JP2011509156A - 血管移植片の開存性を促進するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、Christopher K.Breuer、Themis R.Kyriakides およびJason D.Rohにより、2008年1月8日に出願された米国仮特許出願第60/010,406号への優先権および利益を主張し、この米国仮特許出願の全体は、可能な限り本明細書中に参考として援用される。
本発明は、NIH(National Institutes of Health)よって与えられた認可番号5K08HL083980の下での政府支援とともに行われた。政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
用語「導管」、「移植片」、「血管移植片」、および「骨格」は、本明細書で互換的に使用される。
生分解性合成血管移植片の開存性は、1つまたは複数のサイトカインおよび/またはケモカインを投与して、生分解性合成血管移植片の長期間開存性を促進することによって増大する。サイトカインまたはケモカインの投与により、サイトカインまたはケモカインの非存在下での移植片の開存性と比べて、生分解性合成血管移植片の開存性が増大する。
本明細書に開示されるポリマー血管移植片は、生分解性ポリマーを使用して製造される管状多孔質導管である。ポリマー血管移植片中の孔により、移植片中への宿主細胞の動員および組込みが可能になる。動員された宿主細胞は、外向きの血管組織リモデリング、および血管新組織形成を媒介すると考えられる。現在臨床で使用されている合成血管移植片と異なり、開示されるポリマー血管移植片は生分解性であり、これにより、移植片が分解するにつれて、新組織を形成することによって、移植片が置き換えられることが可能になる。したがって、開示されるポリマー血管移植片は、成長能を提供し、これは、現在使用されている合成血管移植片では可能でない。
生分解性合成血管移植片は、任意の公知の生分解性ポリマー、コポリマー、またはこれらの混合物を使用して製造することができる。多くの適当な生分解性ポリマーが当技術分野で公知である。
生分解性ポリマーの不織、織られた、または編まれたシートまたはフェルトから製造される合成血管移植片は、ポリマーシーラントを用いてさらに処理することができる。ポリマーシーラントは、引張強度および弾性などの血管移植片の生体力学特性を改変するように機能する。ポリマーシーラントは、血管移植片の総多孔度および孔サイズ分布範囲を制御するのに使用することもできる。
適当なサイトカインおよびケモカインには、移植された合成血管移植片への宿主細胞の動員を促進するサイトカインおよびケモカインが含まれる。特に適当なサイトカインおよびケモカインには、移植後に、移植された合成血管移植片への単球の早期動員を促進するものが含まれる。血管移植片に早期に動員される単球は、外向きの血管組織リモデリング、および血管新組織形成を促進すると考えられる。
血管移植片の適合を促進する追加の生物活性剤も投与することができる。適当な生物活性剤または薬物として、それだけに限らないが、抗血栓薬、例えばヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、およびPPack(デキストロフェニルアラニンプロリンアルギニンクロロメチルケトン);抗増殖剤、例えば、エノキサパリン(enoxaprin)、アンギオペプチン、または平滑筋細胞増殖を遮断することができるモノクローナル抗体、ヒルジン、およびアセチルサリチル酸など;抗腫瘍薬/抗増殖剤/抗有糸分裂剤、例えば、パクリタキセル、5−フルオロウラシル、シスプラチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エポチロン、エンドスタチン、アンジオスタチン、およびチミジンキナーゼ阻害剤;麻酔剤、例えば、リドカイン、ブピバカイン、およびロピバカイン;抗凝固剤、例えば、D−Phe−Pro−Argクロロメチルケトン、RGDペプチド含有化合物、ヘパリン、抗トロンビン化合物、血小板受容体アンタゴニスト、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、プロスタグランジン阻害剤、血小板阻害剤、およびマダニ抗血小板ペプチド;血管細胞増殖プロモーター、例えば、増殖因子阻害剤、増殖因子受容体アンタゴニスト、転写アクチベーター、および翻訳プロモーター;血管細胞増殖阻害剤、例えば、増殖因子阻害剤、増殖因子受容体アンタゴニスト、転写抑制因子、翻訳抑制因子、複製阻害剤、阻害性抗体、成長因子に対する抗体、成長因子と細胞毒からなる二官能性分子、抗体と細胞毒からなる二官能性分子;コレステロール低下薬;血管拡張剤;ならびに内因性血管作動性(vascoactive)機構を妨害する薬剤が挙げられる。
サイトカインまたはケモカインは、ポリマー血管移植片を受けている対象に、有効量で投与されることによって、移植された血管移植片における再狭窄、血栓形成、または動脈瘤形成が予防、阻害、または低減される。正確な投与量は、様々な要因、例えば、投与されている特定のサイトカイン(複数も)またはケモカイン(複数も)の性質、投与経路、および対象に依存する可変物(例えば、年齢など)によって変化する。
一実施形態では、サイトカインおよびケモカインを含めたポリペプチド生物活性剤は、非経口注射によって水溶液で投与される。この製剤は、懸濁液またはエマルジョンの形態とすることもできる。一般に、医薬組成物は、有効量のサイトカインまたはケモカインを含んで提供され、薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤、および/または担体を場合により含む。そのような組成物は、希釈剤、滅菌水、様々な緩衝剤含量(例えば、トリス−HCl、酢酸塩、リン酸塩)の緩衝化食塩水、pHおよびイオン強度;ならびに場合により、添加剤、例えば界面活性剤および可溶化剤(例えば、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)80、ポリソルベート80)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、および保存剤(例えば、チメロサール(Thimersol)、ベンジルアルコール)、および充填物質(例えば、ラクトース、マンニトール)を含む。非水性溶媒またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウモロコシ油などの植物油、ゼラチン、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。製剤は、凍結乾燥し、使用直前に再溶解/再懸濁させることができる。製剤は、例えば、細菌をとどめるフィルターを通して濾過することによって、組成物中に滅菌剤を組み込むことによって、組成物を照射することによって、または組成物を加熱することによって滅菌することができる。
別の実施形態では、サイトカインまたはケモカインを含めた生物活性剤は、局所的に投与される。
一実施形態では、サイトカインまたはケモカインは、制御放出製剤を使用して全身的または局所的に投与することができる。好適な実施形態では、サイトカインまたはケモカインは、制御放出製剤を使用して移植片移植部位に局所的に投与される。一実施形態では、サイトカインまたはケモカインは、制御放出製剤として機能するポリマー血管移植片中、またはこのポリマー血管移植片上に組み込まれる。サイトカインまたはケモカインは、任意の公知の適当な方法を使用して、ポリマー血管移植片全体に均等に分散させることができる。例えば、1つまたは複数のサイトカインまたはケモカインは、ポリマー溶液もしくはエマルジョンにこれらを添加することによる製造の間、またはエレクトロスピニング法などによるポリマー布地の製造の間に、ポリマー骨格に添加することができる。さらに、または代わりに、1つまたは複数のサイトカインまたはケモカインは、製造後にポリマー移植片に添加することができる。別の実施形態では、サイトカインまたはケモカインは、管状ポリマー血管移植片の外部または管腔に選択的に局在化されることが好ましい。
ペプチドでもポリペプチドでもない生物活性剤も、経口送達用に製剤化することができる。経口固体剤形は、当業者に公知である。固体剤形として錠剤、カプセル、ピル、トローチもしくはロゼンジ、カシェ剤、ペレット、粉末、もしくは顆粒、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒状製剤中、もしくはリポソーム中への材料の組込んだもの(incorporation)が挙げられる。そのような組成物は、本タンパク質および誘導体の物理状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響し得る。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、21版(2005年、Lippincott、Williams & Wilins、Baltimore、Md. 21201)889〜964頁を参照されたい。この組成物は、液体形態で調製することができ、乾燥粉末(例えば、凍結乾燥した)形態とすることができる。リポソーム被包またはポリマー被包を、組成物を製剤化するのに使用することができる。Marshall, K.、「Modern Pharmaceutics」、G. S. BankerおよびC. T. Rhodes編 10章、1979年も参照されたい。一般に、製剤は、活性薬剤、および胃環境においてペプチドを保護し、腸内で生物学的に活性な物質を放出する不活性成分を含む。
本明細書に開示される生分解性合成血管移植片は、任意の血管または心血管の外科的な用途のための静脈、動脈、または動静脈(artero−venous)導管として使用することができる。例示的な用途には、それだけに限らないが、先天性心臓手術、冠動脈バイパス手術、末梢血管手術、および血管アクセスが含まれる。
播種されたヒト骨髄単核細胞(hBMC)は、TEVGの機能的結果および血管発生を改善する
材料および方法:
生分解性PGA−P(CL/LA)骨格構築物
二重シリンダーチャンバー成形システムを直径6.5mmのポリプロピレンロッドから構築した。長さ30mmにわたって、直径1.4mmの内側シリンダーをロッドの中心を通じて抜き、入口では6.0mmとなるように徐々に先細にした。ポリグリコール酸(PGA)不織フェルト(ConcordiaFibers、Coventry、RI)を、骨格のフレームワークに使用した。フェルトは、約90%(PGA)または83%(PLLA)の総多孔度を有する300mmの厚さであった。内側シリンダーが徐々に先細であることにより、平らなフェルト切片(6.0mm×4.0mm)を、二重シリンダーチャンバーシステムの入口を通して挿入する間に、容易に管に形成することが可能になった。次いでステンレス鋼針(21g)を反対端に導入することによって、内側の管腔を維持し、フェルトをさらに圧縮した。3−カプロラクトンとL−ラクチド(P(CL/LA))の50:50コポリマーシーラント溶液(263,800Da、Absorbable Polymers International、Birmingham、AL)を、1,4−ジオキサン中に5%(w/v)でコポリマーを溶解させることによって作製した。このP(CL/LA)シーラントをチャンバーシステムの入口に注入し、フェルトを貫通させ、開いた綴じ目(open seam)を融合させた。ハイブリッドポリエステル骨格を、−20℃で30分間、即座に凍結させ、P(CL/LA)シーラントの液体から固相への急速な変換を可能にし、PGA繊維を相互接続している新しく画定された多孔質構造のP(CL/LA)ポリマーを有する封管を作製した。骨格を24時間凍結乾燥することによって、溶媒を除去した後、これらを二重シリンダーチャンバーシステムから取り出した。
マウスの骨髄を、MCP−1−/−または同系のC57BL/6マウス(Jackson Laboratories)の大腿骨から単離した。未分画のヒト骨髄(10ドナー)は、Lonzaから購入した。骨髄を滅菌PBS中で1:1に希釈し、100μmナイロンメッシュを通して濾過した。次いでhistopaque−1077(ヒト)またはhistopaque−1068(マウス)(Sigma)を使用して、密度勾配遠心分離によって単核細胞を単離した。
骨格にBMCを付着させるのに、フィブリンゲル溶液を使用した。滅菌したフィブリノーゲン溶液(PBS中100mg/mlのヒトフィブリノーゲン[Sigma])中に2×106細胞/mlでBMCを懸濁させた。50マイクロリットルのBMC−フィブリノーゲン溶液(1×106個のBMC)を、それぞれの骨格上に静的に播種した。滅菌したトロンビン溶液(PBS中40mMのCaCl2中の100U/mlのヒトトロンビン[Sigma])を添加することによって、細胞溶液を骨格上に凝固させた。播種した骨格は、外科的に移植される準備ができるまで、10%のFBSを含むRPMI−1640培地中で、37℃でインキュベートした。すべての骨格は、播種して48時間以内に移植した。
すべての骨格は、3〜4カ月齢のメスのC.B−17 SCID/bgマウス(Taconic Farms)の腎臓下の下大静脈(IVC)中に縫合した。麻酔したマウスを仰臥位に配置し、腹部正中切開で開いた。腎臓下IVCまたは大動脈を、5倍の拡大率下で露出し、クロスクランプし、切除した。次いで、末端間の近位および遠位の吻合について、連続10−0ナイロン縫合糸を使用して、長さ3ミリメートルの骨格を間置移植片として挿入した。動物を手術から戻し、いずれの抗凝固または抗血小板療法を使用することなく維持した。合計97匹の動物に、BMC播種骨格、播種していない骨格、MCP−1を溶出する骨格を移植した。1日目、3日目、1週間目、3週間目、6週間目、10週間目、および24週間目に、動物を屠殺し、移植片を生理的圧力条件下でインビボ灌流固定にかけた後、外植した。すべての動物実験は、動物の使用およびケアについての施設の指針に従って行い、倫理調査委員会は、記載した実験手順を認可した。
TEVGのインビボ開存性および形態を、microCTAを使用して評価した。麻酔したマウスを、100IUのヘパリンを用いて抗凝固処置した後、屠殺した。PE−10(ポリエチレン)カテーテルを、IVCまたは大動脈中に挿入し、Omnipaque(300mg/ml)300mlを、それぞれの静脈または動脈の循環系中に注入した。次いでマウスを、X−O(商標)microCT(Gamma−Medica、Northridge、CA)で映像化した。COBRAソフトウェア(Exxim Computing Corporation)を使用して3次元再構築を行った。Total Commander(Ghisler & Co.)を使用して画像を合わせ、AMIDEイメージングソフトウェア(Loening)を用いてボリュームを与えた。
外植した移植片を10%のホルマリン中で一晩固定し、次いでパラフィン中に包埋した。H&E、Gamoriトリクローム(コラーゲン)、およびVerhoeff−van Gieson(エラスチン)を用いて切片を染色した。以前に公開された方法を使用して、いくつかの移植前のhBMC播種骨格を、グリコールメタクリレート中に包埋することにより、加工してより良好な組織学的構造を維持した。
ImageJソフトウェア(NIH)を使用して、それぞれの外植した骨格についての内径および壁厚を測定した。
すべてのデータを平均値±標準誤差として表す。統計的有意は、Windows(登録商標)用MS ExcelおよびSPSS11.5で計算した。すべての多群分析において、群間の全体的な比較は、一元配置ANOVAを用いて実施した。有意差が見出された場合、チューキー法を使用して対での比較を実施し、複数の対での分析を補正した。厳密に対での比較をするために、独立したスチューデントのt検定を実施した。0.05未満の確率値は、有意であるとみなした。
骨格上にhBMCを播種することにより、並行して移植した播種していない骨格と比較して、IVC間置移植片としてその開存率が有意に改善された。術後10週目までに、7つの播種していない骨格のうちの3つは完全に閉塞し、1つは70%超狭窄し、残りの3つは開存のままであった(図1)。マイクロCT血管造影は、マウスは、大静脈側副を発達させることにより、移植片閉塞を補償したことを示し、閉塞は、急性血栓事象ではなく、段階的な狭窄過程による可能性があることを示した。閉塞した骨格の組織学的分析での確認によって、管腔内への閉塞性の細胞増殖が示された。反対に、hBMC播種を移植前に実施した場合、100%の開存率を得た(図1)。すべてのhBMC播種骨格(n=5)は、10週目で開存しており、マイクロCT血管造影および組織学的分析の両方によって測定した場合、十分に画定された内部管腔を有していた。
幹細胞は、播種したhBMCのマイナー画分を構成する。
材料および方法は、以下に記載したものを除いて、実施例1に記載した通りであった。
フローサイトメトリーを使用することによって、ヒト骨髄の単核細胞画分中の亜集団を同定し、定量化した。5人の異なるドナーに由来するヒトBMCを使用し、3連で試験した。使用した抗体は、BD Biosciences(CD8 PerCP(SK1)、CD14 FITC(M5E2)、CD31 FITC(WM59)、CD34 PEおよびPerCP−Cy5.5(8G12)、CD45 APC−Cy7(2D1)、CD56 PE(NCAM16.2)、CD146(P1H12)、CD73 PE(AD2)、CD90 FITC(5E10)、7AAD);E−Bioscience(CD3 APC(HIT3a)、CD4 FITC(L3T4)、CD19(PE−Cy7));Miltenyi Biotec(CD133 APC(AC133));R&D Systems(VEGFR2 PE(89106));ならびにAbD Serotec(CD 105 Alexa 647(SN6))から購入した。細胞はFACSAria細胞選別機で取得し、結果はDIVAソフトウェア(BD Bioscience)を使用して分析した。
相対的な細胞性を、それぞれの外植した骨格について測定した。各外植片の2つの別々の切片をH&Eを用いて染色し、400倍の拡大率で画像化し、高倍率視野(hpf)として示した。次いで、各切片の5つの領域において、核の数をカウントし、平均した。宿主マウス単球、および播種したヒトBM−MNC亜集団を、それぞれ、陽性のF4/80、hCD45、hCD34およびhCD31発現によって同定し、また、移植前の骨格、および術後1週目の外植片において、同様の方法を使用して定量化した。
播種したhBMCが、血管成長およびTEVGの発達を改善した機構を決定するために、播種に使用したヒトBMC集団内の細胞集団の表現型および相対的な存在量を最初に調査した。ヒトBMCは、単球(10±4.7%)、CD4+T細胞(7.0±2.7%)、CD8+T細胞(7.9±2.5%)、B細胞(6.4±2.1%)、およびNK細胞(3.2±1.4)を含む成熟白血球集団から主になっていた(表1)。
播種したhBMCは、発達中の新血管中に組み込まれない
材料および方法:
材料および方法は、以下に記載したものを除いて、実施例1および2に記載した通りであった。
種特異的抗体を使用することによって、播種したヒト細胞と動員されたマウス宿主細胞を区別した。使用したヒト特異的一次抗体は、マウス−抗ヒトCD31(Dako)、CD68(Dako)、CD34(Abcam)、およびCD45(AbD Serotec)を含んでいた。使用したマウス特異的一次抗体は、ラット−抗マウスMac−3(BD Bioscience)、F4/80(AbD Serotec)、IL−1β(R&D Systems)、およびヤギ−抗マウスVEGF−R2(R&D Systems、最小の交差反応性)を含んでいた。両方の種と交差反応する一次抗体は、マウス−抗ヒトα−平滑筋アクチン(αSMA)(Dako)、VEGF(Santa Cruz)、およびウサギ−抗ヒトフォンウィルブランド因子(vWF)(Dako)であった。抗体結合は、適切なビオチン化二次抗体を使用し、その後にストレプトアビジン−HRPを結合し、3,3−ジアミノベンジジン(Vector)を用いて発色させることによって検出した。次いで核を、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。免疫蛍光検出のために、ヤギ−抗ウサギIgG−Alexa Fluor 568(Invitrogen)、またはヤギ−抗マウスIgG−Alexa Fluor 488(Invitrogen)を使用し、引き続いて4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)で核を対比染色した。
移植して1、3、7、もしくは21日後、または移植直前に収集したTEVGを、液体窒素で即座に凍結し、ドライアイス上で機械的に粉砕し、その後にRLT溶解緩衝液(Oiagen)中でインキュベートすることによってRNAを抽出した。Qiashredderカラム(Oiagen)を通して試料を通過させ、製造者のプロトコールに従って、RNeasyミニキット(Oigen)を使用して処理した。ランダムなヘキサマーおよびオリゴ−dTプライマーを用いた逆転写を、Multiscribe RTシステムプロトコール(Applied Biosystems)に従って実施した。TaqMan 2x PCR Master Mix、およびApplied Biosystemsからの事前に作製したアッセイ試薬(ヒトGAPDH、Hs99999905ml.マウスHPRT、Mm00446968ml)を用いてPCR反応物を準備し、iQ5(Bio−Rad)で分析した。ヒトおよびマウスのプローブの種特異性は、ヒトおよびマウスの対照動脈セグメントで確認した。ヒトRNAの検出限界を求めるために、培養物中のヒトBMC細胞、および骨格上に播種したヒトBMC細胞の10倍連続希釈物から得たヒトGAPDHレベルを測定することによって、検量線を作成した。このアッセイの検出限界は、10細胞と100細胞の間であった。
播種したhBMCまたはその子孫が、発達中のTEVGの細胞性に直接寄与しているかどうかを判定するために、次にヒト特異的マーカーおよび免疫組織化学を使用して、24週間にわたってこれらの細胞を追跡した。CD34+ヒト幹細胞は、術後1週目までにもはや検出することができなかったが、CD68+ヒト単球およびCD31+ヒトECは、骨格の壁内に依然として検出することができた。しかしいずれの細胞型も、管腔表面、血管新組織形成の位置に沿って同定されなかった。3週目までに、CD45、CD68、CD31、またはCD34を発現するヒト細胞は、移植片のどこにもまったく検出することができず、播種したhBMCは、この時点後に存在する可能性はないことを示した。Q−RT−PCRによるヒト特異的GAPDH RNAの検出は、移植前にTEVG上でヒトRNAの存在を確認したが、7POD後にいずれのヒトRNAも検出することができなかった(図2)。
BMC由来MCP−1は、TEVG発達における決定的な分子である
材料および方法:
材料および方法は、以下に記載したものを除いて、実施例1〜3に記載した通りであった。
RPMI−1640+10%のFBS中、PGA−P(CL/LA)骨格または組織培養プラスチック上で、2×106細胞/mlで48時間hBMCを培養した。上清中のVEGF、SDF−1、IL−1β、およびMCP−1のレベルを、R&D SystemsからのELISAキットを使用して測定した。最小検出値は、SDF−1αが156pg/mL、VEGFが15.6pg/mL、IL−1βが3.9pg/mLであり、MCP−1が31.2pg/mLであった。
上記知見に基づいて、宿主単球が、新血管発達を促進すると仮定した。残りの実施例は、播種したhBMCが、早期の宿主単球動員をどのように増大させることができたかに対処する。骨格バイオマテリアルとの相互作用が、hBMCによる走化性因子の産生にどのように影響したかを最初に調査した。ELISAを使用することによって、インターロイキン−1β(IL−1β)、MCP−1、ストローマ由来因子−1α(SDF−1α)、および血管内皮成長因子(VEGF)を含めたいくつかの候補ケモカインの存在について試験した。骨格への曝露は、hBMCによって分泌されるインターロイキン−1β(IL−1β)およびMCP−1の量を有意に増加させることが判明した(図4Aおよび4B)。幹細胞動員としばしば関連する2つの因子である、ストローマ由来因子−1α(SDF−1α)および血管内皮成長因子(VEGF)の産生は、骨格材料への曝露があってもなくても、ELISAの検出レベル未満であった。
MCP−1微粒子は、播種したhBMCのパラクリン機能を模倣する
材料および方法:
材料および方法は、以下に記載したものを除いて、実施例1〜4に記載した通りであった。
組換えヒトMCP−1(R&D Systems)を、以前に公開された方法(Jayら、FASEB Jour.、(2008年))を使用して、生分解性アルギネート微粒子中に封入した。微粒子を、50ug/ulの濃度で、P(CL/LA)シーラント中に直接混合することによって、骨格中に組み込んだ。次いで、上述したものと同様の方法を使用して骨格を構築した。骨格上および骨格の外のMCP−1微粒子のサイズおよび形状分布は、XL−30走査型電子顕微鏡(FEI Company)を使用して画像化した。これらの骨格からのMCP−1の放出プロファイルを、ELISA(R&D Systems)によって測定した。MCP−1を溶出する骨格(n=5)を、M199培地1ml中にそれぞれ浸漬し、37℃の軌道振盪機内でインキュベートした。1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、および168時間で、培地を収集し、新鮮なM199培地1mlと交換した。培地試料は、分析するまで−20℃で貯蔵した。
単独で投与したMCP−1が、早期単球動員を有効に誘導し、播種していない骨格についての結果を改善することができたかどうかを調べるために、hBMCを播種することなく、骨格から直接MCP−1を送達することができるシステムを作製した。hBMCの不均一な集団とサイズを類似させた、直径1〜20μmの生分解性アルギネート微粒子中に、組換えヒトMCP−1を封入した。次いでこの微粒子を骨格中に埋め込むことによって、播種したhBMCのMCP−1放出機能を模倣した。埋め込んだ微粒子は、72時間の過程にわたって骨格から約200ngのMCP−1を放出し、これは、播種したhBMCの大部分が保持される期間と同様であった(図6)。
G−CSF投与は、TEVGにおける早期の外向きのリモデリングを促進する
材料および方法:
材料および方法は、以下に記載したものを除いて実施例1〜5に記載した通りであった。
播種していない骨格をIVC間置移植片として移植し、8週間の時間過程にわたって超音波を用いて連続的にモニターした。実験群にG−CSF(10μg/kg)を術前投与する一方で、対照群にはしなかった。
超音波検査を利用することによって、組織操作移植片の機能的および形態的変化を連続的に調査した。1.5%のイソフルランを用いてマウスを麻酔した。記載した時間過程にわたって、Vevo770(Visualsonics)を使用して、移植片の長軸断面で、内径および壁厚を連続的に測定する。測定値は、移植片の最も狭い部分および最も広い部分での特定の測定に加えて、移植片の近位、中位、および遠位の3分の1での測定を含めた3つの位置で得た。すべての測定は、マウス血管の超音波検査における専門技術を有する一人のオペレーターによって実施され、3通り繰り返すことによって、オペレーターに依存する変動を最小限にした。
すべてのデータを平均値±標準誤差として表す。統計的有意は、Windows(登録商標)用MS ExcelおよびSPSS11.5で計算した。すべての多群分析において、群同士間の全体的な比較は、一元配置ANOVAを用いて実施した。有意差が見出された場合、チューキー法を使用して対での比較を実施し、複数の対での分析を補正した。厳密に対での比較をするために、独立したスチューデントのt検定を実施した。0.05未満の確率値は、有意であるとみなした。
G−CSFの術前投与は、外向きのリモデリングを促進する。連続の超音波モニタリングは、移植後2週間と8週間の間のすべての時点で、有意により広い管腔を実証した。これらの知見は、4週間目で最も顕著であり、このときG−CSF群の内径は、0.84mm±0.06mmと測定され、対照群では、0.68mm±0.05mmと測定された(p<0.05)(図8Aおよび8B)。
Claims (22)
- ポリマー血管移植片の開存性を増大させるための方法であって、有効量のサイトカインまたはケモカインを投与することによって、前記移植片への宿主細胞の動員を促進する工程を含む方法。
- 前記血管移植片が生分解性ポリマーまたは生体吸収性ポリマーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生分解性ポリマーまたは生体吸収性ポリマーが、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリアンヒドリド、ポリ(オルト)エステル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリ(酪酸(butic acid))、ポリ(吉草酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ヒドロキシアルカノエート)、およびポリ(ラクチド−コ−カプロラクトン)、またはこれらの組合せ、ブレンド、もしくはコポリマーからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記生分解性ポリマーまたは生体吸収性ポリマーが、繊維ベースのメッシュに形成される、請求項2に記載の方法。
- 前記繊維ベースのメッシュが不織のメッシュである、請求項4に記載の方法。
- 前記血管移植片がポリマーシーラントをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記ポリマーシーラントが、ε−カプロラクトンとL−ラクチドのコポリマーを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記サイトカインまたはケモカインが、MCP−1、IL−1β、およびG−CSFからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記サイトカインまたはケモカインがMCP−1である、請求項8に記載の方法。
- 前記サイトカインまたはケモカインが、前記血管移植片中または前記血管移植片上に組み込まれる、請求項1に記載の方法。
- サイトカインまたはケモカインを含まないポリマー血管移植片と比べて、ポリマー血管移植片への宿主細胞の動員を増大させるための、有効量の前記サイトカインまたはケモカインを含むポリマー血管移植片または導管。
- 生分解性ポリマーまたは生体吸収性ポリマーを含む、請求項11に記載のポリマー血管移植片または導管。
- 前記生分解性ポリマーまたは生体吸収性ポリマーが、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリアンヒドリド、ポリ(オルト)エステル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリ(酪酸(butic acid))、ポリ(吉草酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ヒドロキシアルカノエート)、およびポリ(ラクチド−コ−カプロラクトン)、またはこれらの組合せ、ブレンド、もしくはコポリマーからなる群から選択される、請求項12に記載のポリマー血管移植片または導管。
- 前記生分解性ポリマーまたは生体吸収性ポリマーが、繊維ベースのメッシュに形成される、請求項13に記載のポリマー血管移植片または導管。
- 前記繊維ベースのメッシュが不織のメッシュである、請求項14記載のポリマー血管移植片または導管。
- 前記血管移植片がポリマーシーラントをさらに含む、請求項15に記載のポリマー血管移植片または導管。
- 前記ポリマーシーラントが、ε−カプロラクトンとL−ラクチドのコポリマーを含む、請求項16に記載のポリマー血管移植片または導管。
- 前記サイトカインまたはケモカインが、MCP−1、IL−1β、およびG−CSFからなる群から選択される、請求項11に記載のポリマー血管移植片または導管。
- 前記サイトカインまたはケモカインがMCP−1である、請求項18に記載のポリマー血管移植片または導管。
- 抗血栓薬、抗増殖剤(anti−proliferative agents)、抗炎症剤、抗増殖剤(antiproliferative agents)、麻酔剤、抗凝固剤、コレステロール低下薬、血管拡張剤、および内因性血管作動性(vascoactive)機構を妨害する薬剤からなる群から選択される活性薬剤をさらに含む、請求項11に記載のポリマー血管移植片または導管。
- 前記サイトカインまたはケモカインが、前記血管移植片または導管全体にわたって分散される、請求項11に記載のポリマー血管移植片または導管。
- 前記サイトカインまたはケモカインが、ミクロスフェア、ナノスフェア、微粒子、および/またはマイクロカプセルの形態で封入され、これらが前記ポリマー血管移植片または導管中に播種される、請求項21に記載のポリマー血管移植片または導管。
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