JP2023156458A - 新規足場ｈｉｖ－１ワクチン免疫原 - Google Patents

新規足場ｈｉｖ－１ワクチン免疫原 Download PDF

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Abstract

【課題】新規足場ＨＩＶ－１ワクチン免疫原を提供する。【解決手段】足場免疫原のいくつかは、ナノ粒子サブユニットのＮ末端に結合された可溶性ｇｐ１４０三量体と、短いペプチドスペーサーを介してナノ粒子サブユニットのＣ末端に融合されたＴヘルパーエピトープとを含む。本発明のいくつかの他の免疫原は、Ｔヘルパーエピトープである短いペプチドスペーサーを介して安定なナノ粒子に結合された可溶性ｇｐ１４０三量体タンパク質を含む。足場免疫原のいくつかは、Ｉ３－０１タンパク質、Ｅ２ｐ、またはタンパク質１ＶＬＷの変異体によって形成されたナノ粒子プラットフォーム上に提示されるｇｐ１４０三量体免疫原を含む。本発明はさらに、ＨＩＶ感染を予防または治療するための足場ＨＩＶ－１ワクチン免疫原を使用する方法を提供する。【選択図】図１－１

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、米国仮特許出願第６２／５８０，０３８号（２０１７年１１月１日出願
；現在係属中）に対する優先権の利益を主張する。優先出願の完全な開示は、その全体が
あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
政府支援の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された助成金番号ＡＩ１２９６９８、ＡＩ
１２５０７８およびＡＩ１２４３３７、ならびに米国エネルギー省によって付与された助
成金番号ＤＥ－ＡＣ０２－７６Ｆ００５１５の下、政府の支援を受けて行われた。政府は
本発明に一定の権利を有する。
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の主
な原因である。ＨＩＶ－１は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＪおよびＫなどのいく
つかの異なるクレードに分けることができ、これらは世界中で罹患率が異なる。各クレー
ドは、遺伝的類似性に基づいてグループ化されたＨＩＶ－１の異なる株から構成される。
ＨＩＶ－１のエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）は、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）のエピ
トープを有し、ワクチン設計の唯一の標的である。切断され成熟したＥｎｖは、各々が（
共）受容体結合タンパク質ｇｐ１２０と、ウイルス膜に三量体スパイクを固定し、細胞時
に融合過程を促進する膜貫通タンパク質ｇｐ４１とを含む、ヘテロ二量体の準安定三量体
としてＨＩＶ‐１ビリオン表面に提示される。不安定な性質、および表面グリカンの密な
層のため、Ｅｎｖの構造決定は長い間困難であり、三量体に基づくワクチンへの取り組み
を妨げてきた。
天然様Ｅｎｖ三量体は、近年、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４三量体によって達成さ
れた有望な成功のため、望ましいワクチンプラットフォームと考えられている。ＳＯＳＩ
Ｐに加えて、一本鎖ｇｐ１４０（ｓｃ‐ｇｐ１４０）三量体、天然柔軟性結合（ＮＦＬ）
三量体（ｎａｔｉｖｅ ｆｌｅｘｉｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ（ＮＦＬ）ｔｒｉｍｅｒ）およ
び未切断融合前最適化（ＵＦＯ）三量体（ｕｎｃｌｅａｖｅｄ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ－ｏ
ｐｔｉｍｉｚｅｄ（ＵＦＯ）ｔｒｉｍｅｒ）など、天然様Ｅｎｖ三量体を生成した他の三
量体設計プラットフォームも提案された。ただし、粒子表面に抗原の密なアレイを提示し
、ワクチン接種時に強力で長期間持続する免疫応答を誘発するサブユニットワクチンは、
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）よりも免疫原性が低いことが多いため、ｇｐ１４０三量体はＨ
ＩＶ‐１ワクチンの最適な型ではない可能性がある。
ｂＮＡｂ誘発におけるＶＬＰワクチンの利点に対する認識の高まりにもかかわらず、天
然様三量体を提示する担体としてのナノ粒子の有用性はＨＩＶ‐１ワクチン開発では厳密
には検討されていない。安全で効果的なＨＩＶ－１ワクチンに対する未だ満たされていな
い医学的必要性が残っている。本発明は、当技術分野におけるこの必要性および他の必要
性に対処する。
一態様では、本発明は、ＨＩＶ－１ワクチン免疫原を提供する。本発明の新規ＨＩＶ－
１ワクチン免疫原は、自己集合ナノ粒子上に提示されるＨＩＶ－１ Ｅｎｖ由来三量体タ
ンパク質と、Ｔヘルパーエピトープ配列とを含む。いくつかの実施形態では、Ｔヘルパー
エピトープは、ナノ粒子サブユニットのＮ末端にＨＩＶ－１三量体タンパク質サブユニッ
トのＣ末端を結合する。いくつかの他の実施形態では、Ｔヘルパーエピトープ配列がナノ
粒子サブユニットのＣ末端に融合されるのに対して、ＨＩＶ－１三量体タンパク質のＣ末
端がナノ粒子サブユニットのＮ末端に融合される。後者の実施形態のいくつかでは、短い
ペプチドスペーサーを使用して、ナノ粒子サブユニットにＴヘルパーエピトープを融合す
る。これにより、ナノ粒子内部の疎水性コアの形成が可能になり、これは、ナノ粒子構造
を安定化させ、融合免疫原のＴ細胞認識を促進するように機能する。これらの実施形態の
いくつかでは、使用される短いペプチドスペーサーは、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号４
）もしくはＧＳＧＳＧ（配列番号１９）の１～５個のタンデム反復、または本質的に構造
的に柔軟な任意の他のペプチド配列であり得る。これらの実施形態のいくつかでは、追加
の短いペプチドセグメントまたはスペーサーを使用して、ナノ粒子サブユニットのＮ末端
、例えば、１Ｇリンカー、または本明細書に記載の他の短いペプチドスペーサーのいずれ
かにＨＩＶ－１タンパク質を融合することができる。いくつかの実施形態では、Ｔヘルパ
ーエピトープ配列は、配列番号１～３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、その保存
的に改変された変異体または実質的に同一の配列を含む。
典型的には、ＨＩＶ－１ワクチン免疫原の自己集合ナノ粒子は、三量体タンパク質配列
を用いて生成される。いくつかの実施形態では、自己集合ナノ粒子のサブユニットは、（
１）配列番号１８に示されるポリペプチド、その保存的に改変された変異体もしくは実質
的に同一の配列、（２）配列番号５～１７のいずれか１つに示されるポリペプチド、その
保存的に改変された変異体もしくは実質的に同一の配列、（３）Ｅ２ｐまたは（４）フェ
リチンである。
様々な実施形態では、本発明のワクチン免疫原中のＨＩＶ－１ Ｅｎｖ由来三量体タン
パク質は、ｇｐ１４０三量体である。いくつかの実施形態では、使用されるＨＩＶ－１
Ｅｎｖ由来三量体タンパク質は、未切断融合前最適化（ＵＦＯ）ｇｐ１４０三量体である
。これらの実施形態のいくつかでは、ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体は、ＨＩＶ－１株ＢＧ５
０５由来の改変されたｇｐ４１ＥＣＴＯドメインを含むキメラ三量体である。本発明のい
くつかのＨＩＶ－１ワクチン免疫原は、ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体であるＨＩＶ－１ Ｅ
ｎｖ由来三量体と、配列番号５～１８のいずれか１つに示されるサブユニット配列を用い
て生成される自己集合ナノ粒子と、配列番号１に示される配列を含むＴヘルパーエピトー
プとを含む。
別の態様では、本発明は、配列番号５～１８のいずれか１つに示されるサブユニットポ
リペプチド、その保存的に改変された変異体または実質的に同一の配列により形成される
自己集合ナノ粒子上に提示されるＨＩＶ－１ Ｅｎｖ由来三量体タンパク質を含むＨＩＶ
－１ワクチン免疫原を提供する。いくつかの実施形態では、使用されるＨＩＶ－１ Ｅｎ
ｖ由来三量体タンパク質は、未切断融合前最適化（ＵＦＯ）ｇｐ１４０三量体である。こ
れらの実施形態のいくつかでは、ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体は、ＨＩＶ－１株ＢＧ５０５
由来の改変されたｇｐ４１ＥＣＴＯドメインを含むキメラ三量体である。いくつかの実施
形態では、ＨＩＶ－１ワクチン免疫原中のＨＩＶ－１三量体タンパク質は、そのＣ末端で
、リンカー配列を介してナノ粒子のＮ末端に結合される。いくつかの他の実施形態では、
リンカー配列は、短いペプチドスペーサーを介してナノ粒子サブユニットのＣ末端に融合
されて、ナノ粒子内部に疎水性コアを形成するのに対して、ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体サ
ブユニットは、ナノ粒子サブユニットのＮ末端に融合される。これは、ナノ粒子構造を安
定化させ、三量体免疫原のＴ細胞認識を促進するように機能する。これらの実施形態のい
くつかでは、使用される短いペプチドスペーサーは、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号４）
、ＧＳＧＳＧ（配列番号１９）、または本質的に構造的に柔軟な任意の他のペプチドであ
り得る。様々な実施形態では、使用されるリンカー配列は、Ｔヘルパーエピトープ配列ま
たはグリシン－セリンリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、配列
番号１～３のいずれか１つに示されるペプチド配列、その保存的に改変された変異体また
は実質的に同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳ（
配列番号４）またはＧＳＧＳＧ（配列番号１９）の１～５個のタンデム反復（例えば、１
または２個の反復）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に例示されるように、追
加の短いペプチドスペーサーまたはセグメントを使用して、ナノ粒子サブユニットのＮ末
端にＨＩＶ－１タンパク質を融合することができる。
関連する態様では、本発明は、本明細書に記載の新規足場ＨＩＶ－１ワクチン免疫原の
うちの１つを含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容
される担体も含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物はアジュバントをさらに含
有する。別の関連する態様では、本発明は、本明細書に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫原
をコードする単離または組換えポリヌクレオチドと、そのようなポリヌクレオチド配列を
有するクローニングおよび発現ベクターと、核酸またはベクターが導入されているか組み
込まれている宿主細胞とを提供する。
別の態様では、本発明は、対象のＨＩＶ－１感染を予防するか、対象にＨＩＶ－１に対
する免疫応答を誘発する方法を提供する。これらの方法は、本明細書に記載の新規足場Ｈ
ＩＶ－１ワクチン免疫原のうちの１つの治療有効量を対象に投与することを伴う。典型的
には、ＨＩＶ－１ワクチン免疫原は、医薬組成物を介して対象に投与される。いくつかの
実施形態では、投与されるＨＩＶ－１ワクチン免疫原は、ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体と、
配列番号１８に示されるサブユニット配列を用いて生成された自己集合ナノ粒子と、配列
番号１に示されるＴヘルパーエピトープ配列とを含む。これらの実施形態では、Ｔヘルパ
ーエピトープ配列は、ナノ粒子サブユニットのＮ末端にＵＦＯ ｇｐ１４０三量体をその
Ｃ末端で共有結合するように機能する。あるいは、Ｔヘルパーエピトープ配列は、短いペ
プチドスペーサーを介してナノ粒子サブユニットのＣ末端に融合されるのに対して、ＵＦ
Ｏ ｇｐ１４０三量体サブユニットは、ナノ粒子サブユニットのＮ末端に融合される。
別の態様では、本発明は、対象のＨＩＶ－１感染を治療するか、対象にＨＩＶ－１に対
する免疫応答を誘発する方法を提供する。概方法は、本明細書に記載の治療有効量のＨＩ
Ｖ－１ワクチン免疫原を含有する医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実
施形態では、投与されるＨＩＶ－１ワクチン免疫原は、ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体と、配
列番号１８に示されるサブユニット配列を用いて生成された自己集合ナノ粒子と、配列番
号１に示されるＴヘルパーエピトープ配列とを含む。これらの方法では、Ｔヘルパーエピ
トープ配列は、ナノ粒子サブユニットのＮ末端にＵＦＯ ｇｐ１４０三量体をそのＣ末端
で共有結合するように機能する。あるいは、Ｔヘルパーエピトープ配列は、短いペプチド
スペーサーを介してナノ粒子サブユニットのＣ末端に融合されるのに対して、ＵＦＯ ｇ
ｐ１４０三量体サブユニットは、ナノ粒子サブユニットのＮ末端に融合される。
本発明の性質および利点のさらなる理解は、明細書の残りの部分および特許請求の範囲
を参照することによって実現され得る。
多様なＵＦＯ２－ＢＧ三量体と、Ｔヘルプシグナルが組み込まれたＩ３－０１ベースｇｐ１４０ナノ粒子とを提示するフェリチンナノ粒子を示す。（Ａ）ｇｐ１２０、ＵＦＯ設計のＢＧ５０５ ｇｐ４１ＥＣＴＯ、およびｇｐ １４０‐ＦＲ画像上で点線によって囲まれ、矢印により表示されたフェリチンを伴うＵＦＯ２‐ＢＧ ｇｐ１４０‐フェリチン（ＦＲ）ナノ粒子の表面モデル。（Ｂ）シングルステップ２Ｇ１２抗体アフィニティー精製後の８つのＵＦＯ２－ＢＧ－ＦＲナノ粒子のＢＮ－ＰＡＧＥ。（Ｃ）５つの代表的なＵＦＯ２－ＢＧ－ＦＲナノ粒子のネガティブ染色ＥＭから導き出された無参照２Ｄクラス平均。（Ｄ）６つのｂＮＡｂおよび４つの非ＮＡｂの小さなパネルに対する５つの代表的なＵＦＯ２－ＢＧ－ＦＲナノ粒子の抗原プロファイル。６つの濃度（２倍希釈により３５ｎＭから開始）の抗原滴定系列を使用して、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６からセンサーグラムを取得した。最高濃度でのピーク値をマトリックスに要約し、６つのｂＮＡｂおよび４つの非ＮＡｂがそれぞれ上下のパネルに示されている。灰色の濃淡の強度が高いほど、Ｏｃｔｅｔにより測定された結合シグナルが大きいことを示す。（Ｅ）Ｉ３－０１ナノ粒子（薄い灰色）の表面モデルを左に示す。前面の５回軸を囲むサブユニットは濃い灰色で強調表示され、３回軸を形成する３つのサブユニットは黒い点線の三角形で示される。３回軸を囲む３つのＩ３－０１サブユニットのＮ末端間の間隔（上面図）と、柔軟なリンカーによる３つのＩ３－０１サブユニットへのｇｐ１４０三量体の固定（黒い点線により示される）とを中央に示す。ｇｐ１４０およびＴヘルパーエピトープの両方を含むＩ３－０１ナノ粒子構築物の概略図を右に示し、このような３つのＴヘルパーエピトープ、ＰＡＤＲＥ、ＤおよびＴｐＤ（それぞれ配列番号１～３）について配列を列挙する。（Ｆ）リンカーとして異なるＴヘルパーエピトープを有するＨＲ１再設計ＢＧ５０５ ｇｐ１４０三量体を提示する３つのＩ３－０１ナノ粒子のＳＥＣプロファイル。（Ｇ）シングルステップ２Ｇ１２アフィニティー抗体精製後の上記の３つのＩ３－０１ナノ粒子のＢＮ－ＰＡＧＥ。（Ｈ）リンカーとして使用されるＰＡＤＲＥを有するＨＲ１再設計ＢＧ５０５ ｇｐ１４０三量体を提示するＩ３－０１ナノ粒子のネガティブ染色ＥＭから導き出された無参照２Ｄクラス平均。（Ｉ）６つのｂＮＡｂおよび４つの非ＮＡｂの小さなパネルに対するｇｐ１４０－ＰＡＤＲＥ－Ｉ３－０１ナノ粒子の抗原プロファイル。６つの濃度（２倍希釈により１４ｎＭから開始）の抗原滴定系列を使用して、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６からセンサーグラムを取得した。右側のＰＧＴ１５１結合プロファイルの隣に、１０の抗体プロファイルの各々の上から下までの６つのラインにそれぞれ対応する６つの抗原濃度を示す。 三量体提示ナノ粒子による効果的なＢ細胞活性化を示す。（Ａ）ＰＧＴ１４５、（Ｂ）ＰＧＴ１２１および（Ｃ）ＶＲＣ０１受容体を運ぶＢ細胞トランスフェクタントにおけるＣａ２＋動員。１０μｇ ｍｌ－１の濃度の抗ＢＣＲ抗体または示された抗原（抗ヒトＩｇ κ鎖Ｆ（ａｂ’）２；抗マウスＩｇＭ；クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｂ／ＣもしくはＡ／Ｅ株に由来するＵＦＯ２－ＢＧ－ＦＲナノ粒子、またはｇｐ４１ＥＣＴＯ内に再設計されたＨＲ１ベンドを含むＢＧ５０５ ｇｐ１４０－ＰＡＤＲＥ－Ｉ３－０１ナノ粒子）により、ドキシサイクリン誘導型のｂＮＡｂ Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現するＷＥＨＩ２３１細胞を刺激した。 マウス免疫化における三量体およびナノ粒子に対する初期中和抗体反応を示す。（Ａ）マウス免疫化プロトコルの概略図を左に示し、製剤化および免疫化の主要パラメーターを中央に、血清ＩｇＧ精製プロトコルを右に列挙する。（Ｂ）ＢＧ５０５三量体に基づく免疫原の試験、ならびに３つのＨＩＶ‐１抗原（ＢＧ５０５ ＵＦＯ三量体、Ｎ３３２足場を提示するフェリチンナノ粒子（１ＧＵＴ＿Ａ＿ＥＳ‐ＦＲ）または別のＮ３３２足場を提示するＩ３‐０１ナノ粒子（１ＫＩＧ＿Ｌ＿ＥＳ‐２‐Ｉ３‐０１）、およびクレード‐Ｃ Ｖ１Ｖ２‐フェリチンナノ粒子（Ｖ１Ｖ２‐ＦＲ））に対する精製マウス血清ＩｇＧのＥＬＩＳＡ結合。最も高いＯＤ４５０値が０．１未満である場合、または曖昧なデータフィッティングの場合を除いて、全ＥＬＩＳＡプロットについてＥＣ５０値を表示する。（Ｃ）精製マウス血清ＩｇＧによるＨＩＶ－１中和。ＩＣ５０値は灰色の濃淡で示す。灰色の濃淡の強度が高いほど、中和が強力であることを示す。（Ｄ）足場三量体群（Ｓ１Ｇ５）から得られた、群複合マウス血清ＩｇＧの中和プロファイル。（Ｅ）フェリチンナノ粒子群（Ｓ２Ｇ１）から得られた、群複合マウス血清ＩｇＧおよびマウスＡ血清ＩｇＧの中和プロファイル。（Ｆ）Ｉ３－０１ナノ粒子群（Ｓ２Ｇ５）から得られた、群複合マウス血清ＩｇＧ、マウスＡおよびマウスＤ血清ＩｇＧの中和プロファイル。比較のためにＭＬＶを含めて、２つのＨＩＶ‐１偽ウイルス、クレードＡ ｔｉｅｒ‐２ ＢＧ５０５およびクレードＢ ｔｉｅｒ‐１ ＳＦ１６２を試験した。群複合マウス血清ＩｇＧの中和プロファイルの隣に、足場ｇｐ１４０三量体、フェリチンナノ粒子およびＩ３‐０１ナノ粒子の構造モデルを示す。 ナノ粒子サブユニットのＣ末端に融合されたＴヘルパーエピトープを有するＨＩＶ－１ ｇｐ１４０三量体提示ナノ粒子の設計概念、ＳＥＣプロファイルおよびネガティブ染色ＥＭ画像を示す。（Ａ）ナノ粒子サブユニットのＣ末端に融合された全反応性（ｐａｎ－ｒｅａｃｔｉｖｅ）Ｔヘルパーエピトープを有するＥ２ｐおよびＩ３－０１ナノ粒子設計の概略図。（Ｂ）２Ｇ１２抗体アフィニティーカラムを使用して精製した後、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラムから得られたＢＧ５０５ ｇｐ１４０三量体提示Ｅ２ｐおよびＩ３－０１ナノ粒子のＳＥＣプロファイル。（Ｃ）ネガティブ染色ＥＭから得られたＢＧ５０５ ｇｐ１４０三量体提示Ｅ２ｐおよびＩ３－０１ナノ粒子の生の顕微鏡写真。
Ｉ．概要
本発明は、本発明者らによる新規ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０ナノ粒子免疫原の開発に一部
基づいている。本明細書の実施例に詳述されるように、本発明者らは、ｇｐ １４０と提
示ナノ粒子足場との間のリンカーとして作用するだけでなく、堅牢なＴ細胞応答を誘発し
、ｂＮＡｂに向けてＢ細胞の発達を導くための組み込まれたＴヘルプシグナルとしても作
用するＴヘルパーエピトープを利用した。本発明者らはさらに、以前は利用されなかった
タンパク質（１ＶＬＷ）を検討して、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０三量体の提示に、安定なナ
ノ粒子足場を提供した。様々な足場ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０免疫原は、アフィニティーカ
ラムおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製すると、優れた純度および均一性
を示す。本明細書に記載の新規ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０ナノ粒子は、ｂＮＡｂおよび非Ｎ
Ａｂを用いて評価すると、他の公知のＨＩＶ－１ ｇｐ１４０ナノ粒子では観察されなか
った強力なＰＧ１６結合を有する極めて優れた抗原プロファイルを示す。さらに例示とし
て、マウスを免疫し、マウスから単離されたＩｇＧのＨＩＶ－１中和活性を評価すること
によって、ＢＧ５０５ ｇｐ１４０三量体を提示するナノ粒子の免疫原性を検討した。本
明細書に開示される２つのＨＩＶ－１ ｇｐ１４０ナノ粒子（Ｓ２Ｇ５およびＳ２Ｇ６）
、ならびに対照ＨＩＶ－１免疫原（足場ｇｐ１４０．６８１三量体（Ｓ１Ｇ５）およびフ
ェリチンナノ粒子（Ｓ２Ｇ１））については、自己ｔｉｅｒ－２ ＢＧ５０５．Ｎ３３２
ＨＩＶ－１ウイルスの中和が観察された。重要なことに、本明細書に記載の新規ＨＩＶ
－１ ｇｐ１４０ナノ粒子免疫原は、免疫化のわずか８週間後にｔｉｅｒ－２ ＮＡｂの
急速な発現を示すＩＣ５０値をもたらし、バランスのとれたＴおよびＢ細胞応答を示す、
これまでに同定された最も優れたＨＩＶ－１ワクチン候補を提示した。
したがって、本発明は、本明細書に例示されるように、Ｔヘルパーエピトープを有する
新規足場ＨＩＶ－１ワクチン免疫原を提供する。本発明では、１ＶＬＷ変異体により形成
された安定なナノ粒子を含む足場ＨＩＶ－１ワクチン免疫原も提供される。本発明はさら
に、ＨＩＶ－１感染の治療または予防に対するこれらの新規足場ＨＩＶ－１免疫原の治療
用途および予防用途を提供する。
本明細書で別段の指定がない限り、本発明のワクチン免疫原、コードポリヌクレオチド
、発現ベクターおよび宿主細胞、ならびに関連する治療用途はいずれも、本明細書に例示
される手順または当技術分野で周知のルーチンに実施される方法に従って生成または実施
することができる。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍ
ｅ ２８９：Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊ Ｎ
Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｍ Ｉ Ｓｉｍｏｎ，Ｇ Ｂ Ｆｉｅｌｄｓ（Ｅｄｉｔｏｒｓ），Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９７）（ＩＳＢＮ－１３：９
７８－０１２１８２１９０６）；米国特許第４，９６５，３４３号および米国特許第５，
８４９，９５４号；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（３ｒｄ ｅｄ．，２０００）；Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．
，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（ｒｉｎｇｂｏｕ ｅｄ．，２００３）；Ｄａ
ｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８６）；またはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
Ｖｏｌ １５２，Ｓ Ｌ Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ａ Ｒ Ｋｉｍｍｅｒｌ Ｅｄｓ，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ（１９８７）；Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ）
（Ｊｏｈｎ Ｅ Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ．ａｌ．，ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ（ＣＰＣＢ）（Ｊｕａｎ Ｓ Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ ｅｔ．ａｌ．ｅｄ．，Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）、ならびにＣｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａ
ｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｂｙ Ｒ Ｉａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ；５
ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ５７，Ｊｅｎｎ
ｉｅ Ｐ Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｂａｒｎｅｓ ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９８）を参照されたい。以下の
節は、本発明の組成物および方法を実施するための追加的指針を提供する。
ＩＩ．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本
発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献
は、本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（Ｅｄ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ ｅｄ，１９
９２）；Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎ
ｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ），Ｏｘ
ｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄ，２０００）；Ｅ
ｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍ
ａｒ（Ｅｄ），Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ Ｌｔｄ（２００２）；
Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ＆Ｓｏｎｓ（３ｒｄ ｅｄ，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（Ｅｄ），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔ ｅｄ，１９９９）；Ｄｉｃｔ
ｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ
（Ｅｄ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎ
ａｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ａｎａｎｄ
ａｎｄ（Ｅｄｓ），Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ Ｌｔｄ（２００２
）；およびＡ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐａｐｅ
ｒｂａｃｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｈｉｎｅ（Ｅｄｓ），Ｏｘ
ｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈ ｅｄ，２０００）。本発明に特
に適用されるこれらの用語のいくつかのさらなる明確化が本明細書に提供される。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそう
でないことを明確に示さない限り、単数および複数の両方を指す。例えば、「Ｅｎｖ由来
三量体」は、単数または複数のＥｎｖ由来三量体分子の両方を指すことができ、語句「少
なくとも１つのＥｎｖ由来三量体」と等価であると考えることができる。
特に明記しない限り、用語「抗原」および「免疫原」は、対象に免疫応答を誘発するこ
とができる物質、典型的にはタンパク質を指すために区別なく使用される。この用語はま
た、対象に一度投与されると（直接的に、またはタンパク質をコードするヌクレオチド配
列もしくはベクターを対象に投与することにより）、そのタンパク質に対して向けられる
液性および／または細胞型の免疫応答を引き起こすことができるという意味で、免疫学的
に活性なタンパク質を指す。したがって、いくつかの実施形態では、用語「免疫原」は、
本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質抗原をコードするポリヌクレオチドを広
く包含することができる。
用語「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。
特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一もしくは本質的に同一の
アミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的
に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与
のタンパク質をコードする。ポリペプチド配列について、「保存的に改変された変異体」
は、保存的アミノ酸置換（類似の電荷を有する側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換され
たアミノ酸残基）を有する変異体を指す。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基
のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（
例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グル
タミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、
スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベー
タ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、
チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げら
れる。
エピトープとは抗原決定基を指す。これらは、特異的な免疫応答を誘発するように抗原
性である分子上の特定の化学基またはペプチド配列であり、例えば、エピトープは、Ｂ細
胞および／またはＴ細胞が応答する抗原の領域である。エピトープは、タンパク質の三次
フォールディングによって並置された連続アミノ酸または非連続アミノ酸の両方から形成
され得る。
ＡＩＤＳなどの状態または疾患の徴候または症状を低減または排除するなど、望ましい
応答をもたらすのに十分なワクチンまたは他の薬剤の有効量。例えば、これは、ウイルス
複製を阻害するか、ＨＩＶ－１感染の場合のＴ細胞数の増加などのウイルス感染の表立っ
た症状を測定可能な程度に変化させるのに必要な量であり得る。一般に、この量は、ウイ
ルス（例えばＨＩＶ）の複製または感染性を測定可能な程度に阻害するのに十分である。
対象に投与される場合、ウイルス複製のインビトロ阻害を達成することが示されている（
例えば、リンパ球中の）標的組織濃度を達成するであろう投与量が一般に使用される。い
くつかの例では、「有効量」は、例えばＨＩＶを治療するために、障害または疾患のいず
れかの１つ以上の症状および／または根本的な原因を治療（予防を含む）する量である。
一例では、有効量とは治療有効量である。一例では、有効量は、ＡＩＤＳに関連する１つ
以上の徴候または症状など、特定の疾患または状態の１つ以上の徴候または症状が発症す
るのを予防する量である。
フェリチンは、あらゆる動物、細菌および植物に見出される球状タンパク質である。フ
ェリチンは、主に、水和鉄イオンおよびプロトンのミネラル化コアへのおよびミネラル化
コアからの輸送を通して多核Ｆｅ（ＩＩＩ）２Ｏ３形成の速度および位置を制御するよう
に作用する。球状形態のフェリチンは、約１７～２０ｋＤａの分子量を有するポリペプチ
ドである単量体サブユニットタンパク質（単量体フェリチンサブユニットとも呼ばれる）
から構成される。
本明細書で使用される場合、融合タンパク質とは、ペプチド結合を介して互いに連結さ
れて単一のタンパク質を形成している少なくとも２つの無関係のタンパク質由来のアミノ
酸配列を含む組換えタンパク質である。無関係のアミノ酸配列は、互いに直接連結され得
るか、リンカー配列を使用して連結され得る。本明細書で使用される場合、タンパク質の
アミノ酸配列がそれらの（１または複数の）天然環境（例えば、細胞内）ではペプチド結
合を介して互いに連結された状態で通常見出されなければ、タンパク質は無関係である。
例えば、フェリチンを構成する単量体サブユニットのアミノ酸配列、およびＨＩＶ－１
ｇｐ１２０またはｇｐ４１糖タンパク質のアミノ酸配列は、通常、ペプチド結合を介して
互いに連結された状態では見出されない。
ＨＩＶ－１エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）は、ｇｐ１６０と呼ばれる、８４５～８
７０アミノ酸の比較的長い前駆体タンパク質として最初に合成される。ｇｐ１６０はホモ
三量体を形成し、ゴルジ体内でグリコシル化を受ける。インビボでは、ｇｐ１６０糖タン
パク質は、エンドタンパク質分解によって成熟エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０およ
びｇｐ４１に処理され、成熟エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０およびｇｐ４１は、ウ
イルスの表面上で複合体として非共有結合によって互いに結合する。ｇｐ１２０表面タン
パク質は、ＨＩＶの主要受容体であるヒトＣＤ４に対する、ならびにケモカイン受容体Ｃ
ＣＲ５およびＣＸＣＲ４などの融合共受容体と相互作用するドメインに対する高親和性結
合部位を含む。ｇｐ４１タンパク質はウイルス膜にわたって広がり、そのアミノ末端に、
ウイルス膜と細胞膜との融合に重要なアミノ酸配列を含む。ＨＩＶ－１エンベロープ糖タ
ンパク質複合体の天然融合許容形態は、３つのｇｐ１２０サブユニットおよび３つのｇｐ
４１サブユニットから構成される三量体構造である。受容体結合（ＣＤ４および共受容体
）部位はｇｐ１２０部分に位置するのに対して、融合ペプチドはｇｐ４１成分に位置する
。野生型ｇｐ１６０ポリペプチドの典型的な配列は、例えば、アクセッション番号ＡＡＢ
０５６０４およびＡＡＤ１２１４２の下にＧｅｎＢａｎｋに示されている。
ｇｐ１４０とは、ｇｐ１２０および全ｇｐ４１外部ドメインをいずれも含むＨＩＶエン
ベロープタンパク質のオリゴマー形態を指す。本明細書で使用される場合、ＨＩＶ－１
ｇｐ１４０三量体免疫原は、典型的には、ｇｐ１４０ドメインと、ｇｐ１４０の改変また
は再設計された外部ドメイン（ｇｐ４１ＥＣＴＯ）とを含む。
ｇｐ１２０は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のエンベロープタンパク質である。ｇ
ｐ１２０は、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質複合体の外部表面露出ドメインの大部分を
含み、細胞ＣＤ４受容体および細胞ケモカイン受容体（ＣＣＲ５など）の両方に結合する
のはｇｐ１２０である。成熟ｇｐ１２０野生型ポリペプチドは、一次配列内に約５００個
のアミノ酸を有する。Ｇｐ１２０は高度にＮ－グリコシル化されており、１２０ｋＤの見
かけの分子量を有する。このポリペプチドは、５つの保存領域（Ｃ１～０５）および５つ
の高可変性領域（Ｖ１～Ｖ５）から構成される。ｇｐ１２０糖タンパク質は、その三次構
造では、３つの主要構造ドメイン（外部ドメイン、内部ドメインおよび架橋シート）およ
び可変ループから構成される。例えば、Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９
３，７０５－７１１，１９９８およびＫｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９３
，６４９－５９，１９９８を参照されたい。内部ドメインはｇｐ４１エンベロープ糖タン
パク質と相互作用すると考えられているのに対して、外部ドメインは、集合したエンベロ
ープ糖タンパク質三量体上に露出している。
ｇｐ１２０の可変領域１および可変領域２（Ｖ１／Ｖ２ドメイン）は、ＨＩＶ－１の最
も可変性の部分のうちの２つ（Ｖ１ループおよびＶ２ループ）を含む約５０～９０残基か
ら構成され、Ｖ１／Ｖ２ドメインの１０残基のうちの１つはＮ－グリコシル化されている
。
ｇｐ４１は、前駆体ＨＩＶエンベロープタンパク質のタンパク質分解産物である。ｇｐ
４１は、Ｎ末端融合ペプチド（ＦＰ）、膜貫通ドメイン、および融合ペプチドと膜貫通ド
メインとを結合する外部ドメインを含む。ｇｐ４１は三量体立体配置のままであり、非共
有結合的にｇｐ１２０と相互作用する。例示的なｇｐ４１のアミノ酸配列は、アクセッシ
ョン番号ＣＡＤ２０９７５の下にＧｅｎＢａｎｋに示されている。
ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４ ｇｐ１４０は、クレードＡ株ＢＧ５０５由来のｇｐ
１４０三量体を用いて開発されたＨＩＶ－１ Ｅｎｖ免疫原である。これは、切断された
ｇｐ１２０とｇｐ４１ＥＣＴＯとの間に、操作されたジスルフィド結合（ＳＯＳと呼ばれ
る）による共有結合を含む。さらに、これは、ｇｐ４１融合後コンホメーションを不安定
化させるＩ５５９Ｐ変異（ＩＰと呼ばれる）と、残基６６４に可溶性を改善する膜近位外
部領域（ＭＰＥＲ）のトランケート化とを有する。このＨＩＶ－１免疫原は、極めて優れ
た抗原プロファイルと、天然スパイクの優れた構造擬態とを有する。選別プローブとして
ＳＯＳＩＰ三量体を使用して、新規ｂＮＡｂを同定し、特性評価した。ＳＯＳＩＰの設計
は他のＨＩＶ－１株にも拡張されており、追加的な安定化変異の組込みを可能にしている
。近年、ウサギおよび非ヒト霊長類におけるＳＯＳＩＰ三量体の免疫原性が報告され、ヒ
トのワクチン試験への道が開かれた。
免疫応答とは、刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞または単球などの免疫系細胞の応答を指す
。いくつかの実施形態では、応答は特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。
いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応
答である。いくつかの他の実施形態では、応答はＢ細胞応答であり、特異的抗体の産生を
もたらす。
免疫原性組成物とは、免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスに対して測定可能なＣ
ＴＬ応答を誘発するか、免疫原性ポリペプチドに対して測定可能なＢ細胞応答（抗体の産
生など）を誘発する免疫原性ポリペプチドを含む組成物を指す。
２つ以上の核酸配列間または２つ以上のアミノ酸配列間の配列同一性または類似性は、
その配列間の同一性または類似性に関して表される。配列同一性は同一性の割合として測
定可能であり、割合が高いほど配列の同一性は高くなる。２つの配列が、特定の割合の同
一のアミノ酸残基またはヌクレオチド（すなわち、特定の領域にわたる、または特定され
ない場合、配列全体にわたる６０％の同一性、場合により、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性）を有する場合、比較ウインドウに
わたる最大一致について比較およびアライメントすると、または以下の配列比較アルゴリ
ズムのうちの１つを使用して、もしくは手動アライメントおよび目視検査によって測定さ
れるように領域を指定すると、２つの配列は「実質的に同一」である。同一性は、少なく
とも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の長さの領域にわたって、またはさらに
好ましくは１００～５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２
００もしくはそれ以上のアミノ酸）の長さの領域にわたって存在してもよい。
核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を使用してアラ
イメントされた場合、比較的高い度合の配列同一性／類似性を有する。比較のために配列
をアライメントする方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアライメ
ントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ ２
：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８
：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，
７３：２３７－４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５
１－３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６：
１０８８１－９０，１９８８；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ
．ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８，１５５－６５，１９９２；およびＰｅａ
ｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ Ｍｏｌ Ｂｉｏ ２４：３０７－３１，１９９４に
記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４
０３－１０ １９９０は、配列アライメント法およびホモロジー計算の詳細な考察を提示
している。
用語「対象」は、哺乳動物、例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物として分類される任意
の動物を指す。非ヒト動物の例には、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウ
サギなどが挙げられる。特に明記しない限り、用語「患者」または「対象」は、本明細書
では区別なく使用される。好ましくは、対象はヒトである。
用語「治療する」または「緩和する」は、疾患（例えば、ＨＩＶ感染）の症状、合併症
もしくは生化学的兆候の発生を予防するか遅延させるために対象に化合物もしくは薬剤を
投与すること、症状を緩和すること、または疾患、状態もしくは障害がさらに進行するの
を阻止または阻害することを含む。治療を必要とする対象には、疾患または障害に既に罹
患している対象、および障害を発症するリスクがある対象が含まれる。治療は、予防的抑
制（疾患の発症を防止もしくは遅延するため、またはその臨床的もしくは亜臨床的症状の
発現を防止するため）、または疾患の発現後の症状の治療的抑制もしくは緩和であり得る
。
未切断融合前最適化（ＵＦＯ）三量体とは、ｇｐ１２０タンパク質と、再設計されたｇ
ｐ４１ＥＣＴＯドメインとにより形成され、さらに安定なＨＩＶ－１ ｇｐ１４０三量体
になるＨＩＶ－１ ｇｐ１４０三量体タンパク質を指す。再設計されたｇｐ４１ＥＣＴＯ
ドメインは、プロトタイプＨＩＶ－１株ＢＧ５０５（およびプロトタイプｇｐ１４０三量
体ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ６６４ ｇｐ１４０）に基づいており、野生型ＢＧ５０５ ｇ
ｐ４１ＥＣＴＯ配列に対して１つ以上の改変を含む。これらの改変には、（１）融合前ｇ
ｐ１４０構造を安定化するための比較的短いループ配列によるＨＲ１の２１残基Ｎ末端の
置換（残基５４８～５６８）と、（２）ＧＧＧＧＳ（配列番号４）モチーフのタンデム反
復のような柔軟なリンカー配列によるｇｐ１２０とｇｐ４１との間のフューリン切断部位
の置換（残基５０８～５１１）とが含まれる。いくつかの実施形態では、ＵＦＯ三量体は
、ｇｐ１２０とｇｐ４１との間の操作されたジスルフィド結合および／またはｇｐ４１に
おける安定化変異をさらに含み得る。例えば、ＨＩＶ－１株ＢＧ５０５に基づくＵＦＯ三
量体は、残基Ａ５０１ＣとＴ６０５Ｃの間の操作されたジスルフィド結合および／または
安定化変異Ｉ５５９Ｐを含むことができる。ＵＦＯ三量体の詳細な説明は、例えば、Ｋｏ
ｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ７：１２０４０，２０１６に記載されている。
ＢＧ５０５株配列に基づくＵＦＯ三量体に加えて、操作されたｇｐ４１ＥＣＴＯドメイン
を使用して、多くの異なるＨＩＶ－１株またはサブタイプ由来のｇｐ１２０ポリペプチド
と対合して、「キメラ」ｇｐ１４０三量体を形成することができる。そのようなキメラ三
量体は、本明細書に例示されるように「ＵＦＯ－ＢＧ」または「ＵＦＯ２－ＢＧ」と呼ば
れる。
ワクチンとは、対象に予防的または治療的免疫応答を誘発する医薬組成物を指す。場合
によっては、免疫応答は防御免疫応答である。典型的には、ワクチンは、病原体、例えば
ウイルス性病原体の抗原、または病的状態と相関する細胞成分に対する抗原特異的免疫応
答を誘発する。ワクチンは、ポリヌクレオチド（開示された抗原をコードする核酸など）
、ペプチドもしくはポリペプチド（開示された抗原など）、ウイルス、細胞または１つ以
上の細胞成分を含み得る。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、いくつかのウイルスのいずれかに由来する非複製性ウイ
ルス殻を指す。ＶＬＰは一般に、１つ以上のウイルスタンパク質、例えば、限定するもの
ではないが、キャプシド、コート、殻、表面および／またはエンベロープタンパク質と呼
ばれるタンパク質、またはこれらのタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチドから構成
される。ＶＬＰは、適切な発現系でのタンパク質の組換え発現時に自発的に形成すること
ができる。特定のＶＬＰを生成する方法は、当技術分野で公知である。ウイルスタンパク
質の組換え発現後のＶＬＰの存在は、当技術分野で公知の従来の技術を使用して、例えば
、電子顕微鏡法、生物物理学的特性評価などによって検出することができる。例えば、Ｂ
ａｋｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ６０：１４４５－１４５６およ
びＨａｇｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８：４５０３－４５０
５を参照されたい。例えば、ＶＬＰは密度勾配遠心分離によって単離され得、および／ま
たは特徴的密度バンディングによって同定され得る。あるいは、問題のＶＬＰ調製物のガ
ラス化水性試料に対して低温電子顕微鏡法を実施し、適切な曝露条件下で画像を記録する
ことができる。
ＩＩＩ．新規足場ＨＩＶ－１三量体免疫原
本発明は、三量体ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ由来タンパク質（例えば、ｇｐ１４０三量体）お
よびＴヘルパーまたはリンカー配列を提示または組み込む異種足場を含むＨＩＶ－１免疫
原を提供する。いくつかの実施形態では、異種提示足場は、自己集合ナノ粒子である。い
くつかの他の実施形態では、異種提示足場は、バクテリオファージＱβＶＬＰなどのウイ
ルス様粒子（ＶＬＰ）である。いくつかの実施形態では（本明細書の実施例１に例示され
るように）、三量体ＨＩＶ－１タンパク質のサブユニットは、本明細書に記載のリンカー
配列、例えば、融合免疫原のＴ細胞認識を促進するようにも機能するＴヘルパーエピトー
プポリペプチドを介して、提示足場（例えば、ナノ粒子）のサブユニットのＮ末端に結合
される。いくつかの他の実施形態では（本明細書の実施例７に例示されるように）、ＨＩ
Ｖ－１三量体タンパク質のサブユニットは、提示足場のサブユニットのＮ末端に接続（例
えば、共有結合）され、Ｔヘルパーまたはリンカーエピトープは、提示足場（例えば、ナ
ノ粒子）のサブユニットのＣ末端に融合される。後者の実施形態では、Ｔヘルパーエピト
ープは、短いペプチドスペーサーを介してナノ粒子サブユニットに融合され得る。これに
より、ナノ粒子内部の疎水性コアの形成が可能になり、これは、ナノ粒子構造を安定化さ
せ、融合免疫原のＴ細胞認識を促進するように機能する。様々な実施形態では、短いペプ
チドスペーサーは、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号４）、ＧＳＧＳＧ（配列番号１９）の
１～５個の反復、または本質的に構造的に柔軟な任意のペプチドであり得る。例示として
、５－ａａ ＧＧＧＧＳスペーサーを用いて、Ｅ２ｐおよびＩ３－０１のサブユニットの
Ｃ末端にＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥを融合することができる（実施例７）。短いペ
プチドスペーサーを使用してナノ粒子サブユニットのＣ末端にＴヘルパーエピトープを融
合することに加えて、第２のペプチドスペーサーまたはセグメントを使用して、ナノ粒子
サブユニットのＮ末端にＨＩＶ－１三量体を融合することができる。例えば、ＨＩＶ－１
タンパク質は、例えば、本明細書に例示される単一のグリシン残基（「１Ｇリンカー」）
または１０－ａａ ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２０）スペーサーを介して、提示ナ
ノ粒子サブユニットのＮ末端に融合され得る（実施例７）。
ナノ粒子提示ワクチン組成物に、任意のＥｎｖ由来ＨＩＶ－１三量体タンパク質を使用
することができる。Ｅｎｖ由来三量体タンパク質は、様々なＨＩＶ－１株から得ることが
できる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ＨＩＶ－１ Ｅｎｖに基づく糖タンパク
質またはドメイン、例えば、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０またはＶ１Ｖ２ドメインの天然の三
量体形態を提示する。いくつかの実施形態では、Ｅｎｖ由来三量体は、ＨＩＶ－１株ＢＧ
５０５、例えば、ＢＧ５０５．ＳＯＳＩＰ６６４ ｇｐ１４０三量体に由来する。いくつ
かの実施形態では、ナノ粒子は、改変されたｇｐ１４０三量体免疫原、例えば、Ｋｏｎｇ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ７，１２０４０，２０１６に記載されているＨＲ１
改変ｇｐ１４０三量体（「ＵＦＯ三量体」）を提示する。いくつかの実施形態では、本発
明で使用されるＨＩＶ－１三量体免疫原は、本明細書に例示されるＵＦＯ２－ＢＧ三量体
である。ＵＦＯ２－ＢＧ三量体は、（１）再設計されたＨＲ１ Ｎ末端ベンドと切断部位
リンカー（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ７，１２０４０，２０１６に記
載されている）とを有するＢＧ５０５ ｇｐ４１ドメインと、（２）他の多様なＨＩＶ－
１株またはサブタイプのうちの１つに由来するｇｐ１２０タンパク質とを含むキメラｇｐ
１４０三量体である。ＢＧ５０５株由来の再設計されたｇｐ４１ＥＣＴＯドメインに加え
て、本発明に適したキメラｇｐ１４０三量体中のｇｐ４１ドメインはまた、ＨＩＶ－１配
列データベースに由来するコンセンサスｇｐ４１ＥＣＴＯドメインであり得る。
様々な実施形態では、これらのＨＩＶ－１ Ｅｎｖ由来免疫原のいずれかを提示するナ
ノ粒子は、ナノ粒子のサブユニット（例えば、Ｉ３－０１、１ＶＬＷ由来ポリペプチド配
列またはフェリチンサブユニット）に三量体免疫原を融合することによって構築すること
ができる。これらのナノ粒子に基づくＨＩＶ－１免疫原の抗原性および構造的完全性は、
標準的なアッセイ、例えば、抗体結合アッセイおよびネガティブ染色電子顕微鏡法（ＥＭ
）を介して容易に分析することができる。本明細書に例示されるように、様々な融合分子
はいずれも、Ｅｎｖ由来三量体（例えば、ｇｐ１４０）の免疫原性エピトープを提示する
ナノ粒子に自己集合することができる。これらのナノ粒子は、堅牢な三量体特異的ｂｎＡ
ｂを誘発することによって、広範囲のＨＩＶ－１ウイルスに対する個体のワクチン接種に
有用である。
いくつかの実施形態では、本発明の足場ｇｐ１４０三量体免疫原は、ナノ粒子足場にｇ
ｐ１４０三量体を接続するためのリンカーとして機能するＴヘルパーエピトープを含む。
いくつかの他の実施形態では、Ｔヘルパーエピトープは、短いペプチドスペーサーを介し
てナノ粒子サブユニットのＣ末端に融合され、ナノ粒子足場内部に封入される。これらの
実施形態で使用することができる短いペプチドスペーサーは、例えば、ＧＧＧＧＳ、ＧＳ
ＧＳＧ、または本質的に構造的に柔軟な任意の他のペプチドであり得る。Ｔヘルパーエピ
トープは、足場免疫原の構造要素としての役割に加えて、堅牢なＴ細胞応答を誘発し、ｂ
ＮＡｂに向けてＢ細胞の発達を導くための組み込まれたＴヘルプシグナルも提供する。本
発明の実施には、当技術分野で公知の任意のＴヘルパーエピトープ配列またはペプチドが
使用され得る。それらは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを含み、免疫化時にヘルパーＴ細
胞を効果的に活性化することができる任意のポリペプチド配列を含む。例えば、Ａｌｅｘ
ａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １，７５１－７６１，１９９４；Ａｈｌ
ｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：１６７７－１６８５，２
００１；Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ３２，２８９６－２９０３，２
０１４；Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：
２５５－２６９，２００２；およびＧｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１：２２５－２３２，２０１
４を参照されたい。いくつかの好ましい実施形態では、使用されるＴヘルパーエピトープ
は、一般的なｐａｎ ＤＲエピトープペプチド（ＰＡＤＲＥ）である。これらの実施形態
のいくつかでは、リンカーは、配列ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１）、その保
存的に改変された変異体または実質的に同一（例えば、少なくとも９０％、９５％または
９９％同一）の配列を含む。いくつかの他の実施形態では、使用されるＴヘルパーエピト
ープは、Ｄ ＴヘルパーエピトープＱＳＩＡＬＳＳＬＭＶＡＱＡＩＰ（配列番号２）また
はＴｐＤエピトープＩＬＭＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＰＭＧＬＰＱＳＩＡＬＳＳＬＭＶＡ
Ｑ（配列番号３）である。様々な実施形態では、リンカーは、配列番号２もしくは配列番
号３に示される配列、その実質的に同一（例えば、少なくとも９０％、９５％または９９
％同一）の配列または保存的に置換された配列を含み得る。
上記のように、三量体ＨＩＶ－１タンパク質を提示するための異種足場は、好ましくは
ナノ粒子である。本発明のワクチン組成物を生成する際に、様々なナノ粒子プラットフォ
ームを使用することができる。一般に、本発明に使用されるナノ粒子は、単一のサブユニ
ットの複数のコピーによって形成される必要がある。追加的または代替的に、粒子サブユ
ニットのアミノ末端は３回軸に近接して露出していなければならず、３つのアミノ末端の
間隔は、様々なＨＩＶ－１三量体成分のカルボキシル末端の間隔と厳密に一致していなけ
ればならない。いくつかの好ましい実施形態では、免疫原は、約２０ｎｍ以下の直径（通
常、１２、２４または６０サブユニットから集合した）と粒子表面上の３回軸とを有する
自己集合ナノ粒子を含む。そのようなナノ粒子は、多価ＨＩＶ－１三量体ワクチンを生成
するための好適な粒子プラットフォームを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の足場ｇｐ１４０三量体免疫原は、超安定ナノ粒子足
場を用いて構築される。例えば、自己集合ナノ粒子は、Ｈｓｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ ５３５，１３６－１３９，２０１６に記載されているＩ３－０１タンパク質を用
いて生成することができる。このタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１８に示されて
いる。いくつかの他の実施形態では、超安定ナノ粒子足場は、保存的に改変された変異体
、または実質的に同一（例えば、少なくとも９０％、９５％または９９％同一）の配列を
有するものを含め、Ｈｓｉａ ｅｔ ａｌ．（上記）に記載されているＩ３－０１の変異
体に基づき得る。いくつかの実施形態では、Ｉ３－０１由来ナノ粒子プラットフォームに
ｇｐ１４０三量体を接続するためのリンカー配列は、上記のようにＴヘルパーエピトープ
を含む。いくつかの他の実施形態では、グリシン－セリンポリペプチドが、Ｉ３－０１由
来ナノ粒子プラットフォームにｇｐ１４０三量体を接続するための第２のペプチドスペー
サーとして使用され、Ｔヘルパーエピトープが、短いペプチドスペーサーを介してナノ粒
子サブユニットのＣ末端に融合される。このような構造設計により、ナノ粒子内部に疎水
性コアが作成され、これにより、ナノ粒子表面に提示されるｇｐ１４０三量体のＴ細胞認
識が強化される。様々な実施形態では、ナノ粒子サブユニットのＣ末端にＴヘルパーエピ
トープを結合するための短いペプチドスペーサーは、例えば、ＧＧＧＧＳ、ＧＳＧＳＧ、
または本質的に構造的に柔軟な任意の他のペプチドであり得る。
Ｉ３－０１配列（配列番号１８）：
ＭＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＭＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳ
ＶＥＥＡＫＫＫＡＬＡＶＦＬＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＥＬＳＦＬＫＥ
ＭＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＣＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＣ
ＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦ
ＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡ
ＬＶＫＧＴＰＶＥＶＡＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＣＴＥ
いくつかの実施形態では、本発明の足場ｇｐ１４０三量体免疫原中の超安定ナノ粒子は
、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来の天然ナノ粒
子であるフェリチンを用いて構築される。例えば、足場ｇｐ１４０三量体免疫原は、フェ
リチンに結合されフェリチン上に提示されるＵＦＯ２－ＢＧ三量体を含むことができる。
これらの実施形態のいくつかでは、ＵＦＯ２－ＢＧ三量体は、本明細書に例示されるよう
に、リンカー配列を用いることなくフェリチンサブユニットに直接接続される。いくつか
の他の実施形態では、Ｔヘルパーエピトープまたは単純なグリシン－セリンリンカーなど
のリンカー配列を使用してもよい。これらの実施形態のいくつかでは、短いペプチドスペ
ーサーを介してナノ粒子サブユニットのＣ末端にＴヘルパーエピトープを融合することが
でき、これにより、ナノ粒子足場内に疎水性コアが形成される。本明細書に記載されるよ
うに、これらの実施形態で使用される短いペプチドスペーサーは、例えば、ＧＧＧＧＳ、
ＧＳＧＳＧ、または本質的に構造的に柔軟な任意の他のペプチドであり得る。フェリチン
は、あらゆる動物、細菌および植物に見出される球状タンパク質である。球状形態のフェ
リチンは、約１７～２０ｋＤａの分子量を有するポリペプチドである単量体サブユニット
タンパク質（単量体フェリチンサブユニットとも呼ばれる）から構成される。本発明で使
用される単量体フェリチンサブユニットは、単量体フェリチンサブユニットの自己集合を
球状形態のタンパク質に導くことができる、フェリチンタンパク質の全長の単一ポリペプ
チドまたはその任意の部分である。単量体フェリチンサブユニットが、その表面にＨＩＶ
－１エピトープを提示するナノ粒子に自己集合することができる限り、任意の公知のフェ
リチンタンパク質の単量体フェリチンサブユニット由来のアミノ酸配列を使用して本発明
の融合タンパク質を生成することができる。フェリチンに加えて、本発明はまた、同様の
分子特性を有する他の多くの自己集合ナノ粒子を使用することができる。これらには、例
えば、以下のＰＤＢ ＩＤを有する分子、すなわち、１ＪＩＧ（バチルス・アントラシス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）由来の１２量体Ｄｌｐ－２）、１ＵＶＨ（マ
イコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）
由来の１２量体ＤＰＳ）、２ＹＧＤ（２４量体眼レンズシャペロンαＢ－クリスタリン）
、３ＣＳ０（２４量体ＤｅｇＰ２４）、３ＭＨ６および３ＭＨ７（２４量体ＨｔｒＡプロ
テアーゼ）、３ＰＶ２（１２量体ＨｔｒＡホモログＤｅｇＱ ＷＴ）、４Ａ８Ｃ（Ｅ．コ
リ（Ｅ．Ｃｏｌｉ．）由来の１２量体ＤｅｇＱ）、４Ａ９Ｇ（Ｅ．コリ由来の２４量体Ｄ
ｅｇＱ）、４ＥＶＥ（ヘリコバクターピロリ株ＹＳ２９由来の１２量体ＨＰ－ＮＡＰ）な
らびに４ＧＱＵ（マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の２４量体ＨｉｓＢ）が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の足場ｇｐ１４０三量体免疫原は、本明細書に例示さ
れるように、タンパク質１ＶＬＷ（配列番号５）またはその変異体（配列番号６～１７）
に由来するナノ粒子足場を用いて構築することができる。様々な実施形態では、本発明の
足場ｇｐ１４０免疫原を構築するためのナノ粒子プラットフォームは、保存的に改変され
た変異体であるポリペプチド配列、または配列番号５～１８のいずれか１つの実質的に同
一の配列を用いて生成することができる。いくつかの実施形態では、１ＶＬＷ由来ナノ粒
子プラットフォームにｇｐ１４０三量体を接続するためのリンカー配列は、上記のように
Ｔヘルパーエピトープを含む。いくつかの他の実施形態では、１ＶＬＷ由来ナノ粒子プラ
ットフォームにｇｐ１４０三量体を接続するためのリンカーは、単純なペプチド配列を含
む。例えば、足場免疫原は、グリシン－セリンリンカー、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号
４）またはＧＳＧＳＧ（配列番号１９）の１～５個の反復（例えば、１または２個の反復
）を含むリンカーを用いて構築することができる。いくつかの他の実施形態では、短いペ
プチドスペーサーを介してナノ粒子サブユニットのＣ末端にＴヘルパーエピトープを融合
して、ナノ粒子内部に疎水性コアを形成することができる。様々な実施形態では、使用さ
れる短いペプチドスペーサーは、例えば、ＧＧＧＧＳ、ＧＳＧＳＧ、または本質的に構造
的に柔軟な任意の他のペプチドであり得る。
いくつかの他の実施形態では、ＨＩＶ－１三量体免疫原を提示するためのナノ粒子足場
は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）由来のジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼ（Ｅ２ｐ）の再設計さ
れた変異体である。Ｅ２ｐは、２３．２ｎｍの直径と、粒子表面上の３回軸頂点（ｔｈｒ
ｅｅｆｏｌｄ ｖｅｒｔｉｃｅ）を分離する１２個の大きな開口とを有する熱安定性６０
量体ナノ粒子である。本発明の足場ＨＩＶ－１三量体免疫原を構築するための再設計され
たＥ２ｐ変異体により形成されたナノ粒子は、野生型Ｅ２ｐナノ粒子と比較して安定性が
強化されている。いくつかの実施形態では、上記のＴヘルパーエピトープを含むリンカー
を用いて、Ｅ２ｐナノ粒子にＨＩＶ－１ ｇｐ１４０三量体を接続することができる。い
くつかの他の実施形態では、完全に集合したＥ２ｐナノ粒子が、Ｔヘルパーエピトープに
よって形成された疎水性コアを封入するように、短いペプチドスペーサーを介してＥ２ｐ
サブユニットのＣ末端にＴヘルパーエピトープを融合することができる。疎水性コアはま
た、Ｅ２ｐナノ粒子表面上のｇｐ１４０三量体のＴ細胞認識を強化するように機能する。
Ｅ２ｐおよびＴヘルパーエピトープを結合するための、これらの実施形態に使用するのに
適した短いペプチドスペーサーは、例えば、ＧＧＧＧＳ、ＧＳＧＳＧ、または本質的に構
造的に柔軟な任意の他のペプチドであり得る。
本発明の足場ＨＩＶ－１三量体免疫原は、本明細書に記載のプロトコル（例えば、実施
例１～７）および／または当技術分野で記載されている他の方法、例えば、Ｈｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ７，１２０４１，２０１６；およびＫｏｎｇ ｅｔ ａｌ．
，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ７，１２０４０，２０１６に従って構築することができる。
ＩＶ．ＨＩＶ－１ワクチン免疫原を発現させるためのベクターおよび宿主細胞
本発明は、本明細書に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫原および関連ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列を有する発現ベクター、ならびにポ
リヌクレオチドまたは発現構築物を有する宿主細胞を提供する。細胞は、例えば、真核細
胞または原核細胞、例えば、動物細胞、植物細胞、細菌または酵母であり得る。様々な発
現ベクター／宿主系が、本発明の融合ポリペプチドを発現させるのに適している。例には
、例えば、微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤ
ＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵
母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイル
ス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウ
イルス、ＴＭＶ）によりトランスフェクトされたか、細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉま
たはｐＢＲ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が挙
げられる。
本発明に有用なベクターは、好ましくは、コードポリヌクレオチド配列の転写および翻
訳を可能にする融合ポリペプチドコード配列に作動可能に結合された配列を含む。結合さ
れた融合ポリペプチドコード配列の転写を可能にする配列は、プロモーターを含み、結合
された配列の強力な発現を可能にする１または複数のエンハンサー要素も含んでもよい。
用語「転写調節配列」は、プロモーターと、作動可能に結合された核酸配列に所望の発現
特性（例えば、高レベル発現、誘導性発現、組織または細胞型特異的発現）を付与する任
意の追加の配列との組合せを指す。プロモーター配列は、構成的または誘導性であり得る
。構成的ウイルスプロモーターの例には、ＨＳＶ、ＴＫ、ＲＳＶ、ＳＶ４０およびＣＭＶ
プロモーターが挙げられる。好適な誘導性プロモーターの例には、シトクロムＰ４５０遺
伝子、熱ショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、エストロゲン遺伝子プロ
モーターなどのホルモン誘導性遺伝子などの遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。
プロモーター／エンハンサー要素に加えて、本発明の発現ベクターは、好適なターミネ
ーターをさらに含み得る。そのようなターミネーターには、例えば、ヒト成長ホルモンタ
ーミネーター、または酵母もしくは真菌宿主の場合、ＴＰＩ１（Ａｌｂｅｒ＆Ｋａｗａｓ
ａｋｉ，Ｊ Ｍｏｌ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ １：４１９－３４，１９８２）もしくはＡ
ＤＨ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯ Ｊ ４
：２０９３－２０９９）が含まれる。本発明に有用なベクターはまた、ポリアデニル化配
列（例えば、ＳＶ４０またはＡｄ５Ｅ１ｂポリ（Ａ）配列）、および翻訳エンハンサー配
列（例えば、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ由来のもの）を含み得る。さらに、本発明に有
用なベクターは、融合ポリペプチドを特定の細胞区画に導くシグナル配列をコードしても
よいか、あるいは、融合ポリペプチドの分泌を導くシグナルをコードしてもよい。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明のワクチン免疫原を発現するベクターは、哺
乳動物発現用のウイルスベクターである。一般に、本発明の融合ＨＩＶ免疫原をコードす
る配列の導入および発現を可能にする任意のウイルスベクターが、本発明に許容可能であ
る。様々な実施形態では、アデノウイルスベクター、ｐＳＶおよびｐＣＭＶ系列のプラス
ミドベクター、ワクシニアおよびレトロウイルスベクター、ならびにバキュロウイルスを
含む哺乳動物発現ベクターを本発明の実施に使用することができる。例えば、本発明のＨ
ＩＶ－１ワクチン免疫原は、ウイルスベクターｐｈＣＭＶ３から発現させることができる
。
融合ポリペプチドを発現させるために使用される特定のベクターに応じて、様々な公知
の細胞または細胞株を本発明の実施に使用することができる。宿主細胞は、本発明の融合
ＨＩＶ免疫原を保有する組換えベクターが導入され得、ベクターが融合ポリペプチドの発
現を促進することを可能にされる場合、本発明に有用な任意の細胞であり得る。宿主細胞
は、多数の細菌株のいずれかなどの原核細胞であってよいか、酵母もしくは他の真菌細胞
、昆虫細胞もしくは両生類細胞、または例えば齧歯類細胞、類人猿細胞もしくはヒト細胞
を含む哺乳動物細胞などの真核細胞であってよい。本発明の融合ポリペプチドを発現する
細胞は、初代培養細胞、例えば、初代ヒト線維芽細胞またはケラチノサイトであってよい
か、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８また
はＣＨＯ細胞などの確立された細胞株であってよい。いくつかの実施形態では、本発明の
ＨＩＶ－１ワクチン免疫原を発現するための宿主細胞は、本明細書に例示されるように、
ＥｘｐｉＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞であり得る。当業者であれば、本発明の融
合ワクチン免疫原を発現する選択された宿主細胞型を培養時に容易に確立および維持する
ことができる。融合ポリペプチドの発現に使用することができる好適な細胞株の他の多く
の特定の例は、当技術分野で説明されている。例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９
８３．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ４６：５８４；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９４
，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：３２２４；Ｌｏｇａｎ ａｎｄ Ｓｈｅ
ｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，８１：３６５５；Ｓｃｈａｒ
ｆ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ，
２０：１２５；Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ，１５３：５１６；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：５５０３；Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６；Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ
．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１；Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，１
９８７，ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７；Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９８４，ＥＭＢ
Ｏ Ｊ ３：１６７１；Ｂｒｏｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
２４：８３８；Ｗｉｎｔｅｒ Ｊ ａｎｄ Ｓｉｎｉｂａｌｄｉ Ｒ Ｍ，１９９１，Ｒ
ｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．，１７：８５；Ｈｏｂｂｓ Ｓ
ｏｒ Ｍｕｒｒｙ Ｌ Ｅ ｉｎ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．，ｐｐ １９１－１９６またはＷｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ
Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ ４
２１－４６３を参照されたい。
融合ポリペプチド発現ベクターは、当業者に公知の多くの好適な方法のいずれかによっ
て、選択された宿主細胞に導入され得る。融合ポリペプチドをコードするベクターを哺乳
動物細胞に導入するために使用される方法は、ベクターの形態に依存する。プラスミドベ
クターの場合、例えば、脂質媒介性トランスフェクション（「リポフェクション」）、Ｄ
ＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはリン
酸カルシウム沈殿を含む多くのトランスフェクション法のいずれかによって、融合ポリペ
プチド配列をコードするＤＮＡが導入され得る。これらの方法は、例えば、上記のＢｒｅ
ｎｔ ｅｔ ａｌ．に詳述されている。多種多様な形質転換細胞および非形質転換細胞ま
たは初代細胞の一過性トランスフェクションに適したリポフェクション試薬および方法が
広く利用可能であり、これにより、リポフェクションが、真核細胞、特に培養時の哺乳動
物細胞に構築物を導入する魅力的な方法になる。例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（
商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＬｉｐｏＴａｘｉ（商標）（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）キットが利用可能である。リポフェクション用の試薬および方法を提
供する他の企業には、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、
Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、ＪＢＬ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、
ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ＰａｎＶｅｒａ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈおよびＷａｋｏ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ ＵＳＡが含まれる。
組換え融合ポリペプチドの長期にわたる高収率の生成のためには、安定な発現が好まし
い。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御要素（
例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位
など）および選択可能なマーカーによって制御される融合ポリペプチドコード配列を用い
て、宿主細胞を形質転換することができる。組換えベクター中の選択可能なマーカーは、
選択に対する耐性を付与し、細胞がそれらの染色体にベクターを安定に組み込むことを可
能にする。一般的に使用される選択可能なマーカーには、アミノグリコシドＧ－４１８に
対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１，１９８１）、およびハイグロマイシンに対する耐性を
付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３０：１４７，１９
８４）が含まれる。適切な選択により、トランスフェクトされた細胞は、融合ポリペプチ
ドコード配列の組み込まれたコピーを含むことができる。
Ｖ．医薬組成物および治療用途
本発明は、ＨＩＶ－１感染を予防および治療するために、本明細書に記載のワクチンポ
リペプチドをコードする足場ＨＩＶ－１免疫原ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使
用する医薬組成物および関連方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示
される免疫原は、医薬組成物に含まれる。医薬組成物は、治療用製剤または予防用製剤の
いずれかであり得る。典型的には、組成物は、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクルさ
らに含み、他の治療成分（例えば、抗生物質または抗ウイルス薬）をさらに含んでもよい
。様々な薬学的に許容される添加剤も組成物に使用することができる。
本発明の医薬組成物のいくつかはワクチンである。ワクチン組成物については、適切な
アジュバントをさらに含めることができる。好適なアジュバントの例には、例えば、水酸
化アルミニウム、レシチン、フロイントアジュバント、ＭＰＬ（商標）およびＩＬ－１２
が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される足場ＨＩＶ－１免疫原は
、制御放出製剤または時間放出製剤として製剤化することができる。これは、徐放性ポリ
マーを含有する組成物中で、またはマイクロカプセル化送達系もしくは生体接着性ゲルを
介して達成することができる。様々な医薬組成物は、当技術分野で周知の標準的な手順に
従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ，１９９５；Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ
，Ｊ Ｒ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９７８）；米国特許第４，６５２，４４１号および米国特許第４，９１７，
８９３号；米国特許第４，６７７，１９１号および米国特許第４，７２８，７２１号；な
らびに米国特許第４，６７５，１８９号を参照されたい。
本発明の医薬組成物は、対象のＨＩＶ－１感染を治療するため、または対象にＨＩＶ－
１に対する免疫応答を誘発するための様々な治療用途または予防用途に容易に使用するこ
とができる。例えば、組成物を対象に投与して、ＨＩＶ－１に対する免疫応答を誘発する
、例えば、ＨＩＶ－１に対する広域中和抗体の産生を誘導することができる。ＨＩＶ感染
を発症するリスクがある対象に対して、本発明のワクチン組成物を投与して、ウイルス感
染に対する予防的保護を提供することができる。特定の対象および状態に応じて、本発明
の医薬組成物は、当業者に公知の様々な投与方法、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈
内、関節内、腹腔内または非経口経路により対象に投与することができる。一般に、医薬
組成物は、そのような治療を必要とする対象に、選択された疾患もしくは状態またはその
１つ以上の症状を予防、阻害および／または改善するのに十分な時間にわたり、およびそ
れらのために十分な条件下で投与される。免疫原性組成物は、ＨＩＶ－１に対する免疫応
答を誘発するのに十分な量で投与される。治療用途では、組成物は、本明細書に記載の治
療有効量の足場ＨＩＶ－１免疫原を含有するべきである。予防用途では、組成物は、本明
細書に記載の予防的有効量の足場ＨＩＶ－１免疫原を含有するべきである。免疫原の適切
な量は、治療または予防される特定の疾患または状態、重症度、対象の年齢、および特定
の対象の他の個人的属性（例えば、対象の健康の全般的状態および対象の免疫系の堅牢性
）に基づいて決定することができる。効果的な投与量の決定はさらに、動物モデル試験、
およびそれに続くヒトの臨床試験により導かれ、対象の標的疾患症状または状態の発生ま
たは重症度を顕著に低減する投与プロトコルにより導かれる。
予防用途では、免疫原性組成物は、何らかの症状の前に、例えば感染の前に提供される
。免疫原性組成物の予防投与は、その後の何らかの感染を予防または改善するのに役立つ
。したがって、いくつかの実施形態では、治療される対象とは、例えばＨＩＶに対する曝
露または曝露の可能性のために、ＨＩＶ感染を有するか、ＨＩＶ感染を発症するリスクが
ある対象である。開示された治療用組成物の治療有効量の投与後、対象は、ＨＩＶ－１感
染、ＨＩＶ－１感染に関連する症状またはその両方に関してモニターされ得る。
治療用途では、免疫原性組成物は、疾患または感染の症状の発症時または発症後、例え
ば、ＨＩＶ－１感染の症状の発現後、またはＨＩＶ－１感染の診断後に提供される。した
がって、免疫原性組成物は、感染および／または関連する疾患症状の予測される重症度、
持続時間または程度を低減するために、予測されるＨＩＶウイルスに対する曝露の前に、
ウイルスに対する曝露もしくはウイルスに対する曝露が疑われた後、または感染の実際の
開始後に提供することができる。
本発明の医薬組成物は、ＨＩＶ感染を治療または予防するために当技術分野で公知の他
の薬剤と組み合わせることができる。これらには、例えば、抗体または他の抗ウイルス剤
、例えば、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、アバカビル、ＡＺＴ、ジダノシン、
エムトリシタビン、ラミブジン、スタブジン、テノホビル、ザルシタビン、ジドブジンな
ど、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、デラビルジン、エファビレンツ、ネビラ
ピン、プロテアーゼ阻害剤、例えば、アンプレナビル、アタザナビル、インジナビル、ロ
ピナビル、ネルフィナビル、オサムプレナビル（ｏｓａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、リトナビ
ル、サキナビル、チプラナビルなど、および融合タンパク質阻害剤、例えば、エンフビル
チドなどが含まれる。医薬組成物および公知の抗ＨＩＶ剤の投与は、同時または連続的の
いずれかであり得る。
本発明のＨＩＶ－１ワクチン免疫原または医薬組成物は、キットの構成要素として提供
され得る。そのようなキットは、追加の構成要素、例えばパッケージング、説明、ならび
に様々な他の試薬、例えば、緩衝液、基質、抗体またはリガンド、例えば、対照抗体また
はリガンドおよび検出試薬を含んでもよい。キットには、任意の説明書をさらに提供する
ことができる。
［実施例］
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、本発明を限定するものではな
い。
［実施例１］
ＵＦＯ ２ －ＢＧ三量体の設計および特性評価
現在の三量体設計が直面する主要な障害は、それらが一度ＢＧ５０５から他の株に拡張
されると、収率、純度および安定性が劣化することである。これまでに提案された解決策
には、（１）ｂＮＡｂアフィニティーカラム、ネガティブ選択、マルチサイクルＳＥＣ、
および複合クロマトグラフィー法（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ
ａｐｐｒｏａｃｈ）など、ミスフォールドＥｎｖタンパク質から天然様三量体を分離す
ることを目的とした精製法、ならびに（２）原子構造から情報を得るか、ライブラリース
クリーニングから導き出される補助変異が含まれる。しかし、これらの解決策は本質的に
経験的であり、三量体収率の低下、およびＥｎｖ特性の予想外の変化などの最適でない結
果をもたらすことが多い。本発明者らは、以前に、Ｅｎｖ準安定性の主因としてＨＲ１ベ
ンド（残基５４７～５６９）を同定した（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ
７，１２０４０，２０１６）。ｇｐ４１ＥＣＴＯ中のこの構造的に歪んだ領域の合理的な
再設計は、複数のＨＩＶ‐１株の三量体収率および純度を顕著に改善したが、依然として
ミスフォールドＥｎｖの量が変化し、ＨＲ１以外の他の領域もＥｎｖ準安定性に寄与する
ことが示唆された。したがって、これらの「準安定性の二次因子」の源を明らかにするこ
とが三量体設計にとって重要であることが証明される可能性がある。
Ｅｎｖ準安定性のあらゆる因子がｇｐ４１ＥＣＴＯ内にコード化され、ＵＦＯ設計のＢ
Ｇ５０５ ｇｐ４１ＥＣＴＯ（ＵＦＯ２－ＢＧと呼ばれる）を使用して多様なＨＩＶ‐１
Ｅｎｖを安定化することができると仮定した。この仮説を検討するために、ＨＩＶ‐１
偽ウイルスの大規模パネルまたは利用可能なデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈ
ｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）のいずれかから５つのクレード起源（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｂ／Ｃおよ
びＡ／Ｅ）の１０のＥｎｖを選択し、本発明者らの以前の試験で試験した３つのＥｎｖも
含めた（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ７，１２０４０，２０１６）。注
目すべきことに、ここで試験した１０のＥｎｖのうち７つが、三量体安定化に対して重要
な課題を提起しているｔｉｅｒ－２／３分離株に由来した。各Ｅｎｖについて、ＳＯＳＩ
Ｐ、ＵＦＯおよびＵＦＯ２‐ＢＧ設計のｇｐ１４０構築物をＥｘｐｉＣＨＯ細胞内に一過
性に発現させ、ＳＯＳＩＰ構築物に対してフューリンを同時トランスフェクトした。ＧＮ
Ｌ精製に続いて、比較のためにＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００カラムから３０
のｇｐ１４０のＳＥＣプロファイルを作成した。ＢＧ５０５を除いて、ＳＯＳＩＰはいず
れも凝集体の顕著な割合（４０～５０ｍｌ）を示し、これには極端に低い収率と、時に三
量体ピークの欠如とが伴った。ＵＦＯは、クレードＡ／Ｅ以外の三量体の収率および純度
を著しく改善し、クレードＣでは最も目に見える改善が観察された。ＵＦＯ２‐ＢＧは、
二量体および単量体の手掛かりを用いず、またはそれらのわずかな手掛かりを用いて１０
株のうち８株で極めて優れた三量体の純度および収率を示し、７つのｔｉｅｒ－２／３分
離株をいずれもカバーした。次いで、ＢＮ‐ＰＡＧＥにより３０のｇｐ１４０構築物をい
ずれも特性評価した。全体的に、ＵＦＯ２‐ＢＧはＳＯＳＩＰおよびＵＦＯに関して二量
体および単量体の含有量を劇的に減少させ、ＳＥＣ画分全体で三量体バンドを示したが、
低分子量のかすかなバンドを時折示した。この発見に基づいて、ＧＮＬカラムから得られ
た総Ｅｎｖタンパク質と、その後のＳＥＣ、およびＢＮ‐ＰＡＧＥによる画分分析後の三
量体部分とを比較した。驚くべきことに、ＧＮＬ精製の簡単な工程は、ｔｉｅｒ－２クレ
ードＢ株およびｔｉｅｒ－３クレードＢ／Ｃ株に由来する２つのＵＦＯ２‐ＢＧ三量体を
除くいずれにも同等の純度をもたらした。次に、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により、８
つの精製ＵＦＯ２‐ＢＧ三量体の熱安定性を評価した。特に、ＤＳＣプロファイルは、６
０．９～６８．４℃の範囲の熱変性中点（Ｔｍ）を有するクレード／株特異的パターンを
示した。試験した８つの三量体のうち、ＵＦＯ２‐ＢＧがＵＦＯと同等であるＢＧ５０５
は、最も高いＴｍ（６８．４℃）をもたらし、２つのクレードＣ三量体（６５．２～６６
．２℃）がそれに続いた。追加の空洞充填変異体およびジスルフィド結合の非存在下では
、ＤＳＣデータは大部分がＷＴ Ｅｎｖの熱安定性を反映した。注目すべきことに、ここ
で試験したＣＮ５４ ＵＦＯおよびＵＦＯ２‐ＢＧ構築物は１４の変異体（ＣＮ５４Ｍ１
４）を含み、これにより、２９３ Ｆ産生三量体の凝集体が減少する。さらに、２９３
Ｆ細胞での発現、およびＳＥＣ精製のために、クレードＢ、ＣおよびＢ／Ｃの４つのＵＦ
Ｏ２－ＢＧ三量体を選択した。結果は、使用した細胞株に関係なくＵＦＯ２‐ＢＧは三量
体特性を改善することができるが、ＥｘｐｉＣＨＯ系と併用した場合にのみ最高純度に達
することを示し、ＢＧ５０５に対する本発明者らの発見と一致している。
したがって、結果から、ｇｐ４１ＥＣＴＯがＥｎｖ準安定性の唯一の源であり、ＵＦＯ
設計のＢＧ５０５ ｇｐ４１ＥＣＴＯが多様なＨＩＶ‐１ Ｅｎｖを安定化することがで
きるという本発明者らの仮説が確認される。ＳＥＣ精製の前後でほぼ同一の三量体純度は
、ＵＦＯ２－ＢＧ三量体のための単純で堅牢かつ費用効果の高い製造プロセスを示唆する
。固有の三量体純度はまた、ＵＦＯ２－ＢＧ三量体を発現する核酸ワクチンの開発および
臨床試験を促進する。
［実施例２］
多様なサブタイプからのＵＦＯ ２ －ＢＧ三量体のナノ粒子提示
本発明者らは、以前に報告した設計戦略（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ７
，１２０４１，２０１６）に従って、多様なＨＩＶ‐１株に由来するＵＦＯ２‐ＢＧ三量
体が２４量体フェリチン（ＦＲ）ナノ粒子上に提示され得るかどうかを検討した。本発明
者らは、ＵＦＯ設計のＢＧ５０５ ｇｐ４１ＥＣＴＯが、ｇｐ１４０三量化およびナノ粒
子集合の両方を促進することができると仮定する（図１Ａ）。この仮説を試験するために
、フェリチンサブユニットのＮ末端（Ａｓｐ５）に融合したｇｐ４１ＥＣＴＯ（残基６６
４）のＣ末端を有する８つのＵＦＯ２－ＢＧ－ＦＲ構築物を設計した。得られた融合構築
物をＥｘｐｉＣＨＯ細胞内に一過性に発現させた後、２Ｇ１２アフィニティーカラムを使
用して簡単に精製した。ＢＮ－ＰＡＧＥは、試験した８つの株いずれについても、良好に
形成されたＵＦＯ２－ＢＧ－ＦＲナノ粒子に対応する高分子量の特徴的なバンドを示した
。表面から突出したｇｐ１４０三量体の規則的なアレイにより修飾した可視粒子コアを示
すネガティブ染色ＥＭによって、ナノ粒子集合を一定して確認した。ＤＳＣ分析は、５つ
の全サブタイプに由来するＵＦＯ２‐ＢＧ‐ＦＲナノ粒子の高い熱安定性を示し、Ｔｍは
６８～７０℃の範囲であった。６つのｂＮＡｂおよび４つの非ＮＡｂのパネルを使用して
、５つの代表的な設計についてＵＦＯ２－ＢＧ－ＦＲナノ粒子の抗原性を評価した。全体
的に、多価ディスプレイは天然様三量体抗原性を保持し、場合によってはそれを増強し、
エピトープおよびサブタイプに特異的なパターンを示した。Ｖ２ ａｐｅｘでは、５つの
ナノ粒子がいずれもＰＧＤＭ１４００に結合し、個々の三量体と同等であるか、それより
も著しく高い親和性を示し、ナノ粒子表面に提示された三量体が天然様の閉じたコンホメ
ーションをとることが確認された。Ｈ０７８．１４では、復元したｂＮＡｂ結合はナノ粒
子表面上の隣接三量体による影響を受けた立体配座平衡のシフトによって説明することが
できたが、Ｄｕ１７２．１７および９３ＪＰ＿ＮＨ１では、親和性の増大は結合活性効果
の結果であると考えられた。対照的に、別のａｐｅｘ ｂＮＡｂ、ＰＧ１６に対するナノ
粒子結合にはほとんど改善が見られなかった。Ｎ３３２超部位（ｓｕｐｅｒｓｉｔｅ）超
部位およびＣＤ４ｂｓでは、多価ディスプレイはＨ０７８．１４ ＵＦＯ２－ＢＧ三量体
に対してさらに好ましい効果を示した。ｇｐ１２０‐ｇｐ４１界面部位では、ＵＦＯ２－
ＢＧ－ＦＲナノ粒子はいずれも、２つの隣接したｇｐ１４０プロトマーの要素を補充する
ＰＧＴ１５１への三量体結合を保持したが、１つのプロトマーのみと相互作用する３５Ｏ
２２では、結合シグナルの交差クレード減少が観察された。非ＮＡｂでは、ナノ粒子は三
量体に似た結合プロファイルを示した。
次に、天然様Ｅｎｖ三量体の多価ディスプレイのための６０ユニット超安定ナノ粒子、
Ｉ３‐０１（Ｈｓｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３５，１３６－１３９，２０１
６）の有用性を検討した。対称性（１２面体）およびサイズ（２５ｎｍ）に関して、Ｉ３
‐０１は本発明者らの以前の試験で試験した６０量体Ｅ２ｐナノ粒子に酷似しているが、
それよりも安定性が高い（図１Ｅ、左）。ただし、Ｉ３－０１サブユニットのＮ末端間の
距離が約５０．５Åと大きいため、ｇｐ１４０三量体のＣ末端に接続するには長いリンカ
ーが必要である（図１Ｅ、中央）。Ｔヘルパーエピトープは、ｇｐ１４０とＩ３－０１サ
ブユニット間のリンカーとしてだけでなく、組み込まれたＴヘルプシグナルとしても使用
され、堅牢なＴ細胞応答を誘発し、ｂＮＡｂに向けてＢ細胞の発達を導くと仮定する。こ
の仮説を試験するために、Ｐａｎ ＤＲエピトープペプチド（ＰＡＤＲＥ）、ＡＫＦＶＡ
ＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１）（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔ
ｙ １，７５１－７６１，１９９４）ならびに２つの最近報告されたＴヘルパーエピトー
プ、ＤおよびＴｐＤ（Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ３２，２８９６－
２９０３，２０１４）を選択して評価した（図１Ｅ、右）。ＨＲ１再設計ＢＧ５０５ ｇ
ｐ１４０（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ７，１２０４０，２０１６）、
ＴヘルパーエピトープおよびＩ３－０１サブユニットを含む３つの融合構築物を設計した
。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞内のフューリンの同時発現に続いて、２Ｇ１２精製物質をＳＥＣに
よって特性評価した（図１Ｆ）。驚くべきことに、ＢＮ－ＰＡＧＥ（図１Ｇ）およびネガ
ティブ染色ＥＭ（図１ｈ）によってさらに確認されるように、ＰＡＤＲＥを含むＩ３－０
１構築物は高純度のナノ粒子を生成した。ｂＮＡｂおよび非ＮＡｂの同じパネルを使用し
て評価すると、このナノ粒子は、これまでに試験したいずれのナノ粒子にも観察されなか
った強力なＰＧ１６結合を有する極めて優れた抗原プロファイルを示した（図１Ｉ）。
要約すると、本発明者らの結果は、多様なＨＩＶ－１株のＵＦＯ２－ＢＧ三量体がフェ
リチンナノ粒子上に提示され得ることを示している。さらに、Ｉ３－０１およびＴヘルパ
ーエピトープなどの超安定ナノ粒子を使用することにより、さらにバランスのとれたＴお
よびＢ細胞応答を有する多価ＨＩＶ－１ワクチンを開発するための新規プラットフォーム
を提供する。
［実施例３］
ナノ粒子はｂＮＡｂを発現するＢ細胞を強力に活性化する
本発明者らは、以前に、様々なＢＧ５０５ ｇｐ１２０およびｇｐ１４０ナノ粒子が、
同種のＶＲＣ０１受容体を発現するＢ細胞に関与する可能性があることを示した（Ｈｅ
ｅｔ ａｌ．，２０１６）。この試験では、個々の三量体に関して、５つのＵＦＯ２－Ｂ
Ｇ－ＦＲナノ粒子およびＢＧ５０５ ｇｐ１４０－ＰＡＤＲＥ－Ｉ３－０１ナノ粒子によ
るＢ細胞活性化を評価した（図２）。アッセイでは、ｂＮＡｂ ＰＧＴ１４５、ＶＲＣ０
１およびＰＧＴ１２１（Ｏｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９，４８１６
－４８２４，２０１２）を発現するＢ細胞を使用した。全体的に、三量体提示ナノ粒子は
、個々の三量体よりも効果的にｂＮＡｂ発現Ｂ細胞を刺激することができ、ピークシグナ
ルはイオノマイシンによる最大活性化に近づいた。ただし、この結果から、検討したエピ
トープに関連するパターンも明らかにされた。Ｎ３３２超部位を認識するＰＧＴ１２１を
発現するＢ細胞を用いて試験すると、一部の三量体およびあらゆるナノ粒子が、検出可能
なＣａ２＋フラックスシグナルを示した。対照的に、Ｖ２ ａｐｅｘおよびＣＤ４ｂｓを
それぞれ標的とするＰＧＴ１４５およびＶＲＣ０１を発現するＢ細胞を活性化した三量体
はほとんどなかった。注目すべきことに、Ｈ０７８．１４ ＵＦＯ２－ＢＧ－ＦＲナノ粒
子によるＰＧＴ１４５発現Ｂ細胞の刺激は、ａｐｅｘがＶ２変異を伴わず多価ディスプレ
イによって復元され得るという追加の証拠を提供し、これはＢＬＩデータと一致する（図
１Ｄ）。同様の効果は、ＢＬＩにより、ＰＧＴ１２１に弱くしか結合しないが、ＰＧＴ１
２１発現Ｂ細胞内で可視的で長期間持続するＣａ２＋フラックスシグナルを誘導するクレ
ードＡ／Ｅ ９３ＪＰ＿ＮＨ１ ＵＦＯ２‐ＢＧ‐ＦＲナノ粒子にも観察され、細胞表面
上のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の架橋が、固有の低親和性を克服するためにさらに役立ち得
ることが示唆された。合わせて、生化学的、構造的および抗原的アプローチとＢ細胞活性
化アッセイとを組み合わせることにより、インビボでのそれらのワクチン潜在力の検討を
可能にするｇｐ１４０ナノ粒子のパネルを確立した。
［実施例４］
野生型マウスを対象とした自己中和抗体の誘導
様々な形態の天然様Ｅｎｖ三量体について、免疫原性が評価されてきた。ＳＯＳＩＰ三
量体により野生型マウスを免疫した場合、ＢＧ５０５．Ｎ３３２に対する自己ｔｉｅｒ－
２ ＮＡｂ反応は１８週間にわたって観察されなかった（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉ
ｒｏｌ ８９，１０３８３－１０３９８，２０１５）。良好に形成されたＥｎｖ三量体の
グリカンシールドは、それらの短い重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）ループのため、
マウス抗体に対して不透過性であるとの結論が下された。それにもかかわらず、ノックイ
ンｂＮＡｂ前駆体を有するマウスでは、改変されたＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ三量体によっ
てｔｉｅｒ－２ ＮＡｂが誘発されることが報告された。６カ月から１年に及ぶワクチン
接種レジメンを使用すると、天然様三量体が、ウサギでは自己ｔｉｅｒ－２ ＮＡｂ反応
を誘発し、マカクではさらに弱いそのような反応を誘発することも報告された（ｄｅ Ｔ
ａｅｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｋｌａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｍａｒｔ
ｉｎｅｚ－Ｍｕｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｐａｕｔｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．
，２０１７；Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。したがって、ｔｉｅｒ－２
ＮＡｂの誘導は、特にＷＴマウスモデルでは、依然としてＨＩＶ－１ワクチン開発に対す
る重要な課題である。
ここでは、本発明者らは、ＵＦＯ設計（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ａ）の中核
であるＨＲ１再設計を含むＢＧ５０５ ｇｐ１４０三量体およびナノ粒子により、単純な
６週間レジメンと血清ＩｇＧ精製手順とを使用してＷＴ ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫して
、非特異的抗ウイルス活性を排除した（図３Ａ）。第１相狂犬病ワクチン試験（Ｗｉｊａ
ｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）でＴ細胞応答および抗体反応の増強を示したヒトアジュ
バントであるＰＩＫＡを使用して、ヒト適合ワクチン製剤を得た。合計８つの三量体およ
び４つのナノ粒子を試験し（図３Ｂ、上部）、ＥＬＩＳＡによって抗原結合について群複
合血清ＩｇＧを評価した（図３Ｂ、下部）。１つのＶ１Ｖ２プローブと２つのＮ３３２ナ
ノ粒子プローブとを利用して、それぞれａｐｅｘおよびＮ３３２超部位に対するＢ細胞応
答を測定した（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。最初に、２９３ Ｆ産生プロ
ーブに対して特異的結合を示す２９３ ＦおよびＥｘｐｉＣＨＯ産生三量体（Ｓ１Ｇ３お
よびＳ１Ｇ４）によって誘発されたマウスＩｇＧを検討し、グリコシル化およびＢ細胞応
答の細胞株特異的パターンを確認した（図１Ｄおよび図１Ｅ）。３つの足場ｇｐ１４０．
６８１三量体は、本発明者らの以前の報告（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）と
一致して、比較的低いＥＣ５０値（Ｓ１Ｇ５、Ｓ１Ｇ６およびＳ１Ｇ７）によって示され
るように、マウスでは強力なＩｇＧ反応を誘発した。フェリチンナノ粒子（Ｓ２Ｇ１）は
、Ｎ３３２超部位に対して比較的強力な抗体反応を誘発するように思われ、多価ディスプ
レイの正の効果が示唆された。３つのｇｐ１４０－Ｔ－エピトープ－Ｉ３－０１ナノ粒子
（Ｓ２Ｇ５、Ｓ２Ｇ６およびＳ２Ｇ７）はいずれも、Ｃ末端（Ｓ１Ｇ８、Ｓ１Ｇ９および
Ｓ１Ｇ１０）にＰＡＤＲＥ、ＤおよびＴｐＤエピトープを含むそれらのそれぞれの三量体
よりも性能が優れていた。最後に、最初のスクリーニングでは、３～８ｍｇ／ｍｌのＩｇ
Ｇ濃度でＨＩＶ－１中和について１２の免疫群から得られた血清ＩｇＧを試験し、ナイー
ブ群を対照として含めた（Ｓ１Ｇ１０）（図３Ｃ）。以前の陰性報告（Ｈｕ ｅｔ ａｌ
．、上記）とは対照的に、足場ｇｐ１４０．６８１三量体（Ｓ１Ｇ５）、フェリチンナノ
粒子（Ｓ２Ｇ１）および２つのＩ３‐０１ナノ粒子（Ｓ２Ｇ５およびＳ２Ｇ６）について
、自己ｔｉｅｒ－２ ＢＧ５０５．Ｎ３３２の中和が観察された。比較的低いＩｇＧ濃度
（１ｍｇ／ｍｌ）で試験した場合、Ｓ１Ｇ５は閾値直下でボーダーライン中和を示したが
（図３Ｄ）、Ｓ２Ｇ１の１例の対象（図３Ｅ）およびＳ２Ｇ５の２例の対象（図３Ｆ）は
、自己ｔｉｅｒ－２ ＢＧ５０５．Ｎ３３２に対してＮＡｂを発現したように思われた。
特に、ｇｐ１４０－ＰＡＤＲＥ－Ｉ３－０１ナノ粒子は、極めて優れた純度、構造均一性
および抗原性を示しただけでなく（図１、図１Ｅ～図１Ｉ）、わずか８週間後にｔｉｅｒ
－２ ＮＡｂの急速な発現を示すＩＣ５０値をもたらした。これらのデータは、ｇｐ１４
０－ＰＡＤＲＥ－Ｉ３－０１ナノ粒子による免疫化が、ウサギ、ＮＨＰおよびヒトに対し
て、現在の三量体ワクチンよりも強力なｔｉｅｒ－２ ＮＡｂ反応を誘発し、範囲も改善
される可能性が高いことを示唆している。
［実施例５］
ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０三量体を提示するための他の超安定ナノ粒子
Ｉ３－０１ナノ粒子に加えて、本明細書に記載のｇｐ１４０－Ｔヘルパーエピトープナ
ノ粒子プラットフォームＨＩＶ－１ワクチン免疫原を構築するための他の安定なナノ粒子
も検討した。具体的には、２．３０Å分解能結晶構造を有するタンパク質「サーモトガ・
マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ Ｍａｒｉｔｉｍａ）由来の２－デヒドロ‐３‐デオ
キシホスホグルコン酸アルドラーゼ４‐ヒドロキシ‐２‐オキソグルタル酸アルドラーゼ
（Ｔｍ００６６）」（ＰＤＢ ＩＤ：１ＶＬＷ）を試験した。１ＶＬＷをコードする遺伝
子配列を基礎として使用し、２．３０Å分解能結晶構造を骨格として使用して、Ｉ３‐０
１よりも望ましい特性を有する６０量体ナノ粒子に自動的に集合し得るタンパク質を設計
した。集合に基づくタンパク質設計、または目視検査に続く手動設計に、１ＶＬＷ配列（
配列番号５）内の１１個のアミノ酸を供した。１２の設計された１ＶＬＷ変異体を合成し
た（配列番号６～１７）。ｇｐ１４０－ＰＡＤＲＥ－Ｉ３－０１ナノ粒子免疫原について
上述したものと同じプロトコルを用いて、これらの配列のナノ粒子上に提示されるｇｐ１
４０三量体の構築、ナノ粒子免疫原の発現、およびそれらの免疫原性を検討する。
１ＶＬＷ野生型アミノ酸配列（配列番号５）（再設計に供される残基には下線が引かれ
ている）：
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ＩＲＧＣＴＥ
ｇｐ１４０三量体を提示するために再設計された１ＶＬＷ変異体（配列番号６～１７）
（改変された残基には二重下線が引かれている）：
＞１ＶＬＷ－ＳＳ１（配列番号６）
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ＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＣＥＶＡＣＫＡＫＡＦＶＥＫ
ＩＲＧＣＴＥ
＞１ＶＬＷ－ＭＵＴ（配列番号７）
ＭＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＫＷＫＡＬＡＶＦＩＧＧＶＨＬＩ
ＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＥＬＳＦＬＫＥＬＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＣＲＫＡ
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ＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＡＥＶＶＥＫＡＫＡＦＶＥＫ
ＩＲＧＣＴＥ
＞１ＶＬＷ－ＪＺ１（配列番号８）
ＭＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＫＭＫＡＬＨＶＦＳＧＧＶＨＬＩ
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ＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶ
ＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＷＤＥＶＳＲＫＡＫＡＦＶＥＫ
ＩＲＧＣＴＥ
＞１ＶＬＷ－ＪＺ２（配列番号９）
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ＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＥＬＳＦＬＫＥＱＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＣＲＫＡ
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ＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＷＨＥＶＡＡＫＡＫＡＦＶＥＫ
ＩＲＧＣＴＥ
＞１ＶＬＷ－ＪＺ３（配列番号１０）
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ＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＥＬＳＦＬＫＥＷＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＣＲＫＡ
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ＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＷＤＥＶＡＡＫＡＫＡＦＶＥＫ
ＩＲＧＣＴＥ
＞１ＶＬＷ－ＪＺ４（配列番号１１）
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ＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＶＶＥＶＡＡＫＡＡＡＦＶＥＫ
ＩＲＧＣＴＥ
＞１ＶＬＷ－ＪＺ５（配列番号１２）
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ＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＩＶＥＶＡＡＫＡＡＡＦＶＥＫ
ＩＲＧＣＴＥ
＞１ＶＬＷ－ＪＺ６（配列番号１３）
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ＩＲＧＣＴＥ
＞１ＶＬＷ－ＪＺ７（配列番号１４）
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ＩＲＧＣＴＥ
＞１ＶＬＷ－ＪＺ８（配列番号１５）
ＭＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＫＷＫＡＬＨＶＦＶＧＧＶＨＬＩ
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ＩＲＧＣＴＥ
＞１ＶＬＷ－ＪＺ９（配列番号１６）
ＭＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＫＭＫＡＬＡＶＦＶＧＧＶＨＬＩ
ＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＥＬＳＦＬＫＥＬＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＣＲＫＡ
ＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＣＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫ
ＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶ
ＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＩＡＥＶＡＡＫＡＡＡＦＶＥＫ
ＩＲＧＣＴＥ
＞１ＶＬＷ－ＪＺ１０（配列番号１７）
ＭＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＫＭＫＡＬＡＶＦＹＧＧＶＨＬＩ
ＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＥＬＳＦＬＫＥＡＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＣＲＫＡ
ＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＣＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫ
ＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶ
ＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＦＶＥＶＡＡＫＡＡＡＦＶＥＫ
ＩＲＧＣＴＥ
［実施例６］
いくつかの例示的な実験手順
抗体：ｂＮＡｂおよび非ＮＡｂのパネルを利用して、様々な天然様三量体およびｇｐ１
４０ナノ粒子の抗原性を特性評価した。Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ内で得られたｂＮＡｂ ＰＧＤＭ１４００、ＰＧＴ１４５、ＰＧＴ１２１および
ＰＧＴ１５１ならびに非ＮＡｂ １９ｂを除き、抗体はＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎ
ｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｉｄｓｒｅａｇｅｎｔ．ｏｒｇ／）か
ら要請された。
ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ三量体およびナノ粒子の発現および精製：結晶学的分析に使用され
る材料を除いて、ＨＥＫ２９３ ＦまたはＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈ
ｅｒ）内に三量体を一時的に発現させた。ＨＥＫ２９３ Ｆ細胞内の三量体生成に使用さ
れるプロトコルは以前に記載されている（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｍｏｒｒｉｓ
ｅｔ ａｌ．，ｍＢｉｏ ８，ｅ０００３６－０００１７，２０１７）。切断されたＨ
Ｒ１再設計三量体では、トランスフェクション時にフューリンプラスミドを加えた。Ｅｘ
ｐｉＣＨＯ細胞内の三量体およびナノ粒子の生成に使用されるプロトコルは以下の通りで
ある。要約すると、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を解凍し、３７℃、１３５ｒｐｍおよび８％ＣＯ
２でシェーカーインキュベーター内で、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ）とともにインキュベートした。細胞が１０×１０６ｍｌ－１の密度に達
した際に、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地を加えて、トランスフェクションのために細
胞密度を６×１０６ｍｌ－１に低下させた。製造元の指示に従って、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞
での２００ｍｌトランスフェクション用にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ／
プラスミドＤＮＡ複合体を調製した。ＳＯＳＩＰおよびＨＲ１再設計三量体、ならびにＢ
Ｇ５０５ ＨＲ１再設計三量体を提示するＩ３－０１ナノ粒子では、１５．４ｍｌの冷Ｏ
ｐｔｉＰＲＯ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で１６０μｇの抗原プラス
ミド、６０μｇのフューリンプラスミドおよび６４０μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ
（商標）ＣＨＯ試薬を混合したのに対して、ＵＦＯおよびＵＦＯ２三量体ならびにＵＦＯ
２－ＢＧ－ＦＲナノ粒子では、フューリンを用いることなく２００μｇの抗原プラスミド
を使用した。１日目の最初のフィード後、Ｍａｘ Ｔｉｔｅｒプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ）に従って、３２℃、１２０ｒｐｍおよび８％ＣＯ２でシェーカーインキ
ュベーター内でＥｘｐｉＣＨＯ細胞を培養し、５日目に追加のフィードを行った。トラン
スフェクションの１３～１４日後に培養上清を採取し、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分
離することにより清澄化し、０．４５μｍフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を
使用して濾過した。三量体では、ガランツス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａ
ｌｉｓ）レクチン（ＧＮＬ）カラム（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用して上清からＥｎ
ｖタンパク質を抽出したが、ナノ粒子では、２Ｇ１２アフィニティーカラムを使用してＥ
ｎｖ融合タンパク質を精製した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／
３００ ＧＬカラムまたはＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｐ
Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ
Ｃ）によって、三量体をさらに精製してもよい。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００
ＧＬカラムを用いたＳＥＣによって、Ｉ３－０３ナノ粒子の純度を特性評価した。三量体
およびナノ粒子の両方について、理論吸光係数とともにＵＶ２８０吸光度を使用してタン
パク質濃度を決定した。
総および部位特異的グリコシル化プロファイルの分析：ＨＩＬＩＣ－ＵＰＬＣによって
、ＥｘｐｉＣＨＯおよび２９３ Ｆ生成三量体の総グリカンプロファイルを作製した。ペ
プチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）によるゲル内消化を介してエンベロ
ープ糖タンパク質からＮ－結合型グリカンを酵素的に放出させ、続いて２－アミノ安息香
酸（２－ＡＡ）を用いて蛍光標識し、ＨＩＬＩＣ－ＵＰＬＣによって分析した。Ｅｎｄｏ
Ｈによる放出されたグリカンの消化により、オリゴマンノース型グリカンの定量が可能
になった。イオン移動度ＭＳを使用してＰＮＧａｓｅ Ｆ消化によって三量体から放出さ
れたグリカンを分析することによって、グリカンの組成を決定した。ナノエレクトロスプ
レーイオン源を備えたＷａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２Ｓｉ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ
Ｃｏｒｐ．）を用いて、陰イオン質量、衝突誘起解離（ＣＩＤ）およびイオン移動度ス
ペクトルを記録した。Ｗａｔｅｒｓ Ｄｒｉｆｔｓｃｏｐｅ（バージョン２．８）ソフト
ウェアおよびＭａｓｓＬｙｎｘ（商標）（バージョン４．１）をデータの取得および処理
に使用した。以前に記載されているようにスペクトルを解釈した（Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ
ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３７６，４４－６０，２００８）。得られた結果を
試料特異的グリカンライブラリーの作製の基礎とし、これをその後の部位特異的Ｎグリコ
シル化分析に使用した。部位特異的Ｎグリコシル化分析では、消化前に、三量体を変性さ
せ、６Ｍ尿素および５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
／ＨＣｌ、ｐＨ８．０緩衝液中で室温（ＲＴ）で１時間インキュベートし、その後、２０
ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を加えてＲＴでさらに１時間暗所でインキュベートし
、次いでＤＴＴ（２０ｍＭ）を加えてさらに１時間インキュベートすることによりアルキ
ル化させて、残留ＩＡＡを除去した。Ｖｉｖａｓｐｉｎカラムを使用して、アルキル化三
量体をｐＨ８．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ中に緩衝交換し、トリプシンおよびキモ
トリプシン（質量分析グレード、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて１：３０（ｗ／ｗ）の比で別
個に消化した。ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｎｒｉｃｈ
ｍｅｎｔキット（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、プロテアーゼにより消
化された試料から糖ペプチドを選択した。高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）フラグメンテ
ーションを使用して、Ｏｒｂｉｔｒａｐ融合質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＬＣ‐ＥＳＩ ＭＳによって濃縮糖ペプチドを分析した
。Ｂｙｏｎｉｃ（商標）（バージョン２．７）およびＢｙｏｌｏｇｉｃ（商標）ソフトウ
ェア（バージョン２．３；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ）を使用して、デー
タ分析および糖ペプチド同定を行った。
ＢＮ－ＰＡＧＥ：ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ－ＰＡＧＥ
）によってＥｎｖタンパク質およびナノ粒子を分析し、クーマシーブルーを用いて染色し
た。タンパク質試料をＧ２５０ローディング色素と混合し、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ
ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に加えた。製造元の指示に
従って、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）ランニングバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＢＮ－ＰＡＧＥゲルを１５０Ｖで２．５時間泳動させた。
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）：２０℃～１２０℃、９０℃ｈ－１の走査速度でＰＢＳ緩
衝液中でＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰキャピラリー熱量計（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して、Ｕ
ＦＯ２－ＢＧ三量体、ＵＦＯ２－Ｕ三量体および三量体提示ナノ粒子の熱安定性を測定し
た。ＶＰキャピラリーＤＳＣ自動データ分析ソフトウェアを使用してデータを分析した。
結晶化のためのタンパク質の生成および精製：ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｓ細胞内
にクレードＢ ｔｉｅｒ－３ Ｈ０７８．１４ ＵＦＯ２－ＢＧ三量体を発現させ、２Ｇ
１２結合アフィニティーマトリックス、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
を使用して培養上清から精製した。Ｆａｂ ＰＧＴ１２４および３５Ｏ２２を哺乳動物Ｆ
ｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性にトランスフェクト
し、ＬＣ－λ捕捉選択カラムを使用して精製した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／
６０カラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーおよびＳＥＣによってさらに精製した
。Ｈ０７８．１４ ＵＦＯ２－ＢＧ三量体タンパク質とＰＧＴ１２４および３５Ｏ２２と
を１：３：２のモル比で室温で３０分間混合することによって、三量体複合体を調製した
。三量体複合体の不均一性を低減するために、エンドグリコシダーゼＨ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、２９３Ｓ細胞内で生成されたＨ０７８．１４ Ｕ
ＦＯ２－ＢＧ．６６４に対して一晩４℃で脱グリコシル化を行った。ＳＥＣによって複合
体をさらに精製した後に、三量体複合体を結晶試験に供した。
タンパク質の結晶化およびデータ収集：ＳＥＣにより精製したＨ０７８．１４ ＵＦＯ
２－ＢＧ三量体複合体を約５ｍｇ／ｍｌに濃縮した後、４℃および２０℃の両方で大規模
な結晶化試験に供した。０．１Ｍ酢酸カルシウム、０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１
５％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００から、ＵＦＯ２－ＢＧ三量体に結合したＦａｂ ＰＧＴ１２
４および３５Ｏ２２を含むタンパク質複合体の結晶を得、これを採取し、２５％グリセロ
ールを用いて凍結保護した後、液体窒素中で直ちにフラッシュ冷却した。現状では、最良
の結晶は６．２０Åの分解能で回折され、スタンフォードシンクロトロン放射光源のビー
ムライン１２‐２でデータを収集し、ＨＫＬ‐２０００を用いて処理し、単位格子定数ａ
＝ｂ＝１２９．３Å、ｃ＝３１４．５Åで９９．７％完全な空間群Ｐ６３で索引付けした
。
構造決定および精密化：３５Ｏ２２：ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４構造（ＰＤＢ：
５ＣＥＺ）の１つのプロトマーとＰＧＴ１２４ Ｆａｂ構造（ＰＤＢ：４Ｒ２６）とを有
するＰｈａｓｅｒを使用した分子置換（ＭＲ）によって、ＰＧＴ１２４および３５Ｏ２２
に結合したＨ０７８．１４ ＵＦＯ２‐ＢＧ三量体構造を解いた。Ｐｈｅｎｉｘを使用し
て構造を精密化し、Ｃｏｏｔをモデル構築に、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙを構造検証に用いた
。データセットの分解能が限られているため、残基精密化当たり２つのＢ因子群を使用し
た。さらに、拘束の参照モデルセットを使用して、位置座標の精密化を行った。複合体構
造の最終的なＲｃｒｙｓｔ値およびＲｆｒｅｅ値は２５．０％および３１．４％である。
ＰｙＭｏｌおよびＣｈｉｍｅｒａにより図を作製した。結晶構造では、残基はＦＡｂにつ
いてはＫａｂａｔ定義に従って、ｇｐ１４０についてはＨＸＢｃ２システムに従って番号
付けした。
ネガティブ染色電子顕微鏡法：ネガティブ染色ＥＭによってＵＦＯ２－ＢＧ三量体およ
び三量体提示ナノ粒子を分析した。約０．０１ｍｇ ｍｌ－１の三量体またはナノ粒子を
含有する３μＬアリコートを、２０ｍＡで３０秒間グロー放電させた炭素被覆４００Ｃｕ
メッシュグリッド上に１５秒間適用し、次いで２％（ｗ／ｖ）ギ酸ウラニルを用いて３０
秒間ネガティブ染色した。検体面上で２．０５Åのピクセルサイズをもたらす約２５ ｅ
－Å－２の電子線量および５２，０００倍の倍率を用いて１２０ｋＶで作動するＦＥＩ
Ｔｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｉｔ電子顕微鏡を使用してデータを収集した。１５００ｎｍの公
称焦点ずれ（ｎｏｍｉｎａｌ ｄｅｆｏｃｕｓ）とＬｅｇｉｎｏｎパッケージとを使用し
て、Ｔｉｅｔｚ ４ｋ×４ｋ ＴｅｍＣａｍ－Ｆ４１６ ＣＭＯＳカメラを用いて画像を
得た。ＤｏＧ Ｐｉｃｋｅｒを使用して生の顕微鏡写真からＵＦＯ２－ＢＧ三量体粒子を
自動的に選択させ、Ａｐｐｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ Ｐｉｃｋｅｒを使用して三量体提示ナ
ノ粒子を手動で選択した。ソフトウェアパッケージを使用して両方を粒子スタック内に入
れた。反復多変量統計分析（ＭＳＡ）／多参照アライメント（ＭＲＡ）により２つの瓶に
分割され、クラスにソートされた粒子を使用して、無参照２次元（２Ｄ）クラス平均を計
算した。三量体の質を分析するために（天然様および非天然）、以前に記載されたように
（ｄｅ Ｔａｅｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３，１７０２－１７１５，２０１５
）無参照２Ｄクラス平均を目視検査した。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）：Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６装置（ｆｏｒｔｅＢｉｏ，
Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｂＮＡｂおよび非ＮＡｂに対する
三量体およびナノ粒子の結合の動態を測定した。アッセイはいずれも、ＦｏｒｔｅＢｉｏ
１×動態バッファー中で１０００ｒｐｍに設定した撹拌により行った。すべての溶液の
最終容量は２００μｌ／ウェルであった。アッセイは、固体黒色９６ウェルプレート（Ｇ
ｅｉｇｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）で３０℃で行った。抗ヒトＦｃ捕捉バイオセンサー（ＡＨ
Ｃ）の表面に、１×動態バッファー中の５μｇ ｍｌ－１の抗体を３００秒間ローディン
グした。６０秒間のバイオセンサーベースライン工程を適用してから、溶液中でのバイオ
センサー上の抗体と抗原との結合を２００秒間にわたり分析した。サイズに応じて、三量
体では２００ｎＭ、ナノ粒子では１４～３５ｎＭから開始する抗原の２倍濃度勾配を６滴
定系列に使用した。相互作用の解離を３００秒間追跡した。抗体がローディングされたが
抗原とともにインキュベートされなかったセンサー、および抗体を含まないが抗原ととも
にインキュベートされたセンサーに関して記録された平均シフトを差し引くことによって
、ベースライン変動の補正を行った。ｆｏｒｔｅＢｉｏのデータ取得ソフトウェアｖ．８
．１によってＯｃｔｅｔデータを処理した。注目すべきことに、ａｐｅｘ指向ｂＮＡｂで
は、２：１相互作用を表す結合方程式を用いて実験データを適合させて、最適適合結果を
達成した。
Ｂ細胞活性化アッセイ：ＰＧＴ１２１、ＰＧＴ１４５またはＶＲＣＯ１を発現するＫ４
６ Ｂ細胞株の生成は以前に記載されている（Ｏｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１８９，４８１６－４８２４２０１２）。要約すると、１０％ＦＣＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔ
ｒｅｐ抗生物質、および２μｇ ｍｌ－１ピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したａ
ｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に、ドキシサイクリン誘導型のｂＮＡｂ Ｂ
細胞受容体（ＢＣＲ）を発現するＫ４６細胞を維持した。細胞を１μｇ ｍｌ－１ドキシ
サイクリン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中で一晩処理して、ヒトＢＣＲ発現を誘導した。３７℃
で１μＭのＩｎｄｏ－１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１時間ローディングし
た後、１０μｇ／ｍｌ－１の濃度の示された薬剤、すなわち、抗マウスＩｇＭ（Ｊａｃｋ
ｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）；Ｃ末端に融合されたＴヘルパーエピトープ（
ＰＡＤＲＥ）を有するＵＦＯ２－ＢＧまたはＨＲ１再設計ｇｐ１４０三量体；ＨＲ１再設
計ｇｐ１４０三量体を提示するＵＦＯ２‐ＢＧ‐ＦＲまたはＩ３‐０１ナノ粒子を用いて
、洗浄した細胞を刺激した。ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を用いてカルシ
ウム動員を評価した。各操作では、未刺激Ｂ細胞を最初に６０秒間記録し、試験用免疫原
を加え、十分に混合し、１８０秒間記録した後、１μｇ ｍｌ－１イオノマイシン（Ｓｉ
ｇｍａ）１μｌを加え、さらに６０秒間記録してｉｎｄｏのローディングを確認した。
マウスの免疫化および血清ＩｇＧ精製：Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから７
週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを購入した。承認されたＩＡＣＵＣプロトコルおよびＡＡＡＬ
ＡＣガイドラインに準拠して、ＴＳＲＩの環境制御室内の換気ケージにマウスを収容した
。製造元の指示に従って、０週目に、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路を介して、５０μｇの抗原
および１００μｌのＡｄｄａＶａｘアジュバント（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）または５０μｌ
のＰＩＫＡアジュバント（Ｙｉｓｈｅｎｇ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）を含有する２００μｌ
の抗原／アジュバント混合物を用いて、各マウスを免疫した。３週目および６週目に、Ａ
ｄｄａＶａｘまたはＰＩＫＡアジュバントに配合された５０μｇの抗原を用いて動物を追
加免疫した。８週目に、ヘパリン処理した毛細管を使用して、眼窩後膜（ｒｅｔｒｏ ｏ
ｒｂｉｔａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して動物を最終的に採血した。試料を等量のＰＢ
Ｓで希釈し、次いで１５ｍｌのＳｅｐＭａｔｅチューブ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）内で４．５
ｍｌのＦｉｃｏｌｌ／Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ上に重層し、１２００ＲＰＭで２０℃で１０
分間遠心して、血漿および細胞を分離した。血漿を５６℃で１時間加熱不活化し、１２０
０ＲＰＭで１０分間遠心し、滅菌濾過した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、１ｍｌのＡ
ＣＫ赤血球溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＭＣ
を２ｍｌのＢａｍｂａｎｋｅｒ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉａ（Ｌｙｍｐｈｏｔｅｃ
Ｉｎｃ．）に再懸濁した。脾臓も採取し、４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃ
ｏｎ）に接地して細胞懸濁液に脾細胞を放出した。細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、
次いで製造元の仕様に従って１０ｍｌのＲＢＣ溶解緩衝液を用いて処理し、細胞凍結のた
めにＢａｍｂａｎｋｅｒ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉａに再懸濁した。製造元の指示に
従って０．２ｍｌプロテインＧスピンキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を
使用して、マウス１匹当たりの全血清の１／３、すなわち血清６００μｌを精製した。Ｅ
ＬＩＳＡおよびＨＩＶ－１中和アッセイによる特性評価のために、各群内のマウス４匹か
ら得られた精製血清ＩｇＧを組み合わせた。
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）：まず、０．２μｇの適切な抗原を含有する５
０μｌのＰＢＳを用いて、Ｃｏｓｔａｒ（商標）９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎ
ｉｎｇ）の各ウェルをコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次い
で、ＰＢＳおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する洗浄緩衝液で５回洗
浄した。次いで、ＰＢＳ、２０ｍｇ ｍｌ－１ブロッティンググレードブロッカー（Ｂｉ
ｏ－Ｒａｄ）および５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳからなる１５０μｌのブロッキング緩衝液を用
いて、各ウェルをコーティングした。ブロッキング緩衝液とともにプレートを室温で１時
間インキュベートし、次いで、洗浄緩衝液で５回洗浄した。精製されたマウスＩｇＧをブ
ロッキング緩衝液中で最大濃度１００μｇ ｍｌ－１に希釈し、その後１０倍希釈系列を
作製した。各抗体希釈液について、合計５０μｌの容量を適切なウェルに加えた。各プレ
ートを室温で１時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で５回洗浄した。次いで、ホース
ラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：２０
００希釈液を洗浄緩衝液中で作製し、この希釈した二次抗体５０μｌを各ウェルに加えた
。二次抗体とともにプレートを室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で５回
洗浄した。最後に、５０μｌのＴＭＢ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて３～５分
間ウェルを反応させた後、５０μｌの２Ｎ硫酸を用いて反応を停止させた。得られたプレ
ートの読み取り値を４５０ｎｍの波長で測定した。
偽ウイルスの生成および中和アッセイ：前述のように、ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ発現プラス
ミドおよびＥｎｖ欠損ゲノム骨格プラスミド（ｐＳＧ３ΔＥｎｖ）により２９３ Ｔ細胞
をトランスフェクションすることにより、偽ウイルスを生成した。中和アッセイに使用す
るために、トランスフェクションの７２時間後に偽ウイルスを採取した。前述のように、
１回の複製偽ウイルスアッセイおよびＴＺＭ－ｂｌ標的細胞を使用して、精製マウス血清
ＩｇＧの中和活性を評価した。要約すると、ＴＺＭ－ｂｌ細胞を９６ウェル平底プレート
に播種した。このプレートに偽ウイルスを加え、これをマウス血清ＩｇＧの連続希釈液と
ともに３７℃で１時間プレインキュベートした。溶解、およびＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商
標）ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加により、感染７２時間後にルシフェラ
ーゼレポーター遺伝子発現を定量した。ＩＣ５０値を決定するために、非線形回帰により
用量反応曲線を適合させた。
マウスレパートリーシーケンシングおよびバイオインフォマティクス分析：前述のよう
に、マウスＢ細胞レパートリーのアンバイアストシーケンシング（ｕｎｂｉａｓｅｄ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）のために５’－ＲＡＣＥプロトコルを開発した。要約すると、ＲＮ
ｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、各マウスの総ＰＢＭＣから３０μ
ｌの水にＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）を抽出した。ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増
幅キット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を用いて５’－ＲＡＣＥを行った。総容量５０μｌのＰｌ
ａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、鋳型として５μｌのｃＤＮＡ、１μｌの５’－ＲＡＣＥプ
ライマー、および１μｌの１０μＭリバースプライマーを用いて免疫グロブリンＰＣＲを
設定した。５’－ＲＡＣＥプライマーにはＰＧＭ／Ｓ５ Ｐ１アダプターを含め、リバー
スプライマーにはＰＧＭ／Ｓ５ Ａアダプターを含めた。重鎖の５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲ
処理用のリバースプライマーとして、マウスの３’－Ｃγ１－３および３’－Ｃμインナ
ープライマーを適合させた。合計２５サイクルのＰＣＲを行い、予測されるＰＣＲ産物（
５００～６００ｂｐ）をゲル精製した（Ｑｉａｇｅｎ）。Ｉｏｎ Ｓ５システムを用いて
ＮＧＳを行った。要約すると、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット
とともにＱｕｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光光度計を使用して、同一群から得られた重鎖
ライブラリーを定量し、次いで、シーケンシングのために１：１：１：１の比を使用して
混合した。Ｉｏｎ ５２０／５３０ Ｅｘｔキットを使用してＩｏｎ Ｃｈｅｆを用いて
鋳型調製（Ｉｏｎ ５２０）およびチップローディングを行い、続いてデフォルト設定の
Ｉｏｎ Ｓ５システムを用いてシーケンシングを行った。マウスアンチボディオミクスパ
イプライン（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙｏｍｉｃｓ ｐｉｐｅｌｉｎｅ）を使用して
、生データを処理し、重鎖生殖細胞系遺伝子利用の分布を決定した。
［実施例７］
Ｔヘルパーエピトープを封入したナノ粒子
ＨＩＶ‐１ ｇｐ１４０とナノ粒子骨格とを接続するリンカーとしてのＴヘルパーエピ
トープの使用は、望ましい抗原性および免疫原性特性を有するＨＩＶ‐１三量体提示ナノ
粒子を生成したが（図１～図３）、このようなナノ粒子の集合はナノ粒子表面に露出した
疎水性Ｔヘルパーエピトープの影響を受けるように思われた。ナノ粒子集合および純度を
改善するために、Ｔ細胞ヘルパーエピトープをナノ粒子ワクチンの設計に組み込むための
代替戦略を検討した。外側表面上の抗原とナノ粒子骨格との間にＴヘルパーエピトープを
挿入する代わりに、短い柔軟なペプチドスペーサーを介してナノ粒子サブユニットのＣ末
端に、このＴヘルパーエピトープを遺伝的に融合した。予測される結果は、外側表面上に
提示された２０のＨＩＶ‐１ ｇｐ１４０三量体、およびナノ粒子シェル内に封入された
６０の疎水性Ｔヘルパーエピトープを有するナノ粒子ワクチンである（図４Ａ）。この設
計は、Ｅ２ｐおよびＩ３‐０１の両方が中空内部を有する大きな６０量体ナノケージであ
り、ほとんどすべてのタンパク質が溶液中での安定性を達成するために疎水性コアと荷電
／親水性表面とを好むという観察に基づいて考案された。
全反応性ＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥを用いて、この戦略を試験した。構築物設定
では、いずれもスペーサーの前に酵素部位（ＡＳ）を含む１Ｇスペーサー（Ｅ２ｐの場合
）または１０ａａ ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳスペーサー（Ｉ３－０１の場合）を用いて、ナ
ノ粒子サブユニットのＮ末端にＨＩＶ‐１ ＢＧ５０５ ｇｐ１４０のＣ末端を融合し、
次いで、５ａａ ＧＧＧＧＳスペーサーを用いて、ナノ粒子サブユニットのＣ末端にＰＡ
ＤＲＥのＮ末端を融合した。得られた２つの融合構築物を２５ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞
内に一過性に発現させ、２Ｇ１２抗体アフィニティーカラムを使用して精製した。Ｓｕｐ
ｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ
ＥＣ）によって、得られたタンパク質を分析した。両構築物について、良好に形成された
ナノ粒子に対応する６～７ｍＬのピークが観察された（図４Ｂ）。比較的小規模なトラン
スフェクション（図１Ｆの２５ｍｌ対１００ｍｌ）を考慮すると、実際のナノ粒子の収率
は、Ｔヘルパーエピトープがナノ粒子の外部のリンカーとして使用される設計と比較して
著しく改善された。ネガティブ染色ＥＭによって、２Ｇ１２により精製されたナノ粒子を
さらに分析した。表面にスパイクを有する完全に集合したナノ粒子は、ネガティブ染色Ｅ
Ｍから得られた生の顕微鏡写真から認識することができる（図４Ｃ）。まとめると、ＳＥ
ＣおよびＥＭデータから、Ｔヘルパーエピトープ封入が、Ｔ細胞ヘルプを組み込んだＨＩ
Ｖ‐１ナノ粒子ワクチンを設計するための有効な戦略を提示する可能性があることが確認
された。
短いペプチドスペーサーを介して、自己集合ナノ粒子のサブユニットのＣ末端にＴヘル
パーエピトープを融合することができる。上記のナノ粒子のサブユニットのＮ末端にＨＩ
Ｖ－１ ｇｐ１４０のＣ末端を融合することができる。これらの融合サブユニットがナノ
粒子に集合すると、ナノ粒子の外側表面上に８個または２４個のＨＩＶ－１ ｇｐ１４０
三量体が提示され、ナノ粒子シェル内部に２４個または６０個のＴヘルパーエピトープが
封入される。ナノ粒子の外側表面上のＨＩＶ－１ ｇｐ１４０三量体は抗ＨＩＶ－１ Ｂ
細胞応答を誘発し、ナノ粒子内部のＴヘルパーエピトープの高密度クラスターはナノ粒子
タンパク質の消化時に広範囲な反応性Ｔ細胞応答を誘発する。
このように、本発明は広範囲に開示され、上記の代表的な実施形態を参照して例示され
ている。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更を加えるこ
とができることが理解される。
さらに、本明細書に引用されているすべての刊行物、配列アクセッション番号、特許お
よび特許出願は、それぞれが個々にそのように示されているかのように、あらゆる目的の
ために参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれることに留意されたい。参照
により本明細書に組み込まれる本文に含まれる定義は、本開示における定義と矛盾する場
合には除外される。

Claims (36)

  1. 自己集合ナノ粒子上に提示されるＨＩＶ－１ Ｅｎｖ由来三量体タンパク質を含み、Ｔ
    ヘルパーエピトープ配列が、（ａ）前記ナノ粒子サブユニットの前記Ｃ末端に融合される
    のに対して、前記ＨＩＶ－１三量体タンパク質サブユニットが前記ナノ粒子サブユニット
    の前記Ｎ末端に融合されるか、（ｂ）前記ナノ粒子サブユニットのＮ末端に前記ＨＩＶ－
    １三量体タンパク質を結合する、ＨＩＶ－１ワクチン免疫原。
  2. 前記Ｔヘルパーエピトープ配列が、配列番号１～３のいずれか１つに示される配列、そ
    の保存的に改変された変異体または実質的に同一の配列を含む、請求項１に記載のＨＩＶ
    －１ワクチン免疫原。
  3. 前記ナノ粒子サブユニットの前記Ｃ末端が、短いペプチドスペーサーを介して前記Ｔヘ
    ルパーエピトープの前記Ｎ末端に融合される、請求項１に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫
    原。
  4. 前記ＨＩＶ－１三量体タンパク質サブユニットが、第２のペプチドスペーサーを介して
    前記ナノ粒子サブユニットの前記Ｎ末端に融合される、請求項３に記載のＨＩＶ－１ワク
    チン免疫原。
  5. 前記Ｔヘルパーエピトープ配列が前記ナノ粒子内に封入される、請求項３に記載のＨＩ
    Ｖ－１ワクチン免疫原。
  6. 前記自己集合ナノ粒子が三量体配列を含む、請求項１に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫
    原。
  7. 前記自己集合ナノ粒子のサブユニットが、（ａ）配列番号１８に示されるポリペプチド
    、その保存的に改変された変異体もしくは実質的に同一の配列、（ｂ）配列番号５～１７
    のいずれか１つに示されるポリペプチド、その保存的に改変された変異体もしくは実質的
    に同一の配列、（ｃ）Ｅ２ｐまたは（ｄ）フェリチンである、請求項１に記載のＨＩＶ－
    １ワクチン免疫原。
  8. 前記ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ由来三量体タンパク質がｇｐ１４０である、請求項１に記載の
    ＨＩＶ－１ワクチン免疫原。
  9. 前記ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ由来三量体タンパク質が、未切断融合前最適化（ＵＦＯ）ｇｐ
    １４０三量体である、請求項１に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫原。
  10. 前記ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体が、ＨＩＶ－１株ＢＧ５０５由来の改変されたｇｐ４１
    ＥＣＴＯドメインを含むキメラ三量体である、請求項９に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫
    原。
  11. 前記ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ由来三量体がＵＦＯ ｇｐ１４０三量体であり、前記自己集合
    ナノ粒子が、配列番号１８および５～１７のいずれか１つに示されるサブユニット配列を
    用いて生成され、前記Ｔヘルパーエピトープが、配列番号１に示される配列を含む、請求
    項９に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫原。
  12. 自己集合ナノ粒子上に提示されるＨＩＶ－１ Ｅｎｖ由来三量体タンパク質を含み、前
    記自己集合ナノ粒子のサブユニットが、配列番号１８および５～１７のいずれか１つに示
    されるポリペプチド、その保存的に改変された変異体または実質的に同一の配列を含み、
    リンカー配列が、（ａ）前記ナノ粒子サブユニットの前記Ｃ末端に融合されるのに対して
    、前記ＨＩＶ－１三量体タンパク質サブユニットが前記ナノ粒子サブユニットの前記Ｎ末
    端に融合されるか、（ｂ）前記ナノ粒子サブユニットの前記Ｎ末端に前記ＨＩＶ－１三量
    体タンパク質を結合する、ＨＩＶ－１ワクチン免疫原。
  13. 前記ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ由来三量体タンパク質が、未切断融合前最適化（ＵＦＯ）ｇｐ
    １４０三量体である、請求項１２に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫原。
  14. 前記ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体が、ＨＩＶ－１株ＢＧ５０５由来の改変されたｇｐ４１
    ＥＣＴＯドメインを含むキメラ三量体である、請求項１３に記載のＨＩＶ－１ワクチン免
    疫原。
  15. 前記リンカー配列が、Ｔヘルパーエピトープ配列もしくはグリシン－セリンリンカーま
    たはその両方を含む、請求項１２に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫原。
  16. 前記リンカー配列が、配列番号１～３のいずれか１つに示される配列、その保存的に改
    変された変異体または実質的に同一の配列を含む、請求項１２に記載のＨＩＶ－１ワクチ
    ン免疫原。
  17. 前記リンカー配列が、ＧＧＧＧＳ（配列番号４）またはＧＳＧＳＧ（配列番号１９）の
    １～５個のタンデム反復を含む、請求項１２に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫原。
  18. 前記リンカー配列が、短いペプチドスペーサーを介して前記ナノ粒子サブユニットの前
    記Ｃ末端に融合され、第２のペプチドスペーサーが、前記ナノ粒子サブユニットの前記Ｎ
    末端に前記ＨＩＶ－１三量体タンパク質サブユニットを結合する、請求項１２に記載のＨ
    ＩＶ－１ワクチン免疫原。
  19. 請求項１に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫原をコードする単離または組換えポリヌクレ
    オチド。
  20. 請求項１２に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫原をコードする単離または組換えポリヌク
    レオチド。
  21. 請求項１に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫原と、薬学的に許容される担体とを含む医薬
    組成物。
  22. アジュバントをさらに含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 請求項１２に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫原と、薬学的に許容される担体とを含む医
    薬組成物。
  24. アジュバントをさらに含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 対象のＨＩＶ－１感染を予防する方法であって、請求項１に記載のＨＩＶ－１ワクチン
    免疫原の治療有効量を前記対象に投与し、それにより前記対象のＨＩＶ－１感染を予防す
    ることを含む方法。
  26. ＨＩＶ－１ワクチン免疫原が、ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体と、配列番号１８および５～
    １７のいずれか１つに示されるサブユニット配列を用いて生成された自己集合ナノ粒子と
    、配列番号１に示される配列を含むＴヘルパーエピトープ配列とを含み、前記Ｔヘルパー
    エピトープ配列が、（ａ）短いペプチドスペーサーを介して前記ナノ粒子サブユニットの
    前記Ｃ末端に融合されるのに対して、前記ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体サブユニットが前記
    ナノ粒子サブユニットの前記Ｎ末端に融合されるか、（ｂ）前記ナノ粒子サブユニットの
    前記Ｎ末端に前記ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体サブユニットをそのＣ末端で共有結合する、
    請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ナノ粒子サブユニットの前記Ｃ末端に融合された前記Ｔヘルパーエピトープ配列が
    、前記ナノ粒子の自己集合時に前記ナノ粒子内に封入される、請求項２６に記載の方法。
  28. 対象のＨＩＶ－１感染を予防する方法であって、請求項１２に記載のＨＩＶ－１ワクチ
    ン免疫原の治療有効量を前記対象に投与し、それにより前記対象のＨＩＶ－１感染を予防
    することを含む方法。
  29. ＨＩＶ－１ワクチン免疫原が、ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体と、配列番号１８および５～
    １７のいずれか１つに示されるサブユニット配列を用いて生成された自己集合ナノ粒子と
    、配列番号１に示される配列を含むＴヘルパーエピトープ配列とを含み、前記Ｔヘルパー
    エピトープ配列が、（ａ）短いペプチドスペーサーを介して前記ナノ粒子サブユニットの
    前記Ｃ末端に融合されるのに対して、前記ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体サブユニットが前記
    ナノ粒子サブユニットの前記Ｎ末端に融合されるか、（ｂ）前記ナノ粒子サブユニットの
    前記Ｎ末端に前記ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体をそのＣ末端で共有結合する、請求項２８に
    記載の方法。
  30. 前記ナノ粒子サブユニットの前記Ｃ末端に融合された前記Ｔヘルパーエピトープ配列が
    、前記ナノ粒子の自己集合時に前記ナノ粒子内に封入される、請求項２９に記載の方法。
  31. 対象のＨＩＶ－１感染を治療するか、対象にＨＩＶ－１に対する免疫応答を誘発する方
    法であって、請求項１に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫原の治療有効量を含む医薬組成物
    を前記対象に投与し、それにより前記対象のＨＩＶ－１感染を治療するか、前記対象にＨ
    ＩＶ－１に対する免疫応答を誘発することを含む方法。
  32. ＨＩＶ－１ワクチン免疫原が、ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体と、配列番号１８および５～
    １７のいずれか１つに示されるサブユニット配列を用いて生成された自己集合ナノ粒子と
    、配列番号１に示される配列を含むＴヘルパーエピトープ配列とを含み、前記Ｔヘルパー
    エピトープ配列が、（ａ）短いペプチドスペーサーを介して前記ナノ粒子サブユニットの
    前記Ｃ末端に融合されるのに対して、前記ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体サブユニットが前記
    ナノ粒子サブユニットの前記Ｎ末端に融合されるか、（ｂ）前記ナノ粒子サブユニットの
    前記Ｎ末端に前記ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体をそのＣ末端で共有結合する、請求項３１に
    記載の方法。
  33. 前記ナノ粒子サブユニットの前記Ｃ末端に融合された前記Ｔヘルパーエピトープ配列が
    、前記ナノ粒子の自己集合時に前記ナノ粒子内に封入される、請求項３２に記載の方法。
  34. 対象のＨＩＶ－１感染を治療するか、対象にＨＩＶ－１に対する免疫応答を誘発する方
    法であって、請求項１２に記載のＨＩＶ－１ワクチン免疫原の治療有効量を含む医薬組成
    物を前記対象に投与し、それにより前記対象のＨＩＶ－１感染を治療するか、前記対象に
    ＨＩＶ－１に対する免疫応答を誘発することを含む方法。
  35. ＨＩＶ－１ワクチン免疫原が、ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体と、配列番号１８および５～
    １７のいずれか１つに示されるサブユニット配列を用いて生成された自己集合ナノ粒子と
    、配列番号１に示される配列を含むＴヘルパーエピトープ配列とを含み、前記Ｔヘルパー
    エピトープ配列が、（ａ）短いペプチドスペーサーを介して前記ナノ粒子サブユニットの
    前記Ｃ末端に融合されるのに対して、前記ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体サブユニットが前記
    ナノ粒子サブユニットの前記Ｎ末端に融合されるか、（ｂ）前記ナノ粒子サブユニットの
    前記Ｎ末端に前記ＵＦＯ ｇｐ１４０三量体をそのＣ末端で共有結合する、請求項３４に
    記載の方法。
  36. 前記ナノ粒子サブユニットの前記Ｃ末端に融合された前記Ｔヘルパーエピトープ配列が
    、前記ナノ粒子の自己集合時に前記ナノ粒子内に封入される、請求項３５に記載の方法。
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