JP2023089005A - がん免疫療法のためのcrispr-cpf1関連方法、組成物および構成要素 - Google Patents
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Abstract
【課題】がん治療において、修飾T細胞の養子免疫伝達有効性を改善する方法を提供する。【解決手段】T細胞の増殖、生存、および/または機能に影響するT細胞発現遺伝子の発現を修飾することによって修飾T細胞の養子免疫伝達有効性を改善する方法を開示する。そのための、また、がんを治療するためのCRISPR/Cpf1関連組成物および方法を開示する。【選択図】図1
Description
優先権の主張
本出願は、その内容の全体が本明細書に参照により援用される、2016年3月4日に出願された米国仮特許出願第62/304,057号明細書の優先権を主張する。
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配列表
本明細書は、配列表(「0841770140Sseqlist.txt」と命名された.txtファイルとして、2017年3月3日に電子的に提出された)を参照する。.txtファイルは2017年3月2日に作成されて、サイズは721,000バイトである。配列表の内容全体は、本明細書に参照により援用される。
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本発明は、CRISPR/Cpf1関連方法、標的核酸配列を編集するための組成物および構成要素、または標的核酸配列の発現調節、および遺伝子操作T細胞またはT細胞前駆体の養子免疫伝達を含むがん免疫療法に関連したそれらの用途に関する。
遺伝子操作T細胞の養子免疫伝達は、治療法としての臨床用試験段階に入った。典型的に、アプローチは、1)アフェレーシス療法によって対象から白血球を得るステップと;2)T細胞を選択/富化するステップと;3)サイトカイン処理によってT細胞を活性化するステップと;4)レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入または電気穿孔によって、クローン化T細胞受容体(TCR)遺伝子またはキメラ抗原受容体(CAR)遺伝子を導入するステップと;5)サイトカイン処理によってT細胞を増殖させるステップと;6)通常はリンパ枯渇によって対象を馴化させるステップと;7)遺伝子操作T細胞を対象に輸液するステップとからなる。
クローン化TCR遺伝子(TRACおよびTRBC)起源としては、特定の悪性腫瘍がある個人から単離された稀なT細胞集団と、特定の腫瘍抗原または腫瘍細胞で免疫化されたT細胞受容体-ヒト化マウスから単離された、T細胞クローンとが挙げられる。養子免疫伝達に続いて、TCR遺伝子操作T細胞は、腫瘍細胞表面の主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質によって提示される、それらの同族の抗原ペプチドを認識する。抗原結合は、シグナルトランスダクション経路を刺激して、T細胞活性化および増殖をもたらす。次に、刺激されたT細胞は、典型的に、グランザイムB、パーフォリン、およびグラニュリシンを含む分泌複合体を伴う細胞毒性抗腫瘍細胞応答を開始して、腫瘍細胞アポトーシスを誘導する。
キメラ抗原受容体(CAR)遺伝子は、典型的に、モノクローナル抗体の一本鎖抗体変数断片(scFv)ドメインに由来して、ヒンジおよび膜貫通ドメインを通じて細胞質内エフェクタードメインに融合する、細胞外腫瘍抗原結合ドメインを含む、人工T細胞受容体をコードする。エフェクタードメインは、典型的に、T細胞共受容体複合体のCD3-ζ鎖に由来して、CD28および/またはCD137受容体タンパク質に由来するドメインもまた含み得る。CAR細胞外ドメインは、TCR遺伝子操作T細胞について記載されるように、MHC非依存性様式で腫瘍抗原に結合して、細胞毒性抗腫瘍作用に至るT細胞の活性化および増殖をもたらす。
これまでのところ、少なくとも15種の異なる腫瘍抗原が、遺伝子操作T細胞の臨床試験で標的化されている。いくつかの試験では、抗腫瘍活性が報告されている。最大の成功は、血液悪性腫瘍で得られている。例えば、B細胞抗原であるCD19を標的化するように遺伝子操作されたCAR-T細胞の養子免疫伝達は、リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、およびB細胞急性リンパ球性白血病がある対象において、複数の部分的および完全寛解をもたらした。対照的に、その他の腫瘍型、特に腎細胞がん、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、メラノーマ、肉腫、および前立腺がんをはじめとする固形腫瘍を標的化する試験は、あまり成功していない。これらの試験の多くでは、非常に少数の患者が客観的応答を経験した。
本開示の主題の要約
本明細書中で開示される方法および組成物は、遺伝子操作されたT細胞またはT細胞前駆体の、対象への投与を含む免疫療法アプローチを用いたがん治療を実現する。がんに罹患している対象を治療するアプローチは、対象からT細胞を単離して、これを、がん細胞によって発現される抗原を標的化するように遺伝的に修飾してから、対象中に再導入する、養子T細胞移入と呼ばれるプロセスである。T細胞を遺伝的に修飾する方法は、特定のがん抗原を特異的に認識する膜貫通T細胞受容体(TCR)またはキメラ抗原受容体(CAR)タンパク質をそれぞれコードするTCRまたはCAR遺伝子の導入を含む。特定の実施形態では、腫瘍が発現する抗原の、TCRまたはCARタンパク質の抗原結合ドメインとの結合が、シグナル伝達カスケードを開始して、T細胞の活性化、増殖、そして最終的には、細胞毒性免疫応答を介したがん細胞の破壊をもたらす(Kershaw et al.,2013 NatRevCancer 13,525-541)。
本明細書中で開示される方法および組成物は、遺伝子操作されたT細胞またはT細胞前駆体の、対象への投与を含む免疫療法アプローチを用いたがん治療を実現する。がんに罹患している対象を治療するアプローチは、対象からT細胞を単離して、これを、がん細胞によって発現される抗原を標的化するように遺伝的に修飾してから、対象中に再導入する、養子T細胞移入と呼ばれるプロセスである。T細胞を遺伝的に修飾する方法は、特定のがん抗原を特異的に認識する膜貫通T細胞受容体(TCR)またはキメラ抗原受容体(CAR)タンパク質をそれぞれコードするTCRまたはCAR遺伝子の導入を含む。特定の実施形態では、腫瘍が発現する抗原の、TCRまたはCARタンパク質の抗原結合ドメインとの結合が、シグナル伝達カスケードを開始して、T細胞の活性化、増殖、そして最終的には、細胞毒性免疫応答を介したがん細胞の破壊をもたらす(Kershaw et al.,2013 NatRevCancer 13,525-541)。
遺伝子修飾されたT細胞を利用する養子T細胞移入は、固形悪性腫瘍および血液悪性腫瘍の治療薬として、臨床試験段階に入っている。これまでの結果は入り交じっている。血液悪性腫瘍(とりわけリンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、および急性リンパ球性白血病(ALL))では、いくつかの第1相および第2相試験において、患者の大部分が、少なくとも部分奏効を示し、一部の患者は完全奏効を示した(Kochenderfer,J.N.et al.,2012 Blood 119,2709-2720)。しかし、(メラノーマ、腎細胞がん、および結腸直腸がんをはじめとする)大多数の腫瘍型では、より少ない応答が観察されている(Johnson,L.A.et al.,2009 Blood 114,535-546;Lamers,C.H.et al.,2013 Mol.Ther.21,904-912;Warren,R.S.et al.,1998 Cancer Gene Ther.5,S1-S2)。したがって、がん治療において、修飾T細胞の養子免疫伝達有効性を改善する必要性が存在する。
遺伝子修飾されたT細胞のがん治療薬としての有効性を制限する要因としては、(1)例えば、養子免疫伝達に続くT細胞の限定的増殖などのT細胞増殖;(2)例えば、腫瘍環境内因子によるT細胞アポトーシス誘導などのT細胞生存;および(3)例えば、宿主免疫細胞およびがん細胞によって分泌される阻害因子による、細胞毒性T細胞機能の阻害などのT細胞機能が挙げられる。本明細書中で開示される方法および組成物は、これらの制限の1つまたは複数に、T細胞の増殖、生存、および/または機能に影響するT細胞発現遺伝子の発現を修飾することによって、対処する。
特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、(例えば、T細胞の増殖を阻害する遺伝子を不活性化することによって)T細胞の増殖に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、(例えば、T細胞アポトーシスを媒介する遺伝子を不活性化することによって)T細胞の生存に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、(例えば、免疫抑制シグナル伝達因子および阻害(例えばアネルギー誘導)シグナル伝達因子をコードする遺伝子を不活性化することによって)T細胞の機能に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、T細胞の持続性を向上させるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、がん治療薬として、遺伝子修飾されたT細胞の有効性、例えば、T細胞増殖、T細胞生存、T細胞機能、T細胞持続性、またはそれらのあらゆる組み合わせを制限する因子の1つまたは複数に影響を与えるのに個々に、または組み合わせて利用され得る。
本明細書中で開示される方法および組成物は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、1つまたは複数のFAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子を改変することによって、T細胞の増殖、生存、持続性、および/または機能に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、CBLBおよび/またはPTPN6遺伝子を改変することによって、T細胞の増殖に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FASおよび/またはBID遺伝子を改変することによって、T細胞の生存に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、CTLA4、PDCD1、TRAC、および/またはTRBC遺伝子を改変することによって、T細胞の機能に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、B2M遺伝子を改変することによって、T細胞の持続性を向上させるのに用いられ得る。
特定の実施形態では、以下に限定されないがFAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子が挙げられる1つまたは複数のT細胞発現遺伝子が、標的ノックアウトとして独立して標的化されて、例えば、T細胞の増殖、生存、持続性、および/または機能に影響する。特定の実施形態では、本開示の方法は、1つのT細胞発現遺伝子(例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される1つ)をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、2つのT細胞発現遺伝子(例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される2つ)を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、3つのT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される3つを独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、4つのT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される4つを独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、5つのT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される5つを独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、6つのT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される6つを独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、7つのT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される7つを独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、8つのT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子のそれぞれを独立してノックアウトすることを含む。
操作されたT細胞の有効性に影響を与えるのに、先に記載される遺伝子に加えて、いくつかの他のT細胞発現遺伝子が標的化されてもよい。当該遺伝子として、以下に限定されないが、TGFBRI、TGFBRII、およびTGFBRIIIが挙げられる(Kershaw et al.2013 NatRevCancer 13,525-541)。特定の実施形態では、TGFBRI、TGFBRII、およびTGFBRIII遺伝子の1つまたは複数が、本明細書中で開示される方法を用いて、個々に、または組み合わせて改変され得る。特定の実施形態では、TGFBRI、TGFBRII、およびTGFBRIII遺伝子の1つまたは複数が、本開示の方法を用いて、個々に、または先に記載される8つの遺伝子(すなわち、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子)のいずれか1つもしくは複数と組み合わせて、改変され得る。
特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、遺伝子の位置(例えばノックアウト位置)、例えば、非コード領域(例えばプロモーター領域)内の位置もしくはコード領域内の位置を標的化することによって、または遺伝子の転写配列、例えばイントロン配列もしくはエキソン配列を標的化することによって、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子を改変する。特定の実施形態では、遺伝子(例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子)のコード配列、例えばコード領域、例えば初期コード領域が、発現の改変またはノックアウトのために標的化される。特定の実施形態では、T細胞発現遺伝子(例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子)の非コード領域(例えばプロモーター領域)中の位置が、T細胞発現遺伝子の発現の改変およびノックアウトのために標的化される。
特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、遺伝子のコード配列を標的化することによって、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子を改変する。特定の実施形態では、コード配列は、初期コード配列である。特定の実施形態では、遺伝子のコード配列は、T細胞発現遺伝子の発現のノックアウトのために標的化される。
特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、遺伝子の非コード配列を標的化することによって、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子を改変する。特定の実施形態では、非コード配列は、プロモーター領域内の配列、エンハンサー配列、イントロン配列、3’UTR内の配列、ポリアデニル化シグナル配列、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、遺伝子の非コード配列は、遺伝子の発現のノックアウトのために標的化される。
特定の実施形態では、本開示の方法は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の1つまたは2つの対立遺伝子を、例えば、当該遺伝子中で改変を誘導することによって、ノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、改変は、挿入、欠失、突然変異、またはそれらの組み合わせを含む。
特定の実施形態では、標的ノックアウトアプローチは、Cpf1酵素を含むCRISPR/Cpf1システムを用いる非相同末端結合(NHEJ)によって媒介される。
「T細胞標的FASノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、NHEJ媒介改変によって改変されると、機能性FAS遺伝子産物発現の低下または排除(例えば、機能性FAS遺伝子産物発現のノックアウト)がもたらされる、FAS遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、FAS遺伝子のコード領域、例えば、初期コード領域にある。
「T細胞標的BIDノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、NHEJ媒介改変によって改変されると、機能性BID遺伝子産物発現の低下または排除(例えば、機能性BID遺伝子産物発現のノックアウト)がもたらされる、BID遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのBID遺伝子のコード領域にある。
「T細胞標的CTLA4ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、NHEJ媒介改変によって改変されると、機能性CTLA4遺伝子産物発現の低下または排除(例えば、機能性CTLA4遺伝子産物発現のノックアウト)がもたらされる、CTLA4遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのCTLA遺伝子のコード領域にある。
「T細胞標的PDCD1ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、NHEJ媒介改変によって改変されると、機能性PDCD1遺伝子産物発現の低下または排除(例えば、機能性PDCD1遺伝子産物発現のノックアウト)がもたらされる、PDCD1遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、PDCD1遺伝子コード領域、例えば、初期コード領域にある。
「T細胞標的CBLBノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、NHEJ媒介改変によって改変されると、機能性CBLB遺伝子産物発現の低下または排除(例えば、機能性CBLB遺伝子産物発現のノックアウト)がもたらされる、CBLB遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのCBLB遺伝子のコード領域にある。
「T細胞標的PTPN6ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、NHEJ媒介改変によって改変されると、機能性PTPN6遺伝子産物発現の低下または排除(例えば、機能性PTPN6遺伝子産物発現のノックアウト)がもたらされる、PTPN6遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのPTPN6遺伝子のコード領域にある。
「T細胞標的B2Mノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、NHEJ媒介改変によって改変されるならば、機能性B2M遺伝子産物発現の低下または排除(例えば、機能性B2M遺伝子産物発現のノックアウト)がもたらされる、B2M遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、当該位置は、B2M遺伝子のコード領域、例えば、初期コード領域にある。
「T細胞標的TRACノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、NHEJ媒介改変によって改変されると、機能性TRAC遺伝子産物発現の低下または排除(例えば、機能性TRAC遺伝子産物発現のノックアウト)がもたらされる、TRAC遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのTRAC遺伝子のコード領域にある。
「T細胞標的TRBCノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、NHEJ媒介改変によって改変されると、機能性TRBC遺伝子産物発現の低下または排除(例えば、機能性TRBC遺伝子産物発現のノックアウト)がもたらされる、TRBC遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのTRBC遺伝子のコード領域にある。
「T細胞標的FAS位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるT細胞標的FASノックアウト位置を指す。
「T細胞標的BID位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるT細胞標的BIDノックアウト位置を指す。
「T細胞標的CTLA4位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるT細胞標的CTLA4ノックアウト位置を指す。
「T細胞標的PDCD1位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるT細胞標的PDCD1ノックアウト位置を指す。
「T細胞標的CBLB位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるT細胞標的CBLBノックアウト位置を指す。
「T細胞標的PTPN6位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるT細胞標的PTPN6ノックアウト位置を指す。
「T細胞標的B2M位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるT細胞標的B2Mノックアウト位置を指す。
「T細胞標的TRAC位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるT細胞標的TRACノックアウト位置を指す。
「T細胞標的TRBC位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるT細胞標的TRBCノックアウト位置を指す。
「T細胞標的ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、T細胞標的FASノックアウト位置、T細胞標的BIDノックアウト位置、T細胞標的CTLA4ノックアウト位置、T細胞標的PDCD1ノックアウト位置、T細胞標的CBLBノックアウト位置、T細胞標的PTPN6ノックアウト位置、T細胞標的B2Mノックアウト位置、T細胞標的TRACノックアウト位置、またはT細胞標的TRBCノックアウト位置のいずれかを指す。
「T細胞標的位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるT細胞標的ノックアウト位置を指す。
一態様において、本明細書中で開示されるのは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される1つのT細胞発現遺伝子の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含むgRNA分子、例えば、単離された、または天然に存在しないgRNA分子である。
特定の実施形態では、gRNA分子の標的化ドメインは、改変、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的位置(例えばT細胞標的ノックアウト位置)の、NHEJに関連する改変を可能にするほど、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的位置(例えばT細胞標的ノックアウト位置)に十分に近い切断事象、例えば二本鎖切断を実現するように構成される。特定の実施形態では、標的化ドメインは、切断事象、例えば二本鎖切断が、T細胞標的位置(例えばT細胞標的ノックアウト位置)の1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、または500ヌクレオチド以内に位置するように構成される。二本鎖切断は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞ノックアウト標的位置(例えばT細胞標的ノックアウト位置)の上流に位置しても、下流に位置してもよい。
特定の実施形態では、第2の標的化ドメインを含む第2のgRNA分子が、改変、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的位置の、NHEJに関連する改変を可能にするほど、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的位置に十分に近い切断事象、例えば二本鎖切断を、単独で、または第1のgRNA分子によって配置される切断と組み合わせて実現するように構成される。特定の実施形態では、第1および第2のgRNA分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、gRNA分子のそれぞれについて独立して、標的位置の1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、または500ヌクレオチド以内に配置されるように構成される。特定の実施形態では、2セットの二本鎖切断は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的位置(例えば、T細胞標的ノックアウト位置)のヌクレオチドの両側に配置される。特定の実施形態では、2セットの二本鎖切断は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的位置(例えば、T細胞標的ノックアウト位置)のヌクレオチドの片側、例えば、上流または下流に配置される。特定の実施形態では、二本鎖切断は、以下で考察されるように、第2のgRNA分子によって配置される追加の二本鎖切断を伴ってよい。例えば、第1のgRNA分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的位置の上流に、例えば標的位置の1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、または500ヌクレオチド以内に配置されるように構成され;そして第2のgRNA分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的位置の下流に、例えば標的位置の1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、または500ヌクレオチド以内に配置されるように構成される。
特定の実施形態では、2つ以上のgRNAが、標的核酸中に2つ以上の切断事象、例えば、2セットの二本鎖切断を配置するのに用いられる場合、2つ以上の切断事象は、同じ、または異なるCpf1タンパク質によってもたらされる。特定の実施形態では、2つのgRNAが、標的核酸中に2セットの二本鎖切断を配置するのに用いられる場合、単一のCpf1ヌクレアーゼが、双方の二本鎖切断を生じさせるのに用いられる。特定の実施形態では、2つ以上のCpf1タンパク質が用いられる場合、Cpf1タンパク質は異なる種に由来する。
複数のT細胞発現遺伝子が、改変のために細胞中で標的化される場合、標的核酸は、1つまたは複数のCpf1タンパク質によって改変、例えば切断され得る。例えば、2つの遺伝子が改変のために標的化されるならば、例えば、双方のT細胞発現遺伝子がノックアウトのために標的化されるならば、同じ、または異なるCpf1タンパク質が、各遺伝子を標的化するのに用いられ得る。特定の実施形態では、双方のT細胞発現遺伝子(または、細胞中の標的化される各遺伝子)が、Cpf1ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。特定の実施形態では、双方のT細胞発現遺伝子(または、細胞中の標的化される各遺伝子)が、Cpf1分子によって切断されて、二本鎖切断が生じる。特定の実施形態では、細胞中の1つまたは複数のT細胞発現遺伝子が、Cpf1ヌクレアーゼによる切断によって改変され得る。2つ以上のCpf1タンパク質が、細胞中の標的核酸、例えば異なる遺伝子を切断するのに用いられる場合、Cpf1タンパク質は、様々な細菌種に由来してよい。例えば、細胞中の1つまたは複数のT細胞発現遺伝子が、1つの細菌種由来のCpf1タンパク質による切断によって改変されてよいし、同じ細胞中の1つまたは複数のT細胞発現遺伝子が、異なる細菌種由来のCpf1タンパク質による切断によって改変されてよい。特定の実施形態では、様々な種由来の2つ以上のCpf1タンパク質が用いられる場合、これらは、標的核酸中の所望の位置の所望の遺伝子における切断特異性を制御するように、同時に送達されてもよいし、順次送達されてもよい。
特定の実施形態では、第1のgRNA分子の標的化ドメインおよび第2のgRNA分子の標的化ドメインは、標的核酸分子の反対側の鎖と相補的である。特定の実施形態では、gRNA分子および第2のgRNA分子は、PAMが外側を向くように構成される。
特定の実施形態では、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子のコード領域、例えば初期コード領域中の位置が、例えばノックアウトのために、標的化される。特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号1~3707から選択されるヌクレオチド配列と同一の配列、またはこれらとは1以下、2以下、3以下、4以下、もしくは5以下のヌクレオチドが異なる配列を含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号1~3707から選択されるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、T細胞標的ノックアウト位置がFASコード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のgRNAが、標的核酸配列において切断、例えば2つの二本鎖切断を配置するのに、例えば1つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドRNAは、配列番号2326~3094から独立して選択される。
特定の実施形態では、T細胞標的ノックアウト位置がBIDコード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のgRNAが、標的核酸配列において切断、例えば2つの二本鎖切断を配置するのに、例えば1つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドRNAは、配列番号3284~3385から独立して選択される。
特定の実施形態では、T細胞標的ノックアウト位置がCTLA4コード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のgRNAが、標的核酸配列において切断、例えば2つの二本鎖切断を配置するのに、例えば1つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドRNAは、配列番号64~370から独立して選択される。
特定の実施形態では、T細胞標的ノックアウト位置がPDCD1コード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のgRNAが、標的核酸配列において切断、例えば2つの二本鎖切断を配置するのに、例えば1つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドRNAは、配列番号1~63から独立して選択される。
特定の実施形態では、T細胞標的ノックアウト位置がCBLBコード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のgRNAが、標的核酸配列において切断、例えば2つの二本鎖切断を配置するのに、例えば1つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドRNAは、配列番号504~2325から独立して選択される。
特定の実施形態では、T細胞標的ノックアウト位置がPTPN6コード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のgRNAが、標的核酸配列において切断、例えば2つの二本鎖切断を配置するのに、例えば1つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドRNAは、配列番号371~503から独立して選択される。
特定の実施形態では、T細胞標的ノックアウト位置がB2Mコード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のgRNAが、標的核酸配列において切断、例えば2つの二本鎖切断を配置するのに、例えば1つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドRNAは、配列番号3095~3283から独立して選択される。
特定の実施形態では、T細胞標的ノックアウト位置がTRACコード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のgRNAが、標的核酸配列において切断、例えば2つの二本鎖切断を配置するのに、例えば1つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドRNAは、配列番号3386~3588から独立して選択される。
特定の実施形態では、T細胞標的ノックアウト位置がTRBCコード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のgRNAが、標的核酸配列において切断、例えば2つの二本鎖切断を配置するのに、例えば1つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドRNAは、配列番号3589~3707から独立して選択される。
特定の実施形態では、gRNAはさらに、直接反復ドメインを含む。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、15~20ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、配列番号3708~3710からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、gRNA分子は、ユニモジュラー(「単分子」とも呼ばれる)gRNAである。特定の実施形態では、標的化ドメインは、15~25ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、18ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、19ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、20ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、21ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、22ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、23ヌクレオチド長である。
切断事象、例えば二本鎖切断は、Cpf1分子によって生成される。特定の実施形態では、Cpf1分子は、二本鎖切断を触媒する。
加えて、本開示の主題は、(a)先に記載されるような第1のgRNA分子をコードする第1のヌクレオチド配列を含む核酸組成物、例えば、単離された、または天然に存在しない核酸組成物、例えばDNA組成物を提供する。特定の実施形態では、核酸組成物はさらに、(b)Cpf1分子をコードする第2のヌクレオチド配列を含む。Cpf1分子は、標的核酸中に二本鎖切断を形成し得る。特定の実施形態では、Cpf1分子は、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種BV3L6株Cpf1分子(AsCpf1)、ラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)ND2006 Cpf1分子(LbCpf1)、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)MA2020(Lb2Cpf1)からなる群から選択される。特定の実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、配列番号3722、配列番号3723、または配列番号3724で示される。
特定の実施形態では、核酸組成物はさらに、(c)FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される1つのT細胞発現遺伝子の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む第2のgRNA分子をコードする第3のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、第2のgRNAは、第1のgRNA分子と同じT細胞標的位置を標的化する。
特定の実施形態では、(a)および(b)は、1つの核酸分子、例えば1つのベクター、例えば1つのウイルスベクター、例えばAAVベクター上に存在する。記載される組成物および方法のいずれかで使用されてもよい代表的AAVベクターとしては、AAV1ベクター、修飾AAV1ベクター、AAV2ベクター、修飾AAV2ベクター、AAV3ベクター、AAV4ベクター、修飾AAV4ベクター、AAV5ベクター、修飾AAV5ベクター、修飾AAV3ベクター、AAV6ベクター、修飾AAV6ベクター、AAV7ベクター、修飾AAV7ベクター、AAV8ベクター、AAV9ベクター、AAV.rh10ベクター、修飾AAV.rh10ベクター、AAV.rh32/33ベクター、修飾AAV.rh32/33ベクター、AAV.rh43ベクター、修飾AAV.rh43ベクター、aAAV.rh64R1ベクター、および修飾AAV.rh64R1ベクターが挙げられる。特定の実施形態では、(a)は、例えば第1のベクター、例えば第1のウイルスベクター、例えば第1のAAVベクターなどの第1の核酸分子上に存在し;(b)は、例えば第2のベクター、例えば第2のベクター、例えば第2のAAVベクターなどの第2の核酸分子上に存在する。第1および第2の核酸分子は、AAVベクターであってもよい。
特定の実施形態では、(a)および(c)は、1つの核酸分子、例えば1つのベクター、例えば1つのウイルスベクター、例えば1つのAAVベクター上に存在する。特定の実施形態では、(a)および(c)は、異なるベクター上にある。例えば(a)は、例えば第1のベクター、例えば第1のウイルスベクター、例えば第1のAAVベクターなどの第1の核酸分子上に存在してもよく;(c)は、例えば第2のベクター、例えば第2のベクター、例えば第2のAAVベクターなどの第2の核酸分子上に存在してもよい。特定の実施形態では、第1および第2の核酸分子は、AAVベクターである。
特定の実施形態では、(a)、(b)、および(c)は、例えば1つのベクター、例えば1つのウイルスベクター、例えばAAVベクターなどの1つの核酸分子上に存在する。特定の実施形態では、核酸分子はAAVベクターである。特定の実施形態では、(a)、(b)、および(c)の1つは、例えば第1のベクター、例えば第1のウイルスベクター、例えば第1のAAVベクターなどの第1の核酸分子上に存在し;(a)、(b)、および(c)の2つめおよび3つめは、例えば第2のベクター、例えば第2のベクター、例えば第2のAAVベクターなどの第2の核酸分子上でコードされる。第1および第2の核酸分子は、AAVベクターであってもよい。
特定の実施形態では、(a)は、例えば第1のベクター、例えば第1のウイルスベクター、第1のAAVベクターなどの第1の核酸分子上に存在し;(b)および(c)は、例えば第2のベクター、例えば第2のベクター、例えば第2のAAVベクターなどの第2の核酸分子上に存在する。第1および第2の核酸分子は、AAVベクターであってもよい。
特定の実施形態では、(b)は、例えば第1のベクター、例えば第1のウイルスベクター、例えば第1のAAVベクターなどの第1の核酸分子上に存在し;(a)および(c)は、例えば第2のベクター、例えば第2のベクター、例えば第2のAAVベクターなどの第2の核酸分子上に存在する。第1および第2の核酸分子は、AAVベクターであってもよい。
特定の実施形態では、(c)は、例えば第1のベクター、例えば第1のウイルスベクター、例えば第1のAAVベクターなどの第1の核酸分子上に存在し;(b)および(a)は、例えば第2のベクター、例えば第2のベクター、例えば第2のAAVベクターなどの第2の核酸分子上に存在する。第1および第2の核酸分子は、AAVベクターであってもよい。
特定の実施形態では、のそれぞれ(a)、(b)、および(c)(i)は、例えは異なるベクター、例えば異なるウイルスベクター、例えば異なるAAVベクターなどの異なる核酸分子上に存在する。例えば、(a)は第1の核酸分子上に、(b)は第2の核酸分子上に、(c)(i)は第3の核酸分子上にあってもよい。第1、第2、および第3の核酸分子は、AAVベクターであってもよい。
本明細書に記載される核酸は、例えば、本明細書に記載されるプロモーターなどの(a)のgRNA分子をコードする配列と作動可能に連結するプロモーターを含んでもよい。核酸は、例えば、本明細書に記載されるプロモーターなどの(c)の第2、第3および/または第4のgRNA分子をコードする配列と作動可能に連結する第2のプロモーターをさらに含んでもよい。プロモーターおよび第2のプロモーターは、互いに異なる。特定の実施形態では、プロモーターおよび第2のプロモーターは同一である。本明細書に記載される核酸は、例えば、本明細書に記載されるプロモーターなどの(b)のCpf1分子をコードする配列と作動可能に連結するプロモーターをさらに含んでもよい。
本開示の主題はまた、(a)先に記載されるようなgRNA分子を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、当該組成物はさらに、(b)Cpf1分子、例えば、先に記載されるようなCpf1分子を含む。特定の実施形態では、当該組成物はさらに、(c)先に記載されるような第2のgRNA分子を含む。特定の実施形態では、請求項66~70のいずれか一項に記載の組成物、組成物は、Cpf1タンパク質、およびgRNA分子をコードするリボ核酸分子を含むリボ核タンパク質組成物である。
本開示の主題はさらに、細胞を改変する、例えば、細胞の標的核酸の、構造を改変する、例えば配列を改変する方法であって:当該細胞を、(a)先に記載されるgRNA分子、および(b)先に記載されるCpf1分子、そして場合によっては、(c)先に記載される第2のgRNA分子と接触させることを含む方法を提供する。別の態様では、本明細書中で開示されるのは、対象(例えば、がんに罹患している対象)を治療する、例えば、対象の標的核酸の構造、例えば配列を改変する方法であって:対象(または対象由来の細胞)を、(a)先に記載されるgRNA;および(b)先に記載されるCpf1分子、そして場合によっては(c)先に記載される第2のgRNA分子と接触させることを含む方法である。
特定の実施形態では、細胞を改変する、例えば、細胞の標的核酸の、構造を改変する、例えば配列を改変する方法は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される2つ以上のT細胞発現遺伝子を改変することを含む。
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される2つ以上のT細胞発現遺伝子を改変することを含む。
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される3つ以上のT細胞発現遺伝子を改変することを含む。
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される4つ以上のT細胞発現遺伝子を改変することを含む。
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される5つ以上のT細胞発現遺伝子を改変することを含む。
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される6つ以上のT細胞発現遺伝子を改変することを含む。
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される7つ以上のT細胞発現遺伝子を改変することを含む。
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子のそれぞれを改変することを含む。
特定の実施形態では、当該方法は、がんに罹患している対象由来の細胞を接触させることを含む。特定の実施形態では、がんは、以下からなる群から選択される:リンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、B細胞急性リンパ球性白血病(B-ALL)、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫(NHL)、びまん性大細胞リンパ腫(DLCL)、多発性骨髄腫、腎細胞がん(RCC)、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、メラノーマ、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝細胞がん、膵臓がん、星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫。
細胞は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子中の1つまたは複数のT細胞標的位置に1つまたは複数の改変を有することから恩恵を被ることとなる対象由来であってよい。
特定の実施形態では、細胞は、T細胞である。接触は、生体外で実行され得、接触した細胞は、接触工程後に対象の体に戻され得る。特定の実施形態では、T細胞は、操作されたT細胞、例えば、操作されたCAR(キメラ抗原受容体)T細胞または操作されたTCR(T細胞受容体)T細胞である。特定の実施形態では、T細胞は、T細胞発現遺伝子のT細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入する前に、そうした後に、またはそうするのと同時に、TCRまたはCARを発現するように操作される。
特定の実施形態では、接触工程は、先に記載されるように、細胞を核酸組成物と接触させることを含む。特定の実施形態では、接触工程は、先に記載されるように、細胞を組成物と接触させることを含む。特定の実施形態では、組成物は、リボ核タンパク質組成物である。
特定の実施形態では、接触は、細胞を、核酸分子、例えばベクター、例えば、AAVベクター、AAV1ベクター、修飾AAV1ベクター、AAV2ベクター、修飾AAV2ベクター、AAV3ベクター、修飾AAV3ベクター、AAV4ベクター、修飾AAV4ベクター、AAV5ベクター、修飾AAV5ベクター、AAV6ベクター、修飾AAV6ベクター、AAV7ベクター、修飾AAV7ベクター、AAV8ベクター、AAV9ベクター、AAV.rh10ベクター、修飾AAV.rh10ベクター、AAV.rh32/33ベクター、修飾AAV.rh32/33ベクター、AAV.rh43ベクター、修飾AAV.rh43ベクター、AAV.rh64R1ベクター、または修飾AAV.rh64R1ベクターと接触させることを含む。
特定の実施形態では、接触は、細胞に、タンパク質またはmRNAとして(b)のCpf1分子、(a)をコードする核酸分子、そして場合によっては(c)を送達することを含む。
特定の実施形態では、接触は、細胞に、タンパク質またはmRNAとして(b)のCpf1分子、RNAとして(a)のgRNA、そして場合によっては、RNAとして(c)の第2のgRNAを送達することを含む。
特定の実施形態では、接触は、細胞に、RNAとして(a)のgRNA、場合によってはRNAとして(c)の第2のgRNA、そして(b)のCpf1分子をコードする核酸組成物を送達することを含む。
本開示の主題はさらに、先に記載されるgRNA分子、先に記載される核酸組成物、または先に記載される組成物、および細胞、例えば、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子中の1つまたは複数のT細胞標的位置での1つまたは複数の改変から恩恵を被ることとなる対象に由来する細胞を含む反応混合物を提供する。
本開示の主題はさらに、(a)先に記載されるgRNA分子、またはgRNAをコードする核酸組成物、および以下の1つまたは複数:(b)先に記載されるCpf1分子;(c)先に記載される第2のgRNA分子を含むキットを提供する。
本開示の主題はさらに、修飾gRNA分子を提供する。特定の実施形態では、修飾gRNA分子は、その5’末端にて、またはその近くに、修飾を含む。特定の実施形態では、gRNA分子は、その3’末端にて、またはその近くに、修飾を含む。特定の実施形態では、gRNA分子は、その5’末端にて、またはその近くに修飾を、そしてその3’末端にて、またはその近くに修飾を含む。特定の実施形態では、修飾は、その5’末端の1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、または1~2ヌクレオチド以内にある。特定の実施形態では、修飾は、その3’末端の1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、または1~2ヌクレオチド以内にある。特定の実施形態では、修飾により、gRNA分子は、T細胞中に導入された場合に、ヌクレアーゼに対する安定性の増大を示す。特定の実施形態では、修飾により、gRNA分子は、T細胞中に導入された場合に、先天性免疫応答の低下を示す。特定の実施形態では、先天性免疫応答は、サイトカイン発現の誘導を伴う。
加えて、本開示の主題は、対象におけるがんの治療に用いられる、先に記載されるgRNA分子を提供する。特定の実施形態では、gRNA分子は、(b)Cpf1分子と組み合わせて用いられる。
本開示の主題はさらに、対象におけるがんの治療用の医薬の製造における、先に記載されるgRNA分子の使用を提供する。特定の実施形態では、医薬はさらに、(b)Cpf1分子を含む。
本開示の主題はさらに、対象におけるがんの治療に用いられる、先に記載される核酸組成物を提供する。
本開示の主題はさらに、対象におけるがんの治療に用いられる、先に記載される組成物を提供する。
本開示の主題はさらに、対象におけるがんの治療用の医薬の製造における、先に記載される核酸組成物の使用を提供する。
本開示の主題はさらにさらに、対象におけるがんの治療用の医薬の製造における、先に記載される組成物の使用を提供する。
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは同等の方法および材料が、本発明でまたは本発明の試験で使用され得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照により援用する。これに加えて、材料、方法、および実施例は、例証のみを意図し、制限は意図されない。
数字およびアルファベットの見出しおよび小見出しをはじめとする見出しは、組織化と提示を目的とし、制限は意図されない。
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
定義
本明細書中で用いられる用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定される特定の値が許容可能な誤差範囲内にあることを意味し、これは部分的に、値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定系の制限事項(limitation)によって決まることとなる。例えば、「約」は、当該技術における実行につき、3標準偏差以内にある、または3標準偏差を超えることを意味し得る。これ以外にも、「約」は、所定の値の最大20%、好ましくは最大10%、より好ましくは最大5%、さらにより好ましくは最大1%の範囲を意味し得る。これ以外にも、特に生体系または生体プロセスに関して、当該用語は、値の1桁以内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内にあることを意味し得る。
本明細書中で用いられる用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定される特定の値が許容可能な誤差範囲内にあることを意味し、これは部分的に、値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定系の制限事項(limitation)によって決まることとなる。例えば、「約」は、当該技術における実行につき、3標準偏差以内にある、または3標準偏差を超えることを意味し得る。これ以外にも、「約」は、所定の値の最大20%、好ましくは最大10%、より好ましくは最大5%、さらにより好ましくは最大1%の範囲を意味し得る。これ以外にも、特に生体系または生体プロセスに関して、当該用語は、値の1桁以内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内にあることを意味し得る。
「ドメイン」は、本明細書の用法では、タンパク質または核酸部分を記述するために使用される。特に断りのない限り、ドメインは、任意の特定の機能特性を有する必要はない。
2つの配列間の相同性または配列同一性(用語は本明細書で同義的に使用される)の計算は、次のようにして実施される。配列は、最適な比較目的で整列され(例えば、最適アライメントのために、第1および第2のアミノ酸または核酸配列の片方または双方にギャップが装入され得て、非相同配列は比較目的で無視され得る)。最適アライメントは、Blosum62重み行列による、ギャップペナルティ12、ギャップ延長ペナルティ4、およびフレームシフトギャップペナルティ5で、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを使用して、最高スコアとして評価される。次に対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド配列部位にある、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列中の位置が、第2の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置において同一である。2つの配列間の同一性百分率は、配列によって共有される同一の位置数の関数である。
本明細書中で用いられる「阻害Cpf1 gRNA分子」は、細胞または対象中に導入されるCRISPR/Cpf1システムの構成要素をコードする配列を含む核酸上の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含むgRNA分子を指す。阻害Cpf1 gRNAは、内在性細胞または対象配列を標的化しない。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA分子は:(a)Cpf1分子をコードする核酸分子;(b)FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/もしくはTRBC遺伝子を標的化する標的化ドメインを含むgRNA(標的遺伝子gRNA)をコードする核酸分子上に;またはCRISPR/Cpf1構成要素、例えば(a)および(b)の双方をコードする複数の核酸分子上に、標的配列と相補的である標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、CRISPR/Cpf1構成要素をコードする、例えば、Cpf1分子または標的遺伝子gRNAをコードする核酸分子は、阻害Cpf1 gRNA標的化ドメインと相補的である複数の標的ドメインを含む。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA分子は、Cpf1分子と複合体形成して、例えば、切断によって、または核酸分子への結合によって、標的核酸分子のCpf1媒介不活性化をもたらし、そしてCRISPR/Cpf1システム構成要素の生成の停止または縮小をもたらす。特定の実施形態では、Cpf1分子は、2つの複合体:Cpf1分子を含む、標的遺伝子gRNAとの複合体であって、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子を改変する複合体;ならびにCpf1分子を含む、阻害Cpf1 gRNA分子との複合体であって、CRISPR/Cpf1システム構成要素、例えば、Cpf1分子または標的遺伝子gRNA分子のさらなる生成を妨げるように作用する複合体を形成する。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA分子/Cpf1分子複合体は、Cpf1分子についての制御領域配列、例えば、Cpf1分子をコードする配列に作動可能に連結するプロモーター、転写領域をコードする配列、エキソン、またはイントロンに結合し、またはその切断を促進する。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA分子/Cpf1分子複合体は、制御領域配列、例えば、gRNA分子に作動可能に連結するプロモーター、またはgRNA分子をコードする配列に結合し、またはその切断を促進する。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA、例えば、Cpf1-標的化阻害Cpf1 gRNA分子、または標的遺伝子gRNA標的化阻害Cpf1 gRNA分子は、Cpf1分子/標的遺伝子gRNA分子複合体媒介遺伝子標的化の効果を制限する。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNAは、時間的、発現レベル、または他の制限を、Cpf1分子/標的遺伝子gRNA分子複合体の活性に課す。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNAは、オフターゲットまたは他の不所望な活性を引き下げる。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA分子は、Cpf1システムの構成要素の生成を阻害する、例えば、完全にまたは実質的に完全に阻害することによって、その活性を制限する。
「修飾物質」は、本明細書の用法では、例えば、対象分子または遺伝子配列の活性(例えば、酵素活性、転写活性、または翻訳活性)、量、分布、または構造を改変し得る薬剤などの実体を指す。特定の実施形態では、調節は、例えば、共有結合または非共有結合の破壊などの切断、または例えば、部分の対象分子への付着などの共有結合または非共有結合の形成を含む。特定の実施形態では、修飾物質は、対象分子の三次元、二次、三次、または四次構造を変化させる。修飾物質は、対象活性を増大させ、低下させ、開始し、または排除し得る。
「大分子」は、本明細書の用法では、少なくとも2、3、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100kDの分子量を有する分子を指す。大分子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、生物製剤、および炭水化物が挙げられる。
「ポリペプチド」は、本明細書の用法では、100個未満のアミノ酸残基を有するアミノ酸のポリマーを指す。特定の実施形態では、それは50、20、または10個未満のアミノ酸残基を有する。
「非相同末端結合」または「NHEJ」は、本明細書の用法では、例えば、正順NHEJ(cNHEJ)、代替NHEJ(altNHEJ)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)、および合成依存性マイクロホモロジー媒介末端結合(SD-MMEJ)をはじめとする、ライゲーション媒介修復および/または非テンプレート媒介修復を指す。
例えば、参照Cpf1分子または参照gRNAなどの「参照分子」は、本明細書の用法では、例えば、修飾または候補Cpf1分子などである対象Cpf1分子または対象gRNA分子などの対象分子が、それに対して比較される分子を指す。例えば、Cpf1分子は、参照Cpf1分子のヌクレアーゼ活性の10%以下を有するとして特徴付けられ得る。基準Cpf1分子の例として、天然に存在する未修飾のCpf1分子、例えば、Zetsche et al.,Cell(2015);163:759-771に記載されるように、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種(例えば、BV3L6株(「AsCpf1」))またはラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(ND2006(「LbCpf1」株またはMA2020株(「Lb2Cpf1」))のCpf1分子等の天然に存在するCpf1分子が挙げられる。特定の実施形態では、参照Cpf1分子は、それが比較されるCpf1分子と、最も近い配列同一性または相同性を有する天然起源Cpf1分子である。特定の実施形態では、参照Cpf1分子は、例えば、変異などの変化がその上で起こった親形態である、天然起源または既知の配列などの配列である。
「置換」または「交換された」は、分子修飾に関連した本明細書の用法では、プロセスの制限は必要でなく、置換実体が存在することのみを示唆する。
「小分子」は、本明細書の用法では、例えば、約2kD未満、約1.5kD未満、約1kD未満、または約0.75kD未満などの約2kD未満の分子量を有する化合物を指す。
「対象」は、本明細書の用法では、ヒトまたは非ヒト動物のどちらを意味してもよい。用語は、哺乳類(例えば、ヒト、その他の霊長類、ブタ、齧歯類(例えば、マウスおよびラットまたはハムスター)、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、およびヤギ)を含むが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、対象は家禽である。
「治療する(Treat)」、「治療する(treating)」、および「治療(treatment)」は、本明細書の用法では、例えば、(a)疾患を阻害し、すなわち、その進行を抑止または予防し;(b)疾患を緩和し、すなわち、疾病状態の退縮を引き起こし;および(c)疾患を治癒させることをはじめとする、例えば、ヒトなどの哺乳類の疾患の治療を意味する。
「X」は、アミノ酸配列の文脈で、本明細書の用法では、特に断りのない限り、任意のアミノ酸(例えば、20個の天然アミノ酸のいずれか)を指す。
がん免疫療法を改善する
一態様では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRACおよび/またはTRBC遺伝子などの1つまたは複数のT細胞発現遺伝子を改変することで、遺伝子操作T細胞の増殖に影響を及ぼし得る。遺伝子操作T細胞が効果的な抗腫瘍応答をするためには、それらは、1)対象への移入に続いて適切に増殖し、十分な数の特異的腫瘍標的化T細胞を提供し;2)対象において必要な抗腫瘍活性を維持するのに十分な時間生存し;3)遺伝子操作T細胞が機能性抗腫瘍表現型を維持するように、腫瘍環境内で免疫細胞、腫瘍細胞、およびその他の細胞によって産生される抑制因子の影響を回避する必要がある。不十分な増殖および/または生存、ならびに阻害因子感受性は、がんに罹患している対象における、遺伝子操作T細胞の有効性の欠如の一因たり得る。本明細書で開示される方法および組成物は、がん治療法としての遺伝子操作T細胞の有効性を改善するために、これらの問題に対処する。
一態様では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRACおよび/またはTRBC遺伝子などの1つまたは複数のT細胞発現遺伝子を改変することで、遺伝子操作T細胞の増殖に影響を及ぼし得る。遺伝子操作T細胞が効果的な抗腫瘍応答をするためには、それらは、1)対象への移入に続いて適切に増殖し、十分な数の特異的腫瘍標的化T細胞を提供し;2)対象において必要な抗腫瘍活性を維持するのに十分な時間生存し;3)遺伝子操作T細胞が機能性抗腫瘍表現型を維持するように、腫瘍環境内で免疫細胞、腫瘍細胞、およびその他の細胞によって産生される抑制因子の影響を回避する必要がある。不十分な増殖および/または生存、ならびに阻害因子感受性は、がんに罹患している対象における、遺伝子操作T細胞の有効性の欠如の一因たり得る。本明細書で開示される方法および組成物は、がん治療法としての遺伝子操作T細胞の有効性を改善するために、これらの問題に対処する。
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、CBLB遺伝子を改変することで、遺伝子操作T細胞の増殖に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、Casitas B系統リンパ腫bタンパク質(CBLBによってコードされる)発現の低下または不在は、対象への移入に続く、遺伝子操作T細胞の増殖を促進するための外来性インターロイキンシグナル伝達に対する必要性を低下させると考えられる(Stromnes,I.M.et al.,2010 J.Clin.Invest.120,3722-3734)。
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、PTPN6遺伝子を改変することで、遺伝子操作T細胞の増殖に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、Src相同性領域2ドメイン含有ホスファターゼ-1タンパク質(PTPN6によってコードされる)の発現低下または不在は、移入されたT細胞の短期蓄積の増大をもたらし、それは引き続いて抗腫瘍活性を改善すると考えられる(Stromnes,I.M.et al.,2012 J.Immunol.189,1812-1825)。
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、FAS遺伝子を改変することで、遺伝子操作T細胞の増殖に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、Fasタンパク質発現の低下または不在が、多くのがん型によって発現される因子であるFasリガンドによるT細胞アポトーシスの誘導を阻害すると考えられる(Dotti,G.et al.,2005 Blood 105,4677-4684)。
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、BID遺伝子を改変することで、遺伝子操作T細胞の増殖に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、Bidタンパク質発現の低下または不在が、Fas経路活性化に続くT細胞アポトーシスの誘導を妨げると考えられる(Lei,X.Y.et al.,2009 Immunol.Lett.122,30-36)。
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、CTLA4遺伝子を改変することで、遺伝子操作T細胞に対する免疫抑制性因子の効果を低下させ得る。特定の実施形態では、細胞毒性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4によってコードされる)発現の低下または不在が、腫瘍環境内で抗原提示細胞によって発現されるCD80またはCD86の結合に続く、非応答性状態(「アネルギー」)の誘導を抑止すると考えられる(Shrikant,P.et al,1999 Immunity 11,483-493)。
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、PDCD1遺伝子を改変することで、遺伝子操作T細胞に対する免疫抑制性因子の効果を低下させ得る。特定の実施形態では、プログラム細胞死タンパク質1(PDCD1によってコードされる)発現の低下または不在が、腫瘍環境内で腫瘍細胞または細胞によって発現されるPD1リガンドの結合によって、T細胞アポトーシス誘導を妨げると考えられる(Topalian,S.L.et al.,2012 N.Engl.J.Med.366,2443-2454)。
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、TRACおよび/またはTRBC遺伝子を改変することで、T細胞特異性および安全性が改善され得る。特定の実施形態では、T細胞受容体(TRACおよびTRBCによってコードされる)発現の低下または不在が、T細胞受容体認識および宿主組織応答を排除することで、移植片対宿主病を妨げると考えられる。したがってこのアプローチを使用して、「汎用」T細胞が生成され得る(Torikai et al.,2012 Blood 119,5697-5705)。特定の実施形態では、TRACおよび/またはTRBC遺伝子の発現の低下または不在により、内在性T細胞受容体の、外来から導入された、操作されたT細胞受容体との誤対形成が低下し、または除外されるので、治療有効性が向上する(Provasi et al.,2012,Nature Medicine 18,807-815)。
特定の実施形態では、本明細書中で開示される組成物および方法は、B2M遺伝子を改変することによってT細胞持続性を向上させるのに用いることができる。特定の実施形態では、ベータ-2-ミクログロブリン(B2Mによってコードされる)の発現の低下または不在により、T細胞上でのMHCI表面発現が減少する。導入CARまたは操作TCRに由来する「外来の」ペプチドが、操作されたT細胞の表面上でクラスI MHCによって示され得るので、特定の実施形態では、ベータ-2ミクログロブリンの除去により、養子免疫療法について低免疫原性(hypoimmunogenic)細胞をもたらす、注入された操作されたT細胞の宿主拒絶反応の可能性が低下し得る(Mandal et al,Cell Stem Cell,2014)。特定の実施形態では、ベータ-2-ミクログロブリンの発現の低下または不在が、同種移植(allotransplantation)用の「容易に入手できる」操作されたT細胞の生成に用いられる(Riolobos et al.Mol.Ther.,2013)。
特定の実施形態では、本明細書中で開示される組成物および方法は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される1つまたは複数の遺伝子を低下させて、操作されたT細胞を用いたがん免疫療法の治療を向上させるのに用いることができる。
本明細書中で開示されるのは、本明細書中で記載される組成物および方法を用いて、免疫療法を介してがんを治療するアプローチである。
一アプローチでは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される1つまたは複数の遺伝子が、標的ノックアウトとして標的化されて、例えば、T細胞の増殖、生存、機能、および/または持続性に影響を与える。特定の実施形態では、前記アプローチは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される1つのT細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBC遺伝子からなる群から選択される2つのT細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBC遺伝子からなる群から選択される3つのT細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBC遺伝子からなる群から選択される4つのT細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBC遺伝子からなる群から選択される5つのT細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBC遺伝子からなる群から選択される6つのT細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBC遺伝子からなる群から選択される7つのT細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBC遺伝子からなる群から選択される8つのT細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。
特定の実施形態では、方法は、疾患発症後に対象の治療を開始するステップを含む。特定の実施形態では、方法は、例えば、がんの発症後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、または36ヶ月間などの疾患発症の十分後に、対象への治療を開始するステップを含む。
特定の実施形態では、方法は、進行した病期にある対象の治療開始を含む。
全体的に、全ての病期における対象の治療開始は、対象に恩恵をもたらすことが期待される。
本明細書で開示される組成物および方法を使用して治療されてもよいがんとしては、血液のがんおよび固形腫瘍が挙げられる。例えば、本明細書で開示される組成物および方法を使用して治療されてもよいがんとしては、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、B細胞急性リンパ球性白血病(B-ALL)、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫(NHL)、びまん性大細胞リンパ腫(DELL)、多発性骨髄腫、腎細胞がん(RCC)、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、メラノーマ、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝細胞がん、膵臓がん、星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫が挙げられるが、これに限定されるものではない。
1つまたは複数のT細胞発現遺伝子を改変する方法
本明細書中で開示されるように、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される1つまたは複数が、例えば本明細書中で記載されるCRISPR-Cpf1媒介方法を用いて、遺伝子編集によって標的化(例えば改変)され得る。
本明細書中で開示されるように、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される1つまたは複数が、例えば本明細書中で記載されるCRISPR-Cpf1媒介方法を用いて、遺伝子編集によって標的化(例えば改変)され得る。
本明細書中で開示される方法および組成物は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される1つまたは複数におけるT細胞標的位置の標的化(例えば改変)を実現する。T細胞標的位置は、例えば、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中を標的化(例えば改変)するCRISPR-Cpf1媒介方法を用いて、遺伝子編集によって標的化(例えば改変)され得る。
本明細書中で開示されるのは、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的位置を標的化する(例えば改変する)方法である。
T細胞標的位置の標的化(例えば改変)は、例えば、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子をノックアウトすること:
(a)1つもしくは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/もしくはTRBC遺伝子のコード領域(例えば初期コード領域)の近傍もしくはその内部での1つもしくは複数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失(例えば、NHEJ媒介挿入または欠失)、または
(b)1つもしくは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/もしくはTRBC遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列の欠失(例えばNHEJ媒介欠失)によって達成される。
(a)1つもしくは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/もしくはTRBC遺伝子のコード領域(例えば初期コード領域)の近傍もしくはその内部での1つもしくは複数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失(例えば、NHEJ媒介挿入または欠失)、または
(b)1つもしくは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/もしくはTRBC遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列の欠失(例えばNHEJ媒介欠失)によって達成される。
全てのアプローチが、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の標的化(例えば改変)を引き起こす。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される方法は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子中のコード領域の近くに1つまたは複数の切断を導入する。特定の実施形態では、本明細書中に記載される方法は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の少なくとも一部の側面に位置するように、2つ以上の切断を導入する。2つ以上の切断により、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列が除去される(例えば欠失する)。本明細書中に記載される全ての方法は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の標的化(例えば改変)をもたらす。
1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の標的化(例えば改変)は、あらゆる機構によって媒介され得る。1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の改変と関連し得る例示的な機構として、以下に限定されないが、非相同末端結合(例えば、古典的または代替)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)、相同指向修復(例えば、内在性供与体テンプレート媒介性)、およびSDSA(合成依存性鎖アニーリング)が挙げられる。
挿入または欠失を導入することによる、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子のノックアウト
特定の実施形態では、当該方法は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子のT細胞標的ノックアウト位置の近傍(例えば初期コード領域)に、もう1つのヌクレオチドの挿入または欠失を導入することを含む。本明細書中で記載されるように、特定の実施形態では、当該方法は、T細胞標的ノックアウト位置、例えば、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子のコード領域(例えば、例えば開始コドンから500bp以内の、初期コード領域、または、例えば開始コドンから最初の500bpの下流の、残りのコード配列)への、1つまたは複数の切断(例えば二重鎖切断)の導入を含む。特定の実施形態では、切断のNHEJ媒介修復により、T細胞標的ノックアウト位置の近傍またはその内部での、インデルのNHEJ媒介導入が可能となる。
特定の実施形態では、当該方法は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子のT細胞標的ノックアウト位置の近傍(例えば初期コード領域)に、もう1つのヌクレオチドの挿入または欠失を導入することを含む。本明細書中で記載されるように、特定の実施形態では、当該方法は、T細胞標的ノックアウト位置、例えば、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子のコード領域(例えば、例えば開始コドンから500bp以内の、初期コード領域、または、例えば開始コドンから最初の500bpの下流の、残りのコード配列)への、1つまたは複数の切断(例えば二重鎖切断)の導入を含む。特定の実施形態では、切断のNHEJ媒介修復により、T細胞標的ノックアウト位置の近傍またはその内部での、インデルのNHEJ媒介導入が可能となる。
特定の実施形態では、二本鎖切断が、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に導入される(例えば、1つのgRNA分子によって配置される)。特定の実施形態では、単一gRNA分子(例えば、Cpf1ヌクレアーゼがある)が、T細胞標的ノックアウト位置、例えば、コード領域(例えば、例えば開始コドンから500bp以内の、初期コード領域、または、例えば開始コドンから最初の500bpの下流の、残りのコード配列)に、またはその近傍に二本鎖切断を生じさせるのに用いられる。特定の実施形態では、切断は、不所望の標的染色体要素、例えば反復要素、例えばAlu反復を回避するように配置される。
特定の実施形態では、2つの切断セット(例えば、2つの二本鎖切断)が、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に導入される(例えば、2つのgRNA分子によって配置される)。特定の実施形態では、2つのgRNA分子(例えば、1つまたは2つのCpf1ヌクレアーゼがある)が、T細胞標的ノックアウト位置、例えば、コード領域(例えば、例えば開始コドンから500bp以内の、初期コード領域、または、例えば開始コドンから最初の500bpの下流の、残りのコード配列)の側面に位置するように、2つの二本鎖切断を生じさせるのに用いられる。特定の実施形態では、gRNA分子は、切断セットの双方が、T細胞標的ノックアウト位置の上流または下流に配置されるように構成される。特定の実施形態では、gRNA分子は、1つの切断セットが、T細胞標的ノックアウト位置の上流に配置され、そして第2の切断セットがその下流に配置されるように構成される。特定の実施形態では、切断は、不所望の標的染色体要素、例えば反復要素、例えばAlu反復を回避するように配置される。
特定の実施形態では、2つ以上(例えば、3つまたは4つ)のgRNA分子が、1つのCpf1分子と共に用いられる。特定の実施形態では、2つ以上(例えば、3つまたは4つ)のgRNAが、2つ以上のCpf1分子と共に用いられる場合、少なくとも1つのCpf1分子は、他のCpf1分子と異なる種に由来する。例えば、2つのgRNA分子が2つのCpf1分子と共に用いられる場合、1つのCpf1分子は、ある一種に由来して、他のCpf1分子は、異なる種に由来してよい。所望の場合には、二本鎖切断を生じさせるのに、双方のCpf1種が用いられる。
細胞内で複数の遺伝子が改変のために標的化される場合、標的化される核酸は、1つまたは複数のCpf1タンパク質(例えばCpf1ヌクレアーゼ)によって、改変、例えば切断され得る。例えば、2つの遺伝子が改変のために標的化される、例えば、双方の遺伝子がノックアウトのために標的化されるならば、同じ、または異なるCpf1タンパク質が、各遺伝子を標的化するのに用いられてよい。特定の実施形態では、双方の遺伝子(または細胞内で標的化される各遺伝子)が、Cpf1ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。特定の実施形態では、双方の遺伝子(または細胞内で標的化される各遺伝子)が、Cpf1ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。特定の実施形態では、細胞中の1つまたは複数の遺伝子が、Cpf1ヌクレアーゼによる切断によって改変され得る。2つ以上のCpf1タンパク質が、細胞中の標的核酸、例えば、異なる遺伝子を切断するのに用いられる場合、Cpf1タンパク質は、異なる細菌種に由来してもよい。例えば、細胞中の1つまたは複数の遺伝子が、1つの細菌種由来のCpf1タンパク質による切断によって改変されてもよい。そして、同細胞中の1つまたは複数の遺伝子が、異なる細菌種由来のCpf1タンパク質による切断によって改変されてもよい。特定の実施形態では、異なる種由来の2つ以上のCpf1タンパク質が用いられる場合、これらは、標的核酸中の所望の位置の所望の遺伝子中で切断特異性を制御するように、同時に送達されても順次送達されてもよい。
特定の実施形態では、第1のgRNA分子の標的化ドメインおよび第2のgRNA分子の標的化ドメインは、標的核酸分子の対向する鎖と相補的である。特定の実施形態では、gRNA分子および第2のgRNA分子は、PAMが外側を向くように構成される。
1つまたは複数のT細胞発現遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列の欠失(例えばNHEJ媒介欠失)による、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子のノックアウト
特定の実施形態では、当該方法は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列の欠失を導入することを含む。本明細書中に記載されるように、特定の実施形態では、当該方法は、2つの二本鎖切断を、一方をT細胞標的ノックアウト位置の5’側に、そして他方を3’側に導入する(すなわち、側面に位置させる)ことを含む。特定の実施形態では、2つのgRNA、例えば、単分子(またはキメラ)またはモジュラーgRNA分子が、2つの切断セット(例えば2つの二本鎖切断)を、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的ノックアウト位置の対向する側に配置するように構成される。
特定の実施形態では、当該方法は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列の欠失を導入することを含む。本明細書中に記載されるように、特定の実施形態では、当該方法は、2つの二本鎖切断を、一方をT細胞標的ノックアウト位置の5’側に、そして他方を3’側に導入する(すなわち、側面に位置させる)ことを含む。特定の実施形態では、2つのgRNA、例えば、単分子(またはキメラ)またはモジュラーgRNA分子が、2つの切断セット(例えば2つの二本鎖切断)を、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的ノックアウト位置の対向する側に配置するように構成される。
特定の実施形態では、当該方法は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列を欠失(例えばNHEJ媒介欠失)させることを含む。本明細書中に記載されるように、特定の実施形態では、当該方法は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中の領域(例えば、コード領域(例えば初期コード領域))または非コード領域(例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン、3’UTR、および/またはポリアデニル化シグナル配列)の側面に位置するように、2つの切断セット(例えば一対の二本鎖切断)を導入することを含む。特定の実施形態では、切断のNHEJ媒介修復により、本明細書中で記載されるように、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の改変が可能となり、これは例えば、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子の一方または双方の対立遺伝子をノックアウトするように、遺伝子の発現を引き下げ、または除外する。
特定の実施形態では、2つの切断セット(例えば、2つの二本鎖切断)が、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子中のT細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に導入される(例えば、2つのgRNA分子によって配置される)。特定の実施形態では、(例えば、1つまたは2つのCpf1ヌクレアーゼと共に)2つのgRNA分子が、T細胞標的ノックアウト位置の側面に位置するように2つの切断セットを生じさせるのに用いられ、例えば、gRNA分子は、1つの切断セットが、T細胞標的ノックアウト位置の上流に配置され、そして第2の切断セットがその下流に配置されるように構成される。特定の実施形態では、切断は、不所望の標的染色体要素、例えば反復要素、例えばAlu反復を回避するように配置される。
特定の実施形態では、2つ以上(例えば、3つまたは4つ)のgRNA分子が、1つのCpf1分子と共に用いられる。特定の実施形態では、2つ以上(例えば、3つまたは4つ)のgRNAが、2つ以上のCpf1分子と共に用いられる場合、少なくとも1つのCpf1分子は、他のCpf1分子と異なる種に由来する。例えば、2つのgRNA分子が2つのCpf1分子と共に用いられる場合、1つのCpf1分子は、ある一種に由来して、他のCpf1分子は、異なる種に由来してよい。所望の場合には、二本鎖切断を生じさせるのに、双方のCpf1種が用いられる。
細胞内で複数の遺伝子が改変のために標的化される場合、標的化される核酸は、1つまたは複数のCpf1タンパク質(例えばCpf1ヌクレアーゼ)によって、改変、例えば切断され得る。例えば、2つの遺伝子が改変のために標的化される、例えば、双方の遺伝子がノックアウトのために標的化されるならば、同じ、または異なるCpf1タンパク質が、各遺伝子を標的化するのに用いられてよい。特定の実施形態では、双方の遺伝子(または細胞内で標的化される各遺伝子)が、Cpf1ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。特定の実施形態では、双方の遺伝子(または細胞内で標的化される各遺伝子)が、Cpf1ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。特定の実施形態では、細胞中の1つまたは複数の遺伝子が、Cpf1ヌクレアーゼによる切断によって改変され得る。2つ以上のCpf1タンパク質が、細胞中の標的核酸、例えば、異なる遺伝子を切断するのに用いられる場合、Cpf1タンパク質は、異なる細菌種に由来してもよい。例えば、細胞中の1つまたは複数の遺伝子が、1つの細菌種由来のCpf1タンパク質による切断によって改変されてもよい。そして、同細胞中の1つまたは複数の遺伝子が、異なる細菌種由来のCpf1タンパク質による切断によって改変されてもよい。特定の実施形態では、異なる種由来の2つ以上のCpf1タンパク質が用いられる場合、これらは、標的核酸中の所望の位置の所望の遺伝子中で切断特異性を制御するように、同時に送達されても連続して送達されてもよい。
特定の実施形態では、第1のgRNA分子の標的化ドメインおよび第2のgRNA分子の標的化ドメインは、標的核酸分子の対向する鎖と相補的である。特定の実施形態では、gRNA分子および第2のgRNA分子は、PAMが外側を向くように構成される。
特定の実施形態では、遺伝子操作されたT細胞の養子移入が、がんの可能な治療を実現し得る。細胞表面受容体をコードする遺伝子が、T細胞中に挿入される。遺伝子操作されたT細胞は、腫瘍関連抗原を検出することができ、これが用いられて、腫瘍細胞をほとんどの正常組織から識別することができる。
標的遺伝子(例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBC遺伝子)の1つまたは2つの対立遺伝子のノックアウトが、疾患発症後に実行されてもよいが、好ましくは疾患経過の早期に実行される。
I.gRNA分子
本明細書中で用いられる用語gRNA分子は、標的核酸に対するgRNA分子/Cpf1分子複合体の特異的標的化または自動誘導(homing)を促進する核酸を指す。gRNA分子は、ユニモジュラー(「単分子」とも呼ばれる単一RNA分子、例えばキメラgRNAを有する)、またはモジュラー(複数、典型的には2つの、別々のRNA分子を含む)であり得る。特定の実施形態では、gRNA分子は、ユニモジュラーgRNAである。
本明細書中で用いられる用語gRNA分子は、標的核酸に対するgRNA分子/Cpf1分子複合体の特異的標的化または自動誘導(homing)を促進する核酸を指す。gRNA分子は、ユニモジュラー(「単分子」とも呼ばれる単一RNA分子、例えばキメラgRNAを有する)、またはモジュラー(複数、典型的には2つの、別々のRNA分子を含む)であり得る。特定の実施形態では、gRNA分子は、ユニモジュラーgRNAである。
特定の実施形態では、gRNA分子は、5’から3’に:図1に示す直接反復ドメインおよび標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、gRNA分子は、15~100(例えば、15~30、30~50、50~70、70~80、または80~100)ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、gRNA分子は、30~50(例えば、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50)ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、gRNA分子は、38ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、gRNA分子は、39ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、gRNA分子は、40ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、gRNA分子は、41ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、gRNA分子は、42ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、gRNA分子は、43ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、gRNA分子は、44ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、gRNA分子は、45ヌクレオチド長である。
直接反復ドメイン
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、10~30(例えば、10~15、15~20、20~25、または20~30)ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、15~25(例えば、15~20、または20~25)ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、15~20(例えば、15、16、17、18、19、または20)ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、20~25(例えば、20、21、22、23、24、または25)ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、20ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、21ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、10~30(例えば、10~15、15~20、20~25、または20~30)ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、15~25(例えば、15~20、または20~25)ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、15~20(例えば、15、16、17、18、19、または20)ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、20~25(例えば、20、21、22、23、24、または25)ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、20ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、21ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
UAAUUUCUACUCUUGUAGAU[配列番号3708]
UAAUUUCUACUCUUGUAGAU[配列番号3708]
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、配列番号3709で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU[配列番号3709]
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU[配列番号3709]
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、配列番号3710で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
GAAUUUCUACUAUUGUAGAU[配列番号3710]
GAAUUUCUACUAUUGUAGAU[配列番号3710]
gRNA分子AsCpf1は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を含む直接反復ドメインを含む。
gRNA分子LbCpf1は、配列番号3709で示されるヌクレオチド配列を含む直接反復ドメインを含む。
gRNA分子Lb2Cpf1は、配列番号3710で示されるヌクレオチド配列を含む直接反復ドメインを含む。
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、1つの単一ステムループを含む。
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、配列番号3708、配列番号3709、または配列番号3710で示される配列に対して少なくとも約80%、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%相同なヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、配列番号3708、配列番号3709、または配列番号3710で示される配列の少なくとも1つの修飾を含むヌクレオチド配列を含む。修飾は、gRNA分子の切断活性に実質的に干渉しない、もしくは干渉しない、またはgRNA分子の切断活性をもたらさない。特定の実施形態では、少なくとも1つの修飾は、挿入、欠失、突然変異、およびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、少なくとも1つの修飾は、RNA二重鎖を保存するステムループ中にある。特定の実施形態では、少なくとも1つの修飾は、少なくとも1つの突然変異を含む。特定の実施形態では、少なくとも1つの修飾は、ステムループ二重鎖構造を破壊しない。特定の実施形態では、少なくとも1つの修飾は、配列番号3708、配列番号3709、または配列番号3710で示される配列の3’末端の最後の3ヌクレオチド以内にない。特定の実施形態では、少なくとも1つの修飾は、配列番号3708、配列番号3709、または配列番号3710で示される配列の3’末端の最後の2ヌクレオチド以内にない。特定の実施形態では、少なくとも1つの修飾は、配列番号3708、配列番号3709、または配列番号3710で示される配列の3’末端の最後の1つのヌクレオチドにない。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、5つ以下の修飾、4つ以下の修飾、3つ以下の修飾、2つ以下の修飾、または1つの修飾を含むか有する。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの修飾を含むか有する。
標的化ドメイン
本開示のgRNAの標的化ドメインは、標的核酸上の標的ドメインと相補的である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBC遺伝子中の標的核酸と相補的であり、例えば、標的化ドメインは、配列番号1~3707からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。標的化ドメインの選択に関する指針が、例えば、Zetsche et al.,Cell(2015);163:759-771において見出され得る。
本開示のgRNAの標的化ドメインは、標的核酸上の標的ドメインと相補的である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBC遺伝子中の標的核酸と相補的であり、例えば、標的化ドメインは、配列番号1~3707からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。標的化ドメインの選択に関する指針が、例えば、Zetsche et al.,Cell(2015);163:759-771において見出され得る。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的核酸上の標的配列と、相補的である、例えば、少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、または約99%相補的である、例えば完全に相補的であるヌクレオチド配列を含む。標的化ドメインは、RNA分子の一部であるので、塩基ウラシル(U)を含むこととなる一方、当該gRNA分子をコードするいかなるDNAも、塩基チミン(T)を含むこととなる。特定の実施形態では、標的化ドメインの、標的配列との相補性は、gRNA分子/Cpf1分子複合体の、標的核酸との相互作用の特異性に寄与する。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび標的配列対において、標的化ドメイン中のウラシル塩基が、標的配列中のアデニン塩基と対形成する。特定の実施形態では、標的化ドメインは、5~50(例えば、5~10、10~20、20~30、30~40、または40~50)ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、15~30(例えば、15~25または25~30)ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、15~25(例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25)ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、18ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、19ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、20ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、21ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、22ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、23ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、24ヌクレオチド長である。
典型的に標的化ドメインは、標的配列との完全相補性を有する。特定の実施形態では標的化ドメインは、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、1、2、3、4、5、6、7または8ヌクレオチドを有し、またはそれを含む。
特定の実施形態では、標的ドメインは、その5’末端の5ヌクレオチド以内にある、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的な1、2、3、4または5ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的ドメインは、その3’末端の5ヌクレオチド以内にある、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的な1、2、3、4または5ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、標的ドメインは、その5’末端の5ヌクレオチド以内にある、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、1、2、3または4ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的ドメインは、その3’末端の5ヌクレオチド以内にある、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、1、2、3または4ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、相補性の程度は、gRNAのその他の性質と合わせて、Cpf1分子の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、例えば、標的化ドメインの5’末端の5ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた、2つの連続する非相補的ヌクレオチドなどの標的ドメインと相補的でない2連続ヌクレオチド(「非相補的ヌクレオチド」)を含む。
特定の実施形態では、標的化ドメインの5’末端の5ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある2連続ヌクレオチドは、いずれも標的化ドメインと相補的でない。
特定の実施形態では、非相補的ヌクレオチドが、標的化ドメインの5’末端の5ヌクレオチド以内に、標的化ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内に、または標的化ドメインの片方もしくは双方の末端から5ヌクレオチド超離れた領域内に、存在する。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号1~3707からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
配列番号1~63で示される標的化ドメインはいずれも、PDCD1遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種(例えば、BV3L6株(「AsCpf1」))、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(ND2006株(「LbCpf1」)またはMA2020株(「Lb2Cpf1」))のCpf1と共に用いられ得る。
配列番号64~370で示される標的化ドメインはいずれも、CTLA4遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種(例えば、BV3L6株(「AsCpf1」))、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(ND2006株(「LbCpf1」)またはMA2020株(「Lb2Cpf1」))のCpf1と共に用いられ得る。
配列番号371~503で示される標的化ドメインはいずれも、PTPN6遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種(例えば、BV3L6株(「AsCpf1」))、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(ND2006株(「LbCpf1」)またはMA2020株(「Lb2Cpf1」))のCpf1と共に用いられ得る。
配列番号504~2325で示される標的化ドメインはいずれも、CBLB遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種(例えば、BV3L6株(「AsCpf1」))、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(ND2006株(「LbCpf1」)またはMA2020株(「Lb2Cpf1」))のCpf1と共に用いられ得る。
配列番号2326~3094で示される標的化ドメインはいずれも、FAS遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種(例えば、BV3L6株(「AsCpf1」))、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(ND2006株(「LbCpf1」)またはMA2020株(「Lb2Cpf1」))のCpf1と共に用いられ得る。
配列番号3095~3283で示される標的化ドメインはいずれも、B2M遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種(例えば、BV3L6株(「AsCpf1」))、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(ND2006株(「LbCpf1」))またはMA2020株(「Lb2Cpf1」))のCpf1と共に用いられ得る。
配列番号3284~3385で示される標的化ドメインはいずれも、BID遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種(例えば、BV3L6株(「AsCpf1」))、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(ND2006株(「LbCpf1」)またはMA2020株(「Lb2Cpf1」))のCpf1と共に用いられ得る。
配列番号3386~3588で示される標的化ドメインはいずれも、TRAC遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種(例えば、BV3L6株(「AsCpf1」))、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(ND2006株(「LbCpf1」)またはMA2020株(「Lb2Cpf1」))のCpf1と共に用いられ得る。
配列番号3589~3707で示される標的化ドメインはいずれも、TRBC遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種(例えば、BV3L6株(「AsCpf1」))、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(ND2006株(「LbCpf1」)またはMA2020株(「Lb2Cpf1」))のCpf1と共に用いられ得る。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号3433で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
AGAAUCAAAAUCGGUGAAUAGGC(配列番号3433)
AGAAUCAAAAUCGGUGAAUAGGC(配列番号3433)
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号3587で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
UUUGAGAAUCAAAAUCGGUGAAU(配列番号3587)
UUUGAGAAUCAAAAUCGGUGAAU(配列番号3587)
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号3538で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
GUCUGUGAUAUACACAUCAGAAU(配列番号3538)
GUCUGUGAUAUACACAUCAGAAU(配列番号3538)
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号3461で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
CACAUGCAAAGUCAGAUUUGUUG(配列番号3461)
CACAUGCAAAGUCAGAUUUGUUG(配列番号3461)
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号3475で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
CAUGUGCAAACGCCUUCAACAAC(配列番号3475)
CAUGUGCAAACGCCUUCAACAAC(配列番号3475)
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号3524で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
GAUUCUCAAACAAAUGUGUCACA(配列番号3524)
GAUUCUCAAACAAAUGUGUCACA(配列番号3524)
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号3566で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
UCUGUGAUAUACACAUCAGAAUC(配列番号3566)
UCUGUGAUAUACACAUCAGAAUC(配列番号3566)
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号3517で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
GAGUCUCUCAGCUGGUACACGGC(配列番号3517)
GAGUCUCUCAGCUGGUACACGGC(配列番号3517)
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号3573で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
UGACACAUUUGUUUGAGAAUCAA(配列番号3573)
UGACACAUUUGUUUGAGAAUCAA(配列番号3573)
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号3580で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
UUGCUCCAGGCCACAGCACUGUU(配列番号3580)
UUGCUCCAGGCCACAGCACUGUU(配列番号3580)
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号3454で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
AUUCUCAAACAAAUGUGUCACAA(配列番号3454)
AUUCUCAAACAAAUGUGUCACAA(配列番号3454)
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号1~3707からなる群から選択される1つの配列に対して少なくとも約80%、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%相同なヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号1~3707からなる群から選択される1つの配列の少なくとも1つの修飾を含むヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該修飾は、セクションVIIIに開示される1つまたは複数の修飾である。特定の実施形態では、少なくとも1つの修飾が、標的化ドメインについて、分解に対する感受性をより低くし、またはより生体適合性にし、例えば免疫原性をより低くする。一例として、標的化ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで修飾されていてもよいし、セクションVIIIの他の修飾で修飾されていてもよい。特定の実施形態では、標的化ドメインのヌクレオチドは、2’修飾、例えば、2-アセチル化、例えば、2’メチル化、またはセクションVIIIの他の修飾を含み得る。
特定の実施形態では、少なくとも1つの修飾は、挿入、欠失、突然変異、およびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、標的化ドメインは、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つ以上の修飾を含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、その5’末端の5ヌクレオチド以内にある、1、2、3、または4つの修飾を含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、その3’末端の5ヌクレオチド以内にある、1、2、3、または4程度の数の修飾を含む。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、例えば、標的化ドメインの5’末端の5ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた2連続ヌクレオチドなどの2連続ヌクレオチドの修飾を含む。
特定の実施形態では、標的化ドメインの5’末端の5ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある2連続ヌクレオチドは、いずれも修飾されていない。特定の実施形態では、標的化ドメインの5’末端の5ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの3’末端の5ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から5ヌクレオチドを超えて離れた領域内にあるヌクレオチドは、いずれも修飾されていない。
標的化ドメイン中の修飾は、セクションIVに記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補標的化ドメインを有するgRNAは、セクションIVのシステム中で評価され得る。候補標的化ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているgRNA分子/Cpf1分子システム中に、単独で配置され、または1つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
特定の実施形態では、全ての修飾ヌクレオチドは、標的ドメイン中に存在する対応するヌクレオチドと相補的であり、ハイブリダイズできる。特定の実施形態では、1、2、3、4、5、6、7または8つ以上の修飾ヌクレオチドは、標的ドメイン中に存在する対応するヌクレオチドと相補的でなくまたはハイブリダイズできない。
II.gRNAをデザインする方法
本明細書中に記載されるgRNAに用いる標的化ドメインを選択し、デザインし、かつ実証する方法が提供される。gRNA中への組込みのための例示的な標的化ドメインもまた、本明細書中で提供される。
本明細書中に記載されるgRNAに用いる標的化ドメインを選択し、デザインし、かつ実証する方法が提供される。gRNA中への組込みのための例示的な標的化ドメインもまた、本明細書中で提供される。
標的配列の選択および検証、ならびにオフターゲット分析の方法が、例えば、Mali et al.,2013 SCIENCE 339(6121):823-826;Hsu et al.NAT BIOTECHNOL,31(9):827-32;Fu et al.,2014 NAT BIOTECHNOL,doi:10.1038/nbt.2808.PubMed PMID:24463574;Heigwer et al.,2014 NAT METHODS 11(2):122-3.doi:10.1038/nmeth.2812.PubMed PMID:24481216;Bae et al.,2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID:24463181;Xiao A et al.,2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID:24389662;およびZetsche et al.,Cell(2015);163:759-771に記載されている。
特定の実施形態では、使用者の標的配列内でのgRNAの標的化ドメインの選択を最適化するのに、例えば、ゲノム全体にわたる総オフターゲット活性を最小にするのに、ソフトウェアツールが用いられてよい。オフターゲット活性は、切断以外であり得る。例えば、Cpf1分子(例えば、AsCpf1、LbCpf1、またはLb2Cpf1)と共に用いられることとなるgRNA分子の可能な各標的化ドメインについて、ソフトウェアツールは、特定の最大数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)のミスマッチ塩基対を含有するゲノム全体にわたって、全ての可能なオフターゲット配列を同定することができる。各オフターゲット配列での切断効率は、例えば、実験的に誘導される重みづけスキームを用いて予測され得る。例えば、gRNAベクター構築のための自動化された試薬デザイン、オンターゲットサーベイヤーアッセイ用のプライマー設計、および次世代シーケンシングを介したオフターゲット切断のハイスループット検出と定量化のためのプライマーデザインなどのその他の機能もまた、ツールに包含され得る。候補gRNA分子は、当該技術分野で周知の方法によって、またはセクションIVに記載されようにして、評価され得る。
特定の実施形態では、Cpf1分子と共に使用されるgRNAが、例えば、公共ツールcas-offinderに基づく特定用途向けgRNA設計ソフトウェアを使用するなど、DNA配列検索アルゴリズムを使用して同定される(Bae et al.Bioinformatics.2014;30(10):1473-1475)。前記特定用途向けgRNA設計ソフトウェアは、それらの全ゲノムでのオフターゲット性向を計算した後に、ガイドをスコアする。典型的に、完全な一致から7つのミスマッチに至るマッチが、17~24の長さに至るガイドのために検討される。ひとたびオフターゲット部位が計算的に判定されたら、各ガイドについて集約スコアが計算されて、ウェブインタフェースを使用して、表形式の出力に要約された。PAM配列(例えば、(T)xN PAM、例えば、TTTN PAM)に隣接する可能なgRNA部位を同定するのに加えて、ソフトウェアはまた、選択されたgRNA部位と、1、2、3つ以上のヌクレオチドが異なる、全てのPAM隣接配列も同定する。各遺伝子のゲノムのDNA配列は、UCSCゲノムブラウザから得られ、配列は、公的に利用可能なRepeatMaskerプログラムを使用して、反復要素についてスクリーニングされる。RepeatMaskerは、反復要素および低複雑度領域について、供試DNA配列を検索する。結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細な注釈である。
同定に続いて、gRNAは、標的部位までの距離に基づいて(妥当な(relavant)PAMを含有するヒトゲノム中の近いマッチの同定に基づいて)階層に格付けされた。特定の実施形態では、AsCpf1、LbCpf1、またはLb2Cpf1について、PAMは、TTTN PAMである。第1の階層gRNA分子についての標的化ドメインは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBC遺伝子中の開始コドンの下流のコード配列の最初の500bp以内を標的化する。第2の階層gRNA分子についての標的化ドメインは、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBC遺伝子のコード配列の残りを標的化する。特定の筋書きでは、遺伝子のコード配列が500bpよりも短い場合、gRNA分子の標的化ドメインは全て、第1の階層に含まれた。階層は、非包括的であることに留意されたい(各gRNAは、ストラテジーについて1回のみ列挙される)。
表1は、第1のデザインおよび階層化ストラテジーに従う例示的な標的化ドメインを提供する。一例として、18量体、19量体、20量体、21量体、22量体、23量体、または24量体の標的化ドメインがデザインされた。FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の発現のノックアウトに関して、この階層化ベースのアプローチを用いて同定された、AsCpf1、LbCpf-1、またはLb2Cpf1分子と共に用いられるように設計された例示的なgRNA(配列番号によって言及される)が、表1に記載される。特定の実施形態では、標的化ドメインは、相補的な塩基の対形成により、標的ドメインにハイブリダイズする。表1の配列番号1~3707で示されるいずれの標的化ドメインも、AsCpf1、LbCpf1、またはLb2Cpf1分子と共に用いられて、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/またはTRBC遺伝子の発現を低下させ、減少させ、または抑制することができる。
III.Cpf1分子
様々な種のCpf1分子が、本明細書中で開示される方法および組成物に用いられ得る。特定の実施形態では、Cpf1分子は、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種(例えばBV3L6株)分子(「AsCpf1」)、ラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(例えばND2006株)分子(「LbCpf1」)、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(例えばMA2020株)分子(「Lb2Cpf1」)から選択される。
様々な種のCpf1分子が、本明細書中で開示される方法および組成物に用いられ得る。特定の実施形態では、Cpf1分子は、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種(例えばBV3L6株)分子(「AsCpf1」)、ラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(例えばND2006株)分子(「LbCpf1」)、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)(例えばMA2020株)分子(「Lb2Cpf1」)から選択される。
本明細書中で用いられる用語Cpf1分子またはCpf1ポリペプチドは、gRNA分子と相互作用することができ、そしてgRNA分子と協調して、標的ドメインおよびPAM配列を含む部位に復帰(home)または局在することができる分子またはポリペプチドを指す。本明細書中で用いられる用語Cpf1分子およびCpf1ポリペプチドは、天然に存在するCpf1分子、および、例えば、基準配列、例えば、天然に存在する最も類似したCpf1分子から、少なくとも1つのアミノ酸残基が異なる、操作された、改変された、または修飾されたCpf1分子またはCpf1ポリペプチドを含む。
フランシセラ・ノビシダ(Francisella novicida)U112 Cpf1(「FnCpf1」)分子の構造が決定されている(Zetsche et al.,Cell(2015);163:759-771)。Cpf1は、トランス活性化crRNA(tracrRNA)を欠く単一RNA誘導エンドヌクレアーゼである。その全体が参照により援用されるZetsche(2015)参照。Cpf1は、標的DNAを切断するために、短いTリッチプロトスペーサー隣接モチーフ(「PAM」)を利用する。同文献参照。Cpf1は、スタガーDNA二本鎖切断を介してDNAを切断して、4ntまたは5ntの5’突出部を付与する。同文献参照。5’突出部は、非相同末端結合(NHEJ)機構を介した遺伝子挿入を容易にすることができる。AsCpf1およびLbCpf1は、ヒト細胞においてヌクレアーゼ活性を示すことが示されている。同文献参照。天然に存在するCpf1分子は、N末端混合アルファ/ベータドメインおよびC末端RuvC様エンドヌクレアーゼドメイン(「RuvCドメイン」)を含む。RuvCドメインは、3つの分離したRuvCモチーフ:RuvC I、RuvCII、およびRuvCIIIを含む。Cas9と異なり、Cpf1は、HNHエンドヌクレアーゼドメインを欠いている。また、天然に存在するCpf1分子は、RuvC IとRuvC IIの間にらせん形の領域を、そしてRuvC IIとRuvC IIIの間にジンクフィンガー様ドメインを含む。天然に存在するCpf1分子の構造は、Zetsche(2015)に記載されている。
RuvCドメインは、FnCpf1の全ての触媒残基、例えば、D917、E1006、およびD1255を保持する。RuvCドメインは、標的DNA、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBCの双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生じさせる。
本開示のCpf1分子またはCpf1ポリペプチドは、ガイドRNA(gRNA)分子と相互作用し、そしてgRNA分子と協調して、標的ドメインおよびPAM配列を含む部位に局在する。特定の実施形態では、標的核酸と相互作用して、これを切断するCpf1分子またはCpf1ポリペプチドの能力は、PAM配列依存的である。PAM配列は、標的核酸中の配列である。特定の実施形態では、標的核酸の切断は、PAM配列の上流で起こる。特定の実施形態では、標的核酸の切断は、PAM配列の下流で起こる。異なる細菌種由来のCpf1分子は、異なる配列モチーフ(例えばPAM配列)を認識することができる。特定の実施形態では、PAMは、TリッチPAMである。特定の実施形態では、PAMは、ヌクレオチド配列(T)xNを有し、式中、Xは、1~10であり、Nは、A、G、C、またはTである。特定の実施形態では、Xは2であるので、PAMはTTNである。特定の実施形態では、Xは3であるので、PAMはTTTNである。特定の実施形態では、Cpf1分子(例えば、AsCpf1、LbCpf1、またはLb2Cpf1)は、配列モチーフTTTNを認識して、当該配列から1~24(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24)bp下流の標的核酸配列の切断を導く。PAM配列を認識するCpf1分子の能力は、Pattanayak et al.,NATURE BIOTECHNOLOGY(2013);31(9):839-843に記載される生体外選択アッセイによって判定され得る。
特定の実施形態では、Cpf1分子またはCpf1ポリペプチドは:
以下に対して少なくとも約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、もしくは約99%相同であり;
以下と比較した場合にアミノ酸残基の約2%、約5%、約10%、約15%、約20%、約30%、もしくは約40%以下が異なり;
以下と少なくとも1、2、5、10、もしくは20個のアミノ酸が、しかし100、80、70、60、50、40、もしくは30個以下のアミノ酸が異なり;または
以下と同一であるアミノ酸配列を含む;
本明細書中で開示されるあらゆるCpf1分子配列、または天然に存在するCpf1分子配列、例えば、本明細書中で列挙され、もしくはZetsche(2015)に記載される種由来のCpf1分子。
以下に対して少なくとも約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、もしくは約99%相同であり;
以下と比較した場合にアミノ酸残基の約2%、約5%、約10%、約15%、約20%、約30%、もしくは約40%以下が異なり;
以下と少なくとも1、2、5、10、もしくは20個のアミノ酸が、しかし100、80、70、60、50、40、もしくは30個以下のアミノ酸が異なり;または
以下と同一であるアミノ酸配列を含む;
本明細書中で開示されるあらゆるCpf1分子配列、または天然に存在するCpf1分子配列、例えば、本明細書中で列挙され、もしくはZetsche(2015)に記載される種由来のCpf1分子。
特定の実施形態では、Cpf1分子またはCpf1ポリペプチドは、基準Cpf1分子または基準Cpf1ポリペプチドと異なる、操作されたCpf1分子または操作されたCpf1ポリペプチドである。特定の実施形態では、基準Cpf1分子または基準Cpf1ポリペプチドは、天然に存在するCpf1分子またはCpf1ポリペプチドである。特定の実施形態では、操作されたCpf1分子または操作されたCpf1ポリペプチドは、基準Cpf1分子または基準Cpf1ポリペプチドのヌクレアーゼ(例えばエンドヌクレアーゼ)活性を保持し、または実質的に保持する。特定の実施形態では、操作されたCpf1分子または操作されたCpf1ポリペプチドは、基準Cpf1分子または基準Cpf1ポリペプチドの少なくとも約70%、約80%、約90%、約95%、または約99%のヌクレアーゼ活性を保持する。
基準Cpf1分子、例えば、天然に存在するCpf1分子に対する1つまたは複数の突然変異または改変が、導入され得る。そのような突然変異または改変は、置換(例えば、保存的置換または非必須アミノ酸の置換);挿入;および/または欠失を含み得る。本明細書中で用いられる用語「非必須」アミノ酸残基は、Cpf1活性(例えば、ヌクレアーゼ/切断活性)を無効にすることなく、または実質的に改変することなく、Cpf1分子、例えば、天然に存在するCpf1分子の野生型配列から改変され得る残基を指す。特定の実施形態では、Cpf1分子またはCpf1ポリペプチドは、基準Cpf1分子、例えば、天然に存在するCpf1分子に対して、1つまたは複数の突然変異または改変、例えば、少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、または50個の突然変異または改変であるが、200、100、または80個未満の突然変異または改変を含む。突然変異および改変は、混合アルファ/ベータドメイン、RuvCドメイン、またはアルファ/ベータドメインおよびRuvCドメインの混合中に存在し得る。
特定の実施形態では、操作されたCpf1分子または操作されたCpf1ポリペプチドは、天然に存在するCpf1分子と異なる、例えば、最も近い相同性を有する、天然に存在するCpf1分子と異なる、切断特性を含む。例えば、Cpf1分子またはCpf1ポリペプチドは、以下のように、天然に存在するCpf1分子と異なり得る:例えば、二本鎖核酸の切断(エンドヌクレアーゼ活性)の、例えば、天然に存在するCpf1分子(例えば、AsCpf1、LbCpf-1、またはLb2Cpf1)と比較した軽減もしくは増大を調節する能力;または核酸分子、例えば、二本鎖核酸分子を切断する能力が、除外されていてよい。
特定の実施形態では、操作されたCpf1分子またはCpf1ポリペプチドは、例えば、2つ以上の異なるCpf1分子またはCpf1ポリペプチドの、例えば、異なる種の2つ以上の、天然に存在するCpf1分子の、融合である。例えば、一種の天然に存在するCpf1分子のフラグメントが、第2の種のCpf1分子のフラグメントに融合されてよい。
天然に存在するCpf1分子は、特定のPAM配列、例えば、例えばAsCpf1、LbCpf-1、およびLb2Cpf1について先で記載された、5’-TTTN PAM配列を認識することができる。特定の実施形態では、操作されたCpf1分子または操作されたCpf1ポリペプチドは、基準Cpf1分子と比較して、PAM特異性を改変している(例えば、PAM認識に影響を与える)。例えば、天然に存在するCpf1分子は、例えば、PAM配列を改変して、例えば、Cpf1分子またはCpf1ポリペプチドが認識するPAM認識を改変して、オフターゲット部位を減少させ、かつ/または特異性を向上させ;またはPAM認識要件を排除するように、改変されていてよい。特定の実施形態では、Cpf1分子は改変され得て、例えば、PAM認識配列の長さが増大され、および/またはCpf1特異性が高い同一性レベルに改善されて、例えば、オフターゲット部位が減少されて特異性が増大される。特定の実施形態では、PAM認識配列の長さは、少なくとも4、5、6、7、8、9、10または15アミノ酸長である。
異なるPAM配列を認識しおよび/またはオフターゲット活性の低下を有するCpf1分子またはCpf1ポリペプチドは、指向性進化を使用して作成され得る。Cpf1分子の指向性進化のために使用され得る代表的な方法およびシステムは、例えば、Esvelt et al.Nature 2011,472(7344):499-503に記載される。候補Cpf1分子は、例えば、セクションIVに記載される方法によって評価され得る。
特定の実施形態では、操作されたCpf1分子および操作されたCpf1ポリペプチドは、分子のサイズを引き下げる1つまたは複数の欠失を含む一方、所望されるCpf1特性、例えば、本質的に固有の構造、Cpf1ヌクレアーゼ活性(例えば、エンドヌクレアーゼ活性;すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生じさせる能力)、および/または核酸分子、例えば、標的核酸もしくはgRNAの認識活性を保持し、または実質的に保持する(例えば、実質的に影響を与えない、または低下させない)。操作されたCpf1分子のサイズが小さいほど、送達方法の融通性を増大させることができ、これによって、ゲノム編集の有用性が増す。特定の実施形態では、操作されたCpf1分子および操作されたCpf1ポリペプチドはさらに、1つまたは複数のリンカーを含み、リンカーは、欠失の側面に位置するアミノ酸残基間に配置される。
特定の実施形態では、Cpf1分子またはCpf1ポリペプチドをコードする核酸組成物は、合成核酸配列を含む。例えば、合成核酸配列は、化学的に修飾されていてよい。特定の実施形態では、配列mRNAは、以下の特性の1つまたは複数、例えば全てを有する:キャッピング、ポリアデニル化、5-メチルシチジンおよび/またはシュードウリジンによる置換。
加えて、または代わりに、合成核酸配列は、コドン最適化されていてよく、例えば、少なくとも1つの一般的でないコドンまたはあまり一般的でないコドンが、一般的なコドンによって置換されている。例えば、合成核酸は、例えば、例えば本明細書中に記載される哺乳類発現系における発現のために最適化された、最適化メッセンジャーmRNAの合成を誘導し得る。
加えて、または代わりに、配列分子または配列ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列(NLS)を含んでよい。核局在化配列は、当該技術において知られている。
Cpf1活性に関与する領域、例えば、標的核酸分子および/またはgRNAとの境界面から空間的に遠位に位置する低保存領域または非保存領域は、Cpf1活性に実質的に影響を与えない、またはこれを低下させない欠失の候補領域または候補ドメインを表す。
配列比較のために、典型的に1つの配列が参照配列の役割を果たし、それと試験配列とが比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力されて、必要ならば部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータが使用され得てまたは代案のパラメータが指定され得る。次に配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、標準配列と比較して、試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列アラインメント法は、当該技術分野で周知である。比較のための最適配列アラインメントは、例えば、Smith and Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2:482cの局所相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443の相同性アライメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理実装(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)によって、または手動アライメントおよび目視検査(例えば、Brent et al.,(2003)Current Protocols in Molecular Biologyを参照されたい)によって、実施され得る。
配列同一性百分率および配列類似性を判定するのに適するアルゴリズムの2つの例は、それぞれ、Altschul et al.,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402;およびAltschul et al.,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410に記載される、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST分析実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公的に利用可能である。
2つのアミノ酸配列間の同一性百分率はまた、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている、E.Meyers and W.Miller,(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-17)のアルゴリズムを使用して、PAM120重み残基表、ギャップ長ペナルティ12およびギャップペナルティ4を使用して、評価され得る。さらに、2つのアミノ酸配列間の同一性百分率は、GCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで利用可能)のGAPプログラムに組み込まれている、Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:444-453)アルゴリズムを使用して、Blossom62マトリックスまたはPAM250マトリックスのどちらか、およびギャップ重み付け16、14、12、10、8、6、または4および長さ重み付け1、2、3、4、5、または6を使用して、判定され得る。
IV.候補分子の機能解析
候補Cpf1分子、候補gRNA分子、候補Cpf1分子/gRNA分子複合体は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるように評価され得る。例えば、Cpf1分子のエンドヌクレアーゼ活性評価する代表的な方法は、例えば、Zetsche et al.,Cell(2015);163:759-771に記載される。
候補Cpf1分子、候補gRNA分子、候補Cpf1分子/gRNA分子複合体は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるように評価され得る。例えば、Cpf1分子のエンドヌクレアーゼ活性評価する代表的な方法は、例えば、Zetsche et al.,Cell(2015);163:759-771に記載される。
結合および切断アッセイ:Cpf1分子のエンドヌクレアーゼ活性を試験する
Cpf1分子/gRNA分子複合体が、標的核酸を結合および切断する能力は、プラスミド切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、合成または生体外転写gRNA分子が、95℃に加熱して緩慢に室温に冷却することで、反応に先だってプレアニールされる。天然または制限消化直線化プラスミドDNA(300ng(約8nM))が、10mMのMgCl2存在下または不在下において、Cpf1プラスミド切断緩衝液(20mMのHEPES pH7.5、150mMのKCl、0.5mMのDTT、0.1mMのEDTA)中の精製Cpf1タンパク質分子(50~500nM)およびgRNA(50~500nM、1:1)と共に、37℃で60分間インキュベートされる。反応は、5×DNAローディングバッファー(30%グリセロール、1.2%SDS、250mMのEDTA)によって停止され、0.8または1%アガロースゲル電気泳動法によって分離され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。得られた分解産物は、Cpf1分子が、双方のDNA鎖を切断するか、または二本鎖の1本のみを切断するかどうかを示す。例えば、直鎖DNA生成物は、双方のDNA鎖の切断を示す。ニックの入った開環状生成物は、二本鎖の1本のみが切断されていることを示す。
Cpf1分子/gRNA分子複合体が、標的核酸を結合および切断する能力は、プラスミド切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、合成または生体外転写gRNA分子が、95℃に加熱して緩慢に室温に冷却することで、反応に先だってプレアニールされる。天然または制限消化直線化プラスミドDNA(300ng(約8nM))が、10mMのMgCl2存在下または不在下において、Cpf1プラスミド切断緩衝液(20mMのHEPES pH7.5、150mMのKCl、0.5mMのDTT、0.1mMのEDTA)中の精製Cpf1タンパク質分子(50~500nM)およびgRNA(50~500nM、1:1)と共に、37℃で60分間インキュベートされる。反応は、5×DNAローディングバッファー(30%グリセロール、1.2%SDS、250mMのEDTA)によって停止され、0.8または1%アガロースゲル電気泳動法によって分離され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。得られた分解産物は、Cpf1分子が、双方のDNA鎖を切断するか、または二本鎖の1本のみを切断するかどうかを示す。例えば、直鎖DNA生成物は、双方のDNA鎖の切断を示す。ニックの入った開環状生成物は、二本鎖の1本のみが切断されていることを示す。
代案としては、Cpf1分子/gRNA分子複合体が、標的核酸に結合して切断する能力は、オリゴヌクレオチドDNA切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、DNAオリゴヌクレオチド(10pmol)が、1×T4ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液中の5単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼおよび約3~6pmol(約20~40mCi)の[γ-32P]-ATPと、50μLの反応物中で37℃で30分間インキュベートすることで、放射性標識される。加熱不活性化(65℃で20分間)後、カラムに通して反応物が精製され、組み込まれていない標識が除去される。標識オリゴヌクレオチドと、等モル量の未標識相補的オリゴヌクレオチドとの95℃で3分間のアニーリングによって、二本鎖基質(100nM)が生成され、室温への緩慢な冷却がそれに続く。切断アッセイでは、95℃で30秒間加熱することでgRNA分子がアニールされ、室温への緩慢な冷却がそれに続く。Cpf1(500nM最終濃度)が、切断アッセイ緩衝液(20mMのHEPES pH7.5、100mMのKCl、5mMのMgCl2、1mMのDTT、5%グリセロール)中のアニールされたgRNA分子(500nM)と共に、総容積9μlでプレインキュベートされる。1μlの標的DNA(10nM)の添加によって反応が開始され、37℃で1時間インキュベートされる。20μlのローディング色素(ホルムアミド中の5mMのEDTA、0.025%SDS、5%グリセロール)の添加によって反応物がクエンチされ、95℃で5分間加熱される。分解産物は、7M尿素を含有する12%変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、ホスホロイメージングによって視覚化される。得られた分解産物は、相補鎖、非相補鎖、またはその双方が切断されたかどうかを示す。
これらのアッセイの片方または双方を使用して、候補gRNA分子または候補Cpf1分子の適合性が評価され得る。
結合アッセイ:Cpf1分子の標的DNAへの結合を試験する
Cpf1分子の標的DNAへの結合を評価する代表的な方法は、例えば、Zetsche et al.,Cell(2015);163:759-771に記載される。
Cpf1分子の標的DNAへの結合を評価する代表的な方法は、例えば、Zetsche et al.,Cell(2015);163:759-771に記載される。
例えば、電気泳動移動度シフト解析では、脱イオン水中で各鎖(10nmol)を混合して、95℃で3分間加熱し、室温に緩慢に冷却することで、標的DNA二本鎖が形成される。全てのDNAは、1×TBEを含有する8%天然ゲル上で精製される。DNAバンドは、UVシャドーイングによって視覚化され、切除されて、ゲル小片をDEPC処理H2Oに浸漬することで溶出される。溶出されDNAは、エタノール沈殿されて、DEPC処理H2Oに溶解される。DNAサンプルは、[γ-32P]-ATPを使用して、T4ポリヌクレオチドキナーゼで37℃で30分間にわたり5’末端標識される。ポリヌクレオチドキナーゼは、65℃で20分間加熱変性され、カラムを使用して、組み込まれていない放射性標識が除去される。結合アッセイは、20mMのHEPES pH7.5、100mMのKCl、5mMのMgCl2、1mMのDTT、および10%グリセロールを含有する緩衝液中で、総容積10μlで実施される。Cpf1タンパク質分子は、等モル量のプレアニールgRNA分子でプログラムされて、100pMから1μMに滴定される。放射性標識DNAが、20pMの最終濃度に添加される。サンプルは、37℃で1時間インキュベートされ、1×TBEおよび5mMのMgCl2を含有する8%天然ポリアクリルアミドゲル上で、4℃で分離される。ゲルは乾燥されて、DNAはホスホロイメージングによって視覚化される。
示差走査型蛍光定量法(Flourimetry)(DSF)
Cpf1-gRNAリボ核タンパク質(RNP)複合体の熱安定性は、DSFによって測定され得る。この技術は、例えば、gRNAなどの結合RNA分子の添加などの好ましい条件下で増大され得る、タンパク質の熱安定性を測定する。
Cpf1-gRNAリボ核タンパク質(RNP)複合体の熱安定性は、DSFによって測定され得る。この技術は、例えば、gRNAなどの結合RNA分子の添加などの好ましい条件下で増大され得る、タンパク質の熱安定性を測定する。
アッセイは、1つはgRNA:Cpf1タンパク質の最良の化学量論比を試験し、もう1つはRNP形成のための最良の溶液条件を判定する、2つの異なるプロトコルを使用して実施される。
RNP複合体を形成するための最良の溶液を判定するために、Cpf1の2uM水溶液+10×SYPRO Orange(登録商標)(Life Techonologiesカタログ番号S-6650)が384ウェルプレート内に分注される。次に、様々なpHの溶液中で希釈された等モル量のgRNA、および塩が添加される。室温で10秒間インキュベートし、短時間遠心分離してあらゆる気泡を除去いた後、 Bio-Rad CFX Manager ソフトウェアと共に、Bio-Rad CFX384(商標)Real-Time System C1000 Touch(商標)サーマルサイクラーを使用して、10秒毎に1℃の温度増大で20℃から90℃への勾配が実行される。
第2のアッセイは、上記アッセイ1からの最適緩衝液中で、様々な濃度のgRNAと2uM Cpf1を混合して、384ウェルプレート内で、室温で10秒間インキュベートすることからなる。等容積の最適緩衝液+10×SYPRO Orange(登録商標)(Life Techonologiesカタログ番号S-6650)が添加され、プレートはMicroseal(登録商標)B粘着剤(MSB-1001)で密封される。あらゆる気泡を除去するための短時間遠心分離に続いて、Bio-Rad CFX Managerソフトウェアと共に、Bio-Rad CFX384(商標)Real-Time System C1000 Touch(商標)サーマルサイクラーを使用して、10秒毎に1℃の温度増大で20℃から90℃への勾配が実行される。
V.ゲノム編集アプローチ
一般に、本明細書に記載される方法に従った任意の遺伝子の改変は、任意の機序によって媒介され得て、任意の方法は特定の機序に限定されないものと理解される。遺伝子改変に関連し得る代表的機序としては、非相同末端結合(例えば、古典的または代替)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)、相同指向修復(例えば、内在性供与体テンプレート媒介性)、およびSDSA(合成依存性鎖アニーリング)が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書に記載されるのは、NHEJを使用して、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLBまたは、PTPN6、B2M、TRACおよび/またはTRBC遺伝子の対立遺伝子の片方または双方を標的ノックアウトする代表的方法である(セクションV.1を参照されたい)。特定の実施形態では、ノックアウトのために、開示される方法が、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、またはPTPN6、B2M、TRACおよびTRBC遺伝子の2つ以上を標的化してもよいことがさらに検討される。
一般に、本明細書に記載される方法に従った任意の遺伝子の改変は、任意の機序によって媒介され得て、任意の方法は特定の機序に限定されないものと理解される。遺伝子改変に関連し得る代表的機序としては、非相同末端結合(例えば、古典的または代替)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)、相同指向修復(例えば、内在性供与体テンプレート媒介性)、およびSDSA(合成依存性鎖アニーリング)が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書に記載されるのは、NHEJを使用して、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLBまたは、PTPN6、B2M、TRACおよび/またはTRBC遺伝子の対立遺伝子の片方または双方を標的ノックアウトする代表的方法である(セクションV.1を参照されたい)。特定の実施形態では、ノックアウトのために、開示される方法が、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、またはPTPN6、B2M、TRACおよびTRBC遺伝子の2つ以上を標的化してもよいことがさらに検討される。
V.1 遺伝子ターゲッティングのためのNHEJアプローチ
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導非相同末端結合(NHEJ)を使用して、標的遺伝子特異的ノックアウトが実施され得る。ヌクレアーゼ誘導NHEJはまた、対象遺伝子中の配列挿入を除去す(例えば、欠失させ)るのにも使用され得る。
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導非相同末端結合(NHEJ)を使用して、標的遺伝子特異的ノックアウトが実施され得る。ヌクレアーゼ誘導NHEJはまた、対象遺伝子中の配列挿入を除去す(例えば、欠失させ)るのにも使用され得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に関連するゲノムの改変は、ヌクレアーゼ誘導NHEJと、NHEJ修復経路の誤りがちな性質とに依存すると考えられる。NHEJは、2つの末端を共に連結することで、DNA中の二本鎖切断を修復する;しかし、通常、元の配列は、それらが二本鎖切断によって形成された真にその通りの2つの適合性末端が、完璧にライゲートされた場合に限り、復元される。二本鎖切断のDNA末端は、しばしば酵素的プロセッシングの対象であり、末端の再結合に先だって、片方または双方の鎖に、ヌクレオチドの付加または除去がもたらされる。これは、NHEJ修復部位におけるDNA配列の挿入および/または欠失(インデル)変異の存在をもたらす。これらの変異の3分の2は、典型的に、読み枠を改変し、したがって、非機能性タンパク質が生じる。それに加えて、読み枠を維持するが、顕著な量の配列を挿入または欠失させる変異は、タンパク質の機能性を破壊し得る。タンパク質の重要な機能ドメインの変異は、重要でない領域の変異よりもおそらく許容性が低いので、これは遺伝子座依存性である。
NHEJによって生成されるインデル変異は、自然界では予測不可能である;しかし、所与の切断部位では、おそらく小規模なマイクロホモロジー領域のために、特定のインデル配列が好まれ、母集団中で大きな比率を占める。欠失の長さは、幅広く変動し得て;最も一般的には、1~50bpの範囲であるが、それらは100~200bpを超える範囲に容易に達し得る。挿入はより短い傾向があり、多くの場合、切断部位に隣接して取り囲む、短い配列重複を含む。しかし、大きな挿入を得ることが可能であり、これらの場合、挿入配列は、多くの場合、ゲノムのその他の領域に、または細胞内に存在するプラスミドDNAにトレースされている。
NHEJは変異原性過程であるので、特定の最終配列の生成が要求されない限り、それはまた小規模な配列モチーフを欠失させるのにも使用され得る。二本鎖切断が、短い標的配列の近くで標的化される場合、NHEJによって引き起こされる修復欠失変異は、頻繁に望まれないヌクレオチドに及び、したがってそれを除去する。より大型のDNA断片の欠失では、配列の両側に1つずつ2つの二本鎖切断が導入されて、介在配列全体が除去され、末端の間にNHEJがもたらされ得る。これらのアプローチの双方を使用して、特定のDNA配列が欠失され得る;しかし、NHEJの誤りがちな性質は、修復部位に、インデル変異をなおも生成してもよい。
例えば、対象遺伝子の早期コード領域のようなコード領域などの遺伝子に標的化されるNHEJ媒介インデルを使用して、対象遺伝子がノックアウト(すなわち発現排除)され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域は、コード配列の第1のエクソン内の、または転写開始部位の500bp以内(例えば、500、450、400、350、300、250、200、150、100または50bp未満)の転写開始部位直後の配列を含む。
特定の実施形態では、NHEJ媒介インデルが、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子中に導入される。Cpf1二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を2つのT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子のいずれか2つの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、双方の遺伝子を標的化する個々のgRNAまたはgRNA対が、Cpf1二本鎖ヌクレアーゼと一緒に提供される。Cpf1二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を3つのT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子のいずれか3つの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、3つ全ての遺伝子を標的化する個々のgRNAまたはgRNA対が、Cpf1二本鎖ヌクレアーゼと共に提供される。Cpf1二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を4つのT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子のいずれか4つの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、4つ全ての遺伝子を標的化する個々のgRNAまたはgRNA対が、Cpf1二本鎖ヌクレアーゼと共に提供される。Cpf1二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を5つのT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子のいずれか5つの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、5つ全ての遺伝子を標的化する個々のgRNAまたはgRNA対が、Cpf1二本鎖ヌクレアーゼと共に提供される。Cpf1二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を6つのT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子のいずれか6つの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、6つ全ての遺伝子を標的化する個々のgRNAまたはgRNA対が、Cpf1二本鎖ヌクレアーゼと共に提供される。Cpf1二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を7つのT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子のいずれか7つの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、7つ全ての遺伝子を標的化する個々のgRNAまたはgRNA対が、Cpf1二本鎖ヌクレアーゼと共に提供される。Cpf1二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を8つのT細胞発現遺伝子、例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子のそれぞれの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、8つ全ての遺伝子を標的化する個々のgRNAまたはgRNA対が、Cpf1二本鎖ヌクレアーゼと共に提供される。
標的位置に対する二本鎖切断の配置
NHEJ媒介インデルを誘導する目的で、gRNAおよびCpf1ヌクレアーゼが二本鎖切断を生じさせる特定の実施形態では、gRNA、例えば、ユニモジュラーgRNA分子が、標的位置のヌクレオチドの近傍に、1つの二本鎖切断を配置するように構成されている。特定の実施形態では、切断部位は、標的位置から0~30bp(例えば、標的位置から30bp未満、25bp未満、20bp未満、15bp未満、10bp未満、9bp未満、8bp未満、7bp未満、6bp未満、5bp未満、4bp未満、3bp未満、2bp未満、または1bp)離れている。特定の実施形態では、切断部位は、標的位置から1~24bp離れている。
NHEJ媒介インデルを誘導する目的で、gRNAおよびCpf1ヌクレアーゼが二本鎖切断を生じさせる特定の実施形態では、gRNA、例えば、ユニモジュラーgRNA分子が、標的位置のヌクレオチドの近傍に、1つの二本鎖切断を配置するように構成されている。特定の実施形態では、切断部位は、標的位置から0~30bp(例えば、標的位置から30bp未満、25bp未満、20bp未満、15bp未満、10bp未満、9bp未満、8bp未満、7bp未満、6bp未満、5bp未満、4bp未満、3bp未満、2bp未満、または1bp)離れている。特定の実施形態では、切断部位は、標的位置から1~24bp離れている。
二本鎖切断Cpf1分子は、標的位置の両側切断を生じさせるのに、本明細書中に記載される方法および組成物に用いられ得る。二本鎖切断は、2つの切断間の核酸配列を除去する(例えば、2つの切断間の領域を欠失させる)のに、標的位置の両側で生じ得る。特定の実施形態では、2つのgRNAは、標的位置の両側に二本鎖切断を配置するように構成されている。
V.2 ゲノム編集方法におけるgRNAおよびCpf1分子
本明細書中で開示されるgRNA分子(例えば、セクションIで開示されるもの)は、二本鎖切断を生じさせて標的核酸の配列、例えば、標的位置または標的遺伝的シグネチャを改変する、本明細書中で開示されるCpf1分子(例えば、セクションIIIで開示されるもの)に用いられ得る。特定の実施形態では、例えば、Cpf1分子を標的化して二本鎖切断をもたらす場合に、gRNAは、二本鎖切断を、(i)標的位置の50、100、150、200、250、300、350、400、450、もしくは500ヌクレオチド以内に、または(ii)標的位置が末端切除の領域内にあるほど十分に近くに、配置する。
本明細書中で開示されるgRNA分子(例えば、セクションIで開示されるもの)は、二本鎖切断を生じさせて標的核酸の配列、例えば、標的位置または標的遺伝的シグネチャを改変する、本明細書中で開示されるCpf1分子(例えば、セクションIIIで開示されるもの)に用いられ得る。特定の実施形態では、例えば、Cpf1分子を標的化して二本鎖切断をもたらす場合に、gRNAは、二本鎖切断を、(i)標的位置の50、100、150、200、250、300、350、400、450、もしくは500ヌクレオチド以内に、または(ii)標的位置が末端切除の領域内にあるほど十分に近くに、配置する。
VI.標的細胞
例えば、Cpf1分子/gRNA分子複合体などのCpf1分子およびgRNA分子を使用して、例えば、多種多様な細胞内で標的核酸を編集するなど、細胞が操作され得る。
例えば、Cpf1分子/gRNA分子複合体などのCpf1分子およびgRNA分子を使用して、例えば、多種多様な細胞内で標的核酸を編集するなど、細胞が操作され得る。
特定の実施形態では、細胞は、例えば、本明細書に記載されるような1つまたは複数の標的遺伝子を編集する(例えば、変異を誘導する)ことで操作される。特定の実施形態では、1つまたは複数の標的遺伝子(例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRACおよび/またはTRBC遺伝子)の発現が調節される。特定の実施形態では、細胞は、1つまたは複数の標的遺伝子を編集する(例えば、変異を誘導する)ことで、および/または例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRACおよび/またはTRBC遺伝子などの1つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節することで、生体外で操作されて、対象に投与される。生体外操作のための標的細胞の起源としては、例えば、対象の血液、対象の臍帯血、または対象の骨髄が挙げられる。生体外操作のための標的細胞の起源としては、例えば、異種供与者血液、臍帯血、または骨髄もまた挙げられる。
分子本明細書に記載されるCpf1およびgRNAは、標的細胞に送達され得る。特定の実施形態では、標的細胞は、例えば、CD8+T細胞(例えば、CD8+未感作T細胞、中枢記憶T細胞、またはエフェクター記憶T細胞)、CD4+T細胞、ナチュラルキラーT細胞(NKT細胞)、制御性T細胞(Treg)、幹細胞記憶T細胞、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)または樹状細胞などのT細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、例えば、対象から作成されて、操作され、改変された(例えば、変異誘導された)、または例えば、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRACおよび/またはTRBC遺伝子などの1つまたは複数の標的遺伝子の発現が操作されて、例えば、CD8+T細胞(例えば、CD8+未感作T細胞、中枢記憶T細胞、またはエフェクター記憶T細胞)、CD4+T細胞、幹細胞記憶T細胞などのT細胞、リンパ系前駆細胞または造血幹細胞に分化した、誘導多能性幹(iPS)細胞などの、iPS細胞、またはiPS細胞に由来する細胞である。
特定の実施形態では、標的細胞は、特異的T細胞受容体(TCR)遺伝子(例えば、TRACおよびTRBC遺伝子)を含有するように改変されている。特定の実施形態では、TCRは、例えば、がん胎児性抗原(CEA)、GP100、T細胞1によって認識されるメラノーマ抗原(MART1)、メラノーマ抗原A3(MAGEA3)、NYESO1またはp53などの腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する。
特定の実施形態では、標的細胞は、特異的キメラ抗原受容体(CAR)を含有するように改変されている。特定の実施形態では、CARは、例えば、CD19、CD20、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、CD171、CEA、ERBB2、GD2、α-葉酸受容体、ルイスY抗原、前立腺特異的膜抗原(PSMA)または腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72)などの腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する。
特定の実施形態では、標的細胞は、例えば、TCRまたはCARなどによって、以下の腫瘍抗原の1つまたは複数に結合するように改変されている。腫瘍抗原としては、AD034、AKT1、BRAP、CAGE、CDX2、CLP、CT-7、CT8/HOM-TES-85、cTAGE-1、フィビュリン-1、HAGE、HCA587/MAGE-C2、hCAP-G、HCE661、HER2/neu、HLA-Cw、HOM-HD-21/ガレクチン9、HOM-MEEL-40/SSX2、HOM-RCC-3.1.3/CAXII、HOXA7、HOXB6、Hu、HUB1、KM-HN-3、KM-KN-1、KOC1、KOC2、KOC3、KOC3、LAGE-1、MAGE-1、MAGE-4a、MPP11、MSLN、NNP-1、NY-BR-1、NY-BR-62、NY-BR-85、NY-CO-37、NY-CO-38、NY-ESO-1、NY-ESO-5、NY-LU-12、NY-REN-10、NY-REN-19/LKB/STK11、NY-REN-21、NY-REN-26/BCR、NY-REN-3/NY-CO-38、NY-REN-33/SNC6、NY-REN-43、NY-REN-65、NY-REN-9、NY-SAR-35、OGFr、PLU-1、Rab38、RBPJκ、RHAMM、SCP1、SCP-1、SSX3、SSX4、SSX5、TOP2A、TOP2B、またはチロシナーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
VII.送達、調合物、および投与経路
構成要素、例えば、Cpf1分子およびgRNA分子は、種々の送達方法および調合物を用いて、種々の形態で標的細胞中に導入され得る。例えば、表2および表3参照。Cpf1またはgRNA構成要素が送達のためにDNAとしてコードされる場合、DNAは、必須ではないが典型的に、発現をもたらすための制御領域を含んでもよく、例えば、プロモーターを含む。Cpf1分子配列に有用なプロモーターとして、例えば、CMVプロモーター、EF-1aプロモーター、EFSプロモーター、MSCVプロモーター、PGKプロモーター、CAGプロモーター、骨格アルファアクチンプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、ジストロフィンプロモーター、アルファミオシン重鎖プロモーター、および平滑筋アクチンプロモーターが挙げられる。gRNAに有用なプロモーターとして、例えば、H1、7SJ、EF-1a、tRNA、またはU6プロモーターが挙げられる。強度が同程度の、または異なるプロモーターが、構成要素の発現を調整するのに選択されてよい。Cpf1分子をコードする配列は、核局在化シグナル(NLS)、例えば、SV40 NLSを含んでもよい。特定の実施形態では、Cpf1分子をコードする配列は、少なくとも2つの核局在化シグナルを含む。特定の実施形態では、Cpf1分子またはgRNA分子のプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、または細胞特異的であってもよい。
構成要素、例えば、Cpf1分子およびgRNA分子は、種々の送達方法および調合物を用いて、種々の形態で標的細胞中に導入され得る。例えば、表2および表3参照。Cpf1またはgRNA構成要素が送達のためにDNAとしてコードされる場合、DNAは、必須ではないが典型的に、発現をもたらすための制御領域を含んでもよく、例えば、プロモーターを含む。Cpf1分子配列に有用なプロモーターとして、例えば、CMVプロモーター、EF-1aプロモーター、EFSプロモーター、MSCVプロモーター、PGKプロモーター、CAGプロモーター、骨格アルファアクチンプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、ジストロフィンプロモーター、アルファミオシン重鎖プロモーター、および平滑筋アクチンプロモーターが挙げられる。gRNAに有用なプロモーターとして、例えば、H1、7SJ、EF-1a、tRNA、またはU6プロモーターが挙げられる。強度が同程度の、または異なるプロモーターが、構成要素の発現を調整するのに選択されてよい。Cpf1分子をコードする配列は、核局在化シグナル(NLS)、例えば、SV40 NLSを含んでもよい。特定の実施形態では、Cpf1分子をコードする配列は、少なくとも2つの核局在化シグナルを含む。特定の実施形態では、Cpf1分子またはgRNA分子のプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、または細胞特異的であってもよい。
表3は、本明細書中に記載される、CRISPR/Cpf1系の構成要素、例えば、Cpf1分子構成要素およびgRNA分子構成要素についての種々の送達方法を要約する。
Cpf1分子および/または1つもしくは複数のgRNA分子の、DNAベースの送達
Cpf1分子および/またはgRNA分子をコードする核酸組成物は、当該技術分野で既知の方法によって、または本明細書中に記載されるようにして、対象に投与され得、または細胞中に送達され得る。例えば、Cpf1をコードするDNAおよび/またはgRNAをコードするDNAは、例えば、ベクター(例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター)、非ベクターベースの方法(例えば、裸のDNAまたはDNA複合体を用いる)、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
Cpf1分子および/またはgRNA分子をコードする核酸組成物は、当該技術分野で既知の方法によって、または本明細書中に記載されるようにして、対象に投与され得、または細胞中に送達され得る。例えば、Cpf1をコードするDNAおよび/またはgRNAをコードするDNAは、例えば、ベクター(例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター)、非ベクターベースの方法(例えば、裸のDNAまたはDNA複合体を用いる)、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
特定の実施形態では、Cpf1をコードするDNAおよび/またはgRNAをコードするDNAは、ベクター(例えば、ウイルスベクター/ウイルスまたはプラスミド)によって送達される。
特定の実施形態では、ベクターは、Cpf1分子および/またはgRNA分子をコードする配列を含む。特定の実施形態では、ベクターはさらに、例えば、Cpf1分子配列と融合した、(例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア局在化のための)シグナルペプチドをコードする配列を含む。例えば、ベクターは、Cpf1分子をコードする配列に融合された、核局在化配列(例えばSV40由来)を含んでよい。
例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム侵入部位(IRES)、2A配列、およびスプライス受容体またはドナーなどの1つまたは複数の調節的/制御要素が、ベクターに包含され得る。特定の実施形態では、プロモーターは、RNAポリメラーゼII(例えば、CMVプロモーター)によって認識される。特定の実施形態では、プロモーターは、RNAポリメラーゼIII(例えば、U6プロモーター)によって認識される。特定の実施形態では、プロモーターは、調節プロモーター(例えば、誘導性プロモーター)である。特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターである。
特定の実施形態では、ベクターまたは送達ビヒクルは、ウイルスベクター(例えば、組換えウイルス生成のための)である。特定の実施形態では、ウイルスは、DNAウイルス(例えば、dsDNAまたはssDNAウイルス)である。特定の実施形態では、ウイルスは、RNAウイルス(例えば、ssRNAウイルス)である。代表的なウイルスベクター/ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。
特定の実施形態では、ウイルスは、分裂細胞に感染する。特定の実施形態では、ウイルスは、非分裂細胞に感染する。特定の実施形態では、ウイルスは、分裂および非分裂細胞の双方に感染する。特定の実施形態では、ウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。特定の実施形態では、ウイルスは、例えば、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。特定の実施形態では、ウイルスは、複製能力がある。特定の実施形態では、ウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製および/またはパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための1つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。特定の実施形態では、ウイルスは、Cpf1分子および/またはgRNA分子の一過性の発現を引き起こす。特定の実施形態では、ウイルスは、Cpf1分子および/またはgRNA分子の例えば、少なくとも1週間、2週間、1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、6ヶ月間、9ヶ月間、1年間、2年間、または恒久的などの持続性の発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング容量は、例えば、少なくとも約4kb~少なくとも約30kb、例えば、少なくとも約5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、または50kbなどで変動してもよい。
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、特定の細胞型または組織を認識する。例えば、ウイルスベクターは、異なる/代替のウイルス外被糖タンパク質で偽型化され得;細胞型特異的受容体で操作され得(例えば、標的化リガンド、例えばペプチドリガンド、一本鎖抗体、または成長因子を組み込むための、1つまたは複数のウイルス外被糖タンパク質の遺伝的修飾);かつ/または一方の末端がウイルス糖タンパク質を認識して、他方の末端が標的細胞表面の部分を認識する、二重特異性がある分子ブリッジを有するように操作され得る(例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン-ビオチン、および化学的結合)。
特定の実施形態では、Cpf1をコードするDNAおよび/またはgRNAをコードするDNAは、組換えレトロウイルスによって送達される。特定の実施形態では、レトロウイルス(例えばモローニマウス白血病ウイルス)は、例えば、宿主ゲノム中への統合を可能にする、逆転写酵素を含む。特定の実施形態では、レトロウイルスは、複製能力がある。特定の実施形態では、レトロウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製およびパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための1つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。
特定の実施形態では、Cpf1をコードするDNAおよび/またはgRNAをコードするDNAは、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは、例えば、ウイルス複製に必要な1つまたは複数の遺伝子を含まないなど、複製欠陥である。
特定の実施形態では、Cpf1をコードするDNAおよび/またはgRNAをコードするDNAは、組換えアデノウイルスによって送達される。特定の実施形態では、アデノウイルスは、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。
特定の実施形態では、Cpf1をコードするDNAおよび/またはgRNAをコードするDNAは、組換えAAVによって送達される。特定の実施形態では、AAVは、そのゲノムを、本明細書中に記載されるように、宿主細胞、例えば標的細胞のゲノム中に組み込まない。特定の実施形態では、AAVは、そのゲノムを、本明細書中に記載されるように、宿主細胞、例えば標的細胞のゲノム中に組み込み得る。特定の実施形態では、AAVは、自己相補的アデノ随伴ウイルス(scAAV)、例えば、共にアニールして二本鎖DNAを形成する双方の鎖をパッケージするscAAVである。開示される方法に用いられ得るAAV血清型として、AAV1、AAV2、修飾AAV2(例えば、Y444F、Y500F、Y730F、および/またはS662Vにて修飾)、AAV3、修飾AAV3(例えば、Y705F、Y731F、および/またはT492Vにて修飾)、AAV4、AAV5、AAV6、修飾AAV6(例えば、S663Vおよび/またはT492Vにて修飾)、AAV8、AAV8.2、AAV9、AAV rhl0が挙げられ、偽型AAV、例えば、AAV2/8、AAV2/5、およびAAV2/6もまた、開示された方法に用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載される方法に用いられ得るAAVカプシドは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh32/33、AAV.rh43、AAV.rh64R1、またはAAV7m8由来のカプシド配列である。
特定の実施形態では、Cpf1をコードするDNAおよび/またはgRNAをコードするDNAは、再操作されたAAVカプシド中で送達され、これは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh32/33、AAV.rh43、またはAAV.rh64R1由来のカプシド配列との配列相同性が、例えば、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、または95%以上である。
特定の実施形態では、Cpf1をコードするDNAおよび/またはgRNAをコードするDNAは、キメラAAVカプシドによって送達される。例示的なキメラAAVカプシドとして、以下に限定されないが、AAV9i1、AAV2i8、AAV-DJ、AAV2G9、AAV2i8G9、またはAAV8G9が挙げられる。
特定の実施形態では、Cpf1をコードするDNAおよび/またはgRNAをコードするDNAは、ハイブリッドウイルス、例えば、本明細書中に記載されるウイルスの1つまたは複数のハイブリッドによって送達される。特定の実施形態では、ハイブリッドウイルスは、(例えば、あらゆるAAV血清型の)AAVの、ボカウイルス、B19ウイルス、ブタAAV、ガチョウAAV、ネコAAV、イヌAAV、またはMVMとのハイブリッドである。
パッケージング細胞が使用されて、標的細胞を感染させる能力があるウイルス粒子が形成される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージし得る293細胞、およびレトロウイルスをパッケージし得るψ2細胞またはPA317細胞が挙げられる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的に、パッケージングと(妥当な場合)引き続く宿主または標的細胞への組み込みに必要な最小のウイルス配列を含有し、その他のウイルス配列は、例えばCpf1などの発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。例えば、遺伝子治療で使用されるAAVベクターは、典型的に、パッケージングおよび宿主または標的細胞内の遺伝子発現に必要なAAVゲノムからの逆方向末端反復(ITR)配列のみを有する。欠損しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに提供される。この後、ウイルスDNAは、他のAAV遺伝子、すなわちrepおよびcapをコードするが、ITR配列が欠如しているヘルパープラスミドを含有する、細胞株内にパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドからのAAVベクター複製とAAV遺伝子発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ITR配列の欠如のために、顕著な量でパッケージされない。アデノウイルスの混入は、例えば、それに対してアデノウイルスがAAVよりも感受性が高い、加熱処理によって低下させ得る。
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型および/または組織型の認識能力を有する。例えば、ウイルスベクターは、異なる/代案のウイルス外被糖タンパク質による偽型であり得て;細胞型特異的受容体によって改変され(例えば、ペプチドリガンド、一本鎖抗体、成長因子などの標的化リガンドに組み込むためのウイルス外被糖タンパク質の遺伝子修飾);および/または改変されて、一端がウイルス糖タンパク質を認識して、もう一方の末端が標的細胞表面部分を認識する、二重特異性がある分子ブリッジを有する(例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン-ビオチン、および化学的結合)。
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。例えば、組織特異的プロモーターが構築されて、特異的標的細胞のみで導入遺伝子(Cpf1およびgRNA)の発現が制限され得る。ベクターの特異性はまた、導入遺伝子発現のマイクロRNA依存性調節によって媒介され得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと標的細胞膜との融合効率の増大を有する。例えば、融合能力がある赤血球凝集素(HA)などのが組み込みまれて、細胞内へのウイルス取り込みが増大され得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、核局在化能力を有する。例えば、(細胞分裂中に)核膜の分解を要し、したがって非分裂細胞に感染しない特定のウイルスは、ウイルスのマトリックスタンパク質に核局在化ペプチドを組み込むように改変され得て、それによって非増殖性細胞への形質導入が可能になる。
特定の実施形態では、Cpf1をコードするDNAおよび/またはgRNAをコードするDNAは、(例えば、裸のDNAまたはDNA複合体を使用して)非ベクターベースの方法によって送達される。例えば、DNAは、例えば、有機修飾シリカまたはケイ酸塩(Ormosil)、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾(例えば、Lee, et al [2012] Nano Lett 12:6322-27に記載されるような)、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介形質移入、デンドリマー、無機ナノ粒子、カルシウムリン酸塩、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をCpf1および/またはgRNAをコードするDNAと混合し、規定の時間と振幅で1回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含む。特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置(例えばポンプ)と連結する容器内で、細胞がCpf1および/またはgRNAをコードするDNAと混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で1回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第2の容器に送達される、システムを使用して実施される。
特定の実施形態では、Cpf1をコードするDNAおよび/またはgRNAをコードするDNAは、ベクターおよび非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。例えば、ビロソームは、不活性化ウイルス(例えば、HIVまたはインフルエンザウイルス)と組み合わされたリポソームを含み、それはウイルスまたはリポソーム法単独のどちらよりも効率的な遺伝子移入をもたらし得る。
特定の実施形態では、送達ビヒクルは、非ウイルスベクターである。特定の実施形態では、非ウイルスベクターは、無機ナノ粒子である。代表的な無機ナノ粒子としては、例えば、磁性ナノ粒子(例えば、Fe3MnO2)、およびシリカが挙げられる。ナノ粒子の外面は、ペイロードの付着(例えば、コンジュゲーションまたは捕捉)を可能にする正荷電ポリマー(例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン)にコンジュゲートされ得る。特定の実施形態では、非ウイルスベクターは、有機ナノ粒子である。例示的な有機ナノ粒子として、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)で被覆された中性ヘルパー脂質、および脂質コーティングで被覆されたプロタミン核酸複合体と共に、カチオン性脂質を含有するSNALPリポソームが挙げられる。遺伝子移入のための例示的な脂質が、以下で表4に示される。
遺伝子移入のための例示的なポリマーが、以下で表5に示される。
特定の実施形態では、ビヒクルは、標的化修飾を有して、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖、および細胞透過性ペプチドなどのナノ粒子およびリポソームの標的細胞アップデート(update)が増大される。特定の実施形態では、ビヒクルは、融合性およびエンドソーム不安定化ペプチド/ポリマーを利用する。特定の実施形態では、ビヒクルは、酸誘発性立体構造変化を受ける(例えば、カーゴのエンドソーム漏出を加速するために)。特定の実施形態では、例えば、細胞区画内の放出のために、刺激切断可能ポリマーが使用される。例えば、還元性細胞環境内で切断されるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーが、使用され得る。
特定の実施形態では、送達ビヒクルは、生物学的非ウイルス送達ビヒクルである。特定の実施形態では、ビヒクルは、弱毒型細菌(例えば、侵入性であるが弱毒化されて発病を予防して導入遺伝子を発現するように、天然にまたは人工的に改変されている(例えば、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、特定のサルモネラ属(Salmonella)株、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、および改変大腸菌(Escherichiacoli);栄養および組織特異的親和性を有して特定細胞を標的化する細菌;修飾表面タンパク質を有して標的細胞特異性を改変する細菌)である。特定の実施形態では、ビヒクルは、遺伝子修飾されたバクテリオファージである(例えば、改変ファージは、大きなパッケージング容量を有し、免疫原性がより低く、哺乳類プラスミド維持配列を含有して、組み込まれた標的化リガンドを有する)。特定の実施形態では、ビヒクルは、哺乳類ウイルス様粒子である。例えば、修飾ウイルス粒子が生成され得る(例えば、「空の」粒子精製と、それに続く、所望のカーゴがあるウイルスの生体外構築によって)。ビヒクルはまた改変されて、標的化リガンドが組み込まれ、標的組織特異性が改変され得る。特定の実施形態では、ビヒクルは、生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞(例えば、対象に由来する球状構造に分解された赤血球である赤血球ゴーストに由来するリン脂質ベースの粒子(例えば、組織標的化が、様々な組織または細胞特異的リガンドの付着によって達成され得る);またはエンドサイトーシス起源の分泌型エキソソーム-対象由来膜結合ナノ小胞(30~100nm)(例えば、様々な細胞型から生成され得て、したがってリガンド標的化の必要なしに細胞に取り込まれ得る)である。
特定の実施形態では、CRISPR/Cpf1システムの構成要素、例えば、本明細書中に記載されるCpf1分子構成要素および/またはgRNA分子構成要素以外の1つまたは複数の核酸組成物(例えばDNA分子)が送達される。特定の実施形態では、核酸組成物は、CRISPR/Cpf1システムの構成要素の1つまたは複数と同時に送達される。特定の実施形態では、核酸組成物は、Cpf1システムの構成要素の1つまたは複数が送達される前後(例えば、約30分、1時間、2時間、3時間、6時間、9時間、12時間、1日、2日、3日、1週、2週、または4週未満)に送達される。特定の実施形態では、核酸組成物は、CRISPR/Cpf1システムの構成要素、例えば、Cpf1分子構成要素および/またはgRNA分子構成要素の1つまたは複数とは異なる手段によって送達される。核酸組成物は、本明細書中に記載される送達方法のいずれかによって送達され得る。例えば、核酸分子は、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスによって送達され得、そしてCpf1分子構成要素および/またはgRNA分子構成要素は、電気穿孔によって送達され得る。特定の実施形態では、核酸組成物は、FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、またはTRBC遺伝子をコードする。
Cpf1分子をコードするRNAの送達
Cpf1分子をコードするRNAおよび/またはgRNA分子は、細胞、例えば、本明細書中に記載される標的細胞中に、当該技術分野で既知の方法によって、または本明細書中に記載されるようにして、送達され得る。例えば、Cpf1をコードするRNAおよび/またはgRNAをコードするRNAは、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾(例えば、Lee,et al[2012]Nano Lett 12:6322-27に記載される)、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。Cpf1をコードするRNAおよび/またはgRNAをコードするRNAは、標的細胞(例えば、本明細書中に記載される標的細胞)による吸収を促進する分子に結合されてよい。
Cpf1分子をコードするRNAおよび/またはgRNA分子は、細胞、例えば、本明細書中に記載される標的細胞中に、当該技術分野で既知の方法によって、または本明細書中に記載されるようにして、送達され得る。例えば、Cpf1をコードするRNAおよび/またはgRNAをコードするRNAは、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾(例えば、Lee,et al[2012]Nano Lett 12:6322-27に記載される)、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。Cpf1をコードするRNAおよび/またはgRNAをコードするRNAは、標的細胞(例えば、本明細書中に記載される標的細胞)による吸収を促進する分子に結合されてよい。
特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をCpf1分子をコードするRNAおよび/またはgRNA分子と混合し、規定の時間と振幅で1回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含む。特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置(例えばポンプ)と連結する容器内で、容器内で、細胞がCpf1分子をコードするRNAおよび/またはgRNA分子と混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で1回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第2の容器に送達される、システムを使用して実施される。Cpf1をコードするRNAおよび/またはgRNAをコードするRNAは、標的細胞(例えば、本明細書中に記載される標的細胞)による吸収を促進する分子に結合されてよい。
Cpf1分子タンパク質の送達
Cpf1分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、細胞内に送達され得る。例えば、Cpf1タンパク質分子は、例えば、byマイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾(例えば、Lee,et al[2012]Nano Lett 12:6322-27に記載されるような)、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。送達は、gRNAをコードするDNA、またはgRNAを伴い得る。
Cpf1分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、細胞内に送達され得る。例えば、Cpf1タンパク質分子は、例えば、byマイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾(例えば、Lee,et al[2012]Nano Lett 12:6322-27に記載されるような)、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。送達は、gRNAをコードするDNA、またはgRNAを伴い得る。
特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をCpf1分子とgRNA分子ありまたはなしで混合し、規定の時間と振幅で1回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含む。特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置(例えばポンプ)と連結する容器内で、容器内で、細胞がCpf1分子とgRNA分子ありまたはなしで混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で1回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第2の容器に送達される、システムを使用して実施される。
Cpf1分子タンパク質およびgRNAのRNP送達
特定の実施形態では、Cpf1分子およびgRNAは、リボ核タンパク質(RNP)送達を介して、標的細胞に送達される。特定の実施形態では、Cpf1分子は、タンパク質として提供され、そしてgRNA分子は、転写または合成されたRNAとして提供される。gRNA分子は、化学合成によって生成され得る。特定の実施形態では、gRNA分子は、標的細胞への送達前に、適切な条件下で、Cpf1分子タンパク質とのRNP複合体を形成する。特定の実施形態では、適切な条件は、室温にて少なくとも約10分間、Cpf1分子タンパク質およびgRNAをインキュベートすることを含む。RNP複合体は、当該技術において知られている適切なあらゆる方法によって、例えば、電気穿孔、脂質媒介形質移入、タンパク質もしくはDNAベースのシャトル、機械力、または動水力(hydraulic force)によって、標的細胞に送達され得る。特定の実施形態では、RNP複合体は、電気穿孔によって標的細胞に送達される。
特定の実施形態では、Cpf1分子およびgRNAは、リボ核タンパク質(RNP)送達を介して、標的細胞に送達される。特定の実施形態では、Cpf1分子は、タンパク質として提供され、そしてgRNA分子は、転写または合成されたRNAとして提供される。gRNA分子は、化学合成によって生成され得る。特定の実施形態では、gRNA分子は、標的細胞への送達前に、適切な条件下で、Cpf1分子タンパク質とのRNP複合体を形成する。特定の実施形態では、適切な条件は、室温にて少なくとも約10分間、Cpf1分子タンパク質およびgRNAをインキュベートすることを含む。RNP複合体は、当該技術において知られている適切なあらゆる方法によって、例えば、電気穿孔、脂質媒介形質移入、タンパク質もしくはDNAベースのシャトル、機械力、または動水力(hydraulic force)によって、標的細胞に送達され得る。特定の実施形態では、RNP複合体は、電気穿孔によって標的細胞に送達される。
VIII.修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、核酸、例えば、特にgRNA中に存在し得るが、Cpf1分子をコードする核酸中にも存在し得る。このセクションで開示される修飾は、先に記載した具体的なgRNA分子修飾のいずれかに加えて、またはその代わりになされ得る。本明細書に記載される「ヌクレオシド」は、5つの炭素砂糖分子(ペントースまたはリボース)またはその誘導体と、1つの有機塩基、プリンまたはピリミジン、またはその誘導体とを含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドと定義される。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、核酸、例えば、特にgRNA中に存在し得るが、Cpf1分子をコードする核酸中にも存在し得る。このセクションで開示される修飾は、先に記載した具体的なgRNA分子修飾のいずれかに加えて、またはその代わりになされ得る。本明細書に記載される「ヌクレオシド」は、5つの炭素砂糖分子(ペントースまたはリボース)またはその誘導体と、1つの有機塩基、プリンまたはピリミジン、またはその誘導体とを含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドと定義される。
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の1つまたは複数を含み得る:
(i)例えば、リン酸ジエステル骨格結合中の非結合リン酸酸素の片方または双方および/または結合リン酸酸素の1つまたは複数の置換などの改変;
(ii)例えば、リボース糖上の2’ヒドロキシルなどのリボース糖の構成要素の置換などの改変;
(iii)リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる徹底的な置換;
(iv)天然起源核酸塩基の修飾または置換;
(v)リボースリン酸骨格の置換または修飾;
(vi)例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置換または部分のコンジュゲーションなどのオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端の修飾;および
(vii)糖の修飾。
(i)例えば、リン酸ジエステル骨格結合中の非結合リン酸酸素の片方または双方および/または結合リン酸酸素の1つまたは複数の置換などの改変;
(ii)例えば、リボース糖上の2’ヒドロキシルなどのリボース糖の構成要素の置換などの改変;
(iii)リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる徹底的な置換;
(iv)天然起源核酸塩基の修飾または置換;
(v)リボースリン酸骨格の置換または修飾;
(vi)例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置換または部分のコンジュゲーションなどのオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端の修飾;および
(vii)糖の修飾。
上に列挙される修飾を混合して、2、3、4つ以上の修飾を有し得る、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供され得る。例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。特定の実施形態では、gRNAの各塩基は修飾され、例えば、全ての塩基が、例えば、全てホスホロチオエート基であるなど、修飾リン酸基を有する。特定の実施形態では、単分子またはモジュラーgRNA分子の全ての、または実質的に全てのリン酸基は、ホスホロチオエート基で置換される。
特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるような修飾を有するヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドが、例えば、「修飾核酸」などの核酸に組み込まれ得る。特定の実施形態では、修飾核酸は、1、2、3つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾核酸内の位置の少なくとも5%(例えば、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%)は、修飾ヌクレオチドである。
未修飾核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによって分解され易くあり得る。例えば、ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様では、本明細書に記載される修飾核酸は、1つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し得て、例えば、ヌクレアーゼに安定性が導入される。
特定の実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示し得る。「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌起源である、一本鎖核酸をはじめとする外来性核酸に対する細胞性応答を含み、それは、具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内包する。特定の実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、主溝相互作用パートナーの核酸との結合を妨害し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示して、そしてまた主溝相互作用パートナーの核酸との結合も妨害し得る。
化学基の定義
本明細書の用法では、「アルキル」は、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を指すことが意図される。アルキル基の例としては、メチル(Me)、エチル(Et)、プロピル(例えば、n-プロピルおよびイソプロピル)、ブチル(例えば、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル)、ペンチル(例えば、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル)などが挙げられる。アルキル基は、1~約20個、2~約20個、1~約12個、1~約8個、1~約6個、1~約4個、または1~約3個の炭素原子を含有し得る。
本明細書の用法では、「アルキル」は、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を指すことが意図される。アルキル基の例としては、メチル(Me)、エチル(Et)、プロピル(例えば、n-プロピルおよびイソプロピル)、ブチル(例えば、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル)、ペンチル(例えば、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル)などが挙げられる。アルキル基は、1~約20個、2~約20個、1~約12個、1~約8個、1~約6個、1~約4個、または1~約3個の炭素原子を含有し得る。
本明細書の用法では、「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなどの単環または多環(例えば、2、3または4つの融合環を有する)芳香族炭化水素を指す。特定の実施形態では、アリール基は、6~約20個の炭素原子を有する。
本明細書の用法では、「アルケニル」は、少なくとも1つの二重結合を含有する脂肪族基を指す。
本明細書の用法では、「アルキニル」は、2~12個の炭素原子を含有し、1つまたは複数の三重結合を有することで特徴付けられる、直鎖または分枝炭化水素鎖を指す。アルキニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、および3-ヘキシニルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書の用法では、「アリールアルキル」または「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基で置換された、アルキル部分を指す。アラルキルは、2つ以上の水素原子がアリール基で置換されている基を含む。「アリールアルキル」または「アラルキル」の例としては、ベンジル、2-フェニルエチル、3-フェニルプロピル、9-フルオレニル、ベンズヒドリル、およびトリチル基が挙げられる。
本明細書の用法では、「シクロアルキル」は、3~12個の炭素を有する環式、二環式、三環式、または多環式非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書の用法では、「ヘテロシクリル」は、複素環系の一価の基を指す。典型的なヘテロシクリルとしては、制限なしに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、およびモルホリニルが挙げられる。
本明細書の用法では、「ヘテロアリール」は、複素環式芳香族環系の一価の基を指す。ヘテロアリール部分の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、およびプテリジニルが挙げられる、が、これに限定されるものではない。
リン酸塩骨格修飾
リン酸基
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、異なる置換基による、1つまたは複数の酸素の置換によって修飾され得る。さらに、例えば、内修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾リン酸塩による、未修飾リン酸部分の徹底的な置換を含み得る。特定の実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非相称の電荷分布がある荷電リンカーのどちらかをもたらす改変を含み得る。
リン酸基
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、異なる置換基による、1つまたは複数の酸素の置換によって修飾され得る。さらに、例えば、内修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾リン酸塩による、未修飾リン酸部分の徹底的な置換を含み得る。特定の実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非相称の電荷分布がある荷電リンカーのどちらかをもたらす改変を含み得る。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。特定の実施形態では、リン酸骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の1つが、以下の基のいずれかによって置換され得る:イオウ(S)、セレン(Se)、BR3(式中、Rは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る)、C(例えば、アルキル基、アリール基など)、H、NR2(式中、Rは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る)、またはOR(式中、Rは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る)。未修飾リン酸基中の亜リン酸原子は、アキラルである。しかし、上の原子または原子群の1つによる非架橋酸素の1つの置換は、亜リン酸原子をキラルにし得て;すなわち、このようにして修飾されたリン酸基中の亜リン酸原子が、立体中心である。ステレオジェン亜リン酸原子は、「R」構造(本明細書のRp)または「S」構造(本明細書のSp)のどちらかを有し得る。
ホスホロジチオエートは、双方の非架橋酸素がイオウで置換されている。ホスホロジチオエートのリン中心はアキラルであり、それは、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を排除する。特定の実施形態では、非架橋酸素の片方または双方の修飾はまた、S、Se、B、C、H、N、およびOR(Rは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る)から独立して選択される基による、非架橋酸素の置換も含み得る。
リン酸塩リンカーはまた、窒素(架橋ホスホロアミデート)、イオウ(架橋ホスホロチオエート)、および炭素(架橋メチレンホスホネート)による、架橋酸素(すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素)の置換によって修飾され得る。置換は、どちらかの連結酸素で、または双方の連結酸素で起こり得る。
リン酸基の置換
リン酸基は、リン非含有コネクターによって置換され得る。特定の実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換され得る。
リン酸基は、リン非含有コネクターによって置換され得る。特定の実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換され得る。
リン酸基を置換し得る部分の例としては、制限なしに、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、酸化エチレンリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。
リボリン酸骨格の置換
核酸を模倣し得るスキャフォールドもまた構築され得て、その中では、リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートによって置換される。特定の実施形態では、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留され得る。例としては、制限なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸(PNA)ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。
核酸を模倣し得るスキャフォールドもまた構築され得て、その中では、リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートによって置換される。特定の実施形態では、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留され得る。例としては、制限なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸(PNA)ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。
糖修飾
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖類に1つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で、修飾または置換され得る。特定の実施形態では、2’ヒドロキシル基の修飾は核酸の安定性を高め得るが、それは、ヒドロキシルが、もはや脱プロトン化して、2’-アルコキシドイオンを形成し得ないためである。2’-アルコキシドは、リンカーリン原子上の分子内求核攻撃によって、分解を触媒し得る。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖類に1つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で、修飾または置換され得る。特定の実施形態では、2’ヒドロキシル基の修飾は核酸の安定性を高め得るが、それは、ヒドロキシルが、もはや脱プロトン化して、2’-アルコキシドイオンを形成し得ないためである。2’-アルコキシドは、リンカーリン原子上の分子内求核攻撃によって、分解を触媒し得る。
「オキシ」-2’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ(OR、式中、「R」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る);ポリエチレングリコール(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2OR(式中、Rは、例えば、Hまたは任意選択的に置換されたアルキルであり得て、nは、0~20(例えば、0~4、0~8、0~10、0~16、1~4、1~8、1~10、1~16、1~20、2~4、2~8、2~10、2~16、2~20、4~8、4~10、4~16、および4~20)の整数であり得る)が挙げられる。特定の実施形態では、「オキシ」-2’ヒドロキシル基修飾は、「ロックド」核酸(LNA)を含み得て、その中では、2’ヒドロキシルが、例えば、C1~6アルキレンまたはC1~6ヘテロアルキレン架橋によって同一リボース糖の4’炭素に連結され得て、代表的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋;O-アミノ(式中、アミノは、例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る)、およびアミノアルコキシ、O(CH2)n-アミノ、(式中、アミノは、例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る)が挙げられる。特定の実施形態では、「オキシ」-2’ヒドロキシル基修飾としては、メトキシエチル基(MOE)、(OCH2CH2OCH3、例えば、PEG誘導体)が挙げられる。
「デオキシ」修飾としては、水素(すなわち、例えば、部分的dsRNAのオーバーハング部分のデオキシリボース糖);ハロ(例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード);アミノ(式中、アミノは、例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る);NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-アミノ(式中、アミノは、例えば、本明細書に記載されるようであり得る)、-NHC(O)R(式中、Rは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る)、シアノ;メルカプト;アルキル-チオ-アルキル;チオアルコキシ;および本明細書に記載されるようなアミノで任意選択的に置換されてもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルが挙げられる。
糖類は、リボース中の対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する、1つまたは複数の炭素もまた含有し得る。したがって、修飾核酸としては、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチド「単量体」は、例えば、αヌクレオシドなど、糖の1’位にα結合を有し得る。修飾核酸としては、C-1’の核酸塩基を欠失している「脱塩基」糖もまた挙げられる。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子の1つまたは複数でさらに修飾され得る。修飾核酸はとしてはまた、例えばL-ヌクレオシドなどのL形態の1つまたは複数の糖も挙げられる。
一般に、RNAは、酸素を有する5員環である糖類リボースを含む。代表的な修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換(例えば、イオウ(S)、セレン(Se)、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる);二重結合の付加(例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する);リボース環縮小(例えば、シクロブタンまたはオキセタンの4員環を形成する);リボース環拡大(例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する6または7員環を形成する)が挙げられる。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドとしては、多環形態(例えば、トリシクロ;および(例えば、リボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で置換されるR-GNAまたはS-GNAなどの)グリコール核酸(GNA)などの「アンロックド」形態、トレオース核酸(TNA、リボースがα-L-トレオフラノシル-(3’→2’)で置換される)が挙げられる。
核酸塩基上の修飾
修飾核酸に組み込まれ得る、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、およびウラシル(U)が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、修飾核酸に組み込まれ得る、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供し得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログから独立して選択され得る。特定の実施形態では、核酸塩基としては、例えば、天然に存在する塩基の合成誘導体が挙げられる。
修飾核酸に組み込まれ得る、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、およびウラシル(U)が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、修飾核酸に組み込まれ得る、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供し得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログから独立して選択され得る。特定の実施形態では、核酸塩基としては、例えば、天然に存在する塩基の合成誘導体が挙げられる。
ウラシル
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、プソイドウリジン(ψ)、ピリジン-4-オンリボヌクレオシド、5-アザ-ウリジン、6-アザ-ウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ウリジン(s2U)、4-チオ-ウリジン(s4U)、4-チオ-プソイドウリジン、2-チオ-プソイドウリジン、5-ヒドロキシ-ウリジン(ho5U)、5-アミノアリル-ウリジン、5-ハロ-ウリジン(例えば、5-ヨード-ウリジンまたは5-ブロモ-ウリジン)、3-メチル-ウリジン(m3U)、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)、ウリジン5-オキシ酢酸(cmo5U)、ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル(mcmo5U)、5-カルボキシメチル-ウリジン(cm5U)、1-カルボキシメチル-プソイドウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチル-ウリジン(chm5U)、5-カルボキシヒドロキシメチル-ウリジンメチルエステル(mchm5U)、5-メトキシカルボニルメチル-ウリジン(mcm5U)、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオ-ウリジン(mcm5s2U)、5-アミノメチル-2-チオ-ウリジン(nm5s2U)、5-メチルアミノメチル-ウリジン(mnm5U)、5-メチルアミノメチル-2-チオ-ウリジン(mnm5s2U)、5-メチルアミノメチル-2-セレン含有-ウリジン(mnm5se2U)、5-カルバモイルメチル-ウリジン(ncm5U)、5-カルボキシメチルアミノメチル-ウリジン(cmnm5U)、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオ-ウリジン(cmnm5s2U)、5-プロピニル-ウリジン、1-プロピニル-プソイドウリジン、5-タウリノメチル-ウリジン(τcm5U)、1-タウリノメチル-プソイドウリジン、5-タウリノメチル-2-チオ-ウリジン(τm5s2U)、1-タウリノメチル-4-チオ-プソイドウリジン、5-メチル-ウリジン(m5U、すなわち、核酸塩基デオキシチミジン(deoxythymine)を有する)、1-メチル-プソイドウリジン(m1ψ)、5-メチル-2-チオ-ウリジン(m5s2U)、1-メチル-4-チオ-プソイドウリジン(m1s4ψ)、4-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、3-メチル-プソイドウリジン(m3ψ)、2-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、ジヒドロウリジン(D)、ジヒドロプソイドウリジン、5,6-ジヒドロウリジン、5-メチル-ジヒドロウリジン(m5D)、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-ジヒドロプソイドウリジン、2-メトキシ-ウリジン、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、4-メトキシ-プソイドウリジン、4-メトキシ-2-チオ-プソイドウリジン、N1-メチル-プソイドウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)プソイドウリジン(acp3ψ)、5-(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5-(イソペンテニルアミノメチル)-2-チオ-ウリジン(inm5s2U)、α-チオ-ウリジン、2’-O-メチル-ウリジン(Um)、5,2’-O-ジメチル-ウリジン(m5Um)、2’-O-メチル-プソイドウリジン(ψm)、2-チオ-2’-O-メチル-ウリジン(s2Um)、5-メトキシカルボニルメチル-2’-O-メチル-ウリジン(mcm5Um)、5-カルバモイルメチル-2’-O-メチル-ウリジン(ncm5Um)、5-カルボキシメチルアミノメチル-2’-O-メチル-ウリジン(cmnm5Um)、3,2’-O-ジメチル-ウリジン(m3Um)、5-(イソペンテニルアミノメチル)-2’-O-メチル-ウリジン(inm5Um)、1-チオ-ウリジン、デオキシチミジン、2’-F-アラ-ウリジン、2’-F-ウリジン、2’-OH-アラ-ウリジン、5-(2-カルボメトキシビニル)ウリジン、5-[3-(1-E-プロペニルアミノ)ウリジン、ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、プソイドウリジン(ψ)、ピリジン-4-オンリボヌクレオシド、5-アザ-ウリジン、6-アザ-ウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ウリジン(s2U)、4-チオ-ウリジン(s4U)、4-チオ-プソイドウリジン、2-チオ-プソイドウリジン、5-ヒドロキシ-ウリジン(ho5U)、5-アミノアリル-ウリジン、5-ハロ-ウリジン(例えば、5-ヨード-ウリジンまたは5-ブロモ-ウリジン)、3-メチル-ウリジン(m3U)、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)、ウリジン5-オキシ酢酸(cmo5U)、ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル(mcmo5U)、5-カルボキシメチル-ウリジン(cm5U)、1-カルボキシメチル-プソイドウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチル-ウリジン(chm5U)、5-カルボキシヒドロキシメチル-ウリジンメチルエステル(mchm5U)、5-メトキシカルボニルメチル-ウリジン(mcm5U)、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオ-ウリジン(mcm5s2U)、5-アミノメチル-2-チオ-ウリジン(nm5s2U)、5-メチルアミノメチル-ウリジン(mnm5U)、5-メチルアミノメチル-2-チオ-ウリジン(mnm5s2U)、5-メチルアミノメチル-2-セレン含有-ウリジン(mnm5se2U)、5-カルバモイルメチル-ウリジン(ncm5U)、5-カルボキシメチルアミノメチル-ウリジン(cmnm5U)、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオ-ウリジン(cmnm5s2U)、5-プロピニル-ウリジン、1-プロピニル-プソイドウリジン、5-タウリノメチル-ウリジン(τcm5U)、1-タウリノメチル-プソイドウリジン、5-タウリノメチル-2-チオ-ウリジン(τm5s2U)、1-タウリノメチル-4-チオ-プソイドウリジン、5-メチル-ウリジン(m5U、すなわち、核酸塩基デオキシチミジン(deoxythymine)を有する)、1-メチル-プソイドウリジン(m1ψ)、5-メチル-2-チオ-ウリジン(m5s2U)、1-メチル-4-チオ-プソイドウリジン(m1s4ψ)、4-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、3-メチル-プソイドウリジン(m3ψ)、2-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、ジヒドロウリジン(D)、ジヒドロプソイドウリジン、5,6-ジヒドロウリジン、5-メチル-ジヒドロウリジン(m5D)、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-ジヒドロプソイドウリジン、2-メトキシ-ウリジン、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、4-メトキシ-プソイドウリジン、4-メトキシ-2-チオ-プソイドウリジン、N1-メチル-プソイドウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)プソイドウリジン(acp3ψ)、5-(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5-(イソペンテニルアミノメチル)-2-チオ-ウリジン(inm5s2U)、α-チオ-ウリジン、2’-O-メチル-ウリジン(Um)、5,2’-O-ジメチル-ウリジン(m5Um)、2’-O-メチル-プソイドウリジン(ψm)、2-チオ-2’-O-メチル-ウリジン(s2Um)、5-メトキシカルボニルメチル-2’-O-メチル-ウリジン(mcm5Um)、5-カルバモイルメチル-2’-O-メチル-ウリジン(ncm5Um)、5-カルボキシメチルアミノメチル-2’-O-メチル-ウリジン(cmnm5Um)、3,2’-O-ジメチル-ウリジン(m3Um)、5-(イソペンテニルアミノメチル)-2’-O-メチル-ウリジン(inm5Um)、1-チオ-ウリジン、デオキシチミジン、2’-F-アラ-ウリジン、2’-F-ウリジン、2’-OH-アラ-ウリジン、5-(2-カルボメトキシビニル)ウリジン、5-[3-(1-E-プロペニルアミノ)ウリジン、ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
シトシン
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、5-アザ-シチジン、6-アザ-シチジン、プソイドイソシチジン、3-メチル-シチジン(m3C)、N4-アセチル-シチジン(act)、5-ホルミル-シチジン(f5C)、N4-メチル-シチジン(m4C)、5-メチル-シチジン(m5C)、5-ハロ-シチジン(例えば、5-ヨード-シチジン)、5-ヒドロキシメチル-シチジン(hm5C)、1-メチル-プソイドイソシチジン、ピロロ-シチジン、ピロロ-プソイドイソシチジン、2-チオ-シチジン(s2C)、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-チオ-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、ゼブラリン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、2-チオ-ゼブラリン、2-メトキシ-シチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-プソイドイソシチジン、4-メトキシ-1-メチル-プソイドイソシチジン、リシジン(k2C)、α-チオ-シチジン、2’-O-メチル-シチジン(Cm)、5,2’-O-ジメチル-シチジン(m5Cm)、N4-アセチル-2’-O-メチル-シチジン(ac4Cm)、N4,2’-O-ジメチル-シチジン(m4Cm)、5-ホルミル-2’-O-メチル-シチジン(f5Cm)、N4,N4,2’-O-トリメチル-シチジン(m4 2Cm)、1-チオ-シチジン、2’-F-アラ-シチジン、2’-F-シチジン、および2’-OH-アラ-シチジンが挙げられる。
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、5-アザ-シチジン、6-アザ-シチジン、プソイドイソシチジン、3-メチル-シチジン(m3C)、N4-アセチル-シチジン(act)、5-ホルミル-シチジン(f5C)、N4-メチル-シチジン(m4C)、5-メチル-シチジン(m5C)、5-ハロ-シチジン(例えば、5-ヨード-シチジン)、5-ヒドロキシメチル-シチジン(hm5C)、1-メチル-プソイドイソシチジン、ピロロ-シチジン、ピロロ-プソイドイソシチジン、2-チオ-シチジン(s2C)、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-チオ-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、ゼブラリン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、2-チオ-ゼブラリン、2-メトキシ-シチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-プソイドイソシチジン、4-メトキシ-1-メチル-プソイドイソシチジン、リシジン(k2C)、α-チオ-シチジン、2’-O-メチル-シチジン(Cm)、5,2’-O-ジメチル-シチジン(m5Cm)、N4-アセチル-2’-O-メチル-シチジン(ac4Cm)、N4,2’-O-ジメチル-シチジン(m4Cm)、5-ホルミル-2’-O-メチル-シチジン(f5Cm)、N4,N4,2’-O-トリメチル-シチジン(m4 2Cm)、1-チオ-シチジン、2’-F-アラ-シチジン、2’-F-シチジン、および2’-OH-アラ-シチジンが挙げられる。
アデニン
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、2-アミノ-プリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-ハロ-プリン(例えば、2-アミノ-6-クロロ-プリン)、6-ハロ-プリン(例えば、6-クロロ-プリン)、2-アミノ-6-メチル-プリン、8-アジド-アデノシン、7-デアザ-アデノシン、7-デアザ-8-アザ-アデノシン、7-デアザ-2-アミノ-プリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノ-プリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、1-メチル-アデノシン(m1A)、2-メチル-アデノシン(m2A)、N6-メチル-アデノシン(m6A)、2-メチルチオ-N6-メチル-アデノシン(ms2m6A)、N6-イソペンテニル-アデノシン(i6A)、2-メチルチオ-N6-イソペンテニル-アデノシン(ms2i6A)、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(io6A)、2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(ms2io6A)、N6-グリシジルカルバモイル(glycinylcarbamoyl)-アデノシン(g6A)、N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(t6A)、N6-メチル-N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(m6t6A)、2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(ms2g6A)、N6,N6-ジメチル-アデノシン(m6 2A)、N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイル-アデノシン(hn6A)、2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイル-アデノシン(ms2hn6A)、N6-アセチル-アデノシン(ac6A)、7-メチル-アデノシン、2-メチルチオ-アデノシン、2-メトキシ-アデノシン、α-チオ-アデノシン、2’-O-メチル-アデノシン(Am)、N6,2’-O-ジメチル-アデノシン(m6Am)、N6-メチル-2’-デオキシアデノシン、N6,N6,2’-O-トリメチル-アデノシン(m6 2Am)、1,2’-O-ジメチル-アデノシン(m1Am)、2’-O-リボシルアデノシン(リン酸塩)(Ar(p))、2-アミノ-N6-メチル-プリン、1-チオ-アデノシン、8-アジド-アデノシン、2’-F-アラ-アデノシン、2’-F-アデノシン、2’-OH-アラ-アデノシン、およびN6-(19-アミノ-ペンタオキサノンアデシル)-アデノシンが挙げられる。
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、2-アミノ-プリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-ハロ-プリン(例えば、2-アミノ-6-クロロ-プリン)、6-ハロ-プリン(例えば、6-クロロ-プリン)、2-アミノ-6-メチル-プリン、8-アジド-アデノシン、7-デアザ-アデノシン、7-デアザ-8-アザ-アデノシン、7-デアザ-2-アミノ-プリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノ-プリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、1-メチル-アデノシン(m1A)、2-メチル-アデノシン(m2A)、N6-メチル-アデノシン(m6A)、2-メチルチオ-N6-メチル-アデノシン(ms2m6A)、N6-イソペンテニル-アデノシン(i6A)、2-メチルチオ-N6-イソペンテニル-アデノシン(ms2i6A)、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(io6A)、2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(ms2io6A)、N6-グリシジルカルバモイル(glycinylcarbamoyl)-アデノシン(g6A)、N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(t6A)、N6-メチル-N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(m6t6A)、2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(ms2g6A)、N6,N6-ジメチル-アデノシン(m6 2A)、N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイル-アデノシン(hn6A)、2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイル-アデノシン(ms2hn6A)、N6-アセチル-アデノシン(ac6A)、7-メチル-アデノシン、2-メチルチオ-アデノシン、2-メトキシ-アデノシン、α-チオ-アデノシン、2’-O-メチル-アデノシン(Am)、N6,2’-O-ジメチル-アデノシン(m6Am)、N6-メチル-2’-デオキシアデノシン、N6,N6,2’-O-トリメチル-アデノシン(m6 2Am)、1,2’-O-ジメチル-アデノシン(m1Am)、2’-O-リボシルアデノシン(リン酸塩)(Ar(p))、2-アミノ-N6-メチル-プリン、1-チオ-アデノシン、8-アジド-アデノシン、2’-F-アラ-アデノシン、2’-F-アデノシン、2’-OH-アラ-アデノシン、およびN6-(19-アミノ-ペンタオキサノンアデシル)-アデノシンが挙げられる。
グアニン
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、イノシン(I)、1-メチル-イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、4-デメチル-ワイオシン(imG-14)、イソワイオシン(imG2)、ウィブトシン(yW)、ペルオキシウィブトシン(o2yW)、ヒドロキシウィブトシン(OHyW)、低修飾ヒドロキシウィブトシン(OHyW*)、7-デアザ-グアノシン、クエオシン(Q)、エポキシクエオシン(oQ)、ガラクトシル-クエオシン(galQ)、マンノシル-クエオシン(manQ)、7-シアノ-7-デアザ-グアノシン(preQ0)、7-アミノメチル-7-デアザ-グアノシン(preQ1)、アルカエオシン(G+)、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-グアノシン(m7G)、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-メチル-イノシン、6-メトキシ-グアノシン、1-メチル-グアノシン(m’G)、N2-メチル-グアノシン(m2G)、N2,N2-ジメチル-グアノシン(m2 2G)、N2,7-ジメチル-グアノシン(m2,7G)、N2、N2,7-ジメチル-グアノシン(m2,2,7G)、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、1-メチル-6-チオ-グアノシン、N2-メチル-6-チオ-グアノシン、N2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシン、α-チオ-グアノシン、2’-O-メチル-グアノシン(Gm)、N2-メチル-2’-O-メチル-グアノシン(m2Gm)、N2,N2-ジメチル-2’-O-メチル-グアノシン(m2 2Gm)、1-メチル-2’-O-メチル-グアノシン(m’Gm)、N2,7-ジメチル-2’-O-メチル-グアノシン(m2,7Gm)、2’-O-メチル-イノシン(Im)、1,2’-O-ジメチル-イノシン(m’Im)、O6-フェニル-2’-デオキシイノシン、2’-O-リボシルグアノシン(リン酸塩)(Gr(p))、1-チオ-グアノシン、O6-メチル-グアノシン、O6-メチル-2’-デオキシグアノシン、2’-F-アラ-グアノシン、および2’-F-グアノシンが挙げられる。
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、イノシン(I)、1-メチル-イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、4-デメチル-ワイオシン(imG-14)、イソワイオシン(imG2)、ウィブトシン(yW)、ペルオキシウィブトシン(o2yW)、ヒドロキシウィブトシン(OHyW)、低修飾ヒドロキシウィブトシン(OHyW*)、7-デアザ-グアノシン、クエオシン(Q)、エポキシクエオシン(oQ)、ガラクトシル-クエオシン(galQ)、マンノシル-クエオシン(manQ)、7-シアノ-7-デアザ-グアノシン(preQ0)、7-アミノメチル-7-デアザ-グアノシン(preQ1)、アルカエオシン(G+)、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-グアノシン(m7G)、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-メチル-イノシン、6-メトキシ-グアノシン、1-メチル-グアノシン(m’G)、N2-メチル-グアノシン(m2G)、N2,N2-ジメチル-グアノシン(m2 2G)、N2,7-ジメチル-グアノシン(m2,7G)、N2、N2,7-ジメチル-グアノシン(m2,2,7G)、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、1-メチル-6-チオ-グアノシン、N2-メチル-6-チオ-グアノシン、N2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシン、α-チオ-グアノシン、2’-O-メチル-グアノシン(Gm)、N2-メチル-2’-O-メチル-グアノシン(m2Gm)、N2,N2-ジメチル-2’-O-メチル-グアノシン(m2 2Gm)、1-メチル-2’-O-メチル-グアノシン(m’Gm)、N2,7-ジメチル-2’-O-メチル-グアノシン(m2,7Gm)、2’-O-メチル-イノシン(Im)、1,2’-O-ジメチル-イノシン(m’Im)、O6-フェニル-2’-デオキシイノシン、2’-O-リボシルグアノシン(リン酸塩)(Gr(p))、1-チオ-グアノシン、O6-メチル-グアノシン、O6-メチル-2’-デオキシグアノシン、2’-F-アラ-グアノシン、および2’-F-グアノシンが挙げられる。
代表的修飾gRNA
特定の実施形態では、修飾核酸は修飾gRNAであり得る。本明細書中に記載されるいずれのgRNAも、このセクションに従って修飾され得ることが理解されるべきであり、配列番号1~3707からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含むあらゆるgRNAが挙げられる。本明細書中で考察されるように、一過性に発現された、または送達された核酸は、例えば細胞ヌクレアーゼによって、分解される傾向があり得る。したがって、一態様において、本明細書中に記載される修飾gRNAは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する、1つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載される特定の修飾gRNAは、特定の細胞、特に本発明の細胞(例えばT細胞)からの先天性免疫応答の引下げを誘発することができる。上述のように「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌起源である、一本鎖核酸をはじめとする外来性核酸に対する細胞性応答を含み、それは、具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内包する。
特定の実施形態では、修飾核酸は修飾gRNAであり得る。本明細書中に記載されるいずれのgRNAも、このセクションに従って修飾され得ることが理解されるべきであり、配列番号1~3707からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含むあらゆるgRNAが挙げられる。本明細書中で考察されるように、一過性に発現された、または送達された核酸は、例えば細胞ヌクレアーゼによって、分解される傾向があり得る。したがって、一態様において、本明細書中に記載される修飾gRNAは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する、1つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載される特定の修飾gRNAは、特定の細胞、特に本発明の細胞(例えばT細胞)からの先天性免疫応答の引下げを誘発することができる。上述のように「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌起源である、一本鎖核酸をはじめとする外来性核酸に対する細胞性応答を含み、それは、具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内包する。
例えば、本明細書で考察されるように、本発明者らは、gRNAの5’末端が、真核生物mRNAキャップ構造またはキャップアナログの組み入れによって修飾された場合に、特定の細胞型(例えば、T細胞)における生体外遺伝子編集における改善を見た。本発明は、5’キャッピングgRNAで観察された改善が、その他の様式で修飾されたgRNAに拡張されて、同一タイプの構造的または機能的結果が達成され得るという認識を包含する(例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドの組み入れによって、3’ポリA配列の組み入れによっておよび/または生体外転写gRNAが仔ウシ腸管アルカリホスファターゼなどのホスファターゼによる処理によって修飾され、5’三リン酸基が除去される場合など)。
したがって、特定の実施形態では、本明細書で考察される方法および組成物は、gRNAがそれらの5’末端でまたはその近く(例えば、それらの5’末端の1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、または1~2ヌクレオチド以内)で修飾されている、方法および組成物を提供する。特定の実施形態では、gRNAの5’末端は、図7に示されるように、真核生物mRNAキャップ構造またはキャップアナログ(例えば、G(5’)ppp(5’)Gキャップアナログ、m7G(5’)ppp(5’)Gキャップアナログ、または3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G抗逆転キャップアナログ(ARCA))の組み入れによって修飾される。キャップまたはキャップアナログは、gRNAの化学合成または生体外転写のどちらかの間に組み入れ得る。特定の実施形態では、生体外転写gRNAは、ホスファターゼ(例えば、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ)による処理によって修飾され、5’三リン酸基が除去される。
特定の実施形態では、gRNAは、その3’末端にまたはその近く(例えば、その3’末端の1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、または1~2ヌクレオチド以内)に修飾を含む。例えば、特定の実施形態では、gRNAの3’末端は、1つまたは複数の(例えば、25~200個の)アデニン(A)残基の付加によって修飾される。ポリA配列は、gRNAをコードする核酸(例えば、プラスミド、PCR産物、ウイルスゲノム)に含まれ得て、または化学合成中に、またはポリアデノシンポリメラーゼ(例えば、大腸菌(E.coli)ポリ(A)ポリメラーゼ)を使用した生体外転写に続いて、gRNAに付加され得る。特定の実施形態では、gRNAは、3’末端Uリボースで修飾され得る。例えば、Uリボースの2つの末端ヒドロキシル基が、アルデヒド基に酸化され得て、同時のリボース環の開環が、下に示される(下に示される)修飾ヌクレオシドをもたらす:
式中、「U」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。特定の実施形態では、3’末端Uが、下で示されるように2’3’環状リン酸エステルで修飾され得る:
式中、「U」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。特定の実施形態では、gRNA分子は、例えば、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの1つまたは複数を組み込むことで、分解に対して安定化され得る、3’ヌクレオチドを含有してもよい。特定の実施形態では、例えば、ウリジンは、例えば、5-(2-アミノ)プロピルウリジン、および5-ブロモウリジンで、または本明細書に記載される修飾ウリジンのいずれかなどの修飾ウリジンで置換され得て;アデノシンおよびグアノシンは、例えば、8-ブロモグアノシンなどの8位に修飾がある修飾アデノシンまたはグアノシンによって、または本明細書に記載される修飾アデノシンおよびグアノシンのいずれかによって置換され得る。
式中、「U」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。特定の実施形態では、3’末端Uが、下で示されるように2’3’環状リン酸エステルで修飾され得る:
式中、「U」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。特定の実施形態では、gRNA分子は、例えば、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの1つまたは複数を組み込むことで、分解に対して安定化され得る、3’ヌクレオチドを含有してもよい。特定の実施形態では、例えば、ウリジンは、例えば、5-(2-アミノ)プロピルウリジン、および5-ブロモウリジンで、または本明細書に記載される修飾ウリジンのいずれかなどの修飾ウリジンで置換され得て;アデノシンおよびグアノシンは、例えば、8-ブロモグアノシンなどの8位に修飾がある修飾アデノシンまたはグアノシンによって、または本明細書に記載される修飾アデノシンおよびグアノシンのいずれかによって置換され得る。
特定の実施形態では、gRNAは、その5’末端またはその近くの修飾と、その3’末端またはその近くの修飾との双方を含む。特定の実施形態では、生体外転写gRNAは、5’キャップ構造またはキャップアナログと、3’ポリA配列との双方を含有する。特定の実施形態では、生体外転写gRNAは、ホスファターゼ(例えば、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ)による処理によって修飾されて5’三リン酸基が除去され、3’ポリA配列を含む。
前述の事項が末端修飾に焦点を合わせる一方で、本明細書で考察される方法および組成物は、gRNA配列中の1つまたは複数の非末端位置および/または1つまたは複数の末端位置に、1つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、gRNAを使用してもよいものと理解される。
特定の実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドがgRNAに組み込まれ得て、例えば、2’OH基が、H、OR、R(式中、Rは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る)、ハロ、SH、SR(式中、Rは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る)、アミノ(式中、アミノは、例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る);またはシアノ(CN)から選択される基によって置換される。特定の実施形態では、リン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート(phosphothioate)基で、本明細書に記載されるように修飾され得る。特定の実施形態では、gRNAのヌクレオチドの1つまたは複数は、それぞれ独立して、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチルなどの2’-糖修飾;または例えば、2’-Fまたは2’-O-メチル、アデノシン(A)、2’-Fまたは2’-O-メチル、シチジン(C)、2’-Fまたは2’-O-メチル、ウリジン(U)、2’-Fまたは2’-O-メチル、チミジン(T)、2’-Fまたは2’-O-メチルをはじめとする2’-フルオロ修飾;グアノシン(G)、2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン(Teo)、2’-O-メトキシエチルアデノシン(Aeo)、2’-O-メトキシエチル-5-メチルシチジン(m5Ceo)、および任意のそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、修飾または未修飾ヌクレオチドであり得る。
特定の実施形態では、gRNAとしては「ロックド」核酸(LNA)が挙げられ、その中では、2’OH基が、例えばC1~6アルキレンまたはC1~6ヘテロアルキレン架橋によって、同一リボース糖上の4’炭素と結合し得て代表的架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋;O-アミノ(アミノは、例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る)、およびアミノアルコキシまたはO(CH2)n-アミノ(アミノは、例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る)が挙げられる。
特定の実施形態では、gRNAとしては、多環である修飾ヌクレオチド(例えば、トリシクロ;およびグリコール核酸(GNA)などの「アンロックド」形態(例えば、リボースが、リン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位によって置換される、R-GNAまたはS-GNA)、またはトレオース核酸(リボースが、α-L-トレオフラノシル-(3’→2’)で置換される、TNA)が挙げられる。
一般に、gRNA分子としては、酸素を有する5員環である、糖類リボースが挙げられる。代表的な修飾gRNAsとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換(例えば、イオウ(S)、セレン(Se)、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる);二重結合付加(例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する);リボース環縮小(例えば、シクロブタンまたはオキセタンの4員環を形成する);リボース環拡大(例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、例えば、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的炭素またはヘテロ原子を有する6または7員環を形成する)が挙げられる。糖アナログ改変の大部分は2’位置に局在するが、4’位置をはじめとするその他の部位も修飾の対象となる。特定の実施形態では、gRNAは、4’-S、4’-Seまたは4’-C-アミノメチル-2’-O-Me修飾を含む。
特定の実施形態では、例えば、7-デアザ-アデノシンなどのデアザヌクレオチドが、gRNAに組み込まれ得る。特定の実施形態では、例えば、N6-メチルアデノシンなどのO-およびN-アルキル化ヌクレオチドが、gRNAに組み込まれ得る。特定の実施形態では、gRNA分子中の1つまたは複数のまたは全てのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである。
XI.阻害Cpf1 gRNA分子およびその、Cpf1システムの活性を制限するための使用
Cpf1分子またはgRNA分子をコードする核酸、例えばDNAを用いる、またはこれを含む方法および組成物は、加えて、「阻害Cpf1 gRNA分子」を用い、またはこれを含むことができる。阻害Cpf1 gRNAは、細胞または対象中に導入される他のCRISPR/Cfp1構成要素の活性を制限することができる。特定の実施形態では、gRNA分子は、細胞または対象中に導入されるCRISPR/Cpf1システムの構成要素をコードする配列を含む核酸上に、標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA分子は:(a)Cpf1分子をコードする核酸;(b)FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/もしくはTRBC遺伝子を標的化する標的化ドメインを含むgRNA分子(標的遺伝子gRNA)をコードする核酸上に;またはCRISPR/Cpf1構成要素、例えば(a)および(b)の双方をコードする複数の核酸上に、標的配列と相補的である標的化ドメインを含む。阻害Cpf1 gRNA分子は、Cpf1分子と複合体形成して、システムの構成要素を不活性化し得る。特定の実施形態では、Cpf1分子/阻害Cpf1 gRNA分子複合体は、Cpf1分子をコードする配列を含む核酸を不活性化する。特定の実施形態では、Cpf1分子/阻害Cpf1 gRNA分子複合体は、標的遺伝子gRNA分子をコードする配列を含む核酸を不活性化する。特定の実施形態では、Cpf1分子/阻害Cpf1 gRNA分子複合体は、時間的、発現レベル、または他の制限を、Cpf1分子/標的遺伝子gRNA分子複合体の活性に課す。特定の実施形態では、Cpf1分子/阻害Cpf1 gRNA分子複合体は、オフターゲットまたは他の不所望の活性を引き下げる。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA分子は、コード配列または制御領域、例えばプロモーターを標的化して、CRISPR/Cpf1システム構成要素を負に調節する。例えば、阻害Cpf1 gRNAは、Cpf1分子のコード配列、Cpf1分子コード配列の発現を調節する制御領域、例えばプロモーター、または2つの間に配置される配列を標的化し得る。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA分子は、標的遺伝子gRNAのコード配列、または制御領域、例えばプロモーターを標的化する。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA、例えば、Cpf1標的化阻害Cpf1 gRNA分子もしくは標的遺伝子gRNA標的化阻害Cpf1 gRNA分子、またはこれをコードする核酸が、別々に、例えば、Cpf1分子またはこれをコードする核酸よりも後に導入される。例えば、第1のベクター、例えばウイルスベクター、例えばAAVベクターは、Cpf1分子および1つまたは複数の標的遺伝子gRNA分子をコードする核酸を導入することができ、そして第2のベクター、例えばウイルスベクター、例えばAAVベクターは、阻害Cpf1 gRNA分子、例えばCpf1標的化gRNA分子または標的遺伝子gRNA標的化gRNA分子をコードする核酸を導入することができる。特定の実施形態では、第2のベクターは、第1のベクターの後に導入されてよい。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA分子、例えば、Cpf1標的化阻害Cpf1 gRNA分子もしくは標的遺伝子gRNA標的化阻害Cpf1 gRNA分子、またはこれをコードする核酸は、Cpf1分子またはこれをコードする核酸と共に、例えば同時に、またはこれと同じベクター内に導入されてよいが、例えば、例えばしばらくするとCpf1の転写が低下するように、後から活性化される転写制御要素、例えば、プロモーターまたはエンハンサーの下にある。特定の実施形態では、転写制御要素は、内因的に活性化される。特定の実施形態では、転写要素は、外部トリガーの導入を介して活性化される。
Cpf1分子またはgRNA分子をコードする核酸、例えばDNAを用いる、またはこれを含む方法および組成物は、加えて、「阻害Cpf1 gRNA分子」を用い、またはこれを含むことができる。阻害Cpf1 gRNAは、細胞または対象中に導入される他のCRISPR/Cfp1構成要素の活性を制限することができる。特定の実施形態では、gRNA分子は、細胞または対象中に導入されるCRISPR/Cpf1システムの構成要素をコードする配列を含む核酸上に、標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA分子は:(a)Cpf1分子をコードする核酸;(b)FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、および/もしくはTRBC遺伝子を標的化する標的化ドメインを含むgRNA分子(標的遺伝子gRNA)をコードする核酸上に;またはCRISPR/Cpf1構成要素、例えば(a)および(b)の双方をコードする複数の核酸上に、標的配列と相補的である標的化ドメインを含む。阻害Cpf1 gRNA分子は、Cpf1分子と複合体形成して、システムの構成要素を不活性化し得る。特定の実施形態では、Cpf1分子/阻害Cpf1 gRNA分子複合体は、Cpf1分子をコードする配列を含む核酸を不活性化する。特定の実施形態では、Cpf1分子/阻害Cpf1 gRNA分子複合体は、標的遺伝子gRNA分子をコードする配列を含む核酸を不活性化する。特定の実施形態では、Cpf1分子/阻害Cpf1 gRNA分子複合体は、時間的、発現レベル、または他の制限を、Cpf1分子/標的遺伝子gRNA分子複合体の活性に課す。特定の実施形態では、Cpf1分子/阻害Cpf1 gRNA分子複合体は、オフターゲットまたは他の不所望の活性を引き下げる。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA分子は、コード配列または制御領域、例えばプロモーターを標的化して、CRISPR/Cpf1システム構成要素を負に調節する。例えば、阻害Cpf1 gRNAは、Cpf1分子のコード配列、Cpf1分子コード配列の発現を調節する制御領域、例えばプロモーター、または2つの間に配置される配列を標的化し得る。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA分子は、標的遺伝子gRNAのコード配列、または制御領域、例えばプロモーターを標的化する。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA、例えば、Cpf1標的化阻害Cpf1 gRNA分子もしくは標的遺伝子gRNA標的化阻害Cpf1 gRNA分子、またはこれをコードする核酸が、別々に、例えば、Cpf1分子またはこれをコードする核酸よりも後に導入される。例えば、第1のベクター、例えばウイルスベクター、例えばAAVベクターは、Cpf1分子および1つまたは複数の標的遺伝子gRNA分子をコードする核酸を導入することができ、そして第2のベクター、例えばウイルスベクター、例えばAAVベクターは、阻害Cpf1 gRNA分子、例えばCpf1標的化gRNA分子または標的遺伝子gRNA標的化gRNA分子をコードする核酸を導入することができる。特定の実施形態では、第2のベクターは、第1のベクターの後に導入されてよい。特定の実施形態では、阻害Cpf1 gRNA分子、例えば、Cpf1標的化阻害Cpf1 gRNA分子もしくは標的遺伝子gRNA標的化阻害Cpf1 gRNA分子、またはこれをコードする核酸は、Cpf1分子またはこれをコードする核酸と共に、例えば同時に、またはこれと同じベクター内に導入されてよいが、例えば、例えばしばらくするとCpf1の転写が低下するように、後から活性化される転写制御要素、例えば、プロモーターまたはエンハンサーの下にある。特定の実施形態では、転写制御要素は、内因的に活性化される。特定の実施形態では、転写要素は、外部トリガーの導入を介して活性化される。
典型的には、阻害Cpf1 gRNA分子、例えば、Cpf1標的化gRNA分子をコードする核酸配列は、負に調節する構成要素、例えばCpf1分子をコードする核酸とは異なる制御領域、例えばプロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、「異なる制御領域」は、単純に、双方の制御配列に機能的に連結する一制御領域、例えばプロモーターの制御下にないことを指す。特定の実施形態では、異なる、は、制御領域の種類またはタイプが「異なる制御領域」を指す。例えば、阻害Cpf1 gRNA分子、例えば、Cpf1標的化gRNA分子をコードする配列は、発現のレベルがより低い制御領域、例えばプロモーターの制御下にあり、または負に調節する構成要素をコードする配列、例えばCpf1分子をコードする核酸よりも後に発現される。
一例として、阻害Cpf1 gRNA分子、例えば、Cpf1標的化阻害Cpf1 gRNA分子をコードする配列は、本明細書中に記載される制御領域(例えばプロモーター)、例えば、ヒトU6核内低分子プロモーターまたはヒトH1プロモーターの制御下にあってよい。特定の実施形態では、負に調節する構成要素をコードする配列、例えばCpf1分子をコードする核酸は、本明細書中に記載される制御領域(例えばプロモーター)、例えば、CMV、EF-1a、MSCV、PGK、CAG制御プロモーターの制御下にあってよい。
以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲または内容をどのようにも限定することは意図されない。
実施例1-T細胞へのCpf1/crRNA RNPの送達
初代CD4+T細胞におけるCpf1媒介切断を実証するために、精製したアシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種BV3L6 Cpf1(「AsCpf1」)を、TCRアルファ鎖に対してデザインした11の異なるgRNA(「crRNA」とも呼ぶ)と複合体形成した(表6)。GWED539は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3433で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED540は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3587で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED541は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3538で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED542は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3461で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED543は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3475で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED544は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3524で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED545は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3566で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED546は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3517で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED547は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3573で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED548は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3580で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED549は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3454で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。
初代CD4+T細胞におけるCpf1媒介切断を実証するために、精製したアシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種BV3L6 Cpf1(「AsCpf1」)を、TCRアルファ鎖に対してデザインした11の異なるgRNA(「crRNA」とも呼ぶ)と複合体形成した(表6)。GWED539は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3433で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED540は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3587で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED541は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3538で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED542は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3461で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED543は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3475で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED544は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3524で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED545は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3566で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED546は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3517で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED547は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3573で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED548は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3580で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。GWED549は、配列番号3708で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号3454で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。
各RNP複合体を電気穿孔によって送達し、そしてTRAC遺伝子座を標的化して切断する個々のRNPの能力を、フローサイトメトリー(FCM)およびT7E1アッセイによって評価した。
AsCpf1酵素の精製
AsCpf1の1307残基に相当する3.9Kbの遺伝子セグメントを、添付のSapI Electraクローニングアーム(DNA 2.0クローニングシステム)およびC-termヌクレオプラスミンNLSによる遺伝子合成によって得た。pUC57ベクター中にクローニングした合成構築体を、SapI消化によって切り出して、pD441-NH、pD441-CH(高コピー)、およびpD421-NH(低コピー)大腸菌(E.coli)発現ベクター中にElectraクローニングした(DNA 2.0、Electraクローニングシステム)。
AsCpf1の1307残基に相当する3.9Kbの遺伝子セグメントを、添付のSapI Electraクローニングアーム(DNA 2.0クローニングシステム)およびC-termヌクレオプラスミンNLSによる遺伝子合成によって得た。pUC57ベクター中にクローニングした合成構築体を、SapI消化によって切り出して、pD441-NH、pD441-CH(高コピー)、およびpD421-NH(低コピー)大腸菌(E.coli)発現ベクター中にElectraクローニングした(DNA 2.0、Electraクローニングシステム)。
AsCpf1遺伝子を含有するプラスミド(N-term His(高コピー)、C-term His(高コピー)、またはN-term His(低コピー))を形質転換し、または細菌発現株中に電気穿孔した後、タンパク質を、以下の方法を用いて発現させて、精製した。また、全てのAsCpf1構築体が、C末端ヌクレオプラスミンNLS配列を含有するが、N末端またはC末端上のSV40 NLSも適用可能である。プラスミドを、タンパク質発現細菌細胞(例えばRosetta 2細胞)中に形質転換し、または電気穿孔した後、生じたいくつかのコロニーを、0.5mLのBrain Heart and Lung(BHL)培地、または別の、抗生物質なしリッチ培地に加えた。30分から1時間後に、または細胞懸濁液が濁って見えたときに、0.5mLのBHL培地または他のリッチ培地および抗生物質(クロラムフェニコールおよびカナマイシン)を培養体に加えた。培養体が濁って見えるようになると(OD=0.6)、培養容量を、容量が8mLに達するまで、二倍にした。次に、培養体全部を、最大1LのTerrificブロス(Teknova)培地+抗生物質+1mLの1000×金属溶液(Teknova)+200μLの1M硫酸マグネシウム溶液に移した。培養体を37℃にて増殖させた。培養体ODを、1~2時間後に、または培養フラスコが僅かに濁って見えたときに、測定した。この時点では、ODは、1時間毎に、または適切な場合には、ODが1.0~1.5に達するまで、測定した。ODが1.0~1.5に達すると、フラスコを低温(18℃から25℃)に移して、ここでもODを30分から1時間後にチェックした。培養体のODが約2.0に達したときに、IPTGを加えることによってタンパク質発現を誘導した。細胞を、18℃にて12~16時間(この時間は、必要に応じて最大3日まで変えることができる)増殖させた。次に、大きな遠心分離機を用いて培養体を収穫してペレット化させて、直ちに溶解させるか、溶解の日まで-80℃にて凍結して維持した。
AsCpf1を発現する細胞ペレットを、ミクロフルイダイザーを用いて溶解させた。そこでは、1~10gの乾燥細胞ペレットを、70mLの溶解バッファ(50mMトリスpH8.0、1mM TCEP[トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン)]またはDTT(ジチオスレイトール)、10~20%グリセロール、および300~1000mM NaClまたはKClで再懸濁させた。これ以外にも、BPER(ThermoFisher)化学溶解キット、BugBuster(EMD Millipore)化学溶解キット、または自社の、同じバッファを含有する化学溶解試薬を、細胞膜を破壊するための1%トリトンX-100の存在下で用いて、細胞を溶解させて、混ざった(folded)AsCpf1を抽出した。最後に、超音波処理器を用いて、ミクロフルイダイザー法におけるのと同じ溶解バッファを、1%トリトンX-100も他のあらゆるマイルドな双性イオン洗剤も無で用いて、細胞を溶解させることができる。
細胞溶解液を遠心分離機内でスピンダウンさせて、細胞残渣ペレットを破棄した。上清を、0.2μmまたは0.45μmのフィルタで濾過して、HisTrap Ni-NTAカラム(GE Healthcare)またはHIsPur Ni-NTAスラリー(Thermo Fisher)を用いた重力カラム上にロードした。双方の場合とも、HisTrapまたは重力カラム中のスラリーを、溶解バッファで平衡させてから、30mMイミダゾールも含有する溶解バッファによる5×~20×のカラム容量の何回かの洗浄に曝した。最後に、HisTrapまたは250~500mMイミダゾール入り溶解バッファを用いた重力カラムのNi-NTA樹脂から、Hisタグの付いたAsCpf1を溶出した。
次に、AsCpf1タンパク質を、分子量カットオフが100kDa以下のフィルタを用いておよそ5mLに濃縮して、サイズ排除カラムを備えるAKTA Pure(GE Healthcare)FPLC機器上にロードした。これ以外にも、6×His-AsCpf1-NLS構築体の正味の正電荷(+8)により、AsCpf1を陽イオン交換カラム上にロードして、100mMから1000mMのNaCl勾配を用いて40分にわたって精製することもできる。NaClをKClで置換することもできる。これ以外にも、3×FLAGタグ(-7正味電荷)を有し、かつNLS(+5正味電荷)を有していないAsCpf1(+3正味電荷)は、負電荷を帯びることとなり、陰イオン交換カラムに結合して、塩勾配の増大により精製され得る。サイズ排除精製法または陽イオン交換精製法用のバッファは、50mM HEPES、pH7.5、1mM TCEPまたはDTT、10%~20%グリセロール、および250mM NaCl一定イオン強度(サイズ排除)または100mMから1000mM NaClイオン強度(陽イオン交換)である。HEPESは、pH6.5~8.5の範囲で緩衝能力を有するあらゆるバッファと置換することができる。AsCpf1タンパク質を、2mLの画分中に溶出して、UV吸光度によってFPLC機器で検出して、1つの主ピークが生じた。このピークの画分をプールして、AsCpf1が存在し、かつ純度が高いかをSDS-PAGEによって分析して判定した。SDS-PAGEは、予想される150kDa分子量マーカーにて、バンドが混入することなく明確なバンドを示した。また、AsCpf1吸光度スペクトルの調査は、260/280UV吸光度比によって測定して、計測可能な核酸の混入のない、明確なタンパク質を示した。
AsCpf1のプールした画分を、NCBIウェブサイトのUniProt Prot-paramツールで示され、そして280の吸光度で測定されるAsCpf1の予測吸光係数(143,940M-1cm-1)に基づいて、50μMに至るまで濃縮した。これらのアリコートを、直ぐに使用するために4℃で保存し、または長期貯蔵のために液体窒素中で急速冷凍して、-80℃にて保存した。
crRNAを化学合成によって生成して、細胞への送達前に、上述の精製したタンパク質に対して、タンパク質およびcrRNAを室温にて最低でも15分間インキュベートすることによって、複合体形成した。複合体形成されたRNPを、2つの別々のアッセイに用いた。RNPを、生体外切断アッセイに用いた。そこではRNPを、TRAC遺伝子座のエキソン1に相当するPCR産物とインキュベートした。RNPを、PCR生成物と1:1のモル比でインキュベートし、そして37℃にて15分間インキュベートした。インキュベーション後、反応物を、プロテイナーゼKと42℃にて20分間処理した。切断を、PAGEゲル上で視覚化した。ほとんどのRNPについて切断が観察されたが、2つが顕著な切断を示した(図2)。また、各RNP複合体の画分を、活性化したヒト初代CD4+T細胞(IL-2、IL-7、IL-15を補った完全培地中で培養した)中に、電気穿孔によって、1μg/100,000細胞の比率で導入した。TCRα/βに特異的なBrilliant Violet 421(BioLegend)結合抗体を用いたFCMによって、電気穿孔の4日後に、細胞上でのTCRα/β発現を監視した。2つのRNP(GWED545およびGWED546)は、TCRα/βの発現に影響を与えなかった多くのRNPと比較して、トランスフェクト細胞上でのTCRα/βの発現を顕著に引き下げた(図3)。加えて、細胞生存度は、Cpf1 RNPによる処理によって悪影響を受けなかった(図4)。TCRα/βネガティブ細胞の生成が、TRAC遺伝子座でのゲノム編集の結果であったことを確認するために、gDNAを収穫して、T7E1アッセイを実行した。簡潔に、T7E1アッセイは、450bpのPCR産物の増幅、精製、およびサイズ確認、PCR産物の変性、ならびに95℃への加熱に続く緩慢な冷却による再ハイブリダイズを含む。次に、ハイブリダイズしたPCR産物を、完全にマッチしないDNAを認識してこれを切断するT7エンドヌクレアーゼI(または他のミスマッチ感受性酵素)で消化した。インデルが元の鋳型DNA中に存在するならば、アンプリコンが変性して再アニールした場合に、異なるインデルを保有するDNA鎖のハイブリダイゼーションをもたらすので、完全にマッチしない二本鎖DNAとなった。消化産物を、ゲル電気泳動によって、またはキャピラリー電気泳動によって視覚化することができる。切断されたDNAの割合(切断産物の密度を、切断および非切断の密度で割った)を用いて、以下の式によりパーセントNHEJを推定した:%NHEJ=(1-(1-切断された割合)1/2)。T7E1アッセイは、約2~5%のNHEJに至るまで感受性であった。実際に、データにより、TCRα/β発現を引き下げたRNPについて、TRAC遺伝子座でのDNA修飾の存在が確認される(図5)。
Cpf1が、複数の供与体に由来するヒトT細胞を切断することができるかを判定するために、GWED545 crRNAおよびGWED546 crRNAからなるRNPを、第2の供与体由来の活性化されたヒトT細胞中に電気穿孔した。TCRα/βに特異的なBrilliant Violet 421(BioLegend)結合抗体を用いたFCMによって、電気穿孔の4日後に、編集効率をFACS分析によって評価した。これらの2つのRNPの、2供与体にわたるヒトT細胞を編集する能力を、TCRα/β発現の損失によって確認した(図6)。
参照による援用
全本明細書で言及される文献、特許、配列表、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、配列表、または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書の任意の定義をはじめとして、本出願が優先される。
全本明細書で言及される文献、特許、配列表、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、配列表、または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書の任意の定義をはじめとして、本出願が優先される。
同等物
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。特定の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内である。
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。特定の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内である。
Claims (125)
- FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される1つのT細胞発現遺伝子の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む阻害セントロメアプロモーター因子1(Cpf1)gRNA分子。
- 直接反復ドメインをさらに含む、請求項1に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記直接反復ドメインは、15~20ヌクレオチド長である、請求項2に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記直接反復ドメインは、配列番号3708~3710からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項2または3に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記標的ドメインは、前記T細胞発現遺伝子の発現のノックアウトのために標的化される、請求項1~4のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記標的ドメインは、前記T細胞発現遺伝子のコード領域内にある、請求項1~5のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記コード領域は、前記T細胞発現遺伝子の初期コード領域である、請求項6に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、T細胞標的ノックアウト位置の500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、25、または10ヌクレオチド以内に二本鎖切断を提供するように構成される、請求項1~4のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、配列番号1~3707から選択されるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列、またはこれらとは1以下、2以下、3以下、4以下、もしくは5以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、配列番号1~3707から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項9に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、15~25ヌクレオチド長である、請求項1~10のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、18ヌクレオチド長である、請求項11に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、19ヌクレオチド長である、請求項11に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、20ヌクレオチド長である、請求項11に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、21ヌクレオチド長である、請求項11に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、22ヌクレオチド長である、請求項11に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、23ヌクレオチド長である、請求項11に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、24長である、請求項11に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記阻害Cpf1 gRNAは、ユニモジュラー阻害Cpf1 gRNA分子である、請求項1~18のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- (a)FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される1つのT細胞発現遺伝子の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む第1の阻害Cpf1 gRNA分子をコードする第1のヌクレオチド配列を含む核酸組成物。
- 前記第1の阻害Cpf1 gRNA分子は、請求項1~19のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子である、請求項20に記載の核酸組成物。
- 直接反復ドメインをさらに含む、請求項20または21に記載の核酸組成物。
- 前記直接反復ドメインは、15~20ヌクレオチド長である、請求項22に記載の核酸組成物。
- 前記直接反復ドメインは、配列番号3708~3710からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項22または23に記載の核酸組成物。
- 前記標的ドメインは、前記T細胞発現遺伝子の発現のノックアウトのために標的化される、請求項20~24のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記標的ドメインは、前記T細胞発現遺伝子のコード領域内にある、請求項20~25のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記コード領域は、前記T細胞発現遺伝子の初期コード領域である、請求項26に記載の核酸組成物。
- 前記標的化ドメインは、T細胞標的ノックアウト位置の500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、25、または10ヌクレオチド以内に二本鎖切断を提供するように構成される、請求項20~27のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記標的化ドメインは、配列番号1~3707から選択されるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列、またはこれらとは1以下、2以下、3以下、4以下、もしくは5以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む、請求項20~28のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記標的化ドメインは、配列番号1~3707から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項29に記載の核酸組成物。
- 前記標的化ドメインは、15~25ヌクレオチド長である、請求項20~30のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記標的化ドメインは、18ヌクレオチド長である、請求項31に記載の核酸組成物。
- 前記標的化ドメインは、19ヌクレオチド長である、請求項31に記載の核酸組成物。
- 前記標的化ドメインは、20ヌクレオチド長である、請求項31に記載の核酸組成物。
- 前記標的化ドメインは、21ヌクレオチド長である、請求項31に記載の核酸組成物。
- 前記標的化ドメインは、22ヌクレオチド長である、請求項31に記載の核酸組成物。
- 前記標的化ドメインは、23ヌクレオチド長である、請求項31に記載の核酸組成物。
- 前記標的化ドメインは、24長である、請求項31に記載の核酸組成物。
- (b)Cpf1分子をコードする第2のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項20~38のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記Cpf1分子は、標的核酸中に二本鎖切断を形成する、請求項39に記載の核酸組成物。
- 前記Cpf1分子は、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種BV3L6株Cpf1分子(AsCpf1)、ラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)ND2006 Cpf1分子(LbCpf1)、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)MA2020(Lb2Cpf1)からなる群から選択される、請求項39または40に記載の核酸組成物。
- 前記第2のヌクレオチド配列は、配列番号3722、配列番号3723、または配列番号3724で示される、請求項39~41のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- (a)および(b)は、1つの核酸分子上に存在する、請求項39~42のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記核酸分子は、AAVベクターである、請求項43に記載の核酸組成物。
- (a)は、第1の核酸分子上に存在し;(b)は、第2の核酸分子上に存在する、請求項43または44に記載の核酸組成物。
- 前記第1の核酸分子および前記第2の核酸分子は、AAVベクターまたはLVベクターである、請求項45に記載の核酸組成物。
- (c)FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択されるT細胞発現遺伝子の第2の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む第2の阻害Cpf1 gRNA分子をコードする第3のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項39~47のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記第2の阻害Cpf1 gRNA分子は、請求項1~19のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子である、請求項47に記載の核酸組成物。
- 前記第1の阻害Cpf1 gRNA分子および前記第2の阻害Cpf1 gRNA分子は、T細胞標的ノックアウト位置の側面に位置するように、2セットの二本鎖切断を生じさせる、請求項47または48に記載の核酸組成物。
- 前記第2の阻害Cpf1 gRNA分子の前記標的化ドメインは、配列番号1~3707から選択されるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列、またはこれらとは1以下、2以下、3以下、4以下、もしくは5以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む、請求項47~49のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記第2の阻害Cpf1 gRNAの前記標的化ドメインは、配列番号1~3707から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項50に記載の核酸組成物。
- (a)および(c)は、1つの核酸分子上に存在する、請求項47~51のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記核酸分子は、AAVベクターまたはLVベクターである、請求項52に記載の核酸組成物。
- (a)は、第1の核酸分子上に存在し;(c)は、第2の核酸分子上に存在する、請求項47~51のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記第1の核酸分子および前記第2の核酸分子は、AAVベクターまたはLVベクターである、請求項54に記載の核酸組成物。
- (a)、(b)、および(c)は、1つの核酸分子上に存在する、請求項47~51のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記核酸分子は、AAVベクターまたはLVベクターである、請求項56に記載の核酸組成物。
- (a)、(b)、および(c)の1つが、第1の核酸分子上にコードされ;第2および第3の(a)、(b)、および(c)が、第2の核酸分子上にコードされている、請求項47~51のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記第1の核酸分子および前記第2の核酸分子は、AAVベクターまたはLVベクターである、請求項58に記載の核酸組成物。
- (a)は、第1の核酸分子上に存在し;(b)および(c)は、第2の核酸分子上に存在する、請求項58または59に記載の核酸組成物。
- (b)は、第1の核酸分子上に存在し;(a)および(c)は、第2の核酸分子上に存在する、請求項58または59に記載の核酸組成物。
- (c)は、第1の核酸分子上に存在し;(b)および(a)は、第2の核酸分子上に存在する、請求項58または59に記載の核酸組成物。
- 前記核酸組成物は、(a)に作動可能に連結されるプロモーターを含む、請求項20~62のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記核酸組成物は、(b)に作動可能に連結されるプロモーターを含む、請求項39~63のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記核酸組成物は、(c)に作動可能に連結される第2のプロモーターを含む、請求項47~64のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- (a)請求項1~19のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子を含む組成物。
- (b)Cpf1分子をさらに含む、請求項66に記載の組成物。
- 前記Cpf1分子は、標的核酸中に二本鎖切断を形成する、請求項67に記載の組成物。
- 前記Cpf1分子は、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種BV3L6株Cpf1分子(AsCpf1)、ラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)ND2006 Cpf1分子(LbCpf1)、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)MA2020(Lb2Cpf1)からなる群から選択される、請求項67または68に記載の組成物。
- (c)第2の阻害Cpf1 gRNA分子をさらに含む、請求項66~69のいずれか一項に記載の組成物。
- Cpf1タンパク質、および前記阻害Cpf1 gRNA分子をコードするリボ核酸分子を含むリボ核タンパク質組成物である、請求項66~70のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞を改変する方法であって、前記細胞を:
(a)請求項1~19のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA;および
(b)Cpf1分子
と接触させることを含む方法。 - 前記Cpf1分子は、標的核酸中に二本鎖切断を形成する、請求項72に記載の方法。
- 前記Cpf1分子は、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種BV3L6株Cpf1分子(AsCpf1)、ラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)ND2006 Cpf1分子(LbCpf1)、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)MA2020(Lb2Cpf1)からなる群から選択される、請求項72または73に記載の方法。
- 前記細胞を、(c)FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択されるT細胞発現遺伝子の第2の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む第2の阻害Cpf1 gRNA分子と接触させることをさらに含む、請求項72~74のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、がんに罹患している対象に由来する、請求項72~75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記がんは、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、B細胞急性リンパ球性白血病(B-ALL)、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫(NHL)、びまん性大細胞リンパ腫(DLCL)、多発性骨髄腫、腎細胞がん(RCC)、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、メラノーマ、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝細胞がん、膵臓がん、星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫からなる群から選択される、請求項76に記載の方法。
- 前記細胞は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子中の1つまたは複数のT細胞標的位置の1つまたは複数の改変から恩恵を被ることとなる対象に由来する、請求項72~77のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、T細胞である、請求項72~78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞は、操作されたT細胞である、請求項79に記載の方法。
- 操作された前記T細胞は、操作されたキメラ抗原受容体(CAR)T細胞である、請求項80に記載の方法。
- 操作された前記T細胞は、操作されたTCR(T細胞受容体)T細胞である、請求項80に記載の方法。
- 前記T細胞は、T細胞発現遺伝子のT細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入する前に、TCRまたはCARを発現するように操作される、請求項79~82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞は、T細胞発現遺伝子のT細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入した後に、TCRまたはCARを発現するように操作される、請求項79~82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞は、T細胞発現遺伝子のT細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入するのと同時に、TCRまたはCARを発現するように操作される、請求項79~82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触は、生体外で実行される、請求項72~85のいずれか一項に記載の方法。
- 接触した前記細胞は、前記対象の体に戻される、請求項72~86のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触は、前記細胞を、請求項20~65のいずれか一項に記載の核酸組成物と接触させることを含む、請求項72~87のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触は、前記細胞を、請求項66~71のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、請求項72~87のいずれか一項に記載の方法。
- 対象を治療する方法であって、対象由来の細胞を:
(a)請求項1~35のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA;および
(b)Cpf1分子
と接触させることを含む方法。 - 前記Cpf1分子は、標的核酸中に二本鎖切断を形成する、請求項90に記載の方法。
- 前記Cpf1分子は、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)属種BV3L6株Cpf1分子(AsCpf1)、ラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)ND2006 Cpf1分子(LbCpf1)、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)MA2020(Lb2Cpf1)からなる群から選択される、請求項90または91に記載の方法。
- 前記細胞を、(c)FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択されるT細胞発現遺伝子の第2の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む第2の阻害Cpf1 gRNA分子と接触させることをさらに含む、請求項90~92のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象は、がんに罹患している、請求項90~93のいずれか一項に記載の方法。
- 前記がんは、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、B細胞急性リンパ球性白血病(B-ALL)、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫(NHL)、びまん性大細胞リンパ腫(DLCL)、多発性骨髄腫、腎細胞がん(RCC)、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、メラノーマ、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝細胞がん、膵臓がん、星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫からなる群から選択される、請求項94に記載の方法。
- 前記対象は、1つまたは複数のT細胞発現遺伝子中の1つまたは複数のT細胞標的位置の1つまたは複数の改変から恩恵を被ることとなる、請求項90~95のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、T細胞である、請求項90~96のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞は、操作されたT細胞である、請求項97に記載の方法。
- 操作された前記T細胞は、操作されたキメラ抗原受容体(CAR)T細胞である、請求項98に記載の方法。
- 操作された前記T細胞は、操作されたT細胞受容体(TCR)T細胞である、請求項98に記載の方法。
- 前記T細胞は、T細胞発現遺伝子のT細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入する前に、TCRまたはCARを発現するように操作される、請求項97~100のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞は、T細胞発現遺伝子のT細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入した後に、TCRまたはCARを発現するように操作される、請求項97~100のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞は、T細胞発現遺伝子のT細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入するのと同時に、TCRまたはCARを発現するように操作される、請求項97~100のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触は、生体外で実行される、請求項90~103のいずれか一項に記載の方法。
- 接触した前記細胞は、前記対象の体に戻される、請求項90~104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触は、前記細胞を、請求項20~65のいずれか一項に記載の核酸組成物と接触させることを含む、請求項90~105のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触は、前記細胞を、請求項66~71のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、請求項90~105のいずれか一項に記載の方法。
- (a)請求項1~19のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子、請求項20~65のいずれか一項に記載の核酸組成物、または請求項66~71のいずれか一項に記載の組成物、ならびに
(b)FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択される1つまたは複数のT細胞発現遺伝子中の1つまたは複数のT細胞標的ノックアウト位置の1つまたは複数の改変から恩恵を被ることとなる対象由来の細胞
を含む反応混合物。 - (a)請求項1~19のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子、または阻害Cpf1 gRNAをコードする核酸組成物、ならびに以下の1つまたは複数:
(b)Cpf1分子;
(c)FAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、B2M、TRAC、およびTRBC遺伝子からなる群から選択されるT細胞発現遺伝子の第2の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む第2の阻害Cpf1 gRNA分子;ならびに
(d)(b)および(c)の1つまたは複数をコードする核酸組成物
を含むキット。 - 前記阻害Cpf1 gRNA分子は、その5’末端にて、またはその近くに、修飾を含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記阻害Cpf1 gRNA分子は、その3’末端にて、またはその近くに、修飾を含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記阻害Cpf1 gRNA分子は、その5’末端にて、またはその近くに修飾を、そしてその3’末端にて、またはその近くに修飾を含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記修飾は、その5’末端の1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、または1~2ヌクレオチド以内にある、請求項110または112に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記修飾は、その3’末端の1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、または1~2ヌクレオチド以内にある、請求項111または112に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記修飾により、前記阻害Cpf1 gRNA分子は、T細胞中に導入された場合に、ヌクレアーゼに対する安定性の増大を示す、請求項110~114のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記修飾により、前記阻害Cpf1 gRNA分子は、T細胞中に導入された場合に、先天性免疫応答の低下を示す、請求項110~114のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記先天性免疫応答は、サイトカイン発現の誘導を伴う、請求項116に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 対象におけるがんの治療に用いられる、請求項1~19のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 前記阻害Cpf1 gRNA分子は、(b)Cpf1分子と組み合わせて用いられる、請求項118に記載の阻害Cpf1 gRNA分子。
- 対象におけるがんの治療用の医薬の製造における、請求項1~19のいずれか一項に記載の阻害Cpf1 gRNA分子の使用。
- 前記医薬はさらに、(b)Cpf1分子を含む、請求項120に記載の使用。
- 対象におけるがんの治療に用いられる、請求項20~65のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 対象におけるがんの治療に用いられる、請求項66~71のいずれか一項に記載の組成物。
- 対象におけるがんの治療用の医薬の製造における、請求項20~65のいずれか一項に記載の核酸組成物の使用。
- 対象におけるがんの治療用の医薬の製造における、請求項66~71のいずれか一項に記載の組成物の使用。
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