JP2023015327A - 高効率標的in situゲノムワイドプロファイリング - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年9月25日に出願された米国仮特許出願第62/562,918号の恩典を主張するものであり、その全体がこれにより参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
本開示は、クロマチンプロファイリングの方法に関する。具体的には、本開示は、転写因子およびヌクレオソームなどのDNA結合タンパク質をプロファイリングするための方法であって、トランスポザーゼまたはヌクレアーゼなどの酵素による、抗体標的化制御切断によって、DNAシーケンシングのための結合DNAが放出される、方法に関する。
転写因子(TF)の、DNA上のそれらの結合部位における作用は、遺伝子発現パターンを推進し、そのためゲノムワイドTFマッピングは、個々の研究者らおよび大規模なインフラストラクチャープロジェクトの両方にとっての中心的目標になっている。TFプロファイリングは、30年以上前にそれが最初に導入されて以来ほとんど変化していないプロトコールである、クロマチン免疫沈降(ChIP)を使用して最もよく行われる(Solomon and Varshavsky, 1985)。細胞をホルムアルデヒドで架橋し、クロマチンを断片
化および可溶化し、抗体を添加し、抗体に結合したクロマチンをDNA抽出のために回収する。DNAマッピング技術の継続的進歩は、X-ChIP(ホルムアルデヒド架橋ChIP)の使用に大変革をもたらしており、ChIP-seqとともに、TFの塩基対分解能マッピングが実現可能になった(Rhee and Pugh, 2011;Skene and Henikoff, 2015;He et al., 2015)。
的のタンパク質に結合した標的DNA部位のライブラリーを産生し得る。超並列シーケンシングの到来とともに、ライブラリーを迅速に分析し得、全ゲノム配列データベースにマッピングして、任意のタンパク質とDNAとの相互作用パターン、または任意のエピジェネティッククロマチン修飾のパターンを判定し得る。これは、転写因子、ポリメラーゼおよび転写装置、構造タンパク質、タンパク質修飾、ならびにDNA修飾など、一連のChIP可能なタンパク質および修飾に適用され得る。ChIPシーケンシング(ChIP-seq)を使用して、例えば遺伝子発現を調節するために、どのようにタンパク質がDNAと相互作用するのかを判定し得る。ChIP-seq技術は、現在、主に、ハイブリダイゼーションアレイを必要とするChIPチップに代わるものとして見られている。アレイは固定数のプローブに制限されるので、これは必然的に何らかのバイアスを導入する。ChIP-seqへの向上は、ゲノム全体を断片化して免疫沈降のための可溶性抽出物を創出する間、in vivoパターンを保つ架橋ステップを保持する。しかしながら、架橋はエピトープマスキングを促進し得、偽陽性結合部位を生成し得る(Teytelman et al., 2013;Park et al., 2013;Jain et al., 2015;Baranello et al., 2016;Meyer and Liu, 2014)。ChIPは、静電接触を妨げないイオン条件を使用して、架橋なしでも実施され得る(Kasinathan et al., 2014)。「ネイティブ」ChIPは直接的なタンパク質-DNA相互作用のマップを提供し、感度および特異度トレードオフはX-ChIP法に勝るとも劣らない。ネイティブChIPは、エピトープマスキングに関する問題も最小限に抑え、X-ChIPと比べて効率を向上させ、したがって、出発細胞数が低い場合に、より適している(O'Neill et al., 2006;Brind'Amour et al.,
2015)。しかし、タンパク質-DNA複合体の不完全な抽出効率、および結合の潜在的喪失に関する問題は残る。また、可溶化は、全クロマチンを抗体に曝露し、非特異的バックグラウンドをもたらし、それがシグナル対ノイズを限定し、特異的なクロマチン特質を見分ける余分なシーケンシングを必要とする。これらのバイアスおよび非効率性が理由で、ChIPは多数の細胞を必要とするので、例えば限定された数の初代細胞または少量の組織しかない場合には不適切である。ゆえに、新しくかつより優れた、ChIPに基づかない方法が必要とされる。本開示はそれらの必要性を満たす。
実施形態は、添付の図面と併せて後続の詳細な説明によってよりよく理解されるであろう。実施形態は、例として示されるものであり、添付の図面の図に限定する目的で示されるものではない。
A.用語および定義
以下の詳細な説明において、本明細書の一部を形成し、実践され得る実施形態が図解によって示されている添付の図面への言及がなされる。他の実施形態が利用され得、範囲から逸脱することなく構造的または論理的変化が加えられ得ることが理解されるべきである。それゆえ、以下の詳細な説明は、限定的な意味で取られるべきではなく、実施形態の範囲は、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によって規定される。
米国特許第5,866,336号に記載される、修飾塩基、修飾糖部分、および修飾リン酸骨格を含有するそうしたヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチドをその構造上の任意の位置で修飾するために使用され得る修飾塩基部分の例としては、それらに限定されるわけではないが、数ある中でも、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルクエオシン、イノシン、N~6-イソペンテニルアデニン(sopentenyladenine)、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2
-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、メトキシアミノメチル(methoxyarninomethyl)-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルクエオシ
ン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、シュードウラシル(pseudouracil)、クエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-S-オキシ酢酸、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、2,6-ジアミノプリン、およびビオチン化アナログが挙げられる。ヌクレオチドをその構造上の任意の位置で修飾するために使用され得る修飾糖部分の例としては、それらに限定されるわけではないが、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシロース、およびヘキソース、またはリン酸骨格の修飾成分、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、もしくはホルムアセタール(formacetal)、またはそのアナログが挙げられる。
る流体を包含する)、脳脊髄液(CSF)、唾液、粘液、痰、汗、尿、もしくは」他の任意の分泌物、排出物、または他の体液であり得る。
& Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988;Higgins & Sharp,
Gene, 73:237-44, 1988;Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-3, 1989;Corpet
et al, Nuc. Acids Res. 16: 10881-90, 1988;Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992;およびPearson et al, Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994に記載されている。Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990は、配列アライメント法および相同性算出の詳細な検討を提示してい
る。
Biol. 215:403-10, 1990)は、配列分析プログラムのblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxと関連した使用のために、国立生物工学情報センター(NCBI:National Center for Biological Information、National Library of Medicine、Building 38A、Room 8N805、Bethesda、Md.20894)を含めたいくつかの発信元からおよびインターネットで利用可能である。blastnは核酸配列を比較するために使用され、一方でblastpはアミノ酸配列を比較するために使用される。さらなる情報は、NCBIウェブサイトに見い出され得る。
に記載される)を使用する。一部の実施形態では、特異的結合剤は抗体である。
Rアルファ3、RORベータ、RORガンマ、Rox、RPF1、RPGアルファ、RREB-1、RSRFC4、RSRFC9、RVF、RXR-アルファ、RXR-ベータ、SAP-la、SAPlb、SF-1、SHOX2a、SHOX2b、SHOXa、SHOXb、SHP、SIII-pl lO、SIII-pl5、SIII-pl8、SIM’、Six-1、Six-2、Six-3、Six-4、Six-5、Six-6、SMAD-1、SMAD-2、SMAD-3、SMAD-4、SMAD-5、SOX-11、SOX-12、Sox-4、Sox-5、SOX-9、Spl、Sp2、Sp3、Sp4、Sph因子、Spi-B、SPIN、SRCAP、SREBP-la、SREBP-lb、SREBP-lc、SREBP-2、SRE-ZBP、SRF、SRY、SRPl、Staf-50、STATlアルファ、STATlベータ、STAT2、STAT3、STAT4、STAT6、T3R、T3R-アルファl、T3R-アルファ2、T3R-ベータ、TAF(I)110、TAF(I)48、TAF(I)63、TAF(II)100、TAF(II)125、TAF(II)135、TAF(II)170、TAF(II)18、TAF(II)20、TAF(II)250、TAF(II)250デルタ、TAF(II)28、TAF(II)30、TAF(II)31、TAF(II)55、TAF(II)70-アルファ、TAF(II)70-ベータ、TAF(II)70-ガンマ、TAF-I、TAF-II、TAF-L、Tal-1、Tal-lベータ、Tal-2、TAR因子、TBP、TBX1A、TBX1B、TBX2、TBX4、TBXS(長いアイソフォーム)、TBXS(短いアイソフォーム)、TCF、TCF-1、TCF-1A、TCF-1B、TCF-1C、TCF-1D、TCF-1E、TCF-1F、TCF-1G、TCF-2アルファ、TCF-3、TCF-4、TCF-4(K)、TCF-4B、TCF-4E、TCFベータl、TEF-1、TEF-2、tel、TFE3、TFEB、TFIIA、TFIIA-アルファ/ベータ前駆体、TFIIA-アルファ/ベータ前駆体、TFIIA-ガンマ、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIE-アルファ、TFIIE-ベータ、TFIIF、TFIIF-アルファ、TFIIF-ベータ、TFIIH、TFIIH*、TFIIH-CAK、TFIIH-サイクリンH、TFIIH-ERCC2/CAK、TFIIH-MAT1、TFIIH-M015、TFIIH-p34、TFIIH-p44、TFIIH-p62、TFIIH-p80、TFIIH-p90、TFII-I、Tf-LFl、Tf-LF2、TGIF、TGIF2、TGT3、THRAl、TIF2、TLE1、TLX3、TMF、TR2、TR2-11、TR2-9、TR3、TR4、TRAP、TREB-1、TREB-2、TREB-3、TREFl、TREF2、TRF(2)、TTF-1、TXRE BP、TxREF、UBF、UBP-1、UEF-1、UEF-2、UEF-3、UEF-4、USF1、USF2、USF2b、Vav、Vax-2、VDR、vHNF-lA、vHNF-lB、vHNF-lC、VITF、WSTF、WT1、WT1I、WT1 I-KTS、WT1 I-del2、WT1-KTS、WTl-del2、X2BP、XBP-1、XW-V、XX、YAF2、YB-1、YEBP、YY1、ZEB、ZF1、ZF2、ZFX、ZHX1、ZIC2、ZID、ZNF174が挙げられる。
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990;およびHarlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999を含めた、様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されている。加えて、材料、方法、および例は単なる例示であり、限定的であることが意図されるわけではない。
B.序論
、Escherichia coli DamメチルトランスフェラーゼがTFに繋留され、in vivoにおけるGATC部位でアデニンのN6-メチル化を触媒する。部位は、N6-メチル指向性制限酵素を使用してゲノムワイドでマッピングされ得る。しかしながら、DamIDの分解能はGATC部位の分布によって限定されるので、DamIDは、シーケンシングリードアウトを使用して潜在的に到達可能な高い分解能を得ることができない(Aughey and Southall, 2016)。代替的な酵素繋留法であるクロマチン内因性切断(ChEC)は、TFにエンド-エキソヌクレアーゼであるミクロコッカスヌクレアーゼ(MNase)を繋留する(Schmid et al., 2004)。ChECにおいて、MNaseは、細胞を透過処理することおよび制御された切断のためにカルシウムを添加することによって活性化される。最近、IlluminaシーケンシングリードアウトがChECに適用され(ChEC-seq)、塩基対分解能をほぼ達成した(Zentner et al., 2015)。酵素繋留法はin vivo(DamID)またはin situ(ChE
C)で行われ、DNAの抽出は生きたまたは透過処理された細胞から直接なされ、ゆえにクロマチンを可溶化および回収する必要性が排除されるので、酵素繋留法はChIPとは根本的に異なる。DamIDおよびChECの両方とも、マッピングされる対象となる各TFに対して、異なるキメラ融合構築物を産生することを必要とし、これは、例えば動物モデル、患者生検、および翻訳後修飾へのそれらの移行可能性を限定する。もともとのクロマチン免疫切断(ChIC)法では、架橋された細胞由来の粗核がまずTF特異的抗体で処置され、その後に、プロテインAとMNaseとの間のキメラ融合体(pA-MN)の添加、およびカルシウムによる活性化が続く(Schmid et al., 2004)。プロテインAは免疫グロブリンGに特異的に結合し、それにより融合タンパク質の必要性がなくなる。
C.例示的な実施形態の説明
ることによって、開示される方法は、そうでなければ断片化および他の処理ステップによって変更され得るであろう自然のままのクロマチン構造を見るという、ChIP法に勝る利点を有する。実施形態では、ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼは、例えば外因性アクチベーターを使用して活性化される。活性化されると、ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼは、目的のクロマチン関連因子に結合しているDNAの配列を切り出し得る。ある特定の実施形態では、目的のクロマチン関連因子に結合しているDNAを切り出すのに十分な時間であるが、ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼが拡散して接近可能なDNAを非特異的にカットしないような十分に短い時間、反応を進ませる。ある特定の実施形態では、この時間は約1秒間~約4時間である。
そらく線形である望ましくない副作用である。ヌクレアーゼを不活性化した後、目的のクロマチン関連因子に結合している切り出されたDNAを回収する。この切り出されたクロマチンを単離しおよび調査して、切り出されたDNAの配列を決定し、それによって、細胞(または細胞の集団)内のDNAの配列への目的のクロマチン関連因子の結合を検出することができる。
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y.)によって行われる。
Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters," in: Current Protocols
in Immunology, section 2.4.1, 1992を参照されたい。モノクローナル抗体の調製は同じように従来的である。例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495, 1975;Coligan et al., sections 2.5.1-2.6.7;およびHarlow et al., in: Antibodies: a Laboratory Manual, page 726, Cold Spring Harbor Pub., 1988を参照
されたい。記載されるように同定されおよび単離された標的または内在化受容体ポリペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein(Nature 256:495, 1975)の古典的方法またはその派生法に従ってマウスハイブリドーマから調製され得る。特異的抗体は、ヒトに近い霊長類抗体にも由来し得る。ヒヒにおいて治療上有用な抗体を作るための一般的な技法は、例えばWO91/11465、1991年およびLosman et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990に見い出され得る。あるいは、クロマ
チン関連因子に特異的に結合する抗体は、ヒト化モノクローナル抗体に由来し得る。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖由来のマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに移入し、次いでマウス対応物のフレームワーク領域にヒト残基を代入することによって産生される。抗体は、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーから単離されたヒト抗体断片に由来し得る。例えば、Barbas et al., in: Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, page 119,
1991;Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433, 1994を参照されたい。ヒ
ト免疫グロブリンファージライブラリーを産生するのに有用であるクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えばSTRATAGENE(登録商標)クローニングシステム(La Jolla、Calif.)から獲得され得る。抗体には、無傷分子、ならびにエピトープ決定基に結合し得るFab、F(ab’)2、およびFvなど、その断片が含まれる。これら断片を作製する方法は当技術分野において公知である。(例えば、Harlow
and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照されたい)。エピトープとは、抗体のパラトープが結合する、抗原上の任意の抗原決定基である。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖など、分子の化学的に活性な表面群からなり、通常、特異的な3次元構造特徴および特異的電荷特徴を有する。
et al., Mass Spectrom., 15: 1685-1692, 2001)、エレクトロスプレーイオン
化(ESI)、表面エンハンス型レーザー脱離-イオン化(SELDI)、化学イオン化、および電子衝突イオン化(EI)の使用によって検出され得る。それらのm/z比に従ったイオンの分離は、四重極型質量分析計(Q)、飛行時間型(TOF)質量分析計、磁場セクター型質量分析計、3Dおよびリニアイオントラップ(IT)、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FT-ICR)分析計、ならびにそれらの組合せ(例えば、四重極-飛行時間型分析計またはQ-TOF分析計)を含めた、任意のタイプの質量分析計を用いて達成され得る。分離の前に、試料を、1次元またはそれを上回る次元のクロマトグラフィー分離、例えば1次元またはそれを上回る次元の液体クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーに供し得る。
Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367 (1998))、またはMuAトランスポザー
ゼならびにR1およびR2末端配列を含むMuトランスポザーゼ認識部位(Mizuuchi, K., Cell, 35: 785, 1983;Savilahti, H, et al, EMBO J., 14: 4893, 1995)の使用を含み得る。高活性Tn5トランスポザーゼ(例えば、EZ-Tn5(商標)トランスポザーゼ)と複合体を形成する、例示的なトランスポザーゼ認識部位。本明細書において提供されるある特定の実施形態とともに使用され得る転移システムのさらなる例としては、Staphylococcus aureus Tn552(Colegio et al,
J. Bacteriol, 183: 2384-8, 2001;Kirby C et al, Mol. Microbiol, 43:
173-86, 2002)、Tyl(Devine & Boeke, Nucleic Acids Res., 22: 3765-72, 1994、および国際公開WO95/23875)、トランスポゾンTn7(Craig, N
L, Science. 271: 1512, 1996;Craig, N L, Review in: Curr Top Microbiol Immunol, 204:27-48, 1996)、Tn/OおよびIS10(Kleckner N, et al,
Curr Top Microbiol Immunol, 204:49-82, 1996)、Marinerトランスポザーゼ(Lampe D J, et al, EMBO J., 15: 5470-9, 1996)、Tel(Plasterk R H, Curr. Topics Microbiol. Immunol, 204: 125-43, 1996)、Pエレメント
(Gloor, G B, Methods Mol. Biol, 260: 97-114, 2004)、Tn3(Ichikawa & Ohtsubo, J Biol. Chem. 265: 18829-32, 1990)、細菌性挿入配列(Ohtsubo & Sekine, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204: 1-26, 1996)、レトロウイルス(Brown, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 86:2525-9, 1989)、ならびに酵母のレトロトランスポゾン(Boeke & Corces, Annu Rev Microbiol. 43 :403-34,
1989)が挙げられる。さらなる例としては、IS5、TnlO、Tn903、IS91
1、およびトランスポザーゼファミリー酵素の改変型(Zhang et al, (2009) PLoS
Genet. 5:e1000689. Epub 2009 Oct 16;Wilson C. et al (2007) J. Microbiol. Methods 71 :332-5)、ならびに米国特許第5,925,545号;第5,9
65,443号;第6,437,109号;第6,159,736号;第6,406,896号;第7,083,980号;第7,316,903号;第7,608,434号;第6,294,385号;第7,067,644号;第7,527,966号;ならびに国際特許公開第WO2012103545号に記載されるものが挙げられ、それらのすべてはそれらの全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。一部の実施形態では、トランスポザーゼは、Tn5トランスポザーゼまたはその高活性変異体である。一部の実施形態では、トランスポザーゼはMuトランスポゾンである。
ベータ、RORガンマ、Rox、RPF1、RPGアルファ、RREB-1、RSRFC4、RSRFC9、RVF、RXR-アルファ、RXR-ベータ、SAP-la、SAPlb、SF-1、SHOX2a、SHOX2b、SHOXa、SHOXb、SHP、SIII-pl1O、SIII-p15、SIII-pl8、SIM’、Six-1、Six-2、Six-3、Six-4、Six-5、Six-6、SMAD-1、SMAD-2、SMAD-3、SMAD-4、SMAD-5、SOX-11、SOX-12、Sox-4、Sox-5、SOX-9、Spl、Sp2、Sp3、Sp4、Sph因子、Spi-B、SPIN、SRCAP、SREBP-la、SREBP-lb、SREBP-lc、SREBP-2、SRE-ZBP、SRF、SRY、SRP1、Staf-50、STATlアルファ、STATlベータ、STAT2、STAT3、STAT4、STAT6、T3R、T3R-アルファl、T3R-アルファ2、T3R-ベータ、TAF(I)l10、TAF(I)48、TAF(I)63、TAF(II)100、TAF(II)125、TAF(II)135、TAF(II)170、TAF(II)18、TAF(II)20、TAF(II)250、TAF(II)250デルタ、TAF(II)28、TAF(II)30、TAF(II)31、TAF(II)55、TAF(II)70-アルファ、TAF(II)70-ベータ、TAF(II)70-ガンマ、TAF-I、TAF-II、TAF-L、Tal-1、Tal-lベータ、Tal-2、TAR因子、TBP、TBXIA、TBXIB、TBX2、TBX4、TBXS(長いアイソフォーム)、TBXS(短いアイソフォーム)、TCF、TCF-1、TCF-1A、TCF-1B、TCF-1C、TCF-1D、TCF-1E、TCF-1F、TCF-1G、TCF-2アルファ、TCF-3、TCF-4、TCF-4(K)、TCF-4B、TCF-4E、TCFベータl、TEF-1、TEF-2、tel、TFE3、TFEB、TFIIA、TFIIA-alpl^eta前駆体、TFIIA-アルファ/ベータ前駆体、TFIIA-ガンマ、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIE-アルファ、TFIIE-ベータ、TFIIF、TFIIF-アルファ、TFIIF-ベータ、TFIIH、TFIIH*、TFIIH-CAK、TFIIH-サイクリンH、TFIIH-ERCC2/CAK、TFIIH-MAT1、TFIIH-M015、TFIIH-p34、TFIIH-p44、TFIIH-p62、TFIIH-p80、TFIIH-p90、TFII-I、Tf-LFl、Tf-LF2、TGIF、TGIF2、TGT3、THRA1、TIF2、TLE1、TLX3、TMF、TR2、TR2-11、TR2-9、TR3、TR4、TRAP、TREB-1、TREB-2、TREB-3、TREF1、TREF2、TRF(2)、TTF-1、TXRE BP、TxREF、UBF、UBP-1、UEF-1、UEF-2、UEF-3、UEF-4、USF1、USF2、USF2b、Vav、Vax-2、VDR、vHNF-1A、vHNF-1B、vHNF-1C、VITF、WSTF、WT1、WT1I、WT1I-KTS、WT1I-del2、WT1-KTS、WT1-del2、X2BP、XBP-1、XW-V、XX、YAF2、YB-1、YEBP、YYl、ZEB、ZF1、ZF2、ZFX、ZHX1、ZIC2、ZID、ZNF174、ASH1L、ASH2、ATF2、ASXL1、BAP1、bcllO、Bmil、BRG1、CARM1、KAT3A/CBP、CDC73、CHD1、CHD2、CTCF、DNMT1、DOTL1、EHMT1、ESET、EZH1、EZH2、FBXL10、FRP(Plu-1)、HD AC1、HDAC2、HMGA1、hnRNPA1、HP1ガンマ、Hsetlb、JaridlA、Jarid1C、KIAA1718 JHDM1D、KAT5、KMT4、LSD1、NFKB P100、NSD2、MBD2、MBD3、MLL2、MLL4、P300、pRB、RbAP46/48、RBP1、RbBP5、RING IB、RNApolII P S2、RNApolII
P S5、ROC1、sap30、setDB1、Sf3bl、SIRT1、Sirt6、SMYD1、SP1、SUV39H1、SUZ12、TCF4、TET1、TRRAP、TRX2、WDR5、WDR77、および/またはYYl。これらDNA結合タンパク質および/またはクロマチン修飾因子に対する抗体は市販されている。
する能力を使用して、新生物、炎症、アレルギー性過敏症、代謝性疾患、遺伝性疾患、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症等を含めた、多様な状態に対する薬物リードを同定し得る。加えて、ウイルス、真菌、農業害虫などの非所望の生物における転写因子を特異的に標的にする同定された化合物は、殺真菌剤、殺細菌剤、除草剤、殺虫剤等として働き得る。ゆえに、転写因子活性に関係している状態の範囲には、ヒトおよび他の動物における、ならびに農業適用などの植物における状態が含まれる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
透過処理された細胞と、目的のクロマチン関連因子に特異的に結合する一次抗体とを接触させるステップであって、前記一次抗体は複数のトランスポソームにカップリングされており、前記複数のトランスポソームのそれぞれは、
少なくとも1種のトランスポザーゼ;ならびに
第1のトランスポザーゼ認識部位を含む第1のDNA分子;および
第2のトランスポザーゼ認識部位を含む第2のDNA分子
を含むトランスポゾンを含む、ステップと;
前記トランスポザーゼを活性化し、それによって、前記目的のクロマチン関連因子に結合しているDNAの配列を切り出し、およびDNAタグでタグ付けするステップであって、前記少なくとも1種のトランスポザーゼは、クロマチンDNAに前記第1および第2のDNA分子を組み込み、それによって、クロマチンDNAを切断し、ならびに前記第1および第2のDNA分子でタグ付けする、ステップと;
前記切り出されたDNAを単離するステップと;
前記切り出されたDNAの配列を決定し、それによって、前記細胞内のDNAの1つまたは複数の配列への目的のクロマチン関連因子の結合をマッピングするステップと
を含む、細胞内のDNA配列への目的のクロマチン関連因子の結合部位を決定するためのin situの方法。
(項目2)
前記抗体が、前記少なくとも1種のトランスポザーゼに間接的にカップリングされている、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記トランスポザーゼが、前記一次抗体に特異的に結合する特異的結合剤に連結されている、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記細胞と、前記一次抗体に特異的に結合する二次抗体とを接触させるステップであって、前記トランスポザーゼは、前記二次抗体に特異的に結合する特異的結合剤に連結されている、ステップ
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記細胞と、前記一次抗体に特異的に結合する二次抗体とを接触させるステップと;
前記細胞と、前記二次抗体に特異的に結合する三次抗体とを接触させるステップであって、
前記トランスポザーゼは、前記三次抗体に特異的に結合する特異的結合剤に連結されている、ステップと
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記特異的結合剤が、プロテインAもしくはプロテインG、または前記一次抗体、前記二次抗体、および/もしくは前記三次抗体に特異的に結合する三次抗体を含む、項目3から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
クロマチンDNAの配列への前記目的のクロマチン関連因子の結合が直接的である、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記目的のクロマチン関連因子が転写因子である、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記細胞が固体表面に固定化されている、項目1から8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記固体表面が、ビーズ、またはマイクロタイタープレートの壁を構成する、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記第1および/または第2のDNA分子がバーコードをさらに含む、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記第1および/または第2のDNA分子がシーケンシングアダプターをさらに含む、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記第1および/または第2のDNA分子がユニバーサルプライミング部位をさらに含む、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記少なくとも1種のトランスポザーゼがTn5トランスポザーゼを含む、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記少なくとも1種のトランスポザーゼがMuトランスポザーゼを含む、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記少なくとも1種のトランスポザーゼがIS5またはIS91トランスポザーゼを含む、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記少なくとも1種のトランスポソームが少なくとも2つの異なるトランスポソームを含み、前記異なるトランスポソームは、前記クロマチンDNAに異なるDNA配列を組み込む、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
産生されたDNA断片を単離するステップをさらに含む、項目1から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
単離された核酸断片を分析するステップをさらに含む、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記単離された核酸断片を分析するステップが、ヌクレオチド配列を決定するステップを含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記ヌクレオチド配列が、増幅の有無にかかわらず、シーケンシングまたはハイブリダイゼーション技法を使用して決定される、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記細胞が原核細胞である、項目1から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
細胞が真核細胞である、項目1から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記細胞がヒト細胞である、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記細胞および/または前記細胞の核を、前記細胞とジギトニンとを接触させることによって透過処理する、項目1から24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記切り出されたDNAを塩分画に供するステップをさらに含む、項目1から25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記目的のクロマチン関連因子と会合した1つまたは複数のタンパク質の素性を判定するステップをさらに含む、項目1から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
少なくとも1つのトランスポソームのごく一部が既知の量の混入DNAを含み、前記混入DNAは較正に使用され得る、項目1から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
項目1から28のいずれか一項に記載の方法を含む、切り出されたクロマチンDNAのライブラリーを調製するための方法。
(項目30)
架橋されていない透過処理された細胞と、目的のクロマチン関連因子を特異的に認識する特異的結合剤とを接触させるステップであって、前記特異的結合剤は、不活性状態にあるヌクレアーゼまたはトランスポザーゼに連結されている、ステップと;
前記ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼを活性化し、それによって、前記目的のクロマチン関連因子に結合しているDNAを切り出すステップと;
前記細胞から拡散する前記切り出されたDNAを単離するステップと;
前記切り出されたDNAの配列を決定し、それによって、前記細胞内のDNAの配列への目的のクロマチン関連因子の結合をマッピングするステップと
を含む、細胞内のクロマチンDNAの配列への目的のクロマチン関連因子の結合を検出するための方法。
(項目31)
前記クロマチンDNAの配列への前記目的のクロマチン関連因子の結合が間接的である、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記クロマチンDNAの配列への前記目的のクロマチン関連因子の結合が直接的である、項目30に記載の方法。
(項目33)
前記目的のクロマチン関連因子が転写因子である、項目30から32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記細胞が固体表面に固定化されている、項目30から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記固体表面が、ビーズ、またはマイクロタイタープレートの壁を構成する、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記切り出されたクロマチンDNAを核酸タグでタグ付けするステップをさらに含む、項目30から35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記核酸タグがシーケンシングアダプターを含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記核酸タグがバーコードを含む、項目36または37に記載の方法。
(項目39)
前記核酸タグがユニバーサルプライミング部位を含む、項目36から38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記ヌクレアーゼが、活性化された場合、前記クロマチン関連因子の結合部位のいずれかの側でDNA配列を切断する、項目30から39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記ヌクレアーゼが2価カチオンの添加によって活性化可能である、項目30から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記ヌクレアーゼがMNaseである、項目30から41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記ヌクレアーゼがCa2+イオンによって活性化される、項目30から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記ヌクレアーゼ活性がキレート剤の添加によってクエンチされる、項目30から43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
トランスポソームが、
少なくとも1種のトランスポザーゼ;ならびに
第1のトランスポザーゼ認識部位を含む第1のDNA分子;および
第2のトランスポザーゼ認識部位を含む第2のDNA分子
を含むトランスポゾンを含み、前記少なくとも1種のトランスポザーゼは、クロマチンDNAに前記第1および第2のDNA分子を組み込み、それによって、クロマチンDNAを切断し、ならびに前記第1および第2のDNA分子でタグ付けする、
項目30から39のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記第1および/または第2のDNA分子がバーコードをさらに含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記第1および/または第2のDNA分子がシーケンシングアダプターをさらに含む、項目45または46に記載の方法。
(項目48)
前記第1および/または第2のDNA分子がユニバーサルプライミング部位をさらに含む、項目45から47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記少なくとも1種のトランスポザーゼが、Tn5トランスポザーゼ、Muトランスポザーゼ、IS5もしくはIS91トランスポザーゼ、またはそれらの組合せを含む、項目45から48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
前記特異的結合剤が抗体である、項目30から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
産生されたDNA断片を単離するステップをさらに含む、項目30から50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記DNA断片がサイズに基づいて単離される、項目51に記載の方法。
(項目53)
単離された核酸断片を分析するステップをさらに含む、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記単離された核酸断片を分析するステップが、ヌクレオチド配列を決定するステップを含む、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記ヌクレオチド配列が、増幅の有無にかかわらず、シーケンシングまたはハイブリダイゼーション技法を使用して決定される、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記ヌクレアーゼまたは前記トランスポザーゼが融合タンパク質の一部である、項目30から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記ヌクレアーゼまたは前記トランスポザーゼが、リンカーを用いて前記特異的結合剤に連結されている、項目30から56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記細胞が原核細胞である、項目30から57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記細胞が真核細胞である、項目30から58のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
前記細胞がヒト細胞である、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記細胞および/または前記細胞の核を、前記細胞とジギトニンとを接触させることによって透過処理する、項目30から60のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記切り出されたDNAを塩分画に供するステップをさらに含む、項目30から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
上清をChIP-seqに供するステップをさらに含む、項目30から62のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
前記目的のクロマチン関連因子と会合した1つまたは複数のタンパク質の素性を判定するステップをさらに含む、項目30から63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
前記タンパク質の前記素性を決定するステップが抗体の使用を含む、項目64に記載の方法。
(項目66)
前記タンパク質の前記素性を決定するステップが質量分析を含む、項目65に記載の方法。
(項目67)
項目30から66のいずれか一項に記載の方法を含む、切り出されたクロマチンDNAのライブラリーを調製するための方法。
(1)未固定の核をレクチン被覆磁気ビーズ上に固定化する;
(2)抗体およびプロテインA-MNase(pA-MN)とともに逐次的にインキュベートし、続いて最小限の洗浄を行うステップ:
(3)氷上でCa++と混合して切断反応を開始させ、次いで、数秒から数分後にキレート化により切断反応を停止させる;そして
(4)遠心分離して、放出されたTF-DNA複合体を含有する上清を回収する。次いで、DNAを上清から抽出し、シーケンシングライブラリー調製に直接使用する。
al., 2014)。マウスプロテインAはマウスIgGと弱くしか結合しないので、ウサギ抗マウス二次抗体をCUT&RUNに使用した。CUT&RUNの効率を試験するために、ヌクレオソーム断片をゲノムワイドに放出すると予想された、3XFLAGタグ付きヒストンH2Aを発現するSaccharomyces cerevisiae株を使用した。実際、0℃で100倍の消化時間の経過にともなって、漸進的切断が観察され、下はモノヌクレオソームサイズに至るまでの断片の放出は、一次抗体の存在に完全に依存した(図1B)。
2014)と比較して、架橋および超音波処理を使用する標準ChIP-seqは、劣った感度および特異度を示した(図2A~2B、右側パネル)。したがって、CUT&RUNは、ChIP-seqと比較して感度/特異度トレードオフが改善されたロバストなTF占有マップを提供する。
Aトランスロカーゼは、TATA結合タンパク質(TBP)を高親和性結合部位から動的に除去する(Zentner and Henikoff, 2013;Auble et al., 1997)。X-ChIPは、ヌクレオソームリモデリング複合体をそれらの一番近くにあるヌクレオソームと架橋させるが、ネイティブChIPは、酵母クロマチンリモデラーをヌクレオソーム非存在領域(NDR)内およびヌクレオソーム上両方のそれらの作用部位でうまく捕捉する(Zentner et al., 2013)。CUT&RUNがそのような大きいクロマチン関連複合体をプ
ロファイリングするために、大きすぎて核膜孔を通って拡散することができない可能性がある、CUT&RUNによりin situで可溶化されるクロマチンではなく、全DNAを抽出するのが最適であることが判明した。それ故、全てのDNAを抽出し、大きいDNA断片をAMPureビーズで優先的に除去した。この改良プロトコールを、>2桁の消化範囲にわたってMot1に適用したとき、ORGANICプロファイリングを使用して得られるものに非常に類似しているクロマチンプロファイルが、しかしそのペアードエンドリード数のたった約15%で、観察された(図4A)。TBP結合部位の上流側のMot1ピークは、CUT&RUNプロファイルとORGANICプロファイルの両方に見られ、これは、Mot1が、in vitroでする(Wollmann et al., 2011)ように、in vivoで上流側からTBPに接近すること(Zentner and Henikoff, 2013)を確証する。ヒートマップおよび平均プロット分析は、≦120bp断片がTBP部
位と近接した軌道を辿り、その一方で≧150bp断片が局所近傍に拡散的に分布することを示し、これは、おそらくMot1の移動動態を表す(図15A~15B)。CUT&RUNを、RSC複合体の触媒成分であるSth1にも適用した。RSCは、NDRでヌクレオソームをスライドさせるように作用し、酵母遺伝子が転写開始部位のすぐ下流の+1ヌクレオソームの推測二回対称軸でアラインメントされた(Ramachandran et al., 2015)。均一な消化が、5秒~30分の時間にわたって観察され(図16A)、GAL4
UAS上の直接的RSCの存在量の確認によって観察された(図16B)(Floer et
al., 2010)。Sth1ピークは、NDR内で最も存在量が多く、CUT&RUNプロファイルは、5秒~10分の間の消化時間で収量の漸増を示し(図4B)、これは、CUT&RUNプロトコールを使用して定量的制限消化が達成されることを示す。最大消化時間について並行して処置した、3XFLAG-Sth1核に由来する、しかし一次抗FLAG抗体を含めなかった、陰性対照について、ほぼ平坦な線が観察された。Sth1 CUT&RUNの結果は、Sth1 ORGANICプロファイリングの結果(Ramachandran et al., 2015)と同様であるが、収量がはるかに高い(図4C)。CUT&RUNは、クロマチン関連複合体の効率的高分解能マッピングを、非常に大きく動的なクロマチン関連複合体であっても、提供するという結論に達した。
を実証する。CUT&RUNは、大きいDNA結合複合体を、希少であり、不溶性であり、ATリッチであるものであったとしても、マッピングすることができるという結論に達した。
2001)を連想させ、これは、テザーの柔軟性の結果として隣接するクロマチンが探索されることを示唆する。
は、MycとMaxの両方の高分解能でのマッピングに成功した(図20A)。Maxの場合、ENCODE ChIP-seqデータとの定量的比較が、同じ抗体を使用すると可能であり、ここで、CUT&RUNは、はるかに高いダイナミックレンジを有したため、はるかに多い数のMax結合部位をロバストに同定することができた(図20B)。DNAのEボックスに結合するために、Mycは、Maxと、Maxが他の結合パートナーを有すること(Ayer and Eisenman, 1993)に加えてだが、ヘテロダイマーを形成する(Blackwood et al., 1991)。予想どおり、ほぼ全てのMyc結合部位に存在するM
axとの非常に高度なオーバーラップが見られた。対照的に、MycおよびMaxについてENCODE X-ChIP-seqによって以前の同定された結合部位間のオーバーラップは、10分の1のMax部位が同定されたので、不良である。しかし、Max ENCODE X-ChIP-seqデータをMax CUT&RUN部位に並べると、高い占有率(図20C)が見られ、これは、CUT&RUNと比較してX-ChIP-seqのより低いダイナミックレンジが、X-ChIP-seqによってこれらのMax結合部位を同定できないことの原因となることを示唆した。
めの好ましい技法である。これらの方法は、X-ChIPと同じホルムアルデヒド架橋プロトコールを使用して、3D相互作用、例えば、エンハンサーに結合したTFと、共活性化因子を介したプロモーターとのその接触との間の3D相互作用を同定する。この実施例では、X-ChIPにより同定されるタンパク質の結合部位は、プロモーターとエンハンサーの両方を、たとえ相互作用の1つが、ホルムアルデヒドにより架橋された間接的タンパク質間相互作用によるものであったとしても、含むことになる。しかし、X-ChIPにも、3Cに基づくマッピングにも、直接的部位と間接的部位とを区別するための系統的方法がない。それ故、タンパク質間相互作用の一過的性質に起因して、TF特異的DNA結合モチーフを含有する直接的結合部位のみをマッピングする結果となることが以前に示されている(Kasinathan et al., 2014)、ネイティブChIPを使用して、CTCF結合部位のマッピングを試みた。タンパク質再分布の証拠のないほぼ完全なタンパク質抽出を達成する(図22A~22B)、新たなネイティブChIPプロトコール(下記参照)を開発した。ネイティブ条件下で、高いモチーフスコアを有する2298部位を同定した。対照的に、CTCFのCUT&RUNマッピングは、多様な範囲のモチーフスコアを有する、X-ChIPにも存在する約22,000部位を検出した(図23)。予想どおり、ネイティブChIPにより同定された全ての部位は、CUT&RUNおよびX-ChIPによってもロバストに検出され、したがって、同様のシグナル分布を示した(図7A)。有意なネイティブChIPシグナルを欠いているCUT&RUN部位は、それにもかかわらず、ネイティブChIPインプットでロバストなフットプリントを同様のカウント累積分布で示し(図7B)、3Dゲノム相互作用について予想されるような未知の結合因子の存在を示した。これは、X-ChIPと同様に、CUT&RUNが、直接的クロマチン相互作用(ネイティブCTCFピーク)と間接的クロマチン相互作用(CUT&RUNピークのみ)の両方を高分解能で発見できることを示す。
応させるために、5つの重要な改良を加えた。第1に、CUT&RUNを1日で行うために、およびCUT&RUNが自動化に好適であるように、迅速かつ効率的な溶液の変化を可能にする磁気ビーズに透過処理された細胞または粗核を固定化した。第2に、抗体およびpA-MNaseを、エピトープが保存され、エピトープに接近可能である、ネイティブ未固定核と、結合させた。第3に、固定化されたMNaseによる切断はゼロ次反応であるので、消化を、放出された断片の拡散を制限し、ひいてはバックグラウンドを低減させる氷冷温度で、行った。切断された断片を溶解度に基づいて分画することができるネイティブクロマチン(Sanders, 1978; Teves and Henikoff, 2012; Jahan et al.,
2016)を使用して、第4に、放出されたクロマチン複合体を特異的に濃縮した。不溶性バルククロマチンを除去した。粒子の両側で切断されたクロマチン断片のみが上清に入る。第5に、DNA抽出後、これらの可溶性断片をIlluminaライブラリー調製およびペアードエンドDNAシーケンシングに使用した。CUT&RUNは、簡易性、分解能、ロバストネス、効率、データ品質、および高不溶性複合体への適用性に関して、ChIP-seqと同様にまたはそれより良好に機能する。CUT&RUNは、反応をin situで行うことにより達成される本質的に低いバックグラウンドのため、他の高分解能方法論のシーケンシング深度の約1/10しか必要としない。MNaseが活性化されるとき核は無傷であるので、CUT&RUNは、標的部位周辺の局所的環境を探索することができる。実際、CUT&RUNは、ヒト細胞において、比較的低いシーケンシング深度で、塩基対分解能で3D接触部位を回収する。
合は、免疫蛍光顕微鏡法のための条件に似ている無傷核環境で起こり、したがって、細胞学的に検証されている抗体については、ChIPで失敗するものであっても、成功するはずである。CUT&RUNは、標的切断反応後にのみクロマチンを可溶化するので、古典的なクロマチン塩の分画(Sanders, 1978;Teves and Henikoff, 2012;Jahan et al., 2016)の特定のTFおよびクロマチン複合体への拡大適用に適している。
。CUT&RUNは、CTCF結合部位と相互作用の両方をマッピングし、ネイティブChIPプロトコールは、直接TF結合している部位を同定するので、それは、ゲノムの完全な高分解能1Dマップを提供し、その上、直接的TF結合部位と間接的TF結合部位を高分解能で区別してその3D接触マップを強化することができる。
胞の添加を必要とし、定量は、抗体の交差反応に依存している(Orlando et al., 2014)。CUT&RUNにおける低いバックグラウンドにもかかわらず試料間で正規化する
ために、異なる種からの一定した少量の断片化スパイクインDNAの添加は、タンパク質占有率の正確な定量に十分であり、タンパク質占有率の正確な定量を可能にする。CUT&RUNでの切断の低いバックグラウンドレベルによって、ピークを簡潔に定義するために必要とされるリードがより少ない。例えば、低分解能ChIP-seqの要件と同様の、およびCTCFに約100,000,000リードを必要としたChIP-exoよりはるかに少ない、約10,000,000のペアードエンドリードしか、各々のCTCF時点に必要とされなかった(Rhee and Pugh, 2011)。さらに、MaxおよびH3K27me3の場合、CUT&RUNの10,000,000リードは、非常に高いダイナミックレンジを提供したが、10,000,000リードは、Max ENCODE X-ChIP-seqからのピークのコールには不十分であった。この対費用効果のため、CUT&RUNは、特にシーケンシングの深度が限定的であるChIP-seqの代替として魅力的である。CUT&RUNの高い効率は、in situプロファイリングとChIPの間の根本的な相違に起因し得る:CUT&RUNは、in vivoで3D立体配座を保持するため、抗体は一次結合反応において露出面にしか接近しないが、ChIPでは、抗体は、細かい小片の状態の細胞または核の可溶化可能なゲノムワイドな内容物と相互作用する。さらに、CUT&RUN切断は、事実上、ゼロ次反応であり、その結果、ゲノム内の全ての結合エピトープについて短時間の低温タイムコースの間に定常的に粒子を放出することになる。エピトープ存在量を説明すると、600,000細胞を用いる約22,000の直接的および間接的CTCF部位のマッピングは、約5000細胞を用いるH3K27me3などの存在量の多いヒストン修飾に概して限定される超低インプットChIP-seqプロトコールの感度に匹敵すると推定される(Brind'Amour et al., 2015)。超低インプットChIPは、約2kbの分解能しか提供しないが、CUT&RU
Nは、ほぼ塩基対分解能を提供する。開示する方法の固有のロバストネス、高度な情報内容、少ないインプットおよびシーケンシング要求ならびに自動化の適格性は、CTCFおよび他のTFのCUT&RUNプロファイリングがエピゲノム診断に応用される可能性があることを示す。まとめると、CUT&RUNには、ChIPおよびその派生物を超えるいくつかの実用面での利点がある:低いシーケンシング深度(sequence depth)要求を
もたらす低いバックグラウンドに伴って、使用の容易さが、CUT&RUNをロボットによる自動化に適用可能なものにし、その上、簡易なスパイクイン戦略での正確な定量を可能にする。したがって、全ての重要な点において、CUT&RUNは、ChIPに基づく戦略の魅力的な代替となる。
et al., 2014;Krassovsky et al., 2012;Gelbart et al., 2001)。酵母核
を記載されているように調製し(Kasinathan et al., 2014)、0.5~0.6mlアリコートで急速凍結し、-80℃で保管した。ヒトK562細胞を標準条件下で培養した。標準プロトコールを電気泳動ゲル分析および免疫ブロット法に使用した。使用した抗体は、マウス抗FLAG(M2、Sigma、St.Louis、MO、カタログ番号F1804)、ウサギ抗マウス(Abcam、Cambridge、UK、カタログ番号ab46540)、CTCF(Millipore Billerica、MA、カタログ番号07-729)、H3K27me3(Millipore カタログ番号07-449)、c-Myc(Cell Signaling Technology Beverly、MA、カタログ番号D3N8F)、Max(Santa Cruz Biotechnology、Dallas、TX、カタログ番号sc-197)およびRNA Pol
II(8WG16、Abcam カタログ番号ab817)であった。pK19pA-MNプラスミドは、Ulrich Laemmliからの寄贈品であり、pA-MNタンパク質は、記載されているように(Schmid et al., 2004)E.coli細胞から調製した。酵母核CUT&RUNのためのCUT&RUNは、公表されている手順に従って調製した粗核を用いて始める。後続のプロトコールを段階的形式で提供する(下記参照)。核を約0.7のOD600の約5×108細胞から記載されているように調製し(Orsi et al., 2015)、10個の600mLアリコートに分割し、急速凍結し、-80℃で保持し、その後、使用前に氷上で解凍した。Bio-Mag Plus Concanavalin A(レクチン)被覆ビーズを、MgCl2、CaCl2およびMnCl2各々1mMを補足したHNT(20mM HEPES pH7.5、100mM NaClおよび0.1%Tween 20)と平衡させた。レクチンを活性化するために必要なのはCa++およびMn++のみであり、MgCl2を含めなくても、透過処理した細胞のビーズへの結合に影響しなかった。ビーズ(300mL)を解凍した核アリコートと迅速に混合し、室温(RT)で≧5分保持し、透明になるまで磁気スタンド上に置き(<1分)、磁気スタンド上でデカントした。次いで、3%ウシ血清アルブミン(BSA)および2mM EDTA pH8を含有する、プロテアーゼ阻害剤(Roche Completeタブレット)と1mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)とを補足したHNT(=HNT-PPi)中で、5分、室温でビーズをインキュベートし、次いで、HNT-PPi+0.1%BSA(ブロッキング緩衝剤)とともに5分インキュベートして、磁気スタンドを使用してデカントした。ビーズをマウス抗FLAG抗体(1:200~1:350)とともに2時間、4℃でインキュベートし、デカントし、HNT+PMSFで1回洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝剤中のウサギ抗マウスIgG抗体(1:200)とともに1時間、4℃でインキュベートした。ビーズをHNT+PMSFで1回洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝剤中のpA-MN(600mg/ml、1:200)とともに1時間、4℃でインキュベートした。ビーズをHNT+PMSFで2回洗浄し、Sth1およびMot1のための10%ポリエチレングリコール8000を必要に応じて含む、20mM HEPES pH7.5、100mM NaCl(消化緩衝剤)で1回洗浄した。ビーズを1.2mlの消化緩衝剤に懸濁し、8×150mLアリコートに分割し、0℃に平衡させ、次いで、CaCl2と迅速に混合し、150mLの2XSTOP[ホルムアルデヒド架橋MNase処置ショウジョウバエクロマチンから抽出した5~50pg/mlのほぼモノヌクレオソームサイズの異種DNA断片をスパイクインとして含有する、200mM NaCl、20mM EDTA、4mM EGTA、50mg/mlのRNase A(Thermo Scientific、Waltham、MA、カタログ番号EN0531)および40mg/mlのグリコーゲン(Sigma、カタログ番号10901393001)]で反応を停止させた。37℃で20分間インキュベートした後、ビーズを5分、13,000rpmで4℃で遠心分離し、上清を磁気スタンドで除去し、3mLの10%SDSおよび2mLのプロテイナーゼK(Invitrogen、Carlsbad、CA、カタログ番号25530049)と混合し、70℃で10分インキュベートし、次いで、室温で1回、緩衝フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール(25:24:1、Sigma P2069)で抽出し、フェーズロック管(Qiagen、Hilden、Germany、カタログ番号129046)に移し、1体積のCHCl3で再抽出し、2mLの2mg/mlのグリコーゲンを含有する新たな管に移し、2~2.5体積のエタノールの添加により沈殿させ、氷で冷却し、10分、13,000rpmで4℃で遠心分離した。ペレットを100%エタノールですすぎ、空気乾燥させ、25mLの0.1×TE8(=1mM Tris pH8、0.1mM EDTA)に溶解した。高塩抽出にCUT&RUNを拡大適用するために、消化を50mL体積で行い、50mLの2XSTOPで停止させ、このSTOPにはRNaseを含めず、標準200mM NaClの代わりに4M NaClを使用した。37℃で20分後、200mLの67mg/mlのRNase Aを添加し、20分インキュベートし、次いで、13,000rpmで遠心分離して上清を清澄化した。哺乳動物細胞ヒトK562のためのCUT&RUNは、ATCC(Manassas、VA、カタログ番号CCL-243)から購入した。遠心分離に基づくプロトコールを使用してCUT&RUNを行った。10,000,000細胞を遠心分離(600g、スインギングバケットローターで3分)により収集し、氷冷リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した。核を、5分間、氷上での1mlのNE1(20mM HEPES-KOH pH7.9;10mM KCl;1mM MgCl2;0.1%Triton X-100;20%グリセロール)への低張溶解によって単離し、その後、上記のとおり遠心分離した(一部の細胞中のヌクレアーゼは、Mg++依存性のDNA分解を引き起こした。その場合、0.5mM スペルミジンを1mM MgCl2の代わりに使用することができる)。核を1.5mlの緩衝剤1(20mM HEPES pH7.5;150mM NaCl;2mM EDTA;0.5mMスペルミジン;0.1%BSA)で短時間洗浄し、次いで、1.5mlの緩衝剤2(20mM HEPES pH7.5;150mM NaCl;0.5mMスペルミジン;0.1%BSA)で洗浄した。核を500mlの緩衝剤2に再懸濁させ、10mlの抗体を添加し、4℃で2時間インキュベートした。核を1mlの緩衝剤2で3回洗浄して未結合の抗体を除去した。核を300mlの緩衝剤2に再懸濁させ、5mlのpA-MNを添加し、4℃で1時間インキュベートした。核を0.5mlの緩衝剤2で3回洗浄して未結合のpA-MNを除去した。管を氷水中の金属ブロック内に配置し、100mMのCaCl2と迅速に混合して2mMの最終濃度にした。EDTAおよびEGTAをそれぞれ10mMおよび20mMの最終濃度になるまで添加することにより反応をクエンチし、ショウジョウバエDNAからの1ngのモノヌクレオソームサイズのDNA断片をスパイクインとして添加した。核を4℃で1時間インキュベートすることにより、切断された断片を上清に遊離させ、核を上記のとおりの遠心分離によりペレット化した。DNA断片を上清から抽出し、シーケンシングライブラリーの構築に使用した。このプロトコールを磁気ビーズとの使用(下に示す)に適用することもできる。TF ChIP-seqデータセットにおけるスパイクイン正規化ゲノムワイドバックグラウンドは、通常は、ライブラリー調製およびシーケンシングにおける試料間の可変性を補償するための正規化のために一定したバックグラウンドレベルを提供するのに十分な高さのものである。標準的正規化のために、ゲノム内の各々の塩基位置に対応する断片末端の数を、マッピングされたリード末端の総数で割った。しかし、CUT&RUNのもともと低いバックグラウンドレベルは、定量的比較のためにスパイクイン対照を必要とする(Hu et al., 2014)。ヒトCUT&RUNのスパイクイン正規化のために、少ない一定量のDrosophila melanogaster DNAを各々の反応に添加した。ペアードエンドリードをヒトゲノムとハエゲノムの両方にマッピングして、ヒトプロファイルをハエリード数に対して正規化した(図9A~9B)。内部正規化を使用することにより、切断の増加は、消化タイムコースで観察されなかった。しかし、ハエスパイクインDNAへの正規化により、経時的な切断レベルの約4倍の増加が観察された。しかるが故に、CUT&RUNは、タンパク質-DNA相互作用の正確な定量に適用可能である。ライブラリー調製、シーケンシング、およびシーケンシングライブラリーのデータ処理は、サイズ選択を伴わないこと、KAPA DNAポリメラーゼライブラリー調製キットプロトコール(www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/dna-library-preparation/kapa-hyper-prep-kits/)に従ったこと、および8サイクルまたはそれより多くのサイクルにわたって増
幅したことを除いて、記載されているように(Kasinathan et al., 2014; Henikoff
et al., 2011)DNA断片から調製した。不溶性クロマチンに由来する大きい断片の全DNA試料を枯渇させるために、試料をAgencourt AMPure XPビーズの1/2体積と混合し、5~10分保持し、磁気スタンド上に配置し、上清を保持してビーズを廃棄した。残存する大きい断片の上清を低減させるために、KAPAポリメラーゼライブラリー調製方法を使用するPCRサイクル数を14サイクルに増加させ、それに応じてアダプター濃度を上昇させた。PCRサイクル数の増加は、長すぎてポリメラーゼが完全に通過できない断片の線形増幅よりも、より短い断片の指数関数的増幅のほうに有利に働く。Illumina HiSeq 2500を用いてペアードエンドモードで25サイクルにわたってライブラリーをシーケンシングした。ペアードエンド断片を、sacCer3/V64ゲノムおよびビルドに、ならびにSAMファイルを生成するためにNovoalign(Novocraft)を記載されているように使用してFlyBaseから得たリリースr5.51(2013年5月)のD.melanogasterゲノム配列に、マッピングした。ヒト試料については、Bowtie2を使用してペアードエンド断片をhg19にマッピングした。データ処理用のカスタムスクリプトは、Supplementary Softwareから提供されており、github.com/peteskeneからダウンロードすることができる。比較分析のために、NCBI SRAアーカイブからダウンロードした公開されているデータセットは、ERR718799(Abf1)、SRR2568522(Reb1)、GSM749690(CTCF;1%の偽発見率を有する、ゲノム全体にわたっての20bpステップでの150bpスライディングウインドウ)であり、CTCF ChIP-exo BAMファイルは、Frank Pughにより好意的に提供されたものであった。CUT&RUNピークへのバイアスがかかっていないTF特異的モチーフのセットを得るために、MEMEモ
チーフ発見プログラムを酵母ORGANIC ChIP-seqピークコールに適用した。得られた対数オッズ位置特異的スコア行列(PSSM)を、S.cerevisiaeゲノムのMAST検索に使用して、有意な対数オッズモチーフスコアを有する部位を同定した。これは、1899のAbf1部位および1413のReb1部位を同定した。以前の研究に従って、そのTFについてのモチーフへの酵母TF結合部位の対応を、真陽性コールの「究極の判断基準」であるように使用した(Rhee and Pugh, 2011;Kasinathan
et al., 2014;Zentner et al., 2015;Ganapathi et al., 2011)。Kasinathanらの閾値法(Kasinathan et al., 2014)を使用してコールされたピークから対数オッズPSSMを構築するためにMEMEを使用した。ピークコーリングカットオフは、ピーク間距離=100、最小ピーク幅=50、および最大ピーク幅=1000である、プールされた1秒~32秒の≦120bpのAbf1およびReb1データセットについての正規化されたカウントの99.5パーセンタイルであった。CUT&RUNモチーフ回収率とORGANICモチーフ回収率を比較するために、同様のピーク数を報告するようにピークコール閾値を調整した。対数オッズ配列ロゴは、PWMTools(ccg.vital-it.ch/pwmtools/)を使用して生成した。トラックスクリーンショットは、IGV(Thorvaldsdottir et al., 2013)を使用して生成した。
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5M NaCl 200mM 400mL 0.5M EDTA 20mM 200mL 0.2M EGTA 4mM+50mL Thermo RNase A(10mg/ml) 50mg/ml+20mLグリコーゲン(20mg/ml) 40_g/ml
水で10mlに。スパイクインについては、約10pg/mlのスパイクインDNA(例えば、ホルムアルデヒド架橋ショウジョウバエS2細胞のMNase消化からのモノヌクレオソームサイズの断片)を添加する。1XSTOP(10ml) 200ml 5M
NaCl 100mM 200mL 0.5M EDTA 10mM 100mL 0.2M EGTA 2mM 水で10mlに。
使用前にビーズを放置して室温に温める;
75mlのビーズを添加し、ピペット操作10回により混合する;
室温で5分間インキュベートする;
2分間、磁石の上に置く;
上清画分を採取する(ビーズに結合したいかなる高MW DNAも採取しないことが不可欠であり、上清画分を遠心沈降させてビーズについてチェックすることができる)。
700mlのEtOHおよび1mlのグリコーゲンを添加することにより沈殿させる(必要とされる追加の塩なし);
70%EtOH洗浄する;
20mlのH2Oに再懸濁させる。
緩衝剤:
水中の50×ストックからの1×に添加したプロテアーゼ阻害剤(Roche 完全EDTA不含)
結合緩衝剤
1×PBS;
1mM CaCl2;
1mM MgCl2;
1mM MnCl2;
NB:本発明者らは、一部の細胞中のヌクレアーゼがDNAのMg++依存性分解を引き起こすことを見出した。結合緩衝剤中のMg++の存在は製造業者の推奨に従うものであるが、レクチンを活性化するためにCa++およびMn++しか必要としない。MgCl2を含めなくても、透過処理した細胞のビーズへの結合に影響しなかった。
NE1:
20mM Hepes-KOH pH7.9;
10mM KCl;
1mM MgCl2;
0.1%Triton X-100;および
20%グリセロール。
NB:本発明者らは、0.5mMスペルミジンでの1mM MgCl2の置換を使用してMg++依存性DNA分解を回避することができることを見出す。
CUT&RUN緩衝剤1:
20mM Hepes pH7.5;
150mM NaCl;
2mM EDTA;
0.5mMスペルミジン;
0.1%BSA。
CUT&RUN緩衝剤2:
20mM Hepes pH7.5;
150mM NaCl;
0.5mMスペルミジン;
0.1%BSA。
他の試薬:
100mM CaCl2;
10%SDS;
5M NaCl;
500mM EDTA;
プロテイナーゼK;
500mM EGTA;
RNaseA;
抽出緩衝剤。
12mlのQC試料についてのDNA抽出を以下のプロトコールの間に行う:
フェノール抽出する;
エタノール沈殿させる;
エタノール洗浄する;
20mLのH2Oに再懸濁させる;
RNase処置する;
0.7%アガロースゲルで電気泳動する。
q14、15およびATAC-seq16を含む、いくつかの方法が、シーケンシングリードアウトを使用してゲノムワイドにTF結合をマッピングするために使用されている。しかし、これらのアプローチは、特定のタンパク質に標的化されないので、いずれか1つのTFに特異的なものではない。さらに、それらを使用して、健常状態と病状を臨床的に区別するために使用することができる特定のクロマチン状態、例えば、ヒストンPTMにより画定されるものを、マッピングすることができない17。他の方法は、DamIDの場合は目的のタンパク質と周囲のDNAをメチル化する酵素との融合体を遺伝子操作により作製すること18により、またはクロマチン内因性切断(ChEC)の場合はタンパク質のフットプリントの標的切断19により、標的特異的マッピングを提供する。酵素繋留アプローチは、クロマチンを断片化および可溶化する必要なく、in vivo(DamID)またはin situ(ChEC)で行われる。しかし、それらはトランスジェニックアプローチを必要とするので、この必要により、ENCODEなどの大きい基礎構造コンソーシアムへの拡張性、および臨床の場への移行性が制限される。加えて、これらの方法は、ヒストンPTMをマッピングすることができない。これらの制限は、架橋された細胞からの粗核を先ずTF特異的抗体で処置し、次いで、カルシウムイオンにより活性化され得る、プロテインAとミクロコッカスヌクレアーゼとの融合タンパク質(pA-MN)で処置する、クロマチン免疫切断(ChIC)法によって、ある程度、克服された19。しかし、ChICは、サザンブロットリードアウトを使用して開発されたため、ゲノムワイドなプロファイリングへのその適用性は、10年より長きにわたって不明確なままである。本発明者らは、最近、ChIC戦略を開発し、本発明者らは、これをCUT&RUN(標的下切断およびヌクレアーゼを使用した放出;図24)20と名付けた。開示するプロトコールは、簡易な取扱いを可能にするために、未固定の核を利用し、コンカナバリンA被覆磁気ビーズを使用してそれらを固体支持体に結合させた。抗体およびpA-MNをin situで標的タンパク質と特異的に結合させた後、0℃でカルシウムへの曝露から数秒後、TFの片側で切断が起こった。非架橋核を使用したので、2カットで放出された切断断片は核外へ自由に拡散し、そのため、無傷核の簡易なペレット化により、放出されたクロマチン断片を含有する上清を使用してシーケンシング用のDNAを直接抽出した。0℃でCa2+依存性消化反応を行うことは、切断されたクロマチン複合体の拡散を制限するために必須であり、そうしなければ、接近可能なDNAを切断して放出することになることを、発見した。全体的としては、CUT&RUNは、架橋ChIP-seqよりはるかに高いシグナル対ノイズ比を有することによって、以前には不明であったゲノムの特徴の同定を可能にすることが明らかになった。CUT&RUNは、哺乳動物TFの塩基対分解能をたった10,000,000のシーケンシングされたリードで達成した。
この簡易な手順は、1日以内に完了することができ、ロボットによる自動化に好適である;(4)この方法を既存の方法論と比較して少ない細胞数で使用することができる;(5)簡易なスパイクイン戦略をタンパク質-DNA相互作用の正確な定量に使用することができる。しかるが故に、CUT&RUNは、生物学的研究において最も評判のよい方法の1つであるChIPseqの魅力的な代替となる。
および細胞数の増加というかなりの犠牲を強いられることが多い。例えば、ChIP-exoでは、標的タンパク質だけではなくそれ以上のもの、例えば、隣接するヌクレオソームを含有する、超音波処理されたあらゆる断片が、エキソヌクレアーゼが最小のTFフットプリントを生成する障害となり、しかるが故に、見かけの局所バックグラウンドに寄与し、その結果、高分解ピークペアをコールするための細胞数およびシーケンシング深度の増加が必要になる。ネイティブChIPは、これらの関連する問題を被らないことが多いが、刺激の強い界面活性剤の非存在下で可溶性クロマチン抽出物を生成する必要があるため一般的適用性が限られており、したがって、安定的に結合しているタンパク質に最もよく適しており、個別的に最適化を必要とすることがある。架橋ChIP法に使用されるものなどの超音波処理がランダムでなく、それ故、断片化バイアスを受けることは、以前に示されている5、43。CUT&RUNは、断片化のない無傷の細胞または核を用いて行われるので、CUT&RUNを使用して全てのゲノム区画を探索することができる。ゲノムワイドな消化にMNaseを使用する技術は、酵素のA/Tバイアスを被ることがあり44、オープンクロマチンを優先的に消化することになる。対照的に、CUT&RUNは、立体的に調節された切断反応を伴うものあり、本発明者らは、CUT&RUNが、いかなる検出可能なA/TバイアスもDNA接近可能性バイアスも被らないことを証明した20。
07-729)
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3.3のどちらかをコードする遺伝子の突然変異を有し、そのうち最も顕著なのは、リシン27のメチオニンへの「オンコヒストン」突然変異(H3K27M)である(Schwartzentruber et al. 2012;Wu et al. 2012)。突然変異型ヒストンH3は細胞内の全H3の約5~15%を構成するにもかかわらず、これらの腫瘍は、Polycomb抑制性複合体2(PRC2)メチルトランスフェラーゼEZH2により触媒され、転写が抑制されているクロマチンに関連するH3テール修飾であるリシン27トリメチル化(H3K27me3)レベルが低い(Chan et al. 2013;Lewis et al. 2013)。H3K2
7Mテールが、EZH2活性部位に結合し、その触媒活性を阻害することを実証するin
vitro研究(Bender et al. 2013;Lewis et al. 2013;Justin et al. 2016)、それがPRC2ランドスケープが包括的に再プログラムし得ることを示すH3K27Mの異所性発現研究(Bender et al. 2013;Chan et al. 2013)、およびDMG患者試料における低い全H3K27me3の発見(Chan et al. 2013;Lewis et al. 2013)は、H3K27MによるEZH2活性の包括的阻害が神経膠腫形成をもたら
すことを仮定するモデルにつながった(Morgan and Shilatifard 2013;Weinberg et
al. 2017)。
ム分析によって、包括的PRC阻害剤を表現型コピーするEZH2突然変異は同定されなかった(Mackay et al. 2017)。最後に、DMGに関する最近のChIP-Seqア
ッセイは、驚くべき残留H3K27me3ドメインを明示し、それらの一部は、ヒストン野生型のDMGより多くのH3K27me3を含有した(Mohammad et al. 2017;Piunti et al. 2017)。PRC2阻害剤の存在にもかかわらず特定のPRC2ドメインを保持することの基礎となる調節の論理は、いまだ不明である(Weinberg et al. 2017
;Funato and Tabar 2018)。H3K27Mが、腫瘍形成を促進するために特定の発生の手がかりまたは二次突然変異を必要とし得ることも、明らかになった。例えば、単独でのH3K27Mは、非常に狭い発生ウインドウ内でのものを除いて、マウスモデルにおいて神経膠腫を誘導するには不十分である(Pathania et al. 2017)。加えて、DMG
細胞集団からの単細胞RNA-seq分析は、特定の未分化前駆起始細胞が腫瘍を生じさせることを示唆する(Filbin et al. 2018)。さらに、H3.1K27MでのACV
R1突然変異とH3.3K27MでのPDGFRA増幅の観察される同時存在は、H3突然変異が発がんに寄与するために遺伝的修飾因子を必要とすることを示す。DMGにおけるクロマチンランドスケープに対する発生の手がかりおよび二次変異の影響は、まだ十分に解明されていない。
トン突然変異を欠いているかまたはH3.1もしくはH3.3のH3テールの27位におけるリシンのメチオニンへの置換を含有する、患者由来DMG細胞系のパネルに適用した(図33A)。この方法は、高分解能での突然変異型H3K27Mヒストンのゲノムワイドな局在のプロファイリングを可能にし、正規化対照としての外来性細胞スパイクインの使用によってゲノムワイドなH3K27me3占有率の高度に定量的な比較を提供する。DMG細胞系および非形質転換幹細胞の代表パネルへの定量的CUT&RUNの適用は、DMGが幹様細胞マーカーと分化細胞マーカーの混合を同時に発現するにもかかわらず、ヒストン突然変異型DMGにおける残留PRC2活性が、胚性幹細胞におけるPRC2活性と高度に一致することを明示する。これらの結果は、分化の手がかりおよび低減されたPRC2活性にもかかわらず原始幹細胞様PRC2ランドスケープの保持が、H3K27M-DMGの特徴およびこれらの致死性小児腫瘍に対する潜在的脆弱性を規定していることを示す。
的に、H3.3バリアントは、複製非依存的方法で堆積し、高ヒストン代謝回転部位に蓄積する(Maze et al. 2014)。H3.1K27M-DMGおよびH3.3K27M-
DMGにおけるH3K27Mのゲノムワイドな局在を評定するために、H3K27Mに対する抗体を、SU-DIPG-IV(H3.1K27M)、SU-DIPG-XIII(H3.3K27M)およびVUMC-10(MYCN増幅された、H3野生型)という3種のDMG細胞系においてCUT&RUN反応に使用した。抗H3K27M抗体は、H3K27Mに高特異的であるが、H3.1K27MとH3.3K27Mとを区別することができない(Piunti et al. 2017;Fang et al. 2018)。H3.3K27M DMG細胞のH3K27M CUT&RUNプロファイルは、H3.3K27Mが、定義されたドメインに蓄積することを示す(図33B)。さらに、本発明者らが、同じ細胞系においてH3K27me3およびH3K27ac CUT&RUNでH3K27Mを比較したとき、活性ヒストン代謝回転部位へのH3.3の組込みと一致して、H3.3K27Mピークは、H3K27acピークと密接に相関し、H3K27me3ドメインとほとんどオーバーラップを有さなかった(図33C)。H3.3K27M細胞におけるH3K27Mのゲノムワイドな局在の分析は、PTN(図33B)、H3F3AおよびMYCを含む、DMG発がんに重要な役割を有するいくつかの遺伝子における蓄積を示す(Mackay et al. 2017; Qin et al. 2017)。加えて、H3.3K27Mは、原子起始細胞を示唆する、ESC再プログラム化因子Sox2およびMYCを含む胚性幹細胞(ESC)において、転写的に活性である遺伝子座に存在する(Takahashi and Yamanaka 2006)。DHH、SUFU、PTCH1、GLI1およびGLI2を含む、SHHシグナル伝達経路の成分もまた、H3K27M蓄積部位であり、これは、ヘッジホッグ経路の活性化を示す(Monje et al. 2011)。
et al. 2017;Funato and Tabar 2018)という説が出されており、これは、H3
K27me3およびH3K27Mが大きいドメインを共占有しないはずであることを含意する。H3K27me3およびH3K27Mが、大きいドメイン内で相互排他的であるかどうかを判定するために、本発明者らは、DMG細胞系においてH3K27me3特異的抗体を用いてCUT&RUNを行った。本発明者らはまた、外来性スパイクインによって大いに異なるH3K27me3含量を有するDMG細胞系にわたってPRC2ドメインサイズおよびロバストネスを定量的に測定するためにCUT&RUNの能力をフルに活用した。本発明者らは、ショウジョウバエS2細胞をCUT&RUN反応にヒト細胞1×106対ショウジョウバエ細胞5×104の固定比で加えた。H3K27me3抗体は、ショウジョウバエH3K27me3とヒトH3K27me3の両方を認識するので、ヒトおよびショウジョウバエリードのシーケンシングにより、一致した対照への正規化およびヒト試料間の直接比較を行うことができた。スパイクインリードは、本発明者らの定量的正規化戦略の妥当性を確証する、細胞系間の定量的ウエスタンブロット結果と近いトラックを示した。興味深いことに、H3K27me3含量は、DMG細胞系間で有意に異なった(図33D)が、H3K27me3ドメインは、ほぼ検出不能なレベルのH3K27me3を有すると以前に報告されている(Grasso et al. 2015;Piunti et al. 2017)H3.1K27M細胞系とH3.3K27M細胞系の両方を含む、DMG細胞系の全てにおいて同定された(図34A)。Pearson相関分析は、DMGのゲノミクスおよびトランスクリプトミクス分析で観察された同様の関係(Mackay et al. 2017)と一致し
て、H3.1K27M腫瘍とH3.3K27M腫瘍間のH3K27me3分布に関してそれらの野生型対応物でのものより高い類似性を明示する(図34B)。しかし、分布およびシグナル強度の複合的差異を観察するための、正規化を区別するLin相関を使用する相関分析は、H3.3とH3.1の分離を示し、これは、H3.1K27M DMG細胞系におけるH3K27me3堆積低減の結果である(図34B)。本発明者らは、ヒストン変異型DMGにおいて目的の非常に多数の遺伝子座に、腫瘍抑制因子WT1を含む多くの濃縮領域を見出した(図34A)。CDKN2aなどの公知の腫瘍抑制因子は、H3.3K27Mおよびヒストン野生型細胞系ではPRC2標的であるが、H3.1K27M細胞系ではそうではなく、これは、以前の報告(Piunti et al. 2017)と一致する。
、H3突然変異型DMGとの相対的比較に役立ち、その一方で、胎児前脳由来NSCは、神経膠芽腫のために確立された対照である(Pollard et al. 2009)。
突然変異および推定的に異なる起始細胞(Mackay et al. 2017)と一致して、他のD
MG細胞系との不良な相関を明示した(図36A)。興味深いことに、H3突然変異型DMG系は、ESCよりNSC系と密接に関連していた(図36A)。これは、H3突然変異型DMGにおけるH3K27me3ドメインがNSCよりESCに類似していたという発見(図35B)と対照をなす。H3.3突然変異型DMG細胞におけるH3.3K27M濃縮は、ESCよりNSCにおけるH3K27ac濃縮と大きく一致していた。これは、H3.3K27Mが、全体としてNSCとより類似している活性クロマチン環境に組み込まれることを示す。
K27ac/H3K27Mピークを欠いているが、それらは、ESCとNSCの両方において強力に活性である、SOX2およびMYC遺伝子座に存在する(図36B)。考え合わせると、これらのデータは、分化を試みるが、幹細胞特異的クロマチン調節機序を停止することができず、その結果、幹細胞関連遺伝子と分化関連活性遺伝子の分化停止および異常な共存が生じる、原始DMG前駆細胞と一致する。
は、偏性PRC2サブユニットSUZ12および代替サブユニットMTF2に対する抗体をCUT&RUN反応において使用した。SUZ12およびMTF2シグナルは、EZH2によるH3K27me3の堆積を媒介するPRC2成分と一致して、両方のH3突然変異型DMG細胞系におけるH3K27me3ピークの中で高度に濃縮されていた(図37A、37B)。しかし、SUZ12およびMTF2は、H3.3K27M細胞系においてH3K27me3濃縮ドメイン(図37B)と比較してH3K27M濃縮ドメインとそれほど共局在しなかった。さらに、SUZ12およびMTF2シグナルは、H3K27M分布と対照をなすことに、H3K27me3ドメインにおけるそれらの濃縮が、ランダムにサンプリングされた領域を上回って有意に上昇しているので、H3K27M媒介動員によって期待されるゲノムワイドな分布の証拠を、H3.1K27M細胞系では示さなかった(図37C)。さらに、SUZ12およびMTF2シグナルは、どちらの細胞系においてもH3K27M領域においてH3K27Mシグナルとあまり相関せず、これは、SUZ12およびMTF2が、H3K27M依存的様式でゲノムと相互作用する可能性が低いことを示す。本発明者らは、H3K27MがPRC2を隔離する可能性は低いという結論に達した。
の重要な調節因子であるPRC2活性も、DMGにおける原始状態と成熟状態の機能障害性の組合せを表すかどうかは不明であった。ここで、本発明者らは、CUT&RUNを使用して、DMG細胞系および非形質転換幹細胞の代表パネルにおいてクロマチンランドスケープをプロファイリングした。本発明者らのデータは、H3K27M-DMGに存在する低い残留PRC2活性レベルが、ESC PRC2ランドスケープと最もよく似ていることを示す。クロマチンの転写活性領域の探索は、GFAPを含む成熟グリアのマーカーと並行してSOX2およびMYCの発現を示す。考え合わせると、本発明者らのデータは、発達プログラムの活性化およびH3K27Mの存在にもかかわらずES様PRC2活性を駆動する幹細胞特異的クロマチン調節ネットワークと一致する。
。それらのモデルによって、PRC2成分は、隔離に起因して、H3.3K27M-DMG細胞系のH3K27M部位の大きいサブセットに局在するはずであり、そうでなければPRC2活性は有意には変更されないことになることが予測される。本発明者らのデータセットは、H3K27M濃縮部位とPRC2成分の間にほとんどオーバーラップがないことを観察した。これは、隔離と矛盾する。さらに、本発明者らは、293TにおけるH3.3K27Mの生理レベルの異所性発現が、H3K27me3レベルを低下させないことも見出した。これは、全体的にEZH2を強く阻害するH3.3K27Mの概念(Weinberg et al. 2017)を支持しない。本発明者らのデータは、H3.3K27MのEZH
2との相互作用が、H3.3K27M-DMGに見られるPRC2活性低下の主要決定因子である可能性が低いことを示す。
、SOX2およびMYCなどの、分化中にサイレンシングを必要とする転写活性遺伝子座に組み込まれているときに新たなPRC2ドメインが発生するのを防止して、幹細胞調節ネットワークの活性化を保存するが、分化の手がかりに対する応答を可能にすることによって、発がんに寄与する可能性が高い(図39B)。対照的に、H3.1K27Mのゲノムワイドな分布は、クロマチンをPRC2活性に対して非応答性にして、ある特定の増殖促進性遺伝子のサイレンシングを防止し、その一方で、幹細胞特異的PRC2動員機序は、腫瘍抑制因子の不十分だが有効な抑制を助長する(図39B)。最近の報告は、H3.3K27Mが、Cbx7とクロマチンの会合を低減させること(Tatavosian et al. 2018)、およびCbxタンパク質には、発生学的に調節されているPRC2ドメインの確
立において十分に実証された役割を果たすこと(Morey et al. 2012)を示したので、本発明者らは、クロモドメイン含有タンパク質がH3K27Mの標的であり得ると推測した。
)によって裏づけられる。さらに、H3K27M突然変異型DMGと同様のH3K27me3レベルでの乳児上衣腫および放射状グリアの最近の同定により、H3K27突然変異は、異常に低いレベルのPRC2活性を促進するために必要でないことが示された(Bayliss et al. 2016)。加えて、RUNX1突然変異との組合せでのみ見出される急性骨髄性白血病のサブセットにおけるH3K27Mの最近の同定は、H3K27Mの影響が、少ないH3K27me3により定義される幹細胞様クロマチン状態において最も顕著であるモデルを、さらに支持する(Lehnertz et al. 2017)。その報告書において、単独
でのRUNX1突然変異は、RUNX1野生型芽細胞より低いH3K27me3レベルを有し、RUNX1突然変異とH3.1K27Mの組合せは、RUNX1突然変異型ヒストン野生型細胞より低いレベルを有した。ACVR1突然変異およびPDGFRA増幅は、DMGにおいて、AMLにおけるRUNX1突然変異に類似した役割を果たして、細胞をH3K27Mの効果に感作させることができる。考え合わせると、これらの発見は、二次突然変異と発生状況が、PRC2活性を低下させて、H3K27Mオンコヒストンがそれらの効果を発揮する環境を提供するのに十分なものであり得ることを実証する。
Technologies、Vancouver、BC)で、細胞を成長させた。解離のためにアキュターゼを用いて、細胞を継代させた。18mMのL-グルタミンを補足したHYQ-SFX昆虫培地(ThermoFisher)でショウジョウバエS2細胞を対数期まで成長させ、擦過により収集した。10%ウシ胎仔血清と2mMのL-グルタミンとを補足したDMEM(ThermoFisher)で293T細胞を成長させた。
9733)、H3K27M(Abcam ab190631)、H3K27ac(Millipore MABE647)、H3(Abcam ab24834)、H3.3(Abnova)、MTF2(ThermoFisher)、SUZ12(Abcam ab12073)およびウサギIgGアイソタイプ対照EPR25A(Abcam ab172730)を含む。CUT&RUN反応のために、1:50で使用したSUZ12およびMTF2を除いて、全ての抗体を1:100希釈で使用した。スパイクイン正規化は、ViCell(ThermoFisher)によってカウントして、ヒト細胞1,000,000個対S2細胞50,000個の比でショウジョウバエS2細胞を用いて行った。
60℃で行う改良を加えて、以前に記載された(Skene and Henikoff 2017)ように増幅した。Bowtie2を使用して、ヒトリードをhg19とアラインメントした。IgG対照と比較して濃縮部位を同定するためのカスタムスクリプトは、github.com/Henikoff/Cut-and-Runで入手可能である。
したhg19ゲノムにマッピングし、BedTool(Quinlan and Hall 2010)を使用してペアードエンド断片BEDファイルおよびスパイク正規化bedGraphを生成した。hg19ゲノムに及ぶ10kbウインドウにマッピングする正規化された断片カウントを使用して、R(www.r-project.org)で相関ヒートマップを生成した。カスタムス
クリプトを使用して、濃縮領域および領域頂点をコールした。Rのggplotユーティリティー(ggplot2.tidyverse.org)を使用して、CUT&RUN散布図を生成した。d
eepTool(Ramirez et al. 2014)を使用して、CUT&RUNシグナルヒートマップおよびメタプロットプロファイルを生成した。BedTool intersectユーティリティーを使用して、濃縮領域共通部分を定量した。Integrative
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で生まれ、それ以来、反復伸長により進化し続け、その結果、高均一若年アレイがコアに生じ、より分岐したα-サテライト配列がセントロメアエッジを占有している。連続マップへのこれらの均一α-サテライトアレイのアセンブリは、既存の配列アセンブリ技術に重大な課題を提示してきた。この問題に対処するために本発明者らは、機能性セントロメアαサテライトの新規同定のために、セントロメアタンパク質により結合された配列のボトムアップ階層的クラスタリングを最近使用した。本発明者らは、最も存在量の多いα-サテライトアレイが、αサテライトの以前に特徴付けられたSF1およびSF2超染色体ファミリー(Alexandrov et al. 2001)にそれぞれ属する基本340bpまたは34
2bpダイマー単位(Henikoff et al. 2015)を含有することを見出した。
N-ChIP)、架橋ChIP(X-ChIP)およびシーケンシャルChIP(ReChIP)を含むDNAシーケンシング(ChiP-seq)戦略での比較クロマチン免疫沈降(ChIP)を使用して、本発明者らは、CENP-B、CENP-CおよびCENP-Tが、物理的に一体化し、CENP-Aヌクレオソームとのコヒーレント複合体を形成することを以前に示した。CENP-A、CENP-CおよびCENPT X-ChIPのミクロコッカスヌクレアーゼ(MNase)消化は、α-サテライトダイマーに対して>165bp保護を生じさせる結果となった(Thakur and Henikoff 2016)が、ネ
イティブ条件下では、MNase消化は、約100~約135bpの範囲のより短いCENP-A結合α-サテライト断片を主として生じさせる結果となった(Hasson et al.
2013;Henikoff et al. 2015;Nechemia-Arbely et al. 2017)。
2013;Henikoff et al. 2015)。本発明者らはまた、500mM NaClが、低
塩条件(Thakur and Henikoff 2016)と比較してセントロメアクロマチンの回収率を
上昇させることを見出し、これにより、回収率の差異が、セントロメアクロマチンの性質の質的差異を表すのかという疑問が生じた。古典的クロマチン塩分画は、異なる物理的特性(Sanders 1978)、機能(Rocha et al. 1984)およびゲノムワイドな分布(Henikoff et al. 2009;Jahan et al. 2016)を有するヌクレオソームを分離するために使用されているので、本発明者らは、セントロメアクロマチンの大部分が、ネイティブMNase-ChIP研究において典型的に回収される可溶性画分には非存在であるCCAN成分の存在により不溶性にされているのではないかと思った。
、粒子に完全に巻き付いているのか、部分的に巻き付いているのかについての不確実性が生じる(Hasson et al. 2013)。本発明者らは、ゲノムの残りを可溶化することなく
無傷抗体標的化粒子の正確な切断および放出を引き起こすことからChIPとは無関係である効率的標的化ヌクレアーゼ法である、CUT&RUNを最近導入した(Skene and Henikoff 2017b)。本発明者らの最新のCUT&RUNプロトコール(Skene and Henikoff 2017a)では、磁気ビーズと結合した透過処理済み細胞に抗体を添加し、その後、その抗体に結合する、MNaseとプロテインAとの融合タンパク質(pA-MN)を添加する。MNaseをカルシウムにより活性化し、次いで、175mM NaClの存在下でのEDTAおよびEGTAとのキレート化により停止させる。MNaseをCUT&RUNで特定の部位に繋留した場合、高ATリッチDNAについてであっても、消化時間の2桁を超える範囲にわたって検出可能なニブリングも、接近可能性バイアスも、内部切断もない。さらに、クロマチン可溶化がないため、不溶性ペレットから抽出されたDNAのCUT&RUN切断パターンもプロファイリングすることができる(Skene and Henikoff 2017b)。塩分画へのCUT&RUNの適用(CUT&RUN.Salt)のため
に、RNaseを含まないキレート化STOP緩衝剤を添加し、上清を除去した後、本発明者らは、細胞/ビーズペレットを500mM NaClとともにインキュベートした。次いで、本発明者らは、低塩および高塩上清ならびに最終ペレットからDNAを抽出した(図49A)。ChIPでは、抗体認識またはDNA回収は、粒子一体性の喪失などの、塩により誘導される粒子立体配座変化による影響を受けることがあるが、CUT&RUNは、DNAが切断される前に抗体認識が起こることから塩分画によく適している。3つの画分全てについて、本発明者らは、CENP-A、CENP-BおよびCENP-CからのDNAに関するqPCRアッセイにおいてセントロメアαサテライトの明確な濃縮を観察したが、陰性対照H3K27me3 CUT&RUN.Saltシーケンシングライブラリーではそれが観察されなかった(図49B)。本発明者らのN-ChIP結果と一致して、クロマチンの大多数(約70%~80%)が高塩CUT&RUN.Salt画分で増幅された(図49C)。
た別個のCCAN複合体を明示した(図40B)。したがって、CUT&RUN.Saltは、ネイティブ条件下で無傷CENP-A/B/C複合体を放出する(それによって、潜在的架橋アーチファクトを回避する)ばかりでなく、未繋留のMNaseが100bpサブ粒子を生じさせるN-ChIPとは対照的に、粒子の破壊を防ぎもする。
α-サテライトダイマーアレイは、高密度のCENP-Bボックス(340bpダイマー1つ当たりCENP-Bおおよそ1つ)を含有する。より老年のαサテライトは、進化の時間とともにランダム突然変異の蓄積に起因してより相違度が大きくなり、これは、CENP-Bボックスの完全喪失または変性につながる。本発明者らは、祖先モチーフとのCENP-Bボックス配列の相違度が、CENP-A/B/Cに結合するαサテライトの能力、したがってセントロメアを形成する能力に対応するのかどうかを問うた。
明者らは、不均一モノマーαサテライトにおけるCUT&RUN.Salt試料におけるCENP-A濃縮を、βサテライト-68~69bpペリセントリックタンデム反復配列アレイを含む、非セントロメア配列と比較した。本発明者らは、反復配列がマスクされたゲノムと比較して、およびβ-サテライトアレイと比較して(図41D)、D7Z2において3倍を超えるCENP-A濃縮を見出した。これは、CENP-Bモチーフを完全に欠いている異なるα-サテライトアレイであってもCENP-Aアセンブリ能力を多少保持することを示す。
et al. 1997)を表し得る。
スに関するCENP-T部分複合体の本発明者らのマッピングから、各々のα-サテライトダイマー単位が巻き付いており2つのCENP-A/H4/H2A/H2Bサブヌクレオソーム間にCENP-TWSXサブ粒子を中心とする右手性超らせんキラリティーがあるモデルを本発明者らは提案した。非架橋CCANのMNase消化に対する感受性は、一つには、DNA保護の差異の主な原因となり得、したがって、CENP-Aヌクレオソームの構造についての結論と矛盾することになる。しかし、塩分画を伴うN-ChIPを続けて行うことにより、本発明者らは、低塩条件を使用して観察されたCENP-A粒子(Lacoste et al. 2014;Nechemia-Arbely et al. 2017)が、ゲノムワイドに全CENP-Aの極一部しか構成しないことを今や示す。対照的に、N-ChIP塩の大画分は、はるかに大きいDNA断片を保護する粒子からなり、これは、無傷CCAN複合体の存在と一致する。均一なα-サテライトアレイにおけるCENP-BボックスへのCENP-B結合は、CCAN一体性を促進するという本発明者らの証拠は、CENP-Bの特異な役割の証拠を与えるものである。加えて、CENP-Bボックスを欠いており、CENP-Bの濃縮を示さない、D7Z2 α-サテライトアレイに、CCAN成分が低レベルで動員されるという本発明者らの発見は、CENP-Bの非存在下であっても固有のCCAN動員の可能性があることを示唆する。したがって、CCAN占有率をα-サテライト配列によって決定するが、アレイへのCENP-B結合によって向上させることができる。
562細胞系で行った。使用した抗体は、抗CENP-A(Abcam、ab13939)、抗CENP-B(Abcam、ab25734)、抗CENP-C(Abcam、ab33034)、ヒストンH3K27me3(Cell Signaling Technologies、9733)、IgG(Antibodies Online、ABIN102961)およびMTPOL(GeneTex、GTX105137)であった。
した(Skene and Henikoff 2017a)。ペアードエンド250bp×250bpまたは
25bp×25bpシーケンシングを行った。
ン対照を使用してリードカウントを較正した。濃縮値は、特異的抗体の較正リードカウントの、非特異的IgG対照の較正リードカウントに対する比を表す。モチーフ強度および密度を推定するために、本発明者らは、15bp CENP-Bボックスモチーフが祖先のものであると推論した。それは、最も均一なSF1(例えば、Cen1様)、SF2(例えば、Cen13様)およびSF3(例えば、DXZ1)α-サテライトアレイに規則正しい間隔で存在するからである。本発明者らは、記載されている(Zentner et al. 2015)ような統計的に有意な出現についてコンティグをスキャンして、CENP-Bモチーフを同定し、CENP-Bボックスミスマッチおよび密度を算出した。本発明者らは、モチーフスコアを、0(有意なモチーフなし)~1(完璧なモチーフ)の尺度について、15のうちの15のマッチが1であり、3より多いミスマッチが0であり、各々のミスマッチから0.25の値を引く、15bpコンセンサスに対する同一性度として定義する。
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Research Center Genomics Shared ResourceでのIllumina HiSeq 2500プラットフォームを用いる2レーンフローセルでのペアードエンド25×25bpシーケンシングのために、等モル濃度でレーンごとに最大24のバーコード化AutoCUT&RUNライブラリーをプールした。
Signaling Tech カタログ番号9733S)を使用した。pAMNaseは、多くのマウス抗体と効率的に結合しないので、本発明者らは、ウサギ抗マウスIgG(1:100、Abcam、カタログ番号ab46540)をアダプターとして使用した。ウサギ抗H3K27ac(1:50、Millipore カタログ番号MABE647)を使用して、H1およびK562細胞においてAutoCUT&RUNによって、ならびにVUMC-10およびSU-DIPG-XIII細胞系において手動で、H3K27acをプロファイリングした。ウサギ抗H3K27ac(1:100、Abcam カタログ番号ab45173)を使用して、VUMC-10およびSU-DIPG-XIII細胞系および異種移植片において、H3K27acをAutoCUT&RUNによってプロファイリングした。
Technologies、カタログ番号05751)、100U/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、20ng/mLの上皮増殖因子(PeproTech、カタログ番号AF-100-15)および20ng/mLの線維芽細胞増殖因子(PeproTech、カタログ番号100-18B)を含有する、NeuroCult NS-A基本培地中で、細胞を維持した。
応するTSSに遺伝子発現値として割り当てた。H1細胞についてのATACシーケンシングデータをGene Omnibus Expression(GEO)(GSE85330)から入手し、Bowtie2を使用してhg19にマッピングした。ミトコンドリアDNAは、リードの約50%を占め、この研究ではそれを除去した。
=0.858ln(CH3K27ac+0.058)-0.615ln(CH3K27me3+0.0816)+1.609ln(CH3K4me2+0.054)
によって記述される。この方程式を使用して、全てのCREAMスコアを生成した。
CUT&RUN対照と比較して領域が濃縮されたカスタムスクリプトを使用して、クロマチンドメインをコールした。マーク間の濃縮領域を比較し、BedToolの交差を使用してオーバーラップを同定した。オーバーラップしている濃縮領域内の塩基対の数によって、オーバーラップしている領域を定量し、これらを使用してベン図を生成した。
れているBaRCウェブツールを使用して、生成した。
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・細胞懸濁液。本発明者らは、ヒトK562細胞を使用した。
・コンカナバリン被覆磁気ビーズ(Bangs Laboratories、カタログ番号BP531)
・目的のエピトープに対する抗体。例えば、CUT&RUNによる1Dおよび3D相互作用のマッピングのためのウサギα-CTCFポリクローナル抗体(Millipore 07-729)
・存在量の多いエピトープに対する陽性対照抗体、例えば、α-H3K27me3ウサギモノクローナル抗体(Cell Signaling Technology、カタログ番号9733)
・二次抗体、例えば、モルモットα-ウサギ抗体
・5%ジギトニン(EMD Millipore、カタログ番号300410)
・プロテインA-Tn5(pA-Tn5)融合タンパク質。-20℃で保管する。
・Illumina適合性オーバーハングを有するモザイクエンド二本鎖オリゴヌクレオチド(配列情報は参考文献16から得、Eurofinsを通して注文したものであり、TE緩衝液中100μM)
モザイクエンド_リバース[PHO]CTGTCTCTTATACACATCT(配列番号2)
モザイクエンド_アダプターA TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG((配列番号3)
モザイクエンド_アダプターB GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG (配列番号4)
・蒸留、脱イオンまたはRNAse不含H2O(dH2O、例えば、Promega、カタログ番号P1197)
・1M塩化マンガン(MnCl2;Sigma-Aldrich、カタログ番号203734)
・1M塩化カルシウム(CaCl2;Fisher、カタログ番号BP510)
・1M塩化カリウム(KCl;Sigma-Aldrich、カタログ番号P3911)・1M塩化マグネシウム(MgCl2)
・1Mヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸pH7.5(HEPES(Na+);Sigma-Aldrich、カタログ番号H3375)
・1Mヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸pH7.9(HEPES(K+);Sigma-Aldrich、カタログ番号H3375)
・5M塩化ナトリウム(NaCl;Sigma-Aldrich、カタログ番号S5150-1L)
・0.5Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA;Research Organics、カタログ番号3002E)
・2Mスペルミジン(Sigma-Aldrich、カタログ番号S2501)
・Roche完全プロテアーゼ阻害剤EDTA不含タブレット(Sigma-Aldrich、カタログ番号5056489001)
・2mg/mlのグリコーゲン(Sigma-Aldrich、カタログ番号10930193001の1:10希釈物)
・RNase A、DNaseおよびプロテアーゼ不含(10mg/ml;Thermo
Fisher Scientific、カタログ番号EN0531)
・10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS;Sigma-Aldrich、カタログ番号L4509)
・プロテイナーゼK(Thermo Fisher Scientific、カタログ番号EO0492)
・Agencourt AMPure XP常磁性ビーズ(Beckman Coulter、カタログ番号A63880)
・1M Tris-HCl pH8.0
・エタノール(Decon Labs、カタログ番号2716)
・NEBNext HiFi 2× PCRマスターミックス
・PCRプライマー(一意的インデックスを有するカスタムPCRプライマーの配列は、参考文献17および18から得た)
・Centrifuge Eppendorf 5810、スイングバケット
・Centrifuge Eppendorf 5424、固定角ローター
・Centrifuge Eppendorf 5415R、冷却固定角ローター
・Macsimag磁気分離機(Miltenyi、カタログ番号130-092-168)、1.7および2ml微量遠心管の底部からの液体の清浄な抜き取りが可能。
・ボルテックスミキサー(例えば、VWR Vortex Genie)
・微量遠心分離機(例えば、VWR Model V)
・1.5ml微小遠心管(Genesee、カタログ番号22-282)
・2ml微小遠心管(Axygen、カタログ番号MCT-200-C)
・チューブローテーター(Labquake、Thermo Fisher)
・1.5ml微小遠心管用のウェルを有するヒーターブロック
・水浴(37℃、55℃および70℃に設定される)
・MaXtractフェーズロック微小遠心管(Qiagen、カタログ番号139046)
・キャピラリー電気泳動装置(例えば、Agilent Tapestation 4200)
・Qubit蛍光光度計(Life Technologies、カタログ番号Q33216)
KCl、20μLの1M CaCl2および20μLの1M MnCl2を混合し、dH2Oで20mlの最終体積にする。その緩衝剤を4℃で6カ月間保管する。
・タイミング 1.5時間~数日
1)室温で新鮮培養物を収集し、細胞をカウントする。同じプロトコールを、1試料当たり最大500,000の哺乳動物細胞に使用することができる。
・一時停止ポイント:必要に応じて、Mr.Frostyイソプロピルアルコールチャンバを使用して細胞を10%DMSO中で凍結保存することができる。本発明者らは、急速凍結を推奨しない。これは、最終的なデータ品質に影響を及ぼす可能性があるバックグラウンドDNA切断の原因となり得るからである。
2)3分、600×g、室温で遠心分離し、液体を抜き取る。
3)穏やかなピペット操作により1.5mlの室温洗浄緩衝剤に再懸濁させ、必要に応じて2ml管に移す。
4)3分、600×g、室温で遠心分離し、液体を抜き取る。
5)ステップ3および4を繰り返す。
6)低(約1100rpm)に設定したボルテックス上に配置し、1mlの冷抗体緩衝剤に再懸濁させる。
7)使用する抗体ごとに1つの、1.5ml管内の100μLアリコートに細胞スラリーを分割する。
8)1~2μLの抗体を添加する。
9)室温で1~2時間、または4℃で最大数日、回転させる。
・タイミング 1時間
10)低(約1100rpm)に設定したボルテックスミキサー上に各々の管を配置し、10μLの活性化ConAビーズスラリーをゆっくりと添加する。
11)室温で章動または回転させて結合させる(5~10分)。
12)100μLのDig-洗浄液当たり1~2μLの二次抗体(例えば、ウサギ一次に対するモルモット抗ウサギ)を混合する。
13)微量遠心分離機でのクイックパルスで蓋および側面から液体を除去し、管を磁気スタンド上に配置して清浄化する。
14)全ての液体を吸引除去し、低(約1100rpm)に設定したボルテックスミキサーに各々の管を低角度で配置し、100μLの二次抗体ミックスを吹きかけ、その間、その溶液によるビーズの大部分または全てを取り除くことを可能にするために穏やかにボルテックスする。軽く叩いて残りのビーズを取り除く。
15)室温で約30分間、章動または回転させる。
16)高速回転させ、磁気スタンド上に配置して清浄化し、液体の全てを吸引除去する。17)1mlのDig洗浄緩衝剤を添加し、反転により、または塊が残存する場合には穏やかなピペット操作により混合する。
18)ステップ16~17を2回繰り返す。
・タイミング 1.5時間
19)1試料当たり100μLについて1:200の最終濃度までpA-Tn5複合体をDig-med緩衝剤に混ぜ入れる。
20)磁気スタンド上に配置して清浄化し、液体の全てを吸引除去する。
21)低(約1100rpm)に設定したボルテックスミキサーに各々の管を低角度で配置し、100μLのpA-Tn5ミックスを吹きかけ、その間、その溶液によるビーズの大部分または全てを取り除くことを可能にするために穏やかにボルテックスする。軽く叩いて残りのビーズを取り除く。
22)管をニューテータ・ローテータ-上に室温で1時間置く。
23)高速回転させ、磁気スタンド上に配置して清浄化し、液体の全てを吸引除去する。24)1mlのDig-med緩衝剤を添加し、反転により、または塊が残存する場合には穏やかなピペット操作により混合する。
25)ステップ23~24を2回繰り返す。
・タイミング 1.2時間
26)高速回転させ、磁気スタンド上に配置して清浄化し、液体の全てを吸引除去する。27)低(約1100rpm)に設定したボルテックスミキサーに各々の管を低角度で配置し、1試料当たり100μLのタグメンテーション緩衝剤を側面に沿って添加し、その間、その溶液によるビーズの大部分または全てを取り除くことを可能にするために穏やかにボルテックスする。軽く叩いて残りのビーズを取り除く。
28)37℃で1時間、インキュベートする。
・タイミング 1.5時間
29)各々の試料に室温で4.5μLの0.5M EDTA、5.5μLの10%SDSおよび1μLの20mg/mlのプロテイナーゼKを添加する。
30)インキュベート(30分、55℃)して、消化する。
31)インキュベート(20分、70℃)して、プロテイナーゼKを不活性化する。
32)1.1体積(122μL)AMPure XP常磁性ビーズを添加し、短時間、フルでボルテックスする。
33)高速回転させ、室温で10~15分間、静置させる。
34)磁石の上に配置し、透明になるまで放置した後、液体を注意深く抜き取る。
35)磁石の上で、ビーズを乱すことなく、1mlの80%エタノールを添加する。
36)管の底に1mlピペットを入れて液体を抜き取り、1mlの80%エタノールを添加する。
37)1mlピペットで液体を抜き取る。
38)残存する液体を20μLピペットで除去し、4~5分放置して乾燥させる。
39)磁気スタンドを取り外し、30μLの10mM Tris-HCl pH8を添加し、フルでボルテックスする。
40)5分後、磁気スタンド上に配置して、透明になるまで放置する。
41)ピペットで液体を新たな管へと除去する。
・タイミング 1時間
42)21μLのDNA+2μLのカスタムAd1_noMX i5+2μLのv2_Ad2?を混合する。試料ごとに異なるバーコードを使用して、i7プライマーをバーコード化する。
43)25μLのNEBNext HiFi 2× PCRマスターミックスを添加する。
44)混合し、高速回転させ、サーモサイクラー内に配置し、HEATED LIDでのサイクリングプログラムを開始する。
45)サイクル1:5分間72℃(ギャップ充填)
46)サイクル2:30秒間98℃
47)サイクル3:10秒間98℃
48)サイクル4:30秒間63℃
49)サイクル3~4を13回繰り返す。
50)1分間72℃、そして8℃で保持する。
・大きいDNA断片および過剰なプライマーの寄与を最小にするために、PCRサイクルは、好ましくは、10秒、60~63℃のアニール/伸長複合ステップを伴う、少なくとも12~14サイクルであるべきである。
51)管が冷めた後、サイクラーを取り外し、1.1体積(55μL)Ampure XPビーズを添加し、短時間、フルでボルテックスする。
52)高速回転させ、室温で10~15分間、静置させる。
53)磁石の上に配置し、透明になるまで放置した後、液体を注意深く抜き取る。磁石の上で、ビーズを乱すことなく、200μLの80%エタノールを添加する。
54)管の底にピペットを入れて液体を抜き取り、200μLの80%エタノールを添加する。
55)液体を抜き取り、残存する液体を20μLピペットで除去し、4~5分放置して乾燥させる。
56)磁気スタンドを取り外し、30μLの10mM Tris-HCl pH8を添加し、フルでボルテックスする。
57)5分後、磁気スタンド上に配置して、透明になるまで放置する。
58)ピペットで液体を新たな管へと除去する。
59)Agilent 4200 TapeStation分析によりライブラリーのサイズ分布を判定する。
60)製造業者の推奨どおりの最終濃度を目指して、所望通りの等しい表現を達成するようにライブラリーを混合する。
61)バーコードライブラリーを用いるペアードエンドIlluminaシーケンシングを製造業者の使用説明書に従って行う。
62)本発明者らは、Bowtie2バージョン2.2.5を、オプション:--local--very-sensitive-local--no-unal--no-mixed--no-discordant--phred33-I 10-X700で使用して、ペアードエンドリードのアラインメントを行う。較正のための断片のマッピングには、本発明者らは、実験ゲノムとスパイクインDNAのものとの交差マッピングを回避するために、--no-overlap--no-dovetailオプションも使用する。
2つの異なるITIS実験からのマッピングされたペアードエンドリードカウント。第1の実験では、150mM NaClをpA-Tn5結合に使用し、その後、500mMの短時間の洗浄を2回、次いで150mM NaCl中でのタグメンテーションを行った。第2の実験では、300mM NaClをpA-Tn5結合に使用し、その後、3回の短時間の洗浄およびタグメンテーションを行った。精製中に、Tn5トランスポサーゼは、E.coli DNAの利用可能な断片と結合し、その一部は、精製プロセスを通して結合したままである。トランスポサーゼのいずれのバッチについても、反応に持ち込まれるE.coli DNA混入物のパーセンテージは、「非侵襲性」スパイクインプロキシとして役立ち、このプロキシを試料を較正するために使用することができ、したがって、それらを定量的に比較することができる。
DNAがITISの好適なスパイクインプロキシとして役立つという本発明者らの証拠を裏づける。E.coli混入のスパイクインプロキシとしての使用は、不均一なスパイクインに有利である。なぜなら、CUT&RUN試料へのpA-MNaseの添加は、停止緩衝剤への不均一なスパイクインDNAの添加より先に行われ、そのため、CUT&RUNプロセスにおけるより早い段階における試料間変動の対照となり、これらの利点がITISに及ぶからである。E.coliゲノムは、CUT&RUNスパイクインに使用される酵母またはショウジョウバエゲノムより単純であり、反復配列マスキングを必要とせず、それは、全ての真核生物にとって異種であるので、事実上、全てのITIS適用に十分なものであるはずである。
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免疫標的化挿入シーケンシングでの少細胞および単一細胞エピゲノムプロファイリング
UT&RUNが、データ品質の低下を伴うことなく100ほども少ない細胞に好適であることを示した(Skene et al., 2018)。ITISを用いる本発明者らの実験の大部分
において、本発明者らは、50,000~500,000のヒトK562またはH1 ES細胞を使用してきた。ITISを少ない細胞数に適用することもできるかどうかを判定するために、本発明者らは、下は20細胞に至るまでK562細胞を段階希釈し、本発明者らの標準プロトコールに従って14サイクルを使用してH3K27me3およびRNAPII-Ser2+5についてITISを行った。Tapestaion分析に基づいて、本発明者らは、線形回収率(対数スケールで)をH3K27me3について下は20細胞に至るまでおよびRNAPIIについて下は60細胞に至るまで観察した(図73)。したがって、ITISは、少ない細胞数を必要とする応用に使用することができる。
AC-seqを適用してTakara ICELL8システムでITISを評価した(Mezger et al., 2018)。ICELL8は、個々の細胞を単一ウェルに選別するディスペンサーを含む、72×72アレイのナノウェルを使用する。ナノディスペンサーは、単一細胞をウェルのサブセット内にのみ堆積させ、他のものは、細胞を獲得しないか、または複数の細胞を獲得する。したがって、ICELL8は、蛍光顕微鏡を使用してアレイをイメージングし、単一細胞を有するウェルを認識し、単一細胞を有するウェルのみに試薬およびプライマーを分注する。ICELL8は、細胞がタグメンテーションステップを通して無傷のままであることからITISと適合性であるため、in situタグメンテーションによってアダプターを挿入した後に分注することができる。これに続いて、水平および垂直にそれぞれ整列させた72 i7および72 i5バーコードプライマーで増幅させて、シングルナノウェルから、それらの内容物がペアードエンドシーケンシング中に各々の末端から読み取られる多重化i7およびi5インラインバーコードを使用するシーケンシングのために組み合わせられた後、得られるDNA断片を区別する。
al., 2015)およびICELL8ナノ分注(Mezger et al., 2018)による分注を使用して実行されており、原則的に、液滴カプセル化(Zheng et al., 2017)に直接適
応させることができる。本発明者らは、ICELL8について概要を述べたのと同じステップを使用して、これらおよび他の単一細胞プラットフォームに同様にコンビナトリアルバーコード化を含むITISを適応させることができると予測する。
et al., 2018)に類似した、単一細胞におけるプロモーターおよびエンハンサーに関する情報が得られることになる。マルチITISについての組合せの可能性は、異なるエピゲノムの特徴に対する抗体の入手可能性によってのみ制限され、これに対して、各々のマルチOMIC法は、単一の特徴ペア専用である。さらに、マルチITISには、「マルチOMIC」戦略に必要とされる完全に異なる2つの基質を使用する不均一性に起因する固有の複雑さなしに同じゲノムリードアウトが得られるという利点がある。多重化戦略の例は、1)初代ウサギ抗体;2)モルモット抗ウサギ二次抗体および洗浄液;3)1つのアダプターセットと複合体化したpA-Tn5および洗浄液;4)初代マウス抗体;5)ウサギ抗マウス二次抗体および洗浄液;6)第2のアダプターセットと複合体化したpA-Tn5および洗浄液の逐次的添加であり、ここで、第1のpA-Tn5での飽和は、ウサギ一次抗体およびモルモット二次IgGエピトープを吸蔵し、pA-Tn5が結合するために利用可能なウサギ抗マウス二次IgGのみが残る。タグメンテ-ションを通常はMg++の添加によって行い、細胞を別々のプラットフォーム用にナノ分注または調製する。ステップ1~3は、本発明者らの現行のプロトコールと同一であり、ステップ4~6は、異なるIgG分子を使用することを除いてステップ1~3と同一である。したがって、それを、ITISおよびCUT&RUNに既に使用した材料(モルモット抗ウサギおよびウサギ抗マウス二次抗体)を用いて行うことができる。原則的には、この手順を、ストレプトアビジン/ビオチンなどの、他の親和性システムに適応させることができ、これによってさらなる多重化が可能になる。
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