう拘束される。したがって、中間時間τで生成された材料に関する現行の成長およびリモデリング時間ｓでの構成成分に特異的な変形勾配は、

であり、式中、Ｆは、バルク材料（即ち、混合物）に関する変形勾配であり、Ｇ^αは、ポリマーであっても細胞外基質であっても新しい母材が外部材料に組み込まれる構成成分に特異的な「堆積ストレッチ」である。（τ）は、個々の構成成分がストレスフリーである自然の構成を示す。変形後にグラフトに保存される弾性エネルギーに関する混合物発現の単純な規則は、構成成分に特異的な保存エネルギーの合計から生じ、即ちＷ＝ΣＷ^αであり、壁の力学の古典的な連続体の定式化を可能にし、Ｃａｕｃｈｙ応力ｔ＝２Ｆ（∂Ｗ／∂Ｃ）Ｆ^Ｔ／ｄｅｔ（Ｆ）（式中、Ｃ＝Ｆ^Ｔであり、Ｆは、右Ｃａｕｃｈｙ－Ｇｒｅｅｎテンソルである）である。成長およびリモデリングプロセスはゆっくりであり、したがって、ｄｉｖｔ＝０が連続体に関するニュートンの運動の第２法則を満たすように、一連の準静的平衡状態を介して記載することができる。各構成成分は展開することができるので、保存エネルギー密度は、

であると解釈され、式中、ρ（ｓ）は全質量密度であり、ρ^α（０）は構成成分αの初期の見かけの質量密度であり、

は、足場内に当初存在した材料の保存エネルギー密度であり、ｍ^α（τ）＞０は質量密度生成速度であり、ｑ^α（ｓ，τ）∈［０，１］は時間ｓで残される時間τで生成された材料の生存割合であり、

は、時間τ∈［０，ｓ］で生成され、

を介して変形された、構成成分αのコホート内で時間ｓで保存されたエネルギーである。細胞および母材構成要素の堆積および分解は、免疫学的および力学的刺激に従い管理され、生成および分解速度は、炎症推進型代謝回転に合わせて増大する。具体的な機能形態を結果に示す。
計算研究

計算モデルを最初に使用して、埋め込まれた臨床ＴＥＶＧの変化する正規化内腔径および壁厚を、マウス実験からの生体力学的および幾何学的データを当て嵌めることにより決定されたモデルパラメーターの値を使用して予測し、シミュレートされたＴＥＶＧの幾何学的（直径／厚さの比、臨床足場に関するＤ／Ｈ＝１６対マウス足場に関するＤ／Ｈ＝３）およびミクロ構造的（臨床足場に関する足場孔径ｒ_ｐ＝４１．９μｍ対マウス足場に関する１１．２μｍ）性質の適切な修正を、臨床およびマウスの足場の相違を説明するために行った。炎症推進型動態はネズミのデータに基づき、免疫応答は極めて重要な役割を狭窄で演じることが公知であるので、４つの重要な炎症パラメーター（δ、β、Κ^ｉ _ｈ、およびΚ^ｉ _ｍａｘ）の、モデル出力に対する効果を、調査した。パラメトリックスタディを、個々の炎症パラメーターの値を変えると共に他の３つのパラメーターを一定に保持することによって、およびその逆も同様に、行った。これにより、正規化直径、壁厚、直径のコンプライアンス、および炎症面質量密度を含む、変化するＴＥＶＧの性質に対する各パラメーターの効果を、単離することが可能になった。直径および厚さを、埋め込まれたＴＥＶＧ足場に関する当初の値によって正規化し；正規化された直径のコンプライアンスを、当初のグラフト直径により正規化された恒常性圧力からの圧力で５０％増大させる直径の変化として計算した。示されるパラメーター（表１参照）は、パイロットシミュレーションに基づいて広範な潜在的生理学的転帰を獲得するように選択した。

種々の構成成分αの生成速度ｍ^αおよび除去速度ｑ^αの変化を介して質量変化を説明するＴＥＶＧ開発の全体的な計算モデル内の重要な方程式は、そのそれぞれが、異物応答に起因して炎症負担（上付き文字ｉ）に、および恒常性標的値からの円周壁応力ｔ_θおよび内腔壁剪断応力τ_ｗの偏差Δに起因して力学生物学的応答（上付き文字ｍ）に依存する可能性がある。４つの重要なモデルパラメーターおよび可能性あるその内の範囲を、免疫適格性のおよび免疫無防備状態のマウスにおける以前の実験から特定して、新生血管形成の可能性ある炎症推進型プロセスに結びつけた。
変化する質量の代謝回転（生成ｍ^α（τ）および除去ｑ^α（ｓ、τ）に起因する）
ρ（ｓ）（グラフト質量）＝ρ^ｐ（ｓ）（ポリマー質量）＋ρ^ｉ（ｓ）（免疫媒介質量）＋ρ^ｍ（ｓ）（力学的媒介質量）
であり、

Ｑ^α（ｓ）∈［０，１］、α＝ｐ、ｉ、またはｍであり、
免疫媒介構成成分に関して

であり、力学的媒介構成成分に関して

である。
大型動物研究
研究設計

この研究の目的は、計算により発生した出力を試験すること、即ち新生組織形成、したがって新生血管発症の、確立されたＩＶＣ介在ＴＥＶＧモデルにおける１年にわたる自然経過を定量することであった。播種されたＴＥＶＧを２４匹の子羊に埋め込み、ｉｎ ｖｉｖｏデータを連続血管造影および血管内超音波を介して、１週、６週、６カ月、および１年で収集した。１週の時点を、ベースライン解剖学的情報に使用し；手術直後の期間と同等のデータを提供したが、動物は、初期の外科的損傷から回復することが可能になり、同じ期間中に埋め込み外科手術および初期カテーテル留置を行うのに必要とされる長時間の麻酔に関連したリスクが低下した。パイロットデータは、６週で著しい狭窄を実証し、計算予測に一致しており、後の時間を長期間にわたるグラフト性能をモニターするのに選択された。主要なエンドポイントは、毎回の血管内超音波撮像でのグラフトの最も狭い断面積であった。研究から除外されるデータはなかった。
大型動物足場

ＴＥＶＧ足場は、Ｇｉｎｚｅ Ｌｔｄ（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）により提供され、臨床試験で使用されたものと同一であった：編まれたＰＧＡコアであり、ＰＣＬＡの５０：５０コポリマーシーラントを含む。
骨髄吸引、アセンブリ、およびＴＥＶＧの埋め込み

２４匹の若い子羊に、骨髄吸引（５ｍＬ／ｋｇ体重）および自家細胞播種済みＴＥＶＧの埋め込みを、胸腔内ＩＶＣ介在グラフトとして受けさせた。動物に、誘導用にプロポフォール（５ｍｇ／ｋｇ）、および維持用にイソフルラン（１～４％）またはプロポフォール（２０～４０ｍｇ／ｋｇ／時）を使用して麻酔をかけた。子羊を側臥位に置き、腸骨稜を覆っているエリアを剃毛し、標準的な滅菌手法で準備した。２ｍｍの切開を行い、吸引針を骨に挿入した。ヘパリン化シリンジ（１００Ｕ／ｍＬ）を使用して５ｍＬ／ｋｇの骨髄を吸引した。

吸引後、骨髄を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配分離を使用して処理して、骨髄由来単核細胞を前述のように単離した。簡単に言うと、骨髄を、１００μｍセルストレーナーに通して濾過して骨棘および凝血を除去した。１：１希釈を、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で実現し、骨髄をＦｉｃｏｌｌ １０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）上に層状化した。血漿および単核細胞層を、遠心分離後に単離した。単核細胞層を、ＰＢＳで２回洗浄して細胞ペレットを得、これを２０ｍＬのＰＢＳで希釈して足場に播種した。単核細胞を、足場上に真空播種し、血漿中で、埋め込みの時間までインキュベートした。

足場を胸腔内ＩＶＣに前述のように埋め込んだ。子羊を左側臥位に置いた。各動物の解剖学的構造に応じて、右開胸を第５または第６肋間腔で行い、胸部ＩＶＣを、横隔膜と右心房との間で解剖した。大静脈心房シャントを、ＩＶＣのクロスクランプ中に潅流が維持されるように配置した。血管をクランプ留めし、直径に一致し播種された足場の２ｃｍセグメントを埋め込み、連続非吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して端々吻合を行った。生来の血管は除去しなかった。チタン血管クリップを縫合糸の尾部に適用して、術後撮像用に吻合をマークした。胸壁、覆っている筋肉、および皮膚層を、吸収性縫合糸で再度近付けた。
介入撮像

術後カテーテル留置を、１週、６週、６カ月、および１年で行った。追加の撮像を、動物の臨床状態に基づき必要に応じて行った。鎮静および挿管後、子羊を左側臥位に置いた。右内頸静脈をカニューレ処置し、９－Ｆｒｅｎｃｈシース（Ｔｅｒｕｍｏ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ）を挿入し、その後、ヘパリンの静脈内ボーラス（１５０Ｕ／ｋｇ）を行った。５－Ｆｒｅｎｃｈ ＪＲ ２．５カテーテル（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ、ＩＮ）を、ＳＶＣを経て右内頸静脈に通し、右心房に入れた。次いで角度の付いたＧｌｉｄｅｗｉｒｅ（Ｔｅｒｕｍｏ）を使用して、ＪＲカテーテルをＴＥＶＧに通して腹腔内ＩＶＣに入れ、そこでＲｏｓｅｎ交換ガイドワイヤ（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ、ＩＮ）を留置した。次いでＪＲカテーテルを５－Ｆｒｅｎｃｈマルチトラック血管造影カテーテル（ＮｕＭｅｄ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＮＹ）に交換し、これを使用して腹腔内ＩＶＣ、ＴＥＶＧの下および上の胸腔内ＩＶＣ、およびＴＥＶＧ内の血行動態圧力を測定した。平均圧力勾配は、ＴＥＶＧの上の平均圧力をＴＥＶＧの下の平均圧力から差し引くことによって計算した。次いでデジタル血管造影を、イオベルソール６８％（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）を腹腔内ＩＶＣに位置決めされたマルチトラック血管造影カテーテルに通して注入することによって、得た。直径を７点で：腹腔内ＩＶＣ、下部胸腔内ＩＶＣ（ＴＥＶＧの横隔膜側）、近位吻合（血流に対して定められる）、中間グラフト、遠位吻合、上部胸腔内ＩＶＣ（ＴＥＶＧの心房側）、および最も重篤に狭小化しているエリアで、測定した。近位および遠位吻合は、前述の外科的に留置された放射線不透過性クリップにより特定された。０．０３５インチのデジタル血管内超音波カテーテル（Ｖｏｌｃａｎｏ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、グラフト内で、Ｒｏｓｅｎガイドワイヤの上を前進させた。これを使用して、血管造影中に測定された同じ７点で画像を得た。これらの画像を、Ｖｏｌｃａｎｏソフトウェアを使用して分析して、前述のような断面積を得た。

インプラントでのサイズ適合グラフトに対する要件に起因して、血管造影およびＩＶＵＳデータをそれらのそれぞれの１週間測定値に対して正規化し、したがってグラフト狭窄は、１週間でのベースラインの中間グラフトサイズに対する倍率変化として表され、即ち

であった。

ＴＥＶＧ内での新生組織の発生を、血管内超音波を使用して測定し、ＴＥＶＧの直径のパーセンテージとして報告した。ＩＶＵＳ撮像データのグラフ再構築を、Ｒｈｉｎｏ ３Ｄ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して行った。
安楽死

処方されたエンドポイントで、動物をケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）およびジアゼパム（０．０２～０．０８ｍｇ／ｋｇ）で深く鎮静させ、その後、両側気胸および失血を誘発させた。完全な獣医学的剖検を、ＴＥＶＧ外植時に行った。動物は、致命的な狭窄が生じた場合にも安楽死させ、ここでは全身症状を伴うグラフト狭小化と定義した。致命的な狭窄に関して安楽死させなかった動物は、埋め込み後６カ月（ｎ＝５）および１２カ月（ｎ＝２）で安楽死させた。残りの動物は、長期追跡調査のために生存させ、３匹は、後期力学的試験のために１８カ月で安楽死させた。
新生組織構造の特徴付け
組織学および免疫組織化学

ＴＥＶＧ外植を、４％ホルマリンで固定し、脱水させ、パラフィン内に包埋し、その後、中間グラフトの４μｍ横断セクションを調製し、スライド上に載置し、熱固定した。標準技法を、ヘマトキシリンおよびイオシンとＰｉｃｒｏ－Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色に採用した。免疫組織化学を使用して、マクロファージ抗原ＣＤ６８（ＣＤ６８、１：５００、Ａｂｃａｍ）およびアルファ平滑筋アクチン（ａＳＭＡ、１：２０００、Ｄａｋｏ）を検出した。試料に、Ｄａｋｏ標的賦活液（９０℃、ｐＨ６．０）で熱誘発型抗原賦活を行い、その後、内因性ペルオキシダーゼ活性（Ｈ２Ｏ中０．３％Ｈ２Ｏ２）および非特異的結合（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒ中３％の正常なヤギ血清、ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）をブロックした。一次抗体のインキュベーション後、セクションを適切なビオチニル化二次抗体（１：１５００、Ｖｅｃｔｏｒ）およびストレプトアビジン－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ）中で逐次的にインキュベートした。ＤＡＢ＋基質色素原（Ｖｅｃｔｏｒ）を、発色に使用した。全ての試料を、Ｇｉｌｌのヘマトキシリン（Ｖｅｃｔｏｒ）で対比染色し、その後、脱水しカバースリップした。
画像の定量

組織染色の顕微鏡写真を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量した。Ｐｉｃｒｏ－Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色検体に関し、タイル化された２５×倍率画像を使用して、血管エリア全体を獲得した。目的のエリアを、Ｃｏｌｏｒ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄコマンドを使用して定量した。免疫組織化学的に染色されたスライドに関し、４つの代表的なタイル化画像を血管の周りで１００×で撮影し、それぞれは、グラフトまたは生来のＩＶＣのセクションの全幅を獲得した。画像をカラーデコンボリューションおよび閾値コマンドを使用して評価して、陽染された面積を定量するかまたは陽性細胞をカウントした。
二軸力学的試験

ＴＥＶＧならびに隣接する近位および遠位胸部ＩＶＣを含む複合検体を、子羊の埋め込み後１８カ月で、右心房から横隔膜まで切開し（５９．３±１６．２ｍｍ）、次いで鈍的切開により血管周囲の組織を取り除いた。検体を、通例のアクリルカニューレでカニューレ処置し、通例のコンピューター制御試験デバイス内に取り付け、Ｈａｎｋ緩衝生理溶液に室温で浸漬した。外径を、ビデオカメラを使用して測定し、長さを、ステッピングモーターを介して規定し；内腔圧および軸力を、標準のトランスデューサーを使用して測定した。検体を、５ｍｍＨｇの圧力で低流量下、１５分間平衡にし、次いで６サイクルの加圧（１～３０ｍｍＨｇ）で予め調整し、共にｉｎ ｖｉｖｏ軸伸長の固定値で行った。受動的データの獲得は、軸伸長の３つの異なる固定値での（ｉｎ ｖｉｖｏ値の９５％、１００％、および１０５％）、周期的圧力直径試験（１．５から３０ｍｍＨｇ）からなった。各プロトコールの非負荷曲線からのデータを、分析に使用した。
計算モデルの検証

変化するヒツジＴＥＶＧに関するデータを集め、予測された（以前のマウス研究からのパラメーターに基づいて）幾何形状と測定された変化する幾何形状との間の差に留意した後、非侵入型最適化技法、以前に詳述されたＳｕｒｒｏｇａｔｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋを使用して、４つの重要な炎症パラメーターの値を特定して、血管内超音波により測定されるように埋め込みの最初の年を通して子羊のグラフトの変化する正規化内腔径および壁厚を獲得した。血管内超音波は非円形グラフト断面を示したので、ＴＥＶＧの水力直径は、当て嵌めプロセスに関する面積測定値から計算した。Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋの最適化に関する境界は、パラメトリックスタディにより知らされた。計算モデルを検証するために、１８カ月で測定されたＴＥＶＧのコンプライアンスと、成長およびリモデリングモデルから予測されたものを比較した。
統計分析

統計分析を行い、グラフを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して作成した。日本対米国の臨床試験における早期狭窄の発生率の比較を、両側Ｆｉｓｈｅｒの正確検定を介して行った。ヒツジ研究からの連続測定値（血管造影およびＩＶＵＳ）は、対になった１週間の値に最初に正規化して、埋め込みで使用される様々な足場サイズを制御して、生来の血管または埋め込み手技の結果としての様々な解剖学的狭小化の程度とのサイズの一致を確実にし、したがってそれぞれの１週間の測定値に対する倍率変化として表される。圧力測定または正規化血管造影およびＩＶＵＳ値を、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定による通常の一元配置ＡＮＯＶＡを使用して分析した。組織形態計測的なおよび顕微鏡写真データ（壁厚、ａＳＭＡ＋面積分率、ＣＤ６８＋細胞／ｍｍ^２、およびコラーゲン面積分率）を、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定による通常の一元配置ＡＮＯＶＡを介して分析した。全ての統計検定では、αは０．０５に制限し、ｐ値＜０．０５は統計的に有意とみなした。
倫理的コンプライアンス
臨床試験

治験審査委員会の承認は、エール大学から得られた（ＨＩＣ ＃０７０１００２１９８およびＮａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＩＲＢ１２－００３５７）。この臨床試験は、臨床試験の実施基準ガイドラインに準拠してＦＤＡ ＩＤＥ １４１２７の下で行った。
ヒツジ研究

Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨは、プロトコールを再調査し、承認した（Ａｒ１３－０００７９）。動物ケアスタッフの代表者が、術中およびその術後過程中に全ての動物をモニターした。動物のケアは、the Care and Use of Laboratory Animals (2011)において公衆衛生局、国立衛生研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）により公表された人道ガイドラインの範囲内、および動物福祉法に記載されるＵＳＤＡ規制の範囲内であった。
結果
ＴＥＶＧの設計および特徴付け

ＴＥＶＧを、自家骨髄由来単核細胞を播種することにより生分解性管状足場上に組み立てた。足場（Ｇｉｎｚｅ Ｌｔｄ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を、ポリ（グリコール酸）繊維（ＰＧＡ）と、５０：５０のモル組成で開環重合により合成されたカプロラクトンおよびラクチドのコポリマー（ＰＣＬＡ）とから作製した。ＰＧＡ繊維をチューブに編み、内面および外面をＰＣＬＡ溶液でコーティングし、次いで真空下で凍結乾燥し、多孔質スポンジ内に包埋された、編まれたＰＧＡ繊維の母材を創出した。

足場は、およそ６カ月間にわたる加水分解によって分解するように設計した。足場の寸法は、内径が１６±０．５ｍｍまたは１８±０．５ｍｍのいずれか、長さが１３±０．５ｃｍ、および壁厚が０．７±０．１ｍｍと測定された（図１Ａ）。内面の定量的走査型電子顕微鏡法は、平均孔径が４１．９±２．７μｍ、多孔度が０．８７±０．０１であることを明らかにした。外面では、平均孔径が３６．４±６．６μｍであり多孔度が０．８６±０．０２であった。ＰＧＡ繊維束を横糸パターンに編み、軸方向で層間の距離は１ｍｍであり、円周方向に走るピーク間は１ｍｍであった。平均ＰＧＡ繊維直径は、１５．８±１．０μｍと測定された。ＴＥＶＧを、適正製造基準（ＧＭＰ）の規制に準拠して組み立てた。骨髄（５ｍｌ／ｋｇ体重）を外科手術当日に採取し、単核細胞画分を、Ｆｉｃｏｌｌ内で密度遠心分離を使用して分離した。米国臨床試験では、この手順により平均して２０．６×１０^６（範囲１９．０～２２．２×１０^６）の単核細胞を得、平均細胞生存率９２．６％（範囲８６．５～９６．８％）であった。フローサイトメトリーは、これらの細胞の７８．３％（範囲７３．２～８５．３％）がＣＤ４５＋であることを実証した。次いでこれらの細胞を、通例の真空システムを使用してポリマー足場に播種し、これにより、４２．７％（範囲２３～６１．４％）の平均播種効率を得た。播種された足場を、自家血漿（密度勾配遠心分離後に非単核細胞画分から得た）中で２時間インキュベートし、その後、ＴＥＶＧが組み立てられたのと同じ日に血管足場として埋め込んだ。臨床試験で使用した全てのＴＥＶＧは、放出およびプロセス後モニタリング基準を満たした（表２）。

ＴＥＶＧの臨床性能

ＦＤＡに承認された臨床試験は、修正されたＦｏｎｔａｎ手術を受ける単心室心奇形を有する子供の、下大静脈（ＩＶＣ）を肺動脈に接続する血管コンジットとして使用した場合の、ＴＥＶＧの安全性および成長能力を評価した（図１２および表３）。

成長能力を、埋め込み後６カ月および３年で行われる連続磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）研究を使用して評価した。ＩＶＣが、その直径をその瞬間その瞬間で変化させる容量血管であることに留意して、内部対照のものに対する経時的なその長さの変化を比較することによるＴＥＶＧの成長を、推定した：肺動脈に吻合したときの上大静脈（ＳＶＣ）（Ｇｌｅｎｎシャントと呼び、これはＦｏｎｔａｎ手術の構成要素である）。４つのＴＥＶＧは、埋め込み後６カ月～３年の間で長さが２．５ｍｍ増大し（範囲１．１～４．２ｍｍ）、それに対してＧｌｅｎｎシャントは同じ期間中に長さが１．５ｍｍ増大した（範囲０．９～２．４ｍｍ）。ＴＥＶＧおよびＧｌｅｎｎシャントの長さの増大平均パーセントは、共に７％であった。

安全性の分析は、３年の研究中、グラフト関連の死亡、最悪のグラフト不全、またはグラフトの置換えを必要とする合併症がないことを実証した。４名の患者は全て、埋め込み後４～７年間、順調であり続けた。しかしながら４名の患者うち３名は、致命的な狭窄（グラフト直径の＞５０％が狭小化）を発症し、埋め込み後５～８カ月での血管形成術により首尾良く処置された。追加のグラフト関連合併症はなかった。登録は、早期ＴＥＶＧ狭窄のこの予期せぬ高発生率に起因して、意図した６名の代わりに４名の患者で制限され：米国での試験では４名の患者うち３名（７５％）が狭窄を発症し、血管形成術で処置され、一方、当初の日本での試験では、２５名のうち１名のみ（４％）が狭窄を発症し、埋め込み後３年以内に血管形成術を必要とした（両側Ｆｉｓｈｅｒの正確検定、ｐ＜０．０１）。

図１２は、先天性心臓外科手術における組織工学的血管グラフトの臨床使用を調査する、パイロット研究に関する流れ図を示す。研究目的は、以下の通りであった。このパイロット研究の一次的な目的は、単心室心奇形の緩和処置のために心臓外両大静脈肺動脈吻合術（ＥＣ ＴＣＰＣ）を必要とする小児科患者における、大きい直径、高い流量、低圧コンジットとして、組織工学的血管グラフトを使用する安全性を決定することであった。二次的な目的は、連続磁気共鳴血管造影を使用して組織工学的血管グラフトの成長の可能性を決定することであった。試験設計は下記の通りであった。この調査は、ＥＣ ＴＣＰＣ用のコンジットとして組織工学的血管グラフトの使用の安全性を決定する、将来性のある非無作為化第１相臨床試験であった。適格性基準：機関での調査の過程でその先天性心奇形の緩和のために修正されたＦｏｎｔａｎの終了のためにＥＣ ＴＣＰＣを受ける候補とみなされた全ての患者は、試験での登録が考慮された。年齢、性別、または人種に基づいて患者を排除しなかった。組入れ基準は、志願し、インフォームドコンセントがなされたＥＣ ＴＣＰＣの候補である単心室奇形を有する患者を含んでいた。除外基準：除外基準は、緊急／救急手術状態、大染色体奇形、ペースメーカーの必要性、４ｕｍ^２ _２（ｕ＝Ｗｏｏｄの単位）よりも大きい肺血管抵抗、異常静脈ドレナージ（妨げられたＩＶＣ）、中程度から重度の房室弁逆流の存在、または他の重大な医学上の問題を含んでいた。調査者の意見では、任意の他の状態の履歴または他の重大な医学上の問題は、プロトコールで指定された手順に対するコンプライアンスを除外した。研究施設：この単一の機関研究は、Ｙａｌｅ－Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌで開始されたが、その後、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌに移った。データハウジング施設は、現場にある（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）。評価項目：研究の主要なエンドポイントは、グラフト不全率ならびにグラフト関連罹患率および死亡率の決定を含んでいた。グラフト不全は、外科的または血管内介入を必要とする、任意のグラフト狭小化／閉塞または拡張／破裂と定義された。グラフト関連罹患率および死亡率は、処置を必要とし、調査者により決定されかつデータ安全性モニタリングボードにより確認された組織工学的血管グラフトにより引き起こされる可能性が高いと考えられる、任意の血栓塞栓性または感染性事象などの任意の術後合併症を含んでいた。試料サイズ：初期プランは、合計６名の患者を登録するためであった。より高い狭窄発生率が予測よりも経験されたので、研究は、合計４名の患者で終了した。これらの血管グラフトを受ける患者の中での有害事象の率を見るためのパイロット研究であったので、研究では、試験を追加しなかった。研究日：Ｙａｌｅ大学附属のＹａｌｅ Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌにある間、２００９年１２月にＦＤＡの承認を受け、２０１１年８月に最初の患者に埋め込んだ。研究は、２０１２年９月にオハイオ州立大学附属のＮａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌに移った。機関施設で必要とされる検査の終了後、２０１４年３月に登録を再開し、２０１７年８月に全ての臨床追跡調査を終了した。研究終了：より高いＴＥＶＧ狭窄発生率が、日本での当初のパイロット研究に基づいて予測されたよりも臨床試験で経験された。これらの知見に基づいて、研究を自発的に保留し、非公開ＤＳＭＢ会議を要求した。ＤＳＭＢは、その後も開催され、一時的に研究を保留し、データを再評価することが推奨された。試験登録：ＮＣＴ０１０３４００７。
新生血管発生の計算モデルの構築

モデルのための基準として軟組織の質量の変化および微細構造の変化について記載するために、全般的な拘束混合理論を使用した。経時的な、マウスに埋め込まれたＴＥＶＧの変化する幾何形状、組成、および力学的性質をシミュレートする計算モデルは、以前に開発された。モデルは、分解性ポリマー足場、血管新生組織の組織化、および新たに生成されたコラーゲンが占める細胞外基質を、別の構造的に有意な構成成分とみなした。具体的に、データドリブン構成的関係は、α＝１、２、．．．ｎ構成成分のそれぞれに関する固有の材料特性、ならびにそれらの個々の生成および除去率を定義し：ｎｅｏＨｏｏｋｅａｎ関係は、ポリマーの力学的挙動について記載し、Ｆｕｎｇ－指数関数的関係は新生組織の関係について記載し、質量密度生成率ｍ）τ＞０は、壁内応力などの力学生物学的刺激、および免疫生物学的刺激に依存し、マクロファージ侵襲に比例し、除去は、時間ｓで保持される時間τ∈［０，ｓ］で生成された材料のパーセンテージを追跡する生存関数ｑ）ｓ、τ∈［０，１］を介して定義される。例えば、恒常的状態からの壁内応力の偏差は、血管細胞が典型的には力学生物学的恒常性を促進させるので、力学的媒介型動態を規制し、一方、足場微細構造は、走査型電子顕微鏡法から定量されるように、細胞浸潤に十分な孔径がマクロファージ活性および表現型に極めて重要なレギュレーターであるので、炎症推進型動態をモジュレートする。

免疫適格性のおよび免疫無防備状態のマウスの以前の研究は、炎症推進型細胞外基質を堆積および分解を制御する４つの重要なモデルパラメーターを特定した（表１）：δは、炎症応答の発生および持続時間をモジュレートし、βは、生成機能の歪みを制御し、Κ^ｉ _ｈは、炎症性細胞外基質生成および分解の速度を制御し、Κ^ｉ _ｍａｘは、細胞外基質分解の炎症効果の規模を拡大縮小し、その生成は、

により与えられ、

は、炎症によって推進される母材構成成分αの生成の基本比率であり、

は、分解性ポリマーに対する異物応答の発生および解消について記載するガンマ分布関数での利得であり、γ_ρ（τ）／γ_ｎは、細胞浸潤に関する臨界孔径によって正規化された足場の孔径であり、Κ^ｉ _ｗは、炎症推進型細胞外基質生成に対する基本利得である。炎症性細胞外基質の分解は、一次速度論型減衰によって支配され、

式中、ｋ^ｉ _ｈは速度パラメーターであり、Κ^ｉ _ｍａｘはここでもΚ^ｉ（τ）の最大値である。
新生組織形成のパラメトリックシミュレーション

新生血管発生の無数のシミュレーション（図７Ａ）は、固定された他のパラメーターを保持しながら個々の炎症性パラメーターの値を変えることによって得られた（表１）。これにより、ｉｎ ｖｉｖｏ研究で可能ではないものが－ＴＥＶＧ内半径、壁厚、直径コンプライアンス、および所望の時間経過での新生組織蓄積を含む、重要な臨床パラメーターの変化に対する個々の寄与体の効果を切り離すことを、実現することが可能になった。示されるパラメーター範囲は、より広範な予備研究（示さず）に基づいて、広範な潜在的生理学的転帰を獲得した。全体として、シミュレーションは、臨床試験により示唆されたものと同様の知見、即ち、増大した炎症推進型新生組織の壁の肥厚および管腔の狭小化に起因するＴＥＶＧの早期の狭小化を予測した。しかしながら興味深いことに、モデルは、免疫応答がポリマー分解と共に弱まると共に、狭小化および肥厚の両方に起因して壁の応力が正常な恒常的値よりも十分低く降下するので後続の力学的媒介型新生組織分解が堆積を上回ることにより、そのような狭小化が広範な症例に関して自発的に反転し得ることも、予測した（図７Ａ～７Ｈ）。ＴＥＶＧ狭窄が自発的に反転し得るという見込みは、これまで考慮されてこなかった。したがって計算モデルは、大型動物モデルを使用して実験的に試験した、予測されない転帰を生成した。

図７Ａ～７Ｈでは、各プロットは、δ、β、Κ^ｉ _ｈ、およびΚ^ｉ _ｍａｘのばらつきに関して正規化内腔径（上列）および壁厚（下列）の埋め込み後最長５２週の早期変化に焦点を当て、矢印は、増大する値の方向を示す。内腔径で予測された一時的な低減およびその後の回復が示され、これらの変化は、部分的には、当初は硬いポリマー足場内の管腔に侵入しその後分解する壁の肥厚からもたらされるものであり、したがって、生物学および力学の力学的制御が増大しながら免疫制御が低下する。
ＴＥＶＧ狭窄は大型動物モデルで自発的に反転する

計算モデルの予測を、ヒツジ胸腔内ＩＶＣ介在グラフトモデルで時間経過研究を行うことにより試験した。ヒツジＩＶＣ介在グラフトは、単心室心奇形を有する大型動物モデルがなくかつ構造的に正常な心臓を有する動物に対するＦｏｎｔａｎ手術の性能が過剰な死亡率（＞８０％）を伴うので、Ｆｏｎｔａｎ手術の代理として使用される検証済みのモデルである。サイズが一致したＴＥＶＧを、２４匹の若い子羊に埋め込んだ（図１３Ａおよび１３Ｂ：ヒツジ研究設計および外科的転帰）。ＴＥＶＧモルホロジーを、血管造影および血管内超音波を使用して、全ての生きている子羊において１２～１８カ月の期間にわたり連続的にモニターして、内腔径および断面積を測定した。血管造影は、６週で、重大なＴＥＶＧ狭窄を明らかにした（１週から－０．４８±０．１６倍直径変化、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による：ａ＝０．０５、ｐ＜０．０００１）。予測された通り、狭窄は、血管内介入なしに６カ月で自発的に改善され、全てのＴＥＶＧは、１年およびそれを超えて、開存したままであった。

血管内超音波は、早期ＴＥＶＧ狭小化が、足場の管腔表面での新生組織の付加成長から得られ、したがって壁が肥厚し、管腔が狭小化することを示唆した。６週で、ＴＥＶＧ狭窄は、グラフトの中間遠位セグメントに限局化し（即ち、心臓に近い領域）、一方、近位吻合では変化が見られなかった。定量的血管内超音波評価により、管腔面積が１～６週で著しく減少し（１週の中間グラフト面積から－０．６７±０．１７倍の面積変化、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による：ａ＝０．０５、ｐ＜０．０００１）、狭小化は６カ月で反転し、グラフトは、１年で開存したままであったことが確認された（図８Ａ）。同じ期間中、壁は、６週でその最大厚さに到達し（範囲１．５～４．６ｍｍ、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による：ａ＝０．０５、ｐ＜０．０００１）、次いで１年の時間経過を経て徐々に薄くなった（図８Ｂ）。

各血管造影中の血液動態データも収集した。グラフトを横断する平均圧力勾配は、前述の形態学的変化に従った。勾配は、１～６週で著しく増大し（０．５±０．５対１１．８±５．５ｍｍＨｇ、ｐ＜０．００１）、次いで６カ月までにベースライン付近まで減少した（１．３±２．８ｍｍＨｇ、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による：ａ＝０．０５、ｐ＜０．００１対６週、ｐ＝０．８８８３対１週）（図１４Ａ～１４Ｄ：血管造影、ＩＶＵＳ、および血液動態データ分析）。最大圧力勾配は、最も狭小化したグラフトに対応する傾向があった。狭窄を発症した２２匹の動物のうち２匹（９．１％）は、腹水、嗜眠、および体重減少を含む症状も発症した。これら子羊の両方は、６週で平均圧力勾配＞１９ｍｍＨｇを有し、それらのグラフトは、血管造影において３つの最も狭いものの２つであり、共に最も狭いポイントで４ｍｍ未満の内腔径を測定した。これら２匹の症候性の動物を、安楽死させた。全ての動物における重大なＴＥＶＧ狭窄の形成にも関わらず、狭窄は残りの子羊で解消し、無症候性のままになった。急に閉塞したグラフトはなく、狭窄の結果、死んだ動物はなかった。
計算モデルの検証

パラメトリックスタディは、ヒツジおよび臨床グラフトで使用されるものと同様の足場設計からなるネズミＩＶＣ介在ＴＥＶＧの研究に基づいてパラメーター化されるが、モデルがｉｎ ｖｉｖｏヒツジデータについて記載することもできるか否かを試験した。これらのデータは、ネズミ実験からの多くのモデルパラメーターを使用する全ての時間（Ｒ２＝０．８３）に十分当て嵌まるが（例えば、コラーゲンの力学的性質およびコラーゲン代謝回転の基本比率）、一時的な炎症応答を制御する４つの重要なパラメーターに関してヒツジに特異的な値を発生させた：δ＝０．３２日－１、β＝３．９６、Κ^ｉ _ｈ＝５．１３、およびΚ^ｉ _ｍａｘ＝７２。パラメーターのこれらの最良適合値は、生来の血管の以前の成長およびリモデリング研究におけるように、Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋの最適化法を使用して特定した。種々の計算測定法の中で、特に、狭窄の存在または非存在を決定づける内腔径および壁厚の変化に留意されたい（図８Ａおよび８Ｂ）。
新生血管の細胞組成の変化は計算モデル予測に一致する

経時的なヒツジ新生組織の変化を、組織学および免疫組織化学を使用して特徴付けた。組織学的セクションは、ｉｎ ｖｉｖｏ撮像で観察されたＴＥＶＧの管腔および壁の変化を確認し、一時的な管腔狭小化が主に足場の肥厚化に起因し、部分的には、埋め込み後６カ月で解消するように見える足場の管腔表面での新生組織形成に起因することを検証した。定量的組織形態計測は、壁の肥厚化が埋め込み後６週でピークに達し、計算予測に一致することを実証した（図９Ａおよび９Ｂ）。ａ－平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）の免疫組織化学的染色は、足場の管腔表面に沿って、ならびに足場の内部で、いくらかの陽性細胞を特定し；それらの数は６週で最大であった。管腔表面に沿って形成されるａＳＭＡ＋細胞は、増殖し、ＴＥＶＧ狭窄を引き起こす新生組織に寄与した、平滑筋細胞であると推定された。ａＳＭＡ＋細胞の全体数は早期にピークに達し、計算モデルにより予測される母材の早期過剰増殖生成に十分に当て嵌まる（図９Ｃおよび９Ｄ）。マクロファージ浸潤の程度は、ＣＤ６８に対する免疫組織化学的染色を使用して評価した。定量的免疫組織化学は、６週で最大マクロファージ密度を明らかにした。６カ月を超えると、マクロファージの数は、足場の分解と一致して減少し、やはり計算予測に十分当て嵌まる（図９Ｅおよび９Ｆ）。まとめると、これらの知見は、ＴＥＶＧ狭窄の形成が炎症によって大きく推進されることを示す。
計算モデルは新生血管生物力学を正確に予測する

ポリマー足場および新生組織の力学的寄与の合計（主に新生組織の細胞外基質構成要素によって決定される）は、ＴＥＶＧの生体力学的性質を決定する。足場分解および新生組織形成は、埋め込み後１週、６週、６カ月、および１年で得られたヒツジＴＥＶＧからＰｉｃｒｏ－Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ（ＰＳＲ）染色セクションの偏光画像を使用して特徴付けられ、ＰＧＡ繊維の分解とコラーゲン線維の堆積および成熟の両方が明らかにされた。ＰＧＡ繊維は、埋め込みから１週間後、足場内で高度に組織化されたままであったが、６週で薄くなって早期断片化の証拠を示し始めた。ＰＧＡ繊維のごくまれな薄い個々の断片は、埋め込み後６カ月でまたはそれを超えて見ることができた。対照的に、最小限の染色が、線維性コラーゲンで、１週間で検出された。新生組織中のコラーゲンの総量は、埋め込みから６週後にピークに達し、著しい量の細い（緑）線維が足場の内部およびその管腔表面に沿ってあった。コラーゲン密度は、圧密化され成熟するにつれ、最初の１年にわたって定常的に増大した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。このコラーゲンは、ＴＥＶＧ狭窄に関連ある新生組織の主要な細胞外基質構成要素であるように見えた。コラーゲンは、足場が分解し、壁が薄くなるにつれて、６週～６カ月の間にリモデル化されるようにも見え；６カ月で、コラーゲン線維はオレンジに見え、中程度の太さのものであることを示している。埋め込み後１年で、壁はさらに薄くなり、コラーゲン線維はより太く（赤）、より稠密に見え、正常で成熟した血管コラーゲンを示した。

埋め込み後１．５年で切除されたＴＥＶＧのｉｎ ｖｉｔｒｏ二軸力学的試験は、モデル予測と同様のＴＥＶＧの構造的応答（圧力－直径）を明らかにした（図１０Ｃ）。データへの当て嵌めに基づくのではなく検証ステップとして計算モデルにより予測されたＴＥＶＧの最終的なコンプライアンスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ力学的特徴付けから見出された値にも十分一致した（図１０Ｄ）。重要なことには、計算モデルにおける材料パラメーターの関連ある値は、新生組織生成に関する力学的刺激が高い壁厚および低い直径により減衰されるので、このバルク挙動が新生血管発症の多くの全体を通して力学媒介型母材代謝回転よりも高い炎症推進型母材代謝回転から得られたことを、示唆した。
考察

複合型先天性心奇形の修復でＴＥＶＧの使用を評価する最初のＦＤＡ承認臨床試験は、狭窄が最も広まっているグラフト関連合併症であるが、早期ＴＥＶＧ狭窄の形成は、以前観察されたよりも非常に高い発生率で生じることを確認した。

早期ＴＥＶＧ狭窄の形成の基礎をなす複合免疫学的および力学的プロセスに対する力学的洞察を得るため、新生血管発症の計算モデルを使用して、新生組織形成を制御する多数の極めて重要な因子の相対的な寄与をパラメーター的に研究した。このモデルは、狭窄の自発的解消を予測し、知見は、ヒツジＩＶＣ介在グラフトモデルで再現可能に確認されたものであった。子羊での無症候性ＴＥＶＧ狭窄は、１～１．５年の全研究期間にわたり急なグラフト不全または血栓症なしに、安全にモニターすることができた。利用可能なデータに基づいて、症状およびグラフトを横断する平均圧力勾配は、形態計測変化のみではなくＴＥＶＧ狭窄の臨床有意性を評価する際の主要な基準とすることができた。ほとんどの狭窄は自然に解消したので、過度に侵襲的な介入ではなく適切なモニタリングが前向きな方法になり得る。

まとめると、ヒト臨床試験、計算シミュレーション、およびヒツジ研究と連結させた以前の研究からの結果は、血管構造内でのＴＥＶＧとしての細胞播種済みＰＧＡ／ＰＣＬＡ足場の埋め込みが、経時的な新生血管の炎症推進型、力学媒介型の変化を動かし始めることを示唆する。ポリマーは当初、強力な異物応答を促し、宿主炎症細胞が足場を浸潤する。同時に、足場は部分的に、浸潤血管細胞およびそれらが堆積する新生組織を、ポリマーの構造的一体性が失われるまで血液動態的に課された力学的な力から、遮蔽する。したがって力学生物学的プロセスは、足場の一体性が減じられるにつれて増大するように見え、グラフトの過剰な肥厚に起因する低い壁の応力は分解を引き起こして後続の堆積を上回り、その結果、初期炎症推進型狭窄の前進的解消をもたらす。しかしながら炎症の結果は完全に陰性ではなく；実際に一部の炎症は、早期宿主細胞補充および新生組織形成の基礎をなす。浸潤単細胞／マクロファージは特に、隣接する血管壁から宿主内皮細胞および平滑筋細胞の内殖を誘発させることによって早期新生組織形成をオーケストレーションする。したがって全体的なＴＥＶＧ機能性は、バランスをとったポリマー足場の分解（主に加水分解による）および新生組織の適切な堆積を必要とする。初期の硬いポリマー足場から、新生組織を構成する細胞－母材複合体への、負荷移動のタイミングを同時に最適化しながら、炎症を促進させしかし制限することが、極めて重要であるように見える（図１１Ａ～１１Ｃ）。

図１１Ａおよび１１Ｂは、足場の埋め込みが異物反応および力学媒介型新生組織リモデリングを誘発させることを示す図である。マクロファージは足場に浸潤する。マクロファージは新生組織形成に必須であるが、過剰なマクロファージ浸潤は狭窄をもたらす。免疫生物学的寄与は、ポリマーが断片化し、分解する間構築し続けるが、ポリマーが消失するにつれて治まり始め；同時に、平滑筋細胞が、細胞外基質をリモデリングすることによって血液動態環境の力学的刺激に応答して、力学的恒常性を確立するように応力遮蔽の量を変化させる。血管新生組織の細胞が低い力学的刺激を感知する状況では、細胞は崩壊し、細胞外基質をリモデリングして、力学的恒常性が再確立されるまで応力遮蔽を低減させる。

同様に、高い力学的刺激の状況では、これらの細胞は、細胞外基質を生成およびリモデリングして、力学的恒常性が得られるまで応力遮蔽を増大させる。力学生物学的寄与は、分解性ポリマー足場の応力遮蔽能力が減じられるときに構築し続ける。埋め込み後の最初の６カ月間の間、マクロファージによる新生組織形成のオーケストレーションが、細胞遊走および細胞外基質生成を推進するパラ分泌シグナル伝達を通して生じる一方、足場分解および損失後、その生体力学的一体性、動態は、新生組織の堆積および分解を介してそれらの局所力学的環境を感知し応答する血管細胞の能力によって、媒介される。足場の力学的一体性の損失はその消失に、したがって新生組織代謝回転に対する炎症および力学的寄与における重なりに先行することに、留意されたい。重要なことには、炎症推進期間中の新生組織の過剰増殖生成が、正常な恒常性標的よりも十分低い新生組織壁応力をもたらし、したがって堆積を上回る新生組織の力学的媒介型分解を促進し、狭窄の自然な解消に寄与することである。

結論として、この研究は、先進計算モデリングとモデル推進型臨床前実験とを、橋渡し研究で組み合わせる有用性を強調した。グラフト性能を最終的には決定する新生組織の幾何形状、組成、および生物力学的な変化を正確に予測することができる堅牢な計算モデルを創出するためのフレームワークが、開発された。結果は、時期尚早に研究の終わりをもたらした、臨床試験で観察された早期狭窄が、血管形成術なしに自発的に解消した可能性があることを示唆した。計算シミュレーションは、関連ある炎症および応力遮蔽を低減させるため、足場の設計（繊維直径、繊維のアライメント、多孔度、および孔径を含む）を変化させることによって、狭小化の程度および持続時間を低減するように足場を修正することができることを予測した。

Claims (39)

1. 閉鎖型使い捨て細胞播種システムにおける使用のための細胞播種チャンバーであって、
   幅および長さを有するハウジング、
   前記ハウジングに挿入可能な吸引棒、および１つまたは複数の側方流体ポートを含む、キャップ、
   前記吸引棒上に位置決めされるマンドレル、ならびに
   ベース部
   を含み、
   前記ハウジングが、その長さに沿った可変の幅、または前記吸引棒もしくは前記マンドレルと前記ハウジングとの間の隙間を有する、細胞播種チャンバー。
2. 前記マンドレルが多孔質マンドレルである、請求項１に記載の細胞播種チャンバー。
3. 前記吸引棒または前記マンドレルと前記ハウジングとの間に、約１ｍｍ～３０ｍｍの間、好ましくは約１～約２０ｍｍの間、約１～約１０ｍｍ、または約１～約５ｍｍの隙間を有する、請求項１または２に記載の細胞播種チャンバー。
4. 前記ハウジングが、前記ハウジングの長さに沿って可変の幅を有する、請求項１または２のいずれか一項に記載の細胞播種チャンバー。
5. 前記ハウジングが、前記ハウジングの長さの約３０％～６０％の間に位置決めされた最大幅を有する領域を有する、請求項４に記載の細胞播種チャンバー。
6. 側方ベントポートを有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞播種チャンバー。
7. 前記マンドレルと前記ハウジングとの間に足場を受容するために構成された、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞播種チャンバー。
8. 狭窄の自発的な反転を誘発させるための内面構造および外面構造を含む、ポリマー生分解性血管グラフトまたは足場であって、前記血管グラフトまたは足場内での細胞の均一な分散を可能にする、ポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
9. 軸方向に配置構成されたポリマー繊維層、および円周方向に配置構成されたポリマー繊維ピークを含む、請求項８に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
10. 前記内面に平均孔径を、および前記外面に異なる平均孔径を含む、請求項８または９に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
11. 約３５μｍ～５０μｍの間、好ましくは約３８μｍ～５０μｍの間、最も好ましくは約３８μｍ～４５μｍの間の平均孔径を前記内面に有する、請求項８から１０のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
12. 約２５μｍ～４５μｍの間、好ましくは約２７μｍ～４３μｍの間、最も好ましくは約３０μｍ～４３μｍの間の平均孔径を前記外面に有する、請求項８から１０のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
13. 約０．５ｍｍ～２ｍｍの間、好ましくは約０．５ｍｍ～１．５ｍｍの間、最も好ましくは約１ｍｍの距離を層間に有する、請求項９から１２のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
14. 約０．５ｍｍ～２ｍｍの間、好ましくは約０．５ｍｍ～１．５ｍｍの間、最も好ましくは約１ｍｍの距離をピーク間に有する、請求項９から１３のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
15. 前記内面および／または前記外面の表面積の、約０．６～０．９５の間、好ましくは約０．７～０．９の間、最も好ましくは約０．８～０．９の間の表面多孔度を含む、請求項８から１４のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
16. 横糸パターンに編まれたポリマー繊維を含む、請求項８から１５のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
17. 約１μｍ～約１００μｍの間、好ましくは約１μｍ～約５０μｍの間、最も好ましくは約５μｍ～約３０μｍの間の繊維直径を有する、請求項８から１６のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
18. ポリマーコーティングをさらに含む、請求項８から１７のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
19. 約１４ｍｍ～２４ｍｍの間、好ましくは約１４ｍｍ～２０ｍｍの間、最も好ましくは約１５ｍｍ～２０ｍｍの間の内径を有する、請求項８から１８のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
20. 約５ｃｍ～２５ｃｍの間、好ましくは約５ｃｍ～１５ｃｍの間、最も好ましくは約１０ｃｍ～１５ｃｍの間の長さを有する、請求項８から１９のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
21. ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、多糖、ならびにそれらのブレンドおよびコポリマーからなる群から選択されるポリマーの１種を含む、請求項８から２０のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
22. 埋め込み後、約６カ月以内に実質的に分解する、請求項８から２１のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
23. 自家生存細胞をさらに含む、請求項８から２２のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
24. 前記生存細胞が骨髄単核細胞である、請求項２３に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
25. 抗新生内膜剤、化学療法剤、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、従来の免疫療法剤、免疫抑制剤、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子からなる群から選択される１種または複数の追加の薬剤をさらに含む、請求項８から２４のいずれか一項に記載のポリマー生分解性血管グラフトまたは足場。
26. グラフトまたは足場に細胞を播種するための方法であって、
    ａ） 請求項１から７のいずれか一項に記載の播種チャンバーを、血液または富化細胞を含む流体が入っている槽を含む閉鎖型使い捨て播種システムに接続するステップ、
    ｂ） グラフトまたは足場を前記播種チャンバーのマンドレル上に挿入するステップ、
    ｃ） 前記播種チャンバーに、前記流体を、グラフトまたは足場の約半分まで、重力流および抽気により満たすステップ、
    ｄ） 前記播種チャンバーに前記流体を満たして、前記グラフトまたは足場を覆うステップ、および
    ｅ） 陰圧を導入して、全ての前記流体を、前記グラフトまたは足場へ引き込むステップ
    を含む方法。
27. グラフトまたは足場に細胞を播種するための方法であって、
    ａ） 請求項１から７のいずれか一項に記載の播種チャンバーを、血液または富化細胞を含む流体が入っている槽を含む閉鎖型使い捨て播種システムに接続するステップ、
    ｂ） グラフトまたは足場を前記播種チャンバーのマンドレル上に挿入するステップ、
    ｃ） 前記播種チャンバーに前記流体を満たすステップ、
    ｄ） 陰圧を下方マンドレル出口に印加し、前記チャンバーの約半分まで空にするステップ、
    ｅ） 前記チャンバーを逆にするステップ、および
    ｆ） 陰圧を印加し、上方出口ポートを通して前記チャンバーを空にするステップ
    を含む方法。
28. 陰圧が、シリンジ、ポンプ、または真空源により提供される、請求項２６または２７に記載の方法。
29. 前記グラフトまたは足場が、請求項８から２５のいずれか一項に記載のポリマーグラフトまたは足場である、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記流体が、約１０ｍｌ～２００ｍｌの間の体積を有する、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記流体が、約１０^５白血球（ＷＢＣ）／ｍｌ～１０^８ＷＢＣ／ｍｌの間、好ましくは約１０^６～１０^８ＷＢＣ／ｍｌの間、より好ましくは約１０^６～１０^７ＷＢＣ／ｍｌの間を有する、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記グラフトまたは足場が、１０ｃｍから～１５ｃｍの間の長さを有する、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 播種が、約１分～１５分の間、好ましくは約１分～１０分の間、最も好ましくは約１分～７分の間の期間内に終了する、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記グラフトまたは前記足場には、前記足場の長さに沿って実質的に同様の細胞密度で細胞が播種される、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記細胞密度が、前記足場の長さに沿って、両端の値を含んで、約０．１×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０^５細胞／ｍｍ^２の間、好ましくは前記足場の長さに沿って、両端の値を含んで、約０．１×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０^４細胞／ｍｍ^２の間、最も好ましくは前記足場の長さに沿って、両端の値を含んで、１×１０^３細胞／ｍｍ^２～１０^４細胞／ｍｍ^２の間である、請求項２６から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 対象における術後狭窄を低減させるかまたは予防する方法であって、請求項８から２５のいずれか一項に記載のポリマー血管グラフトまたは足場を前記対象に投与するステップを含む方法。
37. 前記対象が、再狭窄または他の血管増殖障害のリスクがあるかまたはそれを有する、請求項３６に記載の方法。
38. 前記対象が、血管外傷、血管形成術、血管外科手術、または移植動脈症を受けたことがある、受けている、または受けることになる、請求項３６また３７に記載の方法。
39. 前記ポリマー血管グラフトまたは足場が、対照対象と比較して、対象における術後新生内膜形成、狭窄または再狭窄を低減させるかもしくは予防する、血栓症を低減させるかもしくは予防する、またはそれらの任意の組合せである、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。

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