JP2023109555A - 受精卵用の人工培養液 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の主な課題は、受精卵の発育のために用いることができる新たな受精卵用の人工培養液を提供すること。【解決手段】本発明として、例えば、受精卵ないし胚（特にヒト受精卵ないしヒト胚）の発育のために用いる人工培養液であって、βヒドロキシ酪酸またはその医薬上許容される塩を有効量含有する受精卵用の培養液を挙げることができる。前記培養液には、グルコース、ピルビン酸もしくはその塩、および／または乳酸もしくはその塩や、さらに抗酸化物質またはサイトカインを含みうる。本発明培養液は、例えばＡＲＴ（生殖補助医療）において有用である。【選択図】図１
Description
本発明は、生殖補助医療（ＡＲＴ：Assisted Reproductive Technology）の技術分野に属する。本発明は、受精卵ないし胚のための培養液に関するものである。詳しくは、本発明は、受精卵ないし胚の発育のために用いる培養液であって、主としてβヒドロキシ酪酸を含有することを特徴とする、受精卵用の人工培養液に関するものである。
近年、晩婚化の影響により生殖補助医療（ＡＲＴ）の治療周期数は年々増加し、２０１７年では４４８，２１０周期が行われた。しかし、このうち生産分娩に至ったのは５２，９９７周期（１１．８％）と低い値に留まっている。
妊娠には受精卵を質の良い胚に発育させることが重要であり、ＡＲＴに使用される受精卵の発育に用いる培養液の組成はグルコース、ピルビン酸ないしナトリウム塩と乳酸ないしナトリウム塩を基本としている。この組成に加えて受精卵の発育を改善するために、抗酸化物質またはサイトカインの成分を添加している培養液が存在する（非特許文献１、非特許文献２）。
妊娠には受精卵を質の良い胚に発育させることが重要であり、ＡＲＴに使用される受精卵の発育に用いる培養液の組成はグルコース、ピルビン酸ないしナトリウム塩と乳酸ないしナトリウム塩を基本としている。この組成に加えて受精卵の発育を改善するために、抗酸化物質またはサイトカインの成分を添加している培養液が存在する（非特許文献１、非特許文献２）。
本件発明者らは、以前、母体からの卵胞液中に含まれるβヒドロキシ酪酸（３－ヒドロキシ酪酸）が、、良好胚率や妊娠率に関連する可能性がある旨を報告した（非特許文献３）。
βヒドロキシ酪酸はケトン体の一種であって、ヒトでは、肝臓でアセチルＣｏＡから生成され、血中のグルコース濃度が少ないときに脳や他の組織のエネルギー源として使用されることが知られている。
βヒドロキシ酪酸はケトン体の一種であって、ヒトでは、肝臓でアセチルＣｏＡから生成され、血中のグルコース濃度が少ないときに脳や他の組織のエネルギー源として使用されることが知られている。
Truong T, Gardner DK. Antioxidants improve IVF outcome and subsequent embryo development in the mouse. Hum Reprod. 2017;32:2404-2413.
ＧＭ－ＣＳＦ含有胚培養液、［online］、オリジオ・ジャパン株式会社、［令和３年１０月１日検索］、インターネット＜URL: https://coopersurgicalfertility-jp.com/products/gm-csf/＞
北上茂樹、他９名、卵胞液中のケトン体濃度が胚培養および発生速度に与える影響の検討、［online］、２０１８年度日本ＩＶＦ学会年次大会、［令和３年１０月１日検索］、インターネット＜URL: https://www.jsar.or.jp/dissertation/2018/%E5%8D%B5%E8%83%9E%E6%B6%B2%E4%B8%AD%E3%81%AE%E3%82%B1%E3%83%88%E3%83%B3%E4%BD%93%E6%BF%83%E5%BA%A6%E3%81%8C%E8%83%9A%E5%9F%B9%E9%A4%8A%E3%81%8A%E3%82%88%E3%81%B3%E7%99%BA%E7%94%9F%E9%80%9F%E5%BA%A6/＞
非特許文献１に記載の発明のように、抗酸化物質を添加した培養液では受精卵の発育速度を改善するが、胚盤胞形成率自体は改善しない。非特許文献２に記載の発明のように、サイトカインを添加した培養液では、サイトカインはタンパク質であるため、安定せず、扱いが難しい。
上記のような状況から、受精卵の発育を促進し、胚盤胞への形成率と発生速度を改善する機能を有した、扱いやすい化合物を添加した培養液が望まれている。
本発明の課題は、主として、例えば、受精卵（胚）の発育のために用いることができる新たな受精卵用の人工培養液を提供することにある。
上記のような状況から、受精卵の発育を促進し、胚盤胞への形成率と発生速度を改善する機能を有した、扱いやすい化合物を添加した培養液が望まれている。
本発明の課題は、主として、例えば、受精卵（胚）の発育のために用いることができる新たな受精卵用の人工培養液を提供することにある。
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、従来の胚培養用培養液であるいわゆるＫＳＯＭ(Potassium Simplex Optimized Medium)にケトン体を加えて、受精卵を培養すると、胚盤胞への形成率が高まることなどを見出し、本発明を完成するに到った。
本発明として、例えば、以下の態様を挙げることができる。
［１］受精卵ないし胚の発育のために用いる人工培養液であって、ケトン体（例：βヒドロキシ酪酸）またはその医薬上許容される塩を有効量含有する、受精卵用の培養液。
［２］前記培養液に、グルコース、ピルビン酸もしくはその塩、および／または乳酸もしくはその塩が含まれる、上記［１］に記載の受精卵用の培養液。
［３］前記培養液に、更に抗酸化物質またはサイトカインが含まれる、上記［１］または［２］に記載の受精卵用の培養液。
［４］受精卵ないし胚が、ヒト受精卵またはヒト胚である、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の受精卵用の培養液。
本発明として、例えば、以下の態様を挙げることができる。
［１］受精卵ないし胚の発育のために用いる人工培養液であって、ケトン体（例：βヒドロキシ酪酸）またはその医薬上許容される塩を有効量含有する、受精卵用の培養液。
［２］前記培養液に、グルコース、ピルビン酸もしくはその塩、および／または乳酸もしくはその塩が含まれる、上記［１］に記載の受精卵用の培養液。
［３］前記培養液に、更に抗酸化物質またはサイトカインが含まれる、上記［１］または［２］に記載の受精卵用の培養液。
［４］受精卵ないし胚が、ヒト受精卵またはヒト胚である、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の受精卵用の培養液。
［５］受精卵ないし胚の発育のために用いる培養液にケトン体またはその医薬上許容される塩を添加する工程を含む、受精卵用の培養液の製造方法。
［６］前記培養液に、グルコース、ピルビン酸もしくはその塩、および／または乳酸もしくはその塩が含まれる、上記［５］に記載の受精卵用の培養液の製造方法。
［７］前記培養液に、更に抗酸化物質またはサイトカインが含まれる、上記［５］または［６］に記載の受精卵用の培養液の製造方法。
［８］受精卵ないし胚が、ヒト受精卵またはヒト胚である、上記［５］～［７］のいずれか一項に記載の受精卵用の培養液の製造方法。
［６］前記培養液に、グルコース、ピルビン酸もしくはその塩、および／または乳酸もしくはその塩が含まれる、上記［５］に記載の受精卵用の培養液の製造方法。
［７］前記培養液に、更に抗酸化物質またはサイトカインが含まれる、上記［５］または［６］に記載の受精卵用の培養液の製造方法。
［８］受精卵ないし胚が、ヒト受精卵またはヒト胚である、上記［５］～［７］のいずれか一項に記載の受精卵用の培養液の製造方法。
［９］上記［１］～［４］のいずれか一項に記載の受精卵用の培養液下で受精卵を培養する工程を含む、受精卵ないし胚の発育方法。
本発明によれば、胚盤胞形成率や孵化率を改善することができる。
以下、本発明について詳述する。
本発明に係る受精卵用の培養液（以下、「本発明培養液」という。）は、受精卵ないし胚（以下、これらをまとめて単に「受精卵」ともいう。）の発育のために用いる人工培養液であって、ケトン体またはその医薬上許容される塩を有効量含有することを特徴とする。
本発明に係る受精卵用の培養液（以下、「本発明培養液」という。）は、受精卵ないし胚（以下、これらをまとめて単に「受精卵」ともいう。）の発育のために用いる人工培養液であって、ケトン体またはその医薬上許容される塩を有効量含有することを特徴とする。
「ケトン体」とは、飢餓状態等の生体内（例えば、肝臓内。）において、脂肪酸のβ酸化により生じた過剰なアセチルＣｏＡから産生され得る有機カルボニル化合物のことをいい、例えば、βヒドロキシ酪酸、アセト酢酸、アセトンを挙げることができる。中でも、βヒドロキシ酪酸、アセト酢酸であることが好ましく、βヒドロキシ酪酸であることがより好ましい。
ここで「βヒドロキシ酪酸」は、Ｄ－３－ヒドロキシ酪酸とＬ－３－ヒドロキシ酪酸の２つのエナンチオマーとして存在するが、本発明においてはいずれであっても、また両者のラセミ体ＤＬ体であってもよい。
ケトン体の医薬上許容される塩としては、医薬上許容され、ケトンの塩を形成できれば特に制限されないが、例えば、βヒドロキシ酪酸またはアセト酢酸の塩基付加塩を挙げることができる。
当該塩基付加塩としては、無機塩基との塩や有機塩基との塩が挙げられる。無機塩基との塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩を挙げることができる。有機塩基との塩としては、例えば、アルギニン塩、オルニチン塩、リジン塩等のアミノ酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩を挙げることができる。これらの中でも、ナトリウム塩、アミノ酸塩が好ましい。
当該塩基付加塩としては、無機塩基との塩や有機塩基との塩が挙げられる。無機塩基との塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩を挙げることができる。有機塩基との塩としては、例えば、アルギニン塩、オルニチン塩、リジン塩等のアミノ酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩を挙げることができる。これらの中でも、ナトリウム塩、アミノ酸塩が好ましい。
本発明培養液は、例えば、既存の胚培養用培養液にケトン体を有効量添加する工程を含むことによって製造することができる。具体的には、例えば、市販されている胚培養用培養液に、βヒドロキシ酪酸および／もしくはアセト酢酸、またはこれらの医薬上許容される塩を有効量添加することによって製造することができる。あるいは、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、グルタミン、ＥＤＴＡ、各種アミノ酸、βヒドロキシ酪酸および／またはアセト酢酸、血清アルブミン、および；塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等の無機塩類などの処方成分を所望量秤量し、適量の超純水に溶解し、常法により濾過滅菌して製造することもできる。その際、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類については、例えば、無機塩類の１０倍濃度液などを予め調製しておき、それを用いることができる。
既存の胚培養用培養液としては、例えば、グルコース、ピルビン酸もしくはその塩、および／または乳酸もしくはその塩が含まれているものが好ましく、また下記の（１）～（３）で区分される成分が含まれているものがより好ましい。
（１）塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、乳酸（ナトリウム塩）、グルコース、ピルビン酸（ナトリウム塩）、炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、グルタミン、ＥＤＴＡ（ナトリウム塩）、ウシ血清アルブミンＢＳＡ、また必要に応じて、ストレプトマイシン・ペニシリン等の抗生物質、フェノールレッド。
（２）塩化ナトリウム、ピルビン酸（ナトリウム塩）、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、乳酸（ナトリウム塩）、グルコース、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、グリシル－Ｌ－グルタミン、ＥＤＴＡ、ヒト血清アルブミンＨＳＡまたはヒトＨＳＡリコンビナントタンパク質、ヒトα－・β－グロブリン、また必要に応じて、ゲンタマイシン硫酸塩等の抗生物質、フェノールレッド。
（３）塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、乳酸（ナトリウム塩）、グルコース、ピルビン酸（ナトリウム塩）、炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、タウリン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、ＥＤＴＡ、ヒト血清アルブミンＨＳＡまたはヒトＨＳＡリコンビナントタンパク質、また必要に応じて、ゲンタマイシン硫酸塩等の抗生物質、フェノールレッド。
既存の胚培養用培養液として、いわゆるＫＳＯＭや修正ＫＳＯＭ、ＨＴＦ、ＳＯＦ等を挙げることができる。またグローバル（登録商標）トータル（登録商標、ライフグローバル社製）、ＨｉＧＲＯＷ ＯＶＩＴ（扶桑薬品工業社製）、ＨｉＧＲＯＷ ＯＶＩＴ Ｐｌｕｓ（扶桑薬品工業社製）、Ｇ－１（登録商標）ＰＬＵＳ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社製）、Ｇ－２（登録商標）ＰＬＵＳ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社製）、Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｃｌｅａｖ（登録商標、オリジオ・ジャパン社製）、Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｂｌａｓｔ（登録商標、オリジオ・ジャパン社製）といった商品名で市販されているものを挙げることができる。
本発明培養液のｐＨは、３７℃、５％ＣＯ２下で、７．２～７．４ないし７．３～７．５の範囲内が適当である。本発明培養液の浸透圧は、２５５～２７５ないし２６０～２７０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内が適当である。エンドトキシンの量は、０．１ＥＵ／ｍＬ以下または０．５ＥＵ／ｍＬ以下が適当である。
本発明培養液は、既存の胚培養用培養液を用いる場合と同様にして使用することができ、受精卵を育成することができる。具体的には、例えば、本発明培養液を培養用ディッシュ上にドロップ状に置き、その培養滴をミネラルオイルで覆う。それを使用１日前に炭酸ガス培養器内に入れて培養滴の温度とガスを平衡化させておく。そして、平衡化された培養滴（本発明培養液）に受精卵を入れ、数日間培養することにより、当該受精卵を育成することができる。培養期間中、必要に応じて本発明培養液を交換することもできる。
以下に実施例を掲げて、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
［実施例１］マウス受精卵を用いたβヒドロキシ酪酸の添加効果（１）
凍結ＩＣＲ系マウス前核期受精卵６０個（トランスジェニック社製）を０．２５Ｍシュクロースで融解後、βヒドロキシ酪酸を０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、または４００μＭの濃度で含む、下記表１に示す組成のＫＳＯＭ培養液中、５％Ｏ２、５％ＣＯ２の条件下で生存マウス胚の培養を行った。胚盤胞は、その発生段階に応じ、胞胚腔が生じているが受精卵内部において占める割合が１／２以下であるものをＥＢ（Early Blastocyst）、胞胚腔の占める割合が１／２以上であるが拡張し切ってはいないものをＢ（Blastocyst）、胞胚腔が拡張し切っているが孵化はしていないものをＦＢ（Full Blastocyst）、孵化しているものをＨＢ（Hatched Blastocyst）として倒立顕微鏡による明視野観察により分類し、融解して９６時間培養後における初期胚盤胞（ＥＢ）以上への発生率、および孵化した胚盤胞（ＨＢ）の割合を分析した。その結果を図１と図２にそれぞれ示す。なお、図中の「＊」は、カイ二乗検定においてｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」は、ｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
凍結ＩＣＲ系マウス前核期受精卵６０個（トランスジェニック社製）を０．２５Ｍシュクロースで融解後、βヒドロキシ酪酸を０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、または４００μＭの濃度で含む、下記表１に示す組成のＫＳＯＭ培養液中、５％Ｏ２、５％ＣＯ２の条件下で生存マウス胚の培養を行った。胚盤胞は、その発生段階に応じ、胞胚腔が生じているが受精卵内部において占める割合が１／２以下であるものをＥＢ（Early Blastocyst）、胞胚腔の占める割合が１／２以上であるが拡張し切ってはいないものをＢ（Blastocyst）、胞胚腔が拡張し切っているが孵化はしていないものをＦＢ（Full Blastocyst）、孵化しているものをＨＢ（Hatched Blastocyst）として倒立顕微鏡による明視野観察により分類し、融解して９６時間培養後における初期胚盤胞（ＥＢ）以上への発生率、および孵化した胚盤胞（ＨＢ）の割合を分析した。その結果を図１と図２にそれぞれ示す。なお、図中の「＊」は、カイ二乗検定においてｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」は、ｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
図１から明らかな通り、融解して９６時間後に初期胚盤胞以上（ＥＢ以上）に発育した受精卵は、１００μＭ以上の濃度で０μＭ（コントロール）より高い傾向がみられ、４００μＭでは有意差が見られた。また、図２から明らかな通り、孵化した胚盤胞（ＨＢ）については、１００μＭが最も高い割合であった。
［実施例２］マウス受精卵を用いたβヒドロキシ酪酸の添加効果（２）
実施例１の場合よりさらに多くの前核期受精卵を用いて、βヒドロキシ酪酸を添加しないＫＳＯＭ培養液と１００μＭ添加したＫＳＯＭ培養液で実施例１と同様にして再度培養し、受精卵の孵化率を検討した。その結果を図３に示す。
図３から明らかな通り、孵化した胚盤胞（ＨＢ）は１００μＭで割合が高く、有意差が認められた。
実施例１や２の結果から、ケトン体であるβヒドロキシ酪酸は、受精卵の発育に好ましいということができる。
実施例１の場合よりさらに多くの前核期受精卵を用いて、βヒドロキシ酪酸を添加しないＫＳＯＭ培養液と１００μＭ添加したＫＳＯＭ培養液で実施例１と同様にして再度培養し、受精卵の孵化率を検討した。その結果を図３に示す。
図３から明らかな通り、孵化した胚盤胞（ＨＢ）は１００μＭで割合が高く、有意差が認められた。
実施例１や２の結果から、ケトン体であるβヒドロキシ酪酸は、受精卵の発育に好ましいということができる。
本発明培養液は、受精卵ないし胚の発育に好ましく、ＡＲＴにおいて有用である。
Claims (9)
- 受精卵ないし胚の発育のために用いる人工培養液であって、βヒドロキシ酪酸またはその医薬上許容される塩を有効量含有する、受精卵用の培養液。
- 前記培養液に、グルコース、ピルビン酸もしくはその塩、および／または乳酸もしくはその塩が含まれる、請求項１に記載の受精卵用の培養液。
- 前記培養液に、更に抗酸化物質またはサイトカインが含まれる、請求項１または２に記載の受精卵用の培養液。
- 受精卵ないし胚が、ヒト受精卵またはヒト胚である、請求項１～３のいずれか一項に記載の受精卵用の培養液。
- 受精卵ないし胚の発育のために用いる培養液にケトン体またはその医薬上許容される塩を添加する工程を含む、受精卵用の培養液の製造方法。
- 前記培養液に、グルコース、ピルビン酸もしくはその塩、および／または乳酸もしくはその塩が含まれる、請求項５に記載の受精卵用の培養液の製造方法。
- 前記培養液に、更に抗酸化物質またはサイトカインが含まれる、請求項５または６に記載の受精卵用の培養液の製造方法。
- 受精卵ないし胚が、ヒト受精卵またはヒト胚である、請求項５～７のいずれか一項に記載の受精卵用の培養液の製造方法。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の受精卵用の培養液下で受精卵を培養する工程を含む、受精卵ないし胚の発育方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022011122A JP2023109555A (ja) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 受精卵用の人工培養液 |
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2022
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