JP2023092391A - 止血材組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】保存安定性に優れる止血材組成物の提供。【解決手段】タンパク質と反応して架橋構造を形成する反応性基を有する多糖類と、疎水性溶媒と、架橋タンパク質及び架橋多糖類からなる群より選択される１種以上の化合物を含む架橋粒子と、を含有する、止血材組成物。【選択図】なし

Description

本開示は、止血材組成物に関する。

制御不能な出血は依然として、外傷性傷害及び外科的傷害の主な死亡原因である。したがって、出血を制御するための有効な治療アプローチの開発は、臨床的及び社会的に極めて重要である。
これまで、外科手術に用いられる止血材としては、フィブリン糊、酸化セルロース不織布、コラーゲンスポンジ、でんぷん微粒子、トロンビン含有ゼラチンペースト等が知られており、これらは多様な形態で使用されている。
中でも、トロンビン含有ゼラチンペーストとしてフロシール(登録商標、Ｂａｘｔｅｒ社製）及びサージフロー(Ｅｃｈｉｃｏｎ社製）が広く知られている。
トロンビンは、血液中に含まれるフィブリノーゲンを活性化させ、フィブリン網を形成し、フィブリン網は血球と共に、血餅を形成することにより出血部を封止する作用がある。トロンビンは適切に選別されたヒト血液からウイルス不活化工程及び除去工程を経て精製されるが、感染症伝播のリスクを完全に排除することはできないという問題がある。そのため、安全性に優れる止血材の開発が求められている。

特許文献１では、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するポリエチレングリコールと、親水性溶媒であるポリエチレングリコールと、架橋ゼラチン粒子とを含有する、止血材組成物が開示されている。

特許第６１９５５６８号公報

今般、本発明者らは、特許文献１において開示される止血材組成物は、ポリエチレングリコールが有するＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基が、親水性溶媒に含まれる微量な水分、親水性溶媒が有する水酸基等と反応し、分解され、経時的に止血性が低下してしまい、その保存安定性には改善の余地があるとの課題を新たに見出した。
本開示の一実施形態が解決しようとする課題は、保存安定性に優れる止血材組成物を提供することである。

課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
＜１＞ タンパク質と反応して架橋構造を形成する反応性基を有する多糖類と、疎水性溶媒と、架橋タンパク質及び架橋多糖類からなる群より選択される１種以上の化合物を含む架橋粒子と、を含有する、止血材組成物。
＜２＞ 上記架橋粒子が、上記架橋タンパク質を含み、且つ
上記架橋タンパク質が、架橋ゼラチンである、上記＜１＞に記載の止血材組成物。
＜３＞ 上記架橋粒子の平均一次粒子径が、２０μｍ～７００μｍである、上記＜１＞又は＜２＞に記載の止血材組成物。
＜４＞ 上記反応性基が、－ＣＯＮ（ＣＯＣＨ_２）_２、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イミドエステル基、アルデヒド基、カルボキシ基、イソシアネート基、マレイミド基及びハロアセチル基からなる群より選択される１種以上の基である、上記＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の止血材組成物。
＜５＞ 上記反応性基が、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、上記＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の止血材組成物。
＜６＞ 上記多糖類が、セルロース、デキストラン、デキストリン、プルラン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、キチン、キトサン及びこれらの変性体からなる群より選択される１種以上の多糖類に由来する構造を含む、上記＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載の止血材組成物。
＜７＞ 上記多糖類が、上記反応性基を有する単糖類に由来する構成単位を含み、且つ
上記多糖類１００ｍｏｌ％に対する上記反応性基を有する単糖類に由来する構成単位の含有率が、１ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％である、上記＜１＞～＜６＞のいずれか１つに記載の止血材組成物。
＜８＞ 上記反応性基を有する単糖類に由来する構成単位が、下記一般式（１）で表される、上記＜７＞に記載の止血材組成物。

一般式（１）中、Ｌは、下記式で表される基である。

上記式中、ｎ及びｍは、１～３の整数を表し、＊は、テトラヒドロフラン側の酸素原子に連結する部位を表し、＊＊は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基側の酸素原子に連結する部位を表す。

＜９＞ 上記多糖類の重量平均分子量が、２０００～２５０００００である、上記＜１＞～＜８＞のいずれか１つに記載の止血材組成物。
＜１０＞ 上記疎水性溶媒が、植物油、パラフィン系溶媒、オレフィン系溶媒、シリコーンオイル系溶媒、脂肪酸エステル系溶媒、ハロゲン化アルキル系溶媒及びテルペン系溶媒からなる群より選択される１種以上である、上記＜１＞～＜９＞のいずれか１つに記載の止血材組成物。
＜１１＞ ２５℃の上記疎水性溶媒の動粘度が、１ｍｍ^２／秒～１０００ｍｍ^２／秒である、上記＜１＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の止血材組成物。
＜１２＞ 止血材組成物の総質量に対する上記疎水性溶媒の含有率が、３０質量％～８０質量％である、上記＜１＞～＜１１＞のいずれか１つに記載の止血材組成物。
＜１３＞水を含有しない、又は水を含有し、且つ止血材組成物の総質量に対する水の含有率が０．５質量％以下である、上記＜１＞～＜１２＞のいずれか１つに記載の止血材組成物。

本開示によれば、保存安定性に優れる止血材組成物を提供することができる。

本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。

本開示において、「疎水性溶媒」とは、水と混和性が低いことを意味し、２０℃のイオン交換水（ｐＨ６～８）１Ｌに２０ｇ以上溶解せず均一な水溶液とならないもの、すなわち、水への溶解度が２０ｇ／Ｌ未満である溶剤を指す。また、本開示において、上記溶解度が２０ｇ／Ｌ以上である溶媒を親水性溶媒という。
ここで、イオン交換水のpＨは、２０℃で、イオン交換水が空気に触れてから３分以内に測定した値を表す。

［止血材組成物］
本開示の止血材組成物は、タンパク質と反応して架橋構造を形成する反応性基（以下、「特定反応性基」とも記載する。）を有する多糖類（以下、「特定多糖類」とも記載する。）と、疎水性溶媒と、架橋タンパク質及び架橋多糖類からなる群より選択される１種以上の化合物を含む架橋粒子と、を含有する。

本開示の止血材組成物は、保存安定性に優れる。上記効果が奏される理由は以下のように推測されるが、これに限定されない。
本開示の止血材組成物は疎水性溶媒を含有し、上記疎水性溶媒中に、特定多糖類は、分散した状態で存在する。特定多糖類が有する特定反応性基は、疎水性溶媒中では分解されにくく、優れた保存安定性を示すと推測される。
また、本開示の止血材組成物が架橋粒子を含有することにより、この架橋粒子が、組成物中等の微量な水分を吸収し、特定多糖類の分解が抑制され、優れた保存安定性を示すと推測される。さらに架橋粒子の中でも、架橋ゼラチンは、たんぱく質構造を有するため、水との親和性が高く、上記保存安定性の効果がより顕著に発揮されると推測される。

本開示の止血材組成物の状態は、特に限定されるものではないが、生体への適用容易性の観点から、ペースト状態であることが好ましい。

［特定多糖類］
特定多糖類は、タンパク質と反応して架橋構造を形成する特定反応性基を有する。
特定反応性基は、タンパク質が有するアミノ基等と反応し、架橋構造を形成することができる基であれば、特に限定されるものではないが、止血性を向上する観点からは、－ＣＯＮ（ＣＯＣＨ_２）_２、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基（以下、「ＮＨＳ－エステル基」とも記載する。）、イミドエステル基、アルデヒド基、カルボキシ基、イソシアネート基、マレイミド基及びハロアセチル基からなる群より選択される１種以上の基であることが好ましく、ＮＨＳ－エステル基がより好ましい。
特定多糖類は、特定反応性基を２種以上有していてもよい。また、本開示の止血材組成物は、特定多糖類を２種以上含有してもよい。
なお、本開示において、特定反応基を有しない多糖類を非特定多糖類ともいう。

特定多糖類は、２以上の単糖類に由来する構成単位を含む。
保存安定性及び止血性を向上する観点、並びに生体適合性の観点から、特定多糖類は、セルロース、デキストラン、デキストリン、プルラン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、キチン、キトサン及びこれらの変性体からなる群より選択される１種以上の多糖類に由来する構造を含むことが好ましく、デキストランに由来する構造を含むことが好ましい。
上記した多糖類が有する構造は、特定反応基により変性されたものであることが好ましい。また、上記した多糖類が有する構造は、カルボキシ変性されたものであってもよい。
本開示において、変性体とは、セルロース等と、カルボキシ基等の官能基とを反応させることにより、官能基を導入した化合物を指す。

保存安定性及び止血性を向上する観点から、特定多糖類は、特定反応性基を有する単糖類に由来する構成単位（以下、「特定構成単位」とも記載する。）を含み、且つ特定多糖類１００ｍｏｌ％に対する特定構成単位の含有率は、１ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％であることが好ましく、３ｍｏｌ％～３０ｍｏｌ％であることがより好ましく、５ｍｏｌ％～２５ｍｏｌ％であることがさらに好ましい。

保存安定性及び止血性を向上する観点、生体適合性の観点等から、特定構成単位は、下記一般式（１）で表される構成単位が好ましい。

一般式（１）中、Ｌは、下記式で表される基である。
下記式中、ｎ及びｍは、１～３の整数を表し、＊は、テトラヒドロフラン側の酸素原子に連結する部位を表し、＊＊は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基側の酸素原子に連結する部位を表す。

上記した基の中でも、反応性基の反応速度が最も高く止血性を向上する観点からは、Ｌは、下記式で表される基であることが好ましい。

生体適合性の観点等から、特定多糖類は、上記式（１）で表される構成単位に加え、下記式（２）で表される構成単位を含むことが好ましい。

特定多糖類が式（２）で表される構成単位を含む場合、特定多糖類１００ｍｏｌ％に対する式（２）で表される構成単位の含有率は、４０ｍｏｌ％～９０ｍｏｌ％であることが好ましく、４５ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％であることがより好ましい。

特定多糖類は、下記式（３）で表される構成単位を含むことができ、これにより、水溶解時のｐＨを下げることができる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基等の特定反応性基は低ｐＨの溶液中において分解が抑制されるため、大気中、組成物等のわずかな水分に対する分解反応を抑制することができる。

特定多糖類が式（３）で表される構成単位を含む場合、特定多糖類１００ｍｏｌ％に対する式（３）で表される構成単位の含有率は、５ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％であることが好ましく、８ｍｏｌ％～３０ｍｏｌ％であることがより好ましい。

特定多糖類の重量平均分子量（Ｍｗ）は、２０００～２５０００００であることが好ましく、５０００～２００００００であることがより好ましく、１００００～７５００００であることがさらに好ましく、２００００～２０００００であることが特に好ましい。
特定多糖類のＭｗが２０００以上であることにより、特定多糖類が有する特定反応性基がタンパク質と反応し、架橋構造を形成した際の被膜が良好に形成され、止血性がより向上する。特定多糖類のＭｗが２５０００００以下であることにより、特定多糖類の合成を容易に行うことができ、且つ特定多糖類を含有する止血材組成物の取扱い性に優れる。
また、特定多糖類のＭｗが２０００以上であることにより、特定多糖類が有する特定反応性基の数の調整を容易に行うことができ、止血性及び保存安定性を向上することができる。なお、特定多糖類の数は、特定多糖類の合成時に使用する反応性基を有する単糖類の割合を調整することにより、調整することができる。
止血箇所に適用した止血材組成物は、止血完了後には余剰部分が除去されることが好ましく、通常、生理食塩水等により除去される。特定多糖類のＭｗが２５０００００以下であることにより、上記除去性を向上することができる。

本開示において、Ｍｗは、試料を超純水へ０．１質量％の濃度となるように溶解させ、孔径０．４５μｍフィルターを用いてろ過を行い、得られたろ液に対し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）測定を行うことにより求める。測定条件は、下記の通りである。
（測定条件）
・カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷ_ＸＬ＋Ｇ４０００ＰＷ_ＸＬ＋Ｇ２５００ＰＷ_ＸＬ
・流量：０．７ｍＬ／分
・カラム温度：４０℃
・注入量：１００μＬ
・溶離液：１００ｍＭ ＮａＮＯ_３ａｑ．
・試料濃度：１０００ｐｐｍ
・検出：ＲＩ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）
・分析時間：６０分間
・標準試料：プルラン５．８ｋ，１２．２ｋ，２３．７ｋ，４８．０ｋ，１００ｋ，１８６ｋ，３８０ｋ，８５３ｋ（Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐ－８２）

保存安定性及び止血性を向上する観点から、止血材組成物の総質量に対する特定多糖類の含有率は、１質量％～６０質量％であることが好ましく、５質量％～５０質量％であることがより好ましく、１５質量％～３０質量％であることがさらに好ましい。

保存安定性、止血性及び除去性を向上する観点から、２０℃の疎水性溶媒１００ｇに対する特定多糖類の溶解度は、１質量％以下であることが好ましく、０．５質量％以下であることがより好ましく、０．１質量％以下であることがさらに好ましい。上記溶解度の下限は、特に限定されるものではなく、０質量％であってもよい。
例えば、２０℃における疎水性溶媒１００ｇへの溶解度が１質量％であるとは、疎水性溶媒１００ｇへ溶解する特定多糖類の量が１ｇであることを意味する。

［疎水性溶媒］
疎水性溶媒は、保存安定性、止血性及び除去性を向上する観点から、２０℃のイオン交換水１Ｌに対する溶解度が２０ｇ／Ｌ未満であることが好ましく、５ｇ／Ｌ未満であることがより好ましく、１ｇ／Ｌ未満であることがさらに好ましい。上記溶解度の下限は、特に限定されるものではなく、０ｇ／Ｌであってもよい。

疎水性溶媒の種類は、特に限定されるものではなく、保存安定性及び止血性を向上する観点、並びに生体への適用容易性の観点から、疎水性溶媒は、植物油、パラフィン系溶媒、オレフィン系溶媒、シリコーンオイル系溶媒、脂肪酸エステル系溶媒、ハロゲン化アルキル系溶媒及びテルペン系溶媒からなる群より選択される１種以上であることが好ましく、植物油及び脂肪酸エステル系溶媒からなる群より選択される１種以上であることがより好ましく、植物油がさらに好ましい。
本開示においては、「植物油」とは、植物を原料とする油であれば特に限定されず、これらの誘導体であってもよく、脂肪酸グリセリドを含有する植物油が好ましい。植物油としては、亜麻仁油、えごま油、オリーブ油、グレープシード油、コーン油、やし油、ごま油、こめ油、大豆油、なたね油、パーム油、ひまわり油、べに花油、綿実油、落花生油、アボカド油、アーモンド油、アルガン油、カカオ油、シアバター、ツバキ油、ピーナッツ油、ヒマシ油等が挙げられる。
パラフィン系溶媒としては、オクタン、デカン、ドデカン、トリデカン等が挙げられる。
オレフィン系溶媒としては、デセン、ドデセン等が挙げられる。
シリコーンオイル系溶媒としては、ジメチルシリコーンオイル、メチルフェニルシリコーンオイル、環状ジメチルシリコーンオイル等が挙げられる。
脂肪酸エステル系溶媒としては、ラウリン酸メチル、パルミチン酸メチル、ステアリン酸メチル、オレイン酸メチル、パームオレイン酸メチル、カプリル酸－２－エチルヘキシル、グリセリンモノステアレート、グリセリンモノベヘネート、グリセリンモノ１２－ヒドロキシステアレート、グリセリンモノオレート、グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノカプレート、グリセリンモノラウレート、オレイン酸アルキル（オレイン酸エチル、オレイン酸メチル等）、オレイン酸トリグリセリド、リノール酸アルキル（リノール酸メチル、リノール酸エチル等）、リノール酸トリグリセリド、ジオレイン酸グリセリドなどが挙げられる。
ハロゲン化アルキル系溶媒としては、塩化メチレン、１，１，１－トリクロロエタン等が挙げられる。
テルペン系溶媒としては、Ｄ－リモネン等が挙げられる。
本開示の止血材組成物は、疎水性溶媒を２種以上含有してもよい。

疎水性溶媒の分子量は、３００～１５００であることが好ましい。
医療用途に用いるため、高周波処置などにより瞬間的に高温になる場合がある。このため、実際の手術を想定した安全性の観点から、疎水性溶媒は不揮発性であることが好ましい。不揮発性の溶媒とは、沸点が５０℃以上の溶媒を指し、１００℃以上であることが好ましく、２００℃以上であることがより好ましい。
本開示において、沸点の測定は、１気圧（１０１３２５Ｐａ）下における沸点を意味する。沸点は、沸点計により測定され、例えば、タイタンテクノロジーズ社製の沸点測定器（製品名「ＤｏｓａＴｈｅｒｍ３００」）を用いて測定される。

生体への適用容易性及び生体からの水洗除去性を向上し、且つ経時的な液分離を抑制する観点から、２５℃の疎水性溶媒の動粘度は、１ｍｍ^２／秒～１０００ｍｍ^２／秒であることが好ましく、５ｍｍ^２／秒～２００ｍｍ^２／秒であることがより好ましく、２０ｍｍ^２／秒～１００ｍｍ^２／秒であることがさらに好ましい。
本開示において、動粘度の測定は、ＪＩＳ Ｋ ２２８３（２０００）に準拠して行う。

保存安定性及び止血性を向上する観点から、止血材組成物の総質量に対する疎水性溶媒の含有率は、２５質量％～７５質量％であることが好ましく、３０質量％～７０質量％であることがより好ましく、４０質量％～６０質量％であることがさらに好ましい。

［架橋粒子］
本開示の止血材組成物は、架橋タンパク質及び架橋多糖類からなる群より選択される１種以上の化合物を含む架橋粒子を含有する。架橋粒子を含有する止血材組成物を血液と混合した場合、血液中の水分が架橋粒子に取り込まれ、血液中におけるタンパク質の濃度が向上し、特定多糖類との反応性が向上し、止血性がより向上する。
また、止血効果を向上することを目的として、出血部位へ適用した止血材組成物を、食塩水等を含浸させたガーゼ等により圧迫する場合がある。止血材組成物に架橋粒子を含有させることにより、圧迫後に剥離するガーゼ等への止血材組成物の転写を抑制することができる。これは、ガーゼ等に含浸させた生理食塩水等を架橋粒子が取り込み、架橋の程度に応じて膨潤し、ガーゼと止血材組成物との接触面積が小さくなるためと推測される。
本開示において、架橋粒子とは、２以上のたんぱく質等が架橋した粒子を意味する。また、本開示において、架橋タンパク質とは２以上のタンパク質が架橋したものを指し、架橋多糖類とは、２以上の多糖類が架橋したものを指す。

上記架橋タンパク質としては、架橋ゼラチン、架橋コラーゲン、架橋アルブミン、架橋ヘモグロビン、架橋フィブリノーゲン、架橋フィブリン、架橋カゼイン、架橋エラスチン、架橋ケラチン等が挙げられる。
上記架橋多糖類を構成する多糖類としては、架橋セルロース、架橋デキストラン、架橋デキストリン、架橋プルラン、架橋ヒアルロン酸、架橋アルギン酸、架橋キサンタンガム、架橋キチン、架橋キトサン、これらの変性体等が挙げられる。
本開示の止血材組成物は、架橋粒子を２種以上含有してもよい。
保存安定性、止血性及び転写抑制性を向上する観点からは、架橋粒子は、架橋タンパク質を含み、且つ架橋タンパク質が、架橋ゼラチンであることが好ましい。

水分の取り込み性を向上させ、止血性を向上する観点から、上記架橋タンパク質及び架橋多糖類は、親水性ポリマーであることが好ましい。

保存安定性及び止血性を向上する観点、並びにガーゼへの止血材組成物の転写を抑制する観点から、架橋粒子の総質量に対する架橋タンパク質及び架橋多糖類の含有率の和は、５０質量％以上であることが好ましく、６５質量％以上であることがより好ましく、７５質量％以上であることがさらに好ましく、９０質量％以上であることが特に好ましく、１００質量％であってもよい。

水分の取り込み性を向上させ、保存安定性及び止血性を向上する観点、ガーゼへの止血材組成物の転写を抑制する観点、並びに血管内等への侵入抑制性の観点から、架橋粒子の平均一次粒子径は、２０μｍ～７００μｍであることが好ましく、１００μｍ～７００μｍであることがより好ましく、２００μｍ～７００μｍであることがさらに好ましい。

本開示において、平均一次粒子径の測定は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の画像から無作為に選択した５０個の粒子径を算術平均することにより求める。なお、粒子の粒子径は、一次粒子径を測定する。

保存安定性を向上する観点、水分の取り込み性を向上させ、止血性を向上する観点、ガーゼへの止血材組成物の転写を抑制する観点及び血管内等への侵入抑制性の観点から、止血材組成物の総質量に対する架橋粒子の含有率は、１質量％～５０質量％であることが好ましく、８質量％～４０質量％であることがより好ましく、２０質量％～４０質量％がさらに好ましい。

［特定多糖類、疎水性溶媒及び架橋粒子以外の成分］
本開示の止血材組成物は、特定多糖類、疎水性溶媒及び架橋粒子以外の成分を含有していてもよく、アスコルビン酸等の安定化剤、抗生物質、血管収縮剤、色素、成長因子、増殖因子、骨形成タンパク質、鎮痛剤、抗炎症剤、トラネキサム酸等の抗線溶剤などが挙げられる。
本開示の止血材組成物は、水を含有してもよいが、保存安定性の観点から、止血材組成物の総質量に対する水の含有率は、５質量％以下であることが好ましく、３質量％以下であることがより好ましく、１質量％以下であることがさらに好ましく、０．５質量％以下であることが特に好ましく、０．１質量％以下であることが最も好ましく、含有しないことが最も好ましい。

以下、上記実施形態を実施例により具体的に説明するが、上記実施形態はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、表１～表３中の数値の単位は、特に断りがない場合には、質量％である。

（合成例１）
カルボキシメチルデキストランナトリウムＡ（名糖産業株式会社製、ＣＭＤ－Ｄ４０、Ｍｗ４００００）１０ｇを、１００ｇの蒸留水に溶解させ、１０質量％塩酸水溶液を１３ｇ加えた。得られた溶液を１６００ｍＬのメタノールに再沈殿させ、濾物をメタノールにより洗浄した後、室温（２５℃）において、２４時間真空乾燥させることにより、１０．４４ｇのカルボキシメチルデキストランＸを得た。
次に、カルボキシメチルデキストランＸ１０ｇをジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）１００ｇに溶解させ、Ｎ－ヒドロシクシンイミド（富士フイルム和光純薬株式会社製）３．７８ｇ及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ塩酸塩、富士フイルム和光純薬株式会社製）６．３０ｇをそれぞれ添加し、４０℃にて４時間攪拌した。
得られた溶液を、３５０ｍＬのメタノールに再沈殿させ、濾物をメタノール及びアセトンにより洗浄後、室温（２５℃）において、２４時間真空乾燥させることにより、１０．６ｇのＮ－ヒドロシクシンイミドエステル基を有するカルボキシメチルデキストランＡ（以下、「ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストラン」とも記載する。）を得た。なお、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＡは、上記した一般ｓ式（１）で表される構成単位、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位から構成されるものであった。

ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＡ１０ｍｇを１ｇの重水に溶解させ、４０℃に加熱し、２４時間加水分解を行った。
核磁気共鳴装置（ＢＲＵＫＥＲ社製、４００ＭＨｚＮＭＲ、積算回数：１６回）を用いて、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＡの加水分解物を入手し、得られたスペクトルにおいて、グルコピラノース環１位のプロトン（４．８２ｐｐｍ～５．４７ｐｐｍ）に対する、遊離したＮ－ヒドロシクシンイミドのプロトン（２．６７ｐｐｍ～２．７４ｐｐｍ）の割合を求めることにより、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＡ１００ｍｏｌ％に対するＮ－ヒドロシクシンイミドエステル基を有する単糖類に由来する構成単位（一般式（１）で表される構成単位）の含有率を算出したところ、１４．８ｍｏｌ％であった。
同様に、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位の含有率を算出したところ、それぞれ、７０ｍｏｌ％、１５．２ｍｏｌ％であった。
また、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＡのＭｗは、４５０００であった。

（合成例２）
水酸化ナトリウム１９．６ｇを、蒸留水１０６ｇに溶解させ、そこにプルラン（東京化成工業株式会社製）１０ｇを少しずつ添加し溶解させ、９０分間攪拌した。
攪拌後、クロロ酢酸水溶液（クロロ酢酸７ｇを蒸留水６３ｇに溶解したもの）を加え、６０℃で６時間反応させた。
室温（２５℃）まで冷却後、２０質量％塩酸水溶液を６５ｇ添加し２時間攪拌した。得られた溶液を２５００ｍＬのメタノールに再沈殿させ、濾物をメタノールにより洗浄後、室温（２５℃）において、２４時間真空乾燥させることにより、１０．８５ｇのカルボキシメチルプルランを得た。
カルボキシメチルデキストランＸを、カルボキシメチルプルランに変更し、且つＮ－ヒドロシクシンイミド及びＥＤＣ塩酸塩の添加量をそれぞれ１．６９ｇ、２．８１ｇに変更した以外は、合成例１と同様にして、ＮＨＳ－カルボキシメチルプルランを得た。なお、ＮＨＳ－カルボキシメチルプルランは、上記した一般式（１）で表される構成単位、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位から構成されるものであった。
また、ＮＨＳ－カルボキシメチルプルラン１００ｍｏｌ％に対するＮ－ヒドロシクシンイミドエステル基を有する単糖類に由来する構成単位（一般式（１）で表される構成単位）の含有率を算出したところ、６．３ｍｏｌ％であった。
同様に、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位の含有率を算出したところ、それぞれ、７０ｍｏｌ％、２３．７ｍｏｌ％であった。
また、ＮＨＳ－カルボキシメチルプルランのＭｗは、１２０００であった。

（合成例３）
水酸化ナトリウム１９．６ｇを、蒸留水１０６ｇに溶解させ、そこにデキストリン（三和澱粉工業株式会社製、サンデック（登録商標）＃１００）１０ｇを少しずつ添加し、溶解させ、９０分間攪拌した。
攪拌後、クロロ酢酸水溶液（クロロ酢酸７ｇを蒸留水６３ｇに溶解したもの）を加え、６０℃で６時間反応させた。
室温（２５℃）まで冷却後、２０質量％塩酸水溶液を６５ｇ添加し２時間攪拌した。得られた溶液を２５００ｍＬのメタノールに再沈殿させ、濾物をメタノールにより洗浄後、室温（２５℃）において、２４時間真空乾燥させることにより、１０．２５ｇのカルボキシメチルデキストリンを得た。
カルボキシメチルデキストランＸを、カルボキシメチルデキストリンに変更し、且つＮ－ヒドロシクシンイミド及びＥＤＣ塩酸塩の添加量をそれぞれ３．３１ｇ、５．５１ｇに変更した以外は、合成例１と同様にして、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストリンを得た。なお、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストリンは、上記した一般式（１）で表される構成単位、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位から構成されるものであった。
また、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストリン１００ｍｏｌ％に対するＮ－ヒドロシクシンイミドエステル基を有する単糖類に由来する構成単位（一般式（１）で表される構成単位）の含有率を算出したところ、１０ｍｏｌ％であった。
同様に、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位の含有率を算出したところ、それぞれ、７０ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％であった。
また、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストリンのＭｗは、１８０００であった。

（合成例４）
合成例１で合成したカルボキシメチルデキストランＸ１０ｇをＤＭＡｃ１００ｇに溶解させ、Ｎ－ヒドロシクシンイミド（富士フイルム和光純薬株式会社製）５．６７ｇ及びＥＤＣ塩酸塩（富士フイルム和光純薬株式会社製）９．４５ｇをそれぞれ添加し、４０℃にて４時間攪拌した。
得られた溶液を、３５０ｍＬのメタノールに再沈殿させ、濾物をメタノール及びアセトンにより洗浄後、室温（２５℃）において、２４時間真空乾燥させることにより、１１．２ｇのＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＢを得た。なお、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＢは、上記した一般式（１）で表される構成単位、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位から構成されるものであった。
また、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＢ１００ｍｏｌ％に対するＮ－ヒドロシクシンイミドエステル基を有する単糖類に由来する構成単位（一般式（１）で表される構成単位）の含有率を算出したところ、２１ｍｏｌ％であった。
同様に、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位の含有率を算出したところ、それぞれ、７０ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％であった。
また、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＢのＭｗは、４７０００であった。

（合成例５）
合成例１で合成したカルボキシメチルデキストランＸ１０ｇをＤＭＡｃ１００ｇに溶解させ、Ｎ－ヒドロシクシンイミド（富士フイルム和光純薬株式会社製）１．３２ｇ及びＥＤＣ塩酸塩（富士フイルム和光純薬株式会社製）２．２０ｇをそれぞれ添加し、４０℃にて４時間攪拌した。
得られた溶液を、３５０ｍＬのメタノールに再沈殿させ、濾物をメタノール及びアセトンにより洗浄後、室温（２５℃）において、２４時間真空乾燥させることにより、１０．１ｇのＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＣを得た。なお、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＣは、上記した一般式（１）で表される構成単位、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位から構成されるものであった。
また、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＣ１００ｍｏｌ％に対するＮ－ヒドロシクシンイミドエステル基を有する単糖類に由来する構成単位（一般式（１）で表される構成単位）の含有率を算出したところ、２．２ｍｏｌ％であった。
同様に、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位の含有率を算出したところ、それぞれ、７０ｍｏｌ％、２７．８ｍｏｌ％であった。
また、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＣのＭｗは、４４０００であった。

（合成例６）
カルボキシメチルデキストランナトリウムＡを、カルボキシメチルデキストランナトリウムＢ（名糖産業株式会社製、ＣＭＤ－５００、Ｍｗ５０００００）に変更した以外は、合成例１と同様にして、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＤを得た。なお、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＤは、上記した一般式（１）で表される構成単位、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位から構成されるものであった。
また、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＤ１００ｍｏｌ％に対するＮ－ヒドロシクシンイミドエステル基を有する単糖類に由来する構成単位（一般式（１）で表される構成単位）の含有率を算出したところ、１５ｍｏｌ％であった。
同様に、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位の含有率を算出したところ、それぞれ、７０ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％であった。
また、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＤのＭｗは、５３００００であった。

（合成例７）
カルボキシメチルデキストランナトリウムＡを、カルボキシメチルデキストランナトリウムＣ（名糖産業株式会社製、ＣＭＤ－Ｌ、Ｍｗ１００００）に変更した以外は、合成例１と同様にして、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＥを得た。なお、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＧは、上記した一般式（１）で表される構成単位、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位から構成されるものであった。
また、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＥ１００ｍｏｌ％に対するＮ－ヒドロシクシンイミドエステル基を有する単糖類に由来する構成単位（一般式（１）で表される構成単位）の含有率を算出したところ、１５ｍｏｌ％であった。
同様に、式（２）で表される構成単位及び式（３）で表される構成単位の含有率を算出したところ、それぞれ、７０ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％であった。
また、ＮＨＳ－カルボキシメチルデキストランＥのＭｗは、１１０００であった。

（合成例８）
ジフェニルメタンジイソシアネート（富士フイルム和光純薬株式会社製）５ｇを、トルエン（富士フイルム和光純薬株式会社製）９０ｇ及びジフェニルメタンジイソシアネート（富士フイルム和光純薬株式会社製）５ｇの混合溶液に溶解させ、キトサン（株式会社ゼネラルサイエンスコーポレーション製、Ｍｗ１５０００、パウダー状、脱アセチル化度８４％）５ｇを分散させた。
得られた分散液を１００℃で２４時間攪拌し、室温（２５℃）に冷却後、ろ過し、得られた粉末をトルエン及びアセトンにより洗浄し、風乾させることにより、イソシアネート化キトサンの粉末を得た。
また、イソシアネート化キトサンのＭｗは、１５０００であった。

（合成例Ａ）
株式会社ニッピ製のハイグレードゼラチン（Ｍｗ６０，０００）に対し、吸収線量が５０ｋＧｙとなるようにγ線を照射し、架橋ゼラチンを得た。
架橋ゼラチンを乳鉢により粉砕し、メッシュの篩を使用して、平均一次粒子径２０μｍ以上１００μｍ未満の架橋ゼラチン粒子Ａ、平均一次粒子径１００μｍ以上２００μｍ未満の架橋ゼラチン粒子Ｂ、及び平均一次粒子径２００μｍ以上７００μｍ以下の架橋ゼラチン粒子Ｃを得た。

＜実施例１～実施例２０及び比較例１～比較例６＞
表１～表３に示す成分を混合することにより、ペースト状の止血材組成物を製造した。

表１～表３に示す成分の詳細は以下の通りである。
（疎水性溶媒）
・植物油Ａ：健栄製薬株式会社製、日本薬局方オリーブ油、２５℃の動粘度７２ｍｍ^２／秒、不揮発性
・植物油Ｂ：カネダ株式会社製、日本薬局方大豆油、２５℃の動粘度６０ｍｍ^２／秒、不揮発性・パラフィン系溶媒：日医工株式会社製、流動パラフィンＮｉｋＰ、２５℃の動粘度３７ｍｍ^２／秒、不揮発性
・シリコーンオイル系溶媒Ａ：信越化学工業株式会社製、ＫＦ－９６－１０ｃｓ、２５℃の動粘度１０ｍｍ^２／秒、不揮発性
・シリコーンオイル系溶媒Ｂ：信越化学工業株式会社製、ＫＦ－９６－５００ｃｓ、２５℃の動粘度５００ｍｍ^２／秒、不揮発性
・脂肪酸エステル系溶媒：オレイン酸メチル、花王株式会社製、エキセパール（登録商標）Ｍ－ＯＬ、２５℃の動粘度５ｍｍ^２／秒、不揮発性
上記した疎水性溶媒２０ｇを２０℃のイオン交換水（ｐＨ７）１Ｌに投入したところ、２層に分離し、均一な水溶液とはならず、水への溶解度が２０ｇ／Ｌ未満であることが確認された。

（親水性溶媒）
・ポリエチレングリコール：富士フイルム和光純薬株式会社製、ＰＥＧ２００、２５℃の動粘度６２ｍｍ^２／秒、不揮発性
・ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコール共重合体：ＢＡＳＦ社製、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ６１、２５℃の動粘度３００ｍｍ^２／秒、不揮発性
・ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：富士フイルム和光純薬株式会社製、不揮発性
上記した親水性溶媒２０ｇを２０℃のイオン交換水（ｐＨ７）１Ｌに投入したところ、均一な水溶液となり、水への溶解度が２０ｇ／Ｌ以上であることが確認された。

（非特定多糖類）
・デキストラン４００００：富士フイルム和光純薬株式会社製
・ペンタエリトリトールポリ（エチレングリコール）エーテルテトラスクシンイミジルグルタレート：油化産業株式会社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ－１００ＧＳ、Ｍｗ１００００

（架橋粒子）
・架橋多糖類粒子：ＤＦＥ Ｐｈａｒｍａ社製、Ｐｒｉｍｅｌｌｏｓｅ、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、平均一次粒子径５０μｍ

＜＜保存安定性評価＞＞
実施例１～実施例２０及び比較例１～比較例６において製造した止血材組成物を、５０℃の環境下に１０日間保存した。
ブタを開腹し、肝臓表面部に生検トレパンにより、Φ８ｍｍ、深さ２ｍｍの出血創傷部を形成させた。
保存後の各止血材組成物を、出血創傷部を覆うように、０．５ｇ塗布し、被膜を形成させ、生理食塩水で湿らせたガーゼにより圧迫した。
止血材組成物の適用から、１分後、２分後、５分後及び１０分後の出血創傷部の状態を目視により観察し、下記評価基準に基づき、評価し、表１～表３にまとめた。なお、評価は３～５で保存安定性が良好であると判断した。
（評価基準）
５：１分後の出血創傷部の状態観察において止血が達成されていることを確認することができた。
４：１分後の出血創傷部の状態観察において止血が達成されていなかったが、２分後の出血創傷部の状態観察においては止血が達成されていることを確認することができた。
３：２分後の出血創傷部の状態観察において止血が達成されていなかったが、５分後の出血創傷部の状態観察においては止血が達成されていることを確認することができた。
２：５分後の出血創傷部の状態観察において止血が達成されていなかったが、１０分後の出血創傷部の状態観察においては止血が達成されていることを確認することができた。
１：１０分後の出血創傷部の状態観察においても止血が達成されていなかった。

＜＜止血性評価＞＞
ブタを開腹し、肝臓部を生検トレパンにより、Φ８ｍｍ、深さ２ｍｍの出血創傷部を形成させた。
実施例１～実施例２０及び比較例１～比較例６において製造した止血材組成物を、出血創傷部を覆うように、０．５ｇ塗布し、被膜を形成させ、生理食塩水で湿らせたガーゼにより圧迫した。
止血材組成物の適用から、１分後、２分後、５分後及び１０分後の出血創傷部の状態を目視により観察し、下記評価基準に基づき、評価し、表１～表３にまとめた。なお、評価は３～５で止血性が良好であると判断した。
（評価基準）
５：１分後の出血創傷部の状態観察において止血が達成されていることを確認することができた。
４：１分後の出血創傷部の状態観察において止血が達成されていなかったが、２分後の出血創傷部の状態観察においては止血が達成されていることを確認することができた。
３：２分後の出血創傷部の状態観察において止血が達成されていなかったが、５分後の出血創傷部の状態観察においては止血が達成されていることを確認することができた。
２：５分後の出血創傷部の状態観察において止血が達成されていなかったが、１０分後の出血創傷部の状態観察においては止血が達成されていることを確認することができた。
１：１０分後の出血創傷部の状態観察においても止血が達成されていなかった。

＜＜除去性評価＞＞
実施例１～実施例２０及び比較例１～比較例６において製造した止血材組成物を、スライドガラスプレート(２．５ｃｍ×７．５ｃｍ）に厚さ２ｍｍとなるように塗布をした。
塗布後のスライドガラスプレートを５０ｃｃの生理食塩水へ静かに浸漬させ、１０秒後及び１分後に取り出し、目視により観察し、下記評価基準に基づき、評価し、表１～表２にまとめた。なお、評価は３～５で除去性が良好であると判断した。
（評価基準）
５：浸漬開始から１０秒後に取り出したスライドガラスプレートにおいて、止血材組成物の残存は確認されなかった。
４：浸漬開始から１０秒後に取り出したスライドガラスプレートには止血材組成物の残存がわずかに確認されたが、浸漬開始から１分後に取り出したスライドガラスプレートには止血材組成物の残存は確認されなかった。
３：浸漬開始から１０秒後及び１分後に取り出したいずれのスライドガラスプレートにおいても、止血材組成物の残存がわずかに確認された。
２：浸漬開始から１０秒後及び１分後に取り出したいずれのスライドガラスプレートにおいても、止血材組成物の残存が多く確認された。
１：浸漬開始から１０秒後及び１分後に取り出したいずれのスライドガラスプレートにおいても、止血材組成物が除去された形跡がなく、塗布した止血材組成物のほぼ全量が残存していることが確認された。

＜＜転写抑制性評価＞＞
実施例１～実施例２０及び比較例１～比較例６において製造した止血材組成物を、ブタ摘出肝臓の表面に、０．５ｇ塗布し、被膜を形成させ、生理食塩水で湿らせたガーゼにより２分間圧迫した。
その後、ガーゼをゆっくりと剥離し、ガーゼ表面及び摘出肝臓表面を目視により観察し、下記評価基準に基づき、評価し、表１～表３にまとめた。なお、評価は３～５で転写抑制性が良好であると判断した。
（評価基準）
５：ガーゼへの止血材組成物の転写が見られず、且つ摘出肝臓表面の被膜における剥離が見られなかった。
４：ガーゼへの止血材組成物の転写がわずかに見られたが、摘出肝臓表面の被膜における剥離は見られなかった。
３：ガーゼへの止血材組成物の転写がわずかに見られ、且つ摘出肝臓表面の被膜における剥離がわずかに見られた。
２：ガーゼへの止血材組成物の転写が多く見られ、且つ摘出肝臓表面の被膜における剥離が多く見られた。
１：ガーゼへの止血材組成物の転写が多く見られ、且つ摘出肝臓表面の被膜のほとんどが剥離した。

表１及び表２から、特定多糖類と、疎水性溶媒と、架橋粒子と、を含有する本開示の止血材組成物は、保存安定性に優れることが分かる。
表３から、親水性溶媒を含有する止血材組成物は、保存安定性に改善の余地があることが分かる。
また、表３から、特定多糖類を含有しない止血材組成物は、止血性及び保存安定性に改善の余地があることが分かる。

Claims (13)

1. タンパク質と反応して架橋構造を形成する反応性基を有する多糖類と、疎水性溶媒と、架橋タンパク質及び架橋多糖類からなる群より選択される１種以上の化合物を含む架橋粒子と、を含有する、止血材組成物。
2. 前記架橋粒子が、前記架橋タンパク質を含み、且つ
   前記架橋タンパク質が、架橋ゼラチンである、請求項１に記載の止血材組成物。
3. 前記架橋粒子の平均一次粒子径が、２０μｍ～７００μｍである、請求項１又は請求項２に記載の止血材組成物。
4. 前記反応性基が、－ＣＯＮ（ＣＯＣＨ_２）_２、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イミドエステル基、アルデヒド基、カルボキシ基、イソシアネート基、マレイミド基及びハロアセチル基からなる群より選択される１種以上の基である、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の止血材組成物。
5. 前記反応性基が、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の止血材組成物。
6. 前記多糖類が、セルロース、デキストラン、デキストリン、プルラン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、キチン、キトサン及びこれらの変性体からなる群より選択される１種以上の多糖類に由来する構造を含む、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の止血材組成物。
7. 前記多糖類が、前記反応性基を有する単糖類に由来する構成単位を含み、且つ
   前記多糖類１００ｍｏｌ％に対する前記反応性基を有する単糖類に由来する構成単位の含有率が、１ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％である、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の止血材組成物。
8. 前記反応性基を有する単糖類に由来する構成単位が、下記一般式（１）で表される、請求項７に記載の止血材組成物。
   

   

   
   
   一般式（１）中、Ｌは、下記式で表される基である。
   

   

   
   上記式中、ｎ及びｍは、１～３の整数を表し、＊は、テトラヒドロフラン側の酸素原子に連結する部位を表し、＊＊は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基側の酸素原子に連結する部位を表す。
9. 前記多糖類の重量平均分子量が、２０００～２５０００００である、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の止血材組成物。
10. 前記疎水性溶媒が、植物油、パラフィン系溶媒、オレフィン系溶媒、シリコーンオイル系溶媒、脂肪酸エステル系溶媒、ハロゲン化アルキル系溶媒及びテルペン系溶媒からなる群より選択される１種以上である、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載の止血材組成物。
11. ２５℃の前記疎水性溶媒の動粘度が、１ｍｍ^２／秒～１０００ｍｍ^２／秒である、請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載の止血材組成物。
12. 止血材組成物の総質量に対する前記疎水性溶媒の含有率が、３０質量％～８０質量％である、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載の止血材組成物。
13. 水を含有しない、又は水を含有し、且つ止血材組成物の総質量に対する水の含有率が０．５質量％以下である、請求項１～請求項１２のいずれか一項に記載の止血材組成物。