JP2022553740A - Ｈｌａ特異的なキメラ抗原受容体 - Google Patents

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Abstract

ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドとを含むベクターであって、前記ＣＡＲはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する抗原認識ドメインを含み、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドは同じプロモーターに操作可能に連結し、前記第一のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドの上流にある、ベクター。【選択図】図１

Description

発明の分野
本発明は、ＦＯＸＰ３およびＨＬＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするベクターに関する。本発明はまた、前記ベクターを含む改変された制御性Ｔ細胞、およびその治療目的の使用に関する。
発明の背景
外来臓器または組織の同種移植は、人命を救助する可能性があるが、その一方で深刻で複雑な合併症に至りうる。固形臓器移植の後、免疫介在性拒絶反応により長期かつ包括的な免疫抑制の使用が必要となり、移植された同種移植組織の寿命が限られてしまう（Perkey, E. and Maillard, I., 2018.Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease, 13, pp.219-245）。
たとえば、免疫抑制療法に基づいてタクロリムスを使用している肝臓移植レシピエントの１５～２５％に、急性細胞拒絶反応が起こる（Choudhary, N.S., et al., 2017.Journal of clinical and experimental hepatology, 7(4), pp.358-366）。急性の免疫介在性拒絶反応は、腎臓移植については３０～４０％にのぼる（Roberts, D.M., et al., 2012.Transplantation, 94(8), pp.775-783）。
急性の移植拒絶反応は通常は治療に対してよく応答するが、慢性拒絶反応は困難な状況を呈しうる。たとえば、肝臓移植の患者のうちのかなりの部分が、免疫抑制を増加しても応答しない。慢性拒絶反応は、再移植をすることになったり、死亡したりすることがよくある（Choudhary, N.S., et al., 2017. Journal of clinical and experimental hepatology, 7(4), pp.358-366）。
移植臓器にあって患者には無い抗原が、免疫介在性の拒絶反応の主要な原因である。特に、移植臓器にあって患者には無いヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が、移植拒絶反応の重要な原因である。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－ＤＲが主要な移植抗原であり、最近の臨床データは、ＨＬＡのマッチングもまたＨＳＣＴの臨床試験成績に影響することを示している。急性拒絶反応は、主に、Ｔ細胞媒介性応答の結果であり、その一方で慢性拒絶反応も抗体媒介性応答によるものであるだろう（Choo, S.Y.,2007.Yonsei medical journal, 48(1), pp.11-23）。
患者と移植ドナーをマッチングし移植拒絶反応のリスクを低減するために、ＨＬＡ型判定が使用できる。ＨＬＡマッチングは、たとえば、腎臓および骨髄移植において大きな臨床的影響を与えた。しかしながら、心臓、肝臓、および肺の移植においては、主に医療的な緊急性、ドナーがいるかどうか、および待機時間に基づいて割り当てが行われる（Sheldon, S. and Poulton, K., 2006.In Transplantation immunology, pp. 157-174, Humana Press; and Choo, S.Y., 2007.Yonsei medical journal, 48(1), pp.11-23）。
さらに、サンガーシーケンスに基づくタイピング（Sanger Sequencing-Based Typing, SBT）によるＨＬＡマッチング、すなわち現在の標準治療には、重大な限界がある。ＳＢＴは典型的には、ＨＬＡ遺伝子領域のサブセットをシーケンスするのみであり、それら領域の外の潜在的な機能の差を識別することは除外している。その上、ＳＢＴによって生成されたＤＮＡ配列は、位相の曖昧性（phase ambiguity）を有し、これが試験されたサンプルの５３％に影響し、潜在的なエラーの大きな源となっている。ＨＬＡ遺伝子型の曖昧性のせいで、患者と潜在的ドナーとの正確なマッチングを確実にするための大きな追加試験が必要になることがよくある（Allen, E.S., et al., 2018.Human immunology, 79(12), pp.848-854）。
その結果、特に、移植された臓器に抗原（たとえばＨＬＡ）があって患者には無い場合、移植患者における免疫応答を下方制御するための改善された方法が、依然として必要である。
発明の概要
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫系の活性を調節するＴ細胞の一種である。一般的に、Ｔｒｅｇは、刺激に対する免疫抑制の、下方制御の免疫応答である。特に、Ｔｒｅｇは、通常Ｔ細胞の活性化と増殖を抑制するが、通常Ｔ細胞のいくつかのタイプは、免疫応答に直接関係する（たとえば、細胞障害性Ｔ細胞）。
標的細胞の表面に発現する抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現によって、Ｔｒｅｇの抑制効果を、特定の標的細胞へ向けることができる。本発明は、対象における移植組織への寛容を誘発するために、または移植拒絶反応を治療および／または予防するために、ＨＬＡ抗原（たとえば、ＨＬＡ－Ａ２）に対するＣＡＲを含むＴｒｅｇを使用する。
しかしながら、時が経つにつれて改変されたＴｒｅｇが免疫応答抑制能力を失うかもしれないというリスクがあり、それによって任意のＴｒｅｇ免疫療法の効力が減少するであろうし、および／または改変されたＴｒｅｇの複数回の注入が必要となるであろう。また、改変されたＴｒｅｇ（すなわち、ＣＡＲを発現するＴｒｅｇ）が、時が経つにつれてエフェクター表現型を獲得するかもしれないというリスクもある。さらに、たとえば、もし開始細胞集団にＴエフェクター細胞があれば、改変されたＴｒｅｇの生成の副産物として改変されたＴエフェクター細胞を生成する可能性がある。
Ｔｒｅｇの免疫抑制効果とは反対に、改変されたＴエフェクター細胞が標的細胞の免疫介在性ダメージを増大、または促進しうるので、このことは問題である。
（内因性ＦＯＸＰ３をすでに発現している）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における外因性ＦＯＸＰ３が、制御的機能を増強しうる、という驚くべきことを見出した。
（内因性ＦＯＸＰ３をすでに発現している）Ｔｒｅｇにおける外因性ＦＯＸＰ３の発現が、Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減しうること、かつ、改変されたＴｒｅｇの生成中に改変されたＴエフェクター細胞を生成するリスクを低減すること、という驚くべきことも見出した。
さらに、本発明者らは、ＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチドが、５’から３’への方向において、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドの前にあるという構成によって、ＦＯＸＰ３が発現しているときのみＣＡＲの発現が起こりうること、および、ＦＯＸＰ３が存在しない状態でＣＡＲの発現が起こらないことを確実にすることを、測定した。改変されたＴｒｅｇの当該状況において、このことは特に有利である。これによって、Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクが大きく低減され、および／または、開始集団の中にあるＴエフェクター細胞に前記ＣＡＲを導入することに関連するリスクを低減するからである。
したがって、本発明は、効力と安全性が増強されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇを提供する。対象中の移植組織に対する寛容を誘導するために、または、移植拒絶反応の治療および／または防止のために、前記Ｔｒｅｇを使用してもよい。
第一態様において、本発明は、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドとを含むベクターを提供し、前記ＣＡＲはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する抗原認識ドメインを含み、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドは同じプロモーターに操作可能に連結し、前記第一のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドの上流にある。
好ましくは、前記抗原認識ドメインはＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合する。
前記ベクターは、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間に切断部位をコードするポリヌクレオチド、および／または前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間に配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含んでもよい。好適には、前記ベクターは、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間に自己切断（self-cleaving）配列を含んでもよく、好ましくは、前記自己切断配列は、２Ａ自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。前記２Ａ自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、およびＦ２Ａペプチドからなる群から選択されてもよい。
前記抗原認識ドメインは抗体であるか、抗体断片であるか、または抗体由来である。好適には、前記抗原認識ドメインは、抗原結合断片（Ｆａｂ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、またはシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であってもよい。好ましくは、前記抗原認識ドメインは単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。
前記ＣＡＲは、膜貫通（ＴＭ）ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。前記ＣＡＲはまた、ヒンジドメイン、および／または１個以上の共刺激ドメインを含んでいてもよい。好ましくは、前記ＣＡＲが、ＣＤ８ヒンジドメイン、ＣＤ８ＴＭドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
前記ベクターはウイルスベクターであってもよく、好ましくはレトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターであってもよい。
他の態様において、本発明は、本発明に係るベクターを含む改変されたＴ細胞を提供する。
他の態様において、本発明は、本発明に係るベクターを含む改変された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を提供する。
他の態様において、本発明は、免疫応答、好ましくはＨＬＡを発現する細胞に対する免疫応答を抑制する、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの能力の増強に使用するための、本発明に係る、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはベクターを提供する。
本発明はまた、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力を増強する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、前記Ｔｒｅｇに導入すること、または本発明に係るベクターを前記Ｔｒｅｇに導入することを含む。好ましくは、前記免疫応答は、ＨＬＡを発現する細胞に対するものである。
本発明はまた、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力を増強するための、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用、または、本明細書に記載のようなベクターの使用を提供し、前記使用は、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記Ｔｒｅｇに導入すること、または前記ベクターを前記Ｔｒｅｇに導入することを含む。好ましくは、前記免疫応答は、ＨＬＡを発現する細胞に対するものである。
他の関連した態様において、本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力を増強する方法を提供し、前記方法は、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、前記Ｔｒｅｇに導入することを含む。
他の関連した態様において、本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力を増強する方法を提供し、前記方法は、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、細胞含有サンプルに導入することを含み、前記方法において、
（ａ）前記細胞含有サンプルは、Ｔｒｅｇを含むか、またはＴｒｅｇからなり、および／または
（ｂ）前記細胞含有サンプルは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから富化（enrichment）され、および／または
（ｃ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから生成され、および／または
（ｄ）前記細胞含有サンプルは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）（たとえば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）など）を含むか、またはＰＳＣ（たとえばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣなど）からなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に、前記ＰＳＣから分化される。
好ましくは、前記細胞含有サンプルは、体から単離されたものである。
他の態様において、本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクの低減に使用するための、本発明に係る、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはベクターを提供する。
本発明はまた、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減する方法を提供し、前記方法は、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記Ｔｒｅｇに導入すること、または本発明に係るベクターを前記Ｔｒｅｇに導入することを含む。
本発明はまた、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減するための、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用、または、本明細書に記載のようなベクターの使用を提供し、前記使用は、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記Ｔｒｅｇに導入すること、または前記ベクターを前記Ｔｒｅｇに導入することを含む。
他の関連した態様において、本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減する方法を提供し、前記方法は、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、前記Ｔｒｅｇに導入することを含む。
他の関連した態様において、本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減する方法を提供し、前記方法は、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、細胞含有サンプルに導入することを含み、前記方法において、
（ａ）前記細胞含有サンプルは、Ｔｒｅｇを含むか、またはＴｒｅｇからなり、および／または
（ｂ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから富化され、および／または
（ｃ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記細胞含有サンプルからＴｒｅｇが生成され、および／または
（ｄ）前記細胞含有サンプルは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）（たとえば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）など）を含むか、またはＰＳＣ（たとえばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣなど）からなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記ＰＳＣから分化される。
好ましくは、前記細胞含有サンプルは、体から単離されたものである。
他の態様において、本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中に改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクの低減に使用するための、本発明に係る、ＦＯＸＰ３ポリペプチド、またはベクターを提供する。
本発明はまた、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中に改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクを低減する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記Ｔｒｅｇに導入すること、または本明細書に記載のようなベクターを前記Ｔｒｅｇに導入することを含む。
本発明はまた、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中に改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクを低減するための、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または、本明細書に記載のようなベクターの使用を提供し、前記使用は、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記Ｔｒｅｇに導入すること、または前記ベクターを前記Ｔｒｅｇに導入することを含む。
他の関連した態様において、本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中に改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクを低減する方法を提供し、前記方法は、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、前記Ｔｒｅｇに導入することを含む。
他の関連した態様において、本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中に改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクを低減する方法を提供し、前記方法は、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、細胞含有サンプルに導入することを含み、前記方法において、
（ａ）前記細胞含有サンプルは、Ｔｒｅｇおよび／またはＴエフェクター細胞を含み、および／または
（ｂ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に細胞含有サンプルから富化され、および／または
（ｃ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから生成され、および／または
（ｄ）前記細胞含有サンプルは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）（たとえば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）など）を含むか、またはＰＳＣ（たとえばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣなど）からなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記ＰＳＣから分化される。
好ましくは、前記細胞含有サンプルは、体から単離されたものである。
本発明によると、本明細書に記載の前記ＨＬＡは好ましくはＨＬＡ－Ａ２であり、たとえば好ましくは、前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲはＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲであり、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇであり、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞は、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞である。
これらの態様において、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または前記第二のポリヌクレオチドは、ウイルス性形質導入、たとえばレトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入によって導入されてもよい。好ましくは、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、単一のベクターに導入され、場合によっては前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結される。より好ましくは、前記単一のベクターは、本発明に係るベクターである。
他の態様において、本発明は、本発明に係る方法によって得られうる、または得られた、改変されたＴｒｅｇを提供する。
他の態様において、本発明は、本発明に係るベクター、改変されたＴ細胞、または改変されたＴｒｅｇを含む医薬組成物を提供する。
他の態様において、本発明は、対象における移植組織に対する寛容の誘発に使用するための、もしくは、対象における移植拒絶反応または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療および／または予防に使用するための、もしくは、対象における自己免疫またはアレルギー性疾患の治療および／または予防に使用するための、もしくは、対象における組織の修復および／または組織の再生に使用するための、もしくは、対象における慢性炎症の改善に使用するための、本発明に係るベクター、改変されたＴ細胞またはＴｒｅｇ、もしくは医薬組成物を提供する。好ましくは、前記対象はヒトである。
他の関連した態様において、本発明は、対象における移植組織に対する寛容を誘発する方法、または、対象における移植拒絶反応またはＧｖＨＤを治療および／または予防する方法であって、前記方法は、本発明に係るベクター、改変されたＴ細胞またはＴｒｅｇ、もしくは医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む方法を、提供する。好ましくは、前記対象はヒトである。
前記方法は、
（ｉ）細胞含有サンプルを（たとえば、前記対象から）単離または提供する工程であって、前記細胞含有サンプルはＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなる工程と、
（ｉｉ）本発明に係るベクターを前記細胞含有サンプルに導入する工程とを含んでもよく、
前記細胞含有サンプルは、Ｔｒｅｇを含むか、またはＴｒｅｇからなり、前記ベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルからのＴｒｅｇが富化され、および／または前記ベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルからＴｒｅｇが生成され、および／または、前記細胞含有サンプルは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）（たとえば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）など）を含むか、またはＰＳＣ（たとえばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣなど）からなり、前記ベクターを導入する前または後にＴｒｅｇが前記ＰＳＣから分化される。
図１－Ｔｃｏｎｖ細胞の増殖（ドナー１）図１は、ペプチドを使用した場合と使用しなかった場合のＴＣＲコンストラクトを形質導入したＴｃｏｎｖ細胞の増殖（＊で示す）、ならびに、様々なＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖの比率での、偽（ｍｏｃｋ）形質導入したＴｒｅｇの存在下（白色バー）、ＴＣＲコンストラクトを形質導入したＴｒｅｇの存在下（黒色バー）、またはＴＣＲコンストラクトとＦＯＸＰ３とを形質導入したＴｒｅｇの存在下（灰色バー）での、同じ細胞の増殖を示す。 図２－Ｔｃｏｎｖ細胞のＩＬ－２の産生（ドナー１）図２は、ペプチドを使用した場合と使用しなかった場合のＴＣＲコンストラクトを形質導入したＴｃｏｎｖ細胞のＩＬ－２の産生（＊で示す）、ならびに、様々なＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖの比率での、偽（ｍｏｃｋ）形質導入したＴｒｅｇの存在下（白色バー）、ＴＣＲコンストラクトを形質導入したＴｒｅｇの存在下（黒色バー）、またはＴＣＲコンストラクトとＦＯＸＰ３とを形質導入したＴｒｅｇの存在下（灰色バー）での、同じ細胞のＩＬ－２の産生を示す。 図３－Ｔｃｏｎｖ細胞の増殖（ドナー２）図３は、ペプチドを使用した場合と使用しなかった場合のＴＣＲコンストラクトを形質導入したＴｃｏｎｖ細胞（図１のドナーとは異なるドナーから得たもの）の増殖、ならびに、様々なＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖの比率での、偽（ｍｏｃｋ）形質導入したＴｒｅｇの存在下（白色バー）、ＴＣＲコンストラクトを形質導入したＴｒｅｇの存在下（黒色バー）、またはＴＣＲコンストラクトとＦＯＸＰ３とを形質導入したＴｒｅｇの存在下（灰色バー）での、同じ細胞の増殖を示す。 図４－Ｔｃｏｎｖ細胞のＩＬ－２の産生（ドナー２）図４は、ペプチドを使用した場合と使用しなかった場合のＴＣＲコンストラクトを形質導入したＴｃｏｎｖ細胞（図２のドナーとは異なるドナーから得たもの）のＩＬ－２の産生（＊で示す）、ならびに、様々なＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖの比率での、偽（ｍｏｃｋ）形質導入したＴｒｅｇの存在下（白色バー）、ＴＣＲコンストラクトを形質導入したＴｒｅｇの存在下（黒色バー）、またはＴＣＲコンストラクトとＦＯＸＰ３とを形質導入したＴｒｅｇの存在下（灰色バー）での、同じ細胞の増殖を示す。 図５－Ｔｒｅｇマーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）図５は、形質導入から７～１０日後にフローサイトメトリーで解析した、偽（ｍｏｃｋ）形質導入したＴｒｅｇ、もしくは、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入したＴｒｅｇにおける、Ｔｒｅｇマーカー（ＦＯＸＰ３、ＣＤ２５、およびＣＴＬＡ－４）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。点は、個々の実験を表す。一元配置分散分析（１－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を統計解析ｐ＜０．０５＊、ｐ＜０．００５＊＊のために使用した。 図６－形質導入したＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３、ＣＤ２５、およびＣＴＬＡ－４のＭＦＩ図６は、形質導入したＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３、ＣＤ２５、およびＣＴＬＡ－４のＭＦＩを示す。各線は、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入した同じＴｒｅｇ上のマーカーのＭＦＩを示す単一の実験を表している。 図７－Ｔｃｏｎｖ細胞の増殖（ドナー３）図７は、ペプチドを使用した場合と使用しなかった場合のＴＣＲコンストラクトを形質導入したＴｃｏｎｖ細胞（図１および３のドナーとは異なるドナーから得たもの）の増殖、ならびに、様々なＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖの比率での、偽（ｍｏｃｋ）形質導入したＴｒｅｇの存在下（白色バー）、ＴＣＲコンストラクトを形質導入したＴｒｅｇの存在下（黒色バー）、ＴＣＲコンストラクトとＦＯＸＰ３とを形質導入したＴｒｅｇの存在下（灰色バー）、またはＴＣＲコンストラクトとＦＯＸＰ３とを形質導入したＴｃｏｎｖ細胞、すなわち誘導性Ｔｒｅｇの存在下（赤色バー、各データセットの右側のバー）での、当該細胞の増殖を示す 図８－Ｔｃｏｎｖ細胞によるＩＬ－２の産生（ドナー３）図８は、ペプチドを使用した場合と使用しなかった場合のＴＣＲコンストラクトを形質導入したＴｃｏｎｖ細胞（図７と同じドナーからのもの）によるＩＬ－２の産生のレベルを示し、ならびに、様々なＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖの比率での、偽（ｍｏｃｋ）形質導入したＴｒｅｇの存在下（白色バー）、ＴＣＲコンストラクトを形質導入したＴｒｅｇの存在下（黒色バー）、ＴＣＲコンストラクトとＦＯＸＰ３とを形質導入したＴｒｅｇの存在下（灰色バー）、またはＴＣＲコンストラクトとＦＯＸＰ３とを形質導入したＴｃｏｎｖ、すなわち誘導性Ｔｒｅｇの存在下（赤色バー、各データセットの右側のバー）での、当該細胞のＩＬ－２の産生を示す。 図９－ＴＣＲを形質導入した制御性Ｔ細胞は、放射線照射された宿主に生着できるが、ＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３－細胞の蓄積を防止するためには外因性ＦＯＸＰ３の発現を必要とする。Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇを、ＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニックマウスのリンパ節や脾細胞からビーズ分離によって単離した。ＴｒｅｇにＴＣＲ、ＴＣＲ＋マウスＦＯＸＰ３を形質導入するか、または、Ｔｒｅｇをウイルス不含上清（偽（ｍｏｃｋ））と共に培養した。形質導入から１日後に、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入した細胞を、４Ｇｙ照射による条件付けを行ったＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニック宿主に注入した。７週間後、フローサイトメトリーを用いて、形質導入したＴｒｅｇの生着を測定した。Ａ．形質導入の１日後に、ｈｕｍａｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ２．１およびマウスＦｏｘｐ３の発現を通して、形質導入効率を測定した。 Ｂ．ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入したＴｒｅｇを投与したマウスから得た脾細胞を、Ｔｈｙ１．１で染色し、移入細胞（上部パネル）、ならびに、ＦＯＸＰ３＋ＴＣＲ（下部パネル）を同定した。 Ｃ．ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入したＴｒｅｇについて、形質導入効率の倍率変化（fold change）（左パネル）、および形質導入細胞の絶対数の倍率変化（右パネル）を、注入した日と比較して示す、累計データ（ｎ＝３）。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。独立ｔ検定による統計的解析。Ｄ．形質導入された細胞内の移入から７週間後のＦＯＸＰ３の代表的な発現。グラフは、７週目における形質導入された集団内のＦＯＸＰ３＋細胞の累積率（左）、および注入した日と比較したＦＯＸＰ３＋細胞の倍率変化を示す（ｎ＝３）。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。＊ｐ＝＞０．０５、＊＊ｐ＝＞０．０１は独立ｔ検定により測定。 図１０－外因性ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇは、インビボで７週間後もＴｒｅｇ機能を維持するが、外因性ＦＯＸＰ３を発現しないＴｒｅｇは、エフェクターサイトカインを産生する能力を獲得する。Ａ．脾細胞を、無関係なペプチドまたは１０ｕＭ ＭＢＰでパルスしたＣＤ８６＋ＨＬＡ－ＤＲ４＋ＣＨＯ細胞とともに４時間培養した。フローサイトメトリーにより、ＩＬ－２とＩＦＮｇの産生を測定した。ＦＡＣＳプロットは、ＴＣＲのみを発現するＴｒｅｇを含有するＣＤ４５．１細胞（上部パネル）、およびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇを含有するＴｈｙ１．１細胞を示す。 Ｂのグラフは、ＴＣＲを発現したＴｒｅｇ（濃灰色）およびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を発現したＴｒｅｇ（薄灰色）による累計的ＩＬ－２およびＩＦＮｇ産生を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す（ｎ＝３）。 図１１Ａ－ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲコンストラクト設計の例ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲ（Ａ２ ＣＡＲと表される）をコードするベクターの例の模式図：コンストラクトＦ－Ｃ：５’－ＦＯＸＰ３－Ｐ２Ａ－Ａ２ ＣＡＲ－３’をコードするコンストラクトを表す。コンストラクトＲ－Ｃ：５’－Ｒ－Ｐ２Ａ－Ａ２ ＣＡＲ－３’をコードするコンストラクトであって、Ｒはその他の遺伝子を表す。コンストラクトＣ：Ａ２ ＣＡＲのみをコードするコンストラクトを表す。コンストラクトＣ－Ｒ：５’－Ａ２ ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－Ｒ－３’をコードするコンストラクトであって、Ｒはその他の遺伝子を表す。 図１１Ｂ－ＦＯＸＰ３／ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇの生成ＦＯＸＰ３／ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇの生成および増殖を示す概略図。Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＧＰ（Ｐ．ｇｐ）細胞、つまりｇａｇ ｐｏｌを安定的に発現するレトロウイルスパッケージング細胞株を、１ｘ１０6細胞／１０ｍｍ細胞培養ディッシュに播種した。その次の日、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏｗ細胞を単離し、ＩＬ－２の非存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化した。同じ日に、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬を使用して、エンベロープとＦＯＸＰ３／ＨＬＡ．Ａ２－ＣＡＲをコードするコンストラクトとで、Ｐ．ｇｐ細胞に遺伝子導入した。活性化から２日後、ｇ－レトロウイルスをＴｒｅｇに形質導入し、ＩＬ－２を加えた。２日ごとに、細胞に培地とＩＬ－２とを追加した。ＨＬＡ．Ａ２デキストラマーを使用して、６日目の形質導入効力を検証した。Ｔｒｅｇを、新たな抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用してさらに増殖させた。 図１２－形質導入したＴｒｅｇにおけるＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲおよびＦＯＸＰ３の発現図１２は、コンストラクトＦ－Ｃ、コンストラクトＲ－Ｃ、コンストラクトＣ、およびコンストラクトＣ－Ｒを形質導入したＴｒｅｇにおける、ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲ（Ａ２ ＣＡＲ）発現レベル、ＦＯＸＰ３発現レベル、およびその他の遺伝子Ｒの発現レベルを、フローサイトメトリーで測定したものを、偽（ｍｏｃｋ）コントロールと比較して、示す。図１２Ａは、偽（ｍｏｃｋ）Ｔｒｅｇ、ならびにコンストラクトＦ－Ｃ、コンストラクトＲ－Ｃ、コンストラクトＣ、およびコンストラクトＣ－Ｒを形質導入したＴｒｅｇに関する、デキストラマー（ＨＬＡ）対ＳＳＣ－Ａについての、ＣＤ３＋ＣＤ４＋でゲートしたＦＡＣＳプロットを示す。各コンストラクトを形質導入したＴｒｅｇは、前記ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲを発現した。 図１２Ｂは、偽（ｍｏｃｋ）Ｔｒｅｇ、ならびにコンストラクトＦ－Ｃ、コンストラクトＲ－Ｃ、コンストラクトＣ、およびコンストラクトＣ－Ｒを形質導入したＴｒｅｇに関する、ＦＯＸＰ３の発現対その他の遺伝子Ｒの発現についての、ＣＤ３＋ＣＤ４＋デキストラマー＋でゲートしたＦＡＣＳプロットを示す。前記遺伝子Ｒは、コンストラクトＲ－Ｃを形質導入したＴｒｅｇとコンストラクトＣ－Ｒを形質導入したＴｒｅｇとで、高レベルで発現した。ＦＯＸＰ３はすべてのＴｒｅｇで発現していたが、特に前記ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲのみ（コンストラクトＣ）の発現と比較すると、コンストラクトＦ－Ｃにおいて著しく高かった。 図１３－形質導入し増殖したＴｒｅｇにおけるＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲおよびＦＯＸＰ３の発現図１３は、コンストラクトＦ－Ｃ、コンストラクトＲ－Ｃ、コンストラクトＣ、およびコンストラクトＣ－Ｒを形質導入し、増殖させたＴｒｅｇにおける、ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲ（Ａ２ ＣＡＲ）発現レベル、ＦＯＸＰ３発現レベル、およびその他の遺伝子Ｒの発現レベルを、フローサイトメトリーで測定したものを、偽（ｍｏｃｋ）コントロールと比較して示す。図１３Ａは、増殖した偽（ｍｏｃｋ）Ｔｒｅｇ、ならびにコンストラクトＦ－Ｃ、コンストラクトＲ－Ｃ、コンストラクトＣ、およびコンストラクトＣ－Ｒを形質導入してから増殖させたＴｒｅｇに関する、デキストラマー（ＨＬＡ）対ＳＳＣ－Ａについての、ＣＤ３＋ＣＤ４＋でゲートしたＦＡＣＳプロットを示す。各コンストラクトを形質導入したＴｒｅｇは、増殖後もＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲを発現した。 図１３Ｂは、増殖した偽（ｍｏｃｋ）Ｔｒｅｇ、ならびにコンストラクトＦ－Ｃ、コンストラクトＲ－Ｃ、コンストラクトＣ、およびコンストラクトＣ－Ｒを形質導入した後に増殖したＴｒｅｇに関する、ＦＯＸＰ３の発現対その他の遺伝子Ｒの発現についての、ＣＤ３＋ＣＤ４＋デキストラマー＋でゲートしたＦＡＣＳプロットを示す。増殖後は、コンストラクトＲ－Ｃ、コンストラクトＣ、およびコンストラクトＣ－Ｒを形質導入したＴｒｅｇで、ＦＯＸＰ３の発現が減少した。これに対して、コンストラクトＦ－Ｃを形質導入したＴｒｅｇでは、増殖後に、ＦＯＸＰ３の発現は減少しなかった。その結果、特に前記ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲのみ（コンストラクトＣ）の発現と比較すると、ＦＯＸＰ３の発現が、増殖後のコンストラクトＦ－Ｃにおいてかなり高かった。 図１４－ＦＯＸＰ３とＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲとをコードするコンストラクトを形質導入したＴｒｅｇの表現型系統図１４は、コンストラクトＦ－Ｃ、コンストラクトＲ－Ｃ、コンストラクトＣ、およびコンストラクトＣ－Ｒを形質導入したＴｒｅｇでの表現型系統マーカーの発現を示す。コンストラクトＦ－Ｃを形質導入したＴｒｅｇは、Ｔｒｅｇ表現型系統を維持しつつ、ＦＯＸＰ３の発現を増強していた。 図１４－ＦＯＸＰ３とＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲとをコードするコンストラクトを形質導入したＴｒｅｇの表現型系統図１４は、コンストラクトＲ－Ｃ、コンストラクトＣ、およびコンストラクトＣ－Ｒを形質導入したＴｒｅｇでの表現型系統マーカーの発現を示す。コンストラクトＦ－Ｃを形質導入したＴｒｅｇは、Ｔｒｅｇ表現型系統を維持しつつ、ＦＯＸＰ３の発現を増強していた。
詳細な説明
Ｔｒｅｇの抑制特性は、移植における免疫介在性の器官損傷を改善および／または予防するために、治療目的に利用できる。標的細胞の表面に発現する抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現によって、Ｔｒｅｇの抑制効果を、特定の標的細胞へ向けることができる。移植拒絶反応において、ＣＡＲは、移植片（移植組織）ドナーに有って移植片（移植組織）レシピエントには無いＨＬＡ抗原（たとえば、ＨＬＡ－Ａ２）に対するものであってもよく、ＧｖＨＤにおいて、前記ＣＡＲはレシピエントに有って移植片（移植組織）ドナーに無いＨＬＡ抗原（たとえば、ＨＬＡ－Ａ２）に対するものであってもよい。
驚くべきことに、本発明者らは、（内因性ＦＯＸＰ３をすでに発現している）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における外因性ＦＯＸＰ３の発現が、制御的機能を増強しうる、ということを見出した。
驚くべきことに、本発明者らは、（内因性ＦＯＸＰ３をすでに発現している）Ｔｒｅｇにおける外因性ＦＯＸＰ３の発現が、Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減しうること、および改変されたＴｒｅｇの生成中に改変されたＴエフェクター細胞を生成するリスクを低減すること、を見出した。特に、ＦＯＸＰ３が、５’から３’への方向において、ＣＡＲの前にあるという構成が、ＦＯＸＰ３が発現しているときのみＣＡＲの発現が起こることができ、およびＦＯＸＰ３が存在しない状態でＣＡＲの発現が起こらない、ということを確実にする。
したがって、本発明は、効力と安全性が増強されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇ（特に、ＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇ）を提供する。前記Ｔｒｅｇは、移植拒絶反応または移植片対宿主病の治療および／または防止のために使用してもよい。
本発明の様々な好ましい特徴および実施形態を、非限定的な例示として説明する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられているように、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈において明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
本明細書で使用される「含む（comprising）」、「含む（comprises）」および「構成される（comprised of）」という用語は、「含む（including）」、「含む（includes）」、または「含有する（containing）」、「含有する（contains）」の同義語で、包括的または非限定的（open-ended）であり、記載されていない付加の部材や素子、方法の工程を除外するものではない。「含む（comprising）」、「含む（comprises）」および「構成される（comprised of）」という用語には、「からなる（consisting of）」という用語も含まれる。
本明細書で論じられる出版物は、本願の出願日の前の開示を単に提供する。本明細書のいずれの記載も、かかる出版物が添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成していると認めるものとして解釈されはしない。
この開示は、本明細書に開示する例示の方法や材料によって制限されず、本明細書に記載された方法や材料と類似の、または等価の任意の方法や材料を、この開示の実施形態の実施や試験に使用できる。数の範囲は、その範囲を定義する数を含む。特に断らない限り、任意の核酸は左から右へ、５’から３’の方向に、アミノ酸配列は左から右へ、アミノからカルボキシの方向にそれぞれ書く。
フォークヘッドボックスＰ３タンパク質（ＦＯＸＰ３）
本発明において、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本明細書において第一のポリヌクレオチドと記載されることもある）を細胞（たとえばＴｒｅｇ）に導入することにより、前記細胞の中でＦＯＸＰ３の発現が増加する。
「ＦＯＸＰ３」は、フォークヘッドボックスＰ３タンパク質の略称である。ＦＯＸＰ３は、転写因子のＦＯＸタンパク質ファミリーのメンバーであり、制御性Ｔ細胞の発生（development）と機能における調節経路の主要制御因子として機能する。
「ＦＯＸＰ３の発現を増加させる」とは、細胞（または細胞の集団）におけるＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルを、改変されていない対応する細胞（または細胞の集団）と比較して増大させることを意味する。たとえば、本発明にしたがって改変した細胞（またはかかる細胞の集団）におけるＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルは、本発明にしたがった改変をしていない、対応する細胞（またはかかる細胞の集団）におけるレベルの、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍に増加していてもよい。好ましくは、前記細胞はＴｒｅｇであり、細胞の集団はＴｒｅｇの集団である。
好適には、本発明にしたがって改変した細胞（またはかかる細胞の集団）におけるＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルは、本発明にしたがった改変をしていない、対応する細胞（またはかかる細胞の集団）におけるレベルの、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、または少なくとも５倍に増加していてもよい。好ましくは、前記細胞はＴｒｅｇであり、細胞の集団はＴｒｅｇの集団である。
特定のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを計測する技術は、当該技術分野において周知である。Ｔｒｅｇなどの細胞の集団の中のｍＲＮＡのレベルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＰｒｉｍｅＦｌｏｗ ＲＮＡアッセイ、ノーザンブロット法、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）法、または定量的ポリメラーゼ連鎖反応法（ｑＰＣＲ）などの技術によって測定してもよい。細胞の集団におけるタンパク質のレベルは、フローサイトメトリー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）、ウエスタンブロット法、または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの技術によって測定してもよい。
「ＦＯＸＰ３ポリペプチド」は、ＦＯＸＰ３活性を有するポリペプチド、すなわちＦＯＸＰ３標的ＤＮＡに結合できて、Ｔｒｅｇの発生（development）と機能を調節する転写因子として機能するポリペプチドである。特に、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、野生型ＦＯＸＰ３（配列番号１）と同じ活性、または類似の活性を有していてもよく、たとえば、野生型ＦＯＸＰ３ポリペプチドの活性の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０％を有していてもよい。転写因子活性を測定する技術が、当該技術分野においてよく知られている。たとえば、転写因子ＤＮＡ結合活性は、ＣｈＩＰによって測定されてもよい。転写因子の前記転写調節活性は、それが調節する遺伝子の発現レベルを定量化することにより測定してもよい。遺伝子発現は、ノーザンブロット法、ＳＡＧＥ、ｑＰＣＲ、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ウエスタンブロット法、またはＥＬＩＳＡなどの技術を使用して、ｍＲＮＡおよび／または前記遺伝子から産生されるタンパク質のレベルを測定することにより定量化されてもよい。ＦＯＸＰ３により制御される遺伝子には、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＦＮ－γなどのサイトカインなどがある（Siegler et al. Annu. Rev. Immunol. 2006, 24: 209-26、この参照により本明細書に援用される）。
「ＦＯＸＰ３の機能的断片」とは、ＦＯＸＰ３ポリペプチドの部分若しくは領域、またはＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの部分若しくは領域であって、全長ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと同じかまたは類似の活性を有するものを指す場合がある。前記機能的断片は、全長ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性の、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％を有していてもよい。当業者は、ＦＯＸＰ３の既知の構造および機能の特徴に基づいて、機能的断片を生成することができるであろう。たとえば、Song, X., et al.,2012. Cell reports, 1(6), pp.665-675; Lopes, J.E., et al., 2006 The Journal of Immunology, 177(5), pp.3133-3142; and Lozano, T., et al, 2013. Frontiers in oncology, 3, p.294に記載されている。
「ＦＯＸＰ３変異体」は、ＦＯＸＰ３ポリペプチド、またはＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する同一性が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％であってもよいアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を、含んでいてもよい。ＦＯＸＰ３変異体は、野生型ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと同じ活性、または類似の活性を有していてもよく、たとえば、野生型ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０％を有していてもよい。当業者は、ＦＯＸＰ３の既知の構造および機能の特徴に基づいて、および／または保存的置換を使用して、ＦＯＸＰ３変異体を生成することができるであろう。
ＦＯＸＰ３ポリペプチド配列
好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、ヒトＦＯＸＰ３のポリペプチド配列を含んでいてもよく、たとえば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＢＺＳ１（配列番号１）、またはその機能的断片などを含んでもよい。
ＦＯＸＰ３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＢＺＳ１（配列番号１）：
ＭＰＮＰＲＰＧＫＰＳＡＰＳＬＡＬＧＰＳＰＧＡＳＰＳＷＲＡＡＰＫＡＳＤＬＬＧＡＲＧＰＧＧＴＦＱＧＲＤＬＲＧＧＡＨＡＳＳＳＳＬＮＰＭＰＰＳＱＬＱＬＰＴＬＰＬＶＭＶＡＰＳＧＡＲＬＧＰＬＰＨＬＱＡＬＬＱＤＲＰＨＦＭＨＱＬＳＴＶＤＡＨＡＲＴＰＶＬＱＶＨＰＬＥＳＰＡＭＩＳＬＴＰＰＴＴＡＴＧＶＦＳＬＫＡＲＰＧＬＰＰＧＩＮＶＡＳＬＥＷＶＳＲＥＰＡＬＬＣＴＦＰＮＰＳＡＰＲＫＤＳＴＬＳＡＶＰＱＳＳＹＰＬＬＡＮＧＶＣＫＷＰＧＣＥＫＶＦＥＥＰＥＤＦＬＫＨＣＱＡＤＨＬＬＤＥＫＧＲＡＱＣＬＬＱＲＥＭＶＱＳＬＥＱＱＬＶＬＥＫＥＫＬＳＡＭＱＡＨＬＡＧＫＭＡＬＴＫＡＳＳＶＡＳＳＤＫＧＳＣＣＩＶＡＡＧＳＱＧＰＶＶＰＡＷＳＧＰＲＥＡＰＤＳＬＦＡＶＲＲＨＬＷＧＳＨＧＮＳＴＦＰＥＦＬＨＮＭＤＹＦＫＦＨＮＭＲＰＰＦＴＹＡＴＬＩＲＷＡＩＬＥＡＰＥＫＱＲＴＬＮＥＩＹＨＷＦＴＲＭＦＡＦＦＲＮＨＰＡＴＷＫＮＡＩＲＨＮＬＳＬＨＫＣＦＶＲＶＥＳＥＫＧＡＶＷＴＶＤＥＬＥＦＲＫＫＲＳＱＲＰＳＲＣＳＮＰＴＰＧＰ
本発明のいくつかの実施形態において、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１に対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。いくつかの実施形態において、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１またはその機能的断片を含むか、または配列番号１またはその機能的断片からなる。
好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは配列番号１の変異体、たとえば自然変異体であってもよい。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは配列番号１のアイソフォームである。たとえば、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１と比較して７２～１０６位のアミノ酸の欠失を含んでいてもよい。または、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１と比較して２４６～２７２位のアミノ酸の欠失を含んでいてもよい。
好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２またはその機能的断片を含む。
ＦＯＸＰ３ポリペプチドの例（配列番号２）
ＭＰＮＰＲＰＧＫＰＳＡＰＳＬＡＬＧＰＳＰＧＡＳＰＳＷＲＡＡＰＫＡＳＤＬＬＧＡＲＧＰＧＧＴＦＱＧＲＤＬＲＧＧＡＨＡＳＳＳＳＬＮＰＭＰＰＳＱＬＱＬＰＴＬＰＬＶＭＶＡＰＳＧＡＲＬＧＰＬＰＨＬＱＡＬＬＱＤＲＰＨＦＭＨＱＬＳＴＶＤＡＨＡＲＴＰＶＬＱＶＨＰＬＥＳＰＡＭＩＳＬＴＰＰＴＴＡＴＧＶＦＳＬＫＡＲＰＧＬＰＰＧＩＮＶＡＳＬＥＷＶＳＲＥＰＡＬＬＣＴＦＰＮＰＳＡＰＲＫＤＳＴＬＳＡＶＰＱＳＳＹＰＬＬＡＮＧＶＣＫＷＰＧＣＥＫＶＦＥＥＰＥＤＦＬＫＨＣＱＡＤＨＬＬＤＥＫＧＲＡＱＣＬＬＱＲＥＭＶＱＳＬＥＱＶＥＥＬＳＡＭＱＡＨＬＡＧＫＭＡＬＴＫＡＳＳＶＡＳＳＤＫＧＳＣＣＩＶＡＡＧＳＱＧＰＶＶＰＡＷＳＧＰＲＥＡＰＤＳＬＦＡＶＲＲＨＬＷＧＳＨＧＮＳＴＦＰＥＦＬＨＮＭＤＹＦＫＦＨＮＭＲＰＰＦＴＹＡＴＬＩＲＷＡＩＬＥＡＰＥＫＱＲＴＬＮＥＩＹＨＷＦＴＲＭＦＡＦＦＲＮＨＰＡＴＷＫＮＡＩＲＨＮＬＳＬＨＫＣＦＶＲＶＥＳＥＫＧＡＶＷＴＶＤＥＬＥＦＲＫＫＲＳＱＲＰＳＲＣＳＮＰＴＰＧＰＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮ
好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２に対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。いくつかの実施形態において、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２またはその機能的断片を含むか、または配列番号２またはその機能的断片からなる。
好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは配列番号２の変異体、たとえば自然変異体であってもよい。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２のアイソフォームまたはその機能的断片のアイソフォームである。たとえば、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２と比較して７２～１０６位のアミノ酸の欠失を含んでいてもよい。または、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２と比較して２４６～２７２位のアミノ酸の欠失を含んでいてもよい。
ＦＯＸＰ３ポリヌクレオチド配列
好適には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドは、配列番号３に示すポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号３に示すポリヌクレオチド配列からなる。
ＦＯＸＰ３ポリヌクレオチドの例（配列番号３）
ＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＣＴＣＧＧＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＡＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣＣＡＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡＡＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＣＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＣＧＧＴＧＧＡＴＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＧＡＴＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＧＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＴＴＣＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＣＣＴＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＧＣＣＣＧＧＡＴＧＴＧＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＣＧＡＡＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＧＴＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＧＴＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＴＣＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＣＡＣＡＡＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣＣＣＴＴＴＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＧＣＴＣＡＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＡＣＴＣＡＡＴＧＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＴＧＧＴＴＣＡＣＡＣＧＣＡＴＧＴＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＣＴＧＡＧＴＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＡＡＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＡ
本発明のいくつかの実施形態において、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列、またはその機能的断片を含む。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるポリヌクレオチド配列、または、その機能的断片を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３またはその機能的断片を含むか、または配列番号３またはその機能的断片からなる。
好適には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドは、配列番号４に示すポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号４に示すポリヌクレオチド配列からなる。
ＦＯＸＰ３ポリヌクレオチドの例（配列番号４）
ＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＣＴＴＣＴＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＣＡＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＡＣＧＣＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＣＣＣＡＴＧＣＣＣＣＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＴＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＧＡＣＴＧＧＧＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＧＧＣＣＣＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＣＣＴＧＣＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＴＣＡＡＴＧＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＴＣＣＣＧＣＧＡＡＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＡＴＣＣＴＡＧＣＧＣＣＣＣＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＡＣＧＧＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＧＡＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＣＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＡＣＡＡＡＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＧＡＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＴＡＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＧＡＧＣＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＡＧＧＣＣＣＣＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＴＴＴＧＣＣＧＴＧＣＧＧＡＧＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＧＧＣＡＡＣＴＣＴＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＣＡＣＡＡＣＡＴＧＡＧＧＣＣＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＡＴＧＧＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＴＧＧＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＴＧＴＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＡＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＧＧＣＡＣＡＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＡＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＴＧＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＴＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＴＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＴＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣ
本発明のいくつかの実施形態において、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列、またはその機能的断片を含む。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるポリヌクレオチド配列、または、その機能的断片を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４またはその機能的断片を含むか、または配列番号４またはその機能的断片からなる。
好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは機能的断片またはその変異体をコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化されていてもよい。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは機能的断片またはその変異体をコードするポリヌクレオチドは、ヒトの細胞における発現のためにコドン最適化されていてもよい。
ＨＬＡ特異的キメラ抗原受容体
本発明において、ＨＬＡ特異的な細胞は、ＨＬＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド（本明細書において第二のポリヌクレオチドと記載されることもある）を細胞に導入することにより生成される。
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲｓ」は、抗原特異性を細胞、たとえばＴｒｅｇに付与できる遺伝子操作された受容体のことである。ＣＡＲはまた、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体として知られている。本発明のＣＡＲは、ＨＬＡ、好ましくはＨＬＡ－Ａ２に特異的な結合ドメインを含み、場合によってはヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびエンドドメイン（細胞内シグナル伝達ドメイン、および場合によっては一つ以上の共刺激ドメインを含む）を含む。
ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを、たとえばレトロウイルスベクターを使用して、細胞へ移入してもよい。このように、多数の抗原特異的Ｔ細胞が、養子細胞移入により生成されうる。ＣＡＲが標的抗原と結合すると、その結果、ＣＡＲが発現する細胞（たとえばＴｒｅｇ）に活性化シグナルが伝達される。このように、ＣＡＲは、改変されたＴｒｅｇを、標的抗原を発現する細胞へ向け、それによって前記抗原または前記抗原を含む細胞に対する免疫応答を抑制する。
抗原認識ドメイン
本発明のＣＡＲは、抗原認識ドメインを含む。
本明細書で使用される「抗原認識ドメイン」とは、ＣＡＲの抗原結合能力を画定する、ＣＡＲの細胞外部分のことである。発明のある態様において、抗原認識ドメインは、ＨＬＡに結合する能力のあるＣＡＲを提供する。このように、抗原認識ドメインはＨＬＡを標的とする。
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系または複合体は、ヒトにおける主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。ＨＬＡは、ヒトの免疫系の制御を担っている。
好適には、前記ＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ｃ０７０１、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ａ１１、およびＨＬＡ－Ａ２４０２からなる群から選択される。好ましくは、前記ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ２である。
「ＨＬＡ－Ａ２」は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ０２、およびＨＬＡ－Ａ＊２とも称されてもよい。ＨＬＡ－Ａ＊０２は、ＨＬＡ－Ａ座にある、ある特定のクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）対立遺伝子群である。
好適には、移植（ｇｒａｆｔ／ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）ドナーに存在し、移植（ｇｒａｆｔ／ｔｒａｓｐｌａｎｔ）レシピエントには存在しない、またはその逆である、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）に結合できる抗原結合ドメインを、含んでいてもよい。たとえば、移植が臓器移植である場合、前記ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）は、移植臓器に存在して患者に存在しなくてもよい。移植がＨＳＣＴ（たとえば骨髄移植）である場合、前記ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）は、患者に存在して移植臓器に存在しなくてもよい。
抗原認識ドメインは、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）内の１個以上の領域またはエピトープと結合してもよく、好適にはそれに特異的に結合してもよい。エピトープは抗原決定基としても知られ、抗原認識ドメイン（たとえば抗体）によって認識される抗原の一部である。換言すると、エピトープは抗体が結合する抗原の特定の部分である。適切には、抗原認識ドメインは、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）内の１個の領域またはエピトープと結合し、好適にはそれに特異的に結合する。たとえばタンパク質／ポリペプチドフォールディング（折りたたみ、ｆｏｌｄｉｎｇ）によって、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）内の１個よりも多い領域で特異的な結合が起こりうることは、当業者であれば理解されよう。
本発明で使用される前記抗原認識ドメインは、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）に選択的または特異的に結合してもよく、したがって、そのＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）に対する結合親和性が、他のタンパク質／分子に対する結合親和性よりも、大きくてもよい。好適には、本明細書で使用される「特異的に結合する」とは、抗原認識ドメインが他のタンパク質に結合しない、または、それが特異的に結合するＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）への結合と比較して、かなり小さい親和性で（たとえば、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）への親和性の、少なくとも１０、５０、１００、５００、１０００または１００００分の１の親和性で）結合する、ということを意味する。したがって、本明細書でいう抗原認識ドメインは、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）に、他のタンパク質に対する結合の親和性の少なくとも１０、５０、１００、５００、１０００または１００００倍の親和性で、結合してもよい。たとえば、前記抗原認識ドメインの結合親和性は、たとえば、ラインウィーバーバークプロット法を使用するなど、当該技術分野において周知の方法を使用すること、またはＢＩＡｃｏｒｅ １０００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアの１：１結合モデルなど、市販の結合モデルソフトウェアを使用することにより、測定してもよい。好適には、ＨＢＳ－Ｐ緩衝系（０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）が使用される。
前記抗原認識ドメイン（抗原特異的標的ドメインとしても知られる）は、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）を特異的に認識しそれと結合する能力を有する任意のタンパク質またはペプチドであってもよい。前記抗原認識ドメインは、天然由来、合成、半合成、または遺伝子組み換えにより作製した、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）に対する任意の結合パートナーを含む。抗原認識ドメインの例としては、抗体または抗体断片または誘導体、受容体の細胞外ドメイン、細胞表面分子／受容体用のリガンド、またはその受容体結合ドメイン、および腫瘍結合タンパク質などがある。
好ましくは、抗原認識ドメインは、抗体（Ａｂ）であるか、または抗体（Ａｂ）由来である。抗体由来の抗原認識ドメインは、抗体の断片、または１個以上の前記抗体の断片の遺伝子改変産物であってもよく、該断片は抗原との結合に関与する。その例としては、ラクダ抗体（ＶＨＨ）、抗原結合断片（Ｆａｂ）、可変領域（Ｆｖ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、重鎖可変領域（ＶＨ），軽鎖可変領域（ＶＬ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）などがある。
好ましい実施形態において、前記抗原認識ドメインは単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。
抗体は、前記断片抗原結合（Ｆａｂ）可変領域を介して抗原を認識する。抗体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質である。血液タンパク質のガンマグロブリン画分のほとんどを構成する。典型的には、各々が二つの大きい重鎖と二つの小さい軽鎖からなる基本構造単位で構成されている。ラクダ抗体（ＶＨＨ）は軽鎖が無く、可変ドメインに付随する二つの重鎖からなる。
「抗原結合断片」（Ｆａｂ）とは、抗原に結合した抗体上の領域のことであり、重鎖と軽鎖の各々が１個の定常領域と１個の可変領域とを有してなる。
「Ｆｖ」とは、完全な抗原結合部位をもつ、抗体の最も小さい断片のことである。Ｆｖ断片は、単一の重鎖の可変領域に結合した単一の軽鎖の可変領域からなる。
「単鎖抗体」（ｓｃＦｖ）とは、直接またはペプチドリンカー配列を介して互いに接続された軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる、改変された抗体のことである。好適なリンカーは、容易に選択することができ、また、任意の好適な長さ、たとえば１個のアミノ（たとえばＧｌｙ）長～３０個のアミノ酸などを有することができ、たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の任意のアミノ酸、乃至、１２、１５、１８、２０、２１、２５、３０個の任意のアミノ酸であって、たとえば、５～３０アミノ酸、５～２５アミノ酸、６～２５アミノ酸、１０～１５アミノ酸、１２～２５アミノ酸、１５～２５アミノ酸、などである。前記ペプチドリンカー配列は、通常、長さが約１０～２５アミノ酸であり、柔軟性のためにグリシンが多く、溶解性のためにセリンまたはスレオニンが多い。フレキシブルリンカーの例にはグリシンポリマー（Ｇ）n（ｎは１以上の整数である）、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および当該技術分野において既知のその他のフレキシブルリンカーがある。前記リンカーは、１個以上の「ＧＳ」ドメインを含んでもよい。リンカーは異なる特徴を有していてもよく、たとえばフレキシブル、剛直、または切断可能であってもよい。前記ペプチドリンカー配列は、重鎖可変領域のＮ末端を、軽鎖可変領域のＣ末端と繋げる、または、その逆を行うことができる。前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域は、（Ｘ）ｎというリンカー配列を介してリンクしてもよく、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１～３０の整数である。前記リンカー配列は、当該技術分野において既知の任意のリンカー配列であってもよい。
ナノボディとしても知られている「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）は、単一モノマー可変抗体ドメインからなる抗体断片のことである。したがって、ｓｄＡｂは重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）であってもよい。
「重鎖可変領域」または「ＶＨ」とは、フレームワーク領域として知られる隣接するストレッチ(ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｔｒｅｔｃｈ）に挟まれた、３個のＣＤＲを含有する抗体の重鎖の断片のことである。前記フレームワーク領域は、ＣＤＲよりも高度に保存され、ＣＤＲ維持の足場を形成する。「軽鎖可変領域」または「ＶＬ」とは、フレームワーク領域に挟まれた、３個のＣＤＲを含む、抗体の軽鎖の断片のことである。
抗体またはその抗原結合断片についての「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、抗体の重鎖または軽鎖の可変領域中の超可変ループのことである。ＣＤＲは、抗原構造と作用しあうことができ、主として抗原との結合を決定する（ただし、いくつかのフレームワーク領域は、結合に関与していることがわかっている）。重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ３個のＣＤＲを含有する（アミノ末端からカルボキシ末端に向かって付番して、重鎖ＣＤＲ１，２，および３並びに軽鎖ＣＤＲ１，２，および３）。
抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のＣＤＲは、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域配列から、当該技術分野で利用可能な予測ソフトウェアを用いて、たとえばＡｂｙｓｉｓアルゴリズムを用いるか、またはＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴソフトウェア、たとえばｗｗｗ．ＩＭＧＴ．ｏｒｇで入手可能なＩＭＧＴアルゴリズム（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）を用いて予測することができる（たとえばLefranc et al, 2009 NAR 37:D1006-D1012及びLefranc 2003, Leukemia 17: 260-266を参照）。いずれのアルゴリズムによって同定されたＣＤＲ領域も、本発明での使用に、等しく好適であると考えられる。ＣＤＲは、その予測の元になる抗体に応じて及び重鎖と軽鎖との間で長さが異なり得る。従って、インタクトな抗体の３個の重鎖ＣＤＲは、異なる長さであってもよく（または同じ長さであってもよく）、インタクトな抗体の３個の軽鎖ＣＤＲは、異なる長さであってもよい（または同じ長さであってもよい）。たとえば、ＣＤＲは、長さが２または３アミノ酸～５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸の範囲であってもよい。特に、ＣＤＲは、長さが３～１４アミノ酸、たとえば少なくとも３アミノ酸、かつ１５アミノ酸未満であってもよい。
本明細書では、ＣＤＲの位置を定義するために必要に応じてＫａｂａｔ命名法に従うことに留意しなければならない（Kabat et al, 1991, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 647-669）。
ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）と特異的に結合する抗体、その誘導体および断片は、当業者に周知の方法を使用して調製できる。かかる方法には、ファージディスプレイ、ヒト抗体またはヒト化抗体を生成する方法、または、ヒト抗体を作るために改変されたトランスジェニック動物または植物を使用する方法などがある。部分的合成抗体または全長合成抗体のファージディスプレイライブラリが利用可能であり、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）に結合できる抗体またはその断片について、前記ライブラリをスクリーニングすることが可能である。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリもまた利用可能である。前記抗体（もしくはその誘導体または断片）をコードするアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を特定したら、それを単離および／または測定することができる。抗体の配列は、その好適な誘導体または断片を設計するために使用できる。
本発明に使用できる抗体、その誘導体および断片の例を、さらに以下に記載する。
抗原認識ドメインは、少なくとも１個のＣＤＲ（たとえば、ＣＤＲ３）を含んでもよく、これはＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）に結合する抗体（または抗体断片）から予測でき、または、かかる予測されたＣＤＲの変異体（たとえば、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を有する変異体）と結合する抗体から予測できる。３個以下のＣＤＲ領域を含有する分子（たとえば、単一のＣＤＲ、またはその一部）が、ＣＤＲの由来元である抗体の抗原結合活性を保持できるだろうということは、理解されるであろう。２個のＣＤＲ領域を含有する分子は、たとえばミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）の形態の標的抗原と結合することができる、と当該技術分野では記載されている（Vaughan and Sollazzo, 2001, Combinational Chemistry & High Throughput Screening, 4, 417-430）。単一のＣＤＲを含有する分子は、標的に対して強力な結合活性を発揮することができるという記載がある（Nicaise et al, 2004, Protein Science, 13: 1882-91）。
これに関して、抗原認識ドメインは、１個以上の可変重鎖ＣＤＲ、たとえば１個、２個または３個の可変重鎖ＣＤＲを含んでいてもよい。それに代えて／それに加えて、抗原認識ドメインは、１個以上の可変軽鎖ＣＤＲ、たとえば１個、２個または３個の可変軽鎖ＣＤＲを含んでいてもよい。抗原認識ドメインは、３個の重鎖ＣＤＲおよび／または３個の軽鎖ＣＤＲ（特に、３個のＣＤＲを含む重鎖可変領域および／または３個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域）を含んでもよく、少なくとも１個のＣＤＲ、好ましくはすべてのＣＤＲが、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）と結合する抗体由来であってもよく、下記に示すＣＤＲ配列の一つから選択されてもよい。
抗原認識ドメインは、可変重鎖ＣＤＲと可変軽鎖ＣＤＲとの任意の組み合わせを含んでもよく、たとえば、１個の可変重鎖ＣＤＲと１個の可変軽鎖ＣＤＲの組み合わせ、２個の可変重鎖ＣＤＲと１個の可変軽鎖ＣＤＲの組み合わせ、２個の可変重鎖ＣＤＲと２個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせ、３個の可変重鎖ＣＤＲと１個または２個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせ、１個の可変重鎖ＣＤＲと２個または３個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせ、３個の可変重鎖ＣＤＲと３個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせを含んでもよい。好ましくは、前記抗原認識ドメインは、３個の可変重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、および／または３個の可変軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）との組み合わせを含んでもよい。
抗原認識ドメインに存在する１個以上のＣＤＲは、前記ドメインが上記の結合活性を有すれば、すべてが同じ抗体由来でなくてもよい。したがって、あるＣＤＲが、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）と結合する抗体の重鎖または軽鎖から予測されてもよく、一方で他のＣＤＲが、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）と結合する異なる抗体から予測されてもよい。この場合には、ＣＤＲ３が、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）と結合する抗体から予測されるのが好ましいだろう。しかしながら、特に、１個より多いＣＤＲが抗原認識ドメインに存在すれば、前記ＣＤＲがＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）に結合する抗体から予測されるのが好ましく、特に前記ＨＬＡの同じ領域またはエピトープに結合する抗体から予測されるのが好ましい。ＣＤＲの組み合わせは、異なる抗体から使用されてもよく、特に同じ領域またはエピトープと結合する抗体から使用されてもよい。
特に好適な実施形態において、前記抗原認識ドメインは、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）と結合する抗体（または抗体断片）の可変重鎖配列から予測される３個のＣＤＲ、および／またはＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）と結合する抗体（または抗体断片）（好ましくは同じ抗体または抗体断片）の可変軽鎖配列から予測される３個のＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは抗体であるか、または抗体由来であり（たとえば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ，またはｓｄＡｂであり）、前記抗体は配列番号５～１３３、またはその誘導体（たとえば、１個、２個、または３個の置換、好ましくは１個の置換を含む誘導体）から選択される、１個以上のＣＤＲ領域を含む。換言すると、いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、配列番号５～１３３、またはその誘導体（たとえば、１個、２個、または３個の置換、好ましくは１個の置換を含む誘導体）から選択される、１個以上のＣＤＲ領域を含む。好適には、抗原認識ドメインは、配列番号５～１３３、またはその誘導体から選択される、３個のＣＤＲ領域を含む。
Figure 2022553740000002
Figure 2022553740000003
好ましくは、前記抗原結合ドメインは、同じ可変鎖から選択された、ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、またはその誘導体を含む。たとえば、前記抗原結合ドメインは、配列番号５～７、配列番号８～１０、配列番号１１～１３、配列番号１４～１６、配列番号１７～１９、配列番号２０～２２、配列番号２３～２５、配列番号２６～２８、配列番号２９～３１、配列番号３２～３４、配列番号３５～３７、配列番号３８～４０、配列番号４１～４３、配列番号４４～４６、配列番号４７～４９、配列番号５０～５２、配列番号５３～５５、配列番号５６～５８、配列番号５９～６１、配列番号６２～６４、配列番号６５～６７、配列番号６８～７０、配列番号７１～７３、配列番号７４～７６、配列番号７７～７９、配列番号８０～８２、配列番号８３～８５、配列番号８６～８８、配列番号８９～９１、配列番号９２～９４、配列番号９５～９７、配列番号９８～１００、配列番号１０１～１０３、配列番号１０４～１０６、配列番号１０７～１０９、配列番号１１０～１１２、配列番号１１３～１１５、配列番号１１６～１１８、配列番号１１９～１２１、配列番号１２２～１２４、配列番号１２５～１２７、配列番号１２８～１３０、および／または配列番号１３１～１３３、またはその誘導体を含んでもよい。
好ましい実施形態において、前記抗原認識ドメインは、下記のような可変重ＣＤＲおよび可変軽ＣＤＲの組み合わせを含む。
（ｉ）配列番号５～７、および配列番号１７～１９、またはその誘導体；
（ｉｉ）配列番号８～１０、および配列番号２０～２２、またはその誘導体；
（ｉｉｉ）配列番号１１～１３、および配列番号２３～２５、またはその誘導体；
（ｉｖ）配列番号１４～１６、および配列番号２６～２８、またはその誘導体；
（ｖ）配列番号１４～１６、および配列番号２９～３１、またはその誘導体；
（ｖｉ）配列番号１４～１６、および配列番号３２～３４、またはその誘導体；
（ｖｉｉ）配列番号１４～１６、および配列番号３５～３７、またはその誘導体；
（ｖｉｉｉ）配列番号１４～１６、および配列番号３８～４０、またはその誘導体；
（ｉｘ）配列番号１４～１６、および配列番号４１～４３、またはその誘導体；
（ｘ）配列番号１４～１６、および配列番号４４～４６、またはその誘導体；
（ｘｉ）配列番号１４～１６、および配列番号４７～４９、またはその誘導体；
（ｘｉｉ）配列番号１４～１６、および配列番号５０～５２、またはその誘導体；
（ｘｉｉｉ）配列番号１４～１６、および配列番号５３～５５、またはその誘導体；
（ｘｉｖ）配列番号１４～１６、および配列番号５６～５８、またはその誘導体；
（ｘｖ）配列番号１４～１６、および配列番号５９～６１、またはその誘導体；
（ｘｖｉ）配列番号６２～６４、および配列番号９８～１００、またはその誘導体；
（ｘｖｉｉ）配列番号６５～６７、および配列番号１０１～１０３、またはその誘導体；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号６８～７０、および配列番号１０４～１０６、またはその誘導体；
（ｘｉｘ）配列番号７１～７３、および配列番号１０７～１０９、またはその誘導体；
（ｘｘ）配列番号７４～７６、および配列番号１１０～１１２、またはその誘導体；
（ｘｘｉ）配列番号７７～７９、および配列番号１１３～１１５、またはその誘導体；
（ｘｘｉｉ）配列番号８０～８２、および配列番号１１６～１１８、またはその誘導体；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号８３～８５、および配列番号１１９～１２１、またはその誘導体；
（ｘｘｉｖ）配列番号８６～８８、および配列番号１２２～１２４、またはその誘導体；
（ｘｘｖ）配列番号８９～９１、および配列番号１２５～１２７、またはその誘導体；
（ｘｘｖｉ）配列番号９２～９４、および配列番号１２８～１３０、またはその誘導体；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号９５～９７、および配列番号１３１～１３３、またはその誘導体。
前記抗原結合ドメインは、配列番号１３４～１４９から選択される可変重ドメイン、または、配列番号１３４～１４９の一つ以上に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含むか、または配列番号１３４～１４９から選択される可変重ドメイン、または、配列番号１３４～１４９の一つ以上に対する同一性が少なくとも８０％である変異体からなってもよい。前記変異体は、配列番号１３４～１４９の一つ以上に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。
Figure 2022553740000004
前記抗原結合ドメインは、配列番号１５０～１７６から選択される可変軽ドメイン、または、配列番号１５０～１７６の一つ以上に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含むか、または配列番号１５０～１７６から選択される可変軽ドメイン、または、配列番号１５０～１７６の一つ以上に対する同一性が少なくとも８０％である変異体からなってもよい。前記変異体は、配列番号１５０～１７６の一つ以上に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。
Figure 2022553740000005
Figure 2022553740000006
好適には、前記抗原認識ドメインは、可変重ドメインおよび可変軽ドメインの組み合わせを含む。好ましくは、前記抗原認識ドメインは、下記から選択された可変重ドメインおよび可変軽ドメインの組み合わせを含む。
（ｉ）配列番号１３４に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１５０に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１３５に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１５１に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１３６に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１５２に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１５３に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１５４に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１５５に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１５６に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１５７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｉｘ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１５８に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１５９に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１６０に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１６１に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１６２に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｉｖ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１６３に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｖ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１６４に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号１３８に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１６５に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号１３９に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１６６に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４０に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１６７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｉｘ）配列番号１４１に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１６８に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｘ）配列番号１４２に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１６９に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号１４３に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１７０に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉ）配列番号１４４に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１７１に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号１４５に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１７２に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｘｉｖ）配列番号１４６に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１７３に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｘｖ）配列番号１４７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１７４に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉ）配列番号１４８に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１７５に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１４９に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列と、配列番号１７６に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列；
前記抗原結合ドメインは、配列番号１７７～２０３から選択されるアミノ酸配列、または、配列番号１７７～２０３の一つ以上に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含むか、または配列番号１７７～２０３から選択されるアミノ酸配列、または、配列番号１７７～２０３の一つ以上に対する同一性が少なくとも８０％である変異体からなってもよい。前記変異体は、配列番号１７７～２０３の一つ以上に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。前記抗原結合ドメインは、（Ｘ）ｎというリンカー配列を含んでもよく、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１～３０の整数である。前記リンカー配列は、当該技術分野において既知の任意のリンカー配列であってもよい。
抗原結合ドメイン例１（配列番号１７７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＬＤＬＷＧ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＳＳＬＤＩＳＨＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
抗原結合ドメイン例２（配列番号１７８）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ
抗原結合ドメイン例３（配列番号１７９）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＭＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＩＶＬＭＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＨＧＩＮＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＳＹＰＰＴＦＧＲＴＫＶＥＩＫＲ
抗原結合ドメイン例４（配列番号１８０）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
抗原結合ドメイン例５（配列番号１８１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＥＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＥＴＨＬＤＳＧＶＰＳＲＦＴＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＳＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
抗原結合ドメイン例６（配列番号１８２）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＩＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
抗原結合ドメイン例７（配列番号１８３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＳＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
抗原結合ドメイン例８（配列番号１８４）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＧＴＹＹＣＱＱＹＮＴＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
抗原結合ドメイン例９（配列番号１８５）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＤＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＨＴＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
抗原結合ドメイン例１０（配列番号１８６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
抗原結合ドメイン例１１（配列番号１８７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＱＧＩＳＳＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
抗原結合ドメイン例１２（配列番号１８８）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＲＡＰＴＬＬＩＦＡＡＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＳＹＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
抗原結合ドメイン例１３（配列番号１８９）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＲＡＰＴＬＬＩＹＫＡＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＳＹＹＣＱＱＹＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
抗原結合ドメイン例１４（配列番号１９０）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＨＧＩＳＮＹＦＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
抗原結合ドメイン例１５（配列番号１９１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ－（Ｘ）ｎ－ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＹＶＧＤＲＩＴＩＴＣＲＡＳＲＧＩＳＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＴＳＴＬＱＳＧＶＰＬＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＳＹＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
抗原結合ドメイン例１６（配列番号１９２）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＤＳＲＧＳＹＹＹＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ－（Ｘ）ｎ－ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＴＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＧＮＡＶＮＷＹＱＨＦＰＧＴＡＰＴＬＬＩＹＳＮＮＱＲＰＳＧＶＰＥＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＴＶＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＴＡＷＤＤＳＬＲＧＹＬＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ
抗原結合ドメイン例１７（配列番号１９３）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＥＥＬＬＡＬＦＧＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ－（Ｘ）ｎ－ＱＰＶＬＴＱＰＳＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＲＩＴＣＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＶＹＤＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＲＤＥＡＤＹＹＣＨＶＷＤＡＫＴＮＨＱＶＦＧＧＧＴＲＬＴＶＱ
抗原結合ドメイン例１８（配列番号１９４）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＰＱＳＲＷＬＱＳＧＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ－（Ｘ）ｎ－ＱＰＶＬＴＱＰＲＳＶＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＲＶＳＷＹＱＱＴＰＧＴＡＰＫＬＭＩＹＥＶＳＮＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＴＳＳＳＴＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
抗原結合ドメイン例１９（配列番号１９５）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＲＩＮＡＧＮＧＮＴＫＹＳＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＴＧＴＬＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ－（Ｘ）ｎ－ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＧＶＫＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＶＩＹＲＤＹＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＫＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＶＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬ
抗原結合ドメイン例２０（配列番号１９６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＡＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＡＥＲＷＬＨＬＳＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ－（Ｘ）ｎ－ＱＰＶＬＴＱＳＳＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＡＩＳＣＳＧＳＳＳＮＶＧＳＮＴＶＮＷＹＱＱＳＰＧＴＡＰＫＬＬＩＳＳＮＨＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＦＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＧＡＷＤＤＳＬＮＧＹＶＦＧＳＧＴＫＶＴＶＬ
抗原結合ドメイン例２１（配列番号１９７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＳＡＶＹＹＣＡＴＧＨＹＧＤＹＶＷＧＱＧＡＬＶＴＶＳＳ－（Ｘ）ｎ－ＱＡＧＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＳＮＮＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
抗原結合ドメイン例２２（配列番号１９８）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＷＩＮＡＧＮＧＮＴＫＹＳＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＳＳＧＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＶＶＴＶＳＳ－（Ｘ）ｎ－ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＧＳＤＶＧＧＹＫＹＶＳＷＹＱＨＨＰＧＫＡＰＲＬＩＩＹＤＶＮＹＷＰＳＧＶＳＨＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＲＴＧＤＴＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
抗原結合ドメイン例２３（配列番号１９９）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＧＦＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＩＰＭＦＧＴＡＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＩＴＡＥＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＶＰＲＳＳＳＧＹＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ－（Ｘ）ｎ－ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＫＹＮＳＡＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
抗原結合ドメイン例２４（配列番号２００）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＬＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＶＳＴＮＳＧＡＷＳＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＳＴＤＹＡＬＳＬＱＳＲＶＴＩＫＳＤＲＳＫＮＱＦＳＬＱＬＤＳＶＴＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＥＮＷＮＳＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＰＳ－（Ｘ）ｎ－ＱＰＶＬＴＱＳＳＳＡＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＥＶＳＫＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＳＴＡＳＬＴＶＳＧＬＱＡＥＤＥＡＥＹＹＣＳＳＹＡＧＳＮＮＹＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ
抗原結合ドメイン例２５（配列番号２０１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＡＳＲＷＥＰＧＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ－（Ｘ）ｎ－ＱＰＶＬＴＱＳＳＳＶＳＶＡＰＧＫＴＡＲＶＴＣＧＧＤＮＩＧＧＫＳＶＨＷＹＱＱＲＡＧＱＡＰＶＬＶＩＳＨＤＴＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＲＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＶＷＤＡＳＬＧＧＳＷＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
抗原結合ドメイン例２６（配列番号２０２）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＳＹＤＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＲＷＬＲＳＡＳＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ－（Ｘ）ｎ－ＱＡＧＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＡＹＤＶＨＷＹＱＱＬＰＧＡＡＰＫＬＬＩＦＧＤＳＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＤＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＤＳＳＬＳＧＳＲＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
抗原結合ドメイン例２７（配列番号２０３）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＨＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＴＳＧＧＳＳＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＤＳＳＡＹＱＧＲＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ－（Ｘ）ｎ－ＬＰＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＰＶＨＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＶＹＲＮＮＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＲＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＶＳＬＳＧＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
本明細書に記載の前記抗原認識ドメインの変異体は、抗原結合能力を保持する。たとえば、前記変異体は、対応する参照アミノ酸配列の結合レベルの、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のレベルで、ＨＬＡ－Ａ２と結合できればよい。前記変異体は、対応する参照アミノ酸配列のレベルに近いレベルで、または同じレベルでＨＬＡ－Ａ２と結合できてもよく、または、対応する参照アミノ酸配列よりも高いレベル（たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％高くなったレベル）でＨＬＡ－Ａ２と結合できればよい。したがって、前記抗原認識ドメインは、配列番号５～１３３（上記に示す、配列番号１３４～１７６の下線部）のＣＤＲの１個以上（たとえば、１個、２個、３個、４個、５個、または６個）を含むアミノ酸配列を含むか、または該アミノ酸配列からなってもよい。フレームワーク領域で、１個（またはそれ以上）のアミノ酸残基の置換、変異、修飾、交換、欠失および／または付加が生じていてもよい。
したがって、いくつかの実施形態において、前記抗原認識ドメインは、下記配列を含むか、または下記配列からなる：
（ｉ）配列番号１３４に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号５～７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１５０に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１７～１９からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１３５に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号８～１０からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１５１に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号２０～２２からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１３６に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１１～１３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１５２に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号２３～２５からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１５３に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号２６～２８からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１５４に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号２９～３１から成るＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１５５に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号３２～３４からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１５６に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号３５～３７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１５７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号３８～４０からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｉｘ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１５８に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号４１～４３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１５９に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号４４～４６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１６０に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号４７～４９からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１６１に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号５０～５２からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１６２に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号５３～５５からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｉｖ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１６３に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号５６～５８からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｖ）配列番号１３７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１６４に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号５９～６１からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号１３８に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号６２～６４からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１６５に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号９８～１００からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号１３９に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号６５～６７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１６６に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１０１～１０３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４０に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号６８～７０からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１６７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１０４～１０６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｉｘ）配列番号１４１に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号７１～７３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１６８に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１０７～１０９からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｘ）配列番号１４２に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号７４～７６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１６９に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１１０～１１２からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号１４３に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号７７～７９からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１７０に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１１３～１１５からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉ）配列番号１４４に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号８０～８２からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１７１に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１１６～１１８からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号１４５に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号８３～８５からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１７２に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１１９～１２１からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｘｉｖ）配列番号１４６に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号８６～８８からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１７３に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１２２～１２４からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｘｖ）配列番号１４７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号８９～９１からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１７４に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１２５～１２７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；
（ｘｘｖｉ）配列番号１４８に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号９２～９４からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１７５に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１２８～１３０からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列；または
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１４９に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号９５～９７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列、および／または配列番号１７６に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１３１～１３３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含むアミノ酸配列。
いくつかの実施形態において、前記抗原認識ドメインは、下記配列を含むか、または下記配列からなる：
（ｉ）配列番号１７７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号５～７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、配列番号１７～１９からそれぞれ成るＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１７８に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、配列番号８～１０からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号２０～２２からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１７９に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号１１～１３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号２３～２５からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号１８０に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号２６～２８からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｖ）配列番号１８１に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号２９～３１からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号１８２に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号３２～３４からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号１８３に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号３５～３７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号１８４に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号３８～４０からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｉｘ）配列番号１８５に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号４１～４３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘ）配列番号１８６に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号４４～４６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号１８７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号４７～４９からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号１８８に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号５０～５２からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号１８９に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号５３～５５からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｉｖ）配列番号１９０に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号５６～５８からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｖ）配列番号１９１に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号５９～６１からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号１９２に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号６２～６４からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号９８～１００からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号１９３に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号６５～６７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号１０１～１０３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号１９４に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号６８～７０からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号１０４～１０６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｉｘ）配列番号１９５に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号７１～７３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号１０７～１０９からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｘ）配列番号１９６に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号７４～７６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号１１０～１１２からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号１９７に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号７７～７９からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号１１３～１１５からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｘｉｉ）配列番号１９８に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号８０～８２からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号１１６～１１８からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号１９９に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号８３～８５からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号１１９～１２１からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｘｉｖ）配列番号２００に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号８６～８８からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号１２２～１２４からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｘｖ）配列番号２０１に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号８９～９１からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号１２５～１２７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；
（ｘｘｖｉ）配列番号２０２に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号９２～９４からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号１２８～１３０からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列；または
（ｘｘｖｉｉ）配列番号２０３に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列であって、可変重ドメインが、それぞれ配列番号９５～９７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、可変軽ドメインが、それぞれ配列番号１３１～１３３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、アミノ酸配列。
ヒンジドメイン
ＣＡＲは、ヒンジドメインを含んでいてもよい。
本明細書で使用される、「スペーサドメイン」とも称される前記「ヒンジドメイン」は、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインから隔てるＣＡＲの細胞外の一部のことである。前記ヒンジは、標的抗原にアクセスするためのフレキシビリティを提供してもよい。たとえば、長いスペーサはＣＡＲに追加的なフレキシビリティ（ｅｘｔｒａ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供し、膜に近位のエピトープにアクセスしやすくする。
好適なヒンジドメインは、当業者に明らかであろう（たとえば、Guedan, S., et al., 2018. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 12, 145-156）。好適なヒンジドメインとしては、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、ＩｇＧヒンジドメイン、およびＩｇＤヒンジドメインがあるが、これらに限定されるわけではない。好ましくは、前記ヒンジドメインはＣＤ８またはＣＤ２８ヒンジドメインである。
最も好ましくは、前記ヒンジドメインはＣＤ８ヒンジドメインである。好適には、前記ヒンジドメインは、配列番号２２２として示されるアミノ酸配列、または配列番号２２２に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでいてもよい。
ＣＤ８ヒンジドメインの例（配列番号２２２）：
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ
好適には、前記変異体は、配列番号２２２に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。
好適には、前記ヒンジドメインはＣＤ２８ヒンジドメインである。好適には、前記ヒンジドメインは、配列番号２２１として示されるアミノ酸配列、または配列番号２２１に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでいてもよい。
ＣＤ２８ヒンジドメインの例（配列番号２２１）：
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ
好適には、前記変異体は、配列番号２２１に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。
好適には、ＣＡＲは、ｃ－Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬー配列番号２２３）などのタグをコードしてもよい。好適には、前記タグは、ＣＡＲの細胞外ドメインに組み込まれてもよく、たとえば、細胞外ドメインのヒンジドメインなどに組み込まれてもよい。ｃ－Ｍｙｃタグが一体化されているＣＤ２８ヒンジドメインの例を以下に示す。好適には、前記ヒンジドメインは、配列番号２２４として示されるアミノ酸配列、または配列番号２２４に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでいてもよい。
ｃ－Ｍｙｃタグが一体化されているＣＤ２８ヒンジドメインの例（配列番号２２４）：
ＩＥＶＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ
好適には、前記変異体は、配列番号２２４に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。
膜貫通ドメイン
前記ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含んでいてもよい。
本明細書で使用される「膜貫通ドメイン」は、Ｔｒｅｇの細胞膜内にＣＡＲを固定する、ＣＡＲの一部のことである。したがって、膜貫通ドメインは、Ｔｒｅｇの細胞膜内に及ぶ、または存在することができる。膜貫通ドメインは、細胞外および／または細胞内部分を含むタンパク質に由来してもよく、したがって本明細書で使用されるような膜貫通ドメインは、前記細胞膜内にあるかまたはそれに及ぶ部分だけでなく、由来元のタンパク質に由来する細胞外および／または細胞内残基にも付随していてもよい。たとえば、膜貫通ドメインは、その由来元のタンパク質に由来するヒンジドメインに付随していてもよく、たとえば、ＣＤ８に由来する膜貫通ドメインがＣＤ８に由来するヒンジドメインに付随していてもよい。また、たとえばＣＤ８またはＣＤ２８に由来する膜貫通ドメインが、ＣＤ８またはＣＤ２８共刺激ドメインに付随していてもよい。前記膜貫通ドメインはまた、合成であることも可能で、たとえば、新規に設計でき、膜貫通ドメインを有するタンパク質に由来しなくてもよいことは、当業者であれば理解されよう。膜貫通ドメインが細胞膜内に存在することは、蛍光顕微鏡を使用した蛍光標識など、当該技術分野で既知のいずれか好適な方法を使用して調べることができる。
好適な膜貫通ドメインは、当業者に明らかであろう。前記膜貫通ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質、ＩＩ型膜貫通タンパク質、またはＩＩＩ型膜貫通タンパク質などの、膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質からの膜貫通配列を含んでいてもよい。ＣＡＲの膜貫通ドメインはまた、人工疎水性配列を含んでいてもよい。膜貫通ドメインは、二量化しないように選択されてもよい。
ＣＡＲコンストラクトに使用される膜貫通（ＴＭ）ドメインの例を、下記に示す。
１）ＣＤ２８ＴＭドメイン（Pule et al、Mol Ther、2005、Nov;12(5):933-41;Brentjens et al、CCR、2007、Sep15;13(18Pt1):5426-35;Casucci et al、Blood、2013、Nov14;122(20):3461-72）；
２）ＯＸ４０ ＴＭドメイン（Pule et al、Mol Ther、2005、Nov;12(5):933-41）；
３）４１ＢＢ ＴＭドメイン（Brentjens et al、CCR、2007、Sep15;13(18Pt1):5426-35）；
４）ＣＤ３ ｚｅｔａ ＴＭドメイン（Pule et al、Mol Ther、2005、Nov;12(5):933-41;Savoldo B、Blood、2009、Jun18;113(25):6392-402）；
５）ＣＤ８ ａｌｐｈａ ＴＭドメイン（Maher et al、Nat Biotechnol、2002、Jan;20(1):70-5.;Imai C、Leukemia、2004、Apr;18(4):676-84;Brentjens et al、CCR、2007、Sep15;13(18Pt1):5426-35;Milone et al、Mol Ther、2009、Aug;17(8):1453-64）；
６）ＩＣＯＳ ＴＭドメイン；
７）ＣＤ４ ＴＭドメイン。
最も好ましくは、前記ＣＡＲは、ＣＤ８膜貫通ドメインを含んでいてもよい。好適には、膜貫通ドメインは配列番号２２５として示されるアミノ酸配列、または配列番号２２５に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでいてもよい。
ＣＤ８ＴＭドメイン（ＡＡ１８３～２０３）の例（配列番号２２５）：
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ
好適には、前記変異体は、配列番号２２５に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。
最も好ましくは、前記ＣＡＲは、ＣＤ８ヒンジドメインおよびＣＤ８膜貫通ドメインを含んでいてもよい。好適には、前記ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号２２６として示されるアミノ酸配列、または配列番号２２６に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでいてもよい。
ＣＤ８ヒンジドメインおよびＣＤ８膜貫通ドメインの例（配列番号２２６）：
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ
好適には、前記変異体は、配列番号２２６に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。
好適には、前記ＣＡＲは、ＣＤ２８ヒンジドメインおよびＣＤ８膜貫通ドメインを含んでいてもよい。好適には、前記ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号２２７として示されるアミノ酸配列、または配列番号２２７に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでいてもよい。
ＣＤ２８ヒンジドメインおよびＣＤ８膜貫通ドメインの例（配列番号２２７）：
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ
好適には、前記変異体は、配列番号２２７に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。
好適には、ＣＡＲはＣＤ２８膜貫通ドメインを含んでいてもよい。好適には、膜貫通ドメインは配列番号２２８として示されるアミノ酸配列、または配列番号２２８に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでいてもよい。
ＣＤ２８ＴＭドメイン（ＡＡ１５３～１７９）の例（配列番号２２８）：
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ
好適には、前記変異体は、配列番号２２８に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。
膜貫通ドメインの変異体が、細胞膜を横断して、または跨いで（ｓｐａｎnｎｉｎｇ）存在できなくてはならない、すなわち、膜貫通ドメインでありうるものでなければならないことは、当業者であれば理解されよう。
エンドドメイン
ＣＡＲは、１個以上の細胞内シグナル伝達ドメインと、場合によっては１個以上の共刺激ドメインとを含むエンドドメインを含んでいてもよい。
ＣＡＲは、１個以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。
本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、ＨＬＡ（好ましくはＨＬＡ－Ａ２）に結合する有効なＣＡＲのメッセージをＴｒｅｇ内部に伝達して、たとえば免疫抑制機能などのＴｒｅｇ機能を誘導することにかかわる、ＣＡＲの細胞内の部分のことである。
好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、当業者に明らかであろう。前記細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、Ｔｒｅｇがその特殊機能を抗原結合の際に発揮するよう指示するために必要である。細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体のζ鎖またはその相同体（たとえば、η鎖、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖など）、ＣＤ３ポリペプチドドメイン（Δ、δ、およびε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０、など）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、など）、ならびに、ＣＤ２、ＣＤ５およびＣＤ２８、またはそのシグナル伝達ドメインなどのＴ細胞形質導入に関わるその他の分子があるが、これらに限定されない。前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、ＦｃｙＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、またはそれらの組み合わせであってもよい。
最も好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの細胞内シグナル伝達ドメインを含でもよい。好適には、細胞内シグナル伝達ドメインは配列番号２２９として示されるアミノ酸配列、または配列番号２２９に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでいてもよい。
ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの例（配列番号２２９）：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
好適には、前記変異体は、配列番号２２９に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。好適には、細胞内シグナル伝達ドメインは配列番号２３０として示されるアミノ酸配列、または配列番号２３０に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでいてもよい。
ＣＤ２８シグナル伝達ドメインの例（配列番号２３０）：
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ
好適には、前記変異体は、配列番号２３０に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。好適には、細胞内シグナル伝達ドメインは配列番号２３１として示されるアミノ酸配列、または配列番号２３１に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでいてもよい。
ＣＤ２７シグナル伝達ドメインの例（配列番号２３１）：
ＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＨＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ
一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２３１に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるシグナリングモチーフを含む。
さらに別の細胞内シグナル伝達ドメインは当業者に明らかであろう。これらは本発明の代替の実施形態と関連して用いられてもよい。
ＣＡＲはまた、１個以上の共刺激ドメインを含んでいてもよい。
本明細書で使用される「共刺激ドメイン」とは、Ｔｒｅｇ機能（たとえば免疫抑制機能）、増殖、および／または持続を促進しうる、ＣＡＲの細胞内部分のことである。
したがって、ＣＡＲは、たとえばＣＤ３ζなどの細胞内シグナル伝達ドメインに対して前記一つ以上の共刺激ドメインの融合したものを含む化合物エンドドメインを含んでいてもよい。かかる化合物エンドドメインは、抗原認識後に同時に活性化および共刺激シグナルを伝送できる第２世代ＣＡＲと称されてもよい。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、Ｔｒｅｇ増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給する。好適な共刺激ドメインは、当業者に明らかであろう。
したがって、前記ＣＡＲは好ましくはＣＤ２８共刺激ドメインを含んでもよい。好適には、前記１個以上の共刺激ドメインは配列番号２３０として示されるアミノ酸配列、または、配列番号２３０に対する同一性が少なくとも８０％（たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）である変異体を含んでいてもよい。
好適には、前記１個以上の共刺激ドメインは配列番号２３１として示されるアミノ酸配列、または、配列番号２３１に対する同一性が少なくとも８０％（たとえば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）である変異体を含んでいてもよい。
好適には、前記一つ以上の共刺激ドメインは、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、またはＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達ドメインなど、ＴＮＦ受容体ファミリーのシグナリングドメインを１個以上含んでいてもよい。
ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、またはＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達ドメインの配列の例が、下記に示される。前記１個以上の共刺激ドメインは、配列番号２３２～２３５の一つ以上、または配列番号２３２～２３５の一つ以上に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでいてもよい。
ＯＸ４０シグナル伝達ドメインの例（配列番号２３２）：
ＡＬＹＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ
４１ＢＢシグナル伝達ドメインの例（配列番号２３３）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＩＣＯＳシグナル伝達ドメインの例（配列番号２３４）
ＣＷＬＴＫＫＫＹＳＳＳＶＨＤＰＮＧＥＹＭＦＭＲＡＶＮＴＡＫＫＳＲＬＴＤＶＴＬ
ＴＮＦＲＳＦ２５シグナル伝達ドメインの例（配列番号２３５）：
ＴＹＴＹＲＨＣＷＰＨＫＰＬＶＴＡＤＥＡＧＭＥＡＬＴＰＰＰＡＴＨＬＳＰＬＤＳＡＨＴＬＬＡＰＰＤＳＳＥＫＩＣＴＶＱＬＶＧＮＳＷＴＰＧＹＰＥＴＱＥＡＬＣＰＱＶＴＷＳＷＤＱＬＰＳＲＡＬＧＰＡＡＡＰＴＬＳＰＥＳＰＡＧＳＰＡＭＭＬＱＰＧＰＱＬＹＤＶＭＤＡＶＰＡＲＲＷＫＥＦＶＲＴＬＧＬＲＥＡＥＩＥＡＶＥＶＥＩＧＲＦＲＤＱＱＹＥＭＬＫＲＷＲＱＱＱＰＡＧＬＧＡＶＹＡＡＬＥＲＭＧＬＤＧＣＶＥＤＬＲＳＲＬＱＲＧＰ
前記１個以上の共刺激ドメインは、配列番号２３２～２３５のいずれか一つに対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳおよびＴＮＦＲＳＦ２５シグナル伝達ドメインのうちの一つ以上の変異体を含んでいてもよい。
ＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインとを含んでいてもよい。好適には、前記エンドドメインは配列番号２３６として示されるアミノ酸配列、または配列番号２３６に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでいてもよい。
ＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの例（配列番号２３６）：
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
前記エンドドメインは、配列番号２３６に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である変異体を含んでもよい。
細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激ドメインの変異体は、それに対応する野生型細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激ドメインと同じ機能、または類似の機能を有していてもよく、たとえば、野生型ドメインの機能の（たとえば、野生型ドメインのシグナル伝達能力の）少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０％を有していてもよい。
その他のドメイン
いくつかの実施形態において、前記ＣＡＲは１個以上のシグナルペプチドを含む。
ＣＡＲは、細胞表面での発現のための小胞体経路に対してＣＡＲを向かわせるリーダー配列を含んでいてもよい。リーダー配列の例としては、ＣＤ８リーダー配列がある。リーダー配列の例が、配列番号２３７および２４１として下記に示される。
ＣＤ８リーダーの例（配列番号２３７）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
リーダー配列の例（配列番号２４１）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＡＰ
前記リーダー配列は、配列番号２３７または２４１に対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である変異体を含むか、または該変異体からなってもよい。
いくつかの実施形態において、前記ＣＡＲは１個以上のレポータードメインを含み、場合によっては自己切断（self-cleaving）ドメインまたは切断（cleavage）ドメインとの組み合わせでそれを含む。
好適なレポータードメインは、当該技術分野において周知であり、ＧＦＰなどの蛍光蛋白質を含むが、これらに限定されるわけではない。レポータードメインを使用することにより、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターがうまく（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ）導入されているＴｒｅｇ（コードされているＣＡＲが発現するように導入されているＴｒｅｇ）を、たとえばフローサイトメトリーなどの一般的な方法を使用して開始細胞集団から選択し単離できるので、選択可能マーカーの使用が有利である。好適には、前記レポータードメインは、ルシフェラーゼ系レポーター、ＰＥＴレポーター（たとえば、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、または膜タンパク質（たとえば、ＣＤ３４、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ））であってもよい。
ＣＡＲをコードする核酸配列とレポータードメインをコードする核酸配列とは、各ポリペプチドが個々の実体として発現することが可能になる共発現部位によって分離されてもよい。好適な共発現部位は当該技術分野で既知であり、たとえば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）や自己切断ペプチドがある。好適な自己切断ドメインまたは切断ドメインには、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、およびフューリン部位があるが、それらに限定されるわけではない。
ＣＡＲコンストラクトの例
本発明に使用するためのＣＡＲの例を下記に示す。前記ＣＡＲは、配列番号２０９または２１０のうちの一つに対する同一性が少なくとも８０％（たとえば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるアミノ酸配列を含んでもよい。好ましくは、任意のかかる変異体は、配列番号２０９または２１０と比較して少なくとも部分的にその機能を有する。たとえば、前記変異体は、配列番号２０９または２１０のうちの一つとして示されるアミノ酸配列の機能の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を有していてもよい。前記変異体または誘導体は、配列番号２０９または２１０のうちの一つのレベルに近いレベルの機能、または同じレベルの機能を有していてもよく、または、配列番号２０９または２１０のうちの一つとして示されるアミノ酸配列よりも高いレベル（たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％高くなったレベル）の機能を有していてもよい。
ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭドメイン－ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン－ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（配列番号２０９）：
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
ＣＤ２８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭドメイン－ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン－ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（配列番号２１０）：
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
特に、配列番号２０９またはその変異体は、下記（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）を含む抗原結合ドメインと併用してもよい。（ｉ）配列番号８～１０および配列番号２０～２２、またはその誘導体；（ｉｉ）配列番号１１～１３および配列番号２３～２５、またはその誘導体；（ｉｉｉ）配列番号１４～１６および配列番号２６～２８、またはその誘導体。
本発明のベクターは、下記表に示すようなドメインを含むＣＡＲを特に含んでもよい。
Figure 2022553740000007
配列番号２０９および配列番号２１０をコードするポリヌクレオチド配列の例を下記に示す。ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１１または２１２に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）である配列を含んでもよい。好ましくは、任意のかかる変異体は、配列番号２０９または２１０と比較して少なくとも部分的にその機能を有するＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする。たとえば、前記変異体がコードするＨＬＡ特異的ＣＡＲは、配列番号２０９または２１０として示されるアミノ酸配列の機能の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を有していてもよい。前記変異体がコードするＨＬＡ特異的ＣＡＲは、配列番号２０９または２１０のうちの一つのレベルに近いレベルの機能、または同じレベルの機能を有していてもよく、または、配列番号２０９または２１０のうちの一つとして示されるアミノ酸配列よりも高いレベル（たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％高くなったレベル）の機能を有していてもよい。
配列番号２０９をコードするポリヌクレオチド配列の例（配列番号２１１）：
ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＡＧＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＣＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＣＧＣＡＧＣＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＣ
配列番号２１０をコードするポリヌクレオチド配列の例（配列番号２１２）：
ＡＴＣＧＡＧＧＴＧＡＴＧＴＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＡＧＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＣＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＣＧＣＡＧＣＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＣ
第一および第二のポリヌクレオチドの相対的な位置
好ましい実施形態において、前記ＦＯＸＰ３をコードする第一のポリヌクレオチドは、ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドの上流にある。したがって、好ましい実施形態において、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結され、前記第一のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドの上流にある。
本明細書において「上流」という用語がポリヌクレオチドについて使用されるとき、「上流」のポリヌクレオチドは「下流」のポリヌクレオチドの５’側であることを意味する。換言すると、好ましい実施形態において、前記ベクターは、５’ ＦＯＸＰ３－ＨＬＡ特異的ＣＡＲ ３’に方向性を有していてもよい。より好ましい実施形態において、前記ベクターは、５’ プロモーター－ＦＯＸＰ３－ＨＬＡ特異的ＣＡＲ ３’という構造を有していてもよい。本明細書において、ＦＯＸＰ３の発現は、最適発現のためには前記プロモーターに直接駆動される。
重要なことに、ＦＯＸＰ３が、５’から３’への方向において、ＣＡＲの前にあるという構成が、（外因性の）ＦＯＸＰ３が発現しているときのみＣＡＲの発現が起こりうること、およびＦＯＸＰ３が存在しない状態でＣＡＲの発現が起こらないことを確実にする。改変されたＴｒｅｇの当該状況において、このことは特に有利である。これによって、Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクが低減され、および／または、開始集団の中に存在するＴエフェクター細胞に前記ＣＡＲを導入することに関連するリスクを低減するからである。
切断部位および配列内リボソーム進入部位
ＦＯＸＰ３をコードする核酸配列と前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする核酸配列との両方を同じｍＲＮＡ転写産物から発現するようにできる核酸配列によって、ＦＯＸＰ３をコードする前記ポリヌクレオチドが、前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする前記ポリヌクレオチドから、分離されてもよい。
たとえば、前記ベクターは、（ｉ）ＦＯＸＰ３をコードする核酸配列と（ｉｉ）ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする核酸配列との間に配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含んでもよい。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡ配列の途中で翻訳開始可能なヌクレオチド配列である。好適には、前記ベクターは、５’ プロモーター－ＦＯＸＰ３－ＩＲＥＳ－ＨＬＡ特異的ＣＡＲ ３’という構造を有していてもよい。
好適には、前記ベクターは、切断ドメインによって連結された（ｉ）ＦＯＸＰ３をコードする核酸配列と（ｉｉ）ＨＬＡ特異的ＣＡＲとをコードする核酸配列とを含んでもよい。かかる配列は、タンパク質産生中に自己切断してもよく、または細胞中に存在する一般的な酵素によって切断されてもよい。好ましくは切断ドメインは自己切断であってもよい。したがって、ポリペプチド配列中に切断ドメインを含むことにより、第一および第二のポリペプチドが単一のポリペプチドとして発現されるようにでき、前記単一のポリペプチドがその後切断されて、個々の機能的なポリペプチドになる。好適には、前記ベクターは、５’ プロモーター－ＦＯＸＰ３－切断ドメイン－ＨＬＡ特異的ＣＡＲ ３’という構造を有していてもよい。好適な切断ドメインは、フューリン部位（たとえば、配列番号２３８または２３９）を含んでもよい。
フューリン部位ー切断ドメイン：ＲＸＸＲ（配列番号２３８）（優先的には、ＲＲＫＲ（配列番号２３９）
好ましくは、前記ベクターは、自己切断配列によって連結された（ｉ）ＦＯＸＰ３をコードする核酸配列と（ｉｉ）ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする核酸配列とを含んでもよい。かかる配列は、タンパク質産生中に自己切断する。好適には、前記ベクターは、５’ プロモーター－ＦＯＸＰ３－自己切断配列－ＨＬＡ特異的ＣＡＲ ３’という構造を有していてもよい。
好ましくは、前記自己切断配列は、２Ａ自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。好適には、前記ベクターは、５’ プロモーター－ＦＯＸＰ３－２Ａ自己切断ペプチド－ＨＬＡ特異的ＣＡＲ ３’という構造を有していてもよい。
全体的に見れば、多重遺伝子同時発現のための他の方法と比較して、２Ａペプチドの場合、下流タンパク質の発現が相対的に高いレベルとなり、またサイズが小さいので、同時発現した遺伝子の機能を妨げるリスクが低くなる（Liu, Z., et al., 2017. Scientific reports, 7(1）、p.2193）。
その上、２Ａ媒介「自己切断」のメカニズムは、リボソームが前記２ＡのＣ末端でグリシル－プロリル ペプチド結合の形成をスキップするというものである。高度に保存された配列、ＧＤＶＥＸＮＰＧＰ（配列番号２４０）は、異なる２ＡによりＣ末端で共有され、立体障害およびリボソームスキッピングを生じるために必須である。２Ａが媒介するスキッピングの発生には、下記の３つが起こりうる。（１）スキッピングが生じ、翻訳が再開して、二つの「切断された」タンパク質になる、２Ａの上流のタンパク質が、Ｃ末端のプロリン以外の完全な２Ａペプチドに付随し、２Ａの下流のタンパク質がＮ末端の１個のプロリンに付随する；（２）スキッピングが生じるが、リボソームが脱落し、翻訳が継続せず、その結果２Ａの上流のタンパク質のみになる；（３）スキッピングが生じず、翻訳が継続し、その結果融合タンパク質になる。（２）のリスクのため、５’から３’への方向において、ＦＯＸＰ３がＣＡＲの前にあるという構成が、ＦＯＸＰ３が発現しているときのみＣＡＲの発現が起こりうること、およびＦＯＸＰ３が存在しない状態でＣＡＲの発現が起こらないことを確実にする。
好適な自己切断ペプチドには、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、およびＦ２Ａペプチドがある。
好適には、前記ベクターは、下記構造を有していてもよい：
（ｉ）５’ プロモーター－ＦＯＸＰ３－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ特異的ＣＡＲ ３’；
（ｉｉ）５’ プロモーター－ＦＯＸＰ３－Ｔ２Ａ－ＨＬＡ特異的ＣＡＲ ３’；
（ｉｉｉ）５’ プロモーター－ＦＯＸＰ３－Ｅ２Ａ－ＨＬＡ特異的ＣＡＲ ３’；または
（ｉｖ）５’ プロモーター－ＦＯＸＰ３－Ｆ２Ａ－ＨＬＡ特異的ＣＡＲ ３’。
好ましくは、前記ベクターは、下記構造を有していてもよい：５’ プロモーター－ＦＯＸＰ３－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ特異的ＣＡＲ ３’。
Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、およびＦ２Ａペプチドの配列の例を下記に示す。自己切断配列は、配列番号２１３、２１５、２１７、２１９、２４２、２４４、２４６、または２４８のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列、または配列番号２１３、２１５、２１７、２１９、２４２、２４４、２４６、または２４８のいずれかに対する同一性が少なくとも８０％である変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含んでいてもよく、またはこれらのポリヌクレオチド配列からなってもよい。
Ｐ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２１３）：
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
Ｔ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２１５）：
ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
Ｅ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２１７）：
ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
Ｆ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２１９）：
ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
Ｐ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２４２）：
ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
Ｔ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２４４）：
ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
Ｅ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２４６）：
ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
Ｆ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２４８）：
ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
前記自己切断配列は、配列番号２１３、２１５、２１７、２１９、２４２、２４４、２４６、または２４８のいずれか一つに対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または該ポリヌクレオチド配列からなってもよい。
Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、およびＦ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の例を下記に示す。自己切断配列は、配列番号２１４、２１６、２１８、２２０、２４３、２４５、２４７、または２４９のいずれかから選択されるポリヌクレオチド、または配列番号２１４、２１６、２１８、２２０、２４３、２４５、２４７、または２４９のいずれかに対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでいてもよく、または該ポリヌクレオチドもしくは該変異体からなってもよい。
Ｐ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２１４）：
ＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣ
Ｔ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２１６）：
ＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣ
Ｅ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２１８）：
ＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣ
Ｆ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２２０）：
ＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣ
Ｐ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２４３）：
ＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣ
Ｔ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２４５）：
ＧＡＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣ
Ｅ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２４７）：
ＣＡＧＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣ
Ｆ２Ａペプチド切断ドメインの例（配列番号２４９）：
ＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣ
前記自己切断配列は、配列番号２１４、２１６、２１８、２２０、２４３、２４５、２４７、または２４９のいずれか一つに対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である変異体を含んでいてもよく、または該変異体からなってもよい。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明において、ＨＬＡ特異的な細胞は、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本明細書において第一のポリヌクレオチドと記載されることもある）と、ＨＬＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド（本明細書において第二のポリヌクレオチドと記載されることもある）とを、細胞に導入することにより生成される。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、互いに同義であるものとする。ポリヌクレオチドは、任意の好適なタイプのヌクレオチド配列、たとえば合成ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、または部分的ゲノムＤＮＡ配列であってもよい。
「ポリペプチド」という用語は、「タンパク質」と同義であり、典型的には隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合により互いに連続した、一連の残基、典型的にはＬアミノ酸を意味する。
多数の異なるポリヌクレオチドが、遺伝子コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードしうる。当業者であれば、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を起こすことにより、前記ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主個体のコドンの使用頻度を反映することができる。
前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、一本鎖または二本鎖であってもよく、合成または修飾ヌクレオチドを含んでもよい。当該技術分野において、オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が知られている。これらの修飾としては、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端へのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が挙げられる。ポリヌクレオチドは、当該技術分野の任意の方法により修飾されてもよい。かかる修飾は、前記ポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を向上させる場合がある。
前記ポリヌクレオチドは、単離された、または組み換えられた形態であってもよい。前記ポリヌクレオチドをベクターに組み込んでもよく、前記ベクターを宿主細胞に組み込んでもよい。
前記ポリヌクレオチドは、コドン最適化されてもよい。細胞が異なっていれば、特定のコドンの使用頻度が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量の偏りに相当する。配列中のコドンを調整して、対応するｔＲＮＡの相対的存在量に合うようにコドンを適合させることにより、発現を増加させることが可能である。好適には、前記ポリヌクレオチドは、疾患マウスモデルにおける発現のためにコドンが最適化されていてもよい。好適には、前記ポリヌクレオチドは、ヒト対象における発現のためにコドンが最適化されていてもよい。
ＨＩＶやその他のレンチウイルスなど、多くのウイルスは、多数のレアコドンを利用しており、一般的に使用される哺乳動物のコドンに対応するようにこれらを変えることによって、哺乳動物のプロデューサー細胞におけるパッケージング成分の発現の増加を達成することができる。コドン使用頻度表は、哺乳類の細胞についても、またその他の様々な生物についても、当該技術分野で周知である。コドン最適化では、ｍＲＮＡ不安定モチーフおよび隠れたスプライス部位の除去も行ってもよい。
変異体、誘導体、および断片
本明細書で言及されている特異的なポリペプチドおよびポリヌクレオチドに加えて、その誘導体、変異体、および断片の使用も本発明に包含される。
本発明のタンパク質またはポリペプチドに関連して本明細書で使用される「誘導体」という用語は、得られたポリペプチドが所望の機能を保持することを提供する、前記配列からの、または前記配列への、１個（またはそれ以上）のアミノ酸残基の置換、変異、修飾、代替、欠失、および／または付加を含む（たとえば、前記誘導体または変異体が抗原結合ドメインの場合、前記所望の機能は、抗原結合ドメインの標的抗原と結合する能力であってもよく、または前記誘導体または変異体がシグナル伝達ドメインの場合、前記所望の機能は、前記ドメインが信号を発する（たとえば、下流の分子を活性化または不活性化する）能力であってもよい）。前記変異体または誘導体は、対応する参照配列と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の機能を有していてもよく、または、対応する参照配列と比較して、同様のレベルの機能、または同一のレベルの機能を有していてもよく、または、対応する参照配列よりも高いレベルの機能、たとえば、改変されていない配列と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％高くなったレベルの機能を有していてもよい。
典型的には、たとえば１、２、または３ないし１０または２０個の置換により、アミノ酸置換を行ってもよい。ただしそれは、改変された配列が必要な活性または能力を保持している、たとえば対応する参照配列と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の活性を有しているか、または、対応する参照配列と比較して、同様のレベルの、または同一のレベルの活性を有しているか、または、対応する参照配列よりも高いレベルの活性、たとえば、改変されていない配列と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％高くなったレベルの活性を有している場合である。アミノ酸置換では、天然由来ではない類似体が使用されてもよい。
本発明で使用されるタンパク質またはペプチドもまた、サイレントな変化を生じ（produce a silent change）て機能的に同等のタンパク質となるアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を有してもよい。内在的な機能が保持される限り、前記残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または、両親媒性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行ってもよい。たとえば、負帯電アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸などがあり、正帯電アミノ酸としては、リジンおよびアルギニンがあり、同様の親水性値をもつ非荷電の極性先端基を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシンがある。
たとえば下記表にしたがい、保存的置換を行ってもよい。第二欄の同じブロックにあるアミノ酸、好ましくは第三欄の同じ列にあるアミノ酸は、互いに置換できうる。
Figure 2022553740000008
前記誘導体は、相同体または変異体でもよい。本明細書で使用される「相同体」または「変異体」という用語は、野生型アミノ酸配列および野生型ヌクレオチド配列と、特定の相同性を有した実体を意味する。「相同性」という用語は、「同一性」と同等視することができる。
相同配列または変異配列は、その対象の配列に対する同一性が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％であってもよいアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を、含んでいてもよい。典型的には、前記相同体は、たとえば、対象のアミノ酸配列、または対象のヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列と同じ結合部位などを含むなど、類似の化学的特性／機能を有するだろう。相同性は、類似（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考えることもできるが、本発明の文脈においては、配列同一性の観点から相同性を表すことが好ましい。
相同性の比較は、目視で、またはより一般には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施することができる。これら市販のコンピュータプログラムは、二つ以上の配列間の百分率相同性または同一性の比率を算出できる。
百分率相同性は、連続配列に対して算出してもよい。すなわち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一残基ずつ直接比較する。これは、「非ギャップ（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アライメントと呼ばれる。典型的には、そのような非ギャップアライメントは、比較的短い数の残基にわたってのみ行われる。
これは非常に単純で一貫した方法であるが、たとえば、１個の挿入または欠失を除いては同一の配列対において、該ヌクレオチド配列中のその挿入または欠失が、その後に続くコドンがアライメントから外されうる、すなわちグローバルアライメントが行われた場合に％相同性の大幅な減少を潜在的に生じるということが考慮されていない。結果として、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性スコアを過度に不利にすることなく、考えられる挿入および欠失を考慮に入れた最適アライメントを作成するように設計される。これは、配列アライメントに「ギャップ」を挿入して局所相同性を最大にすることによって達成される。
しかしながら、これらのより複雑な方法は、アライメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当て、同じ数の同一アミノ酸について、できるだけ少ないギャップの配列アライメント（２つの比較した配列間の類似性が高いことを反映する）が、多くのギャップを持つスコアよりも高いスコアを達成するようにする。ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ内のそれぞれ後続の残基に対してより小さいペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が通常使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然ながら、ギャップのより少ない最適化アライメントを作成する。ほとんどのアライメントプログラムは、ギャップペナルティを修正することを可能にする。しかしながら、そのようなソフトウェアを配列比較に使用する際は、デフォルト値を使用することが好ましい。たとえば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する際、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップについては－１２、それぞれの延長については－４である。
最大百分率相同性の算出は、したがって、ギャップペナルティを考慮に入れ、最適アライメントの作成を最初に必要とする。そのようなアライメントを実行するのに好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al. (1999) ibid－Ch. 18を参照）、ＦＡＳＴＡ（Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツール一式が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両方が、オフラインおよびオンライン検索に利用可能である（Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60を参照）。しかしながら、いくつかのアプリケーションについては、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる別のツールも、タンパク質およびヌクレオチド配列を比較するために利用できる。（FEMS Microbiol. Lett. (1999)174:247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999)177:187-8参照）。
最終的な百分率相同性は同一性の観点から測定することができるが、アライメントプロセス自体は、典型的には、オールオアナッシング対比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいて各対ごとの比較にスコアを割り当てるスケール化類似性スコアマトリクスが一般的に使用される。一般に使用されるそのようなマトリクスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス（一連のＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトマトリクス）である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムでは、一般的には、パブリックデフォルト値または供給されるのであればカスタムシンボル比較表のいずれかが使用される（さらに詳しくはユーザーマニュアルを参照されたい）。しかしながら、いくつかのアプリケーションについては、ＧＣＧパッケージではデフォルト値を使用することが好ましく、他のソフトウェアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリクスを使用することが好ましい。好適には、百分率同一性は、参照配列および／または問い合わせ配列の全体にわたって測定される。
ソフトウェアが最適アライメントを作成すると、百分率相同性、好ましくは百分率配列同一性を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的にはこれを配列比較の一部として行い、数値結果を与える。
「断片」は、典型的には、機能の点で、着目のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの選択された領域のことである。したがって、「断片」は、それぞれ全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸または核酸の配列のことである。
そのような誘導体、変異体、および断片は部位特異的変異誘発などの標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製されてもよい。挿入が作製される場合には、挿入位置のどちらか一方の側で天然由来の配列に対応する５’および３’隣接領域とともに挿入部分をコードする合成ＤＮＡが作製されてもよい。前記隣接領域は、前記配列が適切な酵素（単数または複数）で切断され合成ＤＮＡが切断場所に連結（ｌｉｇａｔｅｄ）され得るように、天然に発生する配列における部位に対応する適当な制限酵素部位を含有する。前記ＤＮＡは次に、コードされるタンパク質を作製するために本発明に従って発現される。これらの方法はＤＮＡ配列操作のための当該技術分野において周知の多数の標準的手法の実例となるだけであり、他の公知の手法もまた使用されてもよい。
ベクター
本発明のいくつかの実施形態において、ＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチド（本明細書において第一のポリヌクレオチドと記載されることもある）、および／またはＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド（本明細書において第二のポリヌクレオチドと記載されることもある）とは、ベクターの連続した部分である。
好ましい実施形態において、ＦＯＸＰ３をコードする前記第一のポリヌクレオチドと、ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとは、単一のベクターの中に存在する。
ベクターは、１つの環境から別の環境へのある実体の移入を可能にする、または容易にするツールである。本発明によれば、例として、組み換え核酸技術に使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（たとえば、異種ｃＤＮＡセグメントなどの異種ＤＮＡセグメント）などの実体を、標的細胞に移入させることができる。
ベクターは、非ウイルス性であってもよいし、ウイルス性であってもよい。組み換え核酸技術に使用されるベクターの例としては、プラスミド、ｍＲＮＡ分子（たとえば、インビトロ転写ｍＲＮＡ）、染色体、人工染色体およびウイルスが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ベクターはまた、たとえば、ネイキッド核酸（たとえば、ＤＮＡ）であってもよい。最も単純な形態では、ベクターそれ自体が、目的のヌクレオチドであってもよい。好ましくは、ベクターは、宿主細胞内で持続的に高レベルで発現できる。
好適には、本発明で使用されるベクターは、たとえばプラスミド、ｍＲＮＡ、またはウイルスベクターであってもよい。好ましい実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。
多くのウイルス系システムが、哺乳類細胞への遺伝子移入のために開発されてきた。たとえば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムに便利なプラットフォームを提供している。当該技術分野において周知の技術を使用して、選択された遺伝子がベクターに挿入でき、レトロウイルス粒子にパッケージできる。前記組み換えウイルスは、その後インビボまたはエクスビボで単離し対象の細胞へ送達できる。
ベクターは、ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、場合によってはそのプロモーターの一つ以上のレギュレーターを含んでいてもよい。好ましい実施形態において、ＦＯＸＰ３をコードする前記第一のポリヌクレオチドと、ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとは、単一のベクターの中に存在し、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、場合によっては同じプロモーター（たとえばＬＴＲ）に操作可能に連結される。
本発明のベクターを、形質転換や形質導入など、当該技術分野で周知の様々な技術を使用して細胞に導入してもよい。いくつかの技術が、当該技術分野で周知である。たとえば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターなどの組み換えウイルスベクターを使用した感染、核酸の直接注入や、遺伝子銃形質転換である。形質導入／遺伝子導入には、多数のベクターが用いられうる。
非ウイルス送達システムには、ＤＮＡ導入法などがあるが、これらに限定されるわけではない。なお、遺伝子導入は、遺伝子を標的細胞へ送達するための非ウイルスベクターを使用したプロセスを含む。非ウイルス送達システムは、リポソームまたは両親媒性細胞浸透性ペプチド、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドと複合されたものを含むことができる。
典型的な遺伝子導入法としては、エレクトロポレーション、ＤＮＡ遺伝子銃、脂質媒介トランスフェクション、圧縮ＤＮＡ媒介トランスフェクション、リポソーム法、イムノリポソーム法、リポフェクション法、カチオン性薬剤媒介トランスフェクション、カチオン性表面両親媒性物質法（ＣＦＡｓ）（Nat. Biotechnol. (1996) 14: 556）、および、これらの組み合わせがある。
ウイルスベクター
本発明のベクターはウイルスベクターであってもよい。
ウイルスベクターは、当業者に既知の任意のウイルスベクターであってもよい。特に、多くのウイルス系システムが、哺乳類細胞への遺伝子移入のために開発されてきた。
好適には、前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはワクチンウイルスベクターである。好ましくは、前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（たとえばガンマレトロウイルスベクター）、またはレンチウイルスベクターである。より好ましくは、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
好適には、本発明で使用される前記ベクターは、ウイルスが標的細胞に侵入すると感染性子孫ウイルス粒子を複製したり産生したりすることができないように、遺伝的に改変された、レトロウイルス系ベクターである。組織培養条件および生存生物の両方で遺伝子を送達するために広く使用されるレトロウイルスが多数ある。その例には、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、フジナミ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ－ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ－ＭＳＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭＬＶ）、トリ骨髄球しゅ症ウイルス－２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、ならびにレンチウイルスを含むレトロウイルス科のその他すべてが含まれるが、これらに限定されるわけではない。レトロウイルスの詳細なリストは、Coffin et al., 1997, "retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763に見られるだろう。
レトロウイルスのゲノムの基本的な構造は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間またはその中に、ゲノムのパッケージングを可能にするパッケージングシグナルと、プライマー結合部位と、宿主細胞ゲノムへの組込みを可能にする組込み部位、パッケージングコンポネントをコードするｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子（これらはウイルス粒子の組み立てに必要なポリペプチドである）が位置する、というものである。より複雑なレトロウイルスは、ＨＩＶ中のｒｅｖおよびＲＲＥ配列などのように、組込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写産物を、細胞核から感染した標的細胞の細胞質へ、効率的に運ぶことを可能にするさらなる機能を有する。
前記プロウイルスにおいて、これら遺伝子は、両端で、長い末端反復（ＬＴＲ）と呼ばれる領域と隣り合わせになっている。前記ＬＴＲは、プロウイルスの組込み（インテグレーション）と、転写とを担なっている。ＬＴＲはまた、エンハンサー－プロモーター配列としても働き、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列によって生じる。
前記ＬＴＲ自体が、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と称される三つの要素に分かれうる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に固有の配列に由来する。ＲはＲＮＡの両端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。前記三つの要素のサイズは、レトロウイルスが異なれば、かなり相違しうる。
本発明のレトロウイルスベクターゲノムにおいて、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖは存在していなくてもよく、または機能しなくてもよい。ＲＮＡの両端の前記Ｒ領域は、繰り返配列である。Ｕ５およびＵ３は、それぞれ、ＲＮＡゲノムの５’末端および３’末端の固有の配列を表す。
好ましくは、エンベロープは、ヒト細胞の形質導入を可能にするものであり、好ましくはＴ細胞、最も好ましくはＴｒｅｇの形質導入を可能にするものである。好適なｅｎｖ遺伝子の例としては、ＶＳＶ－Ｇ、４０７０Ａ ｅｎｖなどＭＬＶ両種指向性ｅｎｖ、ＲＤ１１４ネコ白血病ウイルスｅｎｖ、またはインフルエンザウイルスからのヘマグルチニン（ＨＡ）などがあるが、これらに限定されるわけではない。前記Ｅｎｖタンパク質は、限られた数のヒト細胞型の受容体に結合することができるものであってもよく、標的部分を含有する遺伝子操作されたエンベロープであってもよい。前記ｅｎｖおよびｇａｇ－ｐｏｌをコードする配列は、プロモーターから転写され、場合によっては前記選択されたパッケージング細胞株中で活性なエンハンサーから転写され、前記転写ユニットはポリアデニル化シグナルによって終結する。たとえば、前記パッケージング細胞がヒト細胞であれば、好適なプロモーター－エンハンサーの組み合わせは、ヒトサイトメガロウイルス主要前初期（ｈＣＭＶ－ＭＩＥ）遺伝子からのものと、ＳＶ４０ウイルスからのポリアデニル化シグナルとが使用されてもよい。他にも好適なプロモーターおよびポリアデル化シグナルが、当該技術分野において既知である。
好ましい実施形態において、本発明の前記ベクターはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、より大きなグループのレトロウイルスベクターの一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Coffin et al. "Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763に見られるだろう。手短に言えば、レンチウイルスは、霊長類のグループと非霊長類のグループとに分けられる。霊長類レンチウイルスの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。非霊長類レンチウイルスグループには、原型「遅発性ウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、並びに関連ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、並びにより最近記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、及びウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
レンチウイルスファミリーと他のタイプのレトロウイルスとの判別は、レンチウイルスが分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染できるということである。これに対して、他のレトロウイルスは、たとえば筋肉、脳、肺、および肝臓の組織を構成する非分裂細胞または分裂の遅い細胞には、感染することができない。レンチウイルスは、高分化型／原発性細胞に形質導入可能であるため、レンチウイルススクリーニングストラテジーを使用することにより、原発性標的非分裂宿主細胞または分裂の遅い宿主細胞におけるライブラリ選択を可能にする。
本発明のベクターはウイルス粒子にパッケージされてもよい。ウイルス粒子をパッケージする方法は、当業者に周知である。たとえば、レトロウイルスベクターを作ってパッケージする方法が、Merten, O.W., 2004.The Journal of Gene Medicine: A cross disciplinary journal for research on the science of gene transfer and its clinical applications, 6(S1), pp.S105-S124に記載されている。たとえば、レンチウイルス粒子を作ってパッケージする方法が、Merten, O.W., et al., 2016. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 3, p.16017 and Zufferey, R., 2002. Production of lentiviral vectors. In Lentiviral Vectors (pp. 107-121). Springer, Berlin, Heidelbergに記載されている。
ベクターコンストラクトの例
本発明に使用するためのベクターの例を下記に示す。
好適には、前記ベクターは、以下を含んでもよい（５’から３’）：
（ｉ）配列番号３に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、切断ドメイン、および／またはＩＲＥＳを含むか、または該ポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、切断ドメイン、および／またはＩＲＥＳからなる、第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１１に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号３に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、切断ドメイン、および／またはＩＲＥＳを含むか、または該ポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、切断ドメイン、および／またはＩＲＥＳからなる、第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１２に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号４に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、切断ドメイン、および／またはＩＲＥＳを含むか、または該ポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、切断ドメイン、および／またはＩＲＥＳからなる、第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１１に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド；または
（ｉｖ）配列番号４に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、切断ドメイン、および／またはＩＲＥＳを含むか、または該ポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、切断ドメイン、および／またはＩＲＥＳからなる、第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１２に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド。
前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結されていてもよい。好適には、前記ベクターはウイルスベクターであり、好ましくはレトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。
好適には、前記ベクターは、以下を含んでもよい（５’から３’）：
（ｉ）配列番号３に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）である自己切断配列を含むか、または該ポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、切断ドメイン、および／またはＩＲＥＳからなる、第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１１に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号３に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）である自己切断配列を含むか、または該ポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、切断ドメイン、および／またはＩＲＥＳからなる、第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１２に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号４に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）である自己切断配列を含むか、または該ポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、切断ドメイン、および／またはＩＲＥＳからなる、第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１１に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド；または
（ｉｖ）配列番号４に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）である自己切断配列を含むか、または該ポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、切断ドメイン、および／またはＩＲＥＳからなる、第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１２に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド。
前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結されていてもよい。好適には、前記ベクターはウイルスベクターであり、好ましくはレトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。
好適には、前記ベクターは、以下を含んでもよい（５’から３’）：
（ｉ）配列番号３に対する同一性が少なくとも９５％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも９５％である自己切断配列を含むか、または配列番号３に対する同一性が少なくとも９５％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも９５％である自己切断配列からなる、第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１１に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号３に対する同一性が少なくとも９５％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも９５％である自己切断配列を含むか、または配列番号３に対する同一性が少なくとも９５％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも９５％である自己切断配列からなる、第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１２に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号４に対する同一性が少なくとも９５％であるポリヌクレオチド配列、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも９５％である自己切断配列を含むか、または配列番号４に対する同一性が少なくとも９５％であるポリヌクレオチド配列、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも９５％である自己切断配列からなる、第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１１に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド；または
（ｉｉ）配列番号４に対する同一性が少なくとも９５％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも９５％である自己切断配列を含むか、または配列番号４に対する同一性が少なくとも９５％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも９５％である自己切断配列からなる、第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１２に対する同一性が少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド。
前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結されていてもよい。好適には、前記ベクターはウイルスベクターであり、好ましくはレトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。
遺伝子発現のレギュレーター
本発明のベクターは、ポリヌクレオチド（単数または複数）の発現のためのプロモーターを含んでいてもよい。ＦＯＸＰ３をコードする前記第一のポリヌクレオチドおよびＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする前記第二のポリヌクレオチドが同じベクターの中に存在する場合、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結されてもよい。
「プロモーター」は、遺伝子の転写開始を先導するＤＮＡの領域である。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近く、ＤＮＡの上流（有意鎖の５’領域へ向かって）に位置する。任意の好適なプロモーターが使用されてもよく、その選択は当業者であれば容易に行えるであろう。
一実施形態において、前記プロモーターはＬＴＲであってもよく、たとえばベクターのＬＴＲ（たとえばレトロウイルスＬＴＲまたはレンチウイルスＬＴＲ）であってもよい。
長い末端反復（ＬＴＲ）は、レトロウイルスＲＮＡの逆転写によって形成されるレトロトランスポゾンまたはプロウイルスＤＮＡのどちらかの端部に見られる、ＤＮＡの同じ配列が数百または数千回繰り返したものである。それらは、ウイルスが宿主ゲノムに遺伝物質を挿入するために使用する。遺伝子発現のシグナルは、ＬＴＲの中に見られ、エンハンサー、プロモーター（転写エンハンサーまたは調節エレメントの両方を有しうる）、転写開始（キャッピングなど）、転写ターミネータ、およびポリアデニル化シグナルである。
好適には、本発明のベクターは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲを含んでいてもよい。ＦＯＸＰ３をコードする前記第一のポリヌクレオチドおよびＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする前記第二のポリヌクレオチドが同じベクターの中に存在する場合、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じＬＴＲに操作可能に連結されてもよい。
本発明のベクターは、転写前または転写後に作動しうる、１個以上のさらなる制御配列を含んでもよい。「制御配列」は、ポリペプチドの発現を促進する任意の配列であり、たとえば転写産物の発現を増加したりｍＲＮＡ安定性を増強したりするために作動する、任意の配列である。好適な制御配列には、たとえばエンハンサーエレメント、転写後制御エレメント、およびポリアデニル化部位がある。好適には、前記さらなる制御配列は、ＬＴＲ（単数または複数）の中に存在してもよい。
好適には、前記ベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）を含んでもよく、たとえば前記プロモーターに操作可能に連結されていてもよい。好適には、前記ベクターは、配列番号２５０として示されるヌクレオチド配列、または配列番号２５０に対する同一性が少なくとも８０％である変異体を含んでもよい。好適には、前記変異体は、配列番号２５０に対する同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。
ＷＰＲＥの例（配列番号２５０）
ＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＡＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣ
細胞
一つの態様において、本発明は、本発明に係るベクターを含む細胞を提供する。好適には、前記細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞である。
Ｔ細胞は、胸腺中に発生するリンパ球の一種であり、免疫応答において中心的な役割を果たす。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在により他のリンパ球から区別できる。これら免疫細胞は、骨髄から由来する前駆体細胞として生じ、胸腺に移動するといくつかの別々のタイプに分化する。Ｔ細胞の分化は、胸腺を出た後も継続してもよい。
Ｔ細胞は、その機能に基づいて一連のサブセットにグループ分けされる。ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞が胸腺で選択されるが、その周縁ではさらに分化して異なる機能を有する特殊な細胞になる。Ｔ細胞のサブセットは、最初は機能により定義されるが、関連遺伝子またはタンパク質発現パターンをも有する。従来の適応Ｔ細胞は、ヘルパーＣＤ４＋ Ｔ細胞、細胞障害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、および制御性ＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む。先天的Ｔ細胞には、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、およびガンマデルタＴ細胞などがある。
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、細胞変性免疫応答を制御し、免疫寛容の維持に必須である、抑制機能を有する免疫細胞である。
一つの態様において、本発明は、本発明に係るベクターを含むＴｒｅｇを提供する。換言すると、本発明は改変されたＴｒｅｇを提供する。
本明細書で使用される「改変されたＴｒｅｇ」とは、Ｔｒｅｇによって自然にコードされたわけではないポリヌクレオチド、特に、本明細書に記載のような、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを、含むかまたは発現するように修飾された（modified）Ｔｒｅｇを意味する。Ｔｒｅｇを改変する方法は、当該技術分野で既知であり、たとえば、Ｔｒｅｇの遺伝子組み換え（genetic modification）があげられ、たとえば、レトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入などの形質導入、リポフェクション法、ポリエチレングリコール法、リン酸カルシウム法およびエレクトロポレーション法などの遺伝子導入（ＤＮＡまたはＲＮＡの一過性形質転換など）によるものであるが、これらに限定されるわけではない。任意の好適な方法が、核酸配列をＴｒｅｇに導入するために使用されうる。
本明細書において、「Ｔｒｅｇ」という用語は、免疫抑制機能を有するＴ細胞のことである。
好適には、「免疫抑制機能」とは、病原体、抗原、たとえば同種抗原や自己抗原などといった刺激に応答する免疫系によって促進される多数の生理的な細胞の現象（効果）のうちの一つ以上を低減または阻害するＴｒｅｇの能力を指す場合がある。かかる現象の例には、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）の増加した増殖、および炎症促進性サイトカインの分泌などがある。任意のかかる現象を、免疫応答の強さの指標として使用してもよい。Ｔｒｅｇの存在下でＴｃｏｎｖによる免疫応答が相対的に弱いことは、免疫応答を抑制するＴｒｅｇの能力を示すといえる。たとえば、サイトカインの分泌が相対的に低下することは、免疫応答の弱まりを示し、したがって、免疫応答を抑制するＴｒｅｇの能力を示すといえる。Ｔｒｅｇは、Ｂ細胞、樹状細胞、およびマクロファージなど抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の共刺激分子の発現を調節することにより、免疫応答を抑制することもできる。ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現レベルは、共培養後のインビトロでの活性化されたＴｒｅｇの抑制能を調査するために使用できる。
免疫応答の強度の指標を測定し、それによってＴｒｅｇの抑制能力を測定するためのアッセイが、当該技術分野で既知である。特に、抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞は、Ｔｒｅｇと共培養してもよく、対応する抗原のペプチドを前記共培養に加えてＴｃｏｎｖ細胞からの応答を刺激してもよい。Ｔｃｏｎｖ細胞の増殖の度合い、および／または前記ペプチドの追加に応答してＴｃｏｎｖ細胞が分泌したサイトカインＩＬ－２の量を、共培養したＴｒｅｇの抑制能の指標として使用してもよい。
本発明のＴｒｅｇと共培養された抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞は、本発明のＴｒｅｇの非存在下で培養された同じＴｃｏｎｖ細胞の増殖と比較して、５％少なく、１０％少なく、２０％少なく、３０％少なく、４０％少なく、５０％少なく、６０％少なく、７０％少なく、９０％少なく、９５％少なく、または９９％少ない増殖であってもよい。
本発明のＴｒｅｇと共培養された抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞は、本発明のＴｒｅｇの非存在下で培養された対応するＴｃｏｎｖ細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％少ないエフェクターサイトカインを発現してもよい。
エフェクターサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１７、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１３から選択されてもよい。
好適には、エフェクターサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１７、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮ－γから選択されてもよい。
好適には、Ｔｒｅｇは、マーカーＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦＯＸＰ３（ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦＯＸＰ３+）を発現するＴ細胞である。
マーカーレベルは、当業者に既知の任意の方法によって、たとえばフローサイトメトリーによって、測定することができる。
Ｔｒｅｇｓはまた、ＣＴＬＡ－４（細胞障害性Ｔリンパ球関連分子４）および／またはＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体）を発現してもよい。Ｔｒｅｇ細胞は末梢血、リンパ節、および組織に存在する。
好適には、低レベルで発現した表面タンパク質ＣＤ１２７の非存在下で、またはそれとの組み合わせで、細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ２５を使用することにより（ＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ１２７-、またはＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ１２７low、またはＣＤ４+ＣＤ２５hiＣＤ１２７-、またはＣＤ４+ＣＤ２５hiＣＤ１２７low）、Ｔｒｅｇを同定してもよい。Ｔｒｅｇの同定のために使用するかかるマーカーは、当該技術分野において既知であり、たとえばＬｉｕら（ＪＥＭ；２００６；２０３；７（１０）；１７０１－１７１１）が記載している。
前記Ｔｒｅｇは、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦＯＸＰ３+Ｔ細胞、またはＣＤ４+ＣＤ２５hiＦＯＸＰ３+Ｔ細胞であってもよい。
前記Ｔｒｅｇは、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ１２７-Ｔ細胞、またはＣＤ４+ＣＤ２５hiＣＤ１２７-Ｔ細胞であってもよい。
前記Ｔｒｅｇは、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦＯＸＰ３+ＣＤ１２７-Ｔ細胞、またはＣＤ４+ＣＤ２５hiＦＯＸＰ３+ＣＤ１２７-Ｔ細胞であってもよい。
前記Ｔｒｅｇは脱メチル化されたＴｒｅｇ特異的な脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）を有してもよい。前記ＴＳＤＲは、ＦＯＸＰ３の発現を制御する、重要なメチル化感受性のあるエレメントである（Polansky, J.K., et al.,2008. European journal of immunology, 38(6), pp.1654-1663）。
前記Ｔｒｅｇは、天然Ｔｒｅｇ（natural Treg）または胸腺由来Ｔｒｅｇ（thymus-derived Treg）であってもよいし、適応性Ｔｒｅｇ（adaptive Treg）または末梢誘導Ｔｒｅｇ（peripherally-derived Treg）であってもよいし、またはインビトロ誘導Ｔｒｅｇ（in vitro-induced Treg）であってもよい（Abbas, A.K., et al., 2013. Nature immunology, 14(4), p.307-308）。好適には、前記Ｔｒｅｇは、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦＯＸＰ３+Ｈｅｌｉｏｓ+ニューロピリン１+であってもよい。好ましくは、前記Ｔｒｅｇは、天然Ｔｒｅｇである。
さらに好適なＴｒｅｇの例としては、Ｔｒ１細胞、ＣＤ８+ＦＯＸＰ３+Ｔ細胞；およびγδＦＯＸＰ３+Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
好適には、前記Ｔｒｅｇは、対象から得られた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離される。好適には、対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
好適には、前記Ｔｒｅｇは、改変されたＴｒｅｇが投与される対象に適合（たとえば、ＨＬＡ適合）しているか、または、対象自身のものである。好適には、前記改変されたＴｒｅｇが投与される対象は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。前記Ｔｒｅｇは、患者本人の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）由来の造血幹細胞移植の環境において、または無関係のドナー（第三者）由来の末梢血からのいずれかで、エクスビボ（生体外）で生成されてもよい。好適には、前記Ｔｒｅｇは、改変されたＴｒｅｇが投与される対象自身のものである。
好ましい実施形態において、Ｔｒｅｇは、対象から得られた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離されて適合（たとえば、ＨＬＡ適合）しているか、または、改変されたＴｒｅｇが投与される対象自身のものである。
好適には、前記Ｔｒｅｇは、Ｔｒｅｇの集団の一部である。好適には、前記Ｔｒｅｇの集団は、少なくとも７０％のＴｒｅｇを含み、たとえば少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のＴｒｅｇを含む。かかる集団を、「富化（濃縮）されたＴｒｅｇ集団」、または「富化（濃縮）されたＴｒｅｇサンプル」と称してもよい。
本明細書において、「通常型Ｔ細胞」またはＴｃｏｎは、αβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴリンパ球細胞と、分化抗原群４（ＣＤ４）または分化抗原群８（ＣＤ８）でありうる、免疫抑制機能をもたない共受容体とを意味する。通常型Ｔ細胞は、末梢血、リンパ節、および組織に存在する。改変されたＴｒｅｇは、ＩＬ－２およびＴＧＦ－βの存在下でＣＤ４+ＣＤ２５-ＦＯＸＰ３-細胞のインビトロ培養によってＴｃｏｎから生成されてもよい。
本発明のＴｒｅｇは幹細胞由来であってもよい。特に、本発明のＴｒｅｇはインビトロの幹細胞由来であってもよい。前記Ｔｒｅｇは、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の、Ｔｒｅｇへのエクスビボ分化から由来してもよい。本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、Ｔｒｅｇへの分化前または後に誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞へ導入してもよい。
本明細書において、「幹細胞（stem cell）」という用語は、同じタイプのより多くの幹細胞を無限に生み出すことができる未分化細胞を意味し、また、当該細胞から分化によって他の特殊な細胞が生じうる。幹細胞は多能性である。幹細胞は、たとえば、胚性幹細胞または成体幹細胞であってもよい。
本明細書において、「前駆細胞（progenitor cell）」という用語は、分化して一つ以上の種類の細胞を形成できるが、インビトロでは自己複製に限界がある細胞を意味する。
好適には、前記細胞は、ＴｒｅｇなどのＴ細胞に分化させることができる。
好適には、前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）であってもよい。好適には、前記細胞は、造血幹細胞または造血性前駆細胞である。好適には、前記細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。好適には、前記細胞は、臍帯血から取得してもよい。好適には、前記細胞は、成体末梢血から取得してもよい。
いくつかの態様において、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、臍帯血から取得してもよい。臍帯血は、当該技術分野で周知の技術に準拠して採取できる（たとえば米国特許第７１４７６２６号および７１３１９５８号、この参照により本明細書に援用される）。
一つの態様において、ＨＳＰＣを、多能性幹細胞源、たとえば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）から取得してもよい。
本明細書において、「造血幹細胞および前駆細胞」または「ＨＳＰＣ」という用語は、抗原マーカーＣＤ３４を発現する（ＣＤ３４＋）細胞、およびかかる細胞の集団をいう。特定の実施形態において、「ＨＳＰＣ」という用語は、抗原マーカーＣＤ３４の存在（ＣＤ３４＋）、および系統（ｌｉｎ）マーカーの不在によって特定される細胞をいう。ＣＤ３４＋および／またはＬｉｎ（－）である細胞を含む細胞の集団としては、造血幹細胞および造血前駆細胞が挙げられる。
ＨＳＰＣは、大腿骨、骨盤、肋骨、胸骨や、その他の骨など、成人の骨髄から取得または単離できる。ＨＳＰＣを含有する骨髄液は、針とシリンジを使用して、骨盤から直接取得または単離できる。ＨＳＰＣのその他の採取源としては、臍帯血、胎盤血、動員末梢血、ウォートンゼリー、胎盤、胎児血液、胎児肝臓、または胎児脾臓などがある。特定の実施形態において、治療に使用するためにＨＳＰＣの十分な量を採取するには、対象における幹細胞および前駆細胞の動員を必要とする場合がある。
本明細書において、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、多能的状態に再プログラムされた非多能性細胞をいう。対象の細胞が多能的状態になるよう再プログラムされると、前記細胞はその後、造血幹細胞または前駆細胞（それぞれ、ＨＳＣおよびＨＰＣ）など、所望の細胞タイプにプログラムできる。
本明細書において、「再プログラミング（reprogramming）」という用語は、細胞の能力（potency）を、あまり分化していない状態へと高める方法をいう。
本明細書において、「プログラミング（programming）」という用語は、細胞の能力（potency）を低下させる方法、または細胞をより分化した状態へと分化させる方法をいう。
本発明はまた、改変されていないＴｒｅｇよりも高いＦＯＸＰ３発現を有する改変されたＴｒｅｇ、および、対応する未改変のＴｒｅｇよりも高いＦＯＸＰ３発現を有する改変されたＴｒｅｇを提供する。
「より高いＦＯＸＰ３の発現」とは、遺伝子発現を変える人為的な介入によってＴｒｅｇが操作される前よりも、改変されたＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが高いことを意味する。
「より高いＦＯＸＰ３の発現」は、本明細書に記載のように定義され、測定されてもよい。
好適には、本発明に係る改変されたＴｒｅｇ（またはかかるＴｒｅｇの集団）の中のＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルは、対応する未改変のＴｒｅｇ（またはかかるＴｒｅｇの集団）におけるレベルの、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、または少なくとも５倍に増加してもよい。
好適には、本発明に係る改変されたＴｒｅｇ（またはかかるＴｒｅｇの集団）の中のＣＤ２５ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルは、対応する未改変のＴｒｅｇ（またはかかるＴｒｅｇの集団）におけるレベルの、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、または少なくとも５倍に増加してもよい。
好適には、本発明に係る改変されたＴｒｅｇ（またはかかるＴｒｅｇの集団）の中のＣＴＬＡ－４ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルは、対応する未改変のＴｒｅｇ（またはかかるＴｒｅｇの集団）におけるレベルの、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、または少なくとも５倍に増加してもよい。
本発明の改変されたＴｒｅｇは、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含んでもよい。「外因性ポリヌクレオチド」は、Ｔｒｅｇ外で生じたポリヌクレオチドである。
Ｔエフェクター細胞
本発明は、改変されたＴエフェクター細胞を生成するリスク、たとえば、改変されたＴｒｅｇの生成中に改変されたＴエフェクター細胞を生成するリスクを低減してもよい。
Ｔエフェクター細胞は、免疫応答において体を防御する、相対的に短命な活性化細胞である。Ｔエフェクター細胞には、細胞媒介応答を行う細胞障害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞がある。したがって、Ｔエフェクター細胞は、細胞障害性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞であってもよい。Ｔエフェクター細胞は、低レベルのＦＯＸＰ３を発現してもよく、ＦＯＸＰ３lowまたはＦＯＸＰ３－であってもよい。好ましくは、Ｔエフェクター細胞は免疫抑制機能を有していない。
細胞障害性Ｔ細胞のほとんどは、ＣＤ８、ＣＤ４５、およびＣＤ５４などの表面マーカーのサブセットを発現する。好適には、細胞障害性Ｔ細胞は、ＣＤ８+ＦＯＸＰ３low細胞またはＣＤ８+ＦＯＸＰ３-細胞であってもよい。
好適には、細胞障害性Ｔ細胞は、ＣＤ８+ＣＤ４５+ＦＯＸＰ３low細胞またはＣＤ８+ＣＤ４５+ＦＯＸＰ３-細胞であってもよい。
好適には、細胞障害性Ｔ細胞は、ＣＤ８+ＣＤ５４+ＦＯＸＰ３low細胞またはＣＤ８+ＣＤ５４+ＦＯＸＰ３-細胞であってもよい。
好適には、細胞障害性Ｔ細胞は、ＣＤ８+ＣＤ４５+ＣＤ５４+ＦＯＸＰ３low細胞またはＣＤ８+ＣＤ４５+ＣＤ５４+ＦＯＸＰ３-細胞であってもよい。
ヘルパーＴ細胞（Ｔヘルパー細胞、Ｔｈ細胞、またはＣＤ４＋細胞としても知られる）は、免疫系、特に適応免疫系において重要な役割を果たすＴ細胞のタイプである。それらは、細胞サイトカインを放出することにより他の免疫細胞の活性を助ける。それらは、Ｂ細胞の抗体クラスの変換、細胞障害性Ｔ細胞の活性化および増殖、ならびにマクロファージなど食細胞の殺菌力の最大化に必須である。Ｔヘルパーサブタイプには、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、およびＴｆｈ細胞がある。好ましくは、ヘルパーＴ細胞は、免疫抑制機能の無いＣＤ４＋細胞である。好適には、ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ４+ＦＯＸＰ３low細胞またはＣＤ４+ＦＯＸＰ３-細胞であってもよい。
細胞作成方法
本発明の改変されたＴｒｅｇは、本明細書に記載のような、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本明細書において第一のポリヌクレオチドと記載されることもある）および／または、ＨＬＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド（本明細書において第二のポリヌクレオチドと記載されることもある）とを、導入することにより生成されてもよい。
本明細書において、「導入する（introduce）」という用語は、遺伝子導入方法および形質導入方法の両方を含む、外来ＤＮＡを細胞に挿入するための方法のことである。遺伝子導入は、非ウイルス法により核酸を細胞内に導入するプロセスである。形質導入は、ウイルスベクターを介して細胞に外来のＤＮＡを導入するプロセスである。
本発明の改変されたＴｒｅｇは、本明細書において定義されたポリヌクレオチド（単数または複数）またはベクターをＴｒｅｇに（たとえば、形質導入または遺伝子導入によって）導入することにより、作成されてもよい。
好適には、前記Ｔｒｅｇは、対象から単離されたサンプル由来であってもよい。前記Ｔｒｅｇは、任意の好適な方法によって、前記サンプルからさらに分離されてもよく、たとえば磁性分離によって前記サンプルからさらに分離されてもよい。
本発明の改変されたＴｒｅｇは、下記工程を含む方法によって生成されてもよい。
（ｉ）（たとえば対象から）細胞含有サンプルを単離する、または細胞含有サンプルを得る工程、および
（ｉｉ）前記細胞含有サンプルに、本明細書に記載のような、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、または本明細書に記載のようなベクター（たとえば、５’ ＦＯＸＰ３－ＨＬＡ特異的ＣＡＲ ３’をコードするベクター）を形質導入または遺伝子導入して、改変された細胞の集団を得る工程。
好適には、前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなる。
好適には、前記方法の工程（ｉｉ）の前、および／またはその後に、Ｔｒｅｇ富化サンプルを、細胞含有サンプルから単離し、富化し、および／または生成してもよい。たとえば、Ｔｒｅｇの単離、富化、および／または生成は、工程（ｉｉ）の前に、および／またはその後に行って、Ｔｒｅｇ富化サンプルを単離し、富化し、および／または生成してもよい。本発明のＣＡＲ、ポリヌクレオチド（単数または複数）、および／またはベクターを含む細胞および／またはＴｒｅｇについて富化を行うために、工程（ｉｉ）の後に単離および／または富化を行ってもよい。
Ｔｒｅｇ富化サンプルは、当業者に既知の任意の方法によって、たとえばＦＡＣＳおよび／または磁性ビーズ分離によって、単離または富化されてもよい。
好適には、前記細胞は、本明細書において定義されるようなＴｒｅｇである。
好適には、本発明の改変されたＴｒｅｇは、下記工程を含む方法によって生成されてもよい。
（ｉ）（たとえば対象から）Ｔｒｅｇ富化サンプルを単離する、またはＴｒｅｇ富化サンプルを得る工程；および
（ｉｉ）前記Ｔｒｅｇ富化サンプルに、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドおよび／またはＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチド、または本明細書に記載のようなベクター（たとえば、５’ ＦＯＸＰ３－ＨＬＡ特異的ＣＡＲ ３’をコードするベクター）を形質導入または遺伝子導入して、本発明に係る改変されたＴｒｅｇ細胞の集団を得る工程。
ポリヌクレオチド（単数または複数）またはベクターを導入する前に、または後に、たとえば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理により、または抗ＣＤ３モノクローナル抗体と 抗ＣＤ２８モノクローナル抗体との両方での処理により、前記細胞および／またはＴｒｅｇを活性化および／または増殖させてもよい。
また、ＩＬ－２との組み合わせた、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の存在下で、Ｔｒｅｇを増殖してもよい。好適には、ＩＬ－２はＩＬ－１５と置き換えられてもよい。Ｔｒｅｇ増殖プロトコルで使用されてもよい別の成分としては、ラパマイシン、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）およびＴＧＦβがあるが、これらに限定されるわけではない。
本明細書において、「活性化される」とは、細胞または細胞の集団が刺激されて、細胞（単数または複数）の増殖が起こることを意味する。本明細書において、「増殖される」とは、細胞または細胞の集団の増殖が誘導されることを意味する。細胞の集団の増殖は、たとえば、集団に存在する細胞の数をカウントすることにより測定してもよい。細胞の表現型は、フローサイトメトリーなど当該技術分野で既知の方法によって測定してもよい。
Ｔｒｅｇは、前記方法の各工程の後に、特に増殖の後に、洗浄してもよい。
前記改変されたＴｒｅｇの集団は、当業者に既知の任意の方法によって、たとえばＦＡＣＳおよび／または磁性ビーズ分離によって、さらに富化されてもよい。
製造方法の工程は、閉鎖された無菌の細胞培養系で行われてもよい。
改変されたＴｒｅｇ免疫抑制を増強する
（たとえば本発明に係るベクターの中の）ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＴｒｅｇに導入することによりＦＯＸＰ３の発現を増加させ、したがって前記Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力を増強してもよい。
したがって、本発明は、ＨＬＡ特異的改変されたＴｒｅｇの免疫応答抑制能力の増強に使用するための、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力の増強のための、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの、免疫応答、好ましくはＨＬＡを発現する細胞に対する免疫応答を、抑制する能力の増強に使用するための、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドとを提供する。前記ＣＡＲは、本明細書に記載のような単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインであって、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合するドメインを含んでもよい。前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結されもよい。前記第一のポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチドの上流にあってもよい。前記ｓｃＦｖ抗原認識ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合してもよい。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力の増強に使用するための、本明細書に記載のようなベクターを提供する。好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力の増強に使用するための、本明細書に記載のようなベクターを提供し、前記ベクターは、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドとを含み、前記ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含み、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結し、前記第一のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドの上流にある。前記抗原認識ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合してもよい。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力の増強に使用するための、本明細書に記載のようなベクターを提供し、前記ベクターは、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドとを含み、前記ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する抗原認識ドメインを含み、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結し、前記第一のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドの上流にあり、前記ベクターは、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間に本明細書に記載のような切断部位をコードするポリヌクレオチド、および／または、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間に本明細書に記載のような配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を、さらに含む。前記抗原認識ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合してもよい。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力を増強するための、本明細書に記載のようなベクターの使用を提供する。好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、本明細書に記載のようなベクターをＴｒｅｇに導入することを含む、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力を増強する方法を提供する。
前記ベクターは、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドとを含んでもよく、前記ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含み、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結し、前記第一のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドの上流にある。前記抗原認識ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合してもよい。
前記ベクターは、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドとを含んでもよく、前記ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する抗原認識ドメインを含み、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結し、前記第一のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドの上流にあり、前記ベクターは、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間に本明細書に記載のような切断部位をコードするポリヌクレオチド、および／または、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間に本明細書に記載のような配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を、さらに含む。前記抗原認識ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合してもよい。
本発明は、改変されたＴｒｅｇの免疫応答抑制能力を増強する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、前記Ｔｒｅｇに導入することを含む。好ましくは、前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲである。前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含んでもよい。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力を増強する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、細胞含有サンプルに導入することを含み、
（ａ）前記細胞含有サンプルは、Ｔｒｅｇを含むか、またはＴｒｅｇからなり、および／または
（ｂ）前記細胞含有サンプルは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから富化され、および／または
（ｃ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから生成され、および／または
（ｄ）前記細胞含有サンプルは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）（たとえば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）など）を含むか、またはＰＳＣ（たとえばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣなど）からなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後にＰＳＣから分化される。
好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇであり、前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２特異的ＣＡＲである。前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含んでもよい。
好適には、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または前記第二のポリヌクレオチドは、ウイルス性形質導入によって導入され、好ましくはレトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入によって導入される。
好ましくは、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、単一のベクターに導入され、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結されてもよい。前記ベクターは、本発明に係るベクターであってもよい。
換言すると、本発明は、本明細書に記載のようなベクターを細胞含有サンプルに導入することを含む、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇ（好ましくは、ＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇ）の免疫応答抑制能力を増強する方法を提供し、
（ａ）前記細胞含有サンプルは、Ｔｒｅｇを含むか、またはＴｒｅｇからなり、および／または
（ｂ）前記細胞含有サンプルは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記ベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから富化され、および／または
（ｃ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記ベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから生成され、および／または
（ｄ）前記細胞含有サンプルは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）（たとえば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）など）を含むか、またはＰＳＣ（たとえばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣなど）からなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後にＰＳＣから分化される。
好ましくは、前記ベクターは、ＨＬＡ特異的ＣＡＲを含む。前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲであってもよい。前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含んでもよい。
「免疫応答抑制能力を増強する」という表現は、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを導入することにより、および／または本明細書に記載のようなベクターを導入することにより改変されていない対応するＴｒｅｇ（またはかかるＴｒｅｇの集団）の抑制効果と比較して、免疫応答に対するＴｒｅｇ（またはかかるＴｒｅｇの集団）の抑制効果を増加させることを意味する。好ましくは、前記免疫応答は、ＨＬＡを発現する細胞に対する免疫応答であり、より好ましくはＨＬＡ－Ａ２を発現する細胞に対する免疫応答である。前記抑制効果の増加は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％であってもよく、また様々な手段で測定してもよく、その例としては、Ｔエフェクター細胞によるＩＬ－２の産生における減少（たとえば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％の減少）、またはＩＬ１０などのＴｒｅｇ関連サイトカインの増加（たとえば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％の増加）を測定することなどがある。
「免疫応答」という用語は、病原体または自己抗原などの刺激に応答する免疫系によって促進される数多くの生理的な細胞の現象のことをいう。かかる現象の例には、Ｔｃｏｎｖ細胞の増殖やサイトカインの分泌の増加がある。任意のかかる現象を、免疫応答の強さの指標として使用してもよい。未改変のＴｒｅｇの場合と比較して、改変されたＴｒｅｇの存在下でＴｃｏｎｖによる免疫応答が相対的に弱いことは、免疫応答を抑制する改変されたＴｒｅｇが相対的に増強していることを示すといえる。たとえば、サイトカインの分泌が相対的に低下することは、免疫応答の弱まりの指標であり、つまり、Ｔｒｅｇの免疫応答を抑制する能力の増強を示すといえる。
免疫応答の強度の指標を測定し、それによってＴｒｅｇの抑制能力を測定するためのアッセイが、当該技術分野で既知である。特に、抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞は、Ｔｒｅｇと共培養してもよく、対応する抗原のペプチドを前記共培養に加えてＴｃｏｎｖ細胞からの応答を刺激してもよい。Ｔｃｏｎｖ細胞の増殖の度合い、および／または前記ペプチドの追加に応答してＴｃｏｎｖ細胞が分泌したサイトカインＩＬ－２の量を、共培養したＴｒｅｇの抑制能力の指標として使用してもよい。
本発明の改変されたＴｒｅｇ（すなわちＦＯＸＰ３の発現が増加している）と共培養された抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞の増殖は、対応する未改変のＴｒｅｇ（すなわち、ＦＯＸＰ３の発現が増加していない）と共培養された同じＴｃｏｎｖ細胞よりも、５％少なく、１０％少なく、１５％少なく、２０％少なく、２５％少なく、３０％少なく、３５％少なく、または４０％少なくてもよい。好ましくは、前記Ｔｃｏｎｖ細胞は、ＨＬＡ特異的Ｔｃｏｎｖ細胞である。より好ましくは、前記Ｔｃｏｎｖ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｃｏｎｖ細胞である。
本発明の改変されたＴｒｅｇ（すなわちＦＯＸＰ３の発現が増加している）と共培養された抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞は、対応する未改変のＴｒｅｇ（すなわち、ＦＯＸＰ３の発現が増加していない）と共培養された対応するＴｃｏｎｖ細胞と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％大きいエフェクターサイトカインの減少を示してもよい。好ましくは、前記Ｔｃｏｎｖ細胞は、ＨＬＡ特異的Ｔｃｏｎｖ細胞である。より好ましくは、前記Ｔｃｏｎｖ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｃｏｎｖ細胞である。
本発明の改変されたＴｒｅｇ（すなわちＦＯＸＰ３の発現が増加している）と共培養された抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞の産生は、対応する未改変のＴｒｅｇ（すなわち、ＦＯＸＰ３の発現が増加していない）と共培養された同じＴｃｏｎｖ細胞よりも、１０％以下、２０％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、または６０％以下のエフェクターサイトカインを産生してもよい。好ましくは、前記Ｔｃｏｎｖ細胞は、ＨＬＡ特異的Ｔｃｏｎｖ細胞である。より好ましくは、前記Ｔｃｏｎｖ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｃｏｎｖ細胞である。
エフェクターサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１７、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１３から選択されてもよい。好適には、エフェクターサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１７、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮ－γから選択されてもよい。
本発明の改変されたＴｒｅｇ（すなわちＦＯＸＰ３の発現が増加している）と共培養された抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞は、対応する未改変のＴｒｅｇ（すなわち、ＦＯＸＰ３の発現が増加していない）の細胞数の２分の１、４分の１、８分の１、１０分の１、または２０分の１に、ＩＬ－２の産生を抑制してもよい。好ましくは、前記Ｔｃｏｎｖ細胞は、ＨＬＡ特異的Ｔｃｏｎｖ細胞である。より好ましくは、前記Ｔｃｏｎｖ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｃｏｎｖ細胞である。
改変されたＴｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減する
（たとえば本発明に係るベクターの中の）ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＴｒｅｇに導入することによりＦＯＸＰ３の発現を増加させてもよく、したがって改変されたＴｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減してもよい。さらに、ＦＯＸＰ３が、５’から３’への方向において、ＨＬＡ特異的ＣＡＲの前にあるという本発明に係るベクターにより、ＦＯＸＰ３が発現しているときのみＣＡＲの発現が起こりうること、およびＦＯＸＰ３が存在しない状態でＣＡＲの発現が起こらないことを確実にする。これにより、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを、さらに低減してもよい。
したがって、本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクの低減に使用するための、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減するための、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減するための、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および、本明細書に記載のようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドの使用を提供する。前記ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する、本明細書に記載のような単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含んでもよい。前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結されてもよい。前記第一のポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチドの上流にあってもよい。前記ｓｃＦｖ抗原認識ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合してもよい。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクの低減に使用するための、本明細書に記載のようなベクターを提供する。好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減するための、本明細書に記載のようなベクターの使用を提供する。好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減するための方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載のようなベクターを前記Ｔｒｅｇに導入することを含む。
前記ベクターは、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドとを含んでもよく、前記ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含み、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドは同じプロモーターに操作可能に連結し、前記第一のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドの上流にある。前記抗原認識ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合してもよい。
前記ベクターは、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドとを含んでもよく、前記ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する抗原認識ドメインを含み、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結し、前記第一のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドの上流にあり、前記ベクターは、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間に本明細書に記載のような切断部位をコードするポリヌクレオチド、および／または、本明細書に記載のような前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間に本明細書に記載のような配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を、さらに含む。前記抗原認識ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合してもよい。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、前記Ｔｒｅｇに導入することを含む。好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇであり、前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲである。前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含んでもよい。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減するための方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、細胞含有サンプルに導入することを含み、
（ａ）前記細胞含有サンプルは、Ｔｒｅｇを含むか、またはＴｒｅｇからなり、および／または
（ｂ）前記細胞含有サンプルは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから富化され、および／または
（ｃ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから生成され、および／または
（ｄ）前記細胞含有サンプルは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）（たとえば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）など）を含むか、またはＰＳＣ（たとえばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣなど）からなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後にＰＳＣから分化される。
好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇであり、前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲである。前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含んでもよい。
好適には、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または前記第二のポリヌクレオチドは、ウイルス性形質導入によって導入され、好ましくはレトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入によって導入される。
好ましくは、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、単一のベクターに導入され、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結されてもよい。前記ベクターは、本発明に係るベクターであってもよい。
したがって、本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減するための方法を提供し、前記方法は、本発明に係るベクターを前記Ｔｒｅｇに導入することを含む。好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇ（たとえば、ＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇ）がエフェクター表現型を獲得するリスクを低減するための方法を提供し、前記方法は、本発明に係るベクターを細胞含有サンプルに導入することを含み、
（ａ）前記細胞含有サンプルは、Ｔｒｅｇを含むか、またはＴｒｅｇからなり、および／または
（ｂ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記ベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから富化され、および／または
（ｃ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記ベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから生成され、および／または
（ｄ）前記細胞含有サンプルは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）（たとえば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）など）を含むか、またはＰＳＣ（たとえばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣなど）からなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後にＰＳＣから分化される。
好ましくは、前記ベクターは、ＨＬＡ特異的ＣＡＲを含む。前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲであってもよい。前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含んでもよい。
「改変されたＴｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクの低減」という表現は、Ｔｒｅｇ（またはかかるＴｒｅｇの集団）がエフェクター表現型を獲得する可能性または速度を、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または本明細書に記載のようなＨＬＡ特異的ＣＡＲ（たとえばＨＬＡ－Ａ２特異的ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド、および／または本明細書に記載のようなベクターを導入することにより改変されていない対応するＴｒｅｇの該可能性または速度と比較して低減することを、意味してもよい。好ましくは、前記ＴｒｅｇはＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇ、より好ましくはＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。好適には、前記可能性が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％低減される。好適には、前記速度が、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍遅い速度とされる。
「エフェクター表現型を獲得する」という表現は、ＴｒｅｇがＴエフェクター細胞に関連する表現型を獲得する、および／またはＴｒｅｇに関連する表現型を失う、ということをいう。
好適には、エフェクター表現型を獲得したＴ細胞では、ＦＯＸＰ３、ＣＤ２５および／またはＣＴＬＡ－４のレベルが低下してもよく、好ましくはＦＯＸＰ３のレベルが低下してもよい。本明細書に記載の方法は、ＦＯＸＰ３、ＣＤ２５および／またはＣＴＬＡ－４ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルの測定に使用されてもよい。
好適には、エフェクター表現型を獲得したＴ細胞は、１週間以上後に、２週間以上後に、３週間以上後に、４週間以上後に、５週間以上後に、６週間以上後に、７週間以上後に、または８週間以上後に、ＦＯＸＰ３レベルが低下しており、好ましくは７週間以上後に、ＦＯＸＰ３レベルが低下している。好適には、エフェクター表現型を獲得したＴ細胞において、ＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルの低下が、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、または少なくとも５倍、またはそれ以上であってもよい。
好適には、エフェクター表現型を獲得したＴ細胞は、１週間以上後に、２週間以上後に、３週間以上後に、４週間以上後に、５週間以上後に、６週間以上後に、７週間以上後に、または８週間以上後に、ＣＤ２５レベルが低下しており、好ましくは７週間以上後に、ＣＤ２５レベルが低下している。好適には、エフェクター表現型を獲得したＴ細胞において、ＣＤ２５ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルの低下が、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、または少なくとも５倍、またはそれ以上であってもよい。
好適には、エフェクター表現型を獲得したＴ細胞は、１週間以上後に、２週間以上後に、３週間以上後に、４週間以上後に、５週間以上後に、６週間以上後に、７週間以上後に、または８週間以上後に、ＣＴＬＡ－４レベルが低下しており、好ましくは７週間以上後に、ＣＴＬＡ－４レベルが低下している。好適には、エフェクター表現型を獲得したＴ細胞において、ＣＴＬＡ－４ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルの低下が、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、または少なくとも５倍、またはそれ以上であってもよい。
改変されたＴエフェクター細胞の生成のリスクを低減する
（たとえば本発明に係るベクターの中の）ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＴエフェクター細胞に導入することによりＦＯＸＰ３の発現を増加させ、そのため、改変されたＴエフェクター細胞を生成するリスクを低減し、たとえば改変されたＴｒｅｇの生成中に、改変されたＴエフェクター細胞を生成するリスクを低減する。さらに、ＦＯＸＰ３が、５’から３’への方向において、ＨＬＡ特異的ＣＡＲの前にあるという本発明に係るベクターにより、ＦＯＸＰ３が発現しているときのみＣＡＲの発現が起こりうること、およびＦＯＸＰ３が存在しない状態でＣＡＲの発現が起こらないことを確実にする。これにより、改変されたＴｒｅｇの生成中に、改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクをさらに低減してもよい。
したがって、本発明は、改変されたＴエフェクター細胞、たとえば、改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクの低減に使用するための、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、好ましくは改変されたＴｒｅｇの生成中に生成するリスクを低減するための、好ましくは改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中の該リスクの低減に使用するための、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。より好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞は、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞であり、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、改変されたＴエフェクター細胞を、たとえば、改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクを低減するための、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供し、好ましくは改変されたＴｒｅｇの生成中に生成するリスクを低減するための、好ましくは改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中に生成するリスクを低減するための、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。より好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞は、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞であり、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、改変されたＴエフェクター細胞を、たとえば、改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドおよび本明細書に記載のようなＨＬＡ特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドの使用を提供し、好ましくは改変されたＴｒｅｇの生成中に生成するリスクを低減するための、好ましくは改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中に生成するリスクを低減するための、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドおよび本明細書に記載のようなＨＬＡ特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドの使用を提供する。より好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞は、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞であり、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。前記ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する、本明細書に記載のような単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含んでもよい。前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結されてもよい。前記第一のポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチドの上流にあってもよい。前記ｓｃＦｖ抗原認識ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合してもよい。
したがって、本発明は、改変されたＴエフェクター細胞を生成するリスクの低減に使用するための、好ましくは改変されたＴｒｅｇの生成中に生成するリスクの低減に使用するための、本明細書に記載のようなベクターを提供する。好ましくは、前記改変されたＴエフェクター細胞は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞であり、前記改変されたＴｒｅｇは、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇである。より好ましくは、前記改変されたＴエフェクター細胞は、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞であり、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、改変されたＴエフェクター細胞を生成するリスクの低減のための、好ましくは改変されたＴｒｅｇの生成中に生成するリスクの低減のための、本明細書に記載のようなベクターの使用を提供する。好ましくは、前記改変されたＴエフェクター細胞は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞であり、前記改変されたＴｒｅｇは、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇである。より好ましくは、前記改変されたＴエフェクター細胞は、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞であり、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、改変されたＴエフェクター細胞を生成するリスクを低減する方法、好ましくは改変されたＴｒｅｇの生成中に生成するリスクを低減する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載のようなベクターを前記Ｔエフェクター細胞に導入することを含む。好ましくは、前記改変されたＴエフェクター細胞は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞であり、前記改変されたＴｒｅｇは、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇである。より好ましくは、前記改変されたＴエフェクター細胞は、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞であり、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
前記ベクターは、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドとを含んでもよく、前記ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含み、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドは同じプロモーターに操作可能に連結し、前記第一のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドの上流にある。前記抗原認識ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合してもよい。
前記ベクターは、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドとを含んでもよく、前記ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する抗原認識ドメインを含み、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドは同じプロモーターに操作可能に連結し、前記第一のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドの上流にあり、前記ベクターは、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間に本明細書に記載のような切断部位をコードするポリヌクレオチド、および／または、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間に本明細書に記載のような配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を、さらに含む。前記抗原認識ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合してもよい。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクを低減する方法、好ましくは改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中に生成するリスクを低減する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、前記Ｔエフェクター細胞に導入することを含む。好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞は、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞であり、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇであり、前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２特異的ＣＡＲである。前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含んでもよい。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクを低減する方法、好ましくは改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中に生成するリスクを低減する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、本明細書に記載のようなＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、細胞含有サンプルに導入することを含み、
（ａ）前記細胞含有サンプルは、Ｔエフェクター細胞および／またはＴｒｅｇを含み、および／または
（ｂ）前記細胞含有サンプルは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから富化され、および／または
（ｃ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから生成され、および／または
（ｄ）前記細胞含有サンプルは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）（たとえば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）など）を含むか、またはＰＳＣ（たとえばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣなど）からなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後にＰＳＣから分化される。
好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞は、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞であり、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇであり、前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２特異的ＣＡＲである。前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含んでもよい。
好適には、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または前記第二のポリヌクレオチドは、ウイルス性形質導入、好ましくはレトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入によって導入される。
好ましくは、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、単一のベクターに導入され、前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結されてもよい。前記ベクターは、本発明に係るベクターであってもよい。
したがって、本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクを低減する方法、好ましくは改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中に生成するリスクを低減する方法を提供し、前記方法は、本発明に係るベクターを前記Ｔエフェクター細胞に導入することを含む。好ましくは、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞は、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞であり、前記改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇは、改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇである。
本発明は、改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞（たとえば改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞）を生成するリスクを低減する方法、好ましくは改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇ（たとえば改変されたＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇ）の生成中に生成するリスクを低減する方法を提供し、前記方法は、本発明に係るベクターを細胞含有サンプルに導入することを含み、
（ａ）前記細胞含有サンプルは、Ｔエフェクター細胞および／またはＴｒｅｇを含むか、Ｔエフェクター細胞および／またはＴｒｅｇからなり、および／または
（ｂ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記ベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから富化され、および／または
（ｃ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記ベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから生成され、および／または
（ｄ）前記細胞含有サンプルは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）（たとえば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）など）を含むか、またはＰＳＣ（たとえばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣなど）からなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後にＰＳＣから分化される。
好ましくは、前記ベクターは、ＨＬＡ特異的ＣＡＲを含む。前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲであってもよい。前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原認識ドメインを含んでもよい。
「改変されたＴエフェクター細胞を生成するリスクの低減」という表現は、改変されたＴエフェクター細胞（たとえばＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞、またはＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞）を生成する可能性または速度を、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または本明細書に記載のようなベクターを導入することにより改変されていない対応するＴエフェクター細胞（たとえばＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞、またはＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞）の該可能性または速度と比較して低減することを、意味してもよい。好ましくは、改変されたＴｒｅｇ（たとえばＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇ、またはＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇ）の生成中に、前記可能性または速度が低減される。好適には、前記可能性が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％低減される。好適には、前記速度が、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍遅い速度とされる。
好適には、本明細書に記載のようなＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを導入する場合に、改変されたＴｒｅｇ（たとえばＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇ、またはＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇ）の生成中に生成された、改変されたＴエフェクター細胞（たとえばＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞、またはＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞）の数が、ＣＡＲ（たとえばＨＬＡ特異的ＣＡＲまたはＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドのみを使用し、本発明のＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチドやベクター使用しない場合に、対応する改変されたＴｒｅｇ（たとえばＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇ、またはＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇ）の生成中に生成された、対応する改変されたＴエフェクター細胞（たとえばＨＬＡ特異的なＴエフェクター細胞、またはＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞）の数と比較して、低減されてもよい。好適には、改変されたＴｒｅｇ（たとえばＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇ、またはＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔｒｅｇ）の生成中に生成された、改変されたＴエフェクター細胞（たとえばＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞、またはＨＬＡ－Ａ２特異的Ｔエフェクター細胞）の数が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％低減される。
医薬組成物
本発明の細胞（たとえば本発明の改変されたＴｒｅｇ）、または本発明のベクターを含む医薬組成物もまた提供される。
医薬組成物は、治療上有効量の医薬的に活性な薬剤、すなわちベクターおよび／またはＴｒｅｇを含む組成物、または、治療上有効量の医薬的に活性な薬剤、すなわちベクターおよび／またはＴｒｅｇからなる組成物である。好ましくは、医薬組成物は薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含む。
「薬学的に許容される」とは、製剤が滅菌済であり、発熱物質（ｐｙｒｏｇｅｎ）を含まないという意味を含む。担体、希釈剤および／または賦形剤は、前記Ｔｒｅｇまたはベクターと親和性があり、レシピエントに対して有害ではないという意味において、「許容され」なければならない。典型的には、担体、希釈剤および／または賦形剤は、滅菌済であり、発熱物質を含まない生理的媒体または輸液媒体であるが、他の許容可能な担体、希釈剤、賦形剤を用いてもよい。
治療目的の使用のために許容される担体、希釈剤、および賦形剤は、薬学的技術分野で周知である。薬学的担体、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図する投与経路と標準的な薬務とを考慮して選択できる。前記医薬組成物は、担体、賦形剤、または希釈剤として、またはそれらに加えて、任意の好適な結合剤（単数または複数）、滑剤（単数または複数）、懸濁化剤（単数または複数）、コーティング剤（単数または複数）、または可溶化剤（単数または複数）を含んでもよい。
薬学的に許容される担体の例としては、たとえば、水、塩類溶液、アルコール、シリコーン、蝋、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、珪酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、ペトロエスラル脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどがある。
本発明に係るＴｒｅｇまたは医薬組成物は、本明細書に記載の疾患を治療および／または予防するのに適した様式で投与されてもよい。投与量および投与頻度は、対象の状態ならびに対象の疾患の種類および重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は、臨床試験によって決定されてもよい。前記医薬組成物は、適切に処方されればよい。
本明細書に記載のＴｒｅｇまたは医薬組成物は、非経口投与、たとえば静脈内投与でき、または輸液技術により投与してもよい。前記Ｔｒｅｇまたは医薬組成物は、血液と等張にするために、たとえば十分な塩類やグルコースなど、他の物質を含んだ滅菌済水溶液の形態で投与してもよい。前記水溶液は、好適に緩衝してもよい（好ましくはｐＨ３～９）。前記医薬組成物は、適切に処方されればよい。滅菌条件のもとでの好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な薬学的技術によって容易に成しえる。
前記医薬組成物は、輸液媒体、たとえば滅菌済等張溶液中に本発明のＴｒｅｇを含んでもよい。前記医薬組成物は、ガラスまたはプラスチック製の、アンプル、使い捨て注射器、または複数回投与バイアルに封入してもよい。
前記Ｔｒｅｇまたは医薬組成物は、単回または複数回で投与されてもよい。特に、前記Ｔｒｅｇまたは医薬組成物は、単回の使い切りで投与されてもよい。前記医薬組成物は、適切に処方されればよい。
治療する疾患や対象、投与経路によって、前記Ｔｒｅｇまたは医薬組成物が様々な投与量（たとえば、細胞数／ｋｇ、または細胞数／対象、などで測定）で投与されてもよい。いずれにしても、医師が任意の個体対象にとって最も適した実際の投与量を決定するものであり、それはその対象の年齢、体重、および反応に応じて変わるであろう。しかしながら典型的には、本発明のＴｒｅｇについては、投与量として一個の対象につき５ｘ１０7～３ｘ１０9個の細胞、または１０8～２ｘ１０9個の細胞が投与されてもよい。
前記Ｔｒｅｇは、医薬組成物に使用するために適切に変更されてもよい。たとえば、Ｔｒｅｇは、対象に注入される前に、凍結保存されて適切な時間に解凍されてもよい。
前記医薬組成物はさらに、リンパ球枯渇剤（たとえば、サイモグロブリン、ｃａｍｐａｔｈー１Ｈ、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、シクロホスファミド、フルダラビン）、ｍＴＯＲ阻害剤（たとえば、シロリムス、エベロリムス）、共刺激経路を阻害する薬剤（たとえば、抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＣＴＡＬ４Ｉｇ）、および／または特異的なサイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１７、ＴＮＦａｌｐｈａ、ＩＬ１８）などの、一つ以上の他の治療薬を含んでいてもよい。
本発明のＴｒｅｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または医薬組成物を含むキットの使用も、さらに本発明に含まれる。好ましくは、当該キットは、本明細書に記載の前記方法および使用、たとえば、本明細書に記載の治療方法に用いられるためのものである。好ましくは、当該キットは、キットの構成部分の使用についての指示書を含む。
疾患の治療法および／または予防法
臓器移植
本発明は、本発明の改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物を対象に投与する工程を含む、移植に対する寛容を誘導する方法を提供する。好適には、前記対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
移植に対する寛容の誘導は、ドナー移植組織に対するレシピエントの免疫応答のレベルを下げる。
したがって、本発明は、本発明の改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物を対象に投与する工程を含む、移植拒絶反応を治療および／または予防する方法を提供する。
前記対象は移植レシピエントであってもよく、前記移植組織は肝臓、腎臓、心臓、肺臓、膵臓、小腸、胃、骨髄、血管柄付複合組織移植、および皮膚の移植から選択してもよい。好適には、前記移植は肝臓移植である。
移植拒絶反応を予防する、または移植拒絶反応の可能性を低減するために、移植拒絶反応の出ていない対象に、前記改変されたＴｒｅｇを投与してもよい。改変されたＴｒｅｇが投与されない対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％移植拒絶反応の可能性を低減してもよく、または、前記移植拒絶反応を完全に予防してもよい。
移植部位の疼痛や圧痛、インフルエンザのような症状、発熱、体重変化（たとえば体重増加）、および倦怠など、移植拒絶反応の一つの症状の出現の可能性を低減するために、移植拒絶反応の症状の出ていない対象に、前記改変されたＴｒｅｇを投与してもよい。改変されたＴｒｅｇが投与されない対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、前記少なくとも一つの症状を低減してもよく、または、少なくとも一つの症状を完全に予防してもよい。
拒絶反応を打ち消す、または移植拒絶反応の進行を緩やかにさせるために、もしくは、移植部位の疼痛や圧痛、インフルエンザのような症状、発熱、体重変化（たとえば体重増加）、および倦怠などの、移植拒絶反応の少なくとも一つの症状を少なくする、軽くする、または改善するために、移植拒絶反応のある対象に、前記改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物を投与してもよい。少なくとも一つの症状を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％少なくしたり、軽くしたり、または改善してもよく、もしくは、少なくとも一つの症状を完全に癒してもよい。
対象は免疫抑制治療を受けている移植レシピエントであればよい。好適には、本発明は、移植レシピエントが必要とする免疫抑制剤の量を減らすか、または、免疫抑制剤の中断を可能にしてもよい。
移植片対宿主病
本発明は、本発明の改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物を対象に投与する工程を含む、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を治療および／または予防する方法を提供する。好適には、前記対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
好適には、対象は移植レシピエントである。前記対象は移植レシピエントであってもよく、前記移植組織は肝臓、腎臓、心臓、肺臓、膵臓、小腸、胃、骨髄、血管柄付複合組織移植、および皮膚の移植から選択してもよい。好適には、前記移植は骨髄移植である。
ＧｖＨＤは、遺伝的に異なる人物からの移植組織の受領後に生じる一般的な合併症である。ＧｖＨＤは一般的には、骨髄移植に伴って生じるものなど、幹細胞移植に関連している。ＧｖＨＤはまた、肝臓移植組織など、移植された組織のその他の形態でも生じる。ドナーからの組織（移植片）内に残っているドナーの免疫系の白血球が、レシピエント（宿主）を異物（非自己）として認識する。前記移植組織内に存在する白血球が、今度はレシピエントの体の細胞を攻撃し、ＧｖＨＤが生じる。ＧｖＨＤは、急性でも慢性でもありうる。一般的な意味では、急性移植片対宿主病の特徴は、肝臓、皮膚、粘膜、および消化管に対する選択的な損傷である。
好適には、レシピエントに存在するが、移植（ｇｒａｆｔ／ｔｒａｓｐｌａｎｔ）ドナーには存在しないＨＬＡと特異的に結合できる抗原結合ドメインを、前記ＨＬＡ特異的ＣＡＲが含んでいてもよい。
対象は免疫抑制治療を受けていてもよい。
疾患の進行を遅めたり、軽減したり、または止めたりするために、ＧｖＨＤのある対象に改変されたＴｒｅｇを投与してもよい。改変されたＴｒｅｇが投与されない対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％疾患の進行を遅めたり、軽減したり、または止めたりしてもよく、または、前記疾患の進行を完全に止めてもよい。
発疹または皮膚のかゆみ、黄疸、吐き気、嘔吐、下痢、腹部疝痛、目の乾燥や炎症、口内乾燥、息切れ、嚥下困難、体重減少、倦怠および筋力低下や疼痛などの、ＧｖＨＤの少なくとも一つの症状を少なくする、軽くする、または改善するために、ＧｖＨＤのある対象に、前記改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物を投与してもよい。少なくとも一つの症状を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％少なくしたり、軽くしたり、または改善してもよく、もしくは、少なくとも一つの症状を完全に癒してもよい。
ＧｖＨＤを予防する、またはＧｖＨＤの可能性を低減するために、罹患していない、および／またはＧｖＨＤの任意の症状を示していない対象に、前記改変されたＴｒｅｇを投与してもよい。前記改変されたＴｒｅｇは、前記可能性を低減するか、または、発疹または皮膚のかゆみ、黄疸、吐き気、嘔吐、下痢、腹部疝痛、目の乾燥や炎症、口内乾燥、息切れ、嚥下困難、体重減少、倦怠および筋力低下や疼痛などの、ＧｖＨＤの少なくとも一つの症状を予防する。改変されたＴｒｅｇが投与されない対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、前記少なくとも一つの症状を低減してもよく、または、少なくとも一つの症状を完全に予防してもよい。
好適には、本発明の治療方法は、本発明に係る改変されたＴｒｅｇを、または本発明に係る方法により得られうる（たとえば、得られた）改変されたＴｒｅｇを、対象に投与する工程を含んでいてもよい。
好適には、疾患の治療および／または予防のための当該方法は、本発明に係る改変されたＴｒｅｇ（たとえば、本明細書に記載の医薬組成物中の）を、対象に投与する工程を含んでいてもよい。
前記方法は、下記の工程を包含していてもよい。
（ｉ）細胞含有サンプルを単離する、または細胞含有サンプルを提供する；
（ｉｉ）本明細書において定義されたポリヌクレオチド（単数または複数）またはベクターを前記細胞に導入する；および
（ｉｉｉ）対象に、（ｉｉ）からの前記細胞を投与する。
好適には、前記細胞は、本明細書において定義されたようなＴｒｅｇである。
好適には、前記方法の工程（ｉｉ）の前に、および／またはその後に、前記細胞含有サンプルから、富化されたＴｒｅｇ集団を単離し、および／または生成してもよい。たとえば、単離および／または生成は、工程（ｉｉ）の前に、および／またはその後に行い、富化されたＴｒｅｇサンプルを単離し、および／または生成してもよい。本発明のＣＡＲ、ポリヌクレオチド（単数または複数）、および／またはベクターを含む細胞および／またはＴｒｅｇについて富化を行うために、工程（ｉｉ）の後に富化を行ってもよい。
好適には、前記ポリヌクレオチド（単数または複数）またはベクターは、形質導入および／または遺伝子導入によって導入してもよい。
好適には、前記細胞は、自家細胞および／または同種細胞であってもよい。
好適には、改変されたＴｒｅｇは、一つ以上の他の治療薬と組み合わせて投与してもよく、他の治療薬としては、リンパ球枯渇剤（たとえば、サイモグロブリン、キャンパスー１Ｈ、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、シクロホスファミド、フルダラビン）、ｍＴＯＲ阻害剤（たとえば、シロリムス、エベロリムス）、共刺激経路を阻害する薬剤（たとえば、抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＣＴＡＬ４Ｉｇ）、および／または特異的なサイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１７、ＴＮＦａｌｐｈａ、ＩＬ１８）などがある。改変されたＴｒｅｇは、前記一つ以上の他の治療薬と同時にもしくは逐次的に（つまり、その前、または後に）投与してもよい。
実施例
本発明を実施例によりさらに説明するが、これは本発明を実施する際に当業者を支援するためのものであり、本発明の範囲を制限することを意図していない。
実施例１Ａ－天然Ｔｒｅｇｓの単離
ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＣＤ４＋陽性選択キットを使用して単離した。細胞はその後、ＢＤ ＡＲＩＡを使用したＦＡＣＳソーティング前にフローサイトメトリー抗体ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７で染色した。ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７－ ＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ１２７＋ Ｔｃｏｎｖを、ポリプロピレン管に採集した。セルソーティングの純度を、ＦＯＸＰ３ ＰＥ抗体を加えることにより測定した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ＦＯＸＰ３＋細胞の純度は通常、＞７０％であった。
実施例１Ｂ－ＦＯＸＰ３を用いた天然Ｔｒｅｇｓの形質導入
０日目、ＦＡＣＳソーティングしたＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖを、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズとともに１：１で培養することにより、別々に４８時間活性化した。２日目、細胞をカウントし、完全ＲＰＭＩ（Ｔｃｏｎｖ）またはＴｅｘｍａｃｓ培地（Ｔｒｅｇ）内に１ｘ１０6／ｍＬで再懸濁した。非組織培養処理２４ウェルプレートを、レトロネクチンでコーティングし、その後ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミンでブロックし、ＰＢＳで２回洗浄することにより、事前準備した。ＩＬ－２の最終濃度は、Ｔｃｏｎｖについては３００μ／ｍｌ、Ｔｒｅｇについては１０００μ／ｍｌとした。細胞を一晩３７℃でインキュベートした後、上清を除去し、新しい完全培地とＩＬ－２を追加した。培地は一日おきに交換した。
Ｔｃｏｎｖ細胞は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミンを追加したＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）で増殖させた。１００単位／ｍＬのペニシリンと１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを追加したＴｅｘｍａｃｓ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で、制御性Ｔ細胞を培養した。
７～１０日目に、フローサイメトリー解析を行い、マウスＴＣＲ定常領域およびＦＯＸＰ３の発現を通じて形質導入のレベルを解析した。
実施例１Ｃ－ＦＯＸＰ３を形質導入した天然Ｔｒｅｇの存在下での、刺激Ｔｃｏｎｖ細胞の増殖およびＩＬ－２産生
１０日目、ヒトＨＬＡ－ＤＲ４およびＣＤ８０またはＣＤ８６を形質導入したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に、ＭＢＰ１１１－１２９（ＬＳＲＦＳＷＧＡＥＧＱＲＰＧＦＧＹＧＧ）（１０μＭ／ｍｌ）を取り込ませた。懸濁液を標準的な組織培養条件で２時間インキュベートした後、放射線を照射し、洗浄し、適切な濃度で再懸濁した。
温めたＰＢＳ内で３７℃で３分間、形質導入したレスポンダーＴ細胞をＣＦＳＥ細胞追跡色素で染色した後、等量の温めたＦＢＳを加えて、さらに３分間インキュベートした。細胞を５倍容量の完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した後、計数し、形質導入された細胞を１ｘ１０6個／ｍｌで再懸濁した。制御性Ｔ細胞を培養液から取り出し、洗浄し、形質導入された細胞を１ｘ１０6個／ｍｌで完全ＲＰＭＩに再懸濁した。細胞を、１Ｔｒｅｇ：０．１ＣＨＯ細胞：様々な割合のＴｃｏｎｖで、４日間平板培養（ｐｌａｔｅｄ）した。
４日目に、細胞を生死判別色素で染色し、フローサイトメトリーで解析した。「生」細胞をゲーティングし、次にペプチドを使用せずに培養した細胞と比較してＣＦＳＥ蛍光が低い細胞の集団をゲーティングすることにより、増殖率を測定した。
図１は、ペプチドを使用した場合と使用しなかった場合のＴＣＲを形質導入したＴｃｏｎｖ細胞の増殖（青色バー）、ならびに、偽（ｍｏｃｋ）Ｔｒｅｇ（白色バー）の存在下、ＴＣＲを形質導入したＴｒｅｇの存在下、またはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入したＴｒｅｇの存在下での同じ細胞の増殖を示す。
４日目、上清を採取し、ＩＬ－２の産生についてＥＬＩＳＡで解析した。
図２は、ペプチドを使用した場合と使用しなかった場合のＴＣＲを形質導入したＴｃｏｎｖ細胞のＩＬ－２の産生（青色バー）、ならびに、偽（ｍｏｃｋ）Ｔｒｅｇ（白色バー）の存在下、ＴＣＲを形質導入したＴｒｅｇの存在下、またはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入したＴｒｅｇの存在下での同じ細胞の増殖を示す。
実施例２－異なるドナーからのＴ細胞
実施例１に記載されている実験を、異なるドナーからのＴ細胞を使用して繰り返し行った。
図３は、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の増殖率を示す。
図４は、共培養実験から採取された上清中のＩＬ－２の濃度を示す。
実施例３－形質導入した天然ＴｒｅｇにおけるＴｒｅｇマーカーの発現
７～１０日目に、偽（ｍｏｃｋ）形質導入したＴｒｅｇ、もしくは、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入したＴｒｅｇを、Ｔｒｅｇマーカー（ＦＯＸＰ３、ＣＤ２５、およびＣＴＬＡ－４）の発現についてフローサイトメトリーにより解析した。
図５は、各マーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。点は、個々の実験を表す。一元配置分散分析（１－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を統計解析ｐ＜０．０５＊、ｐ＜０．００５＊＊のために使用した。
図６は、前記と同じデータを、異なる形で表したものである。各線は、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入した同じＴｒｅｇ上のマーカーのＭＦＩを示す一つの実験を表している。
実施例４－形質導入した天然Ｔｒｅｇｓを、誘導性Ｔｒｅｇと比較
実施例１Ｃに記載のように、ＣＤ８０+ＣＤ８６+ＤＲ４+ ＣＨＯ細胞にペプチドを取り込ませ、放射線を照射し、その後、０．１ｘ１０6細胞／ｍｌで再懸濁した。温めたＰＢＳ内で３７℃で３分間、形質導入したレスポンダーＴ細胞をＣＦＳＥ細胞追跡色素で染色した後、等量の温めたＦＢＳを加えて、さらに３分間インキュベートした。
細胞を５倍容量の完全培地で洗浄した後、計数し、形質導入された細胞を１ｘ１０6個／ｍｌで再懸濁した。ＴｃｏｎｖとＴｒｅｇの形質導入効率をフローサイトメトリーで測定した。Ｔｒｅｇを培養液から取り出し、洗浄し、形質導入された細胞を１ｘ１０6個／ｍｌで完全ＲＰＭＩに再懸濁した。細胞を、１Ｔｒｅｇ：０．１ＣＨＯ細胞：様々な割合のＴｃｏｎｖで、平板培養（ｐｌａｔｅｄ）した。カルボキシフルオレセイン－スクシンイミジル－エステル（ＣＦＳＥ）で染色したＴｃｏｎｖの希釈度（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を解析することにより、増殖を測定した。
図７のデータは、ＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入した天然Ｔｒｅｇｓが、ＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入したＴｃｏｎｖ細胞（すなわち、誘導性Ｔｒｅｇ）よりも効果的に増殖を抑制することを示している。
培養培地から上清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ－２について解析した。図８に提示したデータは、ＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入した天然Ｔｒｅｇｓが、ＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入したＴｃｏｎｖ細胞（すなわち、誘導性Ｔｒｅｇ）よりも効果的にＩＬ－２の産生を抑制することを示している。
実施例５Ａ－外因性ＦＯＸＰ３を発現しているＴｒｅｇが生着し、存続し、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、およびＴＣＲ発現を保持する
Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ＴｒｅｇまたはＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇを、ＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニックマウスのリンパ節および脾細胞から、ビーズ分離により単離した。ＣＤ４５．１＋ ＴｒｅｇにＴＣＲを形質導入し、Ｔｈｙ１．１＋ ＴｒｅｇにＴＣＲ＋マウスＦＯＸＰ３を形質導入した。形質導入から１日後に、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入した細胞を、４Ｇｙ照射による条件付けを行ったＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニック宿主に１：１の比率で注入した。ＦＡＣＳプロットは、注入された細胞のＣＤ４５．１：Ｔｈｙ１．１の比率、および、それらのそれぞれのＦＯＸＰ３発現を示している。
７週間後、フローサイトメトリーを用いて、生着した細胞をＴＣＲの染色により同定した。ＴＣＲ＋の集団内のＣＤ４５．１：Ｔｈｙ１．１の比率を測定し、生着したＣＤ４５．１（ＴＣＲを形質導入したＴｒｅｇ）またはＴｈｙ１．１（ＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入したＴｒｅｇ）細胞の表現型を、ＦＯＸＰ３およびＣＤ２５について染色により調べた。
Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇを、ＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニックマウスのリンパ節や脾細胞からビーズ分離によって単離した。ＴｒｅｇにＴＣＲ、ＴＣＲ＋マウスＦＯＸＰ３を形質導入するか、または、Ｔｒｅｇをウイルス不含上清（偽（ｍｏｃｋ））と共に培養した。形質導入から１日後に、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入した細胞を、４Ｇｙ照射による条件付けを行ったＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニック宿主に注入した。７週間後、フローサイトメトリーを用いて、形質導入したＴｒｅｇの生着を測定した。図９のＡは、形質導入後１日目のヒト可変２．１およびマウスＦｏｘｐ３の発現を通して測定した、形質導入効率を示す。図９のＢは、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入したＴｒｅｇを投与したマウスから得た脾細胞を、Ｔｈｙ１．１で染色し、移入細胞を同定したもの（上部パネル）、ならびに、ＦＯＸＰ３及びＴＣＲを同定したもの（下部パネル）を示す。図９のＣは、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入したＴｒｅｇについて、形質導入効率の倍率変化（fold change）（左パネル）、および形質導入細胞の絶対数の倍率変化（右パネル）を、注入の日と比較して示した累計データを示す。図９のＤは、移入から７週間後の、形質導入細胞内のＦＯＸＰ３の代表的な発現を示す。グラフは、７週目の形質導入された集団内のＦＯＸＰ３＋細胞の累積率（左）と、注入した日と比較した、ＦＯＸＰ３＋細胞における倍率変化とを示す。
実施例５Ｂ－外因性ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇは、７週間後もインビボでＴｒｅｇ機能を保持するが、外因性ＦＯＸＰ３を発現しないＴｒｅｇは、エフェクターサイトカインを産生する能力を獲得する
脾細胞を、無関係なペプチドまたは１０ｕＭ ＭＢＰでパルスしたＣＤ８６＋ＨＬＡ－ＤＲ４＋ＣＨＯ細胞とともに４時間培養した。外因性ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇは、エフェクターサイトカインの産生が無いことから示されるように、７週間後もインビボでＴｒｅｇ機能を保持していたが、外因性ＦＯＸＰ３を発現していないＴｒｅｇは、エフェクターサイトカインを産生する能力を獲得した（図１０）。
実施例１～５は、ＴＣＲを使用して例示されたが、その結果は広く適用でき、たとえば他のＴＣＲコンストラクトやＣＡＲコンストラクト、たとえばＨＬＡ－Ａ２を標的とする抗原結合ドメインを含むものなどに適用できる。
実施例６Ａ－ＦＯＸＰ３とＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲとをコードするコンストラクトを形質導入したＴｒｅｇは、両方の遺伝子を発現し、内因性ＦＯＸＰ３のみを有するＴｒｅｇと比較して、ＦＯＸＰ３を著しく高いレベルで発現する
ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋の富化によりＰＢＭＣからＴｒｅｇを単離した。前記富化された細胞は、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７およびＣＤ４５ＲＡの染色を行い、ＦＡＣＳでソーティングした。
富化されたＴｒｅｇに、４つのコンストラクトのうちの一つを形質導入した。図１１Ａは、使用されたコンストラクトの概略図を示す。コンストラクトＦ－Ｃ：５’ －ＦＯＸＰ３－Ｐ２Ａ－Ａ２ ＣＡＲ－３’をコードするコンストラクトを表す。コンストラクトＲ－Ｃ：５’－Ｒ－Ｐ２Ａ－Ａ２ ＣＡＲ－３’をコードするコンストラクトであって、Ｒはその他の遺伝子を表す。コンストラクトＣ：Ａ２ ＣＡＲのみをコードするコンストラクトを表す。コンストラクトＣ－Ｒ：５’－Ａ２ ＣＡＲ－Ｐ２ＡＲ－３’をコードするコンストラクトであって、Ｒはその他の遺伝子を表す。
図１１Ｂは、形質導入の方法の概略を示す。
前記富化され形質導入された細胞を、下記プロトコルを使用して増殖した。
・ ０日目、ＧｉｂｃｏTMＤｙｎａｂｅａｄｓTMＨｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８とともに、ＴｅｘＭＡＣＳTM中に０．２５ｘ１０6／ｍｌ
・ ２日目、ＩＬ－２およびウイルスとともに、レトロネクチンをコートしたプレート上でＴｅｘＭＡＣＳTM中に０．１ｘ１０6／ｍｌ
・ ４～９日目、Ｔ２５フラスコ／６ウェルプレートの中でＩＬ－２を含むＴｅｘＭＡＣＳTM中に０．２５ｘ１０6／ｍｌになるまで再懸濁
・ １５日目、Ｔ２５フラスコの中でＩＬ－２を含むＴｅｘＭＡＣＳTM中に０．２５ｘ１０6／ｍｌになるまで再懸濁
図１２は、コンストラクトＦ－Ｃ、コンストラクトＲ－Ｃ、コンストラクトＣ、およびコンストラクトＣ－Ｒを形質導入したＴｒｅｇにおける、ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲ（Ａ２ ＣＡＲ）発現レベル、ＦＯＸＰ３発現レベル、およびその他の遺伝子Ｒの発現レベルをフローサイトメトリーで測定したものを、偽（ｍｏｃｋ）コントロールと比較して、示している。
図１２Ａは、各コンストラクトを形質導入したＴｒｅｇが、ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲを発現したことを示す。前記ＣＡＲが下流にあった場合（コンストラクトＲ－Ｃ）と、前記ＣＡＲが上流にあった場合（コンストラクトＣ－Ｒ）との両方のコンストラクトで、前記ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲが発現していた。
図１２Ｂは、ＦＯＸＰ３がすべてのＴｒｅｇで発現していたが、特に前記ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲのみ（コンストラクトＣ）の発現と比較すると、コンストラクトＦ－Ｃにおいて著しく高かったことを示す。
実施例６Ｂ－ＦＯＸＰ３とＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲとをコードするコンストラクトを形質導入したＴｒｅｇは、ＦＯＸＰ３の発現を維持
図１３は、コンストラクトＦ－Ｃ、コンストラクトＲ－Ｃ、コンストラクトＣ、およびコンストラクトＣ－Ｒを形質導入し、さらに増殖させたＴｒｅｇにおける、ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲ（Ａ２ ＣＡＲ）発現レベル、ＦＯＸＰ３発現レベル、およびその他の遺伝子Ｒの発現レベルを、フローサイトメトリーで測定したものを、偽（ｍｏｃｋ）コントロールと比較して、示す。
図１３Ａは、各コンストラクトを形質導入したＴｒｅｇが、さらに増殖させた後もなお、ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲを発現していたことを示す。
図１３Ｂは、さらに増殖させた後は、コンストラクトＲ－Ｃ、コンストラクトＣ、およびコンストラクトＣ－Ｒを形質導入したＴｒｅｇで、ＦＯＸＰ３の発現が減少したことを示す。これに対して、コンストラクトＦ－Ｃを形質導入したＴｒｅｇでは、さらなる増殖後に、ＦＯＸＰ３の発現は減少しなかった。その結果、特に前記ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲのみ（コンストラクトＣ）の発現と比較すると、ＦＯＸＰ３の発現が、さらなる増殖後のコンストラクトＦ－Ｃにおいてかなり高かった。
実施例７－ＦＯＸＰ３とＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲとをコードするコンストラクトを形質導入したＴｒｅｇは、ＦＯＸＰ３の発現を増強しつつ、Ｔｒｅｇ表現型系統を維持
増殖プロトコルで用いられる培地を、（ＴｅｘＭＡＣＳTMではなく）５％ＡＢ血清を含むＸ－ＶＩＶＯ－１５TMに切り替え、０日目の細胞濃度を（０．２５ｘ１０6／ｍｌではなく）０．２ｘ１０6／ｍｌとしたこと以外は、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ１２７-Ｔｒｅｇを、実施例６Ａに記載されたように、ＦＡＣＳソーティングし、活性化し、形質導入し、増殖した。
Ｔ細胞を培養液から取り出し、デキストラマーとＬＩＶＥ／ＤＥＡＤTMＦｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲを使用して、ＨＬＡ－Ａ２特異的なＣＡＲと生細胞の染色を行った。したがって、抗ＣＤ２５ ＰＥ－Ｃｙ７、抗ＣＤ６２Ｌ ＰＥ－ＣＦ５９４、抗ＴＩＧＩＴ ＢＶ６０５、抗ＣＤ４５ＲＯ ＢＵＶ３９５、および抗ＣＤ２２３ ＢＶ７１１という抗体を含有するブリリアントステインバッファー（ＢＤ）中で、２０～３０分間、４℃Ｃ、暗所で、前記細胞の表面染色を行った。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を洗浄し、固定／透過処理溶液に再懸濁した。前記細胞を、４℃で３０分間、暗所で、インキュベートした。透過処理された細胞を、１ｘ透過処理緩衝液洗浄し、抗ＣＴＬＡ－４ ＢＶ４２１および抗Ｆｏｘｐ３ ＰＥを含有する５０μＬの１ｘ透過処理緩衝液に、３０分間、４℃の暗所で再懸濁した。その後、細胞を１ｘ透過処理緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーで解析した。
各サンプルにおいて、形質導入（ＴＤ）された細胞をデキストラマー＋として特定し、それ以外の細胞を形質導入されていない（ＮＴＤ）と考えた；ＴＤ細胞およびＮＴＤ細胞で、各表現型系統マーカーについて平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。２0は無変化を表し、２1は発現が２倍に増加したことを表す。
図１４は、コンストラクトＦ－Ｃ、コンストラクトＲ－Ｃ、コンストラクトＣ、およびコンストラクトＣ－Ｒを形質導入したＴｒｅｇでの表現型系統マーカーの発現を示す。コンストラクトＦ－Ｃを形質導入したＴｒｅｇは、Ｔｒｅｇ表現型系統を維持しつつ、ＦＯＸＰ３の発現を増強していた。
本明細書で言及された刊行物はすべて、この参照により本明細書に援用される。本発明の範囲と趣旨を逸脱しない、本明細書に開示された本発明の方法、細胞、組成物、および使用の様々な変更および変形が、当業者に明らかであろう。本発明は特定の好適な実施形態に関連して開示されているが、請求項に記載されている発明が、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。開示された本発明を実施するための形態の、当業者に自明である様々な変更は、下記の請求項の範囲内のものとする。

Claims (50)

  1. ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第二のポリヌクレオチドとを含むベクターであって、前記ＣＡＲはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する抗原認識ドメインを含み、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドは同じプロモーターに操作可能に連結し、前記第一のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドの上流にある、ベクター。
  2. 前記抗原認識ドメインがＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合する、請求項１に記載のベクター。
  3. 前記ベクターが、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間に切断部位をコードするポリヌクレオチド、および／または前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１または２に記載のベクター。
  4. 前記ベクターが、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間に自己切断配列を含み、好ましくは、前記自己切断配列は、２Ａ自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  5. 前記２Ａ自己切断ペプチドが、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、およびＦ２Ａペプチドからなる群から選択される、請求項４に記載のベクター。
  6. 前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドが、配列番号１若しくは２、またはそれらの機能的断片に対する同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１若しくは２、またはそれらの機能的断片に対する同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列からなる、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  7. 前記第一のポリヌクレオチドが、配列番号３若しくは４、またはそれらの機能的断片に対する同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％であるポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号３若しくは４、またはそれらの機能的断片に対する同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％であるポリヌクレオチド配列からなる、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  8. 前記抗原認識ドメインが、抗体であるか、抗体断片であるか、または抗体由来である、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  9. 前記抗原認識ドメインが、抗原結合断片（Ｆａｂ）であるか、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であるか、またはシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  10. 前記抗原認識ドメインが、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  11. 前記抗原認識ドメインが、１個以上のＣＤＲ領域を含み、前記１個以上のＣＤＲ領域は、配列番号５～１３３から選択されるか、またはそれらの誘導体であって１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含む誘導体から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  12. 前記抗原認識ドメインが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含み、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が、それぞれ配列番号５～７を含むか、またはそれぞれ配列番号５～７からなり；それぞれ配列番号８～１０を含むか、またはそれぞれ配列番号８～１０からなり；それぞれ配列番号１１～１３を含むか、またはそれぞれ配列番号１１～１３からなり；それぞれ配列番号１４～１６を含むか、またはそれぞれ配列番号１４～１６からなり；それぞれ配列番号１７～１９を含むか、またはそれぞれ配列番号１７～１９からなり；それぞれ配列番号２０～２２を含むか、またはそれぞれ配列番号２０～２２からなり；それぞれ配列番号２３～２５を含むか、またはそれぞれ配列番号２３～２５からなり；それぞれ配列番号２６～２８を含むか、またはそれぞれ配列番号２６～２８からなり；それぞれ配列番号２９～３１を含むか、またはそれぞれ配列番号２９～３１からなり；それぞれ配列番号３２～３４を含むか、またはそれぞれ配列番号３２～３４からなり；それぞれ配列番号３５～３７を含むか、またはそれぞれ配列番号３５～３７からなるか；それぞれ配列番号３８～４０を含むか、またはそれぞれ配列番号３８～４０からなり；それぞれ配列番号４１～４３を含むか、またはそれぞれ配列番号４１～４３からなり；それぞれ配列番号４４～４６を含むか、またはそれぞれ配列番号４４～４６からなり；それぞれ配列番号４７～４９を含むか、またはそれぞれ配列番号４７～４９からなり；それぞれ配列番号５０～５２を含むか、またはそれぞれ配列番号５０～５２からなり；それぞれ配列番号５３～５５を含むか、またはそれぞれ配列番号５３～５５からなり；それぞれ配列番号５６～５８を含むか、またはそれぞれ配列番号５６～５８からなり；それぞれ配列番号５９～６１を含むか、またはそれぞれ配列番号５９～６１からなり；それぞれ配列番号６２～６４を含むか、またはそれぞれ配列番号６２～６４からなり；それぞれ配列番号６５～６７を含むか、またはそれぞれ配列番号６５～６７からなり；それぞれ配列番号６８～７０を含むか、またはそれぞれ配列番号６８～７０からなり；それぞれ配列番号７１～７３を含むか、またはそれぞれ配列番号７１～７３からなり；それぞれ配列番号７４～７６を含むか、またはそれぞれ配列番号７４～７６からなり；それぞれ配列番号７７～７９を含むか、またはそれぞれ配列番号７７～７９からなり；それぞれ配列番号８０～８２を含むか、またはそれぞれ配列番号８０～８２からなり；それぞれ配列番号８３～８５を含むか、またはそれぞれ配列番号８３～８５からなり；それぞれ配列番号８６～８８を含むか、またはそれぞれ配列番号８６～８８からなり；それぞれ配列番号８９～９１を含むか、またはそれぞれ配列番号８９～９１からなり；それぞれ配列番号９２～９４を含むか、またはそれぞれ配列番号９２～９４からなり；それぞれ配列番号９５～９７を含むか、またはそれぞれ配列番号９５～９７からなり；それぞれ配列番号９８～１００を含むか、またはそれぞれ配列番号９８～１００からなり；それぞれ配列番号１０１～１０３を含むか、またはそれぞれ配列番号１０１～１０３からなり；それぞれ配列番号１０４～１０６を含むか、またはそれぞれ配列番号１０４～１０６からなり；それぞれ配列番号１０７～１０９を含むか、またはそれぞれ配列番号１０７～１０９からなり；それぞれ配列番号１１０～１１２を含むか、またはそれぞれ配列番号１１０～１１２からなり；それぞれ配列番号１１３～１１５を含むか、またはそれぞれ配列番号１１３～１１５からなり；それぞれ配列番号１１６～１１８を含むか、またはそれぞれ配列番号１１６～１１８からなり；それぞれ配列番号１１９～１２１を含むか、またはそれぞれ配列番号１１９～１２１からなり；それぞれ配列番号１２２～１２４を含むか、またはそれぞれ配列番号１２２～１２４からなり；それぞれ配列番号１２５～１２７を含むか、またはそれぞれ配列番号１２５～１２７からなり；それぞれ配列番号１２８～１３０を含むか、またはそれぞれ配列番号１２８～１３０からなり；および／またはそれぞれ配列番号１３１～１３３を含むか、またはそれぞれ配列番号１３１～１３３からなる、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  13. 前記抗原認識ドメインが、下記（ｉ）～（ｘｘｖｉｉ）のいずれかを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
    （ｉ）それぞれ配列番号５～７を含むか、またはそれぞれ配列番号５～７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号１７～１９を含むか、またはそれぞれ配列番号１７～１９からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｉｉ）それぞれ配列番号８～１０を含むか、またはそれぞれ配列番号８～１０からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号２０～２２を含むか、またはそれぞれ配列番号２０～２２からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｉｉｉ）それぞれ配列番号１１～１３を含むか、またはそれぞれ配列番号１１～１３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号２３～２５を含むか、またはそれぞれ配列番号２３～２５からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｉｖ）それぞれ配列番号１４～１６を含むか、またはそれぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号２６～２８を含むか、またはそれぞれ配列番号２６～２８からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｖ）それぞれ配列番号１４～１６を含むか、またはそれぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号２９～３１を含むか、またはそれぞれ配列番号２９～３１からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｖｉ）それぞれ配列番号１４～１６を含むか、またはそれぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号３２～３４を含むか、またはそれぞれ配列番号３２～３４からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｖｉｉ）それぞれ配列番号１４～１６を含むか、またはそれぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号３５～３７を含むか、またはそれぞれ配列番号３５～３７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号１４～１６を含むか、またはそれぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号３８～４０を含むか、またはそれぞれ配列番号３８～４０からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｉｘ）それぞれ配列番号１４～１６を含むか、またはそれぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号４１～４３を含むか、またはそれぞれ配列番号４１～４３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘ）それぞれ配列番号１４～１６を含むか、またはそれぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号４４～４６を含むか、またはそれぞれ配列番号４４～４６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｉ）それぞれ配列番号１４～１６を含むか、またはそれぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号４７～４９を含むか、またはそれぞれ配列番号４７～４９からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｉｉ）それぞれ配列番号１４～１６を含むか、またはそれぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号５０～５２を含むか、またはそれぞれ配列番号５０～５２からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｉｉｉ）それぞれ配列番号１４～１６を含むか、またはそれぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号５３～５５を含むか、またはそれぞれ配列番号５３～５５からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｉｖ）それぞれ配列番号１４～１６を含むか、またはそれぞれ配列番号１４～１６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号５６～５８を含むか、またはそれぞれ配列番号５６～５８からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｖ）それぞれ配列番号１４～１６を含むか、またはそれぞれ配列番号１４～１６から成るＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号５９～６１を含むか、またはそれぞれ配列番号５９～６１からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｖｉ）それぞれ配列番号６２～６４を含むか、またはそれぞれ配列番号６２～６４からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号９８～１００を含むか、またはそれぞれ配列番号９８～１００からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｖｉｉ）それぞれ配列番号６５～６７を含むか、またはそれぞれ配列番号６５～６７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号１０１～１０３を含むか、またはそれぞれ配列番号１０１～１０３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｖｉｉｉ）それぞれ配列番号６８～７０を含むか、またはそれぞれ配列番号６８～７０からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号１０４～１０６を含むか、またはそれぞれ配列番号１０４～１０６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｉｘ）それぞれ配列番号７１～７３を含むか、またはそれぞれ配列番号７１～７３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号１０７～１０９を含むか、またはそれぞれ配列番号１０７～１０９からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｘ）それぞれ配列番号７４～７６を含むか、またはそれぞれ配列番号７４～７６からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号１１０～１１２を含むか、またはそれぞれ配列番号１１０～１１２からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｘｉ）それぞれ配列番号７７～７９を含むか、またはそれぞれ配列番号７７～７９からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号１１３～１１５を含むか、またはそれぞれ配列番号１１３～１１５からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｘｉｉ）それぞれ配列番号８０～８２を含むか、またはそれぞれ配列番号８０～８２からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号１１６～１１８を含むか、またはそれぞれ配列番号１１６～１１８からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｘｉｉｉ）それぞれ配列番号８３～８５を含むか、またはそれぞれ配列番号８３～８５からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号１１９～１２１を含むか、またはそれぞれ配列番号１１９～１２１からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｘｉｖ）それぞれ配列番号８６～８８を含むか、またはそれぞれ配列番号８６～８８からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号１２２～１２４を含むか、またはそれぞれ配列番号１２２～１２４からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｘｖ）それぞれ配列番号８９～９１を含むか、またはそれぞれ配列番号８９～９１からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号１２５～１２７を含むか、またはそれぞれ配列番号１２５～１２７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；
    （ｘｘｖｉ）それぞれ配列番号９２～９４を含むか、またはそれぞれ配列番号９２～９４からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号１２８～１３０を含むか、またはそれぞれ配列番号１２８～１３０からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン；または
    （ｘｘｖｉｉ）それぞれ配列番号９５～９７を含むか、またはそれぞれ配列番号９５～９７からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変重ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号１３１～１３３を含むか、またはそれぞれ配列番号１３１～１３３からなるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む可変軽ドメイン。
  14. 前記抗原認識ドメインが、配列番号１３４～１４９の一つ以上に対する同一性が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％である可変重ドメインを含み、および／または配列番号１５０～１７６の一つ以上に対する同一性が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％である可変軽ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  15. 前記抗原認識ドメインが、配列番号１７７～２０３の一つ以上に対する同一性が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１７７～２０３の一つ以上に対する同一性が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列からなる、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  16. 前記ＣＡＲが、膜貫通（ＴＭ）ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、場合によっては、前記ＣＡＲが、ヒンジドメイン、および／または１個以上の共刺激ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  17. 前記ＣＡＲが、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、ＩｇＧヒンジドメイン、およびＩｇＤヒンジドメインからなる群から選択される１個以上のヒンジドメインを含み、好ましくは、前記ＣＡＲがＣＤ８ヒンジドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  18. 前記ＣＡＲが、ＣＤ２８ ＴＭドメイン、ＩＣＯＳ ＴＭドメイン、ＣＤ８ ＴＭドメイン、ＣＤ４ ＴＭドメイン、ＯＸ４０ ＴＭドメイン、４－１ＢＢ ＴＭドメイン、およびＣＤ３ゼータＴＭドメインからなる群から選択される１個以上のＴＭドメインを含み、好ましくは、前記ＣＡＲがＣＤ８ ＴＭドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  19. 前記ＣＡＲが、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７シグナル伝達ドメイン、またはＴＮＦＲＳＦ２５シグナル伝達ドメインからなる群から選択される１個以上の共刺激ドメインを含み、好ましくは、前記ＣＡＲがＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  20. 前記ＣＡＲが、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインまたはその相同体のいずれか、ＣＤ３ポリペプチド、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、ＣＤ２シグナル伝達ドメイン、ＣＤ５シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ８シグナル伝達ドメインからなる群から選択される１個以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、好ましくは、前記ＣＡＲがＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  21. 前記ＣＡＲが、ＣＤ８ヒンジドメイン、ＣＤ８ＴＭドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  22. 前記ＣＡＲが、配列番号２０９または配列番号２１０に対する同一性が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  23. 前記第二のポリヌクレオチドが、配列番号２１１または配列番号２１２に対する同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％であるポリヌクレオチド配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  24. 前記プロモーターが、長い末端反復（ＬＴＲ）である、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  25. 下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
    （ｉ）配列番号３に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片を含むか、または配列番号３に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片からなる第一のポリヌクレオチド、場合によっては、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも７０％である自己切断配列を含むか、または配列番号２１４に対する同一性が少なくとも７０％である自己切断配列からなる第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１１に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）配列番号３に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片を含むか、または配列番号３に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片からなる第一のポリヌクレオチド、場合によっては、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも７０％である自己切断配列を含むか、または配列番号２１４に対する同一性が少なくとも７０％である自己切断配列からなる第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１２に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）配列番号４に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片を含むか、または配列番号４に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片からなる第一のポリヌクレオチド、場合によっては、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも７０％である自己切断配列を含むか、または配列番号２１４に対する同一性が少なくとも７０％である自己切断配列からなる第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１１に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド；または
    （ｉｖ）配列番号４に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片を含むか、または配列番号４に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片からなる第一のポリヌクレオチド、場合によっては、配列番号２１４に対する同一性が少なくとも７０％である自己切断配列を含むか、または配列番号２１４に対する同一性が少なくとも７０％である自己切断配列からなる第一のポリヌクレオチド、および配列番号２１２に対する同一性が少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列を含む、第二のポリヌクレオチド。
  26. 前記ベクターはウイルスベクターであり、好ましくはレトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  27. 請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクターを含む、改変されたＴ細胞。
  28. 前記改変されたＴ細胞が、改変された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である、請求項２７に記載の改変されたＴ細胞。
  29. 免疫応答を抑制する、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの能力の増強に使用するための、好ましくはＨＬＡを発現する細胞に対する免疫応答を抑制する、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの能力の増強に使用するための、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  30. 免疫応答を抑制する、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの能力の増強に使用するための、好ましくはＨＬＡを発現する細胞に対する免疫応答を抑制する、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの能力の増強に使用するための、請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクター。
  31. 改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力を増強する方法であって、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、前記Ｔｒｅｇに導入することを含む方法。
  32. 改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能力を増強する方法であって、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、ＨＬＡ特異的ＣＡＲをコードする第二のポリヌクレオチドとを、細胞含有サンプルに導入することを含み、
    （ａ）前記細胞含有サンプルは、Ｔｒｅｇを含むか、またはＴｒｅｇからなり；および／または
    （ｂ）前記細胞含有サンプルは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから富化され；および／または
    （ｃ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、ならびにＴｒｅｇは、前記第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドを導入する前または後に前記細胞含有サンプルから生成される、方法。
  33. 前記ＨＬＡがＨＬＡ－Ａ２である、請求項２９に記載の使用のためのポリヌクレオチド、請求項３０に記載の使用のためのベクター、または請求項３１または３２に記載の方法。
  34. 前記第一のポリヌクレオチドおよび／または前記第二のポリヌクレオチドは、ウイルス性形質導入により導入され、好ましくはレトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入によって導入される、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、単一のベクターに導入され、場合によっては前記第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは、同じプロモーターに操作可能に連結される、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ベクターが、請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクターである、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクの低減に使用するための、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  38. 改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクの低減に使用するための、請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクター。
  39. 改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減するための方法であって、請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクターを前記Ｔｒｅｇに導入することを含む、方法。
  40. 請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクターを細胞含有サンプルに導入することを含む、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低減するための方法であって、
    （ａ）前記細胞含有サンプルは、Ｔｒｅｇを含むか、またはＴｒｅｇからなり；および／または
    （ｂ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、前記ベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルからＴｒｅｇが富化され、および／または
    （ｃ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、前記ベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルからＴｒｅｇが生成される、方法。
  41. 改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中に改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクの低減に使用するための、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  42. 改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中に改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクの低減に使用するための、請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクター。
  43. 請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクターを細胞含有サンプルに導入することを含む、改変されたＨＬＡ特異的Ｔｒｅｇの生成中に改変されたＨＬＡ特異的Ｔエフェクター細胞を生成するリスクを低減する方法であって、
    （ａ）前記細胞含有サンプルは、Ｔｒｅｇおよび／またはＴエフェクター細胞を含み、および／または
    （ｂ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、前記ベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルからＴｒｅｇが富化され、および／または
    （ｃ）前記細胞含有サンプルは、ＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなり、前記ベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルからＴｒｅｇが生成される、方法。
  44. 前記ＨＬＡがＨＬＡ－Ａ２である、請求項３７または４１に記載の使用のためのポリヌクレオチド、請求項３８または４２に記載の使用のためのベクター、または請求項３９、４０、または４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 請求項３１～３６のいずれか一項に記載の方法によって得られうる、または得られた、改変されたＴｒｅｇ。
  46. 請求項２８または４５に記載の改変されたＴｒｅｇを含む医薬組成物。
  47. 対象における移植組織に対する寛容の誘発に使用するための、または、対象における移植拒絶反応、または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療および／または予防に使用するための、請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクター、請求項２８または４５に記載の改変されたＴｒｅｇ、または請求項４６に記載の医薬組成物。
  48. 対象における移植組織に対する寛容を誘発する方法、または、対象における移植拒絶反応またはＧｖＨＤを治療および／または予防する方法であって、請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクター、請求項２８または４５に記載の改変されたＴｒｅｇ、または請求項４６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  49. 下記工程を含む、請求項４８に記載の方法であって、
    （ｉ）前記対象から細胞含有サンプルを単離または提供する工程であって、前記細胞含有サンプルはＰＢＭＣを含むか、またはＰＢＭＣからなる工程と、
    （ｉｉ）請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクターを前記細胞含有サンプルに導入する工程とを含み、
    前記細胞含有サンプルは、Ｔｒｅｇを含むか、またはＰＢＭＣからなり、および／または請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルからのＴｒｅｇが富化され、および／または請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクターを導入する前または後に前記細胞含有サンプルからＴｒｅｇが生成される、方法。
  50. 前記対象がヒトである、請求項４７に記載の使用のためのベクター、改変されたＴｒｅｇ、または医薬組成物、もしくは請求項４８または４９に記載の方法。
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