JP2023031123A - ホスホリパーゼｄ、及びコリン型プラズマローゲンの定量方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の課題は、コリン型プラズマローゲンに対する新たなホスホリパーゼＤを得ることである。【解決手段】（１－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（１－２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつグリセロール骨格のｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド；（１－３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、前記コリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド；のいずれか記載のポリペプチドを含む、ホスホリパーゼＤを調製する。【選択図】図３
Description
本発明はホスホリパーゼＤや、コリン型プラズマローゲンの定量方法や、発現ベクターや、前記発現ベクターを含有する形質転換体や、前記形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法に関する。
プラズマローゲンは抗酸化作用、イオン輸送、コレステロール排出等の機能を持ったリン脂質の一種である。コリン型プラズマローゲンは哺乳動物において主として心筋、筋肉に多く含まれており、さらに脳にも含まれている。
近年、プラズマローゲンがアルツハイマー型認知症や軽度認知障害（ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ：ＭＣＩ）の患者の脳において有意に減少していることや（非特許文献１、２参照）、アルツハイマー型認知症患者の血液中のプラズマローゲン濃度が低下していること（非特許文献３、４参照）が開示され、アルツハイマー型認知症とプラズマローゲンとの関係が注目されている。また、ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンの血中濃度と冠動脈疾患との関連が報告されるなど、コリン型プラズマローゲンと疾患との関係も注目されつつある（非特許文献５参照）。
こうした中、プラズマローゲンの測定に関する研究も進んできた。たとえば、（Ａ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量を、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定する工程、及び（Ｂ）（ｉ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量と、（ｉｉ）被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球に含まれるプラズマローゲン量とを比較する工程を含む、被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるかを判定するための検査方法（特許文献１参照）が提案されている。
また、ストレプトマイセス・エスピー由来のホスホリパーゼＤはリゾホスファチジルコリンやホスファチジルコリンに対する高いホスホリパーゼＤ活性を有するものの、コリン型プラズマローゲンに対するホスホリパーゼＤ活性の発見に基づきコリン型プラズマローゲンに作用してコリンを遊離させるホスホリパーゼＤとして提案されている（特許文献２参照）。
Guan Ｚ, et al., J Neuropathol Exp Neurol; 58(7):740-747 (1999)
Fujino et al., J Alzheimers Dis Parkinsonism; 2018,8(1) DOI: 10.4172/2161-0460.1000419
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Nishimukai et al., Clinica Chimica Acta; 437(1):147-154 （2014）
本発明の課題は、ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン（以下、「ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）」ともいう）に対する新たなホスホリパーゼＤを得ることである。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ストレプトマイセス グリセオフラバス（Streptomyces griseoflavus）に近縁のストレプトマイセス属Ａ７４６株由来のホスホリパーゼＤが、ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンに対して基質特異性が高いことを見いだした。また、かかるホスホリパーゼＤを用いれば、ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンを選択的に検出若しくは定量できることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
〔１〕以下の（１－１）～（１－３）のいずれか記載のポリペプチドを含む、ホスホリパーゼＤ。
（１－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（１－２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつグリセロール骨格のｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド；
（１－３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、前記コリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド；
〔２〕ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するホスホリパーゼＤであって、以下の（２－１）～（２－４）の性質を有するホスホリパーゼＤ。
（２－１）ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有する；
（２－２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により測定した分子量が３８，０００～５０，０００である；
（２－３）至適温度 ｐＨ７．２、２．５分の反応条件下で、４０～６０℃である；
（２－４）ストレプトマイセス属に属する微生物由来である；
〔３〕ストレプトマイセス グリセオフラバス（Streptomyces griseoflavus）、ストレプトマイセス グリセオルベンス（Streptomyces griseorubens）、又はストレプトマイセス グリセオインカルナタス（Streptomyces griseoincarnatus）に近縁の微生物由来であることを特徴とする、上記〔２〕記載のホスホリパーゼＤ。
〔４〕ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンを基質とした場合のリン酸エステル結合への加水分解活性を１００とした場合に、ｓｎ－２位にアラキドン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が１０以下、及びｓｎ－２位にドコサヘキサエン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が１０以下であることを特徴とする上記〔１〕～〔３〕のいずれか記載のホスホリパーゼＤ。
〔５〕試料と上記〔１〕～〔４〕のいずれか記載のホスホリパーゼＤとを作用させる工程を含むことを特徴とする、前記試料中のｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンの定量方法。
〔６〕上記〔１〕記載のホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
〔７〕上記〔６〕記載の発現ベクターを含有する形質転換体。
〔８〕上記〔７〕記載の形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法。
〔１〕以下の（１－１）～（１－３）のいずれか記載のポリペプチドを含む、ホスホリパーゼＤ。
（１－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（１－２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつグリセロール骨格のｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド；
（１－３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、前記コリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド；
〔２〕ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するホスホリパーゼＤであって、以下の（２－１）～（２－４）の性質を有するホスホリパーゼＤ。
（２－１）ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有する；
（２－２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により測定した分子量が３８，０００～５０，０００である；
（２－３）至適温度 ｐＨ７．２、２．５分の反応条件下で、４０～６０℃である；
（２－４）ストレプトマイセス属に属する微生物由来である；
〔３〕ストレプトマイセス グリセオフラバス（Streptomyces griseoflavus）、ストレプトマイセス グリセオルベンス（Streptomyces griseorubens）、又はストレプトマイセス グリセオインカルナタス（Streptomyces griseoincarnatus）に近縁の微生物由来であることを特徴とする、上記〔２〕記載のホスホリパーゼＤ。
〔４〕ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンを基質とした場合のリン酸エステル結合への加水分解活性を１００とした場合に、ｓｎ－２位にアラキドン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が１０以下、及びｓｎ－２位にドコサヘキサエン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が１０以下であることを特徴とする上記〔１〕～〔３〕のいずれか記載のホスホリパーゼＤ。
〔５〕試料と上記〔１〕～〔４〕のいずれか記載のホスホリパーゼＤとを作用させる工程を含むことを特徴とする、前記試料中のｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンの定量方法。
〔６〕上記〔１〕記載のホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
〔７〕上記〔６〕記載の発現ベクターを含有する形質転換体。
〔８〕上記〔７〕記載の形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法。
本発明のホスホリパーゼＤによりｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンを加水分解することが可能となる。
［ホスホリパーゼＤ］
本発明のホスホリパーゼＤ－（１）は、
（１－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（１－２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつグリセロール骨格のｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド；
（１－３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、前記コリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド；
の（１－１）～（１－３）のいずれか記載のポリペプチドを含むホスホリパーゼＤであり、以下、「本件ホスホリパーゼＤ－（１）」ともいう。
本発明のホスホリパーゼＤ－（１）は、
（１－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（１－２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつグリセロール骨格のｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド；
（１－３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、前記コリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド；
の（１－１）～（１－３）のいずれか記載のポリペプチドを含むホスホリパーゼＤであり、以下、「本件ホスホリパーゼＤ－（１）」ともいう。
本発明のホスホリパーゼＤ－（２）は、
（２－１）ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有する；
（２－２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により測定した分子量が３８，０００～５０，０００である；
（２－３）至適温度 ｐＨ７．２、２．５分の反応条件下で、４０～６０℃である；
（２－４）ストレプトマイセス属に属する微生物由来である；
の（２－１）～（２－４）の性質を有し、ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するホスホリパーゼＤであり、以下、「本件ホスホリパーゼＤ－（２）」ともいう。
また、上記本件ホスホリパーゼＤ－（１）及び本件ホスホリパーゼＤ－（２）を総称して、以下、「本件ホスホリパーゼＤ」又は「本件ＰＬＤ」ともいう。
（２－１）ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有する；
（２－２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により測定した分子量が３８，０００～５０，０００である；
（２－３）至適温度 ｐＨ７．２、２．５分の反応条件下で、４０～６０℃である；
（２－４）ストレプトマイセス属に属する微生物由来である；
の（２－１）～（２－４）の性質を有し、ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するホスホリパーゼＤであり、以下、「本件ホスホリパーゼＤ－（２）」ともいう。
また、上記本件ホスホリパーゼＤ－（１）及び本件ホスホリパーゼＤ－（２）を総称して、以下、「本件ホスホリパーゼＤ」又は「本件ＰＬＤ」ともいう。
本明細書におけるｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンは、グリセロリン脂質のサブクラスの一つで、グリセロリン脂質のＣ１（ｓｎ－１）位にアルケニル（ビニルエーテル）結合した炭化水素鎖、Ｃ２（ｓｎ－２）位にオレイン酸（炭素数１８で二重結合が１つ １８：１）のエステル結合を持つアルケニルエーテル型グリセロリン脂質であって、塩基がコリンであるものであればよく、以下の式（I）にその構造を示す。
式中、Ｒ１は、通常、炭素数１～２０の脂肪族炭化水素基で、例えば、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、イコサニル基等が挙げられる。式中、Ｒ２は、炭素数１８で二重結合が１つの不飽和脂肪酸由来の不飽和脂肪族炭化水素基であり、たとえばオクタデセノイル基である。
本件ホスホリパーゼＤは、ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性、具体的には以下の式（II）に示すようにｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のｓｎ－３位リン酸エステルを加水分解してアルケニルエーテル脂質とコリンを遊離させる作用を有する酵素である。
ホスホリパーゼＤがＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）分子内のリン酸エステルへの加水分解活性を有するか否かは、たとえばＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）にホスホリパーゼＤを作用させて、加水分解により遊離されるコリンを定量することによって行うことができる。コリンの定量については後述する。
上記本件ホスホリパーゼＤ－（２）は、電気泳動条件等により若干変化し得るが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により測定した分子量が３８，０００～５０，０００、好ましくは４２，０００～４５，０００を挙げることができる。また、等電点(Ｇｅｎｅｔｙｘによる計算値)としては５．２～５．６、好ましくは５．４４を挙げることができる。
上記本件ホスホリパーゼＤ－（２）は、ｐＨ７．２、２．５分の反応条件下において、至適温度が４０～６０℃、好ましくは４５℃～５５℃を挙げることができる。
上記本件ホスホリパーゼＤ－（２）は、３７℃、２．５分の反応条件下において、至適ｐＨが３．５～４．５、好ましくは５．５～８．０、より好ましくは６．５～７．５を挙げることができる。
上記本件ホスホリパーゼＤ－（２）は、ストレプトマイセス属に属する微生物由来であり、ストレプトマイセス属に属する微生物としては、ストレプトマイセス グリセオフラバス（Streptomyces griseoflavus）、ストレプトマイセス グリセオルベンス（Streptomyces griseorubens）、又はストレプトマイセス グリセオインカルナタス（Streptomyces griseoincarnatus）に近縁の微生物のほか、ストレプトマイセス アルチオチカス（Streptomyces althioticus）、ストレプトマイセス アルムキスチイ（Streptomyces almquistii）、ストレプトマイセス ヘリオマイシニ（Streptomyces heliomycini）、ストレプトマイセス ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトマイセス フラベオラス（Streptomyces flaveolus）、ストレプトマイセス アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス アルボグリセオラス（Streptomyces albogriseolus）、ストレプトマイセス ビリドディアスタティカス（Streptomyces viridodiastaticus）、ストレプトマイセス ケリカラー（Streptomyces coelicolor）を挙げることができる。なお、近縁の微生物か否かは、例えば近隣結合法等により系統樹を推定し、分子系統解析を行うことによって判断することができる。
さらに、上記本件ホスホリパーゼＤ－（２）は、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を基質とし、ｐＨ７．２、５０℃、２．５分の反応条件下で反応させた場合のリン酸エステル結合への加水分解活性を１００とした場合に、ｓｎ－２位にアラキドン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が１０以下、好ましくは５以下、より好ましくは３以下、ｓｎ－２位にドコサヘキサエン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が１０以下、好ましくは５以下、より好ましくは３以下であるポリペプチドを好適に挙げることができる。
上記本件ホスホリパーゼＤ－（２）をストレプトマイセス属に属する微生物から調製する場合には、ストレプトマイセス属に属する微生物を培養し、培養上清を回収した後、公知の酵素精製方法、例えば、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、及び／又はアフィニティークロマトグラフィーを適宜組み合わせて行うことにより精製して調製することができる。
上記本件ホスホリパーゼＤ－（１）の（１－２）のポリペプチドにおける「配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド」としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％以上、９３％以上、９５％以上、又は９８％以上の同一性を有し、かつＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチドを挙げることができる。なお、上記「配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド」は、配列番号１における８１番目及び２５８番目のＨ、８３番目及び２６０番目のＫ、８８番目及び２６５番目のＤ、好ましくは８１番目～８８番目のＨＲＫＶＬＬＴＤ、及び２５８番目～２６５番目のＨＴＫＩＩＴＶＤのＨｘＫｘｘｘｘＤモチーフ（Ｈはヒスチジン、Ｋはリジン、Ｄはアスパラギン酸、Ｒはアルギニン、Ｖはバリン、Ｌはロイシン、Ｔはスレオニン、ｘは任意のアミノ酸：ＨＫＤモチーフ）においては配列番号１に記載のアミノ酸配列の対応する位置と同一性を維持しているポリペプチドであることが好ましい。なお、上記ＨＫＤモチーフは、ホスホリパーゼＤにおいて触媒反応に寄与するアミノ酸配列である。
上記本件ホスホリパーゼＤ－（１）の（１－３）のポリペプチドにおける「１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチド」とは、例えば１～１０個、１～５個、１～３個、１～２個、又は１個の任意の数のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドを挙げることができる。なお、上記「１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチド」は、配列番号１における８１番目及び２５８番目のＨ、８３番目及び２６０番目のＫ、８８番目及び２６５番目のＤ以外、好ましくは８１番目～８８番目のＨＲＫＶＬＬＴＤ、及び２５８番目～２６５番目のＨＴＫＩＩＴＶＤのＨｘＫｘｘｘｘＤモチーフ以外における１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであることが好ましい。
上記本件ホスホリパーゼＤ－（１）の（１－２）のポリペプチド又は（１－３）のポリペプチドとしては、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を基質とし、ｐＨ７．２、５０℃、２．５分の反応条件下で反応させた場合のリン酸エステル結合への加水分解活性を１００とした場合に、ｓｎ－２位にアラキドン酸が結合したコリン型プラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が１０以下、好ましくは５以下、より好ましくは３以下、ｓｎ－２位にドコサヘキサエン酸が結合したコリン型プラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が１０以下、好ましくは５以下、より好ましくは３以下であるポリペプチドを好適に挙げることができる。
上記本件ホスホリパーゼＤをＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）と作用させる場合には、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＢｉｓＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液を用いることが好ましく、作用させる際のｐＨとしては３．５～４．５、又は５．５～８．０、好ましくは６．５～７．５を挙げることでき、作用させる際の温度としては４０～６０℃、好ましくは４５～５５℃を挙げることができる。
（ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）の定量方法）
本発明の試料中のＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）の定量方法は、試料と上記ホスホリパーゼＤとを作用させる工程を含む、試料中のＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）の定量方法であればよく、本ホスホリパーゼＤの基質特異性によりＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を精度よく定量することが可能となる。試料中のＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を定量する方法としては、たとえば呈色反応を利用した特開２０１４－８２９９１号公報の方法を挙げることができる。具体的には、試料（基質）とホスホリパーゼＤとを作用させた後、熱失活で酵素反応を停止させ、その後コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及び呈色試薬を含む溶液を加えて呈色反応させて吸光度を測定する。次に、試料として既知濃度のＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を用いて検量線を作成し、測定対象の試料を用いて得られた測定値と検量線を比較してＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）量を算出することが可能となる。
本発明の試料中のＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）の定量方法は、試料と上記ホスホリパーゼＤとを作用させる工程を含む、試料中のＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）の定量方法であればよく、本ホスホリパーゼＤの基質特異性によりＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を精度よく定量することが可能となる。試料中のＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を定量する方法としては、たとえば呈色反応を利用した特開２０１４－８２９９１号公報の方法を挙げることができる。具体的には、試料（基質）とホスホリパーゼＤとを作用させた後、熱失活で酵素反応を停止させ、その後コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及び呈色試薬を含む溶液を加えて呈色反応させて吸光度を測定する。次に、試料として既知濃度のＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を用いて検量線を作成し、測定対象の試料を用いて得られた測定値と検量線を比較してＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）量を算出することが可能となる。
上記試料としては、被験体から採取された血漿、血清、血液、唾液、髄液、尿、リンパ液、汗等の体液を挙げることができる。血清及び血漿は、被験体から通常の採血方法（例えば、シリンジ採血又は真空採血）で得られる血液を、遠心（例えば、１０００×ｇ，５分）して、上清を回収する等の公知の方法により処理することによって得ることができる。採血をする際には、ＥＤＴＡ、フッ化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、モノヨード酢酸等の抗凝固剤や解糖阻止剤を用いることもできる。
上記被験体としては、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等の哺乳動物の他、鳥類、魚類、両生類、ホタテ等の海洋生物、なまこ等の軟体生物、乳酸菌やカビ・酵母に至る各種微生物を挙げることができる。
［発現ベクター］
本発明の発現ベクターは、本件ホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（以下、本件発現ベクターともいう）であればよく、本件ホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、配列番号２に記載の塩基配列又は配列番号２に記載の塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本発明の発現ベクターは、本件ホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（以下、本件発現ベクターともいう）であればよく、本件ホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、配列番号２に記載の塩基配列又は配列番号２に記載の塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
発現ベクターの種類としては環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。また、使用する宿主細胞に応じて適宜選択でき、プラスミドべクター、ウイルスベクター、ファージを挙げることができ、市販の発現ベクターを用いることができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＥＴ２４ａ、ｐＥＴ２２ｂ等のｐＥＴベクター、ｐＭＡＬ－ｐ５ｘ等のｐＭＡＬベクター、ｐＧＥＸベクター、ｐＣｏｌｄベクター、ｐＦＮ１８、ｐＰＡＬ７、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５等のｐＢＲベクター、ｐＡＣＹＣ１８４ベクター、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８等のｐＵＣベクター、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋ベクター等を挙げることができ、放線菌を宿主とする場合にはｐＵＣ７０２ベクター、ｐＩＪ６８０ベクター、ｐＩＪ７０２ベクター、ｐＴＯＮａ５ベクター、ｐＴＯＮａｓｈｏｒｔベクター、ｐＴｉｐベクター、ｐＮｉｔベクター等を挙げることができる。さらに、グラム陽性菌を宿主とする場合にはｐＢＩＣベクター、ｐＷＨ１５２０ベクター、ｐＭＭ１５２２ベクター、ｐＨＩＳ１５２２ベクター等を挙げることができる。酵母、特にサッカロマイセス セレビジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７ベクター、ｐＹＣ１ベクター、ＹＥｐ１３ベクター等を挙げることができる。
また、かかる発現ベクターにはプロモーターやターミネーター等の制御配列、アフィニティー及び可溶性タグ等のタグ、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子等の選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含有していてもよい。さらに、宿主細胞外に分泌しやすくするために分泌シグナルをコードするポリヌクレオチドを含有してもよい。分泌シグナルとしては、配列番号３に示すＴａｔ分泌シグナルの他、ＯｍｐＡシグナル（ペリプラズム移行シグナルとして機能）、ｐｅｌＢシグナル（ペリプラズム移行シグナルとして機能）等を挙げることができる。また、アフィニティー及び可溶性タグとしてはＭＢＰタグ（ペリプラズム移行シグナルとしても機能）、ＧＳＴタグ、ＴＦタグ、Ｈａｌｏタグ、Ｈｉｓタグ、ＳＫＩＫタグ（Kato et al., J. Biosci. Bioeng. 10.1016/j.jbiosc.2016.12.004 (2017)）、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅＸａｃｔ ｆｕｓｉｏｎタグ等を挙げることができる。上記アフィニティー及び可溶性タグ等のタグ、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子等の選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、上記発現ベクター内において、本件ホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドの５’末端側又は３’末端側のいずれに配置されていてもよい。
上記ポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス属に属する微生物等の天然由来のポリヌクレオチドでも人工合成のポリヌクレオチドでもよく、本件発現ベクターを導入する微生物の種類に応じて適宜選択でき、配列情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。上記ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの塩基配列の情報に基づき、化学合成する方法や、ＰＣＲによって増幅する方法等の公知の技術によって作製することができる。なお、アミノ酸をコードするために選択されるコドンは、用いる宿主細胞の種類に応じて、発現を最適化してもよい。
［形質転換体］
本発明の形質転換体は、上記本件発現ベクターを宿主に含有する形質転換体（以下、「本件形質転換体」ともいう）であればよく、宿主としては、用いる発現ベクターに応じて適宜選択でき、ＢＬ２１、ＳＨｕｆｆｌｅ等の大腸菌、ストレプトマイセス リビダンス（Streptomyces lividans）等のストレプトマイセス属に属する放線菌、ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）Ｌ８８等の放線菌、バチラス サチリス（Bacillus subtilis）、バチラス メガテリウム（Bacillus megaterium）、ブレビバチルス（Brevibacillus:Bacillus brevis）、コリネバクテリウム グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）等のグラム陽性菌、シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）等のグラム陰性菌、サッカロマイセス セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア パストリス（Pichia pastoris）等の酵母、アスペルギルス オリゼー（Aspergillus oryzae）やアスペルギルス ニガー（Aspergillus nigar）等のアスペルギルス(Aspergillus)属の糸状菌を挙げることができる。
本発明の形質転換体は、上記本件発現ベクターを宿主に含有する形質転換体（以下、「本件形質転換体」ともいう）であればよく、宿主としては、用いる発現ベクターに応じて適宜選択でき、ＢＬ２１、ＳＨｕｆｆｌｅ等の大腸菌、ストレプトマイセス リビダンス（Streptomyces lividans）等のストレプトマイセス属に属する放線菌、ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）Ｌ８８等の放線菌、バチラス サチリス（Bacillus subtilis）、バチラス メガテリウム（Bacillus megaterium）、ブレビバチルス（Brevibacillus:Bacillus brevis）、コリネバクテリウム グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）等のグラム陽性菌、シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）等のグラム陰性菌、サッカロマイセス セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア パストリス（Pichia pastoris）等の酵母、アスペルギルス オリゼー（Aspergillus oryzae）やアスペルギルス ニガー（Aspergillus nigar）等のアスペルギルス(Aspergillus)属の糸状菌を挙げることができる。
本件形質転換体を作製するために本件発現ベクターを宿主に導入する方法としては、公知の方法を用いることができ、コンピテントセル法、リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、リポソーム法等の化学的方法；ウイルスベクターを利用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法等の生物学的方法；エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、超音波遺伝子導入法等の物理的方法；等の公知の方法を例示することができる。
［ホスホリパーゼＤの製造方法］
本発明のホスホリパーゼＤの製造方法は、上記本件形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法であればよく、かかる方法により、本件ホスホリパーゼＤを効率よく産生することができる。培養方法としては宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。例えば、宿主が大腸菌又は放線菌の場合は、温度条件が１０～４５℃、好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２５～３７℃、ｐＨ条件がｐＨ５．５～８．５、好ましくはｐＨ６．２～７．５、培養時間が１０～８０時間、好ましくは１０～４８時間で、振とう培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下若しくは嫌気的条件下で培養することができる。本件ホスホリパーゼＤは培養液又は破砕した本件形質転換体から回収することができ、かかる回収する方法としては、公知のタンパク質の回収方法、例えば、遠心分離、次いで、ゲルろ過、イオン交換、アフィニティー等のクロマトグラフィーにより回収する方法を挙げることができる。
本発明のホスホリパーゼＤの製造方法は、上記本件形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法であればよく、かかる方法により、本件ホスホリパーゼＤを効率よく産生することができる。培養方法としては宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。例えば、宿主が大腸菌又は放線菌の場合は、温度条件が１０～４５℃、好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２５～３７℃、ｐＨ条件がｐＨ５．５～８．５、好ましくはｐＨ６．２～７．５、培養時間が１０～８０時間、好ましくは１０～４８時間で、振とう培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下若しくは嫌気的条件下で培養することができる。本件ホスホリパーゼＤは培養液又は破砕した本件形質転換体から回収することができ、かかる回収する方法としては、公知のタンパク質の回収方法、例えば、遠心分離、次いで、ゲルろ過、イオン交換、アフィニティー等のクロマトグラフィーにより回収する方法を挙げることができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。
例示に限定されるものではない。
（ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）に対して基質特異性が高いホスホリパーゼＤを産生する微生物の探索）
本発明者らは、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）に対して基質特異性が高いホスホリパーゼＤ（本明細書において「ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ」ともいう）を産生する微生物としてこれまでの経験に基づいて放線菌に着目して以下の工程により探索を行った。
１）グリセロールストック（－８０℃保存）した放線菌株をＩＳＰ２寒天培地に白金耳で塗抹し、２８℃で培養した。
２）生育したコロニーを白金耳で取り、ＭＰＤ培地（１％（ｗ／ｖ）グルコース、０．７５％（ｗ／ｖ）モルトエキス、０．７５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．３％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：ｐＨ７．０）若しくはＩＳＰ２培地（１％（ｗ／ｖ）モルトエキス、０．４％（ｗ／ｖ）イーストエキス、０．４％（ｗ／ｖ）グルコース：ｐＨ７．２）５ｍＬに植菌した。その後、２８℃、１６０ｓｐｍ（strokes per minute）で７２時間振とう培養を行った。培養液１ｍＬをＭＰＤ培地１００ｍＬに接種し、２８℃、１６０ｒｐｍで７２時間振とう培養を行った。
本発明者らは、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）に対して基質特異性が高いホスホリパーゼＤ（本明細書において「ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ」ともいう）を産生する微生物としてこれまでの経験に基づいて放線菌に着目して以下の工程により探索を行った。
１）グリセロールストック（－８０℃保存）した放線菌株をＩＳＰ２寒天培地に白金耳で塗抹し、２８℃で培養した。
２）生育したコロニーを白金耳で取り、ＭＰＤ培地（１％（ｗ／ｖ）グルコース、０．７５％（ｗ／ｖ）モルトエキス、０．７５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．３％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：ｐＨ７．０）若しくはＩＳＰ２培地（１％（ｗ／ｖ）モルトエキス、０．４％（ｗ／ｖ）イーストエキス、０．４％（ｗ／ｖ）グルコース：ｐＨ７．２）５ｍＬに植菌した。その後、２８℃、１６０ｓｐｍ（strokes per minute）で７２時間振とう培養を行った。培養液１ｍＬをＭＰＤ培地１００ｍＬに接種し、２８℃、１６０ｒｐｍで７２時間振とう培養を行った。
次に、以下の方法でホスホリパーゼＤのコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性（ホスホリパーゼＤ活性）を測定した。
１）培養液を遠心分離(２１，６００×ｇ、１０分、４℃)し、得られた上清を酵素サンプルとした。また、酵素サンプルを１００℃、１０分で熱失活した熱処理サンプルを熱失活コントロール（ｃｔｒｌ）とした。
２）以下の表１に示す酵素反応液を３７℃で５分保温した後、酵素サンプルを５μＬ加えて、３７℃、３０分反応させた。なお、表中、ＰｌｓＣｈｏはｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したＰｌｓＣｈｏ（ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１））、Ｔｘ１００はＴｒｉｔｏｎＸ－１００を意味する。
１）培養液を遠心分離(２１，６００×ｇ、１０分、４℃)し、得られた上清を酵素サンプルとした。また、酵素サンプルを１００℃、１０分で熱失活した熱処理サンプルを熱失活コントロール（ｃｔｒｌ）とした。
２）以下の表１に示す酵素反応液を３７℃で５分保温した後、酵素サンプルを５μＬ加えて、３７℃、３０分反応させた。なお、表中、ＰｌｓＣｈｏはｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したＰｌｓＣｈｏ（ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１））、Ｔｘ１００はＴｒｉｔｏｎＸ－１００を意味する。
３）以下の表２に示す呈色反応液２００μＬを加え、３７℃で１０分保温した。表２中、ＰＯＤはペルオキシダーゼ、ＣＯＤはコリンオキシダーゼ、４－ＡＡは４－アミノアンチピリン、ＴＯＤＢはＮ，Ｎ－ビス（４－サルフォブチル）－３－メチルアニリンである。
４）呈色後、直ちに２００μＬを分取し、マイクロプレートリーダー(Thermo Fisher社)により５５０ｎｍにおける吸光度（Ａ５５０）を測定した。既知濃度のコリンを用いて作成した検量線から、酵素反応液中のコリン濃度を求めた。また、１分に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素量を１Ｕと定義した。
上記によりｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）に対するホスホリパーゼＤ活性が確認された菌株のうち、活性が高い菌株を対象に基質特異性試験を行った。基質特異性試験では、ｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したＰｌｓＣｈｏ（ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１））（Avanti Polar Lipids社）、ｓｎ－２位にＣ２０：４を有するＰｌｓＣｈｏ（ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２０：４））（Avanti Polar Lipids社）、ｓｎ－２位にＣ２２：６を有するＰｌｓＣｈｏ（ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２２：６））（Avanti Polar Lipids社）の３種類の脂質へのホスホリパーゼＤ活性を測定した。ホスホリパーゼＤ活性の活性測定は上記と同様に行った。そのなかで、ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）に対して最も高いホスホリパーゼＤ活性を示す株としてＡ７４６株をＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ産生菌として選抜した。
（Ａ７４６株の分類学上の同定）
実施例１で選抜したＡ７４６株の分類学上の同定をした。まず、Ａ７４６株をＩＳＰ２培地（日本製薬社）で３０℃、７２時間培養した。培養後、アクロモペプチダーゼ（和光純薬工業社）を用いてＤＮＡを抽出した。かかる抽出したＤＮＡをＰＣＲ法の鋳型として用い、文献（中川恭好、川崎浩子 日本放線菌学会編 東京：日本学会事務センター ８８－１１７（２００１））に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行い、１６ＳｒＤＮＡを約１５００ｂｐ増幅した。
実施例１で選抜したＡ７４６株の分類学上の同定をした。まず、Ａ７４６株をＩＳＰ２培地（日本製薬社）で３０℃、７２時間培養した。培養後、アクロモペプチダーゼ（和光純薬工業社）を用いてＤＮＡを抽出した。かかる抽出したＤＮＡをＰＣＲ法の鋳型として用い、文献（中川恭好、川崎浩子 日本放線菌学会編 東京：日本学会事務センター ８８－１１７（２００１））に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行い、１６ＳｒＤＮＡを約１５００ｂｐ増幅した。
増幅した１６ＳｒＤＮＡの塩基配列をＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ ２．１（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ社）により決定した。増幅した前記１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を、ＢＬＡＳＴ相同検索を用い、国際塩基配列データベースＤＤＢＪ、ＥＮＡ（ＥＭＢＬ）、ＧｅｎＢａｎｋからから得た既知の微生物の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列と比較して、既知の微生物とのＤＮＡ相同性の一致の程度を比較した。近隣結合法として知られている文献（Saitou&Nei，1987；Mol．Biol．Evol．4406-425）に記載のＣｌｕｓｔａｌ Ｗ プログラムを用いて、系統樹を作成した。その系統樹を図１に示す。左上の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾のＴはその種の基準株(Ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ)をそれぞれ示す。
ＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、Ａ７４６株の１６ＳｒＤＮＡ部分配列は、ストレプトマイセス グリセオルベンス（Streptomyces griseorubens）の基準株ＮＢＲＣ １２７８０及びストレプトマイセス グリセオフラバス（Streptomyces griseoflavus）の基準株（ＮＢＲＣ１３０４４）に対して相同率９９．８％の相同性を示し、ストレプトマイセス グリセオインカルナタス（Streptomyces griseoincarnatus）の基準株（ＬＭＧ１９３１６）に対して相同率９９．５％の相同性を示した。さらに、ストレプトマイセス アルチオチカス（Streptomyces althioticus）の基準株ＮＲＲＬ＿Ｂ－３９８１、ストレプトマイセス アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）の基準株Ｍ２７２４５、ストレプトマイセス フラベオラス（Streptomyces flaveolus）の基準株ＡＢ１８４７１２、ストレプトマイセス ヘリオマイシニ（Streptomyces heliomycini）の基準株ＡＢ１８４７１２、及びストレプトマイセス ビリドディアスタティカス（Streptomyces viridodiastaticus）の基準株ＡＢ１８４３１７に対してそれぞれ相同性９９．２％、９９．３％、９９．３％、９９．１％、９９．１％を示した。
さらに、簡易形態観察を行ったところ、粉状のコロニーを示し、色調は表面が灰色・裏面が淡黄色を呈した。また、微視的観察の結果からは、気菌糸（菌糸幅１μｍ）及び連鎖胞子の形成が見られた。
図１の系統樹及び簡易形態観察結果から、Ａ７４６株はストレプトマイセス（Streptomyces）に属し、もっとも近縁の微生物はストレプトマイセス グリセオルベンス（Streptomyces griseorubens）又はストレプトマイセス グリセオフラバス（Streptomyces griseoflavus）であることが確認された。
（ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの精製）
Ａ７４６株が生成するＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを、以下の方法で精製した。
（１）ＭＰＤプレート上のコロニー生育したＡ７４６株のコロニーを白金耳で取り、ＭＰＤ試験管培地５ｍＬに植菌した。３０℃、１６０ｓｐｍで４日間振とう培養を行った（前培養）。前培養液１ｍＬを、ＭＰＤフラスコ培地 １００ｍＬに植菌した。３０℃、１６０ｒｐｍで４日間振とう培養を行った(本培養)。なお、特に記載しない限り、以下のＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの精製の工程はすべて氷中又は４℃で行った。
（２）上記で得られたＡ７４６株の培養液を、遠心分離機（１８，８００×ｇ、３０分）を用いて、この培養液から培養上清（Ｃｕｌｔ．ｓｕｐ．）を回収した。
（３）回収した培養上清に１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を終濃度２０ｍＭになるように加えた後、氷上で７０％（ｗ／ｖ）飽和となるように粉末硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１８，８００×ｇ、３０分）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し粗酵素液(７０％ｓａｔ．ＡＳ)を得た。
（４）（３）で得られた粗酵素液を透析した。
Ａ７４６株が生成するＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを、以下の方法で精製した。
（１）ＭＰＤプレート上のコロニー生育したＡ７４６株のコロニーを白金耳で取り、ＭＰＤ試験管培地５ｍＬに植菌した。３０℃、１６０ｓｐｍで４日間振とう培養を行った（前培養）。前培養液１ｍＬを、ＭＰＤフラスコ培地 １００ｍＬに植菌した。３０℃、１６０ｒｐｍで４日間振とう培養を行った(本培養)。なお、特に記載しない限り、以下のＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの精製の工程はすべて氷中又は４℃で行った。
（２）上記で得られたＡ７４６株の培養液を、遠心分離機（１８，８００×ｇ、３０分）を用いて、この培養液から培養上清（Ｃｕｌｔ．ｓｕｐ．）を回収した。
（３）回収した培養上清に１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を終濃度２０ｍＭになるように加えた後、氷上で７０％（ｗ／ｖ）飽和となるように粉末硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１８，８００×ｇ、３０分）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し粗酵素液(７０％ｓａｔ．ＡＳ)を得た。
（４）（３）で得られた粗酵素液を透析した。
（５）（４）で得られた透析内液を、陰イオン交換クロマトグラフィーであるサンプルを供した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）－ＤＥＡＥ６５０Ｍカラム（東ソーバイオサイエンス社）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に緩衝液を変更し、ＮａＣｌ（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより溶出させ、活性画分（ＤＥＡＥ６５０Ｍ）を得た。
（６）（５）で得られた活性画分（ＤＥＡＥ６５０Ｍ）に終濃度１．５Ｍとなるように硫安粉末をサンプルに添加した。それを、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＰＰＧ－６００Ｍカラム（東ソーバイオサイエンス社）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１．５Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させ、活性画分（ＰＰＧ６００Ｍ）を得た。
（７）（６）で得られた活性画分（ＰＰＧ６００Ｍ）を、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍカラム（東ソーバイオサイエンス社）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で硫酸アンモニウム（１．５Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させ、活性画分（Ｂｕｔｙｌ６５０Ｍ）を得た。
（８）（７）で得られた活性画分（Ｂｕｔｙｌ６５０Ｍ）を、Ａｍｉｃｏｎ－１００ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過し、ろ液を回収した。
（９）（８）で得られたろ液を３０ｋＤａ ｃｕｔ－ｏｆｆのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（Ａｍｉｃｏｎ－３０ｋ：Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）と２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋０．０１％（ｗ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を使用してサンプルのバッファー交換・濃縮を行った。濃縮サンプルの体積は２５０μＬ以下とした。
（１０）（９）で得られたサンプルを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋０．０１ ％ （ｗ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にアプライし、同緩衝液でサイズ排除クロマトグラフィーを行い、活性画分を溶出させ、活性画分（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）を得た。
（１１）（１０）で得られた活性画分（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）を、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ Ｐｈｅｎｙｌ（東ソー社）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１．５Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させ、活性画分（ＴＳＫＰｈｅ）を得た。
（７）（６）で得られた活性画分（ＰＰＧ６００Ｍ）を、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍカラム（東ソーバイオサイエンス社）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で硫酸アンモニウム（１．５Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させ、活性画分（Ｂｕｔｙｌ６５０Ｍ）を得た。
（８）（７）で得られた活性画分（Ｂｕｔｙｌ６５０Ｍ）を、Ａｍｉｃｏｎ－１００ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過し、ろ液を回収した。
（９）（８）で得られたろ液を３０ｋＤａ ｃｕｔ－ｏｆｆのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（Ａｍｉｃｏｎ－３０ｋ：Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）と２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋０．０１％（ｗ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を使用してサンプルのバッファー交換・濃縮を行った。濃縮サンプルの体積は２５０μＬ以下とした。
（１０）（９）で得られたサンプルを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋０．０１ ％ （ｗ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にアプライし、同緩衝液でサイズ排除クロマトグラフィーを行い、活性画分を溶出させ、活性画分（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）を得た。
（１１）（１０）で得られた活性画分（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）を、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ Ｐｈｅｎｙｌ（東ソー社）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１．５Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させ、活性画分（ＴＳＫＰｈｅ）を得た。
各精製工程における収量、収率、ホスホリパーゼＤ活性等を表３に示す。ホスホリパーゼＤ活性は実施例１と同様の方法で測定した。上記工程により、精製度（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｌｄ）が８０１４倍、比活性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｓｐ．ａｃｔ．）が１３４３倍向上した精製ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを得た。また、精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ（ＴＳＫＰｈｅ画分）の分子量をＳＤＳ-ＰＡＧＥ（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）分析により測定した結果を図２に示す。左レーン（Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ）は分子量マーカーであり、右レーンは、活性画分（ＴＳＫＰｈｅ）のバンドを示す。その結果、矢印で示す約９０ｋＤａ、約４３ｋＤａ、及び約３０ｋＤａの３つのバンドが観察された。
（精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの性質）
精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの基質特異性、至適温度、至適ｐＨを調べた。
◆ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの基質特異性
上記で精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを用いて、以下の表４に示す酵素反応液を用いてｐＨ７．２、５０℃で２．５分反応させた以外は実施例１と同様の方法でホスホリパーゼＤ活性を測定し、基質特異性を調べた。
精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの基質特異性、至適温度、至適ｐＨを調べた。
◆ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの基質特異性
上記で精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを用いて、以下の表４に示す酵素反応液を用いてｐＨ７．２、５０℃で２．５分反応させた以外は実施例１と同様の方法でホスホリパーゼＤ活性を測定し、基質特異性を調べた。
基質としてはｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）（Avanti Polar Lipids社）、ｓｎ－２位にアラキドン酸がエステル結合したＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２０：４）（Avanti Polar Lipids社）、ｓｎ－２位にドコサヘキサエン酸が結合したＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２２：６）（Avanti Polar Lipids社）、スフィンゴミエリン（ＳＭ：Sigma Aldrich社）を用いた。ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２０：４）、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２２：６）を式（III）～式(V）に示す。
（１）ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）
1-(1Z-octadecenyl)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
1-(1Z-octadecenyl)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
（２）ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２０：４）
1-(1Z-octadecenyl)-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
1-(1Z-octadecenyl)-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
（３）ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２２：６）
1-(1Z-octadecenyl)-2-docosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
1-(1Z-octadecenyl)-2-docosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を基質とした場合のホスホリパーゼＤ活性を１００とした場合の相対活性を図３に示す。図３の横軸において、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を基質として用いた場合をＰｌｓＣｈｏ１８：１、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２０：４）を基質とした場合をＰｌｓＣｈｏ２０：４、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２２：６）を基質として用いた場合をＰｌｓＣｈｏ２２：６で示す。図３から明らかなように、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２０：４）又はＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２２：６）を基質とした場合の相対活性は検出限界以下であった。同様に、ＳＭにおいても相対活性は検出限界以下であった。したがって、実施例３で精製したＡ７４６株が生成するＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤはコリン型プラズマローゲンのなかでもＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）に特異的であることが明らかとなった。
◆ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）の至適温度
基質となる０．１％ ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ １８：１）、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２、各温度）５０ｍＭとの溶液に精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを２（ｖ／ｖ）％となるように加え、合計量５０μＬとなるように以下の表５に示す反応液を調製した。この反応液を２．５分ほど反応させた。その後、加水分解活性を測定した。結果を図４に示す。図４中、横軸が温度（２０，３０，３７，４０，５０，６０，７０℃）、縦軸が５０℃で反応させた場合の活性を１００とした場合の相対活性を示す。図４から明らかなように精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤは、２５℃～６５℃で高い加水分解活性を有し、３０℃～６０℃、好ましくは４０～６０℃、特に５０℃付近で加水分解活性が特に高いことが明らかとなった。
基質となる０．１％ ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ １８：１）、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２、各温度）５０ｍＭとの溶液に精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを２（ｖ／ｖ）％となるように加え、合計量５０μＬとなるように以下の表５に示す反応液を調製した。この反応液を２．５分ほど反応させた。その後、加水分解活性を測定した。結果を図４に示す。図４中、横軸が温度（２０，３０，３７，４０，５０，６０，７０℃）、縦軸が５０℃で反応させた場合の活性を１００とした場合の相対活性を示す。図４から明らかなように精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤは、２５℃～６５℃で高い加水分解活性を有し、３０℃～６０℃、好ましくは４０～６０℃、特に５０℃付近で加水分解活性が特に高いことが明らかとなった。
◆ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの至適ｐＨ
基質となる０．１％ ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）と、酢酸緩衝液（Ａｃｅｔａｔｅ：ｐＨ４～５）、クエン酸緩衝液（Ｃｉｔｒｉｃ：ｐＨ４～６）、ＢｉｓＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ＢｉｓＴｒｉｓ：ｐＨ６～７）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＨＥＰＥＳ：ｐＨ７～８）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（Ｔｒｉｓ：ｐＨ７．２～９）、又はグリシン緩衝液（Ｇｌｙｃｉｎｅ：ｐＨ９～１０）から選ばれる緩衝液（ｐＨ４、５、６、７、７．２、８、９、又は１０：温度３７℃）５０ｍＭとの溶液に、精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを２％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を各ｐＨ条件にて２．５分ほど酵素反応させた。その後の反応は実施例１と同様の方法で行い、酵素活性を測定した。結果を図５に示す。図５中、横軸がｐＨ、縦軸がＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．２で反応させた場合の活性を１００とした場合の相対活性を示す。図５に基づき、精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤは、ｐＨ４付近及びｐＨ６～８、特にｐＨ６．５～７．５で加水分解活性が高いことが明らかとなった。
基質となる０．１％ ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）と、酢酸緩衝液（Ａｃｅｔａｔｅ：ｐＨ４～５）、クエン酸緩衝液（Ｃｉｔｒｉｃ：ｐＨ４～６）、ＢｉｓＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ＢｉｓＴｒｉｓ：ｐＨ６～７）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＨＥＰＥＳ：ｐＨ７～８）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（Ｔｒｉｓ：ｐＨ７．２～９）、又はグリシン緩衝液（Ｇｌｙｃｉｎｅ：ｐＨ９～１０）から選ばれる緩衝液（ｐＨ４、５、６、７、７．２、８、９、又は１０：温度３７℃）５０ｍＭとの溶液に、精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを２％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を各ｐＨ条件にて２．５分ほど酵素反応させた。その後の反応は実施例１と同様の方法で行い、酵素活性を測定した。結果を図５に示す。図５中、横軸がｐＨ、縦軸がＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．２で反応させた場合の活性を１００とした場合の相対活性を示す。図５に基づき、精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤは、ｐＨ４付近及びｐＨ６～８、特にｐＨ６．５～７．５で加水分解活性が高いことが明らかとなった。
◆ジスルフィド結合の重要性
ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤにおける加水分解活性において、ジスルフィド結合の影響を調べた。
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２、５０℃）５０ｍＭの溶液に精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを２（ｖ／ｖ）％、１ｍＭ阻害剤（還元化剤であるジチオトレイトール：ＤＴＴ、還元化剤である２－メルカプトエタノール：２ＭＥ、システインのチオール基を不可逆的に修飾し、ジスルフィド結合を阻害するヨード酪酸：ＩＡＡ、セリンプロテアーゼ阻害剤であるフッ化フェニルメチルスルホニル：ＰＭＳＦ、金属キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸：ＥＤＴＡ、又は金属キレート剤であるグリコールエーテルジアミン四酢酸：ＥＧＴＡ）となるように加え、合計量４９μＬとなるように調製した。これを５０℃にて５分ほど保温した後、基質となる０．１％ ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ １８：１）／０．００１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を加えて５０℃にて２．５分ほど酵素反応させ、その後の反応は実施例１と同様の方法で行い、加水分解活性を測定した。結果を図６に示す。図６中、横軸が阻害剤、縦軸が水で反応させた場合の活性を１００とした場合の相対活性を示す。図６から明らかなように、システインのチオール基の間で形成されるジスルフィド結合を切断する還元化剤、アルキル化剤で活性が抑制されたことから、本酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの活性発現におけるジスルフィド結合の重要性が示された。
ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤにおける加水分解活性において、ジスルフィド結合の影響を調べた。
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２、５０℃）５０ｍＭの溶液に精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを２（ｖ／ｖ）％、１ｍＭ阻害剤（還元化剤であるジチオトレイトール：ＤＴＴ、還元化剤である２－メルカプトエタノール：２ＭＥ、システインのチオール基を不可逆的に修飾し、ジスルフィド結合を阻害するヨード酪酸：ＩＡＡ、セリンプロテアーゼ阻害剤であるフッ化フェニルメチルスルホニル：ＰＭＳＦ、金属キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸：ＥＤＴＡ、又は金属キレート剤であるグリコールエーテルジアミン四酢酸：ＥＧＴＡ）となるように加え、合計量４９μＬとなるように調製した。これを５０℃にて５分ほど保温した後、基質となる０．１％ ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ １８：１）／０．００１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を加えて５０℃にて２．５分ほど酵素反応させ、その後の反応は実施例１と同様の方法で行い、加水分解活性を測定した。結果を図６に示す。図６中、横軸が阻害剤、縦軸が水で反応させた場合の活性を１００とした場合の相対活性を示す。図６から明らかなように、システインのチオール基の間で形成されるジスルフィド結合を切断する還元化剤、アルキル化剤で活性が抑制されたことから、本酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの活性発現におけるジスルフィド結合の重要性が示された。
◆金属イオンの要求性
金属イオン（Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋，Ｍｎ２＋，Ｚｎ２＋，Ｃｏ２＋，Ａｌ３＋，Ｆｅ２＋，Ｆｅ３＋，Ｃｕ２＋ 終濃度２ｍＭ）と精製した上記ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを、以下の表６に示す反応液によって５０℃にて２．５分ほど酵素反応させ、その後の反応は実施例１と同様の方法で行い、ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤにおける加水分解活性に対する金属イオンの影響を調べた。結果を図７に示す。相対活性は金属イオンを含まない条件でインキュベートした酵素（Ｆｒｅｅ）と比較することによって算出した。また、キレート剤としてＥＤＴＡ（終濃度２ｍＭ）を添加し、金属イオン要求性を評価した。
金属イオン（Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋，Ｍｎ２＋，Ｚｎ２＋，Ｃｏ２＋，Ａｌ３＋，Ｆｅ２＋，Ｆｅ３＋，Ｃｕ２＋ 終濃度２ｍＭ）と精製した上記ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを、以下の表６に示す反応液によって５０℃にて２．５分ほど酵素反応させ、その後の反応は実施例１と同様の方法で行い、ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤにおける加水分解活性に対する金属イオンの影響を調べた。結果を図７に示す。相対活性は金属イオンを含まない条件でインキュベートした酵素（Ｆｒｅｅ）と比較することによって算出した。また、キレート剤としてＥＤＴＡ（終濃度２ｍＭ）を添加し、金属イオン要求性を評価した。
図７から明らかなように、精製したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤは金属イオン要求性ではない酵素であった。
（ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ遺伝子の探索）
Ａ７４６株由来ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ遺伝子の探索を以下の方法により行った。
Ａ７４６株由来ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ遺伝子の探索を以下の方法により行った。
Ｈｉｓｅｑ（登録商標）２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用い、２５０ＰＥ（ペアエンド）によるＤｅ ｎｏｖｏ解析によりドラフトゲノム解析し、ＣＤＳリストを作成した。そのうち、ホスホリパーゼＤスーパーファミリーと推定された遺伝子を１つ見出した。
上記解析により、ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤのアミノ酸配列は、配列番号４に記載された３８７アミノ酸からなる配列であり、Ｓｉｇｎａｌ Ｐプログラムによる予測によりＮ末端側に配列番号３に示す４７アミノ酸からなるＴａｔ分泌シグナルを含有していると考えられる。したがって，ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの成熟（活性）型配列は配列番号１に記載された３４０アミノ酸からなる配列である。なお、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣプログラムによる推定分子量は３８５６８、推定の等電点は５．４４であった。この等電点は推定値であり、実測値とは異なる可能性がある。さらに、ＨＫＤモチーフ（ＨｘＫｘｘｘｘＤ：Ｈはヒスチジン、Ｋはリシン、Ｄはアスパラギン酸、ｘは任意のアミノ酸）を２カ所（配列番号１に示すアミノ酸配列における８１番目～８８番目、２５８番目～２６５番目）有していた。なお、ゲノム解析した結果、既知ホスホリパーゼＤにおけるコンセンサス配列を有する遺伝子産物は配列番号４に記載された３８７アミノ酸からなる配列の他には見いだせなかった。
（大腸菌によるＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの発現）
Ａ７４６株から特願２０２０－３６２９８号に記載の方法と同様にゲノムＤＮＡを得た。得られたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号５に記載のフォワードプライマーＰｌｓＣｈｏ－ＦＷ１及び配列番号６に記載のリバースプライマーＰｌｓＣｈｏ－ＲＶを用いてＰＣＲを行い、ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤと推察される遺伝子のＴａｔシグナルを除いた成熟配列のｃＤＮＡにおいて、５’末端にＮｃｏＩサイトを、３’末端側にＨｉｎｄＩＩＩサイトをコードする塩基配列を付加するように増幅した。得られたＰＣＲ副産物をＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、発現ベクターであるｐＥＴ２２ｂのＮｃｏＩ－ＨｉｎｄIII部位に挿入して、組換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ／ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ）を得た。
Ａ７４６株から特願２０２０－３６２９８号に記載の方法と同様にゲノムＤＮＡを得た。得られたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号５に記載のフォワードプライマーＰｌｓＣｈｏ－ＦＷ１及び配列番号６に記載のリバースプライマーＰｌｓＣｈｏ－ＲＶを用いてＰＣＲを行い、ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤと推察される遺伝子のＴａｔシグナルを除いた成熟配列のｃＤＮＡにおいて、５’末端にＮｃｏＩサイトを、３’末端側にＨｉｎｄＩＩＩサイトをコードする塩基配列を付加するように増幅した。得られたＰＣＲ副産物をＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、発現ベクターであるｐＥＴ２２ｂのＮｃｏＩ－ＨｉｎｄIII部位に挿入して、組換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ／ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ）を得た。
かかる組換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ／ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ）をテンプレートとして、配列番号７に記載のフォワードプライマー２２ｂＰｌＣＰＬＤＨｉｓ．Ｆｗ及び配列番号８に記載のリバースプライマー２２ｂＰｌＣＰＬＤＨｉｓ．Ｒｖを用いて１回目のインバースＰＣＲを行い、Ｃ末端にヒスチジンタグを付加したＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ－Ｈｉｓをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ／ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ－Ｈｉｓ）を作製した。
上記で得られたプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ／ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ－Ｈｉｓ）をテンプレートとして、配列番号９に記載のフォワードプライマー２２ｂＰｌｓＣｈｏＮ＿ｄｅｌＦｗ．及び配列番号１０に記載のリバースプライマー２２ｂＰｌｓＣｈｏＮ＿ｄｅｌＲｖ．を用いてインバースＰＣＲを行い、ｐＥＴ２２ｂ由来のｐｅｌＢのシグナル配列をコードする領域のみを欠失させた組換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ／ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ－Ｈｉｓ：シグナルなし）を作製した。コントロールのプラスミドとして、ｐＥＴ２２ｂを用いた。次に、得られた組換えプラスミド又はコントロールプラスミドｐＥＴ２２ｂを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、組換え大腸菌を得た。得られた組換え大腸菌を、３０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１００ｍＬのＺＹＭ５０５２培地（Studier, F.W. Protein Expr. Purif. 41, 207-234）で、３０℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を回収した。菌体は２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁した後、超音波破砕してそれぞれのプラスミドで形質転換した大腸菌由来の菌溶解液を得た。さらに、それぞれの菌溶解液を１４，０００ｒｐｍ、１５分で遠心して上清を得て、大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液（約０．０４Ｕ／ｍＬ）又はコントロール上清液とした。
上記の大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの分子量をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により測定した結果を図８に示す。図８中、左端及び右端はマーカー、「＋」は上記大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液、「－」は上記コントロール上清液をアプライした場合である。図８に示すように、大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液の「＋」レーンにおいて約４３ｋＤａのバンドが増加しており、発現させたＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの分子量（ヒスチジンタグを含む）はおよそ４３．３ｋＤａであることが明らかとなった。
さらに、上記それぞれの菌溶解液、及び上清（大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液又はコントロール上清液）をウエスタンブロット解析した結果を図９に示す。図９中、「＋」は組換えプラスミドで大腸菌を形質転換して得られた菌溶解液又はその遠心した上清（大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液）、「－」はコントロールプラスミドで大腸菌を形質転換して得られた菌溶解液又はその遠心した上清（コントロール上清）をアプライした場合である。なお、１次抗体としては、Ｈｉｓ－Ｔａｇ（Ｄ３Ｉ１Ｏ）ＸＰＲａｂｂｉｔ ｍＡｂ（登録商標：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いた。
図９に示すように、４３ｋＤａ付近にバンドが検出された。かかる結果からも、ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの分子量はおよそ４３ｋＤａであることが確認された。
（検量線の作成）
実施例６で調製した大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液を用いて、ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの検量線を作成した。なお、ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの定量は、実施例１に記載のようにＰｌｓＣｈｏが加水分解されて得られるコリンを定量することで行った。
実施例６で調製した大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液を用いて、ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの検量線を作成した。なお、ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの定量は、実施例１に記載のようにＰｌｓＣｈｏが加水分解されて得られるコリンを定量することで行った。
（ホスホリパーゼＤ活性の測定）
以下の方法で蛍光強度を測定することでホスホリパーゼＤ活性を測定した。
１）実施例６で調製した大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液を遠心した後の上清を酵素サンプルとした。
２）ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを９６穴ウェルプレートに分注した。
３）以下の表７に示す蛍光法酵素反応液と酵素サンプルを加え、１分ほど振とうした。
以下の方法で蛍光強度を測定することでホスホリパーゼＤ活性を測定した。
１）実施例６で調製した大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液を遠心した後の上清を酵素サンプルとした。
２）ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤを９６穴ウェルプレートに分注した。
３）以下の表７に示す蛍光法酵素反応液と酵素サンプルを加え、１分ほど振とうした。
５）反応後、プレートリーダー (BECKMAN COULTER社)を用いて、蛍光光度（ＥＸ５３５ｎｍ、ＥＭ５９５ｎｍ）を測定した。
なお、基質としては、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）５、２５、又は５０μｇを用いた。結果を図１０に示す。
図１０に示すように、実施例６で調製した大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液を用いればＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）の濃度依存的に蛍光強度が増加していること、及びＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）の検出ができることが確認された。
（基質特異性）
実施例７では基質としてＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を用いたが、さらにＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２０：４）、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２２：６）及びフォスファチジルコリン（ＰｔｄＣｈｏ）を用いて基質特異性を調べた。実施例６で調製した大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液を用いて、実施例７に記載と同様の方法で基質（各１０μg）と３０分反応させて、ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの活性を測定した。結果を図１１に示す。図中、Ｃ１８：１、Ｃ２０：４、及びＣ２２：６はそれぞれＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２０：４）及びＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２２：６）を基質とした場合を示す。また、縦軸はＣ１８：１の場合を１とした場合の相対活性を示す。
実施例７では基質としてＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を用いたが、さらにＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２０：４）、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２２：６）及びフォスファチジルコリン（ＰｔｄＣｈｏ）を用いて基質特異性を調べた。実施例６で調製した大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液を用いて、実施例７に記載と同様の方法で基質（各１０μg）と３０分反応させて、ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤの活性を測定した。結果を図１１に示す。図中、Ｃ１８：１、Ｃ２０：４、及びＣ２２：６はそれぞれＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２０：４）及びＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ２２：６）を基質とした場合を示す。また、縦軸はＣ１８：１の場合を１とした場合の相対活性を示す。
図１１に示すように、実施例６で調製した大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液はＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）に対して極めて基質特異性が高いことが明らかとなった。
（血漿中のコリン型プラズマローゲンの定量）
１．血漿の調製
血清及び血漿は細胞膜ではないため、赤血球や白血球と比べて、これらに含まれるプラズマローゲンは極めて少ない。したがって、血清や血漿中のプラズマローゲン量を測定することはこれまでの技術では困難であった。一方、近年、プラズマローゲンは冠動脈疾患のバイオマーカーとなると考えられており、血清又は血漿中のコリン型プラズマローゲンを定量することは冠動脈疾患等の疾患の発症リスクの判定に重要である。そこで、実施例６で調製した大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液を用いて血漿中のコリン型プラズマローゲンの定量が可能かどうかを調べた。
１．血漿の調製
血清及び血漿は細胞膜ではないため、赤血球や白血球と比べて、これらに含まれるプラズマローゲンは極めて少ない。したがって、血清や血漿中のプラズマローゲン量を測定することはこれまでの技術では困難であった。一方、近年、プラズマローゲンは冠動脈疾患のバイオマーカーとなると考えられており、血清又は血漿中のコリン型プラズマローゲンを定量することは冠動脈疾患等の疾患の発症リスクの判定に重要である。そこで、実施例６で調製した大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液を用いて血漿中のコリン型プラズマローゲンの定量が可能かどうかを調べた。
血漿の準備は、特開２０１６－１１１９２９号公報に記載の方法に準じて行った。簡潔に説明すると、ヘパリン入り採血管（テルモ社）を用いて静脈血を採取し、１０００×ｇ、５分遠心して、上清（すなわち血漿）を回収した。
（血漿サンプルの調製）
上記で回収した血漿を冷凍保存し、測定前に解凍し５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で調整した。
上記で回収した血漿を冷凍保存し、測定前に解凍し５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で調整した。
（蛍光光度計による分析）
ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）の代わりに上記血漿サンプルを２０、３０、又は４０μＬ用いた以外は実施例７と同様の方法で反応させた。結果を図１２に示す。
ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）の代わりに上記血漿サンプルを２０、３０、又は４０μＬ用いた以外は実施例７と同様の方法で反応させた。結果を図１２に示す。
（結果）
図１２に示すように血漿サンプルの量に比例して蛍光強度が増加していることが確認された。実施例７及び８の結果と合わせると、実施例６で調製した大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液を用いれば血漿中のコリン型プラズマローゲンであるＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を特異的に定量できることが確認された。
図１２に示すように血漿サンプルの量に比例して蛍光強度が増加していることが確認された。実施例７及び８の結果と合わせると、実施例６で調製した大腸菌で発現させた酵素ＰｌｓＣｈｏ－ＰＬＤ液を用いれば血漿中のコリン型プラズマローゲンであるＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を特異的に定量できることが確認された。
本発明のホスホリパーゼＤを用いれば、ＰｌｓＣｈｏ（ｓｎ－２ Ｃ１８：１）を安価で特異的に検出又は定量可能とするものであり、産業上の有用性は高い。
Claims (8)
- 以下の（１－１）～（１－３）のいずれか記載のポリペプチドを含む、ホスホリパーゼＤ。
（１－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（１－２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつグリセロール骨格のｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド；
（１－３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、前記コリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するポリペプチド； - ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有するホスホリパーゼＤであって、以下の（２－１）～（２－４）の性質を有するホスホリパーゼＤ。
（２－１）ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解活性を有する；
（２－２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により測定した分子量が３８，０００～５０，０００である；
（２－３）至適温度 ｐＨ７．２、２．５分の反応条件下で、４０～６０℃である；
（２－４）ストレプトマイセス属に属する微生物由来である； - ストレプトマイセス グリセオフラバス（Streptomyces griseoflavus）、ストレプトマイセス グリセオルベンス（Streptomyces griseorubens）、又はストレプトマイセス グリセオインカルナタス（Streptomyces griseoincarnatus）に近縁の微生物由来であることを特徴とする、請求項２記載のホスホリパーゼＤ。
- ｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンを基質とした場合のリン酸エステル結合への加水分解活性を１００とした場合に、ｓｎ－２位にアラキドン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が１０以下、及びｓｎ－２位にドコサヘキサエン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が１０以下であることを特徴とする請求項１～３のいずれか記載のホスホリパーゼＤ。
- 試料と請求項１～４のいずれか記載のホスホリパーゼＤとを作用させる工程を含むことを特徴とする、前記試料中のｓｎ－２位にオレイン酸がエステル結合したコリン型プラズマローゲンの定量方法。
- 請求項１記載のホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
- 請求項６記載の発現ベクターを含有する形質転換体。
- 請求項７記載の形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法。
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