JP2023027249A - 液体媒体内の生存微生物の迅速な検出のためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、電気信号を利用して、液体媒体(例えば、懸濁液)内の微生物の存在および/または濃度を検出するためのシステムおよび方法に関する。
細菌、ウィルス、真菌、イースト、およびかびなどの微生物または病原体は、種々の媒体において容易に増殖し得る。生存(viable)微生物の存在を迅速に検出することに価値があり得るコンテキストは、哺乳類流体サンプルにおける感染症診断および処置、ならびに、食物、飲料(水を含む)、および医薬品などの消耗アイテムの品質試験を含む。
と懸濁液との間の各個体-液体界面(すなわち、「2重層(double layer)」を形成する)におけるキャパシタンスが、細菌含有懸濁液のバルクキャパシタンスより大幅に大きい(例えば、約1000倍大きい)からである。各電極上で形成される2重層は、(例えば、化学的相互作用によって)電極表面に引き寄せられるイオンからなる表面電荷の第1の層、および、(例えば、クーロン力によって)表面電荷に引き寄せられ、第1の層を電気的に覆うために役立つイオンの第2の層を含む。第2の層は、電気的引力および熱運動の影響下で流体内を移動する自由イオンで作られ、「拡散層(diffuse
layer)」と呼ぶことができる。
[発明の概要]
液体媒体懸濁液内の生存微生物(例えば、病原体)を迅速に検出するためのシステムおよび方法は、考えられる懸濁液(例えば、微生物を含有すると考えられる液体媒体)と電気的連通(例えば、導電性接触)状態にある少なくとも2つの電極を利用する。短い初期時間窓内で(例えば、電気パルスの状態の変化後に定常状態電気応答値の95%に到達するために必要とされる時間以内で、または、本明細書で開示される別の時間窓内で)の電気パルスに対する電気応答は、電極間の懸濁液のバルク電気応答が、電極の表面における(または、懸濁液と非接触関係で配置された電極の場合、電極と懸濁液との間の壁の表面における)2重層形成によって電気応答信号が支配される前に、決定されることを可能にする。パルス印加およびパルスの状態の変化に対する電気応答の検出は、所定の期間にわたって反復することができ、そのような応答の変化は、バルク懸濁液内の微生物増殖を検出するのに有用である。例えば、第1および第2の電気パルスが、電極にわたって第1および第2の時刻(例えば、初期および後続の時刻)に印加されると、第1および第2の初期電気応答信号が生成され、各信号は、短い初期時間窓内で(例えば、対応する電気パルスの状態の変化後に定常状態電気応答値の95%に到達するために必要とされる時間以内で、または、本明細書で開示される別の時間窓内で)において電気応答を示す。電子的に測定することができる第1の時刻と第2の時刻との間の電気応答の変化は、液体媒体内の1つまたは複数の病原体の増殖を立証することができる。
なくとも1つの第1の初期電気応答信号を具現化する、または少なくとも1つの第1の初期電気応答信号から導出される第1の電気応答と比較することを含む。或る実施形態において、第1の電気応答は少なくとも1つの第1の初期電気応答信号において具現化する、または少なくとも1つの第1の初期電気応答信号からのみ導出することができ、第2の電気応答は少なくとも1つの第2の初期電気応答信号において具現化する、または少なくとも1つの第2の初期電気応答信号からのみ導出することができる。他の実施形態において、さらなる信号を、第1および第2の電気応答の導出において使用することができる。
或る実施形態において、方法は、第1の電気パルスの状態の変化後に、少なくとも約5倍だけ第1の初期時間窓より長く延長する第1の延長時間窓(しかし、或る実施形態において、約20マイクロ秒以内である)内で電気応答を示す少なくとも1つの第1の延長電気応答信号を生成するために、第1の電気パルスの印加による、液体含有サンプルの第1の部分および少なくとも2つの電極の第1の延長電気応答を検出すること;第2の電気パ
ルスの状態の変化後に、少なくとも約5倍だけ第2の初期時間窓より長く延長する第2の延長時間窓(しかし、或る実施形態において、約20マイクロ秒以内である)内で電気応答を示す少なくとも1つの第2の延長電気応答信号を生成するために、第2の電気パルスの印加による、液体含有サンプルの第2の部分および少なくとも2つの電極の第2の延長電気応答を検出すること;および、第1の電気応答を導出するために少なくとも1つの第1の初期電気応答信号を正規化するために、少なくとも1つの第1の延長電気応答信号を利用すること;および、第2の電気応答を導出するために少なくとも1つの第2の初期電気応答信号を正規化するために、少なくとも1つの第2の延長電気応答信号を利用することをさらに含む。そのため、或る実施形態において、第1の電気応答は、少なくとも1つの第1の延長電気応答信号と組み合わせて少なくとも1つの第1の初期電気応答信号から導出することができ、第2の電気応答は、少なくとも1つの第2の延長電気応答信号と組み合わせて少なくとも1つの第2の初期電気応答信号から導出することができる。或る実施形態において、第1および第2の延長時間窓は、定常状態電気応答値の99.8%に到達するために必要とされる時間以内で延長する。第1および第2の延長時間窓を規定するための20マイクロ秒より長いまたは短い他の時間枠が同様に利用され得る。
或る実施形態において、少なくとも2つの電極は、第1の対の電極および第2の対の電極を備え、少なくとも2つの電極間で第1の電気パルスを印加することは、第1の対の電極間で第1の電気パルスを印加することを含み、少なくとも2つの電極間で第2の電気パルスを印加することは、第1の対の電極間で第2の電気パルスを印加することを含み、第1の初期電気応答を検出することは、第2の対の電極の使用を含み、第2の初期電気応答を検出することは、第2の対の電極の使用を含む。
或る実施形態において、液体含有サンプルの第2の部分は、液体含有サンプルの第1の部分が流体チャネルに供給された後で、約10分以上たって流体チャネルに供給される。
別の態様において、液体含有サンプル内の少なくとも1つの病原体の存在を検出するためのシステムは、液体含有サンプルを受け取るように構成される流体チャネルと、流体チャネルと電気的連通状態にある少なくとも2つの電極と、少なくとも2つの電極と動作可能に結合されたパルス発生器回路要素であって、それにより、少なくとも2つの電極が液体含有サンプルの少なくとも一部分と電気的連通状態にあるときに、少なくとも2つの電極にわたる第1の電気パルスを生成し、少なくとも2つの電極が液体含有サンプルの少なくとも一部分と電気的連通状態にあるときに、少なくとも2つの電極にわたる第2の電気パルスを生成する、パルス発生器回路要素と、少なくとも2つの電極と動作可能に結合された信号検出回路要素であって、信号検出回路要素は、(i)第1の電気パルスの印加による、液体含有サンプルの少なくとも一部分の第1の初期電気応答を検出して、第1の電気パルスの状態の変化後に定常状態電気応答値の95%(または、本明細書で開示する別の閾値パーセンテージ)に到達するために必要とされる時間以内で延長する第1の初期時間窓内で電気応答を示す少なくとも1つの第1の初期電気応答信号を生成し、(ii)第2の電気パルスの印加による、液体含有サンプルの少なくとも一部分の第2の初期電気応答を検出して、第2の電気パルスの状態の変化後に定常状態電気応答値の95%(または、本明細書で開示する別の閾値パーセンテージ)に到達するために必要とされる時間以内で延長する第2の初期時間窓内で電気応答を示す少なくとも1つの第2の初期電気応答信号を生成するように構成される信号検出回路要素と、信号検出回路要素に動作可能に結合され、少なくとも1つの第2の初期電気応答信号を具現化する、または少なくとも1つの第2の初期電気応答信号から導出される第2の電気応答を、少なくとも1つの第1の初期電気応答信号を具現化する、または少なくとも1つの第1の初期電気応答信号から導出される第1の電気応答と比較するように構成される比較回路要素と、を備える。
或る実施形態において、少なくとも1つの第1の初期電気応答信号は、第1の初期時間窓内で得られる複数の測定された電気応答値から導出される少なくとも1つの曲線当てはめパラメータを含む。
の電極にわたる第1の電気パルスを生成し、信号検出回路要素は、第2の対の電極と動作可能に結合される。
別の態様において、液体含有サンプル内の少なくとも1つの病原体の存在を検出するための方法は、液体含有サンプルの少なくとも第1の部分を、流体チャネルと電気的連通状態にある少なくとも2つの電極に接触させるために、液体含有サンプルの少なくとも第1の部分を流体チャネルに供給すること;少なくとも2つの電極間に第1の電気パルスを印加すること;第1の電気パルスの状態の変化後に定常状態電気応答値の95%(または、本明細書で開示する別の閾値パーセンテージ)に到達するために必要とされる時間以内で延長する第1の初期時間窓内で電気応答を示す少なくとも1つの第1の初期電気応答信号を生成するために、第1の電気パルスの印加による、液体含有サンプルの少なくとも第1の部分の第1の初期電気応答を検出すること;液体含有サンプルの少なくとも第2の部分を、少なくとも2つの電極に接触させるために、液体含有サンプルの少なくとも第2の部分を流体チャネルに供給すること;少なくとも2つの電極間に第2の電気パルスを印加すること;第2の電気パルスの状態の変化後に定常状態電気応答値の95%(または、本明細書で開示する別の閾値パーセンテージ)に到達するために必要とされる時間以内で延長する第2の初期時間窓内で電気応答を示す少なくとも1つの第2の初期電気応答信号を生成するために、第2の電気パルスの印加による、液体含有サンプルの少なくとも第2の部分の第2の初期電気応答を検出すること;ならびに、少なくとも1つの第2の初期電気応答信号を具現化する、または少なくとも1つの第2の初期電気応答信号から導出される第2の電気応答を、少なくとも1つの第1の初期電気応答信号を具現化するまたは少なくとも1つの第1の初期電気応答信号から導出される第1の電気応答と比較することを含む。
当業者は、添付図面の図に関連する好ましい実施形態の以下の詳細な説明を読んだ後に、本開示の範囲を理解し、そのさらなる態様を認識するであろう。
connected)」または「直接結合される(directly coupled)」として参照されるとき、介在する要素は存在しない。
本開示は、液体媒体懸濁液内の生存微生物(例えば、病原体)を迅速に検出するための
システムおよび方法を提供する。少なくとも2つの電極は、微生物を含有すると考えられる液体媒体と電気的連通状態で設置される。第1の電気パルスが初期時刻に少なくとも2つの電極にわたって印加されると、第1の初期電気応答信号が生成され、そのような信号は、短い第1の初期時間窓内(第1の電気パルスの状態の変化後に定常状態電気応答値の95%(または、本明細書で開示する別の閾値パーセンテージ)に到達するために必要とされる時間以内)で電気応答を示す。その後、第2の電気パルスが後続の時刻に少なくとも2つの電極にわたって印加されると、第2の初期電気応答信号が生成され、そのような信号は、短い第2の初期時間窓内(第2の電気パルスの状態の変化後に定常状態電気応答値の95%(または、本明細書で開示する別の閾値パーセンテージ)に到達するために必要とされる時間以内)で電気応答を示す。電子的に測定することができる後続の時刻と初期時刻との間の電気応答の変化は、液体媒体内の1つまたは複数の病原体の増殖を立証することができる。そのような病原体は、細菌、ウィルス、真菌、イースト、胞子、および/または他の非哺乳類細胞を含むことができる。概して、非哺乳類細胞は、哺乳類細胞と異なる膜電位を有することになる。そのため、非哺乳類細胞は、電気パルスの印加に応答して、哺乳類細胞と異なるように、溶液の全体的な電気応答および/または電子記号に影響を及ぼすことになる。
い負値になることになり、ついには、ゼロ(すなわち、定常状態)に達する。定常状態条件の到達前の、電気パルスの状態の変化後の非常に短い時間窓に対応する初期電気応答信号の使用は、バルク溶液の電気特性が決定されることを可能にする。
迅速に生成されることを可能にする。そのため、開始溶液のベースライン測定は、高い程度の正値性になるように定量化され、数学的にモデル化される。媒体内に存在する病原体が増殖するため、バルク懸濁液の液体媒体特性および病原体電荷貯蔵特性の両方の測定可能な変化は、このベースラインに対して変化を受け易く、本明細書で開示する方法およびシステムを使用して、従来の技法の使用よりも迅速に検出可能である。或る実施形態において、延長時間窓は、少なくとも2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、150、200、250、500、750、または1000の倍数など、より短い初期時間窓の整数倍を含むことができる。
V=V0(1-e-t/τ)
として数学的に表され得る。
ここで、V0は入力信号の振幅であり、tは時間であり、τは生成される信号の時定数である。当業者によって認識されるように、他の数学的モデルが使用されて、本明細書で開示されるシステムの全体の電子特性の変化を追跡し得る。或る例は、y=a+b(1-e-cx)、y=a+b(1-e((x+c(ln2)1/d-b)/(c))d、およびy=a+((bc(e-cx)-e-dx)/(d-c))などの曲線当てはめ方程式を使用することを含む;しかしながら、他の曲線当てはめ方程式が同様に使用され得ることを当業者は認識するであろう。これらの方程式のそれぞれにおいて、パラメータは、振幅、最小電圧、最大電圧、指数関数的成長などのような種々の電子特性を数学的に示す。所定の期間にわたるパラメータまたはパラメータの組み合わせにおける変化は、懸濁液の電子特性の変化を表し、それは、次に、微生物(例えば、病原体)成長を表す。曲線の下の面積は、異なるパラメータの数学的関係によって決定することができる。或る実施形態において、曲線の下の面積は、2つのパラメータ値の割り算によって表される。パラメータおよびパラメータの組み合わせは全て、時間に対してプロットされる。所定の期間にわたるそのような値の変化は、懸濁液の電子特性の変化を示すことができる。
、(ii)TDIDシステムを使用した5つの1V DCパルスの印加に応答する、平均化した立ち上がりエッジ出力(応答)信号(破線で表す)についての、電圧対時間の重ね合わせプロットを提供する。平均化した立ち上がりエッジ出力または応答信号は、理想的な立ち上がりエッジ入力信号の曲線と形状が異なる曲線を具現化し、上記で概説した曲線当てはめ方程式に従って数学的にモデル化される対象になる。
DCパルスの立ち下がりエッジ(DC入力信号の終了に対応する)についての、平均電圧対時間のプロットである。平均出力または応答信号は、対応する入力信号(示さないが、0.5Vから-0.5Vへの瞬時低下として表すことができる)と形状が異なる曲線を具現化し、上記で概説した曲線当てはめ方程式に従って数学的にモデル化される対象になる。
。比較器は、所望の成果に応じて種々のレベルに設定され得る。或る実施形態において、比較器は、入力パルスの開始と、出力信号が全体最大(入力)信号の66%である状態との間の時間遅延をレポートするように設定することができ、結果として生じる時間遅延は、システムの時定数を表すことになる。例えば、図6は、初期「ベース」電圧(-0.5V)に対応する第1の(下側)水平矢印、および、660mV立ち上がり(すなわち、出力電圧における66%の上昇を表す)に対応する第2の(上側)水平矢印を含むように修正された、図3Bと同じ電圧対時間データプロット(曲線当てはめなし)を示し、両方の矢印について、立ち上がり時間を決定するために、対応する時間差を計算することができる。
信号を表示するために使用することができる。
商標)ソフトウェア(Parametric Technology Corporation、米国マサチューセッツ州ニードハム(Needham,Massachusetts,US))、AUTOCAD(登録商標)ソフトウェア(Autodesk,Inc
.,米国カルフォルニア州サンラファエル(San Rafael,Californi
a,US)、または同様なもの)により種々の3次元設計をすることができる。付加および/または除去製造プロセスを使用することができる。流体デバイスは、当業者によって認識されるように、3D印刷、射出成形、(レーザー除去、ブレードカッティング、または同様なものによって種々の材料を通して規定可能な)ステンシル層の積層および圧縮または付着、フォトリソグラフィによる特徴画定とそれに続くエッチング、または他の方法を通して作製され得る。チャネルを含む流体デバイスは、異なるタイプの非導電性材料を用いて印刷することができる。1つのそのような例は、光硬化性ポリマー樹脂であるが、他の材料を使用することができる。
を当てはめ、方程式の個々のパラメータを得ることによって実施され得る。1つのそのようなパラメータは、方形パルスにおける指数関数的立ち上がりであり得る。或る実施形態において、曲線の下の面積は、当てはめパラメータに基づく数学的計算を使用することによって決定され得る。或る実施形態において、立ち上がり時間は、測定チャネル電極から受信される信号が予め指定された状態の変化(例えば、電圧パルスの開始または終了)から立ち上がるのにかかる時間を計算することによって決定することができる。或る実施形態において、データ生成および分析のプロセスは、指定された期間にわたって反復されて、バルク懸濁液内の生存微生物(例えば、病原体)の存在または非存在を判定する。
図8Aは、一実施形態による流体デバイス50の概略的な斜視図であり、流体デバイス50は、本体構造52の側壁を通って突出するチャネル伸長部54A、54Bを有する流体チャネル54を含み、また、流体チャネル54に垂直に配置された2つの円柱電極56A、56Bを含む。図示するように、各電極56A、56Bの中心線が流体チャネル54の中心線53に交差する。流体デバイス50の使用時、液体媒体および微生物を含有する懸濁液は、流体デバイス50を通って流れ、電極56A、56Bに接触することができる。1つまたは複数の電気パルスを、電極56A、56Bに印加することができ、同じ電極56A、56Bを、流体デバイス50の電気応答および/または流体チャネル54の内容物を検出するために使用することができる。例えば、短い初期時間窓(例えば、電気パルスの状態の変化後の200ナノ秒以内)内の電気パルスに対する電気応答は、電極56A、56Bの間の懸濁液のバルク電気応答が、電極56A、56Bの表面における2重層形成によって電気応答信号が支配される前に決定されることを可能にし、一方、延長時間窓(例えば、電気パルスの状態の変化後の約20マイクロ秒以内)内の電気応答は、初期電気応答信号を正規化するために使用することができる。
ート65A、65Bを含むことができる。図8Aのデバイス50と同様の方法で、1つまたは複数の電気パルスを、電極66A、66Bに印加することができ、同じ電極66A、66Bを、流体デバイス60の電気応答および/または流体チャネル64の内容物を検出するために使用することができる。
ントで具現化される、外部流体インターフェース(図示せず)にインターフェースするための取り付け具またはポート95A、95Bを含むことができる。
に同様に結合することができる。ポンプ136が示されるが、流体チャネル54にバルク懸濁液を供給するために、圧力源および/または真空源、重力流装置、または同様なものなどの任意の適した流体移送デバイスが、使用され得ることが理解される。
またはモーター駆動式ロッキング装置を使用する)が使用されて、バルク懸濁液の所定の部分が、測定チャネル内にまた測定チャネルから外に移動するようにさせる可能性がある。別の例として、蠕動ポンピングが使用されて、バルク懸濁液の所定の部分を、測定チャネル内に、また測定チャネルから外に移動させ得る。測定チャネル内にサンプルの所定の部分を導入するための他の自動化方法が使用され得る。
印加および測定は、所定の期間にわたって周期的に反復されて、バルク懸濁液の特性の変化を決定した。
[例1]
図8Bによる流体チャネルを含む流体デバイスの3D設計が、SOLIDWORKS(登録商標)を使用して行われ、Eden 350/350Bプリンターを使用する3D印刷によって作製された。3D印刷された流体デバイスは、非導電性で透明で剛性がありほぼ無色の材料であるveroclear-rgea10で作られた。これらのカセットは、1mm高さ、1mm幅、および10mm長さの寸法を有するトレンチチャネルを含み、長さ寸法は電極間に延在した。それぞれの3D印刷された流体デバイスは、石鹸および温水でこすり洗いすることによって徹底的にクリーニングされた。乾燥後、各流体デバイスは、両面医療等級接着剤(約10ミクロン厚)によってガラス顕微鏡スライドにシールされて、閉鎖測定チャネルを形成した。使用する前に、ガラススライドは、アセトン、エタノール、および水によってそれぞれクリーニングされた。
大腸菌(Escherichia coli)(ATCC 25922)およびクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)(ATCC 700603)が本調査において使用された。細菌の負荷培養を生成するために、大腸菌およびクレブシエラ・ニューモニエが共に、トリプチックソイブイヨン培地(TSB:Tryptic Soy Broth)(RPI Corp.)内で37℃で10~14時間の間、一晩、培養された。懸濁液は、10分の間、スピンダウンされ、新鮮な無菌TSB内で2回、再懸濁された。再懸濁されたサンプルの光学密度は、約108CFU/mlの濃度を得るために調整された。懸濁液は、その後、約102CFU/mlの濃度まで段階的に希釈された。適切な希釈液が、30mlの作りたての無菌TSBに添加されて、大腸菌について2CFU/mlおよび40CFU/mlの、そして、クレブシエラ・ニューモニエについて70CFU/mlの初期負荷を与えた。TSBのみを含有する(微生物を含まない)対照が、この調査において同様に使用された。対照は、実験の最中に汚染されず、そのことは、各時点で(すなわち、30分ごとに)プレーティングによって確認された。懸濁液―すなわち、微生物含有サンプルおよび対照の両方―は、その後、初期の読み取りが行われる前に、30分の間、37℃で培養された。
、10KHzの周波数および1V(ピーク・ピーク間)電圧を有する電気方形パルスを電極に印加することによって行われた。同じ電極が、電気応答を検出するために使用された。このプロセスは、プレーティングのための適切な希釈と共に、8hrの期間の間、30分ごとに反復された。
y=a+b(1-e-cx)
ここで、yは出力電圧であり、xは時間であり、aは初期電圧値(切片)であり、bはパルスの振幅であり、cは曲線の指数関数成分である。ベースラインからのパラメータCの増加は、サンプル組成物内の病原体の存在を示した。そのため、パラメータCにおける定常的な増加の欠如は、病原体成長の欠如を示した。パラメータCについてのパーセンテージ変化は、約2CFU/ml初期負荷を有する大腸菌サンプルの場合、約6.0%、約40CFU/ml初期負荷を有する大腸菌サンプルの場合、約3.0%、約70CFU/ml初期負荷を有するクレブシエラ・ニューモニエサンプルの場合、約5.0%であると決定された。所定の期間にわたって、パラメータCについてのパーセンテージ変化は、対照(TSBのみ)について約±1.0%の間で変動した。図13は、約2CFU/ml初期負荷大腸菌サンプルについての、パラメータCのパーセンテージ変化対時間のグラフである。図14は、約70CFU/ml初期負荷クレブシエラ・ニューモニエについての、パラメータC対時間のグラフである。図15は、約40CFU/ml初期負荷大腸菌および対照(TSBのみ)についての、パラメータC対時間のグラフである。データ分析は、立ち上がり時間の計算を同様に含んだ。立ち上がり時間は、出力電圧が、予め指定された電圧まで立ち上がるために必要な時間量であり、この場合、0.63V(定常状態電圧の63%)である。立ち上がり時間および病原体(微生物)カウントは、反比例関係を有するため、病原体が増殖するにつれて、立ち上がり時間は減少する。図16は、TSB内の70CFU/mlのクレブシエラ・ニューモニエ(ATCC 700603)の初期負荷を用いた、本明細書で開示するTDIDシステムを利用した8hr実験についての、時定数(μs)対時間(hrs)のプロットである。この特定の場合、立ち上がり時間は、図16に示すように、約70CFU/ml初期負荷を有するクレブシエラ・ニューモニエサンプルについて約5.0%減少した。
1mm径および電極間に5mmの距離を有する測定チャネルを含む図12Aによる使い捨て閉鎖閉じ込め組み立て体200が、設計され、非導電性樹脂を使用して3D印刷された(デバイスは、この例の残りの部分において、ボトルと呼ばれる)。ボトルのリザーバの最大流体保持容量は90mlであった。
ビングを含んだ。それぞれの読み取りの前に、蠕動ポンプは、ボトルのチューブと接触して、特定の時間の間、チャネル内に新鮮流体をポンピングした。
y=a+b(1-e-cx)
ここで、yは出力電圧であり、xは時間であり、aは初期電圧値(切片)であり、bはパルスの振幅であり、cは曲線の指数関数成分である。この特定の場合、実験の最中のベースラインからのパラメータCの増加は、サンプル組成物内の病原体の存在を示した。パラメータCについてのパーセンテージ変化は、6時間の実験にわたって約3.0%であると決定された。図17はパラメータC対時間のグラフである。
流体デバイスは、例1において上記で述べたのと同じ方法で作られた。各流体デバイスは、1mm×1mm×50mmの高さ×幅×長さ(2つの電極間)寸法を有する流体トレンチチャネルを含んだ。電極は、測定チャネルの幅に沿ってオフセットした。それぞれの3D印刷された流体デバイスは、石鹸および温水でこすり洗いすることによって徹底的にクリーニングされた。乾燥後、各流体デバイスは、医療等級接着剤によってガラス顕微鏡スライドにシールされて、閉鎖測定チャネルを形成した。使用する前に、ガラス顕微鏡スライドは、石鹸および水でクリーニングされた。
に希釈された。
y=(a/π)[arctan((x-b)/c)+(π/2)]
ここで、yは出力電圧であり、xは時間であり、aは初期電圧値(切片)であり、bは遷移高さであり、cは遷移中心であり、dは遷移幅である。初期濃度からのパラメータbおよびdの減少は、サンプル組成物内の病原体(細菌)の濃度の増加を示す。
図19は、各濃度(104、105、106、107、および108CFU/ml)の3つのアリコートの分析についての、パラメータd(マイクロ秒単位)対細菌の濃度のプロットであり、細菌濃度の増加に伴うパラメータdの実質的な曲線の減少を示す。
B内の2つの異なる濃度(104CFU/mlおよび108CFU/ml)の大腸菌の場合の、20の1V DCパルスの印加に応答する、平均の立ち上がりエッジ出力(応答)信号についての、電圧(V)対時間(μs)のプロットである。そのような図は、約0ボルトの電圧値の上のまたその下の2つの応答信号の差を示し、2つのプロットの間の完全オーバラップの欠如を立証した。
Claims (25)
- 液体含有サンプル内の少なくとも1つの病原体の存在を検出するための方法であって、
前記液体含有サンプルの少なくとも一部分と電気的連通状態にある少なくとも2つの電極間に第1の電気パルスを印加することと、
前記第1の電気パルスの状態の変化後に定常状態電気応答値の95%に到達するために必要とされる時間以内で延長する第1の初期時間窓内で電気応答を示す少なくとも1つの第1の初期電気応答信号を生成するために、前記第1の電気パルスの印加による、前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分および前記少なくとも2つの電極の第1の初期電気応答を検出することと、
前記液体含有サンプルの少なくとも一部分と電気的連通状態にある前記少なくとも2つの電極間に第2の電気パルスを印加することと、
前記第2の電気パルスの状態の変化後に前記定常状態電気応答値の95%に到達するために必要とされる時間以内で延長する第2の初期時間窓内で電気応答を示す少なくとも1つの第2の初期電気応答信号を生成するために、前記第2の電気パルスの印加による、前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分および前記少なくとも2つの電極の第2の初期電気応答を検出することと、および、
前記少なくとも1つの第2の初期電気応答信号を具現化する、または前記少なくとも1つの第2の初期電気応答信号から導出される第2の電気応答を、前記少なくとも1つの第1の初期電気応答信号を具現化する、または前記少なくとも1つの第1の初期電気応答信号から導出される第1の電気応答と比較することと、を含む、方法。 - 前記第1の電気パルスが印加される前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分は、前記液体含有サンプルの第1の部分を含み、
前記第1の初期電気応答が検出される前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分は、前記液体含有サンプルの前記第1の部分を含み、
前記第2の電気パルスが印加される前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分は、前記液体含有サンプルの第2の部分を含み、
前記第2の初期電気応答が検出される前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分は、前記液体含有サンプルの前記第2の部分を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第1の電気パルスが印加される前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分は、前記第2の電気パルスが印加される前記液体含有サンプルの同じ少なくとも一部分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの電極は、流体チャネルと電気的連通状態にあり、前記方法は、
前記第1の電気パルスを印加する前に前記流体チャネルに前記液体含有サンプルの前記第1の部分を供給すること、および、
前記第2の電気パルスを印加する前に前記流体チャネルに前記液体含有サンプルの前記第2の部分を供給することをさらに含む、請求項2に記載の方法。 - 以下の特徴(i)または(ii):(i)前記第1の電気パルスの状態の変化は電流増加または電圧増加を含むこと、または、(ii)前記第2の電気パルスの状態の変化は電流増加または電圧増加を含むこと、の少なくとも一方を含む、請求項1に記載の方法。
- 以下の特徴(i)または(ii):(i)前記第1の電気パルスの状態の変化は電流低下または電圧低下を含むこと、または、(ii)前記第2の電気パルスの状態の変化は電流低下または電圧低下を含むこと、の少なくとも一方を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの第1の初期電気応答信号は、所定の、またはユーザーにより決定
された電圧または電流値の到達に対応する時間値を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの第1の初期電気応答信号は、前記第1の初期時間窓内で得られる複数の測定された電気応答値から導出される少なくとも1つの曲線当てはめパラメータを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の電気パルスおよび前記第2の電気パルスのそれぞれは、直流電気信号を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の電気パルスの状態の変化後に、少なくとも約5倍前記第1の初期時間窓より長く延長する第1の延長時間窓内で電気応答を示す少なくとも1つの第1の延長電気応答信号を生成するために、前記第1の電気パルスの印加による、前記液体含有サンプルの前記第1の部分および前記少なくとも2つの電極の第1の延長電気応答を検出することと、
前記第2の電気パルスの状態の変化後に、少なくとも約5倍前記第2の初期時間窓より長く延在する第2の延長時間窓内で電気応答を示す少なくとも1つの第2の延長電気応答信号を生成するため、前記第2の電気パルスの印加による、前記液体含有サンプルの前記第2の部分および前記少なくとも2つの電極の第2の延長電気応答を検出することと、および、
前記第1の電気応答を導出するために前記少なくとも1つの第1の初期電気応答信号を正規化するために、前記少なくとも1つの第1の延長電気応答信号を利用することと、および、前記第2の電気応答を導出するために前記少なくとも1つの第2の初期電気応答信号を正規化するために、前記少なくとも1つの第2の延長電気応答信号を利用することと、をさらに含む、請求項2に記載の方法。 - 前記第1の初期時間窓は、前記第1の電気パルスの状態の変化後の、約100ナノ秒以内に延長し、前記第2の初期時間窓は、前記第2の電気パルスの状態の変化後の、約100ナノ秒以内に延長する、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の電気パルスの印加時刻と前記第2の電気パルスの印加時刻との間で前記少なくとも1つの病原体の成長を促す条件下でリザーバ内に前記液体含有サンプルを維持することをさらに含み、
前記流体チャネルに前記液体含有サンプルの前記第1の部分を供給することは、前記液体含有サンプルの前記第1の部分を、前記リザーバから前記流体チャネルに移送することを含み、
前記流体チャネルに前記液体含有サンプルの前記第2の部分を供給することは、前記液体含有サンプルの前記第2の部分を、前記リザーバから前記流体チャネルに移送することを含む、請求項4に記載の方法。 - 以下のステップ(A)または(B):(A)前記液体含有サンプルの前記第1の部分を前記流体チャネルから前記リザーバに戻すこと、または、(B)前記液体含有サンプルの前記第2の部分を前記流体チャネルから前記リザーバに戻すこと、の少なくとも一方をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 前記液体含有サンプルの前記第2の部分は、前記液体含有サンプルの前記第1の部分の少なくともサブセットを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの電極は、第1の対の電極および第2の対の電極を備え、
前記少なくとも2つの電極間で前記第1の電気パルスを印加することは、前記第1の対の電極間で前記第1の電気パルスを印加することを含み、
前記少なくとも2つの電極間で前記第2の電気パルスを印加することは、前記第2の対
の電極間で前記第2の電気パルスを印加することを含み、
前記第1の初期電気応答を検出することは、前記第2の対の電極の使用を含み、
前記第2の初期電気応答を検出することは、前記第2の対の電極の使用を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記液体含有サンプルの前記第2の部分は、前記液体含有サンプルの前記第1の部分が前記流体チャネルに供給された後で、約10分以上たって前記流体チャネルに供給される、請求項4に記載の方法。
- 前記液体含有サンプルの前記第2の部分は、前記液体含有サンプルの前記第1の部分が前記流体チャネルに供給された後で、約1時間以上たって前記流体チャネルに供給される、請求項4に記載の方法。
- 液体含有サンプル内の少なくとも1つの病原体の存在を検出するためのシステムであって、
前記液体含有サンプルを受け取るように構成される流体チャネルと、
前記流体チャネルと電気的連通状態にある少なくとも2つの電極と、
前記少なくとも2つの電極と動作可能に結合されたパルス発生器回路要素であって、前記少なくとも2つの電極が前記液体含有サンプルの少なくとも一部分と電気的連通状態にあるときに、前記少なくとも2つの電極にわたる第1の電気パルスを生成し、前記少なくとも2つの電極が前記液体含有サンプルの少なくとも一部分と電気的連通状態にあるときに、前記少なくとも2つの電極にわたる第2の電気パルスを生成する、パルス発生器回路要素と、
前記少なくとも2つの電極と動作可能に結合された信号検出回路要素であって、(i)前記第1の電気パルスの印加による、前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分の第1の初期電気応答を検出して、前記第1の電気パルスの状態の変化後に定常状態電気応答値の95%に到達するために必要とされる時間以内で延長する第1の初期時間窓内で電気応答を示す少なくとも1つの第1の初期電気応答信号を生成し、(ii)前記第2の電気パルスの印加による、前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分の第2の初期電気応答を検出して、前記第2の電気パルスの状態の変化後に前記定常状態電気応答値の95%に到達するために必要とされる時間以内で延長する第2の初期時間窓内で電気応答を示す少なくとも1つの第2の初期電気応答信号を生成するように構成される、信号検出回路要素と、
比較回路要素であって、前記信号検出回路要素に動作可能に結合され、前記少なくとも1つの第2の初期電気応答信号を具現化するまたは前記少なくとも1つの第2の初期電気応答信号から導出される第2の電気応答を、前記少なくとも1つの第1の初期電気応答信号を具現化するまたは前記少なくとも1つの第1の初期電気応答信号から導出される第1の電気応答と比較するように構成される比較回路要素と、を備える、システム。 - 前記第1の電気パルスが生成される前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分は前記液体含有サンプルの第1の部分を含み、
前記少なくとも1つの第1の初期電気応答信号が生成される前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分は前記液体含有サンプルの前記第1の部分を含み、
前記第2の電気パルスが生成される前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分は前記液体含有サンプルの第2の部分を含み、
前記少なくとも1つの第2の初期電気応答信号が生成される前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分は前記液体含有サンプルの前記第2の部分を含む、請求項18に記載のシステム。 - 前記液体含有サンプルを保持するように構成されるリザーバをさらに備え、前記流体チ
ャネルは、前記リザーバから前記液体含有サンプルの前記第1の部分および前記液体含有サンプルの前記第2の部分を受け取るように構成される、請求項19に記載のシステム。 - 前記液体含有サンプルの前記第1の部分および前記第2の部分を、前記リザーバから前記流体チャネルに移送するように構成される流体移送デバイスをさらに備える、請求項20に記載のシステム。
- 前記少なくとも1つの第1の初期電気応答信号は、所定のまたはユーザーにより決定された電圧または電流値の到達に対応する時間値を含む、請求項18に記載のシステム。
- 前記少なくとも1つの第1の初期電気応答信号は、前記第1の初期時間窓内で得られる複数の測定された電気応答値から導出される少なくとも1つの曲線当てはめパラメータを含む、請求項18に記載のシステム。
- 前記少なくとも2つの電極は、第1の対の電極および第2の対の電極を備え、
前記パルス発生器回路要素は、前記第1の対の電極と動作可能に結合されて、前記第1の対の電極が前記液体含有サンプルの前記少なくとも一部分と電気的連通状態にあるときに、前記第1の対の電極にわたる前記第1の電気パルスを生成し、
前記信号検出回路要素は、前記第2の対の電極と動作可能に結合される、請求項18に記載のシステム。 - 液体含有サンプル内の少なくとも1つの病原体の存在を検出するための方法であって、
前記液体含有サンプルの前記少なくとも第1の部分を、前記流体チャネルと電気的連通状態にある少なくとも2つの電極に接触させるために、前記液体含有サンプルの少なくとも第1の部分を流体チャネルに供給することと、
前記少なくとも2つの電極間に第1の電気パルスを印加することと、
前記第1の電気パルスの状態の変化後に定常状態電気応答値の95%に到達するために必要とされる時間以内で延長する第1の初期時間窓内で電気応答を示す少なくとも1つの第1の初期電気応答信号を生成するために、前記第1の電気パルスの印加による、前記液体含有サンプルの前記少なくとも前記第1の部分の第1の初期電気応答を検出することと、
前記液体含有サンプルの前記少なくとも第2の部分を、前記少なくとも2つの電極に接触させるために、前記液体含有サンプルの少なくとも第2の部分を前記流体チャネルに供給することと、
前記少なくとも2つの電極間に第2の電気パルスを印加することと、
前記第2の電気パルスの状態の変化後に前記定常状態電気応答値の95%に到達するために必要とされる時間以内で延長する第2の初期時間窓内で電気応答を示す少なくとも1つの第2の初期電気応答信号を生成するために、前記第2の電気パルスの印加による、前記液体含有サンプルの前記少なくとも第2の部分の第2の初期電気応答を検出することと、および、
前記少なくとも1つの第2の初期電気応答信号を具現化する、または前記少なくとも1つの第2の初期電気応答信号から導出される第2の電気応答を、前記少なくとも1つの第1の初期電気応答信号を具現化する、または前記少なくとも1つの第1の初期電気応答信号から導出される第1の電気応答と比較することと、を含む、方法。
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