JP2023089195A - グリピカン3抗体およびそのコンジュゲート - Google Patents
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Abstract
【課題】グリピカン3抗体およびそのコンジュゲートを提供する。【解決手段】抗GPC3抗体およびGPC3に向けられた抗体-薬物コンジュゲートが本明細書において提供される。特に、GPC3に向けられたチュブリシン抗体(tubulysin antibody)-薬物コンジュゲートおよびGPC3を発現する障害を処置するためにかかるコンジュゲートを使用する方法が本明細書において提供される。好ましい抗GPC3抗体は、マウスGPC3-1抗体のキメラ形態またはヒト化形態である。【選択図】図7
Description
関連出願の相互参照
本願は、2018年2月15日に出願された米国出願第62/631,353号の優先権の恩典を主張し、その内容全体が、参照により組み込まれる。
本願は、2018年2月15日に出願された米国出願第62/631,353号の優先権の恩典を主張し、その内容全体が、参照により組み込まれる。
グリピカン3(GPC3)は、肝細胞癌細胞上に発現されることが知られている細胞表面プロテオグリカンであり、多数の悪性細胞上に報告されている。本発明は、GPC3抗体およびそのコンジュゲートを提供する。
抗GPC3抗体およびGPC3に向けられた抗体-薬物コンジュゲートが本明細書において提供される。特に、GPC3に向けられたチュブリシン抗体(tubulysin antibody)-薬物コンジュゲートおよびGPC3を発現する障害を処置するためにかかるコンジュゲートを使用する方法が本明細書において提供される。好ましい抗GPC3抗体は、マウスGPC3-1抗体のキメラ形態またはヒト化形態である。マウスGPC3-1抗体は、配列番号8に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号9に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。
図2Bは、hGPC3-1重鎖バリアントのヒトvHドナー配列、HV1-69-2/HJ4との配列アライメントを示している。
定義
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を表す、すなわち、微量に存在し得る天然に存在する可能性がある変異を除き、集団を構成する各抗体は同一である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られているという抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法によって抗体を産生することを要求するものと解釈すべきではない。例えば、本発明にしたがって使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohlerら(1975)Nature256:495によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得、または組換えDNA法によって作製され得る(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clacksonら(1991)Nature,352:624-628およびMarksら(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーからも単離され得、またはその他の方法によって作製され得る。本明細書に記載されている抗体は、モノクローナル抗体である。
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を表す、すなわち、微量に存在し得る天然に存在する可能性がある変異を除き、集団を構成する各抗体は同一である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られているという抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法によって抗体を産生することを要求するものと解釈すべきではない。例えば、本発明にしたがって使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohlerら(1975)Nature256:495によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得、または組換えDNA法によって作製され得る(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clacksonら(1991)Nature,352:624-628およびMarksら(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーからも単離され得、またはその他の方法によって作製され得る。本明細書に記載されている抗体は、モノクローナル抗体である。
抗体は、典型的には、単離された形態で提供される。これは、抗体が、典型的には、その産生または精製から生じる妨害タンパク質およびその他の夾雑物から少なくとも50%w/w純粋であることを意味するが、抗体が過剰の薬学的に(pharmaceutical)許容され得る担体(複数可)またはその使用を容易にすることを目的とする他のビヒクルと組み合わされる可能性を除外しない。時には、抗体は、妨害タンパク質および作製または精製由来の夾雑物から少なくとも60%、70%、80%、90%、95または99%w/w純粋である。単離された抗体を含む抗体は、細胞傷害剤にコンジュゲートすることができ、抗体薬物コンジュゲートとして提供することができる。
「単離された」ポリヌクレオチドは、その天然の成分から同定され、分離され、および/または回収されたポリヌクレオチドを表す。
モノクローナル抗体のその標的抗原への特異的結合は、少なくとも106、107、108、109または1010M-1の親和性を意味する。特異的結合は、規模が検出可能により高く、少なくとも1つの無関係な標的に対して生じる非特異的結合と識別可能である。特異的結合は、特定の官能基または特定の空間的適合(例えば、ロックおよび鍵タイプ)間での結合の形成の結果であり得るのに対して、非特異的結合は、通常、ファンデルワールス力の結果である。GPC3に向けられた抗体-薬物コンジュゲートおよび抗GPC3抗体は、GPC3に特異的に結合する。
基本的な抗体構造単位は、サブユニットの四量体である。各四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同一の対を含み、各対は1つの「軽」鎖(約25kDa)と1つの「重」鎖(約50~70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主として関与する約100~110またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は、当初、切断可能なシグナルペプチドに連結されて発現される。シグナルペプチドなしの可変領域は、成熟可変領域と称されることがある。したがって、例えば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドなしの軽鎖可変領域を意味する。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類され、それぞれ、抗体のイソタイプをIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEとして規定する。軽鎖および重鎖の中で、下付き文字と定常領域は、約12またはそれを超えるアミノ酸の「J」領域によって連結され、重鎖も、約10またはそれを超えるアミノ酸の「D」領域を含む。(一般に、Fundamental Immunology(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.,1989、Ch.7参照、あらゆる目的のために、その全体が参照により組み込まれる)。各軽/重鎖対の成熟可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、完全な状態の抗体は2つの結合部位を有する。鎖は全て、相補性決定領域またはCDRとも称される3つの超可変領域によって連結された相対的に保存されたフレームワーク領域(FR)という同一の一般的構造を呈する。各対の2つの鎖からのCDRは、フレームワーク領域によって整列させられ、特異的なエピトープへの結合が可能となる。N末端からC末端へ、軽鎖および重鎖はいずれも、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat、Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD、1987 and 1991)またはChothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987);Chothiaら、Nature342:878-883(1989)の定義に従う。Kabatは、異なる重鎖可変領域間または異なる軽鎖可変領域間の対応する残基に同じ番号が割り当てられる、幅広く使用されるナンバリング規約(Kabatナンバリングシステム)も提供する。重鎖定常領域のナンバリングは、Kabatに記載されているようにEUインデックスを通じて為される(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987および1991)。
「抗体」という用語は、完全な状態の抗体およびその抗原結合断片を含む。「完全な状態の抗体」とは、抗体のクラスに対して適切なように、抗原結合可変領域ならびに軽鎖定常ドメイン(CL)および重鎖定常ドメイン、CH1、CH2、CH3およびCH4を含む抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン(例えば、ヒトの天然配列定常ドメイン)またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。抗体断片は、標的への特異的な結合に関して、当該抗体断片が由来した完全な状態の抗体と競合し、それは、分離した重鎖、軽鎖Fab、Fab’、F(ab’)2、F(ab)c、ダイアボディ、Dab、ナノボディおよびFvを含む。断片は、組換えDNA技術によって、または完全な状態のイムノグロブリンの酵素的または化学的分離によって作製することができる。「抗体」という用語は、ダイアボディ(ホモ二量体Fv断片)またはミニボディ(VL-VH-CH3)、二重特異的抗体なども含む。二重特異的または二機能性抗体は、2つの異なる重/軽鎖対と2つの異なる結合部位とを有する人工のハイブリッド抗体である(例えば、Songsivilai and Lachmann,Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990);Kostelnyら、J.Immunol.,148:1547-53(1992)参照)。
「患者」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよびその他の哺乳動物の被験体を含む。
アミノ酸置換を保存的または非保存的として分類する目的のために、アミノ酸は、以下のようにグループ分けされる。グループI(疎水性側鎖):met、ala、val、leu、ile;グループII(中性親水性側鎖):cys、ser、thr;グループIII(酸性側鎖):asp、glu;グループIV(塩基性側鎖):asn、gln、his、lys、arg;グループV(鎖の配向に影響を与える残基):gly、pro;およびグループVI(芳香族側鎖):trp、tyr、phe。保存的置換は、同じクラス中のアミノ酸間での置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスの1つの構成要素を別の構成要素と交換することから構成される。
パーセント配列同一性は、Kabatナンバリング規約によって最大限に合致するように整列させた抗体配列を用いて決定される。アライメント後、対象抗体領域(例えば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体)が参照抗体の同じ領域と比較されている場合、対象抗体領域と参照抗体領域間のパーセント配列同一性は、対象抗体領域と参照抗体領域の両方において同一のアミノ酸によって占められている位置の数を、ギャップは計数せずに、2つの領域の整列させた位置の総数によって除し、100を乗じて百分率に変換したものである。
1またはそれを超える列挙された要素を「含む(comprising)」組成物または方法は、具体的に列挙されていないその他の要素を含み得る。例えば、抗体を含む組成物は、単独でまたは他の成分と組み合わせて該抗体を含有し得る。
「治療的有効量」または「有効量」という用語は、哺乳動物中の疾患または障害を処置するのに有効である抗体-薬物コンジュゲートの量を表す。がんの場合には、治療的有効量のコンジュゲートは、がん細胞の数を低下させ得;腫瘍サイズを縮小させ得;末梢臓器中へのがん細胞の浸潤を阻害し得(すなわち、ある程度遅らせ得る、好ましくは停止させ得る);腫瘍転移を阻害し得(すなわち、ある程度遅らせ得る、好ましくは停止させ得る);腫瘍成長を阻害し得;および/またはがんと関連する症状の1またはそれより多くを緩和し得る。がん治療に関しては、有効性は、例えば、無増悪期間(TTP)を評価し、および/または奏効率(RR)を決定することによって測定することができる。「有効レジメン」という用語は、障害の処置を達成するのに十分な、投与されているコンジュゲートの量および投薬頻度の組み合わせを表す。
「処置する」または「処置」という用語は、文脈によって別段の指示がなければ、その目的ががんの発達または拡散などの望ましくない生理学的変化または障害を阻害しまたは遅らせる(和らげる)ことである治療的処置を表す。有益なまたは所望の臨床的結果としては、検出可能かまたは検出不能かを問わない、症状の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の安定化された(すなわち、悪化しない)状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の軽減または寛解、緩解(部分的であるか、または完全であるかを問わない)が含まれるが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けていない場合に予想される生存期間と比べて、生存期間を延長することも意味し得る。処置を必要とするものには、検出可能な疾患を有するものが含まれる。処置を必要とするものには、検出できない疾患を有するもの、例えば、GPC3を発現する障害に対する処置後に完全な応答を達成したが、再発を予防するために治療を必要としている患者も含まれ得る。
本明細書において使用される「化合物」という用語は、文脈によって別段の指示または示唆がなければ、名称が付されたまたは構造によって表された化学的化合物それ自体を表しおよび包含し、塩形態が除外されるべきことを文脈が明らかにしていなければ、明示されているか否かを問わず、前記化学的化合物の塩形態(複数可)を表しおよび包含する。化合物の塩には、双性イオン塩形態、有機対イオンまたは無機対イオンを有する酸付加および塩基付加塩形態ならびに同一であり得るまたは異なり得る2またはそれを超える対イオンを含む塩形態が含まれる。いくつかの態様において、塩形態は、化合物の薬学的に許容され得る塩形態である。「化合物」という用語は、化合物のカルボニル基が水和されてジェミナルジオールを形成する場合のように、溶媒が化合物と非共有結合で会合しているか、または化合物と共有結合で可逆的に結合している化合物の溶媒和物形態をさらに包含する。溶媒和物形態は、化合物それ自体およびその塩形態(複数可)の溶媒和物を含み、水和物を含む、半溶媒和物、一溶媒和物、二溶媒和物を包含し、化合物が2またはそれを超える溶媒分子と会合することができる場合には、2またはそれを超える溶媒分子は同一であり得、または異なり得る。いくつかの事例では、本発明の化合物は、上記形態の1またはそれより多く、例えば、塩および溶媒和物の明示的な参照を含むが、これは、化合物の何らかの固体状態形態を示唆するものではなく、この参照は単に強調のためであり、上で特定されている形態とは別のものをすべて除外するものと解釈すべきではない。さらに、化合物または抗体薬物コンジュゲート組成物の塩および/または溶媒和物形態への明示的な参照が為されていない場合、その省略は、文脈がこのような塩および/または溶媒和形態を除外すべきことを明らかにしていなければ、化合物またはコンジュゲートの塩および/または溶媒和物形態(複数可)を除外すると解釈すべきではない。
本明細書において使用される「部分」という用語は、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、分子または化合物の指定された区域、断片または官能基を意味する。化学的部分は、分子、化合物または化学式中に埋め込まれたまたは付加された化学的実体(すなわち、置換基または可変基)として時折表記される。
文脈によって別段の表記または示唆がなければ、所定の範囲の炭素原子によって本明細書中に記載されている任意の置換基または部分については、表記された範囲は炭素原子のあらゆる各数字が記載されていることを意味する。したがって、例えば、「必要に応じて置換されたC1-C4アルキル」または「必要に応じて置換されたC2-C6アルケニル」という表記は、それぞれ、本明細書に定義されているとおりの、必要に応じて置換された1、2、3もしくは4つの炭素のアルキル部分が存在すること、または本明細書に定義されているとおりの、必要に応じて置換された2、3、4、5もしくは6つの炭素のアルケニル部分が存在することを具体的に意味する。このような数的表記は全て、各炭素原子基の全てを開示することが明示的に意図されており、したがって、「必要に応じて置換されたC1-C4アルキル」は、置換されているかまたは置換されていないかを問わず、メチル、エチル、3炭素アルキルおよび4炭素アルキルを含み、これらの位置異性体の全てを含む。したがって、アルキル部分が置換されている場合、数的表記は置換されていない基本部分を表し、その基本部分の置換基中に存在し得る当該基本部分に直接結合していない炭素原子を含むことは意図されない。炭素原子の与えられた範囲によって特定されている本明細書に定義されているとおりのエステル、カルボネート、カルバメートおよび尿素に関しては、表記された範囲は、それぞれの官能基のカルボニル炭素を含む。したがって、C1エステルはギ酸エステルを表し、C2エステルは酢酸エステルを表す。
本明細書に記載されている有機置換基、有機部分および有機基は、ならびに本明細書に記載されているその他の任意の他の部分に関しては、不安定な部分が、本明細書に記載されている使用の1またはそれより多くに対して十分な化学的安定性を有する化合物を作るために使用することができる一過性の種である場合を除き、通常、不安定な部分を除外する。5価の炭素を有する置換基、部分または基をもたらす本明細書に与えられた定義の運用による置換基、部分または基は、明確に除外される。
本明細書において使用される「アルキル」という用語は、単独でまたは別の用語の一部として、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、メチルを表すか、またはそのうちの1つが一価である連続する炭素原子の集合体であって、炭素原子の1またはそれより多くが飽和しており(すなわち、1またはそれを超えるsp3炭素から構成される)、直鎖状、第二級、第三級または環状配置で、すなわち、直鎖、分岐、環状配置またはこれらのある組み合わせで、共に共有結合で連結している炭素原子の集合体を表す。連続する飽和炭素原子が環状配置である場合には、かかるアルキル部分は、いくつかの態様において、カルボシクリルと称される。
アルキル置換基としてアルキル部分を参照する場合、当該アルキル置換基が結合しているマーカッシュ構造または別の有機部分に対するそのアルキル置換基は、該アルキル置換基のsp3炭素を通じて該構造または該部分に共有結合で付着されているメチルまたは連続する炭素原子の鎖である。したがって、本明細書において使用されているアルキル置換基は、少なくとも1つの飽和した部分を含有し、不飽和アルキル部分を規定するために1またはそれを超える独立に選択された二重結合および/または三重結合をさらに含有し得、本明細書に記載されているとおりの適切な必要に応じて存在する(optional)置換基(複数可)を含む1~4、典型的には1~3または1もしくは2の他の部分によって置換されてもよい。飽和アルキル部分中の炭素原子の数は様々であって良く、典型的には、1~8、1~6または1~4であり、不飽和アルキル部分においては、典型的には、3~8、3~6または3~4の間で様々である。
文脈によって別段の表記または示唆がなければ、「アルキル」という用語は、表記されている数の共有結合で連結された飽和炭素原子を有する飽和非環式炭化水素ラジカルを示し、「C1-C6アルキル」または「C1-C6アルキル」などの用語は、1つの飽和炭素原子(すなわち、メチル)または2、3、4、5もしくは6つの連続する非環式飽和炭素原子を含有するアルキル部分または基を意味し、「C1-C8アルキル」は、1つの飽和炭素原子または2、3、4、5、6、7もしくは8つの連続する飽和非環式炭素原子を有するアルキル部分または基を表す。
飽和アルキル置換基、飽和アルキル部分または飽和アルキル基が明記されている場合、種には、親アルカンから水素原子を除去することによって得られた種(すなわち、アルキル部分は一価である)が含まれ、メチル、エチル、1-プロピル(n-プロピル)、2-プロピル(イソプロピル、-CH(CH3)2)、1-ブチル(n-ブチル)、2-メチル-1-プロピル(イソブチル、-CH2CH(CH3)2)、2-ブチル(sec-ブチル、-CH(CH3)CH2CH3)、2-メチル-2-プロピル(t-ブチル、-C(CH3)3)、アミル、イソアミル、sec-アミルならびにその他の直鎖および分岐鎖アルキル部分が含まれ得る。
本明細書に使用される「アルキレン」という用語は、単独でまたは別の用語の一部として、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、表記された数の炭素原子、通例1~8、1もしくは6または1~4の範囲の炭素原子の、2つのラジカル中心を有する(すなわち、二価である)飽和、分岐鎖または直鎖炭化水素ジラジカルであって、置換されておりまたは置換されておらず、炭素原子の1またはそれより多くが飽和している(すなわち、1またはそれを超えるsp3炭素から構成される)飽和、分岐鎖または直鎖炭化水素ジラジカルを表す。これらのラジカル中心は、ジラジカルを形成するために、親アルカンの同じもしくは2つの異なる飽和(すなわち、sp3)炭素原子から、または別のその飽和炭素から1つの水素原子が除去されている本明細書に記載のアルキルラジカルから、またはアルキルラジカルのラジカル炭素から2つの水素原子を除去することによって誘導可能である。
アルキレン部分の例は、メチレン(-CH2-)、1,2-エチレン(-CH2CH2-)、1,3-プロピレン(-CH2CH2CH2-)、1,4-ブチレン(-CH2CH2CH2CH2-)および同様のジラジカルであるが、これらに限定されない。典型的には、アルキレンは、sp3炭素のみを含有する(すなわち、ラジカル炭素原子にかかわらず完全に飽和されている)分岐鎖または直鎖炭化水素であり、いくつかの態様では、置換されていない。他の態様において、アルキレンは、不飽和アルキレン部分の末端炭素が一価のsp3炭素原子であるように、1またはそれを超える二重結合および/または三重結合官能基、典型的には1または2の、より典型的には1のこのような官能基の形態で不飽和の内部部位を含有する。さらに別の態様において、アルキレンは置換されておらず、または必要に応じて存在する置換基に対して本明細書で定義されているように、1~4、典型的には1~3、または1もしくは2の置換基で置換されている。
本明細書において使用される「必要に応じて置換されたアルキル」または「必要に応じて置換されたフェニル」は、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、本明細書に定義されているとおりのアルキルまたはフェニル置換基、部分または基であって、その置換基、部分または基の1または複数の水素原子が、1または複数の異なる部分または基で必要に応じて置換されているアルキルまたはフェニル置換基、部分または基を表し、本明細書に定義されているとおりのシアノ、ハロゲン、-CX3(Xは、独立に、ハロゲンである)、N結合部分およびO結合部分からなる群より選択されるものを含む。
典型的には、必要に応じて存在する置換基は、-X、-Cl、-OH、-OR’、-OC(=O)R’、-NH2、-NH(R’)、-NR’(R’)2、-N(R’)3、-CF3、-CNおよび-NO2からなる群より選択され、各Xは独立にハロゲンであり、各R’は独立にC1-C6アルキルである。
本明細書において使用される「O結合部分」は、その酸素原子を通じてO結合部分が会合しているマーカッシュ構造または別の部分に直接結合している酸素含有有機部分を表す。O結合部分には、-OH、アシルオキシ(すなわち、-OC(=O)Ra、ここで、Raは、典型的には、-H、必要に応じて置換されたアルキルまたは必要に応じて置換されたフェニルであり、アルキル部分が飽和または不飽和であるC1-C6アルキルオキシなどのエーテル基が含まれる。他の例示的なO結合置換基は、カルバメートに対する定義によって与えられる。
本明細書において使用される「N結合部分」は、その窒素原子を通じてN結合部分が会合しているマーカッシュ構造または別の部分に直接結合している含窒素有機部分を表す。N結合部分には、-NH2、-NHRa、-N(Ra)2およびアミド(すなわち、-NRaC(=O)Ra)が含まれ、ここで、Raは、-H、必要に応じて置換されたC1-C6アルキルおよび必要に応じて置換されたフェニルからなる群より典型的に選択される。他の例示的なN結合置換基は、カルバメートに対する定義によって与えられる。
本明細書において使用される「カルバメート」は、-O-C(=O)N(Ra)-または-O-C(=O)N(Ra)2によって表されるカルバメート官能基を含有する置換基、部分または基を意味し(ここで、式中、Raは、独立に選択され、水素または必要に応じて置換されたC1-C6アルキルである)、-O-C(=O)NH(必要に応じて置換されたアルキル)または-O-C(=O)N(必要に応じて置換されたアルキル)2が含まれ、これらは、例示的なカルバメート置換基であり、必要に応じて置換されたアルキルは、独立に選択される必要に応じて置換されたC1-C6アルキルである。カルバメートがマーカッシュ群(すなわち、置換基)として使用される場合、カルバメート官能基の単結合した酸素(O結合)または窒素(N結合)はそれが会合しているマーカッシュ式に結合している。カルバメート置換基の結合は、明示的に示されているか(N結合またはO結合)、またはこの置換基が言及されている文脈において暗に示されている。本明細書に記載されているO結合カルバメートが例示的な一価のO結合部分であり、N結合カルバメートが例示的なN結合部分である。
本明細書において使用される「ハロゲン」または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味し、典型的には-Fまたは-Clである。
本明細書において使用される「その塩」という句は、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、化合物(例えば、薬物、薬物リンカー化合物または抗体薬物コンジュゲート化合物)の塩形態を表す。化合物の塩形態は、1またはそれを超える分子内塩形態であり、および/または酢酸イオン、コハク酸イオンまたはその他の対イオンなどの別の分子の包含を伴う。化合物の塩形態中の対イオンは、典型的には、親化合物上の電荷を安定化させる有機部分または無機部分である。化合物の塩形態は、その構造中に、1または1を超える帯電した原子を有する。複数の帯電した原子が塩形態の一部である場合には、複数の対イオンおよび/または複数の帯電した対イオンが存在する。このため、化合物の塩形態は、典型的には、該化合物の非塩形態の原子に対応する1またはそれを超える帯電した原子と1またはそれを超える対イオンとを有する。いくつかの態様において、化合物の非塩形態は、少なくとも1つのアミノ基またはその他の塩基性部分を含有し、したがって酸の存在下において、塩基性部分の酸付加塩が得られる。他の態様において、化合物の非塩形態は、少なくとも1つのカルボン酸基またはその他の酸性部分を含有し、したがって塩基の存在下において、カルボキシレートまたはその他の陰イオン性部分が得られる。
化合物の塩形態中の例示的な対陰イオンおよび対陽イオンには、硫酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩(gentisinate)、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩(すなわち、1,1’メチレンビス-(2-ヒドロキシ-3-ナフトエート))塩が含まれるが、これらに限定されない。
化合物の塩形態の選択は、投与の予定される経路(複数可)に応じた様々なpH値での十分な水溶解度、流動特性を有する結晶化度および加速された(すなわち、40℃および75%相対湿度で保存されたときの分解または固体状態変化を決定するための)条件下での化学的安定性および固体状態安定性を決定することによる取り扱いおよび要求される貯蔵寿命に適した低い吸湿性(すなわち、相対湿度に対する水吸収)など、医薬品が示さなければならない特性に依存する。
「薬学的に許容され得る」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されたこともしくは承認可能であること、または動物における、より具体的にはヒトにおける使用に関して米国薬局方もしくはその他の一般的に認められた薬局方に列記されていることを意味する。「薬学的に適合し得る成分」という用語は、抗体または抗体-薬物コンジュゲートがともに被験体に投与される薬学的に許容され得る希釈剤、佐剤、賦形剤またはビヒクルを表す。
「薬学的に許容され得る塩」は、本明細書に記載されているとおりの被験体に投与するのに適した化合物の塩形態であり、いくつかの態様において、P.H.StahlおよびC.G.Wermuth、編集、Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection and Use,Weinheim/Zuerich:Wiley-VCH/VHCA,2002によって記載されている対陽イオンまたは対陰イオンを含む。
本発明の文脈における溶媒和物は、溶媒分子との配位を通じて錯体を形成する本発明の化合物の溶媒和物形態である。水和物は、配位が水とともに起こる溶媒和物の1つの特定の形態である。本発明の文脈における好ましい溶媒和物は水和物である。
本明細書において使用される「チュブリシン化合物」は(文脈によって別段の表記または示唆がなければ)、細胞傷害活性または細胞増殖抑制活性を有する、テトラペプチドをベースとするチューブリン破壊剤であり、中央の5員環含窒素ヘテロアリーレン部分およびN末端のピペコリン酸残基を有する非天然アミノ酸残基によって特徴付けられ、いくつかの態様では、四級化された薬物単位として抗体薬物コンジュゲート中に取り込ませるために使用され得る第三級アミンを含有する。四級化に適した非限定的な例示的チュブリシンは、以下の構造:
またはその塩、特に、薬学的に許容され得る塩を有し、式中、表記された窒素原子は、チュブリシン化合物が四級化された薬物単位中に取り込まれるときの四級化の部位であり;円は、5員環含窒素ヘテロアリーレン部分を表し、そのヘテロアリールに対する示された置換基は、残りの位置における必要に応じて存在する置換と互いに1,3の関係性にあり;Xは、O、SまたはNR2Bであり;R3、R4、R5およびR6は、独立に、必要に応じて置換されたC1-C6アルキルであり、R7Aは、必要に応じて置換されたフェニルであり;R2BおよびR8Aは、独立に、水素または必要に応じて置換されたC1-C6アルキルであり;Zは、-CH2-、-CH2CH2-もしくは-CH=CH-であり、R2Aは、水素もしくは必要に応じて置換されたC1-C6アルキルであり、または-XR2Aは、一価のO結合置換基もしくは一価のN結合置換基を表す。
Shankarら、“Synthesis and structure-activity relationship studies of novel tubulysin U analogs-effect on cytotoxicity of structural variations in the tubuvaline fragment” Org.Biomol.Chem.(2013)11:2273-2287;Xiangmingら、“Recent advances in the synthesis of tubulysins”Mini-Rev.Med.Chem.(2013)13:1572-8;Shankarら、“Synthesis and cytotoxic evaluation of diastereomers and N-terminal analogs of Tubulysin-U” Tet.Lett.(2013)54:6137-6141;Shankarら、“Total synthesis and cytotoxicity evaluation of an oxazole analogue of Tubulysin U” Synlett(2011)2011(12):1673-6;Raghavanら、J.Med.Chem.(2008)51:1530-3;Balasubramanian,R.ら、“Tubulysin analogs incorporating desmethyl and dimethyl tubuphenylalanine derivatives” Bioorg.Med.Chem.Lett.(2008)18:2996-9;およびRaghavanら、“Cytotoxic simplified tubulysin analogues” J.Med.Chem.(2008)51:1530-3によって、チュブリシン薬物を調製する例示的な方法および構造活性相関が提供される。
またはその塩、特に、薬学的に許容され得る塩が含まれ、式中、R2Aはメチル、エチルまたはプロピルまたは-C(=O)R2Bであり、R2Bは前に定義されており;およびR7Bは、水素または-OHである。他の態様において、四級化に適したチュブリシンは、R2Aが-C(=O)CH3であり、およびR7Bが水素である上記構造を有するチュブリシンMであり、またはR2Aがエチルであり、およびR7Bが水素である上記構造を有するチュブリシン化合物である。
本明細書において使用される「四級化されたチュブリシン薬物単位」は(文脈によって別段の表記または示唆がなければ)、その三級アミン窒素が四級アミン塩として四級化された薬物単位構造中に存在し、抗体薬物コンジュゲートの薬物リンカー部分からのその放出に際して、四級化された薬物単位が遊離の三級アミン含有チュブリシン化合物を与える三級アミン含有チュブリシン化合物に関する。いくつかの態様において、四級化されたチュブリシン薬物単位(D+)は、チュブリシン化合物のC末端成分の三級アミン窒素を、適切な脱離基を有するリンカー単位前駆体と縮合させることによって得られる。他の態様において、C末端成分が、まず、チュブリシン化合物の残部と四級化され、次いで、付加されて、D+単位を完成する。したがって、四級化されたチュブリシン薬物単位を含有する構造は、D+が形成された特定の方法を暗に意味せず、その形成において使用される反応物が三級アミン含有薬物であることを必要とせず、D+が抗体薬物コンジュゲート化合物から放出されることが予定される三級アミン含有の構造を取り込みまたはかかる構造に対応することのみを必要とする。
本明細書において使用される「ストレッチャー単位」は、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、抗体に結合しているリンカー単位のコハク酸部分またはその加水分解された形態とグルクロニド単位との間に介在する、抗体薬物コンジュゲートのグルクロニドをベースとする薬物リンカー部分中のリンカー単位の成分を表す。または、ストレッチャー単位は、抗体薬物コンジュゲートの調製において使用することができる、リンカー単位のマレイミド部分とグルクロニド単位の間に介在するグルクロニドをベースとする薬物リンカー化合物中のリンカー単位の成分を表す。ストレッチャー単位(A)は、単一の単位であり得、または複数のサブユニットを含有し得る。典型的には、Aは1つの特有の単位を有し、または2~4個の特有のサブユニットを有する。
いくつかの態様において、ストレッチャー単位またはその第一のサブユニットは、その二価の中心の1つがマレイミドもしくはスクシンイミド部分またはこれらの加水分解された形態の窒素原子に結合しており、他方がカルボニル残基に結合している必要に応じて置換されたC1-C6アルキレンから構成され、国際公開第2013/173337号に記載されているように自己安定化リンカーを与えるために、C1-C6アルキレンの必要に応じて存在する置換基が時に塩基性単位として存在する。Aが2またはそれを超える特有のサブユニットを有する場合、第二のサブユニットは、典型的には、-Lp(PEG)部分であり、式中、Lpは、三官能性アミン含有アミノ酸残基から構成される平行コネクタ単位であり、PEGは本明細書に定義されているとおりのPEG単位であり、またはαアミノ酸、βアミノ酸もしくはその他のアミン含有酸残基である。いずれの事例でも、第二のサブユニットのアミン含有酸残基のアミン窒素原子は、第一のサブユニットのカルボニル残基に結合しており、第二のサブユニットのカルボニル残基の炭素原子は、グルクロニドをベースとするリンカー単位のグルクロニド単位にまたは通例、そのカルボニル残基がグルクロニドをベースとするリンカー単位のグルクロニド単位に結合している別のアミン含有酸残基であるAの第三のサブユニットのアミン窒素原子に結合している。
本明細書において使用される「平行コネクタ単位」という用語は、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、抗体薬物コンジュゲートの薬物リンカー部分のリンカー単位中の三官能性有機部分であり、またはPEG単位が疎水性薬物単位に「平行」配位して、その疎水性を少なくとも部分的に遮蔽することができるように、三官能性基の1つがPEG単位に結合しており、他の2つがリンカー単位内の平行コネクタ(LP)単位に結合している疎水性薬物単位を有する薬物リンカー化合物のリンカー単位中の三官能性有機部分である。LPに結合したPEG単位は、その遮蔽を与えるために、典型的には8から24の範囲の、エチレングリコールサブユニットの反復数を含有する。LP、PEGおよび疎水性薬物単位は、国際公開第2015/057699号によってさらに記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
文脈によって別段の表記または示唆がなければ、本明細書において使用される「グルクロニド単位」という用語は、抗体薬物コンジュゲートまたは薬物リンカー化合物のグルクロニドをベースとする薬物リンカー部分の薬物単位に結合したリンカー単位の切断可能な成分であり、アミノベンジル残基とグリコシド結合を通じてアミノベンジル残基にコンジュゲートした炭水化物残基とから構成され、ベンジル残基は、遊離の薬物として薬物単位を放出するために、そのグリコシド結合におけるグリコシダーゼによる酵素作用に際して、自壊することができる。いくつかの態様において、本明細書に定義されているとおりの四級化されたチュブリシン薬物単位などの四級化された薬物単位は、そのアミノ残基の窒素原子がリンカー単位の残部に共有結合で付着しているおよびそのアリーレン残基がグルクロン酸残基などのグリコシドコンジュゲートした炭水化物残基で置換されているアミノベンジル部分のベンジル炭素原子に共有結合で付着されており、前記炭素原子残基は、グリコシダーゼによるグリコシド結合の切断に際して、ベンジル部分が自発的な断片化を経て、遊離の三級含有薬物として四級化された薬物単位を放出するように、ベンジル炭素原子とオルトまたはパラの関係にある。他の態様において、カルバメート官能基が、ベンジル炭素原子と四級化されていないアミン含有薬物単位のアミン窒素原子との間に介在し、カルバメート官能基の一価の酸素原子はベンジル炭素原子に共有結合で付着されている。これらの態様において、自発的なCO2の喪失を経て、遊離のアミン含有薬物を与えるカルバミン酸官能基含有薬物単位が放出される。四級化されていない薬物単位に結合したグルクロニド単位は国際公開第2007/011968号によってさらに記載されており、四級化された薬物単位に結合したグルクロニド単位は、国際公開第2016/040684号によってさらに記載されている。
文脈から自明でなければ、「約」という用語は、表記された値の標準偏差内の値を包含する。
詳細な説明
I.総論
本発明は、一つには、ヒトGPC3へ標的化された抗体-薬物コンジュゲートなどの抗体-薬物コンジュゲートが、GPC3+発現細胞を死滅させるのに特に効果的であるという発見に基づいている。特に、重鎖可変領域アクセプター配列として、生殖系列hIGHv1-18またはhIGHV1-26-2およびJエキソンJH-4を、軽鎖可変領域アクセプター配列に対しては、生殖系列hIGKv2-30およびJエキソンJK-2をとして使用し、1またはそれを超える鍵となる部位の残基をマウス抗体またはマウス生殖系列配列へ戻すように変異することによって、高親和性GPC3-1ヒト化抗体を構築できることが見出された。重鎖については、これらの鍵となる部位には、位置H24、H38、H48、H66、H67、H69、H71、H73、H93およびH94の1またはそれより多くが含まれた。軽鎖については、これらの鍵となる部位には、位置L45、L46、L105およびL106の1またはそれより多くが含まれた。GPC3-1ヒト化抗体は、抗体薬物コンジュゲート(ADC)の一部として、薬物送達において効果的であった。SGD-6859チュブリシンM薬物-リンカーにコンジュゲートすると、得られるhGPC3-1ecチュブリシンMコンジュゲート(hGPC3-1ecSGD-6859)は、HCC細胞株のパネルに対して極めて活性があった。hGPC3-1の後の「ec」という表記は、抗体が重鎖の位置239にシステイン置換を有することを示す(付番は、Kabatで表記されたEUインデックスによる)。
I.総論
本発明は、一つには、ヒトGPC3へ標的化された抗体-薬物コンジュゲートなどの抗体-薬物コンジュゲートが、GPC3+発現細胞を死滅させるのに特に効果的であるという発見に基づいている。特に、重鎖可変領域アクセプター配列として、生殖系列hIGHv1-18またはhIGHV1-26-2およびJエキソンJH-4を、軽鎖可変領域アクセプター配列に対しては、生殖系列hIGKv2-30およびJエキソンJK-2をとして使用し、1またはそれを超える鍵となる部位の残基をマウス抗体またはマウス生殖系列配列へ戻すように変異することによって、高親和性GPC3-1ヒト化抗体を構築できることが見出された。重鎖については、これらの鍵となる部位には、位置H24、H38、H48、H66、H67、H69、H71、H73、H93およびH94の1またはそれより多くが含まれた。軽鎖については、これらの鍵となる部位には、位置L45、L46、L105およびL106の1またはそれより多くが含まれた。GPC3-1ヒト化抗体は、抗体薬物コンジュゲート(ADC)の一部として、薬物送達において効果的であった。SGD-6859チュブリシンM薬物-リンカーにコンジュゲートすると、得られるhGPC3-1ecチュブリシンMコンジュゲート(hGPC3-1ecSGD-6859)は、HCC細胞株のパネルに対して極めて活性があった。hGPC3-1の後の「ec」という表記は、抗体が重鎖の位置239にシステイン置換を有することを示す(付番は、Kabatで表記されたEUインデックスによる)。
hGPC3-1ecSGD-6859ADCは、肝細胞癌(HCC)などのGPC3を発現する腫瘍を標的とすることができる。HCCは、一般に、化学療法抵抗性として分類されてきた。これは、HCC細胞中での薬物排出輸送体の高い発現によるものである。これらのトランスフォーマは、全身の化学療法薬を効率的に排除する。チュブリシンMは、薬物排出輸送体に対する不良な基質であり、このため、HCCを標的とするADCのための効果的な薬物-リンカーである。さらに、チュブリシンMは、十分なバイスタンダー活性を有するのに十分に細胞透過性である。
II.本発明の抗体
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体由来のCDRが、ヒト「アクセプター」抗体配列中に移植されている遺伝子操作された抗体である(例えば、Queen、米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号;Winter、米国特許第5,225,539号;Carter、米国特許第6,407,213号;Adair、米国特許第5,859,205号;およびFoote、米国特許第6,881,557号参照)。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、このような配列の複合物、ヒト抗体配列のコンセンサス配列または生殖系列領域配列であり得る。
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体由来のCDRが、ヒト「アクセプター」抗体配列中に移植されている遺伝子操作された抗体である(例えば、Queen、米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号;Winter、米国特許第5,225,539号;Carter、米国特許第6,407,213号;Adair、米国特許第5,859,205号;およびFoote、米国特許第6,881,557号参照)。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、このような配列の複合物、ヒト抗体配列のコンセンサス配列または生殖系列領域配列であり得る。
したがって、ヒト化抗体は、完全にまたは実質的に非ヒトドナー抗体に由来する一部または全部のCDRと、存在する場合、ヒト抗体配列に完全にまたは実質的に由来する可変領域フレームワーク配列および定常領域とを有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体重鎖に由来する少なくとも1つ、2つ、通常は全ての3つのCDRと、存在する場合、ヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に実質的に由来する重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域とを有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖に由来する少なくとも1つ、2つ、通常は全ての3つのCDRと、存在する場合、ヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に実質的に由来する軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域とを有する。ナノボディおよびダイアボディ以外、ヒト化抗体は、通例、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。(Kabatによって定義されるところにより)対応する残基の少なくとも60%、85%、90%、95%または100%が各CDR間で同一である場合に、ヒト化抗体またはヒト抗体中のCDRは、非ヒト抗体中の対応するCDRに実質的に由来する、または対応するCDRと実質的に同一である。いくつかの実施形態において、各CDR中に3つ以下の保存的アミノ酸置換が存在する場合に、ヒト化抗体またはヒト抗体中のCDRは、非ヒト抗体中の対応するCDRに実質的に由来する、または対応するCDRと実質的に同一である。Kabatによって定義される対応する残基の少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または100%が同一である場合に、抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、それぞれ、ヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に実質的に由来する。本発明のいくつかのヒト化抗体では、抗体の重鎖可変フレームワーク領域中に少なくとも3つおよび最大9つのマウスGPC3-1復帰突然変異が存在し、抗体の軽鎖可変領域中に最大4つのマウスGPC3-1復帰突然変異が存在する。
ヒト化抗体は、多くの場合、マウス抗体に由来する全ての6つのCDR(好ましくは、Kabatの定義による)を組み入れるが、全てのCDRより少ない(例えば、少なくとも3、4または5の)マウス抗体由来のCDRを用いて、ヒト化抗体を作製することもできる(例えば、Pascalisら、J.Immunol.169:3076,2002;Vajdosら、Journal of Molecular Biology,320:415-428,2002;Iwahashiら、Mol.Immunol.36:1079-1091,1999;Tamura et al.,Journal of Immunology,164:1432-1441,2000)。
CDR立体構造および/または抗原への結合に対する影響の可能性に基づいて、ヒト可変領域フレームワーク残基のある種のアミノ酸を、置換のために選択することができる。このような影響の可能性の調査は、モデリング、特定の位置のアミノ酸の特徴の調査または特定のアミノ酸の置換または変異誘発の効果の経験的観察による。
本発明は、ヒトGPC3抗原に対して向けられた抗体を提供する。好ましい抗体は、マウスGPC3-1抗体に由来するキメラ抗体またはヒト化抗体である。重鎖可変領域に対する好ましいアクセプター配列は、生殖系列hIGHV1-18またはhIGHV1-69-2およびJエキソンJH4である。軽鎖可変領域については、好ましいアクセプター配列は、生殖系列hIGKV2-30およびJエキソンJK2である。
例示的な抗GPC3抗体は、配列番号1に記載されている重鎖CDRおよび配列番号2に記載されている軽鎖CDRを含み、配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%または95%の同一性を有する成熟重鎖可変領域および配列番号2と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%または95%の同一性を有する成熟軽鎖可変領域をさらに有するヒト化抗体である。CDRは、Kabatによって定義されるところによる。好ましくは、重鎖可変ドメインフレームワークの以下のアミノ酸残基が維持されている:H24がVによって占められ、H38がQによって占められ、H48がMによって占められ、H66がRによって占められ、H67がVによって占められ、H69がLによって占められ、H71がAによって占められ、H73がKによって占められ、H93がGによって占められ、H94がRによって占められ、軽鎖の以下のアミノ酸残基が維持されている:L45がRによって占められ、L46がLによって占められ、L105がEによって占められ、L106がIによって占められている。
したがって、配列番号1に記載されている重鎖可変領域および配列番号2に記載されている軽鎖可変領域を含むが、H24がVまたはAによって占められ、H38がQ、RまたはKによって占められ、H48がMまたはIによって占められ、H66がRまたはKによって占められ、H67がVまたはAによって占められ、H69がLによって占められ、H71がAによって占められ、H73がKまたはTによって占められ、H93がGまたはAによって占められ、H94がRによって占められ、および軽鎖の以下のアミノ酸残基が存在する:L45がRまたはKによって占められ、L46がLまたはRによって占められ、L105がEまたはVによって占められ、L106がIまたはMによって占められる、ヒト化抗体が本明細書において提供される。
マウスGPC3-1抗体のヒト化形態は、4つの例示されたヒト化重鎖成熟可変領域(HA-HD)および7つの例示されたヒト化軽鎖成熟可変領域(LA-LE、LB-Q、LB-V)を含む。これらの鎖の順列には、HALA、HALB、HALC、HBLA、HBLB、HBLC、HBLD、HBLE、HBLB-Q、HBLB-V、HCLA、HCLB、HCLC、HDLA、HDLBおよびHDLCが含まれる。これらの順列のうち、HBLEが好ましい。HBLEは、配列番号1に記載されている重鎖および配列番号2に記載されている軽鎖を含む。しかしながら、HBLEに代えて、HALA、HALB、HALC、HBLA、HBLB、HBLC、HBLD、HBLE、HBLB-Q、HBLB-V、HCLA、HCLB、HCLC、HDLA、HDLBおよびHDLCの任意の1つを使用することができる。
いくつかの態様において、ヒトGPC3に対するヒト化GPC3-1抗体の見かけの解離定数(kd)は、好ましくは、0.1nM~10nMの範囲内、より好ましくは、0.1nM~5nMの範囲内、さらに好ましくは、1nM~3nMまたは2nM~約3nMの範囲内にある。いくつかの態様において、本発明の抗体は、ヒトGPC3に対するマウスGPC3-1抗体の見かけの解離定数の0.1~1.5倍、または0.5~2倍の範囲内の見かけの解離定数を有する。いくつかの態様において、ヒト化GPC3-1に対する抗体の見かけの解離定数(kd)は約2.7である。
A.定常領域の選択
ヒト化GPC3-1抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結することができる。定常領域の選択は、1つには、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、抗体依存性細胞食作用および/または補体依存性細胞傷害が望まれるかどうかに依存し得る。例えば、ヒトイソタイプIgG1およびIgG3は、強力な補体依存性細胞傷害を有し、ヒトイソタイプIgG2は、弱い補体依存性細胞傷害を有し、ヒトIgG4は、補体依存性細胞傷害を欠如する。ヒトIgG1およびIgG3は、ヒトIgG2およびIgG4より強力な細胞媒介性エフェクター機能も誘導する。軽鎖定常領域は、λまたはκであり得る。抗体は、2つの軽鎖および2つの重鎖を含有する四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFvとして、または重鎖および軽鎖サブスクリプトドメインがスペーサーを通じて連結されている一本鎖抗体として、発現され得る。
ヒト化GPC3-1抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結することができる。定常領域の選択は、1つには、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、抗体依存性細胞食作用および/または補体依存性細胞傷害が望まれるかどうかに依存し得る。例えば、ヒトイソタイプIgG1およびIgG3は、強力な補体依存性細胞傷害を有し、ヒトイソタイプIgG2は、弱い補体依存性細胞傷害を有し、ヒトIgG4は、補体依存性細胞傷害を欠如する。ヒトIgG1およびIgG3は、ヒトIgG2およびIgG4より強力な細胞媒介性エフェクター機能も誘導する。軽鎖定常領域は、λまたはκであり得る。抗体は、2つの軽鎖および2つの重鎖を含有する四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFvとして、または重鎖および軽鎖サブスクリプトドメインがスペーサーを通じて連結されている一本鎖抗体として、発現され得る。
ヒト定常領域は、異なる個体間でのアロタイプの多様性およびイソアロタイプの多様性を示す、すなわち、定常領域は、1またはそれを超える多型位置において、異なる個体で異なり得る。イソアロタイプは、イソアロタイプを認識する血清が1またはそれを超える他のイソタイプの非多型領域に結合する点でアロタイプとは異なる。
重鎖のC末端リジンなど、軽鎖および/または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端の1つまたはいくつかのアミノ酸は、分子の一部または全部において、欠損してもよく、または誘導体化されてもよい。補体媒介性細胞傷害もしくはADCCなどのエフェクター機能を低下もしくは増加させるために、(例えば、Winterら、米国特許第5,624,821号;Tsoら、米国特許第5,834,597号;およびLazarら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:4005,2006参照)、またはヒトでの半減期を延長するために(例えば、Hintonら、J.Biol.Chem.279:6213,2004参照)、定常領域中に置換を施すことができる。
薬物-リンカーの部位特異的コンジュゲーションを可能とするために、定常領域は修飾され得る。このような技術には、天然に存在するまたは操作されたシステイン残基、ジスルフィド架橋、ポリヒスチジン配列、糖鎖工学タグおよびトランスグルタミナーゼ認識配列の使用が含まれる。細菌のトランスグルタミナーゼを用いた部位特異コンジュゲーションのための例示的な置換は、N297SまたはN297Qである。操作されたシステインを用いる部位特異的コンジュゲーションのための例示的な置換は、S239Cである(米国特許出願公開第20100158909号;Fc領域の付番は、EUインデックスにしたがう)。いくつかの態様において、追加のシステイン残基の存在は、鎖間ジスルフィド結合の形成を可能とする。このような鎖間ジスルフィド結合の形成は、立体障害を引き起こすことができ、それにより、Fc領域-FcγR結合相互作用の親和性を低下させる。IgG定常領域のFc領域中またはその近傍に導入されたシステイン残基(複数可)は、治療剤へのコンジュゲーションのための部位としての役割も果たすことができる(すなわち、薬物のマレイミド誘導体などのチオール特異的試薬を用いて細胞傷害薬物をカップリングする。治療剤の存在は立体障害を引き起こし、それにより、Fc領域-FcγR結合相互作用の親和性をさらに低下させる。抗体断片も、薬物-リンカーの部位特異的コンジュゲーションのために修飾することができる、例えば、Kimら、Mol Cancer Ther 2008;7(8)を参照。
B.組換え抗体の発現
ヒト化またはキメラGPC3-1抗体は、組換え発現によって作製することができる。組換えポリヌクレオチド構築物は、典型的には、天然に付随するまたは異種のプロモーター領域などの、抗体鎖のコード配列に機能的に連結された発現調節配列を含む。好ましくは、発現調節配列は、真核宿主細胞を形質転換または形質移入することができるベクター中の真核プロモーター系である。ベクターが適切な宿主中に取り込まれたら、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに交さ反応する抗体の収集および精製に適した条件下に維持される。
ヒト化またはキメラGPC3-1抗体は、組換え発現によって作製することができる。組換えポリヌクレオチド構築物は、典型的には、天然に付随するまたは異種のプロモーター領域などの、抗体鎖のコード配列に機能的に連結された発現調節配列を含む。好ましくは、発現調節配列は、真核宿主細胞を形質転換または形質移入することができるベクター中の真核プロモーター系である。ベクターが適切な宿主中に取り込まれたら、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに交さ反応する抗体の収集および精製に適した条件下に維持される。
哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチドセグメントを発現するための好ましい宿主である。Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)参照。完全な状態の異種タンパク質を分泌することができる多数の適切な宿主細胞株が本分野において開発されており、CHO細胞株(例えば、DG44)、様々なCOS細胞株、HeLa細胞、HEK293細胞、L細胞ならびにSp2/0およびNS0を含む非抗体産生骨髄腫が含まれる。好ましくは、細胞は、非ヒトである。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサー(Queenら、Immunol.Rev.89:49(1986))などの発現調節配列ならびにリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。好ましい発現調節配列は、内在性遺伝子、サイトメガロウイルス、SV40、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスなどに由来するプロモーターである。Coら、J.Immunol.148:1149(1992)を参照。
発現されたら、HPLC精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの本分野の標準的な手技にしたがって抗体を精製することができる(一般的に、Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,NY,1982)参照)。
III.核酸
本発明は、さらに、本明細書に記載されているヒト化重鎖および軽鎖のいずれかをコードする核酸を提供する。典型的には、該核酸は、成熟した重鎖および軽鎖可変領域に融合されたシグナルペプチドもコードする。核酸上のコード配列は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナルなどの、コード配列の発現を確実にするための制御配列と機能的に連結され得る。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、単離された形態で存在し得、または1もしくはそれを超えるベクター中にクローニングされ得る。核酸は、例えば、固相合成または重複するオリゴヌクレオチドのPCRによって合成することができる。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、例えば、発現ベクター内に1つの連続する核酸として連結することができ、または別々とすることができる、例えば、それぞれがその独自の発現ベクター中にクローニングされ得る。
本発明は、さらに、本明細書に記載されているヒト化重鎖および軽鎖のいずれかをコードする核酸を提供する。典型的には、該核酸は、成熟した重鎖および軽鎖可変領域に融合されたシグナルペプチドもコードする。核酸上のコード配列は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナルなどの、コード配列の発現を確実にするための制御配列と機能的に連結され得る。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、単離された形態で存在し得、または1もしくはそれを超えるベクター中にクローニングされ得る。核酸は、例えば、固相合成または重複するオリゴヌクレオチドのPCRによって合成することができる。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、例えば、発現ベクター内に1つの連続する核酸として連結することができ、または別々とすることができる、例えば、それぞれがその独自の発現ベクター中にクローニングされ得る。
一実施形態において、本開示は、HA、HB、HCまたはHDに記載されているアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域をコードすることができる。この単離されたポリヌクレオチドは、ヒトIgG重鎖定常領域をさらにコードすることができる。IgG定常領域のイソタイプは、例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である。一実施形態において、IgG定常領域のイソタイプはIgG1である。別の実施形態において、コードされるIgG1定常領域は、Kabatシステムにおいて記載されているとおりにEUインデックスにしたがって、残基239に置換を含むアミノ酸配列、すなわち、S239Cを有する。本開示は、HA、HB、HCまたはHDに記載されているアミノ酸配列(例えば、配列番号1またはそのバリアント)を含む抗体重鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供し、さらに、その発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物の宿主細胞、例えば、CHO細胞である。
別の実施形態において、本開示は、LA、LB、LC、LD、LE、LB-QまたはLB-Vに記載されているアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。例えば、配列番号2のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチド。この単離されたポリヌクレオチドは、ヒトIgG軽鎖定常領域をさらにコードすることができる。IgG軽鎖定常領域のイソタイプは、例えば、κ定常領域である。本開示は、LA、LB、LC、LD、LE、LB-QまたはLB-Vに記載されているアミノ酸配列(例えば、配列番号2またはそのバリアント)を含む抗体軽鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供し、さらに、その発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物の宿主細胞、例えば、CHO細胞である。
別の実施形態において、本開示は、配列番号1のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号2のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする1または複数の単離されたポリヌクレオチドを提供し、該重鎖可変ドメインおよび該軽鎖可変ドメインは、ヒトGPC3に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を形成する。本開示は、配列番号1のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号2のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする1または複数の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。1または複数の発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物の細胞、例えば、CHO細胞である。
別の実施形態において、本開示は、配列番号1のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドおよび配列番号2のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第一および第二のベクターであって、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、ヒトGPC3に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を形成するベクターを提供する。ベクターを含む宿主細胞、好ましくは、CHO細胞などの哺乳動物の宿主細胞が提供される。
IV.抗体-薬物コンジュゲート
抗GPC3抗体は、抗体-薬物コンジュゲート(ADC)を形成するために、細胞傷害部分または細胞増殖抑制部分にコンジュゲートすることができる。抗体へのコンジュゲーションに特に適した部分は、細胞傷害剤(例えば、化学療法剤)、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体もしくは化合物または毒素(これらの部分は、治療剤と総称される)である。例えば、抗GPC3抗体は、化学療法剤などの細胞傷害剤または毒素(例えば、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素などの細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤)にコンジュゲートすることができる。細胞傷害剤の有用なクラスの例には、例えば、DNA副溝結合剤、DNAアルキル化剤および微小管破壊剤が含まれる。例示的な細胞傷害剤には、例えば、チュブリシン、アウリスタチン、カンプトテシン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、エトポシド、マイタンシノイド(例えば、DM1、DM2、DM3、DM4)、タキサン、ベンゾジアゼピン(例えば、ピロロ[1,4]ベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピンおよびオキサゾリジノベンゾジアゼピン)およびビンカアルカロイドが含まれる。例示的な抗体-薬物コンジュゲートには、薬物成分がチュブリシン薬物であることを意味するチュブリシンベースの抗体-薬物コンジュゲート、薬物成分がアウリスタチン薬物であることを意味するアウリスタチンベースの抗体-薬物コンジュゲート、薬物成分がマイタンシノイド薬物であることを意味するマイタンシノイド抗体-薬物コンジュゲート、および薬物成分がベンゾジアゼピン(例えば、ピロロ[1,4]ベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピンおよびオキサゾリジノベンゾジアゼピン)であることを意味するベンゾジアゼピン抗体薬物コンジュゲートが含まれる。
抗GPC3抗体は、抗体-薬物コンジュゲート(ADC)を形成するために、細胞傷害部分または細胞増殖抑制部分にコンジュゲートすることができる。抗体へのコンジュゲーションに特に適した部分は、細胞傷害剤(例えば、化学療法剤)、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体もしくは化合物または毒素(これらの部分は、治療剤と総称される)である。例えば、抗GPC3抗体は、化学療法剤などの細胞傷害剤または毒素(例えば、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素などの細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤)にコンジュゲートすることができる。細胞傷害剤の有用なクラスの例には、例えば、DNA副溝結合剤、DNAアルキル化剤および微小管破壊剤が含まれる。例示的な細胞傷害剤には、例えば、チュブリシン、アウリスタチン、カンプトテシン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、エトポシド、マイタンシノイド(例えば、DM1、DM2、DM3、DM4)、タキサン、ベンゾジアゼピン(例えば、ピロロ[1,4]ベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピンおよびオキサゾリジノベンゾジアゼピン)およびビンカアルカロイドが含まれる。例示的な抗体-薬物コンジュゲートには、薬物成分がチュブリシン薬物であることを意味するチュブリシンベースの抗体-薬物コンジュゲート、薬物成分がアウリスタチン薬物であることを意味するアウリスタチンベースの抗体-薬物コンジュゲート、薬物成分がマイタンシノイド薬物であることを意味するマイタンシノイド抗体-薬物コンジュゲート、および薬物成分がベンゾジアゼピン(例えば、ピロロ[1,4]ベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピンおよびオキサゾリジノベンゾジアゼピン)であることを意味するベンゾジアゼピン抗体薬物コンジュゲートが含まれる。
治療剤を抗体に結合するための技術は周知である。(例えば、Alleyら、Current Opinion in Chemical Biology 2010 14:1-9;Senter,Cancer J.,2008,14(3):154-169を参照。)治療剤は、(例えば、加水分解によって、タンパク質分解によって、または切断剤によって)抗体が切除されなければ、その活性を低下させるようにコンジュゲートすることができる。いくつかの態様において、GPC3を発現するがん細胞によって内部に取り込まれたときにコンジュゲートが抗体から切断されるように(例えば、エンドソーム中で、または例えばpH感受性もしくはプロテアーゼ感受性によって、リソゾームの環境中で、またはカベオラ(caveolear)の環境中で)、GPC3を発現するがん細胞の細胞内環境中で切断に対して感受性であるが、細胞外環境に対しては実質的に感受性でない切断可能なリンカーを用いて、治療剤を抗体に結合させる。いくつかの態様において、治療剤は、非切断可能なリンカーを用いて、抗体に結合させることもできる。
本発明者らは、予想外のことに、四級化されたチュブリシン薬物-リンカーを含むGPC3標的化ADCが、とりわけ、リンカー単位がグルクロニド単位から構成されているときに、GPC3を発現する障害を処置するために有効であることを見出した。
グルクロニドをベースとしたリンカーは、バリン-シトルリンおよびバリン-アラニンなどのプロテアーゼ切断可能なリンカーに対する親水性の代替物であり、薬物放出を開始するために細胞内βグルクロニダーゼを活用する。グリカン残基に近接するコンジュゲーションの部位が疎水性薬物を遮蔽する役割を果たすので、位置239または239/295または294におけるシステインバリアント(および二重システインバリアント)も、チュブリシンMなどの疎水性薬物へのコンジュゲーションに特に適している。チュブリシンおよびチュブリシンに結合させたグルクロニドリンカーは、国際公開第2016/040684号により完全に記載されている。一実施形態において、GPC標的化ADCは、内部取り込み後に、修飾されていないチュブリシンMを細胞中に放出する。
を有し、式中、Aは、ストレッチャー単位であり;R2Aは、-C(=O)R2Bであり、R2Bは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、2-メチル-プロパ-1-イル、2,2-ジメチル-プロパ-1-イルもしくはビニルであり、またはR2Aは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、プロパ-2-エン-1-イルもしくは2-メチル-プロパ-2-エン-1-イルであり;および
R7Bは、-Hまたは-OHである。
R7Bは、-Hまたは-OHである。
より好ましい実施形態において、四級化されたチュブリシン薬物単位は、(αS,γR)-γ-[[[2-[(1R,3R)-1-(アセチルオキシ)-4-メチル-3-[メチル[(2S,3S)-3-メチル-2-[[[(2R)-1-メチル-2-ピペリジニル]カルボニル]-アミノ]-1-オキソペンチル]アミノ]ペンチル]-4-チアゾリル]カルボニル]アミノ]-α-メチル-ベンゼンペンタン酸としても知られ、CAS番号936691-46-2を有するチュブリシンMに関連する。したがって、より好ましい、四級化されたチュブリシン薬物単位を有するグルクロニドベースの薬物リンカー化合物は、R2Aが-C(=O)CH3およびR7Bが水素である上記構造を有する。
塩形態、特に、薬学的に許容され得る塩であり、式中、示されたmDPR部分のアミン窒素原子は好ましくはプロトン化されており、またはBOCなどの適切な酸に不安定な保護基によって保護されている。その他の特に好ましいグルクロニドベースの薬物リンカー化合物は、チュブバリンN-メチル置換基をエチルまたはn-プロピル置換基で置き換える。
その他のより好ましい実施形態、四級化されたチュブリシン薬物単位は、チュブバリン部分のO結合型酢酸置換基がO結合型エチルエーテル置換基によって置き換えられている(すなわち、R2Aがエチルである)チュブリシンMに関連する。
塩形態、特に薬学的に許容され得る塩である。
グルクロニドベースのチュブリシン薬物リンカー化合物の調製は、国際公開第2016/0404684号に詳述されており、参照により本明細書に明確に組み込まれる。その調製は、以下の反応スキームによって例示される。
その活性化されたエステルmDPR(BOC)-OSuおよびmDPR(BOC)-OPFFに変換されるmDPR(BOC)-OHの調製は、Nature Biotech,2014,32,1059-1062)に記載されており、そのための手法は、参照により本明細書に明確に組み込まれ、チュブリシンMの四級化のために臭素化されているグルクロニド中間体の調製は、Molecular Cancer Therapeutics,2016,15,938-945によって記載されている、そのための手法は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
本発明の抗体薬物コンジュゲートは、抗GPC3抗体の位置239または239/295または294におけるシステインバリアント残基が、マイケル付加を通じて、当該化合物のマレイミド部分と縮合されており、これにより、その部分をスクシンイミド部分へ変換し、次いで、スクシンイミド部分がそのカルボニル炭素の1つにおいて加水分解を受け得るグルクロニドベースの薬物リンカー化合物の上記実施形態の任意の1つの構造を有する。
チュブバリン残基の酢酸基が、チュブリシンMep残基の三級アミン窒素へのその窒素原子の四級化を通じたグルクロニドリンカーの結合を有するエーテルまたは別のエステル基によって置き換えられており、上述されているものなどの薬物リンカー化合物から調製され得るチュブリシンMおよびその類縁体の代表的な抗体薬物コンジュゲートは、以下のように例示され:
必要に応じて、薬学的に許容され得る塩形態で、式中、下付き文字pは、薬物負荷量を表し、典型的には、1~4の範囲であり、いくつかの態様において、2または4であり、Abは、抗GPC3抗体であり、Sは、システイン239またはシステイン295の硫黄原子である。
抗体または融合タンパク質は、位置239または295を占めるシステインを介して、酵素、発色団または蛍光標識などの検出可能なマーカーへコンジュゲートすることもできる。後者のADC構造は、そのカルボニル基の1つにおけるスクシンイミド部分の加水分解によって前者に関連し、いくつかの実施形態においては、ストレッチャー単位Aが塩基性単位から構成されるときに起こる。
必要に応じて、薬学的に許容され得る塩形態で、式中、下付き文字pは、薬物負荷量を表し、典型的には、1~4の範囲であり、いくつかの態様において、2または4であり、Abは、抗GPC3抗体であり、Sは、システイン239またはシステイン295の硫黄原子である。
薬物または標識にコンジュゲートさせる他に、抗体は、抗体結合を阻害する阻害的ドメインまたは遮蔽ドメインへ結合させた切断可能なリンカーを介して連結することもできる(例えば、国際公開第2003/068934号、国際公開第2004/009638号、国際公開第2009/025846号、国際公開第2101/081173号および国際公開第2014/103973号参照)。リンカーは、ある種の組織または病変に対して特異的である酵素によって切断されるように設計することができ、これにより、抗体が所望の位置で優先的に活性化されることが可能となる。遮蔽部分は、抗体の結合部位へ直接結合することによって作用することができ、または立体障害を介して間接的に作用することができる。
薬物負荷量-「p」
上に示されているGPC3標的化抗体-薬物コンジュゲートを参照すると、下付き文字pは、抗体分子に対する薬物負荷量(抗体分子に結合させた薬物の分子の数)を表し、整数値である。標的細胞に送達することができる薬物の量を決定するので、抗体-薬物コンジュゲート分子の集団を含む組成物において、平均薬物負荷量(例えば、集団中の抗体当たりの薬物-リンカー分子の平均数)は、重要な品質特性である。平均薬物負荷量は整数値または非整数値であり得るが、典型的には、非整数値である。最適な平均薬物負荷量は、薬物または薬物-リンカーの組み合わせの種類に応じて様々である。
上に示されているGPC3標的化抗体-薬物コンジュゲートを参照すると、下付き文字pは、抗体分子に対する薬物負荷量(抗体分子に結合させた薬物の分子の数)を表し、整数値である。標的細胞に送達することができる薬物の量を決定するので、抗体-薬物コンジュゲート分子の集団を含む組成物において、平均薬物負荷量(例えば、集団中の抗体当たりの薬物-リンカー分子の平均数)は、重要な品質特性である。平均薬物負荷量は整数値または非整数値であり得るが、典型的には、非整数値である。最適な平均薬物負荷量は、薬物または薬物-リンカーの組み合わせの種類に応じて様々である。
抗体-薬物コンジュゲート組成物の不均一性は、いくつかの態様において、薬物-リンカー分子を抗体分子へコンジュゲートするために使用されるコンジュゲーション技術に依存する。例えば、いくつかの態様において、薬物-リンカー分子を抗体分子へコンジュゲートするために使用されるコンジュゲーション技術は、抗体上での薬物-リンカー分子の分布に関しておよび/または抗体分子上での薬物-リンカーの数に関して不均一である抗体-薬物コンジュゲート組成物をもたらす(例えば、非部位特異的技術を用いて鎖間ジスルフィドを介してコンジュゲートする場合)。他の態様において、薬物-リンカー分子を結合するために使用されるコンジュゲーション技術は、リガンド分子上での薬物-リンカー分子の分布に関しておよび/または抗体分子上での薬物-リンカー分子の数に関して実質的に均一である抗体-薬物コンジュゲート組成物をもたらす(例えば、部位特異的コンジュゲーション技術を用いる場合)。部位特異的方法と非部位特異的方法の両方で、通例、わずかな百分率のコンジュゲートしていない抗体分子も存在する。コンジュゲートしていない抗体分子の百分率は、平均薬物負荷量の値に含まれる。
本発明の好ましい態様において、抗体-薬物コンジュゲート化合物の集団を含む組成物を参照する場合の平均薬物負荷量は、約2~約14、好ましくは、約2~約10である。本明細書中に例示されているチュブリシンM抗体薬物コンジュゲートについては、特に好ましい平均薬物負荷量は約2である。いくつかの態様において、抗体-薬物コンジュゲート化合物の集団中の各抗体分子に対する実際の薬物負荷量は、1~4、1~3または1~2であり、一般的な薬物負荷量は2である。好ましい態様において、約2の平均薬物負荷量は、部位特異的コンジュゲーション技術(例えば、抗体に導入される操作されたシステイン)を介して達成される。
本発明のいくつかの他の態様において、抗体-薬物コンジュゲート化合物の集団を含む組成物を参照する場合の平均薬物負荷量は約3または約4であり、抗体-薬物コンジュゲート化合物の集団中の各抗体分子に対する実際の薬物負荷量は1~8である。
いくつかの態様において、抗体-薬物コンジュゲート化合物の集団中の各抗体分子に対する実際の薬物負荷量は、1~10(または6~10もしくは6~8)である。例えば、鎖間ジスルフィドの他に、(EUインデックスにしたがって、位置239に導入されたシステイン残基などの)導入されたシステイン残基に薬物-リンカーがコンジュゲートしている場合には、より高い薬物負荷量を達成することができる。
V.治療上の適用
本明細書に記載されているGPC3標的化抗体-薬物コンジュゲートは、GPC3を発現するがんなどの、GPC3を発現する障害を処置するために使用することができる。典型的には、このようながんは、タンパク質(例えば、イムノアッセイによって)またはRNAレベルで測定される検出可能なレベルのGPC3を示す。このようながんのいくつかは、好ましくは同じ患者からの、同じ種類の非がん性組織と比べて上昇したレベルのGPC3を示す。必要に応じて、がん中のGPC3のレベルは、処置を行う前に測定される。
本明細書に記載されているGPC3標的化抗体-薬物コンジュゲートは、GPC3を発現するがんなどの、GPC3を発現する障害を処置するために使用することができる。典型的には、このようながんは、タンパク質(例えば、イムノアッセイによって)またはRNAレベルで測定される検出可能なレベルのGPC3を示す。このようながんのいくつかは、好ましくは同じ患者からの、同じ種類の非がん性組織と比べて上昇したレベルのGPC3を示す。必要に応じて、がん中のGPC3のレベルは、処置を行う前に測定される。
GPC3発現を伴うがんの例には、肝細胞癌(HCC)および肺癌が含まれる(HCCのおよそ70%において、および肺癌の20%においてGPC3が発現される。)。その他のがんには、ウィルムス腫瘍(腎芽腫)、卵巣明細胞癌、結腸直腸癌および肉腫が含まれる。
本発明の方法は、本発明の抗体-薬物コンジュゲートを患者に投与することを含む、GPC3を発現するがんを有する患者を処置することを含む。がんは、例えば、HCC、肺癌、ウィルムス腫瘍、卵巣明細胞癌、結腸直腸癌または肉腫を含む、任意の、GPC3を発現するがんであり得る。
タンパク質の増加する発現ががん細胞からの治療剤の排出を増加させた後に、いくつかのがん細胞は治療剤への耐性を生ずる。このようなタンパク質には、P-糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質、肺耐性関連タンパク質および乳がん耐性タンパク質が含まれる。がん細胞中の薬物耐性の検出は、当業者によって行うことができる。排出タンパク質を検出する抗体またはアッセイは、例えば、Promega、Millipore、AbcamおよびSigma-Aldrichから市販されている。本方法によって処置されるべきがんは、GPC3を発現する多耐性がんであり得る。いくつかの態様において、がんは、多剤耐性GPC3+HCCである。
GPC3に向けられた抗体-薬物コンジュゲートは、発症を遅らせ、重度を低減し、さらなる悪化を阻止し、および/またはがんの少なくとも1つの徴候もしくは症状を寛解させる投薬量、投与の経路および投与の頻度を意味する有効レジメンで投与される。
GPC3に向けられたコンジュゲートに対する例示的な投薬量には、約1.0μg/kg~約10mg/kg、1.0μg/kg~約5mg/kg、1.0μg/kg~約5mg/kg、約1.0μg/kg~約1.0mg/kg、約10μg/kg~約3mg/kg、約10μg/kg~約2mg/kg、約1.0μg/kg~1.0mg/kgまたは約1.0μg/kg~500.0μg/kgまたは約1.0μg/kg~80.0、100.0もしくは200.0μg/kgが含まれる。
GPC3に向けられたチュブリシンMコンジュゲートに対する例示的な投薬量は、一般的には、約1.0μg/kg~1.0mg/kgまたは約1.0μg/kg~500.0μg/kgまたは約1.0μg/kg~80.0、100.0もしくは200.0μg/kgであるが、別の投薬量が考えられる。
投与は、様々な投与経路によってでよい。ある種の実施形態において、コンジュゲートは、静脈内、筋肉内または皮下など非経口的に投与される。がんの処置のためのADCの投与については、送達は、静脈内または皮下投与による全身循環中への送達であり得る。特定の実施形態において、投与は、静脈内送達を介する。静脈内投与は、例えば、30~90分などの期間にわたる注入によってでよいか、または単回ボーラス注射によってでよい。いくつかの態様において、投与は、末梢に挿入された中心静脈カテーテル中へのスローIVプッシュ(すなわち、30~60秒にわたる)を介する。
投与の頻度は、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、および投与されている他の医薬など、多くの異なる要因に依存する。頻度は、毎日、毎週、毎月、年に4回または患者の症状もしくは処置されているがんの進行の変化に応じて不定期の間隔であり得る。静脈内投与のための例示的な頻度は、処置の継続する過程にわたって、週に2回から年に4回の間であるが、より高いまたは低い頻度の投与も可能である。静脈内投与のための他の例示的な頻度は、3週間ごと、または処置の継続する過程にわたって、毎週1回から(or)毎月1回の間であるが、より高いまたは低い頻度の投与も可能である。皮下投与については、例示的な投与頻度は毎日~毎月であるが、より高いまたは低い頻度の投与も可能である。
非経口投与用の医薬組成物は、好ましくは、無菌であり、実質的に等張であり、GMP条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形で(すなわち、単回投与用の投薬量)で与えることができる。医薬組成物は、1またはそれを超える、生理的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を用いて製剤化することができる。製剤は、選択された投与の経路に依存する。注射のために、コンジュゲートは、水溶液中に、好ましくは、(注射の部位における不快感を軽減するために)ハンクス液、リンゲル液などの生理的に適合的な緩衝液、または生理的食塩水または酢酸緩衝液中に製剤化され得る。溶液は、懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤などの製剤化剤を含有し得る。または、抗体は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない無菌水で構成するための凍結乾燥された形態であり得る。液体製剤中のコンジュゲートの濃度は、幅広く様々であって良い。いくつかの態様において、ADCは、約0.5mg/mL~約30mg/mL、約0.5mg/mL~約10mg/mL、約1mg/mL~約10mg/mL、約2mg/mL~約10mg/mLまたは約2mg/mL~約5mg/mLの濃度で存在する。
本発明のコンジュゲートでの処置は、化学療法、放射線、幹細胞処置、手術、および処置されている当該障害に対する標準的治療を含む、処置されている障害に対して有効なその他の処置と組み合わせることができる。したがって、本発明は、単独療法としての、または、例えば、本明細書に記載されている疾患および/または障害の処置ための標準的治療もしくは被験薬との併用治療における本明細書に記載されている疾患および障害を処置する方法を包含する。がんの処置方法は、さらなる抗癌剤またはがんを処置するための他の薬剤と組み合わされた、有効量の本発明のGPC3に向けられた抗体-薬物コンジュゲートを、これを必要としている患者に投与することを含む。
併用治療のためのいくつかの薬剤には、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、ニボルマブ、ドキソルビシン、FEMOX(ゲムシタビンおよびオキサリプラチン)、ドキソルビン(doxorubin)、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ビノレルビンおよびマイトマイシンCが含まれる。一実施形態において、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、ニボルマブ、ドキソルビシン、FEMOX(ゲムシタビンおよびオキサリプラチン)、ドキソルビン、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ビノレルビンおよびマイトマイシンCの1またはそれより多くが、本発明のGPC3に向けられたADCとの併用治療において投与される。
さらなる実施形態において、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、ニボルマブ、ドキソルビシン、FEMOX(ゲムシタビンおよびオキサリプラチン)、ドキソルビン、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ビノレルビンおよびマイトマイシンCの1またはそれより多くが、本発明のヒト化されたGPC3-1ADCとの併用治療において投与される。さらなる実施形態において、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、ニボルマブ、ドキソルビシン、FEMOX(ゲムシタビンおよびオキサリプラチン)、ドキソルビン、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ビノレルビンおよびマイトマイシンCの1またはそれより多くが、本発明のhGPC3-1ec-SGD-6859との併用治療において投与される。
本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態または態様は、具体的に別段の記載がなければ、他のいずれとも組み合わせて使用することができる。明確性および理解のために、例示および例によって、いくぶん詳しく本発明を記載してきたが、添付の特許請求の範囲の範囲内で、ある種の変更および改変を実施し得ることは自明である。
以下の実施例で記載されている細胞株は、米国培養細胞系統保存機関(ATCC)またはドイツ微生物細胞培養保存機関GmbH、Braunschweig、Germany(DMSZ)によって指定された条件に従ってまたは他の方法で知られているとおり培養で維持した。
方法
抗体選択
リード抗体、GPC3-1は、アミノ酸残基375~563を包含する組換えGPC3でマウスを免疫することによって同定した(図1参照)。GPC3抗体産生マウスの脾臓およびリンパ節から採集したリンパ球を骨髄腫細胞に融合した。ハイブリドーマ成長培地中に一晩、融合細胞を回収した。回収後、細胞を遠心沈殿させ、次いで、半固体培地中に播種した。ハイブリドーマをインキュベートし、IgGを産生するハイブリドーマクローンを選んだ。このハイブリドーマキャンペーン(hybridoma campaign)由来の抗体を、GPC3を発現する細胞株上でADCとしてスクリーニングした。いくつかのエピトープクラス由来の抗体がADC活性を示した。その優れたADC細胞傷害の他、シェディングをもたらすことができるタンパク質分解切断部位の近位の膜であるエピトープを有することに基づいて、リード抗体を選択した。
抗体選択
リード抗体、GPC3-1は、アミノ酸残基375~563を包含する組換えGPC3でマウスを免疫することによって同定した(図1参照)。GPC3抗体産生マウスの脾臓およびリンパ節から採集したリンパ球を骨髄腫細胞に融合した。ハイブリドーマ成長培地中に一晩、融合細胞を回収した。回収後、細胞を遠心沈殿させ、次いで、半固体培地中に播種した。ハイブリドーマをインキュベートし、IgGを産生するハイブリドーマクローンを選んだ。このハイブリドーマキャンペーン(hybridoma campaign)由来の抗体を、GPC3を発現する細胞株上でADCとしてスクリーニングした。いくつかのエピトープクラス由来の抗体がADC活性を示した。その優れたADC細胞傷害の他、シェディングをもたらすことができるタンパク質分解切断部位の近位の膜であるエピトープを有することに基づいて、リード抗体を選択した。
競合結合アッセイ
10万個のGPC3陽性細胞を96ウェルプレートに移し、3~5nMのAlexaFluor-488標識mGPC3-1および漸増濃度(10pM~2μM)の非標識ヒト化またはマウスGPC3-1mAbとともに、氷上で1時間インキュベートした。細胞を遠心し、PBSで3回洗浄し、125μLのPBS+2%FBS溶液中に再懸濁した。フローサイトメーターを用いて蛍光を分析し、飽和蛍光シグナルのパーセントを使用して結合した標識GPC3-1mAbのパーセントを決定した。可変の勾配を有するS字形用量応答曲線にデータをフィッティングすることによって、EC50を外挿した。
10万個のGPC3陽性細胞を96ウェルプレートに移し、3~5nMのAlexaFluor-488標識mGPC3-1および漸増濃度(10pM~2μM)の非標識ヒト化またはマウスGPC3-1mAbとともに、氷上で1時間インキュベートした。細胞を遠心し、PBSで3回洗浄し、125μLのPBS+2%FBS溶液中に再懸濁した。フローサイトメーターを用いて蛍光を分析し、飽和蛍光シグナルのパーセントを使用して結合した標識GPC3-1mAbのパーセントを決定した。可変の勾配を有するS字形用量応答曲線にデータをフィッティングすることによって、EC50を外挿した。
飽和結合アッセイ
10万個のGPC3陽性細胞を96ウェルプレートに移した。10pM~5μMの範囲の濃度でAlexaFluor-488標識GPC3mAbを添加し、氷上で30分間細胞をインキュベートした。細胞を遠心分離によってペレットとし、PBS+1%BSA溶液で3回洗浄し、125μLのPBS+2%FBS中に再懸濁した。フローサイトメーターを用いて蛍光を分析し、飽和蛍光シグナルのパーセントを使用して結合したパーセントを決定し、その後見かけのKdを計算した。
10万個のGPC3陽性細胞を96ウェルプレートに移した。10pM~5μMの範囲の濃度でAlexaFluor-488標識GPC3mAbを添加し、氷上で30分間細胞をインキュベートした。細胞を遠心分離によってペレットとし、PBS+1%BSA溶液で3回洗浄し、125μLのPBS+2%FBS中に再懸濁した。フローサイトメーターを用いて蛍光を分析し、飽和蛍光シグナルのパーセントを使用して結合したパーセントを決定し、その後見かけのKdを計算した。
表面プラズモン共鳴によって測定された親和性
AcroBiosystemsからヒトGPC3(hGPC3 GP3-H5258)を購入し、Pierce NHS-LC-LC-ビオチンを用いて1.5:1のビオチン/タンパク質比のモル比でビオチン化した。hGPC3-1ecを分析物として使用して、High Precision Streptavidin(SAX)BiosensorsおよびプローブとしてのGPC3を用いるOctet Red 384システム(ForteBio)上でバイオレイヤー干渉法(BLI)を実施した。結合したhGPC3への二価結合は、600秒の結合および1800秒の解離ならびに400、160、64、25.6、10.2、4.1および1.64nMの8つの濃度点にわたる1:1の比でのフィットに対して、X2=0.59およびR2=0.9998で、2.04E-10M(kdiss2.3E-5/kon1.134E5)であることが測定された。hGPC3-1ec(HBLE)の結合親和性(KD)は、14nMであることが決定された(図6)。
AcroBiosystemsからヒトGPC3(hGPC3 GP3-H5258)を購入し、Pierce NHS-LC-LC-ビオチンを用いて1.5:1のビオチン/タンパク質比のモル比でビオチン化した。hGPC3-1ecを分析物として使用して、High Precision Streptavidin(SAX)BiosensorsおよびプローブとしてのGPC3を用いるOctet Red 384システム(ForteBio)上でバイオレイヤー干渉法(BLI)を実施した。結合したhGPC3への二価結合は、600秒の結合および1800秒の解離ならびに400、160、64、25.6、10.2、4.1および1.64nMの8つの濃度点にわたる1:1の比でのフィットに対して、X2=0.59およびR2=0.9998で、2.04E-10M(kdiss2.3E-5/kon1.134E5)であることが測定された。hGPC3-1ec(HBLE)の結合親和性(KD)は、14nMであることが決定された(図6)。
ヒト化抗体の設計
ヒト化抗体は、マウスGPC3-1抗体から誘導した。異なる位置に復帰突然変異を取り込んで、4つのヒト化重鎖(HA-HD)および7つのヒト化軽鎖(LA-LE)を作製した。いくつかの事例では、復帰突然変異はマウス生殖系列と合致するが、その他の事例では、(体細胞変異を有する事例のように)合致しない。ヒト化重鎖および軽鎖を対にした。配列アライメントのための図2~5および表1~5を参照されたい。HA、HB、HC、HDならびにLA、LBおよびLCバリアントを用いた最初のヒト化の後に、CDR-L1中に見出される潜在的な脱アミド化モチーフ(「NG」)に対処するために、さらなるL鎖バリアントを開発した(配列番号13)(表5)。
表1:hGPC3-1可変重(vH)鎖バリアント中のヒト化されている変異
表2:hGPC3-1可変軽(vL)鎖バリアント中のヒト化されている変異
表3:hGPC3-1重鎖バリアント中の特異的なフレームワーク変異
*マウス残基
表4:hGPC3-1軽鎖バリアント中の特異的フレームワーク変異
*マウス残基
表5:hGPC3-1軽鎖バリアント中の特異的CDR-L1脱アミド変異
抗体薬物コンジュゲートの作製
ヒト化抗体は、マウスGPC3-1抗体から誘導した。異なる位置に復帰突然変異を取り込んで、4つのヒト化重鎖(HA-HD)および7つのヒト化軽鎖(LA-LE)を作製した。いくつかの事例では、復帰突然変異はマウス生殖系列と合致するが、その他の事例では、(体細胞変異を有する事例のように)合致しない。ヒト化重鎖および軽鎖を対にした。配列アライメントのための図2~5および表1~5を参照されたい。HA、HB、HC、HDならびにLA、LBおよびLCバリアントを用いた最初のヒト化の後に、CDR-L1中に見出される潜在的な脱アミド化モチーフ(「NG」)に対処するために、さらなるL鎖バリアントを開発した(配列番号13)(表5)。
表1:hGPC3-1可変重(vH)鎖バリアント中のヒト化されている変異
表4:hGPC3-1軽鎖バリアント中の特異的フレームワーク変異
表5:hGPC3-1軽鎖バリアント中の特異的CDR-L1脱アミド変異
米国特許出願第62/465,129号(2017年2月28日出願)および米国特許出願第62/561,151号(2017年9月20日)に記載されているように、本明細書に記載されている抗GPC3抗体を用いて抗体薬物コンジュゲートを調製した。IgG1mAbのシステイン変異体の調製は、米国特許出願公開第2010/0158909号に一般的に記載されている。抗体のIgG1鎖の239位に導入されたシステイン残基のチオール基を介して抗GPC3抗体に薬物-リンカーSGD-6859をコンジュゲートし、平均薬物負荷量は、抗体当たり約2個の薬物であった。239位にシステインを有する抗体は、表記ecを有する。
インビトロ細胞傷害アッセイ
抗体-薬物コンジュゲート(ADC)処理前に、細胞株を24時間播種した。表記用量のADCで細胞を処理し、37℃で96時間インキュベートした。いくつかの実験では、非抗原結合ADCを陰性対照として含めた。製造業者の指示にしたがい、CelltiterGlo(Promega Corporation、Madison、WI)を用いて、細胞株に対する細胞生存率を測定した。25分間、室温で、CelltiterGlo試薬とともに細胞をインキュベートし、Envisionプレートリーダー(Perkin Elmer、Waltham、MA)上で発光を測定した。ビヒクル処理された細胞(対照=100%)と比較して、生存率を最大値の半分に低下させるために必要とされる化合物の濃度であるIC50として結果が報告されている。
抗体-薬物コンジュゲート(ADC)処理前に、細胞株を24時間播種した。表記用量のADCで細胞を処理し、37℃で96時間インキュベートした。いくつかの実験では、非抗原結合ADCを陰性対照として含めた。製造業者の指示にしたがい、CelltiterGlo(Promega Corporation、Madison、WI)を用いて、細胞株に対する細胞生存率を測定した。25分間、室温で、CelltiterGlo試薬とともに細胞をインキュベートし、Envisionプレートリーダー(Perkin Elmer、Waltham、MA)上で発光を測定した。ビヒクル処理された細胞(対照=100%)と比較して、生存率を最大値の半分に低下させるために必要とされる化合物の濃度であるIC50として結果が報告されている。
インビボ活性研究
皮下HCCおよび肺癌モデル
5×105のJHH7または2.5×106のHep3Bまたは2.5×106Huh7HCC細胞をヌードマウスの皮下に接種した。1×106のNCI-H661細胞をNSGマウスの皮下に接種した。腫瘍成長はキャリパーでモニタリングし、式(0.5×[長さ×幅2])を用いて平均腫瘍体積を計算した。平均腫瘍体積が約100mm3に達した時点で、マウスは処置しないか、またはヒト化GPC3-1ADCの単回用量を腹腔内に投与した。腫瘍体積が約400mm3に達した時点で、マウスを安楽死させた。全ての動物の取り扱いは、実験動物管理評価・認定協会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)によって認証された施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに基づいて行った。
皮下HCCおよび肺癌モデル
5×105のJHH7または2.5×106のHep3Bまたは2.5×106Huh7HCC細胞をヌードマウスの皮下に接種した。1×106のNCI-H661細胞をNSGマウスの皮下に接種した。腫瘍成長はキャリパーでモニタリングし、式(0.5×[長さ×幅2])を用いて平均腫瘍体積を計算した。平均腫瘍体積が約100mm3に達した時点で、マウスは処置しないか、またはヒト化GPC3-1ADCの単回用量を腹腔内に投与した。腫瘍体積が約400mm3に達した時点で、マウスを安楽死させた。全ての動物の取り扱いは、実験動物管理評価・認定協会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)によって認証された施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに基づいて行った。
S239Cまたは天然のシステインにコンジュゲート実験動物管理評価・認定協会したときの、SGD-5937またはSGD-6859のマレイミドおよびチュブリシンMアセテート安定性のインビボでの評価
薬物-リンカー化学の関数としての薬物の安定性を、異種移植モデルで使用された系統であるSCIDマウス中で評価した。天然のシステイン上に4薬物/mAbおよび操作されたS239C上に2薬物/mAbで負荷したMPグルクロニド-チュブリシンM(SGD-6859)およびmDPRグルクロニド-チュブリシンM(SGD-5937)を含有するヒト化IgGコンジュゲートを調製した。3mg/kgの単回腹腔内用量としてSCIDマウスにコンジュゲートを投与し、次いで、投与の4日後および10日後に終末放血に供した。EDTA被覆エッペンドルフ管中への遠心分離を用いて、各動物から得た血液試料を処理して血漿とした。抗ヒト捕捉アフィニティー樹脂(IgSelect、GE Healthcare)を用いて、2~8℃で3時間、血漿をバッチ精製した。PBSpH7.4(1×)+0.5MNaClを用いて、結合した試料を洗浄し、50mMグリシン、pH3を用いて溶出した。溶出された試料をTrispH7.4で中和し、PNGアーゼF(New England BioLabs Inc)を用いて脱グリコシル化し、次いで、10mMDTTを用いて還元した。質量分析検出(Waters Xevo G2-S QTOF)と結合した逆相UPLC(PLRP8μm、Agilent)を用いて各試料を分析した。各試料の薬物-抗体比率(DAR)は、負荷していないおよび薬物負荷した(アセチル化されたおよび脱アセチル化された)抗体ピークのデコンボリューションされた質量から得た総イオン数の相対比率を用いて計算した。完全な状態の薬物(%アセチル化)は、薬物を負荷した軽鎖および重鎖種の総イオン数を用いて計算し、42ダルトンの喪失によって評価した。
薬物-リンカー化学の関数としての薬物の安定性を、異種移植モデルで使用された系統であるSCIDマウス中で評価した。天然のシステイン上に4薬物/mAbおよび操作されたS239C上に2薬物/mAbで負荷したMPグルクロニド-チュブリシンM(SGD-6859)およびmDPRグルクロニド-チュブリシンM(SGD-5937)を含有するヒト化IgGコンジュゲートを調製した。3mg/kgの単回腹腔内用量としてSCIDマウスにコンジュゲートを投与し、次いで、投与の4日後および10日後に終末放血に供した。EDTA被覆エッペンドルフ管中への遠心分離を用いて、各動物から得た血液試料を処理して血漿とした。抗ヒト捕捉アフィニティー樹脂(IgSelect、GE Healthcare)を用いて、2~8℃で3時間、血漿をバッチ精製した。PBSpH7.4(1×)+0.5MNaClを用いて、結合した試料を洗浄し、50mMグリシン、pH3を用いて溶出した。溶出された試料をTrispH7.4で中和し、PNGアーゼF(New England BioLabs Inc)を用いて脱グリコシル化し、次いで、10mMDTTを用いて還元した。質量分析検出(Waters Xevo G2-S QTOF)と結合した逆相UPLC(PLRP8μm、Agilent)を用いて各試料を分析した。各試料の薬物-抗体比率(DAR)は、負荷していないおよび薬物負荷した(アセチル化されたおよび脱アセチル化された)抗体ピークのデコンボリューションされた質量から得た総イオン数の相対比率を用いて計算した。完全な状態の薬物(%アセチル化)は、薬物を負荷した軽鎖および重鎖種の総イオン数を用いて計算し、42ダルトンの喪失によって評価した。
結果
[実施例1]ヒト化mAbの設計および試験
hIGHv1-18/hIGHJ4またはhIGHV1-69-2/hIGHJ4重鎖可変領域ヒト生殖系列とhIGK2-30/hIGKJ2軽鎖可変領域ヒト生殖系列とをヒトアクセプター配列として用いて、いくつかのヒト化GPC3-1抗体を構築した。これらの抗体では、マウス抗体またはマウス生殖系列配列へと戻り変異するべきアミノ酸残基の選択が異なった。HBLE(配列番号1に記載されている重鎖可変領域(vHB)および配列番号2に記載されている軽鎖可変領域(vLE))と表記される抗体を、その(i)結合特性(表6および7参照)、(ii)薬物を送達する能力および(iii)他のバリアントと比較した復帰突然変異の数に基づいて、リードヒト化GPC3-1抗体として選択した。
[実施例1]ヒト化mAbの設計および試験
hIGHv1-18/hIGHJ4またはhIGHV1-69-2/hIGHJ4重鎖可変領域ヒト生殖系列とhIGK2-30/hIGKJ2軽鎖可変領域ヒト生殖系列とをヒトアクセプター配列として用いて、いくつかのヒト化GPC3-1抗体を構築した。これらの抗体では、マウス抗体またはマウス生殖系列配列へと戻り変異するべきアミノ酸残基の選択が異なった。HBLE(配列番号1に記載されている重鎖可変領域(vHB)および配列番号2に記載されている軽鎖可変領域(vLE))と表記される抗体を、その(i)結合特性(表6および7参照)、(ii)薬物を送達する能力および(iii)他のバリアントと比較した復帰突然変異の数に基づいて、リードヒト化GPC3-1抗体として選択した。
HALA(vHAと表記される重鎖可変領域およびvLAと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HALB(vHAと表記される重鎖可変領域およびvLBと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HALC(vHAと表記される重鎖可変領域およびvLCと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HBLA(vHBと表記される重鎖可変領域およびvLAと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HBLB(vHBと表記される重鎖可変領域およびvLBと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HBLC(vHBと表記される重鎖可変領域およびvLCと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HBLD(vHBと表記される重鎖可変領域およびvLDと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HBLE(vHBと表記される重鎖可変領域およびvLEと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HBLB-Q(vHBと表記される重鎖可変領域およびvLB-Qと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HBLB-V(vHBと表記される重鎖可変領域およびvLB-Vと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HCLA(vHCと表記される重鎖可変領域およびvLAと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HCLB(vHCと表記される重鎖可変領域およびvLBと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HCLC(vHCと表記される重鎖可変領域およびvLCと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HDLA(vHDと表記される重鎖可変領域およびvLAと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)、HDLB(vHDと表記される重鎖可変領域およびvLBと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)およびHDLC(vHDと表記される重鎖可変領域およびvLCと表記される軽鎖可変領域を有する抗体)と表記される抗体を、HBLE抗体の代わりに本発明において使用することができる。vHA、vHB、vHC、vHD、vLA、vLB、vLB-Q、vLB-V、vLC、vLDおよびvLE配列については図2~5を参照されたい。
表6:hGPC3-1抗体バリアントのhGPC3結合
表7:hGPC3-1脱アミドバリアントのhGPC3結合
表6:hGPC3-1抗体バリアントのhGPC3結合
[実施例2]hGPC3-1ecSGD-6859/SGD-6183のインビトロ抗腫瘍活性
JHH7、Huh7およびHep3Bを含むGPC3を発現するHCC細胞株のパネルに対して、ヒト化GPC3-1ecSGD-6859またはGPC3-1SGD-6183抗体-薬物コンジュゲートの細胞傷害活性を評価した。図7に示されているように、ヒト化GPC3-1ecSGD-6859またはGPC3-1SGD-6183抗体-薬物コンジュゲートは、3つの細胞株全てにおいて活性であった。
JHH7、Huh7およびHep3Bを含むGPC3を発現するHCC細胞株のパネルに対して、ヒト化GPC3-1ecSGD-6859またはGPC3-1SGD-6183抗体-薬物コンジュゲートの細胞傷害活性を評価した。図7に示されているように、ヒト化GPC3-1ecSGD-6859またはGPC3-1SGD-6183抗体-薬物コンジュゲートは、3つの細胞株全てにおいて活性であった。
NCI-H661およびNCI-H446を含むGPC3を発現する肺癌細胞株のパネルに対して、ヒト化GPC3-1ecSGD-6859またはGPC3-1SGD-6183抗体-薬物コンジュゲートの細胞傷害活性を評価した。図8に示されているように、ヒト化GPC3-1ecSGD-6859またはGPC3-1SGD-6183抗体-薬物コンジュゲートは、両細胞株中において活性であった。
[実施例3]HCC腫瘍に対するヒト化GPC3-1ecSGD-6859またはGPC3-1(S239C、Q295C)SGD-5937またはGPC3-1SGD-6183のインビボ抗腫瘍活性
3つの皮下HCC異種移植モデル、JHH7、Huh7およびHep3B中で、hGPC3-1ecSGD-6859またはhGPC3-1ecSGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183の活性を試験した。確立された(約100mm3)腫瘍を有するヌードマウスに、JHH7モデルに対しては図9に図示されているとおりにhGPC3-1ecSGD-5937もしくはhGPC3-1SGD-6183、Huh7腫瘍モデルに対しては図10中のhGPC3-1ecSGD-6859もしくはhGPC3-1SGD-6183およびHep3B腫瘍モデルに対しては図11中のhGPC3-1ecSGD-6859またはhGPC3-1SGD-6183を投与した。hGPC3-1ecSGD-6859またはhGPC3-1ecSGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183での処置は、非処置に比べて腫瘍成長を減少させた。単回ADC投与後に、いくつかのマウス中で持続的な退行が得られた。1つの皮下肺癌異種移植モデル、NCI-H661中で、hGPC3-1(S239C、Q295C)SGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183の活性を試験した。図12に図示されているとおりに、hGPC3-1(S239C、Q295C)SGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183を、確立された(約100mm3)腫瘍を有するNSGマウスに投与した。hGPC3-1(S239C、Q295C)SGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183での処置は、非処置に比べて腫瘍成長を減少させた。単回ADC投与後に、いくつかのマウス中で持続的な退行が得られた。データは、hGPC3-1ecSGD-6859またはhGPC3-1ecSGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183がGPC3を発現するHCC異種移植モデル中で有意な用量依存的抗腫瘍活性を示し、hGPC3-1(S239C、Q295C)SGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183がGPC3を発現する肺異種移植モデル中で有意な用量依存的抗腫瘍活性を示すことを実証する。
3つの皮下HCC異種移植モデル、JHH7、Huh7およびHep3B中で、hGPC3-1ecSGD-6859またはhGPC3-1ecSGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183の活性を試験した。確立された(約100mm3)腫瘍を有するヌードマウスに、JHH7モデルに対しては図9に図示されているとおりにhGPC3-1ecSGD-5937もしくはhGPC3-1SGD-6183、Huh7腫瘍モデルに対しては図10中のhGPC3-1ecSGD-6859もしくはhGPC3-1SGD-6183およびHep3B腫瘍モデルに対しては図11中のhGPC3-1ecSGD-6859またはhGPC3-1SGD-6183を投与した。hGPC3-1ecSGD-6859またはhGPC3-1ecSGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183での処置は、非処置に比べて腫瘍成長を減少させた。単回ADC投与後に、いくつかのマウス中で持続的な退行が得られた。1つの皮下肺癌異種移植モデル、NCI-H661中で、hGPC3-1(S239C、Q295C)SGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183の活性を試験した。図12に図示されているとおりに、hGPC3-1(S239C、Q295C)SGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183を、確立された(約100mm3)腫瘍を有するNSGマウスに投与した。hGPC3-1(S239C、Q295C)SGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183での処置は、非処置に比べて腫瘍成長を減少させた。単回ADC投与後に、いくつかのマウス中で持続的な退行が得られた。データは、hGPC3-1ecSGD-6859またはhGPC3-1ecSGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183がGPC3を発現するHCC異種移植モデル中で有意な用量依存的抗腫瘍活性を示し、hGPC3-1(S239C、Q295C)SGD-5937またはhGPC3-1SGD-6183がGPC3を発現する肺異種移植モデル中で有意な用量依存的抗腫瘍活性を示すことを実証する。
[実施例4]S239Cまたは天然のシステインに結合したときの、SGD-5937またはSGD-6859のマレイミドおよびチュブリシンMアセテート安定性のインビボでの評価
チュブリシンMの脱アセチル化は、その効力を著しく減少させる。S239CにコンジュゲートしたDAR2ADCとして、h00ecSGD-6859またはh00ecSGD-5937を調製した。天然のシステインにコンジュゲートした混合された平均DAR4のADCとして、h00SGD-6859またはh00SGD-5937を調製した。3mg/kgのADCの1つを、SCIDマウスの腹腔内に投与した。PLRP-MSによって、投与から0日、4日および10日後に、マレイミド安定性およびチュブリシンMアセテート安定性を評価した。天然のシステインにコンジュゲートしたSGD-6859およびSGD-5937の両方は、S239Cへのコンジュゲーションと比較すると、増加したマレイミドおよびチュブリシンM不安定性を示した(図13)。このデータは、S239Cへのコンジュゲーションはより安定なDARをもたらし、効力に関して重要なチュブリシンMアセテートに対する保護をもたらすことを示す。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
ヒトグリピカン-3(GPC3)タンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が配列番号1の3つの重鎖相補性決定領域(CDR)および配列番号2の3つの軽鎖CDRを含み、前記CDRがKabatによって定義されるとおりである、抗体。
(項目2)
ヒト化抗体、キメラ抗体またはベニヤ化抗体である、項目1に記載の抗体。
(項目3)
配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する成熟重鎖領域と配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域とを含む、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目4)
配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域と配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域とを含むヒト化抗体である、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目5)
前記成熟重鎖可変領域が配列番号1と少なくとも95%の配列同一性を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号2と少なくとも95%の配列同一性を有する、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目6)
H24がVまたはAによって占められ、H38がQ、RまたはKによって占められ、H48がMまたはIによって占められ、H66がRまたはKによって占められ、H67がVまたはAによって占められ、H69がLによって占められ、H71がAによって占められ、H73がKまたはTによって占められ、H93がGまたはAによって占められ、H94がRによって占められ、および前記軽鎖の以下のアミノ酸残基が存在する:L45がRまたはKによって占められ、L46がLまたはRによって占められ、L105がEまたはVによって占められ、L106がIまたはMによって占められ、付番がKabat付番システムによる、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目7)
以下の可変領域フレームワーク位置が指定されているとおりに占められている:H24がVによって占められ、H38がQによって占められ、H48がMによって占められ、H66がRによって占められ、H67がVによって占められ、H69がLによって占められ、H71がAによって占められ、H73がKによって占められ、H93がGによって占められ、H94がRによって占められ、付番がKabat付番システムによる、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目8)
以下の可変領域フレームワーク位置が指定されているとおりに占められている:L45がRによって占められ、L46がLによって占められ、L105がEによって占められ、L106がIによって占められ;付番がKabat付番システムによる、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目9)
HALA、HALB、HALC、HBLA、HBLB、HBLC、HBLD、HBLE、HBLB-Q、HBLB-V、HCLA、HCLB、HCLC、HDLA、HDLBおよびHDLCである、項目1に記載の抗体。
(項目10)
前記成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合されており、前記成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合されている、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目11)
前記重鎖定常領域が、天然のヒト定常領域に比してFcγ受容体に対する低下した結合を有する前記天然のヒト定常領域の変異体形態である、項目10に記載の抗体。
(項目12)
前記重鎖定常領域がIgG1イソタイプの重鎖定常領域である、項目10に記載の抗体。
(項目13)
前記重鎖定常領域が、配列番号5または配列番号6を含むアミノ酸配列を有し、および前記軽鎖定常領域が配列番号7を含むアミノ酸配列を有する、項目10に記載の抗体。
(項目14)
前記抗体が細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤にコンジュゲートしている、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目15)
前記コンジュゲートした細胞傷害剤がチュブリシンである、項目14に記載の抗体。
(項目16)
前記コンジュゲートした細胞傷害剤が、
の構造を有するコンジュゲートしたチュブリシンであり、
前記コンジュゲートしたチュブリシンが塩形態、特に、薬学的に許容され得る塩形態またはその溶媒和物であり、式中、波線は前記チュブリシンが前記抗体にコンジュゲートしている部位を示し;
R2Aは、-C(=O)R2Bであり、R2Bは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、2-メチル-プロパ-1-イル、2,2-ジメチル-プロパ-1-イルもしくはビニルであり、またはR2Aは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、プロパ-2-エン-1-イルもしくは2-メチル-プロパ-2-エン-1-イルであり;および
R7Bは、-Hまたは-OHである、項目14に記載の抗体。
(項目17)
前記コンジュゲートした細胞傷害剤が、
の構造を有するコンジュゲートしたチュブリシンであり、
前記コンジュゲートしたチュブリシンが塩形態、特に、薬学的に許容され得る塩形態またはその溶媒和物であり、式中、波線は、前記チュブリシンが前記抗体にコンジュゲートしている部位を示す、項目14に記載の抗体。
(項目18)
前記コンジュゲートした細胞傷害剤が、
の構造を有するコンジュゲートしたチュブリシンであり、
前記コンジュゲートしたチュブリシンが塩形態、特に、薬学的に許容され得る塩形態またはその溶媒和物であり、式中、波線は、前記チュブリシンが前記抗体にコンジュゲートしている部位を示す、項目14に記載の抗体。
(項目19)
塩形態、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する抗GPC3抗体-薬物コンジュゲート化合物であって;式中、
Aは、ストレッチャー単位であり;
R2Aは、-C(=O)R2Bであり、R2Bは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、2-メチル-プロパ-1-イル、2,2-ジメチル-プロパ-1-イルもしくはビニルであり、またはR2Aは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、プロパ-2-エン-1-イルもしくは2-メチル-プロパ-2-エン-1-イルであり;
R7Bは、-Hまたは-OHであり;
Abは、項目1~16のいずれか一項に記載された抗体であり;
Sは、前記抗体からの硫黄原子であり;および
下付き文字pは、1~4の整数である、
抗GPC3抗体-薬物コンジュゲート化合物。
(項目20)
前記化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の1つを有する、項目19に記載の抗GPC3抗体-薬物コンジュゲート化合物。
(項目21)
前記化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の1つを有する、項目19に記載の抗GPC3抗体-薬物コンジュゲート化合物。
(項目22)
前記化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の1つを有する、項目19に記載の抗GPC3抗体-薬物コンジュゲート化合物。
(項目23)
Abへの結合がAbの操作されたシステイン残基の硫黄原子を介している、項目19~22のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート化合物。
(項目24)
Abへの結合が、付番のEUインデックスシステムにしたがって、前記重鎖定常領域の239位における硫黄原子または操作されたシステイン残基を介している、項目19~22のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート化合物。
(項目25)
pが2である、項目19~22のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート化合物。
(項目26)
抗体-薬物コンジュゲート組成物であって、塩形態の、特に、薬学的に塩形態のもしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する抗GPC3抗体-薬物コンジュゲート化合物の集団を含み;式中、
Aは、ストレッチャー単位であり;
R2Aは、-C(=O)R2Bであり、R2Bは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、2-メチル-プロパ-1-イル、2,2-ジメチル-プロパ-1-イルもしくはビニルであり、またはR2Aは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、プロパ-2-エン-1-イルもしくは2-メチル-プロパ-2-エン-1-イルであり;
R7Bは、-Hまたは-OHであり;
Abは、項目1に記載された抗体であり;
Sは、前記抗体からの硫黄原子であり;および
下付き文字pは、各抗体薬物コンジュゲート化合物に対して1~4の整数であり;および
前記組成物の平均薬物負荷量が約2であり、
下付き文字pは、1~4の整数であり;
前記組成物の平均薬物負荷量が約2である、抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(項目27)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の1つを有する、項目26に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(項目28)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する、項目26に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(項目29)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の1つを有する、項目26に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(項目30)
Abへの結合がAbの操作されたシステイン残基の硫黄原子を介している、項目26~29のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(項目31)
Abへの結合が、付番のEUインデックスシステムにしたがって、前記重鎖定常領域の239位における硫黄原子または操作されたシステイン残基を介している、項目26~29のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(項目32)
GPC3を発現するがんを有する患者を処置する方法であって、前記項目のいずれか一項に記載の組成物の有効レジメンを前記患者に投与することを含む、方法。
(項目33)
前記がんが、肝細胞癌(HCC)、肺癌、ウィルムス腫瘍(腎芽腫)、卵巣明細胞癌、結腸直腸癌または肉腫である、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記がんがHCCである、項目32に記載の方法。
(項目35)
自己免疫疾患を有する患者を処置する方法であって、項目1~32のいずれか一項に記載の組成物の有効レジメンを前記患者に投与することを含む、方法。
(項目36)
項目1~35のいずれかに記載の抗体と薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
(項目37)
前記3つの重鎖CDRが配列番号10、11および12に記載されているとおりであり、ならびに前記3つの軽鎖CDRが配列番号13、14および15に記載されているとおりである、項目1に記載の抗体。
(項目38)
前記抗体が配列番号10、11および12に記載されているとおりの前記3つの重鎖CDRと、配列番号13、14および15に記載されているとおりの前記3つの軽鎖CDRとを含む、ヒトGPC3タンパク質に特異的に結合する抗体。
(項目39)
配列番号10、11および12に記載されているとおりの前記3つの重鎖CDRと、配列番号13、14および15に記載されているとおりの前記3つの軽鎖CDRとを含む重鎖可変領域をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
(項目40)
配列番号1に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号2に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する成熟重鎖領域を含む、項目39に記載のポリヌクレオチド。
(項目41)
項目39または40に記載のポリヌクレオチドを含む単離されたベクター。
(項目42)
項目41に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
(項目43)
前記宿主細胞がCHO細胞である、項目42に記載の宿主細胞。
(項目44)
抗GPC3抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、
a)前記抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドの発現に適した条件下で項目42に記載の宿主細胞を培養すること、および
b)前記抗体またはその抗原結合断片を単離すること、
を含む、方法。
(項目45)
前記宿主細胞がCHO細胞である、項目44に記載の方法。
(項目46)
抗GPC3抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、
a)前記抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドの発現に適した条件下で項目42に記載の宿主細胞を培養すること、
b)前記抗体またはその抗原結合断片を単離すること、および
c)前記抗体またはその抗原結合断片に細胞傷害剤をコンジュゲートすること、
を含む、方法。
(項目47)
前記宿主細胞がCHO細胞である、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記細胞傷害剤がチュブリシンである、項目46に記載の方法。
(項目49)
GPC3を発現するがんを有する患者を処置する方法であって、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する抗GPC3抗体-薬物コンジュゲート化合物の集団を含む組成物の有効レジメンを前記患者に投与することを含み;式中、
Aは、ストレッチャー単位であり;
R2Aは、-C(=O)R2Bであり、R2Bは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、2-メチル-プロパ-1-イル、2,2-ジメチル-プロパ-1-イルもしくはビニルであり、またはR2Aは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、プロパ-2-エン-1-イルもしくは2-メチル-プロパ-2-エン-1-イルであり;
R7Bは、-Hまたは-OHであり;
Abは、項目1に記載された抗体であり;
Sは、前記抗体からの硫黄原子であり;および
下付き文字pは、各抗体薬物コンジュゲート化合物に対して1~4の整数であり;および
前記組成物の平均薬物負荷量が約2である、方法。
(項目50)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の1つを有する、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する、項目49に記載の方法。
(項目52)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の1つを有する、項目49に記載の方法。
(項目53)
前記がんが、HCC、肺癌、ウィルムス腫瘍(腎芽腫)、卵巣明細胞癌、結腸直腸癌または肉腫である、項目49~52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記がんがHCCである、項目53に記載の方法。
(項目55)
医薬組成物であって、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する抗GPC3抗体-薬物コンジュゲート化合物の集団を含み;式中、
Aは、ストレッチャー単位であり;
R2Aは、-C(=O)R2Bであり、R2Bは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、2-メチル-プロパ-1-イル、2,2-ジメチル-プロパ-1-イルもしくはビニルであり、またはR2Aは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、プロパ-2-エン-1-イルもしくは2-メチル-プロパ-2-エン-1-イルであり;
R7Bは、-Hまたは-OHであり;
Abは、配列番号1の前記3つの重鎖相補性決定領域(CDR)と配列番号2の前記3つの軽鎖CDRとを含む抗体であり、
前記CDRは、Kabatによって定義されているとおりであり、
Sは、前記抗体からの硫黄原子であり;および
下付き文字pは、2である、
医薬組成物。
(項目56)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の1つを有する、項目55に記載の医薬組成物。
(項目57)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する、項目55に記載の医薬組成物。
(項目58)
抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の1つを有する、項目55に記載の医薬組成物。
(項目59)
医薬組成物であって、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する抗GPC3抗体-薬物コンジュゲート化合物の集団を含み;式中、
Abは、配列番号:1の前記3つの重鎖相補性決定領域(CDR)と配列番号:2の前記3つの軽鎖CDRとを含む抗体であり、
前記CDRは、Kabatによって定義されているとおりであり、
Sは、前記抗体からの硫黄原子であり;および
下付き文字pは、2である、
医薬組成物。
チュブリシンMの脱アセチル化は、その効力を著しく減少させる。S239CにコンジュゲートしたDAR2ADCとして、h00ecSGD-6859またはh00ecSGD-5937を調製した。天然のシステインにコンジュゲートした混合された平均DAR4のADCとして、h00SGD-6859またはh00SGD-5937を調製した。3mg/kgのADCの1つを、SCIDマウスの腹腔内に投与した。PLRP-MSによって、投与から0日、4日および10日後に、マレイミド安定性およびチュブリシンMアセテート安定性を評価した。天然のシステインにコンジュゲートしたSGD-6859およびSGD-5937の両方は、S239Cへのコンジュゲーションと比較すると、増加したマレイミドおよびチュブリシンM不安定性を示した(図13)。このデータは、S239Cへのコンジュゲーションはより安定なDARをもたらし、効力に関して重要なチュブリシンMアセテートに対する保護をもたらすことを示す。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
ヒトグリピカン-3(GPC3)タンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が配列番号1の3つの重鎖相補性決定領域(CDR)および配列番号2の3つの軽鎖CDRを含み、前記CDRがKabatによって定義されるとおりである、抗体。
(項目2)
ヒト化抗体、キメラ抗体またはベニヤ化抗体である、項目1に記載の抗体。
(項目3)
配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する成熟重鎖領域と配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域とを含む、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目4)
配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域と配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域とを含むヒト化抗体である、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目5)
前記成熟重鎖可変領域が配列番号1と少なくとも95%の配列同一性を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号2と少なくとも95%の配列同一性を有する、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目6)
H24がVまたはAによって占められ、H38がQ、RまたはKによって占められ、H48がMまたはIによって占められ、H66がRまたはKによって占められ、H67がVまたはAによって占められ、H69がLによって占められ、H71がAによって占められ、H73がKまたはTによって占められ、H93がGまたはAによって占められ、H94がRによって占められ、および前記軽鎖の以下のアミノ酸残基が存在する:L45がRまたはKによって占められ、L46がLまたはRによって占められ、L105がEまたはVによって占められ、L106がIまたはMによって占められ、付番がKabat付番システムによる、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目7)
以下の可変領域フレームワーク位置が指定されているとおりに占められている:H24がVによって占められ、H38がQによって占められ、H48がMによって占められ、H66がRによって占められ、H67がVによって占められ、H69がLによって占められ、H71がAによって占められ、H73がKによって占められ、H93がGによって占められ、H94がRによって占められ、付番がKabat付番システムによる、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目8)
以下の可変領域フレームワーク位置が指定されているとおりに占められている:L45がRによって占められ、L46がLによって占められ、L105がEによって占められ、L106がIによって占められ;付番がKabat付番システムによる、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目9)
HALA、HALB、HALC、HBLA、HBLB、HBLC、HBLD、HBLE、HBLB-Q、HBLB-V、HCLA、HCLB、HCLC、HDLA、HDLBおよびHDLCである、項目1に記載の抗体。
(項目10)
前記成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合されており、前記成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合されている、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目11)
前記重鎖定常領域が、天然のヒト定常領域に比してFcγ受容体に対する低下した結合を有する前記天然のヒト定常領域の変異体形態である、項目10に記載の抗体。
(項目12)
前記重鎖定常領域がIgG1イソタイプの重鎖定常領域である、項目10に記載の抗体。
(項目13)
前記重鎖定常領域が、配列番号5または配列番号6を含むアミノ酸配列を有し、および前記軽鎖定常領域が配列番号7を含むアミノ酸配列を有する、項目10に記載の抗体。
(項目14)
前記抗体が細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤にコンジュゲートしている、前記項目のいずれか一項に記載の抗体。
(項目15)
前記コンジュゲートした細胞傷害剤がチュブリシンである、項目14に記載の抗体。
(項目16)
前記コンジュゲートした細胞傷害剤が、
前記コンジュゲートしたチュブリシンが塩形態、特に、薬学的に許容され得る塩形態またはその溶媒和物であり、式中、波線は前記チュブリシンが前記抗体にコンジュゲートしている部位を示し;
R2Aは、-C(=O)R2Bであり、R2Bは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、2-メチル-プロパ-1-イル、2,2-ジメチル-プロパ-1-イルもしくはビニルであり、またはR2Aは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、プロパ-2-エン-1-イルもしくは2-メチル-プロパ-2-エン-1-イルであり;および
R7Bは、-Hまたは-OHである、項目14に記載の抗体。
(項目17)
前記コンジュゲートした細胞傷害剤が、
前記コンジュゲートしたチュブリシンが塩形態、特に、薬学的に許容され得る塩形態またはその溶媒和物であり、式中、波線は、前記チュブリシンが前記抗体にコンジュゲートしている部位を示す、項目14に記載の抗体。
(項目18)
前記コンジュゲートした細胞傷害剤が、
前記コンジュゲートしたチュブリシンが塩形態、特に、薬学的に許容され得る塩形態またはその溶媒和物であり、式中、波線は、前記チュブリシンが前記抗体にコンジュゲートしている部位を示す、項目14に記載の抗体。
(項目19)
塩形態、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式
Aは、ストレッチャー単位であり;
R2Aは、-C(=O)R2Bであり、R2Bは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、2-メチル-プロパ-1-イル、2,2-ジメチル-プロパ-1-イルもしくはビニルであり、またはR2Aは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、プロパ-2-エン-1-イルもしくは2-メチル-プロパ-2-エン-1-イルであり;
R7Bは、-Hまたは-OHであり;
Abは、項目1~16のいずれか一項に記載された抗体であり;
Sは、前記抗体からの硫黄原子であり;および
下付き文字pは、1~4の整数である、
抗GPC3抗体-薬物コンジュゲート化合物。
(項目20)
前記化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
(項目21)
前記化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
(項目22)
前記化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
(項目23)
Abへの結合がAbの操作されたシステイン残基の硫黄原子を介している、項目19~22のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート化合物。
(項目24)
Abへの結合が、付番のEUインデックスシステムにしたがって、前記重鎖定常領域の239位における硫黄原子または操作されたシステイン残基を介している、項目19~22のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート化合物。
(項目25)
pが2である、項目19~22のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート化合物。
(項目26)
抗体-薬物コンジュゲート組成物であって、塩形態の、特に、薬学的に塩形態のもしくはその溶媒和物の式:
Aは、ストレッチャー単位であり;
R2Aは、-C(=O)R2Bであり、R2Bは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、2-メチル-プロパ-1-イル、2,2-ジメチル-プロパ-1-イルもしくはビニルであり、またはR2Aは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、プロパ-2-エン-1-イルもしくは2-メチル-プロパ-2-エン-1-イルであり;
R7Bは、-Hまたは-OHであり;
Abは、項目1に記載された抗体であり;
Sは、前記抗体からの硫黄原子であり;および
下付き文字pは、各抗体薬物コンジュゲート化合物に対して1~4の整数であり;および
前記組成物の平均薬物負荷量が約2であり、
下付き文字pは、1~4の整数であり;
前記組成物の平均薬物負荷量が約2である、抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(項目27)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
(項目28)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
(項目29)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
(項目30)
Abへの結合がAbの操作されたシステイン残基の硫黄原子を介している、項目26~29のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(項目31)
Abへの結合が、付番のEUインデックスシステムにしたがって、前記重鎖定常領域の239位における硫黄原子または操作されたシステイン残基を介している、項目26~29のいずれか一項に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(項目32)
GPC3を発現するがんを有する患者を処置する方法であって、前記項目のいずれか一項に記載の組成物の有効レジメンを前記患者に投与することを含む、方法。
(項目33)
前記がんが、肝細胞癌(HCC)、肺癌、ウィルムス腫瘍(腎芽腫)、卵巣明細胞癌、結腸直腸癌または肉腫である、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記がんがHCCである、項目32に記載の方法。
(項目35)
自己免疫疾患を有する患者を処置する方法であって、項目1~32のいずれか一項に記載の組成物の有効レジメンを前記患者に投与することを含む、方法。
(項目36)
項目1~35のいずれかに記載の抗体と薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
(項目37)
前記3つの重鎖CDRが配列番号10、11および12に記載されているとおりであり、ならびに前記3つの軽鎖CDRが配列番号13、14および15に記載されているとおりである、項目1に記載の抗体。
(項目38)
前記抗体が配列番号10、11および12に記載されているとおりの前記3つの重鎖CDRと、配列番号13、14および15に記載されているとおりの前記3つの軽鎖CDRとを含む、ヒトGPC3タンパク質に特異的に結合する抗体。
(項目39)
配列番号10、11および12に記載されているとおりの前記3つの重鎖CDRと、配列番号13、14および15に記載されているとおりの前記3つの軽鎖CDRとを含む重鎖可変領域をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
(項目40)
配列番号1に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号2に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する成熟重鎖領域を含む、項目39に記載のポリヌクレオチド。
(項目41)
項目39または40に記載のポリヌクレオチドを含む単離されたベクター。
(項目42)
項目41に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
(項目43)
前記宿主細胞がCHO細胞である、項目42に記載の宿主細胞。
(項目44)
抗GPC3抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、
a)前記抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドの発現に適した条件下で項目42に記載の宿主細胞を培養すること、および
b)前記抗体またはその抗原結合断片を単離すること、
を含む、方法。
(項目45)
前記宿主細胞がCHO細胞である、項目44に記載の方法。
(項目46)
抗GPC3抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、
a)前記抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドの発現に適した条件下で項目42に記載の宿主細胞を培養すること、
b)前記抗体またはその抗原結合断片を単離すること、および
c)前記抗体またはその抗原結合断片に細胞傷害剤をコンジュゲートすること、
を含む、方法。
(項目47)
前記宿主細胞がCHO細胞である、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記細胞傷害剤がチュブリシンである、項目46に記載の方法。
(項目49)
GPC3を発現するがんを有する患者を処置する方法であって、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
Aは、ストレッチャー単位であり;
R2Aは、-C(=O)R2Bであり、R2Bは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、2-メチル-プロパ-1-イル、2,2-ジメチル-プロパ-1-イルもしくはビニルであり、またはR2Aは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、プロパ-2-エン-1-イルもしくは2-メチル-プロパ-2-エン-1-イルであり;
R7Bは、-Hまたは-OHであり;
Abは、項目1に記載された抗体であり;
Sは、前記抗体からの硫黄原子であり;および
下付き文字pは、各抗体薬物コンジュゲート化合物に対して1~4の整数であり;および
前記組成物の平均薬物負荷量が約2である、方法。
(項目50)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
(項目51)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
(項目52)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
(項目53)
前記がんが、HCC、肺癌、ウィルムス腫瘍(腎芽腫)、卵巣明細胞癌、結腸直腸癌または肉腫である、項目49~52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記がんがHCCである、項目53に記載の方法。
(項目55)
医薬組成物であって、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
Aは、ストレッチャー単位であり;
R2Aは、-C(=O)R2Bであり、R2Bは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、2-メチル-プロパ-1-イル、2,2-ジメチル-プロパ-1-イルもしくはビニルであり、またはR2Aは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、プロパ-2-エン-1-イルもしくは2-メチル-プロパ-2-エン-1-イルであり;
R7Bは、-Hまたは-OHであり;
Abは、配列番号1の前記3つの重鎖相補性決定領域(CDR)と配列番号2の前記3つの軽鎖CDRとを含む抗体であり、
前記CDRは、Kabatによって定義されているとおりであり、
Sは、前記抗体からの硫黄原子であり;および
下付き文字pは、2である、
医薬組成物。
(項目56)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
(項目57)
前記抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
(項目58)
抗体-薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
(項目59)
医薬組成物であって、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式:
Abは、配列番号:1の前記3つの重鎖相補性決定領域(CDR)と配列番号:2の前記3つの軽鎖CDRとを含む抗体であり、
前記CDRは、Kabatによって定義されているとおりであり、
Sは、前記抗体からの硫黄原子であり;および
下付き文字pは、2である、
医薬組成物。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
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