JP2023063994A - Ｏ－マンノシルグリカン関連化合物および糖鎖伸長プライマーとしてのその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】筋ジストロフィーに関連するO-マンノシルグリカン糖鎖の伸長のプライマーとなり得る化合物、その組成物および製造方法、ならびにそれを用いた糖鎖伸長方法を提供する。【解決手段】単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物であって、Rbo5Pはリビトール（Rbo）が5位においてリン酸（P）とリン酸エステル結合していることを表し、3GalNAcβは3位において上記リン酸（P）とリン酸エステル結合しているβ-N-アセチルガラクトサミン化合物を表す、化合物、またはその塩が提供される。その組成物および製造方法、ならびにそれを用いた糖鎖伸長方法も提供される。【選択図】図６
Description
本開示は広く糖鎖の分野に関する。本開示はより具体的には、糖タンパク質を修飾する糖鎖に関する。本開示はより具体的には、その異常が筋ジストロフィーの病因になることが知られるＯ－マンノシルグリカン糖鎖に関する。
筋肉細胞は、その細胞膜上に存在する糖タンパク質であるαジストログリカンの糖鎖がラミニンに結合することにより、基底膜に繋ぎ止められる。ラミニンは基底膜を構成する主要な成分である。αジストログリカンの糖鎖と基底膜のラミニンとの相互作用により、筋肉の伸縮に伴う組織のずれ動きに対応して正常な生理機能を保つことができる。この相互作用に異常があると、筋肉の伸縮の際に細胞膜の破壊等が起こり、筋細胞の減少や筋力の低下がもたらされる。
ラミニンとの相互作用に関わるαジストログリカンの糖鎖（コアM3グリカンとして知られる）の根元は、Ser/Thr残基の側鎖におけるO-マンノシル化で構成されることから、この糖鎖全体をO-マンノシルグリカンあるいはコアM3 O-マンノシルグリカンと呼ぶことができる。ラミニンとの結合を担う糖鎖の非還元末端側領域は特にマトリグリカンと呼ばれ、これはXyl-GlcA二糖単位の反復によって形成されている。非特許文献１は、コアM3グリカンが、O-マンノースとマトリグリカンの間に位置する中央領域においてタンデムに並んだ2つのリビトールリン酸（RboP）ユニットを含むという発見を記述している。RboPはグラム陽性細菌の細胞壁成分に含まれていることが知られていたが、それが哺乳類のタンパク質修飾糖鎖の一部をなすということは全く新しい発見であった。
αジストログリカノパチーと呼ばれる主要な型の筋ジストロフィーは、αジストログリカンのO-マンノシルグリカン糖鎖を生合成するための酵素の遺伝子が欠損し、その結果、筋肉細胞と基底膜との上記相互作用が損なわれることにより引き起こされる遺伝的疾患である。生体内におけるαジストログリカンの糖鎖の合成は、数種類の酵素（具体的には、ヌクレオチド化合物から糖鎖の非還元末端へと糖部分またはリビトールリン酸部分を転移させる転移酵素）が順番に作用して段階的に、すなわち糖鎖を伸長させながら起こり、その複数種類の酵素のそれぞれの欠損が筋ジストロフィーを引き起こし得ることが知られている。従って筋ジストロフィーの原因遺伝子は患者間で一様ではない。遺伝子治療には様々な技術的および倫理的障壁があるなか、現在も、筋ジストロフィーの根本的な治療法は存在していない。コアM3グリカンの構造、その生合成に関わる酵素群、およびそれらの酵素の欠損と筋ジストロフィーとの関係については、非特許文献１のほか、非特許文献２に総説されている。O-マンノシルグリカンに関係する糖鎖の異常は、筋ジストロフィー以外の状態、障害、または疾患にも関連する可能性がある。
非特許文献３は、伸長中のコアM3グリカンにおいて1つ目のRboPに2つ目のRboPを連結させる酵素であるフクチン関連タンパク質（FKRP）の結晶構造を記述している。FKRP遺伝子の欠損は筋ジストロフィーの原因となる。非特許文献３は、FKRP酵素がRboPのリン酸とO-マンノース上のリン酸とを認識するホモ四量体であり、6位においてリン酸化されたO-マンノースの存在が当該酵素の糖鎖伸長活性のために必要であったことを報告している。
遺伝子治療に代わり得る、筋ジストロフィー等の治療法の有力な候補として、正常な糖鎖を外部から供給するというアプローチがある。このようなアプローチをバイパス糖鎖治療とも呼ぶ。つまり、細胞が自力で完全には合成できない糖鎖を、人為的に供給することにより、細胞が持つ欠損をバイパスして筋肉細胞－基底膜間の相互作用を補完することが企図される。このアプローチに向けて、本発明者らは、αジストログリカンの糖鎖のうちマトリグリカンを含む非還元末端側領域を合成する方法を開発した（特許文献１）。
Kanagawa et al. (2016) Cell Reports 14, 2209-2223
Manya and Endo (2017) BBA - General Subjects 1861, 2462-2472
Kuwabara et al. (2020) NATURE COMMUNICATIONS, 11:303
バイパス糖鎖治療は、必ずしも完全長のコアM3グリカンを供給する必要はない。例えば、一連の中途糖鎖産物を経ながらコアM3グリカンが伸長していく一連の生合成のうち、ある一ステップに関わる酵素が欠損している患者の場合、そのステップの下流に相当する中途糖鎖産物さえ供給すれば、あとは患者自身が持つ酵素（欠損していない下流酵素）を使用して糖鎖の伸長が続行され得る。そのような中途糖鎖産物を、糖鎖伸長のための基質あるいは「プライマー」ということができる。しかしながら、多数ある筋ジストロフィー関連酵素がそれぞれどのような構造をプライマーとして利用できるのか、そのようなプライマーを製造するためにはどのような化学合成を行えばよいのか、といったことに関する知見がほとんど欠如している。上述した非特許文献３によれば、糖鎖修飾ペプチドの文脈で、最も根元のリン酸化マンノースから第1のリビトールまでを含む中途糖鎖全体がFKRP酵素のプライマーとして必要になることが示唆されていた。
本開示は、糖鎖、特に筋ジストロフィーに関連するO-マンノシルグリカン糖鎖の伸長のプライマーとなり得る化合物、その組成物および製造方法、ならびにそれを用いた糖鎖伸長方法を提供する。
本開示は以下の実施形態を包含する。
［１］
単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物であって、前記Rbo5Pはリビトール（Rbo）が5位においてリン酸（P）とリン酸エステル結合していることを表し、前記3GalNAcβは3位において前記リン酸（P）とリン酸エステル結合しているβ-N-アセチルガラクトサミン化合物を表す、化合物、またはその塩。
［２］
前記Rbo5P-3GalNAcβ化合物が、下記式(I)で表される構造を有し、
ここで、Rは水素原子、p-NO2PhCO-、またはアルキニル-(PEG)-CO-であり、PEGは反復数1～24のポリエチレングリコールであり、R6は炭素数1～6のアルキレン基であり、R7は酸素原子、硫黄原子、または窒素原子である、
［１］に記載の化合物またはその塩。
［３］
［１］または［２］に記載の化合物またはその塩における前記リビトール（Rbo）の1位に、さらに第2のRbo5Pがリン酸エステル結合している、単離されたRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩。
［４］
［３］に記載の化合物またはその塩における前記第2のRbo5Pの4位水酸基に、β-キシロースがグリコシド結合している、単離されたXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩。
［５］
［４］に記載の化合物またはその塩における前記Xylの4位水酸基に、β-グルクロン酸がグリコシド結合している、単離されたGlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩。
［６］
［１］～［５］のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む、糖鎖伸長用プライマー組成物。
［７］
［１］または［２］に記載の化合物またはその塩を、CDPリビトールの存在下でFKRP酵素と混合することにより、前記Rbo5P-3GalNAcβ化合物のRboの1位に第2のRbo5Pをリン酸エステル結合させてRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成することを含む、糖鎖伸長方法。
［８］
（ａ）前記Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、UDPキシロースの存在下でRXYLT1酵素と混合することにより前記Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物における末端Rboの4位にキシロース（Xyl）をグリコシド結合させてXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成すること、
および任意で、
（ｂ）工程ａで得られた前記Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、UDPグルクロン酸の存在下でB4GAT1酵素と混合することにより前記Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物におけるXylの4位にグルクロン酸（GlcA）をグリコシド結合させてGlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成すること、
および任意で、
（ｃ）工程ｂで得られた前記GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、UDPキシロースの存在下でLARGE酵素と混合することにより前記GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物におけるGlcAの3位にキシロース（Xyl）をグリコシド結合させてXylα1-3GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成すること
をさらに含む、［７］に記載の糖鎖伸長方法。
［９］
（１）2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物の3位の水酸基と、下記式(II)で表される構造
（式中、R1～R4は水酸基の保護基であり、OR5はホスホネート基である）
を有するリビトール誘導体のホスホネート基とを反応させて、前記ガラクトピラノシド化合物の3位と前記リビトール誘導体の5位とをホスホネート連結で連結すること、
（２）前記ホスホネート連結基を酸化してホスフェート連結基に変換すること、
（３）前記リビトール誘導体と連結された前記ガラクトピラノシド化合物の2位のアジド基をアセチルアミノ基に変換すること、および
（４）前記リビトール誘導体と連結された前記ガラクトピラノシド化合物の4,6位からベンジリデンを除去して4,6位にそれぞれ水酸基を露出させること
を含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の製造方法。
［１０］
前記2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物は、1位水酸基の水素原子が-R6-NHZ基で置換されており、ここでR6は炭素数1～6のアルキレン基であり、Zはベンジルオキシカルボニル基であり、
前記方法は、
（０ａ）3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-D-ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート、HO-R6-NHZ、およびBF3・OEt2を反応させて、1位水酸基の水素原子が-R6-NHZ基で置換された3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物を得ること、および
（０ｂ）前記工程０ａで得られたガラクトピラノシド化合物のアセチル保護基を脱保護し、さらにベンズアルデヒドジメチルアセタールを反応させて4,6位水酸基をベンジリデン保護すること
を含む予備的方法により、前記工程（１）の2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物を調製することをさらに含む、［９］に記載の方法。
［１］
単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物であって、前記Rbo5Pはリビトール（Rbo）が5位においてリン酸（P）とリン酸エステル結合していることを表し、前記3GalNAcβは3位において前記リン酸（P）とリン酸エステル結合しているβ-N-アセチルガラクトサミン化合物を表す、化合物、またはその塩。
［２］
前記Rbo5P-3GalNAcβ化合物が、下記式(I)で表される構造を有し、
ここで、Rは水素原子、p-NO2PhCO-、またはアルキニル-(PEG)-CO-であり、PEGは反復数1～24のポリエチレングリコールであり、R6は炭素数1～6のアルキレン基であり、R7は酸素原子、硫黄原子、または窒素原子である、
［１］に記載の化合物またはその塩。
［３］
［１］または［２］に記載の化合物またはその塩における前記リビトール（Rbo）の1位に、さらに第2のRbo5Pがリン酸エステル結合している、単離されたRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩。
［４］
［３］に記載の化合物またはその塩における前記第2のRbo5Pの4位水酸基に、β-キシロースがグリコシド結合している、単離されたXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩。
［５］
［４］に記載の化合物またはその塩における前記Xylの4位水酸基に、β-グルクロン酸がグリコシド結合している、単離されたGlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩。
［６］
［１］～［５］のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む、糖鎖伸長用プライマー組成物。
［７］
［１］または［２］に記載の化合物またはその塩を、CDPリビトールの存在下でFKRP酵素と混合することにより、前記Rbo5P-3GalNAcβ化合物のRboの1位に第2のRbo5Pをリン酸エステル結合させてRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成することを含む、糖鎖伸長方法。
［８］
（ａ）前記Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、UDPキシロースの存在下でRXYLT1酵素と混合することにより前記Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物における末端Rboの4位にキシロース（Xyl）をグリコシド結合させてXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成すること、
および任意で、
（ｂ）工程ａで得られた前記Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、UDPグルクロン酸の存在下でB4GAT1酵素と混合することにより前記Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物におけるXylの4位にグルクロン酸（GlcA）をグリコシド結合させてGlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成すること、
および任意で、
（ｃ）工程ｂで得られた前記GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、UDPキシロースの存在下でLARGE酵素と混合することにより前記GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物におけるGlcAの3位にキシロース（Xyl）をグリコシド結合させてXylα1-3GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成すること
をさらに含む、［７］に記載の糖鎖伸長方法。
［９］
（１）2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物の3位の水酸基と、下記式(II)で表される構造
（式中、R1～R4は水酸基の保護基であり、OR5はホスホネート基である）
を有するリビトール誘導体のホスホネート基とを反応させて、前記ガラクトピラノシド化合物の3位と前記リビトール誘導体の5位とをホスホネート連結で連結すること、
（２）前記ホスホネート連結基を酸化してホスフェート連結基に変換すること、
（３）前記リビトール誘導体と連結された前記ガラクトピラノシド化合物の2位のアジド基をアセチルアミノ基に変換すること、および
（４）前記リビトール誘導体と連結された前記ガラクトピラノシド化合物の4,6位からベンジリデンを除去して4,6位にそれぞれ水酸基を露出させること
を含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の製造方法。
［１０］
前記2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物は、1位水酸基の水素原子が-R6-NHZ基で置換されており、ここでR6は炭素数1～6のアルキレン基であり、Zはベンジルオキシカルボニル基であり、
前記方法は、
（０ａ）3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-D-ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート、HO-R6-NHZ、およびBF3・OEt2を反応させて、1位水酸基の水素原子が-R6-NHZ基で置換された3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物を得ること、および
（０ｂ）前記工程０ａで得られたガラクトピラノシド化合物のアセチル保護基を脱保護し、さらにベンズアルデヒドジメチルアセタールを反応させて4,6位水酸基をベンジリデン保護すること
を含む予備的方法により、前記工程（１）の2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物を調製することをさらに含む、［９］に記載の方法。
本実施形態の糖鎖伸長プライマー用化合物は、従来必要と考えられていたよりもはるかにコンパクトな中核構造を有し、短工程で大量合成することも可能である。従って、より長くて複雑なプライマーを合成したり生物学的試料から分離したりすることを含む代替アプローチよりも有利となる。本実施形態の糖鎖伸長プライマー用化合物は、生物工学的に有用となる様々な機能性官能基を装着して提供することができる。一実施形態による糖鎖伸長プライマーは、日本人に多い福山型筋ジストロフィーのようにフクチン（略称FKTN；GalNAcに第1のRboPを連結する酵素）が欠損した条件におけるプライマーとしても有用となり得る。
本開示は一態様において、単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩を提供する。ここでRbo5Pは、リビトール（Rbo）が5位においてリン酸（P）とリン酸エステル結合している構造を表す。またここで3GalNAcβは、3位において該リン酸（P）とリン酸エステル結合しているβ-N-アセチルガラクトサミン化合物を表す。すなわちRbo5P-3GalNAcβ化合物はリン酸ジエステルである。本開示におけるプライマー化合物の中核をなす糖およびリビトールは天然に見出されるコアM3 O-マンノシルグリカン中のものと同じ立体配置を有する。従って例えばN-アセチルガラクトサミンはN-アセチル-D-ガラクトサミンである。本開示におけるRbo5Pは、D体表記のD-リビトール-5-ホスフェートである。
図１０はコアM3 O-マンノシルグリカン全体の概要を示す。右端に示されたSer/Thrは、αジストログリカンタンパク質のセリンまたはスレオニン残基を表す。左端のマトリグリカンは、Xyl-GlcA二糖の反復からなり、この図では反復の表示が省略されている。図１０に示されているように、コアM3 O-マンノシルグリカンは、Rbo5P-3GalNAcβ構造を糖鎖の一部として、より具体的にはN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）と第2のRbo5Pとの間に挿入された形で、内包している。本開示において、「単離された」Rbo5P-3GalNAcβ化合物とは、このように天然に見出されるような糖鎖から独立してRbo5P-3GalNAcユニットが存在していることを意味する。本発明は、コアM3グリカンの根元のリン酸化マンノースを欠く糖鎖断片、さらにはその次に位置するGlcNAcすらも欠く糖鎖断片が、FKRP酵素による糖鎖伸長（すなわち第2のRbo5Pの追加）のプライマーになり得るという発見に部分的に基づく。従って、本実施形態の単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物は、還元末端側においてコアM3グリカンのマンノースあるいはリン酸化マンノースに繋がっていないこと、さらにはGlcNAcにも結合していないことを特徴とする。また、例えば天然糖鎖が消化されたもののように無秩序で雑多な糖鎖断片を含む生物学的材料からRbo5P-3GalNAcβ断片を高純度で特異的に単離することは現実性が低い。例えば、試料中に存在する糖鎖断片の総モル数または総重量の半分以上がRbo5P-3GalNAcβ化合物で占められている場合、その試料中のRbo5P-3GalNAcβ化合物は「単離」されていると言える。単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物は好ましくは少なくとも1ミリグラム以上の量で試料中に存在する。このような単離された状態でのRbo5P-3GalNAcβ化合物の取得は、本開示に提供される規定された合成手順に従うことによって達成できることである。本段落において説明された「単離された」という語の意味は、本開示における他の「単離された」糖鎖断片化合物についても同様に適用される。
非特許文献１は、GalNAcβ1-3GlcNAcβ-p-ニトロフェニルという人工化合物が、インビトロでFKTN酵素によるRbo5P転移反応のアクセプター基質となり得ることを記載していたが、その反応効率は低く限定的だった。本実施形態の化合物は、糖鎖伸長プライマーとしてFKTN酵素段階の下流の基質を提供し、FKTN酵素段階およびそれ以前の糖鎖生合成段階（または、それらにおける欠損）を迂回できるため、有利である。本実施形態の化合物はまた、FKRP酵素段階およびそれ以後の糖鎖生合成段階を検査または研究するためのツールを提供することができる。本実施形態の化合物はまた、プライマーとしての直接的利用のほかに、より長い糖鎖の人工合成のためのビルディングブロックとしての利用可能性も有する。
本開示において、糖タンパク質またはその糖鎖に関する文脈で「還元末端」側とは、糖鎖のうちタンパク質に近い側すなわち根元側を指し、「非還元末端」側とはタンパク質から遠い側すなわち先端側を指す。また本開示では、コアM3グリカンのタンデムRboPのうち還元末端側のものすなわち生合成で先に糖鎖に追加されるものを第1のRboPまたは第1のRbo5Pと呼び、非還元末端側のものすなわち後で糖鎖に追加されるものを第2のRboPまたは第2のRbo5Pと呼ぶ。
本開示において、例えば「Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩」というように使用されている用語「塩」は、当業者に通常理解されるように酸由来の陰イオンと塩基由来の陽イオンとがイオン結合した化合物を表し、塩の形態は調製に使用される溶液環境に応じて変化し得ることが理解されるべきである。例えば本開示における塩はトリエチルアミン塩、ナトリウム塩、カリウム塩等であり得る。本開示における塩は薬学的に許容される塩であり得る。本明細書においては「化合物またはその塩」という記載を省略して単に「化合物」に言及することもあり得、文脈に明らかに反しない限り、化合物についての説明はその対応する塩にも適用され得ることが理解されるべきである。
本開示において、「β-N-アセチルガラクトサミン化合物」あるいは「GalNAcβ化合物」という用語は、β-N-アセチルガラクトサミンそのもの、および1位が修飾されたβ-N-アセチルガラクトサミンを包含する。1位が修飾されたβ-N-アセチルガラクトサミンは、1位の水酸基が他の基で置換されている。これは1位の水酸基の水素原子が置換されている場合を含む。β-N-アセチルガラクトサミン化合物の1位は糖以外（例えばグルコース環以外、特に、GlcNAc以外）の基で修飾され得る。1位の構造を変化させてもRbo5P-3GalNAcβ化合物およびそれより下流の伸長化合物のプライマー能力は維持されることが見出された。β-N-アセチルガラクトサミン化合物におけるβ-N-アセチルガラクトサミンの1位は例えばリンカーで修飾され得る。リンカーは典型的には、ガラクトース環に結合している末端とは違う末端（遠位端）において、反応性官能基に連結される。従って一実施形態におけるβ-N-アセチルガラクトサミン化合物において、β-N-アセチルガラクトサミンは、1位が、反応性官能基に連結されたリンカーで修飾されている。
本開示において反応性官能基とは、ワンポットで２ステップ以内で（例えば１ステップで）もう１つの反応性官能基と反応して、当該反応性官能基を有する分子とそのもう１つの反応性官能基を有する分子とを共有結合的に連結できることが当業者に知られる官能基を意味する。当業者は、通常の知識に基づいて、個々のアプリケーションに応じた適切な反応性官能基を選択することができる。
反応性官能基の具体例としては、アルキンおよびアルケンが挙げられる。本開示において反応性官能基の文脈で使用される「アルキン」という用語は、アルキンに基づく１価または２価の基（アルキニル基またはアルキニレン基）であってアジド・アルキン環化付加反応（クリックケミストリーとしても知られる）に利用可能な炭素原子間三重結合を含む基を表す。例えば、反応性官能基に含まれるアルキン構造は式-C≡CRで表すことができ、ここでRは炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る。本開示において反応性官能基の文脈で使用される「アルケン」は、アルケンに基づく１価または２価の基（アルケニル基またはアルケニレン基）を表す。アルケン構造は例えば式-C=CRR'で表すことができ、ここでR、R'は独立に、炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る。
反応性官能基のさらなる例としては、
アジド（-N3）、アミノ（-NH2）、NアルキルもしくはNアリール（-NRR'；ここでR、R'は独立に炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、または水素原子であるが、R、R'は両方水素原子ではない）、窒素原子が近位側に位置するアミド（-NRCOR'；ここでR、R'は独立に炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る）、カーバメート（-NRCOOR'；ここでR、R'は独立に炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、または炭素数1～20のアルキルシリル基であり得、Rは水素原子であってもよい）、イミン（-N=CRR'；ここでR、R'は独立に炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る）、カルボキシルもしくはそのエステル（-COOR；ここでRは炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る）、ケトンもしくはアルデヒド（-COR；ここでRは炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る）、窒素原子が遠位側に位置するアミド（-CONRR'；ここでR、R'は独立に炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る）、チオールもしくはチオエーテル（-SR；ここでRは炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る）、またはチオエステル（-SC(=O)R；ここでRは炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、または炭素数1～20のアルキルシリル基であり得る）
のうちの一つ以上が挙げられる。
アジド（-N3）、アミノ（-NH2）、NアルキルもしくはNアリール（-NRR'；ここでR、R'は独立に炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、または水素原子であるが、R、R'は両方水素原子ではない）、窒素原子が近位側に位置するアミド（-NRCOR'；ここでR、R'は独立に炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る）、カーバメート（-NRCOOR'；ここでR、R'は独立に炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、または炭素数1～20のアルキルシリル基であり得、Rは水素原子であってもよい）、イミン（-N=CRR'；ここでR、R'は独立に炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る）、カルボキシルもしくはそのエステル（-COOR；ここでRは炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る）、ケトンもしくはアルデヒド（-COR；ここでRは炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る）、窒素原子が遠位側に位置するアミド（-CONRR'；ここでR、R'は独立に炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る）、チオールもしくはチオエーテル（-SR；ここでRは炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、炭素数1～20のアルキルシリル基、または水素原子であり得る）、またはチオエステル（-SC(=O)R；ここでRは炭素数1～20のアルキル基、アリール基（例えばフェニル基）、または炭素数1～20のアルキルシリル基であり得る）
のうちの一つ以上が挙げられる。
リンカーとは、当業者に通常理解されるように炭化水素系鎖による連結構造を意味する。やはり当業者に通常理解されるように、リンカーの炭化水素系鎖には、置換基を有するものや、O、N、またはSのようなヘテロ原子が挿入されたものも包含される。ポリエチレングリコール（PEG）は好適なリンカーの一例である。目安として、リンカーの長さ、すなわち上記GalNAc環1位の炭素原子から遠位末端までの最大距離（または上記GalNAc環1位の炭素原子と反応性官能基との間の最大距離）は典型的には100Å以内であり得、より典型的には50Å以内、あるいは30Å以内である。リンカーの長さは典型的に3Å以上、5Å以上、または10Å以上であり得る。リンカーは、炭素数1～50のアルキレン基に相当する長さを有し得る。
リンカーは、Rbo5P-3GalNAcβ化合物の検出を促進する基を含むか、あるいはそのような基に連結していてもよい。例えば、リンカーがベンゼン環（例えば本明細書に示される13bの場合のようにCO基またはNHCO基に結合したベンゼン環）を有する場合、顕著なUV吸収が得られるため、クロマトグラフィー等における検出が促進される。一実施形態におけるβ-N-アセチルガラクトサミン化合物は、1位が、上記のようなベンゼン環および／または反応性官能基に連結されたリンカーで修飾されている。
ある実施形態において、Rbo5P-3GalNAcβ化合物は、下記式(I)で表される構造を有する。
ここで、Rは水素原子、p-NO2PhCO-、またはアルキニル-(PEG)-CO-であり得る。PEGは反復数1～24のポリエチレングリコールであり、例えば反復数1～10のポリエチレングリコールである。R6は炭素数1～6のアルキレン基であり、例えば炭素数1～3のアルキレン基である。R7は酸素原子、硫黄原子、または窒素原子である。別の実施形態では、上記ニトロ基もしくはアルキニル基またはNHR基が別の反応性官能基に置き換えられてもよい。
ここで、Rは水素原子、p-NO2PhCO-、またはアルキニル-(PEG)-CO-であり得る。PEGは反復数1～24のポリエチレングリコールであり、例えば反復数1～10のポリエチレングリコールである。R6は炭素数1～6のアルキレン基であり、例えば炭素数1～3のアルキレン基である。R7は酸素原子、硫黄原子、または窒素原子である。別の実施形態では、上記ニトロ基もしくはアルキニル基またはNHR基が別の反応性官能基に置き換えられてもよい。
本開示におけるPEGあるいはポリエチレングリコールは、当業者に通常理解されるように、-(O-CH2-CH2)-あるいは-(CH2-CH2-O)-を反復単位とするリンカー部分を表す。ただし、「ポリ」という語に関わらず、上記反復単位の数が1のものもPEGに含まれるとここでは定義する。また、PEGリンカー部分の末端には、追加の-CH2-または-CH2-CH2-基が含まれ得る。
上述したRbo5P-3GalNAcβ化合物と共通の構造を有し非還元末端側に伸長された化合物も提供される。一実施形態において、上述したRbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩におけるリビトール（Rbo）の1位に、さらに第2のRbo5Pがリン酸エステル結合している、単離されたRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩が提供される。この化合物または塩は、RXYLT1酵素（別名TMEM5）による糖鎖伸長（すなわちXylの追加）のプライマーとなり得る。糖鎖の文脈で使用される「プライマー」という用語は、糖鎖伸長をもたらす酵素による非還元末端への1つ以上の単糖またはリビトールリン酸の転移において、最初のアクセプター基質となることができる糖鎖断片を表す。
さらなる実施形態において、上述したRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩における第2のRbo5Pの4位水酸基に、β-キシロースがグリコシド結合している、単離されたXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩が提供される。この化合物または塩は、B4GAT1酵素による糖鎖伸長（すなわちGlcAの追加）のプライマーとなり得る。
さらなる実施形態において、上述したXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩におけるXylの4位水酸基に、β-グルクロン酸がグリコシド結合している、単離されたGlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩が提供される。この化合物または塩は、LARGE酵素による糖鎖伸長（すなわちさらなるXylおよびGlcAの追加）のプライマーとなり得る。LARGEはLARGE1またはLARGE2であり得、LARGE1がより好ましい。
本開示は一態様において、上述した化合物またはその塩を含む、糖鎖伸長用プライマー組成物を提供する。換言すると、糖鎖伸長用の上記化合物またはその塩が提供され、糖鎖伸長用プライマーとしての上記化合物またはその塩の使用が提供される。各プライマーに適した酵素およびグリコシルドナー基質（ヌクレオチド糖またはヌクレオチドリビトール）の種類は、本明細書に記載されており、また当業者にとって明らかである。本実施形態の組成物は、それらの酵素および／またはドナー基質をさらに含んでいてもよい。組成物は、乾燥粉末のような固体、または水溶液のような液体として提供され得る。
糖鎖伸長酵素を調製する方法は公知であり、例えば非特許文献１は、酵素をコードする発現ベクターでヒト細胞株をトランスフェクトし、細胞により発現され放出された酵素タンパク質を精製することを記載している。
本開示は別の態様において、単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩を、シチジンジホスフェート（CDP）リビトールの存在下でFKRP酵素と混合することにより、Rbo5P-3GalNAcβ化合物のリビトール（Rbo）の1位に第2のRbo5Pをリン酸エステル結合させてRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成することを含む、糖鎖伸長方法を提供する。混合することによりRbo5P-3GalNAcβ化合物と酵素との接触が達成される。糖鎖伸長は典型的には水溶液環境中または細胞中で行われる。例えば糖鎖伸長はインビトロで、例えば無細胞の溶液中もしくは培養細胞もしくは培養組織中で、またはインビボで、例えばヒトもしくはヒト以外の哺乳類動物の体内で行われ得る。
この方法による糖鎖伸長は、異なる酵素を同様に作用させていくことにより、さらに継続することができる。つまりこの糖鎖伸長方法は、さらに、
（ａ）上記で得られたRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、ウリジンジホスフェート（UDP）キシロースの存在下でRXYLT1酵素と混合することにより該Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物における末端Rboの4位にキシロース（Xyl）をグリコシド結合させてXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成することを含み得る。
この糖鎖伸長方法は、さらに、
（ｂ）工程ａで得られたXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、UDPグルクロン酸の存在下でB4GAT1酵素と混合することにより該Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物におけるXylの4位にグルクロン酸（GlcA）をグリコシド結合させてGlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成することを含み得る。
この糖鎖伸長方法は、さらに、
（ｃ）工程ｂで得られた前記GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、ウリジンジホスフェートキシロースの存在下でLARGE酵素（例えばLARGE1）と混合することにより前記GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物におけるGlcAの3位にキシロース（Xyl）をグリコシド結合させてXylα1-3GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成することをさらに含み得る。
（ａ）上記で得られたRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、ウリジンジホスフェート（UDP）キシロースの存在下でRXYLT1酵素と混合することにより該Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物における末端Rboの4位にキシロース（Xyl）をグリコシド結合させてXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成することを含み得る。
この糖鎖伸長方法は、さらに、
（ｂ）工程ａで得られたXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、UDPグルクロン酸の存在下でB4GAT1酵素と混合することにより該Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物におけるXylの4位にグルクロン酸（GlcA）をグリコシド結合させてGlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成することを含み得る。
この糖鎖伸長方法は、さらに、
（ｃ）工程ｂで得られた前記GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、ウリジンジホスフェートキシロースの存在下でLARGE酵素（例えばLARGE1）と混合することにより前記GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物におけるGlcAの3位にキシロース（Xyl）をグリコシド結合させてXylα1-3GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成することをさらに含み得る。
異なる酵素およびドナー基質は、各ステップごとに供給されてもよいし、複数酵素および複数のドナー基質を一緒に供給して各ステップを連続的に起こらせてもよい。
上記説明では、糖転移酵素の反応により得られた産物を次の段階のアクセプター基質すなわちプライマーとすることを記載している。糖転移酵素の反応により得られた産物の代わりに、本明細書に開示される合成方法によって化学合成された同じ化合物をプライマーとすることもできる。逆に、後述する化学合成の代わりに、または化学合成に加えて、酵素による伸長反応を用いて、本開示に係る糖鎖断片の化合物または塩を製造することも企図される。
以下、本開示の実施形態に係る化合物または塩の化学合成スキームを説明する。これらの説明ではいくつかの具体的な化合物または塩に言及しているが、本質的に同様のスキームを使用しながら、当業者の通常の知識の範囲内で必要な修正を加えて、他の実施形態の化合物または塩を製造できることが理解されるであろう。提供されているスキームの図は例示であり、収率の数値は当然ながら変動し得るし、本明細書全体の開示に基づいて、および当業者の通常の理解の範囲内で、試薬の分量、種類、反応条件等を適宜変更し得ることが理解されるべきである。
図１は、単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物、Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物、およびXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物の塩の具体例を示す。トリエチルアミン塩が示されているが、他の塩または非塩を提供することも可能である。
図２～３は、単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物（またはその塩）である12、13a、13b、13X、13Yの合成スキームである。「known」は公知化合物を表す。6→7a,7bの工程では、BF3・OEt2（三フッ化ホウ素エーテル錯体）が6のイミドイル基（OC(NH)CCl3）を活性化し、1位の炭素をグリコシルアクセプターHOC2H4NHZの酸素原子が攻撃しつつイミドイル基が脱離して7a（7%）、7b（33%）になったと考えられる。ここではHO-を有するグリコシルアクセプターを用いて1位修飾を行っているが、例えば代わりにHS-やH2N-の基を有するグリコシルアクセプターを用いることにより1位のOを例えばSやNに置き換えることもできる。またここでは-C2H4-およびNHZを使用しているが、当業者の通常の知識に基づいて同様のスキームに従って様々なリンカーおよび反応性官能基またはその前駆体を1位に取り付けることができることが理解される。7b→8はヒドラジン酢酸（H2NNH2・AcOH）を用いたレブリノイル（CH3COC2H4CO-）保護基の脱保護である。生成物7がαとβの混合物であり、6がαイミデートであることから、アクセプターが6の1位を直接攻撃したのではなくイミドイル基の脱離が先行して不安定なカチオンを生じ、結果として若干の7a（α体）を生じたと考えられる。
対照的に、100→101の工程では、より高い収率で101すなわちβ体だけを得ることができた。6とは異なり100はαとβの混ざりであるところ、β体だけを高収率で得られることは予測外だった。
101→8の工程では、アセチル保護基を脱保護した後、ベンズアルデヒドジメチルアセタールを用いて4,6位の水酸基を選択的に保護している。
一方、リビトール誘導体に関しては、110→1の工程ではベンジルトリクロロアセトイミデート（BnOC(NH)CCl3）をTMSOTf（Me3SiOSO2CF3、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルフォネート）で活性化させ、110の水酸基の酸素原子がBn（C6H5CH2-）のCH2炭素を攻撃することで、1を得ている。1→2の工程では1のアリル基（-CH2CH=CH2）の二重結合にイリジウム錯体が配位して、ビニル基（-CH=CHCH3）に異性化することで酸加水分解されやすくなり、5位が遊離水酸基となって2を生じている。2→3の工程ではその水酸基の酸素原子が2-クロロ-1,3,2-ベンゾジオキサホスホリン-4-オン試薬のリン原子を攻撃し、反応の後処理（水との反応）によってサリチル酸が遊離して3を生じている。
3と8を連結して9を生じる工程においては、ホスホネート3（ROPH(=O)O-X+、Xは+NHEt3）がPivCl（ピバロイルクロリド、Me3CC(=O)Cl）によって混合酸無水物（ROPH(=O)OC(=O)CMe3）に変化する。活性化されたホスホネートのリン原子は8（HOR’）の水酸基の酸素原子の攻撃を受け-OC(=O)CMe3が脱離して、ホスホネート9（ROPH(=O)OR’で表されるジエステル）が得られる。
9→10の工程ではホスホネート連結部分をヨウ素で酸化してホスフェート連結部分に変換している。10→11の工程ではTBDPS（tert-ブチルジフェニルシリル）基を脱離させてリビトール1位の水酸基を生じている。11→20の工程では、亜鉛で11のアジド基（N3）を還元しアミノ基（NH2）としている。その後メタノール中で無水酢酸を用いてアミノ基を選択的にアセチル化して（水酸基やリン酸の酸素はアセチル化されない）20を得ている。本開示における「ホスホネート連結」および「ホスフェート連結」は、それぞれ、1つのリンに2つのエステル結合が形成しているジエステル部分を表す。
20→13aの工程において、基質上のベンジル（PhCH2-）基やベンジリデン（PhCH=）基などのベンジル位の炭素はパラジウム触媒の存在下で容易に還元される。この場合は水素化されて水酸基やアミノ基を遊離させ、13aが得られる。基質は最初脂溶性であるが、反応の進行とともに水溶性に変化し2-プロパノールには溶けにくくなるので、途中溶媒を水に置き換えて反応を継続させればよい。
13aは遊離アミノ基を備えた単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物であり、市販のリンカー化合物等を連結させてさらに様々な修飾を与えることができるため汎用性が高い。13b、13X、13Yはその例であり、いずれもFKRP酵素による糖鎖伸長のプライマーとして機能することが確認されている。
本開示は一態様において、上述した実施形態の単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物もしくはそれが非還元末端側に伸長された化合物またはその塩を製造する方法を提供する。この方法により、単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物等またはその塩を位置選択的かつ立体選択的に製造することができる。この方法は以下の（１）～（４）の操作を含み得る。
（１）2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物の3位の水酸基と、下記式(II)で表される構造
（式中、R1～R4は水酸基の保護基であり、OR5はホスホネート基である）
を有するリビトール誘導体のホスホネート基とを反応させて、上記ガラクトピラノシド化合物の3位と上記リビトール誘導体の5位とをホスホネート連結で連結すること。
ここで、R1～R4は互いに同じまたは異なる種類の基であり得る。例えば、R2、R3、R4が同じ種類でR1だけが異なる種類の基であってもよい。R2、R3、R4がベンジル基でありR1がTBDPSのようなシリル基であることは好適な一例である。ガラクトピラノシド化合物の1位は、β-N-アセチルガラクトサミン化合物について説明したように修飾を有し得る。当業者は合成スキームに適合する適切な保護基および修飾基を選択することができる。
（式中、R1～R4は水酸基の保護基であり、OR5はホスホネート基である）
を有するリビトール誘導体のホスホネート基とを反応させて、上記ガラクトピラノシド化合物の3位と上記リビトール誘導体の5位とをホスホネート連結で連結すること。
ここで、R1～R4は互いに同じまたは異なる種類の基であり得る。例えば、R2、R3、R4が同じ種類でR1だけが異なる種類の基であってもよい。R2、R3、R4がベンジル基でありR1がTBDPSのようなシリル基であることは好適な一例である。ガラクトピラノシド化合物の1位は、β-N-アセチルガラクトサミン化合物について説明したように修飾を有し得る。当業者は合成スキームに適合する適切な保護基および修飾基を選択することができる。
（２）上記（１）におけるホスホネート連結基を酸化してホスフェート連結基に変換すること。
このことは、例えばヨウ素の溶液を加えることによって達成することができるがこれに限定されない。
このことは、例えばヨウ素の溶液を加えることによって達成することができるがこれに限定されない。
（３）上記リビトール誘導体と連結されたガラクトピラノシド化合物の2位のアジド基をアセチルアミノ基に変換すること。
このことは、例えば亜鉛の存在下でアジド基をいったんアミノ基に還元させ、続いて例えば無水酢酸およびメタノールを加えることによりアセチル化を行うことによって達成され得る。
このことは、例えば亜鉛の存在下でアジド基をいったんアミノ基に還元させ、続いて例えば無水酢酸およびメタノールを加えることによりアセチル化を行うことによって達成され得る。
（４）上記リビトール誘導体と連結されたガラクトピラノシド化合物の4,6位からベンジリデンを除去して4,6位にそれぞれ水酸基を露出させること。
このことは例えばパラジウム触媒および水素の存在下での加水素分解により行うことができる。単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物は4,6位にそれぞれ遊離水酸基を有するようになる。
このことは例えばパラジウム触媒および水素の存在下での加水素分解により行うことができる。単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物は4,6位にそれぞれ遊離水酸基を有するようになる。
上記方法は、リビトール部分の1～4位水酸基の保護基（および場合によってはガラクトピラノシド化合物の1位が有し得る保護基）を脱保護することを含み得るが、その具体的な手法およびタイミングは、保護基（R1～R4）の種類の選択に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、R2、R3、R4がベンジル基である場合には、その脱保護は上記ベンジリデンの除去と一緒に行うことができる。ガラクトピラノシド化合物の1位が有し得るアミノ基のベンジルオキシカルボニル保護基も同様である。例えばR1がTBDPS基である場合には、その脱保護は、フッ化テトラ-n-ブチルアンモニウムのようなフッ化物イオン化合物によって行うことができ、そのタイミングは、例えば工程（２）の後かつ工程（３）の前であり得るが、これに限定されない。
アミノ基が連結されたRbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩を製造する実施形態においては、上記製造方法が、下記のようにして工程（１）の2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物を調製することをさらに含むことが好ましい。
すなわちこの場合は、工程（１）の2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物は、1位水酸基の水素原子が-R6-NHZ基で置換されており、ここでR6は炭素数1～6（例えば炭素数1～3、例えば炭素数2）のアルキレン基であり、Zはベンジルオキシカルボニル基であり、
上記方法は、
（０ａ）3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-D-ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート、HO-R6-NHZ、およびBF3・OEt2を反応させて、1位水酸基の水素原子が-R6-NHZ基で置換された3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物を得ること、および
（０ｂ）工程０ａで得られたガラクトピラノシド化合物のアセチル保護基を脱保護し、さらにベンズアルデヒドジメチルアセタールを反応させて、4,6位水酸基をベンジリデン保護すること
を含む予備的方法により、工程（１）の2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物を調製することをさらに含む。
すなわちこの場合は、工程（１）の2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物は、1位水酸基の水素原子が-R6-NHZ基で置換されており、ここでR6は炭素数1～6（例えば炭素数1～3、例えば炭素数2）のアルキレン基であり、Zはベンジルオキシカルボニル基であり、
上記方法は、
（０ａ）3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-D-ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート、HO-R6-NHZ、およびBF3・OEt2を反応させて、1位水酸基の水素原子が-R6-NHZ基で置換された3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物を得ること、および
（０ｂ）工程０ａで得られたガラクトピラノシド化合物のアセチル保護基を脱保護し、さらにベンズアルデヒドジメチルアセタールを反応させて、4,6位水酸基をベンジリデン保護すること
を含む予備的方法により、工程（１）の2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物を調製することをさらに含む。
この予備的方法の工程（０ａ）では、3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-D-ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデートがα体とβ体の混合物であるにも関わらず、リンカー修飾されたβ体の3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物だけが高収率で生じ得るため好ましい。
図４は、単離されたRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩の合成スキームである。図５は、単離されたXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩の合成スキームである。Rbo5P-3GalNAcβ化合物の合成と本質的に同じ工程を追加的に利用してこれらを合成できることが理解される。
以上の説明および図面を参照すれば明らかなように、本開示で使用されている糖、保護基、官能基、溶媒等の略称は、糖鎖合成の分野の当業者が最も一般的に理解するとおりの意味を有している。
［化学合成］
2-N-(ベンジルオキシカルボニル)アミノエチル 2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-3-O-レブリノイル-α-D-ガラクトピラノシドおよび2-N-(ベンジルオキシカルボニル)アミノエチル2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-3-O-レブリノイル-β-D-ガラクトピラノシド（7aおよび7b）
MS4A（0.73 g）を、6（1.77 g, 3.30 mmol）およびHOC2H4NHZ（1.00 g, 5.12 mmol）のトルエン溶液（20 mL）に加え、室温で1時間撹拌した。-50℃でこの混合物にBF3・OEt2（62μL, 0.49 mmol）を加えて20分間撹拌した。飽和NaHCO3で反応をクエンチした。通常の後処理（ワークアップ）とゲル濾過（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH）およびWakogel（登録商標）C-300（3:1-1:5 n-ヘキサン:EtOAc）による精製により、7a（135.5 mg, 0.24 mmol）および7b（617.2 mg, 1.09mmol）をそれぞれ収率7%および33%で得た。
Rf0.32 and 0.20 (1:1 n-hexane:EtOAc), 7a, [α]D +72.4° (c 1.07, CHCl3); 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 7.51-7.49 (m, 2H, Ar-H), 7.39-7.30 (m, 8H, Ar-H), 5.52 (s, 1H, PhCH), 5.32 (dd, 1H, J2,3 = 11 .1 Hz, J3,4 = 3.4 Hz, H-3), 5.26 (br, 1H, NH), 5.13, 5.10 (ABq, 2H, J= 12.5 Hz, PhCH 2), 5.06 (d, 1H, J1,2 = 3.3 Hz, H-1), 4.41 (d, 1H, H-4), 4.22 (brd, 1H, J = 12.4 Hz, H-6a), 4.00 (dd, 1H, J5,6b = 1.2 Hz, J6a,6b = 12.7 Hz, H-6b), 3.93 (dd, 1H, H-2), 3.84, 3.60 (2m, 1Hx2, 1/2OCH2x2), 3.72 (s, 1H, H-5), 3.48, 3.40 (2m, 1Hx2, 1/2NCH2x2), 2.78-2.65 (m, 4H, Lev), 2.11 (s, 3H, COCH3). 13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 206.17 (C=O), 172.17 [OC=O(Lev)], 156.42 (NHC=O), 137.46, 136.51, 129.10, 128.54, 128.21, 128.13, 128.09, 126.16 (Ar), 100.76 (PhCH), 98.90 (C-1), 73.38 (C-4), 69.41 (C-3), 69.02 (C-6), 68.02 (OCH2), 66.77 (PhCH2), 62.80 (C-5), 57.37 (C-2), 40.75 (NCH2), 37.87 [CH2(Lev)], 29.69 (COCH3), 28.15 [CH2(Lev)]. ESI-HRMS: m/z calcd for C28H32N4O9Na [M+Na+], 591.2067; found, 591.2055, m/z calcd for C28H32N4O9K [M+K+], 607.1806; found, 607.1793. 7b, [α]D +10° (c 0.3, CHCl3); 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 7.52-7.50 (m, 2H, Ar-H), 7.50-7.30 (m, 8H, Ar-H), 5.51 (s, 1H, PhCH), 5.36 (m, 1H, NH), 5.10 (s, 2H, PhCH 2), 4.73 (dd, 1H, J2,3 = 10.9 Hz, J3,4 = 3.5 Hz, H-3), 4.35 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, H-1), 4.28 (dd, 1H, J5,6a = 1.3 Hz, J6a,6b = 12.5 Hz, H-6a), 4.27 (d, 1H, H-4), 4.01 (dd, 1H, J5,6b = 1.6 Hz, H-6b), 3.99, (m, 1H, 1/2OCH2), 3.89 (dd, 1H, H-2), 3.74, (m, 1H, 1/2OCH2), 3.48, 3.44 (2m, 1Hx2, 1/2NCH2x2), 3.42 (s, 1H, H-5), 2.77-2.74 (m, 2H, 1/2Lev), 2.70-2.62 (m, 2H, 1/2Lev), 2.10 (s, 3H, COCH3).13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 206.14 (C=O), 172.08 [OC=O(Lev)], 156.48 (NHC=O), 137.47, 136.63 [C (q), Ar], 129.12, 128.50, 128.21, 128.04, 128.01, 126.28 (Ar), 102.47 (C-1), 100.91 (PhCH), 72.58 (C-4), 72.02 (C-3), 69.59 (OCH2), 68.84 (C-6), 66.66 (PhCH2), 66.42 (C-5), 60.34 (C-2), 40.99 (NCH2), 37.87 [CH2(Lev)], 29.69 (COCH3), 28.09 [CH2(Lev)].
ESI-HRMS: m/zcalcd for C28H32N4O9K [M+K+], 607.1806; found, 607.1793.
MS4A（0.73 g）を、6（1.77 g, 3.30 mmol）およびHOC2H4NHZ（1.00 g, 5.12 mmol）のトルエン溶液（20 mL）に加え、室温で1時間撹拌した。-50℃でこの混合物にBF3・OEt2（62μL, 0.49 mmol）を加えて20分間撹拌した。飽和NaHCO3で反応をクエンチした。通常の後処理（ワークアップ）とゲル濾過（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH）およびWakogel（登録商標）C-300（3:1-1:5 n-ヘキサン:EtOAc）による精製により、7a（135.5 mg, 0.24 mmol）および7b（617.2 mg, 1.09mmol）をそれぞれ収率7%および33%で得た。
Rf0.32 and 0.20 (1:1 n-hexane:EtOAc), 7a, [α]D +72.4° (c 1.07, CHCl3); 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 7.51-7.49 (m, 2H, Ar-H), 7.39-7.30 (m, 8H, Ar-H), 5.52 (s, 1H, PhCH), 5.32 (dd, 1H, J2,3 = 11 .1 Hz, J3,4 = 3.4 Hz, H-3), 5.26 (br, 1H, NH), 5.13, 5.10 (ABq, 2H, J= 12.5 Hz, PhCH 2), 5.06 (d, 1H, J1,2 = 3.3 Hz, H-1), 4.41 (d, 1H, H-4), 4.22 (brd, 1H, J = 12.4 Hz, H-6a), 4.00 (dd, 1H, J5,6b = 1.2 Hz, J6a,6b = 12.7 Hz, H-6b), 3.93 (dd, 1H, H-2), 3.84, 3.60 (2m, 1Hx2, 1/2OCH2x2), 3.72 (s, 1H, H-5), 3.48, 3.40 (2m, 1Hx2, 1/2NCH2x2), 2.78-2.65 (m, 4H, Lev), 2.11 (s, 3H, COCH3). 13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 206.17 (C=O), 172.17 [OC=O(Lev)], 156.42 (NHC=O), 137.46, 136.51, 129.10, 128.54, 128.21, 128.13, 128.09, 126.16 (Ar), 100.76 (PhCH), 98.90 (C-1), 73.38 (C-4), 69.41 (C-3), 69.02 (C-6), 68.02 (OCH2), 66.77 (PhCH2), 62.80 (C-5), 57.37 (C-2), 40.75 (NCH2), 37.87 [CH2(Lev)], 29.69 (COCH3), 28.15 [CH2(Lev)]. ESI-HRMS: m/z calcd for C28H32N4O9Na [M+Na+], 591.2067; found, 591.2055, m/z calcd for C28H32N4O9K [M+K+], 607.1806; found, 607.1793. 7b, [α]D +10° (c 0.3, CHCl3); 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 7.52-7.50 (m, 2H, Ar-H), 7.50-7.30 (m, 8H, Ar-H), 5.51 (s, 1H, PhCH), 5.36 (m, 1H, NH), 5.10 (s, 2H, PhCH 2), 4.73 (dd, 1H, J2,3 = 10.9 Hz, J3,4 = 3.5 Hz, H-3), 4.35 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, H-1), 4.28 (dd, 1H, J5,6a = 1.3 Hz, J6a,6b = 12.5 Hz, H-6a), 4.27 (d, 1H, H-4), 4.01 (dd, 1H, J5,6b = 1.6 Hz, H-6b), 3.99, (m, 1H, 1/2OCH2), 3.89 (dd, 1H, H-2), 3.74, (m, 1H, 1/2OCH2), 3.48, 3.44 (2m, 1Hx2, 1/2NCH2x2), 3.42 (s, 1H, H-5), 2.77-2.74 (m, 2H, 1/2Lev), 2.70-2.62 (m, 2H, 1/2Lev), 2.10 (s, 3H, COCH3).13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 206.14 (C=O), 172.08 [OC=O(Lev)], 156.48 (NHC=O), 137.47, 136.63 [C (q), Ar], 129.12, 128.50, 128.21, 128.04, 128.01, 126.28 (Ar), 102.47 (C-1), 100.91 (PhCH), 72.58 (C-4), 72.02 (C-3), 69.59 (OCH2), 68.84 (C-6), 66.66 (PhCH2), 66.42 (C-5), 60.34 (C-2), 40.99 (NCH2), 37.87 [CH2(Lev)], 29.69 (COCH3), 28.09 [CH2(Lev)].
ESI-HRMS: m/zcalcd for C28H32N4O9K [M+K+], 607.1806; found, 607.1793.
2-N-(ベンジルオキシカルボニル)アミノエチル3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド（101）
3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-D-ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート（166.9 mg, 0.351 mmol）およびHOC2H4NHZ（171.3 mg, 0.877 mmol）のトルエン中溶液（2.5 mL）にMS4A（0.07 g）を加え、室温で1時間撹拌した。-50℃でこの混合物にBF3・OEt2（10μL, 80μmol）を加え、3時間にわたり-14℃になるまで撹拌した。飽和NaHCO3で反応をクエンチした。通常の後処理とゲル濾過（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH）による精製により、101（131.8 mg, 0.259 mmol）を収率73%で得た。
Rf0.38 (10:1 EtOAc:MeOH), [α]D -5.19° (c 1.31, CHCl3); 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 7.37-7.31 (m, 5H, Ar-H), 5.32 (dd, 1H, J3,4 = 3.4 Hz, J4,5 = 0.8 Hz, H-4), 5.27 (m, 1H, NH), 5.11 (s, 1H, PhCH 2), 4.76 (dd, 1H, J2,3 = 11 Hz, H-3), 4.35 (d, 1H, J1,2 = 10 Hz, H-1 ), 4.12 (m, 2H, H-6ab), 3.96 (m, 1H, 1/2OCH2), 3.83 (dt, 1H, J5,6a = J5,6b = 6.6 Hz, H-5), 3.78 (m, 1H, 1/2OCH2), 3.67 (m, 1H, H-2), 3.48 (m, 2H, NCH2), 2.15, 2.05, 2.03 (3s, 3Hx3, 3Ac). 13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 170.3, 170.0, 169.75 (C=O), 156.41, 136.50, 128.56, 128.18, 128.15 (Ar), 102.59 (C-1), 70.95 (C-3), 70.87 (C-5), 69.93 (OCH2), 66.81 (PhCH2), 66.32 (C-4), 61.29 (C-6), 60.83 (C-2), 41.01 (NCH2), 20.62, 20.62, 20.59 (CH3). ESI-HRMS: m/z calcd for C22H28N4O10Na [M+Na+], 531.1703; found, 531.1692.
3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-D-ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート（166.9 mg, 0.351 mmol）およびHOC2H4NHZ（171.3 mg, 0.877 mmol）のトルエン中溶液（2.5 mL）にMS4A（0.07 g）を加え、室温で1時間撹拌した。-50℃でこの混合物にBF3・OEt2（10μL, 80μmol）を加え、3時間にわたり-14℃になるまで撹拌した。飽和NaHCO3で反応をクエンチした。通常の後処理とゲル濾過（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH）による精製により、101（131.8 mg, 0.259 mmol）を収率73%で得た。
Rf0.38 (10:1 EtOAc:MeOH), [α]D -5.19° (c 1.31, CHCl3); 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 7.37-7.31 (m, 5H, Ar-H), 5.32 (dd, 1H, J3,4 = 3.4 Hz, J4,5 = 0.8 Hz, H-4), 5.27 (m, 1H, NH), 5.11 (s, 1H, PhCH 2), 4.76 (dd, 1H, J2,3 = 11 Hz, H-3), 4.35 (d, 1H, J1,2 = 10 Hz, H-1 ), 4.12 (m, 2H, H-6ab), 3.96 (m, 1H, 1/2OCH2), 3.83 (dt, 1H, J5,6a = J5,6b = 6.6 Hz, H-5), 3.78 (m, 1H, 1/2OCH2), 3.67 (m, 1H, H-2), 3.48 (m, 2H, NCH2), 2.15, 2.05, 2.03 (3s, 3Hx3, 3Ac). 13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 170.3, 170.0, 169.75 (C=O), 156.41, 136.50, 128.56, 128.18, 128.15 (Ar), 102.59 (C-1), 70.95 (C-3), 70.87 (C-5), 69.93 (OCH2), 66.81 (PhCH2), 66.32 (C-4), 61.29 (C-6), 60.83 (C-2), 41.01 (NCH2), 20.62, 20.62, 20.59 (CH3). ESI-HRMS: m/z calcd for C22H28N4O10Na [M+Na+], 531.1703; found, 531.1692.
2-N-(ベンジルオキシカルボニル)アミノエチル2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド（8）
（方法１）
β-アノマー（7b）（490.1 mg, 0.862 mmol）をトルエン（2.5 mL）およびEtOH（10 mL）で希釈した。それからH2NNH2・AcOH（166.1 mg, 1.693 mmol）を加え40分間撹拌した。反応混合物を直接ゲル濾過（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH）に適用し、8（403.0 mg）を99%収率で得た。Rf 0.31 (1:1 トルエン:EtOAc)。
（方法２）
MeOH（20 mL）、H2O（10 mL）およびEt3N（10 mL）の混合物中の101（2.35 g, 4.62 mmol）の溶液を室温で一晩撹拌した。減圧下で揮発性成分を除去して102（1.77 g）を定量的収率で取得し、それをTHF（20 mL）で希釈した。それからベンズアルデヒドジメチルアセタール（1.4 mL, 9.07 mmol）および触媒量のp-TsOH・H2Oを加え3時間撹拌した。Et3Nで反応混合物をクエンチした。減圧下で揮発性成分を除去し、残渣をEtOHから再結晶化させて結晶を得た（1.35 g）。母液を濃縮して残渣をSilica Gel 60（5:1～1:10トルエン:EtOAc-10:1 EtOAc:MeOH）に適用し、8（0.36 g）を得た。2ステップにわたり78%の収率で合計量1.71 gの8が得られた。
M.p. 174.0 °C (from EtOH). [α]D +2.9° (c 1.27, CHCl3). 1H-NMR δH (CDCl3): 7.51-7.49 (m, 2H, Ar-H), 7.40-7.29 (m, 8H, Ar-H), 5.56 (s, 1H, PhCH), 5.37 (m, 1H, NH), 5.11 (s, 2H, PhCH 2), 4.31 (dd, 1H, J5,6a = 1.3 Hz, J6a,6b = 12.6 Hz, H-6a), 4.29 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, H-1), 4.16 (dd, 1H, J3,4 = 3.7 Hz, J4,5 = 0.7 Hz, H-4), 4.05 (dd, 1H, J5,6b = 1.7 Hz, H-6b), 4.00, 3.74 (2m, 1Hx2, 1/2OCH2 x2), 3.63 (dd, 1H, J2,3 = 10.2 Hz, H-2), 3.55 (bdt, 1H, J = 3.7, 9.9 Hz, H-3), 3.51, 3.44 (2m, 1Hx2, 1/2NCH2x2), 3.42 (s, 1H, H-5), 2.59 (d, 1H, J3,OH = 9.6 Hz, OH-3).13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 156.50 (NHC=O), 137.20, 136.61 [C (q), Ar], 129.41, 128.51, 128.34, 128.05, 128.02, 126.34 (Ar), 102.40 (C-1), 101.44 (PhCH), 74.46 (C-4), 71.41 (C-3), 69.57 (OCH2), 68.94 (C-6), 66.65 (C-5, PhCH2), 64.06 (C-2). ESI-HRMS: m/z calcd for C23H26N4O7K [M+K+], 509.1439; found, 509.1426.
（方法１）
β-アノマー（7b）（490.1 mg, 0.862 mmol）をトルエン（2.5 mL）およびEtOH（10 mL）で希釈した。それからH2NNH2・AcOH（166.1 mg, 1.693 mmol）を加え40分間撹拌した。反応混合物を直接ゲル濾過（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH）に適用し、8（403.0 mg）を99%収率で得た。Rf 0.31 (1:1 トルエン:EtOAc)。
（方法２）
MeOH（20 mL）、H2O（10 mL）およびEt3N（10 mL）の混合物中の101（2.35 g, 4.62 mmol）の溶液を室温で一晩撹拌した。減圧下で揮発性成分を除去して102（1.77 g）を定量的収率で取得し、それをTHF（20 mL）で希釈した。それからベンズアルデヒドジメチルアセタール（1.4 mL, 9.07 mmol）および触媒量のp-TsOH・H2Oを加え3時間撹拌した。Et3Nで反応混合物をクエンチした。減圧下で揮発性成分を除去し、残渣をEtOHから再結晶化させて結晶を得た（1.35 g）。母液を濃縮して残渣をSilica Gel 60（5:1～1:10トルエン:EtOAc-10:1 EtOAc:MeOH）に適用し、8（0.36 g）を得た。2ステップにわたり78%の収率で合計量1.71 gの8が得られた。
M.p. 174.0 °C (from EtOH). [α]D +2.9° (c 1.27, CHCl3). 1H-NMR δH (CDCl3): 7.51-7.49 (m, 2H, Ar-H), 7.40-7.29 (m, 8H, Ar-H), 5.56 (s, 1H, PhCH), 5.37 (m, 1H, NH), 5.11 (s, 2H, PhCH 2), 4.31 (dd, 1H, J5,6a = 1.3 Hz, J6a,6b = 12.6 Hz, H-6a), 4.29 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, H-1), 4.16 (dd, 1H, J3,4 = 3.7 Hz, J4,5 = 0.7 Hz, H-4), 4.05 (dd, 1H, J5,6b = 1.7 Hz, H-6b), 4.00, 3.74 (2m, 1Hx2, 1/2OCH2 x2), 3.63 (dd, 1H, J2,3 = 10.2 Hz, H-2), 3.55 (bdt, 1H, J = 3.7, 9.9 Hz, H-3), 3.51, 3.44 (2m, 1Hx2, 1/2NCH2x2), 3.42 (s, 1H, H-5), 2.59 (d, 1H, J3,OH = 9.6 Hz, OH-3).13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 156.50 (NHC=O), 137.20, 136.61 [C (q), Ar], 129.41, 128.51, 128.34, 128.05, 128.02, 126.34 (Ar), 102.40 (C-1), 101.44 (PhCH), 74.46 (C-4), 71.41 (C-3), 69.57 (OCH2), 68.94 (C-6), 66.65 (C-5, PhCH2), 64.06 (C-2). ESI-HRMS: m/z calcd for C23H26N4O7K [M+K+], 509.1439; found, 509.1426.
5-O-アリル-2,3,4-トリ-O-ベンジル-1-O-tert-ブチルジフェニルシリル-D-リビトール（1）
5-O-アリル-2,3-ジ-O-ベンジル-1-O-tert-ブチルジフェニルシリル-D-リビトール（3.48 g, 5.68 mmol）およびベンジルトリクロロアセトイミデート（2.1 mL, 11 mmol）のCH2Cl2（32 mL）中溶液にMS4A（0.81 g）を加え室温で1時間撹拌した。-20℃においてこの混合物にTMSOTf（0.25 mL, 1.4 mmol）を加え、2.5時間かけて7℃になるまで撹拌した。飽和NaHCO3で反応をクエンチした。通常の後処理およびSilica Gel 60カラム（n-ヘキサン100:1～10:1 n-ヘキサン:EtOAc）による精製によって、1（3.00 g, 4.38 mmol）を収率77%で得た。
Rf0.61 (30:1 toluene:EtOAc), [α]D +7.1° (c 1.83, CHCl3); 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 7.68-7.62 (m, 4H, Ar-H), 7.40-7.05 (m, 21H, Ar-H), 5.89-5.84 (m, 1H, -CH=), 5.24-5.20, 5.14-5.10 (2m, 1Hx2, 1/2CH2=x2), 4.71-4.52 (m, 6H, 3PhCH 2), 3.92 (m, 2H, OCH2), 3.97-3.81 (m, 3H, H-2 or 3, 4), 3.79 (m, 1H, H-3 or 2), 3.69 (dd, 1H, J4,5a = 2.6 Hz, J5a,5b = 10.6 Hz, H-5a), 3.63 (dd, 1H, J4,5b = 5.7 Hz, H-5b), 1.06 (s, 9H, tert-Bu). 13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 138.78, 138.75, 138.58, 135.74, 135.68 [C (q), Ar], 134.97 (=CH-), 133.59, 133.43, 129.57, 129.56, 128.22, 128.20, 127.88, 127.72, 127.63, 127.60, 127.43, 127.34, 127.29 (Ar), 116.61 (=CH2), 79.99, 78.66, 78.63 (C-2,3,4), 73.70, 72.46, 72.36 (3PhCH2), 72.15 (OCH2), 70.34 (C-5), 63.82 (C-1), 26.90 (C-CH3), 19.21 (C-CH3). ESI-HRMS: m/z calcd for C45H52O5SiK [M+K+], 739.3221; found, 731.3194.
5-O-アリル-2,3-ジ-O-ベンジル-1-O-tert-ブチルジフェニルシリル-D-リビトール（3.48 g, 5.68 mmol）およびベンジルトリクロロアセトイミデート（2.1 mL, 11 mmol）のCH2Cl2（32 mL）中溶液にMS4A（0.81 g）を加え室温で1時間撹拌した。-20℃においてこの混合物にTMSOTf（0.25 mL, 1.4 mmol）を加え、2.5時間かけて7℃になるまで撹拌した。飽和NaHCO3で反応をクエンチした。通常の後処理およびSilica Gel 60カラム（n-ヘキサン100:1～10:1 n-ヘキサン:EtOAc）による精製によって、1（3.00 g, 4.38 mmol）を収率77%で得た。
Rf0.61 (30:1 toluene:EtOAc), [α]D +7.1° (c 1.83, CHCl3); 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 7.68-7.62 (m, 4H, Ar-H), 7.40-7.05 (m, 21H, Ar-H), 5.89-5.84 (m, 1H, -CH=), 5.24-5.20, 5.14-5.10 (2m, 1Hx2, 1/2CH2=x2), 4.71-4.52 (m, 6H, 3PhCH 2), 3.92 (m, 2H, OCH2), 3.97-3.81 (m, 3H, H-2 or 3, 4), 3.79 (m, 1H, H-3 or 2), 3.69 (dd, 1H, J4,5a = 2.6 Hz, J5a,5b = 10.6 Hz, H-5a), 3.63 (dd, 1H, J4,5b = 5.7 Hz, H-5b), 1.06 (s, 9H, tert-Bu). 13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 138.78, 138.75, 138.58, 135.74, 135.68 [C (q), Ar], 134.97 (=CH-), 133.59, 133.43, 129.57, 129.56, 128.22, 128.20, 127.88, 127.72, 127.63, 127.60, 127.43, 127.34, 127.29 (Ar), 116.61 (=CH2), 79.99, 78.66, 78.63 (C-2,3,4), 73.70, 72.46, 72.36 (3PhCH2), 72.15 (OCH2), 70.34 (C-5), 63.82 (C-1), 26.90 (C-CH3), 19.21 (C-CH3). ESI-HRMS: m/z calcd for C45H52O5SiK [M+K+], 739.3221; found, 731.3194.
2,3,4-トリ-O-ベンジル-1-O-tert-ブチルジフェニルシリル-D-リビトール（2）
THF（1.5 mL）中の触媒量の(1,5-シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニルホスフィン)イリジウム(I)ヘキサフルオロホスフェートをH2で活性化させた。この溶液に、THF（3.0 mL）中の化合物1（74.3 mg, 108μmol）を加え、1時間撹拌した（溶液A）。THF（1.5 mL）中のさらなる触媒量の上記イリジウム(I)錯体をH2で活性化させた。これに、溶液Aを加え、40分間撹拌した。それからH2O（1.0 mL）、NaHCO3（188 mg, 2.24 mmol）、およびI2（53.5 mg, 0.211 mmol）を加え、0℃で30分間撹拌した。1 M Na2S2O3で反応をクエンチし、通常の後処理を行った。得られた粗材料をSilica Gel 60N（30:1-5:1 n-ヘキサン:EtOAc）で精製して、2（49.3 mg）を収率71%で得た。
[α]D +7.7° (c 1.51, CHCl3); 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 7.66 (m, 4H, Ar-H), 7.41-7.22 (m, 21H, Ar-H), 4.70, 4.62 (ABq, 2H, J = 11.2 Hz, PhCH 2), 4.69, 4.55 (ABq, 2H, J = 11.8 Hz, PhCH 2), 4.56 (s, 2H, PhCH 2), 3.97 (m, 2H, H-3, 4), 3.90 (m, 2H, H-1ab), 3.77 (m, 1H, H-2), 3.74 (m, 2H, H-5ab), 2.31 (brt, 1H, J = 6.2 Hz, OH-5), 1.06 (s, 9H, tert-Bu). 13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 138.33, 138.18, 138.13, 135.71, 135.66 [C (q), Ar], 133.40, 133.28, 129.69, 129.67, 128.92, 128.42, 128.37, 128.31, 127.99, 127.78, 127.75, 127.69, 127.54 (Ar), 79.74, 79.01, 78.96 (C-2,3,4), 73.88, 72.61, 71.86 (3PhCH2), 63.49 (C-1), 61.50 (C-5), 26.90 (C-CH3), 19.20 (C-CH3).ESI-HRMS: m/z calcd for C42H48O5SiNa [M+Na+], 683.3169; found, 683.3145.
THF（1.5 mL）中の触媒量の(1,5-シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニルホスフィン)イリジウム(I)ヘキサフルオロホスフェートをH2で活性化させた。この溶液に、THF（3.0 mL）中の化合物1（74.3 mg, 108μmol）を加え、1時間撹拌した（溶液A）。THF（1.5 mL）中のさらなる触媒量の上記イリジウム(I)錯体をH2で活性化させた。これに、溶液Aを加え、40分間撹拌した。それからH2O（1.0 mL）、NaHCO3（188 mg, 2.24 mmol）、およびI2（53.5 mg, 0.211 mmol）を加え、0℃で30分間撹拌した。1 M Na2S2O3で反応をクエンチし、通常の後処理を行った。得られた粗材料をSilica Gel 60N（30:1-5:1 n-ヘキサン:EtOAc）で精製して、2（49.3 mg）を収率71%で得た。
[α]D +7.7° (c 1.51, CHCl3); 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 7.66 (m, 4H, Ar-H), 7.41-7.22 (m, 21H, Ar-H), 4.70, 4.62 (ABq, 2H, J = 11.2 Hz, PhCH 2), 4.69, 4.55 (ABq, 2H, J = 11.8 Hz, PhCH 2), 4.56 (s, 2H, PhCH 2), 3.97 (m, 2H, H-3, 4), 3.90 (m, 2H, H-1ab), 3.77 (m, 1H, H-2), 3.74 (m, 2H, H-5ab), 2.31 (brt, 1H, J = 6.2 Hz, OH-5), 1.06 (s, 9H, tert-Bu). 13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 138.33, 138.18, 138.13, 135.71, 135.66 [C (q), Ar], 133.40, 133.28, 129.69, 129.67, 128.92, 128.42, 128.37, 128.31, 127.99, 127.78, 127.75, 127.69, 127.54 (Ar), 79.74, 79.01, 78.96 (C-2,3,4), 73.88, 72.61, 71.86 (3PhCH2), 63.49 (C-1), 61.50 (C-5), 26.90 (C-CH3), 19.20 (C-CH3).ESI-HRMS: m/z calcd for C42H48O5SiNa [M+Na+], 683.3169; found, 683.3145.
2,3,4-トリ-O-ベンジル-1-O-tert-ブチルジフェニルシリル-D-リビトール5-(トリエチルアンモニウムホスホネート（3）
CH3CN（10 mL）およびピリジン（10 mL）中の2（748.1 mg, 1.092 mmol）の溶液に、2-クロロ-1,3,2-ベンゾジオキサホスホリン-4-オン（777 mg, 3.84 mmol）を室温で2時間加えた。反応をCHCl3で希釈し1 M Et3NH2CO3でクエンチした。この混合物をCHCl3で抽出した。有機相を1 M Et3NH2CO3で洗浄し、通常の方法で処理した。残渣を、Silica Gel 60N（球状中性）カラムに供し（50:1-1:1 n-ヘキサン:EtOAc-20:1 EtOAc:MeOH-2:1 CHCl3:MeOH、1% Et3N含有）、3（694.6 mg）を収率77%で得た。この化合物はこれ以上精製することなく先の反応に進めた。
1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 7.65-7.61 (m, 3H, Ar-H), 7.40-7.34 (m, 2H, Ar-H), 7.30-7.17 (m, 20H, Ar-H), 5.85 (d, 1H, JP,H = 556.3 Hz, PH), 4.73-4.51 (m, 6H, 3PhCH 2), 4.21 (m, 1H, H-5a), 4.10 (m, 1H, H-5b), 3.95-3.84 (m, 5H, H-1ab, 2, 3, 4), 2.95 (m, 6H, 3CH3CH 2), 1.24 (t, 9H, J = 7.3 Hz, 3CH 3CH2), 1.03 (s, 9H, tert-Bu).
HRMS: m/zcalcd for C42H48O7PSi [M-Et3NH-], 723.2907; found, 723.2930.
CH3CN（10 mL）およびピリジン（10 mL）中の2（748.1 mg, 1.092 mmol）の溶液に、2-クロロ-1,3,2-ベンゾジオキサホスホリン-4-オン（777 mg, 3.84 mmol）を室温で2時間加えた。反応をCHCl3で希釈し1 M Et3NH2CO3でクエンチした。この混合物をCHCl3で抽出した。有機相を1 M Et3NH2CO3で洗浄し、通常の方法で処理した。残渣を、Silica Gel 60N（球状中性）カラムに供し（50:1-1:1 n-ヘキサン:EtOAc-20:1 EtOAc:MeOH-2:1 CHCl3:MeOH、1% Et3N含有）、3（694.6 mg）を収率77%で得た。この化合物はこれ以上精製することなく先の反応に進めた。
1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 7.65-7.61 (m, 3H, Ar-H), 7.40-7.34 (m, 2H, Ar-H), 7.30-7.17 (m, 20H, Ar-H), 5.85 (d, 1H, JP,H = 556.3 Hz, PH), 4.73-4.51 (m, 6H, 3PhCH 2), 4.21 (m, 1H, H-5a), 4.10 (m, 1H, H-5b), 3.95-3.84 (m, 5H, H-1ab, 2, 3, 4), 2.95 (m, 6H, 3CH3CH 2), 1.24 (t, 9H, J = 7.3 Hz, 3CH 3CH2), 1.03 (s, 9H, tert-Bu).
HRMS: m/zcalcd for C42H48O7PSi [M-Et3NH-], 723.2907; found, 723.2930.
O-[2-N-(ベンジルオキシカルボニル)アミノエチル2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド] 3-(2,3,4-トリ-O-ベンジル-1-O-tert-ブチルジフェニルシリル-D-リビト-5-イルトリエチルアンモニウムホスフェート)（10）
3（97.1 mg, 0.118 mmol）と8（56.2 mg, 0.120 mmol）の混合物について、ピリジンを用いた共沸を二度行い、真空乾燥させ、そしてピリジン（2 mL）で希釈した。この溶液にPivCl（7μL）を加えて室温で撹拌し、20、90、および140分後にそれぞれ追加のPivCl（7μL×3）を加えた。1時間後に反応物をCHCl3により希釈し、飽和NaHCO3でクエンチした。混合物をCHCl3で抽出した。有機相を通常の手法で処理した。残渣をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH）に供し、収率62%で9（85.3 mg, 0.724 mmol）を得た。Rf 0.32および0.45 (1:1 トルエン:EtOAc×2)。この化合物はこれ以上精製することなく先の反応に進めた。
3（97.1 mg, 0.118 mmol）と8（56.2 mg, 0.120 mmol）の混合物について、ピリジンを用いた共沸を二度行い、真空乾燥させ、そしてピリジン（2 mL）で希釈した。この溶液にPivCl（7μL）を加えて室温で撹拌し、20、90、および140分後にそれぞれ追加のPivCl（7μL×3）を加えた。1時間後に反応物をCHCl3により希釈し、飽和NaHCO3でクエンチした。混合物をCHCl3で抽出した。有機相を通常の手法で処理した。残渣をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH）に供し、収率62%で9（85.3 mg, 0.724 mmol）を得た。Rf 0.32および0.45 (1:1 トルエン:EtOAc×2)。この化合物はこれ以上精製することなく先の反応に進めた。
化合物9 （85.3 mg, 72.4μmol）をピリジン（2.4 mL）で希釈した。この溶液に、ピリジン（2.4 mL）およびH2O（0.12 mL）中のI2（50.8 mg, 0.200 mmol）溶液を加えて室温で40分間撹拌した。反応物をCHCl3で希釈し1 M Na2S2O3でクエンチした。混合物をCHCl3で抽出した。有機相を通常の手法で処理した。残渣をSilica Gel 60N（球状中性）カラムに供し（50:1 EtOAc:MeOH-100:1-10:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））、収率98%で10（91.8 mg, 70.9μmol）を得た。Rf 0.53（10:1 CHCl3:MeOH（5% AcOH含有））。
[α]D +7.4° (c 1.50, CHCl3). 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 12.42 (s, 1H, Et3NH +),7.66-7.59 (m, 4H, Ar-H), 7.46-7.44 (m, 2H, Ar-H), 7.39-7.16 (m, 29H, Ar-H), 5.44 (s, 1H, PhCH), 5.38 (br, 1H, NH), 5.11, 5.07 [ABq, 2H, J = 11.7 Hz, PhCH 2 (Z)], 4.80, 4.57 (ABq, 2H, J = 11.7 Hz, PhCH 2), 4.73, 4.62 (ABq, 2H, J = 11.2 Hz, PhCH 2), 4.69, 4.66 (ABq, 2H, J = 11.7 Hz, PhCH 2), 4.35 (m, 1H, Rbo-5a), 4.22 (m, 1H, Rbo-5b), 4.08 (m, 2H, Gal-3, 6a), 4.05 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, Gal-1), 3.99 (m, 2H, Gal-4, Rbo-4), 3.91 (m, 5H, Rbo-1ab, 2, 3, 1/2OCH2), 3.79 (d, 1H, J6a,6b = 11.2 Hz, Gal-6b), 3.71 (dd, 1H, J2,3 = 10.4 Hz, Gal-2), 3.62 (m, 1H, 1/2OCH2), 3.41 (m, 2H, NCH2), 2.96 (s, 1H, Gal-5), 2.71 [m, 6H, 3NCH2 (Et3N)], 1.03 (s, 9H, tert-Bu), 1.00 [t, 9H, J = 7.4 Hz, 3CH3 (Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 156.48 (NHC=O), 139.11, 138.84, 138.11, 136.66 [C (q)], 135.69, 135.66 (Ar), 133.59, 133.44 [C (q), Ar], 129.52, 129.00, 128.92, 128.69, 128.46, 128.18, 128.13, 128.02, 127.98, 127.77, 127.70, 127.60, 127.58, 127.50, 127.42, 127.26, 127.19, 127.14, 126.51 (Ar), 102.21 (Gal-1), 100.89 (PhCH), 80.36, 78.62 (Rbo-2,3,4), 79.07 (d, 3JCCOP = 6.6 Hz, Gal-4), 73.78 (PhCH2), 73.57(d, 2JCOP= 4.1 Hz, Gal-3), 72.34, 72.04 (2PhCH2), 69.43 (OCH2), 68.85 (Gal-6), 66.60 [PhCH2 (Z)], 66.37 (Gal-5), 65.13 (d, 2JCOP= 5.0 Hz, Rbo-5), 63.95 (Rbo-1), 62.26 (d, 3JCCOP= 7.8 Hz, Gal-2), 45.13 [CH2 (Et)], 41.05 (NCH2), 26.87 [CH3 (tert-Bu)], 19.18 [CMe3 (tert-Bu)], 8.19 [CH3(Et)].
HRMS: m/zcalcd for C65H72N4O14PSi [M-Et3NH-], 1191.4557; found, 1191.4570.
[α]D +7.4° (c 1.50, CHCl3). 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 12.42 (s, 1H, Et3NH +),7.66-7.59 (m, 4H, Ar-H), 7.46-7.44 (m, 2H, Ar-H), 7.39-7.16 (m, 29H, Ar-H), 5.44 (s, 1H, PhCH), 5.38 (br, 1H, NH), 5.11, 5.07 [ABq, 2H, J = 11.7 Hz, PhCH 2 (Z)], 4.80, 4.57 (ABq, 2H, J = 11.7 Hz, PhCH 2), 4.73, 4.62 (ABq, 2H, J = 11.2 Hz, PhCH 2), 4.69, 4.66 (ABq, 2H, J = 11.7 Hz, PhCH 2), 4.35 (m, 1H, Rbo-5a), 4.22 (m, 1H, Rbo-5b), 4.08 (m, 2H, Gal-3, 6a), 4.05 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, Gal-1), 3.99 (m, 2H, Gal-4, Rbo-4), 3.91 (m, 5H, Rbo-1ab, 2, 3, 1/2OCH2), 3.79 (d, 1H, J6a,6b = 11.2 Hz, Gal-6b), 3.71 (dd, 1H, J2,3 = 10.4 Hz, Gal-2), 3.62 (m, 1H, 1/2OCH2), 3.41 (m, 2H, NCH2), 2.96 (s, 1H, Gal-5), 2.71 [m, 6H, 3NCH2 (Et3N)], 1.03 (s, 9H, tert-Bu), 1.00 [t, 9H, J = 7.4 Hz, 3CH3 (Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 156.48 (NHC=O), 139.11, 138.84, 138.11, 136.66 [C (q)], 135.69, 135.66 (Ar), 133.59, 133.44 [C (q), Ar], 129.52, 129.00, 128.92, 128.69, 128.46, 128.18, 128.13, 128.02, 127.98, 127.77, 127.70, 127.60, 127.58, 127.50, 127.42, 127.26, 127.19, 127.14, 126.51 (Ar), 102.21 (Gal-1), 100.89 (PhCH), 80.36, 78.62 (Rbo-2,3,4), 79.07 (d, 3JCCOP = 6.6 Hz, Gal-4), 73.78 (PhCH2), 73.57(d, 2JCOP= 4.1 Hz, Gal-3), 72.34, 72.04 (2PhCH2), 69.43 (OCH2), 68.85 (Gal-6), 66.60 [PhCH2 (Z)], 66.37 (Gal-5), 65.13 (d, 2JCOP= 5.0 Hz, Rbo-5), 63.95 (Rbo-1), 62.26 (d, 3JCCOP= 7.8 Hz, Gal-2), 45.13 [CH2 (Et)], 41.05 (NCH2), 26.87 [CH3 (tert-Bu)], 19.18 [CMe3 (tert-Bu)], 8.19 [CH3(Et)].
HRMS: m/zcalcd for C65H72N4O14PSi [M-Et3NH-], 1191.4557; found, 1191.4570.
O-[2-N-(ベンジルオキシカルボニル)アミノエチル2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド] 3-(2,3,4-トリ-O-ベンジル-D-リビト-5-イルトリエチルアンモニウムホスフェート)（11）
化合物10（15.6 mg, 12.1μmol）をTHF（1 mL）で希釈した。これに、THF中1 Mのn-Bu4NF溶液（48μL）を加え4日間撹拌した。溶液をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して、11を定量的に得た。
Rf0.54 (10:1 CHCl3:MeOH containing 1% AcOH). [α]D +4.6° (c 1.62, CHCl3); 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 12.33 (s, 1H, Et3NH +), 7.48 (m, 2H, Ar-H), 7.35-7.23 (m, 23H, Ar-H), 5.48 (s, 1H, PhCH), 5.44 (m, 1H, NH), 5.11, 5.08 [ABq, 2H, J= 12.3 Hz, PhCH 2 (Z)], 4.83-4.57 (m, 6H, 3PhCH 2), 4.39 (m, 1H, Rbo-5a), 4.23 (m, 1H, Rbo-5b), 4.14-4.08 (m, 3H, Gal-1, 3, 6a), 4.02, 3.95, 3.82 (3m, 4H, Rbo-2, 3, 4, Gal-4), 3.92 (m, 1H, 1/2OCH2), 3.86 (d, 1H, J6a,6b = 11.2 Hz, Gal-6b), 3.78-3.73 (m, 3H, Rbo-1ab, Gal-2), 3.67 (m, 1H, 1/2OCH2), 3.43 (m, 2H, NCH2), 3.02 (s, 1H, Gal-5), 2.76 [m, 6H, 3NCH2(Et3N)], 1.06 [t, 9H, J = 7.3 Hz, 3CH3 (Et3N)].13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 156.50 (NHC=O), 138.62, 138.48, 138.48, 138.09, 136.65 [C (q), Ar], 129.05, 128.90, 128.87, 128.79, 128.47, 128.39, 128.31, 128.27, 128.10, 127.99, 127.96, 127.79, 127.75, 127.69, 127.58, 127.47, 126.54, 126.08 (Ar), 102.16 (Gal-1), 101.05 (PhCH), 79.37, 79.12 (Rbo-2,3,4), 78.85 (d, 3JCCOP= 7.7 Hz, Gal-4), 73.88 (PhCH2), 73.63 (d, 2JCOP= 4.8 Hz, Gal-3), 72.28, 71.90 (2PhCH2), 69.44 (OCH2), 68.91 (Gal-6), 66.62 [PhCH2 (Z)], 66.39 (Gal-5), 62.34 (d, 2JCOP= 7.9 Hz, Rbo-5), 62.34 (d, 3JCCOP = 7.9 Hz, Gal-2), 61.59 (Rbo-1), 45.23 [CH2 (Et)], 41.03 (NCH2), 8.23 [CH3 (Et)].
HRMS: m/zcalcd for C55H71N5O14P [M+H+], 1056.4735; found, 1056.4634, m/zcalcd for C49H54N4O14P [M-Et3NH-], 953.3379; found, 953.3357.
化合物10（15.6 mg, 12.1μmol）をTHF（1 mL）で希釈した。これに、THF中1 Mのn-Bu4NF溶液（48μL）を加え4日間撹拌した。溶液をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して、11を定量的に得た。
Rf0.54 (10:1 CHCl3:MeOH containing 1% AcOH). [α]D +4.6° (c 1.62, CHCl3); 1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 12.33 (s, 1H, Et3NH +), 7.48 (m, 2H, Ar-H), 7.35-7.23 (m, 23H, Ar-H), 5.48 (s, 1H, PhCH), 5.44 (m, 1H, NH), 5.11, 5.08 [ABq, 2H, J= 12.3 Hz, PhCH 2 (Z)], 4.83-4.57 (m, 6H, 3PhCH 2), 4.39 (m, 1H, Rbo-5a), 4.23 (m, 1H, Rbo-5b), 4.14-4.08 (m, 3H, Gal-1, 3, 6a), 4.02, 3.95, 3.82 (3m, 4H, Rbo-2, 3, 4, Gal-4), 3.92 (m, 1H, 1/2OCH2), 3.86 (d, 1H, J6a,6b = 11.2 Hz, Gal-6b), 3.78-3.73 (m, 3H, Rbo-1ab, Gal-2), 3.67 (m, 1H, 1/2OCH2), 3.43 (m, 2H, NCH2), 3.02 (s, 1H, Gal-5), 2.76 [m, 6H, 3NCH2(Et3N)], 1.06 [t, 9H, J = 7.3 Hz, 3CH3 (Et3N)].13C NMR δC (150 MHz, CDCl3): 156.50 (NHC=O), 138.62, 138.48, 138.48, 138.09, 136.65 [C (q), Ar], 129.05, 128.90, 128.87, 128.79, 128.47, 128.39, 128.31, 128.27, 128.10, 127.99, 127.96, 127.79, 127.75, 127.69, 127.58, 127.47, 126.54, 126.08 (Ar), 102.16 (Gal-1), 101.05 (PhCH), 79.37, 79.12 (Rbo-2,3,4), 78.85 (d, 3JCCOP= 7.7 Hz, Gal-4), 73.88 (PhCH2), 73.63 (d, 2JCOP= 4.8 Hz, Gal-3), 72.28, 71.90 (2PhCH2), 69.44 (OCH2), 68.91 (Gal-6), 66.62 [PhCH2 (Z)], 66.39 (Gal-5), 62.34 (d, 2JCOP= 7.9 Hz, Rbo-5), 62.34 (d, 3JCCOP = 7.9 Hz, Gal-2), 61.59 (Rbo-1), 45.23 [CH2 (Et)], 41.03 (NCH2), 8.23 [CH3 (Et)].
HRMS: m/zcalcd for C55H71N5O14P [M+H+], 1056.4735; found, 1056.4634, m/zcalcd for C49H54N4O14P [M-Et3NH-], 953.3379; found, 953.3357.
O-(2-アセトアミドエチル2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド) 3-(D-リビト-5-イルトリエチルアンモニウムホスフェート)（12）
化合物11（20.8 mg, 19.7μmol）を2-PrOH（3 mL）で希釈し、H2雰囲気下、カーボン担持PdおよびAcOH（1滴）の存在下で3日間撹拌した。反応混合物にH2O（1 mL）を加え、反応を1日続けた。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をH2O（2 mL）で希釈した。この溶液にEt3N（3滴）およびAc2O（3滴）を加え、2.5時間撹拌した。反応混合物を揮発させH2O（1.5 mL）で希釈した。H2雰囲気下、カーボン担持PdおよびAcOH（1滴）の存在下で溶液を2日間撹拌した。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をゲル濾過（LH-20, 1% Et3N）に供して、3ステップにわたる41%の収率で12（5.0 mg, 8.0μmol）を得た。Rf 0.46（1:1:1 EtOAc:MeOH:H2O（5%AcOH含有））, [α]D -32° (c 0.06, H2O)。
1H NMR δH (600 MHz, D2O) (DSS = 0 ppm): 4.38 (d, 1H, J1,2 = 8.5 Hz, Gal-1), 4.04-4.00 (m, 2H, Gal-3, 4), 3.91-3.87 (m, 1H, Gal-2, Rbo-5a), 3.81-3.75 (m, 3H, Rbo-4, 5b, 1/2OCH 2CH2N), 3.69 (m, 1H, Rbo-2), 3.67-3.61 (m, 3H, Gal-6ab, Rbo-1a), 3.59-3.53 (m, 3H, Gal-5, Rbo-3, 1/2OCH2), 3.50 (dd, 1H, J1a,1b = 11.9 Hz, J1b,2 = 7.0 Hz, Rbo-1b), 3.21 (m, 2H, NCH2), 3.05 [q, 6H, J = 7.3 Hz, 3NCH2(Et3N)], 1.89, 1.83 (2s, 3Hx2, 2NAc), 1.10 [t, 9H, 3CH3(Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (DSS = 0 ppm): 99.07 (Gal-1), 72.98 (d, 2JCOP = 5.7 Hz, Gal-3), 72.42 (Rbo-3), 69.78 (Rbo-2), 69.40 (Gal-5), 68.68 (d, 3JCCOP= 7.4 Hz, Rbo-4), 65.81 (OCH2CH2N), 64.66 (Gal-4), 62.31 (d, 2JCOP = 5.6 Hz, Rbo-5), 60.03 (Rbo-1), 58.64 (Gal-6), 48.98 (d, 3JCCOP = 6.4 Hz, Gal-2), 44.40 [CH2 (Et)], 37.05 (NCH2), 20.06, 19.54 (COCH3), 8.17 [CH3 (Et)].
化合物11（20.8 mg, 19.7μmol）を2-PrOH（3 mL）で希釈し、H2雰囲気下、カーボン担持PdおよびAcOH（1滴）の存在下で3日間撹拌した。反応混合物にH2O（1 mL）を加え、反応を1日続けた。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をH2O（2 mL）で希釈した。この溶液にEt3N（3滴）およびAc2O（3滴）を加え、2.5時間撹拌した。反応混合物を揮発させH2O（1.5 mL）で希釈した。H2雰囲気下、カーボン担持PdおよびAcOH（1滴）の存在下で溶液を2日間撹拌した。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をゲル濾過（LH-20, 1% Et3N）に供して、3ステップにわたる41%の収率で12（5.0 mg, 8.0μmol）を得た。Rf 0.46（1:1:1 EtOAc:MeOH:H2O（5%AcOH含有））, [α]D -32° (c 0.06, H2O)。
1H NMR δH (600 MHz, D2O) (DSS = 0 ppm): 4.38 (d, 1H, J1,2 = 8.5 Hz, Gal-1), 4.04-4.00 (m, 2H, Gal-3, 4), 3.91-3.87 (m, 1H, Gal-2, Rbo-5a), 3.81-3.75 (m, 3H, Rbo-4, 5b, 1/2OCH 2CH2N), 3.69 (m, 1H, Rbo-2), 3.67-3.61 (m, 3H, Gal-6ab, Rbo-1a), 3.59-3.53 (m, 3H, Gal-5, Rbo-3, 1/2OCH2), 3.50 (dd, 1H, J1a,1b = 11.9 Hz, J1b,2 = 7.0 Hz, Rbo-1b), 3.21 (m, 2H, NCH2), 3.05 [q, 6H, J = 7.3 Hz, 3NCH2(Et3N)], 1.89, 1.83 (2s, 3Hx2, 2NAc), 1.10 [t, 9H, 3CH3(Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (DSS = 0 ppm): 99.07 (Gal-1), 72.98 (d, 2JCOP = 5.7 Hz, Gal-3), 72.42 (Rbo-3), 69.78 (Rbo-2), 69.40 (Gal-5), 68.68 (d, 3JCCOP= 7.4 Hz, Rbo-4), 65.81 (OCH2CH2N), 64.66 (Gal-4), 62.31 (d, 2JCOP = 5.6 Hz, Rbo-5), 60.03 (Rbo-1), 58.64 (Gal-6), 48.98 (d, 3JCCOP = 6.4 Hz, Gal-2), 44.40 [CH2 (Et)], 37.05 (NCH2), 20.06, 19.54 (COCH3), 8.17 [CH3 (Et)].
O-[2-N-(ベンジルオキシカルボニル)アミノエチル2-アセトアミド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド] 3-(2,3,4-トリ-O-ベンジル-D-リビト-5-イル トリエチルアンモニウムホスフェート（20）
化合物11（13.6 mg, 12.9μmol）をEtOAc（1.5 mL）で希釈した。これにAcOH（0.1 mL, 1.75 mmol）およびZn（83.0 mg, 1.27 mmol）を加え、2日間撹拌した。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をMeOH（2 mL）で希釈した。この溶液にEt3N（0.1 mL）およびAc2O（0.1 mL）を加え、2時間撹拌した。反応混合物を揮発させ残渣をゲル濾過（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して、2ステップにわたる97%の収率で20（13.4 mg, 12.5μmol）を得た。Rf 0.29（10:1 CHCl3:MeOH（5%AcOH含有））。1H NMRで1.88 ppmにてNAcシグナルを生じたこの化合物を、さらなる精製なしで次の反応に使用した。
化合物11（13.6 mg, 12.9μmol）をEtOAc（1.5 mL）で希釈した。これにAcOH（0.1 mL, 1.75 mmol）およびZn（83.0 mg, 1.27 mmol）を加え、2日間撹拌した。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をMeOH（2 mL）で希釈した。この溶液にEt3N（0.1 mL）およびAc2O（0.1 mL）を加え、2時間撹拌した。反応混合物を揮発させ残渣をゲル濾過（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して、2ステップにわたる97%の収率で20（13.4 mg, 12.5μmol）を得た。Rf 0.29（10:1 CHCl3:MeOH（5%AcOH含有））。1H NMRで1.88 ppmにてNAcシグナルを生じたこの化合物を、さらなる精製なしで次の反応に使用した。
O-[2-アミノエチル2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド) 3-(D-リビト-5-イル トリエチルアンモニウムホスフェート)（13a）
化合物20（12.2 mg, 11.4μmol）を2-PrOH（2 mL）で希釈し、H2雰囲気下、カーボン担持PdおよびAcOH（1滴）の存在下で2日間撹拌した。反応混合物にH2O（1 mL）を加え、反応を2日続けた。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をH2O（2 mL）で希釈した。H2雰囲気下、カーボン担持PdおよびAcOH（1滴）の存在下で溶液を3日間撹拌した。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、13aを定量的に得た。Rf 0.45（1:1:1 EtOAc:MeOH:H2O（5%Et3N含有））。
[α]D +26.3° (c 0.40, H2O), 1H NMR δH (600 MHz, D2O) (tert-BuOH = 1.23 ppm): 4.57 (d, 1H, J1,2 = 8.5 Hz, Gal-1), 4.18 (ddd, 1H, J2,3 = 10.6 Hz, J3,4 = 3.1 Hz, J3,P = 8.6 Hz, Gal-3), 4.15 (d, 1H, Gal-4), 4.09-4.03 (m, 3H, Gal-2, Rbo-5a, 1/2OCH 2CH2N), 3.96-3.89 (m, 3H, Rbo-4, 5b, 1/2OCH 2CH2N), 3.83 (m, 1H, Rbo-2), 3.80-3.78 (m, 3H, Gal-6ab, Rbo-1a), 3.74-3.71 (m, 2H, Gal-5, Rbo-3), 3.64 (dd, 1H, J1a,1b = 11.9 Hz, J1b,2 = 7.1 Hz, Rbo-1b), 3.23 (m, 2H, NCH2), 3.19 [q, 6H, J = 7.3 Hz, 3NCH2(Et3N)], 2.06 (s, 3H, NAc), 1.91 (s, 3H, OAc), 1.27 [t, 9H, J = 7.3 Hz, 3CH3 (Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (tert-BuOH = 31.1 ppm): 176.56 [NHC=O], 102.63(Gal-1), 76.55 (d, 2JCOP= 5.6 Hz, Gal-3), 76.26 (Rbo-3), 73.57 (Rbo-2), 73.16 (Gal-5), 72.44 (d, 3JCCOP= 7.6 Hz, Rbo-4), 68.41 (Gal-4), 68.11 (d, 2JCOP = 5.5 Hz, Rbo-5), 67.08 (OCH2), 63.81 (Rbo-1), 62.50 (Gal-6), 52.68 (d, 3JCCOP = 5.4 Hz, Gal-2), 48.18 [CH2(Et)], 41.00 (NCH2CH2O),23.89 (NCOCH3), 9.73 [CH3 (Et)]. HRMS: m/z calcd for C15H30N2O13P [(M-HN+Et3)-], 477.1491; found, 477.1492.
化合物20（12.2 mg, 11.4μmol）を2-PrOH（2 mL）で希釈し、H2雰囲気下、カーボン担持PdおよびAcOH（1滴）の存在下で2日間撹拌した。反応混合物にH2O（1 mL）を加え、反応を2日続けた。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をH2O（2 mL）で希釈した。H2雰囲気下、カーボン担持PdおよびAcOH（1滴）の存在下で溶液を3日間撹拌した。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、13aを定量的に得た。Rf 0.45（1:1:1 EtOAc:MeOH:H2O（5%Et3N含有））。
[α]D +26.3° (c 0.40, H2O), 1H NMR δH (600 MHz, D2O) (tert-BuOH = 1.23 ppm): 4.57 (d, 1H, J1,2 = 8.5 Hz, Gal-1), 4.18 (ddd, 1H, J2,3 = 10.6 Hz, J3,4 = 3.1 Hz, J3,P = 8.6 Hz, Gal-3), 4.15 (d, 1H, Gal-4), 4.09-4.03 (m, 3H, Gal-2, Rbo-5a, 1/2OCH 2CH2N), 3.96-3.89 (m, 3H, Rbo-4, 5b, 1/2OCH 2CH2N), 3.83 (m, 1H, Rbo-2), 3.80-3.78 (m, 3H, Gal-6ab, Rbo-1a), 3.74-3.71 (m, 2H, Gal-5, Rbo-3), 3.64 (dd, 1H, J1a,1b = 11.9 Hz, J1b,2 = 7.1 Hz, Rbo-1b), 3.23 (m, 2H, NCH2), 3.19 [q, 6H, J = 7.3 Hz, 3NCH2(Et3N)], 2.06 (s, 3H, NAc), 1.91 (s, 3H, OAc), 1.27 [t, 9H, J = 7.3 Hz, 3CH3 (Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (tert-BuOH = 31.1 ppm): 176.56 [NHC=O], 102.63(Gal-1), 76.55 (d, 2JCOP= 5.6 Hz, Gal-3), 76.26 (Rbo-3), 73.57 (Rbo-2), 73.16 (Gal-5), 72.44 (d, 3JCCOP= 7.6 Hz, Rbo-4), 68.41 (Gal-4), 68.11 (d, 2JCOP = 5.5 Hz, Rbo-5), 67.08 (OCH2), 63.81 (Rbo-1), 62.50 (Gal-6), 52.68 (d, 3JCCOP = 5.4 Hz, Gal-2), 48.18 [CH2(Et)], 41.00 (NCH2CH2O),23.89 (NCOCH3), 9.73 [CH3 (Et)]. HRMS: m/z calcd for C15H30N2O13P [(M-HN+Et3)-], 477.1491; found, 477.1492.
O-[2-N-(4-ニトロ)ベンズアミドエチル2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド) 3-(D-リビト-5-イルトリエチルアンモニウムホスフェート)（13b）
アセトン（0.18 mL）中の4-ニトロベンゾイルクロリド（4.1 mg, 22μmol）溶液を、H2O（1 mL）およびEt3N（5μL, 36μmol）中の13a（7.2 mg, 11μmol）の溶液に加え、室温で40分間撹拌した。反応混合物を直接ゲル濾過カラム（LH-20, 1% Et3N）およびBondElut C8に供し、収率34%で13b（2.7 mg, 3.7μmol）を得た。Rf 0.62（3:2:1 EtOAc:MeOH:H2O（5%Et3N含有）, [α]D -39°(c 0.12, H2O)。
[α]D -39° (c 0.12, H2O), 1H NMR δH (600 MHz, D2O) (DOH = 4.70 ppm): 8.30-8.28 (m, 2H, Ar-H), 7.90-7.88 (m, 2H, Ar-H), 4.49 (d, 1H, J1,2 = 8.5 Hz, Gal-1), 4.09 (ddd, 1H, J2,3 = 10.7 Hz, J3,4 = 3.1 Hz, J3,P = 8.7 Hz, Gal-3), 4.107 (d, 1H, Gal-4), 4.01-3.93 (m, 3H, Gal-2, Rbo-5a, 1/2OCH2), 3.86-3.81 (m, 2H, Rbo-4, 5b), 3.80-3.74 (m, 2H, Rbo-2, 1/2OCH2), 3.71 (dd, 1H, J1a,1b = 11.8 Hz, J1a,2 = 3.1 Hz, Rbo-1a), 3.68 (m, 2H, Gal-6ab), 3.64-3.62 (m, 2H, Gal-5, Rbo-3), 3.56 (dd, 1H, J1b,2 = 7.2 Hz, Rbo-1b), 3.54 (m, 2H, NCH2), 3.11 [q, 6H, J= 7.3 Hz, 3NCH2 (Et3N)], 1.68 (s, 3H, NAc), 1.19 [t, 9H, 3CH3 (Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (DSS = 0 ppm): 77.23, 171.69 (C=O), 152.30, 142.32 [C (q), Ar], 131.16, 126.70 (Ar), 104.02 (Gal-1), 77.93 (d, 2JCOP = 5.4 Hz, Gal-3), 77.43 (Rbo-3), 74.80 (Rbo-2), 74.41 (Gal-5), 73.69 (d, 3JCCOP= 7.6 Hz, Rbo-4), 70.59 (OCH2), 69.68 (Gal-4), 69.33 (d, 2JCOP= 5.7 Hz, Rbo-5), 65.06 (Rbo-1), 63.64 (Gal-6), 53.99 (d, 3JCCOP= 6.4 Hz, Gal-2), 49.42 [CH2 (Et)], 42.65 (NCH2CH2O), 21.78 (NCOCH3), 10.97 [CH3 (Et)].
HRMS: m/zcalcd for C22H33N3O16P [M-Et3NH-], 626.1603; found, 626.1611.
アセトン（0.18 mL）中の4-ニトロベンゾイルクロリド（4.1 mg, 22μmol）溶液を、H2O（1 mL）およびEt3N（5μL, 36μmol）中の13a（7.2 mg, 11μmol）の溶液に加え、室温で40分間撹拌した。反応混合物を直接ゲル濾過カラム（LH-20, 1% Et3N）およびBondElut C8に供し、収率34%で13b（2.7 mg, 3.7μmol）を得た。Rf 0.62（3:2:1 EtOAc:MeOH:H2O（5%Et3N含有）, [α]D -39°(c 0.12, H2O)。
[α]D -39° (c 0.12, H2O), 1H NMR δH (600 MHz, D2O) (DOH = 4.70 ppm): 8.30-8.28 (m, 2H, Ar-H), 7.90-7.88 (m, 2H, Ar-H), 4.49 (d, 1H, J1,2 = 8.5 Hz, Gal-1), 4.09 (ddd, 1H, J2,3 = 10.7 Hz, J3,4 = 3.1 Hz, J3,P = 8.7 Hz, Gal-3), 4.107 (d, 1H, Gal-4), 4.01-3.93 (m, 3H, Gal-2, Rbo-5a, 1/2OCH2), 3.86-3.81 (m, 2H, Rbo-4, 5b), 3.80-3.74 (m, 2H, Rbo-2, 1/2OCH2), 3.71 (dd, 1H, J1a,1b = 11.8 Hz, J1a,2 = 3.1 Hz, Rbo-1a), 3.68 (m, 2H, Gal-6ab), 3.64-3.62 (m, 2H, Gal-5, Rbo-3), 3.56 (dd, 1H, J1b,2 = 7.2 Hz, Rbo-1b), 3.54 (m, 2H, NCH2), 3.11 [q, 6H, J= 7.3 Hz, 3NCH2 (Et3N)], 1.68 (s, 3H, NAc), 1.19 [t, 9H, 3CH3 (Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (DSS = 0 ppm): 77.23, 171.69 (C=O), 152.30, 142.32 [C (q), Ar], 131.16, 126.70 (Ar), 104.02 (Gal-1), 77.93 (d, 2JCOP = 5.4 Hz, Gal-3), 77.43 (Rbo-3), 74.80 (Rbo-2), 74.41 (Gal-5), 73.69 (d, 3JCCOP= 7.6 Hz, Rbo-4), 70.59 (OCH2), 69.68 (Gal-4), 69.33 (d, 2JCOP= 5.7 Hz, Rbo-5), 65.06 (Rbo-1), 63.64 (Gal-6), 53.99 (d, 3JCCOP= 6.4 Hz, Gal-2), 49.42 [CH2 (Et)], 42.65 (NCH2CH2O), 21.78 (NCOCH3), 10.97 [CH3 (Et)].
HRMS: m/zcalcd for C22H33N3O16P [M-Et3NH-], 626.1603; found, 626.1611.
O-[2-N-(4-オキサ-ヘプト-5-インアミドエチル2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド) 3-(D-リビト-5-イル ソディウムホスフェート)（13Y）
CH3CN（0.2 mL）中のプロパルギル-dPEG1-NHSエステル（6.0 mg, 27μmol）を、0.1 M Na3PO4および0.15 M NaCl（0.5 mL, pH 7.7）中の13a（7.3 mg, 11μmol）の溶液に加え、室温で1時間撹拌した。反応混合物を直接ゲル濾過カラム（LH-20, 1% Et3N）およびBondElut C8に供し、定量的収率34%で13Y（7.0 mg, 11μmol）を得た。Rf 0.60（3:2:1 EtOAc:MeOH:H2O（5%Et3N含有））。
[α]D -4.1° (c 0.38, H2O), 1H NMR δH (600 MHz, D2O) (tert-BuOH = 1.23 ppm): 4.53 (d, 1H, J1,2 = 8.5 Hz, Gal-1), 4.20 (m, 2H, CH 2C≡), 4.17 (ddd, 1H, J2,3 = 10.4 Hz, J3,4 = 3.1 Hz, J3,P = 8.5 Hz, Gal-3), 4.14 (d, 1H, Gal-4), 4.03 (dd, 1H, Gal-2), 4.03 (m, 1H, Rbo-5a), 3.92 (m, 3H, Rbo-4, 5b, 1/2OCH 2CH2N), 3.83 (m, 3H, Rbo-2, OCH 2CH2C=O), 3.78 (m, 3H, Rbo-1a, Gal-6ab), 3.72 (m, 4H, Rbo-3, Gal-5, 1/2OCH 2CH2N), 3.64 (dd, 1H, J1a,1b = 11.9 Hz, J1b,2 = 7.1 Hz, Rbo-1b), 3.38 (m, 2H, NCH2), 2.88 (t, 1H, J = 2.31 Hz, C≡CH), 2.54 (m, 2H, CH2C=O), 2.05 (s, 3H, NAc). 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (tert-BuOH = 31.1 ppm): 176.23, 175.36 [2NHC=O], 102.88 (Gal-1), 76.74 (d, 2JCOP = 6.6 Hz, Gal-3), 76.24 (Rbo-3), 73.57 (Rbo-2), 73.17 (Gal-5), 72.45 (d, 3JCCOP= 7.1 Hz, Rbo-4), 71.26 (C≡CH), 69.66 (OCH2CH2N), 68.46 (Gal-4), 68.10 (d, 2JCOP= 5.1 Hz, Rbo-5), 67.39 (OCH2CH2C=O), 63.81 (Rbo-1), 62.45 (Gal-6), 59.33 (C≡CH), 52.79 (d, 3JCCOP= 6.8 Hz, Gal-2), 40.88 (NCH2), 37.39 (CH2C=O), 23.92 (NCOCH3).
HRMS: m/zcalcd for C21H36N2O15P [M-Na-], 587.1858; found, 587.1865.
CH3CN（0.2 mL）中のプロパルギル-dPEG1-NHSエステル（6.0 mg, 27μmol）を、0.1 M Na3PO4および0.15 M NaCl（0.5 mL, pH 7.7）中の13a（7.3 mg, 11μmol）の溶液に加え、室温で1時間撹拌した。反応混合物を直接ゲル濾過カラム（LH-20, 1% Et3N）およびBondElut C8に供し、定量的収率34%で13Y（7.0 mg, 11μmol）を得た。Rf 0.60（3:2:1 EtOAc:MeOH:H2O（5%Et3N含有））。
[α]D -4.1° (c 0.38, H2O), 1H NMR δH (600 MHz, D2O) (tert-BuOH = 1.23 ppm): 4.53 (d, 1H, J1,2 = 8.5 Hz, Gal-1), 4.20 (m, 2H, CH 2C≡), 4.17 (ddd, 1H, J2,3 = 10.4 Hz, J3,4 = 3.1 Hz, J3,P = 8.5 Hz, Gal-3), 4.14 (d, 1H, Gal-4), 4.03 (dd, 1H, Gal-2), 4.03 (m, 1H, Rbo-5a), 3.92 (m, 3H, Rbo-4, 5b, 1/2OCH 2CH2N), 3.83 (m, 3H, Rbo-2, OCH 2CH2C=O), 3.78 (m, 3H, Rbo-1a, Gal-6ab), 3.72 (m, 4H, Rbo-3, Gal-5, 1/2OCH 2CH2N), 3.64 (dd, 1H, J1a,1b = 11.9 Hz, J1b,2 = 7.1 Hz, Rbo-1b), 3.38 (m, 2H, NCH2), 2.88 (t, 1H, J = 2.31 Hz, C≡CH), 2.54 (m, 2H, CH2C=O), 2.05 (s, 3H, NAc). 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (tert-BuOH = 31.1 ppm): 176.23, 175.36 [2NHC=O], 102.88 (Gal-1), 76.74 (d, 2JCOP = 6.6 Hz, Gal-3), 76.24 (Rbo-3), 73.57 (Rbo-2), 73.17 (Gal-5), 72.45 (d, 3JCCOP= 7.1 Hz, Rbo-4), 71.26 (C≡CH), 69.66 (OCH2CH2N), 68.46 (Gal-4), 68.10 (d, 2JCOP= 5.1 Hz, Rbo-5), 67.39 (OCH2CH2C=O), 63.81 (Rbo-1), 62.45 (Gal-6), 59.33 (C≡CH), 52.79 (d, 3JCCOP= 6.8 Hz, Gal-2), 40.88 (NCH2), 37.39 (CH2C=O), 23.92 (NCOCH3).
HRMS: m/zcalcd for C21H36N2O15P [M-Na-], 587.1858; found, 587.1865.
O-[2-N-(4,7,10,13,16-ペンタオキサ-ノナデカ-18-インアミドエチル2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド) 3-(D-リビト-5-イルトリエチルアンモニウムホスフェート)（13X）
CH3CN（0.2 mL）中のプロパルギル-PEG4-NHSエステル（15.5 mg, 38.6μmol）を、0.1% Et3N（0.5 mL）中の13a（10.2 mg, 15.9μmol）の溶液に加え、室温で撹拌した。2時間後および18時間後にそれぞれさらなる0.1% Et3N（0.1 mL×2）を加えた。反応混合物を揮発させ、残渣をゲル濾過カラム（LH-20, 1% Et3N）に供して、収率94%で13X（13.0 mg, 15.0μmol）を得た。Rf 0.60（3:2:1 EtOAc:MeOH:H2O（5%Et3N含有））。
[α]D -5.9° (c 0.95, H2O), 1H NMR δH (600 MHz, D2O) (tert-BuOH = 1.23 ppm): 4.53 (d, 1H, J1,2 = 8.5 Hz, Gal-1), 4.23 (m, 2H, CH 2C≡), 4.17 (ddd, 1H, J2,3 = 10.4 Hz, J3,4 = 3.1 Hz, J3,P = 8.6 Hz, Gal-3), 4.14 (d, 1H, Gal-4), 4.03 (dd, 1H, Gal-2), 4.03 (m, 1H, Rbo-5a), 3.92 (m, 3H, Rbo-4, 5b, 1/2OCH 2CH2N), 3.83 (m, 1H, Rbo-2), 3.78 (m, 2H, OCH 2CH2C=O), 3.75 (m, 1H, 1/2OCH 2CH2N), 3.73-3.67 (m, 21H, Rbo-1a, 3, Gal-5, 6ab, 8OCH2), 3.64 (dd, 1H, J1a,1b = 11.8 Hz, J1b,2 = 7.1 Hz, Rbo-1b), 3.38 (m, 2H, NCH2), 2.88 (t, 1H, J= 2.43 Hz, C≡CH), 3.19 [q, 6H, J = 7.3 Hz, 3NCH2 (Et3N)], 2.53 (m, 2H, CH2C=O), 2.04 (s, 3H, NAc), 1.27 [t, 9H, J= 7.3 Hz, 3CH3 (Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (tert-BuOH = 31.1 ppm):176.16, 175.53 [2NHC=O], 102.88 (Gal-1), 76.74 (d, 2JCOP= 5.5 Hz, Gal-3), 76.24 (Rbo-3), 73.57 (Rbo-2), 73.17 (Gal-5), 72.44 (d, 3JCCOP = 7.6 Hz, Rbo-4), 71.24, 71.09, 71.06, 71.04, 71.00, 70.93 (OCH2), 70.16 (C≡CH), 69.62 (OCH2CH2N), 68.45 (Gal-4), 68.22(OCH2CH2C=O), 68.09 (d, 2JCOP= 5.5 Hz, Rbo-5), 63.81 (Rbo-1), 62.45 (Gal-6), 59.39 (C≡CH), 52.77 (d, 3JCCOP = 6.2 Hz, Gal-2), 48.18 [CH2(Et)], 40.84 (NCH2), 37.47 (CH2C=O), 23.91 (NCOCH3). 9.73 [CH3 (Et)].
HRMS: m/zcalcd for C29H52N2O19P [M-Et3NH-], 763.2907; found, 763.2969.
CH3CN（0.2 mL）中のプロパルギル-PEG4-NHSエステル（15.5 mg, 38.6μmol）を、0.1% Et3N（0.5 mL）中の13a（10.2 mg, 15.9μmol）の溶液に加え、室温で撹拌した。2時間後および18時間後にそれぞれさらなる0.1% Et3N（0.1 mL×2）を加えた。反応混合物を揮発させ、残渣をゲル濾過カラム（LH-20, 1% Et3N）に供して、収率94%で13X（13.0 mg, 15.0μmol）を得た。Rf 0.60（3:2:1 EtOAc:MeOH:H2O（5%Et3N含有））。
[α]D -5.9° (c 0.95, H2O), 1H NMR δH (600 MHz, D2O) (tert-BuOH = 1.23 ppm): 4.53 (d, 1H, J1,2 = 8.5 Hz, Gal-1), 4.23 (m, 2H, CH 2C≡), 4.17 (ddd, 1H, J2,3 = 10.4 Hz, J3,4 = 3.1 Hz, J3,P = 8.6 Hz, Gal-3), 4.14 (d, 1H, Gal-4), 4.03 (dd, 1H, Gal-2), 4.03 (m, 1H, Rbo-5a), 3.92 (m, 3H, Rbo-4, 5b, 1/2OCH 2CH2N), 3.83 (m, 1H, Rbo-2), 3.78 (m, 2H, OCH 2CH2C=O), 3.75 (m, 1H, 1/2OCH 2CH2N), 3.73-3.67 (m, 21H, Rbo-1a, 3, Gal-5, 6ab, 8OCH2), 3.64 (dd, 1H, J1a,1b = 11.8 Hz, J1b,2 = 7.1 Hz, Rbo-1b), 3.38 (m, 2H, NCH2), 2.88 (t, 1H, J= 2.43 Hz, C≡CH), 3.19 [q, 6H, J = 7.3 Hz, 3NCH2 (Et3N)], 2.53 (m, 2H, CH2C=O), 2.04 (s, 3H, NAc), 1.27 [t, 9H, J= 7.3 Hz, 3CH3 (Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (tert-BuOH = 31.1 ppm):176.16, 175.53 [2NHC=O], 102.88 (Gal-1), 76.74 (d, 2JCOP= 5.5 Hz, Gal-3), 76.24 (Rbo-3), 73.57 (Rbo-2), 73.17 (Gal-5), 72.44 (d, 3JCCOP = 7.6 Hz, Rbo-4), 71.24, 71.09, 71.06, 71.04, 71.00, 70.93 (OCH2), 70.16 (C≡CH), 69.62 (OCH2CH2N), 68.45 (Gal-4), 68.22(OCH2CH2C=O), 68.09 (d, 2JCOP= 5.5 Hz, Rbo-5), 63.81 (Rbo-1), 62.45 (Gal-6), 59.39 (C≡CH), 52.77 (d, 3JCCOP = 6.2 Hz, Gal-2), 48.18 [CH2(Et)], 40.84 (NCH2), 37.47 (CH2C=O), 23.91 (NCOCH3). 9.73 [CH3 (Et)].
HRMS: m/zcalcd for C29H52N2O19P [M-Et3NH-], 763.2907; found, 763.2969.
O-[2-N-(ベンジルオキシカルボニル)アミノエチル2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド] 3-[1-(1-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2,3,4-トリ-O-ベンジル-D-リビト-5-イル トリエチルアンモニウムホスホリル)-2,3,4-トリ-O-ベンジル-D-リビト-5-イルトリエチルアンモニウムホスフェート]（15）
3（32.0 mg, 38.7μmol）および11（34.6 mg, 32.8μmol）の混合物について、ピリジンを用いた共沸を三回行い、真空乾燥させ、それからピリジン（1 mL）で希釈した。この溶液にPivCl（2.4μL）を加えて室温で撹拌し、1時間後にさらなるPivCl（2.4μL）を加えた。3.5時間後に反応物をCHCl3で希釈し、1 M Et3NH2CO3でクエンチした。反応混合物をCHCl3で抽出した。有機相を1 M Et3NH2CO3で洗浄した。残渣をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して、粗製物（14）を得た（51.5 mg）。Rf 0.67（10:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））。1H NMRはジアステレオマーの2つ別個のピークを示した。
1H NMR δH (600 MHz, CDCl3) (selected): 12.38 (br, 1H, NH +Et3), 7.64-7.60 (m, 4H, Ar-H), 7.47 (m, 2H, Ar-H), 7.41-7.14 (m, 44H, Ar-H), 5.46, 5.45 (diastereomeric 2s, 1H, PhCH), 5.42 (m, 1H, NH), 5.10, 5.07 [ABq, 2H, J= 8.4 Hz, PhCH 2 (Z)], 4.79-4.56 (m, 12H, 6PhCH 2), 3.65 (m, 1H, 1/2OCH2), 3.42 (m, 2H, NCH2), 3.02, 3.00 (diastereomeric 2s, 1H, Gal-5),2.72 [m, 6H, 3NCH2 (Et3N)], 1.02 [m, 18H, 3CH3 (Et3N), tert-Bu]. HRMS: m/z calcd for C91H101N4O20P2Si [M-Et3NH-], 1659.6259, 1660.6292; found, 1659.6190, 1660.6222.
この化合物を、さらなる精製なしで次の反応に使用した。
3（32.0 mg, 38.7μmol）および11（34.6 mg, 32.8μmol）の混合物について、ピリジンを用いた共沸を三回行い、真空乾燥させ、それからピリジン（1 mL）で希釈した。この溶液にPivCl（2.4μL）を加えて室温で撹拌し、1時間後にさらなるPivCl（2.4μL）を加えた。3.5時間後に反応物をCHCl3で希釈し、1 M Et3NH2CO3でクエンチした。反応混合物をCHCl3で抽出した。有機相を1 M Et3NH2CO3で洗浄した。残渣をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して、粗製物（14）を得た（51.5 mg）。Rf 0.67（10:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））。1H NMRはジアステレオマーの2つ別個のピークを示した。
1H NMR δH (600 MHz, CDCl3) (selected): 12.38 (br, 1H, NH +Et3), 7.64-7.60 (m, 4H, Ar-H), 7.47 (m, 2H, Ar-H), 7.41-7.14 (m, 44H, Ar-H), 5.46, 5.45 (diastereomeric 2s, 1H, PhCH), 5.42 (m, 1H, NH), 5.10, 5.07 [ABq, 2H, J= 8.4 Hz, PhCH 2 (Z)], 4.79-4.56 (m, 12H, 6PhCH 2), 3.65 (m, 1H, 1/2OCH2), 3.42 (m, 2H, NCH2), 3.02, 3.00 (diastereomeric 2s, 1H, Gal-5),2.72 [m, 6H, 3NCH2 (Et3N)], 1.02 [m, 18H, 3CH3 (Et3N), tert-Bu]. HRMS: m/z calcd for C91H101N4O20P2Si [M-Et3NH-], 1659.6259, 1660.6292; found, 1659.6190, 1660.6222.
この化合物を、さらなる精製なしで次の反応に使用した。
粗製物（14）（51.5 mg）をピリジン（1 mL）で希釈した。この溶液に、ピリジン（1 mL）およびH2O（50μL）中のI2（25.2 mg, 99.3μmol）の溶液を加え、室温で1時間40分間撹拌した。反応物をCHCl3で希釈し1 M Na2S2O3でクエンチした。混合物をCHCl3で抽出した。有機相を1 M Et3NH2CO3で洗浄した。残渣をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して、2ステップに渡る57%の収率で15（35.4 mg, 18.8μmol）を得た。Rf 0.48（10:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））。[α]D+0.78° (c 0.77, CHCl3)。アクセプター（11）が43%の収率で回収された（14.8 mg）。
1H NMR δH (600 MHz, CDCl3) (selected): 7.64-7.08 (m, 50H, Ar-H), 5.44 (br, 2H, PhCH, NH), 5.11, [br, 2H, PhCH 2(Z)], 2.75 [brd, 12H, 6NCH2 (Et3N)], 1.03 [brs, 18H, 6CH3(Et3N)], 1.01 (s, 9H, tert-Bu).
HRMS: m/zcalcd for C91H100N4O21P2Si [(M-2Et3NH]2-], 837.3068, 837.8084; found, 837.3052, 837.8063.
1H NMR δH (600 MHz, CDCl3) (selected): 7.64-7.08 (m, 50H, Ar-H), 5.44 (br, 2H, PhCH, NH), 5.11, [br, 2H, PhCH 2(Z)], 2.75 [brd, 12H, 6NCH2 (Et3N)], 1.03 [brs, 18H, 6CH3(Et3N)], 1.01 (s, 9H, tert-Bu).
HRMS: m/zcalcd for C91H100N4O21P2Si [(M-2Et3NH]2-], 837.3068, 837.8084; found, 837.3052, 837.8063.
O-[2-N-(ベンジルオキシカルボニル)アミノエチル 2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド] 3-[1-(2,3,4-トリ-O-ベンジル-D-リビト-5-イル トリエチルアンモニウムホスホリル)-2,3,4-トリ-O-ベンジル-D-リビト-5-イルトリエチルアンモニウムホスフェート]（16）
化合物15（31.8 mg, 16.9μmol）をTHF（1.5 mL）で希釈した。これに、THF（100μL）中1 Mのn-Bu4NF溶液を加え、5日間撹拌した。溶液をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して、収率89%で16（24.6 mg, 14.9μmol）を得た。Rf 0.35 および 0.41（10:1 CHCl3:MeOH（1% AcOH含有））。1H NMR測定はTBDPS基の消失を示した。この化合物を、さらなる精製なく次の反応に使用した。
HRMS: m/zcalcd for C75H82N4O21P2[(M-2Et3NH)2-], 718.2479; found, 718.2492.
化合物15（31.8 mg, 16.9μmol）をTHF（1.5 mL）で希釈した。これに、THF（100μL）中1 Mのn-Bu4NF溶液を加え、5日間撹拌した。溶液をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して、収率89%で16（24.6 mg, 14.9μmol）を得た。Rf 0.35 および 0.41（10:1 CHCl3:MeOH（1% AcOH含有））。1H NMR測定はTBDPS基の消失を示した。この化合物を、さらなる精製なく次の反応に使用した。
HRMS: m/zcalcd for C75H82N4O21P2[(M-2Et3NH)2-], 718.2479; found, 718.2492.
O-(2-アセトアミドエチル2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド) 3-[1-(D-リビト-5-イル トリエチルアンモニウムホスホリル)-D-リビト-5-イルトリエチルアンモニウムホスフェート]（17）
化合物16（24.2 mg, 14.7μmol）を2-PrOH（3 mL）および H2O（0.3 mL）で希釈し、H2雰囲気下、カーボン担持PdおよびAcOH (1滴)の存在下で2日間撹拌した。H2O (1 mL)を反応混合物に加え、4日間反応を続けた。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をH2O（2 mL）で希釈した。この溶液にEt3N（5滴）およびAc2O（5滴）を加え、2.5時間撹拌した。反応混合物を揮発させ、残渣をゲル濾過（LH-20, 1% Et3N）に供した。回収した画分をH2O（1.5 mL）で希釈した。この溶液を、H2雰囲気下、カーボン担持PdおよびAcOH（1滴）の存在下で7日間撹拌した。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をゲル濾過（LH-20, 1% Et3N）に供して、3ステップにわたり収率84%で17（11.6 mg, 12.4μmol）を得た。Rf 0.36（3:2:1 EtOAc:MeOH:H2O（5% Et3N含有））, [α]D -23°(c 0.36, H2O)。
1H NMR δH (600 MHz, D2O) (DSS = 0 ppm): 4.53 (d, 1H, J1,2 = 8.4 Hz, Gal-1), 4.17 (ddd, 1H, J2,3 = 10.7 Hz, J3,4 = 3.0 Hz, J3,P = 8.4 Hz, Gal-3), 4.15 (d, 1H, Gal-4), 4.10-4.02 (m, 4H, Gal-2, Rbo1-1a, 5a, Rbo2-5a), 3.98-3.90 (m, 5H, Rbo1-1b, 4, 5b, Rbo2-4, 5b), 3.85 (m, 1H, Rbo2-2), 3.82-3.77 (m, 4H, Gal-6ab, Rbo2-1a, 1/2OCH2), 3.76-3.68 (m, 4H, Gal-5, Rbo1-3, Rbo2-3, 1/2OCH2), 3.65 (dd, 1H, J1a,1b = 12.0 Hz, J1a,2 = 7.0 Hz, Rbo2-1b), 3.36 (br, 2H, NCH2), 3.19 [br, 12H, 3NCH2 (Et3N)], 2.05, 1.99 (2s, 3Hx2, 2NAc), 1.27 [t, 18H, 6CH3 (Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (DSS = 0 ppm): 177.42, 176.88 (C=O), 104.13 (Gal-1), 77.91 (d, 2JCOP= 5.7 Hz, Gal-3), 77.47 (Rbo2-3), 74.79 (Rbo2-2), 74.44, 73.92 (Gal-5, Rbo1-2, 3), 73.70, 73,64, 73.59 (Rbo1-4, Rbo2-4), 70.85 (OCH2), 69.68 (Gal-4), 69.27, 69.24, 69.19, 69.15 (m, Rbo1-1, 5, Rbo2-5), 65.06 (Rbo2-1), 63.69 (Gal-6), 54.00 (d, 3JCCOP = 6.3 Hz, Gal-2), 49.43 [CH2 (Et)], 42.09 (NCH2CH2O), 25.99, 25.11 (NCOCH3), 10.95 [CH3 (Et)].
HRMS: m/zcalcd for C22H42N2O21P2[(M-2Et3NH)2-], 366.0883; found, 366.0866.
17はFKRP酵素による伸長反応産物をNMR同定するための参照構造として合成した。
化合物16（24.2 mg, 14.7μmol）を2-PrOH（3 mL）および H2O（0.3 mL）で希釈し、H2雰囲気下、カーボン担持PdおよびAcOH (1滴)の存在下で2日間撹拌した。H2O (1 mL)を反応混合物に加え、4日間反応を続けた。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をH2O（2 mL）で希釈した。この溶液にEt3N（5滴）およびAc2O（5滴）を加え、2.5時間撹拌した。反応混合物を揮発させ、残渣をゲル濾過（LH-20, 1% Et3N）に供した。回収した画分をH2O（1.5 mL）で希釈した。この溶液を、H2雰囲気下、カーボン担持PdおよびAcOH（1滴）の存在下で7日間撹拌した。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をゲル濾過（LH-20, 1% Et3N）に供して、3ステップにわたり収率84%で17（11.6 mg, 12.4μmol）を得た。Rf 0.36（3:2:1 EtOAc:MeOH:H2O（5% Et3N含有））, [α]D -23°(c 0.36, H2O)。
1H NMR δH (600 MHz, D2O) (DSS = 0 ppm): 4.53 (d, 1H, J1,2 = 8.4 Hz, Gal-1), 4.17 (ddd, 1H, J2,3 = 10.7 Hz, J3,4 = 3.0 Hz, J3,P = 8.4 Hz, Gal-3), 4.15 (d, 1H, Gal-4), 4.10-4.02 (m, 4H, Gal-2, Rbo1-1a, 5a, Rbo2-5a), 3.98-3.90 (m, 5H, Rbo1-1b, 4, 5b, Rbo2-4, 5b), 3.85 (m, 1H, Rbo2-2), 3.82-3.77 (m, 4H, Gal-6ab, Rbo2-1a, 1/2OCH2), 3.76-3.68 (m, 4H, Gal-5, Rbo1-3, Rbo2-3, 1/2OCH2), 3.65 (dd, 1H, J1a,1b = 12.0 Hz, J1a,2 = 7.0 Hz, Rbo2-1b), 3.36 (br, 2H, NCH2), 3.19 [br, 12H, 3NCH2 (Et3N)], 2.05, 1.99 (2s, 3Hx2, 2NAc), 1.27 [t, 18H, 6CH3 (Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (DSS = 0 ppm): 177.42, 176.88 (C=O), 104.13 (Gal-1), 77.91 (d, 2JCOP= 5.7 Hz, Gal-3), 77.47 (Rbo2-3), 74.79 (Rbo2-2), 74.44, 73.92 (Gal-5, Rbo1-2, 3), 73.70, 73,64, 73.59 (Rbo1-4, Rbo2-4), 70.85 (OCH2), 69.68 (Gal-4), 69.27, 69.24, 69.19, 69.15 (m, Rbo1-1, 5, Rbo2-5), 65.06 (Rbo2-1), 63.69 (Gal-6), 54.00 (d, 3JCCOP = 6.3 Hz, Gal-2), 49.43 [CH2 (Et)], 42.09 (NCH2CH2O), 25.99, 25.11 (NCOCH3), 10.95 [CH3 (Et)].
HRMS: m/zcalcd for C22H42N2O21P2[(M-2Et3NH)2-], 366.0883; found, 366.0866.
17はFKRP酵素による伸長反応産物をNMR同定するための参照構造として合成した。
2,3-ジ-O-ベンジル-1-O-tert-ブチルジフェニルシリル-4-O-(2,3,4-トリ-O-レブリノイル-β-D-キシロピラノシル)-D-リビトール5-(トリエチルアンモニウムホスフェート)（42）
CH3CN（1.6 mL）およびピリジン（1.6 mL）中の41（125.2 mg, 125.5μmol）の溶液に、2-クロロ-1,3,2-ベンゾジオキサホスホリン-4-オン（105.6 mg, 521.4μmol）を室温で2.5時間加えた。反応をCHCl3で希釈し1 M Et3NH2CO3でクエンチした。この混合物をCHCl3で抽出した。有機相を1 M Et3NH2CO3で洗浄し、通常の方法で処理した。残渣を、Silica Gel 60N（球状中性）カラムに供し（1:1 n-ヘキサン:EtOAc-20:1 EtOAc:MeOH-20:1-8:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））、42（87.7 mg, 75.4μmol）を収率60%で得た。
1H NMR δH (600 MHz, CDCl3) (selected): 12.33 (br, 1H, NH +Et3), 7.70-7.63 (m, 6H, Ar-H), 7.41-7.16 (m, 14H, Ar-H), 5.19 (brt, 1H, J= 9.5 Hz, Xyl-3), 4.99 (dd, 1H, J1,2 = 7.7 Hz, J2,3 = 9.7 Hz, Xyl-2), 4.95 (brdt, 1H, J = 5.6 Hz, J = 9.6 Hz, Xyl-4), 4.77 (d, 1H, Xyl-1), 4.72, 4.53 (ABq, 2H, J = 11.2 Hz, PhCH 2), 4.67, 4.52 (ABq, 2H, J = 11.7 Hz, PhCH 2), 4.29 (m, 1H, Rbo-5a), 4.01 (m, 1H, Rbo-5b), 3.96 (m, 1H, Xyl-5a), 3.26(dd, 1H, J4,5b = 10.0 Hz, J5a,5b = 11.6 Hz, Xyl-5b), 2.96 [m, 6H, 3NCH2 (Et3N)], 2.75 (m, 6H, Lev), 2.58 (m, 6H, Lev), 2.17, 2.14, 2.09 (3s, 9H,3COCH3), 1.23 [t, 9H, J = 7.3 Hz, 3CH3(Et3N)], 1.03 (s, 9H, tert-Bu).
HRMS: m/zcalcd for C55H68O17PSi [(M-Et3NH]2-],1059.3969; found, 1059.3988.
この化合物を、さらなる精製なく使用した。
CH3CN（1.6 mL）およびピリジン（1.6 mL）中の41（125.2 mg, 125.5μmol）の溶液に、2-クロロ-1,3,2-ベンゾジオキサホスホリン-4-オン（105.6 mg, 521.4μmol）を室温で2.5時間加えた。反応をCHCl3で希釈し1 M Et3NH2CO3でクエンチした。この混合物をCHCl3で抽出した。有機相を1 M Et3NH2CO3で洗浄し、通常の方法で処理した。残渣を、Silica Gel 60N（球状中性）カラムに供し（1:1 n-ヘキサン:EtOAc-20:1 EtOAc:MeOH-20:1-8:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））、42（87.7 mg, 75.4μmol）を収率60%で得た。
1H NMR δH (600 MHz, CDCl3) (selected): 12.33 (br, 1H, NH +Et3), 7.70-7.63 (m, 6H, Ar-H), 7.41-7.16 (m, 14H, Ar-H), 5.19 (brt, 1H, J= 9.5 Hz, Xyl-3), 4.99 (dd, 1H, J1,2 = 7.7 Hz, J2,3 = 9.7 Hz, Xyl-2), 4.95 (brdt, 1H, J = 5.6 Hz, J = 9.6 Hz, Xyl-4), 4.77 (d, 1H, Xyl-1), 4.72, 4.53 (ABq, 2H, J = 11.2 Hz, PhCH 2), 4.67, 4.52 (ABq, 2H, J = 11.7 Hz, PhCH 2), 4.29 (m, 1H, Rbo-5a), 4.01 (m, 1H, Rbo-5b), 3.96 (m, 1H, Xyl-5a), 3.26(dd, 1H, J4,5b = 10.0 Hz, J5a,5b = 11.6 Hz, Xyl-5b), 2.96 [m, 6H, 3NCH2 (Et3N)], 2.75 (m, 6H, Lev), 2.58 (m, 6H, Lev), 2.17, 2.14, 2.09 (3s, 9H,3COCH3), 1.23 [t, 9H, J = 7.3 Hz, 3CH3(Et3N)], 1.03 (s, 9H, tert-Bu).
HRMS: m/zcalcd for C55H68O17PSi [(M-Et3NH]2-],1059.3969; found, 1059.3988.
この化合物を、さらなる精製なく使用した。
O-[2-N-(ベンジルオキシカルボニル)アミノエチル 2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド] 3-{1-[1-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2,3-ジ-O-ベンジル-4-O-(2,3,4-トリ-O-レブリノイル-β-D-キシロピラノシル)-D-リビト-5-イルホスホリル]-2,3,4-トリ-O-ベンジル-D-リビト-5-イルトリエチルアンモニウムホスフェート}（43）
42（79.8 mg, 68.7μmol）と11（84.0 mg, 79.5μmol）の混合物について、ピリジンを用いた共沸を二度行い、真空乾燥させ、そしてピリジン（2 mL）で希釈した。この溶液にPivCl（4.4μL）を加えて室温で撹拌し、40および90分後にそれぞれ追加のPivCl（4.4μL×2）を加えた。1時間後に反応物をCHCl3により希釈し、1 M Et3NH2CO3でクエンチした。混合物をCHCl3で抽出した。有機相を通常の手法で処理した。残渣をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して43（22.0 mg）を取得し、42と11（134.8 mg）は回収して同様に再カップリングを行い、43（17.0 mg）を得た。43の合計収率は27%であった。Rf 0.59（10:1 CHCl3:MeOH（5% AcOH含有））。1H NMRはジアステレオマーの2つ別個のピークを示した。
HRMS: m/zcalcd for C104H121N4O30P2Si [M-Et3NH-],1995.7316; found, 1995.7297.
この化合物を、さらなる精製なく使用した。
42（79.8 mg, 68.7μmol）と11（84.0 mg, 79.5μmol）の混合物について、ピリジンを用いた共沸を二度行い、真空乾燥させ、そしてピリジン（2 mL）で希釈した。この溶液にPivCl（4.4μL）を加えて室温で撹拌し、40および90分後にそれぞれ追加のPivCl（4.4μL×2）を加えた。1時間後に反応物をCHCl3により希釈し、1 M Et3NH2CO3でクエンチした。混合物をCHCl3で抽出した。有機相を通常の手法で処理した。残渣をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して43（22.0 mg）を取得し、42と11（134.8 mg）は回収して同様に再カップリングを行い、43（17.0 mg）を得た。43の合計収率は27%であった。Rf 0.59（10:1 CHCl3:MeOH（5% AcOH含有））。1H NMRはジアステレオマーの2つ別個のピークを示した。
HRMS: m/zcalcd for C104H121N4O30P2Si [M-Et3NH-],1995.7316; found, 1995.7297.
この化合物を、さらなる精製なく使用した。
O-[2-N-(ベンジルオキシカルボニル)アミノエチル 2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド] 3-{1-[1-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2,3-ジ-O-ベンジル-4-O-(2,3,4-トリ-O-レブリノイル-β-D-キシロピラノシル)-D-リビト-5-イル トリエチルアンモニウムホスファニル]-2,3,4-トリ-O-ベンジル-D-リビト-5-イルトリエチルアンモニウムホスフェート}（44）
化合物43（36.4 mg, 17.2μmol）をピリジン（0.6 mL）で希釈した。この溶液に、ピリジン（0.7 mL）およびH2O（0.03 mL）中のI2（13.0 mg, 51.2μmol）の溶液を加え、室温で撹拌した。2.5時間後に同じI2溶液を加えた（0.3 mL）。1時間後に反応物をCHCl3で希釈し1 M Na2S2O3でクエンチした。混合物をCHCl3で抽出した。有機相を1 M Na2S2O3および1 M Et3NH2CO3で洗浄した。残渣をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して、95%の収率で44（36.6 mg, 16.4μmol）を得た。Rf 0.29（10:1 CHCl3:MeOH（5% AcOH含有））。この化合物を、さらなる精製なく使用した。
1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 12.26 (br, 1H, NH +Et3), 7.63-7.62 (m, 4H, Ar-H), 7.46-7.45 (m, 2H, Ar-H), 7.39-7.15 (m, 39H, Ar-H), 5.44 (brs, 2H, PhCH, NH), 5.18 (t, 1H, J2,3 = J3,4 = 9.5 Hz, Xyl-3), 5.10, 5.07 [ABq, 2H, J = 12.4 Hz, PhCH 2 (Z)], 4.99 (dd, 1H, J1,2 = 7.7 Hz, Xyl-2), 4.95 (dt, 1H, J3,4 = J4,5a = 9.5 Hz, J4,5e = 4.8 Hz, Xyl-4), 4.81 (d, 1H, Xyl-1), 4.72-4.49 (m, 10H, 5PhCH 2), 4.32 (m, 3H, Rbo1-5a, Rbo2-4, 5a), 4.19 (m, 1H, Rbo1-1a), 4.15 (m, 1H, Rbo1-5b), 4.13 (m, 1H, Gal-1), 4.10 (m, 1H, Gal-6a), 4.09 (m, 1H, Gal-3), 5.05 (m, 2H, Rbo1-1b, Rbo2-5b), 3.95 (m, 5H, Gal-4, Rbo1-2, 3, 4, Rbo2-3), 3.91 (m, 1H, Xyl-5e), 3.90 (m, 2H, 1/2OCH2), 3.80 (m, 2H, Gal-6b, Rbo2-1a), 3.75 (m, 1H, Rbo2-1b), 3.71 (m, 1H, Gal-2), 3.65 (m, 2H, 1/2OCH2), 3.59 (m, 1H, Rbo2-2), 3.42 (m, 2H, NCH2), 3.21 (dd, 1H, J5a,5b = 11.5 Hz, Xyl-5a), 3.06 (br, 1H, Gal-5), 2.76 [m, 18H, 6CH2 (Lev), 3NCH2 (Et3N)], 2.56 (m, 6H, 3Lev), 2.17, 2.13, 2.01 (3s, 9H,3COCH3), 1.05 [t, 18H, J = 7.3 Hz, 6CH3(Et3N)], 1.02 (s, 9H, tert-Bu). 13C NMR δC (150 MHz, CDCl3):207.07, 206.55, 206.46 (CH3 C=O), 171.83, 171.71, 171.68 [OC=O (Lev)], 139.00, 138.87, 138.75, 138.13, 136.68 [C (q)], 135.74, 135.62, 133.62, 133.33, 129.51, 129.04, 128.94, 128.85, 128.64, 128.46, 128.41, 128.318, 128.13, 128.09, 128.04, 127.97, 127.85, 127.75, 127.60, 127.56, 127.49, 127.31, 127.21, 127.11, 126.52 (Ar), 102.21 (Gal-1), 101.31 (Xyl-1), 100.91 (PhCH), 79.42 (Rbo2-4), 79.23 (m, Gal-4), 79.06 (Rbo1-2,3,4, Rbo2-2,3), 73.84, 73.75, 73.75 (3PhCH2), 73.57 (m, Gal-3), 72.35, 72.02 (2PhCH2), 71.81 (Xyl-3), 71.22 (Xyl-2), 69.41 (OCH2), 69.25 (Xyl-4), 68.86 (Gal-6), 66.58 [PhCH2 (Z)], 66.36 (Gal-5), 65.6, 64.7, 64.6 (Rbo1-1, 5, Rbo2-5), 63.06 (Rbo2-1), 62.36 (Xyl-5), 62.29 (d, 3JCCOP = 7.3 Hz, Gal-2), 45.20 [CH2 (Et)], 41.03 (NCH2), 37.83, 37.78 [CH2(Lev)], 29.76, 29.68, 29.65 [3COCH3 (Lev)], 27.94, 27.87, 27.82 [CH2 (Lev)], 26.82 [CH3 (tert-Bu)], 19.19 [C (q)(tert-Bu)], 8.28 [CH3 (Et)].
HRMS: m/zcalcd for C104H120N4O31P2Si [(M-2Et3NH)2-],1005.8613; found, 1005.8630.
化合物43（36.4 mg, 17.2μmol）をピリジン（0.6 mL）で希釈した。この溶液に、ピリジン（0.7 mL）およびH2O（0.03 mL）中のI2（13.0 mg, 51.2μmol）の溶液を加え、室温で撹拌した。2.5時間後に同じI2溶液を加えた（0.3 mL）。1時間後に反応物をCHCl3で希釈し1 M Na2S2O3でクエンチした。混合物をCHCl3で抽出した。有機相を1 M Na2S2O3および1 M Et3NH2CO3で洗浄した。残渣をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して、95%の収率で44（36.6 mg, 16.4μmol）を得た。Rf 0.29（10:1 CHCl3:MeOH（5% AcOH含有））。この化合物を、さらなる精製なく使用した。
1H NMR δH (600 MHz, CDCl3): 12.26 (br, 1H, NH +Et3), 7.63-7.62 (m, 4H, Ar-H), 7.46-7.45 (m, 2H, Ar-H), 7.39-7.15 (m, 39H, Ar-H), 5.44 (brs, 2H, PhCH, NH), 5.18 (t, 1H, J2,3 = J3,4 = 9.5 Hz, Xyl-3), 5.10, 5.07 [ABq, 2H, J = 12.4 Hz, PhCH 2 (Z)], 4.99 (dd, 1H, J1,2 = 7.7 Hz, Xyl-2), 4.95 (dt, 1H, J3,4 = J4,5a = 9.5 Hz, J4,5e = 4.8 Hz, Xyl-4), 4.81 (d, 1H, Xyl-1), 4.72-4.49 (m, 10H, 5PhCH 2), 4.32 (m, 3H, Rbo1-5a, Rbo2-4, 5a), 4.19 (m, 1H, Rbo1-1a), 4.15 (m, 1H, Rbo1-5b), 4.13 (m, 1H, Gal-1), 4.10 (m, 1H, Gal-6a), 4.09 (m, 1H, Gal-3), 5.05 (m, 2H, Rbo1-1b, Rbo2-5b), 3.95 (m, 5H, Gal-4, Rbo1-2, 3, 4, Rbo2-3), 3.91 (m, 1H, Xyl-5e), 3.90 (m, 2H, 1/2OCH2), 3.80 (m, 2H, Gal-6b, Rbo2-1a), 3.75 (m, 1H, Rbo2-1b), 3.71 (m, 1H, Gal-2), 3.65 (m, 2H, 1/2OCH2), 3.59 (m, 1H, Rbo2-2), 3.42 (m, 2H, NCH2), 3.21 (dd, 1H, J5a,5b = 11.5 Hz, Xyl-5a), 3.06 (br, 1H, Gal-5), 2.76 [m, 18H, 6CH2 (Lev), 3NCH2 (Et3N)], 2.56 (m, 6H, 3Lev), 2.17, 2.13, 2.01 (3s, 9H,3COCH3), 1.05 [t, 18H, J = 7.3 Hz, 6CH3(Et3N)], 1.02 (s, 9H, tert-Bu). 13C NMR δC (150 MHz, CDCl3):207.07, 206.55, 206.46 (CH3 C=O), 171.83, 171.71, 171.68 [OC=O (Lev)], 139.00, 138.87, 138.75, 138.13, 136.68 [C (q)], 135.74, 135.62, 133.62, 133.33, 129.51, 129.04, 128.94, 128.85, 128.64, 128.46, 128.41, 128.318, 128.13, 128.09, 128.04, 127.97, 127.85, 127.75, 127.60, 127.56, 127.49, 127.31, 127.21, 127.11, 126.52 (Ar), 102.21 (Gal-1), 101.31 (Xyl-1), 100.91 (PhCH), 79.42 (Rbo2-4), 79.23 (m, Gal-4), 79.06 (Rbo1-2,3,4, Rbo2-2,3), 73.84, 73.75, 73.75 (3PhCH2), 73.57 (m, Gal-3), 72.35, 72.02 (2PhCH2), 71.81 (Xyl-3), 71.22 (Xyl-2), 69.41 (OCH2), 69.25 (Xyl-4), 68.86 (Gal-6), 66.58 [PhCH2 (Z)], 66.36 (Gal-5), 65.6, 64.7, 64.6 (Rbo1-1, 5, Rbo2-5), 63.06 (Rbo2-1), 62.36 (Xyl-5), 62.29 (d, 3JCCOP = 7.3 Hz, Gal-2), 45.20 [CH2 (Et)], 41.03 (NCH2), 37.83, 37.78 [CH2(Lev)], 29.76, 29.68, 29.65 [3COCH3 (Lev)], 27.94, 27.87, 27.82 [CH2 (Lev)], 26.82 [CH3 (tert-Bu)], 19.19 [C (q)(tert-Bu)], 8.28 [CH3 (Et)].
HRMS: m/zcalcd for C104H120N4O31P2Si [(M-2Et3NH)2-],1005.8613; found, 1005.8630.
O-[2-N-(2-アセトアミドエチル2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド] 3-[1-(4-O-β-D-キシロピラノシル-D-リビト-5-イル トリエチルアンモニウムホスファニル)-D-リビト-5-イルトリエチルアンモニウムホスフェート]（46）
化合物44（36.6 mg, 16.4μmol）をTHF（1.5 mL）で希釈した。これに、THF（100μL）中1 Mのn-Bu4NF溶液を加え、3日間撹拌した。THF（100μL）中のさらなる1 M n-Bu4NFを加えた。反応をさらに7日間続けた後、溶液をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して、収率88%で45（24.2 mg, 14.4μmol）得たが、その1H NMRはTBDPSとLevの消失を示した。Rf 0.14（8:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））。この化合物を、さらなる精製なく使用した。
HRMS: m/zcalcd for C73H84N2O25P2[(M-2Et3NH]2-], 739.2455; found, 739.2473.
化合物44（36.6 mg, 16.4μmol）をTHF（1.5 mL）で希釈した。これに、THF（100μL）中1 Mのn-Bu4NF溶液を加え、3日間撹拌した。THF（100μL）中のさらなる1 M n-Bu4NFを加えた。反応をさらに7日間続けた後、溶液をゲル濾過カラム（LH-20, 1:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））に供して、収率88%で45（24.2 mg, 14.4μmol）得たが、その1H NMRはTBDPSとLevの消失を示した。Rf 0.14（8:1 CHCl3:MeOH（1% Et3N含有））。この化合物を、さらなる精製なく使用した。
HRMS: m/zcalcd for C73H84N2O25P2[(M-2Et3NH]2-], 739.2455; found, 739.2473.
化合物45（21.4 mg, 12.7μmol）を、2-PrOH（2 mL）および H2O（0.5 mL）で希釈し、H2雰囲気下、カーボン担持Pdの存在下で1日間撹拌した。H2O（1.5 mL）を反応混合物に加え、1日間反応を続けた。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をH2O（2 mL）で希釈した。この溶液にAc2O（5滴）を加え、3時間撹拌した。反応混合物を揮発させ、残渣をゲル濾過（LH-20, 1% Et3N）に供した。回収した画分をH2O（2.5 mL）で希釈した。この溶液を、H2雰囲気下、カーボン担持Pdの存在下で5日間撹拌した。Celite上で不溶物を除去した。減圧下で揮発物を除去し、残渣をBondElut（登録商標）C8（H2O）に供して非アセチル化化合物（6.5 mg）を得、それをH2O（1.5 mL）に希釈して、アセチル化条件（3滴のAc2OおよびEt3N）に晒して1日撹拌した。減圧下で揮発物を除去した。ゲル濾過（LH-20, 1% Et3N）による精製で、46（6.9 mg, 6.5μmol）が4ステップにわたり51%の収率で得られた。Rf 0.37（3:2:1 EtOAc:MeOH:H2O（5% Et3N含有）, [α]D +3.9°(c 0.69, H2O)。
1H NMR δH (600 MHz, D2O) (tert-BuOH = 1.23 ppm): 4.61 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, Xyl-1), 4.52 (d, 1H, J1,2 = 8.5 Hz, Gal-1), 4.17 (ddd, 1H, J2,3 = 10.9 Hz, J3,4 = 3.0 Hz, J3,P = 5.7 Hz, Gal-3), 4.15 (s, 1H, Gal-4), 4.14 (m, 2H, Rbo2-4, 5a), 4.08-4.02 (m, 4H, Gal-2, Rbo1-1a, 5a, Rbo2-5b), 3.99-3.89 (m, 6H, Xyl-5e, Rbo1-1b, 2, 4, 5b, 1/2OCH2), 3.86 (dd, 1H, J= 7.1, 4.7 Hz, Rbo2-3), 3.82-3.75 (m, 5H, Gal-6ab, Rbo1-3, Rbo2-1a, 2), 3.73-3.69 (m, 2H, Gal-5, 1/2OCH2), 3.63-3.58 (m, 2H, Xyl-4, Rbo2-1b), 3.45 (t, 1H, J2,3 = J3,4 = 9.2 Hz, Xyl-3), 3.35 (m, 2H, NCH2), 3.31 (brt, 1H, J = 11.1 Hz, Xyl-5e), 3.29 (dd, 1H, Xyl-2), 3.18 [q, 12H, J = 7.3 Hz, 6NCH2(Et3N)], 2.04, 1.98 (2s, 3Hx2, 2NAc), 1.26 [t, 18H, 6CH3(Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (DSS = 0 ppm):177.41, 176.87 (C=O), 105.63 (Xyl-1), 104.13 (Gal-1), 81.65 (d, 3JCCOP= 7.1 Hz, Rbo2-4), 78.32 (Xyl-3), 77.90 (d, 2JCOP= 6.0 Hz, Gal-3), 77.47 (Gal-5), 75.92 (Xyl-2), 74.34, 74.31 (Rbo1-2, Rbo2-3), 73.93 (Rbo1-3), 73.62 (Rbo1-4), 72.04 (Xyl-4), 70.84 (OCH2), 69.68 (Gal-4), 69.26, 69.22 (Rbo1-1, 5), 67.84 (Xyl-5), 67.15 (Rbo2-1), 63.69 (Gal-6), 54.00 (d, 3JCCOP= 6.5 Hz, Gal-2), 49.43 [CH2 (Et)], 42.09 (NCH2CH2O), 25.11, 24.58 (2NCOCH3), 10.94 [CH3 (Et)].
HRMS: m/zcalcd for C27H50N2O25P2[(M-2Et3NH]2-],432.1094; found, 432.1101.
46はRXYLT1酵素による伸長反応産物をNMR同定するための参照構造として合成した。
1H NMR δH (600 MHz, D2O) (tert-BuOH = 1.23 ppm): 4.61 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, Xyl-1), 4.52 (d, 1H, J1,2 = 8.5 Hz, Gal-1), 4.17 (ddd, 1H, J2,3 = 10.9 Hz, J3,4 = 3.0 Hz, J3,P = 5.7 Hz, Gal-3), 4.15 (s, 1H, Gal-4), 4.14 (m, 2H, Rbo2-4, 5a), 4.08-4.02 (m, 4H, Gal-2, Rbo1-1a, 5a, Rbo2-5b), 3.99-3.89 (m, 6H, Xyl-5e, Rbo1-1b, 2, 4, 5b, 1/2OCH2), 3.86 (dd, 1H, J= 7.1, 4.7 Hz, Rbo2-3), 3.82-3.75 (m, 5H, Gal-6ab, Rbo1-3, Rbo2-1a, 2), 3.73-3.69 (m, 2H, Gal-5, 1/2OCH2), 3.63-3.58 (m, 2H, Xyl-4, Rbo2-1b), 3.45 (t, 1H, J2,3 = J3,4 = 9.2 Hz, Xyl-3), 3.35 (m, 2H, NCH2), 3.31 (brt, 1H, J = 11.1 Hz, Xyl-5e), 3.29 (dd, 1H, Xyl-2), 3.18 [q, 12H, J = 7.3 Hz, 6NCH2(Et3N)], 2.04, 1.98 (2s, 3Hx2, 2NAc), 1.26 [t, 18H, 6CH3(Et3N)]. 13C NMR δC (150 MHz, D2O) (DSS = 0 ppm):177.41, 176.87 (C=O), 105.63 (Xyl-1), 104.13 (Gal-1), 81.65 (d, 3JCCOP= 7.1 Hz, Rbo2-4), 78.32 (Xyl-3), 77.90 (d, 2JCOP= 6.0 Hz, Gal-3), 77.47 (Gal-5), 75.92 (Xyl-2), 74.34, 74.31 (Rbo1-2, Rbo2-3), 73.93 (Rbo1-3), 73.62 (Rbo1-4), 72.04 (Xyl-4), 70.84 (OCH2), 69.68 (Gal-4), 69.26, 69.22 (Rbo1-1, 5), 67.84 (Xyl-5), 67.15 (Rbo2-1), 63.69 (Gal-6), 54.00 (d, 3JCCOP= 6.5 Hz, Gal-2), 49.43 [CH2 (Et)], 42.09 (NCH2CH2O), 25.11, 24.58 (2NCOCH3), 10.94 [CH3 (Et)].
HRMS: m/zcalcd for C27H50N2O25P2[(M-2Et3NH]2-],432.1094; found, 432.1101.
46はRXYLT1酵素による伸長反応産物をNMR同定するための参照構造として合成した。
［酵素による糖鎖伸長］
非特許文献１に記載されているのと本質的に同じようにして、各酵素をヒト細胞株HEK293Tで発現させ精製し、糖鎖伸長アッセイを行った。図６は、FKRP酵素およびグリコシルドナーであるCDP-リビトールを用いたアッセイにおいて、単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物13bが効率的な糖鎖伸長プライマーとなることを証明する実験を示す。HPLCプロファイルに見られるように、FKRP酵素の存在下（図中「FKRP(+)」）では、実質的に完全な糖鎖伸長反応すなわち13bプライマー末端へのRboPの転移が達成された。FKRP(+)で見られるピークがRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物18に対応することは、13bのピークからの分子量増加分がRboPの分子量に一致することを示す質量分析（TOF-MS）によっても確認されている（図示していない）。
13Yおよび13Xは、13bと比べてN-アセチルガラクトサミン環の1位に構造および長さが著しく異なる修飾を有しているが、いずれも、13bと同様に糖鎖伸長プライマーとして機能することが確認された（図７；実験手順は後述する図８と同じ）。
上記FKRP酵素アッセイの産物であるRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物（18）をプライマーとしてRXYLT1酵素アッセイ（UDPキシロースがドナー基質）を行い、その産物であるXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物（47）をプライマーとしてB4GAT1酵素アッセイ（UDPグルクロン酸がドナー基質）を行い、その産物であるGlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物をプライマーとしてLARGE1酵素アッセイ（UDPキシロースがドナー基質）を行った（図８）。図８の下パネルに示す実験では、放射性同位元素標識されたグリコシルドナー（UDP-[14C]XylまたはUDP-[14C]GlcA）を使用することで、反応産物（product）に転移された糖の量を定量測定している。酵素反応（37℃, 16 h）後、逆相（C18）カラムHPLCにて分離し、反応産物に対応する溶出画分の放射活性（β線）を液体シンチレーションカウンタにて測定した。いずれのアッセイの化合物も、糖鎖伸長プライマーとして高効率で機能したことがわかる。伸長後の分子量の増加分は、それぞれキシロース、グルクロン酸、およびキシロースの分子量と一致していた（TOF-MS分析；図示していない）。これらの実施例に例示されるように、天然の糖鎖伸長プロセスと比較して、「GlcNAc以前」の構造を欠く単離された糖鎖断片が、「第2のRboP以降」の糖鎖伸長をサポートできることが明らかになった。
そのことに関連して、図９の実験では、13bをプライマー（アクセプター基質）として変異型FKRP酵素による糖鎖伸長を調べた。非特許文献３では、根元のマンノースまでを含む糖鎖を有するαジストログリカン糖ペプチドを基質として使用した実験系において、当該マンノースのリン酸化を欠く基質に対してはFKRPは糖鎖伸長を行えないことが示されていた。非特許文献３はまた、このリン酸化されたマンノースを認識するH252およびK256残基に変異を有するFKRP（H252AおよびK256A変異体酵素）は、マンノースリン酸化された基質に対してであっても糖鎖伸長を行えないことを示していた。非特許文献３の開示とは対照的に、その同じH252AおよびK256A変異体酵素が、単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物である13bをプライマーとした場合には野生型酵素（図９ｂ）と同様に糖鎖伸長を行うことができた（図９ｃ、ｄ）。一方、第1のRboPのリン酸を認識する触媒ドメイン中の残基R295が変異したR295A変異体は、13bから糖鎖伸長を行うことができなかった（図９ｅ）。
これら実施例の結果は、本開示の実施形態に係る単離された化合物が、著しく低分子量でコンパクトな構造でありながら効率的な糖鎖伸長プライマーを提供できることを示している。
Claims (10)
- 単離されたRbo5P-3GalNAcβ化合物であって、前記Rbo5Pはリビトール（Rbo）が5位においてリン酸（P）とリン酸エステル結合していることを表し、前記3GalNAcβは3位において前記リン酸（P）とリン酸エステル結合しているβ-N-アセチルガラクトサミン化合物を表す、化合物、またはその塩。
- 前記Rbo5P-3GalNAcβ化合物が、下記式(I)で表される構造を有し、
ここで、Rは水素原子、p-NO2PhCO-、またはアルキニル-(PEG)-CO-であり、PEGは反復数1～24のポリエチレングリコールであり、R6は炭素数1～6のアルキレン基であり、R7は酸素原子、硫黄原子、または窒素原子である、
請求項１に記載の化合物またはその塩。 - 請求項１または２に記載の化合物またはその塩における前記リビトール（Rbo）の1位に、さらに第2のRbo5Pがリン酸エステル結合している、単離されたRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩。
- 請求項３に記載の化合物またはその塩における前記第2のRbo5Pの4位水酸基に、β-キシロースがグリコシド結合している、単離されたXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩。
- 請求項４に記載の化合物またはその塩における前記Xylの4位水酸基に、β-グルクロン酸がグリコシド結合している、単離されたGlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物またはその塩。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含む、糖鎖伸長用プライマー組成物。
- 請求項１または２に記載の化合物またはその塩を、CDPリビトールの存在下でFKRP酵素と混合することにより、前記Rbo5P-3GalNAcβ化合物のRboの1位に第2のRbo5Pをリン酸エステル結合させてRbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成することを含む、糖鎖伸長方法。
- （ａ）前記Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、UDPキシロースの存在下でRXYLT1酵素と混合することにより前記Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物における末端Rboの4位にキシロース（Xyl）をグリコシド結合させてXylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成すること、
および任意で、
（ｂ）工程ａで得られた前記Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、UDPグルクロン酸の存在下でB4GAT1酵素と混合することにより前記Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物におけるXylの4位にグルクロン酸（GlcA）をグリコシド結合させてGlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成すること、
および任意で、
（ｃ）工程ｂで得られた前記GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を、UDPキシロースの存在下でLARGE酵素と混合することにより前記GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物におけるGlcAの3位にキシロース（Xyl）をグリコシド結合させてXylα1-3GlcAβ1-4Xylβ1-4Rbo5P-1Rbo5P-3GalNAcβ化合物を生成すること
をさらに含む、請求項７に記載の糖鎖伸長方法。 - （１）2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物の3位の水酸基と、下記式(II)で表される構造
（式中、R1～R4は水酸基の保護基であり、OR5はホスホネート基である）
を有するリビトール誘導体のホスホネート基とを反応させて、前記ガラクトピラノシド化合物の3位と前記リビトール誘導体の5位とをホスホネート連結で連結すること、
（２）前記ホスホネート連結基を酸化してホスフェート連結基に変換すること、
（３）前記リビトール誘導体と連結された前記ガラクトピラノシド化合物の2位のアジド基をアセチルアミノ基に変換すること、および
（４）前記リビトール誘導体と連結された前記ガラクトピラノシド化合物の4,6位からベンジリデンを除去して4,6位にそれぞれ水酸基を露出させること
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の製造方法。 - 前記2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物は、1位水酸基の水素原子が-R6-NHZ基で置換されており、ここでR6は炭素数1～6のアルキレン基であり、Zはベンジルオキシカルボニル基であり、
前記方法は、
（０ａ）3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-D-ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート、HO-R6-NHZ、およびBF3・OEt2を反応させて、1位水酸基の水素原子が-R6-NHZ基で置換された3,4,6-トリ-O-アセチル-2-アジド-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物を得ること、および
（０ｂ）前記工程０ａで得られたガラクトピラノシド化合物のアセチル保護基を脱保護し、さらにベンズアルデヒドジメチルアセタールを反応させて4,6位水酸基をベンジリデン保護すること
を含む予備的方法により、前記工程（１）の2-アジド-4,6-O-ベンジリデン-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド化合物を調製することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
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