CN114929295A - 产生经接种移植物的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有改进的接种室的封闭式一次性接种系统，这些改进的接种室允许用患者的细胞对支架或移植物进行均匀接种。沿室的长度具有可变宽度或在该支架与室壁之间具有最小间隙的这些接种室通过提供对移植物和支架的更快、更高效且均匀的接种改进了封闭式一次性接种系统的现有接种室。还描述了具有生物力学和结构特性的支架，这些特性允许狭窄和新生组织形成的自发逆转，因为移植物会降解，从而产生无支架的新生血管。

Description

产生经接种移植物的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年11月15日提交的美国临时申请第62/936,225号的权益和优先权，该美国临时申请特此通过引用整体并入本文。
关于联邦赞助的研究或开发的声明
本发明是根据来自美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的授权号HL098228、HL128602、HL128847、HL139996、GM068412以及来自美国国防部(Departmentof Defense)的W81XWH-18-1-0518在政府支持下进行的。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明总体上涉及组织工程化移植物，特别是接种有细胞并被设计成被患者自身组织吸收和替代的移植物以及制备方法的领域。
背景技术
许多复杂的先天性心脏畸形的外科手术治疗涉及植入如
Figure BDA0003723815360000011
和
Figure BDA0003723815360000012
等材料的合成支架。此类应用的常见实例是用于单心室畸形的全腔静脉-肺动脉连接术(total cavopulmonary connection，TCPC)。在一些实例中，这些合成移植物作为支架的使用因进行性阻塞、对感染的易感染和血栓栓塞并发症的风险而复杂化。在所有实例中，对心血管重建的显著限制是合成植入物缺乏生长潜力。对于TCPC，这可能导致次优管理策略，该次优管理策略包含由于患者尺寸或支架尺寸过大而推迟Fontan循环的完成，这导致次优流动特性，如呼气相回流和流动停滞区域。
组织工程化血管移植物(TEVG)通过提供生物降解型支架提供了克服这些问题的潜力，在该生物降解型支架中，自体细胞随着支架聚合物的降解而增生并成熟为生理学功能性血管(Shin'oka等人,《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》,344(7),532-533(2001)；Hibino等人,《胸心血管外科杂志(J Thorac Cardiovasc Surg.)》139(2),431-436.e4322010；Roh JD等人,《生物材料(Biomaterials)》29(10),1454-1463(2008)；Hibino等人,《美国实验生物学会联合会杂志(FASEB J.)》25(8),2731-2739(2011)；Hibino等人,《美国实验生物学会联合会杂志》25(12),4253-4263(2011)；Kurobe等人,《组织工程C部分方法(Tissue Eng Part C Methods)》21(1),88-93(2015))。
人类的临床试验证实了TEVG的生长能力，并且证明了无移植物相关死亡或移植物功能不全(Shin'oka等人,《胸心血管外科杂志》129(6),1330-1338(2005))。然而，本研究的结果还证明，狭窄是主要的移植物相关并发症，影响了接近25％的移植物接受者，其中16％的接受者发展成严重狭窄(管腔直径减小>75％)(Hibino等人,《胸心血管外科杂志》139(2),431-436.e432(2010))。尽管使用TEVG治疗患有先天性心脏病的患者取得有希望的结果，但在临床应用中移植物狭窄的高发生率阻碍了这种技术的广泛使用(Fernandez等人,《化学工程的最新观点(Current opinion in chemical engineering)》3,83-90(2014)；Mcallister等人,《柳叶刀(Lancet)》373(9673),1440-1446(2009)；Wystrychowski等人,《胸心血管外科杂志》60(5),1353-1357(2014))。
此外，在可以推荐TEVG的常规临床使用之前，必须优化TEVG的组装，以使移植物个性化并使制备移植物所需的时间最少化并改进其整体效用(Patterson等人,《再生医学(Regenerative Medicine)》7(3),409-419(2012))。
美国专利第9,090,863号和美国公开第US 2018/0353649号描述了用于用细胞对支架和移植物进行接种的封闭式一次性接种系统(CDSS)。CDSS包含用于容纳支架和移植物以及用细胞接种支架和移植物的接种室。使用美国专利第9,090,863号和美国公开第US2018/0353649号的CDSS接种支架和移植物，提供了沿支架和移植物的长度的非均匀细胞接种密度。
仍然需要改进的接种支架和移植物，其沿支架和移植物的长度具有均匀的细胞密度。仍然需要在植入后诱导可逆狭窄的支架和移植物。
因此，本发明的目的是提供与CDSS一起使用的改进的接种室，这些接种室用于沿支架和移植物的长度的均匀接种细胞，以降低植入后狭窄的比率或预防植入后狭窄。
本发明的另一个目的是提供一种具有改进的接种室的系统，这些接种室用于在支架和移植物上接种细胞，以降低植入后狭窄的比率、预防植入后狭窄或逆转植入后狭窄。
本发明的又另一个目的是提供具有在植入后诱导可逆狭窄的结构参数的支架和移植物。
本发明的又另一个目的是提供一种用于在支架和移植物上接种细胞，以降低植入后狭窄的比率、预防植入后狭窄或逆转植入后狭窄的方法。
发明内容
在临床试验期间发现，沿支架或移植物的长度具有非均匀细胞接种密度的支架和移植物导致在植入后移植物狭窄的发生率增加。已经开发了用于封闭式一次性接种系统的改进的接种室，这些接种室提供了沿支架或移植物的长度接种的细胞的均匀密度。称为“翻转”室和“电容器”室的细胞接种室具有带有侧向端口的盖。该翻转室通常沿其长度具有可变宽度。该翻转室可以在接种期间通过翻转该接种室约一半(180°)来操作。该电容器室通常具有沿其着长度的均匀宽度以及在该支架与该室壁之间的窄间隙。
这些细胞接种室通常包含：壳体；具有一个或多个侧向端口的盖；以及基部。该盖通常具有用于可插入到该壳体中的抽吸杆的开口以及定位在该抽吸杆之上的心轴。
该盖可以包含一个或多个侧向管，该一个或多个侧向管各自连接到侧向端口。这些侧向管通常包含侧向入口管、侧向出口管和侧向排气管，该侧向入口管连接到侧向入口端口，该侧向出口管连接到侧向出口端口，该侧向排气管连接到侧向排气端口。该盖通常具有上光滑表面和下螺纹表面。该螺纹表面将该盖固定到该壳体上。该盖的顶部部分是大致平坦的，并且如果该室被倒置，则该盖可以充当基部。
该心轴通常是穿孔的多孔的心轴。可替代地或另外地，该心轴可以具有任何合适布置的突出部，如彼此平行延伸、螺旋向下、以菱形图案、圆形、锯齿形和/或波浪形布置的轴向布置的突出部。
该细胞接种室的该壳体可以沿其长度具有均匀或可变宽度。该细胞接种室可以在该抽吸杆或该心轴与该翻转室的该壳体之间具有介于约1mm与约30mm之间，更优选地介于约3mm与20mm之间的间隙。该细胞接种室可以在该抽吸杆或该心轴与该电容器的该壳体之间具有介于约1mm与约10mm之间，更优选地介于约1mm与5mm之间的间隙。该壳体可以具有定位于该壳体的该长度的约30％与60％之间的具有最大宽度的区域。例如，具有该最大宽度的该区域可以沿该壳体的该长度定位在约50％(一半)处。该壳体通常具有用于收纳该盖的该螺纹表面的螺纹部分。“翻转”接种室消除了MNC在该支架上分布的可变性。装置后面的中心前提是改变该接种室沿其长度的横截面。该室的形状类似于倒置沙漏(hour glass)的形状，其中在该装置的高度的大约40％处具有凸起(最大横截面)。该装置的顶部和底部两者变窄以容纳心轴，其中该支架安装到该心轴，连同用于零件间隙的非常小的体积和过量的液体。横截面变化的效果是，其有效地减慢MNC穿过该支架的最少接种部分的速度。
还提供了用细胞均匀接种移植物或支架的方法。在一些方面，该方法包含以下步骤：a)将接种室连接到封闭式一次性接种系统，该封闭式一次性接种系统含有具有拥有血液或富集细胞的流体的器皿；b)将移植物或支架插入在该接种室的该心轴之上；c)通过重力流和抽气，用该流体填充该接种室，至移植物或支架的约一半；d)用该流体填充该接种室，以覆盖该移植物或支架；以及e)引入负压以穿过该移植物或支架抽出所有该流体。
在其它方面，该方法包含以下步骤：a)将接种室连接到封闭式一次性接种系统，该封闭式一次性接种系统含有具有拥有血液或富集细胞的流体的器皿；b)将移植物或支架插入在该接种室的该心轴之上；c)用该流体填充该接种室；d)将负压施加到下部心轴出口并将该室排空至约一半；e)倒置该室；以及f)施加负压并且通过上部出口端口排空该室。
通常，该接种室通过该侧向入口端口和该侧向出口端口连接到该封闭式一次性接种系统。该负压可以由注射器、泵或真空源提供。通常，该移植物或该支架是使用最小体积的含有细胞的流体，如体积介于约10ml与200ml之间，优选地介于10ml与150ml之间的血液、骨髓穿刺液或富含单核细胞(MNC)的流体均匀接种的。
附图说明
图1A是展示了用于对细胞和/或移植物，例如如在美国专利第9,090,863号和美国申请公开第US 2018/0353649号中描述的组织移植物进行接种和/或测试的示例性封闭式系统(1000)的图。图1B是展示了可以用于代替图1A所示的接种室(18)的先进接种室(180)的透视图的图。图1C是展示了可以用于代替图1A所示的接种室(18)的接种室(180)的横截面透视图的图。图1D是展示了抽吸杆(230)的透视图的图，该抽吸杆含有可以用于代替图1A中所示的接种室(18)的一体式螺纹顶部(170)。图1E是展示了抽吸杆(230)的横截面透视图的图，该抽吸杆含有一体式螺纹顶部(170)并且还含有在基部(232)处的凹口，该凹口被配置成收纳对应形状的夹持件(600)。类似凹口设置在抽吸杆的顶部处。图1F是展示了夹持件(600)的透视图的图，该夹持件可以用于代替图1A所示的接种室(100)内的O形环(22)。夹持件(600)通常是中空的，具有围绕中空中心(610)的实心壁(620)。任选地，壁(620)含有铰链，以便于打开和关闭夹持件(600)。图1G是展示了图1A所示的接种室(100)内的夹持件(600)的横截面透视图的图。图1H是展示了接种室组合件(200)的不同组件的组装的分解图，该接种室组合件可以用于代替图1A中所示的接种室组合件(100)并且包含抽吸杆(230)、支架(20)、支架夹持件(600)和接种室(180)。
图2A和2B是示出了使用50mL或100mL的骨髓与现有技术的标准封闭式一次性接种系统(美国专利第9,090,863B2号和美国申请公开第US 2018/0353649号)的沿支架长度(cm)的细胞的接种梯度(细胞/mm3，因为支架的厚度为1mm，值表示为细胞/mm3)的条形图。
图3A-3E是示出了具有翻转设计的接种室——“翻转”接种室的组装和使用的图。
图4A和4B是示出了具有电容器设计的接种室——“电容器”接种室的组装的图。图4C是连接到接种系统的经组装接种室的图，包含IV袋、真空源、排水管和抽气管线。
图5是示出了沿在翻转接种室(“翻转”，1)或电容器接种室(“电容器”，2)中接种的支架长度(cm)的均匀接种密度(细胞/mm3)的条形图。
图6是示出了与封闭式一次性接种系统一起使用的心轴的不同结构的图。所示的尺寸为：总长度为130mm，接种区域的长度为120mm，宽度为15mm。
图7A-7H是示出了直径(图7A-7D)或厚度(图7E-7H)随时间(周数)的推移的变化与以下四个关键参数的变化的折线图：δ、β、Ki h和Ki max。示出了针对这四个关键参数的参数研究：δ调节炎症应答的开始和持续时间；β决定炎症时程的形状和偏斜；Ki h控制炎症新生组织产生和降解的峰值速率，并且Ki max衡量炎症对新生组织降解的影响。
图8A和8B是示出了TEVG的管腔直径(图8A)或壁厚度(图8B)随时间(周数)的推移的标绘模型模拟(实线)的折线图，其与在1年研究内获得的水力直径的实际血管内超声实验测量值拟合良好(符号±SD)。
图9A-9F是示出了由过度炎症驱动的新生组织形成引起的狭窄的条形图。定量组织学分析表明，壁厚度(图9A)在植入后6周最大，对应于TEVG壁厚度随时间的推移的模型模拟(图9B)(单向ANOVA与图克多重比较检验(Tukey's multiple comparisons test)：a＝0.05，*p<0.05)。图9C示出了血管新生组织内的aSMA+区域随时间的推移的定量与6周时增加的平滑肌细胞密度的模型预测(图9D)一致(单向ANOVA与图克多重比较检验：a＝0.05，**p<0.05)。类似地，CD68+巨噬细胞染色和定量(图9E)证实显著的炎症与TEVG狭窄的发展相对应(单向ANOVA与图克多重比较检验：a＝0.05，**p<0.05)。这一观察结果也与炎症细胞密度的计算模型预测密切匹配(图9F)。绘制数据表示平均值±SEM。
图10A-10D是示出了准确地遵循计算模型预测的经植入移植物的生物力学性质的变化的图。图10A是示出了与天然IVC(最后一个条形)相比，来自天狼猩红染色(Picro-Sirius Red stain)的总胶原面积分数(％)随时间的推移的定量的条形图(单向ANOVA与图克多重比较检验：a＝0.05，**p<0.005，***p<0.0005，****p<0.0001，图表示平均值±SEM)。图10B是示出了与天然IVC(最后一个条形)相比，TEVG中的厚胶原纤维与薄胶原纤维的比率(％)随时间的推移(平均值±SEM)的条形图。图10C是示出了在体内发展1.5年之后，响应于体外加压的TEVG(归一化直径)的机械行为的实验测量值(符号±SD)与来自计算模型的预测值(实线)一致的图。图10D示出了通过2年的模拟新生血管发展预测的2mmHg到3mmHg移植物顺应性(实线)，其与18个月时的实验测量的顺应性合理一致(符号±SD)。
图11A和11B是示出了支架植入诱导异物反应和机械介导的新生组织重塑的图。图11C是示出了支架降解对炎症驱动和机械介导的新生组织形成的相互作用的计算模型图。在TEVG发展的计算模型中，驱动成分演变质量的因素包含聚合物支架的损失(……)以及炎症驱动的(─·─)和机械生物学介导的(---)新生组织的增益。这些成分中的每个成分的总和(─)确定新生组织的质量密度。
图12是示出了调查组织工程化血管移植物在先天性心脏外科手术中的临床用途的初步研究的流程图。
图13A是示出了绵羊研究的研究设计和在每个时间点分析的动物数量的流程图。图13B是示出了存活率(％)相对于术后天数的绵羊研究的存活率曲线。
图14A-14D是示出了在绵羊研究中经植入TEVG的不同参数的变化的图。使用绵羊模型中的TEVG的血管造影和血管内超声。在植入后1周、6周、6个月和1年，从一只绵羊TEVG的代表性连续血管造影和IVUS图像获得数据，证明在6周时发生严重狭窄，随后在6个月时重塑成明显的新生血管。呈现了来自连续血管造影和血管内超声研究的TEVG的相对管腔直径(倍数变化，直径，图14A)和面积变化(倍数变化，面积，图14B)作为相对于1周的倍数变化在1年内的图，表明TEVG的变窄自发逆转6个月(单向ANOVA与图克多重比较检验：a＝0.05，****p<0.0001，平均值±SD)。1周平均值由水平虚线标识。图14C和14D是示出了研究群组中来自每只动物的六周直径(图14C)和压力(图14D)梯度测量值的图。在研究终点之前，两只动物经历无症状腹水，并且两只动物经历需要安乐死的有症状腹水(正方形)。
具体实施方式
I.定义
术语“组织工程化血管移植物(TEVG)”是指一种被设计成插入身体内用于修复或扩张一个或多个血管，如动脉和静脉的血管移植物或支架。
术语“生物相容的”是指身体通常接受而没有主要免疫应答的材料，该材料能够植入生物系统，例如组织植入，而不引起过度纤维化或排斥反应。
术语“生物降解型”是指物质或材料在暴露于水、酶或在体内环境中时分解的能力。
如本文所使用的，“狭窄”是指管腔直径相对于支架在植入时的管腔直径减小25％或更多。
术语“心轴”是指充当核心的圆柱形装置或管，例如金属棒，可以围绕该核心铸造、模制、锻造、弯曲或以其它方式成形材料，例如用于接种和生长细胞的基质支架。心轴通常在至少一端处是打开的。心轴还可以含有沿其纵轴(即，沿其长度)的孔洞或穿孔。
如本文所使用的，术语“多孔的”是指具有一个或多个开口、孔隙、穿孔或孔洞，这些一个或多个开口、孔隙、穿孔或孔洞可以由液体和/或气体填充或灌注，或者允许液体和/或气体流动穿过其中。
如本文所使用的，术语“自发的”在狭窄逆转的上下文中是指在没有另外的侵入性或非侵入性程序的情况下，如在没有外科手术干预或外科手术矫正的情况下发生的动作。
如本文所使用的，术语“狭窄逆转”是指相对于没有经接种细胞并且被狭窄化的经植入移植物，狭窄减少至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
如本文所使用的，术语“基本上”是指约80％、约85％、约90％、约95％或约98％的量度。
II.用于对TEVG进行接种的系统
A.封闭式一次性接种系统
用于用细胞对TEVG进行接种的系统和其方法在本领域中是已知的。在美国专利第9,090,863号和第US 2018/0353649号(图1A，现有技术)中描述了示例性系统。图1A中所展示的装置是用于接种、培养、储存、运输和/或测试细胞和/或移植物，例如组织移植物的封闭式系统(1000)。在美国专利第9,090,863号和《组织工程化C部分：方法(TissueEngineering Part C:Methods.)》(1):88-93(2014)中进一步讨论和说明了现有接种系统的操作、结构和结果。
通常，用于将细胞接种到组织工程化血管移植物中的系统包含用于产生连接到患者的真空的构件，以便从患者提取生物材料到室或支架中。支架充当温育器，从而允许生物材料的至少一部分与支架接触并相互作用。支架与允许可选择流体从生物材料转移回到患者体内的过滤器/开关组合流体连通。转移回到患者体内的示例性生物材料包含血清、红细胞、血小板、白细胞和组合。从接触支架的流体中提取所选择的生物材料减少了用期望的细胞类型对支架进行接种所需的时间，并且增加了患者的愈合率。
图1A-1H(现有技术)中展示了在c中描述的示例性系统的组成部分。通常，组件包含：
端口(1)或端口(2)
细胞分离液容器(3)
阀(5)
流体管线(51、52、53、54、55、56、57、58a-58d和59)
预过滤元件(4)
流动通道(7)
容器(13)
入口端口(11)
出口端口(14)
阀(10)
接种容器(18)
容器(9)
阀(8)
螺纹盖(17)
入口端口(16)
出口端口(24)
采样端口(19)
排气端口(26)
流体容器35a和35b
端口(25)
真空源，例如泵和调节器(28)
接种组合件(100)
多孔管(20)
支架(21)
夹持件(60)
如在美国专利第9,090,863号和第US 2018/0353649号中描述的，这些组件被互连和使用。
例如，该系统包含用于容纳细胞分离物，例如细胞分离液的容器，如容器(3)。示例性容器包含介质袋或能够被灭菌和/或被气密密封的任何柔性或刚性容器(例如，Gibco-BFL 1L介质袋)。在某些实施例中，细胞分离液容器(3)由能够被灭菌的生物相容的刚性材料，如
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聚碳酸酯、聚氯乙烯(PVC)或不锈钢形成。容器(3)可以具有用于容纳细胞分离液的任何合适的体积，通常小于250ml。在优选实施例中，容器(3)具有至少一个端口，该至少一个端口适于无菌填充和/或分配流体，例如骨髓穿刺液。例如，无菌收集骨髓穿刺液(例如，5ml/kg体重)，并且通过端口(1)或端口(2)传递，例如注射到容器(3)中。
通常，容器(3)具有至少一个入口和一个出口。在一些实施例中，容器(3)包含端口，该端口具有一个或多个阀以允许流体或气体的单向流动。例如，使用图1A中所示的实施例作为参考，端口1可以包含和/或采用可擦洗阀的形式，如无针进入端口。可以使用本领域的技术人员已知的任何合适的联接或紧固构件，例如夹持件、螺钉或鲁尔连接器、压力配件、摩擦配件或联接件，将阀连接到容器(3)和/或可以与和容器(3)连通的流体管线相关联。根据图1A中所展示的系统(1000)的实施例，阀(5)与支架，例如与容器(3)连通的流体管线(51)相关联。任选地，容器(3)包含预过滤元件(4)，例如，包含例如开口或孔结构在例如约40微米到约150微米的范围内的筛网或织造元件。当流体从容器中通过时，此类预过滤元件可以用于去除不令人期望的材料，例如骨屑、凝块和/或脂肪沉积物。
可以在系统中使用的流体的实例包含但不限于灭菌流体、造影介质流体、生物流体、含有细胞的流体、血液、血清、骨髓穿刺液或含有培养基的流体。应当理解，在优选实施例中，在测试、接种和培养期间，流体可以保持在人体温度下，并且可以由近似于人血液粘度的流体构成。近似于血液粘度的溶液的一个说明性实例是具有甘油的盐水。
容器(3)中的流体从容器穿过图1A的流体管线(51)。在优选实施例中，流体通过真空被引导离开容器(3)。在其它实施例中，系统结合了流体泵的使用。流体泵可从多个商业来源获得(例如，由Cole-Palmer公司(Cole-Palmer)制造的Masterflex L/S DigitalDrive蠕动泵)。
流体管线(51)以及系统中的所有其它流体管线(例如，管线52、53、54、55、56、57、58a-58d和59)可以由适于在使用中输送流体或气体的任何类型的医用级、可灭菌、耐用的管材制成。例如，流体管线可以是柔性或刚性塑料。
系统还包含流动通道(7)，该流动通道包含至少一个入口、至少一个出口和至少一个过滤器，该至少一个过滤器包含位于其之间的至少一种过滤介质(例如，安置在过滤器壳体中)。在优选实施例中，过滤器以大致垂直于通过流动通道(7)的流动方向的角度安置，但是在一些实施例中，过滤器可以以大致平行于流动方向的角度安置，例如切向流过滤。在优选实施例中，过滤器适于允许在至少两个方向上流动通过，例如其中第一方向和第二方向大致相反，例如其中流体可以在第一方向上从过滤器的上游表面穿过下游表面，并且流体可以在第二方向上从过滤器的下游表面穿过上游表面。在此实施例的一实例中，细胞分离液在第一方向上穿过具有合适孔径(或目径)的过滤器，其中过滤介质呈大致垂直于流动方向的角度，使得过滤器保留太大而不能穿过过滤器的细胞和/或生物材料。第二流体随后在第二方向上穿过过滤器，这可以将保留的细胞和/或生物材料从该过滤介质中洗掉。可以用于流动通道的过滤器在本领域中是众所周知的，并且包含例如颇尔公司(PallCorporation)。在其它实施例中，过滤器(例如，至少一种过滤介质)具有适于保留细胞，例如骨髓源性单核细胞的孔隙率。在某些实施例中，过滤器包含被设计成基于例如配体-受体相互作用可逆地结合并保留所关注细胞的基质。在其它实施例中，多个过滤器可以串联或并联组装用于如本文所述的系统中。可以设想，该系统和方法可以具有任何数量的期望流动路径和截流装置(shutoff)。液体或气体可以通过正压或负压，如通过注射器、泵或真空源进给通过系统。
在某些实施例中，系统包含用于容纳收集流体的构件。在某些实施例中，构件是容器(13)，如介质袋或能够被灭菌和/或被气密密封的任何柔性或刚性容器(例如，GIBCO-BFL1L介质袋)。在某些实施例中，收集容器(13)由能够被灭菌的生物相容的刚性材料，如特氟龙、聚碳酸酯、丙烯酸、PVC或不锈钢形成。容器(13)可以具有用于容纳收集流体的任何合适的体积。
在优选实施例中，容器(13)具有至少一个端口，该至少一个端口适于无菌填充和/或分配流体，例如骨髓穿刺液滤液或流过。例如，无菌收集骨髓穿刺液(例如，5cc/kg体重)并且传递，例如注射到容器(3)中，并且随后(例如，通过任选的预过滤器(4)并通过流体流动管线(51)和(52))穿过包含过滤器的流动通道(7)。过滤器保留所关注的细胞和/或生物材料，从而允许滤液通过流体管线(53)和(54)以及入口端口(11)流入容器(13)中。在另一个优选实施例中，容器(13)具有至少一个流动端口，例如双向流动端口；然而，容器(13)通常具有至少两个端口。在某些实施例中，容器(13)包含入口端口和/或出口端口。
在图1A中所展示的实施例中，容器(13)包含入口端口(11)和出口端口(14)。在仍另一个实施例中，容器(13)包含端口，该端口具有一个或多个阀以允许流体或气体的单向流动。可以使用本领域的技术人员已知的任何合适的联接或紧固构件，例如夹持件、螺钉或鲁尔连接器、压力配件、摩擦配件等，将阀连接到容器(13)和/或与和容器(13)连通的流体管线相关联。根据图1A中所展示的实施例，系统(1000)包含与流体管线(54)相关联的阀(10)。
在某些实施例中，(例如，在洗脱流体穿过流动通道(7)并且细胞被传递到如下文更详细地提到的接种容器(18)中之后)，包含在容器(13)中的收集流体或滤液通过流体管线(59)和(57)被传递到接种容器(18)(在图1A中)中。
在优选实施例中，流体通过真空被引导离开容器(13)。在其它实施例中，使用流体泵(例如，由Cole-Palmer公司制造的Masterflex L/S Digital Drive蠕动泵，但是本领域的技术人员可以从各种可商购获得的泵中选择)。
在某些实施例中，系统包含用于容纳洗脱流体的构件。在某些实施例中，构件是容器(9)，如介质袋、注射器或能够被灭菌和/或被气密密封的任何柔性或刚性容器(例如，Gibco-BFL 1L介质袋)。
根据图1A中所展示的实施例，系统(1000)包含与流体管线(55)相关联的阀(8)。可以使用本领域的技术人员已知的任何合适的联接或紧固构件，例如夹持件、螺钉或鲁尔连接器、压力配件、摩擦配件等，将阀连接到容器(9)和/或与流体管线相关联。在图1A中，洗脱或洗涤流体通过阀(8)和流体管线(53)、流动通道(7)、流体管线(52)、(56)和(57)被传递到接种容器(18)中。
在一个实施例中，容器(9)是填充有无菌洗脱或洗涤流体的注射器。在图1A中，洗脱或洗涤流体通过流动通道7并且通过阀(8)、流体管线53、52、56和57被传递到接种容器(18)中。在此实施例中，由于通过例如手动地或通过机械和/或电气装置压下注射器柱塞而施加在流体上的压力，流体被引导远离容器9。可替代地，例如，容器(9)可以是可以被压缩的柔性容器。然而，如本领域的技术人员将容易理解的，也可以使用流体泵(例如，由COLE-PALMER制造的MASTERFLEX L/S DIGITAL DRIVE蠕动泵，但是本领域的技术人员可以从各种可商购获得的泵中选择)。
在某些实施例中，系统包含用于容纳细胞接种组合件的构件。在某些实施例中，构件是接种容器(18)，如介质袋或能够被灭菌和/或被气密密封的任何柔性或刚性容器。例如，可以使用GIBCO-BFL 1L介质袋。在某些实施例中，容器18可以由能够被灭菌的任何生物相容的刚性材料，如特氟龙、聚碳酸酯、丙烯酸、PVC或不锈钢构成。接种容器(18)可以具有任何合适的体积。
如图1A中所展示的，接种容器(18)包含刚性材料，该刚性材料含有包含螺纹的主体部分以及螺纹盖(17)。容器(18)至少包含入口端口和出口端口(在图1A中所展示的实施例中，接种容器(18)包含入口端口(16)、出口端口(24)、采样端口(19)(例如，用于从接种容器中无菌采集流体样品，以确定例如微生物污染和/或干细胞计数)以及排气端口(26)，其中盖17(图1A)包含端口)。
接种容器18包含入口端口16和出口端口24，其允许流体灌注和/或循环进入和通过容器。入口端口16和出口端口24也分别用于将容器18附接到流体管线57和58a。流体管线58a将接种容器18连接到一个或多个剩余经接种细胞流体容器35a和35b，同时保持封闭式系统。应当理解，虽然在图1A中仅示出了一个接种容器18，但是流体管线，例如流体管线57或58a可以是分支的，以便将多于一个接种容器并联连接到系统。
用于容纳剩余经接种细胞流体的构件是至少一个剩余经接种细胞流体容器35a、35b，如介质袋或能够被灭菌和/或被气密密封的任何柔性或刚性容器。例如，可以使用Gibco-BFL 1L介质袋。在某些实施例中，容器35a，35b可以由能够被灭菌的任何生物相容的刚性材料，如
Figure BDA0003723815360000121
聚碳酸酯、PVC或不锈钢构成。
在优选实施例中，通过使用具有真空源，例如泵和调节器28的真空组合件通过端口25和流体管线58a将流体从容器18中抽出到剩余经接种细胞流体容器35a中，其中来自泵的负压是通过连接到剩余经接种细胞流体容器35a、35b和接种容器18的流体管线来输送的。
在某些实施例中，接种容器(18)容纳接种组合件(100)，该接种组合件含有多孔管(20)和支架(21)，例如细胞或组织支架或移植物，如血管移植物支架。多孔管(20)可以包含任何合适的刚性材料，如TEFLON、PVC、聚碳酸酯、塑料、金属，例如不锈钢，该材料可以被制成流体可渗透的。如夹持件(60)、O形环或索环等一个或多个保持元件也可以放置在管上，例如在支架(21)的两端处，以在接种、培养、储存、运输或处理期间将支架保持在管上的适当位置。
在某些实施例中，系统是一次性的。封闭式一次性系统允许用于构建组织工程化移植物，例如血管移植物的程序，该程序可以快速进行，同时实现与先前所述的方法(Matsumura等人,《生物材料》2003；24:2303-8；和FDA IDE 14127，该文献通过引用整体并入本文)相比类似的接种效率。另外，系统的使用允许人们在护理点(即，在手术室中排除对支架运输的需要)构建组织工程化移植物，例如血管移植物。
接种系统可以使用接种室700(翻转接种室)或接种室800(电容器接种室)来代替接种容器18。
1.接种室
接种室通常包含：壳体，该壳体具有宽度和长度；具有一个或多个侧向端口的盖；以及基部。该盖通常包含抽吸杆，该抽吸杆可插入到该壳体中；以及心轴，该心轴定位在该抽吸杆之上。通常，该盖的上表面是平坦的。该盖通常不包含上表面上的阀、端口或附件。
在示例性实施例中，接种室基部的半径介于10mm与100mm之间，例如介于约35mm与80mm之间。在示例性实施例中，接种室的顶部的直径介于10mm与100mm之间、介于约25mm与60mm之间，例如为38.1mm。在示例性实施例中，接种室基部的高度介于20mm与1000mm之间、介于约120mm与200mm之间，例如为180mm。通常，接种室孔口的内径介于5mm与90mm之间，例如为25.86mm。接种室壁的典型厚度介于0.5mm与10mm之间，例如为大约2mm。当接种室具有螺纹顶部时，螺纹部分的高度通常为该室总长度的大约10％，例如为20.55mm。心轴、接种室和一个或多个支架夹持件的大小通常对应于血管移植物、接种室的期望大小，并且大小被设定成在接种室内装配在一起。
a.翻转接种室
“翻转”接种室沿其长度具有可变的横截面直径。
该室的形状类似于倒置沙漏的形状，其中最大横截面为装置的高度的大约30％到60％，优选地为约40％。该装置的顶部和底部两者变窄以容纳心轴，其中该支架安装到该心轴，连同用于零件间隙的非常小的体积和过量的液体。通常，翻转室在其最窄部分的横截面直径介于约22mm与25mm之间，包含端值。通常，翻转室在其最宽部分的横截面直径介于约60mm与80mm之间，包含端值。
横截面直径变化的效果是，其有效地减慢MNC穿过该支架的最少接种部分的速度。
另外，用于此设计的心轴具有两个真空结点：一个真空结点以直立取向抽负压，并且一个真空结点以反向取向抽负压。
图3A-3E呈现了示例性翻转接种室。翻转接种室700包含盖710、壳体740和基部730。盖包含侧向端口，如连接到入口管722的入口端口722a以及连接到出口管724的出口端口724a。盖710具有平坦的上表面。盖710可以具有任何形状的上表面。通常，盖的上表面没有端口、管或通风口。
壳体740沿其长度具有可变的横截面直径。壳体的上部10％包含用于收纳盖710的螺纹部分的螺纹。壳体740的底部部分连接到基部730。壳体740可以包含下部心轴出口732和734。还可以存在用于定位O形环以将支架密封到心轴的O形环槽760。
盖710连接到抽吸杆720。多孔心轴750附接到抽吸杆720。该附接可以通过任何手段完成，包含夹持件、螺钉或鲁尔连接器、压力配件、摩擦配件或联接件。
通常，翻转接种室被配置成当被定位在其基部上时或当被定位在其盖上时稳定地保持在竖直位置。这示出在图3D和3E中。
b.电容器接种室
电容器接种室通常是沿管的长度具有一致横截面直径的中空管。通常，电容器室的横截面直径介于约10mm与20mm之间，包含端值。与经组装心轴/支架组合件相比，电容器接种室非常窄。该电容器接种室被设计成保持最小体积的流体。支架与室壁之间的最小间隙和最大间隙可以为约1mm和约5mm。
图4A-4C呈现了示例性电容器接种室。电容器接种室800包含盖810、壳体840和基部830。盖包含侧向端口，如连接到入口管822的入口端口822a以及连接到出口管824的出口端口824a。盖810具有平坦的上表面。盖810可以具有任何形状的上表面。通常，盖的上表面没有端口、管或通风口。
壳体840具有沿其长度的恒定横截面直径。壳体的上部10％包含用于收纳盖810的螺纹部分的螺纹。O形环860可以定位在盖810与壳体840之间。壳体840的底部部分连接到基部830。
盖810连接到抽吸杆820。多孔心轴850附接到抽吸杆820。该附接可以通过任何手段完成，包含夹持件、螺钉或鲁尔连接器、压力配件、摩擦配件、联接件等。
2.心轴
心轴的大小通常被设定成配合在抽吸杆之上。心轴可以通过任何合适的附件固定到抽吸杆或盖。示例性附件包含夹持件、钩和接受心轴宽度的狭槽。心轴可以通过模制或胶合附接到抽吸杆。
心轴可以具有适于收纳血管移植物或支架的任何形状。该心轴通常是穿孔的多孔的心轴。可替代地或另外地，该心轴可以具有任何合适布置的突出部，如彼此平行延伸、螺旋向下、以菱形图案、圆形、锯齿形和/或波浪形布置的轴向布置的突出部。
图6提供了心轴的示例性尺寸。在示例性实施例中，将装配在180mm长的接种室内的心轴的长度介于约120mm与140mm之间，如为约128mm。
B.流体体积、细胞密度和接种时间
移植物或支架的接种通常包含使移植物或支架与含有细胞的流体接触。流体可以是血液、骨髓穿刺液或来自血液或骨髓的细胞提取物。流体的体积可以介于约10ml与200ml之间，如介于约25ml、约50ml、约75ml、约100ml、约125ml、约150ml、约175ml与约200ml之间。流体的白细胞(WBC)浓度通常介于约105个细胞/ml与108个细胞/ml之间，优选地介于约106个细胞/ml与108个细胞/ml之间，更优选地介于约106个细胞/ml与107个细胞/ml之间。
接种后，沿支架的长度，移植物或支架的细胞密度通常介于约0.1x103个细胞/mm2与105个细胞/mm2之间，包含端值，优选地，沿支架的长度，移植物或支架的细胞密度介于约0.1x103个细胞/mm2与104个细胞/mm2之间，包含端值，最优选地，沿支架的长度，移植物或支架的细胞密度介于1x103个细胞/mm2与104个细胞/mm2之间，包含端值。
通常，移植物与流体接触，持续介于约1分钟与15分钟之间，优选地介于在约1分钟与10分钟之间，更优选地介于约1分钟与7分钟之间的一段时间的时间段。在最优选实施例中，接种在约15分钟、约7分钟或约1分钟内完成。
C.具有可逆狭窄的移植物或支架
通常，移植物或支架被定位在心轴与壳体之间。移植物或支架通常是聚合物的和多孔的，由生物降解型聚合物制成。移植物或支架可以具有内表面结构和外表面结构，该内表面结构和外表面结构用于诱导狭窄的自发逆转。移植物或支架可以在其内表面上具有平均孔径，并且不同于其外表面上的平均孔径。例如，内表面上的平均孔径可以介于约35μm与50μm之间，优选地介于约38μm与50μm之间，最优选地介于约38μm与45μm之间。外表面上的平均孔径可以介于约25μm与45μm之间，优选地介于约27μm与43μm之间，最优选地介于约30μm与43μm之间。内表面和/或外表面的表面区域的表面孔隙率可以介于约0.6与0.95之间，优选地介于约0.7与0.9之间，最优选地介于约0.8与0.9之间。
通常，移植物或支架由编织聚合物纤维形成。在一些方面，纤维可以被组织成纤维束。纤维束可以是编织的，如以纬纱图案编织。纤维直径可以介于约5nm与30nm之间。通常，编织图案形成轴向布置的聚合物纤维层和周向布置的聚合物纤维峰。各层之间的间隔可以介于约0.5mm与2mm之间，优选地介于约0.5mm与1.5mm之间，最优选地为约1mm。各峰之间的间隔可以介于约0.5mm与2mm之间，优选地介于约0.5mm与1.5mm之间，最优选地为约1mm。
移植物或支架可以包含纤维聚合物涂层。通常，TEVG或支架的内径介于约14mm与22mm之间，厚度介于0.1mm与3mm之间，并且长度介于约5cm与15cm之间。TEVG或支架通常是生物降解型，并且在植入后约六个月内在很大程度上降解。例如，在植入后六个月，移植物已经减少支架的大于约80％重量、大于约80％表面积或大于约80％厚度。
相对于没有细胞或具有较少细胞的移植物，聚合物血管移植物或支架通常包含有效量的活细胞以减少或预防移植物的术后狭窄。通常，沿支架的长度，移植物以以下细胞密度附着有一定量的活细胞：所述细胞密度介于约0.1x103个细胞/mm2与10x104个细胞/mm2之间，包含端值，优选地，沿支架的长度，所述细胞密度介于约0.1x103个细胞/mm2与10x103个细胞/mm2之间，包含端值，最优选地，沿支架的长度，所述细胞密度介于1x103个细胞/mm2与10x103个细胞/mm2之间，包含端值。
从患者的骨髓获得优选的细胞。在优选实施例中，用活自体细胞接种血管移植物。在特定实施例中，细胞是人骨髓单核细胞。聚合物血管移植物或支架可以包含选自由以下组成的组的一种或多种另外的药剂：抗新生内膜剂、化疗剂、甾体和非甾体抗炎药、常规免疫治疗剂、免疫抑制剂、细胞因子、趋化因子和生长因子。
1.聚合物
TEGV支架可以由一种或多种聚合物形成。在一些实施例中，聚合物是生物降解型。在其它实施例中，聚合物是非生物降解型。在一些实施例中，TEVG由多于一种单一聚合物的混合物形成。当使用生物降解型聚合物时，可以使用生物降解型和非生物降解型聚合物的混合物，例如以根据需要提供持久的TEVG植入体。
在某些实施例中，TEVG是由以无规或对齐的构型组装在织造或非织造网格中的聚合物(均聚物和/或共聚物)纤维形成的三维基质。优选地，纳米纤维材料是FDA批准的生物降解型纳米纤维材料。
支架基质中的纤维可以具有任何期望的大小，但通常介于约1.5mm与1nm之间。在某些实施例中，纤维是纳米级的(即，约1nm到约1000nm)和/或微米级的(约1μm到约1000μm)。
可用于产生用于形成TEVG的支架的聚合物可以是无机的(例如，硅氧烷、硫链、黑磷、硼-氮、硅酮)或有机的(意味着含有碳)。有机聚合物可以是天然的(例如，多糖，如淀粉、纤维素、果胶、海藻胶、植物胶；多肽，如酪蛋白、白蛋白、球蛋白、角蛋白、胶原、核酸和烃)、合成的(如热塑性塑料、未硫化弹性体、尼龙、聚氯乙烯、线性聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氨酯、丙烯酸酯树脂)；热固的(例如，硫化弹性体、交联聚乙烯、酚醛树脂、醇酸树脂、聚酯)以及半合成的(例如，纤维素，如人造丝、甲基纤维素、乙酸纤维素；和改性淀粉))。另外，有用的支架可以包含由水溶性或水不溶性纤维素化合物形成的水凝胶。如本领域技术人员将容易理解的，支架的特定类型和组成将取决于期望的应用而变化。然而，通常优选的是，支架中的聚合物材料是生物相容的(即，将不会引发不想要的免疫反应)。在某些实施例中，支架是生物降解型。示例性可降解聚合物包含聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(原酸酯)、聚(磷腈)、聚己内酯或聚酰胺。在优选实施例中，聚合物是聚(乳酸-乙醇酸)。在一个实施例中，TEVG由生物降解型管状支架形成，该管状支架由聚乙醇酸纤维管制造。该管可以涂覆有共聚物，如50:50聚乳酸(PLA)和聚己内酯共聚物。
在一个实施例中，移植物由可以形成为管状支架的聚合物的毡或片状材料形成。例如，装置可以由挤出的聚合物纤维制造为非织造、织造或编织结构。通常，使用任何织物构造形成聚合物片材，包含但不限于织造物、编织物、编带或长丝卷绕。可以使用如静电纺丝等任何合适的方法来制造非织造或织造的聚合物织物。
选择用于制造聚合物血管移植物的聚合物和制造方法适于产生具有适合用作血管支架的生物力学性质的移植物。对于血管移植物功能来说重要的生物力学性质包含初始爆破压力、缝合线保持强度和弹性。在一个实施例中，聚合物血管移植物的初始爆破压力介于约1,500mmHg与约50,000mmHg之间，优选地介于约2,000mmHg与约10,000mmHg之间。在另一个实施例中，聚合物血管移植物的缝合线保持强度介于约1N与约5N之间，优选地介于约2N与约4N之间。在另一个实施例中，血管移植物的固有弹性介于约10MPa与约50MPa之间，优选地介于约15MPa与约40MPa之间。在另一个实施例中，血管移植物的初始拉伸强度介于约1MPa与约10MPa之间，优选地介于约3MPa与约6MPa之间。
2.细胞
在某些实施例中，TEVG支架包含一种或多种类型的细胞。在一些实施例中，一种或多种类型的细胞包含在TEVG的管腔内、整个TEVG的壁的多孔空间内、TEVG的外部和表面上或组合。通常，细胞直接地或通过一种或多种辅助物质附着到TEVG的表面。在一些实施例中，细胞是自体细胞，源自接种细胞的TEVG的预期接受者的一个或多个组织。在其它实施例中，细胞对于移植物的预期接受者是外源的。细胞可以是未分化细胞，如多能干细胞，或分化细胞。在优选实施例中，细胞是活的人细胞。包含在TEVG中的示例性细胞类型包含白细胞(WBC)，如单核细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞；成纤维细胞；肌成纤维细胞成纤维细胞；平滑肌细胞；骨髓祖细胞；红细胞；胚胎干细胞；和组合。在骨髓中制备白细胞。在特定实施例中，自体骨髓单核细胞(BM-MNC)包含在TEVG内。
可以从多个来源获得与TEVG一起使用的细胞。用于从细胞混合物中分离并且任选地操纵一种或多种细胞类型的方法在本领域中是已知的。在示例性实施例中，从受试者(例如，TEVG的预期接受者)的一根或多根长骨(例如，股骨和/或胫骨)收集骨髓，并且使用密度离心法分离单核细胞(Lee等人,《可视实验杂志(J Vis Exp.)》(88),(2014)；Udelsman等人,《组织工程C部分方法》17(7),731-736(2011))。
a.接种剂量
通常，在具有最小体积的含有细胞的流体(血液、骨髓穿刺液或富含单核细胞(MNC)的级分)的情况下，接种室提供沿移植物或支架的长度的最大均匀接种密度。
通常，接种到TEVG中的细胞的量与术后移植物开放性成正比。因此，在优选实施例中，用足够量的细胞接种TEVG，以有效增强TEVG的开放性或降低术后狭窄的比率。用细胞手动地接种TEVG的方法在本领域中是已知的(Udelsman等人,《组织工程C部分方法》17(7),731-736(2011))。
所接种的细胞的最佳数量可以根据细胞类型和TEVG的大小和形状以及预期用途而变化。TEVG通常与介于1.0x106个细胞与500x106个细胞之间，包含端值，优选地介于3.0x106个细胞与250x106个细胞之间的量的细胞接触。
当接种时，所得接种密度沿支架的长度是均匀的。沿支架的长度，接种密度可以介于约0.1x103个细胞/mm2与10x104个细胞/mm2之间。在优选实施例中，TEVG是以下列密度接种：沿支架的长度，介于约0.1x103个细胞/mm2与10x103个细胞/mm2之间，包含端值，优选地，沿支架的长度，介于1x103个细胞/mm2与10x103个细胞/mm2之间，包含端值。
在一些实施例中，在浓度介于约0.1x104个细胞/ml与10x107个细胞/ml之间，包含端值的溶液中用细胞接种TEVG。细胞溶液的典型体积在介于1ml与100ml之间，包含端值，优选地介于10ml与100ml之间，如10ml、50ml、75ml或100ml的范围内。
优选地，以足以产生介于0.1x103个细胞/mm2与10.0x104个细胞/mm2之间，优选地介于1.0x103个细胞/mm2与10.0x103个细胞/mm2之间的细胞密度的量用细胞接种TEVG。因此，接种室允许使用从患者采集的最少量的骨髓接种移植物或支架，并且实现沿移植物或支架的长度的均匀细胞密度。
当制备自体骨髓单核细胞(BM-MNC)细胞用于接种时，来自5ml/kg骨髓的细胞通常提供足够的接种剂量。从临床角度来看，可以从个体采集高达20ml/kg的骨髓而不会引起显著的不良作用，并且常规地用于采集骨髓进行骨髓移植。
3.另外的活性剂
已经确定，接种有骨髓源性单核细胞的TEVG通过旁分泌效应降低和预防术后狭窄的发生率。细胞接种的优势包含响应于身体的反馈机制的释放信号，不同于不管反馈如何而释放药物的药物洗脱支架。因此，在一些实施例中，接种细胞的TEVG与复制经接种细胞的旁分泌效应的一种或多种基于非细胞的合成或非合成化合物组合使用。
TEVG可以包含另外的活性剂，这些另外的活性剂例如增强细胞对血管移植物的粘附或降低移植物在插入后的术后狭窄的发生率。活性剂包含但不限于抗新生内膜剂、化疗剂、甾体和非甾体抗炎药、常规免疫治疗剂、免疫抑制剂、细胞因子、趋化因子和生长因子。
使用生长因子刺激骨髓生长表示用于增加BM-MNC产量的另外的策略。因此，在一些实施例中，TEVG包含生长因子。用于结合到TEVG中的示例性生长因子包含在对组织损伤的生理反应中释放的刺激胞外基质的沉积的生长因子，如血小板源性生长因子(PDGF)、强效趋化因子和转化生长因子β(TGF-β)。
III.制备方法
A.接种室
接种系统的组成部分中的一个或多个组件部分是定制设计的，使得组合件的大小被最佳地设定成适应TEVG的尺寸。优选地，系统或系统的部分是使用合适材料的3D打印来制造的。在示例性实施例中，图2A-4C中所展示的系统的接种室的组成部分中的一个或多个组成部分是通过合适材料的3D打印来制造的。在特定实施例中，3D打印的组件包含以下中的一个或多个：接种室(例如，接种室700和800)、抽吸杆以及夹持件、盖和心轴。组件可以组装到具有所制造支架的接种室组合件中。接种系统的组成部分的尺寸可以根据所期望的尺寸，例如血管移植物的尺寸而变化。
用于形成接种系统的不同组件的合适材料包含聚合物和金属，所述金属包含但不限于不锈钢、铱、铂、金、钨、钽、钯、银、铌、锆、铝、铜、铟、钌、钼、铌、锡、钴、镍、锌、铁、镓、锰、铬、钛、铝、钒和碳，以及其组合、合金和/或叠层。
B.心轴
在TEVG的形成中使用的心轴可以使用本领域已知的手段来制造。用于制造心轴的示例性方法包含3D打印。在一些实施例中，将最终的心轴设计转换成用于3D制造的合适的计算机可读格式。示例性计算机可读格式是STL格式。用于心轴模型的3D打印的合适材料包含聚合物和金属和碳，以及其组合、合金和/或叠层。在一些实施例中，心轴由可液化材料制成，由此允许心轴以简单的方式从移植物释放。使用可液化心轴还允许形成复杂形状的移植物。
C.制备TEVG的方法
提供了基于模板结构，如定制设计的心轴制造TEVG的方法。TEVG可以使用任何适当的方法来制造，如纤维的静电纺丝、冲压、模板、模塑、织造和组合熔融加工、溶剂加工、浸出、发泡、挤出、注塑模制、压缩模制、吹塑模制、喷雾干燥、挤出涂覆以及纺丝，随后加工成织造的、非织造的或编织构建体。
在一些实施例中，TEVG被制造成包含移植物中的孔。孔可以通过任何合适的方法获得，包含盐浸出、升华、溶剂蒸发、喷雾干燥、发泡、将材料加工成纤维以及随后加工成织造或非织造装置。在优选实施例中，支架的纤维基质包含具有合适大小的孔，以允许细胞粘附和生长和/或分化。由于孔的直径为大约10μm到20μm，因此在某些实施例中期望在此范围内的孔径。优选地，装置的孔的直径介于5μm与500μm之间，更优选地介于5μm与250μm之间，更优选地介于5μm与100μm之间。在某些实施例中，聚合物支架被产生或制造以便更接近地模拟天然胞外基质的结构和组成，从而促进经接种细胞的生长和分化并且促进支架或生长在该支架上的细胞的移植和/或植入。
在优选实施例中，TEVG通过静电纺丝含有一种或多种聚合物的储备溶液来制造。通常，用于制造TEVG的一种或多种聚合物是生物降解型聚合物。
D.接种TEVG的方法
通常，接种室，如室700或800，连接到含有具有细胞的流体的封闭式一次性接种系统。
通常，用于接触移植物或支架的细胞数量可以与移植物的表面积成正比，其中细胞数量介于约1.0x104个细胞/mm2移植物与1.0x106个细胞/mm2移植物之间，包含端值，优选地介于0.7x105个细胞/mm2移植物与7.0x105个细胞/mm2移植物之间，包含端值。在一些实施例中，聚合物血管移植物或支架与介于0.5x106个细胞与500x106个细胞之间，包含端值，优选地介于1.0x106个细胞与100x106个细胞之间的量的细胞接触。在优选实施例中，移植物与细胞接触，持续少于3小时，优选地少于2小时，如约30分钟、约20分钟、约15分钟、约7分钟、约5分钟或约1分钟。接触通常在无菌的封闭式接种室内进行。
用于增加聚合物血管移植物或支架的开放性的方法包含以下步骤：将有效量的活细胞施用到移植物或支架上以减少巨噬细胞对移植物的浸润、促进宿主细胞向移植物的募集或者减少或预防血小板激活。
已经开发了减少或减少或预防受试者的术后狭窄的方法。受试者可以是具有罹患再狭窄或其它血管增生病症的风险或患有再狭窄或其它血管增生病症的受试者。例如，在一些实施例中，受试者已经经历、正在经历或将经历血管创伤、血管成形术、血管外科手术或移植动脉病。相对于未治疗的对照受试者，这些方法减少受试者的新生内膜形成、狭窄或再狭窄，减少或预防血栓形成，或其任何组合。
再狭窄意指经治疗的冠状动脉狭窄随时间的推移的复发。再狭窄最常见地定义为在随访血管造影术(follow-up angiography)(通常6或9个月后)时，在支架内(支架内再狭窄)或在支架内并且包含距支架边缘近侧或远侧5mm(区段内再狭窄)大于50％的管腔再狭窄(二进制血管造影再狭窄(binary angiographic restenosis))。再狭窄可以在PCI(经皮冠状动脉干预)后的1到6个月时间段内在临床上表现出来。
在美国专利第9,090,863号和美国申请公开第US 2018/0353649号中描述了用于将细胞接种到血管移植物或支架中的可定制系统和组合物。
IV.使用方法
通常，接种室用于移植物和支架的快速且有效的接种。然后将经接种支架用于心血管手术，以修复或更换受损血管。
A.使用接种室的方法
1.翻转接种室
使用翻转接种室的方法包含以下步骤。填充该室，施加负压，排出该室50％的体积(此时，支架的底部约50％充满单核细胞(MNC))，中断负压，倒置装置并且重新引入负压，从而允许剩余50％的体积通过支架的“上”半部分被抽出，该上半部分然后也充满MNC。因此，支架的下半部分和上半部分依次充满，从而导致产生具有最小MNC损失(高接种效率)的完全充满的支架。
负压可以由注射器、泵或真空源提供。
2.电容器接种室
使用电容器接种室的方法包含以下步骤。心轴和支架组合件被小心地放置到接种室中。与经组装心轴/支架组合件相比，接种室非常窄。该电容器接种室被设计成容纳最小体积的MNC溶液。细胞接种室可以在抽吸杆或心轴与壳体之间具有介于约1mm与约10mm之间，更优选地介于约1mm与5mm之间的间隙。
在将心轴和室固定在一起之后，将MNC引入到装置中。流体迅速填充室并且“溢流”到位于室之上的IV袋中。在将全部体积的MNC引入到接种室和溢流(电容器)IV袋两者之后，施加负压。MNC流体开始穿过支架，并且当IV袋中的液位下降时，整个支架保持浸没在MNC中。直到接种过程的最后，流体才从IV袋中完全排出，并且液位最终下降到接种装置的顶部之下。仅存在非常少量的时间，在该非常少量的时间中，流体从支架的顶部排出，从而将支架暴露于经过滤空气，而支架的底部保持浸没。因此，支架的顶部和底部在整个接种过程中的大部分过程中保持浸没。顶部仅暴露于一小部分MNC溶液，而底部被浸没。因此，接种梯度沿支架的长度被最小化。
负压可以由注射器、泵或真空源提供。
B.使用移植物或支架的方法
已经确定，组织工程化血管移植物(TEVG)上的细胞接种剂量是用于改善移植物的性能和效用的效果依赖性变量，而不管细胞温育时间。通常，在植入到受试者体内之前，用细胞接种TEVG。通常，细胞是来自预期接受者的自体细胞，并且接种方法可以包含从接受者采集细胞的步骤。可以使用本领域已知的任何技术从细胞混合物中分离出一种或多种细胞类型。因此，这些方法还可以包含在应用(即，接种)之前分离或纯化细胞的步骤。
用细胞接种TEVG是使用试剂盒或装置，如封闭式一次性接种系统进行的。封闭式一次性接种系统可以包含用于将细胞接种到移植物或支架上的翻转接种室或电容器接种室中的任何一种。优选地，试剂盒或装置使得能够用可控量的细胞无菌且有效地接种TEVG。
1.用细胞接种的TEVG的使用方法
相对于在不存在细胞的情况下的等效TEVG中的狭窄比率，接种有细胞的TEVG可以降低或预防TEVG的术后狭窄的比率。因此，可以用有效量的细胞接种TEVG，以减少或预防与包含炎症在内的术后狭窄的发展相关的免疫过程中的一个或多个免疫过程。
组织修复具有四个不同的阶段，包含：a)凝血/凝结；b)炎症；c)成纤维细胞迁移/增生；以及d)恢复正常组织结构的最终重塑阶段。在组织损伤之后的最早阶段，上皮细胞和/或内皮细胞释放炎症介质，这些炎症介质引发抗纤维蛋白溶解凝结级联反应，其触发临时胞外基质(ECM)的凝血和发展。血小板的聚集和随后的脱粒促进血管扩张和增加的渗透性，从而允许炎症细胞，如嗜中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞到有效募集到受损组织。嗜中性粒细胞是在伤口愈合的最早阶段最丰富的炎症细胞，但在嗜中性粒细胞脱粒之后被巨噬细胞迅速替代。经激活的巨噬细胞和嗜中性粒细胞清创伤口，消除任何侵入的生物体并且产生扩增炎症应答以及触发成纤维细胞增生和募集的多种细胞因子和趋化因子。在活化时，成纤维细胞转化成分泌α-平滑肌肌动蛋白和ECM组分的肌成纤维细胞。最后，在重塑阶段中，上皮/内皮细胞分裂并且在临时基质之上迁移，以再生受损组织。因此，愈合和新生组织产生是一个精细调节的过程，该过程平衡再生组织和增厚血管壁的需要，而没有过度的增厚和狭窄或纤维化。
a.巨噬细胞
已经显示，循环单核细胞和浸润巨噬细胞的存在对于伤口愈合和新生组织发育至关重要(Arras等人,《临床投资杂志(J Clin Invest)》,101(1):40–50(1998))。然而，在组织损伤部位巨噬细胞浸润的程度也与增生失调和新生内膜形成相关(Hibino等人,《美国实验生物学会联合会杂志》25(12):4253-63(2011))。另外，许多研究已经表明，巨噬细胞和成纤维细胞是参与纤维化发病机制的主要效应细胞(综述于Wynn,《自然综述：免疫学(NatRev Immunol)》4(8):583-94(2004)中)。
在血管损伤之后，将炎症单核细胞(人的CD16-hi、CD64-hi和CD14-hi；小鼠的CD115+、CD11b+和Ly6c-hi)募集到受损组织并且在暴露于局部生长因子、促炎性细胞因子以及微生物化合物时分化成经活化的巨噬细胞(人的Emr1-hi；小鼠的F4/80-hi(Geissmann等人,《科学(Science)》327:656-661(2010))。过度的巨噬细胞浸润导致狭窄，同时巨噬细胞浸润的完全抑制防止新生组织形成(Hibino等人,《美国实验生物学会联合会杂志》25(12):4253-63(2011))。
已经定义了巨噬细胞的极化活化的两种不同的状态：经典地活化的(M1)巨噬细胞表型和可替代地活化(M2)巨噬细胞表型(Gordon和Taylor,《自然综述：免疫学》5:953-964(2005))；Mantovani等人,《免疫学趋势(Trends Immunol)》23:549-555(2002))。经典地活化的(M1)巨噬细胞的作用是TH1细胞免疫应答中的效应细胞，而可替代地活化的(M2)巨噬细胞似乎参与免疫抑制和伤口愈合/组织修复。M1和M2巨噬细胞具有不同的趋化因子和趋化因子受体谱，其中M1分泌吸引TH1细胞的趋化因子CXCL9和CXCL10，并且其中M2巨噬细胞表达趋化因子CCL17、CCL22和CCL24。
M2巨噬细胞的存在与新生内膜发育和狭窄相关(Hibino等人,《美国实验生物学会联合会杂志》25(12):4253-63(2011))。在组织移植物植入后的某些时间点，巨噬细胞浸润的程度、新生组织形成与狭窄之间的相关性提供通过调节巨噬细胞活性来预防狭窄的手段。
另外，巨噬细胞通常位于产生胶原的肌成纤维细胞附近，并且已经显示，单核细胞源性巨噬细胞在损伤之后极为重要地维持炎症应答作为纤维化的先决条件(Wynn和Barron,《肝病研讨会(Semin Liver Dis)》,30(3):245-257(2010))。巨噬细胞产生活化成纤维细胞的前纤维化介质，包含血小板源性生长因子(PDGF)(一种强效趋化剂)和转化生长因子β(TGF-B)。具体地，巨噬细胞的非经典M2(CD14+、CD16+)亚群的显著增加与患有慢性肝病的患者的促炎性细胞因子和临床进展相关。在纤维化进展期间，单核细胞源性巨噬细胞释放细胞因子，使慢性炎症永存，以及直接活化肝星状细胞(HSC)，从而导致其增生和转分化成产生胶原的肌成纤维细胞(Zimmermann等人,《公共科学图书馆·综合(PLOS One)》,5(6):e11049(2010))。
b.血小板
聚集的血小板通过分泌化学品来辅助血管修复，这些化学品将来自周围结缔组织的成纤维细胞吸引到受伤区域以愈合伤口，或者在炎症应答失调的情况下形成瘢痕组织。响应于组织损伤，血小板被活化并且释放刺激胞外基质沉积的多种生长因子，如血小板源性生长因子(PDGF)(一种强效趋化剂)，以及转化生长因子β(TGF-β)。已经显示这两种生长因子在结缔组织的修复和再生中起显著作用。PDGF充当主要促分裂原和化学引诱剂，其显著增强成纤维细胞和炎症细胞的流入，以及刺激细胞增生和基因表达。PDGF使白细胞能够牢固地附着到血管壁并且最终迁移到内皮下组织中。然而，还已知血小板源性趋化因子诱导平滑肌细胞(SMC)增生，并且在新生内膜增生和器官纤维化中发挥作用(Chandrasekar等人,《美国心脏病学会杂志(J Am College Cardiology)》,第35卷,第3期,第555-562页,(2000))。PDGF和其受体的表达增加与硬皮病肺和皮肤组织相关。具体地，有证据证明硬皮病肺和皮肤成纤维细胞中的自分泌PDGF受体介导的信号传导环，这表明硬皮病中的慢性纤维化中的TGF-β和PDGF通路两者(Trojanowska,《风湿病学(Rheumatology)》；47:v2–v4(2008))。另外，PDGF信号传导的失调与心血管适应症，如肺动脉高血压和动脉粥样硬化相关。
响应于损伤诱导的PDGF的中层平滑肌细胞(SMC)增生和迁移是有助于新生内膜增厚的基本事件(Fingerle等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci.)》,86:8412(1989)；Clowes等人,《循环研究(Circ.Res.)》,56:139-145(1985))，该新生内膜增厚最终导致血管变窄和狭窄。
由血小板释放的其它愈合相关生长因子包含碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、血小板源性表皮生长因子和血管内皮生长因子。
可以用有效量的细胞接种TEVG，以产生增强伤口愈合并预防狭窄的促再生免疫环境。也可以用有效量的细胞接种TEVG，以调节血小板活性和功能。因此，也可以用有效量的细胞接种TEVG，以减少或防止血小板的生物功能，如血小板聚集和血小板源性生长因子(PDGF)的产生/表达。
使用接种有细胞的组织工程化血管移植物来减少移植物的术后狭窄的方法包含将接种细胞的移植物外科手术植入或以其它方式施用于患者体内。通常，植入方法包含将移植物附接到动脉的待替代或增强的部分上。附接血管移植物的方法在本领域中是已知的。与对照相比，如未用细胞接种的或用较少细胞接种的等效移植物，这些方法通常减少或抑制巨噬细胞的浸润，或将巨噬细胞从M1表型转化成M2表型或两者。在一些实施例中，这些方法减少或抑制巨噬细胞的增生而不减少或抑制血管新生组织发育。受试者可能患有狭窄、再狭窄或其它血管增生病症，或被鉴定为具有罹患再狭窄或其它血管增生病症的风险，例如已经经历、正在经历或将经历血管创伤、血管成形术、外科手术或移植动脉病等的受试者。所描述的任何方法都可以包含鉴定需要治疗的受试者的步骤。
通过参考以下非限制性实例将进一步理解本发明。
实例
实例1：用于移植物的均匀细胞接种的接种室。
材料和方法
美国专利第9,090,863号描述了如何使用封闭式一次性组织工程化血管移植物接种装置来将单核细胞(MNC)接种到可植入支架上。
使用这种方法接种的每个支架沿移植物的纵轴具有MNC梯度(分布)(这意味着在移植物的顶部接种的细胞少于在移植物的底部接种的细胞)。在新的浓度和接种体积的情况下，经接种支架在接近移植物的底部3cm处达到充满点(图2A和2B)，这不允许进一步的细胞接种，从而导致骨髓浪费和对患者的潜在风险。
整个移植物(长度为13cm)从顶部留出5mm，并且底部移植物接种有足够的MNC以满足释放标准，然而，在移植物的下部部分中发现的MNC比上部部分多得多。此实例呈现了两个接种室——翻转和电容器，用于接种装置以消除这种差异。
翻转接种室
“翻转”接种室消除了MNC在该支架上分布的可变性。装置后面的中心前提是改变该接种室沿其长度的横截面。
图3A-3E示出了翻转接种室的实例。该室的形状类似于倒置沙漏的形状，其中在该装置的高度的大约40％处具有凸起(最大横截面)。该装置的顶部和底部两者变窄以容纳心轴，其中该支架安装到该心轴，连同用于零件间隙的非常小的体积和过量的液体。
横截面变化的效果是，其有效地减慢MNC穿过该支架的最少接种部分的速度。
填充该室，施加真空，排出该室50％的体积(此时，支架的底部约50％充满MNC)，中断真空，倒置装置并且重新引入真空，从而允许剩余50％的体积通过支架的“上”半部分被抽出，该上半部分然后也充满MNC。通过这种方法，支架的下半部分和上半部分依次充满，从而导致产生具有最小MNC损失(高接种效率)的完全充满的支架。
另外，用于此设计的心轴具有两个真空结点：一个真空结点以直立取向抽负压，并且一个真空结点以反向取向抽负压。
用翻转室接种移植物的方法
1.将支架固定在心轴(装置的上部部分)上。
2.通过逆时针旋转心轴直到心轴压缩密封O形环，将心轴(上部)固定到装置的室(下部)部分。
3.所有必要的固定装置、管子和通气孔(air vent)放置在装置上。
4.室填充有MNC。
5.将负压被引入到下心轴出口。
6.室的50％的体积被拉动通过该室。
7.中断真空。
8.倒置装置。
9.重新引入真空。
10.剩余的50％体积通过支架的“上部”部分被抽出。
11.拆卸装置，并且支架现在准备好用于植入。
总接种时间是7分钟(7:01±0.03分钟)。
在接种之后，将经接种支架沿支架的长度切割成1cm宽的环，形成12个环。计算每个环中的细胞数量，并且图5示出了数据。使用PicoGreen dsDNA测定对细胞进行计数，并且将计数表示为细胞/mm3。
电容器接种室
“电容器”接种室消除了MNC在该支架上分布的可变性。装置后面的中心前提是通过将整个支架尽可能长时间地暴露于MNC接种过程来降低MNC梯度。
图4A-4C示出了电容器接种室的实例。在此室中，支架安装到心轴。然后，将支架和心轴组合件小心地放置到接种室中。与经组装心轴/支架组合件相比，接种室非常窄。该电容器接种室被设计成容纳最小体积的MNC溶液。用于均匀接种的支架与室壁之间的最小和最大间隙可以是1mm和10mm，如1mm和5mm。
在将心轴和室固定在一起之后，将MNC引入到装置中。液体迅速填充室并且“溢流”到位于室之上的IV袋中。
在将全部体积的MNC引入到接种室和溢流(电容器)IV袋两者之后，施加真空。MNC液体开始穿过支架，并且当IV袋中的液位下降时，整个支架保持浸没在MNC中。直到接种过程的最后，液体才从IV袋中完全排出，并且液位最终下降到接种装置的顶部之下。仅存在非常少量的时间，在该非常少量的时间中，液体从支架的顶部排出，从而将支架暴露于经过滤空气，而支架的底部保持浸没。因此，支架的顶部和底部在整个接种过程中的大部分过程中保持浸没。顶部仅暴露于一小部分MNC溶液，而底部被浸没。因此，接种梯度沿支架的长度被最小化。
用电容器室接种移植物的方法
1.填充IV袋
2.填充室
3.从室中排出空气
4.用血液填充室，覆盖支架
5.引入真空，通过支架真空抽出流体
6.排放室
7.去除经接种支架
总接种时间是1分钟15秒。
在接种之后，将经接种支架沿支架的长度切割成1cm宽的环，形成12个环。计算每个环中的细胞数量，并且图5示出了数据。
结果
结果示出了图5中用翻转接种室(1)或电容器接种室(2)接种的支架的均匀接种。
实例2：提供狭窄的自发逆转的支架参数。
开发了模拟新生血管形成的计算模型。此计算模型最初由小鼠模型中的TEVG发育的先前研究中收集的数据制定，并且该计算模型成功地描述并预测了2年时间段内的新生血管形成。呈现的是对来自美国临床试验以及计算模拟的数据的第一分析，这些计算模拟表明在先前临床试验中观察到的早期狭窄可能在没有干预的情况下自然地逆转。还呈现了使用已建立的大动物模型测试模拟产生的建议的实验，该建议是TEVG变窄的过渡时期将发展并且随后作为新生血管形成的自然历史的一部分自发解决。表征了TEVG在植入后至多1.5年在大动物模型中的几何形状、组成和生物力学性质的演变。数据验证了计算模型的主要预测。体内观察结果与来自计算模型的结果的比较进一步使得能够细化模型参数的值，并且由此收集对TEVG从接种有自体细胞的支架转化成能够生长和重塑的活新生血管的机制。
材料和方法
TEVG
支架表征
使用扫描电子显微镜(SEM)表征支架。沿轴向方向切割未植入支架的样品以产生0.5cm的正方形，这些正方形用碳带安装在SEM台上。将样品在真空下在氩气中用金溅射涂覆至3nm厚度，并且在Hitachi S4800 SEM上在5kV和10mA下成像。用FIJI图像分析软件分析图像。孔径根据100x的7个SEM图像计算。纤维直径通过至少5根PGA纤维平均计算。
释放标准和后处理测试
从细胞(0.2mL等分试样)和经接种支架(5×5mm区段)获得样品，并且使样品经历释放和后处理监测。使用台盼蓝排除法(trypan blue exclusion)和血细胞计数器进行细胞计数和活力。使用FITC-CD45和7AAD进行FACS，以确定白细胞数量和细胞活力。接种效力通过使用血细胞计数器对从接种前和接种后溶液获得的样品中的细胞数量进行定量，并且然后计算接种前和接种后溶液中的细胞数量除以接种前溶液中的细胞数量的差值来确定。
临床试验
研究设计
此试点试验的主要目的是评估TEVG在患有单心室心脏畸形的患者体内作为心外改良的Fontan导管的安全性。次要目标是通过评估TEVG在植入后6个月到3年之间的长度变化来确定其生长潜力。最初的设计是招募六名患者并且在三年时间段内通过连续超声心动图和MRI监测这些患者。
生长分析
使用植入后6个月和3年进行的连续MRI研究评估TEVG的生长能力。TEVG的生长能力通过比较其长度随时间的推移的变化与从其第一分支至肺动脉吻合测量的患者的Glenn分流SVC来估计。
安全性分析
研究团队在首次住院期间和TEVG植入后的所有安排的随访预约(术后1个月、6个月、12个月、24个月和36个月)以及任何未安排的心脏病学或心脏外科手术预约或住院期间对患者进行观察和评估。另外，研究护士每月通过电话联系患者的父母或监护人，以使用标准化调查检查他们的医疗状况。记录所有不良事件，并且由研究团队确定这些不良事件的等级和归因，并且由数据安全监测委员会(data safety monitoring board)进行审查。分析数据，并且与在日本东京妇女医院(Tokyo Women's Hospital in Japan)进行的初步试点研究中移植物相关并发症的发生率进行比较。
血管成形术
用血管成形术治疗发展狭窄(定义为TEVG的管腔直径减小>50％)的患者，而无需支架。
计算模型
受约束的混合框架
α＝1,…,n在结构上显著的成分被赋予单独的时变的产生和降解速率以及材料性质，但被约束为与整个移植物一起变形。因此，对于在中间时间τ产生的材料，在当前生长和重塑时间s的成分特定的变形梯度是
Figure BDA0003723815360000291
其中F是散装材料(即，混合物)的变形梯度，并且Gα是成分特定的“沉积拉伸”，在这些沉积拉伸处，新基质被结合在外部材料中，无论是聚合物还是胞外基质。(τ)表示各个成分无应力的自然构型。在变形时存储在移植物中的弹性能量的混合物表达式的简单规则源自成分特定的储存能量的总和，即W＝∑Wα,其允许壁力学的经典连续体公式，其中柯西应力(Cauchy stress)
Figure BDA0003723815360000292
其中C＝FT F是右柯西格林张量(right Cauchy-Green tensor)。生长和重塑过程是缓慢的，并且因此可以通过一系列准静态平衡状态来描述，使得divt＝0满足连续体的牛顿第二运动定律。因为每个成分可以演变，所以所存储的能量密度被认为是
Figure BDA0003723815360000301
其中ρ(s)是总质量密度，ρα(0)是成分α的初始表观质量密度，
Figure BDA0003723815360000302
Figure BDA0003723815360000303
最初存在于支架中的材料的储存能量密度，mα(τ)>0质量密度生产率，qα(s，τ)∈[0,1]在时间τ产生的在时间s保留的材料的存活分数，并且
Figure BDA0003723815360000304
在时间s存储在成分α的群组中的在时间τ∈[0,s]产生并通过
Figure BDA0003723815360000305
变形的能量。根据免疫学和机械刺激控制细胞和基质成分的沉积和降解，其中炎症驱动的周转的产生和降解率增加。结果中给出了具体的函数形式。
计算研究
计算模型首先用于使用通过拟合小鼠实验的生物力学和几何数据确定的模型参数的值来预测经植入的临床TEVG的演变归一化的管腔直径和壁厚度，其中对模拟TEVG的几何(对于临床支架，直径/厚度比D/H＝16对对于小鼠支架D/H＝3)和微结构(对于临床支架，支架孔径rp＝41.9μm对对于小鼠支架11.2μm)性质进行适当修改，以解释临床支架和小鼠支架的差异。由于炎症驱动的动力学是基于小鼠数据，并且已知免疫应答在狭窄中发挥至关重要作用，因此研究了四个关键炎症参数(δ、β、Kih和Ki max)对模型输出的影响。通过改变单个炎症参数的值同时保持其它三个参数恒定并且反之亦然来进行参数研究。这允许隔离每个参数对演变的TEVG性质的影响，这些性质包含标准化直径、壁厚度、直径顺应性和炎症区域质量密度。通过经植入的TEVG支架的原始值对直径和厚度进行归一化；归一化的直径顺应性被计算为从通过原始移植物直径归一化的自平衡压力增加50％的压力的直径变化。基于试点模拟，所描绘的参数(参见表1)被选择以捕获宽范围的潜在生理结果。
表1：所测试的炎症参数。
炎症参数(输入)
Figure BDA0003723815360000306
TEVG发展的整体计算模型内的关键方程，该关键方程通过不同成分α的生产率mα和去除qα的变化来解释质量的变化，这些成分中的每个成分可以取决于归因于异物应答的炎症负担(上标i)，以及由于圆周壁应力tθ和管腔壁剪切应力τw与自平衡目标值的偏差Δ而产生的机械生物应答(上标m)。从用于结合可能的炎症驱动的新生血管形成的过程的免疫感受态小鼠和免疫受损小鼠中的先前实验鉴定其中的四个关键模型参数和可能的范围。
演变的质量周转(由于产生mα(τ)和去除qα(s,τ))
ρ(s)(移植物质量)＝ρp(s)(聚合物质量)+ρi(s)(免疫介导的质量)+ρm(s)(机械介导的质量)
其中
Figure BDA0003723815360000311
对于Qα(s)∈[0，1]，a＝p、i或m
其中对于免疫介导的成分，
Figure BDA0003723815360000312
和
Figure BDA0003723815360000313
其中对于机械介导的成分，
Figure BDA0003723815360000314
和
Figure BDA0003723815360000315
大型动物研究
研究设计
本研究的目的是测试计算生成的输出，即，在已建立的IVC插入TEVG模型中，对新生组织形成的自然历史进行定量，以及因此对1年内的新生血管发育进行定量。将经接种的TEVG植入24只羔羊体内，并且在1周、6周、6个月和1年通过连续血管造影和血管内超声收集体内数据。将1周时间点用于基线解剖信息；其提供了与立即术后期相当的数据，但是允许动物从初始外科手术损伤中恢复并且降低与在同一时间段期间进行植入外科手术和初始导管插入术所需要的延长的麻醉相关的风险。试点数据证明了6周时的显著狭窄，这与计算预测一致，并且选择稍后的时间来监测长期的移植物性能。主要终点是在每次血管内超声成像时移植物的最窄横截面面积。本研究没有排除数据。
大型动物支架
TEVG支架由郡是公司(Gunze Ltd.)(日本东京(Tokyo,Japan))提供并且与临床试验中所使用的支架相同：具有PCLA的50:50共聚物密封剂的编织PGA芯。
TEVG的骨髓穿刺、组装和植入
二十四只幼年羔羊经历骨髓抽吸(5mL/kg体重)并且作为胸腔内IVC插入移植物植入接种自体细胞的TEVG。使用丙泊酚(5mg/kg)进行诱导并且使用异氟烷(1-4％)或丙泊酚(20-40mg/kg/小时)进行维持将动物麻醉。将羔羊置于侧卧位，并且将覆盖髂嵴的区域剃毛并且以标准无菌方式准备。制作2mm切口，并且将抽吸针插入到骨中。使用肝素化注射器(100U/mL)来抽吸5mL/kg骨髓。
抽吸后，使用Ficoll密度梯度分离处理骨髓，以分离骨髓源性单核细胞，如先前所述。简而言之，将骨髓通过100μm细胞滤网过滤，以去除骨针和凝块。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)实现1:1稀释，并且将骨髓分层到Ficoll 1077(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))上。离心后分离血浆和单核细胞层。用PBS对单核细胞层进行两次洗涤以产生在20mL PBS中稀释的细胞沉淀，以对支架进行接种。将单核细胞真空接种到支架上，将其在血浆中温育直至植入时间。
如先前所述，将支架植入胸腔内IVC中。将羔羊置于左侧卧位。根据每只动物的解剖结构，在第五或第六肋间空间中进行右胸廓切开术，并且在膈膜与右心房之间解剖胸腔IVC。在IVC的交叉夹住期间，放置cavoatrial分流以维持灌注。夹住血管并且植入直径匹配的经接种支架的2cm区段，其中使用运行的不可吸收的单丝缝合线进行端到端吻合。没有去除天然血管。在缝线尾部施加钛血管夹持件，以标记吻合进行术后成像。用可吸收缝线重新接近胸壁、上覆肌肉和皮肤层。
介入成像
手术后导管插入术在1周、6周、6个月和1年进行。基于动物的临床状况，根据需要进行另外的成像。在镇静作用和插管之后，将羔羊置于左侧卧位。将右颈内静脉插管并且插入9弗伦奇鞘(新泽西州萨默塞特郡的泰尔茂(Terumo,Somerset,NJ))，随后静脉推注肝素(150U/kg)。将5弗伦奇JR 2.5导管(印第安纳州布卢明顿的库克医疗公司(Cook Medical,Bloomington,IN))通过SVC通入右颈内静脉并通入右心房。使用成角度的Glidewire(泰尔茂)，将JR导管然后穿过TEVG进入放置Rosen交换导丝(印第安纳州布卢明顿的库克医疗公司)的腹内IVC。然后将JR导管更换为5弗伦奇多轨道血管造影术导管(纽约霍普金顿的纽卡斯尔医药大学(NuMed,Hopkinton,NY))，该导管用于测量TEVG之下和之上以及TEVG内的腹内IVC、胸腔内IVC的血流动力学压力。通过从TEVG之下的平均压力中减去TEVG之上的平均压力来计算平均压力梯度。然后通过定位在腹内IVC中的多轨道血管造影术导管注射碘佛醇68％(北卡罗来纳州罗利市的马林克罗制药有限公司(Mallinckrodt Pharmaceuticals,Raleigh,NC))来获得数字血管造影照片。在七个点处测量直径：腹内IVC、低胸腔内IVC(在TEVG的隔膜侧)、近侧吻合(相对于血流限定)、中间移植物(midgraft)、远侧吻合、高胸腔内IVC(在TEVG的心房侧)和最严重变窄的区域。通过上述外科手术放置的不透射线夹持件鉴定近侧和远侧吻合。将0.035英寸的数字血管内超声导管(加利福尼亚州圣地亚哥的火山公司(Volcano,San Diego,CA))在Rosen导丝上推进穿过移植物。这用于在血管造影术期间测量的相同的七个点处获得图像。使用火山软件分析这些图像，以获得如先前所述的横截面面积。
由于在植入时对大小匹配的移植物的需要，血管造影术和IVUS数据相对于其相应的1周测量结果归一化，并且因此移植物狭窄被表示为相对于1周时的基线中间移植物大小的倍数变化，即
Figure BDA0003723815360000331
使用血管内超声测量TEVG内的新生组织发育并且报告为TEVG的直径的百分比。使用Rhino 3D(华盛顿州西雅图(Seattle,WA))对IVUS成像数据进行图形重建。
安乐死
在规定的终点，用氯胺酮(20mg/kg)和地西泮(0.02-0.08mg/kg)对动物进行深度镇静，随后诱导双侧气胸并放血。在TEVG外植时进行完全的兽医尸检。如果动物出现严重狭窄(在此定义为具有全身性症状的移植物变窄)，则也将对动物进行安乐死。在植入后6个月(n＝5)和12个月(n＝2)时，对针对严重狭窄而未进行安乐死的动物进行安乐死。剩余的动物存活下来进行长期随访，其中在18个月时对三只动物进行安乐死用于后期机械测试。
新生组织结构表征
组织学和免疫组织化学
在制备中间移植物的4μm横切面并固定在载玻片上并热固定之前，将TEVG外植体用4％福尔马林固定、脱水并包埋在石蜡中。标准技术适用于苏木精和伊红(hematoxylin&eosin)和天狼猩红染色。免疫组织化学用于检测巨噬细胞抗原CD68(CD68，1:500，艾博抗公司(Abcam))和α平滑肌肌动蛋白(aSMA，1:2000，达科公司(Dako))。将样品用Dako靶修复溶液(Dako target retrieval solution)(90℃，pH 6.0)进行热诱导的抗原修复，随后阻断内源性过氧化物酶活性(含0.3％H2O2的水溶液)和非特异性结合(含3％正常山羊血清的Background Sniper，BioCare医疗公司(BioCare Medical))。在一级抗体温育之后，将切片在适当的生物素化二级抗体(1:1500，维克多公司(Vector))和链霉亲和素-辣根过氧化物酶(维克多公司)中依次温育。DAB+底物色原(维克多公司)用于显色。将所有样品在脱水和盖玻片之前用Gill的苏木精(维克多公司)复染色。
图像定量
使用ImageJ对组织学染色的显微照片进行定量。对于天狼猩红染色的样本，使用平铺的25x放大率图像来捕获整个血管区域。使用颜色阈值命令对所关注区域进行定量。对于免疫组织化学染色的载玻片，在血管周围以100x拍摄四张代表性的平铺图像，每张图像捕获移植物切片或天然IVC的全宽度。使用颜色去卷积和阈值命令评估图像，以对阳性染色区域或计数阳性细胞进行定量。
双轴机械测试
在羔羊体内植入后18个月，从右心房到隔膜(59.3±16.2mm)切除包含TEVG和相邻的近侧和远侧胸腔IVC的复合样本，然后通过钝性解剖清洗血管周围组织。将样本插管在定制的丙烯酸插管上，安装在定制的计算机控制的测试装置内，并且在室温下浸入Hank缓冲生理溶液中。使用摄像机测量外径并且通过步进电机规定长度；使用标准传感器测量管腔压力和轴向力。将样品在5mmHg的压力下在低流量下平衡15分钟，然后用6个循环的加压(1mmHg到30mmHg)进行预处理，两者都在体内轴向拉伸的固定值下进行。被动数据的采集由在轴向拉伸的三个不同的固定值(体内值的95％、100％和105％)下的循环压力-直径测试(1.5mmHg到30mmHg)组成。将来自每个方案的卸载曲线的数据用于分析。
计算模型验证
在收集关于演变的绵羊TEVG的数据并且注意到所预测的(基于来自先前小鼠研究的参数)与所测量的演变的几何形状之间的差异之后，使用非侵入性优化技术(先前详细描述的替代管理框架)来鉴定四个关键炎症参数的值，以捕获如通过血管内超声测量的在植入的第一年过程中的演变的羔羊移植物的归一化的管腔直径和壁厚度。由于血管内超声显示非圆形移植物横截面，从用于拟合过程的面积测量结果计算TEVG的水力直径。通过参数研究通知替代管理框架优化的界限。为了验证计算模型，将在18个月时TEVG的所测量的顺应性与从生长和重塑模型预测的顺应性进行比较。
统计分析
使用GraphPad Prism 7.03版(加利福尼亚州拉荷亚的GraphPad软件公司(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA))进行统计分析并创建图表。通过双尾费希尔精确检验(Fisher's exact test)对日本对美国临床试验中早期狭窄发生率进行比较。首先将来自绵羊研究(血管造影术和IVUS)的连续测量结果相对于成对的1周值归一化，以控制在植入时使用的可变支架大小，从而确保大小与天然血管相匹配或由于植入程序导致的可变吻合变窄程度，并且因此表示为相对于相应的1周测量结果的倍数变化。使用普通单向ANOVA和事后图克多重比较检验(Tukey's post-hoc multiple comparison's test)来分析压力测量结果或归一化的血管造影术和IVUS值。利用事后图克多重比较检验通过普通单向ANOVA来分析组织形态学和微图数据(壁厚度、aSMA+面积分数、CD68+细胞/mm2和胶原面积分数)。对于所有统计检验，α被限制为0.05，并且p值<0.05被认为是统计上显著的。
伦理顺应性
临床试验
从耶鲁大学(Yale University)(HIC#0701002198)和全国儿童医院(NationwideChildren's Hospital)(IRB12-00357)获得机构审查委员会批准。根据良好的临床实践指南，在FDA IDE 14127下进行这种临床试验。
绵羊研究
全国儿童医院(俄亥俄州哥伦布(Columbus,OH))的机构动物护理和使用委员会(The Institutional Animal Care and Use Committee)审查并批准了该方案(Ar13-00079)。动物护理人员的代表在术中和术后过程中监测所有动物。动物护理符合美国国立卫生研究院公共卫生服务部(Public Health Service,National Institutes of Health)(马里兰州贝塞斯达(Bethesda,MD))在《实验室动物的护理和使用(Care and Use ofLaboratory Animals)》(2011)中发布的人道指南，以及《动物福利法(Animal WelfareAct)》中阐述的USDA法规。
结果
TEVG的设计和表征
通过将自体骨髓源性单核细胞接种到生物降解型管状支架上来组装TEVG。支架(日本京都的郡是公司(Gunze Ltd,Kyoto,Japan))由聚(乙醇酸)纤维(PGA)和己内酯和丙交酯的共聚物(PCLA)制成，该共聚物通过开环聚合以50:50摩尔组成合成。将PGA纤维编织成管，并且用PCLA溶液涂覆内表面和外表面，并且然后在真空下冷冻干燥，从而产生嵌入在PCLA的多孔海绵内的编织PGA纤维的基质。
支架被设计成通过水解经大约6个月而降解。所测量的支架尺寸：内径为16±0.5mm或18±0.5mm，长度为13±0.5cm，并且壁厚度为0.7±0.1mm(图1A)。内表面的定量扫描电子显微镜显示的平均孔径为41.9±2.7μm，并且孔隙率为0.87±0.01。关于外表面，平均孔径为36.4±6.6μm，并且孔隙率为0.86±0.02。PGA纤维束以纬纱图案编织，各层之间的轴向间隔为1mm，并且各峰之间的周向间隔为1mm。所测量的平均PGA纤维直径是15.8±1.0μm。根据良好生产规范(GMP)规定，组装TEVG。在外科手术当天采集骨髓(5ml/kg体重)，并且在Ficoll中使用密度离心分离单核细胞部分。在美国临床试验中，该程序产生平均20.6×106(范围为19.0-22.2x 106)个单核细胞，其中平均细胞活力为92.6％(范围为86.5-96.8％)。流式细胞术表明，这些细胞中的78.3％(范围为73.2-85.3％)是CD45+。然后使用定制真空系统将这些细胞接种到聚合物支架上，其产生的平均接种效率为42.7％(范围为23-61.4％)。在组装TEVG的同一天，在作为血管支架植入之前，将经接种支架在自体血浆(密度梯度离心后从非单核细胞部分获得)中温育两小时。临床试验中使用的所有TEVG均满足释放和后处理监测标准(表2)。
表2：TEVG的释放测试和后处理监测标准。
Figure BDA0003723815360000361
TEVG的临床性能
FDA批准的临床试验评估TEVG在用作将下腔静脉(IVC)连接到经历改良的Fontan操作的具有单心室心脏畸形的儿童的肺动脉的血管导管时的安全性和生长能力(图12和表3)。
表3：临床试验患者人口统计
Figure BDA0003723815360000362
使用植入后6个月和3年进行的连续磁共振成像(MRI)研究来评估生长能力。注意到，IVC是电容容器，该电容容器逐时刻地改变其直径，通过当吻合到肺动脉(称为Glenn分流，其是Fontan手术的组成部分)时，将其长度随时间的推移的变化与内部对照——上腔静脉(SVC)的变化进行比较来估计TEVG的生长。在植入后6个月到3年之间，四个TEVG的长度增加了2.5mm(范围为1.1mm到4.2mm)，而在同一时间段期间，Glenn分流的长度增加了1.5mm(范围为0.9mm到2.4mm)。TEVG和Glenn分流的长度的平均百分比增加均为7％。
安全性分析表明，在3年研究期间，没有移植物相关的死亡、灾难性移植衰竭或需要移植物置换的并发症。所有四名患者在植入后4-7年继续表现良好。然而，四名患者中有三名患者发展成严重狭窄(移植物直径变窄>50％)，并且在植入后5-8个月成功用血管成形术治疗。没有另外的移植相关并发症。由于早期TEVG狭窄的这种出乎意料的高发生率，招募被封顶在4名患者而不是预期的6名患者：在美国试验中，4名患者中有3名(75％)患者发展成狭窄并且用血管成形术治疗，而在原日本试验中，25名患者中仅有1名(4％)患者在植入后三年内发展成狭窄并且需要进行血管成形术(双侧费希尔精确检验，p<0.01)。
图12展示了调查组织工程化血管移植物在先天性心脏外科手术中的临床用途的先导研究的流程图。研究目标如下。这项试点研究的主要目标是确定在需要心外全腔静脉肺动脉连接术(EC TCPC)姑息治疗单心室心脏畸形的儿科患者中使用组织工程化血管移植物作为大直径、高流量、低压导管的安全性。次要目标是使用连续磁共振血管造影术来确定组织工程化血管移植物的生长潜力。试验设计如下。本调查是具有前瞻性、非随机化的1期临床试验，其确定使用组织工程化血管移植物作为EC TCPC导管的安全性。合格标准：在该机构的调查过程中，被认为经历EC TCPC用于完成改良的Fontan以缓解其先天性心脏畸形的候选者的所有患者都被考虑用于招募到试验中。没有患者因年龄、性别或种族而被排除在外。纳入标准包含作为EC TCPC的候选者的单心室畸形的患者，这些患者自愿并提供知情同意。排除标准：排除标准包含急迫/紧急手术状态、主要染色体异常、需要起搏器、肺血管阻力大于4um2 2(u＝伍德单位(Wood's unit))、异常静脉引流(IVC中断)、存在中度至重度心房-心室瓣膜回流或其它重大医疗问题。在研究者看来，不符合方案指定的程序的任何其它病状或其它显著医疗问题的历史。研究地点：这项单一机构研究在耶鲁-纽黑文医院(Yale-New Haven Hospital)启动，但随后转移到全国儿童医院。数据存放设施在现场(俄亥俄州哥伦布的全国儿童医院(Nationwide Children's Hospital,Columbus,OH))。结果量度：研究的主要终点包含确定移植衰竭率以及移植物相关的发生率和死亡率。移植衰竭被定义为需要外科手术或血管内干预的任何移植物变窄/阻塞或扩张/破裂。移植物相关的发生率和死亡率包含任何术后并发症，如需要治疗的任何血栓栓塞或感染事件，并且被认为可能是由组织工程化血管移植物引起，如由研究者确定并且经数据安全监测委员会证实。样品大小：最初的计划是招募总共6名患者。由于经历的狭窄发生率高于预期发生率，因此研究在总共4名患者时结束。由于这是观察接受这些血管移植物的患者的不良事件的比率的试点研究，因此该研究无法进行测试。研究日期：于2009年12月获得FDA批准，而在耶鲁大学附属的耶鲁纽黑文儿童医院于2011年8月对第一名患者进行植入。该研究于2012年9月被重新安置到俄亥俄州立大学附属的全国儿童医院。在完成对机构设施的所需检查之后，于2014年3月恢复招募并且于2017年8月完成所有临床随访。研究终止：在临床试验中经历TEVG狭窄的发生率高于基于日本的原试点试验研究的预测发生率。基于这些发现，该研究被自愿搁置，并且要求举行闭门DSMB会议(closed DSMB meeting)。DSMB随后召开会议，并且建议暂时搁置研究并重新评估数据。试验注册：NCT01034007。
构建新生血管发育的计算模型
使用一般约束的混合理论来描述软组织的质量变化和微观结构变化，作为模型的基础。先前开发了用于模拟植入小鼠体内的TEVG的几何形状、成分和机械性质随时间的推移的变化的计算模型。该模型认为降解聚合物支架、组织血管新生组织和新产生的以胶原为主的胞外基质在结构上是分离的显著成分。具体地，数据驱动的本构关系(constitutiverelationship)定义了α＝1,2,…n成分中的每种成分的固有材料性质以及其单独的产生和去除速率：新胡克关系(neoHookean relation)描述了聚合物的机械行为，芬格-指数关系(Fung-exponential relation)描述了新生组织的机械行为，质量密度产生的速率m)τ>0取决于与巨噬细胞侵入成比例的机械生物刺激，如壁内壁应力和免疫生物刺激，并且去除是通过存活函数q)s,τ∈[0,1]来定义的，该存活函数跟踪在时间τ∈[0,s]时产生的在时间s时保留的材料的百分比。例如，来自自平衡条件的壁内应激的偏差调节机械介导的动力学，因为血管细胞通常促进机械生物自平衡，而由扫描电子显微镜术定量的支架微结构调节炎症驱动的动力学，因为足以用于细胞浸润的孔径是巨噬细胞活性和表型的关键调节剂。
免疫感受态和免疫受损的小鼠的先前研究鉴定了控制炎症驱动的胞外基质的沉积和降解的四个关键模型参数(表1)：δ调节炎症应答的开始和持续时间，β控制生产函数的偏斜度，Ki h控制炎症胞外基质的产生和降解的速率，并且Ki max衡量胞外基质降解的炎症效应，其产量由下式给出
Figure BDA0003723815360000391
其中
Figure BDA0003723815360000392
是由炎症驱动的基质成分α的产生的基础速率，并且
Figure BDA0003723815360000393
是描述异物对降解聚合物的应答的开始和消退的γ分布函数的增益，其中rp(τ)/rn是由细胞浸润的关键孔径归一化的支架的孔径，并且Ki w是炎症驱动的胞外基质产生的基础增益。炎症胞外基质的降解受一级动力学类型衰变控制，
Figure BDA0003723815360000394
其中Ki h是速率参数，并且Ki max再次是Ki(τ)的最大值。
新生组织形成的参数模拟
新生血管发育的无数模拟(图7A)通过改变单独的炎症参数的值同时保持其它参数固定而产生(表1)。这允许用体内研究实现不可能的事情——分离个体贡献者对关键临床参数，包含TEVG内半径、壁厚度、直径顺应性和期望时程内的新生组织累积的演变的影响。所描绘的参数范围基于更广泛的初步研究(未示出)捕获宽范围的潜在生理结果。总体而言，模拟预测的发现与临床试验建议的发现类似，即由于炎症驱动的新生组织壁增厚和管腔变窄增加，TEVG早期变窄。然而有趣的是，该模型还预测这种变窄在宽范围的情况下将自发逆转，因为免疫应答随着聚合物降解减弱并且随后机械介导的新生组织降解超过沉积，因为由于变窄和增稠两者，壁应力下降至远低于正常自平衡值(图7A-7H)。先前没有考虑TEVG狭窄可以自发逆转的可能性。因此，计算模型产生了出乎意料的结果，该结果是使用大动物模型通过实验进行测试的。
在图7A-7H中，每个图集中在对于δ、β、Ki h和Ki max的变化的归一化的管腔直径(顶行)和壁厚度(底行)的早期演变(植入后长达52周)，其中箭头示出了增加值的方向。示出了预测的管腔直径的瞬时减小和随后的恢复，其中这些变化部分地导致壁增厚，该壁侵占初始刚性的聚合物支架内的管腔，该聚合物支架随后降解，因此减少免疫控制同时增加生物学和机械学的机械控制。
TEVG狭窄在大动物模型中自发逆转
通过在绵羊胸腔内IVC插入移植物模型中进行时程研究来测试计算模型的预测。绵羊IVC插入移植物是用作Fontan手术的替代物的经验证模型，因为不存在具有单心室心脏畸形的大动物模型，并且Fontan手术对具有在结构上正常的心脏的动物的表现与过高死亡率(>80％)相关。将大小匹配的TEVG植入到24只幼年羔羊体内(图13A和13B：绵羊研究设计和外科手术结果)。使用血管造影术和血管内超声在所有存活羔羊中在12到18个月的时间段内连续监测TEVG形态，以测量管腔直径和横截面面积。血管造影术显示6周时的显著的TEVG狭窄(相对于1周的直径变化为-0.48±0.16倍，单向ANOVA与图克多重比较检验：a＝0.05,p<0.0001)。如所预测的，到6个月时，狭窄在没有血管内干预的情况下自发地改善，并且所有TEVG在1年及以上仍保持明显。
血管内超声表明，早期TEVG变窄是由于新生组织在支架的管腔表面上的外加生长引起的，从而使壁增厚并且使管腔变窄。在6周时，TEVG狭窄位于移植物的中远侧区段(即，更靠近心脏的区域)，而在近侧吻合处没有观察到变化。定量血管内超声评估证实，管腔面积从1周到6周显著降低(相对于1周中间移植物面积变化-0.67±0.17倍，单向ANOVA与图克多重比较检验：a＝0.05，p<0.0001)，变窄逆转6个月，并且移植物在1年时保持明显(图8A)。在同一时间段期间，壁在6周时达到其最大厚度(范围为1.5mm到4.6mm，单向ANOVA与图克多重比较检验：a＝0.05，p<0.0001)，并且然后在1年时程内逐渐变薄(图8B)。
还收集在每次血管造影术期间的血流动力学数据。跨移植物的平均压力梯度遵循上述形态测定变化。梯度从1周到6周显著增加(0.5±0.5mmHg对11.8±5.5mmHg，p<0.001)，然后在6个月时降低到接近基线(1.3±2.8mmHg，单向ANOVA与图克多重比较检验：a＝0.05，p<0.001对6周，p＝0.8883对1周)(图14A-14D：血管造影术、IVUS和血流动力学数据分析)。最大压力梯度倾向于对应于最窄的移植物。发展成狭窄的22只动物中有两只(9.1％)也出现了包含腹水、嗜睡和体重减轻在内的症状。这些羔羊中的两只羔羊在6周时的平均压力梯度>19mmHg，并且这两只羔羊的移植物在血管造影术上是三个最窄移植物中的两个，两个移植物在最窄点处测量的管腔直径均小于4mm。将这两只有症状的动物安乐死。尽管所有动物形成显著的TEVG狭窄，但是保持无症状的剩余羔羊的狭窄得到消退。没有移植物被急性闭塞并且没有动物因狭窄而死亡。
计算模型验证
虽然参数研究是基于对小鼠IVC插入TEVG的研究而参数化的，该TEVG由与在绵羊和临床移植物中使用的类似支架设计组成，但测试该模型是否还可以描述体内绵羊数据。使用来自鼠实验的许多模型参数(例如，胶原的机械性质和胶原周转的基础速率)，这些数据对于所有时间(R2＝0.83)都很好地拟合，但对于控制时间炎症应答的四个关键参数产生了绵羊特异性值：δ＝0.32天-1，β＝3.96，Ki h＝5.13，并且Ki max＝72。如在天然血管的先前生长和重塑研究中，使用替代管理框架优化方法鉴定参数的这些最佳拟合值。在不同的计算度量中，特别注意指示狭窄存在或不存在的管腔直径和壁厚度的演变(图8A和8B)。
新生血管的演变细胞组成与计算模型预测一致
使用组织学和免疫组织化学表征绵羊新生组织随时间的推移的变化。组织学区段证实了用体内成像观察到的TEVG的管腔和壁的变化，并且证实瞬时管腔变窄主要是由于支架增厚，并且部分是由于支架的管腔表面上的新生组织形成，该新生组织在植入后6个月似乎消退。定量组织形态测定表明，在植入后6周，壁增厚达到峰值，这与计算预测一致(图9A和9B)。a-平滑肌肌动蛋白(aSMA)的免疫组织化学染色鉴定了沿支架的管腔表面以及支架内的一些阳性细胞；其数量在6周时最多。假定沿管腔表面形成的aSMA+细胞是增生的并促成引起TEVG狭窄的新生组织的平滑肌细胞。aSMA+细胞的总数在早期达到峰值，这与计算模型预测的基质的早期旺盛生产很好地拟合(图9C和9D)。使用针对CD68的免疫组织化学染色来评估巨噬细胞浸润的程度。定量免疫组织化学显示在6周时巨噬细胞密度最大。超过6个月，巨噬细胞的数量随着支架降解而减少，这也与计算预测很好地拟合(图9E和9F)。总之，这些发现显示TEVG狭窄的形成很大程度上是炎症驱动的。
计算模型准确预测新生血管生物力学
聚合物支架和新生组织的机械促成作用的总和(主要由新生组织的胞外基质组分确定)确定TEVG的生物力学性质。使用来自在植入后1周、6周、6个月和1年获得的绵羊TEVG的天狼猩红(PSR)染色的切片的偏振光图像来表征支架降解和新生组织形成，这揭示了PGA纤维的降解以及胶原纤维的沉积和成熟两者。PGA纤维在植入1周后在支架内保持高度组织，但在6周时已经变薄并且开始显示早期碎裂的证据。在植入后6个月及以上，仅PGA纤维的稀薄的单个碎片可见。相比之下，在1周时检测到纤维状胶原染色最少。在植入后6周，新生组织中的胶原总量达到峰值，其中显著量的薄(绿色)纤维在支架内并且沿其管腔表面。随着胶原密度压实和成熟，胶原密度在第一年内稳步增加(图10A和10B)。这种胶原似乎是与TEVG狭窄相关的新生组织的原代胞外基质组分。随着支架降解和壁变薄，胶原也似乎在6周到6个月之间重塑；在6个月时，胶原纤维显示为橙色，这代表胶原纤维具有中等厚度。植入一年后，壁变得更薄，并且胶原纤维显得更厚(红色)且更致密，表明正常的成熟的血管胶原。
植入后1.5年切除的TEVG的体外双轴机械测试揭示了与模型预测类似的TEVG的结构应答(压力-直径)(图10C)。TEVG的最终顺应性(其作为验证步骤而不是基于数据拟合由计算模型进行预测)也与体外机械特性中发现的值很好地匹配(图10D)。重要的是，在计算模型中的材料参数的相关值表明，在整个许多新生血管发育过程中，这种本体行为由比机械介导的基质周转更高的炎症驱动的基质周转引起，因为用于新生组织产生的机械刺激被高壁厚度和低直径衰减。
讨论
评估TEVG在复杂先天性心脏畸形的修复中的用途的第一FDA批准的临床试验证实，狭窄是最普遍的移植物相关并发症，但早期TEVG狭窄的形成以比先前观察到的发生率高得多的发生率发生。
为了获得对早期TEVG狭窄形成背后的复杂免疫学和机械过程的机械见解，使用新生血管发育的计算模型来参数化地研究控制新生组织形成的多个关键因素的相对促成作用。该模型预测狭窄的自发消退，这是在绵羊IVC插入移植物模型中可再现证实的发现。在整个1到1.5年的研究时间段期间，可以安全地监测羔羊的无症状TEVG狭窄而没有急性移植衰竭或血栓形成。基于可用数据，在整个移植物上的症状和平均压力梯度可以是评估TEVG狭窄的临床显著性的主要标准，而不是单独的形态测定变化。因为大多数狭窄都是自然消退的，所以适当的监测而不是过度激进的干预可以是前进的方向。
总的来说，来自与人临床试验、计算模拟和绵羊研究结合的先前研究的结果表明，将接种细胞的PGA/PCLA支架作为TEVG植入脉管系统内启动了炎症驱动的、机械介导的新生血管的演变随时间的推移的运动。聚合物最初引发强烈的异物应答，并且宿主炎症细胞浸润支架。同时，支架部分地保护浸润性血管细胞和其沉积的新生组织免受血液动力学强加的机械力，直到丧失聚合物的结构完整性。因此，随着支架完整性的降低，机械生物学过程似乎增加，并且由于移植物的过度增厚引起的低壁应力导致降解超过随后的沉积，从而导致初始炎症驱动的狭窄逐渐消退。然而，炎症的后果并不完全是负面的；事实上，一些炎症对于早期宿主细胞募集和新生组织形成是基础的。浸润性单核细胞/巨噬细胞具体地通过诱导宿主内皮细胞和平滑肌细胞从相邻血管壁向内生长来协调早期新生组织形成。因此，总体TEVG功能需要聚合物支架的平衡降解(主要通过水解)和新生组织的适当沉积。似乎关键的是促进但限制炎症，同时优化负载从最初刚性的聚合物支架转移到构成新生组织的细胞基质复合物的时间(图11A-11C)。
图11A和11B是示出了支架植入诱导异物反应和机械介导的新生组织重塑的图。巨噬细胞浸润支架。巨噬细胞对于新生组织形成是必需的，但过度的巨噬细胞浸润会导致狭窄。当聚合物破碎和降解时，免疫生物学促成作用继续建立，但随着聚合物消失而开始消退；同时，平滑肌细胞通过重塑胞外基质以改变应激屏蔽的量使得建立机械内稳态来响应血液动力学环境的机械刺激。在血管新生组织中的细胞感测到低机械刺激的情况下，这些细胞分解并重塑胞外基质以减少应力屏蔽，直到重新建立机械内稳态。
类似地，在高机械刺激的情况下，这些细胞产生并重塑胞外基质以增加应力屏蔽，直到获得机械内稳态。随着降解的聚合物支架的应力屏蔽能力降低，机械生物学促成作用继续建立。在植入后前6个月期间，巨噬细胞对新生组织形成的编排通过驱动细胞迁移和胞外基质产生的旁分泌信号传导而发生，而在支架降解并失去其生物力学完整性之后，动力学由血管细胞通过新生组织的沉积和降解来感测和响应其局部机械环境的能力介导。应注意，支架机械完整性的丧失先于支架的消失，因此炎症和机械因素对新生组织周转的促成作用重叠。重要的是，在炎症驱动期间，新生组织的旺盛生产导致新生组织壁应力远低于正常内稳态靶标，从而促进超过沉积的新生组织的机械介导的降解，从而有助于狭窄的自然消退。
总之，本研究强调了在转化研究中将先进的计算建模和模型驱动的临床前实验组合的效用。开发了一种用于创建稳健的计算模型的框架，这些计算模型可以准确地预测最终确定移植物性能的新生组织的几何结构、组成和生物力学的变化。结果表明，在没有血管成形术的情况下，在临床试验中观察到的导致研究过早结束的早期狭窄将自发消退。计算模拟预测，可以通过改变支架设计(包含纤维直径、纤维定向(fiber alignment)、孔隙率和孔径)以减少相关的炎症和应激屏蔽来修改支架，从而减少变窄的程度和持续时间。

Claims (39)

1.一种用于封闭式一次性细胞接种系统的细胞接种室，所述细胞接种室包括：
壳体，所述壳体具有宽度和长度，
盖，所述盖包括能够插入到所述壳体中的抽吸杆以及一个或多个侧向流体端口，
心轴，所述心轴定位在所述抽吸杆之上，以及
基部，
其中所述壳体沿所述壳体的长度具有可变宽度或者在所述抽吸杆或所述心轴与所述壳体之间具有间隙。
2.根据权利要求1所述的细胞接种室，其中所述心轴是多孔心轴。
3.根据权利要求1或2所述的细胞接种室，其在所述抽吸杆或所述心轴与所述壳体之间具有介于约1mm与30mm之间，优选地介于约1mm与约20mm之间、介于约1mm与约10mm之间或介于约1mm与约5mm之间的间隙。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的细胞接种室，其中所述壳体沿所述壳体的所述长度具有可变宽度。
5.根据权利要求4所述的细胞接种室，其中所述壳体具有定位于所述壳体的所述长度的约30％与60％之间的具有最大宽度的区域。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的细胞接种室，其具有侧向排气端口。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的细胞接种室，其被配置成在所述心轴与所述壳体之间收纳支架。
8.一种聚合物生物降解型血管移植物或支架，其包括内表面结构和外表面结构，所述内表面结构和所述外表面结构用于诱导狭窄的自发逆转，从而允许细胞在所述血管移植物或支架内均匀分散。
9.根据权利要求8所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其包括轴向布置的聚合物纤维层和周向布置的聚合物纤维峰。
10.根据权利要求8或9所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其包括所述内表面上的平均孔径和所述外表面上的不同的平均孔径。
11.根据权利要求8到10中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其在所述内表面上的平均孔径介于约35μm与50μm之间，优选地介于约38μm与50μm之间，最优选地介于约38μm与45μm之间。
12.根据权利要求8到10中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其在所述外表面上的平均孔径介于约25μm与45μm之间，优选地介于约27μm与43μm之间，最优选地介于约30μm与43μm之间。
13.根据权利要求9到12中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其在各层之间的间隔介于约0.5mm与2mm之间，优选地介于约0.5mm与1.5mm之间，最优选地为约1mm。
14.根据权利要求9到13中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其在各峰之间的间隔介于约0.5mm与2mm之间，优选地介于约0.5mm与1.5mm之间，最优选地为约1mm。
15.根据权利要求8到14中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其包括所述内表面和/或所述外表面的表面区域的表面孔隙率，所述表面孔隙率介于约0.6与0.95之间，优选地介于约0.7与0.9之间，最优选地介于约0.8与0.9之间。
16.根据权利要求8到15中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其包括以纬纱图案编织的聚合物纤维。
17.根据权利要求8到16中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其纤维直径介于约1μm与约100μm之间，优选地介于约1μm与约50μm之间，最优选地介于约5μm与约30μm之间。
18.根据权利要求8到17中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其进一步包括聚合物涂层。
19.根据权利要求8到18中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其内径介于约14mm与24mm之间，优选地介于约14mm与20mm之间，最优选地介于约15mm与20mm之间。
20.根据权利要求8到19中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其长度介于约5cm与25cm之间，优选地介于约5cm与15cm之间，最优选地介于约10cm与15cm之间。
21.根据权利要求8到20中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其包括选自由以下组成的组的一种或多种聚合物：聚酯、聚(原酸酯)、聚(磷腈)、聚(己内酯)、聚酰胺、多糖和其共混物和共聚物。
22.根据权利要求8到21中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其中所述移植物或支架在植入后约六个月内在很大程度上降解。
23.根据权利要求8到22中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其进一步包括活自体细胞。
24.根据权利要求23所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其中所述活细胞是骨髓单核细胞。
25.根据权利要求8到24中任一项所述的聚合物生物降解型血管移植物或支架，其中所述移植物或支架进一步包括选自由以下组成的组的一种或多种另外的药剂：抗新生内膜剂、化疗剂、甾体和非甾体抗炎药、常规免疫治疗剂、免疫抑制剂、细胞因子、趋化因子和生长因子。
26.一种用于用细胞对移植物或支架进行接种的方法，所述方法包括
a)将根据权利要求1到7中任一项所述的接种室连接到封闭式一次性接种系统，所述封闭式一次性接种系统包括具有包括血液或富集细胞的流体的器皿，
b)将移植物或支架插入在所述接种室的所述心轴之上，
c)通过重力流和抽气，用所述流体填充所述接种室，至移植物或支架的约一半，
d)用所述流体填充所述接种室，以覆盖所述移植物或支架，以及
e)引入负压以穿过所述移植物或支架抽出所有所述流体。
27.一种用于用细胞对移植物或支架进行接种的方法，所述方法包括
a)将根据权利要求1到7中任一项所述的接种室连接到封闭式一次性接种系统，所述封闭式一次性接种系统包括具有包括血液或富集细胞的流体的器皿，
b)将移植物或支架插入在所述接种室的所述心轴之上，
c)用所述流体填充所述接种室，
d)将负压施加到下部心轴出口并将所述室排空至约一半，
e)倒置所述室，以及
f)施加负压并且通过上部出口端口排空所述室。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中负压由注射器、泵或真空源提供。
29.根据权利要求26到28中任一项所述的方法，其中所述移植物或支架是根据权利要求8到25中任一项所述的聚合物移植物或支架。
30.根据权利要求26到29中任一项所述的方法，其中所述流体的体积介于约10ml与200ml之间。
31.根据权利要求26到30中任一项所述的方法，其中所述流体具有约105个白细胞(WBC)/ml到108个WBC/ml，优选地为约106个WBC/ml到108个WBC/ml，更优选地为约106个WBC/ml到107个WBC/ml。
32.根据权利要求26到31中任一项所述的方法，其中所述移植物或所述支架的长度介于10cm与15cm之间。
33.根据权利要求26到32中任一项所述的方法，其中接种在介于约1分钟与15分钟之间，优选地介于约1分钟与10分钟之间，最优选地介于约1分钟与7分钟之间的时间段内完成。
34.根据权利要求26到33中任一项所述的方法，其中所述移植物或所述支架是沿着所述支架的所述长度以基本上类似的细胞密度用细胞进行接种的。
35.根据权利要求26到34中任一项所述的方法，其中沿着所述支架的所述长度，所述细胞密度介于约0.1x103个细胞/mm2与105个细胞/mm2之间，包含端值，优选地，沿着所述支架的所述长度，所述细胞密度介于约0.1x103个细胞/mm2与104个细胞/mm2之间，包含端值，最优选地，沿着所述支架的所述长度，所述细胞密度介于1x103个细胞/mm2与104个细胞/mm2之间，包含端值。
36.一种减少或减少或预防受试者的术后狭窄的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求8到25中任一项所述的聚合物血管移植物或支架。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述受试者具有罹患再狭窄或其它血管增生病症的风险或患有再狭窄或其它血管增生病症。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述受试者已经经历、正在经历或将经历血管创伤、血管成形术、血管外科手术或移植动脉病。
39.根据权利要求36到38中任一项所述的方法，其中相对于对照受试者，所述聚合物血管移植物或支架减少或预防受试者的术后新生内膜形成、狭窄或再狭窄，减少或预防血栓形成，或其任何组合。
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