JP2022551600A - 循環腫瘍細胞を標的化するための血小板の操作方法 - Google Patents

Abstract

本明細書において、分割毒素を含む抗体を作製するための遺伝子回路を構築するために使用され得る核酸構築物が開示される。また本明細書において、抗体を含む血小板を作製する方法も開示される。本明細書に開示される方法により作製される血小板を使用して、循環腫瘍細胞を標的とすることができる。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１日に出願された米国仮出願第６２／９０８，８７４号の出願日の利益を主張する。先に出願された当該出願の内容は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。

配列表の組み込み
本出願は、出願の出願と同時にＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、配列表のファイル名は、２１１０１＿０３７６Ｐ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇであり、４２３バイトのサイズであり、２０２０年８月３１日に作成され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

癌は、米国において第２位の死因である。毎年、１００万人を超える人々が癌と診断され、５０万人を超える人々が癌により死亡している（Ｓｏｃｉｅｔｙ ＡＣ．Ａｔｌａｎｔａ：２０１２）。癌関連死のうちの９０％超は、転移が原因である（Ｌｏｕ ＸＬ，ｅｔ ａｌ，，Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；２７（５）：４５０－６０）。癌は非常に活発な研究分野であり続けているが、根治的な治療は依然として困難である。癌は拡散すると制御が困難となるため、癌と診断された患者の治療における根本的課題は、転移の予防である（Ｇａｙ ＬＪ，Ｆｅｌｄｉｎｇ－Ｈａｂｅｒｍａｎｎ Ｂ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１；１１（２）：１２３－３４）。転移癌に対する現在の治療法は、例えば化学療法などの全身的な治療を必要とし、癌の増殖を停止または減速させるか、または癌による症状の緩和が目的である（Ｇｋｏｕｎｔｅｌａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，ＥＳＭＯ Ｏｐｅｎ ２０１６；１（４）：ｅ００００７８）。全身治療は、吐き気、嘔吐、神経障害、臓器および組織の損傷、ならびに免疫不全をはじめとする他の健康問題を引き起こし得るため、多くの患者にとって辛いものである（Ｌｏｖｅ ＲＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ １９８９；６３（３）：６０４－１２）。同様に、標的化薬剤を使用している患者も常に再発に直面し、薬剤抵抗性を発現させている。その原因は主に代替経路の活性化である（Ｄｉａｚ ＬＡ，Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１２；４８６（７４０４）：５３７－４０；およびＭｉｓａｌｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１２；４８６（７４０４）：５３２－６）。さらに患者間で癌特異的バイオマーカーの発現レベルが異なるため、一部の患者には有効な薬剤が、他の患者には効果がない、または重大な副作用が生じる場合がある（Ｌｅｎｚ ＨＪ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ ２００６；５８７：２１１－３１）。したがって、様々な患者に適用することができ、広範な腫瘍細胞を除去しながら、全身的な副作用を回避する様な治療法が非常に望ましい。

本明細書において、ａ）ｉ）第一の組み換え部位、ｉｉ）ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、およびＢＣＬ－ＸＬ、ならびにｉｉｉ）第二の組み換え部位、に動作可能に連結されたプロモーター、ならびにｂ）操作された抗体配列をコードすることができる配列、を含む核酸構築物が開示され、この場合において当該操作された抗体配列は、インテイン配列に隣接される分割毒素配列を含み、およびこの場合において当該操作された抗体配列をコードすることができる配列は、当該プロモーターのフレーム外にある。

本明細書において、核酸構築物を含む巨核球が開示され、この場合において当該核酸構築物は、ｉ）第一の組み換え部位、ｉｉ）第二の組み換え部位、およびｉｉｉ）操作された抗体配列をコードすることができる配列に動作可能に連結されたプロモーターを含み、この場合において当該操作された抗体配列は、インテイン配列に隣接される分割毒素配列を含み、この場合において当該操作された抗体配列をコードすることができる配列は、当該プロモーターとフレーム内にある。

本明細書において、ａ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体であって、当該インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、およびこの場合において、当該分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端にあるもの、ｂ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体であって、当該インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、およびこの場合において、当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端にあるもの、またはｃ）第一のインテイン断片により隣接される第一の分割毒素配列を含む第一のＦｃ領域、および第二のインテイン断片により隣接される第二の分割毒素配列を含む第二のＦｃ領域、を含む、操作された抗体であって、この場合において当該第一のインテイン断片は、インテインＮ断片を含み、この場合において、当該第一の分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端にあり、当該第二のインテイン断片は、インテインＣ断片を含み、この場合において当該第二の分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端にあるもの、を含む操作された巨核球が開示される。

本明細書において、ａ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体であって、当該インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、およびこの場合において、当該分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端にあるもの、ｂ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体であって、当該インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、およびこの場合において、当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端にあるもの、またはｃ）第一のインテイン断片により隣接される第一の分割毒素配列を含む第一のＦｃ領域、および第二のインテイン断片により隣接される第二の分割毒素配列を含む第二のＦｃ領域、を含む、操作された抗体であって、この場合において当該第一のインテイン断片は、インテインＮ断片を含み、この場合において、当該第一の分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端にあり、当該第二のインテイン断片は、インテインＣ断片を含み、この場合において当該第二の分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端にあるもの、を含む操作された血小板が開示される。

本明細書において、ａ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む、操作された抗体を含む操作された血小板の第一の亜群であって、当該インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、当該分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端であるもの、およびｂ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む、操作された抗体を含む操作された血小板の第二の亜群であって、当該インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端であるもの、を含む操作された血小板の群が開示される。

本明細書において、操作された抗体が開示され、当該操作された抗体は、第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域を含み：ａ）当該第一のＦｃ領域は、インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含み、当該インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、当該分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端であり、およびｂ）当該第二のＦｃ領域は、インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含み、当該インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端である。

本明細書において、操作された抗体が開示され、当該操作された抗体は、Ｆｃ領域を含み、当該Ｆｃ領域は：ａ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列であって、当該インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、当該分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端であるもの、またはｂ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列であって、当該インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端であるもの、を含む。

図１Ａ～Ｅは、疾患治療用の送達システムとしての操作された血小板を示す。図１Ａは、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）における細胞の歪み、不活化および破壊を示す。 図１Ｂは、巨核球が細胞質の伸長から血小板を形成すること、およびこれらの形成された血小板が生物活性タンパク質で満たされることを示す。 図１Ｃは、リソソーム酵素で満たされた操作された血小板を示す。 図１Ｄは、操作されていない血小板が、トロンビンおよび他の低分子により活性化されることを示す。 図１Ｅは、操作されたデザイナー受容体が、血小板に対するデザイナードラッグ（ＤＲＥＡＤＤ）により排他的に活性化され、それにより当該受容体が、薬学的に不活性な低分子に結合して、内因性分子にはもはや結合しないことを示す。 図２は、ＨＳＣ分化の概要を示す。ＨＳＣは複能性幹細胞であり、様々な前駆細胞へと分化する潜在能力を有し、前駆細胞はより専門化された血液細胞となる。 図３Ａ～Ｄは、ＨＳＣの増殖と潜在能力を評価する方法を示す。図３Ａは、（ｉ）マウス骨髄から単離された細胞、（ｉｉ）指定された日数、Ｄｅｘｔｅｒ培養物中で増殖した細胞、（ｉｉｉ）ＭｅｔｈｏＣｕｌｔに移された細胞、および（ｉｖ）系統が確立したコロニーの数が経時的に計数されたこと、を示す。 図３Ｂは、マウス骨髄から単離された細胞を、（ｉ）ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ中で７日間増殖させ、および（ｉｉ）ＣＤ４１とＣＤ４５で標識して、それらの分化を評価したことを示す。ＣＤ４１は、血小板（Ｐ４ゲート内の細胞、ピンク色）を標識し、ＣＤ４５は、すべての血液系統の有核細胞（Ｐ３ゲート内の細胞、青色）を標識する。両方で標識された細胞（Ｐ２ゲート内の細胞、緑色）は、ＭＫおよび前駆細胞である。 図３Ｃは、骨髄由来のＬＳＫ＋細胞（ＨＳＣ）をソートし、ＯＰ９間質細胞上で８日間増殖させたことを示す。 図３Ｄは、ＥＳ細胞をＯＰ９間質細胞上で９日間増殖させ、ＬＳＫ＋細胞をフローサイトメトリーにより検出した（Ｐ３ゲート内の細胞、青色）ことを示す。 図４Ａ～Ｄは、Ｒｏｓａ２６座位のランディングパッドを示す。図４Ａは、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、マウスＥＳ細胞のＲｏｓａ２６アレル内に挿入された３ｘ ａｔｔＰ部位を示す。 図４Ｂは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼを使用することで、遺伝子回路がＲｏｓａ２６アレルを標的とし、安定的に統合され得ることを示す。 図４Ｃは、統合を確認するためのＰＣＲスクリーニングの結果を示す。 図４Ｄは、スクリーニングプライマーを使用した、マウス由来のｃＤＮＡのＰＣＲ結果を示す。レーン１：２－ｌｏｇのラダー、レーン２：統合が無い野生型、レーン３：ランディングパッドの挿入。 図５Ａ～Ｃは、循環腫瘍細胞の標的化破壊のために操作された血小板を示す図である。図５Ａは、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）が原発腫瘍から離れ、血流中に入り、他の組織に侵入したときに、転移が発生することを示す。ＣＴＣは、ＣＴＣを囲む血小板の助けを借りて血流中で生存する。ＣＴＣは血小板を活性化することができ、血小板は、自身のタンパク質内容物を分泌する。 図５Ｂは、血小板を巨核球（ＭＫ）から作製して、生物活性タンパク質を作製し、血小板中にパッケージングし得ることを示す。 図５Ｃは、操作されたＭＫを、遺伝的ツールを使用して生物活性治療剤で満たし、血流を離れる前にＣＴＣを標的とし、死滅することができることを示す。 図６Ａ～Ｂは、標的のＣＴＣの死滅が示されている。図６Ａは、分割毒素タンパク質のα－サルシンのインテイン介在性の復元を示す。 図６Ｂは、分割毒素タンパク質を伴う操作されたモノクローナル抗体の概略図である。工程１：操作されたモノクローナル抗体は、ＣＴＣ特異的抗原を認識する。２：操作されたモノクローナル抗体は、細胞によって飲み込まれ、エンドソーム／リソソーム経路に入り、そこで当該操作されたモノクローナル抗体が処理され、および／または分解される。３．分割毒素タンパク質（分割α－サルシンタンパク質を図示）が細胞質に入る。４．インテインは、分割毒素タンパク質を自発的に再構築して、機能させる。５．毒性が極めて高いα－サルシンタンパク質は、細胞死を誘導する。 図７Ａ～Ｂは、ＬａｃＱ遺伝子回路の概略図である。図７Ａは、ＬａｃＩリプレッサータンパク質が構造的に発現されること（紫色）、ならびにＱＦ（オレンジ色）およびＧＦＰ（緑色）の上流のｌａｃオペレーター部位に結合することを示す。 図７Ｂは、ＩＰＴＧが存在するとき、ＬａｃＩタンパク質に結合し、リプレッサータンパク質の立体構造変化が生じることを示す。 図８Ａ～Ｆは、ＥＳ細胞においてＬａｃＱが遺伝子発現を制御することを示す。ＩＰＴＧの非存在下での安定的トランスフェクトされたＥＳ細胞について、図８Ａは、明視野画像を示し、 図８Ｂは、蛍光画像を示す。 １００μＭ ＩＰＴＧの存在下で２４時間後の安定的トランスフェクトされたＥＳ細胞について、図８Ｃは、明視野画像を示し、図８Ｄは、蛍光画像を示す。 同上。 図８Ｅは、異なる量のＩＰＴＧを添加することによって、ＥＳ細胞における遺伝子発現のレベルをＬａｃＱが調整し得ることを示す。増殖培地にＩＰＴＧを添加してから２４時間後（薄青色）および４８時間後（濃青色）に、フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰを定量した。 図８Ｆは、１００μＭのＩＰＴＧを２日間添加し、次いで培地からＩＰＴＧを除去することによる、ＬａｃＱ－ＧＦＰのスイッチング動態をフローサイトメトリーを使用して実験したことを示す。各データ点は、三つの独立した実験におけるＧＦＰ発現の平均を表し、エラーバーは、これらの実験間の標準偏差を表す。 図９Ａ～Ｂは、血小板のインビトロ産生を示す。図９Ａは、血小板が、ＭＫを拡張するための３種の遺伝子（ｃ－ＭＹＣ、ＢＭｌ１、およびＢＣＬ－ＸＬ）を過剰発現させることにより、ｉＰＳ細胞から作製され得ること、そしてそれらの発現がオフになると、成熟ＭＫは、乱流の存在下で血小板を産生し得ることを示す。 図９Ｂは、Ｃｒｅの非存在下では、３種の遺伝子はオンのままであり、装填用の遺伝子はオフであることを示している。Ｃｒｅリコンビナーゼに曝露されると、ＤＮＡは相同組み換えを経て、３種の遺伝子を切り出し、血小板内に装填されるタンパク質に対する遺伝子の発現をオンにする。

本開示は、本発明の以下の詳細な説明、本明細書に含まれる図面および実施例を参照することによって、より容易に理解することができる。

本発明の方法および組成物が開示および記載される前に、別段の指定がない限り、特定の合成方法に限定されないことが理解され、または別段の指定がない限り、特定の試薬に限定されないことが理解され、当然のことながら変化し得る。本明細書で使用される用語は、特定の態様のみを説明するためにあり、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および材料はここで説明される。

さらに、別段の明示的な言及がない限り、本明細書に記載のいずれの方法も、その工程が特定の順序で実施されることを要求していると解釈されることは決して意図されていない。従って、方法の請求項が、その工程が従うべき順序を実際に列挙していない場合、または工程が特定の順序に限定されることを特許請求の範囲または説明において別途具体的に記載されていない場合、いかなる点においても、順序が推測されることは決して意図されていない。これは、工程の配設または操作フローに関する論理的な問題、文法的な構成または句読点に由来する平易な意味、明細書に記載の態様の数またはタイプを含む、解釈のためのあらゆる可能性のある不明確な根拠にも当てはまる。

本明細書に言及される全ての刊行物は、その刊行物が引用されることに関連して、方法および／または材料を開示し記述するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記述された刊行物は、本出願の出願日に先行してこれらの開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなることも、本発明が先行発明によってかかる公表に先行する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、本明細書に提供される公表日は、実際の公表日と異なっている可能性があり、これは独立した確認を必要とする場合がある。

定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によって明確に別の規定が示されない限り、複数の参照を含む。

本明細書で使用される「または」という語は、特定のリストのうちの任意の一つのメンバーを意味し、またそのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。

本明細書において、範囲は「約」または「およそ」一つの特定の値からおよび／または「約」または「およそ」別の特定の値までであるとして表現することができる。こうした範囲が表現される場合、さらなる態様は、ある特定の値からおよび／またはもう一方の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行する「約」または「およそ」の使用によって、特定の値がさらなる態様を形成することが理解されるであろう。範囲の各々の端点は、他の端点との関連において、および他の端点とは独立して、重要であることがさらに理解されるであろう。また、本明細書に開示されるいくつかの値があり、各値も、値自体に加えて、その特定の値について「約」として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。当然のことながら、二つの特定の単位間の各単位も開示されている。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３および１４も開示される。

本明細書で使用される「任意選択的」または「任意選択的に」という用語は、後に説明される事象または状況が生じる場合もあり、または生じない場合もあることを意味し、また、その説明が先述の事象または状況が生じる事例および生じない事例を含むことを意味する。

本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、対象からの組織または臓器、細胞（対象内、対象から直接採取された、または培養もしくは培養細胞株から維持された細胞のいずれか）、細胞可溶化物（または可溶化物分画）または細胞抽出物、または本明細書に記載されるようにアッセイされた細胞もしくは細胞材料（例えばポリペプチドまたは核酸）に由来する一つ以上の分子を含有する溶液を意味する。試料はまた、細胞または細胞成分を含有する任意の体液または排泄物（例えば、限定されないが、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁）であってもよい。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、投与の標的、例えば、ヒトを指す。したがって、本開示の方法の対象は、哺乳類、魚、鳥類、虫類または両生類などの脊椎動物であることができる。「対象」という用語はまた、家畜動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）および実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）も含む。一態様では、対象は哺乳類である。別の態様では、対象はヒトである。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、成人、小児、青年および新生児の対象、ならびに胎児は、雌雄にかかわらず、網羅されることが意図される。

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、疾患または障害に罹患した対象を指す。「患者」という用語は、ヒトおよび獣医学対象を含む。本開示の方法の一部の態様では、「患者」は、例えば、投与工程の前に、癌の治療を必要とするとして診断されている。

本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「～からなる」および「本質的に～からなる」態様を含み得る。

「ベクター」または「構築物」という用語は、細胞内に、ベクター配列が連結された別の核酸を輸送することができる核酸配列を指す。用語「発現ベクター」は、細胞による発現に適した形態の遺伝子構築物を含有する（例えば、転写制御因子に連結されている）任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミド、またはファージ染色体）を含む。「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの一般的に使用される形態である際に、互換的に使用される。さらに、本発明は、同等の機能を果たす他のベクターを含むことが意図されている。

「発現ベクター」という用語は、本明細書では、それらが動作可能に連結された遺伝子の発現を誘導することができるベクターを指す。組み換えＤＮＡ技術において、実用性のある普遍的な発現ベクターは多くの場合、プラスミドの形態である。組み換え発現ベクターは、本明細書に開示される核酸を、宿主細胞における当該酸の発現に適した形態含むことができる。言い換えると、組み換え発現ベクターは、一つ以上の制御エレメントまたはプロモーターを含むことができ、それらは発現に使用される宿主細胞に基づいて選択されることができ、発現される核酸配列に動作可能に連結される。

「対象の配列」または「対象の遺伝子」という用語は、導入される細胞に対して、部分的または完全に異種である、すなわち外来性である核酸配列（例えば、治療用遺伝子）を意味する場合もある。

「対象の配列」または「対象の遺伝子」という用語はまた、導入される細胞の内因性の遺伝子に対して、部分的または完全に異種であるが、ゲノムを変化させるような方法（例えば、天然遺伝子とは異なる位置に挿入されるか、またはその挿入が「ノックアウト」を生じさせる）で細胞のゲノム内に挿入されるよう設計される核酸配列を意味する場合もある。例えば、対象の配列は、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、またはｍＲＮＡであり得る。

「対象の配列」または「対象の遺伝子」という用語はまた、導入される細胞の内因性遺伝子に対して、部分的または完全に相補的な核酸配列を意味する場合もある。

「対象の配列」または「対象の遺伝子」には、一つ以上の転写制御配列、および任意の他の核酸、例えば選択核酸の最適な発現に必要であり得るイントロンを含むこともできる。「対象のタンパク質」とは、対象の配列または対象の遺伝子から発現されるペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、治療用タンパク質）を意味する。

「動作可能に連結された」という用語は、別の核酸配列との核酸の機能的な関係性を指す。プロモーター、エンハンサー、転写停止部位および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列は、他の配列に動作可能に連結される核酸配列の例である。例えば、転写制御エレメントへのＤＮＡの動作可能な連結は、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的および機能的な関係性を指し、それにより、当該ＤＮＡの転写は、当該ＤＮＡを特異的に認識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによって当該プロモーターから開始される。

「阻害する」、「阻害すること」、および「阻害」とは、活性、反応、状態、疾患、または他の生物学的パラメータを弱める、または減少させることを意味する。これには、活性、反応、状態、または疾患の完全な消去が含まれうるが、これらに限定されない。これにはまた、例えば、天然レベルまたは対照レベルと比較した、活性、反応、状態、または疾患の１０％の阻害または低下も含まれ得る。したがって、一部の態様では、阻害または低下は、天然レベルまたは対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量の低下であり得る。一部の態様では、阻害または低下は、天然レベルまたは対照レベルと比較して、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、または９０～１００％である。一部の態様では、阻害または低下は、天然レベルまたは対照レベルと比較して、０～２５、２５～５０、５０～７５、または７５～１００％である。

本明細書で使用される場合、「調節する」、「調節すること」および「調節」とは、活性または機能または数の変化を意味する。変化は、活性、機能または数の増加または減少、強化または阻害であり得る。

「変える」または「調節する」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用されることができ、例えば、細胞内のヌクレオチド配列の発現について言及する場合、本明細書に記載される方法を適用した後に、細胞内のヌクレオチド配列の発現のレベルが、当該方法の適用前の細胞における発現のレベルとは異なることを意味する。

「促進する」、「促進」および「促進すること」とは、活性、反応、状態、疾患または他の生物学的パラメータにおける増加を指す。これには、活性、反応、状態、または疾患の開始が含まれうるが、これらに限定されない。これにはまた、例えば、天然レベルまたは対照レベルと比較した、活性、反応、状態、または疾患の１０％の増加も含まれ得る。したがって、一部の態様では、増加または促進は、天然レベルまたは対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはそれ以上、またはその間の任意の量の促進であり得る。一部の態様では、増加または促進は、天然レベルまたは対照レベルと比較して、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、または９０～１００％である。一部の態様では、増加または促進は、天然レベルまたは対照レベルと比較して、０～２５、２５～５０、５０～７５、または７５～１００％、またはそれ以上、例えば、２００、３００、５００、または１０００％よりも多い。一部の態様では、増加または促進は、天然レベルまたは対照レベルと比較して、１００パーセントよりも高く、例えば、天然レベルまたは対照レベルと比較して、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００％、またはそれよりも高い。

本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲシステム」および「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子の発現または誘導に関与する転写物および他のエレメントを指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈においては「スペーサー」と呼称される場合もある。例えば、ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡなど）、またはＣＲＩＳＰＲ座位に由来する他の配列および転写物が挙げられる。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲシステムの一つ以上の要素は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲシステムの一つ以上の要素は、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）などの内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物体に由来する。概してＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位で、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において、プロトスペーサーとも呼称される）により特徴付けられる。

本明細書で使用される場合、「疾患」または「障害」または「状態」という用語は、相互交換可能に使用され、身体の状態、または器官のうちのいくつかの状態における任意の変化、例えば罹患したヒト、またはヒトと接触した者に対して、不快感、機能不全、苦痛、またはさらには死など、機能の遂行を妨害すること、もしくは攪乱すること、および／または症状を生じさせることを指す。疾患または障害または状態は、不調、病弱、病気、病弊、障害、疾病、不健康、不満、または愛着に関連する場合もある。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」、「プロモーターエレメント」、または「プロモーター配列」という用語は均等であり、本明細書で使用される場合、対象のヌクレオチド配列に動作可能に連結されるとき、ｍＲＮＡへの対象のヌクレオチド配列の転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、必ずではないが典型的には、（例えば、構造遺伝子の転写開始部位の近位にある）対象ヌクレオチド配列の５’（すなわち上流）に配置され、ｍＲＮＡへの対象ヌクレオチド配列の転写は、プロモーターが制御し、ＲＮＡポリメラーゼや、転写開始のための他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。

好適なプロモーターは、発現が発生するはずの宿主細胞の遺伝子に由来してもよく、または当該宿主細胞に対する病原体に由来してもよい（例えば、組織プロモーターまたは病原体様ウイルス）。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は、誘導剤に応答して増加する。対照的に、プロモーターが構造性プロモーターである場合、転写速度は、誘導剤によって制御されない。また、プロモーターは、組織特異的な様式、または組織選好的な様式で制御されてもよく、それにより、例えば葉、根、または分裂組織などの特定の組織型において、関連するコード領域の転写においてのみ活性となる。プロモーターに適用される場合、「組織特異的」という用語は、異なるタイプの組織においては同じ対象ヌクレオチド配列または対象遺伝子が相対的に発現しない状況下で、特定のタイプの組織に対する対象ヌクレオチド配列または対象遺伝子の選択的発現を誘導することができるプロモーターを指す。

前述の発明は、理解の明確化の目的で、例示および実施例によってある程度詳細に説明されてきたが、ある特定の変更および修正が、添付の特許請求の範囲の範囲内で実践される場合がある。

本明細書において言及される全ての公表文献および特許出願は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。すべての公表文献および特許出願は、個々の公表文献または特許出願が具体的に、および個々に参照により援用されることが示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。

癌関連死の９０％超が、転移によって生じている⁸。このため、癌研究における重要な目標は転移を制限することである。転移は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）とも呼ばれる一部の癌細胞が原発腫瘍部位から離れて血流に入り、異なる場所で他の組織および器官に侵入するときに発生する。ＣＴＣが血流に入ると、ＣＴＣは免疫学的攻撃、せん断力、およびアポトーシスをはじめとする多くの生存をかけた困難に直面する。生存率を高めるためにＣＴＣは血小板を強く引き付けて保護クロークを形成させる。保護クロークは、癌細胞が血流中の影響力を生き延び、免疫学的監視を逃れるのを助ける（Ｅｒｐｅｎｂｅｃｋ Ｌ，Ｓｃｈｏｎ ＭＰ．Ｂｌｏｏｄ ２０１０；１１５（１７）：３４２７－３６；Ｌａｂｅｌｌｅ Ｍ，Ｈｙｎｅｓ ＲＯ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１２；２（１２）：１０９１－９；Ｓｔｅｇｎｅｒ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１４；１３３ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１４９－５７；Ｌｏｕ ＸＬ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；２７（５）：４５０－６０；Ｇａｙ ＬＪ，Ｆｅｌｄｉｎｇ－Ｈａｂｅｒｍａｎｎ Ｂ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１；１１（２）：１２３－３４；Ｌｉ Ｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１６；１３８（９）：２０７８－８７；Ｂｏｒｓｉｇ Ｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００８；８（８）：１２４７－５５；Ｈｏｎｎ ＫＶ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ １９９２；１１（３－４）：３２５－５１；Ｗａｒｄ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０１８；２３（３）：８０８－２２；およびＹｕ ＬＸ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１４；５：５２５６）。血小板が循環腫瘍細胞と相互作用するメカニズムはあまり解明されていないが、研究により、血小板は癌の進行、特に転移中に関与しており、血小板は細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の分解を補助し、元々の腫瘍形成部位から遠い場所で癌細胞がコロニー形成するのをサポートしていることが示されている（Ｇａｙ ＬＪ，Ｆｅｌｄｉｎｇ－Ｈａｂｅｒｍａｎｎ Ｂ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１；１１（２）：１２３－３４；Ｌｉ Ｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１６；１３８（９）：２０７８－８７；Ｂｏｒｓｉｇ Ｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００８；８（８）：１２４７－５５；およびＨｏｎｎ ＫＶ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ １９９２；１１（３－４）：３２５－５１）。

骨髄において、血小板は、造血幹細胞（ＨＳＣ）が専門化された血液細胞や免疫細胞に分化する造血プロセスから誘導され（図２）（Ｃｈａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ：ＪＴＨ ２００７；５ Ｓｕｐｐｌ １：３１８－２７）、造血、創傷治癒、血管新生、炎症および凝血塊形成に重要な役割を果たしている（Ｃｈａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ：ＪＴＨ ２００７；５ Ｓｕｐｐｌ １：３１８－２７；Ｋｕｔｅｒ ＤＪ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１０；４７（３）：２４３－８；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＪ，Ｕｃｈｉｄａ Ｎ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＩＬ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １９９５；１１：３５－７１；およびＭｏｓａａｄ ＹＭ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｓｃｉｅｎｃｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈａｅｍａｐｈｅｒｅｓｉｓ ２０１４；５１（３）：６８－８２）。非常に多くの血小板が全身で循環しており、平均寿命は９～１０日である。この巨大細胞集団の源は、その前駆細胞である巨核球（ＭＫ）に由来する。概して血小板は休止状態で不活性であり、活性化される前にトリガーを必要とする。活性化すると、血小板は細胞内顆粒から３００を超える活性生体分子を分泌する。そのため、血小板は以下のような多くの固有の特徴を保有しており、それゆえにＣＴＣ標的化、および天然搭載物や合成搭載物のインビボ送達に対する魅力的な候補となっている：１）血小板は、循環腫瘍細胞と自然に関連している、２）体内に広範囲の循環域を有している、３）血小板は、無核細胞である、４）血小板は、生体適合性がある、５）ヒトにおける血小板の平均寿命は約１０日である、および６）活性化後、血小板のタンパク質顆粒は分泌小胞として機能し、成分を細胞外流体に放出する。本明細書に開示される組成物および方法は、血小板が循環腫瘍細胞と自然に関連すること、そして低分子を保管、輸送および放出する血小板の能力を利用して、ＣＴＣを標的化および破壊して転移を予防または最小化するための次世代送達方法の開発のための送達ビヒクルとして、血小板を操作するものである。また本明細書において、多能性細胞の分化を誘導して、インビトロで操作された抗体を装填された血小板を生成することができる遺伝子回路の開発が開示され、ならびに操作された血小板が治療用搭載物（例えば、操作された抗体、分割インテイン（ｓｐｌｉｔ ｉｎｔｅｉｎｓ）、または分割毒素）を放出する時と場所を制御して、血小板の空間的および時間的な活性を再プログラミングするための、血小板用遺伝子ツールを開発するための計算モデリングおよびコンピュータシミュレーションが開示される。

インテインは、タンパク質スプライシングとして知られるプロセスにおいて、２つの前駆体断片から共有結合的にタンパク質を再構築するタンパク質要素である。当該プロセスは自然発生し、外因性のエネルギーまたは補因子を必要としない（Ｐｅｒｌｅｒ ＦＢ．ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ２００５；５７（７）：４６９－７６；Ｗｏｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２０１３；２６（３）：２０７－１３；およびＮｏｇａｍｉ Ｓ，Ｓａｔｏｗ Ｙ，Ｏｈｙａ Ｙ，Ａｎｒａｋｕ Ｙ．Ｐｒｏｂｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｖｍａ１ ｐｒｏｔｏｚｙｍｅ：ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９７；１４７（１）：７３－８５）。インテイン技術は多くのアプリケーションで活用されている。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳｃｅＶＭＡインテインの条件付きタンパク質スプライシングは、人工的に分割させ、別々になった半分を不活性な状態にさせて、共局在と構築のためには条件を必要とさせることができる（Ｍｏｏｔｚ ＨＤ，Ｍｕｉｒ ＴＷ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００２；１２４（３１）：９０４４－５）。トランス－スプライス－誘導条件のレパートリーは拡張され、現在では温度、光、およびタンパク質－スキャホールド活性化も含まれる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＥＣ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２００７；３（１）：５０－４；Ｓｅｌｇｒａｄｅ ＤＦ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１３；１３５（２０）：７７１３－９；Ｔｙｓｚｋｉｅｗｉｃｚ ＡＢ，Ｍｕｉｒ ＴＷ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ２００８；５（４）：３０３－５；およびＺｅｉｄｌｅｒ ＭＰ，ｅｔ ａｌ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００４；２２（７）：８７１－６）。本明細書に記載されるように、この技術を使用して毒素を２つの対応する分割毒素配列へと分割することができる。例えばリボソーム不活性化タンパク質であるα－サルシンは、対応する不活性分割毒素配列へと分割されることができる毒素であり、その構築された活性型で細胞を殺傷する（図６）。不活性分割毒素のそれぞれが個別に生成され、ＣＴＣ上の異なる受容体を標的とする個別の血小板群内に装填されることができる。不活性分割毒素のそれぞれがＣＴＣ内に入ると、各毒素は自発的に構築されて、ＣＴＣを殺傷する。

本明細書において、循環腫瘍細胞を標的とし、破壊するよう設計される操作された血小板が開示される。細胞は複雑でダイナミックなシステムであり、生涯にわたってこれらのシグナルを連続的に感知し、統合し、保存し、および応答する優れた能力を有しており、細胞療法は次世代の癌治療にとって魅力的な手段である。血小板はＣＴＣと関連するため、ＣＴＣを標的化する癌治療の現場において魅力的である。多くの研究により、ＣＴＣは、血小板を誘引して結合するための様々な受容体を発現していること、結合すると、血小板の活性化と、その細胞内容物の放出を促進することが示されている（Ｌｏｕ ＸＬ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；２７（５）：４５０－６０；およびＹｕ ＬＸ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１４；５：５２５６）。合成生物学は、細胞を再プログラミングし得る方法を変革し、遺伝子部分をより複雑な遺伝子回路に組み立てることで、細胞挙動をより確実に、およびより予測可能に制御する手段を提供する（Ｗｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ ＭＳ，Ｄｅａｎｓ ＴＬ．Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１８；４５（７）：５９９－６１４）。血小板の前駆細胞である巨核球は、合成生物学を介した高レベルの再プログラミングに適している。本明細書において、ＣＴＣ受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体に融合された不活性分割毒素で満たされるように、血小板を設計する方法が記載される。分割毒素の各半分がＣＴＣによって内部移行されると、当該部分は自発的に構築されて機能的な毒性タンパク質が生成され、ＣＴＣを死滅させる。

組成物
遺伝子回路／核酸構築物。本明細書において、ｉ）第一の組み換え部位、ｉｉ）ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、およびＢＣＬ－ＸＬ遺伝子、ならびにｉｉｉ）第二の組み換え部位、に動作可能に連結されたプロモーター、ならびにｂ）操作された抗体配列をコードすることができる配列、を含む核酸構築物が開示され、この場合において当該操作された抗体配列は、インテイン配列に隣接される分割毒素配列を含み、およびこの場合において当該操作された抗体配列をコードすることができる配列は、当該プロモーターのフレーム外にある。一部の態様では、当該一つ以上のプロモーターは、制御可能であってもよい。一部の態様では、当該一つ以上のプロモーターは、一つ以上の培地調節因子によって調節されてもよい。一部の態様では、当該培地調節因子を使用して、幹細胞の分化を特定の細胞型へと誘導してもよい。一部の態様では、当該一つ以上の培地調節因子は、多能性幹細胞の巨核球への分化を促進してもよい。一部の態様では、当該一つ以上の培地調節因子は、巨核球の血小板への分化を促進してもよい。一部の態様では、当該一つ以上の培地調節因子は、多能性幹細胞の血小板への分化を促進してもよい。一部の態様では、当該一つ以上の培地調節因子は、イソプロピル β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、キナ酸、またはオーキシンであってもよい。一部の態様では、当該一つ以上の培地調節因子は、一つ以上のプロモーターを活性化してもよい。一部の態様では、当該一つ以上のプロモーターは、構造的に活性であってもよい。一部の態様では、当該一つ以上のプロモーターは、ＣＭＶ、ＲＳＶ、Ｕ６、ベータアクチン、または伸長因子プロモーターであってもよい。一部の態様では、第一または第二の組み換え部位は、ｌｏｘＰ、ａｔｔＰ、Ｂｘｂ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。一部の態様では、ｃ－ＭＹＣ遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、およびＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、第一の組み換え部位および第二の組み換え部位に隣接されてもよい。一部の態様では、操作された抗体配列の発現は、抑制されてもよい。一部の態様では、操作された抗体の発現は、リコンビナーゼ部位を切断する一つ以上のリコンビナーゼの存在下で誘導されてもよい。一部の態様では、当該一つ以上のリコンビナーゼは、Ｃｒｅ、ｐｈｉＣ３１、またはＢｘｂ１であってもよい。一部の態様では、当該一つ以上のリコンビナーゼは、リコンビナーゼ部位を切断し、操作された抗体配列を、プロモーターとフレーム内に導入してもよい。一部の態様では、操作された抗体配列は、第一のインテイン断片に隣接される分割毒素配列を含んでもよく、この場合において当該インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、この場合において当該分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端である。一部の態様では、操作された抗体配列は、インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含んでもよく、この場合において当該インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、この場合において当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端である。

分割毒素。本明細書で使用される場合、「分割毒素」または「分割毒素配列」という用語は、活性毒素配列の一部分または断片を意味するために使用され得る。活性毒素配列の２つの部分または断片は、活性毒素配列の別の部分もしくは断片に融合またはライゲーションされたとき、活性毒素複合体または活性毒素配列を形成することができる。分割インテインシステムを使用した毒素スプライシングは、活性毒素配列の人工断片化を使用し、活性毒素配列の各部分または断片を分割インテイン断片に繋ぎ合わせて、キメラ毒素－インテイン融合物を形成することができる。キメラ毒素－インテイン融合物の活性毒素配列の部分または断片は、活性毒素へと再構成されることができ、そのため、キメラ毒素－インテイン融合物の分割毒素配列は、標的細胞（例えば、循環腫瘍細胞）への取り込み後に分解されると、再結合される。これらのキメラ毒素－インテイン融合物は、分解するまで非毒性のままであり、分解するとインテインスプライシングの活性化、および毒素配列の部分もしくは断片の融合またはライゲーションが生じ、活性毒素配列または活性毒素複合体が形成される。毒素スプライシングシステムの操作および実装に関する検討としては、以下が挙げられる：毒素分割部位の選択、分割部位（エクステイン）の化学性、および温度感受性。

「相補的分割毒素配列」または「相補的分割毒素」という用語は、本明細書において、活性毒素配列の二つの部分または二つの断片を指し、それらは互いに融合またはライゲーションされたとき、活性毒素複合体または活性毒素配列を形成することができる。相補的分割毒素は、Ｎ分割毒素およびＣ分割毒素の部分または断片（例えば、分割毒素Ｃ断片（Ｃ末端断片）または分割毒素Ｎ断片（Ｎ末端断片））を指す場合もある。

分割インテインシステムを使用した毒素スプライシングは、活性毒素配列の人工断片化を使用して、分割毒素配列を形成することができる。分割毒素配列は、分割インテイン断片に繋ぎ合わされて、キメラ毒素－インテイン融合物を形成することができる（例えば、インテイン配列に隣接される分割毒素配列）。キメラ毒素－インテイン融合物の分割毒素配列は、活性毒素へと再構成されることができ、キメラ毒素－インテイン融合物の分割毒素配列は、標的細胞（例えば、循環腫瘍細胞）への取り込み後に分解された際に、再結合される。キメラ毒素－インテイン融合物は、分解するまで非毒性のままであり得、分解するとインテインスプライシングの活性化、および相補的分割毒素配列の融合またはライゲーションが生じ、活性毒素配列または活性毒素複合体が形成される。毒素スプライシングシステムの操作および実装に関する検討としては、以下が挙げられる：毒素分割部位の選択、分割部位（エクステイン）の化学性、および温度感受性。

一部の態様では、例えばアルファ－サルシンなどの毒素は、Ｎ末端断片（例えば、分割毒素Ｎ断片）およびＣ末端断片（例えば、分割毒素Ｃ断片）へと分割されてもよい。一部の態様では、アルファ－サルシンは、その構造に基づいて、Ｎ末端βヘアピン断片、およびＣ末端触媒断片へと分割されてもよい。図６Ｂを参照すると、操作された抗体が循環腫瘍細胞に飲み込まれ、エンドソーム／リソソーム経路に入り、分解される。インテイン断片に隣接される分割毒素配列であって、当該インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列、およびインテイン断片に隣接される分割毒素配列であって、当該インテイン断片は、インテインＮ断片を含む分割毒素配列が、細胞質に入る。インテインＮ断片を含むインテイン断片は、インテインＣ断片を含むインテイン断片に結合して、インテイン複合体を形成し、この場合において当該インテイン複合体は不活性である。インテインＮ末端に対してＮ末端である分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列に結合して、毒素複合体を形成し、この場合において毒素複合体は、活性である。インテインが再構成され、分割毒素はスプライシングされて、アポトーシスを誘導する。分割毒素の個々の断片構築物は、独立して発現された場合（例えば、分割毒素配列）、毒性はない。循環腫瘍細胞中での分解後、インテイン断片は再構成し、Ｎ－分割毒素配列とＣ－分割毒素配列を一緒にスプライシングして、機能的な毒素（例えばアルファ－サルシン）を形成する。

活性毒素およびそれらの各分割毒素をコードする核酸配列、ならびにそれらの対応するアミノ酸配列が公知である。

多能性幹細胞。本明細書において、多能性幹細胞が開示される。本明細書において、本明細書に開示される核酸構築物のいずれかを含む多能性幹細胞が開示される。本明細書において、本明細書に開示される遺伝子回路のいずれかを含む多能性幹細胞が開示される。一部の態様では、多能性幹細胞は、造血前駆幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。一部の態様では、多能性幹細胞は、臍帯血または骨髄から誘導される。一部の態様では、ｉＰＳＣは、血液細胞から誘導されてもよい。一部の態様では、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であってもよい。

巨核球。本明細書において、巨核球が開示される。本明細書において、任意の発生段階の巨核球が開示される。本明細書において、本明細書に記載される核酸構築物のいずれかを含む巨核球が開示される。本明細書において、核酸構築物を含む巨核球が開示される。一部の態様では、核酸構築物は、ｉ）第一の組み換え部位、ｉｉ）第二の組み換え部位、およびｉｉｉ）操作された抗体配列をコードすることができる配列に動作可能に連結されたプロモーターを含んでもよく、この場合において当該操作された抗体配列は、インテイン配列に隣接される分割毒素配列を含み、この場合において当該操作された抗体配列をコードすることができる配列は、当該プロモーターとフレーム内にある。本明細書において、ａ）第一のインテイン断片に隣接される分割毒素配列であって、この場合において当該分割毒素断片は、インテインＮ断片に対してＮ末端であるもの、ｂ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列であって、この場合において当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端であるもの、またはｃ）それらの組み合わせ、を含む操作された抗体配列が開示される。

また本明細書において、操作された抗体を含む操作された巨核球が開示される。一部の態様では、操作された巨核球は、ａ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体であって、当該インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、およびこの場合において、当該分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端にあるもの、ｂ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体であって、当該インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、およびこの場合において、当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端にあるもの、またはｃ）第一のインテイン断片により隣接される第一の分割毒素配列を含む第一のＦｃ領域、および第二のインテイン断片により隣接される第二の分割毒素配列を含む第二のＦｃ領域、を含む、操作された抗体であって、この場合において当該第一のインテイン断片は、インテインＮ断片を含み、この場合において、当該第一の分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端にあり、当該第二のインテイン断片は、インテインＣ断片を含み、この場合において当該第二の分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端にあるもの、を含んでもよい。一部の態様では、インテインＮ断片に対してＮ末端である分割毒素配列、およびインテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列、または第一および第二の分割毒素配列は、同じ毒素の連続した断片である。一部の態様では、インテインＮ断片に対してＮ末端である分割毒素配列、およびインテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列、または第一および第二の分割毒素配列は、α－サルシンの断片である。一部の態様では、インテインＣ断片およびインテインＮ断片、または第一および第二のインテイン断片は、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡインテインの断片である。一部の態様では、Ｆｃ領域、または第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域は、ＩｇＧ抗体またはその断片のＦｃ領域である。一部の態様では、ＩｇＧ抗体またはその断片は、腫瘍関連抗原認識部位を含んでもよい。一部の態様では、ＩｇＧ抗体またはその断片は、抗Ｈｅｒ－２抗体であってもよい。

血小板。本明細書において、血小板が開示される。本明細書において、操作された血小板が開示される。本明細書において、操作された抗体を含む操作された血小板が開示される。一部の態様では、操作された血小板は、ａ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体であって、当該インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、およびこの場合において、当該分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端にあるもの、ｂ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体であって、当該インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、およびこの場合において、当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端にあるもの、またはｃ）第一のインテイン断片により隣接される第一の分割毒素配列を含む第一のＦｃ領域、および第二のインテイン断片により隣接される第二の分割毒素配列を含む第二のＦｃ領域、を含む、操作された抗体であって、この場合において当該第一のインテイン断片は、インテインＮ断片を含み、この場合において、当該第一の分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端にあり、当該第二のインテイン断片は、インテインＣ断片を含み、この場合において当該第二の分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端にあるもの、を含んでもよい。一部の態様では、インテインＮ断片に対してＮ末端である分割毒素配列、およびインテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列、または第一および第二の分割毒素配列は、同じ毒素の連続した断片である。一部の態様では、インテインＮ断片に対してＮ末端である分割毒素配列、およびインテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列、または第一および第二の分割毒素配列は、α－サルシンの断片である。一部の態様では、インテインＣ断片およびインテインＮ断片、または第一および第二のインテイン断片は、Ｓ．セレビシエ ＳｃｅＶＭＡインテインの断片である。一部の態様では、Ｆｃ領域、または第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域は、ＩｇＧ抗体またはその断片のＦｃ領域である。一部の態様では、ＩｇＧ抗体またはその断片は、腫瘍関連抗原認識部位を含む。一部の態様では、ＩｇＧ抗体またはその断片は、抗Ｈｅｒ－２抗体であってもよい。

また本明細書において、操作された血小板の群が開示される。一部の態様では、操作された血小板の群は、ａ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む、操作された抗体を含む操作された血小板の第一の亜群であって、当該インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、当該分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端であるもの、およびｂ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む、操作された抗体を含む操作された血小板の第二の亜群であって、当該インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端であるもの、を含んでもよい。一部の態様では、インテインＮ断片に対してＮ末端である分割毒素配列、およびインテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列は、分割毒素の断片であり、再結合されたとき、活性毒素を形成する。一部の態様では、インテインＮ断片に対してＮ末端である分割毒素配列、およびインテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列は、α－サルシンの断片である。一部の態様では、インテインＣ断片およびインテインＮ断片は、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡインテインの断片である。一部の態様では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ抗体またはその断片のＦｃ領域である。一部の態様では、ＩｇＧ抗体またはその断片は、腫瘍関連抗原認識部位を含んでもよい。一部の態様では、ＩｇＧ抗体またはその断片は、抗Ｈｅｒ－２抗体であってもよい。

操作された抗体。本明細書において、操作された抗体が開示される。本明細書において、第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域を含む操作された抗体が開示され、ａ）当該第一のＦｃ領域は、インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含み、当該インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、当該分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端であり、およびｂ）当該第二のＦｃ領域は、インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含み、当該インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端である。一部の態様では、インテインＮ断片に対してＮ末端である分割毒素配列、およびインテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列は、分割毒素の断片であり、再結合されたとき、活性毒素を形成する。一部の態様では、インテインＮ断片に対してＮ末端である分割毒素配列、およびインテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列は、α－サルシンの断片である。一部の態様では、インテインＣ断片およびインテインＮ断片は、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡインテインの断片である。一部の態様では、第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域は、ＩｇＧ抗体またはその断片のＦｃ領域であってもよい。一部の態様では、ＩｇＧ抗体またはその断片は、腫瘍関連抗原認識部位を含んでもよい。一部の態様では、ＩｇＧ抗体またはその断片は、抗Ｈｅｒ－２抗体であってもよい。

本明細書において、操作された抗体が開示され、当該操作された抗体は、Ｆｃ領域を含み、当該Ｆｃ領域は：ａ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列であって、当該インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、当該分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端であるもの、またはｂ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列であって、当該インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端であるもの、を含む。一部の態様では、インテインＮ断片に対してＮ末端である分割毒素配列、およびインテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列は、分割毒素の断片であり、再結合されたとき、活性毒素を形成する。一部の態様では、インテインＮ断片に対してＮ末端である分割毒素配列、およびインテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列は、α－サルシンの断片である。一部の態様では、インテインＣ断片およびインテインＮ断片は、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡインテインの断片である。一部の態様では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ抗体またはその断片のＦｃ領域であってもよい。一部の態様では、ＩｇＧ抗体またはその断片は、腫瘍関連抗原認識部位を含んでもよい。一部の態様では、ＩｇＧ抗体またはその断片は、抗Ｈｅｒ－２抗体であってもよい。

血小板または血小板群の作製方法
本明細書において、血小板または血小板群を作製する方法が開示される。本明細書において、操作された抗体を含む血小板または血小板群を作製する方法が開示される。一部の態様では、方法は、ａ）本明細書に開示される核酸構築物のいずれかを含む多能性幹細胞を提供すること、ｂ）多能性幹細胞が巨核球へと拡張することが可能となる条件下で、培地中で多能性幹細胞を培養すること、ｃ）第一の組み換え部位と第二の組み換え部位との間の部位特異的組み換え事象を触媒するのに適した条件下で、巨核球をリコンビナーゼに暴露し、それによりｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＢＣＬ－ＸＬを切り出し、操作された抗体配列をコードすることができる配列をプロモーターとフレーム内に導入すること、およびｄ）巨核球を血小板へと分化させること、を含んでもよく、この場合において血小板は、操作された抗体配列によりコードされる操作された抗体を含む。一部の態様では、操作された抗体は、ａ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域であって、当該インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、およびこの場合において、当該分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端にあるもの、ｂ）インテイン断片により隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域であって、当該インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、およびこの場合において、当該分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端にあるもの、またはｃ）第一のインテイン断片により隣接される第一の分割毒素配列を含む第一のＦｃ領域、および第二のインテイン断片により隣接される第二の分割毒素配列を含む第二のＦｃ領域であって、この場合において当該第一のインテイン断片は、インテインＮ断片を含み、この場合において、当該第一の分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端にあり、当該第二のインテイン断片は、インテインＣ断片を含み、この場合において当該第二の分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端にあるもの、を含んでもよい。一部の態様では、培地は、一つ以上の培地調節因子を含んでもよい。一部の態様では、当該培地調節因子を使用して、幹細胞の分化を特定の細胞型へと誘導してもよい。一部の態様では、当該一つ以上の培地調節因子は、多能性幹細胞の巨核球への分化を促進してもよい。一部の態様では、当該一つ以上の培地調節因子は、巨核球の血小板への分化を促進してもよい。一部の態様では、当該一つ以上の培地調節因子は、多能性幹細胞の血小板への分化を促進してもよい。一部の態様では、当該一つ以上の培地調節因子は、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、キナ酸、またはオーキシンであってもよい。一部の態様では、当該一つ以上の培地調節因子は、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）であってもよい。一部の態様では、リコンビナーゼは、Ｃｒｅであってもよい。一部の態様では、多能性幹細胞は、造血前駆幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。一部の態様では、多能性幹細胞は、臍帯血または骨髄から誘導されてもよい。一部の態様では、ｉＰＳＣは、血液細胞から誘導されてもよい。一部の態様では、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であってもよい。一部の態様では、インテインＮ断片に対してＮ末端である分割毒素配列およびインテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列、または第一の分割毒素配列および第二の分割毒素は、分割毒素の断片であり、再結合されたとき、活性毒素を形成する。一部の態様では、インテインＮ断片に対してＮ末端である分割毒素配列、およびインテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列、または第一の分割毒素配列および第二の分割毒素配列は、α－サルシンの断片である。一部の態様では、インテインＣ断片およびインテインＮ断片は、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡインテインの断片であり、または第一のインテイン断片および第二のインテイン断片は、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡインテインの断片である。一部の態様では、Ｆｃ領域、または第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域は、ＩｇＧ抗体またはその断片のＦｃ領域である。一部の態様では、ＩｇＧ抗体またはその断片は、腫瘍関連抗原認識部位を含んでもよい。一部の態様では、ＩｇＧ抗体またはその断片は、抗Ｈｅｒ－２抗体であってもよい。一部の態様では、方法は、血小板を単離または精製することをさらに含んでもよい。

インテイン。本明細書に記載される組成物および方法のいずれかで使用されるインテインは、当業者に公知の方法を使用して単離およびクローニングされてもよい。本明細書に開示される核酸構築物および方法に有用なインテインは、市販もされている。一部の態様では、野生型インテインが所望の切断活性を呈さない限り、インテインは、Ｎ末端および／またはＣ末端の切断に関して操作されてもよい。一部の態様では、所望の切断特性を有する改変インテインは、インテイン配列内の一つ以上の残基、および／またはインテイン配列に隣接する一つ以上の残基を置換することにより、生成されてもよい。例えば、Ｎ末端切断活性を有する改変インテインは、最後のインテイン残基を変えることによって生成されてもよい。あるいは、最初のインテイン残基を変えることによって、Ｃ末端切断活性を有する改変インテインが生成されてもよい。

一部の態様では、インテインは、分割インテインであってもよい。本明細書で使用される場合、「分割インテイン」という用語は、以下の特性を有する、天然の状態から単離された、または組み換えＤＮＡ技術を介して生成されたタンパク質を指す：（１）タンパク質は２等分されて発生し、当該２等分は高いアフィニティと選択性で相互作用する；（２）当該２等分は、触媒活性に必要なすべてのインテイン配列を含まなければならず、および補足的な非インテインペプチド配列も含有し得る；（３）当該タンパク質は、当該２等分が緊密に関連付けられたときにのみ酵素活性を有する；および（４）酵素活性は、部位選択的なペプチドの切断またはライゲーションであり、その活性は、非インテインペプチド配列からインテイン配列を分離させる役割を果たし、または非インテインペプチド配列を連続的な線形タンパク質または環状タンパク質へとライゲーションさせる役割を果たす。

一部の態様では、インテインは、ノストック・パンクチホルメ（Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）に由来する天然分割インテインのＤｎａＥ、および／またはシネコキスティス種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）に由来するＳｓｐ、アファノセイス・ハロフィティカ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ）に由来するＡｈａ、アファニゾメノン・オバリスポルム（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ ｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍ）に由来するＡｏｖ、アナバエナ種に由来するＡｓｐ、アナバエナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）に由来するＡｖａ、シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ）に由来するＣｒａ（ＣＳ５０５）、シアノチレセ種（ＣｙａｎｏｔｉＩｅｃｅ）に由来するＣｓｐ（ＣＣＹＯｌｌＯ）、シアノセイス種（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐｅｃｉｅｓ）に由来するＣｓｐ （ＰＣＣ８８０１）、クロコスファエラ・ワトソニイ（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ）に由来するＣｗａ、ミクロキスティス・アエルギノーザ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来するＭａｅｒ（ＮＩＥＳ８４３）、ミクロコレウス・クトノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）に由来するＭｃｈｔ（ＰＣＣ７４２０）－２、オシラトリア・リムネチカ（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｌｉｍｎｅｔｉｃａ）に由来するＯｌｉ、シネココッカス・エロンゲート（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）に由来するＳｅｌ（ＰＣ７９４２）、シネココッカス種に由来するＳｓｐ［ＰＣＣ７００２）、テルンロシネココッカス・エロンゲート（Ｔｈｅｒｎｌｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）に由来するＴｅｌ、トリコデスミウム・エリスラエウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）に由来するＴｅｒ－３、テルンロシネココッカス・ブルカヌス（Ｔｈｅｒｎｌｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｖｕｌｃａｎｕｓ）に由来するＴｖｕからなる群から選択される分割インテインであってもよい。一部の態様では、インテインは、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡに由来する。

本明細書において、「相補的インテイン」という用語は、Ｎ－インテイン部分およびＣ－インテイン部分、または分割インテインペアの断片（例えば、インテインＣ断片またはインテインＮ断片）を指すために使用される。

本明細書において使用される場合、「Ｎ－インテイン」または「インテインＮ断片」という用語は、単一のインテインポリペプチドのＮ末端部分に対する相同性を有するインテインポリペプチドを指し、当該インテインポリペプチドは、相補的Ｃ－インテイン（またはインテインＣ断片）と関連付けられて、活性インテイン酵素を形成する。

本明細書において使用される場合、「Ｃ－インテイン」または「インテインＣ断片」という用語は、単一のインテインポリペプチドのＣ末端部分に対する相同性を有するインテインポリペプチドを指し、当該インテインポリペプチドは、相補的Ｎ－インテイン（またはインテインＮ断片）と関連付けられて、活性インテイン酵素を形成する。

本明細書で使用される場合、「エクステイン」という用語は、Ｎ－インテインおよびＣ－インテインに融合される性質であり、分割インテインの酵素作用を介して操作される（例えば、切断される、またはライゲーションされる）Ｎ末端ペプチド配列およびＣ末端ペプチド配列を指す。

本明細書で使用される場合、「ペプチドの」という用語は、２アミノ酸の長さよりも長いペプチドおよびタンパク質を指し、非アミノ酸分子（例えば、クロモフォア、薬剤、毒素、撮像造影剤など）を包含する場合もある。

インテインは自己触媒性酵素の一種であり、プロテアーゼ活性とリガーゼ活性の両方を含有し、当該活性は、これら分子の自然な寿命サイクルにおいて機能する。インテイン試薬は、ペプチド基質の切断、ライゲーション、および環状化に対する有用性を有していることが実証されている。１９９８年に、「分割インテイン」と呼ばれるインテインの新種が発見された。当該酵素は、Ｎ－インテイン（例えば、インテインＮ断片）とＣ－インテイン（例えば、インテインＣ断片）（相補的な半インテイン）と呼ばれる２つの部分に分かれて自然発生する。広範な低級原核生物において分割インテインが発見されている（Ｚｅｔｔｌｅｒ Ｊ．，ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５５３：９０９－９１４（２００９）；Ｄａｓｓａ Ｂ．，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４６：３２２－３３０（２００７）；Ｃｈｏｉ Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５５６：１０９３－１１０６（２００６）；Ｃａｓｐｉ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，．５０：１５６９－１５７７（２００３）；Ｌｉｕ Ｘ．ａｎｄ Ｙａｎｇ Ｊ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７５：２６３１５－２６３１８（２００３）；Ｗｕ Ｈ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．５：９２２６－９２３１（１９９８））。一方で真核生物では分割インテインは特定されていない。２つの分割インテインは、隣接するエクステイン配列に関して、しっかりと固定され、そしてかなり無差別的であることを特徴としている。一種は、Ｎｐｕ ＤｎａＥインテインであり（Ｉｗａｉ Ｉ．，ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５５０：１８５３－ １８５８（２００６）；Ｚｅｔｔｌｅｒ Ｊ．，ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５５３：９０９－９１４（２００９））、そして他の種はメタゲノムデータから特定されたＧＰ４１分割インテインである（Ｃａｒｖａｊａｌ－Ｖａｌｌｅｊｏｓ Ｐ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：２８６８６－２８６９６（２０１２）；国際特許出願公開ＷＯ２０１３０４５６３２）。

Ｎ－インテインおよびＣ－インテイン（例えば、インテインＮ断片およびインテインＣ断片）は、付加されるエクステイン（インテイン活性により結合される２つの半タンパク質）とともに、複数のドメイン間の相互作用を介して、極めて特異的に、および緊密に関連付けられ、活性インテイン酵素を形成する（Ｓｈａｈ Ｎ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３５：１８６７３－１８６８１；Ｄａｓｓａ Ｂ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３７：２５６０－２５７３（２００９））。一種目のインテインに存在するリガーゼ活性とプロテアーゼ活性に加えて、分割インテインは、Ｎ－インテインドメインとＣ－インテインドメイン（例えば、インテインＮ断片およびインテインＣ断片）の緊密で選択的な相互作用によって、アフィニティ分離における有用性を有している。

融合タンパク質。「融合タンパク質」という用語は、ペプチド結合により結合された二つ以上のポリペプチドのうちのすべて、または一部を含む、天然、合成、半合成、または組み換えによる単一のタンパク質分子を指す。例えば、Ｎ末端断片（例えば、分割毒素Ｎ断片）およびＣ末端断片（例えば、分割毒素Ｃ断片）などの相補的な分割毒素配列が一緒に結合されて、融合タンパク質を形成してもよい。

融合タンパク質またはキメラタンパク質を作製する方法は当分野に公知であり、限定されないが、標準的な組換えＤＮＡ技術が挙げられる。例えば、異なるタンパク質配列をコードするＤＮＡ断片（例えば、Ｎ－インテインおよび分割毒素断片、Ｃ－インテインおよび分割毒素断片であって、当該分割毒素断片は相補的な分割毒素（または相補的なエクステイン）である）は、従来的な技術に従ってインフレームで一緒にライゲーションされる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置をはじめとする従来的な技術によって合成されてもよい。

一部の態様では、Ｎ－インテイン断片およびＣ－インテイン断片および分割毒素配列（例えば、相補的な分割毒素配列）は、ペプチド結合を介して直接連結される。一部の態様では、融合タンパク質は、Ｎ－インテイン断片またはＣ－インテイン断片と、個々の相補的な分割毒素配列との間にスペーサー分子またはリンカー分子を含む。好適なスペーサー／リンカー分子は、当分野で公知である。

本明細書に記載される融合タンパク質において、インテインＮ断片は、直接的（例えば、ペプチド結合を介して）、または間接的（例えば、リンカーアミノ酸配列を介して）のいずれかで分割毒素配列（例えば、断片）に融合されてもよい。したがって一部の態様では、分割毒素配列は、インテインＮ断片のＮ末端に直接的または間接的のいずれかで融合される。一部の態様では、分割毒素配列の最初のアミノ酸は、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｉｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｈｅ、Ｇｌｙ，、ＧｌｕおよびＰｒｏからなる群から選択されてもよい。

一部の態様では、融合タンパク質は、分割毒素配列とインテイン配列との間のリンカーを含んでもよい。例えば、融合タンパク質は、分割毒素配列（例えば、断片）のＣ末端と、インテインのＮ断片のＮ末端との間にリンカーを含んでもよい。リンカーは、例えば、約１～約１０アミノ酸の長さであってもよい。一部の態様では、リンカーは、約１～約５アミノ酸の長さであってもよい。例えば、リンカーは、１、２、３、４、または５アミノ酸を含有してもよい。一部の態様では、分割毒素配列、およびインテインのＮ断片のＮ末端に接触するリンカーの最後のアミノ酸は、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｉｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｈｅ、Ｇｌｙ，、ＧｌｕおよびＰｒｏからなる群から選択されてもよい。

本明細書に記載される融合タンパク質は、任意で、一つ以上の検出可能な標識をさらに含んでもよい。本開示による使用に適した標識は当分野に公知であり、概して、その化学的性質によって、および直接的手段か、または間接的な手段かによって、タンパク質の検出を可能にする識別シグナルを提供する任意の分子が含まれる。したがって例えば、融合タンパク質は、例えば特定のレポーター分子、フルオロフォア、放射性物質、または酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ）などの従来的な様式で標識され得る。一部の態様では、融合タンパク質は、検出可能な標識として一つ以上の蛍光色素を含んでもよい。検出可能な標識を含むようにタンパク質を改変するための標準的な方法は、当分野で公知である。

治療方法
ヒト患者を治療する方法が、本明細書に開示される。一部の態様では、方法は、本明細書に開示される血小板のうちの一つ以上を患者に投与することを含んでもよい。一部の態様では、方法は、本明細書に開示される操作された血小板のうちの一つ以上を患者に投与することを含んでもよい。一部の態様では、患者は、投与工程の前に、治療を必要とするものとして特定される。

また本明細書において、循環腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する方法も開示される。一部の態様では、循環腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する方法。一部の態様では、方法は、循環腫瘍細胞を、本明細書に開示される血小板のうちの一つ以上と接触させることを含んでもよい。一部の態様では、接触は、ａ）インテインＮ断片を含むインテイン断片を、インテインＣ断片を含むインテイン断片に結合させて、インテイン複合体を形成させることであって、当該インテイン複合体は不活性であること、およびｂ）インテインＮ断片に対してＮ末端である分割毒素配列を、インテインＣ断片に対してＣ末端である分割毒素配列に結合させて、毒素複合体を形成させることであって、当該毒素複合体は活性であること、が可能となる条件下で実施されてもよく、それにより循環腫瘍細胞のアポトーシスが誘導される。一部の態様では、循環腫瘍細胞は、癌抗原を発現する。一部の態様では、癌抗原は、Ｈｅｒ－２であってもよい。

一部の態様では、疾患は、癌であってもよい。一部の態様では、癌は、原発性腫瘍または続発性腫瘍であってもよい。一部の態様では、癌は、転移している。一部の態様では、癌は、固形癌または血液癌であってもよい。癌は、任意の癌であってもよい。一部の態様では、癌は、肛門癌、膀胱癌、脳癌、骨癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、内分泌癌、食道癌、眼癌、胆嚢癌、頭頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、リンパ腫、黒色腫、口腔癌または口腔咽頭癌、骨肉腫、副甲状腺癌、膵癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、皮膚癌、腹部癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、外陰癌、卵巣癌、肺癌、または胃癌であってもよい。

アゴニストおよび用量。「治療」という用語は、疾患または障害の治療の文脈で本明細書において使用される場合、概してヒト対象または患者の治療および両方に関連してもよく、この場合において、何らかの望ましい治療効果が実現され、例えば疾患または障害の進行が阻害され、進行速度の低下、進行速度の停止、疾患または障害の退縮、疾患または障害の改善、および疾患または障害の治癒が誘導されてもよい。予防的手段としての治療（すなわち、予防、防止）も含まれる。

一部の態様では、血小板、操作された血小板、または血小板群は、治療有効量で送達されてもよい。

本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、望ましい治療レジメンに従い投与されたとき、何らかの望ましい治療効果を生じさせるのに有効であり、合理的な利益／リスクの比率に見合った血小板の量を指す。

同様に、本明細書で使用される場合、「予防有効量」という用語は、望ましい治療レジメンに従い投与されたとき、何らかの望ましい予防効果を生じさせるのに有効であり、合理的な利益／リスクの比率に見合った血小板の量を指す。本明細書で使用される場合、「予防」とは、特定の状態、疾患または障害を遅延、軽減、または回避することを助けることにより健康を維持することを目的として、症候性の状態、疾患または障害の検出に先立って投与される手段を指す。

一部の態様では、本明細書に記載される血小板のいずれかは、任意の量で、対象または患者に輸液を介して投与されてもよく、この場合において当該量は、治療応答を惹起させるのに充分である。一部の態様では、血小板濃度は、少なくとも１，０００μｌ、５，０００μｌ、または１０，０００μｌ、または１，０００μｌ～５，０００μｌ、５，０００μｌ～１０，０００μｌの範囲内、またはその間の任意の量であってもよい。

「投与レジメン」または「支持レジメン」とは、特定の速度で、規定の様式（例えば、連続的または断続的）に従い投与される血小板または他の細胞の量およびタイプを含む、血小板投与のスケジュールを指す場合があり、この場合において様式または速度は、時とともに変化し得る。「最適化された投与レジメン」または「最適化された支持レジメン」とは、意図されるレシピエントの分子的特質に従い血小板を選択することにより最適化される投与レジメンまたは支持レジメンを指す。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能」という用語は、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用することに適しており、合理的な利益／リスク比に見合った、化合物、成分、物質、組成物、剤型などを指す。担体、希釈剤、賦形剤などはそれぞれ、製剤の他の成分との適合性があるという意味でも「許容可能」でなければならない。

一部の態様では、本開示の方法または組成物は、症候改変であるか、または疾患改変であるかに関わらず、他の療法と組み合わされてもよい。

「治療」という用語は、併用治療および併用療法を含み、この場合において２つ以上の治療または両方が、例えば、連続的または同時に組み合わされる。例えば、本明細書に記載される化合物を用いた治療を、一つ以上の他の（例えば、１、２、３、４種の）剤または療法と組み合わせることが有益であり得る。連携療法の適切な例は、本明細書の開示に基づき、当業者に公知である。典型的には、連携療法は、治療される個体の診断を条件として、本明細書に記載される疾患または障害の治療において治療効果を付与しうると考えられる当分野で公知の任意の療法であってもよい。特定の組み合わせは、医師の裁量で為され、医師は、自身の普遍的な一般知識と、当業者に公知の投与レジメンを使用して用量も選択する。

剤（例えば、操作された血小板）は、同時投与または連続投与されてもよく、それぞれ異なる投与スケジュールで、異なる経路を介して投与され得る。例えば、連続投与される場合、剤は、短い間隔を空けて（例えば、５～１０分間にわたり）投与されてもよく、または長い間隔を空けて（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上の時間を空けて、または必要とされる場合にはさらに長い時間を空けて）投与されてもよく、正確な投与レジメンは、治療剤の特性に見合ったものである。

方法
また本明細書において、赤血球および血小板を作製する方法が開示される。方法は、以下の工程を含んでもよい。方法は、工程ａ）：遺伝子操作されたフィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）を提供すること、を含んでもよい。当該フィーダー細胞は、一つ以上の遺伝子回路を含んでもよい。当該一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上の対象遺伝子、および一つ以上のプロモーターを含んでもよい。方法は、工程ｂ）：遺伝子操作されたフェド細胞（ｆｅｄ ｃｅｌｌ）を提供すること、を含んでもよい。当該フェド細胞は、一つ以上の遺伝子回路を含んでもよい。当該一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上の対象遺伝子、および一つ以上のプロモーターを含んでもよい。当該一つ以上の対象遺伝子は、ａ）の一つ以上の対象遺伝子とは異なってもよい。方法は、工程ｃ）：ａ）の遺伝子操作されたフィーダー細胞を、ｂ）の遺伝子操作されたフェド細胞とともに培養すること、をさらに含んでもよい。培養工程は、遺伝子操作されたフェド細胞が赤血球または血小板に分化することが可能となる条件下で、培地中で行われてもよい。本明細書に開示される遺伝子操作されたフェド細胞の一つ以上が、赤血球または血小板に分化してもよい。

一部の態様では、本明細書に開示される方法の工程ａ）の一つ以上の遺伝子回路は、制御可能であってもよい。一部の態様では、一つ以上の遺伝子回路は、遺伝子操作されたフェド細胞中の遺伝子回路の一つ以上の対象遺伝子により制御されてもよい。一部の態様では、本明細書に開示される一つ以上の遺伝子回路は、遺伝子操作されたフィーダー細胞中の遺伝子回路の一つ以上の対象遺伝子により制御されてもよい。

一部の態様では、工程ａ）における、本明細書に開示される一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上のプロモーターにより制御されてもよい。一部の態様では、工程ａ）における一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上のリコンビナーゼをさらに含んでもよい。一部の態様では、一つ以上のリコンビナーゼは、例えば、Ｃｒｅ、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ、またはＢｘｂ１インテグラーゼであってもよい。一部の態様では、一つ以上のリコンビナーゼは、制御可能であってもよい。一部の態様では、本明細書に開示される、および工程ａ）における一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上の組み換え部位をさらに含んでもよい。一部の態様では、一つ以上の組み換え部位は、ｌｏｘＰ、ａｔｔＰ、またはＢｘｂ１であってもよい。一部の態様では、ａｔｔＰ部位は、Ｒｏｓａ２６座位および／または１１番染色体に挿入されてもよい。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、制御性エレメント、プロモーター、プロモーターエンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および発現を制御することができる他のエレメント（例えば、転写終結シグナル、限定されないが、ポリアデニル化シグナルおよびポリ－Ｕ配列が挙げられる）を指す。プロモーターは、構造的発現を誘導してもよい。プロモーターは、時間依存性の様式、限定されないが、細胞周期依存性または発生段階依存性の様式で発現を誘導してもよい。プロモーターの例としては、限定されないが、ＷＰＲＥ、ＣＭＶエンハンサー、およびＳＶ４０エンハンサーが挙げられる。特異的な遺伝子特異的プロモーターが使用されてもよい。そのようなプロモーターは、細胞特異的発現、または特定の経路に関連付けられた発現を可能にする。哺乳動物細胞で活性な任意のプロモーターが使用されてもよい。一部の態様では、プロモーターは、限定されないが、Ｔｅｔ－ｏｎおよびＴｅｔ－ｏｆｆシステムをはじめとする誘導性プロモーターである。そのような誘導性プロモーターを使用して、望ましい発現のタイミングを制御してもよい。一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターの例としては、限定されないが、テトラサイクリン誘導性システム（ｔｅｔ）、ヒートショックプロモーター、およびＩＰＴＧ活性化プロモーターが挙げられる。一部の態様では、プロモーターは、双方向性である。

プロモーターおよび／またはエンハンサーは、その機能を誘発させる光または特定の化学的事象のいずれかにより特異的に活性化されてもよい。システムは、例えばテトラサイクリンやデキサメタゾンなどの試薬によって制御されてもよい。

一部の態様では、本明細書に開示される遺伝子回路は、プロモーター、例えば限定されないが、エンハンサー、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、およびリプレッサー配列；構造的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーターまたはそれらのバリアントを含んでもよい。組織特異的プロモーターの例としては限定されないが、アルブミン、リンパ特異的プロモーター、Ｔ細胞プロモーター、神経フィラメントプロモーター、膵臓特異的プロモーター、乳清プロモーター；ｈｏｘプロモーター、ａ－フェトプロテインプロモーター、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子プロモーター、ＦＡＢプロモーター、インスリン遺伝子プロモーター、トランスサイレチン、アルファ．ｌ－アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター１型（ＰＡＩ－ｌ）、アポリポタンパク質ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子、ＧＦＡＰプロモーター、ＯＰＳＩＮプロモーター、ＮＳＥ、Ｈｅｒ２、ｅｒｂ２、ならびにそれらの断片および誘導体が挙げられる。他のプロモーターの例としては限定されないが、テトラサイクリン、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、およびマウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ））、および他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターおよびそれらのバリアントが挙げられる。

本明細書および工程ａ）に開示される一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上のリプレッサータンパク質をさらに含んでもよい。一部の態様では、一つ以上のリプレッサータンパク質は、ＬａｃＩ、ＴｅｔＲ、および／またはＱＳであってもよい。一部の態様では、本明細書に開示される一つ以上のリプレッサータンパク質は、制御可能であってもよい。

培地は、一つ以上の調節因子をさらに含んでもよい。一部の態様では、一つ以上の調節因子は、本明細書に開示されるａ）またはｂ）の遺伝子回路を調節（例えば、抑制または活性化）してもよい。一部の態様では、工程ａ）における、本明細書に開示される一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上の培地調節因子により制御されてもよい。一部の態様では、当該一つ以上の培地調節因子は、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、キナ酸、またはオーキシンであってもよい。

本明細書に開示される方法は、制御可能ではない、工程ａ）の一つ以上の遺伝子回路を含んでもよい。一部の態様では、本明細書に開示される、および工程ａ）の遺伝子回路の一つ以上のプロモーターは、構造的に発現されてもよい。一部の態様では、本明細書に開示される、および工程ａ）の遺伝子回路の一つ以上のプロモーターは、ＣＭＶ、ＲＳＶおよび／もしくはＵ６、ベータアクチン、ならびに／または伸長因子プロモーターであってもよい。一部の態様では、一つ以上のプロモーターは、一つ以上のオペレーター部位（例えば、ｔｅｔ）を含んでもよい。そのようなオペレーター部位は、一つ以上のリプレッサータンパク質が結合することを可能にし得る。

本明細書に開示される方法は、工程ａ）において、遺伝子回路の一つ以上の対象遺伝子を含んでもよい。一部の態様では、本明細書に開示される遺伝子回路の一つ以上の対象遺伝子は、エリスロポエチン、トロンボポエチン、および／またはＩＬ１－αであってもよい。一部の態様では、本明細書に開示される、および工程ａ）の遺伝子回路の一つ以上の対象遺伝子は、構造的に発現されてもよい。

本明細書に開示される方法は、遺伝子操作されたフィーダー細胞を含んでもよい。一部の態様では、遺伝子操作されたフィーダー細胞は、胚性幹細胞、またはマウス胚性幹細胞から誘導されてもよい。一部の態様では、遺伝子操作されたフィーダー細胞は、骨芽細胞であってもよい。一部の態様では、骨芽細胞は、ＯＰ－９間質細胞であってもよい。一部の態様では、骨芽細胞は、臍帯血または骨髄に由来してもよい。一部の態様では、遺伝子操作されたフィーダー細胞は、不死化細胞株から誘導されてもよい。一部の態様では、遺伝子操作されたフィーダー細胞は、未分化型造血幹細胞（ＨＳＣ）の増殖を支持してもよい。一部の態様では、遺伝子操作されたフィーダー細胞は、遺伝子操作されることができる細胞であってもよい。

本明細書に開示される方法は、遺伝子操作されていないフィーダー細胞を含んでもよい。一部の態様では、フィーダー細胞は、胚性幹細胞、またはマウス胚性幹細胞から誘導されてもよい。一部の態様では、フィーダー細胞は、骨芽細胞であってもよい。一部の態様では、骨芽細胞は、ＯＰ－９間質細胞であってもよい。一部の態様では、骨芽細胞は、臍帯血または骨髄に由来してもよい。一部の態様では、フィーダー細胞は、不死化細胞株から誘導されてもよい。一部の態様では、フィーダー細胞は、未分化型造血幹細胞（ＨＳＣ）の増殖を支持してもよい。

本明細書に開示される方法は、様々な細胞を使用することができる。細胞の例としては、限定されないが、例えば胚性幹細胞などの幹細胞が挙げられる。

本明細書に開示される方法は、制御可能である、本明細書に開示される、およびｂ）の一つ以上の遺伝子回路を含んでもよい。一部の態様では、ｂ）の一つ以上の遺伝子回路は、遺伝子操作されたフェド細胞中の遺伝子回路の一つ以上の対象遺伝子により制御されてもよい。一部の態様では、ｂ）の一つ以上の遺伝子回路は、遺伝子操作されたフィーダー細胞中の遺伝子回路の一つ以上の対象遺伝子により制御されてもよい。一部の態様では、ｂ）における一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上のリコンビナーゼをさらに含んでもよい。一部の態様では、一つ以上のリコンビナーゼは、Ｃｒｅ、またはｐｈｉＣ３１インテグラーゼ、またはＢｘｂ１インテグラーゼであってもよい。一部の態様では、一つ以上のリコンビナーゼは、制御可能であってもよい。

本明細書に開示される方法は、一つ以上の組み換え部位を含む、本明細書に開示される、および工程ｂ）における一つ以上の遺伝子回路を含んでもよい。一部の態様では、一つ以上の組み換え部位は、ｌｏｘＰ、ａｔｔＰ、またはＢｘｂ１であってもよい。一部の態様では、ａｔｔＰ部位、ｌｏｘＰ部位、またはＢｘｂ１部位は、Ｒｏｓａ２６座位で挿入されてもよい。一部の態様では、本明細書に開示される、および工程ｂ）における一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上のプロモーターにより制御されてもよい。一部の態様では、本明細書に開示される、および工程ｂ）における一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上のリプレッサータンパク質をさらに含んでもよい。一部の態様では、一つ以上のリプレッサータンパク質は、ＬａｃＩ、ＴｅｔＲ、またはＱＳであってもよい。一部の態様では、一つ以上のリプレッサータンパク質は、制御可能であってもよい。

一部の態様では、本明細書に開示される、および工程ｂ）における一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上の培地調節因子により制御されてもよい。一部の態様では、一つ以上の調節因子は、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、キナ酸、またはオーキシンであってもよい。そのような培地調節因子または剤は、当分野で周知である。

本明細書に開示される方法は、制御可能ではなくてもよい、本明細書に開示され、および工程ｂ）の一つ以上の遺伝子回路を含んでもよい。一部の態様では、本明細書に開示される、および工程ｂ）の遺伝子回路の一つ以上のプロモーターは、構造的に活性であってもよい。一部の態様では、工程ｂ）の遺伝子回路の一つ以上のプロモーターは、ＣＭＶ、ＲＳＶ Ｕ６、ベータアクチン、および／または伸長因子プロモーターであってもよい。一部の態様では、一つ以上のプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶおよび／またはＵ６）は、一つ以上のオペレーター部位を含んでもよい。一部の態様では、オペレーター部位は、リプレッサータンパク質が結合することを可能にし得る。

一部の態様では、本明細書に開示される、および工程ｂ）の遺伝子回路の一つ以上の対象遺伝子は、ＨｏｘＢ４および／またはＧＡＴＡ－１であってもよい。一部の態様では、本明細書に開示される、および工程ｂ）の遺伝子回路の一つ以上の対象遺伝子は、構造的に発現されてもよい。一部の態様では、ＧＡＴＡ－１は、オーキシンタンパク質分解タグを含む。

一部の態様では、本明細書に記載される遺伝子操作されたフェド細胞は、造血前駆幹細胞であってもよい。一部の態様では、造血幹細胞は、臍帯血、骨髄、ｉＰＳ細胞、またはＥＳ細胞から誘導されてもよい。一部の態様では、遺伝子操作されたフェド細胞は、血小板および赤血球の前駆細胞を生成する能力を有し得る。一部の態様では、前駆細胞は、血小板および赤血球を生成する能力を有し得る。一部の態様では、前駆細胞は、本明細書に開示される遺伝子回路のうちの一つ以上を含んでもよい。一部の態様では、前駆細胞は、対象の一つ以上の遺伝子のいずれかの発現を制御し得る、本明細書に開示される遺伝子回路のうちの一つ以上を含む。一部の態様では、一つ以上の対象遺伝子は、ＨｏｘＢ４および／またはＧＡＴＡ－１であってもよい。一部の態様では、本明細書に記載される遺伝子回路は、一つ以上のリプレッサータンパク質（例えば、ＬａｃＩ、ＴｅｔＲまたはＱＳ）を含んでもよく、一つ以上の培地調節因子（例えば、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、キナ酸、またはオーキシン）によって制御されてもよい。

対象遺伝子は、任意の遺伝子であってもよい。対象遺伝子は、内因性であってもよく、または導入されてもよい。「標的」、「標的遺伝子」、「標的ヌクレオチド配列」という用語は、相互交換可能に使用され得、対象遺伝子を指す。例えば、標的遺伝子は、機能が判明している遺伝子であるか、またはその機能は不明であるが、その全ヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列が判明している遺伝子である。あるいは、標的遺伝子の機能とそのヌクレオチド配列の両方ともが不明である。標的遺伝子は、真核細胞の天然遺伝子であってもよく、または例えば遺伝子形質転換によって当該真核細胞または当該真核細胞の親細胞に過去に導入された異種遺伝子であってもよい。異種標的遺伝子は、真核細胞のゲノム内に安定的に統合されてもよく、または真核細胞中に染色体外分子として、たとえば自律的に複製する染色体外分子として存在する。標的遺伝子は、標的タンパク質の複製、転写、翻訳、もしくは標的タンパク質の発現に重要な他のプロセスを制御するポリペプチドをコードする領域またはポリヌクレオチド領域を含むポリヌクレオチドを含んでもよく、または標的ポリペプチドをコードする領域と、標的ポリペプチドの発現を制御する領域、または例えば５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲ、またはイントロンなどの非コード領域を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。標的遺伝子とは、例えば、対象の遺伝子を転写することによって産生されるｍＲＮＡ分子を指す場合がある。

本明細書に開示される遺伝子回路の設計または構築は、モジュラー様式で実施されてもよく、それにより、異種遺伝子や他の組み換え遺伝子を含む任意の遺伝子の制御が可能となる。一部の態様では、部分またはモジュールは、遺伝子活性化因子、遺伝子リプレッサー、リコンビナーゼ、ゲノム編集、および合成転写因子であってもよい。一部の態様では、本明細書に記載の遺伝子回路は、一つ以上のモジュールを含んでもよい。

ベクターは、原核生物に導入され、および増幅されることができ、次いで増幅されたベクターは、真核細胞に導入されることができる。またベクターは、原核生物に導入され、および増幅されることもでき、真核細胞に導入されることができるベクターを産生する（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部としてプラスミドを増幅する）中間ベクターとしての機能を果たすこともできる。原核生物を使用して、ベクターのコピーを増幅し、および一つ以上の核酸を発現して、宿主細胞または宿主生物体への送達のための一つ以上のタンパク質の供給源を提供することができる。原核生物におけるタンパク質の発現は、多くの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を誘導する構造的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するベクターを含む大腸菌において実施される。またベクターは、酵母発現ベクター（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）であってもよい。

一部の態様では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において、一つ以上の配列の発現を駆動することができる。哺乳動物発現ベクターの例としては限定されないが、ｐＣＤＭ８およびｐＭＴ２ＰＣが挙げられる。哺乳動物細胞では、制御エレメントが、ベクターの発現を制御する。プロモーターの例は、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、および本明細書に開示されるもの、および当分野で公知のものに由来するプロモーターである。

一部の態様では、本明細書に開示される方法は、工程ｃ）で、工程ａ）またはｂ）における一つ以上の対象遺伝子の発現を可能にする条件を含んでもよい。一部の態様では、骨芽細胞は、マイトマイシンＣに接触されてもよく、曝露されてもよく、または処置されてもよい。肝細胞を添加する前に、骨芽細胞を洗浄してもよい。骨芽細胞を洗浄して、マイトマイシンＣを除去してもよい。概して、骨芽細胞は、当業者に公知の標準プロトコルに従って調製されてもよい。骨芽細胞は、例えば、マイトマイシンＣで処置されてもよく、その後、またはその直後に、フィーダー細胞上で追加細胞が増殖する。

一部の態様では、本明細書に開示される方法において使用され得る培地は、一つ以上の構成要素または調節因子（例えば、培地調節因子）を含んでもよい。一つ以上の構成要素または調節因子は、血小板および／または赤血球の前駆幹細胞の形成をもたらしてもよい。一部の態様では、本明細書に記載される一つ以上の構成要素または調節因子は、イソプロピル β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、キナ酸、またはオーキシンであってもよい。一部の態様では、前駆幹細胞は、血小板および／または赤血球の前駆細胞を生成してもよい。一部の態様では、前駆幹細胞は、一つ以上の自己識別細胞表面マーカーを発現してもよい。一部の態様では、前駆幹細胞は、ＧＡＴＡ－１および／またはＨｏｘＢ４を発現してもよい。一部の態様では、一つ以上の細胞表面マーカーの発現は、本明細書に開示される遺伝子回路によって生じてもよい。一部の態様では、一つ以上の細胞表面マーカーは、自己識別性であってもよい。一部の態様では、一つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ４１ａおよびＣＤ４３であってもよい。

一部の態様では、本明細書に記載の方法によって産生される血小板および／または赤血球は、一つ以上の細胞表面マーカーを発現してもよい。一部の態様では、一つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂであってもよい。

一部の態様では、本明細書に開示される方法は、工程ｄ）血小板もしくは赤血球を単離または精製することをさらに含んでもよい。

治療方法
本明細書において、患者を治療する方法が開示される。一部の態様では、患者は、血小板輸血を必要としてもよい。一部の態様では、方法は、インビトロで生成され、任意で単離される血小板の治療有効量を投与することを含んでもよい。インビトロで生成され、任意で単離される血小板は、本明細書に開示される方法のいずれかにより生成されてもよい。

本明細書において、治療剤、ペプチド、酵素、または生物活性分子（生体分子）を含む血小板を作製する方法が開示される。一部の態様では、方法は、身体に放出される治療用タンパク質を自身の中に担持する血小板を作製するための本明細書に開示される方法のいずれかを含んでもよい。一部の態様では、方法は、本明細書に記載される外因性および／または内因性の制御を含んでもよい。一部の態様では、方法は、例えば特定の薬剤への結合時に、および／または組織特異的ペプチドへの結合時に、血小板を活性化して、酵素の放出を誘発させることができる受容体を含むように、血小板を操作することも含んでもよい。

本明細書において、治療剤、ペプチド、酵素、または生物活性分子（生体分子）を含む血小板を作製する方法が開示される。一部の態様では、方法は、以下の工程を含んでもよい：ａ）遺伝子操作された骨芽細胞を提供すること、ｂ）遺伝子操作された造血幹細胞（ＨＳＣ）を提供することであって、当該ＨＳＣは、一つ以上の遺伝子回路、および一つ以上のプロモーターを含み、当該一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上の対象遺伝子を含み、当該一つ以上の対象遺伝子は、ａ）の一つ以上の対象遺伝子とは異なること、ｃ）ａ）の遺伝子操作された骨芽細胞と、ｂ）の遺伝子操作されたＨＳＣとを、当該遺伝子操作されたＨＳＣが血小板幹細胞へと分化することが可能な条件下で、培地中で培養すること、およびｄ）治療剤、ペプチド、酵素、または生物活性分子を含む血小板を作製すること。一部の態様では、作製される血小板は、操作された受容体または改変された受容体を含んでもよい。一部の態様では、遺伝子操作されたＨＳＣは、多能性幹細胞に由来してもよく、またはその前駆幹細胞のうちの一つに由来してもよい。前駆幹細胞は、治療剤、ペプチド、酵素、または生物活性分子を産生することができる。前駆幹細胞は、治療剤、ペプチド、酵素、または生物活性分子を産生または分泌するように、内因的または外因的に制御されてもよい。方法は、特定の薬剤への結合時に、および／または組織特異的ペプチドへの結合時に、血小板を活性化して、酵素の放出を誘発させることができる受容体を含むように、血小板を操作することも含んでもよい。

本明細書で使用される場合、「治療剤」という用語は、化学化合物、タンパク質、ペプチド、低分子、抗体、遺伝子、酵素、または細胞を指す。

一部の態様では、本明細書に開示される治療用タンパク質または剤は、血小板への最終分化の前に、血小板前駆幹細胞の遺伝子回路から転写されてもよい。一部の態様では、本明細書に開示される治療用タンパク質または剤は、巨核球中の遺伝子回路から転写されてもよい。これらの治療用タンパク質または剤は、前駆細胞の細胞質内に存在してもよく、したがって、最終分化した血小板の一部であってもよい。治療用タンパク質または剤の産生は、構造的に発現するプロモーターから、および／または誘導性遺伝子回路を用いて転写されてもよい。

一部の態様では、本明細書に開示される方法はさらに、工程ｅ）工程ｃ）で作製された前駆幹細胞を、当該前駆幹細胞の血小板への分化が促進される条件下で培地中で再培養すること、を含んでもよい。一部の態様では、本明細書に開示される方法は、工程ｆ）血小板を収集または単離することをさらに含んでもよい。

一部の態様では、本明細書に開示される方法を実施して、治療用細胞を作製してもよい。治療用細胞は、一つ以上の治療剤、ペプチド、酵素、遺伝子、または生物活性分子を含んでもよい。一部の態様では、治療剤は、低分子、遺伝子、ペプチド、酵素、ワクチン、または抗微生物剤であってもよい。

一部の態様では、ａ）の一つ以上の遺伝子回路は、制御可能である。一部の態様では、ａ）の一つ以上の遺伝子回路は、遺伝子操作されたＨＳＣ中の遺伝子回路の一つ以上の対象遺伝子により制御されてもよい。一部の態様では、ａ）の一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上のプロモーターにより制御されてもよい。一部の態様では、ａ）およびｂ）の遺伝子回路の一つ以上のプロモーターは、ＣＭＶ、ＲＳＶおよび／またはＵ６であってもよい。一部の態様では、一つ以上のプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶおよび／またはＵ６）は、オペレーター部位（例えば、ｔｅｔ）を含んでもよい。

一部の態様では、ａ）の一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上のリコンビナーゼをさらに含んでもよい。一部の態様では、一つ以上のリコンビナーゼは、Ｃｒｅ、ｐｈｉＣ３１、インテグラーゼ、および／またはＢｘｂ１であってもよい。一部の態様では、一つ以上のリコンビナーゼは、制御可能であってもよい。一部の態様では、ａ）の一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上の組み換え部位をさらに含んでもよい。一部の態様では、一つ以上の組み換え部位は、ｌｏｘＰまたはａｔｔＰであってもよい。一部の態様では、ａｔｔＰまたは任意の他のリコンビナーゼ認識部位は、Ｒｏｓａ２６座位および／または１１番染色体の座位に挿入されてもよい。一部の態様では、ａｔｔＰおよび任意の他のインテグラーゼ認識部位は、治療剤の挿入部位としての機能を果たしてもよい。

一部の態様では、ａ）の一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上のリプレッサータンパク質をさらに含んでもよい。一部の態様では、一つ以上のリプレッサータンパク質は、ＬａｃＩ、ＴｅｔＲ、および／またはＱＳであってもよい。一部の態様では、一つ以上のリプレッサータンパク質は、制御可能であってもよい。

一部の態様では、本明細書に開示される培地は、一つ以上の構成要素または調節因子をさらに含んでもよい。一部の態様では、工程ａ）およびｂ）の一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上の培地調節因子または構成要素により制御されてもよい。一部の態様では、一つ以上の培地調節因子または構成要素は、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、キナ酸、またはオーキシンであってもよい。

一部の態様では、ａ）の遺伝子回路の一つ以上の対象遺伝子は、トロンボポエチンであってもよい。一部の態様では、トロンボポエチンは、構造的に発現されてもよい。

一部の態様では、ｂ）の一つ以上の遺伝子回路は、制御可能であってもよい。一部の態様では、ｂ）の一つ以上の遺伝子回路は、遺伝子操作されたＨＳＣ中の遺伝子回路の一つ以上の対象遺伝子により制御されてもよい。一部の態様では、ｂ）の一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上のプロモーターにより制御されてもよい。一部の態様では、ｂ）の遺伝子回路の一つ以上のプロモーターは、ＣＭＶ、ＲＳＶおよび／またはＵ６であってもよい。

一部の態様では、ｂ）の一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上のリコンビナーゼをさらに含んでもよい。一部の態様では、一つ以上のリコンビナーゼは、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ、またはＣｒｅ、またはＢｘｂ１インテグラーゼであってもよい。一部の態様では、一つ以上のリコンビナーゼは、制御可能であってもよい。一部の態様では、ｂ）の一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上の組み換え部位をさらに含んでもよい。一部の態様では、一つ以上の組み換え部位は、ｌｏｘＰ、ａｔｔＰ、またはＢｘｂ１であってもよい。一部の態様では、ａｔｔＰ部位、ｌｏｘＰ部位またはＢｘｂ１部位は、Ｒｏｓａ２６座位で挿入されてもよい。一部の態様では、一つ以上の組み換え部位は、治療剤の挿入部位としての機能を果たしてもよい。

本明細書で記載される場合、例えばａｔｔＰなどのゲノム中のリコンビナーゼ部位を使用して、本明細書に開示される遺伝子回路のうちのいずれかを、「ドッキング部位」を介してゲノム内に挿入してもよい。このドッキング部位は、本明細書に開示される遺伝子回路をゲノム内に標的化挿入および安定的挿入することを可能にし、当該部位は、遺伝子発現の実現に安定的であることが判明しており、およびエピジェネティックなサイレンシングに抵抗性であり得る。

治療剤の位置は、ゲノム内であってもよい。

一部の態様では、ｂ）の一つ以上の遺伝子回路は、一つ以上のリプレッサータンパク質をさらに含んでもよい。一部の態様では、一つ以上のリプレッサータンパク質は、ＬａｃＩ、ＴｅｔＲ、および／またはＱＳであってもよい。一部の態様では、一つ以上のリプレッサータンパク質は、制御可能であってもよい。

一部の態様では、本明細書に開示される培地は、一つ以上の培地調節因子をさらに含んでもよい。一部の態様では、当該一つ以上の培地調節因子は、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、キナ酸、またはオーキシンであってもよい。

一部の態様では、ｂ）の遺伝子回路の一つ以上の対象遺伝子は、ＧＡＴＡ－１であってもよい。一部の態様では、ＧＡＴＡ－１は、構造的に発現されてもよい。

一部の態様では、工程ｃ）の血小板前駆幹細胞は、一つ以上の細胞表面マーカーを発現してもよい。一部の態様では、工程ｃ）の血小板前駆幹細胞は、ＧＡＴＡ－１を発現してもよい。一部の態様では、一つ以上の表面マーカーは、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ４１ａ、およびＣＤ４３であってもよい。一部の態様では、血小板または赤血球は、一つ以上の細胞表面マーカーを発現してもよい。一部の態様では、一つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂであってもよい。

本明細書において、治療剤を必要とする患者を治療する方法が開示される。方法は、治療用血小板の治療有効量を対象にまたは患者に投与することを含んでもよい。方法は、投与工程の前に、治療を必要とする患者を特定することを含んでもよい。方法は、単離された血小板の治療有効量を患者に投与することを含んでもよい。一部の態様では、血小板は、治療剤を含む。単離された血小板および赤血球は、ＤＮＡを含有しない。これらの細胞は、本明細書に開示される方法を介して発現するように操作されたタンパク質およびペプチドを発現する。これらの細胞は、無核化される。

治療的投与は、予防的適用を包含する。遺伝子検査および他の予後方法に基づいて、医師は、その患者と相談して、患者が臨床的に決定した素因を有する、または状態、障害、もしくは疾患のタイプに対する感受性の増加（場合によっては、感受性の大幅な増加）を有する場合、予防的投与を選択することができる。

本明細書に記載される治療剤を含む血小板、ならびに血小板と赤血球は、臨床疾患の発症を遅らせ、低減させ、または好ましくは予防するのに充分な量で、対象（例えば、ヒト患者）に投与されてもよい。したがって、一部の態様では、患者は、ヒト患者である。治療用途では、組成物は、状態、障害または疾患をすでに有する、または有すると診断された対象（例えば、ヒト患者）に、兆候または症状を少なくとも部分的に改善するのに充分な量、または状態、その合併症および帰結の症状の進行を阻害する（および好ましくは停止させる）のに充分な量で、投与される。これを達成するのに適切な量が、「治療有効量」として定義される。本明細書に記載される血小板、ならびに治療剤を含む血小板の治療有効量は、治癒を達成するが、その転帰は、達成され得るいくつかの中の一つに過ぎない量であってもよい。症状のうちの一つ以上は、重症度が低くてもよい。治療を受けた個体では、回復が加速されてもよい。

本明細書に記載される血小板内に存在し、哺乳動物（例えばヒト）に適用される本明細書に開示される方法において使用される治療剤のうちの１種類以上の治療有効量は、年齢、体重および他の一般状態（上述）の個体差を考慮に入れて、当業者によって決定されてもよい。

本明細書に記載の治療剤を含む血小板を含む血小板は、様々な投与経路のいずれかによる投与に対して製剤化されてもよい。

治療剤を含む血小板を含む血小板は、非経口投与用に調製されてもよい。非経口投与用に調製された血小板には、静脈内（または動脈内）、筋肉内、皮下、および腹腔内の投与用に調製された血小板が含まれる。

本明細書に記載される遺伝子回路または核酸構築物のいずれかを、本明細書に開示される細胞のいずれか、または方法のいずれかとともに使用してもよい。

実施例１：多能性幹細胞を操作して、内因性の合図を制御し、分化を強化する
マウスＨＳＣが遺伝子ツールを使用するための適切な細胞源を提供するかを判定するために、血小板を搭載するツールおよび方法が開発され、骨髄すべてをマウスから取り出し、長期的な可能性について試験した（図３Ａ）。他の報告と一致して、系統が確立したＨＳＣ前駆細胞の数は、経時的に著しく減少する（Ｍｏｏｔｚ ＨＤ，Ｍｕｉｒ ＴＷ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００２；１２４（３１）：９０４４－５；Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＥＣ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２００７；３（１）：５０－４；Ｓｅｌｇｒａｄｅ ＤＦ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１３；１３５（２０）：７７１３－９；Ｔｙｓｚｋｉｅｗｉｃｚ ＡＢ，Ｍｕｉｒ ＴＷ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｌｉｇｈｔ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ２００８；５（４）：３０３－５；Ｚｅｉｄｌｅｒ ＭＰ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００４；２２（７）：８７１－６；およびＤｅａｎｓ ＴＬ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２００７；１３０（２）：３６３－７２）（図３Ｂ）。次に、骨髄から単離されたＨＳＣを、インビトロで血小板に分化させることができるかを判定するために、マウス骨髄から多能性ＨＳＣ（ＬＳＫ＋細胞）を単離し、標準的な分化条件下でそれらを分化させた（Ｄｅａｎｓ ＴＬ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１２；１０９（３８）：１５２１７－２２；Ｓｉｎｇｈ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｓ Ｍａｃｒｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１３；２（３）：２６９－７２；ａｎｄ Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０２０）（図３Ｃ）。これらの実験から、培養においてＨＳＣはとても寿命が短いため、これらの目的のためにＨＳＣを直接遺伝子操作することは現実的ではないと結論付けた。次に、インビトロで胚性幹細胞（ＥＳ）を多能性ＨＳＣに分化させることの有効性を試験した結果、多能性ＨＳＣ（ＬＳＫ＋）細胞が、培養から９日以内に取得され得たことが判明した（図３Ｄ）。マウス胚性幹（ＥＳ）は急速に増殖し、多能性細胞集団を着実に更新し、そして培養中での維持が容易であるために、ＥＳ細胞が遺伝子操作される。これらの遺伝子操作されたＥＳ細胞は、ＨＳＣに分化される。このＥＳ細胞法の別の利点は、操作された細胞は速やかに拡張され、例えば初代ＨＳＣなどの代替的な細胞株よりも長く維持され得ることである。初代ＨＳＣは、急速に老化に達し、または自発的に分化するために、機能性寿命が短い。これを実現するために、ＣＲＩＳＰＲ技術を利用して、遺伝子回路用の「ランディングパッド」または「ドッキング部位」を挿入するモジュラー技術を実装した。従来的な技術では、遺伝子回路はゲノム内にランダムに挿入されるため、回路が安定的に統合された安定クローンを選択し、および特定の挿入部位での回路の機能性を試験することが含まれる。これらの工程は面倒で時間がかかる可能性がある。さらに、各クローンは異なっている可能性があり、（例えば、局所的エンハンサー、リプレッサー、またはエピジェネティックな修飾による）位置的な影響が、回路の脱制御または誤制御をもたらし得るために、試験段階は重要である。これらの制限をバイパスするために、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞を、Ｒｏｓａ２６座位の「ドッキング部位」を用いて操作することにより、標的化と安定的な遺伝子回路の挿入を可能にする。Ｒｏｓａ２６座位は広く使用され、マウスモデルにおける安定的な遺伝子発現を実現しており、エピジェネティックなサイレンシングに抵抗性である（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１７；６（１１）：２０１４－２０）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、３つのａｔｔＰ部位がＲｏｓａ２６座位に追加された（図４）。これにより、これらの部位での一方向性の組み換えが可能となり、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼを使用した、この場所での特異的な遺伝子回路の挿入が可能となる（図４Ｂ）（Ｂｕｓｈ Ｌ，Ｍａｒｖｉｎ Ｊ，Ｄｅａｎｓ ＴＬ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｍａｇｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｒａｒｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｅｖｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ ２０１９；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／５１２４４２）。これにより、マウスＥＳ細胞のゲノム内に、任意の遺伝子ネットワークを挿入するための安定的な技術が可能となる。さらに、ＥＳ細胞は分化全能性であるために、これらの遺伝子改変細胞は、対象の疾患または組織に基づいて、様々な異なる機能細胞型に分化することができる。ＭＫにおける血小板産生およびリソソーム酵素の産生を目的として、遺伝子改変ＥＳ細胞をＨＳＣに分化させ、リソソーム酵素の発現を、分化全体を通して様々な段階で制御する。さらに、この技術の開発により、あらゆる遺伝的背景の細胞型の使用が可能になり、使用される様々なマウスモデルとの免疫適合性が確保される。最後に、ＣＲＩＳＰＲ技術の使用により、ヒト細胞株に類似のドッキング部位を構築することが可能となる。

実施例２：巨核球を遺伝子操作して、生体分子を分泌する血小板を生成する
血小板は以下のような多くの特徴を保有しており、それゆえに天然搭載物や合成搭載物のインビボ送達に対する魅力的な候補となっている：１）血小板は、体内で広範囲の循環域を有している、２）血小板は、無核細胞である、３）血小板は、生体適合性がある、４）ヒトにおける血小板の平均寿命は約１０日である、および５）活性化後、血小板のタンパク質顆粒は分泌小胞として機能し、成分を細胞外流体に放出する。本明細書に開示される合成生物学を使用することにより、ＭＫは、血小板分泌に標的とされる治療レベルのタンパク質カーゴを発現するようにプログラム化され得る。概念実証として、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、およびルシフェラーゼを最初にＭＫで発現させ、治療用搭載物の送達ビヒクルとして血小板を使用することの有効性を判定する。この一連のレポーター分子は、カーゴの装填および送達プロセスの様々な態様を分析するために使用することができるために選択された。ＥＧＦＰを使用して、可溶性トランスジェニックカーゴが分泌顆粒内にパッケージングされているかを判定する。ＳＥＡＰを使用して、インビトロで増殖した細胞の培地内へのカーゴ放出の程度を分析する。ルシフェラーゼを使用して、内因性血小板と同じように、外傷部位で操作された血小板が富化されているかを判定し、インビボモデルにこれら実験が移行した際に使用されるかを判定する。

実験および方法 治療用生体分子のための送達ビヒクルとして血小板を使用する概念を実証するために、構造的に発現するレポーター遺伝子を、ＥＳ細胞のａｔｔＰ部位に挿入する（図４）。これらの細胞は、ＯＰ９間質支持細胞上に播種され、前述を使用してＭＫに分化される。ＥＳ細胞中のａｔｔＰランディングパッドが使用され、構造的に発現するレポーター遺伝子を挿入するよう操作される。これらの細胞をＭＫおよび血小板に分化させ、次いでこれらの細胞をレポーターの発現に関して分析して、これらの組み換え型タンパク質の位置と機能、およびそれらが血小板機能にどのように影響するかを決定した。

ＭＫおよび血小板においてＧＦＰを発現させる：多くの生体治療分子候補と同様に、ＧＦＰは細胞質全体に拡散する、小さな可溶性のタンパク質である。ＦＡＣＳ分析のためにＭＫを回収し、ＭＫの分化、およびＧＦＰの発現レベルを確認する。全集団におけるＧＦＰ発現ＭＫの割合も評価する。ＭＫにおけるＧＦＰ発現レベルを決定した後、ＧＦＰを発現するＭＫは、血小板に分化される。ＦＡＣｓ分析は、血小板の分化を確認し、これらの細胞におけるＧＦＰ発現を定量化するために行われる。血小板精製細胞におけるＧＦＰの細胞内分布を確立するために、ＧＦＰに対する抗体を使用して免疫標識する。

ＭＫおよび血小板において、ＳＥＡＰを発現させる：ＯＰ９間質細胞の層上でＨＳＣをＭＫに分化させた後、これらの細胞を回収し、確立されたＥＬＩＳＡプロトコルを使用して、培地中におけるＳＥＡＰ分泌を定量する（Ｗｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ ＭＳ，Ｄｅａｎｓ ＴＬ．Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１８；４５（７）：５９９－６１４）。ＭＫからのＳＥＡＰ分泌を決定した後、ＳＥＡＰを発現するＭＫは、血小板に分化し、血小板がインビトロでも生体分子を分泌することができるかを決定する。これを達成するため、操作された血小板は、複数の時点にわたり（１０日間、１日３回）培養培地中のＳＥＡＰレベルを検証されることにより、操作されていない血小板とともに特徴解析される。

ＭＫおよび血小板において、ルシフェラーゼを発現させる：操作された血小板が外傷に応答することができるかを判定するために、ルシフェラーゼをＭＫ細胞と血小板で発現させる。ルシフェラーゼは、生きた動物の撮像が可能である。これらの実験は、ルシフェラーゼを発現することができる操作された血小板に対する概念実証としての役割を果たす。ＨＳＣをＭＫに分化させた後、生物発光検査が可能なプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性が定量される。

血小板の特徴解析。血小板細胞の分化は、フローサイトメトリーを使用し、表面マーカーによって特定することができる。公知の活性化因子であるフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）（Ｓｃｏｔｔ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ ２０１２；１２：１４）、フィブリノーゲン（Ｉｔｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２０１８；１７４（３）：６３６－４８ ｅ１８）、コラーゲン（Ａｖａｎｚｉ ＭＰ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０１６；５６（１）：１７０－８；ａｎｄ Ｂｌｉｎ Ａ，Ｌｅ Ｇｏｆｆ Ａ，Ｍａｇｎｉｅｚ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｏｒｇａｎ：ｂｅｙｏｎｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１６；６：２１７００）、およびトロンビン（Ｄｉ Ｂｕｄｕｏ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１５；１２５（１４）：２２５４－６４）に関して、脱顆粒と凝集の評価が行われた。血小板の脱顆粒は、セロトニン、および血小板由来因子４（ＰＤＦ－４：ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ ４）に特異的なＥＬＩＳＡによって判定される（Ｎａｋａｇａｗａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１３；４１（８）：７４２－８）。対照として、マウスから新たに単離された血小板を比較に使用する。公知の活性化因子の存在下で凝集する血小板の能力を、血小板凝集計を使用して判定する。さらに、血小板上のＰＡＲ受容体を酵素的に切断することによって作用する、トロンビンによる血小板の脱顆粒（Ｄｉ Ｂｕｄｕｏ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１５；１２５（１４）：２２５４－６４）を、セロトニン、および血小板由来因子４（ＰＤＦ－４）に特異的なＥＬＩＳＡによって判定する（Ｎａｋａｇａｗａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１３；４１（８）：７４２－８）。

血小板中でＧＦＰが発現されない場合には、細胞膜と関連することが示されているミリストールタグ付けＧＦＰ（Ｔｈｏｎ ＪＮ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０；１９１（４）：８６１－７４） を使用する。この場合、ＧＦＰは、ＭＫの膜と関連し、血小板の膜の一部となる可能性が高い。顕微鏡検査およびフローサイトメトリーを行い、ＧＦＰ発現を観察し、定量化する。ＳＥＡＰまたはルシフェラーゼが血小板の一部ではない場合、レポーター遺伝子は、アミノ酸配列のＬＫＮＧ（配列番号１）でタグ付けされてもよく、この配列は、巨核球タンパク質の標的化および／または保存に直接関与することが示されている（Ｒｈｅｅ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓｉｓ ２００６；４４（４）：２０２－１８）。これを達成するために、ＬＫＮＧ（配列番号１）を、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲのいずれかでレポーター分子に融合させて、ＭＫにおける顆粒パッケージングを標的化することができる。

実施例３：新規血小板受容体を操作するための指向性進化アプローチを開発および検証する
血小板は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）シグナル伝達を介して、生物活性分子を分泌するよう活性化され得る（Ｅｌ Ｇｏｌｌｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５；２８０（３４）：３０３２９－３５）。ＧＰＣＲは、広範な正常状態および病的状態に関与するため、多くの治療標的の焦点となっている、多目的な膜タンパク質の巨大ファミリーである。インビボでのＧＰＣＲシグナル伝達に対する正確な時間空間的な制御を得るために、デザイナードラッグにより排他的に活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ：Ｄｅｓｉｇｎｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ Ｄｒｕｇｓ）を操作して、哺乳動物の脳における振る舞いと生理学的なプロセスを選択的に、急速で可逆的に、および用量依存的に制御した（Ｄｅａｎｓ ＴＬ，Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ ＪＨ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００９；２０（５）：５３７－４４）。これらの操作された受容体は、内因性リガンドを有さないように設計されており、リガンド非存在下ではバックグラウンド活性が無く、そして別手段により薬理学的に不活性な化合物は、ナノモル濃度の薬理学的に不活性で代謝的に安定な低分子により、ＧＰＣＲを排他的に、および強力に活性化する（Ｄｅａｎｓ ＴＬ，Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ ＪＨ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１０；６（６）：４９９－５０１）。血小板は、自身の活性化手段の一つとしてＧＰＣＲを使うため、これら細胞の活性化を空間的および時間的に制御するための戦略として血小板上のＤＲＥＡＤＤを設計することが可能である。

実験および方法。 ＤＲＥＡＤＤはすでに操作されて、Ｇ_q、Ｇ_i、およびＧ_sのＧタンパク質共役シグナル伝達経路を介したニューロンシグナル伝達を非侵襲的に制御すること可能である。合成リガンドによって活性化され、生物活性を有さない受容体を操作するために、血小板活性化を行うＧＰＣＲを改変して、内因性基質／リガンド認識よりも合成リガンドを優先させる。このような改変ＧＰＣＲの先端には、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）があり、この受容体は、Ｇタンパク質のＧ_q、Ｇ₁₂／Ｇ₁₃および一部の場合にはＧ_iファミリーに結合する。ＰＡＲはトロンビンにより活性化され、トロンビンは最も効果の高い血小板の活性化因子である（Ｅｌ Ｇｏｌｌｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５；２８０（３４）：３０３２９－３５）。４つのＰＡＲのうち、ＰＡＲ１およびＰＡＲ４はヒト血小板上に存在し、マウス血小板はＰＡＲ３およびＰＡＲ４を発現する（Ｅｌ Ｇｏｌｌｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５；２８０（３４）：３０３２９－３５）。このため、指向性分子進化アプローチが行われ、薬理学的に不活性な化合物のクロザピン－Ｎ－オキシド（ＣＮＯ）により活性化され、天然リガンドのトロンビンでは活性化されないＰＡＲファミリーの生成を促進する。これらの実験に関し、ＣＮＯが合成リガンドとして使用される。今日最も広く使用されているＤＲＥＡＤＤは、ＣＮＯをリガンドとして使用しており、ＣＮＯが、天然受容体に対するアフィニティを欠く薬理学的に不活性な分子であり、ナノモル濃度でＧＰＣＲシグナル伝達の空間的および時間的な制御を活性化することが示されている（Ｄｅａｎｓ ＴＬ，Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ ＪＨ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００９；２０（５）：５３７－４４；およびＤｅａｎｓ ＴＬ，Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ ＪＨ．Ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｏｆ ａ ｃｅｌｌ：ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１０；６（６）：４９９－５０１）。

指向性分子進化は、ランダム突然変異誘導、スクリーニング、次いで選択の連続したラウンドによって、特定の特性をタンパク質に与える技術である。所望の基準を満たすタンパク質進化の成功は、スクリーニングされるライブラリーの生物学的多様性およびサイズ、スクリーニングアッセイの質、ならびに鋳型から所望の結果への機能的ジャンプのサイズを含む、実験設計のいくつかの態様に依存する。主にＧ_qシグナル伝達経路に会合するＰＡＲ受容体の場合、数個から適度な数の機能的工程を実施して、ＣＮＯに対するこれら受容体を進化させて、シグナル伝達を活性化させることが予測される。これは、元々のＤＲＥＡＤＤ標的受容体もＧ_qシグナル伝達経路を介してシグナル伝達を行うためである。デザイナードラッグに加えて、血小板を活性化する他の薬剤や組織特異的ペプチドに応答し、当該組織への結合時に自身の生物学的搭載物を放出するように受容体を進化させることも可能である。

ＤＲＥＡＤＤを生成する実験手順は、かなり単純であると報告されている。簡潔に述べると、選択受容体にランダム突然変異誘導を行い、多くの異なる変異体のライブラリーを作製する。新たな変異受容体とＣＮＯの相互作用を検証し、ＣＮＯに結合することができる変異体を選択する。より多くのランダム突然変異誘導のラウンドを行い、ＣＮＯとさらに良好な相互作用をする変異体を選択する。最良の変異体候補を選択して、哺乳動物細胞で発現させて、その後に結合アッセイを実施する。

酵母中でＧＰＣＲ発現を行うことができない場合、多コピー数の発現プラスミドを選択する。ＧＰＣＲを過剰発現する多コピー数プラスミドを用いて実験開始すると、酵母に毒性がある場合があり、細胞間でコピー数により大きな変動が生じて、その結果、コロニー間でＧＰＣＲの発現レベルが異なり、実験の再現性が低下する。最後に、複数の酵母株を使用して、指向性変異誘導アプローチを最大化する。

実施例４：循環腫瘍細胞の標的化破壊のために操作された血小板
癌の拡散または転移を予防するために血小板を使用することの治療利益を理解するための実験を行った。転移は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）とも呼ばれる一部の癌細胞が、原発腫瘍部位から離脱して血流に入り、様々な場所で他の組織および器官に侵入するときに発生する、癌関連死の主な原因である（図５Ａ）。ＣＴＣが血流に入ると、癌が二次器官に到達して拡散することを防ぐことは困難であるため、患者におけるＣＴＣの存在は予後不良と関連している。したがってＣＴＣの標的化は、抗癌療法の標的ともなり得る。血小板とＣＴＣの相互作用は、物理的な関連性、および血小板活性化とＣＴＣ浸潤を引き起こす双方向性のコミュニケーションの両方の結果として転移に影響を与えること、そして原発腫瘍形成場所から離れた場所での転移性コロニー形成につながることが示されている（Ｅｒｐｅｎｂｅｃｋ Ｌ，Ｓｃｈｏｎ ＭＰ．Ｂｌｏｏｄ ２０１０；１１５（１７）：３４２７－３６；Ｌａｂｅｌｌｅ Ｍ，Ｈｙｎｅｓ ＲＯ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１２；２（１２）：１０９１－９；およびＳｔｅｇｎｅｒ Ｄ，Ｄｕｔｔｉｎｇ Ｓ，Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ Ｂ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１４；１３３ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１４９－５７）。したがって操作された血小板は、癌患者の転移に対抗するためのスマートな治療剤として役立つ可能性がある。

本明細書において、ＣＴＣの標的化破壊のための治療法として機能する操作された血小板を生成し、ＣＴＣが他の器官および組織に侵入することを防ぐための、合成生物学のアプローチを使用して操作された多能性細胞が開示される。血小板は、典型的には、その前駆細胞である巨核球（ＭＫ）の細胞質で形成される多量のタンパク質を貯蔵する分泌顆粒で満たされている（Ｄｅｕｔｓｃｈ ＶＲ，Ｔｏｍｅｒ Ａ．Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２００６；１３４（５）：４５３－６６；およびＭａｃｈｌｕｓ ＫＲ，Ｉｔａｌｉａｎｏ ＪＥ，Ｊｒ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３；２０１（６）：７８５－９６）。血小板は、ＭＫの伸長から生成される細胞質ブレブであるため、血小板は、ＭＫ細胞質中に存在するタンパク質で満たされており、核を含有しない（図５Ｂ）。したがって、前駆幹細胞で使用される外因性ＤＮＡは、血小板中には存在しない。そのため、このアプローチは、ＣＴＣの標的破壊のための実用的な治療選択肢となりえる（図５Ｃ）。合成遺伝子回路、血小板操作、および計算モデリングを使用して、いつ、どこで、およびどの癌特異的受容体を標的にするかを制御する遺伝子ネットワークをＭＫにおいて開発して、ＣＴＣを標的化および死滅させるための空間的および時間的な制御を伴って、血小板を再プログラミングする。合成遺伝子回路の骨格には、オン／オフの細胞運命スイッチが含まれており、このスイッチによりインビトロでの長期的なＭＫの拡張（オン状態）と、血小板の産生（オフ状態）が可能となる（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ，Ｔａｋａｙａｍａ Ｎ，Ｈｉｒａｔａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１４；１４（４）：５３５－４８）（図１０Ａ）。構築される合成遺伝子ネットワークの最初のものは、モノクローナル抗体を操作して特定の癌受容体を標的とすることを介した、ＣＴＣの特異的死滅を可能とするものである。構築される合成遺伝子ネットワークの２番目のものは、多能性幹細胞の運命を誘導してＭＫを拡張させる遺伝子ツールであり、血小板産生の間に生物活性分子を血小板に搭載させる時間的制御である。全体として、これらの操作された血小板は、多数のＣＴＣの除去を可能にして、転移を著しく減少させ、または防ぐ。本明細書に記載される治療法は、高い柔軟性、精度、およびパーソナライズをもたらし得る。さらに、本明細書に記載される遺伝子回路および設計原理は、任意の腫瘍特異的受容体と組み合わせることができ、多くの癌を治療および／または管理するために使用することができる、汎用プラットフォームとしての役割を果たす。本明細書に記載される技術は、細胞ベースの免疫療法と、癌研究に対する合成生物学とを組み合わせて、既存の癌治療を変える可能性がある。

この目的のために、これらの遺伝ツールを使用して、多能性幹細胞における遺伝子発現を厳密に制御し得ることが実証された（図７および図８）。例えば図７Ａは、ＬａｃＩリプレッサータンパク質がＱＦおよびＧＦＰの上流のｌａｃオペレーター部位に結合することを示す。これにより、ＱＦおよびＧＦＰの転写抑制が生じる。図７Ｂに示されるように、ＩＰＴＧの存在下で、ＬａｃＩタンパク質に結合し、リプレッサータンパク質の立体構造変化が生じる。これにより、リプレッサータンパク質はもはやｌａｃオペレーター部位に結合しなくなり、ＱＦの転写が可能となる。ＱＦタンパク質が産生されると、それらはＱＵＡＳ結合部位に結合し、ＧＦＰの転写を活性化し、ＧＦＰの安定的な発現をもたらす。

循環腫瘍細胞を標的化し、破壊するように血小板を操作する。細胞は複雑でダイナミックなシステムであり、生涯にわたってこれらのシグナルを連続的に感知し、統合し、保存し、および応答する優れた能力を有しており、細胞療法は次世代の癌治療にとって魅力的な手段である。血小板はＣＴＣと普遍的に関連するため、ＣＴＣを標的とする癌治療の状況下において血小板は魅力的である。多くの研究により、ＣＴＣは血小板を誘引して結合するための様々な受容体を発現していること、結合すると、その細胞内容物の活性化と放出を促進することが示されている（Ｌｏｕ ＸＬ，Ｓｕｎ Ｊ，Ｇｏｎｇ ＳＱ，Ｙｕ ＸＦ，Ｇｏｎｇ Ｒ，Ｄｅｎｇ Ｈ．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；２７（５）：４５０－６０；およびＹｕ ＬＸ，Ｙａｎ Ｌ，Ｙａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１４；５：５２５６）。合成生物学は、細胞を再プログラミングし得る方法を変革し、遺伝子部分をより複雑な遺伝子回路に組み立てることで、細胞挙動をより確実に、およびより予測可能に制御する手段を提供する（Ｗｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ ＭＳ，Ｄｅａｎｓ ＴＬ．Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１８；４５（７）：５９９－６１４）。血小板の前駆細胞である巨核球は、合成生物学を介した高レベルの再プログラミングに適している。本明細書において、ＣＴＣ受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体に融合された不活性分割毒素で満たされるように操作された血小板が開示される。分割毒素の各半分がＣＴＣによって内部移行されると、当該部分は自発的にアセンブリされて機能的な毒性タンパク質が生成され、癌細胞を殺傷する。

本明細書では、ＣＴＣ破壊をプログラム化された血小板を産生するプラットフォームの生成を目的として、ＣＴＣを標的とし、転移に対抗するための次世代癌療法を立案するための合成生物学的アプローチを使用する方法が開示される。具体的には、遺伝子スイッチネットワークを設計および構築して、多能性幹細胞がＭＫへ分化するように誘導し、血小板に装填される分割毒素の量を調整する。これにより、装填と分化の的確なバランスが確保され、それに伴い分割毒素の人工的な装填は、血小板の発生に干渉しない。これらの分割毒素は、分割毒素の標的化送達を目的として、ＣＴＣで過剰発現されていることが判明している特定の受容体を標的とする合成モノクローナル抗体の一部として設計される。このアプローチにより、２つの異なる受容体を使用したＣＴＣの標的化が可能になり、毒性タンパク質の不活性側の両方を受け取る細胞が死滅され、したがって全身的な毒性の回避が可能となる。さらに、数学的モデリング、および回路とタンパク質装填の特徴から導かれるデータを介して、ＭＫにおけるこれら回路の特性を規定する設計ルールが記載される。これらのルールは、ＭＫから血小板への治療用ペプチドのパッケージング用の新規遺伝子ツールを体系的に設計、構築、および特徴解析して、様々な条件下でのこれら回路の性能の調整を可能にし、および体系的に合成血小板活性を調整する方法についての手引きを提供する。

ＣＴＣを標的とする分割毒素タンパク質を伴うモノクローナル抗体の設計。健康な細胞と癌性細胞との識別は、すべての癌治療の成功にとって重要な特性である。モノクローナル抗体系の治療は、過去２０年間にわたり血液悪性腫瘍および固形腫瘍に対する有望な治療戦略として確立されている。モノクローナル抗体による腫瘍関連抗原標的化を目的としたモノクローナル抗体が３０種を超えて存在し、一部はＦＤＡによる承認を受けている（Ｓｃｏｔｔ ＡＭ，Ａｌｌｉｓｏｎ ＪＰ，Ｗｏｌｃｈｏｋ ＪＤ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ ２０１２；１２：１４）。使用されているモノクローナル抗体の１種としては、細胞死をもたらす搭載物（例えば、抗体に共有結合した薬剤、毒素など）を送達する抗体が挙げられる。これらの抗体は、典型的には、患者に注入され、癌細胞に直接結合する。しかし癌細胞で過剰発現される、いわゆる癌特異的抗原の多くは、健康な細胞でも低レベルで存在する場合があり、健康な細胞にも結合するこれらの抗体による有害な副作用が生じている。本明細書に開示されるアプローチでは、典型的には血小板はＣＴＣに引き付けられるため、合成抗体を癌細胞に直接持っていき、健康な細胞に結合してしまう機会を最小化する。

ＣＴＣにおいて分割インテインタンパク質を使用することの概念実証として、分割ＧＦＰ（ＶＭＡインテインを含むＮ末端ＧＦＰについては、Ａｄｄｇｅｎｅ社のプラスミド＃７０２２５、ＶＭＡインテインを含むＣ末端ＧＦＰについては、プラスミド＃７０２２６が利用可能）を、応答特徴解析のレポーターとして使用する。ＧＦＰおよびＶＭＡインテインのＮ末端配列を、乳癌細胞の標的化に使用されるＨＥＲ２抗体のＦＣ領域内にコードさせる（Ｓｃｏｔｔ ＡＭ，Ａｌｌｉｓｏｎ ＪＰ，Ｗｏｌｃｈｏｋ ＪＤ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ ２０１２；１２：１４）。ＨＥＲ２陽性の転移性乳癌細胞は、ＡＴＣＣから購入される（＃ＣＲＬ２３１６、＃ＣＲＬ２３２０、または＃ＣＲＬ２３４３）。実験は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、Ａｄｄｇｅｎｅ社のＮ末端ＧＦＰおよびＣ末端ＧＦＰ、ならびにＶＭＡインテインプラスミドの両方でＨｅＬａ細胞をトランスフェクトすることから開始して、タンパク質の半分のみではＧＦＰ発現がなく、両方のプラスミドでＧＦＰ発現が観察されるようにする。次に、標準的な分子生物学技術を使用して、ＨＥＲ２抗体のＦＣ領域にＮ末端ＧＦＰもしくはＣ末端ＧＦＰ、またはＶＭＡインテインのいずれかを含有されるように、受容体を設計する（図７Ｂ）。ＨＥＲ２抗体のＦＣ領域を、ＦＣ領域内にＮ末端またはＣ末端の分割タンパク質のいずれかを有するように操作する。この抗体の両バージョンが乳癌細胞にトランスフェクトされると、ＧＦＰ発現は、Ｎ末端およびＣ末端の分割タンパク質抗体の両方を受けた細胞で観察される。乳癌細胞におけるＧＦＰ発現を判定した後、Ｎ末端およびＣ末端のＧＦＰタンパク質をα－サルシンと交換し、細胞死の実験を実施する。

インテインが機能性ＧＦＰタンパク質を再構築する前に、合成受容体がリソソーム内で完全に分解された場合、例えば、様々なウイルスコーティング、分割タンパク質用の異なるリンカーなどを含む他の送達方法が調査される。受容体が細胞内に入るが、ＧＦＰを発現しない場合（細胞可溶化物に対するｑＲＴ－ＰＣＲにより発現が無いことが確認される）、抗体に対し、異なる設計戦略が実施される。

分割インテインタンパク質を有するモノクローナル抗体で血小板を装填する。合成生物学ツールを使用することにより、ＭＫは、血小板分泌、および周辺癌細胞による取り込みの標的とされる治療レベルのタンパク質カーゴを発現するようにプログラム化され得る。概念実証として、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、およびルシフェラーゼをＭＫで発現させ、治療用搭載物の送達ビヒクルとして血小板を使用することの有効性を判定する。この一連のレポーター分子は、カーゴの装填および送達プロセスの様々な態様を分析するために使用することができるために選択された。ＥＧＦＰを使用して、可溶性トランスジェニックカーゴが分泌顆粒内にパッケージングされているかを判定する。ＳＥＡＰを使用して、インビトロで増殖した細胞の培地内へのカーゴ放出の程度を分析する。ルシフェラーゼを使用して、内因性血小板と同じように、外傷部位で操作された血小板が富化されているかを判定し、インビボモデルにこれら実験が移行した際に使用されるかを判定する。近年の研究により、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から誘導された不死化ＭＫは、早期ＭＫの拡張に関する３つの遺伝子（ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、およびＢＣＬ－ＸＬ）の過剰発現により拡張され得ることが示されており、その発現が終了したとき、細胞は成熟し、血小板を産生し得るようになる（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ，Ｔａｋａｙａｍａ Ｎ，Ｈｉｒａｔａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１４；１４（４）：５３５－４８；およびＩｔｏ Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２０１８；１７４（３）：６３６－４８）。血小板の放出については、骨髄において見られるようなせん断ストレスを維持する様々な乱流系バイオリアクターが使用されている（Ｉｔｏ Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ２０１８；１７４（３）：６３６－４８；Ａｖａｎｚｉ ＭＰ，Ｏｌｕｗａｄａｒａ ＯＥ，Ｃｕｓｈｉｎｇ ＭＭ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＭＬ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＷＢ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０１６；５６（１）：１７０－８；Ｂｌｉｎ Ａ，Ｌｅ Ｇｏｆｆ Ａ，Ｍａｇｎｉｅｚ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１６；６：２１７００；Ｄｉ Ｂｕｄｕｏ ＣＡ，Ｗｒａｙ ＬＳ，Ｔｏｚｚｉ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１５；１２５（１４）：２２５４－６４；Ｎａｋａｇａｗａ Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ，Ｎａｋａｊｉｍａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１３；４１（８）：７４２－８；およびＴｈｏｎ ＪＮ，Ｍｏｎｔａｌｖｏ Ａ，Ｐａｔｅｌ－Ｈｅｔｔ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０；１９１（４）：８６１－７４）（図９Ａ）。血小板を操作してＣＴＣを標的化して破壊するために、ＭＫにおいて、成熟するにつれて血小板内に装填される生物活性タンパク質を産生するように遺伝子回路を構築する（図９Ｂ）。これを達成するために、ＭＫ増殖に使用される３つの遺伝子をＬｏｘＰ部位に隣接させ、血小板に装填されることが望まれる生物活性タンパク質の遺伝子を、２番目のＬｏｘＰ部位の下流に置く。Ｃｒｅリコンビナーゼの非存在下では、３つの遺伝子はオンの状態に留まり、ＭＫの増殖を促進する。しかしＣｒｅリコンビナーゼが細胞に（リポフェクタミンまたはウイルス導入を使用した一過性のトランスフェクションを介して）添加されると、ＤＮＡに相同組み換えを起こさせ、ＬｏｘＰ部位に隣接される３つの遺伝子が切り出される。これにより、血小板に装填されるタンパク質に対する下流遺伝子がオンになる。初期実験ではＧＦＰを使用して、ＭＫにおける発現、および血小板へのタンパク質装填を簡単に評価および特徴解析する。

ＧＦＰが血小板で発現されていない場合、細胞膜と関連することが示されているミリストールタグ付けＧＦＰ（Ｒｈｅｅ ＪＭ，Ｐｉｒｉｔｙ ＭＫ，Ｌａｃｋａｎ ＣＳ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓｉｓ ２００６；４４（４）：２０２－１８）を使用する。この場合、ＧＦＰは、ＭＫの膜と関連し、血小板の膜の一部となる可能性が高い。顕微鏡検査およびフローサイトメトリーを行い、ＧＦＰ発現を観察し、定量化する。ＳＥＡＰまたはルシフェラーゼが血小板の一部ではない場合、レポーター遺伝子は、アミノ酸配列のＬＫＮＧ（配列番号１）でタグ付けされてもよく、この配列は、巨核球タンパク質の標的化および／または保存に直接関与することが示されている（Ｅｌ Ｇｏｌｌｉ Ｎ，Ｉｓｓｅｒｔｉａｌ Ｏ，Ｒｏｓａ ＪＰ，Ｂｒｉｑｕｅｔ－Ｌａｕｇｉｅｒ Ｖ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５；２８０（３４）：３０３２９－３５）。これを達成するために、ＬＫＮＧ（配列番号１）配列を、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲのいずれかでレポーター分子に融合させて、ＭＫにおける顆粒パッケージングを標的化することができる。

装填血小板を用いて腫瘍細胞を死滅させる。血小板は血流中でＣＴＣと関連し、血小板活性化と腫瘍細胞のシグナル伝達を促進することにより、転移において機能を果たす（Ｅｒｐｅｎｂｅｃｋ Ｌ，Ｓｃｈｏｎ ＭＰ．Ｂｌｏｏｄ ２０１０；１１５（１７）：３４２７－３６；Ｇａｙ ＬＪ，Ｆｅｌｄｉｎｇ－Ｈａｂｅｒｍａｎｎ Ｂ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１；１１（２）：１２３－３４；Ｌｉ Ｎ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：Ｔｏ ｈｅｌｐ ｔｈｅ “ｖｉｌｌａｉｎ” ｔｏ ｄｏ ｅｖｉｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１６；１３８（９）：２０７８－８７；Ｂｏｒｓｉｇ Ｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００８；８（８）：１２４７－５５；Ｈｏｎｎ ＫＶ，Ｔａｎｇ ＤＧ，Ｃｒｉｓｓｍａｎ ＪＤ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：ａ ｃａｕｓａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ？ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ １９９２；１１（３－４）：３２５－５１；Ｗａｒｄ Ｙ，Ｌａｋｅ Ｒ，Ｆａｒａｊｉ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ Ｐｒｏｍｏｔｅ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｖｉａ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＣＤ９７ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈａｔ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ Ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０１８；２３（３）：８０８－２２；およびＹｕ ＬＸ，Ｙａｎ Ｌ，Ｙａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｕｍｏｕｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｖｉａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＴＬＲ４ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌ－ｒｅｌｅａｓｅｄ ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ１ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１４；５：５２５６）。初期実験は、血小板放出のための乱流を提供するＷＡＶＥバッグシステムを使用して装填血小板を作製する（Ｉｔｏ Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｔｕｒｂｕｌｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｏ Ｅｎａｂｌｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃａｌｅ Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ ２０１８；１７４（３）：６３６－４８）。実際にはこの方法は臨床的に意義のある数の血小板を産生しないが、小規模な操作された血小板の採集を行って、転移性乳癌細胞株で試験することが可能となる。次に、血小板の産生は、最適な乱流、渦度、およびせん断を提供することが示されている新しいＶｅｒＭＥＳバイオリアクターを使用することによりスケールアップすることができ、臨床的に意義のある数の血小板の産生が可能となる（Ｉｔｏ Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２０１８；１７４（３）：６３６－４８）。操作された血小板と腫瘍細胞との相互作用の効果を調査するために、乳癌細胞が、癌細胞周辺の操作された血小板の凝集および活性化を刺激する能力が測定され、破壊された血小板から分泌された生物活性タンパク質の取り込みに加えて、癌細胞内への転移もモニタリングされる。また、実験によって、操作された受容体上のＧＦＰに関する、血小板から腫瘍細胞への移動もモニタリングされる。腫瘍細胞中でＧＦＰが観察されたら、ＧＦＰは、α－サルシンで置換される。腫瘍細胞の死は、生死アッセイおよび集団数のカウントで測定される。

ｉＰＳ細胞を使用してＭＫを作製し、ＭＫを遺伝子改変して、血小板にパッケージングされる所望の生物活性タンパク質を大量生産して標的化送達を行うことにより、当該治療法は、より多くの患者に利益をもたらしながら、高度なパーソナライズを維持することが可能となる。

Claims (77)

1. 核酸構築物であって、
   ａ） ｉ．第一の組み換え部位、
   ｉｉ．ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、およびＢＣＬ－ＸＬ、ならびに
   ｉｉｉ．第二の組み換え部位、に動作可能に連結されたプロモーター、および
   ｂ） 操作された抗体配列をコードすることができる配列であって、前記操作された抗体配列は、インテイン配列に隣接される分割毒素配列を含み、および前記操作された抗体配列をコードすることができる配列は、前記プロモーターのフレーム外にある、配列、を含む、核酸構築物。
2. 前記プロモーターが、制御可能である、請求項１に記載の核酸構築物。
3. 前記プロモーターが、構造的に活性である、請求項１に記載の核酸構築物。
4. 前記プロモーターが、ＣＭＶ、ＲＳＶ、Ｕ６、ベータアクチン、または伸長因子プロモーターである、請求項１に記載の核酸構築物。
5. 前記第一または第二の組み換え部位が、ｌｏｘＰ、ａｔｔＰまたはＢｘｂ１である、請求項１に記載の核酸構築物。
6. ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、およびＢＣＬ－ＸＬが、前記第一の組み換え部位および前記第二の組み換え部位に隣接される、請求項１に記載の核酸構築物。
7. 前記プロモーターが、一つ以上の培地調節因子により制御される、請求項１に記載の核酸構築物。
8. 前記一つ以上の培地調節因子が、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、キナ酸、またはオーキシンである、請求項７に記載の核酸構築物。
9. 前記一つ以上の培地調節因子が、前記プロモーターを活性化する、請求項７に記載の核酸構築物。
10. 一つ以上のリコンビナーゼが、Ｃｒｅ、ｐｈｉＣ３１、またはＢｘｂ１である、請求項１に記載の核酸構築物。
11. 前記一つ以上のリコンビナーゼが、リコンビナーゼ部位を切断し、前記操作された抗体配列を、前記プロモーターとフレーム内に導入する、請求項１０に記載の核酸構築物。
12. 前記操作された抗体配列は、第一のインテイン断片に隣接される分割毒素配列を含み、前記インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、前記分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端である、請求項１１に記載の核酸構築物。
13. 前記操作された抗体配列は、インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含み、前記インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、前記分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端である、請求項１２に記載の核酸構築物。
14. 請求項１～１３に記載の核酸構築物のいずれかを含む、多能性幹細胞。
15. 前記多能性幹細胞は、造血前駆幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１４に記載の多能性幹細胞。
16. 前記多能性幹細胞が、臍帯血または骨髄から誘導される、請求項１４に記載の多能性幹細胞。
17. 前記ｉＰＳＣが、血液細胞から誘導される、請求項１４に記載の多能性幹細胞。
18. 請求項１～１３に記載の核酸構築物のいずれかを含む、巨核球。
19. 核酸構築物を含む巨核球であって、前記核酸構築物が、
    ｉ．第一の組み換え部位、
    ｉｉ．第二の組み換え部位、および
    ｉｉｉ．操作された抗体配列をコードすることができる配列であって、前記操作された抗体配列は、インテイン配列に隣接される分割毒素配列を含む、配列、に動作可能に連結されたプロモーターを含み、
    前記操作された抗体配列をコードすることができる前記配列は、前記プロモーターとフレーム内にある、巨核球。
20. 前記操作された抗体配列が、
    ａ）第一のインテイン断片に隣接される分割毒素配列であって、前記分割毒素断片が、インテインＮ断片に対してＮ末端である、分割毒素配列、
    ｂ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列であって、前記分割毒素断片が、インテインＣ断片に対してＣ末端である、分割毒素配列、または
    ｃ）それらの組み合わせ、を含む、請求項１９に記載の巨核球。
21. ａ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体であって、前記インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、および前記分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端である、操作された抗体、
    ｂ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体であって、前記インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、および前記分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端である、操作された抗体、または
    ｃ）第一のインテイン断片に隣接される第一の分割毒素配列を含む第一のＦｃ領域であって、前記第一のインテイン断片は、インテインＮ断片を含み、前記第一の分割毒素配列は、前記インテインＮ断片に対してＮ末端である、第一のＦｃ領域、および第二のインテイン断片に隣接される第二の分割毒素配列を含む第二のＦｃ領域であって、前記第二のインテイン断片は、インテインＣ断片を含み、前記第二の分割毒素配列は、前記インテインＣ断片に対してＣ末端である、第二のＦｃ領域、を含む操作された抗体、を含む、操作された巨核球。
22. 前記インテインＮ断片に対してＮ末端である前記分割毒素配列、および前記インテインＣ断片に対してＣ末端である前記分割毒素配列、または前記第一および前記第二の分割毒素配列は、同じ毒素の連続した断片である、請求項２１に記載の操作された巨核球。
23. 前記インテインＮ断片に対してＮ末端である前記分割毒素配列、および前記インテインＣ断片に対してＣ末端である前記分割毒素配列、または前記第一および前記第二の分割毒素配列は、α－サルシンの断片である、請求項２１に記載の操作された巨核球。
24. 前記インテインＣ断片および前記インテインＮ断片、または前記第一および第二のインテイン断片は、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡインテインの断片である、請求項２１に記載の操作された巨核球。
25. 前記Ｆｃ領域、または前記第一のＦｃ領域と前記第二のＦｃ領域は、ＩｇＧ抗体またはその断片のＦｃ領域である、請求項２１に記載の操作された巨核球。
26. 前記ＩｇＧ抗体またはその断片が、腫瘍関連抗原認識部位を含む、請求項２６に記載の操作された巨核球。
27. 前記ＩｇＧ抗体またはその断片が、抗Ｈｅｒ－２抗体である、請求項２６に記載の操作された巨核球。
28. ａ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体であって、前記インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、および前記分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端である、操作された抗体、
    ｂ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体であって、前記インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、および前記分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端である、操作された抗体、または
    ｃ）第一のインテイン断片に隣接される第一の分割毒素配列を含む第一のＦｃ領域であって、前記第一のインテイン断片は、インテインＮ断片を含み、前記第一の分割毒素配列は、前記インテインＮ断片に対してＮ末端である、第一のＦｃ領域、および第二のインテイン断片に隣接される第二の分割毒素配列を含む第二のＦｃ領域であって、前記第二のインテイン断片は、インテインＣ断片を含み、前記第二の分割毒素配列は、前記インテインＣ断片に対してＣ末端である、第二のＦｃ領域、を含む操作された抗体、を含む、操作された血小板。
29. 前記インテインＮ断片に対してＮ末端である前記分割毒素配列、および前記インテインＣ断片に対してＣ末端である前記分割毒素配列、または前記第一および前記第二の分割毒素配列は、同じ毒素の連続した断片である、請求項２８に記載の操作された血小板。
30. 前記インテインＮ断片に対してＮ末端である前記分割毒素配列、および前記インテインＣ断片に対してＣ末端である前記分割毒素配列、または前記第一および前記第二の分割毒素配列は、α－サルシンの断片である、請求項２８に記載の操作された血小板。
31. インテインＣ断片および前記インテインＮ断片、または前記第一および第二のインテイン断片は、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡインテインの断片である、請求項２８に記載の操作された血小板。
32. 前記Ｆｃ領域、または前記第一のＦｃ領域と前記第二のＦｃ領域は、ＩｇＧ抗体またはその断片のＦｃ領域である、請求項２８に記載の操作された血小板。
33. 前記ＩｇＧ抗体またはその断片が、腫瘍関連抗原認識部位を含む、請求項３２に記載の操作された血小板。
34. 前記ＩｇＧ抗体またはその断片が、抗Ｈｅｒ－２抗体である、請求項３２に記載の操作された血小板。
35. ａ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体を含む操作された血小板の第一の亜群であって、前記インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、および前記分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端である、第一の亜群、および
    ｂ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域を含む操作された抗体を含む操作された血小板の第二の亜群であって、前記インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、および前記分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端である、第二の亜群、を含む、操作された血小板の群。
36. 前記インテインＮ断片に対してＮ末端である前記分割毒素配列、および前記インテインＣ断片に対してＣ末端である前記分割毒素配列は、分割毒素の断片であり、再結合されたとき、活性毒素を形成する、請求項３５に記載の操作された血小板の群。
37. 前記インテインＮ断片に対してＮ末端である前記分割毒素配列、および前記インテインＣ断片に対してＣ末端である前記分割毒素配列は、α－サルシンの断片である、請求項３６に記載の操作された血小板の群。
38. 前記インテインＣ断片および前記インテインＮ断片は、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡインテインの断片である、請求項３７に記載の操作された血小板の群。
39. 前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ抗体またはその断片のＦｃ領域である、請求項３５に記載の操作された血小板の群。
40. 前記ＩｇＧ抗体またはその断片が、腫瘍関連抗原認識部位を含む、請求項３９に記載の操作された血小板の群。
41. 前記ＩｇＧ抗体またはその断片が、抗Ｈｅｒ－２抗体である、請求項３９に記載の操作された血小板の群。
42. 操作された抗体であって、前記操作された抗体は、第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域を含み、
    ａ）前記第一のＦｃ領域は、インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含み、前記インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、および前記分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端であり、
    ｂ）前記第二のＦｃ領域は、インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含み、前記インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、および前記分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端である、操作された抗体。
43. 前記インテインＮ断片に対してＮ末端である前記分割毒素配列、および前記インテインＣ断片に対してＣ末端である前記分割毒素配列は、分割毒素の断片であり、再結合されたとき、活性毒素を形成する、請求項４２に記載の操作された抗体。
44. 前記インテインＮ断片に対してＮ末端である前記分割毒素配列、および前記インテインＣ断片に対してＣ末端である前記分割毒素配列は、α－サルシンの断片である、請求項４２に記載の操作された抗体。
45. 前記インテインＣ断片および前記インテインＮ断片は、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡインテインの断片である、請求項４２に記載の操作された抗体。
    
46. 前記第一のＦｃ領域および前記第二のＦｃ領域は、ＩｇＧ抗体またはその断片のＦｃ領域である、請求項４２に記載の操作された抗体。
47. 前記ＩｇＧ抗体またはその断片が、腫瘍関連抗原認識部位を含む、請求項４６に記載の操作された抗体。
48. 前記ＩｇＧ抗体またはその断片が、抗Ｈｅｒ－２抗体である、請求項４６に記載の操作された抗体。
49. 操作された抗体であって、前記操作された抗体は、Ｆｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域は、
    ａ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列であって、前記インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、および前記分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端である、分割毒素配列、または
    ｂ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列であって、前記インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、および前記分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端である、分割毒素配列、を含む、操作された抗体。
50. 前記インテインＮ断片に対してＮ末端である前記分割毒素配列、および前記インテインＣ断片に対してＣ末端である前記分割毒素配列は、分割毒素の断片であり、再結合されたとき、活性毒素を形成する、請求項４９に記載の操作された抗体。
51. 前記インテインＮ断片に対してＮ末端である前記分割毒素配列、および前記インテインＣ断片に対してＣ末端である前記分割毒素配列は、α－サルシンの断片である、請求項４９に記載の操作された抗体。
52. 前記インテインＣ断片および前記インテインＮ断片は、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡインテインの断片である、請求項４９に記載の操作された抗体。
53. 前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ抗体またはその断片のＦｃ領域である、請求項４９に記載の操作された抗体。
54. 前記ＩｇＧ抗体またはその断片が、腫瘍関連抗原認識部位を含む、請求項４９に記載の操作された抗体。
55. 前記ＩｇＧ抗体またはその断片が、抗Ｈｅｒ－２抗体である、請求項４９に記載の操作された抗体。
56. 操作された抗体を含む血小板を作製する方法であって、
    ａ）請求項１～１３に記載の核酸構築物のいずれかを含む多能性幹細胞を提供すること、
    ｂ）前記多能性幹細胞の巨核球への拡張が可能になる条件下で、前記多能性幹細胞を培地中で培養すること、
    ｃ）前記第一の組み換え部位と前記第二の組み換え部位との間の部位特異的な組み換え事象を触媒するのに適した条件下で、前記巨核球をリコンビナーゼに暴露し、それによりｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＢＣＬ－ＸＬを切り出し、前記操作された抗体配列をコードすることができる配列を、前記プロモーターとフレーム内に導入すること、および
    ｄ）前記巨核球を、血小板に分化させること、を含み、
    前記血小板が、前記操作された抗体配列によってコードされる前記操作された抗体を含む、方法。
57. 前記操作された抗体が、
    ａ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域であって、前記インテイン断片は、インテインＮ断片を含み、および前記分割毒素配列は、インテインＮ断片に対してＮ末端である、Ｆｃ領域、
    ｂ）インテイン断片に隣接される分割毒素配列を含むＦｃ領域であって、前記インテイン断片は、インテインＣ断片を含み、および前記分割毒素配列は、インテインＣ断片に対してＣ末端である、Ｆｃ領域、または
    ｃ）第一のインテイン断片に隣接される第一の分割毒素配列を含む第一のＦｃ領域であって、前記第一のインテイン断片は、インテインＮ断片を含み、前記第一の分割毒素配列は、前記インテインＮ断片に対してＮ末端である、第一のＦｃ領域、および第二のインテイン断片に隣接される第二の分割毒素配列を含む第二のＦｃ領域であって、前記第二のインテイン断片は、インテインＣ断片を含み、前記第二の分割毒素配列は、前記インテインＣ断片に対してＣ末端である、第二のＦｃ領域、を含む、請求項５６に記載の方法。
58. 前記培地が、一つ以上の培地調節因子を含む、請求項５６に記載の方法。
59. 前記一つ以上の培地調節因子が、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）である、請求項５８に記載の方法。
60. 前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅである、請求項５６に記載の方法。
61. 前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項５６に記載の方法。
62. 前記インテインＮ断片に対してＮ末端である前記分割毒素配列、および前記インテインＣ断片に対してＣ末端である前記分割毒素配列、または前記第一の分割毒素配列および前記第二の分割毒素は、分割毒素の断片であり、再結合されたとき、活性毒素を形成する、請求項５７に記載の方法。
63. 前記インテインＮ断片に対してＮ末端である前記分割毒素配列、および前記インテインＣ断片に対してＣ末端である前記分割毒素配列、または前記第一の分割毒素配列および前記第二の分割毒素配列は、α－サルシンの断片である、請求項５７に記載の方法。
64. 前記インテインＣ断片および前記インテインＮ断片は、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡインテインの断片である、または前記第一のインテイン断片および前記第二のインテイン断片は、Ｓ．セレビシエＳｃｅＶＭＡインテインの断片である、請求項５７に記載の方法。
65. 前記Ｆｃ領域、または前記第一のＦｃ領域と前記第二のＦｃ領域は、ＩｇＧ抗体またはその断片のＦｃ領域である、請求項５７に記載の方法。
66. 前記ＩｇＧ抗体またはその断片が、腫瘍関連抗原認識部位を含む、請求項６５に記載の方法。
67. 前記ＩｇＧ抗体またはその断片が、抗Ｈｅｒ－２抗体である、請求項６５に記載の方法。
68. 前記血小板を単離すること、または精製することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
69. ヒト患者を治療する方法であって、請求項２８～４１のいずれかに記載の血小板の一つ以上を前記患者に投与することを含む、方法。
70. 前記患者が、前記投与工程の前に、治療の必要があるとして特定されている、請求項６９に記載の方法。
71. 前記ヒト患者が、癌を有する、請求項６９に記載の方法。
72. 前記癌が、乳癌である、請求項７１に記載の方法。
73. 前記癌が、転移している、請求項７１に記載の方法。
74. 循環腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、循環腫瘍細胞と、請求項２８～４１に記載の血小板の一つ以上とを接触させることを含む、方法。
75. 前記接触は、ａ）前記インテインＮ断片を含むインテイン断片を、前記インテインＣ断片を含むインテイン断片に結合させて、インテイン複合体を形成させることであって、前記インテイン複合体は不活性である、形成させること、およびｂ）前記インテインＮ断片に対してＮ末端である前記分割毒素配列を、前記インテインＣ断片に対してＣ末端である前記分割毒素配列に結合させて、毒素複合体を形成させることであって、前記毒素複合体は活性である、形成させること、が可能となる条件下で実施され、それにより前記循環腫瘍細胞のアポトーシスが誘導される、請求項７４に記載の方法。
76. 前記循環腫瘍細胞が、癌抗原を発現する、請求項７４に記載の方法。
77. 前記癌抗原が、Ｈｅｒ－２である、請求項７６に記載の方法。

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