JP2023184762A - 音響液滴射出を使用して試料から標的部分を抽出するためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

【課題】音響液滴射出を使用して試料から標的部分を抽出するためのシステムおよび方法の提供。【解決手段】音響射出技術を使用して試料から標的分析物を抽出するための方法およびシステムが提供される。その方法は、標的分析物を含有し、上方領域および下方領域を含む流体組成物を収容する流体リザーバーに、集束音響エネルギーを印加することを含み、上方領域の標的分析物の濃度は、下方領域の標的分析物の濃度とは異なっている。集束音響エネルギーは、流体組成物から流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で印加され、液滴中の分析物の濃度は、上方領域における分析物の濃度または下方領域における分析物の濃度のいずれかに相当し、分析物の濃度は、液滴にわたって実質的に均一である。上記流体組成物は、イオン標的分析物の抽出に使用されるイオン液体を含むことができる。関連方法および音響抽出システムも提供される。【選択図】なし

Description

（１）技術分野
本発明は、一般に、音響液滴射出を使用して流体組成物から標的分析物を抽出するためのシステムおよび方法に関する。本発明は、化学および生物学を含めた数々の分野において実用性がある。

（２）関連技術の説明
混合物からの分子の抽出は、有機合成化学、材料科学、医薬の研究および開発、ならびに分子生物学を含めた数々の技術分野で用いられるプロセスにおいて必須のステップである。生体分子、例えば核酸およびタンパク質の抽出は、現在、多くの状況で必要とされているが、それらが普通は複雑な宿主環境、例えば細胞、組織および血液に含有されている限り、特に難易度が高い。それにもかかわらず、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の効率的かつ有効な抽出は、数々のプロセスおよび生成物に必要である。診断キット、同一性および血縁関係についての試験、病原体検出、組織適合試験、ならびに遺伝子研究は、まさにそれらの例である。

ＤＮＡ精製は、生物学的環境からの染色体および／もしくはミトコンドリアＤＮＡの分離および除去を伴う場合があり、または組換えＤＮＡ構築物、すなわち組換え配列を含有するＤＮＡ、例えばプラスミドを単離する状況で行われる場合がある。ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、診断試験手順、および高感度アッセイの宿主は、高純度を必要とする。ＤＮＡ試料中の夾雑物は、診断または分析手順の１つまたは複数の非常に重要なステップを阻害するおそれがある。一部の夾雑物は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または制限酵素作用を阻害するおそれがある。

いかなるＤＮＡ精製方法も、（１）生物学的宿主環境、例えば標的ＤＮＡを含有する細胞または組織の有効な破壊、（２）プロテアーゼおよび／または変性剤を使用するタンパク質および核タンパク複合体の変性、（３）内因性ヌクレアーゼの不活化、ならびに（４）試料からの標的ＤＮＡの除去を必要とする。単離された標的ＤＮＡは、元々存在していたいかなる化合物または材料、例えば、タンパク質、脂質、ＲＮＡ、他の核酸等をも含むべきではなく、ほとんどの場合、精製プロセスは、機械的せん断から生じるＤＮＡ断片化または夾雑物の存在を回避しなければならない。ＲＮＡが本来的に不安定であり、内因性ＲＮＡｓｅを阻害するために強力な変性剤が必要とされ、ＲＮＡｓｅが熱安定性であり熱変性後にリフォールドされ、補因子が欠如したＲＮＡｓｅが不活化困難である限り、ＲＮＡの単離は、より一層複雑である。

核酸精製では、細胞または組織の破壊は、通常、細胞膜の脂質二層を破壊するための洗浄剤を使用して行われる。洗浄剤は、細胞膜内の脂質と脂質の相互作用および脂質とタンパク質の相互作用の両方を破壊して、膜構成成分を可溶化可能にする。細胞膜に加えて細胞壁を含有する生物では、追加の処置が必要となる場合があり、例えば、グラム陽性細菌のペプチドグリカン細胞壁を消化するには、リゾチームを用いる処置が必要であり、酵母の多糖体細胞壁を破壊するには、リチカーゼまたはザイモリアーゼ（zymolase）を用いる処置が必要である。

タンパク質および核タンパク質の変性は、二次構造の破壊によるタンパク質構造の改変を伴い、タンパク質変性剤、例えばイオン洗浄剤、カオトロピック剤、還元剤、熱、および／またはプロテアーゼを使用して行われる。哺乳動物細胞では、ＤＮＡは、巨大分子核タンパク質構造のヒストン（すなわち、クロマチン）で圧縮され、変性により、核タンパク複合体からの染色体ＤＮＡの放出が可能になる。キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、典型的に、プロテイナーゼＫのようにヌクレアーゼを不活化するために使用される。一部の商業的システムは、段階的処理、すなわち細胞溶解、変性およびヌクレアーゼ不活化を必要とし、他のシステムは、前述のステップの３つすべてを行うための構成成分を含有する単一溶液を提供している。

最終的に、標的ＤＮＡは、タンパク質、タンパク質断片、脂質、炭水化物、塩および細胞デブリを含有する可能性が高い、処置された生体試料から単離しなければならない。歴史的に、ＤＮＡは、液体－液体抽出を介して精製された。水性細胞加水分解物は、ＲＮＡｓｅ活性を阻害するために必要に応じていくらかのイソアミルアルコールを含有するフェノール－クロロホルム混合物と共に振とうされた。この混合物は、タンパク質、脂質、炭水化物および細胞デブリを含有する疎水性クロロホルム－フェノール下方相と、核酸が残存した上方水相の二層に分離する。上方相のＤＮＡ水溶液は収集され、ＤＮＡは上清から沈殿し、ＤＮＡ沈殿物はすすがれ、緩衝剤で溶解される。しかしその技術は、厄介で時間がかかり、広く指摘されてきた通り、クロロホルムは毒性が高く、フェノールは可燃性、腐食性であり、やはり毒性がある。

液体－液体抽出は、遠心分離ベースのカラムを使用する固相核酸精製方法を大きく置き換えてきた。この場合、細胞可溶化液は、緩衝液、およびカオトロピック剤または短鎖アルコールのいずれかと混合される。可溶化液はカラムに移され、負に帯電している核酸を保持するために表面処置されている固相に液体を通すために遠心分離される。タンパク質および他の夾雑物が、カラムを通して洗浄されると同時に、核酸がそれに結合する。洗浄ステップの後、核酸は、水または緩衝剤（例えば、ｐＨ約８．４の希釈ＴＲＩＳ－ＥＤＴＡ緩衝剤）で溶出される。混床固相抽出も開示されており、Smithらの米国特許第６，３
７６，１９４号を参照されたい。カラムベースのＤＮＡ抽出は、フェノール－クロロホルム技術を用いる従来の液体－液体抽出よりも容易かつ安全であるが、まだ人手がかかり、容易には自動化されない。

従来の固相分離に対する変形形態では、磁気ビーズベースの核酸精製方法が開発されてきた。このプロセスでは、コーティングされたまたはそうでなければ表面処置された磁気ビーズが、カオトロピック剤の存在下で核酸に結合する。ビーズは、生体試料と合わされ、試料中の核酸は、ビーズ表面に結合する。表面に結合した核酸を有するビーズを、マイクロプレートウェル、遠心分離管または他の容器の安定な位置に引き寄せるために、磁石が使用される。ビーズが磁気によって固定されたら、不純物を含有する上清を除去し、ビーズを清浄な洗浄緩衝剤で洗浄し、核酸を、少量の希釈溶出緩衝剤で磁気ビーズから外す。この技術は、遠心分離を排除することによって、一般に他の固相精製方法よりも自動化しやすく、高スループットである。しかし、各試料を清浄にする費用は、かなりかさむ。ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質を単離し、精製するための様々なタイプの抽出技術が、Tan et al. (2009) J. Biomed. Biotech., Article ID 574398に記載されて
いる。その文書に説明されている通り、生体分子を単離し、精製するための改善されたやり方が、継続的に必要とされている。Tanらは、作業時間を短縮し、人件費を低減し、作
業者の安全性を増強し、理想的には結果の再現性および質の両方を増大するためには、抽出手順の自動化が望ましいと述べている。Tanらはさらに、中型から大型研究室での使用
を企図された商業的に利用可能な自動化システムは、それらが大型であり、高価であり、複雑である限り、いくらかの制限を受ける一方、小～中程度の試料のスループットに適合されたより最近の自動化プロセスでは、試料当たりの処理時間が約２０～４０分であり、まだ抽出プロセスに時間がかかっていると述べている。自動化手順の各抽出ステップのためにも、必要に応じた液体の移動のためにも、液体の適切な取扱いは必須であり、Tanらが説明する通り、最適には、ロボットワークステーションが完全に自動化され、それによって前処理ステップの必要性が取り除かれるべきである。Tanらはさらに、小型化の継続
的な改善が必要であり、その改善により、利用可能な抽出システムの弱点を修復できると指摘している。

音響液滴射出（ＡＤＥ）は、不混和性流体の射出に有用であると開示されている方法である。Ellsonらの米国特許第６，５４８，３０８号および同第６，６４２，０６１号を参照されたい。前述の特許文献は、不混和性液体から基材表面上に液滴を射出するためのＡＤＥの使用を記載しており、その液滴は、一般に、液体の一方に対応する第１の領域および他方の液体に対応する第２の領域を有する。しかし、ＡＤＥは、試料からの標的部分の抽出には実行されておらず、抽出技術の開発は、上記のTanらによって説明されている通
り、複雑化し、問題を伴い得ることが周知である。

理想的な抽出システムおよび方法は、少なくとも以下の目標を達成することができる。

単離された標的分子を高純度で提供すること、

多種多様な標的分子のいずれを抽出するにも使用できること、

正確で一貫した、再現性のある結果が得られること、

完全に自動化されること、

高温または不活性雰囲気を必要とすることなく、標準実験室条件下で使用できること、

試料当たりの処理時間を最小限にし、ハイスループット試料処理を可能にすること、

およそナノリットルまたはそれよりも小さい非常に小さい試料サイズの有効かつ効率的な処理、正確性および信頼性を可能にすること、

毒性のある揮発性溶媒の必要性を排除すること、

その後の抽出ステップに再循環し、再使用することができる試薬に頼れること、ならびに

分析デバイス、例えば質量分析計への、抽出された標的部分の急速導入を可能にすること。

米国特許第６，３７６，１９４号明細書明細書 米国特許第６，５４８，３０８号明細書明細書 米国特許第６，６４２，０６１号明細書明細書

Tan et al. (2009) J. Biomed. Biotech., Article ID 574398

発明の要旨
本発明は、当技術分野における前述の必要性に対処し、音響液滴射出（ＡＤＥ）技術を使用して標的分析物を抽出するための方法およびシステムを提供する。標的分析物は、例えば溶媒または溶媒混合物に溶解した流体組成物中に存在し、複数構成成分の組成物に単一分析物または分析物混合物を含むことができる。流体組成物は、生体試料、例えば生体組織、細胞、血液等を含むことができ、それらは、抽出前にある方式で処理されていても処理されていなくてもよい。本発明は、ＡＤＥ技術を用い、好ましい実施形態では、例えば試料中の様々なタイプの構成成分に対して異なる親和性を有する液体、および／または目的の構成成分の溶解度が異なっている液体を使用する液体－液体分配を用いる。本発明の方法およびシステムは、ハイスループットの状況で容易に実施することができ、複雑な生物学的混合物から構成された少量の生体試料を含めた試料から、様々な標的分子を抽出するのに有用である。

本発明の抽出方法は、初期流体組成物からの標的分析物の部分的または完全な除去を包含し、最終的な流体組成物が、初期流体組成物よりも低濃度の非標的構成成分を含有する、分離プロセスも包含する。

本発明の第１の実施形態では、選択された濃度の標的分析物を含有する流体液滴を生成するための方法が提供される。その方法は、（ａ）流体リザーバー内に、標的分析物を含有し、上方領域および下方領域を含む流体組成物を提供するステップであって、分析物は、上方領域では第１の濃度で存在し、下方領域では第２の濃度で存在し、さらに第２の濃度は、第１の濃度とは異なっている、ステップと、（ｂ）流体組成物から流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で、流体リザーバーに集束音響エネルギーを印加するステップであって、射出された液滴は、選択された濃度の標的分析物を含み、さらに選択された濃度は、（ｉ）第１の濃度または第２の濃度のいずれかに実質的に等価であり、（ｉｉ）液滴にわたって実質的に均一である、ステップとを含む。流体リザーバー内の流体組成物は、一般に、標的分析物を含有する試料、例えば生体試料を含む。生体試料は、流体に溶解もしくは懸濁した試料を含むことができ、または生体試料は、それ自体が流体であってよい。

前述の実施形態の一態様では、流体組成物の上方領域は、第１の液体の上方層を含み、流体組成物の下方領域は、第２の液体の下方層を含む。標的分析物、第１の液体および第２の液体に応じて、分析物は、第１の液体または第２の液体に優先的に分配され得る。すなわち、第１の液体および第２の液体は、第１の液体が標的分析物に対して第１の親和性を有し、第２の液体が標的分析物に対して第２の親和性を有するように選択され、第１の親和性および第２の親和性は異なっている。例えば、親水性の、例えばイオン性の標的分析物、親水性の上方液体、および疎水性の下方液体を用いる場合、標的分析物は、上方の親水性の液体に分配される傾向がある。別の例として、標的分析物の溶解度が、上方液体よりも下方液体において高い場合、標的分析物は、下方液体に分配される傾向がある。第１の液体および第２の液体は、揮発度、密度、粘度、および／または他の物理的もしくは化学的特徴が異なっていてよい。

関連する態様では、下方液体への標的分析物の溶解度は、上方液体へのその溶解度と少なくとも約５０％異なる。

関連する別の態様では、下方液体への標的分析物の溶解度は、上方液体へのその溶解度と少なくとも約８５％異なる。

前述の実施形態の別の態様では、標的分析物は、イオン標的分析物、すなわち選択されたｐＨ、例えば約６～約８の範囲のｐＨでイオン化される分析物である。イオン標的分析物は、それぞれカチオン性対イオンまたはアニオン性対イオンと会合している、負に帯電している部分または正に帯電している部分であってよい。

別の態様では、標的分析物は、生体分子を含む。生体分子は、核酸、ペプチドまたはタンパク質、脂質部分等であってよい。関連する態様では、生体分子は、ＤＮＡを含む。ペプチド、タンパク質等は、約１００ダルトン～約２００キロダルトンの範囲の分子量を有することができる。しかし本発明が、大きい核酸断片、非断片化一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、１つの全ゲノムまたは２つ以上の全ゲノム、および無傷細胞との併用に有用である限り、かなり大きい標的分析物も想定される。

さらなる態様では、流体組成物は、イオン液体、すなわち抽出のために使用される条件で液体形態である塩を含む。

関連する態様では、その方法は、流体組成物からの荷電生体分子、例えば核酸（例えば、ＤＮＡ）の音響射出に、イオン液体を用いる。

関連する別の態様では、イオン液体は、第１の液体として働き、水性液体は、第２の液体として働き、水性液体は、イオン液体および水性液体に対するイオン分析物の相対的親和性を変えるｐＨに緩衝される。

前述の実施形態の別の態様では、その方法はさらに、ステップ（ａ）の前に、試料と第１の液体および第２の液体の混和性混合物との組合せを、２つの液体を実質的に不混和性にする条件に晒して、流体組成物を上方領域および下方領域に分配することを含む。

実施形態の別の態様では、液滴レシーバーは、分析機器を含む。関連する態様では、分析機器は、質量分析計である。

実施形態の別の態様では、方法のステップ（ｂ）は、複数の流体液滴を液滴レシーバー内に射出するために、複数回反復される。

実施形態の別の態様では、液滴レシーバーは、液滴を受けるリザーバーを含む。関連する態様では、方法のステップ（ｂ）は、標的分析物の少なくとも２０ｗｔ．％が流体リザーバーから液滴を受けるリザーバーに移されるまで、複数回反復される。

実施形態のさらなる態様では、流体リザーバーは、標的分析物を含有する流体組成物をそれぞれ収容する複数の流体リザーバーの１つであり、流体組成物のいずれか２つは、同じでも異なっていてもよく、かつ／または標的分析物のいずれか２つは、同じでも異なっていてもよい。複数のリザーバーは、アレイ状に配列されていてよく、かつ／または統合された複数のリザーバーユニットを含む基材内に含有されていてよい。関連する態様では、流体液滴は、流体リザーバーのアレイから液滴を受けるリザーバーの対応するアレイに音響的に射出される。

実施形態の別の態様では、流体リザーバー内の流体組成物は、約１２５μＬ以下の体積を有する。

実施形態の別の態様では、射出された流体液滴は、約６０ｎＬ以下の体積を有する。

実施形態の別の態様では、流体液滴は、約３０ｎＬ以下の体積を有する。

この実施形態の関連する態様では、音響液滴射出は、例えば、最大約０．５秒、または最大約０．１秒、または最大約０．００１秒の急速なリザーバーからリザーバーへの遷移により、複数の流体リザーバーに対して連続して行われる。

実施形態のさらなる態様では、流体リザーバーの内表面は、表面コーティング組成物でコーティングされる。関連する態様では、表面コーティングは、上方流体層をはじくか、または引き付け、それによって上方流体層のメニスカスの形状および中心領域の厚さを変えるように選択される。

実施形態の別の態様では、その方法は、上方流体層および下方流体層の間の液体と液体の境界の存在を検出することをさらに含む。関連する態様では、流体液滴は、液体と液体の境界が検出されなくなるまで上方流体層から繰り返し射出され、このことは、上方層の実質的にすべてが流体組成物から除去され、音響射出プロセスが停止され得ることを意味する。

本発明の別の実施形態では、試料からイオン標的分析物を抽出するための方法であって、イオン液体へのイオン分析物の分配を促進する条件下で、試料をイオン液体および非イオン液体と混ぜ合わせ、その混合物から非イオン液体を音響的に除去することを含む、方法が提供される。

本発明の追加の実施形態では、試料からイオン標的分析物を抽出するための方法であって、イオン液体へのイオン分析物の分配を促進する条件下で、試料をイオン液体および非イオン液体と混ぜ合わせて、イオン分析物のイオン液体溶液を提供し、その混合物から非イオン液体を除去し、イオン分析物溶液の液滴を液滴レシーバー内に音響的に射出することを含む、方法が提供される。

別の実施形態では、本発明は、（ａ）流体リザーバー内に、標的分析物を含有し、第１の液体の上方層および第２の液体の下方層を含む初期流体組成物を提供するステップであって、分析物は、上方層では第１の濃度で存在し、下方層では第２の濃度で存在し、第２の濃度は、第１の濃度よりも高い、ステップと、（ｂ）流体の上方層の流体液滴を射出するのに有効な方式で、流体リザーバーに集束音響エネルギーを繰り返し印加し、それによって、上方層の少なくとも一部を除去しながら、下方層が流体リザーバー内に残存できるようにするステップとを含む、抽出方法を提供する。

本発明のさらなる実施形態では、生体試料からイオン分析物を抽出するための方法であって、（ａ）イオン分析物を含む生体試料および水性媒体の液滴を、液滴を受けるリザーバーに含有されているイオン液体に音響的に射出するステップと、（ｂ）液滴を受けるリザーバーを反転し、それによって、上方水層およびイオン分析物を含む下方イオン液体層を形成するステップと、（ｃ）上方水層を除去して、イオン液体中にイオン分析物を含むイオン分析物溶液を提供するステップとを含む、方法が提供される。生体試料は、処理された生体試料、例えば溶解細胞を含有する試料であってよい。

実施形態の一態様では、水性媒体は、生体試料を第１のｐＨに維持する緩衝システムを含み、第１のｐＨは、生体試料中のイオン分析物の少なくとも６０ｗｔ．％がイオン液体と混ぜ合わされる際にイオン液体に分配されるように選択される。

実施形態の別の態様では、その方法は、ステップ（ｃ）の後、（ｄ）イオン分析物溶液を、イオン液体中のイオン分析物の少なくとも６０ｗｔ．％が抽出緩衝剤に分配されるように選択された第２のｐＨを有する抽出緩衝剤と混ぜ合わせるステップをさらに含む。

さらなる実施形態では、本発明は、水性生体試料からＤＮＡを音響的に抽出するための方法であって、

（ａ）上方水層および下方イオン液体層を含む流体組成物を提供するのに有効な条件下で、水性生体試料を、流体リザーバー内でイオン液体と混ぜ合わせるステップと、

（ｂ）生体試料中のＤＮＡが、下方イオン液体層に分配されるように、流体組成物を処置するステップと、

（ｃ）イオン液体中のＤＮＡ溶液が、流体容器内に残存するように、上方水層を除去するステップと、

（ｄ）ＤＮＡ溶液を、イオン液体中のＤＮＡの少なくとも６０ｗｔ．％が抽出緩衝剤に分配されるように選択されたｐＨを有する抽出緩衝剤と混ぜ合わせるステップと、

（ｅ）ＤＮＡを含有する抽出緩衝剤の液滴を、液滴レシーバー内に音響的に連続的に射出するステップとを含む、方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、水性生体試料から脂質構成成分を抽出するための方法であって、水性生体試料を流体リザーバー内で有機溶媒と混ぜ合わせ、それによって、脂質溶液を含む上方有機層および下方水層を有する分配された流体組成物を提供するステップと、脂質溶液の液滴を、液滴レシーバー内に音響的に連続的に射出するステップとを含む、方法を提供する。

本発明のさらなる実施形態では、試料からイオン標的分析物を抽出するための音響抽出システムであって、（ａ）イオン標的分析物およびイオン液体を含む流体組成物を収容する流体リザーバーと、（ｂ）流体組成物から流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で音響放射を発生させるために、流体リザーバーと音響的な接続関係にある音響液滴射出器であり、音響放射発生器、およびリザーバー内の焦点に音響放射を集束させるための集束手段を含む、音響液滴射出器とを含む、システムが提供される。

この実施形態の一態様では、そのシステムは、液滴レシーバー、例えば分析機器、例えば質量分析計等、または液滴を受けるリザーバーをさらに含む。

この実施形態の別の態様では、そのシステムは、イオン標的分析物およびイオン液体を含む流体組成物をそれぞれ収容する複数の流体リザーバーを含み、流体組成物のいずれか２つは、同じでも異なっていてもよく、かつ／または標的分析物のいずれか２つは、同じでも異なっていてもよい。複数のリザーバーは、アレイ状に配列されていてよく、かつ／または統合された複数のリザーバーユニットを含む基材内に含有されていてよい。実施形態の関連する態様では、そのシステムは、流体リザーバーのそれぞれに対して連続して音響的な接続関係に射出器を位置決めするための手段をさらに含む。

実施形態の関連する態様では、標的分析物は、生体分子を含む。

別の実施形態では、反応混合物からの反応生成物の合成および音響的抽出のための方法が提供される。その方法は、

（ａ）流体リザーバー内に、第１の反応物、第２の反応物および流体媒体を含有する、典型的に約１ｎＬ～約３ｍＬの範囲の体積を有する反応混合物を提供するステップと、

（ｂ）反応混合物を、第１の反応物および第２の反応物の間の化学反応を引き起こして反応生成物をもたらす反応条件に晒すステップであって、流体媒体は、反応生成物が第１の溶解度を有する第１の液体を含む、ステップと、

（ｃ）第１の液体と不混和性であり、反応生成物が第１の溶解度と少なくとも５０％異なっている第２の溶解度を有する第２の液体を、反応混合物に混合し、それによって、異なる濃度の反応生成物を含有する上方層および下方層を有する流体組成物を提供するステップと、

（ｄ）反応生成物を含有する流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で、流体リザーバーに集束音響エネルギーを印加するステップと
を含む。

前述の実施形態の関連する態様では、反応混合物は、反応触媒をさらに含む。関連する別の態様では、その方法は、反応生成物および触媒を異なる液体に分配し、それによって、反応生成物および触媒を実質的に分離する。

前述の実施形態の別の関連する態様では、反応混合物は、界面活性剤をさらに含む。関連する別の態様では、その方法は、反応生成物および界面活性剤を異なる液体に分配し、それによって、反応生成物および界面活性剤を実質的に分離する。

さらなる実施形態では、本発明は、反応生成物の合成および音響伝達のための方法であって、

（ａ）流体リザーバー内に、第１の反応物、第２の反応物、および流体媒体から構成された、典型的に約１ｎＬ～約３ｍＬの範囲の体積を有する反応混合物を提供するステップと、

（ｂ）反応混合物を、第１の反応物と第２の反応物の間の化学反応を引き起こして反応生成物をもたらす反応条件に晒すステップと、

（ｃ）反応生成物を含有する流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で、流体リザーバーに集束音響エネルギーを印加するステップと
を含む、方法を提供する。

本発明はさらに、別の実施形態では、２つの溶媒の混合物中の分析物の分配係数Ｄを決定するための方法であって、

（ａ）流体リザーバー内で、既知の量Ｘの分析物を、第１の体積Ｖ_１の第１の溶媒、および第１の溶媒と実質的に不混和性の第２の体積Ｖ_２の第２の溶媒と合わせ、、分析物が、合わされた第１の溶媒および第２の溶媒中、濃度Ｘ／（Ｖ_１＋Ｖ_２）を有し、

それによって、第１の溶媒の上方層および第２の溶媒の下方層を有する、二相流体組成物を形成するステップであって、分析物は、第１の溶媒において濃度Ｃ_１を有し、第２の溶媒において濃度Ｃ_２を有する、ステップと、

（ｂ）上方層の液滴を音響的に射出するステップと、

（ｃ）射出された液滴中のＣ_１を決定するステップと、

（ｄ）関係式Ｃ_２＝（Ｃ_１Ｖ_１）／Ｖ_２に従ってＣ_１からＣ_２を算出するステップと、

（ｅ）Ｃ_２に対するＣ_１の比を確認することによって、分配係数Ｄを決定するステップとを含む、方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、分析物の量が既知であっても既知でなくてもよい、２つの溶媒の混合物中の分析物の分配係数Ｄを決定するための音響的方法であって、

（ａ）流体リザーバー内で、分析物、第１の体積Ｖ_１の第１の溶媒、および第１の溶媒と実質的に不混和性の第２の体積Ｖ_２の第２の溶媒を合わせ、それによって、第１の溶媒の上方層および第２の溶媒の下方層を有する、分配された流体組成物を形成するステップであって、分析物は、第１の溶媒において濃度Ｃ_１を有し、第２の溶媒において濃度Ｃ_２を有する、ステップと、

（ｂ）上方層の液滴を音響的に射出するステップと、

（ｃ）（ｂ）で射出された液滴中のＣ_１を決定するステップと、

（ｄ）分配された流体組成物から上方層を除去するステップと、

（ｅ）下方層の液滴を音響的に射出するステップと、

（ｆ）（ｅ）で射出された液滴中のＣ_２を決定するステップと、

（ｇ）Ｃ_２に対するＣ_１の比を確認することによって、分配係数Ｄを決定するステップとを含む、方法を提供する。

本発明のさらなる実施形態では、試料から標的分析物を抽出するための音響システムであって、

（ａ）第１の反応物、第２の反応物および流体媒体から構成された、約１ｎＬ～約３ｍＬの範囲の体積を有する反応混合物である流体組成物を収容する流体リザーバーと、

（ｂ）流体組成物から流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で音響放射を発生させるために、流体リザーバーと音響的な接続関係にある音響液滴射出器であり、音響放射発生器、およびリザーバー内の焦点に音響放射を集束させるための集束手段を含む、音響液滴射出器と
を含む、システムが提供される。

さらなる実施形態では、本発明は、水性試料から金属イオンを除去するための方法であって、

標的分析物および金属イオンを含む水性試料に、（ａ）正に帯電しているクラウンエーテル、正に帯電しているクリプタンドまたはそれらの組合せおよび（ｂ）負に帯電している対イオンから構成されたイオン液体を含む金属抽出組成物を添加するステップと、

二相が混和性になるまで、初期二相溶液を加温し、それによって、金属イオンを単相溶液中で金属抽出組成物と混合するステップと、

単相溶液を冷却して上方水層、および、金属抽出組成物および金属イオンの下方層を含む第２の二相溶液を作製するステップと
を含む、方法を提供する。

関連の実施形態では、本発明は、正に帯電しているクラウンエーテル、正に帯電しているクリプタンドまたはそれらの組合せ、および負に帯電している対イオンのイオン液体を含む、前述の（または他の）プロセスで使用するための金属抽出組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、液体と液体の分離方法であって、

（ａ）流体リザーバー内に、標的分析物および非分析物構成成分を含有し、上方層および下方層を含む流体組成物を提供するステップであって、（ｉ）標的分析物は、上方層において第１の分析物濃度で存在し、下方層において第２の分析物濃度で存在し、（ｉｉ）非分析物構成成分は、上方層において第１の構成成分濃度で存在し、下方層において第２の構成成分濃度で存在する、ステップと、

（ｂ）流体組成物から流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で、流体リザーバーに集束音響エネルギーを印加するステップと
を含む、方法を提供する。

さらなる実施形態では、液体と液体の分離方法であって、

（ａ）第１の流体中に標的分析物および非分析物構成成分を含む試料を提供するステップと、

（ｂ）その試料を第２の流体と合わせて、流体組成物を提供するステップと、

（ｃ）流体組成物を混合条件に晒すステップと、

（ｄ）流体組成物が、上方層および下方層を含む分離した流体組成物になるようにするステップであって、標的分析物は、上方層において上方分析物濃度を有し、下方層において下方分析物濃度を有し、非分析物構成成分は、上方層において上方濃度を有し、下方層において下方構成成分濃度を有し、（ｉ）下方分析物濃度および上方分析物濃度が異なっているか、（ｉｉ）下方構成成分濃度および上方構成成分濃度が異なっているか、または（ｉ）および（ｉｉ）の両方であるかのいずれかである、ステップと
を含む、液体と液体の分離方法が提供される。

図１は、脂質構成成分を生体試料から上方有機層に抽出した後、脂質層を音響的に射出する本発明の代表的な方法を、概略的に例示する。

図２および図３は、ＤＮＡを水性緩衝剤からイオン液体に抽出し、その後、緩衝剤を音響的に除去し（図２）、次にイオン液体中のＤＮＡを、さらに分析するために抽出緩衝剤を使用して処理する（図３）本発明の別の代表的な方法を、概略的に例示する。 同上。

図４は、ＤＮＡを、２ステップ抽出プロセスでイオン液体を使用して生体試料から除去する本発明の方法を、概略的に例示する。

発明の詳細な説明
１．定義および用語

別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関連する分野の技術者によって一般に理解される意味を有する。本発明の説明に対して特に重要な具体的用語を、以下に定義する。

本明細書および添付の特許請求の範囲では、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）
」および「その」は、文脈によって別段明示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば「１つの流体」は、単一流体だけでなく、合わされていても合わされていなくてもよい２つまたはそれよりも多い異なる流体の組合せも指し、「１つの溶媒」または「１つの液体」、例えば「１つのイオン液体」は、単一溶媒または液体、ならびに２つまたはそれよりも多い溶媒および２つまたはそれよりも多い液体を指し、その２つもしくはそれよりも多い溶媒、または２つもしくはそれよりも多い液体は、個別であってよく、または合わされていてよい。

「放射」という用語は、その通常の意味で使用され、媒体中を移動する外乱波形の形態のエネルギーの放射および伝播を指し、したがってエネルギーは、媒体自体のいかなる永久的置換えも引き起こさずに、媒体のある粒子から別の粒子に移動する。本発明の音響ベースの抽出方法およびシステムと合わせて使用される放射は、音響放射である。

「音響放射」および「音響エネルギー」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、音波形態のエネルギーの放射および伝播を指す。他の波形と同様に、音響放射は、以下に論じられる通り、集束手段を使用して集束させることができる。

「集束手段」および「音響集束手段」という用語は、レンズのように作用する音響エネルギー源とは分離されたデバイスによって、または強め合う干渉および弱め合う干渉により焦点に音響エネルギーを集束させる音響エネルギー源の空間的配置によって、音響波を焦点に集束させるための手段を指す。集束手段は、曲面を有する固体部材のように簡単であってよく、または音響放射を方向付けるために回折を用いる、フレネルレンズに見出される構造などの複雑な構造を含むことができる。適切な集束手段には、当技術分野で公知であり、例えばNakayasuらの米国特許第５，７９８，７７９号およびAmemiya et al. (1997) Proceedings of the 1997 IS&T NIP13 International Conference on Digital Printing Technologies, pp. 698-702に記載されている通り、フェーズドアレイ法も含まれる。

本明細書で使用される「音響接続」および「音響的に接続された」という用語は、音響エネルギーを実質的に喪失することなく物体間で音響放射を伝達可能にするように、物体が別の物体と直接的または間接的に接触して置かれている状態を指す。２つのアイテムが音響的に間接的に接続されている場合、音響放射を伝達することができる媒介物を提供するための「音響接続媒体」が必要である。したがって射出器は、例えば、射出器を流体に浸すことによって、または射出器と流体との間に音響接続媒体を挿入して、射出器によって発生した音響放射を、音響接続媒体を介して流体内に伝達させることによって、流体に音響的に接続させることができる。

「流体リザーバー」および「リザーバー」という用語は、本明細書で使用される場合、流体を保持または含有するための入れ物、チャンバ、または表面領域を指す。したがって、リザーバー内の流体は、自由表面、すなわち液滴をそれから射出可能にする表面を必然的に有する。リザーバーは、その最も簡単な形態の１つでは、単に流体と表面が接触した結果として、限局領域内に流体を保持するのに十分な濡れ特性を有する固体表面上の位置であってよく、限局領域は、リザーバーとして働く。

「流体」という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも部分的に液体である物質を指す。流体は、最小限に、部分的に、または完全に溶媒和され、分散し、または懸濁している固体を含有することができる。流体の例として、限定されるものではないが、水性液体（水自体および塩水を含む）、水溶液、非水性液体、例えば有機溶媒等、非水性溶液、コロイド、懸濁液、エマルジョン、およびゲルが挙げられる。流体は、目的の分析物が、多くの構成成分のうちのただ１つの構成成分である、生体試料流体であってよい。

「部分」という用語は、本明細書で使用される場合、物質、例えば、分子断片、無傷分子（単量体分子、オリゴマー分子もしくはポリマーを含む）、または無傷分子もしくは他の材料の混合物（例えば、異なる長さおよび／もしくは配列のＤＮＡの混合物）の任意の特定の組成物を指す。

「近傍」という用語は、本明細書で使用される場合、集束音響放射の焦点から、液滴が射出される流体表面までの距離を指し、その距離が、流体に向けられた集束音響放射によって流体表面から液滴が射出されるような距離にされるべきであることを示し、したがって当業者は、簡単で日常的な実験方法を使用して、任意の所与の流体に適した距離を選択することができる。しかし一般に、音響放射焦点と流体表面との間の適切な距離は、流体における音響放射（すなわち、液滴を射出するために使用される音響放射）の波長の約１～約１５倍の範囲であり、より典型的にはその波長の約１～約１０倍の範囲、好ましくはその波長の約１～約５倍の範囲である。

例えば「実質的に同一のリザーバー」という句におけるような「実質的に」という用語は、音響特性が実質的に逸脱しないリザーバーを指す。例えば、「実質的に同一のリザーバー」の音響減衰は、互いに１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、および最も好ましくは最大で０．１％逸脱する。「実質的に」という用語の他の使用は、類似の定義を含む。

流体試料における「標的分析物」（時として本明細書では単に「分析物」と呼ばれる）は、目的の分析物である任意の部分であってよい。分析物は、共通の特徴（例えば、脂質または塩）を有する、原子、イオン、塩、分子、あるクラスの分子であってよく、その分子および分子クラスには、有機化合物、無機化合物、および有機金属化合物が含まれる。分析物は、環境研究（例えば、水質評価に関する）、医薬の文脈、化学産業、エネルギー分野、および数々の他の分野に関連する分析物であってよい。分析物の代表例として、限定されるものではないが、薬物、代謝産物、阻害剤、リガンド、受容体、触媒、合成ポリマー、金属、金属イオン、染料、殺有害生物薬（例えば、ＤＤＴ、アルドリン（eldrin）、テトラクロロジベンゾダイオキシン［ＴＣＤＤ］等）、発癌物質（例えば、多環式芳香族炭化水素［ＰＣＡＨ］）、アロステリックエフェクター、抗原、およびウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＰＶ、肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ、サイトメガロウイルス、エプスタイン－バーウイルス、黄熱等）が挙げられる。標的分析物は、多段階反応における反応生成物または中間体であってもよい。さらに、標的分析物は、本発明の抽出プロセスが第１の流体から第２の流体への分析物の一部の画分の移動を伴う、目的の部分であってよい。標的分析物はまた、流体から除去される構成成分、例えば夾雑物であってよい。

しばしば、分析物は、本明細書で「生物学的分子」とも呼ばれる「生体分子」であり、それらの用語は、一般に細胞および組織に見出され、全体的もしくは部分的に、天然に存在し、組換えにより生成され、生物学的に誘導され、化学的に合成され得るか、または化学的もしくは生物学的に修飾され得る、任意の分子実体を指す。その用語は、例えば、核酸；アミノ酸；オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ならびに非ペプチド部分、例えば核タンパク質および糖タンパク質とのそのコンジュゲートを含めた、ペプチド；単糖、二糖および多糖を含めた糖；脂質部分；ならびに前述のいずれか２つまたはそれよりも多くの共有結合性または非共有結合性コンジュゲート、例えば核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチドグリカン、ムコ多糖等を包含する。生体分子の代表例として、酵素、受容体、グリコサミノグリカン、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、細胞応答修飾因子、例えば増殖因子および走化性因子、抗体、ワクチン、ハプテン、毒素、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス薬剤、プラスミド、ＤＮＡ、ならびにＲＮＡが挙げられる。

「核酸」は、ヌクレオシドまたはヌクレオチド自体であってよいが、従来のプリンおよびピリミジン塩基、すなわちアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）だけでなく、例えばその保護形態を含有するヌクレオシドおよびヌクレオチドを含むこともでき、塩基は、保護基、例えば、アセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリルまたはベンゾイル、ならびにプリンおよびピリミジンアナログで保護される。適切なアナログは、当業者に公知であり、関連する文書および文献に記載されている。一般的なアナログには、限定されるものではないが、１－メチルアデニン、２－メチルアデニン、Ｎ^６－メチルアデニン、Ｎ^６－－イソペンチル－アデニン、２－メチルチオ－Ｎ^６－イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアデニン、８－ブロモアデニン、２－チオシトシン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、５－エチルシトシン、４－アセチルシトシン、１－メチルグアニン、２－メチルグアニン、７－メチルグアニン、２，２－ジメチルグアニン、８－ブロモグアニン、８－クロログアニン、８－アミノグアニン、８－メチルグアニン、８－チオグアニン、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、５－エチルウラシル、５－プロピルウラシル、５－メトキシウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－（メチル－アミノメチル）ウラシル、５－（カルボキシメチルアミノメチル）－ウラシル、２－チオウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、５－（２－ブロモビニル）ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、１－メチルプソイドウラシル、キューオシン（queosine）、イノシン、１－メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２－アミノプリン、６－ヒドロキシアミノプリン、６－チオプリンおよび２，６－ジアミノプリンが含まれる。さらに、「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語には、従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく他の糖も同様に含有する部分が含まれる。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、糖部分上の修飾も含み、例えば、ヒドロキシ基の１つまたは複数は、ハロゲン原子もしくは脂肪族基で置き換えられるか、またはエーテル、アミン等として官能化される。

核酸には、オリゴヌクレオチドも含まれ、「オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明の目的では、ポリデオキシリボ－ヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマーの包括的用語である。したがって、本明細書におけるオリゴヌクレオチド分析物には、オリゴヌクレオチド修飾、例えばアナログ、ヌクレオチド間修飾、例えば無電荷連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミド酸、カルバミメート等）を有するもの、負に帯電している連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するもの、および正に帯電している連結（例えば、アミノアルキルホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホトリエステル）を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質など（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リシン等を含む）を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）を有するもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含有するものなどによる、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の置換が含まれ得る。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語の間の長さによる区別は企図されず、これらの用語は、交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造だけを指す。本明細書で使用される場合、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの記号は、IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature recommendations (Biochemistry 9:4022, 1970)に従う。

「ペプチド」分析物（または「ペプチド性」分析物）は、１つまたは複数のアミノ酸から構成された任意の構造を包含し、したがってそれには、ペプチド、ジペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質が含まれる。ペプチド分析物のすべてまたは一部を形成するアミノ酸は、２０種の従来の天然に存在するアミノ酸、すなわち、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）、ならびに非従来型アミノ酸、例えば従来のアミノ酸の異性体および修飾物、例えばＤ－アミノ酸、非タンパク質アミノ酸、翻訳後修飾されたアミノ酸、酵素的に修飾されたアミノ酸、β－アミノ酸、アミノ酸を模倣するように設計された構築物または構造（例えば、α，α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸、β－アラニン、ナフチルアラニン、３－ピリジルアラニン、４－ヒドロキシプロリン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリシン、およびノルロイシン）、および例えばRosenbergらの米
国特許第５，６７９，７８２号に記載されている通りの他の非従来型アミノ酸のいずれかであってよい。ペプチド分析物は、天然に存在するアミド－ＣＯＮＨ－連結が、ペプチド骨格内の１つまたは複数の部位において非従来型連結、例えばＮ置換アミド、エステル、チオアミド、レトロペプチド（－ＮＨＣＯ－）、レトロチオアミド（－ＮＨＣＳ－）、スルホンアミド（－ＳＯ_２ＮＨ－）、および／またはペプトイド（Ｎ置換グリシン）連結で置き換えられている、非ペプチド骨格連結を含有することもできる。したがって、ペプチド分析物には、疑似ペプチドおよびペプチド模倣薬が含まれ得る。ペプチド分析物は、（ａ）天然に存在し、（ｂ）化学合成によって生成され、（ｃ）組換えＤＮＡ技術によって生成され、（ｄ）より大きい分子の生化学的もしくは酵素的断片化によって生成され、（ｅ）先に列挙される方法（ａ）～（ｄ）の組合せから得られる方法によって生成され、または（ｆ）ペプチドを生成するための任意の他の手段によって生成され得る。

「糖」または「糖分析物」には、限定されるものではないが、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、ムコ多糖またはペプチドグリカン（ペプチド－多糖）、プソイドペプチドグリカン等が含まれ、二糖、オリゴ糖、多糖等における単糖単位を含めた単糖には、ヘキソース、ペントースおよびテトロースが含まれ、それらはＤ－またはＬ－形態であってよく、さらに単糖単位間のグリコシド連結は、α－グリコシド連結またはβ－グリコシド連結のいずれかであってよい。糖分析物の例示的な例として、単糖であるフルクトース、グルコース、ブドウ糖、ガラクトース、マンノース、リボース、デオキシリボース、アロース、フコース、ラムノース、エリトロース、トレオースおよびグリセルアルデヒド、二糖であるスクロース、ラクトース、マルトース、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、多糖であるアミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、クリソラミナリン、キシランおよびガラクトマンナン、ならびにムコ多糖（グリコサミノグリカンとも呼ばれる）であるコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびヒアルロナンが挙げられる。

「脂質」または「脂質分析物」は、疎水性または両親媒性分子を指し、それには、広範な分類の脂肪酸、リン脂質、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質（saccharolipid）、およびポリケタイドが含まれる。脂質材料の代表例として、限定さ
れるものではないが、リン脂質、例えばリン酸化ジアシルグリセリド、特にジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択されるリン脂質（各アシル基は、約１０～約２２個の炭素原子を含有し、飽和または不飽和である）；脂肪酸、例えばイソ吉草酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、およびアラキドン酸；前述の脂肪酸のエステルを含む低級脂肪酸エステル（脂肪酸のカルボン酸基－（ＣＯ）－ＯＨは、エステル部分－（ＣＯ）－ＯＲで置き換えられており、Ｒは、１個または２個のヒドロキシ基で必要に応じて置換されているＣ_１～Ｃ_３アルキル部分である）；前述の脂肪酸に対応する脂肪アルコール（脂肪酸のカルボン酸基は、－ＣＨ_２ＯＨ基によって置き換えられている）；糖脂質、例えばセレブロシドおよびガングリオシド；動物油、例えば肝油およびニシン油、ならびに植物油、例えばババス油、ヒマシ油、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、カラシ油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ピーナッツ油、ケシの実油、ナタネ油、ベニバナ油、ゴマ油、大豆油、ヒマワリ種子油、キリ油、または小麦胚芽油を含めた油；ならびに動物性ワックス、例えば蜜蝋、ラノリンおよびセラックワックス、鉱物性ワックス、例えばモンタンワックス、石油由来ワックス、例えば微結晶性ワックスおよびパラフィンワックス、および植物ワックス、例えばカルナウバワックスおよびカンデリラワックスを含めたワックスが挙げられる。

「抽出」および「抽出する」は、それらの用語が本明細書で使用される場合、第１の流体から第２の流体への標的分析物の遊走を伴うプロセスを指し、したがって先の節で説明される通りの分離プロセスを包含する。その用語は、典型的に、組成物の他の構成成分に対する、組成物の一の構成成分である標的分析物、例えば２つの流体相の一方における夾雑物の増強を指す。抽出は、完全であってよく、これは、標的分析物が試料の他の構成成分から完全に分離されることを意味し、したがって抽出後に一方の流体相は、１００％の標的分析物を含有している。抽出はまた、部分的であってよく、その場合、標的分析物の１００％未満の一部の画分が、組成物中の他の構成成分から単離される。したがって、本発明の方法を使用する抽出は、流体の１つにおける標的分析物の濃度を増大もしくは低減すること、流体の１つから分析物の一部もしくはすべてを除去すること、流体の１つにおける分析物の量を濃縮すること、分析物を単離すること、分析物を精製すること、標的分析物と最初に関連している構成成分、例えば夾雑物を除去すること、または前述の２つもしくはそれよりも多くの組合せを目的とし得る。「液体－液体抽出」は、その用語が本明細書で使用される場合、第１の流体および第２の流体が、液体を含む流体から独立に選択される抽出プロセスを指し、したがって、液体－液体抽出は、ゲル－液体抽出、懸濁液－液体抽出等を包含する。ここで抽出プロセスは、流体液滴が、増大したもしくは低減した濃度の標的分析物（試料中、または初期の抽出前の流体層もしくは流体組成物中の標的分析物の初期濃度に対して）または増大したもしくは低減した濃度の非標的構成成分（試料中、または初期の抽出前の流体層もしくは流体組成物中の非標的構成成分の初期濃度に対して）を有する流体から音響的に射出されるように、音響射出プロセスと接続している。

分析物を「含有する」または「含む」試料への言及には、分析物を含有することが既知であるが、その分析物の同定が未知であってよい試料、および分析物を含有することが疑われる試料の両方が含まれる。

「アレイ」という用語は、本明細書で使用される場合、フィーチャの二次元配置、例えばリザーバー（例えば、ウェルプレート内のウェル）の配置、または基材表面上の流体液滴もしくは分子部分の配置（オリゴヌクレオチドまたはペプチドアレイのように）を指す。アレイは、一般に、例えば、直線グリッド、並列ストライプ、スパイラル等に規則的に整列しているフィーチャから構成されるが、整列していないアレイも同様に有利に使用することができる。パターンが規則的に整列したフィーチャを必ずしも含有しないという点で、アレイはパターンとは異なる。さらに、本明細書で提供される通り、表面上への射出された液滴の沈着によって形成されたアレイおよびパターンは、通常、ヒトの裸眼では実質的に見えない。アレイは、典型的に、必ずしもそうであるわけではないが、少なくとも約４～約１０，０００，０００個のフィーチャ、一般に約４～約１，０００，０００個の範囲のフィーチャを含む。

２．抽出方法

本発明は、流体組成物からの標的分析物の抽出に音響液滴射出（ＡＤＥ）を使用する。一実施形態では、ＡＤＥを抽出プロセスで実施して、選択された濃度の標的分析物を含有する流体液滴を生成する。標的分析物を含有する流体組成物は、流体リザーバー内に提供され、流体組成物は、２つまたはそれよりも多い相から構成される。すなわち、流体組成物は、上方領域または上方層、および１つまたは複数の下方領域または下方層を含み、例えば流体組成物は、二層、三層、四層、または五層もしくはそれよりも多い層から構成され得る。簡潔にするために、流体組成物が、第１の流体の上方層および第２の流体の下方層を含み、第１の流体および第２の流体が、抽出に用いられる条件で実質的に不混和性である、二相システムに対する方法が記載される。流体組成物中の標的分析物は、第１の流体中に第１の濃度で存在し、第２の流体中に、第１の濃度とは異なる第２の濃度で存在する。一般に、第１の濃度および第２の濃度は、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約８５％、例えば少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれを超えて異なる。集束音響エネルギーは、流体組成物から、一般に液滴レシーバーに向けて、その中に流体液滴を射出するのに有効な方式で、流体リザーバーに印加される。射出された流体液滴における選択された濃度、すなわち標的分析物の濃度は、第１の濃度または第２の濃度のいずれかに実質的に等価である。さらに、選択された濃度は、液滴にわたって実質的に均一である。一例では、標的分析物の一部の画分は、一方の流体（例えば、生体試料を含有する流体、例えば細胞可溶化液等）から第２の流体に移動する。別の例では、２つの流体における標的分析物の濃度は、変化してよく変化しなくてもよいが、一方の流体における標的分析物と関連する構成成分は、抽出プロセス後に第２の流体中に存在しない場合がある。例えば抽出後に、一方の流体は、標的分析物および複数の夾雑物を含有する場合があり、一方で第２の流体は、標的分析物を含有し、夾雑物が存在しないか、または実質的に低濃度の夾雑物を含む。別の例として、抽出プロセスは、１つまたは複数の流体層中の標的分析物または他の構成成分の濃度を変化させることを含む。前述の例の変形形態では、抽出は、２つの標的分析物を伴い、そのプロセスによって、１つまたは複数の流体層における標的分析物の一方の濃度が増大され、他方の標的分析物の濃度が低減される。

本発明の方法は、非常に小さい試料サイズを用いる場合に有効なので、リザーバー内の全流体組成物は、一般に約１２５μＬ以下、例えば約６０μＬ以下、約４５μＬ以下、約３０μＬ以下等の体積を占める。

流体組成物は、標的分析物を含有する試料、例えば生体試料を含むことができる。生体試料は、流体に溶解もしくは懸濁した試料を含むことができ、または生体試料自体が流体であってよい。生体試料には、例えば、組織、組織ホモジネート、細胞、細胞懸濁液、細胞抽出物、全血、血漿、血清、唾液、喀痰、鼻汁、脳脊髄液、間質液、リンパ液、精液、膣液、または糞便が含まれる。より典型的な生体試料は、組織、細胞、または血液から構成される。生体試料は、抽出前に、ある方式で処理されてよく処理されていなくてもよい。予備的な処理方法は、当技術分野で公知であり、それには、例えば、抗凝固剤を血液試料に組み込むこと、血液を血漿および血清に分離すること、様々な試料のタイプに合わせて遠心分離および再懸濁手順を交互に行うこと、保存剤または保存剤を含有する輸送媒体を試料に組み込むこと等が含まれる。しかし本発明は、これに関して限定されず、任意の予備的処理を受けていない生体試料、および非生体試料を用いて容易に実施される。

生体試料中の標的分析物には、限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、脂質化合物、および核酸、特にＤＮＡが含まれる。他の生物学的標的分析物および他のタイプの標的分析物は、この節のパート（１）「定義および用語」に記載される。

２つまたはそれよりも多い流体を使用する標的分析物の抽出は、別の流体に対する一方の流体との分析物の親和性の差に依存する。「親和性」という用語は、分析物を、別の流体に対して一方の流体に分配させる任意の因子または因子の組合せを含む。このような因子の例として、限定されるものではないが、極性度に関する分析物および流体の適合性、分析物と流体のイオン相互作用、分析物と流体の水素結合、分析物および溶媒の相対的親水性または疎水性、より一般的には、前述の因子に関係しないが、流体への分析物の可溶性の度合いが挙げられる。

一部の実施形態では、本発明の抽出プロセスは、先に説明される通り、標的分析物の溶解度が異なっている２つの液体を使用し、その溶解度の差は、第１の濃度および第２の濃度の差に対応する。溶解度の差は、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約８５％、例えば少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％であってよい。一部の実施形態では、溶解度の差は、約５０％未満であってよい。他の実施形態では、先に言及される通り、溶解度の差は、相対的に疎水性の第１の液体および相対的に親水性の第２の液体の使用から生じ、したがって、親水性部分は、親水性液体に優先的に分配される一方、疎水性部分は、疎水性液体に優先的に分配される。このようなシステムは、例えば、異なる疎水性を有する複数の構成成分、例えば試料中にやはり存在する他の構成成分の疎水性とは異なる疎水性を有する標的分析物を含有する試料を含む流体組成物を用いる場合に有用である。

他の実施形態では、標的分析物は、極性分子または塩であってよく、その場合、相対的に極性の溶媒は、プロトン性または非プロトン性のいずれかであってよく、抽出プロセスにおいて相対的に非極性の溶媒と合わされる。水素結合を受ける標的を用いる場合、プロトン性溶媒が有用であり、このような場合、プロトン性溶媒は、非極性であってよく非極性でなくてもよい非プロトン性溶媒と合わされる。

さらに、限定されるものではないが一部のイオン分析物を含めた一部の分析物は、以下に説明される通り、イオン液体で容易に抽出することができる。ある場合には、イオン液体は、別の流体組成物からイオン分析物を抽出するために使用される。他の場合には、イオン分析物を、イオン液体ではない第２の流体組成物内に優先的に分配させるイオン液体が使用される。ある場合には、このようなプロセスの両方は、以下にさらに詳細に説明される通り、多段階抽出プロセスに合わせられる。

多種多様な溶媒を、本発明と併用することができる。実際、本発明の抽出プロセスに対して有害効果を及ぼさないという条件で、事実上いかなる溶媒も使用することができる。当然のことながら、非毒性の溶媒が好ましい。単一抽出ステップまたはプロセスに使用される液体は、粘度、揮発度、ならびに他の化学的および物理的特徴が変わり得る。粘性材料からの標的分析物の抽出は、相対的に非粘性の流体を使用して促進される。溶媒の１つが揮発性である場合、蒸発に関する懸念は、より低い密度を有し、揮発性が低い第２の溶媒を使用することによって除外することができ、揮発性が低く、より低い密度の溶媒は、揮発性がより高い下方の溶媒の上に上方層を形成して、その蒸発を防止する。

本発明の方法およびシステムに用いることができる溶媒には、水性および有機溶媒、プロトン性および非プロトン性溶媒、イオンおよび非イオン液体、ポリマーおよび非ポリマー液体等が含まれる。流体は、組合せでは、単相、二相、三相、またはそれよりも多い多相の流体組成物を形成することができ、２つの流体の組合せを用いる場合、得られる流体組成物は、単相または二相である。一部の実施形態では、本発明は、選択された流体が混和性である度合い、および選択された液体の組合せが多かれ少なかれ混和性にされ得る条件を使用する。

本発明との併用に有用な溶媒の例として、限定されるものではないが、酢酸、アセトン、アセトニトリル、アンモニア、ベンゼン、ｎ－ブタノール、ｉ－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、２－ブタノン、酢酸ブチル、ｔ－ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロベンゼン、クロロホルム、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、シクロペンタン、１，２－ジクロロエタン、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、ジエチレングリコール、ジエチレングリコールジメチルエーテル（ジグリム）、ジ－イソプロピルエーテル、１，２－ジメトキシエタン（グリム、ＤＭＥ）、ジメチルエーテル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１，４－ジオキサン、エタノール、酢酸エチル、エチレングリコール、ギ酸エチル、ギ酸、フラン、グリセリン、ヘプタン、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、ヘキサメチル亜リン酸トリアミド（ＨＭＰＴ）、ｎ－ヘキサン、メタノール、メチルｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、塩化メチレン、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、ギ酸メチル、Ｎ－メチル－ピロリジノン（ＮＭＰ）、ニトロメタン、１－オクタノール、ｎ－ペンタン、石油エーテル（リグロイン（ligroine））、ピペリジン、ポリエチレングリコール、ｎ－プロパノール、ｉ－プロパノール、ピリジン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、トリクロロエチレン、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、水、重水、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、ならびに共に参照により本明細書に組み込まれるEllsonらの米国特許第６，５４８，３０８号および同第６，６４２，０６１号に記載されている他の溶媒が挙げられる。好ましい水性溶媒には、水、緩衝化合物および／または塩の水溶液、例えばリン酸緩衝剤、Ｔｒｉｓ緩衝剤、ＭＥＳ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、炭酸水素アンモニウム等が含まれる。

本明細書の有用な溶媒システムおよび溶媒の組合せの具体例として、限定されるものではないが、水性溶媒、例えば水または緩衝液および有機溶媒、例えばシクロヘキサン、ジクロロメタン、１－オクタノール、ｎ－ペンタン、ｎ－ブタノール、または全フッ素化または半フッ素化アルカン溶媒、例えばペルフルオロヘプタン、１，１，１，２，３，３－ヘキサフルオロプロパン、ペンタフルオロペンタン等；水性溶媒、例えば水または緩衝液および脂質溶媒、例えば油；２つの水層を用いる二成分システム（水性液体は、異なる溶質を含有し、不混和性である。例えば、Partitioning in Aqueous Two-Phase System: Theory, Methods, Uses, and Applications to Biotechnology, Eds. Harry
Walter et al. (Academic Press, 1985)、Hamta et al. (2017), "Application of polyethylene glycol based aqueous two-phase systems for extraction of heavy metals," Journal of Molecular Liquids 231:20-24、およびEiden
et al. (2016), "Two-Phase System Rehydration of Antibody-Polymer Microarrays Enables Convenient Compartmentalized Multiplex Immunoassays," Analytical Chemistry 88(23)を参照されたい）（また、Tavana et al. (2010) Adv. Mater. 22(24):2628-2631 and Fang et al. (2012) Tissue Engineering Part C: Methods 18)9):647-657を参照されたい）；例えば、同じ緩衝剤組成物を有するが、第１および第２の水性液体が異なるｐＨに緩衝されている２つの水性液体の場合がそうである通り、同じ溶質を含有するが異なるｐＨを有する２つの水性液体の組合せ；ならびに有機液体が不混和性である２つの有機層を用いる二成分システム、例えば、エタノール／シクロヘキサンの組合せ、ヘキサン／ジクロロメタンの組合せ、エーテル／クロロホルムの組合せ等が挙げられる。

抽出プロセスのために選択された２つの流体は、抽出に用いられる条件下で不混和性であるべきである。混和性は、当技術分野で理解されている通り、一方の流体が別の流体に可溶性である度合いを指す。この溶解度は、温度、静水圧または他の因子と共に変わってよく、この変数は、本発明のプロセスに有利に組み込むことができる。すなわち、流体組成物は、相転移を誘導し、２つの流体を混和性にする条件に晒すことができ、したがって、標的分析物は両方の流体と十分に混合される。その後、流体組成物は、２つの流体を不混和状態に戻す条件に晒すことができ、したがって、音響エネルギーは、２つの流体層の一方における焦点ゾーンを標的にし、二層の一方だけから形成され、主にそれだけを含む流体液滴を射出することができる。様々な条件下での溶媒の混和性は、関連する文書および文献を参照することによって決定することができ、かつ／または２つの溶媒を合わせ、様々な温度、圧力等での混和性の度合いを確認することによって、経験的に決定することができる。最も一般的には、本明細書における２つの流体の混和性は、温度変化によって変わり（したがって、２つの流体を含有する流体組成物の温度の上昇または低下により、それらの混和性が変わる）、かつ／または例えば塩、例えば塩化ナトリウムを添加することにより、もしくはｐＨ変化により化学的に変わる。ある場合には、本発明の抽出プロセスに用いられる２つの流体は、約４０℃～約９０℃の間で混和性である。

標的分析物および２つの流体は、抽出前に、他の技術を使用して、例えば分析物および流体を収容する容器の反転の反復、撹拌、超音波処理、かき混ぜ、流体の温度の緩和、他方の流体を介する一方の流体の液滴の射出（例えば、音響射出）（以下に論じられる図２に例示される通り）等を使用して同様に混合され得ることが理解される。

一実施形態では、抽出方法は、イオン液体を使用する。この節のパート（１）に示される通り、イオン液体は、液体形態の塩を含む。すなわち、イオン液体は、主に電子的に中性の種から作成される通常の液体とは対照的に、大部分または完全にイオンから構成される（すなわち、「実質的にイオン性」とは、イオン液体の実質的にすべてがイオン性であることを意味する）。本発明と併用するための好ましいイオン液体は、純粋にイオン性または実質的にイオン性であり、抽出条件で液体状態である。より好ましいイオン液体は、「室温イオン液体」（ＲＴＩＬ）である。ＲＴＩＬは、相対的に低融点を有し、１００℃未満の温度、例えば、約０℃～約１００℃の範囲の温度で液体形態である塩から構成される。ＲＴＩＬは、流体組成物の温度を変化させずに行うことができる抽出プロセスを促進する利便性をもたらす限り、本明細書において好ましい。イオン液体は、イオン分析物、例えば負に帯電している分析物、例えばＤＮＡの抽出に有用であるが、他のタイプの分析物の抽出にも同様に有用である。一般的なイオン液体には、限定されるものではないが、イミダゾリウム塩、ピロリジニウム塩、ピペリジニウム塩、ピリジニウム塩、モルホリニウム塩、アンモニウム塩、ホスホニウム塩、スルホニウム塩、およびグアニジウム塩が含まれる。適切なイオン液体は、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（２０１２年１０月）およびＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．によって刊行されているイオン流体カタログに列挙されており、商業的に利用可能な生成物として得ることができる。イオン液体の具体例を、以下に提供する。以下の一覧では、アニオンの略語は以下の通りである。

酢酸塩（ＣＨ_３ＣＯＯ^－）、ＯＡｃ；

ビス［オキサレート（２－）］ホウ酸塩、ｂｏｂ；

ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｔｆ_２Ｎ；

ジシアナミド、ＤＣＡ；

ギ酸塩（ＨＣＯ_２ ^－）、ＨＣＯＯ；

ヘキサフルオロリン酸塩、ＰＦ_６ ^－；

硫酸水素塩、ＨＳＯ_４ ^－；

ヒドロキシ酢酸塩（ＣＨ_２（ＯＨ）ＣＯＯ^－）、ＨＯＯＡｃ；

メタンスルホン酸塩（メシル酸塩）、ＣＨ_３ＳＯ_３ ^－；

２－（２－メトキシエトキシ）エチル硫酸塩、ＣＨ_３（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＯＳＯ_４ ^－；

メチル硫酸塩（ＣＨ_３－Ｏ－ＳＯ_３ ^－）、ＭｅＳＯ_４；

オクチル硫酸塩（Ｃ_８Ｈ_７ＳＯ_４ ^－）、ＯｃＳＯ_４；

硝酸塩、ＮＯ_３ ^－；

スルファミン酸塩、Ｈ_２ＮＳＯ_３ ^－；

テトラシアノホウ酸塩、Ｂ（ＣＮ）_４ ^－；

テトラフルオロホウ酸塩、ＢＦ_４ ^－；

チオシアン酸塩、ＳＣＮ^－；

ｐ－トルエンスルホン酸塩、またはトシル酸塩、Ｔｏｓ；

トリシアノメタン（Ｃ（ＣＮ）_３ ^－）、ＴＣＭ；

トリフルオロ酢酸塩（ＣＦ_３ＣＯＯ^－）、ＴＦＡ；

トリフルオロメタンスルホン酸塩（トリフレート、ＣＦ_３ＳＯ_３ ^－）、ＯＴｆ；および

トリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロリン酸塩、ＦＡＰ。

代表的なイオン液体（最初に示されている種は、カチオンであり、次に示されている種は、アニオンであり、プラスおよびマイナスの記号は、標準イオン液体命名法に適合するように省略されていると理解されたい）には、以下が含まれる。

１－ベンジル－メチルイミダゾリウム（Ｚｍｉｍ）塩、例えば［Ｚｍｉｍ］［Ｃｌ］；

Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）ブチルアンモニウム（ＨＥＢＡ）塩、例えば［ＨＥＢＡ］［Ｔｆ_２Ｎ］および［ＨＥＢＡ］［ＨＣＯＯ］；

ビス（２－ヒドロキシエチル）アンモニウム（ＨＥＡ）塩、例えば［ＨＥＡ］［ＴＦＡ］および［ＨＥＡ］［ＯＡｃ］；

ビス（２－メトキシエチル）アンモニウム（ＭＥＡ）塩、例えばＭＥＡスルファミン酸塩；

１－ブチル－２，３－ジメチルイミダゾリウム（Ｂｍｍｉｍ）塩、例えば［Ｂｍｍｉｍ］［Ｃｌ］、［Ｂｍｍｉｍ］［Ｉ］、［Ｂｍｍｉｍ］［ＰＦ_６］、［Ｂｍｍｉｍ］［ＢＦ_４］、および［Ｂｍｍｉｍ］［ＯＴｆ］；

１－ブチル－３－メチルイミダゾリウム（Ｂｍｉｍ）塩、例えば［Ｂｍｉｍ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［Ｂｍｉｍ］［Ｃｌ］、［Ｂｍｉｍ］［Ｂｒ］、［Ｂｍｉｍ］［Ｉ］、［Ｂｍｉｍ］［ＤＣＡ］、［Ｂｍｉｍ］［ＰＦ_６］、［Ｂｍｉｍ］［ＨＳＯ_４］、［Ｂｍｉｍ］［ＭｅＳＯ_４］、［Ｂｍｉｍ］［ＯｃＳＯ_４］、［Ｂｍｉｍ］［ＢＦ_４］、［Ｂｍｉｍ］［Ｂ（ＣＮ）_４］、［Ｂｍｉｍ］［Ｔｏｓ］、［Ｂｍｉｍ］［ＴＣＭ］、［Ｂｍｉｍ］［ＴＦＡ］、［Ｂｍｉｍ］［ＮＯ_３］、および［Ｂｍｉｍ］［ＯＡｃ］；

１－ブチル－３－メチルピリジニウム（Ｂ３ｍｐｙ）塩、例えば［Ｂ３ｍｐｙ］［Ｃｌ］、［Ｂ３ｍｐｙ］［ＤＣＡ］、［Ｂ３ｍｐｙ］［ＭｅＳＯ_４］、および［Ｂ３ｍｐｙ］［ＢＦ_４］；

１－ブチル－４－メチルピリジニウム（Ｂ４ｍｐｙ）塩、例えば［Ｂ４ｍｐｙ］［Ｃｌ］および［Ｂ４ｍｐｙ］［ＢＦ_４］；

１－ブチル－１－メチルピロリジニウム（Ｂｍｐｙｒ）塩、例えば［Ｂｍｐｙｒ］［ｂｏｂ］、［Ｂｍｐｙｒ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［Ｂｍｐｙｒ］［Ｃｌ］、［Ｂｍｐｙｒ］［ＤＣＡ］、［Ｂｍｐｙｒ］［ＯＴｆ］、［Ｂｍｐｙｒ］［ＦＡＰ］、および［Ｂｍｐｙｒ］［Ｂ（ＣＮ）_４］；

Ｎ－ブチルピリジニウムクロリド（Ｂｐｙ）塩、例えば［Ｂｐｙ］［Ｃｌ］、［Ｂｐｙ］［ＰＦ_６］、［Ｂｐｙ］［ＢＦ_４］、および［Ｂｐｙ］［ＯＴｆ］；

Ｎ，Ｎ－ジメチル（２－ヒドロキシエチル）アンモニウム（ＭＭＨＥＡ）塩、例えば［ＭＭＨＥＡ］［ＨＯＯＡｃ］、［ＭＭＨＥＡ］［Ｔｆ_２Ｎ］、および［ＭＭＨＥＡ］［ＴＦＡ］；

１，３－ジメチルイミダゾリウム（Ｍｍｉｍ）塩、例えば［Ｍｍｉｍ］［Ｃｌ］、［Ｍｍｉｍ］［Ｂｒ］、および［Ｍｍｉｍ］［ＭｅＳＯ_４］、

１，１－ジメチルピロリジニウム（ＭＭｐｙｒ）塩、例えば［ＭＭｐｙｒ］［Ｉ］および［ＭＭｐｙｒ］［Ｔｆ_２Ｎ］；

Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－スルホプロピルアンモニウム Ｔｆ_２ＮおよびＯＴｆ；

１－（２－エトキシエチル）－１－メチルピロリジニウム（ＥＯＥＭｐｙｒ）塩、例えば［ＥＯＥＭｐｙｒ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［ＥＯＥＭｐｙｒ］［Ｂｒ］、［ＥＯＥＭｐｙｒ］［ＢＣＮ_４，］、［ＥＯＥＭｐｙｒ］［Ｔｆ_２Ｎ］、および［ＥＯＥＭｐｙｒ］［ＦＡＰ］；

１－エチル－２，３－ジメチルイミダゾリウム（Ｅｍｍｉｍ）塩、例えば［Ｅｍｍｉｍ］［Ｂｒ］、［Ｅｍｍｉｍ］［Ｃｌ］、［Ｅｍｍｉｍ］［ＭｅＳＯ_４］、および［Ｅｍｍｉｍ］［ＢＦ_４］；

Ｎ－エチル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－メトキシエチルアンモニウムＴｆ_２Ｎ、Ｂｒ、Ｂ（ＣＮ）_４、およびＦＡＰ；

Ｎ－エチル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－プロピルアンモニウムＴｆ_２Ｎ、Ｂｒ、ＤＣＡ、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド（Ｎｅｍｍｐ ｔｆｎ）、臭化物（Ｎｅｍｍｐ
Ｂｒ）、ジシアナミド（Ｎｅｍｍｐ ＤＣＮ）、Ｂ（ＣＮ）_４、およびＦＡＰ；

１－エチル－３－メチルイミダゾリウム（Ｅｍｉｍ）塩、例えば［Ｅｍｉｍ］［ｂｏｂ］、［Ｅｍｉｍ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［Ｅｍｉｍ］［Ｂｒ］、［Ｅｍｉｍ］［Ｃｌ］、［Ｅｍｉｍ］［ＤＣＡ］、［Ｅｍｉｍ］［ＨＳＯ_４］、［Ｅｍｉｍ］［ＭｅＳＯ_４］、［Ｅｍｉｍ］［ＯｃＳＯ_４］、［Ｅｍｉｍ］［Ｂ（ＣＮ）_４］、［Ｅｍｉｍ］［ＢＦ_４］、［Ｅｍｉｍ］［ＴＦＡ］、および［Ｅｍｉｍ］［ＯＴｆ］；

グアニジウム（ｇｕａ）塩、例えば［ｇｕａ］［ＯＴｆ］および［ｇｕａ］［ＦＡＰ］；

１－ヘキサデシル－２，３－ジメチルイミダゾリウム（Ｃｍｍｉｍ）塩、例えば［Ｃｍｍｉｍ］［Ｃｌ］；

１－ヘキサデシル－３－メチルイミダゾリウム（Ｃｍｉｍ）塩、例えば［Ｃｍｉｍ］［Ｃｌ］および［Ｃｍｉｍ］［ＦＡＰ］；

１－ヘキシル－１－メチルピロリジニウム（Ｈｍｐｙｒ）塩、例えば［Ｈｍｐｙｒ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［Ｈｍｐｙｒ］［ＦＡＰ］、および［Ｈｍｐｙｒ］［Ｃｌ］；

１－ヘキシル－２，３－ジメチルイミダゾリウム（Ｈｍｍｉｍ）塩、例えば［Ｈｍｍｉｍ］［Ｃｌ］および［Ｈｍｍｉｍ］［ＦＡＰ］；

１－ヘキシル－３－メチルイミダゾリウム（Ｈｍｉｍ）塩、例えば［Ｈｍｉｍ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［Ｈｍｉｍ］［Ｃｌ］、［Ｈｍｉｍ］［ＰＦ_６］、［Ｈｍｉｍ］［ＢＦ_４］［Ｈｍｉｍ］［ＯＴｆ］、および［Ｈｍｉｍ］［ＦＡＰ］；

Ｎ－ヘキシルピリジニウム（ＨＰｙ）塩、例えば［ＨＰｙ］［Ｃｌ］、［ＨＰｙ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［ＨＰｙ］［ＯＴｆ］、および［ＨＰｙ］［ＦＡＰ］；

１－（２－ヒドロキシエチル）－３－メチルイミダゾリウム（ＨＯＥ－Ｍｉｍ）塩、例えば［ＨＯＥ－Ｍｉｍ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［ＨＯＥ－Ｍｉｍ］［Ｃｌ］、［ＨＯＥ－Ｍｉｍ］［Ｂｒ］、［ＨＯＥ－Ｍｉｍ］［ＯＴｆ］、および［ＨＯＥ－Ｍｉｍ］［ＦＡＰ］；

Ｎ－（３－ヒドロキシプロピル）ピリジニウム（ＨＯＰ－Ｐｙ）塩、例えば［ＨＯＰ－Ｐｙ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［ＨＯＰ－Ｐｙ］［Ｃｌ］、［ＨＯＰ－Ｐｙ］［Ｂｒ］、［ＨＯＰ－Ｐｙ］［Ｂ（ＣＮ_４）］、および［ＨＯＰ－Ｐｙ］［ＦＡＰ］；

１－（３－メトキシプロピル）－１－メチルピペリジニウム（ＭＯＰＭｐｉ）塩、例えば［ＭＯＰＭｐｉ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［ＭＯＰＭｐｉ］［Ｃｌ］、［ＭＯＰＭｐｉ］［Ｂｒ］、［ＭＯＰＭｐｉ］［Ｂ（ＣＮ_４）］、および［ＭＯＰＭｐｉ］［ＦＡＰ］；

１－メチルイミダゾリウム（Ｍｉｍ）塩、例えば［Ｍｉｍ］［ＢＦ_４］；

メチルトリオクチルアンモニウム［ＭＯｃ_３Ａ］塩、例えば［ＭＯｃ_３Ａ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［ＭＯｃ_３Ａ］［ＴＦＡ］、および［ＭＯｃ_３Ａ］［ＯＴｆ］；

１－オクチル－３－メチルイミダゾリウム（Ｏｍｉｍ）塩、例えば［Ｏｍｉｍ］［Ｃｌ］、［Ｏｍｉｍ］［Ｉ］、［Ｏｍｉｍ］［ＢＦ_４］、および［Ｏｍｉｍ］［ＦＡＰ］；

１－オクチル－１－メチルピロリジニウム（ＯＭｐｙｒ）塩、例えば［ＯＭｐｙｒ］［Ｃｌ］；

１－プロピル－３－メチルイミダゾリウム（Ｐｍｉｍ）塩、例えば［Ｐｍｉｍ］［Ｉ］；

１－（３－スルホプロピル）－３－ブチルイミダゾリウム Ｔｆ_２ＮおよびＯＴｆ；

Ｎ－（３－スルホプロピル）－ピリジニウム Ｔｆ_２ＮおよびＦＡＰ；

テトラブチルアンモニウム（ＮＢ４）塩、例えば［ＮＢ４］［Ｔｆ_２Ｎ］；

テトラメチルアンモニウム（Ｎｍ４）塩、例えば［Ｎｍ４］［ｂｏｂ］および［Ｎｍ４］［ＦＡＰ］；

トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウム（Ｐ（ｈ３）ｔ）塩、例えば［Ｐ（ｈ３）ｔ］［ｂｏｂ］、［Ｐ（ｈ３）ｔ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［Ｐ（ｈ３）ｔ］［ＰＦ_６］、［Ｐ（ｈ３）ｔ］［ＢＦ_４］、［Ｐ（ｈ３）ｔ］［ＤＣＡ］、および［Ｐ（ｈ３）ｔ］［ＦＡＰ］；

１，２，３－トリメチルイミダゾリウム（Ｍｍｍｉ）塩、例えば［Ｍｍｍｉ］［Ｉ］；

２－アミノ－１，６－ジメチルイミダゾ［４，５－ｂ］－ピリジン塩、例えば２－アミノ－１，６－ジメチルイミダゾ［４，５－ｂ］－ピリジンＴｆ_２Ｎ；ならびに

トリエチル－ヘキサデシルホスホニウム（ＴＨＰ）塩、例えば［ＴＨＰ］［ＤＣＮ］。本明細書では、［Ｂｍｉｍ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［Ｂｍｉｍ］［ＯＡｃ］、［Ｂ３ｍｐｙ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［Ｂ４ｍｐｙ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［ＭＯｃ_３Ａ］［Ｔｆ_２Ｎ］、［ＭＭｐｙｒ］［Ｔｆ_２Ｎ］、および［Ｐ（ｈ３）ｔ］［ＤＣＡ］が特に興味深い。

ポリマー性イオン液体も、本発明と併用することができる。ポリマー性イオン液体は、当技術分野で公知であり、例えばShaplov et al. (2011), "Polymeric Ionic Liquids: Comparisons of Polycations and Polyanions," Macromolecules 44(24):9792-9803、Wu et al. (2017), "Polymerizable ionic liquids and polymeric ionic liquids: facile synthesis of ionic liquids containing ethylene oxide repeating unit via methanesulfonate and their electrochemical properties," RSC Advances 7: 5394-5401、およびMecerreyes et al. (2011), "Polymeric ionic liquids: Broadening the properties and applications of polyelectrolytes," Progress in Polymer Science 36(12): 1629-1648に記載されている。Zhang et al. (2015) Molecules 20:17378-17392に記載されている熱応答性ポリ
（イオン液体）ベースのナノゲルも、本明細書において使用するのに適しており、その調製も、その刊行物に記載されている。

イオン液体の前述の一覧は、単に例示的なものであり、限定することを企図されないことを理解されよう。本明細書において有用な他のイオン液体には、Plechkova et al. (2008) Chem. Soc. Rev. 37:123-150、Branco et al., "Physico-Chemical Properties of Task-Specific Ionic Liquids," in Ionic Liquids: Theory, Properties, New Approaches, Ed. A. Korkorin (Intech, 2011)およびPlechkova et
al. (2015), in Ionic Liquids Completely Uncoiled (Wiley, 2015)に記載されているイオン液体が含まれる。本発明の方法と併用するのに有用なさらに他のイオン液体は、他所で文献に記載されており、かつ／または当業者に明らかとなろう。本明細書で使用するのに一般に好ましいイオン液体は、試料から著しい画分の標的分析物の抽出を可能にし（約５０％またはそれよりも多い、例えば５０％～１００％、５０％～９５％、５０％～８５％、５０％～７５％等）、かつ／または標的分析物と元々関連していた少なくとも１つの非標的構成成分（例えば、少なくとも１つの夾雑物）の濃度が、流体層の１つにおいて低減されている（例えば、少なくとも５０％、例えば５０％～１００％、５０％～９５％、５０％～８５％、５０％～７５％等低減されている）流体組成物を提供する。好ましいイオン液体は、相対的に非毒性であり、実験室において容易に使用され、リザーバー中心に水性抽出流体を濃縮するように、流体リザーバー表面に対して高い親和性を有する。ある場合には、選択されたイオン液体は、監査可能な音響インピーダンスを有することが望ましい場合がある。さらに、ある場合には、分析物サイズに基づいて抽出バイアスを示すイオン液体が好ましい一方、他の場合には、好ましいイオン液体は、分析物サイズに関係する抽出バイアスを示さないイオン液体である（通常、核酸分析物、例えばＤＮＡを用いる場合のように）。

一部の実施形態では、本発明の抽出プロセスに使用されるイオン液体は、磁気イオン液体である。磁気イオン液体は、磁気ビーズの液体形態として働き、目的の標的分析物を含有する磁気イオン液体は、枯渇した非イオン（例えば、水性）層を容易に除去できるように、流体リザーバーの片側に引き寄せることができる。磁気イオン液体（ＭＩＬ）は、当技術分野で公知であり、文献に記載されている。例えば、Clark et al. (2015) Anal. Chem. 87:1552-1559を参照されたい。その文献に記載されている通り、ＭＩＬの例として、ベンジルトリオクチルアンモニウムブロモトリクロロ鉄酸塩（ＩＩＩ）および１，１２－ジ－（３－ヘキサデシル－ベンズイミダゾリウム）ドデカンビス［（トリフルオロメチル）スルホニル］イミドブロモトリクロロ鉄酸塩（ＩＩＩ）が挙げられる。

一実施形態では、その方法は、生体試料からの生体分子の抽出に使用され、生体分子は、第２の液体に対して第１の液体に優先的に分配され、混合およびその後の分配の完了後に、音響射出技術を使用して、二相の一方を除去する。例えば、以下にさらに詳細に説明される通り、音響射出技術は、流体リザーバーから分析物を含有する上方流体層の液滴を急速に連続的に射出するように実施することができ、分析物を含有する流体液滴は、さらなる処理および／または分析のために液滴リザーバーに射出される。音響射出技術は、分析物を含有していない上方流体層の液滴を繰り返し射出し、それによって、流体リザーバーから非分析物を含有する上方流体を除去し、分析物が下方流体層中に残存するように実施することもできる。

このような方法の一例は、図１に図示されている。図１では、生体試料は、流体容器内に提供される。試料は、水性流体中の複数構成成分の混合物である。少なくとも１つの構成成分が第２の流体を優先的に選択することを理由として、試料からその構成成分を除去する第２の流体が添加される。次に、上方層は、デカントによって、またはより好ましくは、例えば下記の通り集束音響射出システムを使用する反復音響射出によって、流体容器から除去することができる。図１に例示される具体例では、生体試料から脂質構成成分を除去することが望ましい。したがって、「第１の流体」は、水性試料自体であり、例えば、核酸、タンパク質、脂質および他の構成成分を含有する、図に示される通りの細胞アッセイ物５０μＬである（「細胞アッセイ物」という用語は、本明細書では、ある程度処理されていても処理されていなくてもよい細胞試料、例えば細胞可溶化液を指すために使用される）。脂質は、非極性または低極性溶媒においてはるかにより可溶性が高いので、選択された「第２の流体」は、有機溶媒、例えばジエチルエーテル１０μＬである。この抽出プロセスの後、水層の最上部の脂質含有エーテル層は、前述の通り除去することができる。

興味深いことに、図１から分かる通り、選択された流体リザーバー内で異なる特性を有する２つの溶媒を合わせると、メニスカスの反転が生じ得る。すなわち、第１の流体は、第２の流体を添加する前に凹面メニスカスを有しているが、第２の流体を添加すると、その凹面メニスカスが、流体と流体の境界で凸面形状に変換する。このことは、複数の場合において望ましい場合がある。例えば、流体容器内の中心点に集束する音響放射を用いると、下方流体は、上方流体層と接触することなく（または最小限接触して）、中心の「液体開口部」を介して射出され得る。これによって、上方層の除去ステップを省略して、全体的な抽出プロセスを合理化することができる。このやり方によるメニスカスの反転は、特定の流体のタイプ、例えば、有機溶媒、水性液体、イオン液体等を引き付けるか、またははじく内表面を有する流体リザーバーを使用することによって達成され得る。このような内表面を有する流体リザーバーは、例えば数々の供給源から得られる、様々なタイプのコーティングを有するマイクロウェルプレートとして、商業的に得ることができる。

本発明の抽出プロセスの別の例を、非イオン液体に対してイオン液体に優先的に分配される生体分子の抽出に関して記載する。このような重要な生体分子は、ＤＮＡであり、これは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）であってもそうでなくてもよい。このような方法の第１のステップは、図２に概略的に示されている。生体試料は、その試料中の細胞および／または組織材料を溶解させ、次に本明細書では「初期緩衝剤」と呼ばれる適切な水性緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝剤）に試料を再懸濁させることによって、最初に処理することができる。生体試料は、循環無細胞ＤＮＡを含むこともできる。マイクロウェルプレート、例えば３８４－ウェルプレート内で行う場合、個々のウェルは、抽出が行われる流体リザーバーとして働くので、既知の量のイオン液体を複数のウェルのそれぞれに添加する。イオン液体は、ＤＮＡに対して強力な親和性を有するように選択され、初期緩衝剤は、ＤＮＡがイオン液体に優先的に、すなわち緩衝液と比較して優先的に分配されるように選択される。図２に例示される通り、その方法は、５～３０μｌ、例えば２５μｌのイオン液体、例えば［Ｂｍｉｍ］［ＰＦ_６］（１－ブチル－３－メチルイミダゾリウムヘキサフルオロリン酸塩）を、個々のウェルに添加することを含み得る。ウェルは、好ましくは、集束音響射出技術を使用してウェルへ上向きに液滴を音響的に射出することによってイオン液体で充填されているので、図に例示されている個々のウェルは、反転された配置で示されている。あるいは、少量のイオン液体を含有するウェルは、単に反転することができ、表面張力はイオン液体を適所に維持する。次に、ＤＮＡを含有する水性緩衝剤を、好ましくは集束音響液滴射出を再び使用して、各ウェルに導入する。２つの液体の体積は、同じでも同じでなくてもよく、図では、両方の体積、すなわちイオン液体の体積およびＤＮＡを含有する水性緩衝剤の体積は、２５μｌと示されている。

図２に示される通り、２つの液体の密度は、異なっていてよい。図２は、代表的な非限定的密度の数値を提供しており、イオン液体密度は、一般に１．３ｇ／ｍＬ超と示され、ＤＮＡ水溶液の密度は、およそ１．１ｇ／ｍＬと示されている。その結果として、反転された流体リザーバー内の２つの液体は、ウェルの「底部」上にある上方層である水性緩衝剤、および緩衝剤の下にある、下方層としてのＤＮＡを含有するイオン液体に分配される。次に、示される通り二層の相対的位置を交換するように、ウェルプレートを反転することができる。すなわち、反転後に、ＤＮＡを含有するイオン液体は、ウェルの底部にあり、水性緩衝剤層は、イオン液体層を通してその上に上昇している。

この時点で、水性緩衝剤層を除去するために、さらなるステップが用いられる。このステップは、本明細書では「抽出緩衝剤」と呼ばれる、第２の水性緩衝液を使用する。抽出緩衝剤は、初期緩衝剤とは対照的に、ＤＮＡがイオン液体から抽出緩衝剤に優先的に分配されるように選択される。初期緩衝剤および抽出緩衝剤は、異なる緩衝剤構成成分を含有することができ、または同じ緩衝剤構成成分を含有するが、異なるｐＨレベルを有することができる。そのプロセスは、図３に概略的に例示されている。この場合、抽出緩衝剤は、ＤＮＡを含むイオン液体を含有する流体リザーバーに導入され、２つの液体は混合される。マイクロウェルプレート内のマイクロウェルは、流体リザーバーとして容易に使用できるので、混合は、単にウェルプレートを複数回急速に反転させることによって達成することができる。混合し、二相が分離する時間を設けた後、各リザーバーは、下方層としてのイオン液体、および上方層としてのＤＮＡを含む抽出緩衝剤を含有する。上方層、すなわち水性ＤＮＡ層は、任意の適切な手段を使用して除去することができるが、層を音響射出することが好ましい。音響射出を使用して、層を、前述の通り反転された個々の入れ物に移すことができ、または分析機器、例えば質量分析計に直接的に、音響的に射出することができる。音響射出を使用する分析機器へのＤＮＡ水溶液の移動は、共にそれらの全体が参照によって組み込まれるSinclair et al. (2016) Journal of Laboratory Automation 21(1):19-26およびEllsonらの米国特許第７，４０５，３９５号（Ｌａｂｃｙ
ｔｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に記載されている通りに行うことができる。ＤＮＡを含有する水性液体を分析機器に移すための音響液滴射出の使用は、必要に応じておよそ数ナノリットルの非常に少量の試料を用いて実施することができる。さらに、分析機器への音響伝達は、非常に急速に行うことができ、１時間当たり１０，０００を超えるデータ点を作製することができ、したがって、ハイスループットプロセスに理想的に適している。

別の実施形態では、３つの異なる流体を使用する抽出方法が提供され、第１の流体および第２の流体を使用する第１のステップでは、標的分析物は第２の流体に分配されるが、第２の流体および第３の流体を使用する第２のステップでは、標的分析物は第３の流体に分配される。すなわち、標的分析物は、代替が第１の流体である場合には第２の流体に優先的に分配されるが、第２の流体に対しては第３の流体に優先的に分配される。第１、第２、および第３の流体は、別個に処理するために、複数の種、例えば夾雑物または分析物を試料から除去し、それによって第３の流体中の標的分析物のより純粋な溶液を提供するように選択される。この方法の例は、以下の通りである。水性生体試料（すなわち、標的分析物としてＤＮＡを含有する第１の流体）を、イオン液体（すなわち、標的分析物が分配される第２の流体）と混ぜ合わせ、上方水層および下方イオン液体層に分配させることができる。イオン液体は、この第１のステップでその層にＤＮＡが分配されるように選択される。次に、好ましくは本明細書の他所に記載される通り、音響射出を使用して上方層を除去して、標的分析物であるＤＮＡを含む流体組成物を、イオン液体中に残す。その後のステップで、ＤＮＡを含有するイオン液体は、ＤＮＡの少なくとも６０ｗｔ．％（好ましくはＤＮＡの少なくとも７５ｗｔ．％、例えば少なくとも８５ｗｔ．％、少なくとも９０ｗｔ．％、少なくとも９５ｗｔ．％、または１００％）が、ここでイオン液体から抽出緩衝剤に移動し、それによってイオン液体の最上部に上方流体層が形成されるように選択されたｐＨを有する水性抽出緩衝剤と混ぜ合わされる。次に、ＤＮＡを含有する水層を、前述の通り音響的に射出することができる。

図４は、ＤＮＡを標的分析物として含有する生体試料（図では細菌可溶化液として示されている）３５μＬを使用する前述の二重抽出方法を概略的に例示している。生体試料は、独立型単一リザーバー、他のこのようなリザーバーの群の１つである独立型リザーバー（例えば、他の管を含有する管のラックにおける管）、マイクロウェルプレート内のウェル、例えば３８４ウェルプレート等であってよいリザーバーに含有される。「第１の流体」は、図に示されている通り、ＤＮＡを含有する水性緩衝剤であってよい。イオン液体を、流体リザーバーに添加すると、水相の下に下方層が形成される。２つの流体層は、適切な方法を使用して混合されるが、図４に示される通り、加熱が好ましい。加熱は、層を混合し、それらを混和性にするだけでなく（相対的に穏やかな温度で水性流体と混和性にされ得る、適切なイオン液体が選択されるという条件で）、生体試料中の細胞を溶解して、細胞内容物を放出する。ＤＮＡは、イオン液体中にやはり優先的に残存し、ただし第１の流体は、適切なｐＨ、すなわちＤＮＡが水相中に残らずにイオン液体に分配されるｐＨに緩衝される。望ましくない細胞構成成分を含有する上方流体は、デカント、水性射出、または任意の他の適切な方法によって除去されるが、好ましい方法は、やはり集束音響射出を伴う。水相を除去した後、標的分析物を含有するイオン液体の単相は、流体リザーバーに残存する。次に、抽出緩衝剤を添加し、二相を混合する。一実施形態では、先に説明した通り、抽出緩衝剤は、ＤＮＡの少なくとも６０ｗｔ．％（前述の通り、好ましくはＤＮＡの少なくとも７５ｗｔ．％等）が、イオン液体から抽出緩衝剤に移動することができ、それによって上方水性ベースが形成されるように選択されたｐＨに緩衝される。次に、ＤＮＡを含有する水性流体層は、前述の通り音響的に射出される。

３．反応生成物

本明細書の初期に説明されている通り、標的分析物は、生体試料に含有されるか、または生体試料から誘導された分析物に限定されない。標的分析物は、無機化合物、有機金属化合物、またはさらには原子もしくはイオンであってよく、この節のパート（１）を参照されたい。次に、さらなる実施形態では、標的分析物は、多段階反応における反応生成物であってよい。すなわち本発明は、反応生成物の合成および音響抽出のための方法であって、流体リザーバー内に、第１の液体を構成する第１の反応物、第２の反応物、および流体媒体の反応混合物を提供するステップと、反応混合物を、第１の反応物と第２の反応物の間の化学反応を引き起こして第１の溶解度を有する反応生成物をもたらす条件に晒すステップと、第１の液体と不混和性であり、反応生成物が第１の溶解度と少なくとも５０％異なっている第２の溶解度を有する第２の液体を、反応混合物に混合し、それによって、異なる濃度の反応生成物を含有する上方層および下方層を有する流体組成物を提供するステップと、反応生成物を含有する流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で、流体リザーバーに集束音響エネルギーを印加するステップとを含む、方法をさらに提供する。反応混合物は、反応触媒、界面活性剤、または追加の有用な構成成分をさらに含むことができる。反応触媒および／または界面活性剤が使用される場合、２つの液体は、反応生成物が一方の層に分配され、触媒および／または界面活性剤が他方の層に分配されて、反応生成物からのこれらの他の部分の除去を可能にするように選択することができる。前述のプロセスの変形形態では、反応生成物は、必ずしも二層の一方に分配されるわけではないが、その他の構成成分、すなわち触媒および界面活性剤（反応生成物に対して夾雑物としてみなされ得る）は、他方の層と比較して一方の層に対して実際に親和性を有する。したがってこの場合、抽出プロセスは、標的分析物を同時に移動することなく、一方の層から別の層に夾雑物を移動させ、したがって両方の層は、標的分析物を含有しているが、それらの層の一方は、かなり低濃度の夾雑物を有する。

反応条件は、一般に、必ずしもそうであるわけではないが、反応が反応混合物中で所定の反応時間進行できるようにすること、反応物を混ぜ合わせること、反応混合物の温度を変化させること、少なくとも１つの触媒を反応混合物に添加すること、少なくとも１つの界面活性剤を反応混合物に添加すること、少なくとも１つの追加の反応物を反応混合物に導入すること、およびこれらの２つまたはそれよりも多くの組合せからなる群から選択される。

本発明の関連する態様では、反応生成物の合成および音響伝達のための方法が提供される。その方法は、

（ａ）流体リザーバー内に、第１の反応物、第２の反応物、および流体媒体から構成された、約１ｎＬ～約３ｍＬの範囲の体積を有する反応混合物を提供するステップと、

（ｂ）反応混合物を、第１の反応物と第２の反応物の間の化学反応を引き起こして反応生成物をもたらす反応条件に晒すステップと、

（ｃ）反応生成物を含有する流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で、流体リザーバーに集束音響エネルギーを印加するステップと
を含む。

反応条件は、前述の通りであり、すなわち、反応が反応混合物中で所定の反応時間進行できるようにすること、反応物を混ぜ合わせること、反応混合物の温度を変化させること、少なくとも１つの触媒を反応混合物に添加すること、少なくとも１つの界面活性剤を反応混合物に添加すること、少なくとも１つの追加の反応物を反応混合物に導入すること、および前述の２つまたはそれよりも多くの組合せからなる群から選択される。

関連の実施形態では、試料から標的分析物を抽出するための音響システムであって、（ａ）第１の反応物、第２の反応物および流体媒体から構成された、約１ｎＬ～約３ｍＬの範囲の体積を有する反応混合物である流体組成物を収容する流体リザーバーと、（ｂ）流体組成物から流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で音響放射を発生させるために、流体リザーバーと音響的な接続関係にある音響液滴射出器であり、音響放射発生器、およびリザーバー内の焦点に音響放射を集束させるための集束手段を含む、音響液滴射出器とを含む、システムが提供される。一実施形態では、液滴レシーバーは、反転された流体リザーバー、例えば反転されたマイクロウェルプレート内のウェルである。別の実施形態では、液滴レシーバーは、分析機器、例えば質量分析計であり、質量分析計に射出された液滴は、直接的または間接的に機器によって分析される。

４．金属イオンの抽出

別の実施形態では、標的分析物および少なくとも１つのアルカリ金属イオン、典型的にリチウムカチオン、ナトリウムカチオンもしくはカリウムカチオン、および／または少なくとも１つのアルカリ土類金属イオン、例えばカルシウムもしくはマグネシウムイオンを含有する水性試料から、金属イオン、例えばアルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンを除去するための抽出方法が提供される。このことは、目的の標的分析物を含有する水性流体が、分析のために質量分析計に移される（例えば、音響射出を介して）、質量分析の状況において特に有用である。イオン抑制、すなわち標的分析物のイオン化抑制は、質量分析において周知の問題であり、イオン抑制の最も一般的な原因の１つは、著しい量の（約１０^－５Ｍまたはそれよりも多い）アルカリ金属カチオンおよび／またはアルカリ土類金属カチオンの存在である。Volmer et al. (2006) LCGC North America 24(5): 498-510を参照されたい。ナトリウムおよびカリウムは、それらが生物学的に関連するために最大の懸案事項となる２つのアルカリ金属である。また、多価カチオンは、一般に、不溶性塩を形成するために沈殿によって溶液から除去することができるが（リン酸塩による鉄または銅の沈殿と同様に）、一価アルカリ金属カチオンは、溶液から除去するのがより困難である。クラウンエーテルは、アルカリ金属イオンにしっかりと結合するが、現在まで、試料の残部からクラウンエーテルを分離するのに有効な抽出プロセスがまだ開発されていないため、水溶液からアルカリ金属を除去するために有効に使用されていない。

したがって、この実施形態では、生体試料および他の水性組成物からアルカリ金属および／またはアルカリ土類金属を有効に抽出する新しい方法が提供される。その方法は、標的分析物ならびにアルカリ金属イオンおよび／またはアルカリ土類金属イオンを含む水性試料に、イオン液体、ならびにクラウンエーテル、クリプタンドおよびそれらの組合せから選択される金属結合化合物を含む金属抽出組成物を添加し、それによって初期二相溶液を形成するステップと、二相が混和性になるような条件（例えば加熱）を二相溶液に印加し、それによって、金属塩を単相溶液中で金属抽出組成物と混合するステップと、例えば冷却によって二相溶液を再作製するステップとを含み、このステップで作製された二相溶液は、上方水層ならびに金属抽出組成物および金属イオンの下方層を含む。次に、水層は、標的分析物を分析するために、質量分析計（または他のタイプの液滴レシーバー）に射出され得る。金属抽出組成物は、イオン液体および金属結合化合物を、約１：１００～約１００：１の範囲、より典型的には約１：１０～約１０：１の範囲の重量比で含む。

好ましい金属結合化合物は、クラウンエーテル、例えば１２－クラウン－４、１５－クラウン－５、および１８－クラウン－６である。特に好ましい金属結合化合物は、カチオン性部分で、典型的に必ずしもそうであるわけはないが、この節のパート２「抽出方法」で列挙される液体塩内に含有されるカチオンに相当するカチオン性部分で官能化されることによってイオン液体に変換されているクラウンエーテルを含む。例えば、限定されるものではないが、このやり方によるクラウンエーテルの修飾は、水素原子（Ｃ－Ｈ基内の）を、負に帯電している対イオンと会合している正に帯電している窒素原子を含有する官能基で置き換えることによって達成され得る。このような１つのクラウンエーテル塩は、式（Ｉ）の構造を有する

［式中、Ｒは、第三級アミノ基および窒素複素環から選択することができ、Ｘは、アニオン種、例えばハロゲン化物イオンである］。このようなクラウンエーテル塩の具体例は、式（ＩＩ）の構造を有する。

このクラウンエーテル塩は、Dharaskar et al. (2016), "Synthesis, characterization and application of 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate for extractive desulfurization of liquid fuel" Arabian Journal of Chemistry 9:578-587によって記載されている技術に類似の技術を使用して、クロロメチル１８
－クラウン－６およびＮ－メチルイミダゾールから合成することができる。

関連の実施形態では、本発明は、イオン液体、ならびにクラウンエーテル、クリプタンドおよびそれらの組合せから選択される金属結合化合物を含む、前述の抽出（または他の）プロセスで使用するための金属抽出組成物を提供する。これらの官能化クラウンエーテルおよびクリプタンドは、ある特定のタイプの標的分析物に対して選択的親和性を有するイオン液体であり、アルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンを除去するためのキレート剤であるという点で、本発明の抽出プロセスにおいて二重の目的を果し得ることに留意されたい。

５．２つの溶媒における分析物の分配係数の決定

本明細書に記載され、特許請求されるプロセスを含めた任意の抽出プロセスでは、２つの溶媒における特定の標的分析物の分配係数を知ることが極めて有用である。溶媒の一方は、水性生体試料、水性緩衝剤等におけるように水であってよく、他方の溶媒は、抽出プロセスにおける使用を考慮される候補溶媒であってよい。したがって、さらなる実施形態では、本発明は、２つの溶媒の混合物中の分析物の分配係数Ｄを決定するための方法であって、

（ａ）流体リザーバー内で、既知の量Ｘの分析物を、第１の体積Ｖ_１の第１の溶媒、および第１の溶媒と実質的に不混和性の第２の体積Ｖ_２の第２の溶媒と合わせ、したがって、分析物が、合わされた第１の溶媒および第２の溶媒中、濃度Ｘ／（Ｖ_１＋Ｖ_２）を有し、それによって、第１の溶媒の上方層および第２の溶媒の下方層を有する、分配された流体組成物を形成するステップであって、分析物は、第１の溶媒において濃度Ｃ_１を有し、第２の溶媒において濃度Ｃ_２を有する、ステップと、

（ｂ）上方層の液滴を音響的に射出するステップと、

（ｃ）射出された液滴中のＣ_１を決定するステップと、

（ｄ）関係式Ｃ_２＝（Ｃ_１Ｖ_１）／Ｖ_２に従ってＣ_１からＣ_２を算出するステップと、

（ｅ）Ｃ_２に対するＣ_１の比を確認することによって、分配係数Ｄを決定するステップとを含む、方法を提供する。

関連の実施形態では、２つの溶媒中の分配係数Ｄを決定するための方法であって、

（ａ）流体リザーバー内で、分析物、第１の体積Ｖ_１の第１の溶媒、および第１の溶媒と実質的に不混和性の第２の体積Ｖ_２の第２の溶媒を合わせ、それによって、第１の溶媒の上方層および第２の溶媒の下方層を有する、分配された流体組成物を形成するステップであって、分析物は、第１の溶媒において濃度Ｃ_１を有し、第２の溶媒において濃度Ｃ_２を有する、ステップと、

（ｂ）上方層の液滴を音響的に射出するステップと、

（ｃ）（ｂ）で射出された液滴中のＣ_１を決定するステップと、

（ｄ）分配された流体組成物から上方層を除去するステップと、

（ｅ）下方層の液滴を音響的に射出するステップと、

（ｆ）（ｅ）で射出された液滴中のＣ_２を決定するステップと、

（ｇ）Ｃ_２に対するＣ_１の比を確認することによって、分配係数Ｄを決定するステップとを含む、方法が提供される。

６．音響射出およびハイスループットプロセス

音響射出は、所定の一貫したサイズのナノリットルサイズの液滴の急速な処理および作製を可能にする。本明細書で先に参照によって組み込まれたStearnsらの米国特許第６，
４１６，１６４号を参照されたい。前述の特許文献は、流体表面から音響的に射出された液滴のサイズが、音響出力、音響周波数、トーンバースト期間、および／または集束レンズのＦ値を変えることによってどのように注意深く制御され得るかについて記載しており、一般におよそ２を超えるＦ値を有するレンズが好ましい。したがって、ＡＤＥは、「超単分散」液滴の射出を可能にし、これは本発明の文脈では、射出された粒子が約１％の変動係数で一貫した直径を有することを意味する。さらにＡＤＥは、正確な所定量の流体試料を、分析のためにシステムに導入することを可能にする。音響射出を使用するさらなる利点は、およそ５μｌまたはそれ未満の非常に小さい試料サイズから液滴を射出できることである。このことは、試料の利用性が制限されており、必要に迫られて小さい流体試料を分析しなければならない場合に、特に有利である。処理能力に関して、Mutzらの米国特許第６，９３８，９９５号は、複数のリザーバー内で流体試料の音響アセスメントと併用される音響射出技術は、１秒当たり５個、１０個、またはさらには２５個を超えるリザーバーの分析を達成できると説明しており、これは１日当たり５０，０００個を優に上回る流体試料に換算される。

本発明のシステムは、音響射出技術を使用して可能になる精密度のおかげで、非常に小さいサイズの試料流体液滴を音響的に射出するために使用することができる。しかし本発明は、これに関して限定されず、音響的に射出される液滴の体積は、約０．５ｐＬ～約３ｍＬの範囲であってよい。本発明のシステムは、多くの適用で、分析のためにナノリットルサイズの流体液滴を作製するために使用され、ここで「ナノリットルサイズの」液滴は、約０．５ｐＬ～２．０ｎＬ、約０．５ｐＬ～１．５ｎＬ、約０．５ｐＬ～１．０ｎＬ、約１．０ｐＬ～２．０ｎＬ、約１．０ｐＬ～１．５ｎＬ、約１．０ｐＬ～１．０ｎＬ等の範囲を含めて、一般に最大約３０ｎＬの流体試料、典型的に約１０ｎＬ以下、好ましくは約５．０ｎＬ以下、より好ましくは約３．０ｎＬ以下、例えば１．０ｎＬ以下、約５０ｐＬ以下、約２５ｐＬ以下、および約１ｐＬ以下の流体試料を含有する。典型的な操作範囲では、約１ｎＬ～約３０ｎＬの範囲の液滴が生成される。流体試料表面からの液滴の音響射出は、以下により詳細に説明される通り、音響射出器を使用して行われる。音響射出技術は、特にハイスループット処理に適しており、特にハイスループット質量分析（ＨＴＭＳ）が、試料の調製およびローディングの容易な自動化の欠如、試料を保存する必要性、相互汚染を排除する必要性、流体リザーバーから分析デバイスに直接的に移行できないこと、ならびに適切なサイズの液滴を作製できないことによって妨げられている限り、ＨＴＭＳに適している。

次に一実施形態では、本発明のシステムおよび方法は、液体－液体抽出の状況で流体組成物から液滴を射出するための流体試料液滴作製デバイスとして、音響射出器を使用する。音響射出器は、流体表面から上向きに流体液滴の射出を引き起こす方式で、分析物を含有する流体組成物を収容するリザーバーに音響エネルギーを向ける。

そのシステムは、リザーバーおよび音響射出器を音響的な接続関係に位置決めするための手段を含むこともできる。典型的に、音響放射発生器、およびその音響放射発生器によって発生した音響放射を集束するための集束手段から構成される単一射出器が使用される。しかし、複数の射出器も同様に、有利に使用することができる。同様に、単一リザーバーを使用することができるが、デバイスは、典型的に、例えばアレイとして複数のリザーバーを含む。システムが複数のリザーバーのそれぞれから分析物を含有する流体試料の液滴を射出するために使用される場合、音響射出器に対してリザーバーを含有する基材（例えば移動式ステージ上に位置することができる）を移動させるか、またはその逆のために、位置決め手段が組み込まれる。一連のリザーバーのそれぞれからの流体液滴の急速かつ連続的な音響射出は、それによって容易に促進される。いずれかのタイプの位置決め手段、すなわち、射出器の位置決め手段、またはリザーバーもしくはリザーバー基材の位置決め手段は、例えば、モーター、レバー、滑車、歯車、それらの組合せ、または他の電気機械もしくは機械的手段から構築され得る。

いかなる音響液滴射出システムも、本発明のシステムおよび方法と併用することができるが、好ましいＡＤＥシステムは、その共通の譲渡のすべてが参照により本明細書に組み込まれる以下の米国特許に記載されるシステムである。Stearnsらの米国特許第６，４１
６，１６４号、Ellsonらの同第６，６６６，５４１号、Ellsonらの同第６，６０３，１１８号、Ellsonらの同第６，７４６，１０４号、Ellsonらの同第６，８０２，５９３号、Ellsonらの同第６，９３８，９８７号、Mutzらの同第７，２７０，９８６号、Ellsonらの同第７，４０５，３９５号、およびMutzらの同第７，４３９，０４８号。本明細書で使用するための好ましいＡＤＥシステムは、Ｌａｂｃｙｔｅ Ｉｎｃ．から利用可能なシステム、特にＥｃｈｏ（登録商標）５２５、Ｅｃｈｏ（登録商標）５５０、およびＥｃｈｏ（登録商標）５５５液体ハンドラーを含めたＥｃｈｏ（登録商標）５００－シリーズ液体ハンドラーシステム、ならびにＥｃｈｏ（登録商標）６００およびＥｃｈｏ（登録商標）６５５液体ハンドラーを含めたＥｃｈｏ（登録商標）６００－シリーズ液体ハンドラーシステムであり、それらはすべて、高い正確性、精密度および速度で幅広い流体クラスを射出することができる。

前述の特許文献に記載されている通り、音響射出デバイスは、単一リザーバーまたは複数のリザーバーから流体液滴を射出するように構築され得る。構成成分のモジュール性および互換性を提供するために、デバイスは、時として、複数の取り外し可能なリザーバー、例えばラック内の管等と併用されることが好ましい場合がある。一般に、リザーバーは、各リザーバーに個々の系統的なアドレス指定能力を提供するために、パターンまたはアレイ状に配列される。さらに、リザーバーのそれぞれは、多くのリザーバーを必要とする環境において別個のまたは独立型容器として提供され得るが、リザーバーは、統合された複数のリザーバーユニット内に含有されることが好ましい。一例として、複数のリザーバーユニットは、固体表面であってよく、その上に、別個の流体含有領域が表面濡れ特性のおかげで適所に維持され、流体を含有する各限局領域がリザーバーを構成する。別の例として、複数のリザーバーユニットは、リザーバーとして働く個々のウェルを有するウェルプレートであってよい。デバイスとの併用に適した多くのウェルプレートが商業的に利用可能であり、例えば、ウェルプレート１個当たり９６個、３８４個、１５３６個、または３４５６個のウェルを含有することができ、フルスカート、ハーフスカートを有し、またはスカートなしでもよい。ウェルプレートまたはマイクロタイタープレートは、一般に使用される実験室アイテムになっている。Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＳＬＡＳ）は、米国国家規格協会と協力して、マイクロタイタープレートのための規格を確立し、維持している。このようなウェルプレートのウェルは、一般に、直線アレイの形態である。

このような商業的に利用可能なウェルプレートの利用性は、少なくとも約１０，０００個のウェル、または１００，０００～５００，０００個ものウェル、またはそれよりも多くを含有する他の幾何構造の特注ウェルプレートの製造および使用を排除しない。さらに、リザーバーの構築に使用される材料は、中に含有される流体試料と適合性がなくてはならない。したがって、リザーバーまたはウェルが、有機溶媒、例えばアセトニトリルを含有することが企図される場合、アセトニトリルに溶解するか、またはアセトニトリルで膨潤するポリマーは、リザーバーまたはウェルプレートの形成に使用するには適していないはずである。同様に、ＤＭＳＯを含有することを企図されたリザーバーまたはウェルは、ＤＭＳＯと適合性がなくてはならない。水ベースの流体では、リザーバーの構築にいくつかの材料が適しており、それには、セラミック、例えば酸化ケイ素および酸化アルミニウム、金属、例えばステンレス鋼および白金、ならびにポリマー、例えばポリエステル、ポリプロピレン、環式オレフィンコポリマー（例えば、日本ゼオンからＺｅｏｎｅｘ（登録商標）としておよびＴｉｃｏｎａからＴｏｐａｓ（登録商標）として商業的に利用可能なもの）、ポリスチレンおよびポリテトラフルオロエチレンが含まれるが、それらに限定されない。感光性の流体では、リザーバーは、デバイスの機能を実質的に損なわないために十分な音響透過性を有する、光学的に不透明な材料から構築され得る。

さらに、動作中に音響放射発生器を各リザーバーまたはリザーバーウェルと整列させるのに必要な移動量および時間を低減するために、各リザーバーの中心は、隣接するリザーバー中心から約１センチメートル以下、より好ましくは約１．５ミリメートル以下、より一層好ましくは約１ミリメートル以下、最適には約０．５ミリメートル以下に位置することが好ましい。これらの寸法は、リザーバーのサイズを最大容積に限定する傾向がある。リザーバーは、典型的に約１ｍＬ以下、好ましくは約１００μＬ以下、より好ましくは約１μＬ以下、最適には約１ｎＬ以下の流体を含有するように構築される。複数のリザーバーの取扱いを促進するためには、リザーバーが音響的に実質的に区別できないことも好ましい。

本発明のシステムおよび方法と併用される音響射出デバイスは、少なくとも約２５０Ｈｚの速度での液滴の音響射出を可能にするが、５００Ｈｚ、１ｋＨｚ、またはそれを超える速度を含めたより高い射出速度も可能であり、液滴が小さいほど高い反復速度が可能になる。デバイスは、例えばウェルプレートまたは個々の管のラックの場合のように、アレイ状に配列され得る複数のリザーバーのそれぞれから、液滴を急速に射出することもできる。すなわち、基材の位置決め手段または射出器の位置決め手段は、射出器を一連の流体リザーバーのそれぞれに間断なく音響的に接続し、それによって、異なるリザーバーからの流体試料液滴の急速かつ制御された射出が可能になる。現在の商業的に利用可能な技術では、基材が射出器に対して移動することができ、かつ／または射出器が同じ基材内の１つのリザーバーから別のリザーバーに移動することができ、各リザーバーの反復可能な制御された音響接続は、高性能の位置決め手段では約０．１秒未満で、通常の位置決め手段では約１秒未満で移動できる。Ellsonらの米国特許第６，６６６，５４１号に説明されている通り、特注で設計されたシステムは、リザーバーからリザーバーへの遷移時間（音響射出事象間の時間に等価である）を、約０．００１秒未満に低減することができる。特注で設計されたシステムを提供するためには、パルスおよび連続の２つの基本的な種類のモーションがあることを常に念頭に置くことが重要である。パルスモーションは、射出器が基材内のリザーバーに音響的に接続されて、リザーバー内の試料流体から液滴を音響的に射出する位置に、基材または射出器を移動し、射出器が次のリザーバーに音響的に接続されるように基材および／または射出器を再配置する別個のステップを含む。このような方法と共に高性能の位置決め手段を使用すると、０．１秒未満で、各リザーバーの反復可能な制御された音響接続が可能になる。他方では、連続モーション設計は、基材および／または射出器を、同じ速度ではないが連続的に移動し、移動中に射出を提供する。パルス幅は非常に短いので、このタイプのプロセスでは、１０Ｈｚを超えるリザーバー間遷移、さらには１０００Ｈｚを超えるリザーバー間遷移が可能になる。

したがって本発明の方法は、ハイスループットの状況で本開示の抽出プロセスを実施するのに理想的である。抽出は、リザーバーからリザーバーへの非常に急速な遷移、および任意のタイプの液滴リザーバー、例えば反転されたマイクロウェルプレートまたは分析機器への音響液滴射出と共に、一連の流体リザーバー、例えばマイクロウェルプレート内のウェルのそれぞれにおいて本明細書に記載の通り行うことができる。

本明細書で有利に使用することができる代表的な集束音響射出システムは、参照によりその開示が組み込まれるEllsonらの米国特許第６，６６６，５４１号の図１に例示されている。その文献に説明されている通り、音響液滴射出デバイスは、音響射出器を含み、その射出器は、音響放射発生器、および発生した音響放射を流体試料内の流体表面の近傍の焦点に集束するための集束手段を含む。したがって音響射出器は、流体リザーバー内の流体組成物から流体の液滴を射出するように、音響放射を発生させ、集束させるように適合される。音響放射発生器および集束手段は、単一コントローラーによって制御される単一ユニットとして機能することができ、または独立に制御することができる。当技術分野で公知の曲面レンズまたはフレネルレンズを含めた様々な集束手段のいずれも、本発明と併用することができる。このような集束手段は、Loveladyらの米国特許第４，３０８，５４７号およびQuateらの米国特許第５，０４１，８４９号、ならびに米国特許出願公開第２
００２０３７５７９号に記載されている。さらに、射出器を個々の各リザーバーに音響的に接続し、したがってその中の流体に接続するいくつかのやり方がある。音響接続は、リザーバーに含有されている流体との直接的な接触によって達成され得るが、好ましい手法は、射出器の任意の部分（例えば、集束手段）を、射出される流体のいずれとも接触させずに、射出器をリザーバーおよびリザーバーの流体に音響的に接続することである。

音響液滴射出器は、各リザーバーの外表面と直接的または間接的に接触することができる。直接的な接触を用いて射出器をリザーバーに音響的に接続するには、効率的な音響エネルギー伝達を確保するために直接接触が全面的に等角的であることが好ましい。すなわち、射出器およびリザーバーは、接合接触に適合された対応する表面を有するべきである。したがって、音響接続が集束手段を介して射出器とリザーバーとの間で達成される場合、リザーバーは、集束手段の表面プロファイルに対応する外表面を有することが望ましい。等角接触でない場合、音響エネルギー伝達の効率および正確性は、損なわれる場合がある。さらに、多くの集束手段は曲面を有するので、直接接触手法は、特別に形成された反形表面を有するリザーバーの使用が必要となり得る。

最適には、音響接続は、音響接続媒体が射出器と流体リザーバーのベースとの間に置かれるという条件で、射出器とリザーバーのそれぞれとの間で間接的な接触を介して達成される。音響接続媒体は、音響集束手段およびリザーバーの下面の両方と等角接触している音響接続流体、好ましくは音響的に均質な材料であり得る。システムは、単一音響射出器を含有することができ、または複数の射出器を含有することができる。液滴の配置の正確性、ならびに液滴サイズおよび速度の一貫性は、単一射出器を用いる方が容易に達成されるので、一般に、単一射出器設計の方が複数の射出器設計よりも好ましい。しかし、本発明は、単一射出器設計に限定されない。

本発明の方法において２つ以上の流体リザーバーが使用される場合、リザーバーは、好ましくは実質的に同一であり、かつ音響的に実質的に区別できないが、同一の構築は必要条件ではない。この節の初期に説明される通り、リザーバーは、トレー、ラック、または他のこのような構造内の個別の取り外し可能な構成成分であってよいが、プレート、例えばマイクロウェルプレート、または他の基材内に固定されていてもよい。各リザーバーは、好ましくは、示される通り実質的に軸対称性であり、円形リザーバーベースから上向きに延びる垂直壁を有するが、他のリザーバー形状およびリザーバーベース形状を使用することもできる。各リザーバーベースの材料および厚さは、音響放射が、そのベースを介して各リザーバー内に含有されている流体試料に伝達され得るようにすべきである。

操作では、既に説明されている通り、流体リザーバーに、標的分析物を含有する試料を含む流体組成物を充填する。標的分析物は、一般に、溶媒もしくは溶媒混合物中に抽出された形態であり、または本明細書で初期に説明されている通り、下方流体層中に存在し得る。音響射出器は、射出器と、提供されたリザーバーとの間に音響接続を用いて、流体リザーバーの真下に位置付けられる。射出器およびリザーバーが互いに適切に位置付けられたら、音響放射発生器を起動させて、音響放射を発生させ、それを、集束手段によってリザーバー内の流体表面近傍の焦点に向ける（流体表面は、液体－空気界面または液体－液体界面のいずれかであり得る）。その結果として、流体液滴は、流体表面から液滴レシーバー、例えば基材、反転されたリザーバー、反転されたマイクロウェルプレート内のウェル、液滴移動デバイス、または分析機器に向かって射出される。複数リザーバーシステムでは、次に、例えばマルチウェルプレートまたは管ラックを、音響射出器に対して再配置することができ、したがって、別のリザーバーが射出器と整列し、次の流体組成物の液滴が射出され得る。

射出された液滴を向かわせることができる分析機器は、標的分析物を検出し、試料中の標的分析物の量もしくは濃度を決定し、または標的分析物の化学組成を決定するために使用される任意の機器であってよい。分析機器が、質量分析計、または分析物がイオン化形態であることを必要とする他のタイプのデバイスである場合、出てくる液滴は、イオン化領域を通過した後に、質量分析計、またはその分析物がイオン化形態であることを必要とする他の分析機器に入る。イオン化領域では、選択されたイオン化供給源、例えばエレクトロスプレーイオン供給源は、分析物をイオン化形態に変換する。イオン化形態の標的分析物を含有する、射出された流体液滴を用いる場合、イオン化供給源への曝露は不要である。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１１月２２日出願のDatwaniらの米国仮特許出願第６２／５９０，０７９号、"System and Method for
the Acoustic Loading of an Analytical Instrument Using a Continuous Flow Sampling Probe"を参照されたい。例示的な分析機器として、限定されるものではないが、質量分析計、分光デバイス、分離システム、およびそれらの組合せが挙げられる。例示的なイオン化技術として、限定されるものではないが、化学イオン化、電子衝撃イオン化、脱離化学イオン化、誘導結合プラズマイオン化、ならびにエレクトロスプレーイオン化および大気圧化学イオン化、および大気圧光イオン化を含めた大気圧イオン化が挙げられる。例示的な分離方法として、限定されるものではないが、液体クロマトグラフィー、固相抽出、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動法、または任意の他の液相試料精製もしくは分離プロセスが挙げられる。例示的な質量分析計として、限定されるものではないが、セクター型質量分析計、飛行時間型質量分析計、四重極質量フィルタ質量分析計、三次元四重極イオントラップ質量分析計、リニア四重極イオントラップ質量分析計、ドーナツ形イオントラップ質量分析計、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計が挙げられる。

さらに、本明細書の本発明は、既に記載されている通り、結果を最適化するための音響射出プロセスの改変を包含する。例えば、Ellsonらの米国特許第６，９３２，０９７号、Ellsonらの同第６，９３８，９９５号、Ellsonらの同第７，３５４，１４１号、Qureshi
らの同第７，８９９，６４５号、Ellsonらの同第７，９００，５０５号、Stearnsらの同
第８，１０７，３１９号、Ellsonらの同第８，４５３，５０７号、およびStearnsらの同
第８，５０３，２６６号に説明されている通り、前述の音響液滴射出器は、リザーバー内の流体組成物を特徴付けるために、例えば、流体メニスカスの高さ、ならびに他の特性、例えば流体の体積、粘度、密度、表面張力、組成、音響インピーダンス、音響減衰、流体における音の速度を測定するために利用することができ、次にそれらのいずれかまたはすべてを使用して、音響出力、音響周波数、トーンバースト期間、および／または集束レンズのＦ値を含めた液滴射出に最適なパラメーターを決定することができる。別の例として、Ellsonの米国特許第８，５４４，９７６号および同第８，８８２，２２６号に記載されている通り、音響照合プロセスを使用して、集束活性化音響射出システムにおける音響射出器および流体を含有するリザーバーの相対的な位置を最適化することができる。さらなる例は、射出前にリザーバー内の表面から反射された音響放射の波形を分析することによって、流体液滴を射出するために使用される音響放射の振幅を最適化するための方法である。Stearnsらの米国特許第７，７１７，５４４号および同第８，７７０，６９１号を参
照されたい。液滴のサイズおよび一貫性は、Hadimiogluらの米国特許第６，３８３，１１５号の方法を使用して確保することができ、リザーバー特性の変動は、Mutzらの米国特許第７，４８１，５１１号およびEllsonらの同第７，７８４，３３１号の方法を使用して制御することができる。

７．液体と液体の境界の動的追跡

好ましい実施形態では、音響射出プロセスを最適化するための前述の方法およびシステムの組合せは、本発明の状況において有利に使用することができる。より具体的には、流体リザーバー内の２つの流体層の間の境界の垂直位置は、リザーバー内の全流体組成物の高さのように、各音響射出事象の前に追跡することができる。これは、前述の特許文献に記載されている音響照合技術を使用して行うことができる。次に、本発明の抽出プロセス中に、上方流体の高さ（すなわち、中心点における液体と液体の境界からメニスカスまでの距離）は、流体組成物の全体的な（中心の）高さと、液体境界（の中心）の垂直位置の組合せから算出することができ、すなわち上方流体の高さは、全体的な流体の高さから、特定された境界の高さを引いたものに等しい。次にこれにより、上方層が完全に射出された後、下方層を射出することなく音響射出を停止することができるプロセスが促進される。

本発明を、いくつかの具体的な実施形態と共に記載してきたが、前述の説明および以下の実施例は、本発明の範囲を例示することを企図され、限定しないと理解されたい。これに関して、本発明の基本的な理解のために必要である以上に詳細に本発明の構造的詳細を示す意図はなく、説明は図および／または実施例と共に、本発明が実際にどのように具体化され得るかについて、当業者に明らかにする。本開示は、適用可能な法によって認められる限り、添付の特許請求の範囲に列挙される主題のあらゆる改変形態および等価形態を含む。さらに、本明細書に記載される本発明の要素のいずれの組合せも、本明細書で別段指定されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、本開示によって包含される。

本明細書に引用されるあらゆる特許文献、特許刊行物、参考文献、および他の材料は、それらの全体が参照により組み込まれる。

実験

Ｅｃｈｏ（登録商標）５５５液体ハンドラー（Ｌａｂｃｙｔｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）は、そのシステムが、高い正確性、精密度および速度により幅広い流体クラスを射出できるので、音響液滴射出器（ＡＤＥ）システムとして働く。流体試料を、３８４ウェルポリプロピレンソースプレートのウェルにロードし、そのソースプレートを電動式ステージシステムに搭載して、任意のソースウェルからのサンプリングを自動化する。Ｅｃｈｏ ５５５システムを、水中５０％までのメタノールおよび５０％までのアセトニトリルを含む水溶液に対して較正する。システムの音響トランスデューサーは、流体メニスカスの高さ、および他の特性（例えば、流体の体積、粘度、密度、表面張力、音響インピーダンス、音響減衰、流体における音の速度等）を測定して、音響出力、音響周波数、トーンバースト期間、および／または集束レンズのＦ値を含めた液滴射出のための最適なパラメーターを決定するために、リザーバー内の流体の自動的な特徴付けのために利用することもできる。

流体リザーバーは、３８４ウェルマイクロプレート内のウェルであった。流体リザーバーに、すなわちマイクロウェルプレートの試料をロードしたウェルに、適切な生体適合性緩衝剤、例えばＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝剤２０μＬおよびイオン液体としてのＢＭＩＭ ＰＦ_６２０μＬを添加する。一部のウェルを親水性アミンコーティングでコーティングし、他のものはコーティングしない。一部のウェルには界面活性剤を添加し、他のものには添加しない。本発明の抽出／分離プロトコールに従って、流体液滴を反転されたマイクロウェルプレートまたは分析機器、例えば質量分析計に注入する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
選択された濃度の標的分析物を含有する流体液滴を生成するための方法であって、
（ａ）流体リザーバー内に、前記標的分析物を含有し、上方領域および下方領域を含む流体組成物を提供するステップであって、前記分析物は、前記上方領域では第１の濃度で存在し、前記下方領域では第２の濃度で存在し、さらに前記第２の濃度は、前記第１の濃度とは異なっている、ステップと、
（ｂ）前記流体組成物から流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で、前記流体リザーバーに集束音響エネルギーを印加するステップであって、射出された前記液滴は、前記選択された濃度の前記標的分析物を含み、さらに前記選択された濃度は、（ｉ）前記第１の濃度または前記第２の濃度のいずれかに実質的に等価であり、（ｉｉ）前記液滴にわたって実質的に均一である、ステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記流体組成物が、前記標的分析物を含有する試料を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記試料が、生体試料を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記生体流体試料が、組織、組織ホモジネート、細胞、細胞懸濁液、細胞抽出物、全血、血漿、血清、唾液、喀痰、鼻汁、脳脊髄液、間質液、リンパ液、精液、膣液、または糞便を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記生体試料が、組織、細胞、または血液を含む、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記上方領域が、第１の液体を含む上方層であり、前記下方領域が、第２の液体を含む下方層であり、前記上方層および前記下方層の間に液体と液体の境界が存在する、項目１から５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記第１の液体および前記第２の液体が、前記標的分析物が前記第１の液体において第１の溶解度を有し、前記第２の液体において第２の溶解度を有するように選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記第１の溶解度が、前記第２の溶解度と少なくとも約５０％異なっている、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記第１の溶解度が、前記第２の溶解度と少なくとも約８５％異なっている、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記第１の液体および前記第２の液体が、前記第１の液体が前記標的分析物に対して第１の親和性を有し、前記第２の液体が前記標的分析物に対して第２の親和性を有するように選択され、前記第１の親和性および前記第２の親和性が異なっている、項目６に記載の方法。
（項目１１）
前記第１の液体および前記第２の液体の一方が、親水性であり、前記第１の液体および前記第２の液体の他方が、疎水性である、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記流体組成物が、異なる疎水性を有する複数の構成成分を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記標的分析物が、前記流体組成物における他方の構成成分の疎水性とは異なる疎水性を有する、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記第１の液体および前記第２の液体の一方が、前記標的分析物にイオン結合するイオン種を含む、項目６に記載の方法。
（項目１５）
前記標的分析物が、負に帯電している、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記第２の液体が、イオン液体を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記標的分析物が、核酸を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記核酸が、ＤＮＡを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の液体および前記第２の液体は、揮発度が異なっている、項目６に記載の方法。
（項目２０）
前記第１の液体が、前記第２の液体よりも揮発性が低い、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記第１の液体および前記第２の液体は、粘度が異なっている、項目６に記載の方法。
（項目２２）
ステップ（ｂ）の前に、前記第１の液体および前記第２の液体が、混合条件に晒される、項目６に記載の方法。
（項目２３）
前記混合条件が、かき混ぜ、撹拌、超音波処理、反転、またはそれらの組合せを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
ステップ（ａ）の前に、前記試料と２つの前記液体の混和性混合物との組合せを、２つの前記液体を実質的に不混和性にする条件に晒すことを含む、項目６に記載の方法。
（項目２５）
前記条件が、加熱または冷却を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記条件が、塩を前記流体組成物に添加することを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記第１の濃度および前記第２の濃度が、少なくとも５０％異なっている、項目６に記載の方法。
（項目２８）
前記第１の濃度および前記第２の濃度が、少なくとも８５％異なっている、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記液滴レシーバーが、分析機器を含む、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記分析機器が、質量分析計を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
ステップ（ｂ）を反復して、複数の流体液滴を前記液滴レシーバー内に射出することをさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
ステップ（ｂ）の各反復の前に、前記液体と液体の境界の存在を音響的に検出することをさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
前記液体と液体の境界が検出できない場合、ステップ（ｂ）の反復を中断することをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記液滴レシーバーが、液滴を受けるリザーバーである、項目１に記載の方法。
（項目３５）
複数の流体液滴を、前記液滴を受けるリザーバー内に射出するために、ステップ（ｂ）を反復することをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記標的分析物の少なくとも２０ｗｔ．％が前記流体リザーバーから前記液滴を受けるリザーバーに移されるまで、ステップ（ｂ）が反復される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記標的分析物の少なくとも５０ｗｔ．％が前記流体リザーバーから前記液滴を受けるリザーバーに移されるまで、ステップ（ｂ）が反復される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記標的分析物の少なくとも８０ｗｔ．％が前記流体リザーバーから前記液滴を受けるリザーバーに移されるまで、ステップ（ｂ）が反復される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記分析物が、前記流体組成物中では当初濃度で存在し、前記液滴を受けるリザーバー内では抽出濃度で存在し、前記抽出濃度が、前記当初濃度よりも高い、項目３４から３８のいずれかに記載の方法。
（項目４０）
ステップ（ｂ）の各反復の前に、前記液体と液体の境界の存在を音響的に検出することをさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目４１）
ステップ（ｂ）の各反復の前に、前記液体と液体の境界の存在を音響的に検出することをさらに含む、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記流体リザーバーが、標的分析物を含有する流体組成物をそれぞれ収容する複数の流体リザーバーのうちの１つである、項目１に記載の方法。
（項目４３）
前記流体組成物のいずれか２つが、同じでも異なっていてもよい、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記標的分析物のいずれか２つが、同じでも異なっていてもよい、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記標的分析物のいずれか２つが、同じでも異なっていてもよい、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記流体リザーバーが、アレイ状に配列されている、項目４２に記載の方法。
（項目４７）
前記流体リザーバーが、統合された複数のリザーバーユニットを含む基材内に含有されている、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記統合された複数のリザーバーユニットが、マイクロウェルプレートであり、前記流体リザーバーが、その中のウェルである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記液滴を受けるリザーバーが、複数の液滴を受けるリザーバーを含む統合された構造内に含有されている、項目３４に記載の方法。
（項目５０）
前記液滴を受けるリザーバーが、アレイ状に配列されている、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記液滴レシーバーが、反転されたマイクロウェルプレート内のウェルである、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
ステップ（ｂ）が、音響液滴射出器を前記流体リザーバーに音響的に接続し、前記射出器を起動させて、前記リザーバーに向けて前記流体組成物中に音響放射を発生させることによって行われ、前記音響液滴射出器が、音響放射発生器、および前記リザーバー内の焦点に前記音響放射を集束させるための集束手段を含む、項目１に記載の方法。
（項目５３）
ステップ（ｂ）が、音響液滴射出器を前記リザーバーに音響的に接続し、前記射出器を起動させて、前記リザーバーに向けて前記流体組成物中に音響放射を発生させることによって行われ、前記音響液滴射出器が、音響放射発生器、および前記リザーバー内の焦点に前記音響放射を集束させるための集束手段を含む、項目４２から５１のいずれかに記載の方法。
（項目５４）
前記流体液滴を射出した後に、（ｃ）第２のリザーバーおよび前記音響液滴射出器を、音響的な接続関係に位置決めするステップをさらに含み、ステップ（ｂ）を反復する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
ステップ（ｂ）および（ｃ）を、追加の流体リザーバーを用いて複数のリザーバー内で反復することをさらに含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
ステップ（ｃ）が、最大約０．５秒のリザーバーからリザーバーへの遷移時間で反復される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記リザーバーからリザーバーへの遷移時間が、最大約０．１秒である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記リザーバーからリザーバーへの遷移時間が、最大約０．００１秒である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
各リザーバーからリザーバーへの遷移が、前記リザーバーを前記音響液滴射出器に対して移動させることによって行われる、項目５６に記載の方法。
（項目６０）
各リザーバーからリザーバーへの遷移が、前記音響液滴射出器を前記リザーバーに対して移動させることによって行われる、項目５６に記載の方法。
（項目６１）
前記標的分析物が、共通の特徴を有する、原子、イオン、塩、分子またはあるクラスの分子を含む、項目１に記載の方法。
（項目６２）
前記標的分析物が、有機化合物、有機金属化合物、または無機化合物を含む、項目１に記載の方法。
（項目６３）
前記標的分析物が、薬理学的に活性な薬剤、代謝産物、酵素阻害剤、リガンド、受容体、触媒、ポリマー、金属、金属イオン、染料、殺有害生物薬、発癌物質、アロステリックエフェクター、抗原、およびウイルスから選択される、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記標的分析物が、生体分子を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６５）
前記生体分子が、ＤＮＡである、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記標的分析物が、反応生成物である、項目１に記載の方法。
（項目６７）
前記流体リザーバー内の前記流体組成物が、約１２５μＬ以下の体積を占める、項目１に記載の方法。
（項目６８）
前記流体リザーバー内の前記流体組成物が、約６０μＬ以下の体積を占める、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記流体リザーバー内の前記流体組成物が、約３０μＬ以下の体積を占める、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記射出された流体液滴が、約６０ｎＬ以下の体積を有する、項目１に記載の方法。
（項目７１）
前記射出された流体液滴が、約６０ｎＬ以下の体積を有する、項目６７に記載の方法。
（項目７２）
前記射出された流体液滴が、約６０ｎＬ以下の体積を有する、項目６８に記載の方法。
（項目７３）
前記流体リザーバーが、表面コーティング組成物でコーティングされた内表面を有する、項目１に記載の方法。
（項目７４）
前記表面コーティング組成物が、前記上方層をはじく、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記表面コーティングが、前記上方層を引き付ける、項目７３に記載の方法。
（項目７６）
試料からイオン標的分析物を抽出するための方法であって、イオン液体への前記イオン分析物の分配を促進する条件下で、前記試料を前記イオン液体および非イオン液体と混ぜ合わせ、その混合物から前記非イオン液体を音響的に除去することを含む、方法。
（項目７７）
試料からイオン標的分析物を抽出するための方法であって、イオン液体への前記イオン分析物の分配を促進する条件下で、前記試料を前記イオン液体および非イオン液体と混ぜ合わせて、前記イオン分析物のイオン液体溶液を提供し、その混合物から前記非イオン液体を除去し、イオン分析物溶液の液滴を液滴レシーバー内に音響的に射出することを含む、方法。
（項目７８）
前記試料が、生体流体試料を含む、項目７６または項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記生体流体試料が、組織、組織ホモジネート、細胞、細胞懸濁液、細胞抽出物、全血、血漿、血清、唾液、喀痰、鼻汁、脳脊髄液、間質液、リンパ液、精液、膣液、または糞便を含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記生体試料が、組織、細胞、または血液を含む、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記イオン分析物が、負に帯電している、項目７６または７７に記載の方法。
（項目８２）
前記標的分析物が、核酸を含む、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記核酸が、ＤＮＡを含む、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記ＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡを含む、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記非イオン液体が、抽出緩衝剤を含む、項目７６または７７に記載の方法。
（項目８６）
（ａ）流体リザーバー内に、標的分析物を含有し、第１の液体の上方層および第２の液体の下方層を含む初期流体組成物を提供するステップであって、前記分析物は、前記上方層では第１の濃度で存在し、前記下方層では第２の濃度で存在し、前記第２の濃度は、前記第１の濃度よりも高い、ステップと、
（ｂ）前記流体の前記上方層の流体液滴を射出するのに有効な方式で、前記流体リザーバーに集束音響エネルギーを繰り返し印加し、それによって、前記上方層の少なくとも一部を除去しながら、前記下方層が前記流体リザーバー内に残存できるようにするステップとを含む、抽出方法。
（項目８７）
前記初期流体組成物が、前記標的分析物を含有する試料を含む、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記試料が、生体試料を含む、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記生体流体試料が、組織、組織ホモジネート、細胞、細胞懸濁液、細胞抽出物、全血、血漿、血清、唾液、喀痰、鼻汁、脳脊髄液、間質液、リンパ液、精液、膣液、または糞便を含む、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記生体試料が、組織、細胞、または血液を含む、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
ステップ（ａ）の前に、前記試料と２つの前記液体との混和性混合物の組合せを、２つの前記液体を実質的に不混和性にする条件に晒すことを含む、項目８６に記載の方法。
（項目９２）
前記条件が、加熱を含む、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記条件が、冷却を含む、項目９１に記載の方法。
（項目９４）
生体試料からイオン分析物を抽出するための方法であって、
（ａ）前記イオン分析物を含む生体試料および水性媒体の液滴を、液滴を受けるリザーバーに含有されているイオン液体に音響的に射出するステップと、
（ｂ）前記液滴を受けるリザーバーを反転し、それによって、上方水層およびイオン分析物を含む下方イオン液体層を形成するステップと、
（ｃ）前記上方水層を除去して、前記イオン液体中に前記イオン分析物を含むイオン分析物溶液を提供するステップと
を含む、方法。
（項目９５）
前記生体試料が、処理された生体試料を含む、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記処理された生体試料が、溶解細胞を含む、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記水性媒体が、前記生体試料を第１のｐＨに維持する緩衝システムを含み、前記第１のｐＨは、前記生体試料中の前記イオン分析物の少なくとも６０ｗｔ．％が前記イオン液体と接触する際に前記イオン液体に分配されるように選択される、項目９５または９６に記載の方法。
（項目９８）
前記第１のｐＨは、前記生体試料中の前記イオン分析物の少なくとも７５ｗｔ．％が前記イオン液体と接触する際に前記イオン液体に分配されるように選択される、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
ステップ（ｃ）の後、（ｄ）前記イオン分析物溶液を、前記イオン液体中の前記イオン分析物の少なくとも６０ｗｔ．％が抽出緩衝剤に分配されるように選択された第２のｐＨを有する前記抽出緩衝剤と混ぜ合わせるステップをさらに含む、項目９７に記載の方法。
（項目１００）
前記第２のｐＨは、前記イオン液体中の前記イオン分析物の少なくとも７５ｗｔ．％が前記抽出緩衝剤に分配されるように選択される、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記イオン分析物溶液を、前記イオン液体中の前記イオン分析物の少なくとも６０ｗｔ．％が前記抽出緩衝剤に分配されるように選択された第２のｐＨを有する前記抽出緩衝剤と混ぜ合わせることをさらに含む、項目９８に記載の方法。
（項目１０２）
前記第２のｐＨは、前記イオン液体中の前記イオン分析物の少なくとも７５ｗｔ．％が前記抽出緩衝剤に分配されるように選択される、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
水性生体試料からＤＮＡを音響的に抽出するための方法であって、
（ａ）上方水層および下方イオン液体層を含む流体組成物を提供するのに有効な条件下で、前記水性生体試料を、流体リザーバー内でイオン液体と混ぜ合わせるステップと、
（ｂ）前記生体試料中のＤＮＡが、前記下方イオン液体層に分配されるように、前記流体組成物を処置するステップと、
（ｃ）前記イオン液体中のＤＮＡ溶液が、流体容器内に残存するように、前記上方水層を除去するステップと、
（ｄ）前記ＤＮＡ溶液を、前記イオン液体中の前記ＤＮＡの少なくとも６０ｗｔ．％が抽出緩衝剤に分配されるように選択されたｐＨを有する前記抽出緩衝剤と混ぜ合わせるステップと、
（ｅ）前記ＤＮＡを含有する抽出緩衝剤の液滴を、液滴レシーバー内に音響的に連続的に射出するステップと
を含む、方法。
（項目１０４）
前記ＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡを含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
水性生体試料から脂質構成成分を抽出するための方法であって、
前記水性生体試料を流体リザーバー内で有機溶媒と混ぜ合わせ、それによって、脂質溶液を含む上方有機層および下方水層を有する分配された流体組成物を提供するステップと、前記脂質溶液の液滴を、液滴レシーバー内に音響的に連続的に射出するステップとを含む、方法。
（項目１０６）
試料からイオン標的分析物を抽出するための音響システムであって、
（ａ）前記イオン標的分析物およびイオン液体を含む流体組成物を収容する流体リザーバーと、
（ｂ）前記流体組成物から流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で音響放射を発生させるために、前記流体リザーバーと音響的な接続関係にある音響液滴射出器であって、音響放射発生器、および前記リザーバー内の焦点に前記音響放射を集束させるための集束手段を含む、音響液滴射出器と
を含む、システム。
（項目１０７）
前記液滴レシーバーをさらに含む、項目１０６に記載のシステム。
（項目１０８）
前記液滴レシーバーが、分析機器を含む、項目１０７に記載のシステム。
（項目１０９）
前記分析機器が、質量分析計を含む、項目１０８に記載のシステム。
（項目１１０）
前記液滴レシーバーが、液滴を受けるリザーバーである、項目１０７に記載のシステム。
（項目１１１）
前記イオン標的分析物およびイオン液体を含む流体組成物をそれぞれ収容する複数の流体リザーバーを含む、項目１０７に記載のシステム。
（項目１１２）
前記流体組成物のいずれか２つが、同じでも異なっていてもよい、項目１０７に記載のシステム。
（項目１１３）
前記標的分析物のいずれか２つが、同じでも異なっていてもよい、項目１０７に記載のシステム。
（項目１１４）
前記標的分析物のいずれか２つが、同じでも異なっていてもよい、項目１１２に記載のシステム。
（項目１１５）
前記流体リザーバーが、アレイ状に配列されている、項目１１１に記載のシステム。
（項目１１６）
前記リザーバーが、統合された複数のリザーバーユニットを含む基材内に含有されている、項目１１５に記載のシステム。
（項目１１７）
前記統合された複数のリザーバーユニットが、マイクロウェルプレートであり、前記流体リザーバーが、その中に含有されているウェルである、項目１１６に記載のシステム。
（項目１１８）
前記液滴レシーバーが、反転されたマイクロウェルプレート内のウェルである、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
前記流体リザーバーのそれぞれに対して連続して音響的な接続関係に前記射出器を位置決めするための手段をさらに含む、項目１１１に記載のシステム。
（項目１２０）
前記流体組成物が、水性流体をさらに含む、項目１０６に記載のシステム。
（項目１２１）
前記水性流体が、緩衝システムを含有する、項目１２０に記載のシステム。
（項目１２２）
前記流体リザーバー内の前記流体組成物が、約１２５μＬ以下の体積を占める、項目１０６に記載のシステム。
（項目１２３）
前記流体リザーバー内の前記流体組成物が、約６０μＬ以下の体積を占める、項目１２２に記載のシステム。
（項目１２４）
前記流体リザーバー内の前記流体組成物が、約３０μＬ以下の体積を占める、項目１２３に記載のシステム。
（項目１２５）
前記流体組成物が、約２．５μＬ以下の体積を占める、項目１２４に記載のシステム。
（項目１２６）
前記イオン標的分析物が、核酸を含む、項目１０６に記載のシステム。
（項目１２７）
前記核酸が、ＤＮＡを含む、項目１２６に記載のシステム。
（項目１２８）
前記ＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡを含む、項目１２７に記載のシステム。
（項目１２９）
前記流体組成物が、生体試料を含む、項目１０６に記載のシステム。
（項目１３０）
前記イオン標的分析物が、核酸を含む、項目１２９に記載のシステム。
（項目１３１）
前記核酸が、ＤＮＡを含む、項目１３０に記載のシステム。
（項目１３２）
前記ＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡを含む、項目１３１に記載のシステム。
（項目１３３）
反応生成物の合成および音響的抽出のための方法であって、
（ａ）流体リザーバー内に、第１の反応物、第２の反応物および流体媒体から構成された、約１ｎＬ～約５ｍＬの範囲の体積を有する反応混合物を提供するステップと、
（ｂ）前記反応混合物を、前記第１の反応物および前記第２の反応物の間の化学反応を引き起こして反応生成物をもたらす反応条件に晒すステップであって、前記流体媒体は、前記反応生成物が第１の溶解度を有する第１の液体を含む、ステップと、
（ｃ）前記第１の液体と不混和性であり、前記反応生成物が前記第１の溶解度と少なくとも５０％異なっている第２の溶解度を有する第２の液体を、前記反応混合物に混合し、それによって、異なる濃度の前記反応生成物を含有する上方層および下方層を有する流体組成物を提供するステップと、
（ｄ）前記反応生成物を含有する流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で、前記流体リザーバーに集束音響エネルギーを印加するステップと
を含む、方法。
（項目１３４）
前記上方層が、前記第１の液体を含み、前記下方層が、前記第２の液体を含む、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
前記第１の溶解度が、前記第２の溶解度よりも高い、項目１３３または１３４に記載の方法。
（項目１３６）
前記反応混合物が、反応触媒をさらに含む、項目１３３に記載の方法。
（項目１３７）
ステップ（ｃ）において、前記反応生成物および前記触媒を異なる液体に優先的に分配し、、ステップ（ｃ）により、前記反応生成物および前記触媒が実質的に分離される、項目１３６に記載の方法。
（項目１３８）
前記反応混合物が、界面活性剤をさらに含む、項目１３３に記載の方法。
（項目１３９）
ステップ（ｃ）において、前記反応生成物および前記界面活性剤を異なる液体に優先的に分配し、、ステップ（ｃ）により、前記反応生成物および前記触媒が実質的に分離される、項目１３８に記載の方法。
（項目１４０）
反応生成物の合成および音響伝達のための方法であって、
（ａ）流体リザーバー内に、第１の反応物、第２の反応物および流体媒体から構成された、約１ｎＬ～約３ｍＬの範囲の体積を有する反応混合物を提供するステップと、
（ｂ）前記反応混合物を、前記第１の反応物と前記第２の反応物の間の化学反応を引き起こして反応生成物をもたらす反応条件に晒すステップと、
（ｃ）前記反応生成物を含有する流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で、前記流体リザーバーに集束音響エネルギーを印加するステップと
を含む、方法。
（項目１４１）
前記反応条件が、
前記反応が、前記反応混合物中で所定の反応時間進行できるようにすること、
前記反応物を混ぜ合わせること、
前記反応混合物の温度を変化させること、
少なくとも１つの触媒を前記反応混合物に添加すること、
少なくとも１つの界面活性剤を前記反応混合物に添加すること、
少なくとも１つの追加の反応物を前記反応混合物に導入すること、および
これらの２つまたはそれよりも多くの組合せ
からなる群から選択される、項目１４０に記載の方法。
（項目１４２）
２つの溶媒の混合物中の分析物の分配係数Ｄを決定するための方法であって、
（ａ）流体リザーバー内で、既知の量Ｘの分析物を、第１の体積Ｖ _１ の第１の溶媒、および前記第１の溶媒と実質的に不混和性の第２の体積Ｖ _２ の第２の溶媒と合わせ、、前記分析物が、合わされた前記第１の溶媒および前記第２の溶媒中、濃度Ｘ／（Ｖ _１ ＋Ｖ _２ ）を有し、
それによって、前記第１の溶媒の上方層および前記第２の溶媒の下方層を有する、分配された流体組成物を形成するステップであって、前記分析物は、前記第１の溶媒において濃度Ｃ _１ を有し、前記第２の溶媒において濃度Ｃ _２ を有する、ステップと、
（ｂ）前記上方層の液滴を音響的に射出するステップと、
（ｃ）射出された前記液滴中のＣ _１ を決定するステップと、
（ｄ）関係式Ｃ _２ ＝（Ｃ _１ Ｖ _１ ）／Ｖ _２ に従ってＣ _１ からＣ _２ を算出するステップと、
（ｅ）Ｃ _２ に対するＣ _１ の比を確認することによって、前記分配係数Ｄを決定するステップと
を含む、方法。
（項目１４３）
２つの溶媒の混合物中の分析物の分配係数Ｄを決定するための音響的方法であって、
（ａ）流体リザーバー内で、分析物、第１の体積Ｖ _１ の第１の溶媒、および前記第１の溶媒と実質的に不混和性の第２の体積Ｖ _２ の第２の溶媒を合わせ、
それによって、前記第１の溶媒の上方層および前記第２の溶媒の下方層を有する、分配された流体組成物を形成するステップであって、前記分析物は、前記第１の溶媒において濃度Ｃ _１ を有し、前記第２の溶媒において濃度Ｃ _２ を有する、ステップと、
（ｂ）前記上方層の液滴を音響的に射出するステップと、
（ｃ）（ｂ）で射出された前記液滴中のＣ _１ を決定するステップと、
（ｄ）前記分配された流体組成物から前記上方層を除去するステップと、
（ｅ）前記下方層の液滴を音響的に射出するステップと、
（ｆ）（ｅ）で射出された前記液滴中のＣ _２ を決定するステップと、
（ｇ）Ｃ _２ に対するＣ _１ の比を確認することによって、前記分配係数Ｄを決定するステップと
を含む、方法。
（項目１４４）
試料から標的分析物を抽出するための音響システムであって、
（ａ）第１の反応物、第２の反応物および流体媒体から構成された、約１ｎＬ～約３ｍＬの範囲の体積を有する反応混合物である流体組成物を収容する流体リザーバーと、
（ｂ）前記流体組成物から流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で音響放射を発生させるために、前記流体リザーバーと音響的な接続関係にある音響液滴射出器であり、音響放射発生器、および前記リザーバー内の焦点に前記音響放射を集束させるための集束手段を含む、音響液滴射出器と
を含む、音響システム。
（項目１４５）
水性試料から金属イオンを除去するための方法であって、
標的分析物を含む水性試料に、金属イオン、負に帯電している対イオンと会合した正に帯電しているクラウンエーテル、クリプタンドまたはそれらの組合せのイオン液体を含む金属イオン結合化合物を含む金属イオン抽出組成物を添加し、それによって初期二相溶液を形成するステップと、
二相が混和性になるまで、前記初期二相溶液を加温し、それによって、前記金属イオンを単相溶液中で前記金属抽出組成物と混合するステップと、
前記単相溶液を冷却して、上方水層ならびに前記金属抽出組成物および前記金属イオンの下方層を含む第２の二相溶液を作製するステップと
を含む、方法。
（項目１４６）
前記水層を、液滴レシーバー内に音響的に射出することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４７）
前記液滴レシーバーが、分析機器を含む、項目１４６に記載の方法。
（項目１４８）
前記分析機器が、質量分析計を含む、項目１４７に記載の方法。
（項目１４９）
前記金属イオンが、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、および鉄イオンから選択される、項目１４５に記載の方法。
（項目１５０）
前記金属イオンが、アルカリ金属イオンである、項目１４９に記載の方法。
（項目１５１）
前記アルカリ金属イオンが、リチウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、およびそれらの組合せから選択される、項目１５０に記載の方法。
（項目１５２）
前記金属イオンが、アルカリ土類金属イオンである、項目１４９に記載の方法。
（項目１５３）
前記アルカリ土類金属イオンが、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンから選択される、項目１５２に記載の方法。
（項目１５４）
前記イオン液体が、正に帯電しているクラウンエーテルを含む、項目１４５から１５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５５）
前記クラウンエーテルが、カチオン基で官能化された１２－クラウン－４、１５－クラウン－５、および１８－クラウン－６から選択される、項目１５４に記載の方法。
（項目１５６）
前記金属結合化合物が、正に帯電しているクリプタンドを含む、項目１４５から１５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５７）
前記正に帯電しているクリプタンドが、カチオン基で官能化されたクリプタンドを含む、項目１５６に記載の方法。
（項目１５８）
前記クラウンエーテルが、構造

［式中、Ｒは、第三級アミノ基および窒素複素環から選択され、Ｘは、ハロゲン化物である］を有する、項目１５５に記載の方法。
（項目１５９）
前記クラウンエーテルが、構造

を有する、項目１５６に記載の方法。
（項目１６０）
正に帯電しているクラウンエーテル、クリプタンドまたはそれらの組合せおよびそれと会合した負に帯電している対イオンのイオン液体を含む、金属抽出組成物。
（項目１６１）
前記イオン液体が、正に帯電しているクラウンエーテルを含む、項目１６０に記載の組成物。
（項目１６２）
前記正に帯電しているクラウンエーテルが、カチオン基で官能化された１２－クラウン－４、１５－クラウン－５、および１８－クラウン－６から選択される、項目１６１に記載の組成物。
（項目１６３）
前記イオン液体が、正に帯電しているクリプタンドを含む、項目１６０に記載の組成物。
（項目１６４）
前記クラウンエーテルが、構造

［式中、Ｒは、第三級アミノ基および窒素複素環から選択され、Ｘは、ハロゲン化物である］を有する、項目１６２に記載の組成物。
（項目１６５）
構造

を有する、項目１６４に記載の組成物。
（項目１６６）
液体と液体の分離方法であって、
（ａ）流体リザーバー内に、標的分析物および非分析物構成成分を含有し、上方層および下方層を含む流体組成物を提供するステップであって、（ｉ）前記標的分析物は、前記上方層において第１の分析物濃度で存在し、前記下方層において第２の分析物濃度で存在し、（ｉｉ）前記非分析物構成成分は、前記上方層において第１の構成成分濃度で存在し、前記下方層において第２の構成成分濃度で存在する、ステップと、
（ｂ）前記流体組成物から流体液滴を液滴レシーバー内に射出するのに有効な方式で、前記流体リザーバーに集束音響エネルギーを印加するステップと
を含む、方法。
（項目１６７）
前記流体液滴が、前記上方層から射出される、項目１６６に記載の方法。
（項目１６８）
前記流体液滴が、前記下方層から射出される、項目１６６に記載の方法。
（項目１６９）
液体と液体の分離方法であって、
（ａ）第１の流体中に標的分析物および非分析物構成成分を含む試料を提供するステップと、
（ｂ）前記試料を第２の流体と合わせて、流体組成物を提供するステップと、
（ｃ）前記流体組成物を混合条件に晒すステップと、
（ｄ）前記流体組成物が、上方層および下方層を含む分離した流体組成物になるようにするステップであって、前記標的分析物は、前記上方層において上方分析物濃度を有し、前記下方層において下方分析物濃度を有し、前記非分析物構成成分は、前記上方層において上方濃度を有し、前記下方層において下方構成成分濃度を有し、（ｉ）前記下方分析物濃度および前記上方分析物濃度が異なっているか、（ｉｉ）前記下方構成成分濃度および前記上方構成成分濃度が異なっているか、または（ｉ）および（ｉｉ）の両方であるかのいずれかである、ステップと
を含む、方法。
（項目１７０）
前記混合条件が、前記第１の流体および前記第２の流体を可逆的に混和性にする条件を含む、項目１６９に記載の方法。

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。