JP2023168145A - Isoprene synthase and method for producing isoprene using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、イソプレン合成酵素、及びそれを用いたイソプレンの製造方法に関するものである。 The present invention relates to an isoprene synthase and a method for producing isoprene using the same.
自動車用タイヤや、手袋、パッキンなど様々な用途でゴムが利用されている。ゴムには、天然ゴムと合成ゴムがあり、天然ゴムはパラゴムノキを原料としているため、ゴムの収量が天候や生産国の情勢などに左右されるという問題がある。また、合成ゴムはブタジエンやイソプレンを原料としている。ブタジエンやイソプレンは、石油を蒸留することで得られるナフサを分解することで得ているため、石油の安定供給の問題や、石油による地球温暖化への影響が問題視されている。 Rubber is used in a variety of applications, including automobile tires, gloves, and packing. There are two types of rubber: natural rubber and synthetic rubber, and since natural rubber is made from Hevea trees, there is a problem in that the yield of rubber is affected by the weather and the situation in the country of production. Synthetic rubber is also made from butadiene and isoprene. Butadiene and isoprene are obtained by decomposing naphtha, which is obtained by distilling petroleum, so there are concerns about the stable supply of petroleum and the impact of petroleum on global warming.
そこで、イソプレンを合成する方法が求められている。イソプレンを合成する方法として、メバロン酸経路又は非メバロン酸経路から得たジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からイソプレン合成酵素（ＩＳＰＳ）によりリン酸を取り除く方法が知られている。特許文献１ではイソプレン合成酵素（ＩＳＰＳ）のアミノ酸を置換することで、イソプレンの生産量が増えることが記載されている。 Therefore, there is a need for a method to synthesize isoprene. As a method for synthesizing isoprene, a method is known in which phosphate is removed from dimethylallyl diphosphate (DMAPP) obtained from the mevalonate pathway or the non-mevalonate pathway using isoprene synthase (ISPS). Patent Document 1 describes that the production amount of isoprene is increased by replacing amino acids in isoprene synthase (ISPS).
非特許文献１には、ポプラ由来のイソプレン合成酵素（ＩＳＰＳ）のループ構造を構成する５７０位のアラニンをアスパラギン酸などの極性アミノ酸に変異することで、イソプレン合成活性が改善することが記載されている。 Non-Patent Document 1 describes that isoprene synthesis activity is improved by mutating alanine at position 570, which constitutes the loop structure of poplar-derived isoprene synthase (ISPS), to a polar amino acid such as aspartic acid. There is.
しかしながら、イソプレン合成活性についてさらなる改善が求められている。 However, further improvements in isoprene synthesis activity are required.
本発明は、以上の点に鑑み、イソプレン合成活性に優れたイソプレン合成酵素、及びそれを用いたイソプレンの製造方法を提供することを目的とする。 In view of the above points, an object of the present invention is to provide an isoprene synthase with excellent isoprene synthesis activity and a method for producing isoprene using the same.
なお、特許文献２には、メバロン酸に、メバロン酸リン酸転移酵素（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸リン酸転移酵素（ＰＭＶＫ）、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素（ＤＭＤＣ）、イソペンテニル二リン酸異性化酵素（ＩＰＩ）、及び、ファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＳ）を無細胞系で作用させてファルネシル二リン酸を製造する方法が記載されているが、イソプレンを製造するものではない。 In addition, Patent Document 2 describes that mevalonate contains mevalonate phosphotransferase (MVK), phosphomevalonate phosphotransferase (PMVK), diphosphomevalonate decarboxylase (DMDC), and isopentenyl diphosphate isomerase ( Although a method for producing farnesyl diphosphate by using IPI) and farnesyl diphosphate synthase (FPS) in a cell-free system is described, it does not produce isoprene.
本発明に係るイソプレン合成酵素は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を基質としてイソプレンを合成する酵素であって、野生型のアミノ酸配列のＮ末端から１０番目と１１番目のαヘリックスをつなぐループ構造において、Ｎ末端から１１番目のαヘリックスに最も近いアラニンをアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したものとする。 The isoprene synthase according to the present invention is an enzyme that synthesizes isoprene using dimethylallyl diphosphate (DMAPP) as a substrate, and has a loop structure connecting the 10th and 11th α-helices from the N-terminus of the wild-type amino acid sequence. , the alanine closest to the 11th α-helix from the N-terminus is replaced with asparagine or aspartic acid.
さらに、上記アミノ酸配列のＣ末端から１番目と２番目のαヘリックスをつなぐループ構造において、Ｃ末端から１番目のαヘリックスに最も近いアラニンをアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したものであってもよい。 Furthermore, in the loop structure connecting the first and second α-helices from the C-terminus of the above amino acid sequence, the alanine closest to the first α-helix from the C-terminus may be replaced with asparagine or aspartic acid.
本発明に係るイソプレン合成酵素は、以下の（１）～（３）のいずれか１つの特徴を有するアミノ酸配列からなるイソプレン合成酵素とする。
（１）配列番号３７～４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号３７～４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記アミノ酸配列からなるポリペプチドがジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を基質としてイソプレンを生成する活性を有するアミノ酸配列、及び
（３）配列番号３７～４６のいずれか１つのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ上記アミノ酸配列からなるポリペプチドがジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を基質としてイソプレンを生成する活性を有するアミノ酸配列。
The isoprene synthase according to the present invention is an isoprene synthase consisting of an amino acid sequence having any one of the following characteristics (1) to (3).
(1) the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 37 to 46;
(2) In the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 37 to 46, one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added, and the polypeptide consisting of the above amino acid sequence is dimethylated. an amino acid sequence having the activity of producing isoprene using allyl diphosphate (DMAPP) as a substrate, and (3) having 90% or more sequence identity with any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 37 to 46, and An amino acid sequence in which a polypeptide consisting of an amino acid sequence has the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate (DMAPP) as a substrate.
本発明に係るイソプレンの製造方法は、メバロン酸に、メバロン酸リン酸転移酵素（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸リン酸転移酵素（ＰＭＶＫ）、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素（ＤＭＤＣ）、イソペンテニル二リン酸異性化酵素（ＩＰＩ）、及び、上記イソプレン合成酵素を作用させるものとする。 The method for producing isoprene according to the present invention comprises adding mevalonate to mevalonate phosphotransferase (MVK), phosphomevalonate phosphotransferase (PMVK), diphosphomevalonate decarboxylase (DMDC), and isopentenyl diphosphate isomerization. The enzyme (IPI) and the above-mentioned isoprene synthase are allowed to act.
本発明のイソプレン合成酵素によれば、野生型と比較して、イソプレンの生産量が増加する。 According to the isoprene synthase of the present invention, the amount of isoprene produced increases compared to the wild type.
以下、本発明の実施に関連する事項について詳細に説明する。 Hereinafter, matters related to the implementation of the present invention will be explained in detail.
本実施形態に係るイソプレン合成酵素は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を基質としてイソプレンを合成する酵素であって、野生型のアミノ酸配列のＮ末端から１０番目と１１番目のαヘリックスをつなぐループ構造において、Ｎ末端から１１番目のαヘリックスに最も近いアラニンをアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したものとする。ここで、アミノ酸配列において、アミノ酸残基がαヘリックスを構成しているか、ループ構造を構成しているかは、フリーソフト「Jpred4(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred4/index.html)」を用いて特定するものとする。 The isoprene synthase according to the present embodiment is an enzyme that synthesizes isoprene using dimethylallyl diphosphate (DMAPP) as a substrate, and has a loop connecting the 10th and 11th α-helices from the N-terminus of the wild-type amino acid sequence. In the structure, the alanine closest to the 11th α-helix from the N-terminus is replaced with asparagine or aspartic acid. Here, in the amino acid sequence, whether the amino acid residues constitute an α-helix or a loop structure can be determined using the free software Jpred4 (http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred4/index .html)".
イソプレン合成酵素は、Ｎ末端側に葉緑体標的シグナルを有する場合がある。葉緑体標的シグナルは、植物において葉緑体に輸送するためものであり、葉緑体内へと輸送された後、プロテアーゼにより切除除去される。本明細書において、「野生型のアミノ酸配列」を持つイソプレン合成酵素とは、葉緑体標的シグナルを欠損させたものを指すものとする。イソプレン合成酵素の葉緑体標的シグナルを欠損させることにより、イソプレン合成活性が向上する傾向にある。 Isoprene synthase may have a chloroplast targeting signal on the N-terminal side. Chloroplast targeting signals are for transport to chloroplasts in plants, and after being transported into the chloroplasts, they are excised and removed by proteases. As used herein, isoprene synthase having a "wild-type amino acid sequence" refers to one lacking a chloroplast targeting signal. Deletion of the chloroplast targeting signal of isoprene synthase tends to improve isoprene synthesis activity.
本実施形態に係るイソプレン合成酵素は、配列番号３７～４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１個から複数個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記アミノ酸配列からなるポリペプチドがジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を基質としてイソプレンを生成する活性を有するアミノ酸配列であるか、あるいは、配列番号３７～４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ上記アミノ酸配列からなるポリペプチドがジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を基質としてイソプレンを生成する活性を有するアミノ酸配列であってもよい。 The isoprene synthase according to this embodiment has one to a plurality of amino acids substituted, deleted, inserted, and/or added in the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 37 to 46, and the above-mentioned The polypeptide consisting of an amino acid sequence is an amino acid sequence having the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate (DMAPP) as a substrate, or is a polypeptide having the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 37 to 46 and 90 % or more of sequence identity, and the polypeptide consisting of the above amino acid sequence may be an amino acid sequence having the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate (DMAPP) as a substrate.
本明細書においては、「１～複数個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加されている」とは、例えば１～５０個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～３０個、さらに好ましくは１～２０個、特に好ましくは１～１０個の任意の数のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加されていることを意味する。 As used herein, "one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and/or added" means, for example, 1 to 50 amino acids, preferably 1 to 40 amino acids, more preferably 1 to 30 amino acids. , more preferably 1 to 20 amino acids, particularly preferably 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, inserted and/or added.
配列番号３７～４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列との配列同一性は、９０％以上であればよいが、９５％以上の配列同一性を有するものであることが好ましく、９８％以上の配列同一性を有するものであることがさらに好ましく、９９％以上の配列同一性を有するものであることが特に好ましい。 The sequence identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 37 to 46 may be 90% or more, but it is preferably 95% or more, and 98% or more. It is more preferable that the sequence identity is 99% or more, and it is particularly preferable that the sequence identity is 99% or more.
ここで、本明細書において、配列同一性の特定は、ＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズムを用いて、ＥＭＢＯＳＳ（https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）のプログラムで決定することができる。 Here, in this specification, sequence identity can be determined using the EMBOSS (https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/) program using the BLAST2 search algorithm. can.
「アミノ酸配列からなるポリペプチドがジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を基質としてイソプレンを生成する活性を有する」とは、その活性程度が、野生型のイソプレン合成酵素と比較して高いことが好ましく、例えば、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、２．０倍以上の活性を例示することができる。 "A polypeptide consisting of an amino acid sequence has the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate (DMAPP) as a substrate" preferably means that the degree of the activity is higher than that of wild-type isoprene synthase, For example, the activity can be 1.1 times or more, 1.2 times or more, 1.3 times or more, 1.4 times or more, 1.5 times or more, and 2.0 times or more.
本実施形態に係るイソプレン合成酵素は、野生型のアミノ酸配列のＮ末端から１０番目と１１番目のαヘリックスをつなぐループ構造において、Ｎ末端から１１番目のαヘリックスに最も近いアラニンをアスパラギン又はアスパラギン酸に置換をすることで、野生型のイソプレン合成酵素を用いた場合と比較し、イソプレンの生産量が増加する。このメカニズムは定かではないが、このアラニンは、基質ポケットに近い位置にあり、アラニンをより大きな側鎖を持つアスパラギンやアスパラギン酸に置換することで、基質ポケットの剛性を高め、基質であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）との親和性が高まることにより、イソプレン合成活性が向上したものと推測できる。 In the isoprene synthase according to this embodiment, in the loop structure connecting the 10th and 11th α-helices from the N-terminus of the wild-type amino acid sequence, the alanine closest to the 11th α-helix from the N-terminus is replaced with asparagine or aspartic acid. By substituting , the amount of isoprene produced increases compared to when wild-type isoprene synthase is used. Although the mechanism is not clear, this alanine is located close to the substrate pocket, and by replacing alanine with asparagine or aspartic acid, which have a larger side chain, the rigidity of the substrate pocket is increased, and the substrate dimethylallyl is It can be inferred that isoprene synthesis activity was improved by increasing the affinity with diphosphoric acid (DMAPP).
本実施形態に係るイソプレン合成酵素は、さらに、野生型のアミノ酸配列のＣ末端から１番目と２番目のαヘリックスをつなぐループ構造において、１番目のαヘリックスに最も近いアラニンをアスパラギン又はアスパラギン酸に置換をするものであってもよい。 In the isoprene synthase according to the present embodiment, in the loop structure connecting the first and second α-helices from the C-terminus of the wild-type amino acid sequence, the alanine closest to the first α-helix is converted into asparagine or aspartic acid. It may also be a replacement.
例えば、サツマイモ（Ipomoea batatas）由来のイソプレン合成酵素（ＩｂＩＳＰＳ）の場合、図２に示すように、野生型のアミノ酸配列（配列番号：３２）における２６３位のアラニンが、野生型のアミノ酸配列のＮ末端から１０番目と１１番目のαヘリックスをつなぐループ構造における、Ｎ末端から１１番目のαヘリックスに最も近いアラニンに相当する。なお、配列番号：３２のアミノ酸配列は、葉緑体標的シグナル欠損後に、開始コドンに対応するメチオニンを付与している。 For example, in the case of isoprene synthase (IbISPS) derived from sweet potato (Ipomoea batatas), as shown in Figure 2, alanine at position 263 in the wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO: 32) is It corresponds to the alanine closest to the 11th α-helix from the N-terminus in the loop structure connecting the 10th and 11th α-helices from the end. In addition, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, methionine corresponding to the start codon is added after the chloroplast targeting signal is deleted.
また、野生型のアミノ酸配列（配列番号：３２）における５２７位のアラニンが、野生型のアミノ酸配列のＣ末端から１番目と２番目のαヘリックスをつなぐループ構造において、Ｃ末端から１番目のαヘリックスに最も近いアラニンに相当する。 Furthermore, alanine at position 527 in the wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO: 32) is located at the first α-helix from the C-terminus in the loop structure connecting the first and second α-helices from the C-terminus of the wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO: 32). Corresponds to alanine, which is closest to the helix.
ギンドロ（Populus alba）由来のイソプレン合成酵素（ＰａＩＳＰＳ）の場合、図３に示すように、野生型のアミノ酸配列（配列番号：３５）における２７１位のアラニンが、野生型のアミノ酸配列のＮ末端から１０番目と１１番目のαヘリックスをつなぐループ構造における、Ｎ末端から１１番目のαヘリックスに最も近いアラニンに相当する。なお、配列番号：３５のアミノ酸配列は、葉緑体標的シグナル欠損後に、開始コドンに対応するメチオニンを付与している。 In the case of isoprene synthase (PaISPS) derived from Populus alba, as shown in Figure 3, alanine at position 271 in the wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO: 35) is separated from the N-terminus of the wild-type amino acid sequence. It corresponds to the alanine closest to the 11th α-helix from the N-terminus in the loop structure connecting the 10th and 11th α-helices. In addition, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, methionine corresponding to the start codon is added after the chloroplast targeting signal is deleted.
また、野生型のアミノ酸配列（配列番号：３５）における５３４位のアラニンが、野生型のアミノ酸配列のＣ末端から１番目と２番目のαヘリックスをつなぐループ構造において、Ｃ末端から１番目のαヘリックスに最も近いアラニンに相当する。 Furthermore, alanine at position 534 in the wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO: 35) is located at the first α-helix from the C-terminus in the loop structure connecting the first and second α-helices from the C-terminus of the wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO: 35). Corresponds to alanine, which is closest to the helix.
シマホルトノキ（Elaeocarpus photiniifolius）由来のイソプレン合成酵素（ＥｐＩＳＰＳ）の場合、図４に示すように、野生型のアミノ酸配列（配列番号：３６）における２５６位のアラニンが、野生型のアミノ酸配列のＮ末端から１０番目と１１番目のαヘリックスをつなぐループ構造における、Ｎ末端から１１番目のαヘリックスに最も近いアラニンに相当する。なお、配列番号：３６のアミノ酸配列は、葉緑体標的シグナル欠損後に、開始コドンに対応するメチオニンを付与している。 In the case of isoprene synthase (EpISPS) derived from Elaeocarpus photiniifolius, as shown in Figure 4, alanine at position 256 in the wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO: 36) is located at the N-terminus of the wild-type amino acid sequence. It corresponds to the alanine closest to the 11th α-helix from the N-terminus in the loop structure connecting the 10th and 11th α-helices. In addition, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, methionine corresponding to the start codon is added after the chloroplast targeting signal is deleted.
また、野生型のアミノ酸配列（配列番号：３６）における５１９位のアラニンが、野生型のアミノ酸配列のＣ末端から１番目と２番目のαヘリックスをつなぐループ構造において、Ｃ末端から１番目のαヘリックスに最も近いアラニンに相当する。 In addition, alanine at position 519 in the wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO: 36) is located at the first α-helix from the C-terminus in the loop structure connecting the first and second α-helices from the C-terminus of the wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO: 36). Corresponds to alanine, which is closest to the helix.
本実施形態に係るイソプレン合成酵素の製造方法は、特に限定されないが、例えば、次の（１）～（８）の工程により、生産することができる。（１）National Center for Biotechnology Information(NCBI)のデータベースからサツマイモ（Ipomoea batatas）やギンドロ（Populus alba）、シマホルトノキ（Elaeocarpus photiniifolius）、ポプラ（Populus）、ユーカリ（Eucalyptus）、クズ（Pueraria montana）などの植物のイソプレン合成酵素遺伝子情報を取得する。（２）次に、イソプレン合成酵素遺伝子のクローニングに使用する宿主生物（例えば、大腸菌（Escherichia coli））のコドン使用頻度表にあわせてコドン最適化を行う。この変換の際には遺伝子配列の中に制限酵素 BamH I（GGATCC）とHindIII（AAGCTT）の配列を含まないようにする。（３）上記植物から得られるイソプレン合成酵素がＮ末端にChloroplast targeting signal（葉緑体標的シグナル）を有している場合は、イソプレン合成酵素遺伝子の５’末端から葉緑体標的シグナルに相当する塩基配列を削除する。（４）野生型のアミノ酸配列のＮ末端から１０番目と１１番目のαヘリックスをつなぐループ構造を特定し、Ｎ末端から１１番目のαヘリックスに最も近いアラニンをアスパラギン又はアスパラギン酸に置換する。（５）設計した遺伝子配列に従い、イソプレン合成酵素遺伝子を全合成し、ＰＣＲ法により、イソプレン合成酵素遺伝子を増幅する。（６）得られたイソプレン合成酵素遺伝子とプラスミドベクターについて制限酵素処理を行い、ＤＮＡフラグメントとプラスミドを連結し、イソプレン合成酵素遺伝子を含むプラスミドベクターを得る（ライゲーション）。（７）得られたプラスミドベクターを、宿主生物（例えば、大腸菌（Escherichia coli））に形質転換する。（８）形質転換した宿主生物を培養し、培養液からタンパク質を回収することで、イソプレン合成酵素を得ることができる。 The method for producing isoprene synthase according to the present embodiment is not particularly limited, but it can be produced, for example, by the following steps (1) to (8). (1) From the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI), sweet potato (Ipomoea batatas), ginkgo (Populus alba), striped tree (Elaeocarpus photiniifolius), poplar (Populus), eucalyptus (Eucalyptus), kudzu (Pueraria montana), etc. Obtaining plant isoprene synthase gene information. (2) Next, codon optimization is performed in accordance with the codon usage table of the host organism (eg, Escherichia coli) used for cloning the isoprene synthase gene. During this conversion, the gene sequence should not include the sequences of the restriction enzymes BamHI (GGATCC) and HindIII (AAGCTT). (3) If the isoprene synthase obtained from the above plant has a Chloroplast targeting signal at the N-terminus, the chloroplast targeting signal corresponds to the chloroplast targeting signal from the 5' end of the isoprene synthase gene. Delete the base sequence. (4) Identify the loop structure that connects the 10th and 11th α-helices from the N-terminus of the wild-type amino acid sequence, and replace the alanine closest to the 11th α-helix from the N-terminus with asparagine or aspartic acid. (5) Totally synthesize the isoprene synthase gene according to the designed gene sequence, and amplify the isoprene synthase gene by PCR method. (6) The obtained isoprene synthase gene and plasmid vector are treated with restriction enzymes, and the DNA fragment and plasmid are ligated to obtain a plasmid vector containing the isoprene synthase gene (ligation). (7) Transform the obtained plasmid vector into a host organism (eg, Escherichia coli). (8) Isoprene synthase can be obtained by culturing the transformed host organism and collecting the protein from the culture solution.
ここで、本明細書において、「コドン最適化」とは、元のアミノ酸配列を維持しつつ、元の塩基配列の少なくとも１つのコドンを、対象の生物種においてより頻繁に使用されるコドンで置き換えることを指す。コドン使用頻度表は、例えば、公益財団法人かずさＤＮＡ研究所が提供する「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」（www.kazusa.or.JP/codon/）において容易に入手可能であり、これらの表を用いて、コドンを最適化することができる。特定の動物種における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムについても、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ社；Ｊａｃｏｂｕｓ、ＰＡ）等において入手可能である。 Here, in this specification, "codon optimization" refers to replacing at least one codon of the original base sequence with a codon that is used more frequently in the target biological species while maintaining the original amino acid sequence. refers to something. Codon usage frequency tables are easily available, for example, in the "Codon Usage Database" (www.kazusa.or.JP/codon/) provided by Kazusa DNA Research Institute, and using these tables, Codons can be optimized. Computer algorithms for codon optimizing particular sequences for expression in particular animal species are also available, such as at Gene Forge (Aptagen, Jacobus, PA).
本発明で使用する宿主細胞は、特に限定されないが、大腸菌、枯草菌、放線菌、パン酵母、アカパンカビ等取り扱いが容易な菌株が好ましい。例えば、大腸菌の菌株としては、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＸＬ１－ｂｌｕｅ株、ＨＢ１０１株などのＫ－１２株由来やＢＬ２１などのＢ株由来の大腸菌を用いることができる。さらに宿主細胞として、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などを用いてもよい。 The host cells used in the present invention are not particularly limited, but easy-to-handle strains such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes, baker's yeast, Neurospora crassa, and the like are preferred. For example, as the E. coli strain, E. coli derived from K-12 strain such as JM109 strain, DH5α strain, XL1-blue strain, HB101 strain, or B strain such as BL21 can be used. Furthermore, insect cells, plant cells, animal cells, etc. may be used as host cells.
形質転換に用いる発現ベクターとしては、上記宿主である大腸菌、パン酵母等において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能であり、かつ外来蛋白質の発現効率の高いものであることが好ましい。上記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは該微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれるものであってもよい。 The expression vector used for transformation is preferably one that is capable of autonomous replication or integration into the chromosome in the above-mentioned hosts such as E. coli and baker's yeast, and has a high efficiency of expression of the foreign protein. The expression vector for expressing the above DNA is preferably a recombinant vector that is capable of autonomous replication in the microorganism and is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the above DNA, and a transcription termination sequence. It may also include a gene that controls a promoter.
発現ベクターとしては、具体的には、pET-21a(+)（Merck社製）、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK233-2（Pharmacia社製）、pSE280（Invitrogen社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pQE-30（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agricultural Biological Chemistry,48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric.Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII SK+、pBluescriptII SK(-)（Stratagene社製）、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX（Pharmacia社製）、pET-3（Novagen社製）、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔gene, 33, 103 (1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28(Takara社製)、pSTV29（Takara社製）、pUC118（Takara社製）、pPA1（特開昭63-233798号公報）、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392(1990)〕、pQE-30（QIAGEN社製）等が挙げられる。 Specifically, expression vectors include pET-21a(+) (Merck), pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (all commercially available from Boehringer Mannheim), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen). pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-8 (manufactured by QIAGEN), pQE-30 (manufactured by QIAGEN), pKYP10 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 110600/1983), pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 ( 1984)], pLSA1 [Agric.Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Stratagene), pTrS30 (FERMBP-5407), pTrS32 (FERM BP-5408), pGEX (Pharmacia), pET-3 (Novagen), pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5 , pC194, pUC18 [gene, 33, 103 (1985)], pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (manufactured by Takara), pSTV29 (manufactured by Takara), pUC118 (manufactured by Takara), pPA1 ( JP-A No. 63-233798), pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pQE-30 (manufactured by QIAGEN), and the like.
プロモーターとしては、宿主である大腸菌、パン酵母等の細胞中で発現できるものであればよい。例えば、trpプロモーター（Ｐ trp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PS Eプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等が挙げられる。またＰ trpを２つ直列させたプロモーター（Ｐ trpｘ２）、tacプロモーター、letIプロモーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等を用いることもできる。 Any promoter may be used as long as it can be expressed in host cells such as E. coli and baker's yeast. Examples include promoters derived from Escherichia coli, phage, etc., such as trp promoter (P trp), lac promoter (Plac), PL promoter, PR promoter, PSE promoter, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, and the like. Furthermore, promoters that have been artificially designed and modified such as a promoter in which two P trps are arranged in series (P trpx2), tac promoter, letI promoter, lacT7 promoter, etc. can also be used.
リボソーム結合配列としては、宿主である放線菌細胞中で発現できるものであれば特に限定されないが、シャイン－ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。 The ribosome-binding sequence is not particularly limited as long as it can be expressed in the host Streptomyces cells, but the ribosome-binding sequence must be an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases) ) is preferably used.
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主である大腸菌、パン酵母等の細胞へＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されないが、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942号公報）、またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等が挙げられる。 The method of introducing the recombinant vector is not particularly limited as long as it is a method of introducing DNA into the above-mentioned host cells such as E. coli and baker's yeast, but for example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (Japanese Unexamined Patent Publication No. 63-2483942), or the methods described in Gene, 17, 107 (1982) and Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979). Can be mentioned.
発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって、各酵素を取得することができる。例えば、宿主細胞として大腸菌を用いる場合、通常用いられるＬ培地、ＹＴ培地、Ｍ９－ＣＡ培地などで培養すればよい。発現ベクターが薬剤耐性遺伝子を持っている場合、それに対応する薬剤を適当な濃度になるように添加することが望ましい。酵素をコードする遺伝子を発現させる場合には、その上流のプロモーターを適当な方法で働かせて発現誘導を行えばよい。例えば、ＩＰＴＧやインドールアクリル酸（ＩＡＡ）などを添加して、発現を誘導することができる。 Each enzyme can be obtained by culturing host cells transformed with expression vectors. For example, when E. coli is used as a host cell, it may be cultured in commonly used L medium, YT medium, M9-CA medium, etc. When the expression vector has a drug resistance gene, it is desirable to add the corresponding drug at an appropriate concentration. When expressing a gene encoding an enzyme, expression may be induced by activating the upstream promoter in an appropriate manner. For example, expression can be induced by adding IPTG, indole acrylic acid (IAA), or the like.
培養によって得られた、菌体から目的の酵素を取得するためには、慣用の技術、例えば、細胞のリゾチーム処理、超音波破砕、遠心分離、各種クロマトグラフィーなどを用いることができる。目的の酵素が可溶性画分に得られた場合は、そのまま酵素液として使用してもよい。またその可溶性画分を各種クロマトグラフィー、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーなどで精製して使用することができる。目的の酵素が、不溶性顆粒を形成し不溶性となった場合は、グアニジンや尿素で可溶化し、そのまま又は各種クロマトグラフィーで精製し、リフォールディングさせて、酵素液として使用することができる。 In order to obtain the desired enzyme from the bacterial cells obtained by culture, conventional techniques such as lysozyme treatment of cells, ultrasonic disruption, centrifugation, and various chromatography techniques can be used. If the desired enzyme is obtained in a soluble fraction, it may be used as is as an enzyme solution. Further, the soluble fraction can be purified and used by various chromatography methods, such as affinity chromatography, gel filtration, and ion exchange chromatography. When the target enzyme forms insoluble granules and becomes insoluble, it can be solubilized with guanidine or urea and used as an enzyme solution either as it is or after being purified by various chromatography and refolded.
本実施形態に係るイソプレンの製造方法は、メバロン酸に、メバロン酸リン酸転移酵素（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸リン酸転移酵素（ＰＭＶＫ）、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素（ＤＭＤＣ）、イソペンテニル二リン酸異性化酵素（ＩＰＩ）、及び、上記イソプレン合成酵素を作用させるものとする。この反応は、細胞内で行われるものではなく、細胞の存在しない系で行われることが好ましい。ただし、実質的に目的の生成物の生産に影響を与えない程度の細胞が混入していることを排除するものではない。 The method for producing isoprene according to the present embodiment includes mevalonic acid, mevalonate phosphotransferase (MVK), phosphomevalonate phosphotransferase (PMVK), diphosphomevalonate decarboxylase (DMDC), isopentenyl diphosphate isomer The isoprene synthase (IPI) and the above-mentioned isoprene synthase are allowed to act. Preferably, this reaction is not carried out intracellularly, but in a cell-free system. However, this does not exclude the presence of cells that do not substantially affect the production of the desired product.
酵素はメバロン酸リン酸転移酵素（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸リン酸転移酵素（ＰＭＶＫ）、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素（ＤＰＭＶＣ）、イソペンテニル二リン酸異性化酵素（ＩＰＰＩ）及びイソプレン合成酵素（ＩＳＰＳ）の順に順次添加し作用させてもよいが、全ての酵素を混合し、酵素カクテルとして作用させてもよい。反応容量は、特に限定されるものではなく、少量で作用させることも可能であるし、工業用に大量に反応を行わせることもできる。 The enzymes are mevalonate phosphotransferase (MVK), phosphomevalonate phosphotransferase (PMVK), diphosphomevalonate decarboxylase (DPMVC), isopentenyl diphosphate isomerase (IPPI), and isoprene synthase (ISPS). Although they may be added one after another and allowed to act, all the enzymes may be mixed and made to act as an enzyme cocktail. The reaction capacity is not particularly limited, and the reaction can be carried out in a small amount or in large quantities for industrial use.
ここで、本明細書において、「酵素カクテル」とは、基質から目的の生成物を生産させる酵素の混合物を意味する。この酵素の混合物には、基質から目的の化合物を合成するために必要な酵素が含まれていればよい。また酵素反応の補助因子（Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、ＡＴＰなど）が含まれてもよい。さらに酵素反応に影響を与えない不純物が含まれても構わない。 As used herein, the term "enzyme cocktail" refers to a mixture of enzymes that produces a desired product from a substrate. This enzyme mixture only needs to contain the enzymes necessary to synthesize the target compound from the substrate. Additionally, cofactors for enzymatic reactions (Mg 2+ , Mn 2+ , ATP, etc.) may be included. Furthermore, impurities that do not affect the enzymatic reaction may be included.
基質であるメバロン酸は、常法に従い得ることができ、例えば、発酵法や化学合成法により得ることができる。 Mevalonic acid, which is a substrate, can be obtained by a conventional method, for example, by a fermentation method or a chemical synthesis method.
基質濃度は、酵素が作用できる濃度であれば特に限定されないが、好ましくは０．０１～５００ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．０２～２００ｍｇ／ｍＬである。イソプレン合成に用いるメバロン酸リン酸転移酵素（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸リン酸転移酵素（ＰＭＶＫ）、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素（ＤＰＭＶＣ）、イソペンテニル二リン酸異性化酵素（ＩＰＰＩ）及びイソプレン合成酵素（ＩＳＰＳ）それぞれの酵素濃度も、酵素が作用できる濃度であれば特に限定されないが、好ましくは０．０１～５０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．１～５ｍｇ／ｍＬである。反応温度は、酵素が作用できる温度であれば特に限定されるものではないが、好ましくは１０～８０℃であり、より好ましくは２０～６０℃であり、さらに好ましくは３０～５０℃である。 The substrate concentration is not particularly limited as long as it allows the enzyme to act, but is preferably 0.01 to 500 mg/mL, more preferably 0.02 to 200 mg/mL. Mevalonate phosphotransferase (MVK), phosphomevalonate phosphotransferase (PMVK), diphosphomevalonate decarboxylase (DPMVC), isopentenyl diphosphate isomerase (IPPI) and isoprene synthase (ISPS) used for isoprene synthesis ) The concentration of each enzyme is not particularly limited as long as the enzyme can act, but is preferably 0.01 to 50 mg/mL, more preferably 0.1 to 5 mg/mL. The reaction temperature is not particularly limited as long as the enzyme can act, but is preferably 10 to 80°C, more preferably 20 to 60°C, and even more preferably 30 to 50°C.
本発明で使用するメバロン酸リン酸転移酵素、ホスホメバロン酸リン酸転移酵素、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素、及びイソペンテニル二リン酸異性化酵素は、例えば、天然に存在する酵素あるいは、メバロン酸リン酸転移酵素、ホスホメバロン酸リン酸転移酵素、ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素、及びイソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に得られる組換え体であることができる。 Mevalonate phosphotransferase, phosphomevalonate phosphotransferase, diphosphomevalonate decarboxylase, and isopentenyl diphosphate isomerase used in the present invention are, for example, naturally occurring enzymes or mevalonate phosphotransferases. It can be a recombinant obtained by genetic engineering using genes encoding the enzymes phosphomevalonate phosphotransferase, diphosphomevalonate decarboxylase, and isopentenyl diphosphate isomerase.
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Examples of the present invention will be shown below, but the present invention is not limited to these Examples.
＜比較例１＞
(Ａ)遺伝子の取得
サツマイモ（Ipomoea batatas）由来のイソプレン合成酵素遺伝子を設計した。まず、NationalCenter for Biotechnology Information（NCBI）データベースに登録されているIpbalsr mRNA 配列（配列番号：１、アクセッション番号：JP105673）を取得した。そして、文献（Ilmen et al. 2015）の記載を参考に３’末端側から２２７ｂｐを削除し、先頭に開始コドンＡＴＧを付与して合計１７６７ｂｐ（５８９ａａ）の塩基配列とした。そして、この塩基配列について、大腸菌 Escherichia coliのコドン使用頻度表（表１）に合わせてコドン最適化変換を行った。変換の際には目的遺伝子配列の中に制限酵素 BamH I（GGATCC）とHind III（AAGCTT）の配列を含まないようにした。設計した塩基配列（配列番号：２）の全合成を、ＩＤＴ（Integrated DNA technology）社に依頼した。なお、表１における各セルの値は、左から順に、塩基配列、塩基配列に対応するアミノ酸、コドン頻度を表す。
<Comparative example 1>
(A) Gene acquisition An isoprene synthase gene derived from sweet potato (Ipomoea batatas) was designed. First, the Ipbalsr mRNA sequence (SEQ ID NO: 1, accession number: JP105673) registered in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database was obtained. Then, referring to the description in the literature (Ilmen et al. 2015), 227 bp was deleted from the 3' end, and a start codon ATG was added to the beginning, resulting in a total base sequence of 1767 bp (589 aa). Then, this base sequence was subjected to codon optimization conversion in accordance with the codon usage table (Table 1) of Escherichia coli. During conversion, the target gene sequence was made to exclude the restriction enzymes BamH I (GGATCC) and Hind III (AAGCTT). Total synthesis of the designed base sequence (SEQ ID NO: 2) was commissioned to IDT (Integrated DNA technology). Note that the values in each cell in Table 1 represent, from the left, the base sequence, the amino acid corresponding to the base sequence, and the codon frequency.
（Ｂ）全合成遺伝子断片の調整
ＩＤＴ社の操作プロトコルに従い、合成した１０００ｎｇ分の遺伝子断片の乾燥粉末に10mM TE buffer（ｐＨ８．０、Sigma-Aldrich社製）を１００μＬ添加し、１０ｎｇ／μＬとなるように濃度を調整した。次に、５０℃のヒートブロックで２０分間インキュベートし、ボルテックスで１０秒間懸濁した。その後、Wizard(R)Plus SV Minipreps DNA Purification System（Promega社製）を用いてＤＮＡを精製し５０μＬのＤＮＡ溶液Ａを得た。
(B) Preparation of fully synthesized gene fragments According to the operating protocol of IDT, 100 μL of 10 mM TE buffer (pH 8.0, manufactured by Sigma-Aldrich) was added to the dried powder of 1000 ng of synthesized gene fragments, and the mixture was adjusted to 10 ng/μL. The concentration was adjusted so that Next, the mixture was incubated in a heat block at 50°C for 20 minutes and suspended by vortexing for 10 seconds. Thereafter, DNA was purified using Wizard (R) Plus SV Minipreps DNA Purification System (manufactured by Promega) to obtain 50 μL of DNA solution A.
（Ｃ）プライマー設計とＰＣＲ反応
ＩＤＴ社より取得した全合成遺伝子配列情報を参考に、制限酵素サイトを付加したＦｗプライマー（配列番号：８、制限酵素サイト：BamH I）とＲｖプライマー（配列番号：９、制限酵素サイト：Kpn I）を作製し、下記に示したＰＣＲ反応組成液を調製した。ＰＣＲ装置（GeneAmp PCR system 2700,Applied Biosystems社製）を用いて、下記の温度条件でＰＣＲ反応を行った。
＜ＰＣＲ反応組成液 合計５０μＬ＞
ポリメラーゼバッファー（New England Biolab社製 Q5 Reaction Buffer（５×）） １０μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（New England Biolab社製） １μＬ
Ｆｗプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） ２．５μＬ
Ｒｖプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） ２．５μＬ
ＤＮＡ溶液Ａ ２５μＬ
ＰＣＲ酵素（New England Biolab社製 Q5 High Fidelity DNApolymerase） ０．５μＬ
ヌクレアーゼフリー水 ８．５μＬ
＜温度条件＞
９８℃で３０秒間処理した後、９８℃で１０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間の処理を３０サイクル行い、最後に７２℃で２分間の処理をし、４℃で冷却した。
(C) Primer design and PCR reaction Based on the total synthetic gene sequence information obtained from IDT, the Fw primer with a restriction enzyme site added (SEQ ID NO: 8, restriction enzyme site: BamH I) and the Rv primer (SEQ ID NO: 9. Restriction enzyme site: Kpn I) was created and the PCR reaction composition solution shown below was prepared. PCR reaction was performed using a PCR device (GeneAmp PCR system 2700, manufactured by Applied Biosystems) under the following temperature conditions.
<PCR reaction composition solution total 50 μL>
Polymerase buffer (New England Biolab Q5 Reaction Buffer (5x)) 10 μL
10mM dNTPs (manufactured by New England Biolab) 1μL
Fw primer (10 pmol/μL) 2.5 μL
Rv primer (10 pmol/μL) 2.5 μL
DNA solution A 25μL
PCR enzyme (Q5 High Fidelity DNA polymerase manufactured by New England Biolab) 0.5 μL
Nuclease-free water 8.5μL
<Temperature conditions>
After treatment at 98°C for 30 seconds, 30 cycles of treatment at 98°C for 10 seconds, 50°C for 30 seconds, 72°C for 1 minute, and finally 72°C for 2 minutes, and cooling at 4°C. .
（Ｄ）制限酵素処理
上記で得られたＰＣＲ産物について制限酵素処理を行った。ＰＣＲ産物１０μＬ（２００ｎｇ分）に、制限酵素BamH I（Takara社製）とHind III（Takara社製）をそれぞれ１５Ｕ添加した。反応条件は、BamH I（Takara社製）が３０℃で１８時間、Hind III（Takara社製）が３７℃で１８時間で行った。図１に示すpET-21a発現ベクター（Merck社製）についても同様に制限酵素処理を行った。
(D) Restriction enzyme treatment The PCR product obtained above was subjected to restriction enzyme treatment. 15 U each of restriction enzymes BamH I (manufactured by Takara) and Hind III (manufactured by Takara) were added to 10 μL (200 ng) of the PCR product. The reaction conditions were BamH I (manufactured by Takara) at 30°C for 18 hours, and Hind III (Takara) at 37°C for 18 hours. The pET-21a expression vector (manufactured by Merck) shown in FIG. 1 was also treated with restriction enzymes in the same manner.
（Ｅ）ライゲーション
得られた制限酵素処理済み遺伝子断片６．５μＬと、同様に制限酵素処理を行ったpET-21a発現ベクター（Merck社製）１μＬ、Ligation High ver.2（Toyobo社製）７．５μＬを混合し、１４℃で１７時間インキュベートした。インキュベート溶液８μＬを大腸菌（JM109 株）コンピテントセル１００μＬと混合し、氷上で１０分間静置した後、４２℃で６０秒間加熱した。すぐに氷上で２分間静置し、２００μＬのＳＯＣ培地を加え、３８℃で４５分間インキュベートした。遠心分離により凝縮した菌体液２０μＬを、ＬＢ／ａｍｐ寒天培地（BD Biosciences社製）に植菌し、３８℃で１７時間培養した。続いて形成した形質転換株のコロニーＰＣＲを行い、目的遺伝子と同じ長さのＤＮＡが増幅されたコロニーを選別した。選抜した形質転換株のコロニーを２ｍＬのＬＢ／ａｍｐ寒天培地（BD Biosciences製）の入った試験管に入れ、３８℃で１７時間、振盪培養した。その培養液から Wizard(R) Plus SV Minipreps DNA Purification System（Promega社製）を用いてプラスミドを抽出した。
(E) Ligation 6.5 μL of the obtained restriction enzyme-treated gene fragment, 1 μL of pET-21a expression vector (manufactured by Merck) that was similarly treated with restriction enzymes, and Ligation High ver.2 (manufactured by Toyobo)7. 5 μL was mixed and incubated at 14° C. for 17 hours. 8 μL of the incubation solution was mixed with 100 μL of E. coli (strain JM109) competent cells, allowed to stand on ice for 10 minutes, and then heated at 42° C. for 60 seconds. Immediately, the mixture was left standing on ice for 2 minutes, 200 μL of SOC medium was added, and the mixture was incubated at 38° C. for 45 minutes. 20 μL of the bacterial body fluid condensed by centrifugation was inoculated onto an LB/amp agar medium (manufactured by BD Biosciences) and cultured at 38° C. for 17 hours. Subsequently, colony PCR was performed on the resulting transformed strain, and colonies in which DNA of the same length as the target gene had been amplified were selected. A colony of the selected transformant strain was placed in a test tube containing 2 mL of LB/amp agar medium (manufactured by BD Biosciences), and cultured with shaking at 38° C. for 17 hours. Plasmids were extracted from the culture solution using Wizard(R) Plus SV Minipreps DNA Purification System (manufactured by Promega).
（Ｆ）葉緑体標的シグナルの除去
上記で抽出したプラスミドを含む溶液をＤＮＡ溶液Ｂとした。ＩＤＴ社より取得した全合成遺伝子配列情報を参考に、制限酵素サイトを付加したＦｗプライマー（配列番号：１０、制限酵素サイト：BamH I）とＲｖプライマー（配列番号：１１、制限酵素サイト：BamH I）を作製した。次に、下記に示したＰｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲ反応組成液を調整し、ＰＣＲ装置（GeneAmp PCR system 2700, Applied Biosystems社製）を用いて、下記の温度条件で、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲを行った。
＜Ｐｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲ反応組成液 合計５０μＬ＞
ポリメラーゼバッファー（Thermo Fisher Scientific社製 Phusion HF Buffer（５×）） １０μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Thermo Fisher Scientific社製） １μＬ
Ｆｗプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） ２．５μＬ
Ｒｖプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） ２．５μＬ
ＤＮＡ溶液Ｂ ４μＬ
ＰＣＲ酵素（Thermo Fisher Scientific社製Phusion DNApolymerase） ０．５μＬ
ヌクレアーゼフリー水 ２９．５μＬ
＜温度条件＞
９８℃で３０秒間処理した後、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間の処理を３０サイクル行い、最後に７２℃で５分間の処理をし、４℃で冷却した。
(F) Removal of chloroplast target signal The solution containing the plasmid extracted above was designated as DNA solution B. With reference to the total synthetic gene sequence information obtained from IDT, Fw primer (SEQ ID NO: 10, restriction enzyme site: BamH I) with a restriction enzyme site added and Rv primer (SEQ ID NO: 11, restriction enzyme site: BamH I) were prepared. ) was created. Next, the Phusion PCR reaction composition shown below was prepared, and Phusion PCR was performed using a PCR device (GeneAmp PCR system 2700, manufactured by Applied Biosystems) under the following temperature conditions.
<Phusion PCR reaction composition solution total 50 μL>
Polymerase buffer (Thermo Fisher Scientific Phusion HF Buffer (5x)) 10 μL
10mM dNTPs (manufactured by Thermo Fisher Scientific) 1μL
Fw primer (10 pmol/μL) 2.5 μL
Rv primer (10 pmol/μL) 2.5 μL
DNA solution B 4μL
PCR enzyme (Thermo Fisher Scientific Phusion DNA polymerase) 0.5 μL
Nuclease-free water 29.5μL
<Temperature conditions>
After treatment at 98°C for 30 seconds, 30 cycles of treatment at 98°C for 10 seconds, 55°C for 30 seconds, 72°C for 3 minutes, and finally 72°C for 5 minutes, and cooling at 4°C. .
上記で得られたＰＣＲ産物に制限酵素 BamH1を１５Ｕ添加し、３７℃で、６時間処理した。制限酵素処理した遺伝子断片７．５μＬとLigation High ver.2（Toyobo社製）７．５μＬを混合し、１６℃で１７時間インキュベートすることで、Self-Ligationを行った。これにより、イソプレン合成酵素遺伝子（配列番号：２）の５’末端の４塩基目から１２３ｂｐ（４１ａａ）を削除し、１６４４ｂｐ（５４８ａａ）の目的遺伝子（配列番号：３）を含むプラスミドが得られた。 15 U of restriction enzyme BamH1 was added to the PCR product obtained above, and the mixture was treated at 37° C. for 6 hours. Self-ligation was performed by mixing 7.5 μL of the restriction enzyme-treated gene fragment and 7.5 μL of Ligation High ver. 2 (manufactured by Toyobo) and incubating at 16° C. for 17 hours. As a result, 123 bp (41 aa) was deleted from the 4th base of the 5' end of the isoprene synthase gene (SEQ ID NO: 2), and a plasmid containing 1644 bp (548 aa) of the target gene (SEQ ID NO: 3) was obtained. .
（Ｇ）イソプレン合成酵素の生産
得られたプラスミドを大腸菌 BL21（DE3）Star株（Thermo Fisher Scientific社製）へ形質転換した。形質転換した株を２ｍＬのＬＢ／ａｍｐ培地（BD Biosciences社製）で１７時間培養し、この全量を１００ｍＬのＬＢ／ａｍｐ培地へ入れ、３７℃、１８０ｒｐｍでＯＤ６００が１．１前後になるまで振盪培養した。培養液を氷上で３０分間冷やした後、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭになるように加え、１８℃、１２０ｒｐｍで１７時間振盪培養した。
(G) Production of isoprene synthase The obtained plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) Star strain (manufactured by Thermo Fisher Scientific). The transformed strain was cultured in 2 mL of LB/amp medium (manufactured by BD Biosciences) for 17 hours, and the entire volume was added to 100 mL of LB/amp medium, and cultured at 37°C and 180 rpm until OD 600 reached around 1.1. Cultured with shaking. After cooling the culture solution on ice for 30 minutes, isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 1 mM, and cultured with shaking at 18° C. and 120 rpm for 17 hours.
培養液を遠心分離（４０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）し、上清を除去した後、菌体を５．０ｍＬのタンパク質回収バッファー（100mM Tris-HCl buffer（pH7.5, Sigma-Aldrich社製）、10% glycerol（v/v）(関東化学社製)、0.5mM EDTA(同仁化学社製)を混合し、純水でメスアップ）で洗い、再度遠心分離（４０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）した。上清を除去した後、菌体重量１ｇに対して４ｍＬのB-PERTM Bacterial Protein Extraction Reagent（Thermoscientific社製）を添加し、懸濁させた。その後、室温で１５分間静置し、遠心分離（９０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）した後、上清の可溶性画分と、ペレットの不溶性画分を回収した。 After centrifuging the culture solution (4000 rpm, 15 minutes, 4°C) and removing the supernatant, the bacterial cells were added to 5.0 mL of protein recovery buffer (100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5, manufactured by Sigma-Aldrich)). , 10% glycerol (v/v) (manufactured by Kanto Kagaku Co., Ltd.), and 0.5mM EDTA (manufactured by Dojindo Kagaku Co., Ltd.), washed with purified water and centrifuged again (4000 rpm, 15 minutes, 4°C). did. After removing the supernatant, 4 mL of B-PER ™ Bacterial Protein Extraction Reagent (manufactured by Thermoscientific) was added and suspended per 1 g of bacterial weight. Thereafter, the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes, centrifuged (9000 rpm, 15 minutes, 4°C), and the soluble fraction of the supernatant and the insoluble fraction of the pellet were collected.
得られたタンパク質可溶性画分を２ｍＬエッペンチューブに１．５ｍＬずつ分注し、Ni-NTA樹脂（QIAGEN社製）を２００μＬ、5M NaCl（終濃度３００ｍＭ）、imidazole（終濃度１０ｍＭ）を添加し混合した。これを４℃、８００ｒｐｍで、３分間遠心分離し、上清を除去した。Wash buffer（50 mM Tris-HCl buffer（pH 8.0, Sigma-Aldrich社）、300 mM NaCl(関東化学社製)、20mM imidazole(関東化学社製)を混合し、純水でメスアップ）を５００μＬ添加し混合した後、４℃、８００ｒｐｍで、３分間遠心分離を３回繰り返し、樹脂の洗浄を行った。Elutionbuffer（50 mM Tris-HCl buffer（pH8.0, Sigma-Aldrich社製）、300 mM NaCl(関東化学社製)、250 mM imidazole(関東化学社製)、15% glycerol（v/v）(関東化学社製)を混合し、純水でメスアップ）を２００μＬ添加し混合した後、４℃、８００ｒｐｍで、３分間遠心分離して目的タンパク質を溶出した。得られた上清を酵素液とし、Bradford法によりタンパク質濃度を測定したところ、０．６２７μｇ／μＬであった。得られた酵素液は２５％グリセロールで－２０℃で保存した。 Dispense 1.5 mL of the obtained protein soluble fraction into 2 mL Eppendorf tubes, add 200 μL of Ni-NTA resin (manufactured by QIAGEN), 5 M NaCl (final concentration 300 mM), and imidazole (final concentration 10 mM) and mix. did. This was centrifuged at 4° C. and 800 rpm for 3 minutes, and the supernatant was removed. Add 500 μL of wash buffer (mix 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0, Sigma-Aldrich), 300 mM NaCl (manufactured by Kanto Kagaku), and 20 mM imidazole (manufactured by Kanto Kagaku), and make up the volume with pure water). After mixing, centrifugation was repeated three times at 4° C. and 800 rpm for 3 minutes to wash the resin. Elutionbuffer (50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0, manufactured by Sigma-Aldrich), 300 mM NaCl (manufactured by Kanto Kagaku), 250 mM imidazole (manufactured by Kanto Kagaku), 15% glycerol (v/v) (Kanto After adding and mixing 200 μL of diluted with pure water (manufactured by Kagaku Co., Ltd.), the target protein was eluted by centrifugation at 4° C. and 800 rpm for 3 minutes. The resulting supernatant was used as an enzyme solution, and the protein concentration was measured by the Bradford method and found to be 0.627 μg/μL. The obtained enzyme solution was stored at -20°C in 25% glycerol.
得られたタンパク質について、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行った。その結果、目的のイソプレン合成酵素（配列番号：３２）のアミノ酸配列から推定される分子量６３．１ＫＤａのバンドを可溶性画分で確認できた。 The obtained protein was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). As a result, a band with a molecular weight of 63.1 KDa estimated from the amino acid sequence of the target isoprene synthase (SEQ ID NO: 32) was confirmed in the soluble fraction.
（Ｈ）ＩｂＩＳＰＳの活性確認
まず、イソプレン（和光純薬（株）製）を、酵素反応用バッファー（Sigma-Aldrich社製 Tris-HCl buffer（pH 7.5））に１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬとなるように溶解させて試料とした。ブランクとしては、酵素反応用バッファーを用いた。
Confirmation of the activity of (H)IbISPS First, add 100 μg/mL, 50 μg/mL, 10 μg of isoprene (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to an enzyme reaction buffer (Tris-HCl buffer (pH 7.5) manufactured by Sigma-Aldrich). A sample was prepared by dissolving the solution at a concentration of 2 μg/mL and 2 μg/mL. As a blank, an enzyme reaction buffer was used.
上記で調製した溶液を４０℃で１０分間インキュベートした後、固相マイクロ抽出（Supelco社製）を用いて以下の条件でヘッドスペース抽出を行った。
＜抽出条件＞
抽出ファイバー：Supelco社製 SPME fiber assembly Carbon /Polydimethylsiloxane (CAR /PDMS), df 75 mum, needle size 23 ga
平衡化：４０℃で８分間
After incubating the solution prepared above at 40° C. for 10 minutes, headspace extraction was performed using solid phase microextraction (manufactured by Supelco) under the following conditions.
<Extraction conditions>
Extracted fiber: Supelco SPME fiber assembly Carbon /Polydimethylsiloxane (CAR /PDMS), df 75 mum, needle size 23 ga
Equilibration: 8 minutes at 40°C
得られた試料について、以下の条件でＧＣ－ＭＳ分析を行った。
［分析条件］
ＧＣ部：HP 6890 Series GC System（AgilentTechnologies社製）
ＭＳ部：5969C VL MSD（Agilent Technologies 社製）
カラム：Agilent J&W DB-WAX（Agilent社製 30m×0.25mm I.D. 0.25μm film 厚）
イオン化法：ＥＩ法（７０ｅＶ）
キャリヤーガス：ヘリウム
流量：１．２ｍＬ／ｍｉｎ
インレットライナー：Inlet Liner, Direct（SPME）Type, straight Design（Supelco社製）
ＧＣ注入口温度：１５０℃
ＧＣインターフェース温度：２５０℃
イオンチャンバー温度：２３０℃
昇温条件：４０℃で４分間保持
The obtained sample was subjected to GC-MS analysis under the following conditions.
[Analysis conditions]
GC section: HP 6890 Series GC System (manufactured by Agilent Technologies)
MS section: 5969C VL MSD (manufactured by Agilent Technologies)
Column: Agilent J&W DB-WAX (Agilent 30m x 0.25mm ID 0.25μm film thickness)
Ionization method: EI method (70eV)
Carrier gas: helium flow rate: 1.2mL/min
Inlet liner: Inlet Liner, Direct (SPME) Type, straight Design (manufactured by Supelco)
GC inlet temperature: 150℃
GC interface temperature: 250℃
Ion chamber temperature: 230℃
Temperature raising conditions: Hold at 40℃ for 4 minutes
分析の結果、Ｒｔ１．５９付近に特異的なピークトップが確認できた。ｍ／ｚ６８で検出されたＲｔ１．５９のピーク面積をもとに、検量線を作成した。 As a result of the analysis, a specific peak top was confirmed around Rt1.59. A calibration curve was created based on the peak area of Rt1.59 detected at m/z68.
次に以下に示す配合に従い、酵素カクテルを調製し、３８℃で１８時間インキュベートした。なお、ＭＶＫ、ＰＭＶＫ、ＭＶＤ、ＩＰＩは、それぞれ配列番号４７～５０に示すアミノ酸配列を持つものを使用した。
＜酵素カクテル 合計５００μＬ＞
メバロン酸（ＭＶＡ、１１．７ｍｇ／ｍＬ） １０μＬ
ＭＶＫ ２２．５μｇ
ＰＭＶＫ ４０μｇ
ＭＶＤ ２２．５μｇ
ＩＰＩ ２７．５μｇ
上記で得られたイソプレン合成酵素 １０．５μｇ
１Ｍ ＭｇＣｌ２ １０μＬ
ＡＴＰ １６μＬ
酵素反応用バッファー（Sigma-Aldrich社製 Tris-HCl buffer（pH 7.5）） ３３９μＬ
Next, an enzyme cocktail was prepared according to the formulation shown below and incubated at 38°C for 18 hours. Note that MVK, PMVK, MVD, and IPI had amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 47 to 50, respectively.
<Enzyme cocktail total 500μL>
Mevalonic acid (MVA, 11.7mg/mL) 10μL
MVK 22.5μg
PMVK 40μg
MVD 22.5μg
IPI 27.5μg
Isoprene synthase obtained above 10.5μg
10μL of 1M MgCl2
ATP 16μL
Enzyme reaction buffer (Sigma-Aldrich Tris-HCl buffer (pH 7.5)) 339 μL
得られた試料について、上記と同様に、ヘッドスペース抽出を行い、ＧＣ－ＭＳ分析を行った。得られたピーク面積から検量線を用いてイソプレン濃度を計算し、イソプレンの生産量を求め、３回測定した平均値を表２に示した。 The obtained sample was subjected to headspace extraction and GC-MS analysis in the same manner as above. The isoprene concentration was calculated from the obtained peak area using a calibration curve to determine the production amount of isoprene, and the average value of three measurements is shown in Table 2.
＜比較例２＞
５２７位のアラニン（Ａ）をアスパラギン（Ｎ）に変異させたイソプレン合成酵素（配列番号：３３）を作製した。具体的には、比較例１の（Ｆ）葉緑体標的シグナルの除去で得られたプラスミドを形質転換した大腸菌株の培養液から Wizard(R) Plus SV Minipreps DNA Purification System（Promega社製）を用いてプラスミドを抽出してＤＮＡ溶液Ｃを調製した。そして、目的の変異箇所が中央部に来るようにＦｗプライマー（配列番号：１２）とＲｖプライマー（配列番号：１３）を設計した。次に、下記に示したＫＯＤ ＰＣＲ反応組成液を調製し、ＰＣＲ装置（GeneAmp PCR system 2700, Applied Biosystems社製）を用いて、下記の温度条件で、ＰＣＲ反応を行った。
＜温度条件＞
条件は９４℃で２分間間処理した後、９８℃で１０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で３分３０秒間の処理を２５サイクル行い、４℃で冷却した。
＜ＫＯＤ ＰＣＲ反応組成液 合計５０μＬ＞
ポリメラーゼバッファー（Takara社製 PCR Buffer for KOD-Plus-Neo（５×）） ５μＬ
２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Thermo Fisher Scientific社製） ５μＬ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ３μＬ
Ｆｗプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） １．５μＬ
Ｒｖプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） １．５μＬ
ＤＮＡ溶液Ｃ １μＬ
ＰＣＲ酵素（Takara社製 KOD-Plus-Neo（１．０Ｕ／μＬ）） １μＬ
ヌクレアーゼフリー水 ３２μＬ
<Comparative example 2>
An isoprene synthase (SEQ ID NO: 33) was produced in which alanine (A) at position 527 was mutated to asparagine (N). Specifically, the Wizard (R) Plus SV Minipreps DNA Purification System (manufactured by Promega) was used from the culture solution of an E. coli strain transformed with the plasmid obtained by removing the chloroplast targeting signal (F) in Comparative Example 1. DNA solution C was prepared by extracting the plasmid. Then, Fw primer (SEQ ID NO: 12) and Rv primer (SEQ ID NO: 13) were designed so that the target mutation site was located in the center. Next, the KOD PCR reaction composition shown below was prepared, and a PCR reaction was performed using a PCR device (GeneAmp PCR system 2700, manufactured by Applied Biosystems) under the following temperature conditions.
<Temperature conditions>
The conditions were that after treatment at 94°C for 2 minutes, 25 cycles of treatment at 98°C for 10 seconds, 58°C for 30 seconds, and 68°C for 3 minutes and 30 seconds were performed, followed by cooling at 4°C.
<KOD PCR reaction composition solution total 50μL>
Polymerase buffer (Takara PCR Buffer for KOD-Plus-Neo (5x)) 5 μL
2mM dNTPs (manufactured by Thermo Fisher Scientific) 5μL
3μL of 25mM MgSO4
Fw primer (10 pmol/μL) 1.5 μL
Rv primer (10 pmol/μL) 1.5 μL
DNA solution C 1μL
PCR enzyme (Takara KOD-Plus-Neo (1.0U/μL)) 1μL
Nuclease-free water 32μL
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応組成液に制限酵素Dpn Iを１５Ｕ添加し、３７℃で、２時間処理した。Dpn I処理後のＰＣＲ反応組成液２０μＬと大腸菌コンピテントセル（JM109 株）を混合し、形質転換を行った。得られた大腸菌コロニーからプラスミド抽出を行い、変異を有するイソプレン合成酵素遺伝子が導入されたプラスミドを得た。 After the PCR reaction, 15 U of restriction enzyme Dpn I was added to the PCR reaction composition solution, and the mixture was treated at 37° C. for 2 hours. E. coli competent cells (JM109 strain) were mixed with 20 μL of the PCR reaction composition solution after Dpn I treatment, and transformation was performed. Plasmid extraction was performed from the obtained E. coli colony to obtain a plasmid into which a mutated isoprene synthase gene was introduced.
酵素カクテルを調製して、３８℃で９６時間インキュベートした以外は、比較例１と同様に、イソプレンの生産を行い、ＧＣ－ＭＳ分析により、イソプレンの生産量を求めた。結果は表２に示した。 Isoprene was produced in the same manner as in Comparative Example 1, except that an enzyme cocktail was prepared and incubated at 38° C. for 96 hours, and the amount of isoprene produced was determined by GC-MS analysis. The results are shown in Table 2.
＜比較例３＞
４９７位のアラニン（Ａ）をアスパラギン（Ｎ）に変異させたイソプレン合成酵素（配列番号：３４）を作製した。具体的には、プライマーとして配列番号１４，１５に記載のものを使用した以外は、比較例２と同様にしてイソプレン合成酵素（配列番号：３４）を生産し、イソプレン合成酵素の活性を求めた。
<Comparative example 3>
An isoprene synthase (SEQ ID NO: 34) was produced in which alanine (A) at position 497 was mutated to asparagine (N). Specifically, isoprene synthase (SEQ ID NO: 34) was produced in the same manner as in Comparative Example 2, except that primers shown in SEQ ID NOs: 14 and 15 were used, and the activity of isoprene synthase was determined. .
＜実施例１＞
２６３位のアラニン（Ａ）をアスパラギン（Ｎ）に変異させたイソプレン合成酵素（配列番号：３７）を作製した。具体的には、プライマーとして配列番号１６，１７に記載のものを使用した以外は、比較例２と同様にしてイソプレン合成酵素（配列番号：３７）を生産し、イソプレン合成酵素の活性を求めた。
<Example 1>
An isoprene synthase (SEQ ID NO: 37) was produced in which alanine (A) at position 263 was mutated to asparagine (N). Specifically, isoprene synthase (SEQ ID NO: 37) was produced in the same manner as in Comparative Example 2, except that primers shown in SEQ ID NOs: 16 and 17 were used, and the activity of isoprene synthase was determined. .
＜実施例２＞
２６３位のアラニン（Ａ）をアスパラギン酸（Ｄ）に変異させたイソプレン合成酵素（配列番号：３８）を作製した。具体的には、プライマーとして配列番号１８，１９に記載のものを使用した以外は、比較例２と同様にしてイソプレン合成酵素（配列番号：３８）を生産し、イソプレン合成酵素の活性を求めた。
<Example 2>
An isoprene synthase (SEQ ID NO: 38) was produced in which alanine (A) at position 263 was mutated to aspartic acid (D). Specifically, isoprene synthase (SEQ ID NO: 38) was produced in the same manner as in Comparative Example 2, except that primers shown in SEQ ID NOs: 18 and 19 were used, and the activity of isoprene synthase was determined. .
＜実施例３＞
２６３位のアラニン（Ａ）をアスパラギン酸（Ｄ）に変異させ、５２７位のアラニン（Ａ）をアスパラギン（Ｎ）に変異させたイソプレン合成酵素（配列番号：３９）を作製した。具体的には、プライマーとして配列番号１２，１３，１８，１９に記載のものを使用した以外は、比較例２と同様にしてイソプレン合成酵素（配列番号：３９）を生産し、イソプレン合成酵素の活性を求めた。
<Example 3>
An isoprene synthase (SEQ ID NO: 39) was produced in which alanine (A) at position 263 was mutated to aspartic acid (D) and alanine (A) at position 527 was mutated to asparagine (N). Specifically, isoprene synthase (SEQ ID NO: 39) was produced in the same manner as in Comparative Example 2, except that primers shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 18, and 19 were used. Activity was determined.
＜実施例４＞
２６３位のアラニン（Ａ）をアスパラギン（Ｎ）に変異させ、５２７位のアラニン（Ａ）をアスパラギン（Ｎ）に変異させたイソプレン合成酵素（配列番号：４０）を作製した。具体的には、プライマーとして配列番号１２，１３，１６，１７に記載のものを使用した以外は、比較例２と同様にしてイソプレン合成酵素（配列番号：４０）を生産し、イソプレン合成酵素の活性を求めた。
<Example 4>
An isoprene synthase (SEQ ID NO: 40) was produced in which alanine (A) at position 263 was mutated to asparagine (N) and alanine (A) at position 527 was mutated to asparagine (N). Specifically, isoprene synthase (SEQ ID NO: 40) was produced in the same manner as in Comparative Example 2, except that primers shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 16, and 17 were used. Activity was determined.
＜比較例４＞
ギンドロ（Populus alba）由来のイソプレン合成酵素遺伝子を設計した。まず、NationalCenter for Biotechnology Information (NCBI) データベースに登録されているmRNA 配列（配列番号：４、アクセッション番号：AB198180.1）を取得した。そして、文献（Ilmen et al. 2015）の記載を参考に５’末端側の１１１ｂｐを削除し、先頭に開始コドンＡＴＧを付与して合計１６７７ｂｐ（５５９ａａ）の塩基配列とした。そして、GeneScript社に委託して大腸菌 Escherichia coli のコドン使用頻度表（表１）に合わせてコドン最適化変換を行い、pET-21aベクターへの挿入を行った。変換の際には目的遺伝子配列の中に制限酵素BamH I (GGATCC) と Hind III (AAGCTT) の配列を含まないようにした。得られた遺伝子配列（配列番号：５）の全合成とプラスミド作製は同社に依頼した。
<Comparative example 4>
We designed an isoprene synthase gene derived from Populus alba. First, an mRNA sequence (SEQ ID NO: 4, accession number: AB198180.1) registered in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database was obtained. Then, referring to the description in the literature (Ilmen et al. 2015), 111 bp on the 5' end side was deleted, and a start codon ATG was added to the beginning, resulting in a total base sequence of 1677 bp (559 aa). Then, GeneScript was commissioned to carry out codon optimization conversion in accordance with the codon usage table of Escherichia coli (Table 1), and insert it into the pET-21a vector. During conversion, the target gene sequence was made so as not to contain the sequences of the restriction enzymes BamH I (GGATCC) and Hind III (AAGCTT). Total synthesis of the obtained gene sequence (SEQ ID NO: 5) and plasmid production were outsourced to the company.
GeneScript社が合成した４μｇ分のプラスミドの乾燥粉末を、同社の操作プロトコルに従い、乾燥粉末に純水を１００μＬ添加し、ボルテックスで１０秒間懸濁した。それ以降の操作は比較例１と同様にイソプレン合成酵素を生産した。得られたイソプレン合成酵素について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果、目的のイソプレン合成酵素（ＰａＩＳＰＳ）のアミノ酸配列（配列番号：３５）から推定される分子量６４．２ＫＤａのバンドを可溶性画分で確認できた。 100 μL of pure water was added to the dry powder of 4 μg of plasmid synthesized by GeneScript, according to the company's operating protocol, and suspended by vortexing for 10 seconds. The subsequent operations were the same as in Comparative Example 1 to produce isoprene synthase. As a result of performing SDS-PAGE on the obtained isoprene synthase, a band with a molecular weight of 64.2 KDa estimated from the amino acid sequence (SEQ ID NO: 35) of the target isoprene synthase (PaISPS) was confirmed in the soluble fraction. Ta.
得られたイソプレン合成酵素を用いて、比較例１と同様にイソプレン合成酵素の活性を求めた。 Using the obtained isoprene synthase, the activity of isoprene synthase was determined in the same manner as in Comparative Example 1.
＜実施例５＞
２７１位のアラニン（Ａ）をアスパラギン（Ｎ）に変異させたイソプレン合成酵素（配列番号：４１）を作製した。具体的には、比較例４で得たプラスミドと、プライマーとして配列番号２０，２１に記載のものを使用した以外は、比較例２と同様にしてイソプレン合成酵素（配列番号：４１）を生産し、イソプレン合成酵素の活性を求めた。
<Example 5>
An isoprene synthase (SEQ ID NO: 41) was produced in which alanine (A) at position 271 was mutated to asparagine (N). Specifically, isoprene synthase (SEQ ID NO: 41) was produced in the same manner as Comparative Example 2, except that the plasmid obtained in Comparative Example 4 and those described in SEQ ID NOs: 20 and 21 were used as primers. , the activity of isoprene synthase was determined.
＜実施例６＞
２７１位のアラニン（Ａ）をアスパラギン酸（Ｄ）に変異させたイソプレン合成酵素（配列番号：４２）を作製した。具体的には、比較例４で得たプラスミドと、プライマーとして配列番号２２，２３に記載のものを使用した以外は、比較例２と同様にしてイソプレン合成酵素（配列番号：４２）を生産し、イソプレン合成酵素の活性を求めた。
<Example 6>
An isoprene synthase (SEQ ID NO: 42) was produced in which alanine (A) at position 271 was mutated to aspartic acid (D). Specifically, isoprene synthase (SEQ ID NO: 42) was produced in the same manner as Comparative Example 2, except that the plasmid obtained in Comparative Example 4 and those described in SEQ ID NOs: 22 and 23 were used as primers. , the activity of isoprene synthase was determined.
＜実施例７＞
２７１位のアラニン（Ａ）をアスパラギン酸（Ｄ）に変異させ、５３４位のアラニン（Ａ）をアスパラギン（Ｎ）に変異させたイソプレン合成酵素（配列番号：４３）を作製した。具体的には、比較例４で得たプラスミドと、プライマーとして配列番号２２，２３，２４，２５に記載のものを使用した以外は、比較例２と同様にしてイソプレン合成酵素（配列番号：４３）を生産し、イソプレン合成酵素の活性を求めた。
<Example 7>
An isoprene synthase (SEQ ID NO: 43) was produced in which alanine (A) at position 271 was mutated to aspartic acid (D) and alanine (A) at position 534 was mutated to asparagine (N). Specifically, isoprene synthase (SEQ ID NO: 43 ) was produced and the activity of isoprene synthase was determined.
＜比較例５＞
シマホルトノキ（Elaeocarpus photiniifolius）由来のイソプレン合成酵素遺伝子を設計した。まず、National Center for Biotechnology Information (NCBI) データベースに登録されているmRNA 配列（配列番号：６、アクセッション番号：FX134022.1）を取得した。そして、文献（Ilmen et al. 2015）の記載を参考に５’末端側の１２０ｂｐと３’末端側の１３８ｂｐを削除し、先頭に開始コドンＡＴＧを付与して合計１６２０ｂｐ（５４０ａａ）の塩基配列とした。そして、GeneScript社に委託して大腸菌 Escherichia coli のコドン使用頻度表（表１）に合わせてコドン最適化変換を行い、pET-21aベクターへの挿入を行った。変換の際には目的遺伝子配列の中に制限酵素BamH I (GGATCC) と Hind III (AAGCTT) の配列を含まないようにした。得られた遺伝子配列（配列番号：７）の全合成とプラスミド作製は同社に依頼した。
<Comparative example 5>
We designed an isoprene synthase gene derived from Elaeocarpus photiniifolius. First, an mRNA sequence (SEQ ID NO: 6, accession number: FX134022.1) registered in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database was obtained. Then, referring to the description in the literature (Ilmen et al. 2015), we deleted 120 bp at the 5' end and 138 bp at the 3' end, and added a start codon ATG to the beginning, resulting in a total base sequence of 1620 bp (540 aa). did. Then, GeneScript was commissioned to carry out codon optimization conversion in accordance with the codon usage table of Escherichia coli (Table 1), and insert it into the pET-21a vector. During conversion, the target gene sequence was made so as not to contain the sequences of the restriction enzymes BamH I (GGATCC) and Hind III (AAGCTT). Total synthesis of the obtained gene sequence (SEQ ID NO: 7) and plasmid production were outsourced to the company.
GeneScript社が合成した４μｇ分のプラスミドの乾燥粉末を、同社の操作プロトコルに従い、乾燥粉末に純水を１００μＬ添加し、ボルテックスで１０秒間懸濁した。それ以降の操作は比較例１と同様にイソプレン合成酵素を生産した。得られたイソプレン合成酵素について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果、目的のイソプレン合成酵素（ＥｐＩＳＰＳ）のアミノ酸配列（配列番号：３６）から推定される分子量６２．４ＫＤａのバンドを可溶性画分で確認できた。 100 μL of pure water was added to the dry powder of 4 μg of plasmid synthesized by GeneScript, according to the company's operating protocol, and suspended by vortexing for 10 seconds. The subsequent operations were the same as in Comparative Example 1 to produce isoprene synthase. As a result of performing SDS-PAGE on the obtained isoprene synthase, a band with a molecular weight of 62.4 KDa estimated from the amino acid sequence (SEQ ID NO: 36) of the target isoprene synthase (EpISPS) was confirmed in the soluble fraction. Ta.
得られたイソプレン合成酵素を用いて、比較例１と同様にイソプレン合成酵素の活性を求めた。 Using the obtained isoprene synthase, the activity of isoprene synthase was determined in the same manner as in Comparative Example 1.
＜実施例８＞
２５６位のアラニン（Ａ）をアスパラギン（Ｎ）に変異させたイソプレン合成酵素（配列番号：４４）を作製した。具体的には、比較例５で得たプラスミドと、プライマーとして配列番号２６，２７に記載のものを使用した以外は、比較例２と同様にしてイソプレン合成酵素（配列番号：４４）を生産し、イソプレン合成酵素の活性を求めた。
<Example 8>
An isoprene synthase (SEQ ID NO: 44) was produced in which alanine (A) at position 256 was mutated to asparagine (N). Specifically, isoprene synthase (SEQ ID NO: 44) was produced in the same manner as Comparative Example 2, except that the plasmid obtained in Comparative Example 5 and those described in SEQ ID NOs: 26 and 27 were used as primers. , the activity of isoprene synthase was determined.
＜実施例９＞
２５６位のアラニン（Ａ）をアスパラギン酸（Ｄ）に変異させたイソプレン合成酵素（配列番号：４５）を作製した。具体的には、比較例５で得たプラスミドと、プライマーとして配列番号２８，２９に記載のものを使用した以外は、比較例２と同様にしてイソプレン合成酵素（配列番号：４５）を生産し、イソプレン合成酵素の活性を求めた。
<Example 9>
An isoprene synthase (SEQ ID NO: 45) was produced in which alanine (A) at position 256 was mutated to aspartic acid (D). Specifically, isoprene synthase (SEQ ID NO: 45) was produced in the same manner as Comparative Example 2, except that the plasmid obtained in Comparative Example 5 and those described in SEQ ID NOs: 28 and 29 were used as primers. , the activity of isoprene synthase was determined.
＜実施例１０＞
２５６位のアラニン（Ａ）をアスパラギン酸（Ｄ）に変異させ、５１９位のアラニン（Ａ）をアスパラギン（Ｎ）に変異させたイソプレン合成酵素（配列番号：４６）を作製した。具体的には、比較例５で得たプラスミドと、プライマーとして配列番号２８，２９，３０，３１に記載のものを使用した以外は、比較例２と同様にしてイソプレン合成酵素（配列番号：４６）を生産し、イソプレン合成酵素の活性を求めた。
<Example 10>
An isoprene synthase (SEQ ID NO: 46) was produced in which alanine (A) at position 256 was mutated to aspartic acid (D) and alanine (A) at position 519 was mutated to asparagine (N). Specifically, isoprene synthase (SEQ ID NO: 46 ) was produced and the activity of isoprene synthase was determined.
結果は表２～４と図５～７に示すとおりであり、Ａ５２７Ｎの変異を有するイソプレン合成酵素を用いた比較例２は、野生型のイソプレン合成酵素を用いた比較例１と比較し、イソプレンの生産量が少なかった。Ａ４９７Ｎの変異を有するイソプレン合成酵素を用いた比較例３は、野生型のイソプレン合成酵素を用いた比較例１と比較し、イソプレンの生産量が少なかった。 The results are shown in Tables 2 to 4 and Figures 5 to 7, and Comparative Example 2 using isoprene synthase with the A527N mutation was compared with Comparative Example 1 using wild-type isoprene synthase. production was low. Comparative Example 3 using isoprene synthase having the A497N mutation produced less isoprene than Comparative Example 1 using wild-type isoprene synthase.
一方、実施例１～４は、比較例１と比較し、イソプレンの生産量が多かった。 On the other hand, Examples 1 to 4 produced a larger amount of isoprene than Comparative Example 1.
実施例５～７は、比較例４と比較し、イソプレンの生産量が多かった。 Examples 5 to 7 had a higher production amount of isoprene than Comparative Example 4.
実施例８～１０は、比較例５と比較し、イソプレンの生産量が多かった。 Examples 8 to 10 had a higher production amount of isoprene than Comparative Example 5.
本発明のイソプレン合成酵素は、イソプレンゴムなどの原料となるイソプレンの合成に使用することができる。 The isoprene synthase of the present invention can be used to synthesize isoprene, which is a raw material for isoprene rubber and the like.
本発明に係るイソプレン合成酵素は、以下の（１）～（３）のいずれか１つの特徴を有するアミノ酸配列からなるイソプレン合成酵素とする。
（１）配列番号３９、配列番号４３、又は配列番号４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号３９、配列番号４３、又は配列番号４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記アミノ酸配列からなるポリペプチドがジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を基質としてイソプレンを生成する活性を有するアミノ酸配列、及び
（３）配列番号３９、配列番号４３、又は配列番号４６のいずれか１つのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ上記アミノ酸配列からなるポリペプチドがジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を基質としてイソプレンを生成する活性を有するアミノ酸配列。
The isoprene synthase according to the present invention is an isoprene synthase consisting of an amino acid sequence having any one of the following characteristics (1) to (3).
(1) The amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, or SEQ ID NO: 46 ,
(2) In the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, or SEQ ID NO: 46, one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added, and the above amino acid an amino acid sequence in which a polypeptide consisting of the sequence has the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate (DMAPP) as a substrate; and (3) an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO: 43, or SEQ ID NO: 46. An amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the above amino acid sequence, and in which a polypeptide consisting of the above amino acid sequence has an activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate (DMAPP) as a substrate.
Claims (4)
野生型のアミノ酸配列のＮ末端から１０番目と１１番目のαヘリックスをつなぐループ構造において、Ｎ末端から１１番目のαヘリックスに最も近いアラニンをアスパラギン又はアスパラギン酸に置換した、イソプレン合成酵素。 An enzyme that synthesizes isoprene using dimethylallyl diphosphate (DMAPP) as a substrate,
An isoprene synthase in which the alanine closest to the 11th α-helix from the N-terminus is replaced with asparagine or aspartic acid in the loop structure connecting the 10th and 11th α-helices from the N-terminus of the wild-type amino acid sequence.
（１）配列番号３７～４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号３７～４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ前記アミノ酸配列からなるポリペプチドがジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を基質としてイソプレンを生成する活性を有するアミノ酸配列、及び
（３）配列番号３７～４６のいずれか１つのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記アミノ酸配列からなるポリペプチドがジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を基質としてイソプレンを生成する活性を有するアミノ酸配列。 Isoprene synthase consisting of an amino acid sequence having any one of the following characteristics (1) to (3),
(1) the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 37 to 46;
(2) In the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 37 to 46, one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added, and the polypeptide consisting of the amino acid sequence is dimethylated. an amino acid sequence having the activity of producing isoprene using allyl diphosphate (DMAPP) as a substrate, and (3) having 90% or more sequence identity with any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 37 to 46, and An amino acid sequence in which a polypeptide consisting of an amino acid sequence has the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate (DMAPP) as a substrate.
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