JP2023161714A

JP2023161714A - 脳機能活性化組成物

Info

Publication number: JP2023161714A
Application number: JP2022072220A
Authority: JP
Inventors: 秀吉長; Hideyoshi Cho; 実和野口; Miwa Noguchi
Original assignee: UNITEC FOODS CO Ltd
Current assignee: UNITEC FOODS CO Ltd
Priority date: 2022-04-26
Filing date: 2022-04-26
Publication date: 2023-11-08

Abstract

【課題】脳機能の低下に起因する症状あるいは疾患の予防又は改善作用を有する従来の組成物よりも更に高い脳機能活性効果を示す組成物を提供する。【解決手段】脳機能活性化組成物が、ホスファチジルイノシトール含有素材と、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸及びアラキドン酸からなる群から選ばれた少なくとも１種とを有効成分として含有する。この脳機能活性化組成物は、好ましくは神経細胞の軸索及び樹状突起の伸長、並びに神経細胞新生作用を有する。【選択図】なし

Description

本発明は、脳機能活性化組成物に関する。

ホスファチジルイノシトール（以下、「ＰＩ」と略する場合がある。）は、ヒトをはじめとする真核生物の細胞膜を構成しているリン脂質である。ホスファチジルイノシトールは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン等の他の細胞膜構成リン脂質同様、細胞内外の情報伝達機能に深く関わっていることが知られている。近年、脳内のＰＩとその関連リン脂質の含有量が加齢とともに減少することから、これらの脳内物質が、成人後の脳の構成と機能性に関して重要な役割を担うものと考えられている。特許文献１には、ＰＩを有効成分として含有する経口用記憶学習能力改善用組成物が開示されている。

アラキドン酸（以下、「ＡＡ」と略する場合がある。）は、ｎ－６系不飽和脂肪酸の一種で、体内ではリノール酸からγ－リノレン酸、ジ・ホモγ－リノレン酸を経て生合成され、細胞膜を構成する主要な成分のひとつで、脳、肝臓、皮膚等のあらゆる組織に存在する。アラキドン酸は乳児の脳と体の発達には欠かせない成分で、特に１歳未満の乳児では、体内でアラキドン酸を合成する力が弱いため、粉ミルク等にアラキドン酸を添加したものが販売されている。さらにアラキドン酸は、脳の神経細胞の主要成分であり、学習力と記憶力を向上させる効果がある。特許文献２には、アラキドン酸及び／又はアラキドン酸を構成脂肪酸とする化合物を含んで成る、脳機能の低下に起因する症状あるいは疾患の予防又は改善作用を有する組成物が開示されている。また、特許文献３には、アラキドン酸及び／又はアラキドン酸を構成脂肪酸とする化合物を有効成分として含有して成る神経再生剤が開示されている。

エイコサペンタエン酸（以下、「ＥＰＡ」と略する場合がある。）は体内で合成されない必須脂肪酸の１つである。ドコサヘキサエン酸（以下、「ＤＨＡ」と略する場合がある。）も体内でほぼ合成されない必須脂肪酸の１つである。体内でＥＰＡからＤＨＡに変換されるが、その変換率は低い。ＤＨＡは脳を中心とした神経組織にとても多く含まれ、ｎ－３系脂肪酸の中で血液脳関門を通過できる唯一の脂肪酸である。特許文献４には、ＥＰＡ、ＤＨＡ等のｎ－３系脂肪酸を含む脂質を含有する、末梢神経障害の予防又は改善用組成物が開示されている。

国際公開第２０２１／０３９３８５号特開２０１２－０３６２１４号公報特開２０１４－０５８５７９号公報特開２０１９－１８２８８１号公報

近年、特許文献２に開示されている、脳機能の低下に起因する症状あるいは疾患の予防又は改善作用を有する組成物よりも更に高い脳機能活性効果を示す組成物が希求されていたが、そのような組成物は提供されていなかった。本発明が解決しようとする課題は、従来の組成物よりも更に高い脳機能活性効果を示す組成物を提供することである。

本発明者らは上記課題に鑑み検討を重ね、ホスファチジルイノシトール含有素材と、ＥＰＡ、ＤＨＡ及びＡＡからなる群から選ばれた少なくとも１種とを有効成分として含有する組成物が、従来の組成物よりも更に高い脳機能活性効果を示すことを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。

本発明は、ホスファチジルイノシトール含有素材と、ＥＰＡ、ＤＨＡ及びＡＡからなる群から選ばれた少なくとも１種とを有効成分として含有する脳機能活性化組成物である。
前記脳機能活性化組成物は、好ましくは神経細胞の軸索及び樹状突起の伸長、並びに神経細胞新生作用を有する。
前記脳機能活性化組成物は、好ましくはホスファチジルイノシトール含有素材と、アラキドン酸とを有効成分として含有する。
前記ホスファチジルイノシトール含有素材は、好ましくは大豆由来である。
前記ホスファチジルイノシトール含有素材は、好ましくは大豆リン脂質の酵素処理物であって、ホスファチジルイノシトールの含有量が４０質量％以上であり、且つ、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸からなる群からなる群から選ばれた少なくとも１種のリン脂質を含む。
さらに前記脳機能活性化組成物は、好ましくは飲食品、食品添加物、医薬品、サプリメント、又は動物飼料の形態である。

本発明の脳機能活性化組成物は、従来の組成物よりも更に高い脳機能活性効果を示す組成物を提供する。

ＰＩ、脂肪酸、若しくはＰＩ及び脂肪酸を含む培地で培養された細胞の軸索及び樹状突起の伸長を示す顕微鏡写真。ＰＩ、脂肪酸、若しくはＰＩ及び脂肪酸を含む培地で培養された細胞から抽出された全タンパク質の含有量を示すグラフ。ＰＩ、脂肪酸、若しくはＰＩ及び脂肪酸を含む培地で培養された細胞の細胞新生を示すグラフ。

本発明について更に詳細に説明する。
＜ホスファチジルイノシトール含有素材＞
ＰＩは細胞外からのシグナルが細胞膜中の特異的受容体に結合することにより遊離される情報伝達物質の前駆体であるホルモン、神経伝達物質、光などの刺激が細胞膜のレセプターに結合することにより、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）が働き、膜の微量成分であるホスファチジルイノシトール－４，５－ニリン酸（ＰＩＰ２）のグリセロールとリン酸の間のエステル結合を切断し、イノシトール－１，４，５－三リン酸とジアシルグリセロールを産生する。イノシトール－１，４，５－三リン酸は細胞内小胞体に蓄えられているＣａ²⁺を遊離させ、Ｃａ²⁺依存性酵素を活性化する。また、ジアシルグリセロールはＣａ²⁺依存性プロテインキナーゼＣを活性化させる。このような生体情報伝達に関わるＰＩは、一般にそのグリセロール骨格のｓｎ－２位に高度不飽和脂肪酸、特にＡＡが結合しているものであることが知られている。また、脳内に存在するＰＩは転写因子のＮｒｆ２ ( Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2)を介して細胞の抗酸化システムを活性化するため、脳内に取り込まれた脂肪酸を酸化ストレスから保護し、安定性を高める機能が期待される。

本発明に用いるホスファチジルイノシトールとしては、天然物由来であってよく、合成のものであってもよい。飲食品等の形態で提供するためには、天然物由来であることが好ましい。例えば、国際公開第２００７／０１０８９２号には、大豆等の天然物に由来する粗製リン脂質を、微生物由来酵素（ホスホリパーゼ）で処理して、ホスファチジルイノシトール以外のリン脂質の分解及び除去により、ホスファチジルイノシトールの含有量を高めたホスファチジルイノシトール含有素材の調製が記載されている。したがって、このような公知の方法又はこれに準じた方法により、天然物由来のホスファチジルイノシトール含有素材を調製して、本発明の脳機能活性組成物に用いることができる。あるいは、市販のホスファチジルイノシトール含有素材を利用してもよい。なお、ホスファチジルイノシトールは、イノシトール環を有するリン脂質の総称であり、例えば天然には７種類程度が知られている。使用できるホスファチジルイノシトールとしては、特にその種類に制限はなく、また、複数種類の混合物ないしは組み合わせであってもよい。また、ホスファチジルイノシトールの量的な特定は、検知し得る各種類の１又は複数の総量として取り扱うことができる。

天然物由来のホスファチジルイノシトール含有素材を用いる場合には、その基原等に特に制限はない。例えば、大豆由来のリン脂質、コーン由来のリン脂質、ヒマワリ由来のリン脂質、アブラナ由来のリン脂質、牛由来のリン脂質等を使用することができるが、原料リン脂質の安定供給の面で大豆由来のリン脂質、ヒマワリ由来のリン脂質が好ましく、大豆由来のリン脂質がより好ましい。

大豆等の天然物からホスファチジルイノシトール含有素材を調製して用いる場合、例えばホスファチジルイノシトールの含有量（純度）が２０質量％以上に高められた素材を用いることが好ましく、３０質量％以上に高められた素材を用いることがより好ましく、４０質量％以上に高められた素材を用いることが更に好ましく、５０質量％以上に高められた素材を用いることが特に好ましい。あるいは、ホスファチジルイノシトール以外の他のリン脂質の合計の含有量としては、例えば、４０質量％以下の素材を用いることが好ましく、３０質量％以下の素材を用いることがより好ましく、２０質量％以下の素材を用いることが更に好ましい。

前記ホスファチジルイノシトール含有素材は大豆リン脂質の酵素処理物であってよい。この場合、前記ホスファチジルイノシトール含有素材は、ホスファチジルイノシトールの含有量が４０質量％以上であり、且つ、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸からなる群からなる群から選ばれた少なくとも１種のリン脂質を含むことが好ましい。

ここで、リン脂質含有量は、当業者に周知の方法で測定することができる。特に測定方法としては日本油化学協会制定の測定法として定められている高速液体クロマトグラフィーによるリン脂質組成の定量分析を行うことが望ましい。例えば、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸等の特定のリン脂質について、それらの濃度の知れた標準品を指標試料に用いた、ＨＰＬＣ定量分析等により測定することができる。また、近年では31P－NMRを用いたリン脂質の定量分析を行うこともできる。

＜脂肪酸＞
本発明に用いるＥＰＡ、ＤＨＡ及びＡＡとしては、天然物由来であってよく、合成のものであってもよい。これらの脂肪酸は市販されている。添加する脂肪酸は遊離脂肪酸以外に、消化管内でリパーゼ、ホスホリパーゼなどの酵素によって加水分解を受けて遊離脂肪酸を産生する分子構造が対象となる。対象となる分子構造はアシルグリセリド（トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール）、脂肪酸エステル（エチルエステル）、ｓｎ－２位脂肪酸エステル化グリセロリン脂質にコリンが結合したホシファチジルコリンおよびリゾホシファチジルコリンとホスファチジルセリン、ステロールエステル体などがある。また、前記脂肪酸は精製形態を含んでいても、粗抽出物形態を含んでいてもよい。

前述の通り、ＤＨＡは正常な脳の発達と認知機能に必須の脂肪酸であり、脳リン脂質に豊富に存在している。脳リン脂質の主要脂肪酸であるにも関わらずＤＨＡの脳内での新生合成はわずかである。そのため、ＤＨＡは血液より脳血液関門（ＢＢＢ）を通過して脳内に運び込まれる必要がある。脳内へのＤＨＡ取り込み用の主要な輸送体として、既報のオーファン輸送体でメジャーファシリテーター・スーパーファミリー（Major Facilitator Super family:MFS；膜貫通領域を１２個～１４個持つという構造的共通点を持つ膜輸送体）のメンバーであるＭＦＳ領域含有蛋白質２ａ(MFS domain-containing protein 2a:Mfsd2a）が報告されている（Christer Betsholtz,Nature, 2014年, 509号, p. 432-433）。Ｍｆｓｄ２ａは中枢神経系の脳毛細血管内皮細胞（ＢＢＢの本体）含有血管壁の内皮に選択的及び独占的に発現していることが見出されている。ＤＨＡはリゾホスファチジルコリン体としてＭｆｓｄ２ａで輸送されてＢＢＢを通過して脳実質に取り込まれる。
つまり、ＤＨＡはＰＩによって培養神経芽細胞腫に取り込み易い分子形態に改変され、ＰＩがＤＨＡのＢＢＢ輸送のキャリアー輸送体となることによりＢＢＢ通過性が高まると推測される。
また、軸索の伸長は神経細胞の細胞体による栄養物質（ＤＨＡ）輸送によって賄われているが、その神経細胞のＤＨＡはキャリアー輸送体によりＢＢＢを経由して全てグリア細胞より補給されている。軸索を取り囲むミエリン鞘はＤＨＡ含量が非常に高いことから、ＤＨＡの取り込みをＰＩが促進することによりミエリン鞘や軸索の発達に貢献すると推測される。

ＤＨＡの由来は特に制限がなく、寒冷水の魚の魚油、マグロ油(２６質量％)、イワシ油(１３質量％)、オキアミ油(１０質量％)、タラ油、ニシン油、サバ油、サケ油、マグロ眼窩油、イクラ油（リン脂質７０質量％の内ＤＨＡは２０～３０質量％、トリアシルグリセロール３０質量％の内ＤＨＡは２０質量％）、微細藻類による植物性ＤＨＡ油、ＤＨＡ摂取蓄積鶏卵油、微細藻類（ユーグレナ藻）、食用藍藻スピルリナ、ラビリンチュラ、シゾキトリウム（Shizochytrium sp.）由来の藻類ＤＨＡ油等が挙げられる。

ＥＰＡは上述の魚油のＤＨＡと併存しており、両者はクロマトグラフィーで分離される。ＥＰＡもＤＨＡの菌体油脂を生産する糸状菌モルティエレラ属アルピン1S-4 Mu48の菌株を培養で生産が可能である。
Mortriella sp.以外の菌株の、Phyium sp.、Saprolegnie diclina、Phyium irregulare、Shewnella purefaciens、又はEnglena gracilisを培養した菌体油脂も対象となる。ＥＰＡは脳内に取り込まれないと考えられているが、ＥＰＡは赤血球の変形能を改善することが知られているので、ＢＢＢの本体である脳毛細血管を通過する赤血球から脳への酸素供給能を向上させることが期待される。

ｎ－３脂肪酸含有精製油脂（例えば精製魚油、精製藻類油）は市販されており、例えば日油株式会社製サンオメガＤＨＡ２７、不二製油株式会社製ＤＨＡ／ＥＰＡ高含有組成物、日本水産株式会社製ＤＤオイル、ＢＡＳＦ社製ＤＨＡアルガオイルを使用することができる。

ＡＡは豚レバー、牛レバー、鶏ハツ、豚バラ肉、鶏モモ、肉、卵黄油、母乳脂に存在する。ＡＡの好ましい起源は、土壌より分離した接合菌類かび目の糸状菌モルティエレラ属アルピン１Ｓ－４の菌株を培養することに由来するＡＡ含有油脂である。その他にはペニシリウム属、クラドスポリウム属、ムコール属、フザリウム属、ホルモデンドラス属、アスペルギルス属、ロードトルラ属が発酵で産生する菌体油脂も挙げられる。

脳内に取り込まれる血漿中のＡＡは１８ｍｇ／日で、脳内におけるＡＡの半減期は１４７日である。ＡＡは細胞膜にある脂肪酸トランスポーターと脂肪酸結合蛋白質により脳内に取り込まれると考えられている。脳内ではＡＡ生合成が活発でないが、その一方でＡＡが結合しているアナンダマイド、ｓｎ－２アラキドニルグリセロール、ｓｎ－２ＡＡ結合リン脂質が豊富に存在することから、ＡＡの脳内移行が推測されている。

＜脳機能活性化＞
本発明において、脳機能活性化作用は、神経細胞の軸索及び樹状突起の伸長、及び神経細胞新生作用を少なくとも含む。神経細胞の軸索及び樹状突起の伸長、及び神経細胞新生作用により、脳機能が活性化され、脳機能の低下に起因する症状あるいは疾患の予防又は改善作用、より具体的には、記憶及び学習能力の低下、認知能力の低下、感情障害（例えば、うつ病など）、知的障害（例えば、アルツハイマー型認知障害、脳血管性認知障害）の予防・改善、物忘れ予防、ボケ予防、記憶力の維持及び向上、集中力の維持及び向上、注意力の維持及び向上、学習機能の向上などの効果が期待される。

＜軸索及び樹状突起の伸長＞
神経ネットワークの構成単位である神経細胞は高度に分化した細胞であり、情報の出力を担う軸索と入力を担う樹状突起という２種類の神経突起を持つ。
神経細胞は１本の軸索と複数本の樹状突起を伸ばし、標的細胞と接続することで情報のやり取りを行う。
軸索と次のニューロンの樹状突起の間には隙間があり、電気信号が軸索の終末部（シナプス前部）に到達すると、終末部から神経伝達物質が放出される。
この神経伝達物質が、次のニューロンの樹状突起や樹状突起上の棘突起（シナプス後部）に存在する受容体に結合することにより、再び電気信号に変換される。

大脳皮質で起きる変化の中心はシナプスであることが報告されている（Kleim et al. 2002）。大脳皮質の厚みやシナプス密度はほとんど差がないが、１個の神経細胞あたりのシナプスの数が増加する。つまり、シナプスで起きる変化は、このシナプスの数の増加（側枝形成）とスパイン（樹状突起棘）の変化によると考えられる。なかでもグルタミン酸作動性シナプスの多くは樹状突起スパインという小突起構造上に形成される。
シナプスでは、信号伝達が長期間にわたって起こりやすくなる長期増強と、逆に信号伝達が起きにくくなる長期抑圧が起こり、その結果、学習と忘却が起こる（シナプス可塑性）。スパインは興奮性神経細胞の接続部の大部分を形成するため、スパインが新しく形成されたり、またその大きさが変化したりすることにより、どの脳神経回路にどの程度の電気信号が流れるかが大きく左右される。よって、樹状突起や軸索が伸長することでスパイン形成も促進すると考えられる。

＜細胞新生＞
以前、脳神経細胞は一度死ぬと再生しないと考えられてきたが、１９９０年代に入り脳内でも神経細胞が新生していることが明らかになった。なかでも脳内にある海馬の歯状回では、正常な脳でも神経細胞の新生が毎日起こっていることがわかってきている（Ming & Song, Annual Review of Neuroscience, 2005; Zhao et al., Cell, 2008）。一度海馬内で形成された学習と記憶は、徐々に大脳新皮質に移行し、その後はその学習と記憶の内容を想起する際には海馬を必要としなくなる（記憶固定）。
なお、神経細胞の新生は運動や記憶課題のような神経系の活動の程度に依存して増減する。しかしながら加齢とともに神経幹細胞数は減少し、記憶学習能力が低下することが分かっている。
細胞新生による効果として、（１）新たに学習と記憶を習得し、形成する際に新生した神経細胞が既存の神経ネットワークに組み込まれ、より多くの情報を保持し、処理できるようになる、（２）大脳皮質に記憶固定が起これば、当該記憶は海馬の中に存在している必要はないと考えられ、新生した神経細胞が過去の記憶とは別のメモリとなり、新たな学習と記憶をしやすくしているなどが考えられている。
実際に、成体の海馬神経新生が増加したマウスは、正常な物体認識、空間学習、恐怖条件付けなどを示し、自発的な運動と組み合わせると、探索行動が活発になると報告されている（Sahay et al., Nature, 2011; Stone et al., Journal of Neuroscience, 2011）。

＜組成物の形態＞
本発明にかかる組成物は、適当な添加物や製剤的素材等ととともに、例えば、飲食品、食品添加物、医薬品、サプリメント、動物飼料の等の形態に調製してもよい。

典型的に、飲食品の形態としては、例えば、ゼリー、プリン、グミ、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー等の菓子類、パン類、食用油類、マヨネーズ、ドレッシング、バター、クリーム、マーガリン等の油脂食品類、ケチャップ、ソース等の調味料類、牛乳、ヨーグルト、チーズ等の乳製品類、うどん、そば、ラーメン、パスタ、やきそば、きしめん、そーめん、ひやむぎ、ビーフン等の麺類、味噌汁、コーンスープ、コンソメスープ等のスープ類、お茶、炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等の飲料類、流動食、ふりかけ等の形態が挙げられる。

また、典型的に、サプリメント及び医薬品の形態としては、例えば散剤、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等の形態が挙げられる。

ホスファチジルイノシトールは、リポソームの形態をとってもよい、すなわち、リポソームの脂質二重膜の構成脂質となり得る。リポソーム化することで、経口摂取したとき腸管等からの吸収率が高められる。吸収率を高める手段としてはリポソームの形態のほかに、乳化あるいはマイクロ乳化等を行ってもよい。

本発明の脳機能活性化組成物の好ましい投与量としては、被投与者又は被投与動物の年齢、健康状態、投与継続期間、投与頻度などによって、適宜決定することができる。一般的な投与量を例示すれば、例えば、ホスファチジルイノシトールにして２．０～３０００．０ｍｇ／ｋｇ（体重）／１日、ＥＰＡにして１０～３０ｍｇ／ｋｇ（体重）／１日、ＤＨＡにして１０～２０ｍｇ／ｋｇ（体重）／１日、ＡＡにして３～２０ｍｇ／ｋｇ（体重）／１日の量で投与することができる。２０２０年の日本人の食事摂取基準によれば、ｎ－３系脂肪酸の摂取量は０．７～２．２ｇ／日、ｎ－６系脂肪酸の摂取量は４～１３ｇ／日とされている。臨床投与試験では、健常高齢者には０．５～１．７ｇ／日、軽度認知障害者には０．２～１．７ｇ／日で記憶改善効果があったという報告もある。ｎ－３系脂肪酸は３ｇ以上／日で凝血能低下による出血傾向があらわれた例も報告されている。なお、ＥＰＡのエチルエステルが抗動脈硬化の治療薬として使用される場合は、投与量１８００ｍｇ／日と指定されている。

また、所定期間にわたって継続的に摂取するように用いられてもよく、例えば１ヶ月以上にわたって継続的に摂取するように用いられることも可能である。なお、ホスファチジルイノシトールを５０質量％以上高含有する素材を用いてin vitroの変異原性試験とラットを用いた単回及び９０日間の反復投与試験において安全性が確認されており、ラットにおける単回投与によるＬＤ５０値は、２，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）／１日の量以上であると報告されている（Honda et al., The Journal of Toxicological Sciences, 2009年, 34巻3号, p. 265-280）。

本発明の脳機能活性化組成物に含まれる、ホスファチジルイノシトール、ＥＰＡ、ＤＨＡ及びＡＡのそれぞれの含有量は、特に限定されないが、１日当たりに無理なく摂取できる量で、各成分が上記有効投与量となるように調整された含有量であることが好ましい。例えば、本発明の脳機能活性化組成物中の固形分換算で、ホスファチジルイノシトールの含有量は２０～６０質量％が好ましく、４０～６０質量％がより好ましい。また、ＥＰＡの含有量は５～８０質量％が好ましく、６０～８０質量％がより好ましい。また、ＤＨＡの含有量は５～８０質量％が好ましく、６０～８０質量％がより好ましい。更に、ＡＡの含有量は１０～８０質量％が好ましく、６０～８０質量％がより好ましい。本発明の脳機能活性化組成物が、ＥＰＡ、ＤＨＡ及びＡＡからなる群から選ばれた２種又は３種の脂肪酸を含む場合、これらの脂肪酸の含有量は、好ましくは、本発明の脳機能活性化組成物中の固形分換算で２０質量％以上、より好ましくは７０質量％以上である。

以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例及び比較例において、各種物性は以下のとおりに測定ないし算出された。
＜Neuro2a細胞のプレーティング＞
Neuro2a細胞（脳組織から分離されたニューロン及びアメーバ幹細胞の形態を備えたマウス神経芽細胞であり、微小管タンパク質のビンブラスチン沈殿のメカニズム、単離されたタンパク質へのGTP結合の動態、in vivoでの微小管の代謝回転、及び微小管タンパク質の合成と集合に関する研究に使用されてきた。）を、２４ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製IWAKIマイクロプレート 24well/Flat Bottom）、カルチャースライド８ウェル（Corning社製BioCoat（登録商標））、９６ウェルプレート（Colorimetric）の各ウェルの細胞培養液（Ｅ－ＭＥＭ）中に１．０×１０⁵細胞／３００μｌとなるようにプレーティングした。

＜軸索染色＞
上記プレーティングされたNeuro2a細胞がカルチャースライド８ウェルに付着した２４時間後、ソイブレイン（登録商標）ＰＩ５０（ユニテックフーズ株式会社製、ホスファチジルイノシトール含有量が５０質量％以上）、ＤＨＡ、ＥＰＡ、及びＡＡ（これら３つの脂肪酸は東京化成工業株式会社製）それぞれを、図１に示す濃度及び組み合わせとなるようにエタノールに溶解させ、各細胞培養液に添加し、２４時間培養を続けた。その後ＰＢＳにて洗浄後、０．３質量％過酸化水素加メタノールを用いて内因性ペルオキシダーゼの阻害を行った。ニチレイ抗原賦活化液（ｐＨ９）を使用し、抗原賦活化（スチームクッカーを使用）後、２．５質量％Normal Horse Serumにてブロッキングを行った。その後、１次抗体としては抗rabbit Myelin Basic Protein抗体（Cell Signaling社製）、抗mouse Neurofilament-H抗体（Cell Signaling社製）、２次抗体としてImmPRESS Horse Anti-Rabbit IgG Polymer Kit（VECTOR LABORATORIES社製）とImmPRESS Horse Anti-mouse IgG Polymer Kit（VECTOR LABORATORIES社製）を使用し反応させた後、最後にＤＡＢで発色させた。結果を図１に示す。図１（ａ）～（ｅ）と（ｆ）～（ｈ）を比較すると、ＰＩと、ＥＰＡ、ＤＨＡ及びＡＡからなる群から選ばれた少なくとも１種との組み合わせを含む培地で培養されたNeuro2a細胞の樹状突起及び軸索は、エタノール、ＰＩ、ＥＰＡ、ＤＨＡ、ＡＡそれぞれを含む培地で培養されたNeuro2a細胞の樹状突起及び軸索より伸長したことが確認された。

＜タンパク質の濃度＞
上記プレーティングされたNeuro2a細胞が２４ウェルプレートに付着した２４時間後、ソイブレイン（登録商標）ＰＩ５０（ユニテックフーズ株式会社製、ホスファチジルイノシトール含有量が５０質量％以上）、ＤＨＡ、ＥＰＡ、及びＡＡ（これら３つの脂肪酸は東京化成工業株式会社製）それぞれを、図１に示す濃度及び組み合わせとなるようにエタノールに溶解させ、各細胞培養液に添加し、７２時間培養を続けた。その後０．２５質量％トリプシン／ＰＢＳを少量（φ５０ｍｍディッシュ：０．５ｍｌ、φ３５ｍｍディッシュ：０．２ｍｌ程度）加え、３７℃で約５分間程度培養した。その後光学顕微鏡で培養された細胞が剥がれたことを確認し、血清入り培地を加えトリプシンの活性を止めた。次いでピペッティングで培養された細胞をプレートから剥がし、各細胞浮遊液を各遠心チューブに移し、各遠心チューブ１３００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離し、上液を吸引除去した。ＰＢＳを加え遠心分離を２回程度行った後、Thermo Scientific社製T-per(Protein Extraction Reagent)を用いて細胞を溶解し、全タンパク質を抽出した。抽出された全タンパク質の濃度を、Unchained Labs社製LUNATICを用いて専用チップのキャピラリー中で測定した。当該濃度が大きいほど、神経細胞の樹状突起及び軸索が伸長したことを示す。結果を図２に示す。

図２の左側の４本のバーが示す通り、０．１ｍｇ／ｍｌのＰＩ及び３０μＭのＤＨＡを含む培地で培養されたNeuro2a細胞から抽出された全タンパク質の濃度は、エタノール、０．１ｍｇ／ｍｌのＰＩ、３０μＭのＤＨＡそれぞれを含む培地で培養されたNeuro2a細胞から抽出された全タンパク質の濃度より高かった。すなわちＰＩ及びＤＨＡを含む培地で培養されたNeuro2a細胞の樹状突起及び軸索は、エタノール、ＰＩ、ＤＨＡそれぞれを含む培地で培養されたNeuro2a細胞の樹状突起及び軸索より伸長したことが確認された。
また、図２の中央の４本のバーが示す通り、ＰＩ及びＥＰＡを含む培地で培養されたNeuro2a細胞の樹状突起及び軸索は、エタノール、ＰＩ、ＥＰＡそれぞれを含む培地で培養されたNeuro2a細胞の樹状突起及び軸索より伸長したことが確認された。
さらに、図２の右側の４本のバーが示す通り、ＰＩ及びＡＡを含む培地で培養されたNeuro2a細胞の樹状突起及び軸索は、エタノール、ＰＩ、ＡＡそれぞれを含む培地で培養されたNeuro2a細胞の樹状突起及び軸索より伸長したことが確認された。
上記される通り、神経細胞の樹状突起及び軸索が伸長に対する、ＰＩと上記３つの脂肪酸のいずれか１つの併用による相乗効果が示された。

＜細胞新生＞
上記プレーティングされたNeuro2a細胞が９６ウェルプレートに付着した２４時間後、大豆リン脂質の酵素処理物であるソイブレイン（登録商標）ＰＩ５０（ユニテックフーズ株式会社製、ホスファチジルイノシトール含有量が５０質量％以上）、ＤＨＡ、ＥＰＡ、及びＡＡ（これら３つの脂肪酸は東京化成工業株式会社製）それぞれを、表２に示す濃度と組み合わせとなるようにエタノールに溶解させ、各細胞培養液に添加し、２４時間培養を続けた。その後BrdU Cell Proliferation ELISA Kit（Abcam社製ab126556）にて処理を行った後、４５０／５５０ｎｍの２波長に設定した分光光度計付きマイクロタイタープレートリーダー（iMark社製BIO RAD)を用いてプレートを読み取った。結果を図３に示す。

０．１ｍｇ／ｍｌのＰＩ並びに３０μＭのＤＨＡ、ＥＰＡ又はＡＡを含む培地で培養されたNeuro2a細胞の細胞新生（図３の右側の３本のバー）は、コントロール培地、０．１ｍｇ／ｍｌのＰＩを含む培地、３０μＭのＤＨＡを含む培地、３０μＭのＥＰＡを含む培地、３０μＭのＡＡを含む培地それぞれで培養されたNeuro2a細胞の細胞新生（図３の左側の５本のバー）より多かった。特にＰＩ及びＡＡを含む培地で培養されたNeuro2a細胞の細胞新生は多かった。
上記される通り、神経細胞の細胞新生に対する、ＰＩと上記３つの脂肪酸のいずれか１つの併用による相乗効果が示された。特にＰＩとＡＡの併用が最も高い値を示した。前述の通り、一般的に神経系細胞にはＰＩにＡＡが多く結合していることから、併用添加により細胞内でＡＡ－ＰＩの産生が促進され、BrdU陽性細胞が増加し、神経新生が促進されたと考えられる。
前述のようにＤＨＡなどは遊離脂肪酸の状態ではＢＢＢの通過性が悪く、ＡＡも専用の輸送体が見出されていない。よって、ＰＩと組み合わせることにより短期にこれらの脂肪酸の脳への取り込みを促進できると考えられる。

Claims

ホスファチジルイノシトール含有素材と、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸及びアラキドン酸からなる群から選ばれた少なくとも１種とを有効成分として含有することを特徴とする脳機能活性化組成物。
神経細胞の軸索及び樹状突起の伸長、並びに神経細胞新生作用を有する、請求項１記載の脳機能活性化組成物。
ホスファチジルイノシトール含有素材と、アラキドン酸とを有効成分として含有する、請求項１記載の脳機能活性化組成物。
前記ホスファチジルイノシトール含有素材は、大豆由来である、請求項１記載の脳機能活性化組成物。
前記ホスファチジルイノシトール含有素材は、大豆リン脂質の酵素処理物であって、ホスファチジルイノシトールの含有量が４０質量％以上であり、且つ、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸からなる群からなる群から選ばれた少なくとも１種のリン脂質を含む該素材である、請求項１記載の脳機能活性化組成物。
飲食品、食品添加物、医薬品、サプリメント、又は動物飼料の形態である、請求項１～５のいずれか１つに記載の脳機能活性化組成物。