JP2023141905A - 炎症性腸疾患の予防又は治療剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】炎症性腸疾患の予防又は治療剤、炎症性腸疾患の発症が予防されたモデル非ヒト動物、炎症性腸疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】ｍｉＲ－１５０の阻害剤を有効成分とする、炎症性腸疾患の予防又は治療剤；ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損している、炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物；炎症性腸疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養する工程と、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｍｉＲ－１５０の発現量を測定する工程と、を含み、前記ｍｉＲ－１５０の発現量が、前記被験物質の非存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養した場合と比較して低下したことが、前記被験物質が炎症性腸疾患の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。【選択図】なし
Description
本発明は、炎症性腸疾患の予防又は治療剤に関する。より詳細には、本発明は、炎症性腸疾患の予防又は治療剤、炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物、及び、炎症性腸疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法に関する。
潰瘍性大腸炎やクローン病に代表される炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）は、免疫異常に基づく多様な病態を示す疾患である。炎症性腸疾患は、炎症抑制薬により一時的に病態を抑えることができても、再発、再然を繰り返す慢性疾患であり、治療の副作用にも注意を要する代表的難病である。
近年、日本においても、炎症性腸疾患患者数が増大している。炎症性腸疾患は、発症機構が解明されておらず、決定的な治療法が見出されていない。このため、厚生労働省の特定疾患に指定されており、新規治療法の開発が急務とされている。
炎症性腸疾患の発症機構を解明し、副作用の少ない有効性の高い分子標的薬の開発が求められている。現在は、分子標的薬として、抗ＴＮＦ抗体や抗インテグリンα４β７抗体等の抗体医薬を繰り返し注射するという患者の苦痛を伴う対症療法が行われているのが現状である。
発明者らは、以前に、炎症性腸疾患モデルマウスを作製した（特許文献１を参照）。このマウスは、Ｔ細胞特異的にＲＡＳ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１ａ（Ｒａｐ１ａ）及びＲＡＳ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１ｂ（Ｒａｐ１ｂ）を欠損したマウス（以下、Ｒａｐ１ ＫＯマウスという。）であり、大腸炎及び大腸癌を自然発症する。
ところで、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とは、タンパク質に翻訳されない２０～２５塩基程度の長さの一本鎖ＲＮＡであり、ヒトを含む生物に多数存在することが知られている。ヒトゲノムには１，０００以上のｍｉＲＮＡがコードされていると考えられている。
ｍｉＲＮＡは、次のような工程を経て生合成される。まず、ｍｉＲＮＡ遺伝子から一次転写産物であるｐｒｉｍａｒｙ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）が転写される。続いて、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡがプロセシングされ、特徴的なヘアピン構造を有する約７０塩基のｐｒｅｃｕｒｓｏｒ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）が生成される。続いて、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが核内から細胞質に輸送されてプロセシングされ、成熟型ｍｉＲＮＡが生成される。
成熟型ｍｉＲＮＡは、標的となるｍＲＮＡに相補的に結合してｍＲＮＡの翻訳を抑制するか、あるいはｍＲＮＡを分解することにより、遺伝子発現の転写後制御に関与していると考えられている。ｍｉＲＮＡは、発生、細胞増殖、細胞分化、アポトーシス、代謝等の広範な生物学的プロセスに重要な役割を担うことが知られている。
近年、ｍｉＲＮＡに対して非常に強力にかつ特異的に結合するｔｉｎｙ ＬＮＡ（人工核酸よりなる８塩基程度の小さな核酸医薬）等が開発され、ｍｉＲＮＡの働きを抑制するｍｉＲＮＡ阻害剤を実用化する研究が進展している（例えば、非特許文献１を参照。）。ｍｉＲＮＡ阻害剤等の核酸医薬品は、低分子医薬品、抗体医薬品に続く第３の医薬品といわれており、抗体医薬を凌駕する有効性と安全性が期待でき、従来の医薬品では治療が難しかった疾患を根治する可能性を秘めている。
Yamamoto T., et al., Highly Potent GalNAc-Conjugated Tiny LNA Anti-miRNA-122 Antisense Oligonucleotides, Pharmaceutics, 13 (6), 817, 2021.
本発明は、炎症性腸疾患の予防又は治療剤、炎症性腸疾患の発症が予防されたモデル非ヒト動物、炎症性腸疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］ｍｉＲ－１５０の阻害剤を有効成分とする、炎症性腸疾患の予防又は治療剤。
［２］前記ｍｉＲ－１５０が、5'-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3'（配列番号１）又は5'-CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG-3'（配列番号２）の塩基配列を有する、［１］に記載の炎症性腸疾患の予防又は治療剤。
［３］ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損している、炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物。
［４］炎症性腸疾患モデル非ヒト動物において、ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損した非ヒト動物である、［３］に記載の炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物。
［５］前記炎症性腸疾患モデル非ヒト動物が、Ｔ細胞特異的にＲＡＳ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１ａ（Ｒａｐ１ａ）及びＲＡＳ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１ｂ（Ｒａｐ１ｂ）を欠損した非ヒト動物である、［４］に記載の炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物。
［６］炎症性腸疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養する工程と、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｍｉＲ－１５０の発現量を測定する工程と、を含み、前記ｍｉＲ－１５０の発現量が、前記被験物質の非存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養した場合と比較して低下したことが、前記被験物質が炎症性腸疾患の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
［１］ｍｉＲ－１５０の阻害剤を有効成分とする、炎症性腸疾患の予防又は治療剤。
［２］前記ｍｉＲ－１５０が、5'-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3'（配列番号１）又は5'-CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG-3'（配列番号２）の塩基配列を有する、［１］に記載の炎症性腸疾患の予防又は治療剤。
［３］ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損している、炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物。
［４］炎症性腸疾患モデル非ヒト動物において、ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損した非ヒト動物である、［３］に記載の炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物。
［５］前記炎症性腸疾患モデル非ヒト動物が、Ｔ細胞特異的にＲＡＳ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１ａ（Ｒａｐ１ａ）及びＲＡＳ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１ｂ（Ｒａｐ１ｂ）を欠損した非ヒト動物である、［４］に記載の炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物。
［６］炎症性腸疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養する工程と、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｍｉＲ－１５０の発現量を測定する工程と、を含み、前記ｍｉＲ－１５０の発現量が、前記被験物質の非存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養した場合と比較して低下したことが、前記被験物質が炎症性腸疾患の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
本発明により、炎症性腸疾患の予防又は治療剤、炎症性腸疾患の発症が予防されたモデル非ヒト動物、炎症性腸疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。
［ｍｉＲＮＡの表記］
本明細書において、ヒト型ｍｉＲＮＡにはｈｓａの略称を使用する。また、マウス型ｍｉＲＮＡにはｍｍｕの略称を使用する。また、前駆体型ｍｉＲＮＡにはｍｉｒを使用し、成熟型ｍｉＲＮＡにはｍｉＲを使用する。しかしながら、場合により、これらを厳密に区別せずに記載する場合がある。
本明細書において、ヒト型ｍｉＲＮＡにはｈｓａの略称を使用する。また、マウス型ｍｉＲＮＡにはｍｍｕの略称を使用する。また、前駆体型ｍｉＲＮＡにはｍｉｒを使用し、成熟型ｍｉＲＮＡにはｍｉＲを使用する。しかしながら、場合により、これらを厳密に区別せずに記載する場合がある。
［炎症性腸疾患の予防又は治療剤］
一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ－１５０の阻害剤を有効成分とする、炎症性腸疾患の予防又は治療剤を提供する。ここで、ｍｉＲ－１５０は、成熟型のｍｉＲＮＡ １５０を意味する。
一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ－１５０の阻害剤を有効成分とする、炎症性腸疾患の予防又は治療剤を提供する。ここで、ｍｉＲ－１５０は、成熟型のｍｉＲＮＡ １５０を意味する。
実施例において後述するように、発明者らは、炎症性腸疾患モデル非ヒト動物及び炎症性腸疾患患者のＴ細胞において、ｍｉＲ－１５０の発現量が増加することを明らかにした。また、炎症性腸疾患モデル非ヒト動物のｍｉＲ－１５０をノックアウトすると、大腸炎の発症が全く認められなくなることを明らかにした。これらの結果は、ｍｉＲ－１５０の阻害剤が炎症性腸疾患の予防又は治療剤となることを示す。
本実施形態の予防又は治療剤において、ｍｉＲ－１５０は哺乳動物のｍｉＲＮＡであることが好ましく、なかでも、ヒト、サル等の霊長類、マウス等のげっ歯類のｍｉＲＮＡであることが好ましい。特に、ヒトの炎症性腸疾患の予防又は治療のためには、ｍｉＲ－１５０はヒトのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０）であることが好ましい。
ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０は、前駆体であるｈｓａ－ｍｉｒ－１５０から生成される。ｈｓａ－ｍｉｒ－１５０の塩基配列は5'-CUCCCCAUGGCCCUGUCUCCCAACCCUUGUACCAGUGCUGGGCUCAGACCCUGGUACAGGCCUGGGGGACAGGGACCUGGGGAC-3'（配列番号３）である。
ｈｓａ－ｍｉｒ－１５０から、成熟型ｍｉＲＮＡである、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－３ｐが生成される。ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐの塩基配列は5'-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3'（配列番号１）であり、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－３ｐの塩基配列は5'-CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG-3'（配列番号２）である。
ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐは、ｈｓａ－ｍｉｒ－１５０の塩基配列の第１６番目から第３７番目に対応する。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－３ｐは、ｈｓａ－ｍｉｒ－１５０の塩基配列の第５１番目から第７２番目に対応する。
本実施形態の予防又は治療剤において、ｍｉＲ－１５０の阻害剤は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐの阻害剤であってもよいし、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－３ｐの阻害剤であってもよい。
なお、マウスｍｉＲＮＡであるｍｍｕ－ｍｉＲ－１５０－５ｐは、ヒトｍｉＲＮＡであるｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐと同一の塩基配列を有している。また、マウスｍｉＲＮＡであるｍｍｕ－ｍｉＲ－１５０－３ｐは、ヒトｍｉＲＮＡであるｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－３ｐと同一の塩基配列を有している。したがって、本実施形態の予防又は治療剤は、炎症性腸疾患モデルマウスに対しても炎症性腸疾患の予防又は治療効果を有する。
ｍｉＲ－１５０の阻害剤は、ｍｉＲ－１５０の機能を阻害するものであれば特に限定されず、一本鎖又は二本鎖の核酸断片であってよい。ｍｉＲ－１５０の阻害剤として機能する核酸断片は、少なくとも一部がｍｉＲ－１５０にハイブリダイズするものである。ｍｉＲ－１５０の阻害剤として機能する核酸断片は、一部又は全部が、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）等の修飾核酸であってもよい。
ｍｉＲ－１５０の阻害剤として機能する核酸断片の具体例として、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｔｏｕｇｈ Ｄｅｃｏｙ（Ｓ－ＴｕＤ）、ＩＤＴ（登録商標）ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｔｉｎｙ ＬＮＡ等が挙げられる。
Ｓ－ＴｕＤは、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡを主な構成成分とする２本鎖ＲＮＡであり、Ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ（ＭＢＳ）がＲＩＳＣ複合体化した成熟型ｍｉＲＮＡに特異的に結合し、低濃度でもｍｉＲＮＡ活性を強力に阻害する。Ｓ－ＴｕＤは、株式会社ジーンデザインより入手することができる。
ＩＤＴ（登録商標）ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡとＺＥＮという特殊修飾を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手することができる。
上述した炎症性腸疾患の予防又は治療剤は、薬学的に許容される担体とともに、炎症性腸疾患の予防又は治療用医薬組成物として製剤化されていてもよい。炎症性腸疾患の予防又は治療用医薬組成物をヒト又は非ヒト動物の生体に投与することにより、炎症性腸疾患の予防又は治療を行うことができる。
製剤化は、有効成分（ｍｉＲ－１５０の阻害剤）及び薬学的に許容される担体を組み合わせて一般的な製剤技術により行うことができる。医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤等の形態で非経口的に投与することができる。
薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤等が挙げられる。
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
医薬組成物は、上述したｍｉＲ－１５０の阻害剤と、上述した薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分（ｍｉＲ－１５０の阻害剤）を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．０１～５０ｍｇの有効成分を投与すればよい。
また、医薬組成物の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人１日あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分を１日１回又は２～４回程度に分けて投与すればよい。
［炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物］
一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損している、炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物を提供する。本実施形態に係る発明は、非ヒト動物の炎症性腸疾患を予防する方法であって、前記非ヒト動物のｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損させる工程を含む方法に係る発明であるということもできる。
一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損している、炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物を提供する。本実施形態に係る発明は、非ヒト動物の炎症性腸疾患を予防する方法であって、前記非ヒト動物のｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損させる工程を含む方法に係る発明であるということもできる。
本実施形態のモデル非ヒト動物は、炎症性腸疾患モデル非ヒト動物において、ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損した非ヒト動物であることが好ましい。ここで、炎症性腸疾患モデル非ヒト動物としては、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した非ヒト動物が挙げられる。
実施例において後述するように、発明者らは、炎症性腸疾患モデルマウスのｍｉＲ－１５０をノックアウトすると、大腸炎の発症が全く認められなくなることを明らかにした。この結果は、ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損した非ヒト動物は、炎症性腸疾患が予防されていることを示す。
非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物が挙げられる。非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット等のげっ歯類、サル等の霊長類が挙げられる。マウスＲａｐ１ａ遺伝子のｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿１４５５４１であり、マウスＲａｐ１ｂ遺伝子のｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０２４４５７である。非ヒト動物がマウス以外の動物である場合には、各動物種におけるＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂが欠損していればよい。
本実施形態のモデル非ヒト動物において、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損しているとは、機能的なＲａｐ１ａタンパク質及びＲａｐ１ｂタンパク質の発現が抑制されているか、又は欠損していることを意味する。例えば、ゲノム上のＲａｐ１ａアレルの一部又は全部、及びＲａｐ１ｂアレルの一部又は全部が欠失（ノックアウト）していてもよいし、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等の導入によりＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂの発現が抑制（ノックダウン）されていてもよい。
Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損させる方法としては、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ－ＬｏｘＰシステムを用いる方法が挙げられる。例えば、Ｒａｐ１ａアレル及びＲａｐ１ｂアレルのそれぞれを、Ｃｒｅリコンビナーゼの標的配列であるＬｏｘＰ配列で挟んだ非ヒト動物（ｆｌｏｘ非ヒト動物）（以下、「Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物」という場合がある。）と、Ｔ細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼタンパク質をコードする遺伝子を連結した発現ユニットを導入した非ヒト動物とを交配させる方法が挙げられる。
Ｔ細胞特異的に発現する遺伝子としては、例えば、ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ（Ｌｃｋ）、ＣＤ４等が挙げられる。以下、Ｌｃｋ遺伝子のプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼタンパク質をコードする遺伝子を連結した発現ユニットを有する非ヒト動物を「Ｌｃｋ－Ｃｒｅ非ヒト動物」という場合がある。また、ＣＤ４遺伝子のプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼタンパク質をコードする遺伝子を連結した発現ユニットを有する非ヒト動物を「ＣＤ４－Ｃｒｅ非ヒト動物」という場合がある。
Ｒａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆ非ヒト動物と、Ｌｃｋ－Ｃｒｅ非ヒト動物又はＣＤ４－Ｃｒｅ非ヒト動物とを交配させると、子孫の中に、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した非ヒト動物が出現する。Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した非ヒト動物は、炎症性腸疾患モデル非ヒト動物として利用することができ、大腸炎及び大腸癌を自然発症する。
例えば、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した非ヒト動物と、ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損した非ヒト動物とを交配させることにより、子孫の中に、炎症性腸疾患モデル非ヒト動物において、ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損した非ヒト動物を得ることができる。
［炎症性腸疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法］
一実施形態において、本発明は、炎症性腸疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養する工程と、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｍｉＲ－１５０の発現量を測定する工程と、を含み、前記ｍｉＲ－１５０の発現量が、前記被験物質の非存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養した場合と比較して低下したことが、前記被験物質が炎症性腸疾患の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、炎症性腸疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養する工程と、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｍｉＲ－１５０の発現量を測定する工程と、を含み、前記ｍｉＲ－１５０の発現量が、前記被験物質の非存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養した場合と比較して低下したことが、前記被験物質が炎症性腸疾患の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法を提供する。
実施例において後述するように、発明者らは、炎症性腸疾患の患者のＴ細胞、及び、炎症性腸疾患モデルマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞では、ｍｉＲ－１５０の発現量が上昇していることを明らかにした。また、発明者らは、炎症性腸疾患モデルマウスにおいて、ｍｉＲ－１５０を欠損させると、大腸炎が予防されることを明らかにした。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｍｉＲ－１５０の発現量を低下させる薬物は、炎症性腸疾患の予防又は治療剤となり得る。
本実施形態のスクリーニング方法により、炎症性腸疾患の予防又は治療剤をスクリーニングすることができる。被験物質としては、特に限定されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒト由来の細胞であってもよいし、マウス等の非ヒト動物由来の細胞であってもよい。ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ヒト由来の細胞である場合、当該細胞は、健常人由来の細胞であってもよいし、炎症性腸疾患患者由来の細胞であってもよい。あるいは、Ｒａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損した細胞であってもよい。
ＣＤ４＋Ｔ細胞が、マウス由来の細胞である場合、当該細胞は、野生型の細胞であってもよいし、炎症性腸疾患モデルマウス由来の細胞であってもよい。炎症性腸疾患モデルマウスとしては、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したマウスを好適に利用することができる。
ＣＤ４＋Ｔ細胞の精製は、例えば、フローサイトメーターを用いたソーティングにより行ってもよいし、磁気ビーズを用いた市販のキットを用いて行ってもよい。
ｍｉＲ－１５０の発現量の測定は、定量的リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロッティング等により行うことができる。ｍｉＲ－１５０の発現量としては、成熟型のｍｉＲ－１５０の発現量を測定することが好ましい。
被験物質の存在下で培養したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｍｉＲ－１５０の発現量が、被験物質の非存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養した場合と比較して低下した場合、当該被験物質は炎症性腸疾患の予防又は治療剤の候補である。
［その他の実施形態］
一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ－１５０の阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、炎症性腸疾患の予防又は治療方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ－１５０の阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、炎症性腸疾患の予防又は治療方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、炎症性腸疾患の予防又は治療における使用のための、ｍｉＲ－１５０の阻害剤を提供する。
一実施形態において、本発明は、炎症性腸疾患の予防又は治療剤を製造するための、ｍｉＲ－１５０の阻害剤の使用を提供する。
これらの各実施形態において、ｍｉＲ－１５０の阻害剤については上述したものと同様である。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（炎症性腸疾患に関連するｍｉＲＮＡの同定）
発明者らは、以前に、炎症性腸疾患モデルマウスを作製した（特許文献１を参照。）。このマウスは、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したマウス（以下、Ｒａｐ１ ＫＯマウスという。）であり、大腸炎及び大腸癌を自然発症する。
（炎症性腸疾患に関連するｍｉＲＮＡの同定）
発明者らは、以前に、炎症性腸疾患モデルマウスを作製した（特許文献１を参照。）。このマウスは、Ｔ細胞特異的にＲａｐ１ａ及びＲａｐ１ｂを欠損したマウス（以下、Ｒａｐ１ ＫＯマウスという。）であり、大腸炎及び大腸癌を自然発症する。
野生型マウス及びＲａｐ１ ＫＯマウスの脾臓からナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を回収し、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体でコートしたプレート上で４８時間培養して活性化させた。続いて、各細胞からＲＮＡを抽出し、次世代シーケンサーでｍｉＲＮＡを網羅的にシーケンスした。その結果、野生型のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、Ｒａｐ１欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞において、発現量が有意に上昇したｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１５０に着目した。
続いて、定量的リアルタイムＰＣＲにより、ｍｉＲ－１５０の発現量の上昇の再現性を確認した。ｍｉＲ－１５０としては、ｍｍｕ－ｍｉＲ－１５０－５ｐの発現量を測定した。
図１は、野生型マウス及びＲａｐ１ ＫＯマウスの脾臓から回収したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で刺激して活性化させた場合における、ｍｉＲ－１５０の発現量の経時変化を、定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。
その結果、野生型のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、Ｒａｐ１欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ｍｉＲ－１５０の発現量が有意に上昇していることが明らかとなった。また、野生型のＣＤ４＋Ｔ細胞では、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による刺激によって、ｍｉＲ－１５０の発現量が低下した。これに対し、Ｒａｐ１欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞では、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で刺激しても、ｍｉＲ－１５０の発現量が低下しなかったことが明らかとなった。
［実験例２］
（ヒトＴ細胞におけるｍｉＲ－１５０の発現量の測定）
クローン病患者（６名、３２～６７歳）、潰瘍性大腸炎患者（６名、４０～７７歳）、健常人（１０名、２８～５７歳）の末梢血からＴ細胞を精製し、ｍｉＲ－１５０の発現量を定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。ｍｉＲ－１５０としては、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐの発現量を測定した。
（ヒトＴ細胞におけるｍｉＲ－１５０の発現量の測定）
クローン病患者（６名、３２～６７歳）、潰瘍性大腸炎患者（６名、４０～７７歳）、健常人（１０名、２８～５７歳）の末梢血からＴ細胞を精製し、ｍｉＲ－１５０の発現量を定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。ｍｉＲ－１５０としては、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐの発現量を測定した。
図２（ａ）及び（ｂ）は、ｍｉＲ－１５０の発現量の測定結果を示すグラフである。図２（ａ）は健常人及びクローン病患者の結果を比較したものである。また、図２（ｂ）は健常人及び潰瘍性大腸炎患者の結果を比較したものである。
その結果、炎症性腸疾患の患者のＴ細胞では、ｍｉＲ－１５０の発現量が上昇する傾向が認められた。この結果は、炎症性腸疾患にｍｉＲ－１５０が関連することを更に支持するものである。
［実験例３］
（ｍｉＲ－１５０のノックアウト）
ｍｉＲ－１５０－／－マウス（ジャクソン・ラボラトリー）とＲａｐ１ ＫＯマウスを交配し、ｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウスを作製した。図３は、本実験例の概要を説明する模式図である。続いて、ｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウスにおける大腸炎の症状を検討した。
（ｍｉＲ－１５０のノックアウト）
ｍｉＲ－１５０－／－マウス（ジャクソン・ラボラトリー）とＲａｐ１ ＫＯマウスを交配し、ｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウスを作製した。図３は、本実験例の概要を説明する模式図である。続いて、ｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウスにおける大腸炎の症状を検討した。
図４は、ｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウス及びコントロールマウスの体重変化を測定した結果を示すグラフである。図４中、「ＤＫＯ」はｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウスの結果であることを示し、「Ｒａｐ１ ＫＯ」はＲａｐ１ ＫＯマウス（ｍｉＲ－１５０＋／＋Ｒａｐ１ ＫＯマウス）の結果であることを示し、「１５０ＫＯ」はｍｉＲ－１５０－／－マウスの結果であることを示し、「ｆ／ｆ」はＲａｐ１ａｆ／ｆＲａｐ１ｂｆ／ｆマウスの結果であることを示す。
その結果、ｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウスでは、Ｒａｐ１ ＫＯマウスで認められる体重減少が抑制されたことが明らかとなった。この結果は、ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損することで、炎症性腸疾患が予防されることを示唆する。
図５は、ｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウス及びコントロールマウスにおける、大腸粘膜固有層中のＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の数を測定した結果を示すグラフである。図５中、「ＤＫＯ」はｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウスの結果であることを示し、「ＫＯ」はＲａｐ１ ＫＯマウス（ｍｉＲ－１５０＋／＋Ｒａｐ１ ＫＯマウス）の結果であることを示し、「１５０」はｍｉＲ－１５０－／－マウスの結果であることを示し、「ＷＴ」は野生型マウスの結果であることを示す。
その結果、Ｒａｐ１ ＫＯマウスでは、大腸粘膜固有層中のＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の数の増加が認められたことが明らかとなった。これに対し、ｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウスでは、大腸粘膜固有層中のＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の数の増加が認められないことが明らかとなった。この結果は、ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損することで、炎症性腸疾患が予防されることを更に支持するものである。
［実験例４］
（大腸組織の病理学的解析）
ｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウス及びコントロールマウスの大腸組織の切片をヘマトキシリン・エオシン染色し、病理組織学的解析を行った。コントロールマウスとしては、野生型マウス、Ｒａｐ１ ＫＯマウス、ｍｉＲ－１５０－／－マウスを使用した。
（大腸組織の病理学的解析）
ｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウス及びコントロールマウスの大腸組織の切片をヘマトキシリン・エオシン染色し、病理組織学的解析を行った。コントロールマウスとしては、野生型マウス、Ｒａｐ１ ＫＯマウス、ｍｉＲ－１５０－／－マウスを使用した。
図６は、各マウスの大腸組織の切片の顕微鏡画像である。スケールバーは１ｍｍを示す。図６中、「ＷＴ」は、野生型マウスの結果であることを示し、「ＣＤ４ Ｒａｐ１ ＫＯ」は、Ｒａｐ１ ＫＯマウスの結果であることを示し、「ｍｉＲＮＡ１５０ ＫＯ」は、ｍｉＲ－１５０－／－マウスの結果であることを示し、「ＤＫＯ」は、ｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウスの結果であることを示す。
その結果、Ｒａｐ１ ＫＯマウスでは大腸炎が認められた。これに対し、ｍｉＲ－１５０－／－Ｒａｐ１ ＫＯマウスでは大腸炎が全く認められないことが明らかとなった。この結果は、ｍｉＲ－１５０のノックアウトにより、炎症性腸疾患を予防又は治療できることを示す。
本発明により、炎症性腸疾患の予防又は治療剤、炎症性腸疾患の発症が予防されたモデル非ヒト動物、炎症性腸疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。
Claims (6)
- ｍｉＲ－１５０の阻害剤を有効成分とする、炎症性腸疾患の予防又は治療剤。
- 前記ｍｉＲ－１５０が、5'-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3'（配列番号１）又は5'-CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG-3'（配列番号２）の塩基配列を有する、請求項１に記載の炎症性腸疾患の予防又は治療剤。
- ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損している、炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物。
- 炎症性腸疾患モデル非ヒト動物において、ｍｉＲ－１５０をホモ又はヘテロに欠損した非ヒト動物である、請求項３に記載の炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物。
- 前記炎症性腸疾患モデル非ヒト動物が、Ｔ細胞特異的にＲＡＳ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１ａ（Ｒａｐ１ａ）及びＲＡＳ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１ｂ（Ｒａｐ１ｂ）を欠損した非ヒト動物である、請求項４に記載の炎症性腸疾患が予防されたモデル非ヒト動物。
- 炎症性腸疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養する工程と、
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｍｉＲ－１５０の発現量を測定する工程と、を含み、
前記ｍｉＲ－１５０の発現量が、前記被験物質の非存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を培養した場合と比較して低下したことが、前記被験物質が炎症性腸疾患の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
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