CN118252938A - 抑制或敲除Jun基因表达的试剂用于治疗射血分数保留的心衰的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及疾病治疗领域，具体地提供了能够抑制或敲除Jun基因表达的试剂在射血分数保留的心衰（HFpEF）治疗中的应用以及筛选药物的方法。
Description
技术领域
本发明涉及疾病治疗领域，具体地提供了能够抑制或敲除Jun基因表达的试剂在射血分数保留的心衰（HFpEF）治疗中的应用以及筛选药物的方法。
背景技术
心血管疾病代表着医学挑战的难题之一，心衰更是心血管疾病患者死亡的主要原因，也是临床面临的一大难题，包括收缩功能障碍的心衰和舒张功能障碍的心衰，其中舒张功能障碍的心衰随着医学的发展，也被更广泛的定义为射血分数保留的心衰。射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)是整个工业化世界发病率和死亡率的主要原因，并且其患病率正以惊人的速度增长。HFpEF目前占所有HF的50%，患有这种综合性疾病的患者会出现心衰的典型症状，包括劳力不耐受、呼吸困难、肺部、皮下组织和腹腔中的血管外液蓄积，以及经常导致因紧急利尿而住院的间歇性心血管失代偿。HFpEF这一定义排除了诸如心脏淀粉样变性、遗传性肥厚性心肌病、瓣膜病和其他具有明确病因的疾病。HFpEF更多是指的患者其病理生理学涉及多器官综合征，其中心脏、肺、肾、骨骼、免疫、炎症、代谢和其他成分共同导致的结果。重要的是，HFpEF是一种高发病率和高死亡率的综合征，据统计全世界因HF的死亡率为35%，其中HFpEF占比大于50%。
迄今为止，关于HFpEF的基础研究几乎也是空白的，且缺乏很少有效的药物疗法被证明可以改变HFpEF患者的疾病进展和预后，从而产生了巨大的未满足的临床需求。
发明内容
本申请的发明人首次发现Jun是HFpEF发生发展的重要调控因子。由此提供了以下发明。
抑制或敲除Jun基因表达
在一个方面，本发明提供了能够抑制或敲除Jun基因表达的试剂在制备用于预防和/或治疗射血分数保留的心衰（HFpEF）的药物中的用途。还提供了用于预防和/或治疗射血分数保留的心衰（HFpEF）的方法，所述方法包括向有此需要的受试者（例如人）施用有效量的能够抑制或敲除Jun基因表达的试剂。在某些实施方案中，所述治疗至少包括改善心脏舒张功能，例如降低舒张功能参数E/E’和/或E/A。
本文所述的能够抑制或敲除Jun基因表达的试剂可以通过任何机制破坏Jun基因的表达，例如通过在RNA或蛋白质水平上抑制Jun的表达，例如敲除Jun基因，降低或抑制基因的转录，和/或，降低或抑制该基因的mRNA产物的翻译。
在某些实施方案中，表达水平的测定可以在核酸水平或蛋白水平实施。在核酸水平测定表达的方法包括但不限于Northern印迹、PCR、RT-PCR或实时(real)RT-PCR。在蛋白水平测定表达的方法包括但不限于Western印迹或聚丙烯酰胺凝胶电泳联合蛋白染色技术如考马斯亮蓝或银染、质谱、ELISA等。
基因编辑系统
在某些实施方案中，所述能够抑制或敲除Jun基因表达的试剂是基因编辑系统。本领域技术人员熟知使用基因编辑系统对靶基因（例如Jun）进行敲低或敲除。
在某些实施方案中，所述基因编辑系统可以是现在已知的任何位点特异性(序列特异性)基因组编辑系统。在某些实施方案中，所述基因组编辑系统包括至少一种位点特异性核酸酶，例如RNA引导的核酸酶（例如Cas核酸酶）、锌指核酸酶、兆碱基大范围核酸酶、TALE-核酸酶、重组酶、转座酶、以及它们的任何组合。在某些实施方案中，所述位点特异性核酸内切酶靶向Jun基因，在靶点处诱导DNA断裂，通过例如同源重组（HR）或非同源末端连接（NHEJ）完成修饰以导致Jun基因的破坏。
在某些实施方案中，所述基因编辑系统选自CRISPR/Cas、TALEN、ZFN、转座子技术、PASTE技术、PE技术、碱基编辑器、以及它们的任何组合。
在某些实施方案中，所述基因编辑系统包含RNA引导的核酸内切酶以及指导RNA（gRNA），gRNA包含与靶标基因座中的靶序列具有互补性的指导序列。在某些实施方案中，所述基因编辑系统存在于一种或多种载体上。
在某些实施方案中，所述基因编辑系统为CRISPR/Cas系统，其包含Cas效应蛋白（包括不限于Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas13a(C2c2)、C2c3、Cas13b）以及相应的指导RNA(gRNA)。CRISPR/Cas系统通过指导RNA(gRNA)将Cas酶蛋白募集到靶标基因座以完成修饰，gRNA包含与靶标基因座中的靶序列具有互补性的指导序列。在某些实施方案中，所述gRNA可以是嵌合指导RNA或单一指导RNA(sgRNA)。在某些实施方案中，gRNA包含指导序列和tracr配对序列(或直接重复序列)。在某些实施方案中，gRNA包含指导序列、tracr配对序列(或直接重复序列)和tracr序列。在某些实施方案中，所述CRISPR-Cas系统不包含和/或不依赖于tracr序列的存在（例如，如果Cas蛋白是Cas12a）。
RNA干扰剂
在某些实施方案中，所述能够抑制或敲除Jun基因表达的试剂包括RNA干扰剂。
在本文中，表述“RNA干扰剂”是指，通过RNA干扰(RNAi)机制来抑制靶基因表达的任何试剂。“RNA干扰(RNAi)”是一种进化上保守的过程，其中与靶基因相同或高度相似的序列的RNA的表达或引入导致从该靶基因转录的信使RNA(mRNA)的序列特异性降解或特异性转录后基因沉默(PTGS)，从而抑制靶基因的表达。
因此，本领域技术人员知晓，可以根据Jun编码基因或其转录生成的mRNA的序列选取靶序列设计小干扰RNA（siRNA）或者小RNA（microRNA、miRNA）分子。该siRNA或者miRNA分子可以干扰基因的转录、翻译或转录、翻译后的修饰，进而影响蛋白的表达。
在本文中，所述siRNA是指Small interfering RNA，是一种小RNA分子，由大约21-25个核苷酸组成，由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成，siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。
在本文中，所述微小RNA(miRNA)是指天然存在的一类非编码RNA分子，长度约为21-25个核苷酸，它们基于与靶mRNA的序列互补，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控。miRNA可参考miRBase数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)。
此外，为了延长siRNA对靶基因表达的抑制作用，可以设计一对特定的寡核苷酸序列，退火后克隆至载体中，该重组载体的转录产物即短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA），其可以自身折叠配对成茎长为19-21个碱基的茎环（stem-loop）结构，其中该19-21个碱基即来源于靶基因mRNA的一段特定序列，这种茎环结构的前体在细胞内很快被切割形成有功能的siRNA。这种载体表达的shRNA经剪切形成的siRNA具有表达量稳定、待续时间长的特点，从而可引起目标基因表达的长效抑制。
在某些实施方案中，所述RNA干扰剂选自小干扰RNA (siRNA)、小发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)。
反义寡核苷酸
在某些实施方案中，所述试剂包括反义寡核苷酸。
在本文中，表述“反义寡核苷酸”是指，与有义核酸互补的分子，例如与Jun基因的编码链互补或与Jun基因的mRNA序列互补。因此，所述反义寡核苷酸可以与有义核酸形成氢键(即与其退火)。反义寡核苷酸可以与编码Jun的核酸序列的整个编码链互补，或仅与其一部分互补，例如全部或部分蛋白质编码区(或开放阅读框)。反义寡核苷酸也可以与编码Jun的核酸序列的编码链的全部或部分非编码区反义。反义寡核苷酸的长度可以是例如约5、10、15、20、25、30或更多个核苷酸。
可以使用本领域已知的程序使用化学合成和酶促连接反应构建上述反义寡核苷酸。例如，可以使用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸化学合成，所述修饰的核苷酸被设计成增加分子的生物稳定性或增加反义和有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。或者，可以使用表达载体以生物学方式产生上述反义寡核苷酸，该表达载体包含克隆至其中的靶核酸，从插入的核酸转录的RNA将具有与靶核酸的反义方向。
在获得所述RNA干扰剂或反义寡核苷酸后，可以使用如上所述的方法进一步测定该RNA干扰剂或反义寡核苷酸对Jun的mRNA或蛋白表达水平的抑制活性。
施用
本文所述的试剂可以与药学上可接受的载体和/或赋形剂形成药物组合物施用。“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。
本文所述的试剂可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用。优选给药途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径。肠胃外给药是指通常通过注射而不是肠内和局部给药的给药方式，包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，可经由非肠胃外途径施用，比如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。
本文所述的试剂可以被配制成与其预期施用途径相兼容的剂型。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本文所述的试剂，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。
本文所述的试剂可以以剂量单位形式配制以易于施用。剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗对象的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的经计算与所需的药物载体联合以产生的期望的治疗效果的活性成分。
本文所述的试剂施用于有此需要的受试者。在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者为人。
药物筛选
在另一方面，本发明提供了筛选用于预防和/或治疗射血分数保留的心衰（HFpEF）的药物的方法，所述方法包括筛选Jun抑制剂的步骤。所述筛选步骤在体外进行。
在某些实施方案中，所述Jun抑制剂能够抑制或下调Jun基因的表达、或抑制或阻断Jun蛋白的活性。
在某些实施方案中，所述Jun抑制剂选自本文中所述的能够抑制或敲除Jun基因表达的试剂。
在某些实施方案中，所述Jun抑制剂选自特异性结合Jun蛋白的亲和分子，由此抑制或阻断Jun蛋白的活性。在某些实施方案中，所述亲和分子选自小分子化合物。
在某些实施方案中，所述筛选Jun抑制剂的步骤包括：检测受试试剂能否抑制Jun基因表达或Jun蛋白活性；选择能够抑制Jun基因表达或Jun蛋白活性的受试试剂作为候选药物。在某些实施方案中，所述表达水平包括蛋白水平和/或mRNA水平。
在某些实施方案中，所述筛选Jun抑制剂的步骤包括：(1) 使受试试剂与能够表达Jun基因的细胞接触；(2) 测定Jun基因的表达水平或Jun蛋白的活性；(3) 将步骤(2)的测定结果与不存在所述受试试剂时的测定结果进行比较；(4) 选择具有抑制所述基因表达或蛋白活性的能力的受试试剂作为候选药物。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“射血分数保留的心衰（HFpEF）”是指在心室收缩功能正常或轻度减低的情况下，心室舒张功能受损和顺应性减低使心室充盈减少和充盈压升高，从而导致肺循环和体循环淤血的一类临床综合征。HFpEF典型地是指舒张功能障碍的心衰。在某些实施方案中，HFpEF的临床诊断标准主要包括：（1）存在心衰的症状和（或）体征；（2）心脏影像学检查（主要指TTE检查）提示LVEF ≥ 50%；（3）存在与左心室舒张功能不全和（或）左心室充盈压升高一致的心脏结构和（或）功能异常的客观证据，其中左心室舒张功能不全和(或)心室充盈压升高的结构和(或)功能异常指标主要包括：（a）平均E/e'比值>15；（b）左心房容积指数＞40 ml/m2(心房颤动)。
如本文中所使用的，术语“Jun”是指Jun原癌基因,AP-1转录因子亚基（Jun proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit），也称为AP1、AP-1、cJUN或c-Jun。Jun可以是人源的，也可以是来自其它物种（例如，非人哺乳动物、鱼、爬行动物或鸟，例如啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊、灵长类等）的同源基因。Jun的序列是本领域技术人员熟知的，可参见各种公共数据库，人Jun的示例性基因序列可参见GenBank: NM_002228.4，示例性蛋白序列可参见NCBI: NP_002219.1；小鼠Jun的示例性基因序列可参见Ensembl：ENSMUSG00000052684，NCBI Gene ID: 16476，示例性蛋白序列可参见UniProtKB: P05627，NCBI: NP_034721.1。
如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定（即，不再恶化）疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状（无论部分或全部），无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比（如果未接受治疗），延长存活期。
如本文中所使用的，术语“有效量”至少是实现特定病症的可测量改善或预防需要的最小浓度。本文中的有效量可以随诸如患者的疾病状态，年龄，性别，和重量，和抗体引发个体中期望的应答的能力等因素而变化。有效量也是治疗有益效果超过治疗的任何毒性或不利效果的量。为了预防性使用，有益或期望的结果包括如下的结果，诸如消除或降低风险，减轻严重性，或者延迟疾病的发作，包括疾病的生物化学，组织学和/或行为症状，其并发症和疾病形成期间呈现的中间病理学表型。为了治疗性使用，有益或期望的结果包括临床结果，诸如减少源自疾病的一种或多种症状，提高那些患有疾病的对象的生命质量，降低治疗疾病需要的其它药物的剂量，增强另一种药物的效果(诸如经由靶向)，延迟疾病的进展，和/或延长存活。可以在一次或多次施用中施用有效量。
有益效果
本申请的发明人首次发现Jun是HFpEF发生发展的重要调控因子，通过抑制或敲除Jun基因表达能够很好的遏制HFpEF的发生发展，改善舒张功能，从而用于HFpEF的预防和治疗，具有重要的临床价值。此外，还提供了筛选用于预防和/或治疗HFpEF的药物的方法。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1：HFpEF模型的构建。A：实验流程示意图；B：小鼠喂养5周后舒张功能（E/A）的检测结果；C：小鼠喂养5周后舒张功能（E/E’）的检测结果。
图2：HFD+L-NAME喂养15周之后心肌细胞Jun的相对表达量，表明Jun在HFpEF模型小鼠中高表达。
图3：Myh6-creERT2/Jun-Rosa26LSL/-小鼠的Jun过表达效率检测。A: 实验流程示意图；B：实时定量PCR检测Jun-OE在他莫昔芬又到第五天的过表达程度；C：免疫荧光染色证明Jun在Jun-OE小鼠过表达；D：Jun-OE小鼠在肺组织和心脏组织免疫荧光染色。
图4：Myh6-cre ERT2 /Jun-Rosa26 LSL/- 小鼠的舒张功能检测。A: 小鼠左室舒张功能检测示意图；B：小鼠左室 E/A 统计结果；C：小鼠左室 E/E’ 统计结果。
图5：Jun flox/flox小鼠的构建策略示意图。
图6：Jun flox/flox小鼠的F1代小鼠5’同源臂和3’同源臂PCR鉴定电泳图。数字：F1代小鼠编号；WT：野生型对照；M：1kb DNA ladder。
图7：Myh6-cre ERT2 /Jun flox/flox小鼠的PCR鉴定电泳图（2%琼脂糖凝胶）。
图8：敲除Jun可以有效缓解HFpEF的发生发展。
序列信息
本申请涉及的序列的描述提供于下表中。
表1：序列信息。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本申请所要求保护的范围。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实验材料及方法
动物：C57BL/6N野生型小鼠购自北京维通利华；Myh6-cre ERT2 小鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司，品系全名为C57BL/6Smoc-Myf6 em1(CreERT2-pA)Smoc （南方模式生物，NM-KI-200125）；Jun-Rosa26 LSL/LSL 小鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司，其为利用CRISPR/Cas9技术获得的条件性过表达CAG-LSL-Jun-IRES-EGFP-WPRE-pA基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠；Jun flox/flox小鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司，其为使用CRISPR/Cas9技术获得的可进行条件性敲除的Jun基因flox杂合子小鼠。
试剂如下表所示。
表2：试剂信息。
动物实验准则
本实施例中，所有动物研究均根据中国国家心血管病中心阜外医院动物保健和使用委员会实验动物中心的指导下进行。所有小鼠均在同一环境下进行扩繁和饲养，实验过程将小鼠随机分组。超声心动图分析由不知道研究目标的的独立研究者进行。
常规超声检测
所有小鼠在不同条件下喂养五周之后开始进行常规超声检测，每隔两周测一次，一直到十五周检测结束。具体地，使用配备MS400换能器(Visual Sonics)的VisualSonicsVevo 2100系统进行经胸超声心动图。左心室射血分数（LVEF）和其他收缩功能指标是从心室中部水平的短轴M型扫描获得的，如乳头肌的存在所表明的，在有意识的、轻轻约束的小鼠中。在麻醉小鼠中获得心尖四腔视图，用于在二尖瓣水平使用脉冲波和组织多普勒成像进行舒张功能测量。麻醉由2.5%异氟醚诱导，并通过对其中一只后爪上的坚定压力缺乏反应来证实。在超声心动图采集期间（在体温控制条件下）异氟烷降低至1.0-1.5%，并进行调整以将心率保持在每分钟500次的范围内。收集的参数包括：心率、左心室舒张末期直径、左心室收缩末期直径、舒张末期室间隔壁厚度、左心室舒张末期后壁、左心室缩短分数、LVEF、多普勒血流峰值舒张早期穿过二尖瓣的速度、舒张晚期穿过二尖瓣的峰值多普勒血流速度、等容舒张时间、舒张早期和早期充盈减速时间二尖瓣环处心肌松弛速度的组织多普勒峰值。在程序结束时，所有小鼠都从麻醉中恢复过来，没有任何异常。所有参数至少测量3次，并给出平均值。超声检测包括收缩功能及舒张功能检测。
实施例1：Jun的表达与HFpEF存在相关性。
1.1 射血分数保留的心衰模型诱导
八周龄到十周龄雄性C57BL/6N野生型小鼠被分为三组，即正常组（正常饮食饮水），模型组（高脂饮食配合给予N-硝基-L-精氨酸甲酯）。其中，模型组通过以下文献记载的方式进行造模：Gabriele G. Schiattarella等人，Nitrosative stress drives heartfailure with preserved ejection fraction，https://doi.org/10.1038/s41586-019-1100-z。具体地，使用高脂饮食(HFD) (60%千卡，来自脂肪(猪油))和N-硝基-L-精氨酸甲酯（缩写为L-NAME，于饮用水中0.5g/L）的方式来诱导射血分数保留的心衰，得到HFpEF动物模型。
在模型诱导第五周检测小鼠的收缩功能参数LVEF并没有发生变化，而舒张功能参数（E/E’）在模型诱导第五周时显著升高，表明已成功获得了前述文献所记载的射血分数保留的心衰模型，同时，五周时模型对照组和模型治疗组舒张功能参数（E/E’）无显著区别，在基线相同的情况下进行后续给药处理，如图1所示。
1.2Jun的表达与HFpEF的相关性
在模型诱导到15周的时候，采用灌流的方法将正常小鼠和小鼠HFpEF动物模型的心肌细胞提取分离，进行定量RCR检测具体操作如下。
1.2.1. 成年鼠心肌细胞分离：
为了从成年小鼠心脏中分离心肌细胞，我们采用经典的灌流的方法分离心肌细胞。具体小鼠在处死前20分钟向小鼠注射100μl肝素钠（在50ml中1000个单位）以防止操作过程中心脏凝血增大消化难度，之后，将小鼠麻醉，处死，取出心脏将心脏转移到无钙液中进行洗涤，之后使用Langendorff的方法进行消化，使用Langendorff装置用无钙液灌注心脏5分钟，然后用消化酶液（0.7mg / ml II型胶原酶和0.7mg / ml牛血清白蛋白无钙液）消化大约30分钟，大约20分钟的时候不断去触碰心脏，当心脏变软变滑表明消化基本结束，之后收集来自心室的组织，剪碎，并轻轻吹打解离成单个细胞，静置沉降，取上清，去掉没消化的及粘连的组织，100g 4℃ 离心2分钟，得到心肌细胞沉淀，上清则大部分为非心肌细胞，心肌细胞用含有10%FBS的无钙液重悬，用于后续实验，非心肌细胞可以用培养基或者PBS重选用于后续实验，如果为了得到更纯的心肌细胞和非心肌细胞，可以将细胞悬浮液离心（100g，室温下2分钟）三次，以将心肌细胞与非心肌细胞分离。收集心肌细胞用于进一步的实验。
1.2.2. 定量PCR检测：
使用GeneJet RNA纯化试剂盒（Thermo Scientific，K0732）从细胞中提取总RNA，并使用iScript TM cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，1708890）逆转录0.1μg总RNA以产生cDNA，使用ABI Vii7实时系统（Life Technologies，Q6）上的iTaqUniversl SYBR Green supermix（1725121，Bio-Rad）进行qPCR（引物F为SEQ ID NO: 1；引物R为SEQ ID NO: 2），b-Actin，用于标准化定量分析。如图2所示，与正常小鼠对比，在小鼠HFpEF动物模型中显著地观察到Jun的高表达。这表明，在小鼠中Jun的表达量与HFpEF存在相关性，在HFpEF中，Jun是高表达的。
实施例2：Jun过表达导致射血分数保留的心衰
2.1Jun过表达转基因小鼠
利用心肌细胞特异的cre工具鼠Myh6-cre ERT2 与Jun过表达的小鼠Jun-Rosa26 LSL/LSL 杂交得到Myh6-cre ERT2 /Jun-Rosa26 LSL/- 小鼠，即通过他莫昔芬诱导的Jun在心肌细胞特异的过表达小鼠。Myh6-cre ERT2 小鼠与Jun-Rosa26 LSL/LSL 小鼠均为上海南方模式生物科技股份有限公司构建。
Myh6-cre ERT2 的品系全名为C57BL/6Smoc-Myf6 em1(CreERT2-pA)Smoc ，将CreERT2-pA插入到小鼠Myf6基因起始密码子处，Myf6-CreERT2与含有loxP位点侧翼序列的小鼠品系杂交，诱导Cre介导的重组将导致后代myf6阳性的细胞（心肌细胞）中侧翼序列的缺失。
Jun-Rosa26 LSL/LSL 小鼠的构建采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，在Rosa26基因位点定点插入CAG-LSL-Jun-IRES-EGFP-WPRE-pA表达框。
Myh6-cre ERT2 与Jun-Rosa26 LSL/LSL 杂交得到Myh6-cre ERT2 /Jun-Rosa26 LSL/- 小鼠，该小鼠为条件性过表达小鼠模型，其中，他莫昔芬诱导Cre重组酶cre ERT 在心肌细胞中的特异性表达，其识别LSL中的两个LoxP并剪切其间的终止子，使得Myh6阳性细胞持续表达Jun。
2.2 表达效率检测
我们研究发现，小鼠在他莫昔芬诱导6天左右死亡（图3，A）。首先，我们检测了老鼠的过表达效率，在他莫昔芬给药第五天，分离小鼠的心肌细胞，并提取RNA进行实时定量聚合酶链式反应（PCR）检测Jun表达水平，发现，Myh6-creERT2/Jun-Rosa26LSL/- 小鼠的心肌细胞Jun的表达量相对对照组上调十倍左右（图3，B）符合预期。接着，在蛋白水平我们用免疫荧光染色也证明了Jun在Myh6-cre ERT2 /Jun-Rosa26 LSL/- 小鼠心脏切片中表达更高（图3，C），此外，通过对Myh6-creERT2/Jun-Rosa26LSL/-小鼠肺组织切片和心脏切片进行Tag即GFP的染色，确实只有心脏切片检测到GFP的表达（图3，D）。通过这些数据，我们得出结论，Myh6- cre ERT2 /Jun-Rosa26 LSL/ 可以实现Jun在心肌细胞特异的过表达。
2.3 舒张功能变化检测
经过实验，我们证明成年小鼠心肌细胞Jun过表达之后收缩功能及结构参数没有发生显著变化，也排除了爆发性心肌炎导致的死亡，发生心房变大淤血，出现严重的肺淤血，综合考虑，我们猜测小鼠发生舒张功能障碍的心衰，即射血分数保留的心衰，因此，我们对小鼠的舒张功能评价指标（E/E’及E/A）进行检测。正如我们预测的，Myh6-cre ERT2 /Jun- Rosa26 LSL/- 小鼠他莫昔芬诱导后第三天并没有发生显著变化，但在第四天一直到第五天，小鼠心脏舒张功能发生明显异常即E/A的值以及E/E’的值在第四天显著增高，第五天加剧（图4，A-C）。因此，我们可以得出结论成年小鼠心肌细胞Jun过表达之后，小鼠发生急性射血分数保留的心衰导致小鼠死亡。
实施例3：Jun敲除逆转射血分数保留的心衰。
3.1 概述
利用心肌细胞特异的cre工具鼠Myh6-cre ERT2 （南方模式生物，NM-KI-200125）与Jun基因经flox修饰的小鼠Jun flox/flox杂交得到Myh6-cre ERT2 /Jun flox/flox小鼠，该小鼠可以通过他莫昔芬诱导Jun在心肌细胞特异的敲除。Myh6-cre ERT2 /Jun flox/flox小鼠在本文中可简称为Jun-KO小鼠。
心肌细胞特异的cre工具鼠Myh6-cre ERT2 的品系全名为C57BL/6Smoc-Myf6 em1 (CreERT2-pA)Smoc ，将CreERT2-pA插入到小鼠Myf6基因起始密码子处。Myf6（myogenic factor6）肌原因子6，是一种参与肌肉发育的DNA结合蛋白。Myf6-CreERT2与在目的基因两侧插入loxp位点的小鼠品系（即flox小鼠）杂交，诱导Cre介导的重组将导致后代myf6阳性的细胞中Loxp之间的基因片段的删除。
Jun基因经flox修饰的小鼠Jun flox/flox的小鼠构建策略示意图如图5所示，利用同源重组原理，采用受精卵同源重组的方式，对Jun基因进行flox修饰。简要过程如下：通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA；通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体（donor vector），该载体包含3.1 kb 5’同源臂、2.2 kb的flox区域和3.0 kb 3’同源臂。将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得9只阳性F1代小鼠。F1代小鼠即为Jun基因经flox修饰的小鼠Jun flox/flox。
3.2 靶点及相关序列
目的基因名称（Ensembl号）：Jun（ENSMUSG00000052684）；
目的基因Ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000052684;r=4:95049034-95052222;t=ENSMUST00000107094；
方案针对的转录本（Ensembl号）：Jun-201（ENSMUST00000107094.1）；
Flox针对的exon：exon 1；
gRNA1为SEQ ID NO: 3；
gRNA2为SEQ ID NO: 4；
5’同源臂序列为SEQ ID NO: 5；
flox区域（loxp-Jun片段-loxp）序列为SEQ ID NO: 6；
3’同源臂序列为SEQ ID NO: 7。
3.3基因型鉴定
5’同源臂PCR鉴定的引物为：引物I(Forward)为SEQ ID NO: 8；引物II(Reverse)为 SEQ ID NO: 9。
3’同源臂引物为：引物III(Forward)为SEQ ID NO: 10；引物IV(Reverse)为SEQID NO: 11。
F1代小鼠5’和3’同源臂PCR鉴定电泳结果如图6所示。PCR鉴定阳性小鼠为：12、13、14、15、17、18、19、21、22号；经测序确认均为阳性。
3.4 后续繁育
利用心肌细胞特异的cre工具鼠Myh6-cre ERT2 （南方模式生物，NM-KI-200125）与Jun基因经flox修饰的小鼠Jun flox/flox杂交得到Myh6-cre ERT2 /Jun flox/flox小鼠（即，Jun-KO小鼠）。
在后续小鼠交配繁殖过程中，可通过短片段PCR的方式对小鼠基因型进行鉴定。PCR鉴定条件及引物如下所示。示例性结果如图7所示，WT为一条221 bp的条带；杂合子为221 和 289 bp 的两条带；纯合子为：一条289 bp的条带。
表3：PCR鉴定条件及引物。
此外，可在DNA水平验证Cre活性。通常是取一小块表达Cre的组织，抽提基因组DNA，通过PCR的方法对flox区域进行扩增，通过flox区域的有无，定性判断Cre是否发挥作用。PCR鉴定条件及引物如下所示。有Cre活性为1386 bp条带；无Cre活性为为3638 bp条带；野生型为3505 bp条带。
表4：PCR鉴定条件及引物。
3.5 实验流程
在获得动物模型后，即自诱导HFpEF模型的第五周起，对模型治疗组使用他莫昔芬进行基因敲除，对模型对照组不进行基因敲除，诱导全程同时加以正常饮食和饮水的小鼠作为阴性对照。
3.6 实验结果
结果如图8所示。首先，5周时对小鼠的舒张功能进行检测，舒张功能参数E/E’以及E/A显著升高，证明舒张功能存在障碍，表明成功获得了如前述文献所记载的模型。进一步，在5~15周的持续检测中，模型治疗组（使用他莫昔芬进行Jun基因敲除）中HFpEF的发生发展都得到了很好的遏制，具体体现在Jun被敲除后，利用高脂饮食配合L-NAME处理（HFD +0.5g/L L-NAME）处理的小鼠舒张功能显著改善，并可以一直持续到第十五周；但在Jun没有被敲除的模型对照组小鼠中，则观察到舒张功能的持续恶化；同时，模型治疗组中，Jun的表达相比模型对照组是下调的。这表明通过抑制或敲除Jun表达能够在小鼠HFpEF模型中对HFpEF产生预防和治疗的作用。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (11)
1.能够抑制或敲除Jun基因表达的试剂在制备用于预防和/或治疗射血分数保留的心衰的药物中的用途。
2.权利要求1所述的用途，其中，所述试剂为基因编辑系统。
3.权利要求2所述的用途，其中，所述基因编辑系统包括至少一种位点特异性核酸酶。
4.权利要求3所述的用途，其中，所述位点特异性核酸酶选自Cas核酸酶、锌指核酸酶、兆碱基大范围核酸酶、TALE-核酸酶、Cre重组酶、转座酶、以及它们的任何组合。
5.权利要求1所述的用途，其中，所述试剂为RNA干扰剂或反义寡核苷酸。
6.权利要求5所述的用途，其中，所述RNA干扰剂为siRNA、shRNA或miRNA。
7.权利要求1-6任一项所述的用途，其中，所述试剂敲除Jun基因、降低或抑制Jun基因的转录、和/或降低或抑制Jun的mRNA产物的翻译。
8.筛选用于预防和/或治疗射血分数保留的心衰的药物的方法，所述方法包括筛选Jun抑制剂的步骤。
9.权利要求8所述的方法，其中，所述Jun抑制剂能够抑制或下调Jun基因的表达、或抑制或阻断Jun蛋白的活性。
10.权利要求8所述的方法，其中，所述筛选Jun抑制剂的步骤包括：检测受试试剂能否抑制Jun基因表达或Jun蛋白活性；选择能够抑制Jun基因表达或Jun蛋白活性的受试试剂作为候选药物。
11.权利要求10所述的方法，其中，所述表达水平为蛋白水平或mRNA水平。
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