JP2023103316A - Igy antibody-containing feed that provides protective effect against ems/ahpnd - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物、および当該組成物をエビ類に投与するまたは摂取させることを含むエビ類毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する方法に関する。 The present invention relates to a composition for controlling infection of shrimp by Vibrio bacteria expressing toxin A and toxin B, and a method for controlling infection of shrimp by Vibrio bacteria expressing shrimp toxoid A and toxin B, which comprises administering or ingesting the composition to shrimp.
ＥＭＳまたはＡＨＰＮＤ（早期死亡症候群または急性肝すい臓壊死病；以下、本明細書においてＥＭＳ／ＡＨＰＮＤと表記することがある。）は、近年被害が拡大しているエビ類の感染症で、その原因菌は特殊タイプの腸炎ビブリオ（ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus））である。 EMS or AHPND (Early Death Syndrome or Acute Hepatic Necrosis of the Hepatic Disease; hereinafter sometimes referred to as EMS/AHPND in this specification) is an infectious disease of shrimp that has been causing more and more damage in recent years, and the causative bacterium is a special type of Vibrio parahaemolyticus (Vibrio parahaemolyticus).
一般的に、海水中にはビブリオ・パラヘモリティカスが常在しているが、特殊タイプのビブリオ・パラヘモリティカスのみがエビ類に病原性を示すことが分かっており、この特殊タイプの腸炎ビブリオが産生する毒素Ａおよび毒素Ｂがエビへの致死因子として働く可能性が報告されている（非特許文献１、２）。また、毒素Ａまたは毒素Ｂの組換え体を用いた試験では、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方が存在する場合に、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの病態が生じ、用量依存的に死亡率が上昇するが、毒素Ａまたは毒素Ｂいずれかが単独で存在する場合には死亡率は認められないことが報告されている（非特許文献３）。 In general, Vibrio parahaemolyticus is resident in seawater, but only a special type of Vibrio parahaemolyticus is known to be pathogenic to shrimp, and it has been reported that toxin A and toxin B produced by this special type of Vibrio parahaemolyticus may act as lethal factors for shrimp (Non-Patent Documents 1 and 2). Further, in a test using a recombinant of toxin A or toxin B, it has been reported that when both toxin A and toxin B are present, the pathology of EMS/AHPND occurs and the mortality rate increases in a dose-dependent manner, but no mortality rate is observed when either toxin A or toxin B is present alone (Non-Patent Document 3).
また、ビブリオ属の他の種である、ビブリオ・オウェンジー（Vibrio owensii）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、またはビブリオ・カンプベリイ（Vibrio campbellii）も、毒素ＡおよびＢを発現し、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを引き起こすことが報告されている（非特許文献４～６）。 Other species of the Vibrio genus, Vibrio owensii, Vibrio harveyi, or Vibrio campbellii, have also been reported to express toxins A and B and cause EMS/AHPND (4-6).
エビ類においては、抗体を介した特異的免疫機能が存在しないといわれており、エビ類の感染症にして能動免疫による感染防除効果は期待できない。エビ類における感染症に対する防除対策として抗生物質を用いる方法があるが、抗生物質の多用に伴い耐性菌の出現といった問題点もある。 In shrimp, it is said that there is no specific immune function mediated by antibodies, and it is not possible to expect an infection control effect by active immunization for infectious diseases of shrimp. There is a method of using antibiotics as a control measure against infectious diseases in shrimps, but there is also the problem of emergence of resistant bacteria due to the frequent use of antibiotics.
エビ類における感染症に対するその他の防除対策として、受動免疫が注目されている。受動免疫による感染症の防除方法は、病原体に対する抗体を対象に投与するまたは摂取させることにより、当該病原体による感染症を防除する手法である。エビ類について、病原体を抗原とした鶏卵由来ＩｇＹを経口投与することで感染症防除効果が得られたことが報告されている（特許文献１、非特許文献７）。ＩｇＹとは、鶏が持つ免疫グロブリンであり、主に卵黄に存在する。抗原を用いて鶏に免疫した際に、当該抗原に特異的なＩｇＹが作られた後、卵内の卵黄に移行することから、動物の命を犠牲にすることなく特異的抗体を大量かつ安価に生産できる手法として注目されている。 Passive immunization is attracting attention as another control measure against infectious diseases in shrimps. Methods for controlling infectious diseases by passive immunization are techniques for controlling infectious diseases caused by pathogens by administering antibodies against pathogens to subjects or having them ingest antibodies against the pathogens. It has been reported that oral administration of hen egg-derived IgY using a pathogen as an antigen produced an effect of controlling infectious diseases in shrimp (Patent Document 1, Non-Patent Document 7). IgY is an immunoglobulin that chickens have and is mainly present in egg yolk. When chickens are immunized with an antigen, IgY specific to the antigen is produced and then transferred to the yolk of the egg, so it is attracting attention as a method that can produce large amounts of specific antibodies at low cost without sacrificing the lives of animals.
ここで、非特許文献７は、ビブリオ・パラヘモリティカスの菌体そのものを抗原としたＩｇＹを用いることを記載している。しかし、その生存率は６０％程度（すなわち、ＩｇＹ摂取により致死率が４０％程度に抑制された）にとどまっている。 Here, Non-Patent Document 7 describes the use of IgY using the Vibrio parahaemolyticus itself as an antigen. However, the survival rate remains at about 60% (that is, the lethality rate was suppressed to about 40% by IgY intake).
エビ類におけるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤについて、より高い生存率を達成するために有効な防除方法が求められている。 For EMS/AHPND in shrimp, effective control methods are needed to achieve higher survival rates.
本発明は、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物、および当該組成物をエビ類に投与するまたは摂取させることを含むエビ類毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する方法を提供する。本明細書において、処置方法は、防除方法、治療方法および予防方法を包含する。防除方法は、治療方法および予防方法を包含する。 The present invention provides a composition for controlling infection of shrimp by Vibrio bacteria expressing toxin A and toxin B, and a method of controlling infection of shrimp by Vibrio bacteria expressing shrimp toxoid A and toxin B, comprising administering or ingesting the composition to shrimp. As used herein, treatment methods include preventative, therapeutic and prophylactic methods. Control methods include therapeutic methods and prophylactic methods.
以上に鑑み、本件の発明者は、特殊タイプの腸炎ビブリオが産生する毒素Ａおよび毒素Ｂに注目し、研究を開始した。鋭意検討の結果、毒素Ａに対するＩｇＹが、エビ類のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによる死亡率を劇的に低減することを見いだした。当該知見に基づいて、本発明は完成された。 In view of the above, the inventor of the present invention focused on toxin A and toxin B produced by a special type of Vibrio parahaemolyticus and started research. As a result of intensive studies, it was found that IgY against toxin A dramatically reduced mortality due to EMS/AHPND in shrimp. The present invention was completed based on this knowledge.
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
［１］毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物であって、毒素Ａに対する抗体を含む、前記組成物。
［２］毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌が、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・オウェンジー（Vibrio owensii）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、またはビブリオ・カンプベリイ（Vibrio campbellii）である、上記［１］に記載の組成物。
［３］毒素Ａに対する抗体が、毒素Ａで免疫した鶏の卵より得られる鶏卵抗体である、上記［１］または［２］に記載の組成物。
［４］毒素Ａに対する抗体が、毒素Ａに対するＩｇＹ抗体である、上記［１］または［２］に記載の組成物。
［５］感染症が、エビ類の早期死亡症候群／急性肝すい臓壊死病（EMS／AHPND）である、上記［１］または［２］のいずれか１項に記載の組成物。
［６］組成物がエビ類餌料である、上記［１］または［２］に記載の組成物。
［７］毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末を、組成物重量に対して０．１％～２０％含む、上記［６］に記載の組成物。
［８］上記［１］～［８］のいずれか１項に記載の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを含む、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する方法。
［９］上記［１］～［８］のいずれか１項に記載の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを含む、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を処置する方法。
That is, in one aspect, the present invention may be as follows.
[1] A composition for controlling infections of shrimp by Vibrio bacteria expressing toxins A and B, the composition comprising an antibody against toxin A.
[2] The composition according to [1] above, wherein the Vibrio bacterium expressing toxins A and B is Vibrio parahaemolyticus, Vibrio owensii, Vibrio harveyi, or Vibrio campbellii expressing toxins A and B.
[3] The composition according to [1] or [2] above, wherein the antibody against toxin A is a chicken egg antibody obtained from eggs of chickens immunized with toxin A.
[4] The composition of [1] or [2] above, wherein the antibody against toxin A is an IgY antibody against toxin A.
[5] The composition according to any one of [1] or [2] above, wherein the infectious disease is shrimp early death syndrome/acute pancreatic necrosis of the liver (EMS/AHPND).
[6] The composition according to [1] or [2] above, wherein the composition is shrimp feed.
[7] The composition according to [6] above, which contains 0.1% to 20% of the whole egg powder containing an antibody against toxin A relative to the weight of the composition.
[8] A method for controlling infections in shrimp caused by Vibrio bacteria expressing toxins A and B, comprising administering to shrimp the composition according to any one of [1] to [8] above, or having the shrimp ingest it.
[9] A method of treating shrimp infections caused by Vibrio bacteria expressing toxins A and B, comprising administering or having the shrimp ingest the composition according to any one of [1] to [8] above.
本発明により、ビブリオ属細菌の毒素Ａに対する抗体を含む組成物が、有効に毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌による感染症を防除するために有効であることが示された。本発明の組成物は、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによるエビ類の死亡率を２０％以下にまで低減することが可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it has been shown that a composition containing an antibody against Vibrio toxin A is effective for controlling infections caused by Vibrio bacterium effectively expressing toxins A and B. The composition of the present invention is capable of reducing shrimp mortality from EMS/AHPND to 20% or less.
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。 The present invention will be specifically described below, but the present invention is not limited thereto. Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present invention shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art.
定義
本明細書において「エビ類」とは、クルマエビ科（family Panaeidae）に属するエビをいう。クルマエビ科に属するエビは、例えばバナメイエビ、ブラックタイガー、クルマエビであってもよい。
Definition As used herein, the term "shrimp" refers to shrimp belonging to the family Panaeidae. Shrimp belonging to the Kuruma shrimp family may be, for example, Vannamei shrimp, black tiger, and Kuruma shrimp.
本明細書において「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌」とは、ビブリオ属細菌であって、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現する細菌を意味する。そのような細菌には、ビブリオ・パラヘモリティカス、ビブリオ・オウェンジー、ビブリオ・ハーベイ、またはビブリオ・カンプベリイであって、毒素ＡおよびＢを発現する細菌が含まれる。好ましい態様において、「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌」は、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ・パラヘモリティカスであってもよい。 As used herein, “a Vibrio bacterium expressing toxins A and B” means a bacterium belonging to the genus Vibrio and expressing toxin A and toxin B. Such bacteria include Vibrio parahaemolyticus, Vibrio owengei, Vibrio harvey, or Vibrio campberryi, which express toxins A and B. In a preferred embodiment, the "toxin A- and B-expressing Vibrio bacterium" may be toxin A- and B-expressing Vibrio parahaemolyticus.
本明細書において「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症」とは、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌の感染により引き起こされるエビ類の疾病であれば特に限定されない。当該感染症にはエビ類のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤが含まれる。「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症」を、本明細書において単に「エビ類の感染症」と表記することがある。 As used herein, “infection of shrimp by Vibrio bacteria expressing toxins A and B” is not particularly limited as long as it is a disease of shrimp caused by infection with Vibrio bacteria expressing toxins A and B. Such infections include shrimp EMS/AHPND. "Shrimp infections caused by Vibrio bacteria expressing toxins A and B" are sometimes referred to simply as "shrimp infections" in the present specification.
本明細書において「毒素Ａ」とは、ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａ（アミノ酸配列は配列番号２に示され、それをコードする塩基配列は配列番号１に示される）、またはその変異体もしくはホモログである。ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａは、GenBankアクセッション番号AB972427.1に開示される塩基配列の１１１９～１４５４番目のヌクレオチドによりコードされる。 As used herein, "toxin A" is toxin A derived from Vibrio parahaemolyticus (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2 and the base sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 1), or a variant or homolog thereof. Toxin A from Vibrio parahaemolyticus is encoded by nucleotides 1119-1454 of the nucleotide sequence disclosed in GenBank Accession No. AB972427.1.
本明細書において「毒素Ｂ」とは、ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａ（アミノ酸配列は配列番号４に示され、それをコードする塩基配列は配列番号３に示される）、またはその変異体もしくはホモログである。ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ｂは、GenBankアクセッション番号AB972427.1に開示される塩基配列の１４６７～２７８３番目のヌクレオチドによりコードされる。 As used herein, "toxin B" is toxin A derived from Vibrio parahaemolyticus (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4 and the base sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 3), or a variant or homologue thereof. Toxin B from Vibrio parahaemolyticus is encoded by nucleotides 1467-2783 of the nucleotide sequence disclosed in GenBank Accession No. AB972427.1.
本明細書において「変異体」とは、元となるタンパク質のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入もしくは付加された配列を有するタンパク質を意味してもよい。「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入もしくは付加された」とは、対象となるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸（例えば、アミノ酸配列の全長に対して３０％、好ましくは２５％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％または１％のアミノ酸）が欠失しているか、他のアミノ酸に置換されているか、他のアミノ酸が挿入されているか、および／または他のアミノ酸が付加されていることを意味する。 As used herein, the term "mutant" may mean a protein having a sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, or added to the amino acid sequence of the original protein. “One or several amino acids have been deleted, inserted or added” means that one or several amino acids (for example, 30%, preferably 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, 2% or 1% amino acids with respect to the entire length of the amino acid sequence) are deleted, substituted with other amino acids, inserted with other amino acids, and/or added with other amino acids.
上記のうち置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。以下に、アミノ酸残基の保存的置換について置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、
Ｅ群：セリン、スレオニン
Ｆ群：フェニルアラニン、チロシン
Among the above substitutions, preferably conservative substitutions. A conservative substitution is the replacement of a particular amino acid residue with a residue having similar physico-chemical characteristics, but may be any substitution that does not substantially alter the structural characteristics of the original sequence, e.g., any substitution that does not disrupt the helices present in the original sequence or any other type of secondary structure that characterizes the original sequence. Conservative substitution of amino acid residues is exemplified below by classifying each substitutable residue, but substitutable amino acid residues are not limited to those described below.
Group A: leucine, isoleucine, valine, alanine, methionine Group B: aspartic acid, glutamic acid Group C: asparagine, glutamine Group D: lysine, arginine,
Group E: serine, threonine Group F: phenylalanine, tyrosine
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができる。例えば、不用意な糖鎖修飾を排除するために上記のＢ、Ｄ、Ｅ群のアミノ酸をそれ以外の群のアミノ酸に置換してもよい。または、３次構造でタンパク質中に折りたたまれることを防ぐためにシステインを欠失させるか、他のアミノ酸に置換してもよい。あるいは、親水性／疎水性のバランスが保たれるように、または合成を容易にするために親水度を上げるように、アミノ酸に関する疎水性／親水性の指標であるアミノ酸のハイドロパシー指数（J. Kyte およびR. Doolittle, J. Mol. Biol., Vol.157, p.105-132, 1982）を考慮して、アミノ酸を置換してもよい。 In the case of non-conservative substitutions, members of one of the above classes may be exchanged for members of another class. For example, amino acids in the above groups B, D, and E may be substituted with amino acids in other groups in order to eliminate inadvertent sugar chain modification. Alternatively, cysteines may be deleted or substituted with other amino acids to prevent folding into the protein in tertiary structure. Alternatively, amino acids may be substituted in consideration of the hydropathic index of amino acids (J. Kyte and R. Doolittle, J. Mol. Biol., Vol. 157, p. 105-132, 1982), which is an indicator of the hydrophobicity/hydrophilicity of amino acids, so as to maintain a hydrophilic/hydrophobic balance or increase the hydrophilicity to facilitate synthesis.
あるいは、本明細書において「変異体」とは、元となるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を意味してもよい。好ましくは、「変異体」は、元となるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性％を決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＣｌｕｓｔａｌＷ等があげられる。特に、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されたもので、ＮＣＢＩやDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894；Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス）、DNASIS Pro（日立ソフト）、Vector NTI（Infomax）等のプログラムを用いて決定することもできる。 Alternatively, "variant" as used herein may refer to a protein comprising an amino acid sequence that has at least 70% sequence identity to the amino acid sequence of the original protein. Preferably, a "variant" may be a protein comprising an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, or 99% sequence identity to the amino acid sequence of the original protein. The percent identity of two amino acid sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculations. Percent identity can also be determined using computer programs. Such computer programs include, for example, BLAST and ClustalW. In particular, the various conditions (parameters) for identity search by the BLAST program are described in Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997) and can be publicly obtained from the websites of NCBI and DNA Data Bank of Japan (DDBJ) (BLAST manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al. schul et al.). It can also be determined using programs such as genetic information processing software GENETYX Ver.7 (Genetics), DNASIS Pro (Hitachi Software), and Vector NTI (Infomax).
本明細書においてビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａまたは毒素Ｂの「ホモログ」とは、他のビブリオ属細菌由来の毒素Ａまたは毒素Ｂであってもよい。好ましくは、ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａまたは毒素Ｂの「ホモログ」は、ビブリオ・オウェンジー、ビブリオ・ハーベイ、またはビブリオ・カンプベリイ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂであってもよい。 As used herein, a "homolog" of toxin A or toxin B from Vibrio parahaemolyticus may be toxin A or toxin B from another bacterium of the genus Vibrio. Preferably, the "homologue" of toxin A or toxin B from Vibrio parahaemolyticus may be toxin A or toxin B from Vibrio owengei, Vibrio harveyi, or Vibrio campberryi.
本明細書において「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する」とは、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌の感染を防ぎ、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症の発症を防ぐ作用を意味する。エビ類の感染症の防除効果は、エビ類の感染症による死亡率の低減効果により評価してもよい。エビ類はＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによりほぼ１００％死滅する。ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによる死亡率が、処置しない区と比較して低減した場合は、エビ類の感染症を防除したと判断することができる。好ましい態様において、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによる死亡率が５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、または２０％以下に低減した場合に、エビ類の感染症を防除したと判断してもよい。 As used herein, "controlling shrimp infections caused by Vibrio bacteria expressing toxins A and B" means the action of preventing infection with Vibrio bacteria expressing toxins A and B and preventing the onset of infections in shrimp caused by Vibrio bacteria expressing toxins A and B. You may evaluate the control effect of the shrimp infectious disease by the reduction effect of the mortality rate by the shrimp infectious disease. Shrimp are almost 100% killed by EMS/AHPND. If the EMS/AHPND mortality rate is reduced compared to the untreated plot, it can be determined that the shrimp infection has been controlled. In preferred embodiments, control of shrimp infections may be determined when EMS/AHPND mortality is reduced to 50% or less, 40% or less, 30% or less, 25% or less, or 20% or less.
エビ類の感染症を防除するための組成物
本発明は、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物であって、毒素Ａに対する抗体を含む、前記組成物に関する。当該組成物を、以下、本明細書において「本発明の組成物」と表記することがある。各構成についての範囲は、上記「定義」の項目において記載した通りである。
COMPOSITION FOR CONTROLLING SHRIMP INFECTIONS The present invention relates to a composition for controlling shrimp infections caused by Vibrio bacteria expressing toxins A and B, which composition comprises an antibody against toxin A. The composition is hereinafter sometimes referred to as "the composition of the present invention" in this specification. The scope for each configuration is as described in the "Definitions" section above.
毒素Ａに対する抗体は、毒素Ａに対して特異的な抗体であれば特に限定されない。 Antibodies to toxin A are not particularly limited as long as they are specific to toxin A.
一態様において、毒素Ａに対する抗体は、毒素Ａで免疫した鶏の卵より得られる鶏卵抗体である。「鶏卵抗体」とは、鶏の卵に含まれる抗体である。鶏を抗原で免疫することにより、当該抗原に特異的な抗体が作られ、卵内の卵黄に移行することが知られている。また、鶏卵抗体には、主にＩｇＹ（免疫グロブリン・クラスＹ）が含まれることが知られている。好ましい態様において、本発明の組成物に含まれる毒素Ａに対する抗体は毒素Ａに対するＩｇＹ抗体である。 In one embodiment, the antibodies to toxin A are chicken egg antibodies obtained from eggs of chickens immunized with toxin A. A "chicken egg antibody" is an antibody contained in a chicken egg. It is known that immunizing a chicken with an antigen produces an antibody specific to the antigen and transfers it to the yolk of the egg. Egg antibodies are also known to mainly contain IgY (immunoglobulin class Y). In a preferred embodiment, the antibody against toxin A contained in the composition of the invention is an IgY antibody against toxin A.
毒素Ａに対する抗体は、例えば、鶏を毒素Ａで免疫し、免疫した鶏から得られた卵の全卵または卵黄より得ることができる。ここで、毒素Ａで鶏を免疫する際には、接種源に含まれる抗原は毒素Ａのみとする。複数の抗原で鶏を免疫する場合は、他の抗原は、毒素Ａを接種した部位とは異なる部位に接種する。鶏を毒素Ａで免疫する際の接種回数および接種量は、鶏の卵において毒素Ａに対する抗体が生じる条件であれば特に限定されない。例えば、鶏は毒素Ａで複数回、例えば、３回、５回、７回、または１０回接種することが、鶏卵における抗体価を上げるために好ましい。また、１回あたりの接種量は、０．１～５．０ｍｇ／ｍＬ、０．３～３．０ｍｇ／ｍＬ、０．５～１．０ｍｇ／ｍＬ、または０．７ｍｇ／ｍＬであることができる。 Antibodies against toxin A can be obtained, for example, from whole eggs or egg yolks of eggs obtained from chickens immunized with toxin A. Here, when immunizing chickens with toxin A, toxin A is the only antigen contained in the inoculum. When immunizing chickens with multiple antigens, the other antigens are inoculated at a site different from the site where toxin A was inoculated. The number of inoculations and the amount of inoculation when immunizing chickens with toxin A are not particularly limited as long as the conditions are such that antibodies against toxin A are generated in chicken eggs. For example, chickens may be inoculated with toxin A multiple times, eg, 3, 5, 7, or 10 times, to increase antibody titers in chicken eggs. Also, the dose per injection can be 0.1-5.0 mg/mL, 0.3-3.0 mg/mL, 0.5-1.0 mg/mL, or 0.7 mg/mL.
毒素Ａで免疫した鶏から得られた卵の全卵または卵黄を粉末化したものを、毒素Ａに対する抗体を含む材料として使用してもよい。毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末を用いることが好ましい。全卵粉末を用いることにより、卵を卵白と卵黄とに分離する、ＩｇＹ抗体を分離する等の工程を減らすことができ、組成物の製造コストの低減を図ることができる。 Powdered whole eggs or egg yolks obtained from chickens immunized with toxin A may be used as the material containing antibodies against toxin A. It is preferred to use whole egg powder containing antibodies against toxin A. By using whole egg powder, steps such as separating the egg into egg white and yolk, separating the IgY antibody, etc. can be reduced, and the manufacturing cost of the composition can be reduced.
一態様において、本発明の組成物は、エビ類餌料である（以下、「本発明のエビ類餌料」と記載することがある）。エビ類餌料は、毒素Ａに対する抗体と公知のエビ類用の餌料（例えば、市販のエビ類用の餌料）と混合することにより得てもよい。例えば、毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末と公知のエビ類用の餌料を混合することにより、エビ類餌料を得てもよい。毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末を用いる場合、組成物重量に対して全卵粉末を０．１重量％以上、０．５重量％以上、１．０重量％以上、５．０重量％以上、１０重量％以上含むように調整してもよい。組成物重量に対する全卵粉末の含有量の上限に特に制限はなく、当業者が適宜設定することができる。組成物の製造コストを考慮する場合、組成物重量に対する全卵粉末の含有量は２０重量％以下とすることが好ましい。 In one aspect, the composition of the present invention is a shrimp feed (hereinafter sometimes referred to as "the shrimp feed of the present invention"). A shrimp feed may be obtained by mixing an antibody against toxin A with a known shrimp feed (eg, commercially available shrimp feed). For example, a shrimp feed may be obtained by mixing whole egg powder containing antibodies against toxin A with a known shrimp feed. When using whole egg powder containing an antibody against toxin A, it may be adjusted to contain 0.1% by weight or more, 0.5% by weight or more, 1.0% by weight or more, 5.0% by weight or more, 10% by weight or more of the composition weight. There is no particular upper limit for the content of the whole egg powder relative to the weight of the composition, and it can be appropriately set by those skilled in the art. When considering the production cost of the composition, the content of the whole egg powder is preferably 20% by weight or less with respect to the weight of the composition.
エビ類の感染症を防除するための方法
本発明は、本発明の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを含む、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類感染症を防除する方法に関する。以下、本明細書において「本発明のエビ類の感染症を防除するための方法」と表記することがある。各構成についての範囲は、上記「定義」の項目において記載した通りである。また、「本発明の組成物」については上記「エビ類の感染症を防除するための組成物」の項目において説明した通りである。
Method for Controlling Shrimp Infections The present invention relates to a method for controlling shrimp infections caused by Vibrio bacteria expressing toxins A and B, which comprises administering or having shrimps ingest the composition of the present invention. Hereinafter, this specification may be referred to as "the method for controlling infectious diseases of shrimp of the present invention". The scope for each configuration is as described in the "Definitions" section above. In addition, the "composition of the present invention" is as described in the above item "Composition for controlling infectious diseases of shrimp".
本発明の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを開始する時期は、エビ類の養殖期間内であって、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌への感染が確認されない段階であればいかなる時期であってもよい。好ましくは孵化直後または養殖開始直後より本発明の組成物のエビ類への投与・摂取を開始する。また、本発明の組成物をエビ類に投与する、または摂取させる期間は、エビ類の養殖期間の全範囲に渡っていてもよい。 The timing to start administering or ingesting the composition of the present invention to shrimp may be any time during the shrimp farming period, as long as infection with Vibrio bacteria expressing toxins A and B is not confirmed. Preferably, administration and intake of the composition of the present invention to shrimps is started immediately after hatching or immediately after the start of cultivation. In addition, the period during which the composition of the present invention is administered to shrimp or allowed to ingest may extend over the entire shrimp culture period.
一態様において、本発明のエビ類の感染症を防除するための方法は、本発明のエビ類餌料をエビ類に摂取させることを含む方法であってもよい。本発明のエビ類餌料については上述の通りである。その際、餌量は、一日あたりエビ類体重の３～１０重量％、３～７重量％、４～６重量％、または５重量％を、一日に数回に分けて摂取させてもよい。 In one aspect, the method for controlling infectious diseases of shrimp of the present invention may be a method comprising feeding shrimp with the shrimp feed of the present invention. The shrimp feed of the present invention is as described above. In this case, the feed amount may be 3 to 10% by weight, 3 to 7% by weight, 4 to 6% by weight, or 5% by weight of the shrimp body weight per day, divided into several times a day.
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to Examples, but the present invention is not limited to these.
実施例１：ＩｇＹの調製
ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａおよび毒素Ｂの組換えタンパク質を、大腸菌を用いて調製した。
Example 1: Preparation of IgY Recombinant proteins of toxin A and toxin B from Vibrio parahaemolyticus were prepared using E. coli.
ニワトリに６週間ごとに組換えタンパク質（毒素Ａおよび／または毒素Ｂ）を１ｍＬ（０．７ｍｇ／ｍＬ）注射した。注射は計５回行った。１回の注射につき、１ｍＬをニワトリの胸と足の２箇所に分けて注射した。ＩｇＹは、免疫したニワトリにおいて作られた後、当該ニワトリの卵内の卵黄に移行する。以下の４つの試験区に分けて、ＩｇＹを調製した。 Chickens were injected with 1 mL (0.7 mg/mL) of recombinant protein (toxin A and/or toxin B) every 6 weeks. A total of 5 injections were performed. For each injection, 1 mL was injected in two separate areas on the chicken's chest and leg. After IgY is made in the immunized chicken, it transfers to the yolk within the chicken's egg. IgY was prepared by dividing into the following four test groups.
試験区Ａ：毒素Ａの組換えタンパク質を注射した。 Plot A: Toxin A recombinant protein was injected.
試験区Ｂ：毒素Ｂの組換えタンパク質を注射した。 Plot B: Toxin B recombinant protein was injected.
試験区ＡＢ：毒素Ａの組換えタンパク質を１箇所に注射し、毒素Ｂの組換えタンパク質を別の箇所に注射した。 Plot AB: Recombinant protein of toxin A was injected at one site and recombinant protein of toxin B was injected at another site.
試験区ＡＢｍｉｘ：毒素Ａと毒素Ｂの組換えタンパク質を混合したものを注射した。 Plot ABmix: A mixture of toxin A and toxin B recombinant proteins was injected.
実施例２：ＩｇＹ含有餌料の調製
実施例１において免疫したニワトリから得られた卵の全卵を粉末化し、全卵粉末を得た。また、対照区として何も免疫されていない鶏から得られた全卵粉末も用意した。餌料は市販のエビ用餌料と混ぜて作成し、最終的な餌の重量に対し全卵粉末の含有率Ｘ重量％（Ｘは数値）という形で表した。成型には、市販のエビ用餌料と全卵粉末を滅菌蒸留水と混ぜ合わせ、シリンジを用いてトレーに餌の形に整形し、６０℃のオーブンで約２時間乾燥させ、４℃で保存した。対照区、試験区合わせて５種類のＩｇＹ含有餌料を得た。
Example 2 Preparation of IgY-Containing Feed Whole eggs obtained from the chickens immunized in Example 1 were pulverized to obtain whole egg powder. In addition, as a control group, whole egg powder obtained from chickens not immunized with anything was also prepared. The feed was prepared by mixing with commercially available shrimp feed, and expressed in the form of the content of whole egg powder X weight % (where X is a numerical value) with respect to the weight of the final feed. For molding, commercially available shrimp feed and whole egg powder were mixed with sterilized distilled water, shaped into a feed shape on a tray using a syringe, dried in an oven at 60°C for about 2 hours, and stored at 4°C. A total of 5 types of IgY-containing feeds were obtained for the control group and test group.
実施例３：感染実験（１）
方法
感染試験には、ＡＨＰＮＤ ＴＵＭＳＡＴ株（発明者が分離したビブリオ・パラヘモリティカスの株であって、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現することが確認された株）を用いてバナメイエビを感染させ、実施例２で調製したＩｇＹ含有餌料（全卵粉末の含有率２０％）を与えて死亡率を確認することにより防除効果を調べた。
Example 3: Infection experiment (1)
Method In the infection test, the AHPND TUMSAT strain (a strain of Vibrio parahaemolyticus isolated by the inventor and confirmed to express toxin A and toxin B) was used to infect vannamei shrimp, and the control effect was examined by giving the IgY-containing feed prepared in Example 2 (20% whole egg powder content) to confirm the mortality rate.
感染試験を行った際の水槽における条件は、塩分濃度３０ｐｐｔ、水温約２４℃、水量１０Ｌ、餌量は一日にエビ体重の５％を一日に３～４回で行った（ｎ＝２５）。また、感染実験を行う上で水槽内にバナメイエビを入れ、２日間給餌したのち、浸漬感染させた。給餌は浸漬感染後も６日間継続して行い、死亡率を確認した。 The conditions in the aquarium when the infection test was conducted were as follows: salt concentration of 30 ppt, water temperature of about 24° C., water volume of 10 L, feed volume of 5% of shrimp body weight per day, 3 to 4 times per day (n=25). For the infection experiment, vannamei shrimp were placed in a water tank, fed for two days, and then infected by immersion. Feeding was continued for 6 days after immersion infection, and the mortality rate was confirmed.
結果
結果を図１に示す。免疫していないニワトリ由来の鶏卵粉末を給餌した区の死亡率は１００％であった（対照区（control））。試験区Ａの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は１３％、試験区Ｂの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は８６％、試験区ＡＢｍｉｘの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は８２％、そして試験区ＡＢの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は１７％であった。
Results The results are shown in FIG. The mortality rate in the group fed with egg powder from non-immunized chickens was 100% (control). The mortality rate in the group fed with the feed containing the whole egg powder of the test group A was 13%, the mortality rate in the group fed with the feed containing the whole egg powder in the test group B was 86%, the mortality rate in the group fed with the feed containing the whole egg powder in the test group ABmix was 82%, and the mortality rate in the group fed with the feed containing the whole egg powder in the test group AB was 17%.
これらの結果から、鶏卵卵黄抗体を用いた経口受動免疫によりＡＨＰＮＤの防除が可能となることが示された。また、特に試験区Ａおよび試験区ＡＢの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は２０％以下に低減されていることから、毒素Ａに対して特異的なＩｇＹを含む餌料が、ＡＨＰＮＤに対する防除に特に有効であることが示された。 These results indicated that AHPND can be controlled by oral passive immunization using chicken egg yolk antibody. In particular, the mortality rate of the test plots A and AB fed with the feed containing whole egg powder was reduced to 20% or less, so the feed containing IgY specific to toxin A was shown to be particularly effective in controlling AHPND.
実施例４：感染実験（２）
方法
感染試験には、別途調製したＡＨＰＮＤ ＴＵＭＳＡＴ株（実施例３で使用した物と同じ株）を用いてバナメイエビを感染させ、実施例２で調製したＩｇＹ含有全卵粉末を含む餌料として、全卵粉末の含有率１重量％（ｔｏｘｉｎＡ－１）および１０重量％（ｔｏｘｉｎＡ－１０）の餌料を与えて死亡率を確認することにより防除効果を調べた。対照として、免疫していないニワトリ由来の全卵粉末を１重量％含む餌料（コントロール－１）を与えた区、および免疫していないニワトリ由来の全卵粉末を１０重量％含む餌料（コントロール－１０）を与えた区を設定した。
Example 4: Infection experiment (2)
Method In the infection test, a separately prepared AHPND TUMSAT strain (the same strain as used in Example 3) was used to infect Vannamei shrimp, and as a feed containing the IgY-containing whole egg powder prepared in Example 2, feeds containing 1% by weight (toxinA-1) and 10% by weight (toxinA-10) of the whole egg powder were given to check the mortality rate. As controls, a group fed with a diet containing 1% by weight of whole egg powder derived from non-immunized chickens (Control-1) and a group fed with a diet containing 10% by weight of whole egg powder derived from non-immunized chickens (Control-10) were set.
感染試験を行った際の水槽における条件は、塩分濃度３０ｐｐｔ、水温約２６℃、水量１０Ｌ、餌量は一日にエビ体重の５％を一日に３～４回で行った（ｎ＝２５）。また、感染実験を行う上で水槽内にバナメイエビを入れ、２日間給餌したのち、浸漬感染させた。給餌は浸漬感染後も７日間継続して行い、死亡率を確認した。 The conditions in the aquarium when the infection test was conducted were as follows: salt concentration 30ppt, water temperature about 26°C, water volume 10L, feed volume 5% of shrimp weight 3-4 times a day (n=25). For the infection experiment, vannamei shrimp were placed in a water tank, fed for two days, and then infected by immersion. Feeding was continued for 7 days after immersion infection, and the mortality rate was confirmed.
結果
結果を図２に示す。免疫していないニワトリ由来の鶏卵粉末含む餌料（コントロール－１、およびコントロール－１０）を与えた区の死亡率はそれぞれ５２％および３２％であった。ｔｏｘｉｎＡ－１を給餌した区の死亡率は４％、ｔｏｘｉｎＡ－１０を給餌した区の死亡率は０％であった。
Results The results are shown in FIG. The mortality rates in the plots fed the diet containing egg powder derived from non-immunized chickens (Control-1 and Control-10) were 52% and 32%, respectively. The toxin A-1-fed group had a mortality rate of 4%, and the toxin A-10-fed group had a mortality rate of 0%.
これらの結果からも、鶏卵卵黄抗体を用いた経口受動免疫によりＡＨＰＮＤの防除が可能となることが示された。特に、毒素Ａに対して特異的なＩｇＹを含む全卵粉末を１重量％含有する餌料を使用しても、ＡＨＰＮＤに対する防除に特に有効であることが示された。 These results also indicate that AHPND can be controlled by oral passive immunization using chicken egg yolk antibody. In particular, the use of a diet containing 1% by weight of whole egg powder containing IgY specific for Toxin A was also shown to be particularly effective in controlling AHPND.
本発明により、ビブリオ属細菌の毒素Ａに対する抗体を含む組成物が、有効に毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌による感染症を防除するために有効であり、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによるエビ類の死亡率を２０％以下にまで低減できることが示された。エビ類のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤへの感染は致死率が高く、エビ類の養殖業において甚大な被害を与えるものであるが、本発明はエビ類のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによる死亡率を低減し、エビ類の養殖を安定的に行うために有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it was shown that a composition containing an antibody against Vibrio toxin A is effective in controlling infections caused by Vibrio bacterium expressing toxins A and B, and can reduce the mortality rate of shrimp by EMS/AHPND to 20% or less. Infection of shrimp with EMS/AHPND has a high fatality rate and causes great damage in the shrimp farming industry. However, the present invention is useful for reducing the mortality rate of shrimp due to EMS/AHPND and stably farming shrimp.
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