JP2022547885A - 腫瘍溶解性アデノウイルスと、cdk4/6阻害剤と、更なる治療的に活性な薬剤との組み合わせによる腫瘍の処置 - Google Patents
腫瘍溶解性アデノウイルスと、cdk4/6阻害剤と、更なる治療的に活性な薬剤との組み合わせによる腫瘍の処置 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、アデノウイルスと、CDK4阻害剤と、PARP阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、ヌトリン又はヌトリン誘導体を含む群から選択される少なくとも1種の更なる剤との組み合わせに関する。
Description
本発明は、腫瘍溶解性ウイルスとCDK4/阻害剤との組み合わせ、疾患、例えば、腫瘍の処置におけるこのような組み合わせの使用、疾患、例えば、腫瘍の処置における使用のための、CDK4/6阻害剤と組み合わせた腫瘍溶解性ウイルス、好ましくは、腫瘍溶解性アデノウイルス及び疾患、例えば、腫瘍の処置における使用のための、腫瘍溶解性ウイルス、好ましくは、腫瘍溶解性アデノウイルスと組み合わせたCDK4/6阻害剤に関する。
現在、数多くの治療概念が、腫瘍の処置に使用されている。外科手術を使用する以外に、化学療法及び放射線療法が優勢である。しかしながら、これらの技術は全て、かなりの副作用を伴う。複製選択的腫瘍溶解性ウイルスの使用により、腫瘍の処置のための新たなプラットフォームが提供される。それに関連して、ウイルス剤の選択的腫瘍内複製が開始され、これにより、ウイルス複製、感染した腫瘍細胞の溶解及びウイルスの隣接腫瘍細胞への拡散がもたらされる。ウイルスの複製能力は、腫瘍細胞に限られているため、正常な組織は、複製から免れ、このため、ウイルスによる溶解を免れる。
本発明の根底にある課題は、腫瘍溶解性ウイルス及び特に、アデノウイルスに基づく腫瘍治療の効力を増大させるための手段を提供することである。
これらの課題及び他の課題は、添付の独立請求項の主題によって解決され、好ましい実施態様は、添付の従属請求項から採用することができる。
また、本発明の根底にある課題は、第1の態様においても解決される。また、第1の態様は、アデノウイルスと、CDK4/6阻害剤と、PARP阻害剤、ブロモドメイン阻害剤及びヌトリン又はヌトリン誘導体を含む群から選択される少なくとも1種の更なる剤とを含む組み合わせによるこのような第1の態様の第1の実施態様でもある。
以下に、このような第1の態様の更なる実施態様が開示される。
実施態様2:アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様1の組み合わせ。
実施態様3:アデノウイルスが、YB-1依存的様式で複製している、実施態様1及び2のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様4:アデノウイルスが、核内にYB-1を欠いた細胞では複製欠損であるが、核内にYB-1を有する細胞では複製している、実施態様3の組み合わせ。
実施態様5:アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、E1B55kDa、E4orf6、E4orf3及びE3ADPを含む群から選択される、実施態様2~4のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様6:がん遺伝子タンパク質が、E1Aタンパク質である、実施態様5の組み合わせ。
実施態様7:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様6の組み合わせ。
実施態様8:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様6の組み合わせ。
実施態様9:E1Aタンパク質が、YB-1の核内への局在を誘引しない、実施態様6~8のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様10:がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質E1Aと比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様5~9のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様11:欠失が、CR3ストレッチの欠失並びにN末端の欠失及びC末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様10の組み合わせ。
実施態様12:E1Aタンパク質が、Rbに結合可能である、実施態様6~11のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様13:E1Aタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、該欠失が、好ましくは、CR1領域及び/又はCR2領域における欠失である、実施態様6~12のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様14:E1Aタンパク質が、Rbに結合不可能である、実施態様13の組み合わせ。
実施態様15:ウイルスが、E1A12Sタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様1~14のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様16:ウイルスが、E1A13Sタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~15のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様17:ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスE3領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~16のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様18:ウイルスが、E1B 19kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~17のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様19:ウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様1~18のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様20:ウイルスが、アデノウイルス血清型5である、実施態様1~19のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様21:アデノウイルスが、XVir-N-31、dl520、AdΔ24、AdΔ24-RGD、dl922-947、E1Ad/01/07、dl1119/1131、CB016、VCN-01、E1Adl1107、E1Adl1101、ORCA-010、Enadenotucirev及び機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様1~20のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様22:アデノウイルスが、XVir-N-31である、実施態様21の組み合わせ。
実施態様23:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、アデノウイルスE3領域が、機能的に不活性である、実施態様21の組み合わせ。
実施態様24:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、dl520が、E1B 19kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様21~23のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様25:アデノウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているdl520である、実施態様21~24のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様26:ウイルスが、YB-1をコードする、実施態様1~25のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様27:YB-1をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び/又はYB-1依存性プロモーターの制御下にある、実施態様26の組み合わせ。
実施態様28:YB-1依存性プロモーターが、アデノウイルスE2後期プロモーターである、実施態様27の組み合わせ。
実施態様29:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRbリン酸化を低下させる化合物である、実施態様1~28のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様30:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRb発現を低下させる化合物である、実施態様1~29のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様31:CDK4/6阻害剤が、PD0332991とも呼ばれるパルボシクリブ、LY-2835219とも呼ばれるアベマシクリブ、LEE011とも呼ばれるリボシクリブ、G1T28とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様1~30のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様32:CDK4/6阻害剤が、細胞をG1で停止させ、E2F1を阻害する、実施態様1~31のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様33:組成物が、さらに、PARP阻害剤を含む、実施態様1~32のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様34:PARP阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びBMN673を含む群から選択される、実施態様33の組み合わせ。
実施態様35:組成物が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を含む、実施態様1~32のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様36:ブロモドメイン阻害剤が、JQ-1、OTX-015、I-BET151、CPI-0610、I-BET762、CPI203、PFI-1及びMS436を含む群から選択される、実施態様35の組み合わせ。
実施態様37:組成物が、ヌトリン又はヌトリン誘導体をさらに含む、実施態様1~36のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様38:ヌトリンが、ヌトリン-3である、実施態様37の組成物。
実施態様39:ヌトリン誘導体が、NVP-HDM201、イダサヌトリン、AM-8553、SAR405838、ヌトリン-3a、AMG232を含む群から選択される、実施態様37及び38の組成物。
実施態様40:該組み合わせの成分が、別々に投与するためのものである、実施態様1~39のいずれか1つの組み合わせ。
実施態様41:該組み合わせの成分が、併用投与のためのものである、実施態様1~39のいずれか1つの組み合わせ。
また、本発明の根底にある課題は、第2の態様においても解決される。また、第2の態様は、アデノウイルスとCDK4/6阻害剤とを含む、疾患、より好ましくは、腫瘍又はがんの処置における使用のための、第1の態様(その任意の実施態様を含む)の組み合わせによるこのような第2の態様の第1の実施態様でもある。
以下に、このような第2の態様の更なる実施態様が開示される。
実施態様1:疾患、好ましくは、腫瘍又はがんの治療及び/又は予防のための方法における使用のための、アデノウイルスとCDK4/6阻害剤とを含む、
組み合わせ。
組み合わせ。
実施態様2:アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様1の使用のための組み合わせ。
実施態様3:アデノウイルスが、YB-1依存的様式で複製している、実施態様1及び2のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様4:アデノウイルスが、核内にYB-1を欠いた細胞では複製欠損であるが、核内にYB-1を有する細胞では複製している、実施態様3の使用のための組み合わせ。
実施態様5:アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、E1B55kDa、E4orf6、E4orf3及びE3ADPを含む群から選択される、実施態様2~4のいずれか1つの使用ための組み合わせ。
実施態様6:がん遺伝子タンパク質が、E1Aタンパク質である、実施態様5の使用ための組み合わせ。
実施態様7:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様6の使用のための組み合わせ。
実施態様8:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様6の使用のための組み合わせ。
実施態様9:E1Aタンパク質が、YB-1の核内への局在を誘引しない、実施態様6~8のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様10:がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質E1Aと比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様5~9のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様11:欠失が、CR3ストレッチの欠失並びにN末端の欠失及びC末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様10の使用のための組み合わせ。
実施態様12:E1Aタンパク質が、Rbに結合可能である、実施態様6~11のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様13:E1Aタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、該欠失が、好ましくは、CR1領域及び/又はCR2領域における欠失である、実施態様6~12のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様14:E1Aタンパク質が、Rbに結合不可能である、実施態様13の使用のための組み合わせ。
実施態様15:ウイルスが、E1A12Sタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様1~14のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様16:ウイルスが、E1A13Sタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~15のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様17:ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスE3領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~16のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様18:ウイルスが、E1B 19kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~17のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様19:ウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様1~18のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様20:ウイルスが、アデノウイルス血清型5である、実施態様1~19のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様21:アデノウイルスが、XVir-N-31、dl520、AdΔ24、AdΔ24-RGD、dl922-947、E1Ad/01/07、dl1119/1131、CB016、VCN-01、E1Adl1107、E1Adl1101、ORCA-010、Enadenotucirev及び機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様1~20のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様22:アデノウイルスが、XVir-N-31である、実施態様21の使用のための組み合わせ。
実施態様23:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、アデノウイルスE3領域が、機能的に不活性である、実施態様21の使用のための組み合わせ。
実施態様24:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、dl520が、E1B 19kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様21~23のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様25:アデノウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているdl520である、実施態様21~24のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様26:ウイルスが、YB-1をコードする、実施態様1~25のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様27:YB-1をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び/又はYB-1依存性プロモーターの制御下にある、実施態様26の使用のための組み合わせ。
実施態様28:YB-1依存性プロモーターが、アデノウイルスE2後期プロモーターである、実施態様27の使用のための組み合わせ。
実施態様29:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRbリン酸化を低下させる化合物である、実施態様1~28のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様30:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRb発現を低下させる化合物である、実施態様1~29のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様31:CDK4/6阻害剤が、PD0332991とも呼ばれるパルボシクリブ、LY-2835219とも呼ばれるアベマシクリブ、LEE011とも呼ばれるリボシクリブ、G1T28とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様1~30のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様32:CDK4/6阻害剤が、細胞をG1で停止させ、E2F1を阻害する、実施態様1~31のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様33:組成物が、さらに、PARP阻害剤を含む、実施態様1~32のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様34:PARP阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びBMN673を含む群から選択される、実施態様33の使用のための組み合わせ。
実施態様35:組成物が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を含む、実施態様1~32のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様36:ブロモドメイン阻害剤が、JQ-1、OTX-015、I-BET151、CPI-0610、I-BET762、CPI203、PFI-1及びMS436を含む群から選択される、実施態様35の使用のための組み合わせ。
実施態様37:組み合わせの成分が、別々の投与のためのものである、実施態様1~36のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様38:腫瘍細胞は、CDK4/6シグナル伝達経路が破壊されている、実施態様1~37のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様39:腫瘍細胞が、細胞周期の制御されていないG1-S移行を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様40:腫瘍細胞が、RB1遺伝子、CDKN2A遺伝子及びCDKN2B遺伝子を含む群から選択される遺伝子において、機能喪失突然変異又は欠失を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様41:腫瘍細胞が、遺伝子の増幅及び/又は遺伝子の活性化突然変異を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様42:遺伝子が、CCND1、E2F1、E2F2、E2F3、CDK4及びCDK6を含む群から選択される、実施態様41の使用のための組み合わせ。
実施態様43:遺伝子が、分裂促進性シグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子である、実施態様41の使用のための組み合わせ。
実施態様44:分裂促進性シグナル伝達経路が、PI3K経路及びMAPK経路を含む群から選択される、実施態様43の使用のための組み合わせ。
実施態様45:腫瘍細胞の細胞が、1つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び/又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、実施態様1~44のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様46:薬学的に活性な薬剤が、細胞分裂阻害剤である、実施態様45の使用のための組み合わせ。
実施態様47:耐性が、ABCトランスポーターにより媒介される、請求項46の使用のための組み合わせ。
実施態様48:ABCトランスポーターが、MRP及びMDR、特に、MDR-1を含む群から選択される、請求項47の使用のための組み合わせ。
実施態様49:耐性が、多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)、特に、細胞分裂阻害剤及び/又は放射線に対して多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)である、実施態様45~48のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様50:腫瘍細胞が、Rb陽性である、実施態様1~49のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様51:腫瘍細胞が、核内にYB-1を有する、実施態様1~50のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様52:腫瘍細胞が、誘引後に核内にYB-1を有する、実施態様1~51のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
実施態様53:YB-1の核への輸送が、放射線照射、細胞分裂阻害剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される少なくとも1つの手段により誘発される、実施態様52の使用のための組み合わせ。
実施態様54:手段が、細胞、臓器又は生物、好ましくは、それを必要とする生物、より好ましくは、腫瘍を患っている生物に適用される、実施態様53の使用のための組み合わせ。
実施態様55:腫瘍が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん(mBC)、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項1~54のいずれか1つの使用のための組み合わせ。
また、本発明の根底にある課題は、第3の態様においても解決される。また、第3の態様は、対象における疾患、より好ましくは、腫瘍又はがんの治療及び/又は予防における使用のための、アデノウイルスによるこのような第3の態様の第1の実施態様でもある。ここで、方法は、アデノウイルス及びCDK4/6阻害剤を対象に投与することを含む。
以下に、このような第3の態様の更なる実施態様が開示される。
実施態様2:アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様1の使用のためのアデノウイルス。
実施態様3:アデノウイルスが、YB-1依存的様式で複製している、実施態様1及び2のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様4:アデノウイルスが、核内にYB-1を欠いた細胞では複製欠損であるが、核内にYB-1を有する細胞では複製している、実施態様3の使用のためのアデノウイルス。
実施態様5:アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、E1B55kDa、E4orf6、E4orf3及びE3ADPを含む群から選択される、実施態様2~4のいずれか1つの使用ためのアデノウイルス。
実施態様6:がん遺伝子タンパク質が、E1Aタンパク質である、実施態様5の使用ためのアデノウイルス。
実施態様7:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様6の使用のためのアデノウイルス。
実施態様8:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様6の使用のためのアデノウイルス。
実施態様9:E1Aタンパク質が、YB-1の核内への局在を誘引しない、実施態様6~8のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様10:がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質E1Aと比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様5~9のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様11:欠失が、CR3ストレッチの欠失並びにN末端の欠失及びC末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様10の使用のためのアデノウイルス。
実施態様12:E1Aタンパク質が、Rbに結合可能である、実施態様6~11のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様13:E1Aタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、該欠失が、好ましくは、CR1領域及び/又はCR2領域における欠失である、実施態様6~12のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様14:E1Aタンパク質が、Rbに結合不可能である、実施態様13の使用のためのアデノウイルス。
実施態様15:ウイルスが、E1A12Sタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様1~14のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様16:ウイルスが、E1A13Sタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~15のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様17:ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスE3領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~16のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様18:ウイルスが、E1B 19kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~17のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様19:ウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様1~18のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様20:ウイルスが、アデノウイルス血清型5である、実施態様1~19のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様21:アデノウイルスが、XVir-N-31、dl520、AdΔ24、AdΔ24-RGD、dl922-947、E1Ad/01/07、dl1119/1131、CB016、VCN-01、E1Adl1107、E1Adl1101、ORCA-010、Enadenotucirev及び機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様1~20のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様22:アデノウイルスが、XVir-N-31である、実施態様21の使用のためのアデノウイルス。
実施態様23:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、アデノウイルスE3領域が、機能的に不活性である、実施態様21の使用のためのアデノウイルス。
実施態様24:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、dl520が、E1B 19kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様21~23のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様25:アデノウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているdl520である、実施態様21~24のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様26:ウイルスが、YB-1をコードする、実施態様1~25のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様27:YB-1をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び/又はYB-1依存性プロモーターの制御下にある、実施態様26の使用のためのアデノウイルス。
実施態様28:YB-1依存性プロモーターが、アデノウイルスE2後期プロモーターである、実施態様27の使用のためのアデノウイルス。
実施態様29:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRbリン酸化を低下させる化合物である、実施態様1~28のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様30:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRb発現を低下させる化合物である、実施態様1~29のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様31:CDK4/6阻害剤が、PD0332991とも呼ばれるパルボシクリブ、LY-2835219とも呼ばれるアベマシクリブ、LEE011とも呼ばれるリボシクリブ、G1T28とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様1~30のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様32:CDK4/6阻害剤が、細胞をG1で停止させ、E2F1を阻害する、実施態様1~31のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様33:方法が、さらに、PARP阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様1~32のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様34:PARP阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びBMN673を含む群から選択される、実施態様33の使用のためのアデノウイルス。
実施態様35:方法が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様1~32のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様36:ブロモドメイン阻害剤が、JQ-1、OTX-015、I-BET151、CPI-0610、I-BET762、CPI203、PFI-1及びMS436を含む群から選択される、実施態様35の使用のためのアデノウイルス。
実施態様37:アデノウイルス、CDK4/6阻害剤、PARP阻害剤及び/又はブロモドメイン阻害剤が、対象に別々に又は任意の組み合わせとして投与される、実施態様1~36のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様38:腫瘍細胞は、CDK4/6シグナル伝達経路が破壊されている、実施態様1~37のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様39:腫瘍細胞が、細胞周期の制御されていないG1-S移行を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様40:腫瘍細胞が、RB1遺伝子、CDKN2A遺伝子及びCDKN2B遺伝子を含む群から選択される遺伝子において、機能喪失突然変異又は欠失を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様41:腫瘍細胞が、遺伝子の増幅及び/又は遺伝子の活性化突然変異を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様42:遺伝子が、CCND1、E2F1、E2F2、E2F3、CDK4及びCDK6を含む群から選択される、実施態様41の使用のためのアデノウイルス。
実施態様43:遺伝子が、分裂促進性シグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子である、実施態様41の使用のためのアデノウイルス。
実施態様44:分裂促進性シグナル伝達経路が、PI3K経路及びMAPK経路を含む群から選択される、実施態様43の使用のためのアデノウイルス。
実施態様45:腫瘍細胞の細胞が、1つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び/又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、実施態様1~44のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様46:薬学的に活性な薬剤が、細胞分裂阻害剤である、実施態様45の使用のためのアデノウイルス。
実施態様47:耐性が、ABCトランスポーターにより媒介される、請求項46の使用のためのアデノウイルス。
実施態様48:ABCトランスポーターが、MRP及びMDR、特に、MDR-1を含む群から選択される、請求項47の使用のためのアデノウイルス。
実施態様49:耐性が、多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)、特に、細胞分裂阻害剤及び/又は放射線に対して多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)である、実施態様45~48のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様50:腫瘍細胞が、Rb陽性である、実施態様1~49のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様51:腫瘍細胞が、核内にYB-1を有する、実施態様1~50のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様52:腫瘍細胞が、誘引後に核内にYB-1を有する、実施態様1~51のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
実施態様53:YB-1の核への輸送が、放射線照射、細胞分裂阻害剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される少なくとも1つの手段により誘発される、実施態様52の使用のためのアデノウイルス。
実施態様54:手段が、細胞、臓器又は生物、好ましくは、それを必要とする生物、より好ましくは、腫瘍を患っている生物に適用される、実施態様53の使用のためのアデノウイルス。
実施態様55:腫瘍が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん(mBC)、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項1~54のいずれか1つの使用のためのアデノウイルス。
また、本発明の根底にある課題は、第4の態様においても解決される。また、第4の態様は、対象における疾患、より好ましくは、腫瘍又はがんの治療及び/又は予防における使用のための、CDK4/6阻害剤によるこのような第4の態様の第1の実施態様でもある。ここで、方法は、アデノウイルス及びCDK4/6阻害剤を対象に投与することを含む。
以下に、このような第4の態様の更なる実施態様が開示される。
実施態様2:アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様1の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様3:アデノウイルスが、YB-1依存的様式で複製している、実施態様1及び2のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様4:アデノウイルスが、核内にYB-1を欠いた細胞では複製欠損であるが、核内にYB-1を有する細胞では複製している、実施態様3の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様5:アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、E1B55kDa、E4orf6、E4orf3及びE3ADPを含む群から選択される、実施態様2~4のいずれか1つの使用ためのCDK4/6阻害剤。
実施態様6:がん遺伝子タンパク質が、E1Aタンパク質である、実施態様5の使用ためのCDK4/6阻害剤。
実施態様7:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様6の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様8:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様6の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様9:E1Aタンパク質が、YB-1の核内への局在を誘引しない、実施態様6~8のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様10:がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質E1Aと比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様5~9のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様11:欠失が、CR3ストレッチの欠失並びにN末端の欠失及びC末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様10の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様12:E1Aタンパク質が、Rbに結合可能である、実施態様6~11のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様13:E1Aタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、該欠失が、好ましくは、CR1領域及び/又はCR2領域における欠失である、実施態様6~12のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様14:E1Aタンパク質が、Rbに結合不可能である、実施態様13の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様15:ウイルスが、E1A12Sタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様1~14のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様16:ウイルスが、E1A13Sタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~15のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様17:ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスE3領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~16のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様18:ウイルスが、E1B 19kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~17のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様19:ウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様1~18のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様20:ウイルスが、アデノウイルス血清型5である、実施態様1~19のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様21:アデノウイルスが、XVir-N-31、dl520、AdΔ24、AdΔ24-RGD、dl922-947、E1Ad/01/07、dl1119/1131、CB016、VCN-01、E1Adl1107、E1Adl1101、ORCA-010、Enadenotucirev及び機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様1~20のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様22:アデノウイルスが、XVir-N-31である、実施態様21の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様23:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、アデノウイルスE3領域が、機能的に不活性である、実施態様21の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様24:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、dl520が、E1B 19kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様21~23のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様25:アデノウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているdl520である、実施態様21~24のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様26:ウイルスが、YB-1をコードする、実施態様1~25のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様27:YB-1をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び/又はYB-1依存性プロモーターの制御下にある、実施態様26の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様28:YB-1依存性プロモーターが、アデノウイルスE2後期プロモーターである、実施態様27の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様29:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRbリン酸化を低下させる化合物である、実施態様1~28のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様30:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRb発現を低下させる化合物である、実施態様1~29のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様31:CDK4/6阻害剤が、PD0332991とも呼ばれるパルボシクリブ、LY-2835219とも呼ばれるアベマシクリブ、LEE011とも呼ばれるリボシクリブ、G1T28とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様1~30のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様32:CDK4/6阻害剤が、細胞をG1で停止させ、E2F1を阻害する、実施態様1~31のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様33:方法が、さらに、PARP阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様1~32のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様34:PARP阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びBMN673を含む群から選択される、実施態様33の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様35:方法が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様1~32のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様36:ブロモドメイン阻害剤が、JQ-1、OTX-015、I-BET151、CPI-0610、I-BET762、CPI203、PFI-1及びMS436を含む群から選択される、実施態様35の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様37:アデノウイルス、CDK4/6阻害剤、PARP阻害剤及び/又はブロモドメイン阻害剤が、対象に別々に又は任意の組み合わせとして投与される、実施態様1~36のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様38:腫瘍細胞は、CDK4/6シグナル伝達経路が破壊されている、実施態様1~37のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様39:腫瘍細胞が、細胞周期の制御されていないG1-S移行を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様40:腫瘍細胞が、RB1遺伝子、CDKN2A遺伝子及びCDKN2B遺伝子を含む群から選択される遺伝子において、機能喪失突然変異又は欠失を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様41:腫瘍細胞が、遺伝子の増幅及び/又は遺伝子の活性化突然変異を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様42:遺伝子が、CCND1、E2F1、E2F2、E2F3、CDK4及びCDK6を含む群から選択される、実施態様41の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様43:遺伝子が、分裂促進性シグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子である、実施態様41の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様44:分裂促進性シグナル伝達経路が、PI3K経路及びMAPK経路を含む群から選択される、実施態様43の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様45:腫瘍細胞の細胞が、1つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び/又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、実施態様1~44のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様46:薬学的に活性な薬剤が、細胞分裂阻害剤である、実施態様45の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様47:耐性が、ABCトランスポーターにより媒介される、請求項46の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様48:ABCトランスポーターが、MRP及びMDR、特に、MDR-1を含む群から選択される、請求項47の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様49:耐性が、多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)、特に、細胞分裂阻害剤及び/又は放射線に対して多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)である、実施態様45~48のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様50:腫瘍細胞が、Rb陽性である、実施態様1~49のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様51:腫瘍細胞が、核内にYB-1を有する、実施態様1~50のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様52:腫瘍細胞が、誘引後に核内にYB-1を有する、実施態様1~51のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様53:YB-1の核への輸送が、放射線照射、細胞分裂阻害剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される少なくとも1つの手段により誘発される、実施態様52の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様54:手段が、細胞、臓器又は生物、好ましくは、それを必要とする生物、より好ましくは、腫瘍を患っている生物に適用される、実施態様53の使用のためのCDK4/6阻害剤。
実施態様55:腫瘍が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん(mBC)、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項1~54のいずれか1つの使用のためのCDK4/6阻害剤。
また、本発明の根底にある課題は、第5の態様においても解決される。また、第5の態様は、対象における疾患、より好ましくは、腫瘍又はがんの治療及び/又は予防における使用のための、PARP阻害剤によるこのような第5の態様の第1の実施態様でもある。ここで、方法は、アデノウイルス、CDK4/6阻害剤及びPARP阻害剤を対象に投与することを含む。
以下に、このような第5の態様の更なる実施態様が開示される。
実施態様2:アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様1の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様3:アデノウイルスが、YB-1依存的様式で複製している、実施態様1及び2のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様4:アデノウイルスが、核内にYB-1を欠いた細胞では複製欠損であるが、核内にYB-1を有する細胞では複製している、実施態様3の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様5:アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、E1B55kDa、E4orf6、E4orf3及びE3ADPを含む群から選択される、実施態様2~4のいずれか1つの使用ためのPARP阻害剤。
実施態様6:がん遺伝子タンパク質が、E1Aタンパク質である、実施態様5の使用ためのPARP阻害剤。
実施態様7:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様6の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様8:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様6の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様9:E1Aタンパク質が、YB-1の核内への局在を誘引しない、実施態様6~8のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様10:がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質E1Aと比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様5~9のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様11:欠失が、CR3ストレッチの欠失並びにN末端の欠失及びC末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様10の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様12:E1Aタンパク質が、Rbに結合可能である、実施態様6~11のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様13:E1Aタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、該欠失が、好ましくは、CR1領域及び/又はCR2領域における欠失である、実施態様6~12のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様14:E1Aタンパク質が、Rbに結合不可能である、実施態様13の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様15:ウイルスが、E1A12Sタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様1~14のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様16:ウイルスが、E1A13Sタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~15のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様17:ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスE3領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~16のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様18:ウイルスが、E1B 19kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~17のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様19:ウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様1~18のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様20:ウイルスが、アデノウイルス血清型5である、実施態様1~19のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様21:アデノウイルスが、XVir-N-31、dl520、AdΔ24、AdΔ24-RGD、dl922-947、E1Ad/01/07、dl1119/1131、CB016、VCN-01、E1Adl1107、E1Adl1101、ORCA-010、Enadenotucirev及び機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様1~20のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様22:アデノウイルスが、XVir-N-31である、実施態様21の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様23:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、アデノウイルスE3領域が、機能的に不活性である、実施態様21の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様24:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、dl520が、E1B 19kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様21~23のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様25:アデノウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているdl520である、実施態様21~24のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様26:ウイルスが、YB-1をコードする、実施態様1~25のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様27:YB-1をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び/又はYB-1依存性プロモーターの制御下にある、実施態様26の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様28:YB-1依存性プロモーターが、アデノウイルスE2後期プロモーターである、実施態様27の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様29:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRbリン酸化を低下させる化合物である、実施態様1~28のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様30:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRb発現を低下させる化合物である、実施態様1~29のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様31:CDK4/6阻害剤が、PD0332991とも呼ばれるパルボシクリブ、LY-2835219とも呼ばれるアベマシクリブ、LEE011とも呼ばれるリボシクリブ、G1T28とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様1~30のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様32:CDK4/6阻害剤が、細胞をG1で停止させ、E2F1を阻害する、実施態様1~31のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様33:方法が、さらに、PARP阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様1~32のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様34:PARP阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びBMN673を含む群から選択される、実施態様33の使用のためのPARP。
実施態様35:方法が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様1~32のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様36:ブロモドメイン阻害剤が、JQ-1、OTX-015、I-BET151、CPI-0610、I-BET762、CPI203、PFI-1及びMS436を含む群から選択される、実施態様35の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様37:アデノウイルス、CDK4/6阻害剤、PARP阻害剤及び/又はブロモドメイン阻害剤が、対象に別々に又は任意の組み合わせとして投与される、実施態様1~36のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様38:腫瘍細胞は、CDK4/6シグナル伝達経路が破壊されている、実施態様1~37のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様39:腫瘍細胞が、細胞周期の制御されていないG1-S移行を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様40:腫瘍細胞が、RB1遺伝子、CDKN2A遺伝子及びCDKN2B遺伝子を含む群から選択される遺伝子において、機能喪失突然変異又は欠失を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様41:腫瘍細胞が、遺伝子の増幅及び/又は遺伝子の活性化突然変異を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様42:遺伝子が、CCND1、E2F1、E2F2、E2F3、CDK4及びCDK6を含む群から選択される、実施態様41の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様43:遺伝子が、分裂促進性シグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子である、実施態様41の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様44:分裂促進性シグナル伝達経路が、PI3K経路及びMAPK経路を含む群から選択される、実施態様43の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様45:腫瘍細胞の細胞が、1つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び/又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、実施態様1~44のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様46:薬学的に活性な薬剤が、細胞分裂阻害剤である、実施態様45の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様47:耐性が、ABCトランスポーターにより媒介される、請求項46の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様48:ABCトランスポーターが、MRP及びMDR、特に、MDR-1を含む群から選択される、請求項47の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様49:耐性が、多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)、特に、細胞分裂阻害剤及び/又は放射線に対して多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)である、実施態様45~48のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様50:腫瘍細胞が、Rb陽性である、実施態様1~49のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様51:腫瘍細胞が、核内にYB-1を有する、実施態様1~50のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様52:腫瘍細胞が、誘引後に核内にYB-1を有する、実施態様1~51のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
実施態様53:YB-1の核への輸送が、放射線照射、細胞分裂阻害剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される少なくとも1つの手段により誘発される、実施態様52の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様54:手段が、細胞、臓器又は生物、好ましくは、それを必要とする生物、より好ましくは、腫瘍を患っている生物に適用される、実施態様53の使用のためのPARP阻害剤。
実施態様55:腫瘍が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん(mBC)、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項1~54のいずれか1つの使用のためのPARP阻害剤。
本発明の根底にある課題は、第6の態様において解決される。また、第6の態様は、対象における疾患、より好ましくは、腫瘍又はがんの治療及び/又は予防における使用のための、ブロモドメイン阻害剤によるこのような第6の態様の第1の実施態様でもある。ここで、方法は、アデノウイルス、CDK4/6阻害剤及びブロモドメイン阻害剤を対象に投与することを含む。
以下に、このような第6の態様の更なる実施態様が開示される。
実施態様2:アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様1の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様3:アデノウイルスが、YB-1依存的様式で複製している、実施態様1及び2のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様4:アデノウイルスが、核内にYB-1を欠いた細胞では複製欠損であるが、核内にYB-1を有する細胞では複製している、実施態様3の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様5:アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、E1B55kDa、E4orf6、E4orf3及びE3ADPを含む群から選択される、実施態様2~4のいずれか1つの使用ためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様6:がん遺伝子タンパク質が、E1Aタンパク質である、実施態様5の使用ためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様7:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様6の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様8:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様6の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様9:E1Aタンパク質が、YB-1の核内への局在を誘引しない、実施態様6~8のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様10:がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質E1Aと比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様5~9のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様11:欠失が、CR3ストレッチの欠失並びにN末端の欠失及びC末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様10の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様12:E1Aタンパク質が、Rbに結合可能である、実施態様6~11のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様13:E1Aタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、該欠失が、好ましくは、CR1領域及び/又はCR2領域における欠失である、実施態様6~12のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様14:E1Aタンパク質が、Rbに結合不可能である、実施態様13の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様15:ウイルスが、E1A12Sタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様1~14のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様16:ウイルスが、E1A13Sタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~15のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様17:ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスE3領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~16のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様18:ウイルスが、E1B 19kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~17のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様19:ウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様1~18のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様20:ウイルスが、アデノウイルス血清型5である、実施態様1~19のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様21:アデノウイルスが、XVir-N-31、dl520、AdΔ24、AdΔ24-RGD、dl922-947、E1Ad/01/07、dl1119/1131、CB016、VCN-01、E1Adl1107、E1Adl1101、ORCA-010、Enadenotucirev及び機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様1~20のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様22:アデノウイルスが、XVir-N-31である、実施態様21の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様23:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、アデノウイルスE3領域が、機能的に不活性である、実施態様21の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様24:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、dl520が、E1B 19kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様21~23のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様25:アデノウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているdl520である、実施態様21~24のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様26:ウイルスが、YB-1をコードする、実施態様1~25のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様27:YB-1をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び/又はYB-1依存性プロモーターの制御下にある、実施態様26の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様28:YB-1依存性プロモーターが、アデノウイルスE2後期プロモーターである、実施態様27の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様29:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRbリン酸化を低下させる化合物である、実施態様1~28のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様30:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRb発現を低下させる化合物である、実施態様1~29のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様31:CDK4/6阻害剤が、PD0332991とも呼ばれるパルボシクリブ、LY-2835219とも呼ばれるアベマシクリブ、LEE011とも呼ばれるリボシクリブ、G1T28とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様1~30のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様32:CDK4/6阻害剤が、細胞をG1で停止させ、E2F1を阻害する、実施態様1~31のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様33:方法が、さらに、PARP阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様1~32のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様34:PARP阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びBMN673を含む群から選択される、実施態様33の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様35:方法が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様1~32のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様36:ブロモドメイン阻害剤が、JQ-1、OTX-015、I-BET151、CPI-0610、I-BET762、CPI203、PFI-1及びMS436を含む群から選択される、実施態様35の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様37:アデノウイルス、CDK4/6阻害剤、PARP阻害剤及び/又はブロモドメイン阻害剤が、対象に別々に又は任意の組み合わせとして投与される、実施態様1~36のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様38:腫瘍細胞は、CDK4/6シグナル伝達経路が破壊されている、実施態様1~37のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様39:腫瘍細胞が、細胞周期の制御されていないG1-S移行を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様40:腫瘍細胞が、RB1遺伝子、CDKN2A遺伝子及びCDKN2B遺伝子を含む群から選択される遺伝子において、機能喪失突然変異又は欠失を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様41:腫瘍細胞が、遺伝子の増幅及び/又は遺伝子の活性化突然変異を有する、実施態様1~38のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様42:遺伝子が、CCND1、E2F1、E2F2、E2F3、CDK4及びCDK6を含む群から選択される、実施態様41の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様43:遺伝子が、分裂促進性シグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子である、実施態様41の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様44:分裂促進性シグナル伝達経路が、PI3K経路及びMAPK経路を含む群から選択される、実施態様43の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様45:腫瘍細胞の細胞が、1つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び/又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、実施態様1~44のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様46:薬学的に活性な薬剤が、細胞分裂阻害剤である、実施態様45の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様47:耐性が、ABCトランスポーターにより媒介される、請求項46の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様48:ABCトランスポーターが、MRP及びMDR、特に、MDR-1を含む群から選択される、請求項47の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様49:耐性が、多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)、特に、細胞分裂阻害剤及び/又は放射線に対して多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)である、実施態様45~48のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様50:腫瘍細胞が、Rb陽性である、実施態様1~49のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様51:腫瘍細胞が、核内にYB-1を有する、実施態様1~50のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様52:腫瘍細胞が、誘引後に核内にYB-1を有する、実施態様1~51のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様53:YB-1の核への輸送が、放射線照射、細胞分裂阻害剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される少なくとも1つの手段により誘発される、実施態様52の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様54:手段が、細胞、臓器又は生物、好ましくは、それを必要とする生物、より好ましくは、腫瘍を患っている生物に適用される、実施態様53の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
実施態様55:腫瘍が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん(mBC)、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項1~54のいずれか1つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
本発明の根底にある課題は、第7の態様において解決される。また、第7の態様は、対象における疾患、より好ましくは、腫瘍又はがんの治療及び/又は予防における使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体によるこのような第6の態様の第1の実施態様でもある。ここで、該方法は、アデノウイルスと、CDK4/6阻害剤と、ブロモドメイン阻害剤とを対象に投与することを含む。
以下に、このような第6の態様の更なる実施態様が開示される。
実施態様2:アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様1の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様3:アデノウイルスが、YB-1依存的様式で複製している、実施態様1及び2の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様4:アデノウイルスが、核内にYB-1を欠く細胞では複製欠損であるが、核内にYB-1を有する細胞では複製している、実施態様3の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様5:アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも1種のアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、E1B55kDa、E4orf6、E4orf3及びE3ADPを含む群から選択される、実施態様2~4のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様6:がん遺伝子タンパク質が、E1Aタンパク質である、実施態様5の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様7:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様6の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様8:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様6の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様9:E1Aタンパク質が、YB-1の核への局在を誘引しない、実施態様6~8のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様10:がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質E1Aと比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様5~9のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様11:欠失が、CR3ストレッチの欠失及びN末端の欠失及びC末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様10の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様12:E1Aタンパク質が、Rbに結合可能である、実施態様6~11のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様13:E1Aタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、欠失が、好ましくは、CR1領域及び/又はCR2領域における欠失である、実施態様6~12のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様14:E1Aタンパク質が、Rbに結合不可能である、実施態様13の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様15:ウイルスが、E1A12Sタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様1~14のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様16:ウイルスが、E1A13Sタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~15のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様17:ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスE3領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~16のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様18:ウイルスが、E1B19kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~17のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様19:ウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様1~18のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様20:ウイルスが、アデノウイルス血清型5である、実施態様1~19のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様21:アデノウイルスが、XVir-N-31、dl520、AdΔ24、AdΔ24-RGD、dl922-947、E1Ad/01/07、dl1119/1131、CB016、VCN-01、E1Adl1107、E1Adl1101、ORCA-010、Enadenotucirev及び機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様1~20のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様22:アデノウイルスが、XVir-N-31である、実施態様21の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様23:アデノウイルスが、dl520であり、アデノウイルスE3領域が、機能的に不活性である、実施態様21の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様24:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、dl520が、E1B19kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様21~23のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様25:アデノウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているdl520である、実施態様21~24のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様26:ウイルスが、YB-1をコードする、実施態様1~25のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様27:YB-1をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び/又はYB-1依存性プロモーターの制御下にある、実施態様26の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様28:YB-1依存性プロモーターが、アデノウイルスE2後期プロモーターである、実施態様27の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様29:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRbリン酸化を減少させる化合物である、実施態様1~28のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様30:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRb発現を減少させる化合物である、実施態様1~29のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様31:CDK4/6阻害剤が、PD0332991とも呼ばれるパルボシクリブ、LY-2835219とも呼ばれるアベマシクリブ、LEE011とも呼ばれるリボシクリブ、G1T28とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様1~30のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様32:CDK4/6阻害剤が、細胞をG1期で停止させ、E2F1を阻害する、実施態様1~31のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様33:方法が、PARP阻害剤を対象に投与することをさらに含む、実施態様1~32のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様34:PARP阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ、タラゾパリブ及びBMN673を含む群から選択される、実施態様33の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様35:方法が、ブロモドメイン阻害剤を対象に投与することをさらに含む、実施態様1~32のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様36:ブロモドメイン阻害剤が、JQ-1、OTX-015、I-BET151、CPI-0610、I-BET762、CPI203、PFI-1及びMS436を含む群から選択される、実施態様35の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様37:アデノウイルス、CDK4/6阻害剤、PARP阻害剤、ブロモドメイン阻害剤及び/又はヌトリンもしくはヌトリン誘導体が、別々に又は任意の組み合わせとして対象に投与される、実施態様1~36のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様38:ヌトリン誘導体が、NVP-HDM201、イダサヌトリン、AM-8553、SAR405838、ヌトリン-3a及びAMG232を含む群から選択される、実施態様1~37のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様39:ヌトリン誘導体が、ヌトリン-3aとは異なる、実施態様1~37のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様40:腫瘍細胞は、CDK4/6シグナル伝達経路が破壊されている、実施態様1~39のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様41:腫瘍細胞が、細胞周期の制御不能なG1-S移行を有する、実施態様1~40のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様42:腫瘍細胞が、RB1遺伝子、CDKN2A遺伝子及びCDKN2B遺伝子を含む群から選択された遺伝子において、機能喪失突然変異又は欠失を有する、実施態様1~40のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様43:腫瘍細胞が、遺伝子の増幅及び/又は遺伝子における活性化突然変異を有する、実施態様1~40のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様44:遺伝子が、CCND1、E2F1、E2F2、E2F3、CDK4及びCDK6を含む群から選択される、実施態様43の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様45:遺伝子が、分裂促進シグナル伝達経路の構成要素をコードする遺伝子である、実施態様43の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様46:分裂促進シグナル伝達経路が、PI3K経路及びMAPK経路を含む群から選択される、実施態様45の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様47:腫瘍細胞の細胞が、1つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び/又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、実施態様1~46のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様48:薬学的に活性な薬剤が、細胞分裂阻害剤である、実施態様47の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様49:耐性が、ABCトランスポーターにより媒介される、実施態様48の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様50:ABCトランスポーターが、MRP及びMDR、特に、MDR-1を含む群から選択される、実施態様49の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様51:耐性が、多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)、特に、細胞分裂阻害剤及び/又は放射線に対して多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)である、実施態様47~50のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様52:腫瘍細胞が、Rb陰性である、実施態様1~51のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様53:腫瘍細胞が、Rb陽性である、実施態様1~52のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様54:腫瘍細胞が、核内にYB-1を有する、実施態様1~53のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様55:腫瘍細胞が、誘引後に核内にYB-1を有する、実施態様1~54のいずれか1つの使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様56:YB-1の核への輸送が、放射線、細胞分裂阻害剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される少なくとも1種の手段により誘発される、実施態様55の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
実施態様57:手段が、細胞、器官又は生物、好ましくは、それを必要とする生物、より好ましくは、腫瘍を患っている生物に適用される、実施態様56の使用のためのヌトリン又はヌトリン誘導体。
本発明の根底にある課題は、第8の態様において解決される。また、第8の態様は、併用療法によるこのような第7の態様の第1の実施態様でもある。ここで、このような併用療法は、中でも、
a)アデノウイルス、特に、その任意の実施態様を含む第3の態様に従って本明細書で定義されたもの;CDK4/6阻害剤、特に、その任意の実施態様を含む第4の態様に従って本明細書で定義されたもの;及びPARP阻害剤、特に、第4の態様に従って本明細書で定義されたもの、
b)アデノウイルス、特に、その任意の実施態様を含む第3の態様に従って本明細書で定義されたもの;CDK4/6阻害剤、特に、その任意の実施態様を含む第4の態様に従って本明細書で定義されたもの;及びブロモドメイン阻害剤、特に、第5の態様に従って本明細書で定義されたもの、
c)アデノウイルス、特に、その任意の実施態様を含む第3の態様に従って本明細書で定義されたもの;CDK4/6阻害剤、特に、その任意の実施態様を含む第4の態様に従って本明細書で定義されたもの;及びヌトリン又はヌトリン誘導体、特に、第6の態様に従って本明細書で定義されたもの、
d)アデノウイルス、特に、その任意の実施態様を含む第3の態様に従って本明細書で定義されたもの;CDK4/6阻害剤、特に、その任意の実施態様を含む第4の態様に従って本明細書で定義されたもの;ブロモドメイン阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、特に、第5の態様に従って本明細書で定義されたもの;及びヌトリン又はヌトリン誘導体、特に、第6の態様に従って本明細書で定義されたもの、
e)アデノウイルス、特に、その任意の実施態様を含む第3の態様に従って本明細書で定義されたもの;CDK4/6阻害剤、特に、その任意の実施態様を含む第4の態様に従って本明細書で定義されたもの;ブロモドメイン阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、特に、第5の態様に従って本明細書で定義されたもの;及びPARP阻害剤、特に、第5の態様に従って本明細書で定義されたもの並びに
f)アデノウイルス、特に、その任意の実施態様を含む第3の態様に従って本明細書で定義されたもの;CDK4/6阻害剤、特に、その任意の実施態様を含む第4の態様に従って本明細書で定義されたもの;ブロモドメイン阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、特に、第5の態様に従って本明細書で定義されたもの;PARP阻害剤、特に、第5の態様に従って本明細書で定義されたもの;及びヌトリン又はヌトリン誘導体、特に、第6の態様に従って本明細書で定義されたものを、それを必要とする対象に投与することを含む。
a)アデノウイルス、特に、その任意の実施態様を含む第3の態様に従って本明細書で定義されたもの;CDK4/6阻害剤、特に、その任意の実施態様を含む第4の態様に従って本明細書で定義されたもの;及びPARP阻害剤、特に、第4の態様に従って本明細書で定義されたもの、
b)アデノウイルス、特に、その任意の実施態様を含む第3の態様に従って本明細書で定義されたもの;CDK4/6阻害剤、特に、その任意の実施態様を含む第4の態様に従って本明細書で定義されたもの;及びブロモドメイン阻害剤、特に、第5の態様に従って本明細書で定義されたもの、
c)アデノウイルス、特に、その任意の実施態様を含む第3の態様に従って本明細書で定義されたもの;CDK4/6阻害剤、特に、その任意の実施態様を含む第4の態様に従って本明細書で定義されたもの;及びヌトリン又はヌトリン誘導体、特に、第6の態様に従って本明細書で定義されたもの、
d)アデノウイルス、特に、その任意の実施態様を含む第3の態様に従って本明細書で定義されたもの;CDK4/6阻害剤、特に、その任意の実施態様を含む第4の態様に従って本明細書で定義されたもの;ブロモドメイン阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、特に、第5の態様に従って本明細書で定義されたもの;及びヌトリン又はヌトリン誘導体、特に、第6の態様に従って本明細書で定義されたもの、
e)アデノウイルス、特に、その任意の実施態様を含む第3の態様に従って本明細書で定義されたもの;CDK4/6阻害剤、特に、その任意の実施態様を含む第4の態様に従って本明細書で定義されたもの;ブロモドメイン阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、特に、第5の態様に従って本明細書で定義されたもの;及びPARP阻害剤、特に、第5の態様に従って本明細書で定義されたもの並びに
f)アデノウイルス、特に、その任意の実施態様を含む第3の態様に従って本明細書で定義されたもの;CDK4/6阻害剤、特に、その任意の実施態様を含む第4の態様に従って本明細書で定義されたもの;ブロモドメイン阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、特に、第5の態様に従って本明細書で定義されたもの;PARP阻害剤、特に、第5の態様に従って本明細書で定義されたもの;及びヌトリン又はヌトリン誘導体、特に、第6の態様に従って本明細書で定義されたものを、それを必要とする対象に投与することを含む。
その任意の実施態様を含む第3の態様、その任意の実施態様を含む第4の態様、その任意の実施態様を含む第5の態様及びその任意の実施態様を含む第6の態様に関連して記載された種々の実施態様を特に、a)、b)、c)、d)、e)及びf)として上記定義されるような、その種々の形態における第8の態様の併用療法の実施態様であることができることは、本発明の範囲内である。
本発明の根底にある課題は、第9の態様において解決される。また、第9の態様は、対象における疾患の治療及び/又は予防のための方法によるこのような第7の態様の第1の実施態様でもある。ここで、該方法は、アデノウイルス及びCDK4/6阻害剤を対象に投与することを含む。
以下に、このような第9の態様の更なる実施態様が開示される。
実施態様2:アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様1の方法。
実施態様3:アデノウイルスが、YB-1依存的様式で複製している、実施態様1及び2のいずれかの方法。
実施態様4:アデノウイルスが、核内にYB-1を欠く細胞では複製欠損であるが、核内にYB-1を有する細胞では複製している、実施態様3の方法。
実施態様5:アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも1種のアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、E1B55kDa、E4orf6、E4orf3及びE3ADPを含む群から選択される、実施態様2~4のいずれか1つの方法。
実施態様6:がん遺伝子タンパク質が、E1Aタンパク質である、実施態様5の方法。
実施態様7:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様6の方法。
実施態様8:E1Aタンパク質が、機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様6の方法。
実施態様9:E1Aタンパク質が、YB-1の核への局在を誘引しない、実施態様6~8のいずれか1つの方法。
実施態様10:がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質E1Aと比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様5~9のいずれか1つの方法。
実施態様11:欠失が、CR3ストレッチの欠失及びN末端の欠失及びC末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様10の方法。
実施態様12:E1Aタンパク質が、Rbに結合可能である、実施態様6~11のいずれか1つの方法。
実施態様13:E1Aタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、1つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、欠失が、好ましくは、CR1領域及び/又はCR2領域における欠失である、実施態様6~12のいずれか1つの方法。
実施態様14:E1Aタンパク質が、Rbに結合不可能である、実施態様13の方法。
実施態様15:ウイルスが、E1A12Sタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様1~14のいずれか1つの方法。
実施態様16:ウイルスが、E1A13Sタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~15のいずれか1つの方法。
実施態様17:ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスE3領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~16のいずれか1つの方法。
実施態様18:ウイルスが、E1B19kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様1~17のいずれか1つの方法。
実施態様19:ウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様1~18のいずれか1つの方法。
実施態様20:ウイルスが、アデノウイルス血清型5である、実施態様1~19のいずれか1つの方法。
実施態様21:アデノウイルスが、XVir-N-31、dl520、AdΔ24、AdΔ24-RGD、dl922-947、E1Ad/01/07、dl1119/1131、CB016、VCN-01、E1Adl1107、E1Adl1101、ORCA-010、Enadenotucirev及び機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様1~20のいずれか1つの方法。
実施態様22:アデノウイルスが、XVir-N-31である、実施態様21の方法。
実施態様23:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、アデノウイルスE3領域が、機能的に不活性である、実施態様21の方法。
実施態様24:アデノウイルスが、dl520であり、ここで、dl520が、E1B 19kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様21~23のいずれか1つの方法。
実施態様25:アデノウイルスが、繊維においてRGDモチーフを発現しているdl520である、実施態様21~24のいずれか1つの方法。
実施態様26:ウイルスが、YB-1をコードする、実施態様1~25のいずれか1つの方法。
実施態様27:YB-1をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び/又はYB-1依存性プロモーターの制御下にある、実施態様26の方法。
実施態様28:YB-1依存性プロモーターが、アデノウイルスE2後期プロモーターである、実施態様27の方法。
実施態様29:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRbリン酸化を低下させる化合物である、実施態様1~28のいずれか1つの方法。
実施態様30:CDK4/6阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるRb発現を低下させる化合物である、実施態様1~29のいずれか1つの方法。
実施態様31:CDK4/6阻害剤が、PD0332991とも呼ばれるパルボシクリブ、LY-2835219とも呼ばれるアベマシクリブ、LEE011とも呼ばれるリボシクリブ、G1T28とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様1~30のいずれか1つの方法。
実施態様32:CDK4/6阻害剤が、細胞をG1で停止させ、E2F1を阻害する、実施態様1~31のいずれか1つの方法。
実施態様33:方法が、さらに、PARP阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様1~32のいずれか1つの方法。
実施態様34:PARP阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びBMN673を含む群から選択される、実施態様33の方法。
実施態様35:方法が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様1~32のいずれか1つの方法。
実施態様36:ブロモドメイン阻害剤が、JQ-1、OTX-015、I-BET151、CPI-0610、I-BET762、CPI203、PFI-1及びMS436を含む群から選択される、実施態様35の方法。
実施態様37:アデノウイルス、CDK4/6阻害剤、PARP阻害剤及び/又はブロモドメイン阻害剤が、対象に別々に又は任意の組み合わせとして投与される、実施態様1~36のいずれか1つの方法。
実施態様38:腫瘍細胞は、CDK4/6シグナル伝達経路が破壊されている、実施態様1~37のいずれか1つの方法。
実施態様39:腫瘍細胞が、細胞周期の制御されていないG1-S移行を有する、実施態様1~38のいずれか1つの方法。
実施態様40:腫瘍細胞が、RB1遺伝子、CDKN2A遺伝子及びCDKN2B遺伝子を含む群から選択される遺伝子において、機能喪失突然変異又は欠失を有する、実施態様1~38のいずれか1つの方法。
実施態様41:腫瘍細胞が、遺伝子の増幅及び/又は遺伝子の活性化突然変異を有する、実施態様1~38のいずれか1つの方法。
実施態様42:遺伝子が、CCND1、E2F1、E2F2、E2F3、CDK4及びCDK6を含む群から選択される、実施態様41の方法。
実施態様43:遺伝子が、分裂促進性シグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子である、実施態様41の方法。
実施態様44:分裂促進性シグナル伝達経路が、PI3K経路及びMAPK経路を含む群から選択される、実施態様43の方法。
実施態様45:腫瘍細胞の細胞が、1つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び/又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、実施態様1~44のいずれか1つの方法。
実施態様46:薬学的に活性な薬剤が、細胞分裂阻害剤である、実施態様45の方法。
実施態様47:耐性が、ABCトランスポーターにより媒介される、請求項46の方法。
実施態様48:ABCトランスポーターが、MRP及びMDR、特に、MDR-1を含む群から選択される、請求項47の方法。
実施態様49:耐性が、多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)、特に、細胞分裂阻害剤及び/又は放射線に対して多耐性(multiple resistance)又は多耐性(polyresistance)である、実施態様45~48のいずれか1つの方法。
実施態様50:腫瘍細胞が、Rb陽性である、実施態様1~49のいずれか1つの方法。
実施態様51:腫瘍細胞が、核内にYB-1を有する、実施態様1~50のいずれか1つの方法。
実施態様52:腫瘍細胞が、誘引後に核内にYB-1を有する、実施態様1~51のいずれか1つの方法。
実施態様53:YB-1の核への輸送が、放射線照射、細胞分裂阻害剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される少なくとも1つの手段により誘発される、実施態様52の方法。
実施態様54:手段が、細胞、臓器又は生物、好ましくは、それを必要とする生物、より好ましくは、腫瘍を患っている生物に適用される、実施態様53の方法。
実施態様55:腫瘍が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん(mBC)、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項1~54のいずれか1つの方法。
第10の態様において、また、本発明は、医薬の製造のための組成物の使用に関し、ここで、該組成物は、その任意の実施態様を含む本発明の第1の態様に関連して開示された組成物であり、該医薬は、その任意の実施態様を含む本発明の第2の態様に関連して特定された疾患の治療及び/又は予防のためのものである。
第11の態様において、また、本発明は、医薬の製造のためのアデノウイルスの使用に関し、ここで、アデノウイルスは、その任意の実施態様を含む本発明の第3の態様に関連して開示されたアデノウイルスであり、該医薬は、その任意の実施態様を含む本発明の第3の態様に関連して特定された疾患の治療及び/又は予防のためのものである。
第12の態様において、また、本発明は、医薬の製造のためのCDK4/6阻害剤の使用に関し、ここで、CDK4/6阻害剤は、その任意の実施態様を含む本発明の第4の態様に関連して開示されたCDK4/6阻害剤であり、該医薬は、その任意の実施態様を含む本発明の第4の態様に関連して特定された疾患の治療及び/又は予防のためのものである。
第13の態様において、また、本発明は、医薬の製造のためのPARP阻害剤の使用に関し、ここで、PARP阻害剤は、その任意の実施態様を含む本発明の第5の態様に関連して開示されたPARP阻害剤であり、該医薬は、その任意の実施態様を含む本発明の第5の態様に関連して特定された疾患の治療及び/又は予防のためのものである。
第14の態様において、また、本発明は、医薬の製造のためのブロモドメイン阻害剤の使用に関し、ここで、ブロモドメイン阻害剤は、その任意の実施態様を含む本発明の第6の態様に関連して開示されたブロモドメイン阻害剤であり、該医薬は、その任意の実施態様を含む本発明の第6の態様に関連して特定された疾患の治療及び/又は予防のためのものである。
第15の態様において、また、本発明は、医薬の製造のためのヌトリン又はその誘導体の使用に関し、ここで、ヌトリン又はヌトリン誘導体は、その任意の実施態様を含む本発明の第7の態様に関連して開示されたヌトリン又はヌトリン誘導体であり、該医薬は、その任意の実施態様を含む本発明の第7の態様に関連して特定された疾患の治療及び/又は予防のためのものである。
その任意の実施態様を含む本明細書に開示された各態様及び任意の態様の実施態様において、CDK4/6阻害剤は、CDK4/6を阻害し又は阻害可能であり、このため、適切に処理された細胞をG1期で停止させる薬剤である。
その任意の実施態様を含む本明細書に開示された各態様及び任意の態様の実施態様において、ブロモドメイン阻害剤は、二価ブロモドメイン阻害剤であり、より好ましくは、ブロモドメイン阻害剤は、下記式
で示されるAZD5153である。
で示されるAZD5153である。
その任意の実施態様を含む本明細書に開示された各態様及び任意の態様の実施態様において、ブロモドメイン阻害剤は、BET分解剤であり、好ましくは、ブロモドメイン阻害剤は、下記式で示されるdBET6及び下記式で示されるARV771を含む群から選択される(例えば、Scheepstra M et.al.(Computational and Structural Biotechnology Journal 17(2019)160-179)を参照のこと)。
本発明の一態様の各実施態様及び任意の実施態様が、本発明の他の各態様及び任意の態様(その任意の実施態様を含む)の実施態様でもあることが、当業者により認識されるのであろう。
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、驚くべきことに、腫瘍溶解性ウイルス、好ましくは、腫瘍溶解性アデノウイルスをCDK4/6阻害剤と併用することにより、このような腫瘍溶解性アデノウイルスに基づく腫瘍処置の効力を向上させることを見出した。より具体的には、CDK4/6阻害剤は、E2F1(本明細書において、E2F-1とも呼ばれる)を阻害し、このため、好ましくは、腫瘍細胞におけるその有効濃度を低下させ、細胞におけるG1停止を同調させると考えられる。このため、感染した細胞が増えれば、ウイルスのライフサイクル全体を完結させることができる。
本明細書で提供された証拠及び洞察に基づいて、当業者は、任意の-突然変異体-アデノウイルスが本発明の実施における使用に適していると理解するであろう。同使用は、そのようなアデノウイルスにより、少なくとも野生型発現の10%、20%又は30%程度、E1B55K及びE4orf6それぞれの活性が達成されることを許容する。このような突然変異体アデノウイルスは、E1Aを改変することにより生成することができると、当業者により理解されるであろう。例示的な突然変異体アデノウイルスは、アデノウイルスXVir-N-31、dl520、AdΔ24、AdΔ24-RGD、dl922-947、E1Ad/01/07、dl1119/1131、CB016、VCN-01、E1Adl1107、E1Adl1101、ORCA-010、Enadenotucirev及び機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物と結合可能な発現されたウイルス性腫瘍遺伝子を欠いているウイルスである。
アデノウイルスについての名称の由来は、Wallace P. Rowe及びRobert J. Huebnerにより(Rowe, et al., 1953)、1953年にヒトの扁桃及び咽頭扁桃組織からウイルスが初めて分離されたことによる。アデノウイルス科は、5つの属、すなわち、Mastadenoviruses、Aviadenoviruses、Siadenoviruses、Atadenoviruses及びIchtadenovirusesを含む(Modeow, 2013)。げっ歯類の新生児におけるその発がん性のため、それらは、7つのサブグループHAdV-A~HAdV-Gに分類することができ(Boulanger and Blair, 1991)、全部で62の血清型に分類することができる。それにより、腫瘍溶解性ウイルス療法に関する研究は、主に、Mastadenovirus C型血清型5に焦点が当てられている。
80~110nmのサイズを有する非被覆の二十面体キャプシドは、キャプシドの頂点にある、ペントンベース及び繊維と呼ばれるスパイク様タンパク質構造から構築される12個のペントンと、ヘキソンと呼ばれる249面とからなる、252個のキャプソメアから構成される(Modrow, 2013)。アデノウイルスの全ライフサイクルは、細胞侵入を伴う初期段階、ウイルスゲノムの核移行、初期遺伝子の転写及び翻訳並びに後期遺伝子の転写及び翻訳を伴う後期段階に細分することができる。それにより、後期タンパク質は、主に、構造タンパク質の構築とビリオンの成熟を担っている(Russell, 2000)。許容細胞では、初期段階に約6~8時間かかり、続けて、後期段階に約4~6時間かかる。結合は、少なくともアデノウイルスHAdV-A、-C、-E及び-Fについては、繊維構造のあらゆる末端に存在するノブ構造とターゲット細胞上のレセプターとの相互作用を介して生じる。このレセプターは、コクサッキーBウイルス吸着を担うものと同じものとして検出されたため、このレセプターは、コクサッキー及びアデノウイルスレセプター(CAR)と呼ばれている(Bergelson, 1997)。加えて、ターゲット細胞の表面への結合は、特定のアデノウイルス型の繊維タンパク質の結合を媒介する、体液中の可溶性タンパク質である「架橋分子」、例えば、血液凝固因子VII及びXにより支持される(Modrow, 2013)。この吸着段階の後、ペントンベースにおけるRGDモチーフ(アルギニン-グリシン-アスパラギン酸)は、この過程で共レセプターとして機能するヘテロ二量体インテグリンαvβ3又はαvβ5と相互作用する。この相互作用により、ウイルスの内在化がもたらされる(Wickham et al., 1993)。その後、細胞膜においてクラスリン媒介内在化を介したエンドサイトーシスが起こり、ウイルスは、エンドソームに存在する。細胞内小胞の酸性化後、ウイルス繊維タンパク質は、そのコンホメーションを変化させ、エンドソーム膜を破壊する(Greber et al., 1996)。この時点で、ウイルス粒子は、細胞質中で浮遊している。微小管のダイニンに残存粒子が結合することにより、ウイルスゲノムは核内に移入される(Modrow, 2013)。
アデノウイルスのゲノムは、長さ36~38kbの二本鎖、線状DNAからなる。両5’末端に共有結合している2つの末端タンパク質(TP)分子の相互作用により、準環状状態が形成される(Modrow, 2013)。一般的には、アデノウイルスゲノムの5つのコード領域は、主に、感染の初期段階に活性な初期遺伝子E1~E4と、主に、ウイルス粒子形成に必要なタンパク質をコードする後期遺伝子(L1~L5)に細分することができる(Modrow, 2013)。
アデノウイルス複製は、大型E1Aタンパク質(E1A13S)により強力に誘引される初期ウイルス遺伝子E2の発現に特に依存している。感染後に最初に転写されるウイルス遺伝子は、初期領域1A(E1A)である。一次E1A転写物は、差次的スプライシングによりプロセシングされ、13S、12S、11S、10S及び9Sの沈降係数を有する5つの異なるメッセージを生成する。13S及び12S mRNAは、感染初期に最も豊富に存在する。一方、9S mRNAは、後期に最も豊富に存在する。11S及び10S mRNAは、感染後の後期により豊富になるマイナー種である。13S、12S、11S、10S及び9S E1A mRNAはそれぞれ、289残基(R)、243R、217R、171R及び55Rのタンパク質をコードし、それらは全て、in vitroでのみ検出される9S産物を除いて、in vivoで検出可能である。一般的には、アデノウイルス遺伝子の発現は、感染の過程で高度にレギュレーションされ、その複雑性は高い。これにより、効率的なウイルス複製に必要なウイルスDNAポリメラーゼ及び他のタンパク質をコードするE2遺伝子の転写は、E2初期プロモーター及びE2後期プロモーターの2つのプロモーターの制御下にある。
その2つの重複した転写制御領域のために、E2-初期プロモーターは、+1位から始まる主プロモーターと、-26位から始まる副プロモーターに細分することができ、両方とも、TATAモチーフを含有する(Swaminathan and Thimmapaya, 1996)。これらのモチーフは、TATAボックス結合タンパク質(TBP)の結合部位として機能する。さらに、-68位と-77位との間の活性化転写因子(ATF)に対する1つの結合部位と、互いに逆向きに並んだ2つのE2F1/DP-1結合部位(TTTCGCGC)は、主要E2初期プロモーターの-35位及び-63位に位置している(Swaminathan and Thimmapaya, 1996)。E1Aを介したE2初期プロモーターの活性化は、主に、主要プロモーター部分に局在する2つのE2F1結合部位に依存している。
感染の中間段階では、約6hpi(感染後時間)後、E2遺伝子の発現は、E2後期プロモーターにより制御される。その157bp配列の位置nt -33~-22には、TATAボックスが存在し、これは、細胞TBPに結合することができ、細胞内TBPにより活性化されることができる(Swaminathan and Thimmapaya, 1996)。さらに、2つのSP1認識部位及び3つのCCAATボックスが、E2後期プロモーターに特徴的である。
細胞因子YB-1が、逆方向CCAATボックスに結合可能であることが示されたため、Y-ボックス結合タンパク質1(YB-1)とE2後期プロモーターとの間の相互作用が調査された。Holm et al.は、2002年に、E2後期プロモーターに存在するY-ボックス(逆方向CCAATボックス)とYB-1との特異的相互作用が、このプロモーターの活性を制御する能力を有することを実際に示した(Holm et al., 2002)。そのトランス活性化活性を発揮するために、YB-1は、アデノウイルス複合体E1B-55k/E4-orf6を介して核内に移行しなければならない。これらの初期ウイルス遺伝子は、E1A-13Sのトランス活性化後に発現される(Frisch and Mymryk, 2002)。
YBX1遺伝子によりコードされる細胞因子YB-1は、転写、スプライシング、翻訳制御及びDNA損傷の修復において複数の機能を有するコールドショックドメイン担持DNA結合タンパク質である(Kohno et al., 2003)。さらに、細胞因子YB-1は、がん細胞における多剤耐性表現型の発達に関与するMDR1及びMRP1遺伝子のその活性化により、薬剤耐性に重要な役割を果たしている(Mantwill et al., 2006)。YB-1の発現は、外因性ストレス要因、例えば、アデノウイルス感染、化学療法又はUV照射の暴露を介して、その後の核輸送により誘引される(Mantwill et al., 2006)。
アデノウイルスの初期遺伝子及び後期遺伝子の転写活性化は、ウイルスのライフサイクルにとって極めて重要である。簡潔に、ウイルスのライフサイクルは、E1A転写の活性化により開始され、続けて、E2、E3及びE4遺伝子の活性化のカスケードが起こる。最後に、主な後期プロモーター(MLP)が活性化され、主にゲノムカプシド形成に関与するカプシド及びアクセサリータンパク質の発現を調整する(Turner et al 2015)。非増殖細胞に存在するウイルスDNA複製に対する防御を克服するために、ウイルスは、初期1Aタンパク質(E1A)を発現する。これらの最初期タンパク質は、細胞をS期に移行させ、他の全てのウイルス初期遺伝子の発現を誘引する。感染の間、幾つかのE1Aアイソフォームが、ヒトアデノウイルス5型に存在する289、243、217、171及び55残基のタンパク質として発現される。感染に関して、ウイルス遺伝子発現の主な要因は、大型E1A 289Rタンパク質である(Radko et al 2015)。
感染に際して、アデノウイルスE1Aタンパク質の発現は、ヒトアデノウイルスの主なターゲットである最終分化上皮細胞においてさえも、G0/G1期からS期への細胞周期進行及びウイルス複製を促進する。この過程は、アデノウイルスのライフサイクルに必須であると考えられる。
正常な細胞を温存しつつ、がん細胞に感染し、複製し、殺傷するように、アデノウイルスが設計された。腫瘍細胞における感染及び複製に続けて、腫瘍溶解性ウイルスは、該細胞を殺傷し、その後の増幅サイクルのためにビリオンを放出する。腫瘍細胞内のみでの複製を達成するために、2種類の遺伝子改変がなされ、3つのサブクラスの腫瘍溶解性アデノウイルス(本明細書において、CRAdとも呼ばれる)が設計されており、これらは全て、本発明の実施において使用することができる。さらに、本発明の実施における使用に適した腫瘍溶解性アデノウイルスは、中でも、WO第2003/099859号に記載されている。
I型CRAdは、ゲノムのE1領域における突然変異又は欠失を特徴とし、細胞周期レギュレーター、例えば、p53及び網膜芽細胞腫タンパク質(Rb)の不活性化を妨害する。その結果、I型CRAdは、活発に分裂している腫瘍細胞内で複製する。例えば、E1B-55kDaタンパク質を発現することができないOnyx-015(dl1520としても公知)は、p53を不活性化することができず、p53誘引細胞周期停止を回避することができない。幾つかの研究から、Onyx-015選択性の分子基盤がp53又はp53経路に関与する遺伝子のうちの1つの発現の欠如によると考えられた。しかしながら、O’Shea et al.では、p53不活化ではなく、後期ウイルスRNA排出により、Onyx-015ウイルス選択性が決定されることが示された。E1A領域に欠失を有する他のI型CRAdは、Rbに結合することができず、S期への進行を誘発することができない。例えば、dl922-947及びΔ24は、E1A領域のCR2ドメインにおいて24ヌクレオチドの欠失を含有し、E1A-Rb相互作用を阻害する。その結果、これらのウイルスは、遊離の非結合型E2F1を利用可能な腫瘍細胞で主に複製する。
アデノウイルス複製を腫瘍細胞に限定する別の方法は、ウイルス複製に必要なウイルス遺伝子の転写をレギュレーションすることである。II型CRAdにおいて、ゲノムは、腫瘍特異的プロモーターの制御下に置かれる。それらのプロモーターは、正常組織と比較して、一部の腫瘍で優先的に発現されることが公知の遺伝子(例えば、テロメラーゼ又はシクロオキシゲナーゼII);又は正常組織と比較して、腫瘍で過剰発現される遺伝子(例えば、前立腺特異的抗原、PSA又はα-フェトプロテイン、AFP)に由来した。III型CRAd、例えば、XVir-N-31(Ad-Delo3-RGD)は、E1A13Sタンパク質におけるトランス活性化ドメインCR3の欠失を特徴とする。XVir-N-31は、正常細胞における複製欠損アデノウイルスである。XVir-N-31は、核内に細胞多機能タンパク質YB-1が存在することにより、その複製能が回復する。したがって、CRAdは、腫瘍細胞においてのみ複製可能であり、このため、それらを最終的に溶解する。p53、ras、RBのいずれの突然変異も、XVir-N-31の複製欠損を補完するのに有効ではない。XVir-N-31は、E1A13Sを欠いているため、E1B55kタンパク質及びE4orf6タンパク質は発現しない。この欠損は、E1A13Sとは独立して、E1B55k及びE4orf6の発現を誘発する腫瘍細胞の核内でのYB-1の存在により補完される。核内でのYB-1の存在によりひとたび誘引されると、E1B55k及びE4orf6は、さらに、細胞YB-1を核内に移入させ、ウイルス複製を推進する。
細胞周期は、ギャップ1(G1)、合成(S)、ギャップ2(G2)及び有糸分裂(M)期を経て連続的に進行する。この進行は、複雑なシグナル伝達ネットワークを介してレギュレーションされる。CDK(サイクリン依存性キナーゼ)タンパク質であるCDK1、CDK2、CDK4及びCDK6は、特定のサイクリンタンパク質と複合体を形成した場合、細胞周期進行の主なレギュレーターとなる。CDKの構成的発現と種々のサイクリンの時間的制御とにより、異なるサイクリン-CDK複合体による特定の細胞周期のレギュレーションが可能となる。CDK活性は、幾つかの阻害性タンパク質によりネガティブにレギュレーションされる。CDKの生物学及び機能の種々の側面は、以前に包括的にレビューされている。
構造的かつ機能的相同性を示すCDK4及びCDK6は、サイクリンDタンパク質と複合体を形成した場合、G1期にある休止細胞のS期への移行をレギュレーションする。サイクリンDタンパク質は、サイクリンD1~3の3つのサブタイプを有し、有糸分裂促進性刺激の存在下で蓄積する。CDK4/6のネガティブレギュレーターは、CDK4(INK4)タンパク質の阻害因子であるp16INK4A、p15INK4B、p18INK4C及びp19INK4Dを含む。これらは、サイクリンD1との結合を減少させるか又はそれらの触媒ドメインを直接的に占有することによりCDK4/6活性を阻害する。
CDK4/6のキナーゼ活性により、Rb、p107及びp130を含む網膜芽細胞腫(Rb)タンパク質ファミリーのメンバーのリン酸化がもたらされ、同リン酸化により、それらの機能的不活性化がもたらされる。休止細胞では、活性型低リン酸化Rbが、他のコレプレッサーとともに、DP-1/2と複合体を形成するE2F1転写因子ファミリーのメンバーに結合し、E2F1の機能をサプレッションする(Rubin et al 2005)。リン酸化されると、Rbは、この複合体から解離し、中でも、細胞周期のS期への移行に必要なサイクリンA、サイクリンE及びDHFRを含むE2F1ターゲット遺伝子の転写が可能となる。したがって、CDK4/6活性の阻害により、Rb脱リン酸化及びE2F1活性のレプレッションがもたらされ、これにより、G0/G1停止が促進される。これにより、がん細胞におけるターゲット治療としてのCDK4/6阻害剤の開発が促進されている。
CDK4/6-Rbシグナル伝達経路の破壊及び細胞周期の制御されていないG1-S移行は、がん細胞に共通の特徴である。これは、RB1遺伝子(Rbをコードする)、CDKN2A(p16INK4A及びp14ARFをコードする)又はCDKN2B(p15INK4Bをコードする)の機能喪失突然変異又は欠失を含む種々の分子的変化により起こる場合がある。また、このようなデレギュレーションは、CCND1(サイクリンD1をコードする)、E2F1-3、CDK4、CDK6又は種々の有糸分裂促進性シグナル伝達経路、例えば、PI3K経路もしくはMAPK経路の成分の増幅又は活性化突然変異にもよる場合がある。
幾つかのATP競合性低分子CDK阻害剤が開発されている。しかしながら、第一世代阻害剤、例えば、フラボピリドールは非選択的であり、複数のCDKを阻害することおそれがあり、これにより、限定された効力及び高い毒性をもたらされる場合がある。次世代CDK4/6阻害剤は高選択性を示し、パルボシクリブ(PfizerからのPD-0332991)、アベマシクリブ(Eli LillyからのLY-2835219)及びリボシクリブ(NovartisからのLEE011)及びトリラシクリブ(G1T28)を含む。これらのCDK4/6阻害剤は、白血病、乳がん、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び転移性乳がん(mBC)を含む幾つかのがん実体のin vitro及びin vivoモデルにおいて前臨床試験されている。ほとんどの研究で、それらは、G0/G1停止及び細胞増殖の阻害と相関する、Rbリン酸化、E2F1ターゲット遺伝子のタンパク質発現及び転写における用量依存的減少を伴う、一貫した分子的及び機能的表現型を実証された。加えて、これらの全ての報告から、Rb発現は、これらの阻害剤に対する感受性のための前提条件であることが実証されている。
CDK4/6阻害剤、例えば、PD-0332991により、リン酸化Rbの減少と相関する総Rbタンパク質の用量依存的減少がもたらされる。この総Rbの減少は、RB1転写物レベル及びE2F1ターゲット遺伝子であるCCNA2及びCCNE2の転写の減少と部分的に相関する。また、E2F1発現量も、顕著にダウンレギュレーションされる。
本発明の実施における使用に適したCDK4/6阻害剤を図25に開示する。
実施例部分から明らかなように、任意のCDK4/6阻害剤は、ウイルス、好ましくは、アデノウイルス、より好ましくは、腫瘍溶解性アデノウイルスと組み合わせて使用するのに適している。それにより、CDK4/6阻害剤は、細胞をG1で停止させ、E2F1、より具体的には、E2F1活性を阻害する。
任意のCDK4/6阻害剤が、治療有効濃度で使用されることは、当業者に理解されるであろう。
PARP1は、一本鎖切断(DNAの「ニック」)を修復するのに重要なタンパク質である。ほ乳類では、17のPARPファミリーメンバーが発見されており、これらのうちの6つのみが、ポリADP-リボース(pADPr)を合成する。PARP1、PARP2及びPARP3は、DNA修復に役割を有する。PARP1は、一本鎖切断(SSB)及び二本鎖切断(DSB)を受けたDNAに結合する。ついで、PARP1は、活性部位における重要なアミノ酸残基を整列させるコンホメーション変化を受けることにより、その活性を向上させる。PARP1が活性化されると、PARP1は、pADPrを合成する。pADPrは、タンパク質に結合し、その機能を変化させる。存在するpADPrのレベルがDNA損傷を反映しており、pADPrに対する応答がDNA修復後に終結することを確実にするために、pADPrは、pADPrグリコヒドロラーゼにより急速に分解される。
DNA修復経路を阻害することにより、PARP1阻害剤は、DNA内の一本鎖切断を増加させる。BERがもはや起こらないために、このDNA損傷は修復されず、複製後の娘細胞に引き継がれる。これにより、BRCA1及びBRCA2突然変異を有する腫瘍ではDSBが増加する(Scott et al. 2015, J Clin Oncol., 33(12): 1397-140)。PARP薬剤候補であるルカパリブ、ベリパリブ及びオラパリブを含むPARP阻害剤の化学構造は、全てのPARP阻害剤構造を特徴付けるベンズアミド部分を含めて、図26に示され、Antolin and Mestres 2014, Oncotarget, 30;5(10):3023-8に記載されている。
加えて、YB-1が、PARP活性を増強し、PARP1阻害剤の有効性を低下させることが十分に確立されている(Alemasova et al.2018, Oncotarget, 34, 23349-65)。このことから、YB-1依存性腫瘍溶解性アデノウイルスは、CDK4/6阻害剤及びPARP阻害剤の両方との組み合わせで、がん細胞殺傷において相乗的に作用するであろうことが示唆される。オラパリブ及びBMN673(Talazolarib developed from Pfizer, USA, Clin Cancer Res. 2013, 15;19(18):5003-15)は、PARP阻害剤の例である。
任意のPARP阻害剤が、治療有効濃度で使用されることは、当業者に理解されるであろう。
本発明の実施における使用に適したCDK4/6阻害剤を図25に開示する。
エピジェネティックな状況における異常は、がんの特徴であり、リシン残基のアセチル化は、翻訳後修飾であり、細胞のシグナル伝達及び疾患生物学に広く関連している。アセチル化部位を「書く(wrire)」酵素(ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、HAT)及びアセチル化部位を「消去する(erase)」酵素(ヒストンデアセチラーゼ、HDAC)は、現在の薬剤開発における広範な研究領域である。アセチル化リシン残基による巨大分子複合体へのタンパク質のリクルートは、ブロモドメイン(BRD)により媒介される。ブロモドメインは、ε-N-リシンアセチル化モチーフを認識する進化的に高度に保存されたタンパク質相互作用モジュールである。保存されたBRDフォールドは深く、主に疎水性のアセチルリシン結合部位を含有する。同部位は、低分子量の薬学的に活性な分子の開発に魅力的なポケットを提示する。BRDを含有するタンパク質は、多種多様な疾患の発症に関与している。
近年、BET(ブロモドメイン及び末端外)ファミリーのBRDをターゲットとする2つの非常に強力かつ選択的な阻害剤により、がんにおけるこれらのBRDのターゲット化を支持する説得力のあるデータが提供された。BRD2、BRD3、BRD4及びBRDTから構成されるブロモドメインタンパク質のBET(ブロモドメイン及び末端外ドメイン)サブファミリーは、RNAポリメラーゼII(POLII)による転写レギュレーションにおいて多様な役割を果たし、新しいクラスのエピジェネティックな薬剤ターゲットである。これらのタンパク質は、アセチル化リシン残基において活性化クロマチンに結合することにより、転写の開始期及び伸長期を促進する。これらのいわゆるエピジェネティックな「リーダー」による活性化クロマチンの認識により、RNAポリメラーゼII複合体の活性転写部位へのリクルートが促進される。BRD4/P-TEFb相互作用は、有糸分裂後の素早い転写再開に重要である(Muller et al., 2011, Expert Rev. Mol. Medicine, 13, e19)。P-TEFbは、Drosophila細胞由来のin vitro転写系を使用して、ロングラン-オフ転写物の生成に必要な因子として同定され、精製された。P-TEFbは、Drosophilaの触媒サブユニットであるCdk9及びレギュラトリーサブユニットであるサイクリンTを含有するサイクリン依存性キナーゼである。ヒトでは、Cdk9並びに幾つかのサイクリンサブユニットであるサイクリンT1、T2及びKのうちの1つを含有する、複数の形態のP-TEFbが存在する。P-TEFbは、ブロモドメインタンパク質BRD4を含む他の因子と会合し、超伸長複合体と呼ばれる大型のタンパク質複合体と会合することが見出されている(Yang Z, et al.,2005. Mol Cell; 19:535-45;Fu et al., 1999, J Biol Chem., 274:34527-30)。
JQ-1(チエノ-トリアゾロ-1-4-ジアゼピン)は、BRD2、BRD3、BRD4を含むブロモドメインタンパク質のBETファミリーの強力な阻害剤である(Filippakopoulos et al., 2010 Nature 468, 1067-1073)。JQ-1は、ブロモドメインとアセチル基の間の相互作用を妨げ、特定の遺伝子をダウンレギュレーションさせる。OTOX15、BAY1238097、GSK2820151、I-BET762及びPLX51107を含む更なるBETブロモドメイン阻害剤が記載されている(Perez-Salvia and Esteller 2017, EPIGENETICS, 12, 323-339;Brandt et al., 2015ACS Chem. Biol., 10, 22-39)。JQ-1は、ベンゾジアゼピンに構造的に関連している。式は、C23H25ClN4O2Sである。
近年、BET阻害剤であるJQ-1が、アデノウイルス感染及びアデノウイルスベクター媒介遺伝子送達を促進することが示されている。細胞をJQ-1で処理すると、転写伸長のP-TEFbのサブユニットであるCDK9とのBRD4会合の増加が誘引される。しかしながら、論文で述べられたように、アデノウイルス感染及び導入遺伝子発現をレギュレーションするために、BED4が利用する機構を精密にするには、更なる研究が必要である(Baojie Lv et al 2018, Scientific reports, 8, 11554)。重要なこととして、ウイルス複製及びウイルス転写は調査されなかった。しかしながら、CDK9は、停止したポリメラーゼの再開を刺激し、転写中のポリメラーゼの数、このため、時間当たりのmRNA合成量を増加させることにより転写を活性化することが公知である(Gressel et al. 2017, eLife, 6, e29736)。加えて、BET阻害剤耐性は、CDK4/6阻害剤により克服することができることが示された(Jin et al. 2018, Mol Cell;71(4):592-605)。近年、細胞周期の有糸分裂後期から初期G1期までのP-TEFb-Brd4相互作用の劇的な増加及びP-TEFbの染色体への能動的なリクルート、続けて、G1進行に重要な遺伝子の転写開始が実証された。重要なこととして、Brd4の枯渇は、必須のG1遺伝子の転写を減少させることにより、プロセス全体を停止させ、G1細胞周期停止及びアポトーシスをもたらした(Yang et al., 2008, Mol Cell Biol., 28:967-976, Kohoutek, 2009, Cell Division, 4. 19)。
しかしながら、CDK4/6阻害剤及びBET阻害剤と併用して、YB-1依存性腫瘍溶解性アデノウイルスを使用することについては何も知られていない。
他のブロモドメイン阻害剤が、ウイルス、好ましくは、アデノウイルス、より好ましくは、腫瘍溶解性アデノウイルス、例えば、XVir-N-31及びCDK4/6阻害剤を使用する三重治療における使用に等しく適切であろうことが理解されるであろうし、本発明の範囲内にある。
任意のブロモドメイン(Bet)阻害剤が、治療上有効濃度で使用されることは、当業者に理解されるであろう。
本発明の実施における使用に適したブロモドメイン阻害剤は、図27に開示されている。
p53及びE2F1に対するMDM2の役割
p53及び網膜芽細胞腫(Rb)タンパク質は、2つの重要な腫瘍サプレッサーである。一方又は両方における突然変異が、全てのヒトがん腫瘍において見出され、両方とも、薬剤開発プログラムにおける可能性のある治療ターゲットとして広範に研究されている。p53及びE2F1は、細胞増殖及び生存(細胞死)の重要なレギュレーターであるため、その存在量及び活性は、厳密にレギュレーションされている。E3ユビキチン-タンパク質リガーゼとしても公知のマウスダブルマイニュート2タンパク質(MDM2)は、MDM2-p53経路とRb-E2F1経路との両方をレギュレーションすると考えられる。Rb及びp53は、直接相互作用することができないため、MDM2は、Rbとp53との間の架橋であることが示唆されている(Polager and Ginsberg, Nat Rev Cancer 2009, 9, 738-48)。MDM2のがん遺伝子としての役割をさらに支持するものとして、軟組織肉腫及び骨肉腫並びに乳房腫瘍を含む幾つかのヒト腫瘍タイプは、MDM2レベルが向上していることが示されている。MDM2がんタンパク質は、p53をユビキチン化し、p53と拮抗するが、p53非依存的な機能も実行する可能性がある。MDM2は、p53に直接結合し、その転写活性を阻害する。加えて、p53選択的E3ユビキチンリガーゼとして、MDM2は、p53のユビキチン化を促進し、p53をプロテアソーム分解のターゲットとする(Eischem et al, Hum. Mutant. 20014, 35, 728-737)。一方、MDM2は、p53欠損がん細胞の生存にも必要であるという証拠が存在する(Feeley et al, Cancer Res 2017, 77, 3823-3833)。
p53及び網膜芽細胞腫(Rb)タンパク質は、2つの重要な腫瘍サプレッサーである。一方又は両方における突然変異が、全てのヒトがん腫瘍において見出され、両方とも、薬剤開発プログラムにおける可能性のある治療ターゲットとして広範に研究されている。p53及びE2F1は、細胞増殖及び生存(細胞死)の重要なレギュレーターであるため、その存在量及び活性は、厳密にレギュレーションされている。E3ユビキチン-タンパク質リガーゼとしても公知のマウスダブルマイニュート2タンパク質(MDM2)は、MDM2-p53経路とRb-E2F1経路との両方をレギュレーションすると考えられる。Rb及びp53は、直接相互作用することができないため、MDM2は、Rbとp53との間の架橋であることが示唆されている(Polager and Ginsberg, Nat Rev Cancer 2009, 9, 738-48)。MDM2のがん遺伝子としての役割をさらに支持するものとして、軟組織肉腫及び骨肉腫並びに乳房腫瘍を含む幾つかのヒト腫瘍タイプは、MDM2レベルが向上していることが示されている。MDM2がんタンパク質は、p53をユビキチン化し、p53と拮抗するが、p53非依存的な機能も実行する可能性がある。MDM2は、p53に直接結合し、その転写活性を阻害する。加えて、p53選択的E3ユビキチンリガーゼとして、MDM2は、p53のユビキチン化を促進し、p53をプロテアソーム分解のターゲットとする(Eischem et al, Hum. Mutant. 20014, 35, 728-737)。一方、MDM2は、p53欠損がん細胞の生存にも必要であるという証拠が存在する(Feeley et al, Cancer Res 2017, 77, 3823-3833)。
MDM2のE2F1経路に対するポジティブな効果に沿って、MDM2は、Rb、E2F1及びE2F1のヘテロ二量体パートナーであるDP1と物理的に相互作用して、G1/S細胞周期移行を促進することができる。したがって、MDM2とE2F1又はDP1との相互作用により、細胞周期進行に関与するE2F1ターゲット遺伝子の転写を刺激することができる。さらに、Fボックスタンパク質であるSKP2による分解のためのE2F1のターゲティングは、MDM2の結合により拮抗される。このように、MDM2結合により、E2F1の安定性が向上し(Zhang et al. Oncogene 2005, 24, 7238-7247)、一方で、MDM2阻害は、E2F1タンパク質レベルの低下に関連するという証拠が存在する。MDM2は、他の多くのがんタンパク質と同様に、低リン酸化Rbに選択的に結合する。MDM2とRbとの間の相互作用により、Rb-E2F1複合体形成が阻害され、Rb機能のサプレッションがもたらされる。加えて、RBとMDM2との間の相互作用により、MDM2媒介性Rb分解が引き起こされる。現在の事実から、(p53の他に)MDM2も、Rbの重要なネガティブなレギュレーターであることが確認されると考えられる(Shi and Gu, Genes Cancer. 2012, 3: 240-248;Yap et al., Oncogene 1999, 18, 7681-7689、Wu et al., JBC 2009, 284, 26315-26321)。
ヌトリン-3
ヌトリンは、cis-イミダゾリン類似体であり、MDM2と腫瘍サプレッサーであるp53との間の相互作用を阻害する。ヌトリン-3は、抗がん研究において最も一般的に使用される化合物である。ヌトリン小分子は、MDM2のp53結合ポケットを占有し、p53野生型細胞においてp53経路の活性化をもたらすp53-MDM2相互作用を効果的に破壊する。ヌトリン-3処理に応答して、p53がん細胞は、細胞周期停止(G0/G1又はG2/S)又はアポトーシスのいずれかを受ける。加えて、ヌトリン-3により、分化及び細胞老化を誘因することができる。MDM2、MDM4、p73、ATM及びE2F1の一ヌクレオチド多型を含む一連の因子が、ヌトリン-3処置のアウトカムに影響を及ぼすことが示された。p53の活性化により、p21及びMDM2がアップレギュレーションされ、p21及びMDM2は両方とも、Rbの重要なレギュレーターである。近年、ヌトリン-3が、Rb及びE2F1タンパク質レベルとRbリン酸化の両方対してネガティブに影響を及ぼし、それが、ヌトリン-3に対する細胞応答に顕著に影響を及ぼすことが示された(Du et al., JBC 2009, 284, 26315-26321)。
ヌトリンは、cis-イミダゾリン類似体であり、MDM2と腫瘍サプレッサーであるp53との間の相互作用を阻害する。ヌトリン-3は、抗がん研究において最も一般的に使用される化合物である。ヌトリン小分子は、MDM2のp53結合ポケットを占有し、p53野生型細胞においてp53経路の活性化をもたらすp53-MDM2相互作用を効果的に破壊する。ヌトリン-3処理に応答して、p53がん細胞は、細胞周期停止(G0/G1又はG2/S)又はアポトーシスのいずれかを受ける。加えて、ヌトリン-3により、分化及び細胞老化を誘因することができる。MDM2、MDM4、p73、ATM及びE2F1の一ヌクレオチド多型を含む一連の因子が、ヌトリン-3処置のアウトカムに影響を及ぼすことが示された。p53の活性化により、p21及びMDM2がアップレギュレーションされ、p21及びMDM2は両方とも、Rbの重要なレギュレーターである。近年、ヌトリン-3が、Rb及びE2F1タンパク質レベルとRbリン酸化の両方対してネガティブに影響を及ぼし、それが、ヌトリン-3に対する細胞応答に顕著に影響を及ぼすことが示された(Du et al., JBC 2009, 284, 26315-26321)。
以前の研究から、MDM2の腫瘍形成性は、p53のそのネガティブなレギュレーションによることが示唆されたが、p53非依存性相互作用は、同程度に重要である可能性がある。MDM2阻害剤を利用した近年の研究中に、E2F転写因子1(E2F1)が、がんのp53状態に関係なく、MDM2の阻害時にダウンレギュレーションされることが注目された。1つの刊行物には、MDM2機能を阻害するためのアンチセンスRNAの使用を記載されている。著者らは、MDM2がp53依存性メカニズム及びp53非依存性メカニズムを介して、前立腺がんの成長に役割を有すると結論づけた。さらに、Bcl2、Rb、pRb及びE2F1タンパク質レベルが低下したが、p21は増加したことが示されている(Zhang et al 2003, PNAS 2003,100, 11636-11641)。一方、MDM2が、そのユビキチン化を阻害することにより、E2F1タンパク質の半減期を延長させることが示された。MDM2は、E2F1 E3リガーゼであるSCF(SKP2)を置き換える。MDM2とE2F1との間の直接結合は、MDM2のE2F1ユビキチン化に対するネガティブな効果に必須であり、MDM2の核局在化シグナルの欠失によっては、E2F1タンパク質レベルを向上させる能力の喪失はもたらされない。MDM2阻害時のE2F1のダウンレギュレーションは、pRB又はp14(Arf)のいずれによるものでもなかった。加えて、E2F1は、MDM2ノックダウンにより誘引される細胞増殖の阻害の少なくとも一部を担っていた。結論として、本研究から、E2F1タンパク質の安定化がMDM2媒介性腫瘍形成の別のp53非依存性要素である可能性が高いという証拠が提供される(Zhang et al., Oncogene 2005, 24, 7238-7247)。
明らかに、Rb-E2F1経路及びMDM2-p53経路は、それらの間の多面的なクロストークと共に、細胞周期進行及び生存性の極めて重要なレギュレーターである。しかしながら、MDM2ターゲッティング薬剤を使用する臨床研究は、少なくとも単剤として使用した場合には、現時点では当初の期待を満たしていない。これにより、MDM2阻害剤と他の抗がん剤との最適化された併用の調査に拍車がかかった。
ヌトリンの幾つかの誘導体が開発され、ヒトでの研究に進んでいる(図1)。これらの化合物は、正常又は「野生型」p53を含有する腫瘍に最もよく作用すると考えられる。しかしながら、近年の結果から、E2F1転写活性が、MDM2アンタゴニスト誘引性アポトーシスの重要な決定因子であり、p73が、ヌトリン-3により誘引されるE2F1媒介性アポトーシスに重要であることが示唆されている(Burgess et al., Frontiers in Oncology 2016, 6, article 7;Skalniak et al., 2019, 29, 151-170;Kitagawa et al., Oncogene 2008, 27, 5303-5314)。
ヌトリン及びその誘導体(NVP-HDM201、イダサヌトリン、AM-8553、SAR405838、ヌトリン-3a、AMG232)を図43に示す。
本明細書に記載された本発明のウイルス及び組み合わせにより特に処置することができる腫瘍は、好ましくは、神経系の腫瘍、眼の腫瘍、皮膚の腫瘍、軟組織の腫瘍、胃腸の腫瘍、呼吸器系の腫瘍、骨格の腫瘍、内分泌系の腫瘍、女性生殖器系の腫瘍、乳腺の腫瘍、男性生殖器系の腫瘍、尿排出系の腫瘍、混合腫瘍及び胚性腫瘍を含む造血系の腫瘍並びに白血病を含む群から選択されるような腫瘍である。これらの腫瘍が、特に、本明細書で特に定義されたような、耐性腫瘍であることは、本発明の範囲内にある。
神経系の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
1.頭蓋の腫瘍及び脳(頭蓋内)の腫瘍、好ましくは、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、神経節腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維腫、血管芽細胞腫、脂肪腫、頭蓋咽頭腫、奇形腫及び脊索腫;
2.脊髄及び脊柱管の腫瘍、好ましくは、膠芽腫、髄膜腫、神経芽腫、神経線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、血管肉腫、線維肉腫及び多発性骨髄腫;並びに
3.末梢神経の腫瘍、好ましくは、シュワン神経膠腫、神経線維腫、神経線維肉腫及び神経周囲線維芽細胞腫。
眼の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
1.眼瞼の腫瘍及び眼瞼腺の腫瘍、好ましくは、腺腫、腺がん、乳頭腫、組織球腫、肥満細胞腫瘍、基底細胞腫瘍、メラノーマ、扁平上皮がん、線維腫及び線維肉腫;
2.結膜の腫瘍及び瞬膜の腫瘍、好ましくは、扁平上皮がん、血管腫、血管肉腫、腺腫、腺がん、線維肉腫、メラノーマ及び乳頭腫;並びに
3.眼窩、視神経及び眼球の腫瘍、好ましくは、網膜芽細胞腫、骨肉腫、肥満細胞腫瘍、髄膜腫、網状細胞腫瘍、グリオーマ、シュワン神経膠腫、軟骨腫、腺がん、扁平上皮がん、形質細胞腫瘍、リンパ腫、横紋筋肉腫及びメラノーマ。
皮膚の腫瘍群は、好ましくは、組織球腫、脂肪腫、線維肉腫、線維腫、肥満細胞腫瘍、悪性メラノーマ、乳頭腫、基底細胞腫瘍、ケラトアカントーマ、血管周囲細胞腫、毛嚢の腫瘍、汗腺の腫瘍、脂腺の腫瘍、血管腫、血管肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、形質細胞腫及びリンパ管腫の腫瘍を含む。
軟組織の腫瘍群は、好ましくは、胞巣状軟部肉腫、類上皮細胞肉腫、軟組織の軟骨肉腫、軟組織の骨肉腫、軟組織のユーイング肉腫、原始神経外胚葉性腫瘍(PNET)、線維肉腫、線維腫、平滑筋肉腫、平滑筋腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性血管周囲細胞腫、血管腫、血管肉腫、悪性間葉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)、悪性シュワン神経膠腫、悪性黒色細胞シュワン神経膠腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、リンパ管腫及びリンパ管肉腫の腫瘍を含む。
胃腸の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
1.口腔の腫瘍及び舌の腫瘍、好ましくは、扁平上皮がん、線維肉腫、メルケル細胞腫瘍、誘導性線維芽細胞腫、線維腫、線維肉腫、ウイルス性乳頭腫症、特発性乳頭腫症、鼻咽頭ポリープ、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫及び肥満細胞腫瘍;
2.唾液腺の腫瘍、好ましくは、腺がん;
3.食道の腫瘍、好ましくは、扁平上皮がん、平滑筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、バレットがん及び傍食道腫瘍;
4.膵外分泌腫瘍、好ましくは、腺がん;並びに
5.胃の腫瘍、好ましくは、腺がん、平滑筋腫、平滑筋肉腫及び線維肉腫。
呼吸器系の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
1.鼻及び鼻腔の腫瘍、喉頭及び気管の腫瘍、好ましくは、扁平上皮がん、線維肉腫、線維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管腫、血管肉腫、メラノーマ、肥満細胞腫瘍、骨肉腫、軟骨肉腫、オンコサイトーマ(横紋筋腫)、腺がん及び筋芽細胞腫;並びに
2.肺の腫瘍、好ましくは、扁平上皮がん、線維肉腫、線維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管腫、血管肉腫、メラノーマ、肥満細胞腫瘍、骨肉腫、軟骨肉腫、オンコサイトーマ(横紋筋腫)、腺がん、筋芽細胞腫、小細胞がん、非小細胞がん、気管支腺がん、気管支肺胞腺がん及び肺胞腺がん。
骨格の腫瘍群は、好ましくは、骨肉腫、軟骨肉腫、傍骨肉腫、血管肉腫、滑膜細胞肉腫、血管肉腫、線維肉腫、悪性間葉腫、巨細胞腫、骨腫及び多小葉性骨腫を含む。
内分泌系の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
1.甲状腺/副甲状腺の腫瘍、好ましくは、腺腫及び腺がん;
2.副腎の腫瘍、好ましくは、腺腫、腺がん及び褐色細胞腫(副腎髄質腫);
3.視床下部/下垂体の腫瘍、好ましくは、腺腫及び腺がん;
4.内分泌膵臓の腫瘍、好ましくは、インスリノーマ(β細胞腫瘍、APUDom)及びZollinger-Ellison症候群(膵臓のデルタ細胞のガストリン分泌腫瘍);並びに
5.多発性内分泌新生物(MEN)及び化学外胚葉腫。
女性性器系腫瘍の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
1.卵巣の腫瘍、好ましくは、腺腫、腺がん、嚢胞腺腫及び未分化がん;
2.子宮の腫瘍、好ましくは、平滑筋腫、平滑筋肉腫、腺腫、腺がん、線維腫、線維肉腫及び脂肪腫;
3.子宮頸部の腫瘍、好ましくは、腺がん、腺腫、平滑筋肉腫及び平滑筋腫;
4.膣及び外陰部の腫瘍、好ましくは、平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維平滑筋腫、線維腫、線維肉腫、ポリープ及び扁平上皮がん。
乳腺の腫瘍群は、好ましくは、線維腺腫、腺腫、腺がん、間葉系腫瘍、がん、がん肉腫を含む。
男性性器系の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
1.精巣の腫瘍、好ましくは、セミノーマ、間質細胞腫瘍及びセルトリ細胞腫瘍;
2.前立腺の腫瘍、好ましくは、腺がん、未分化がん、扁平上皮がん、平滑筋肉腫及び移行細胞がん;並びに
3.陰茎及び外陰部の腫瘍、好ましくは、肥満細胞腫瘍及び扁平上皮がん。
尿排出系の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
1.腎臓の腫瘍、好ましくは、腺がん、移行細胞がん(上皮性腫瘍)、線維肉腫、軟骨肉腫(間葉性腫瘍)、ウィルムス腫瘍、腎芽腫及び胎児性腎腫(胎児性多能性芽腫);
2.尿管の腫瘍、好ましくは、平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維乳頭腫、移行細胞がん;
3.膀胱の腫瘍、好ましくは、移行細胞がん、扁平上皮がん、腺がん、ボトリオイド(胎児性横紋筋肉腫)、線維腫、線維肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、乳頭腫及び血管肉腫;並びに
4.尿道の腫瘍、好ましくは、移行細胞がん、扁平上皮がん及び平滑筋肉腫。
造血系の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
1.リンパ腫、リンパ性白血病、非リンパ性白血病、骨髄増殖性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫。
混合腫瘍及び胚芽腫瘍の群は、好ましくは、血管肉腫、胸腺腫及び中皮腫を含む。
好ましくは、これらの腫瘍は、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、骨肉腫、膠芽腫、メラノーマ、小細胞肺がん及び結腸直腸がんを含む群から選択される。更なる腫瘍は、本明細書に記載されるように耐性である腫瘍、好ましくは、多耐性である腫瘍、特に、上記されたような腫瘍群でもある。
また、本発明の組み合わせが投与される対象が、それぞれ特定され、スクリーニングされることも、本発明の範囲内にある。その多様な態様において本発明から利益を受けることができる患者のこのような特定は、対象のサンプルの核におけるYB-1の検出に基づく。
実施態様において、腫瘍組織の検査は、YB-1に対する抗体、YB-1に対するアプタマー及びYB-1に対するシュピーゲルマー(spiegelmer)及びYB-1に対するアンチカリンを含む群から選択される剤を使用することにより行われる。基本的に、対応するマーカーについて同じ手段を作製し、それに応じて使用することができる。抗体、特にモノクローナル抗体の製造は、当業者に公知である。YB-1又はマーカーの特異的検出のための更なる手段は、ターゲット構造、本件では、YB-1又は前記マーカーに高い親和性で結合するペプチドである。従来技術では、このようなペプチドを生成するためのファージディスプレイ等の方法が公知である。典型的には、ペプチドライブラリーを出発点とし、ここで、個々のペプチドは、8~20個のアミノ酸長を有し、ライブラリーのサイズは、約102~1018、好ましくは108~1015の異なるペプチドである。ターゲット分子結合ポリペプチドの特別な形態は、いわゆるアンチカリンであり、これは、例えば、ドイツ国特許出願DE第19742706号に記載されている。
本明細書中に開示されたYB-1又は対応するマーカーの特異的結合のための、そして、細胞核におけるYB-1の細胞周期非依存性局在化の検出のための更なる手段は、いわゆる、アプタマー、すなわち、RNA又はDNAのいずれかとして、一本鎖又は二本鎖のいずれかとして存在し、ターゲット分子に特異的に結合するD-核酸である。アプタマーの生成は、例えば、欧州特許EP第0533838号に記載されている。アプタマーの特別な形態は、いわゆる、アプタザイムであり、これは、例えば、Piganeau, N. et al. (2000), Angew. Chem. Int. Ed., 39, no. 29, pages 4369 - 4373に記載されている。これらは、アプタマー部分とは別に、リボザイム部分を含み、アプタマー部分に結合するターゲット分子の結合又は放出の際に触媒活性を獲得し、核酸基質を開裂させ、この開裂がシグナル生成を伴って進行する限りにおいて、アプタマーの特別な実施態様である。
アプタマーの更なる形態は、いわゆる、シュピーゲルマー、すなわち、L-核酸で調製されるターゲット分子結合核酸である。このようなシュピーゲルマーの製造方法は、例えば、WO第98/08856号に記載されている。
腫瘍組織のサンプルは、穿刺又は手術により得ることができる。YB-1が細胞周期とは無関係に、核内に局在するかどうかの評価は、多くの場合、顕微観察技術及び/又は免疫組織分析を使用することにより、好ましくは、抗体又は他の前述の手段のいずれかを使用することにより行われる。核内においてYB-1を検出するための、特に、YB-1が細胞周期とは無関係にそこに局在することを検出するための更なる手段は、当業者に公知である。例えば、YB-1の局在化は、それらをスクリーニングする場合、染色された組織切片において容易に検出することができる。核内におけるYB-1の存在の頻度は、局在化が細胞周期とは無関係にあることを既に示している。核内におけるYB-1の細胞周期とは無関係にあることの検出のための更なる選択肢は、YB-1に対する染色及びYB-1が核内に局在するかどうかの検出並びに細胞の段階の決定にある。YB-1の検出と同様に、YB-1に対する前述の手段を使用することによっても、これを行うことができる。この手段の検出は、当業者に公知の方法により行われる。YB-1に特異的に結合し、分析されるサンプル内の任意の他の構造、特に細胞には結合しない前記剤により、それらの局在化及びYB-1へのそれらの特異的結合のために、YB-1の局在化も、該手段の適切なラベリングにより検出し、確立することができる。前記手段のラベリング方法は、当業者に公知である。
以下に、本発明を、図面及びサンプルを参照することにより更に実証するものとする。これらから、新規な特徴、実施態様及び利点を得ることができる。
図1aは、CDK4/6阻害剤LY(LY-2835219)、PD(PD-032991)又はLEE(LEE011)と組み合わせて使用された場合の、XVir-N-31(XVir)、野生型アデノウイルス(WT)及び対照(Ctrl)についての細胞生存率の指標としての相対吸光度を示す棒グラフである。図1bは、CDK4/6阻害剤LY(LY-2835219)、PD(PD-032991)又はLEE(LEE011)と組み合わせられた場合の、XVir-N-31(XVir)及び野生型アデノウイルス(WT)についてのウイルス力価を示す棒グラフである。図1cは、CDK4/6阻害剤LY(LY-2835219)、PD(PD-032991)又はLEE(LEE011)と組み合わせられた場合の、XVir-N-31(XVir)及び野生型アデノウイルス(WT)についての相対的な繊維DNAを示す棒グラフである。
図2は、ウェスタンブロット分析の結果を示す。
図3a~dは、棒グラフである。
図4a~dは、棒グラフである。
図5は、棒グラフである。
図6は、一連の顕微鏡写真である。
図7は、パルボシクリブ処理の有無における、GFPを発現しているE1欠失アデノウイルスに感染させたT24細胞の蛍光顕微鏡画像である。
図8は、化合物Nutlin 3a、Lee、Cl1040及びロスコビチン(Roscovertine)を使用した、48時間後のアデノウイルスdl703のウイルスDNA複製を示す棒グラフである。
図9A~Cは、示された濃度のNutlin-3a及びLEE011(リボシクリブ)(図9A)、ロスコビチン(図9B)及びCI-1040(図9C)で処理されたUMUC細胞のウェスタンブロット解析の結果を示す。Rbは、網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。phRBは、リン酸化された網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。E2F-1は、転写因子E2F-1を意味する。GAPDHは、ローディング対照としての役割を果たした。
図9A~Cは、示された濃度のNutlin-3a及びLEE011(リボシクリブ)(図9A)、ロスコビチン(図9B)及びCI-1040(図9C)で処理されたUMUC細胞のウェスタンブロット解析の結果を示す。Rbは、網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。phRBは、リン酸化された網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。E2F-1は、転写因子E2F-1を意味する。GAPDHは、ローディング対照としての役割を果たした。
図9A~Cは、示された濃度のNutlin-3a及びLEE011(リボシクリブ)(図9A)、ロスコビチン(図9B)及びCI-1040(図9C)で処理されたUMUC細胞のウェスタンブロット解析の結果を示す。Rbは、網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。phRBは、リン酸化された網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。E2F1は、転写因子E2F1を意味する。GAPDHは、ローディング対照としての役割を果たした。
図10は、処理後48時間で測定されたUMUC3細胞における細胞周期分布を示す棒グラフである。ここで、CDK4/6阻害剤の濃度は、以下のとおりとした。ロスコビチン(Roscovetine):10μM、CI-1040:1μM、Nutlin-3a:10μM及びLEE011:10μM。
図11は、パルボシクリブ処理の有無における、アデノウイルスヘキソン遺伝子発現を示す顕微鏡画像のパネルである。
図12は、XVir-N-31単独、15nM PARP阻害剤PARPi、500nM PD(パルボシクリブ)又は15nM PARPiと500nM PDとの組み合わせに暴露させたT24細胞の効力アッセイの結果を、細胞生存率として示す棒グラフである。ここで、細胞は、感染させなかったか(左欄)、10MOIで感染させたか(中央欄)又は50MOIで感染させたか(右欄)のいずれかとした。
図13は、XVir-N-31(20MOI)、XVir-N-31及び15nM PARPi、XVir-N-31及び500nM PD並びにXVir-N-31、15nM PARPi及び500nM PDでの処理後(1dpi、2dpi、3dpi、4dpi、5dpi及び6dpi)のSRB染色T24細胞の培養物を示す写真のパネルである。
図14は、XVir-N-31(10MOI)、XVir-N-31及び160nM PARPi、XVir-N-31及び400nM PD並びにXVir-N-31、160nM PARPi及び400nM PDでの処理後(1dpi、2dpi、3dpi、4dpi、5dpi及び6dpi)のSRB染色UMUC細胞の培養物を示す写真のパネルである。
図15は、XVir-N-31、CDK4/6阻害剤であるパルボシクリブ及びブロモドメイン阻害剤であるJQ-1での感染後5日目のT24細胞に対する効力アッセイの結果を示す棒グラフである。Y軸:% 細胞生存。
図16は、XVir-N-31単独、200nM アベマシクリブ、500nM JQ-1又は200nM アベマシクリブと500nM JQ-1との組み合わせと共に曝露させた後5日目のSK-N-MC細胞の効力アッセイの結果を、細胞生存率として示す棒グラフである。ここで、細胞を感染させなかったか又は5、10又は20MOIで感染させたかのいずれかとした。
図17は、示された濃度のCDK4/6阻害剤LY-2835219(アベマシクリブ)及びWee阻害剤MK-1775(アダボセルチブ)で処理されたSK-N-MC細胞の、処理後24時間及び48時間でのウェスタンブロット分析の結果を示す。Rbは、網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。phRBは、リン酸化された網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。E2F1は、転写因子E2F1を意味する。GAPDHは、ローディング対照としての役割を果たした。
図18は、XVir-N-31、CDK4/6阻害剤であるパルボシクリブ及びアダボセルチブ(Wee阻害剤、MK-1775)での感染後5日目のSK-N-MC細胞に対する効力アッセイの結果を示す。細胞生存率として表現。
図19は、SK-N-MC細胞を示された阻害剤で処理した後の細胞周期分布を示す。
図20は、種々の細胞株におけるE2F1発現に対するE2F1指向性siRNAの影響を示す棒グラフである。Y軸:% siCTRLトランスフェクション細胞としてのアクチンに対して正規化されたE2F1発現。
図21は、E2F1阻害により、siRNA-E2F1で処理されたT24細胞において、E2-初期発現が増加することを示す棒グラフである。Y軸:アクチンに対して正規化されたアデノウイルス遺伝子発現(% siCTRL)。
図22は、アデノウイルスE2初期発現を決定するためのプライマーの位置を示すスキームである。
図23は、アデノウイルスの野生型E2初期プロモーター(上側)及びE2F1結合部位に突然変異を有する突然変異型E2初期プロモーター(下側)のヌクレオチド配列の表示である。
図24は、感染後24時間でRT-qPCRにより得られたAdWT-RGD及びAdE2Fm(繊維中にRGDモチーフ(motive)も含有する)感染T24細胞におけるRNA発現を示す棒グラフである。AD-WT遺伝子発現を100%に設定した。
図25は、本発明での使用に適した種々のCDK4/6阻害剤を示す。
図25は、本発明での使用に適した種々のCDK4/6阻害剤を示す。
図26は、本発明での使用に適した種々のPARP阻害剤を示す。
図26は、本発明での使用に適した種々のPARP阻害剤を示す。
図27は、本発明での使用に適した種々のBet阻害剤を示す。
図27は、本発明での使用に適した種々のBet阻害剤を示す。
図27は、本発明での使用に適した種々のBet阻害剤を示す。
図28は、WT-Ad5及びE1A遺伝子のCR3ドメインの欠失によりE1A12タンパクのみを発現している腫瘍溶解性アデノウイルスであるアデノウイルスdl520の構造を示す。
図29は、E1B19Kタンパクの欠失、E3領域における2kbの欠失、E1A13Sタンパクの欠失、繊維タンパクへのRGDモチーフの導入を特徴とする、XVir-N-31の構造を示す。
図30は、Kleijn et al.(Kleijn et al., PLoS One. 2014; 9(5): e97495)にも記載されており、E1A遺伝子のCR2ドメインの欠失を特徴とするAd-デルタ24及びAd-デルタ24-RGDの構造を示す。それらは、デレギュレーションされた網膜芽細胞腫-経路(Rb)を有する腫瘍細胞においてのみ複製する。Ad-デルタ24-RGDは、さらに、XVir-N-31において示されるように、繊維ノブにRGDモチーフを含有する。腫瘍溶解性アデノウイルスdl922-947は、デルタ24と類似していることに留意されたい。このウイルスにおける欠失もE1A-CR2ドメインに位置し、RB結合(網膜芽細胞腫タンパク質)に影響を及ぼすためである。
図31は、RB経路を欠いた腫瘍で複製するように特異的に操作されている複製能を有するアデノウイルスであるVCN-01の構造が修飾された繊維による感染能の増強を表わし、可溶性ヒアルロニダーゼの発現による分布の改善を表わすことを示す(Pascual-Pasto et al. Sci Transl Med. 2019,11 476)。VCN-01のE1Aにおける欠失は、デルタ24における欠失(E1AにおけるCR2ドメインの欠失)と類似している。さらに、このE1Aタンパク質の発現は、E1AプロモーターにE2F1結合部位を導入することによりレギュレーションされる。加えて、それは、繊維ノブにRGDモチーフを含有し、可溶性ヒアルロニダーゼを発現する(Martinez-Velez et al. 2016, Clin Cancer Res. 1;22(9):2217-25. The Oncolytic Adenovirus VCN-01 as Therapeutic Approach Against Pediatric Osteosarcoma)。
図32は、E1Adl1107及びE1Adl1101の構造を示す。ここで、これら2つの腫瘍溶解性アデノウイルスの欠失は、p300(p300 HAT又はE1A関連タンパク質p300としても公知のヒストンアセチルトランスフェラーゼp300)又はpRb(網膜芽細胞腫タンパク質)への結合に影響を及ぼす(Howe et al., MOLECULAR THERAPY 2000, 2, 485-495)。
図33は、腫瘍溶解性アデノウイルスCB016(及び野生型アデノウイルス5(WT-Ad5)のうちの1つ)の構造を示す。ここで、E1A-CR2ドメインにおける欠失は、Ad-デルタ24におけるのと類似している。加えて、CB016は、CR1ドメインにおける欠失を含有する。加えて、CB016は、繊維にRGDモチーフ又は血清型3由来の繊維のいずれかを含有する(LaRocca et al., Oral Oncol. 2016, 56, 25-31)。
図34は、E1A CR2-ドメインにおけるE1AΔ24欠失、E3/19Kタンパク質における効力増強T1突然変異及び感染性増強繊維RGD修飾(Dong et al., Hum Gene Ther. 2014 Oct 1; 25(10): 897-904)を含有するアデノウイルスORCA-010の構造を示す。
図35は、感染後5日目(5dpi)でのUMUC-3細胞におけるXVir-N-31単独又はパルボシクリブのみとの併用、タラゾパリブのみとの併用もしくはパルボシクリブ及びタラゾパリブの両方との併用(「併用」)の細胞殺傷効果を決定するために、% 細胞生存率として表現された効力アッセイの結果を示す棒グラフである。ここで、XVir-N-31のMOIを10、20又は50とした。
図36は、感染後4日目(4dpi)でのT24細胞におけるXVir-N-31単独又はパルボシクリブのみとの併用、タラゾパリブのみとの併用もしくはパルボシクリブ及びタラゾパリブの両方との併用(「併用」)の細胞殺傷効果を決定するために、% 細胞生存率として表現された効力アッセイの結果を示す棒グラフである。ここで、XVir-N-31のMOIを10、50又は100とした。
図37は、感染後5日目(5dpi)での253J細胞におけるXVir-N-31単独又はパルボシクリブのみとの併用、タラゾパリブのみとの併用もしくはパルボシクリブ及びタラゾパリブの両方との併用(「併用」)の細胞殺傷効果を決定するために、% 細胞生存率として表現された効力アッセイの結果を示す棒グラフである。ここで、XVir-N-31のMOIを10、20又は50とした。
図38は、タラゾパリブ単独、パルボシクリブ単独又はタラゾパリブ及びパルボシクリブの両方(併用)と併用した感染後48時間でのT24細胞(左側)及びUMUC-3細胞(右側)の細胞周期段階G0/G1、S及びG2にある細胞(%)を示す棒グラフである。
図39は、5、10及び20MOI XVir-N-31、200nMアベマシクリブ(CDK4/6阻害剤)及び200nMJQ-1(ブロモドメイン阻害剤)による感染後4日でのA673細胞に対する効力アッセイにおける生存細胞(%)を示す棒グラフである。
図40は、XVir-N-31(1、5及び10MOI)、100nM パルボシクリブ単独、100nM JQ-1単独又は併用(パルボシクリブ及びJQ-1の両方)による処置後の、感染後4日目でのSRB染色Cal-33細胞の培養物を示す写真のパネルである。
図41は、100nM パルボシクリ、100nM JQ-1又はパルボシクリブ及びJQ-1の両方の組み合わせを使用した、5MOI XVir-N-31でのCal-33細胞の感染後4日目での% 細胞生存率として表現された図40に示された効力試験の結果を示す棒グラフである。
図42(A,B)は、感染後24時間(図42A)及び48時間(図42B)でのCal-33における「相対的な繊維」として表現されたXVir-N-31複製を示す棒グラフである。MOIを10とし、パルボシクリブ濃度を100nMとし、JQ-1濃度を等しく100nMとした。
図42(A,B)は、感染後24時間(図42A)及び48時間(図42B)でのCal-33における「相対的な繊維」として表現されたXVir-N-31複製を示す棒グラフである。MOIを10とし、パルボシクリブ濃度を100nMとし、JQ-1濃度を等しく100nMとした。
図43は、ヌトリン及びその誘導体、すなわち、NVP-HDM201、イダサヌトリン、AM-8553、SAR405838、ヌトリン-3a、AMG232を示す。
図43は、ヌトリン及びその誘導体、すなわち、NVP-HDM201、イダサヌトリン、AM-8553、SAR405838、ヌトリン-3a、AMG232を示す。
図43は、ヌトリン及びその誘導体、すなわち、NVP-HDM201、イダサヌトリン、AM-8553、SAR405838、ヌトリン-3a、AMG232を示す。
図43は、ヌトリン及びその誘導体、すなわち、NVP-HDM201、イダサヌトリン、AM-8553、SAR405838、ヌトリン-3a、AMG232を示す。
図44は、XVir-N-31単独、XVir-N-1と30μM ヌトリン-3a、XVir-N-31と500nM パルボシクリブ並びにXVir-N-31とヌトリン-3a及びパルボシクリブの両方による処置後のSRB染色T24細胞の培養物を示す写真のパネルである。ここで、XVir-N-31のMOIを0、1、5、10、20又は30とした。
図45は、% 対照に対する細胞生存率として表現された、図44に示された効力試験の結果を示す棒グラフである。
図46は、XVir-N-31単独、XVir-N-31と30μM ヌトリン-3a、XVir-N-31と500nM パルボシクリブ並びにXVir-N-31とヌトリン-3a及びパルボシクリブの両方による処置後のSRB染色T24shRb細胞の培養物を示す写真のパネルである。ここで、XVir-N-31のMOIを0、1、5、10、20又は30とした。
図47は、% 対照に対する生存細胞として表現された、図46に示された効力試験の結果を示す棒グラフである。
図48は、XVir-N-31単独、XVir-N-1と10μM イダサヌトリン、XVir-N-31と500nM パルボシクリブ並びにXVir-N-31とイダサヌトリン及びパルボシクリブの両方による処置後のSRB染色T24細胞の培養物を示す写真のパネルである。ここで、XVir-N-31のMOIを0、5、10、20、40及び60とした。
図49は、% 対照に対する生存細胞として表現された、図48に示された効力試験の結果を示す棒グラフである。
図50は、XVir-N-31単独、XVir-N-1と10μM イダサヌトリン、XVir-N-31と500nM パルボシクリブ並びにXVir-N-31とイダサヌトリン及びパルボシクリブの両方による処置後のSRB染色T24shRb細胞の培養物を示す写真のパネルである。ここで、XVir-N-31のMOIを0、5、10、20、40又は60とした。
図51は、% 対照に対する生存細胞として表現された、図50に示された効力試験の結果を示す棒グラフである。
図52は、それぞれ24時間後及び48時間後でのT24shRb細胞(左側)及びT24細胞(右側)における「相対的な繊維」として表現された、XVir-N-31複製を示す棒グラフである。MOIを20とする。パルボシクリブ濃度を500nMとし、ヌトリン-3a濃度を30μMとした。
図53は、ウェスタンブロット分析の結果を示す。
図54は、T24shRB細胞をパルボシクリブ、ヌトリン-3a又は両方の組み合わせに曝露させた時のE2F1タンパク質の相対量を示す棒グラフである。
図55(A)~(D)は、細胞をパルボシクリブ、ヌトリン-3a又は両方の組み合わせに、示された濃度で曝露させた時のT24細胞(A)、T24shRb細胞(B)、UMUC-3細胞(C)及びRT112細胞(D)の細胞周期段階G0/G1、S及びG2にある細胞(%)を示す棒グラフである。
図55(A)~(D)は、細胞をパルボシクリブ、ヌトリン-3a又は両方の組み合わせに、示された濃度で曝露させた時のT24細胞(A)、T24shRb細胞(B)、UMUC-3細胞(C)及びRT112細胞(D)の細胞周期段階G0/G1、S及びG2にある細胞(%)を示す棒グラフである。
図56(A)~(D)は、細胞をパルボシクリブ、ヌトリン-3a又は両方の組み合わせに、示された濃度で曝露させた時のT24細胞(A)、T24shRb細胞(B)、UMUC-3細胞(C)及びRT112細胞(D)の細胞周期段階G1にある細胞(%)を示す棒グラフである。
図56(A)~(D)は、細胞をパルボシクリブ、ヌトリン-3a又は両方の組み合わせに、示された濃度で曝露させた時のT24細胞(A)、T24shRb細胞(B)、UMUC-3細胞(C)及びRT112細胞(D)の細胞周期段階G1にある細胞(%)を示す棒グラフである。
図57は、100nM リボシクリブ(LEE011とも呼ばれるLEE)を伴う、100nM JQ1を伴う、並びに100nM リボシクリブ(LEE)及び100nM JQ1の両方を伴う、XVir-N-31感染後のU87細胞の相対生存を示す棒グラフである。XVir-N-31についてのMOIを5とする。
図58は、100nM リボシクリブ(LEE011とも呼ばれるLEE)を伴う、200nM JQ1を伴う、並びに100nM リボシクリブ(LEE)及び200nM JQ1の両方を伴う、XVir-N-31感染後のLN229細胞の相対生存を示す棒グラフである。XVir-N-31についてのMOIを20とする。
図59は、1μM リボシクリブ(LEE011とも呼ばれるLEE)を伴う、200nM JQ1を伴う、並びに100nM リボシクリブ(LEE)及び200nM JQ1の両方を伴う、XVir-N-31感染後のT98G細胞の相対生存を示す棒グラフである。XVir-N-31についてのMOIを50とする。
図60は、XVir-N-31による感染後24時間(h.p.i)での、リボシクリブ(LEE)(500nM)、JQ1(50nM)又はリボシクリブ(500nM)とJQ1 24(50nM)との組み合わせに暴露させた場合のU87細胞中のアデノウイルスXVir-N-31繊維DNAの相対量を示す棒グラフである。
図61は、XVir-N-31による感染後48時間(h.p.i)での、リボシクリブ(LEE)(500nM)、JQ1(100nM)又はリボシクリブ(500nM)とJQ1(100nM)との組み合わせに暴露させた場合のLN229細胞中のアデノウイルスXVir-N-31繊維DNAの相対量を示す棒グラフである。
図62は、XVir-N-31による感染後48時間(h.p.i)での、リボシクリブ(LEE)(1μM)、JQ1(100nM)又はリボシクリブ(1μM)とJQ1(100nM)との組み合わせに暴露させた場合のT98G細胞中のアデノウイルスXVir-N-31繊維DNAの相対量を示す棒グラフである。
図63は、XVir-N-31(MOI20)による感染後24時間での、500nM LEE、200nM JQ-1又は500nM LEEと200nM JQ-1との両方の組み合わせに暴露させた場合のLN229細胞のウェスタンブロット分析の結果を示す。
図64は、XVir-N-31(MOI20)による感染後48時間での、500nM LEE、200nM JQ-1又は500nM LEEと200nM JQ-1との両方の組み合わせに暴露させた場合のLN229細胞のウェスタンブロット分析の結果を示す。
図65は、XVir-N-31(MOI20)による感染後72時間での、500nM LEE、200nM JQ-1又は500nM LEEと200nM JQ-1との両方の組み合わせに暴露させた場合のLN229細胞のウェスタンブロット分析の結果を示す。
図66は、XVir-N-31(MOI20)による感染後72時間での、500nM LEE、200nM JQ-1又は500nM LEEと200nM JQ-1との両方の組み合わせに暴露させた場合のLN229細胞のウェスタンブロット分析の結果を示す。
図67は、E1Aの相互作用パートナー及び保存領域CR1~CR4の位置の図である。
図68は、アデノウイルスAdWT、dl1119、Adデルタ24、XVir-N-31及びAdWT/E2Fm(MOI20)の感染後(PI)24時間での、JQ-1処理(200nM)によるLN229細胞中のアデノウイルスDNAの相対増加を示す棒グラフである。
図69は、アデノウイルスAdWT、dl1119、Adデルタ24、XVir-N-31及びAdWT/E2Fm(MOI20)の感染後(PI)48時間での、JQ-1処理(200nM)によるLN229細胞中のアデノウイルスDNAの相対増加を示す棒グラフである。
図70は、プライミング後又は100nM JQ-1(左側)もしくは500nM JQ-1(右側)のいずれかとの同時処理後の、XVir-N-31による感染後24時間でのUMUC-3細胞中の定量化された繊維DNA(4時間での繊維に対して正規化された繊維/アクチンとして表現)を示す図である。
図71は、500nM JQ-1の有無による感染後39、49、62又は72時間(hpi)でのUMUC-3細胞中のXVir-N-31の粒子形成(PFU/mlとして表現)を示す図である。
図72は、JQ-1無し(上段)及び500nM JQ-1(下段)を伴う感染後39、49、62又は72時間(hpi)でのヘキソン力価試験後におけるXVir-N-31感染細胞(10 MOI)の明視野顕微鏡写真のパネルである。
図73は、感染後12時間、感染後24時間、感染後36時間及び感染後48時間での、500nM JQ-1の有無を伴ってXVir-N-31により処理された場合のUMUC-3細胞のウェスタンブロット分析であり、定量化されたウイルス発現動態を示す。
図74は、100nM JQ-1、300nM JQ-1、500nM パルボシクリブ、100nM JQ-1と500nM パルボシクリブとの併用及び300nM JQ-1と500nM パルボシクリブとの併用の影響下でのG0/G1期、S期及びG2期にあるUMUC-3細胞(%)(左側)及びRT112細胞(%)(右側)を示す棒グラフである。
図75は、処理後24時間での、0、0.2μM及び0.5μMでのJQ-1及び/又はパルボシクリブに曝露させた場合のUMUC-3細胞(左側)及びRT-112細胞(右側)のウェスタンブロット分析の結果を示す。
図76は、それぞれ感染後5日での、200nM JQ-1、100nM パルボシクリブ及び200nM JQ-1と100nM パルボシクリブとの組み合わせにより処理された場合のUMUC-3細胞の殺傷に対するXVir-N31(5 MOI)の効果を示す棒グラフである。
図77は、それぞれ感染後5日での、200nM JQ-1、300nM パルボシクリブ、及び200nM JQ-1と300nM パルボシクリブとの組み合わせにより処理された場合のRT112細胞の殺傷に対するXVir-N31(40 MOI)の効果を示す棒グラフである。
図78は、それぞれ感染後5日での、100nM JQ-1、200nM パルボシクリブ、及び100nM JQ-1と200nM パルボシクリブとの組み合わせにより処理された場合のT24細胞の殺傷に対するXVir-N31(40 MOI)の効果を示す棒グラフである。
図79は、プライミング後及びJQ-1(300nM)、パルボシクリブ(100nM)又はJQ-1(300nM)とパルボシクリブ(100nM)との組み合わせとの同時処理後のXVir-N-31(10 MOI)による感染後24時間でのUMUC-3細胞中のXVir-N-31の複製を示す棒グラフである。ここで、XVir-N-31の複製を相対的な繊維DNAレベルとして定量する。
図80は、プライミング後及びJQ-1(100nM)、パルボシクリブ(200nM)又はJQ-1(100nM)とパルボシクリブ(200nM)との組み合わせとの同時処理後のXVir-N-31(50 MOI)による感染後24時間でのT24細胞中のXVir-N-31の複製を示す棒グラフである。ここで、XVir-N-31の複製を相対的な繊維DNAレベルとして定量する。
図81は、プライミング後及びJQ-1(200nM)、パルボシクリブ(300nM)又はJQ-1(200nM)とパルボシクリブ(300nM)との組み合わせとの同時処理後のXVir-N-31(20 MOI)による感染後24時間でのRT112細胞中のXVir-N-31の複製を示す棒グラフである。ここで、XVir-N-31の複製を相対的な繊維DNAレベルとして定量する。
図82は、200nM JQ-1、500nM パルボシクリブ又は200nM JQ-1と500nM パルボシクリブとの両方の組み合わせを伴って、XVir-N-31(9 MOI)に感染させたウイルス産生UMUC-3細胞の定量的平均産生を示す棒グラフである。ここで、平均産生の定量化を視野(f.o.v.)当たりの染色細胞として示す。
図83は、ヘキソン力価試験後におけるXVir-N-31感染UMUC-3細胞(9 MOI)の明視野顕微鏡写真のパネルである。ここで、この細胞はXVir-N-31単独、XVir-N-31と200nM JQ-1との組み合わせ、XVir-N-31と500nM パルボシクリブとの組み合わせ又はXVir-N-31と200nM JQ-1及び500nM パルボシクリブとの組み合わせで感染させた。
図84は、示されたBET阻害剤OTX(300nM)、AZD(5nM)、dBet6(50nM)及びARV(50nM)と併用した、XVir-N-31(0、5及び10 MOI)による感染後のUMUC-3細胞の相対生存を示す棒グラフである。
図85は、示されたBET阻害剤OTX(130nM)、AZD(10nM)、dBet6(150nM)及びARV(10nM)と併用した、XVir-N-31(0、20及び50 MOI)による感染後のRT112細胞の相対生存を示す棒グラフである。
図86は、示されたBET阻害剤(OTX:50nM、AZD:50nM、dBet6:50nM及びARV:50nM)と併用した、XVir-N-31(10 MOI)による感染後24時間でのUMUC-3細胞中のウイルス複製を示す棒グラフである。
図87は、示されたBET阻害剤(OTX:40nM、AZD:15nM、dBet6:25nM及びARV:15nM)と併用した、XVir-N-31(50 MOI)による感染後24時間でのRT112細胞中のウイルス複製を示す棒グラフである。
図88は、XVir-N-31及びリボシクリブの用量及びスケジュールされた適用を示す動物研究の図である。リボシクリブスクシナート(LEE011)を200mg/kg 体重で毎日合計5日間(X日目からX+4日目まで)強制経口投与した。LEE011を含まない溶解剤をPBS及びXVir-N-31のみの動物に適用した。XVir-N-31をX+1日目及びX+3日目の2回腫瘍に注入した。XVir-N-31を受けさせなかった全ての対照動物それぞれに、PBS注入をi.t.で受けさせた。
図89は、種々の処理群(PBS、LEE、XVir単独及び併用)の体積増殖曲線を示す図である。各データ点は、処理開始後の示された日における平均±腫瘍サイズを示す。
図90は、処理開始後12~21日目での種々の処理群(動物のPBS数=5)、LEE(動物のPBS数=6)、XVir単独(動物のPBS数=7)及び併用(動物のPBS数=7)についての腫瘍体積[mm3]を示すボックスプロット図である。
図91は、XVir-N-31単独の処理と比較して、併用処理を受けた代表的な動物の腫瘍中のウイルスゲノム(繊維/1000アクチンとして表現)を示す棒グラフである。XVir-N31の2回目のi.t.注入の2日後の評価。
実施例1:材料及び方法
細胞培養
ヒト膀胱がん細胞株を、10% FBS(Biochrom AG)及び1% NEA(Biochrom AG)を補充したRPMI又はDMEM培地(Biochrom AG)中において、それぞれ5%又は10% CO2でサブコンフルエントな条件下で培養した。細胞株及び実験条件に応じて、0.2~1×106、0.5~1×105、0.25~0.5×105及び500~700個 細胞をそれぞれ10cmあたりに、6ウェル、12ウェル及び96ウェルフォーマットに播種した。
細胞培養
ヒト膀胱がん細胞株を、10% FBS(Biochrom AG)及び1% NEA(Biochrom AG)を補充したRPMI又はDMEM培地(Biochrom AG)中において、それぞれ5%又は10% CO2でサブコンフルエントな条件下で培養した。細胞株及び実験条件に応じて、0.2~1×106、0.5~1×105、0.25~0.5×105及び500~700個 細胞をそれぞれ10cmあたりに、6ウェル、12ウェル及び96ウェルフォーマットに播種した。
細胞株
HeLaP
HeLaP細胞(ATCC CCL-2)は、患者Henrietta Lacksにちなんで命名された子宮頚部腺がん由来の上皮細胞である。この細胞株は、最も広く分布し、最も古い細胞株である(Rahbari et al., 2009)。1951年に確立された最初の永久細胞株であったためである(Gey et al., 1952)。培養は、37℃、10% CO2条件下でDMEM(10% FBS、1% PS)中で行った。
HeLaP
HeLaP細胞(ATCC CCL-2)は、患者Henrietta Lacksにちなんで命名された子宮頚部腺がん由来の上皮細胞である。この細胞株は、最も広く分布し、最も古い細胞株である(Rahbari et al., 2009)。1951年に確立された最初の永久細胞株であったためである(Gey et al., 1952)。培養は、37℃、10% CO2条件下でDMEM(10% FBS、1% PS)中で行った。
HeLaRDB
HeLaRDBは、HeLaP細胞株の亜細胞株であり、糖タンパク質Pの過剰発現に基づいて、ダウノブラスチンに対する耐性を有する。このアントラサイクリンを含有する培地での培養により耐性が達成された。この細胞増殖抑制剤は、二本鎖DNA配列に介在し、細胞の転写と複製を阻害する(Mizuno et al., 1975)。ダウノブラスチン処理により引き起こされるストレス反応の結果として、細胞因子YB-1は、親細胞株と比較して、より高い核局在化を示す(Holm et al., 2004)。ダウノブラスチンに対する耐性を維持するために、細胞を、0.25μg/ml ダウノブラスチンを含有するDMEM(10% FBS、1% PS)中において、10% CO2条件下、37℃で14日毎に培養した。
HeLaRDBは、HeLaP細胞株の亜細胞株であり、糖タンパク質Pの過剰発現に基づいて、ダウノブラスチンに対する耐性を有する。このアントラサイクリンを含有する培地での培養により耐性が達成された。この細胞増殖抑制剤は、二本鎖DNA配列に介在し、細胞の転写と複製を阻害する(Mizuno et al., 1975)。ダウノブラスチン処理により引き起こされるストレス反応の結果として、細胞因子YB-1は、親細胞株と比較して、より高い核局在化を示す(Holm et al., 2004)。ダウノブラスチンに対する耐性を維持するために、細胞を、0.25μg/ml ダウノブラスチンを含有するDMEM(10% FBS、1% PS)中において、10% CO2条件下、37℃で14日毎に培養した。
A549
A549細胞(ATCC CCL-185)は、1972年にヒト肺胞基底の腺がんから単離された(Giard et al., 1973)。培養を37℃及び10% CO2で、Dulbecco’s MEM(10% FBS及び1% PS)中において行った。
A549細胞(ATCC CCL-185)は、1972年にヒト肺胞基底の腺がんから単離された(Giard et al., 1973)。培養を37℃及び10% CO2で、Dulbecco’s MEM(10% FBS及び1% PS)中において行った。
T24
T24細胞(ATCC HTB-4)は、1970年に原発性ヒト膀胱がんから得られた(Bubenik, Baresova et al., 1973)。HRAS遺伝子における点突然変異により(Reddy et al., 1982)、MAPK及びPI3K経路が活性化されている。さらに、この細胞株には、腫瘍サプレッサー遺伝子p53の遺伝子座における更なる突然変異が存在する(Pinto-Leite et al., 2014)。細胞を、10% FCS、1% PS及び1% 非必須アミノ酸を含有するRPMIにより、37℃、5% CO2条件下で培養した。
T24細胞(ATCC HTB-4)は、1970年に原発性ヒト膀胱がんから得られた(Bubenik, Baresova et al., 1973)。HRAS遺伝子における点突然変異により(Reddy et al., 1982)、MAPK及びPI3K経路が活性化されている。さらに、この細胞株には、腫瘍サプレッサー遺伝子p53の遺伝子座における更なる突然変異が存在する(Pinto-Leite et al., 2014)。細胞を、10% FCS、1% PS及び1% 非必須アミノ酸を含有するRPMIにより、37℃、5% CO2条件下で培養した。
HEK293
HEK293細胞(ATCC CRL-1573)は、1973年に単離されたヒト胚性腎細胞である。全E1領域を含むアデノウイルス血清型5のゲノムの4.5kbサイズ部分の安定したトランスフェクションのために(Graham and Smiley, 1977)、この細胞株は、E1欠損アデノウイルスの産生及びウイルス力価の測定に使用される。
HEK293細胞(ATCC CRL-1573)は、1973年に単離されたヒト胚性腎細胞である。全E1領域を含むアデノウイルス血清型5のゲノムの4.5kbサイズ部分の安定したトランスフェクションのために(Graham and Smiley, 1977)、この細胞株は、E1欠損アデノウイルスの産生及びウイルス力価の測定に使用される。
ウイルス 特性
Ad-WT+AdWT-RGD 野生型マストアデノウイルス、C型、血清型5及びADWT及び更なるRGD繊維モチーフ
AdWT-E2F1mut. マストアデノウイルス、C型、血清型5、E2初期プロモーターの両E2F1結合部位における突然変異、追加のRGD繊維モチーフ及びE3領域における2,7kbサイズの欠失(ΔE3)
XVir-N-31 マストアデノウイルス、C型、血清型5、E1B領域(1.716~1915、200bp)における欠失、E3領域(28.132~30.813)における欠失及びE1A領域における12塩基欠失を伴う。核YB-1発現のみを表わすがん細胞中で複製する。
XVir-N-31/E2F1M マストアデノウイルス、C型、血清型5
E1B領域(1.716~1915、200bp)における欠失、E3領域(28.132~30.813)における欠失及びE1A領域における12塩基欠失を伴う。核YB-1発現のみを表わすがん細胞中で複製する。E2初期プロモーターの両E2F1結合部位における突然変異、追加のRGD繊維モチーフ及びE3領域における2,7kbサイズの欠失(ΔE3)
Ad-WT+AdWT-RGD 野生型マストアデノウイルス、C型、血清型5及びADWT及び更なるRGD繊維モチーフ
AdWT-E2F1mut. マストアデノウイルス、C型、血清型5、E2初期プロモーターの両E2F1結合部位における突然変異、追加のRGD繊維モチーフ及びE3領域における2,7kbサイズの欠失(ΔE3)
XVir-N-31 マストアデノウイルス、C型、血清型5、E1B領域(1.716~1915、200bp)における欠失、E3領域(28.132~30.813)における欠失及びE1A領域における12塩基欠失を伴う。核YB-1発現のみを表わすがん細胞中で複製する。
XVir-N-31/E2F1M マストアデノウイルス、C型、血清型5
E1B領域(1.716~1915、200bp)における欠失、E3領域(28.132~30.813)における欠失及びE1A領域における12塩基欠失を伴う。核YB-1発現のみを表わすがん細胞中で複製する。E2初期プロモーターの両E2F1結合部位における突然変異、追加のRGD繊維モチーフ及びE3領域における2,7kbサイズの欠失(ΔE3)
ターゲット遺伝子 siRNA構築物 製造メーカー
対照 対照(非sil.)siRNA、20μM Qiagen、the Netherlands
E2F1 E2F1(SASI_Hs01_00162220)、10μM Sigma, Merck、Germany
YB-1 YBX1 siRNA FlexiTube、10μM Qiagen、the Netherlands
対照 対照(非sil.)siRNA、20μM Qiagen、the Netherlands
E2F1 E2F1(SASI_Hs01_00162220)、10μM Sigma, Merck、Germany
YB-1 YBX1 siRNA FlexiTube、10μM Qiagen、the Netherlands
方法
siRNAトランスフェクション
特定の遺伝子のダウンレギュレーションを、siRNAトランスフェクションを使用して行った。ここで、リポフェクタミンRNAiMAX(Thermo Fischer)試薬 5μlを一方のチューブ中のOpti-MEM 150μlに加え、36pmol siRNAを他方のチューブ中のOpti-MEM 150μlと合わせた。両チューブの内容物を合わせ、軽くボルテックスした後、この溶液を室温で5分間インキュベーションした。ついで、siRNA-脂質複合体 250μlを前日に6ウェルプレートに播種された250.000~1.000.000個 細胞に、培地を変えずに加え、ウェル当たり30pmolのsiRNAの最終濃度に達した。37℃、10% CO2で48時間インキュベーションした後、感染又は溶解が起こった。
siRNAトランスフェクション
特定の遺伝子のダウンレギュレーションを、siRNAトランスフェクションを使用して行った。ここで、リポフェクタミンRNAiMAX(Thermo Fischer)試薬 5μlを一方のチューブ中のOpti-MEM 150μlに加え、36pmol siRNAを他方のチューブ中のOpti-MEM 150μlと合わせた。両チューブの内容物を合わせ、軽くボルテックスした後、この溶液を室温で5分間インキュベーションした。ついで、siRNA-脂質複合体 250μlを前日に6ウェルプレートに播種された250.000~1.000.000個 細胞に、培地を変えずに加え、ウェル当たり30pmolのsiRNAの最終濃度に達した。37℃、10% CO2で48時間インキュベーションした後、感染又は溶解が起こった。
siRNAと組み合わせたRNA定量
ウイルスをsiRNAトランスフェクションと組み合わせた細胞中のRNAも定量した。ここで、125.000個 細胞を播種し、翌日、30pmol 対照-、YB-1-、及びE2F1-siRNAのsiRNA構築物でトランスフェクションした。48時間のインキュベーション後、感染が起こり、感染後24時間で溶解が起こった。ライゼートを-20℃で保存した。
ウイルスをsiRNAトランスフェクションと組み合わせた細胞中のRNAも定量した。ここで、125.000個 細胞を播種し、翌日、30pmol 対照-、YB-1-、及びE2F1-siRNAのsiRNA構築物でトランスフェクションした。48時間のインキュベーション後、感染が起こり、感染後24時間で溶解が起こった。ライゼートを-20℃で保存した。
RNA単離
細胞をPBSですすぎ、溶解バッファー(mirVana miRNA単離キット、Life Technologies)で溶解し、1.5mlの反応チューブに移した。ホモジネート添加剤(mirVana miRNA単離キット、Life Technologies) 50μlをこのライゼートに加え、再懸濁させ、氷上で10分間インキュベーションした。酸-フェノール-クロロホルム 500μlを加え、約30秒間ボルテックスし、氷上で2分間インキュベーションした。室温で14.000g、5分間遠心分離した後、水相と有機相とを分離する。上側の水相を新たなスナップキャップに移し、等量のイソプロパノールと合わせ、転倒混和した。室温で10分間インキュベーションした後、サンプルを4℃及び14.000gで30分間遠心分離した。続けて、上清を除去し、RNAペレットを75% エタノール 1mlで洗浄した。サンプルを7500g、4℃で5分間軽く遠心分離した。上清を除去した後、風乾させたペレットを、ヌクレアーゼを含まない水 20μlに溶解させ、サーモミキサー中において、55℃及び500rpmで10分間インキュベーションした。続けて、RNA濃度を分光光度測定により測定した。DNAのrutの増幅を避けるために、DNAse消化を行った。ここで、デオキシリボヌクレアーゼI,増幅グレードキット(Invitrogen、life technologies製)を使用した。1μg RNAに、10×DNAse I反応バッファー 1μl及びDNAse I 1μlを加え、DEPC処理水で10μlの最終容量まで満たし、室温で正確に15分間インキュベーションする。25mM EDTA溶液 1μlを加えることにより、DNase Iを不活性化し、それにより、DNAse消化の進行を停止させる。サンプルを65℃で10分間インキュベーションし、ついで、逆転写に使用した。
細胞をPBSですすぎ、溶解バッファー(mirVana miRNA単離キット、Life Technologies)で溶解し、1.5mlの反応チューブに移した。ホモジネート添加剤(mirVana miRNA単離キット、Life Technologies) 50μlをこのライゼートに加え、再懸濁させ、氷上で10分間インキュベーションした。酸-フェノール-クロロホルム 500μlを加え、約30秒間ボルテックスし、氷上で2分間インキュベーションした。室温で14.000g、5分間遠心分離した後、水相と有機相とを分離する。上側の水相を新たなスナップキャップに移し、等量のイソプロパノールと合わせ、転倒混和した。室温で10分間インキュベーションした後、サンプルを4℃及び14.000gで30分間遠心分離した。続けて、上清を除去し、RNAペレットを75% エタノール 1mlで洗浄した。サンプルを7500g、4℃で5分間軽く遠心分離した。上清を除去した後、風乾させたペレットを、ヌクレアーゼを含まない水 20μlに溶解させ、サーモミキサー中において、55℃及び500rpmで10分間インキュベーションした。続けて、RNA濃度を分光光度測定により測定した。DNAのrutの増幅を避けるために、DNAse消化を行った。ここで、デオキシリボヌクレアーゼI,増幅グレードキット(Invitrogen、life technologies製)を使用した。1μg RNAに、10×DNAse I反応バッファー 1μl及びDNAse I 1μlを加え、DEPC処理水で10μlの最終容量まで満たし、室温で正確に15分間インキュベーションする。25mM EDTA溶液 1μlを加えることにより、DNase Iを不活性化し、それにより、DNAse消化の進行を停止させる。サンプルを65℃で10分間インキュベーションし、ついで、逆転写に使用した。
逆転写
RNAをcDNAに書き換えるために、高性能cDNA逆転写キット(Thermo Scientific)を使用した。2μg DNA消化サンプルのRNAを、PCRソフトチューブ中の転写バッファー、100mM dNTP及びRNAse阻害剤を含有するMastermixに加えた。ここで、E2初期プロモーター及びE2後期プロモーターを介して転写されるRNAは、通常、逆転写に使用されるランダムプライマーでは書き換えることができないと考えなければならなかった。これらのランダムプライマーは、二本鎖アデノウイルスゲノムの両鎖に結合するであろうためである。このために、E2初期定量及びE2後期定量に使用されたサンプルについてのRNAからcDNAへの書き換えを、特異的E2初期リバースプライマー(表1)を使用することにより行った。結果を正規化するのに使用されたハウスキーピング遺伝子であるアクチンについては、ランダムプライマーを使用した。
RNAをcDNAに書き換えるために、高性能cDNA逆転写キット(Thermo Scientific)を使用した。2μg DNA消化サンプルのRNAを、PCRソフトチューブ中の転写バッファー、100mM dNTP及びRNAse阻害剤を含有するMastermixに加えた。ここで、E2初期プロモーター及びE2後期プロモーターを介して転写されるRNAは、通常、逆転写に使用されるランダムプライマーでは書き換えることができないと考えなければならなかった。これらのランダムプライマーは、二本鎖アデノウイルスゲノムの両鎖に結合するであろうためである。このために、E2初期定量及びE2後期定量に使用されたサンプルについてのRNAからcDNAへの書き換えを、特異的E2初期リバースプライマー(表1)を使用することにより行った。結果を正規化するのに使用されたハウスキーピング遺伝子であるアクチンについては、ランダムプライマーを使用した。
DNA複製分析
感染細胞内でのウイルス複製を調査するために、DNA複製分析を行った。125.000個 細胞を6ウェルプレートに播種し、10~20MOIで感染させた。感染後それぞれ2、8、12、24、36及び48時間後、溶解を行った。ここで、培地を除去し、接着細胞をPBS 1mlで洗浄した。DNA溶解バッファー 200μlを加えた後、接着細胞を、細胞スクレーパーを使用してプレートから掻き取った。ついで、ライゼートをスナップキャップに移した。酵素プロテイナーゼK 3μlを加え、サーモミキサーにおいて、56℃及び550rpmで一晩インキュベーションした。翌日、DNA分離を行った。
感染細胞内でのウイルス複製を調査するために、DNA複製分析を行った。125.000個 細胞を6ウェルプレートに播種し、10~20MOIで感染させた。感染後それぞれ2、8、12、24、36及び48時間後、溶解を行った。ここで、培地を除去し、接着細胞をPBS 1mlで洗浄した。DNA溶解バッファー 200μlを加えた後、接着細胞を、細胞スクレーパーを使用してプレートから掻き取った。ついで、ライゼートをスナップキャップに移した。酵素プロテイナーゼK 3μlを加え、サーモミキサーにおいて、56℃及び550rpmで一晩インキュベーションした。翌日、DNA分離を行った。
DNA単離
DNA精製のために、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール 200μlをライゼートに加えた。ボルテックスし、続けて、氷上で5分間インキュベーションした後、相分離を4℃、16430gで3分間遠心分離することにより達成した。上側の水相を、相のより良好な可視化のために、10mM TrisCl中のクロロホルム 200μl及びクレゾールレッド 20μlを含有する新たなスナップキャップに移した。ボルテックスし、氷上で5分間インキュベーションした後、4℃、16430gで3分間遠心分離を行った。再度、上側の水相をエタノール 800μl及び3M 酢酸ナトリウム溶液 50μlと合わせた。より良好な沈殿を達成するために、グリコーゲン 2μlを加えた。チューブを短く転倒混和させた後、この溶液を4℃、16430gで30分間遠心分離した。続けて、DNAペレットを70% エタノール 400μlで覆い、室温で10分間インキュベーションした。室温、4760gで7分間遠心分離した後、DNAペレットを37℃で約5~10分間乾燥させた。続けて、このペレットを0,1×TEバッファー 100μlに溶解させ、40℃、400rpmで約3時間振とうした。DNAが完全に溶解したら、DNA濃度を、測定用DNA溶液 2μ及びブランク溶液としての0,1×TEバッファーを使用する分光光度計により測定した。ついで、DNAを4℃で保存した。
DNA精製のために、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール 200μlをライゼートに加えた。ボルテックスし、続けて、氷上で5分間インキュベーションした後、相分離を4℃、16430gで3分間遠心分離することにより達成した。上側の水相を、相のより良好な可視化のために、10mM TrisCl中のクロロホルム 200μl及びクレゾールレッド 20μlを含有する新たなスナップキャップに移した。ボルテックスし、氷上で5分間インキュベーションした後、4℃、16430gで3分間遠心分離を行った。再度、上側の水相をエタノール 800μl及び3M 酢酸ナトリウム溶液 50μlと合わせた。より良好な沈殿を達成するために、グリコーゲン 2μlを加えた。チューブを短く転倒混和させた後、この溶液を4℃、16430gで30分間遠心分離した。続けて、DNAペレットを70% エタノール 400μlで覆い、室温で10分間インキュベーションした。室温、4760gで7分間遠心分離した後、DNAペレットを37℃で約5~10分間乾燥させた。続けて、このペレットを0,1×TEバッファー 100μlに溶解させ、40℃、400rpmで約3時間振とうした。DNAが完全に溶解したら、DNA濃度を、測定用DNA溶液 2μ及びブランク溶液としての0,1×TEバッファーを使用する分光光度計により測定した。ついで、DNAを4℃で保存した。
qPCR
更なる定量のために、リアルタイム定量PCRを使用した。テンプレートDNA又はcDNA 5μlそれぞれを、10ng/μlの最終濃度で使用した。qPCRを、Mastermix GoTaq PCR(Promega Corporation)(Mastermix 7.5μl、プライマー 1.5μl、H2O 1μl) 10μl及びDNAテンプレート 5μlを使用して、ダプリケートでピペットされた96ウェルプレートで行った。相対的定量を、2つの正規化遺伝子を用いた比較CT法を使用して行った。プレートをホイルで閉じ、室温、220gで2分間遠心分離した。ついで、プレートをサーマルサイクラーでの特定の温度-時間プログラムに従ってインキュベーションした。使用されたプライマーを表1に列記する。反応をCFX96リアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad Laboratories)で行った。
更なる定量のために、リアルタイム定量PCRを使用した。テンプレートDNA又はcDNA 5μlそれぞれを、10ng/μlの最終濃度で使用した。qPCRを、Mastermix GoTaq PCR(Promega Corporation)(Mastermix 7.5μl、プライマー 1.5μl、H2O 1μl) 10μl及びDNAテンプレート 5μlを使用して、ダプリケートでピペットされた96ウェルプレートで行った。相対的定量を、2つの正規化遺伝子を用いた比較CT法を使用して行った。プレートをホイルで閉じ、室温、220gで2分間遠心分離した。ついで、プレートをサーマルサイクラーでの特定の温度-時間プログラムに従ってインキュベーションした。使用されたプライマーを表1に列記する。反応をCFX96リアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad Laboratories)で行った。
qPCRサイクル条件
繊維:94℃で2分間、94℃で15秒間、60℃で15秒間及び72℃で15秒間、45サイクル
他のウイルス遺伝子:94℃で1.5分間、94℃で15秒間、58℃で15秒間及び72℃で15秒間、45サイクル
Rb:94℃で2分間、94℃で15秒間、60℃で30秒間及び72℃で1分間、44サイクル
E2F1:95℃で2分間、95℃で15秒間、60℃で30秒間及び72℃で30秒間、40サイクル
繊維:94℃で2分間、94℃で15秒間、60℃で15秒間及び72℃で15秒間、45サイクル
他のウイルス遺伝子:94℃で1.5分間、94℃で15秒間、58℃で15秒間及び72℃で15秒間、45サイクル
Rb:94℃で2分間、94℃で15秒間、60℃で30秒間及び72℃で1分間、44サイクル
E2F1:95℃で2分間、95℃で15秒間、60℃で30秒間及び72℃で30秒間、40サイクル
タンパク質単離
細胞を、1% SDSバッファーを使用して溶解し、核膜の破壊を達成した。タンパク質の変性を避けるために、全プロセスを氷上で行った。培地を吸引した後、細胞を冷PBSで2回洗浄した。ダプリケートのアプローチの1つのウェルの接着細胞を、1% SDSバッファー 200μlで溶解し、細胞スクレーパーにより掻き取った。ついで、ライゼートをダプリケートのアプローチの他のウェルに移し、再度掻き取った。ついで、両ウェルのライゼートを合わせて、スナップキャップチューブに移した。続けて、ライゼートをシリンジで処理して、粘性DNAを破壊し、4℃、31000rpmで30分間遠心分離した。タンパク質が上清中に存在するため、上清を新たなスナップキャップチューブに移し、更なる工程に使用した。
細胞を、1% SDSバッファーを使用して溶解し、核膜の破壊を達成した。タンパク質の変性を避けるために、全プロセスを氷上で行った。培地を吸引した後、細胞を冷PBSで2回洗浄した。ダプリケートのアプローチの1つのウェルの接着細胞を、1% SDSバッファー 200μlで溶解し、細胞スクレーパーにより掻き取った。ついで、ライゼートをダプリケートのアプローチの他のウェルに移し、再度掻き取った。ついで、両ウェルのライゼートを合わせて、スナップキャップチューブに移した。続けて、ライゼートをシリンジで処理して、粘性DNAを破壊し、4℃、31000rpmで30分間遠心分離した。タンパク質が上清中に存在するため、上清を新たなスナップキャップチューブに移し、更なる工程に使用した。
タンパク質定量
タンパク質の量を定量するために、Pierce TM BCAタンパク質キットによるビシンコニン酸(BCA)アッセイを行った。ここで、BCA溶液A+B(50:1) 112.5μl及びサンプル 12.5μlを96ウェルプレートの1つのウェルに加え、37℃で30分間インキュベーションした。タンパク質濃度に応じて、溶液の染色が生じた。既知のタンパク質濃度を有する標準系列により、サンプルのタンパク質濃度をマイクロプレートリーダーにおける562nmでの測光測定により決定した。
タンパク質の量を定量するために、Pierce TM BCAタンパク質キットによるビシンコニン酸(BCA)アッセイを行った。ここで、BCA溶液A+B(50:1) 112.5μl及びサンプル 12.5μlを96ウェルプレートの1つのウェルに加え、37℃で30分間インキュベーションした。タンパク質濃度に応じて、溶液の染色が生じた。既知のタンパク質濃度を有する標準系列により、サンプルのタンパク質濃度をマイクロプレートリーダーにおける562nmでの測光測定により決定した。
SDSゲル電気泳動
後続のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動においてタンパク質を分離するために、計算量のライゼート及び溶解バッファーをローディングバッファー-DDT-混合物(6:1) 15μlと混合した。ついで、タンパク質ロード物質を100℃で5分間加熱した。色タンパク質標準 5μl及びサンプル 40μlをゲル上にロードした。ウイルスタンパク質の検出についてのタンパク質分離のために、10% ゲルを使用した。siRNAによるダウンレギュレートされた遺伝子を研究するために、12% ゲルを使用した。分離ゲル及びスタッキングゲルの組成をバッファー及び溶液のセクションに列記する。約20分間、ゲルをTGS-バッファー中、90Vで泳動させて、全てのタンパク質を1つのバンドに集めた。続けて、ゲルをTGS-バッファー中、150Vで約60分間泳動させて、タンパク質をサイズにより分離した。
後続のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動においてタンパク質を分離するために、計算量のライゼート及び溶解バッファーをローディングバッファー-DDT-混合物(6:1) 15μlと混合した。ついで、タンパク質ロード物質を100℃で5分間加熱した。色タンパク質標準 5μl及びサンプル 40μlをゲル上にロードした。ウイルスタンパク質の検出についてのタンパク質分離のために、10% ゲルを使用した。siRNAによるダウンレギュレートされた遺伝子を研究するために、12% ゲルを使用した。分離ゲル及びスタッキングゲルの組成をバッファー及び溶液のセクションに列記する。約20分間、ゲルをTGS-バッファー中、90Vで泳動させて、全てのタンパク質を1つのバンドに集めた。続けて、ゲルをTGS-バッファー中、150Vで約60分間泳動させて、タンパク質をサイズにより分離した。
ウェスタンブロット
タンパク質をゲルからメンブランに転写するために、ウェスタンブロット技術を使用してブロットした。疎水性PVDF膜を活性化するために、メタノール中で約2分間インキュベーションした。続けて、メンブランをスポンジ、ろ紙及びゲルと共にブロッティングバッファー中において堆積させた。4℃、100Vでの約2時間の電気泳動により、タンパク質をブロッティングバッファー中でメンブランに移した。非特異的な抗体結合を避けるために、メンブランを、細胞タンパク質をそれぞれ分析するために、TBST中の5% 粉乳 10ml中で、その後のウイルスタンパク質を検出する抗体の使用のために、5% BSA-TBST 5ml中でそれぞれ、室温で1時間回転させることでブロッキングした。メンブランをそれぞれ5分間TBST中で5回洗浄した後、メンブランを一次抗体溶液と共に4℃で一晩回転させながらインキュベーションした。抗体GAPDH、E1A、E1B55K、E2A及びE4orf6については、この工程を室温で1時間行った。ここで、抗体を、0.02% アジ化ナトリウムを含むTBST中の5% BSAに、異なる係数で希釈した。更なる5回の洗浄工程後、メンブランを二次抗体の1:10.000希釈中、室温で30分間回転させてインキュベーションした。ウイルス抗体に対する二次抗体(抗マウス)を5% BSA-TBST中に希釈し、他の全ての抗体をTBST中の5%粉乳中に希釈した。これらの二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしている。5回の最後の洗浄工程後、ペルオキシダーゼのシグナルを可視化するために、メンブランをEnhanced-Chemi-Luminescence(ECL)溶液中で5分間インキュベーションした。一次抗体DP-1及びE2F1と共にインキュベーションされたメンブランについては、GE-Healthcare製のAmersham ECL Primeウェスタンブロット検出試薬を使用して、より明るいシグナルを達成した。他の全てについては、研究室において調製されたECL溶液を使用した。使用直前に1:1で混合されたECL A及びECL Bの組成を、バッファー及び溶液のセクションに列記する。最後に、フィルム上にシグナルを呈することによりタンパク質を検出することができた。
タンパク質をゲルからメンブランに転写するために、ウェスタンブロット技術を使用してブロットした。疎水性PVDF膜を活性化するために、メタノール中で約2分間インキュベーションした。続けて、メンブランをスポンジ、ろ紙及びゲルと共にブロッティングバッファー中において堆積させた。4℃、100Vでの約2時間の電気泳動により、タンパク質をブロッティングバッファー中でメンブランに移した。非特異的な抗体結合を避けるために、メンブランを、細胞タンパク質をそれぞれ分析するために、TBST中の5% 粉乳 10ml中で、その後のウイルスタンパク質を検出する抗体の使用のために、5% BSA-TBST 5ml中でそれぞれ、室温で1時間回転させることでブロッキングした。メンブランをそれぞれ5分間TBST中で5回洗浄した後、メンブランを一次抗体溶液と共に4℃で一晩回転させながらインキュベーションした。抗体GAPDH、E1A、E1B55K、E2A及びE4orf6については、この工程を室温で1時間行った。ここで、抗体を、0.02% アジ化ナトリウムを含むTBST中の5% BSAに、異なる係数で希釈した。更なる5回の洗浄工程後、メンブランを二次抗体の1:10.000希釈中、室温で30分間回転させてインキュベーションした。ウイルス抗体に対する二次抗体(抗マウス)を5% BSA-TBST中に希釈し、他の全ての抗体をTBST中の5%粉乳中に希釈した。これらの二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしている。5回の最後の洗浄工程後、ペルオキシダーゼのシグナルを可視化するために、メンブランをEnhanced-Chemi-Luminescence(ECL)溶液中で5分間インキュベーションした。一次抗体DP-1及びE2F1と共にインキュベーションされたメンブランについては、GE-Healthcare製のAmersham ECL Primeウェスタンブロット検出試薬を使用して、より明るいシグナルを達成した。他の全てについては、研究室において調製されたECL溶液を使用した。使用直前に1:1で混合されたECL A及びECL Bの組成を、バッファー及び溶液のセクションに列記する。最後に、フィルム上にシグナルを呈することによりタンパク質を検出することができた。
低分子阻害剤処理
PD-0332991 イセチオナート(パルボシクリブ、Sigma-Aldrich Chemie GmbH)及びLY-2835219(アベマシクリブ、Selleck Chemicals)を10mM ストック溶液として滅菌水中に溶解させた。LEE011(リボシクリブ、MedChem Express)及びNutlin-3a(Sigma)をそれぞれ、10mM及び5μM ストック溶液としてDMSO中に溶解させた。作業濃度を直ちに使用するために新鮮に調製した。
PD-0332991 イセチオナート(パルボシクリブ、Sigma-Aldrich Chemie GmbH)及びLY-2835219(アベマシクリブ、Selleck Chemicals)を10mM ストック溶液として滅菌水中に溶解させた。LEE011(リボシクリブ、MedChem Express)及びNutlin-3a(Sigma)をそれぞれ、10mM及び5μM ストック溶液としてDMSO中に溶解させた。作業濃度を直ちに使用するために新鮮に調製した。
ウイルス感染及び併用処理
ウイルス誘引細胞死の決定のために、細胞を12ウェルプレートに播種した。PD-033299、LY-2835219及びLEE011との併用処理のために、細胞を阻害剤で24時間前処理した。この細胞を、FBSを含まない培地 200~400μl中において、示されたMOIで示されたウイルスに感染させた。低分子阻害剤を1hpiで含むか又は含まない完全培地を細胞に加えた。
ウイルス誘引細胞死の決定のために、細胞を12ウェルプレートに播種した。PD-033299、LY-2835219及びLEE011との併用処理のために、細胞を阻害剤で24時間前処理した。この細胞を、FBSを含まない培地 200~400μl中において、示されたMOIで示されたウイルスに感染させた。低分子阻害剤を1hpiで含むか又は含まない完全培地を細胞に加えた。
細胞生存(SRBアッセイ)
細胞を10% TCAにより、4℃で1時間固定し、1% 酢酸中の0.5% スルホローダミンB(SRB、Sigma-Aldrich Chemie GmbH)により、RTで30分間染色し、続けて、1% 酢酸で洗浄して、過剰のSRBを除去した。乾燥SRBを10mM Trisバッファー中に溶解させ、定量を590nmでの測光測定により行った。
細胞を10% TCAにより、4℃で1時間固定し、1% 酢酸中の0.5% スルホローダミンB(SRB、Sigma-Aldrich Chemie GmbH)により、RTで30分間染色し、続けて、1% 酢酸で洗浄して、過剰のSRBを除去した。乾燥SRBを10mM Trisバッファー中に溶解させ、定量を590nmでの測光測定により行った。
力価試験
感染性ウイルス粒子産生の決定のために、感染細胞及び上清を、細胞スクレーパーを使用して3dpiで回収した。ウイルスを、複数サイクルの凍結融解、続けて、1600rcfでの遠心分離により、インタクトな細胞から放出させた。細胞ライゼートの上清をAdEasyウイルス力価キットの取扱説明書(972500)に記載されているように、Hek293細胞を使用してウイルス粒子産生について試験した。下記試薬を使用した:ヤギ抗ヘキソン抗体(1056、Chemicon)、ウサギ抗ヤギ抗体(P0449、Dako)、DAB溶液(Dako)。
感染性ウイルス粒子産生の決定のために、感染細胞及び上清を、細胞スクレーパーを使用して3dpiで回収した。ウイルスを、複数サイクルの凍結融解、続けて、1600rcfでの遠心分離により、インタクトな細胞から放出させた。細胞ライゼートの上清をAdEasyウイルス力価キットの取扱説明書(972500)に記載されているように、Hek293細胞を使用してウイルス粒子産生について試験した。下記試薬を使用した:ヤギ抗ヘキソン抗体(1056、Chemicon)、ウサギ抗ヤギ抗体(P0449、Dako)、DAB溶液(Dako)。
実施例2:E1マイナスアデノウイルスの複製に対するCDK4/6阻害剤PD0332991の効果
E1欠失アデノウイルスは、非常に低い効力ではあるが、がん細胞において複製することが示された。T24細胞を、100MOI 緑色蛍光タンパク質を発現するE1マイナスアデノウイルス(Ad-GFP)に感染させ、感染の1日前及びインキュベーション時間中に500nM PD0332991で処理した。このような条件下で、GFP発現の増加が観察されたため、E1A非依存性ウイルス複製及びアデノウイルスE2初期プロモーターの活性化により媒介される遺伝子発現が示された。
E1欠失アデノウイルスは、非常に低い効力ではあるが、がん細胞において複製することが示された。T24細胞を、100MOI 緑色蛍光タンパク質を発現するE1マイナスアデノウイルス(Ad-GFP)に感染させ、感染の1日前及びインキュベーション時間中に500nM PD0332991で処理した。このような条件下で、GFP発現の増加が観察されたため、E1A非依存性ウイルス複製及びアデノウイルスE2初期プロモーターの活性化により媒介される遺伝子発現が示された。
実施例3:野生型アデノウイルス又はXVir-N-31と種々のCDK4/6阻害剤との併用
E2初期突然変異アデノウイルスAd-WT/E2M及びAd-GFPをPD0332991と組み合わせて使用した結果に基づいて、実験を、種々のCDK4/6阻害剤を野生型アデノウイルスAd-WT又はXVir-N-31のいずれかと組み合わせて使用して行った。これらの薬剤は、細胞をG1期で停止させるため、全ての阻害剤が、ウイルス複製を支持することができたことが見出されたのは驚くべきことであった。
E2初期突然変異アデノウイルスAd-WT/E2M及びAd-GFPをPD0332991と組み合わせて使用した結果に基づいて、実験を、種々のCDK4/6阻害剤を野生型アデノウイルスAd-WT又はXVir-N-31のいずれかと組み合わせて使用して行った。これらの薬剤は、細胞をG1期で停止させるため、全ての阻害剤が、ウイルス複製を支持することができたことが見出されたのは驚くべきことであった。
さらに、3つの臨床的に進行しているCDK4/6阻害剤PD-033299、LY-2835219及びLEE011による細胞の処理により、細胞の生存性、ウイルス複製及びウイルス力価産生に対する感染に影響を及ぼし得るかどうかを検討した。
処理に際して、3つの阻害剤は全て、RBの発現及びリン酸化レベルに対して類似の効果を表わす。これは、以前から多数の刊行物に記載されている。24時間でのほぼ完全な脱リン酸化後及び総タンパク質のダウンレギュレーション後にも、リン酸化レベルは、経時的に部分的に回復する。CDK2レベルは、処理時にアップレギュレーションされ、サイクリンD2及びサイクリンE2レベルはダウンレギュレーションされた。
実施例4:CDK4/6阻害剤と腫瘍溶解性アデノウイルスとの組み合わせにより生じる相乗効果
CDK4/6阻害剤PD-033299、LY-2835219及びLEE011を細胞のアデノウイルス感染と組み合わせた。細胞の感染は、処理後24時間に行った。ターゲット分子に対する下流の影響は、処理後8~24時間の間にしか検出できないためである。
CDK4/6阻害剤PD-033299、LY-2835219及びLEE011を細胞のアデノウイルス感染と組み合わせた。細胞の感染は、処理後24時間に行った。ターゲット分子に対する下流の影響は、処理後8~24時間の間にしか検出できないためである。
結果を図1に示す。
CDK4/6阻害剤により、細胞生存性、ウイルス複製及びウイルス力価に対して相乗効果が誘引された。(a)細胞を3つのCDK4/6阻害剤PD-033299、LY-2835219及びLEE011で24時間前処理し、XVir-N-31(Moi60)又は野生型アデノウイルス(Moi80)に感染させた。感染後の4日で、細胞生存をSRBアッセイにより測定した。グラフは、最低3つの独立した実験の平均を示す。(b)感染後3日で、ライゼートを細胞から調製し、力価試験をHEK293細胞について行った。ウイルス力価は、対照に対する倍 変化として示す。(c)DNAを感染細胞から4、24、36及び48hpiで抽出し、線維cDNAに対するqPCRを使用することによりウイルス複製について分析した。値を4hpiでのGAPDHに対して正規化する。グラフは、少なくとも2つの独立した実験の代表を示す。エラーバーは、標準誤差を表わす。
図1から明らかなように、3つ全てのCDK4/6阻害剤は、細胞溶解(図1a)、細胞内での複製(図18)及びウイルス粒子の形成(図1b)を劇的に支持した。
実施例5:選択されたウイルスタンパク発現レベルに対するCDK4/6阻害剤パルボシクリブ(PD-033299)の効果
これらの効果をより詳細に分析するために、選択されたウイルスタンパク質の発現レベルを処理された細胞又は処理されていない細胞において決定した。この実験のために、阻害剤パルボシクリブ(PD-033299)を代表的なCDK4/6阻害剤として使用した。細胞を15MOIで感染させた。500nMでのPD処理を、感染24時間及びタンパク質単離を行うまで行った。12、24及び36時間後、タンパク質単離を、1% SDSバッファーを使用して行った。アクチンをポジティブ対照として含めた。ローディング対照は、全ての系統において同じタンパク質レベルの細胞アクチンを示すため、系統間の適切な比較が保証される。hpi:感染後時間。
これらの効果をより詳細に分析するために、選択されたウイルスタンパク質の発現レベルを処理された細胞又は処理されていない細胞において決定した。この実験のために、阻害剤パルボシクリブ(PD-033299)を代表的なCDK4/6阻害剤として使用した。細胞を15MOIで感染させた。500nMでのPD処理を、感染24時間及びタンパク質単離を行うまで行った。12、24及び36時間後、タンパク質単離を、1% SDSバッファーを使用して行った。アクチンをポジティブ対照として含めた。ローディング対照は、全ての系統において同じタンパク質レベルの細胞アクチンを示すため、系統間の適切な比較が保証される。hpi:感染後時間。
結果を図2に示す。図2は、CDK4/6阻害剤PD0332991(PD)と組み合わせたAd-WT及びXVir-N-31感染T24細胞のウイルスタンパク質発現の結果を示す。本実験で調査されたウイルスタンパク質(E1A、E1B-55k、DBP(E2A)及びヘキソン)は全て、CDK4/6阻害剤PD-0332991で処理された細胞では、アデノウイルス野生型ウイルスと比較して、より高いレベルで発現していた。この効果は、E1Aについては12hpi、他のタンパク質については24hpiという早い時期に観察することができた。
実施例6:CDK4/6阻害剤により媒介される効果の特異性
実施例5に従うCDK4/6阻害剤のクラスは、RBの発現を必要とする。このため、3つのRB陽性及び2つのRBマイナス膀胱がん由来細胞株を使用し、これらの細胞を併用療法で処理した。細胞株をIC50濃度のPD-0332991(T24:500nM、RT112:2000nM、253J:100nM)で24時間前処理し、XVir-N-31(T24 MOI50、253J MOI25、RT112 MOI450)に感染させた。値は、少なくとも2つの独立した実験の平均である。エラーバーは、標準誤差を示す。4dpiで、細胞生存を、SRBアッセイ(a、c)を使用して測定した。(b、d)細胞ライゼートを3dpiで調製し、力価試験をHek293細胞について行った。ウイルス力価は、対照に対する倍 変化として示す。
実施例5に従うCDK4/6阻害剤のクラスは、RBの発現を必要とする。このため、3つのRB陽性及び2つのRBマイナス膀胱がん由来細胞株を使用し、これらの細胞を併用療法で処理した。細胞株をIC50濃度のPD-0332991(T24:500nM、RT112:2000nM、253J:100nM)で24時間前処理し、XVir-N-31(T24 MOI50、253J MOI25、RT112 MOI450)に感染させた。値は、少なくとも2つの独立した実験の平均である。エラーバーは、標準誤差を示す。4dpiで、細胞生存を、SRBアッセイ(a、c)を使用して測定した。(b、d)細胞ライゼートを3dpiで調製し、力価試験をHek293細胞について行った。ウイルス力価は、対照に対する倍 変化として示す。
結果を図3に示す。
図3から明らかなように、RB陽性の細胞株のみが、細胞増殖及び細胞生存それぞれの顕著な低下を示した(図3a、c)。また、ウイルス粒子の形成は、PD-0332991処理時にRB陽性細胞株においてのみ増加した(図3b、d)。
実施例7:CDK4/6阻害剤PD-0332991とXVir-N-31との併用処理の効果
RB陽性細胞株におけるウイルス複製に対するPD-0332991の効果を調査するため、繊維DNAコピーの相対定量を、qPCRを使用して行った。膀胱がん細胞株を24時間前処理し、XVir-N-31(T24 MOI40、UMUC3及び253J MOI20、RT112 MOI400)に感染させた。DNAを24~48hpiで抽出し、qPCRを使用してウイルス繊維について分析した。値をGAPDHに対して正規化する。データは、少なくとも2つの独立した実験の代表である。エラーバーS.D。
RB陽性細胞株におけるウイルス複製に対するPD-0332991の効果を調査するため、繊維DNAコピーの相対定量を、qPCRを使用して行った。膀胱がん細胞株を24時間前処理し、XVir-N-31(T24 MOI40、UMUC3及び253J MOI20、RT112 MOI400)に感染させた。DNAを24~48hpiで抽出し、qPCRを使用してウイルス繊維について分析した。値をGAPDHに対して正規化する。データは、少なくとも2つの独立した実験の代表である。エラーバーS.D。
結果を図4に示す。
図4から分かるように、CDK4/6阻害剤PD-0332991とXVir-N-31との併用処理により、ウイルス複製が劇的に増大する。
実施例8:CDK4/6阻害剤の時間動特性
RBの脱リン酸化及び分解に対するCDK4/6阻害剤の時間動特性は、細胞の処理後約10時間である。また、上記示された結果から、RB下流ターゲットの経時的で部分的な回復が示された(図1)。この観察は、CDK4/6阻害剤の時間動特性及びウイルス誘引細胞死に対する効果が実施例7に例示されたように、この併用療法の重要なパラメータであることを意味する。併用療法の適用のために、細胞の前処理のための異なる時点を試験した。それに従って、細胞を感染前(感染前日/時間、dai/hai)又は感染後1時間のいずれかで処理し、細胞増殖を、SRBアッセイを使用して測定した。エラーバーは、S.E.を表わし、値は、3つの独立した実験の平均である。
RBの脱リン酸化及び分解に対するCDK4/6阻害剤の時間動特性は、細胞の処理後約10時間である。また、上記示された結果から、RB下流ターゲットの経時的で部分的な回復が示された(図1)。この観察は、CDK4/6阻害剤の時間動特性及びウイルス誘引細胞死に対する効果が実施例7に例示されたように、この併用療法の重要なパラメータであることを意味する。併用療法の適用のために、細胞の前処理のための異なる時点を試験した。それに従って、細胞を感染前(感染前日/時間、dai/hai)又は感染後1時間のいずれかで処理し、細胞増殖を、SRBアッセイを使用して測定した。エラーバーは、S.E.を表わし、値は、3つの独立した実験の平均である。
結果を図5に示す。
図5から明らかなように、並行処理は、細胞死の増加に既に十分であった。
実施例9:種々のアデノウイルスとCDK4/6阻害剤PD0332991との併用処理
本実施例を、細胞殺傷のために、種々の腫瘍溶解性アデノウイルスをCDK4/6阻害剤、例えば、PD0332991と共に使用することができ、ウイルス複製及び細胞殺傷における観察された増加がXVir-N-31に限定されなかったという実験的証拠を提供するために行った。それに従い、以下のように、Ad-デルタ24及びOnyx-015によるT24がん細胞:T24膀胱がん細胞を、20MOI 示された腫瘍溶解性アデノウイルスに感染させた。500nM CDK4/6阻害剤PD0332991での処理を感染の1日前及び感染後4日間行った。感染から4日後に撮影した。細胞変性効果(CPE)の発生は、ウイルス複製と細胞殺傷を示す。
本実施例を、細胞殺傷のために、種々の腫瘍溶解性アデノウイルスをCDK4/6阻害剤、例えば、PD0332991と共に使用することができ、ウイルス複製及び細胞殺傷における観察された増加がXVir-N-31に限定されなかったという実験的証拠を提供するために行った。それに従い、以下のように、Ad-デルタ24及びOnyx-015によるT24がん細胞:T24膀胱がん細胞を、20MOI 示された腫瘍溶解性アデノウイルスに感染させた。500nM CDK4/6阻害剤PD0332991での処理を感染の1日前及び感染後4日間行った。感染から4日後に撮影した。細胞変性効果(CPE)の発生は、ウイルス複製と細胞殺傷を示す。
結果を図6に示す。
図6から分かるように、RBリン酸化を減少させるCDK4/6阻害剤の代表例としてのCDK4/6阻害剤PD0332991により、他の腫瘍溶解性アデノウイルス、例えば、Ad-デルタ24及びOnyx-015と組み合わせた場合、細胞殺傷が増加した。
実施例10:パルボシクリブと組み合わせたGFPを発現するリコンビナントE1欠失アデノウイルス(Ad-マイナス/GFP)をT24細胞に感染させると、GFP発現が増大する
100.000個 T24細胞/ウェルを6ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地中において、5% CO2、37℃で増殖させた。T24細胞を、感染の24時間前及び再度感染後1時間で、500nM パルボシクリブで処理した。GFPを発現するE1欠失アデノウイルス(Ad-マイナス/GFP)の感染を、血清を含まない培地 400μl中で行った。10倍の倍率の蛍光顕微鏡を使用して、感染後48時間で写真を撮った。
100.000個 T24細胞/ウェルを6ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地中において、5% CO2、37℃で増殖させた。T24細胞を、感染の24時間前及び再度感染後1時間で、500nM パルボシクリブで処理した。GFPを発現するE1欠失アデノウイルス(Ad-マイナス/GFP)の感染を、血清を含まない培地 400μl中で行った。10倍の倍率の蛍光顕微鏡を使用して、感染後48時間で写真を撮った。
パルボシクリブ処理の有無によるGFP発現の蛍光顕微鏡分析の結果を図7に示す。
結果から、T24細胞をパルボシクリブで処理することにより、パルボシクリブによって誘引されるウイルスDNA複製により媒介されるGFP発現が強く増大したことが示される。
実施例11:種々の細胞周期阻害剤で処理されたUMUC細胞におけるE1A非依存性ウイルス複製
異なる処理条件下でのdl703(Mantwill et al. 2013, Journal of Translational Medicine, 11, 216)の複製の差異を調査するため、DNA-複製分析を行った。100.000個 UMUC細胞を6ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するDMEM培地中、5% CO2条件下、37℃で増殖させた。播種後24時間で、細胞を10μM Lee(リボシクリブ)、1μM CI-1040、10μM ヌトリン-3a及び10μM ロスコビチン(Roscovertine)で24時間処理し、感染後、再度、適切な量の阻害剤を培地に加えた。50 MOI dl703(マストアデノウイルス、C型、血清型5、E1領域に3.2kbサイズの欠失を有する)による感染を処理後24時間で行った。感染後4及び48時間で、DNAを単離し、qPCRをウイルス繊維遺伝子に特異的なプライマーを使用して行った。繊維フォワード 5’-AAGCTAGCCCTGCAAACATCA-3’(配列番号:17);繊維リバース 5’-CCCAAGCTACCAGTGGCAGTA-3’(配列番号:18)。
異なる処理条件下でのdl703(Mantwill et al. 2013, Journal of Translational Medicine, 11, 216)の複製の差異を調査するため、DNA-複製分析を行った。100.000個 UMUC細胞を6ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するDMEM培地中、5% CO2条件下、37℃で増殖させた。播種後24時間で、細胞を10μM Lee(リボシクリブ)、1μM CI-1040、10μM ヌトリン-3a及び10μM ロスコビチン(Roscovertine)で24時間処理し、感染後、再度、適切な量の阻害剤を培地に加えた。50 MOI dl703(マストアデノウイルス、C型、血清型5、E1領域に3.2kbサイズの欠失を有する)による感染を処理後24時間で行った。感染後4及び48時間で、DNAを単離し、qPCRをウイルス繊維遺伝子に特異的なプライマーを使用して行った。繊維フォワード 5’-AAGCTAGCCCTGCAAACATCA-3’(配列番号:17);繊維リバース 5’-CCCAAGCTACCAGTGGCAGTA-3’(配列番号:18)。
結果を図8に示す。
図8から明らかなように、UMUC細胞をCDK4/6阻害剤LEE011(リボシクリブ)で処理することにより、E1マイナスアデノウイルスdl703のウイルスDNA複製が劇的に増大した(ほぼ100倍)。この増大から、E2F1発現の抑制と組み合わせたリボシクリブによる特異的誘引G1停止により、E1とは無関係のアデノウイルス複製が促進されることが強く示唆される。その結果、E1A遺伝子に特異的な欠失を有するウイルスだけが、CDK4/6処理下でアデノウイルスDNA複製の増大を示すのではなく、E1A遺伝子の完全な欠失を有するアデノウイルスであっても、ウイルスDNA複製の増大を示す。
Mek阻害剤GI-1040は、E2F1発現阻害及びG1停止に関して類似の性質を示したが、その複製は、リボシクリブ処理細胞と比較してはるかに低かった。これは、ウイルス複製に必要な他の重要な細胞周期関連経路、例えば、MEK/ERKが同時に阻害されるという事実によると考えられる。加えて、MEK/ERK経路の阻害は、腫瘍溶解性アデノウイルス複製との併用療法のために、臨床状況において、それを不適当にする、100倍以上の粒子形成を減少させることが示された(Schumann and Doppelstein 2016, Cancer Research, 66, 1282-1288)。
実施例12:示された細胞周期阻害剤で処理されたUMUC細胞のウェスタンブロット分析
示された濃度のCI-1040、ロスコビチン、Nutlin-3a及びLEE011(リボシクリブ)で処理されたUMUC細胞のウェスタンブロット分析。1×106個 細胞を10cm皿に播種した。処理後24時間で、核膜の破壊を達成するために、1% SDSバッファーを使用して、タンパク質を単離した。全てのサンプルをシリンジに数回吸引して、DNAを破壊し、続けて、4℃、30000rpmで30分間遠心分離した。上清を新たな反応チューブに移し、更なる工程に直接使用するか又は-80℃で保存した。タンパク質を分離するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。4℃、100Vで約2時間の電気泳動により、40μg 総タンパク質をロードし、示された特異抗体に対してプローブした。
示された濃度のCI-1040、ロスコビチン、Nutlin-3a及びLEE011(リボシクリブ)で処理されたUMUC細胞のウェスタンブロット分析。1×106個 細胞を10cm皿に播種した。処理後24時間で、核膜の破壊を達成するために、1% SDSバッファーを使用して、タンパク質を単離した。全てのサンプルをシリンジに数回吸引して、DNAを破壊し、続けて、4℃、30000rpmで30分間遠心分離した。上清を新たな反応チューブに移し、更なる工程に直接使用するか又は-80℃で保存した。タンパク質を分離するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。4℃、100Vで約2時間の電気泳動により、40μg 総タンパク質をロードし、示された特異抗体に対してプローブした。
結果を図9A、9B及び9Cに示す。
図9から明らかなように、ロスコビチン及びNutlin-3aは、Rb、phRB及びE2F1発現に対して顕著な効果を有さなかったが、10μMでのLEE-011(リボシクリブ)及び1μMでのMI-1040により、E2F1並びにRb及びphRb発現の阻害が誘引された。
実施例13:E1欠失複製欠損アデノウイルスdl703のウイルスDNA複製に対するCDK4/6阻害剤の分析
細胞周期分析のために、細胞を6ウェルプレート(2,5×10E4c/ウェル)に播種した。dl703による感染前8時間で、細胞を示された濃度の細胞周期阻害剤で処理した。10MOI dl703による感染後、細胞を再度48時間処理した。未処理細胞及びdl703感染のみさせた細胞を対照とした。感染後48時間で、細胞をトリプシン処理により回収し、ボルテックスしながら、80% エタノールで固定した。細胞周期の状態を調査するために、固定された細胞をRT及び300gで5分間遠心分離し、エタノールを吸引した。細胞を再懸濁させ、1% BSA-PBS(ウシ血清アルブミン)で洗浄し、再度遠心分離した。細胞をEDUで染色し、細胞周期分析を、Thermo Fischer製のClick-iT(商標)Plus EdUフローサイトメトリーアッセイキット、カタログ番号.C10632を使用して行った。加えて、1% BSA/PBS細胞で3回洗浄した後、PI(ヨウ化プロピジウム、50μg/ml)で染色した。FACScaliburフローサイトメトリーシステムで染色した後、測定を直接行った。データをFlowJoソフトウェアで分析した。
細胞周期分析のために、細胞を6ウェルプレート(2,5×10E4c/ウェル)に播種した。dl703による感染前8時間で、細胞を示された濃度の細胞周期阻害剤で処理した。10MOI dl703による感染後、細胞を再度48時間処理した。未処理細胞及びdl703感染のみさせた細胞を対照とした。感染後48時間で、細胞をトリプシン処理により回収し、ボルテックスしながら、80% エタノールで固定した。細胞周期の状態を調査するために、固定された細胞をRT及び300gで5分間遠心分離し、エタノールを吸引した。細胞を再懸濁させ、1% BSA-PBS(ウシ血清アルブミン)で洗浄し、再度遠心分離した。細胞をEDUで染色し、細胞周期分析を、Thermo Fischer製のClick-iT(商標)Plus EdUフローサイトメトリーアッセイキット、カタログ番号.C10632を使用して行った。加えて、1% BSA/PBS細胞で3回洗浄した後、PI(ヨウ化プロピジウム、50μg/ml)で染色した。FACScaliburフローサイトメトリーシステムで染色した後、測定を直接行った。データをFlowJoソフトウェアで分析した。
CDK4/6阻害剤の特徴
CI1040:二重特異的スレオニン/チロシンキナーゼであるマップキナーゼキナーゼ(MEK)は、多くの場合ヒト腫瘍で活性化されるRAS/RAF/MEK/ERKシグナル伝達経路の重要な成分である。CI-1040は、MEKを強力に阻害し(Allen et al. 2003, Semin Oncol. (5 Suppl 16):105-16)、G1停止を引き起こすベンズヒドロキサマート化合物である。
CI1040:二重特異的スレオニン/チロシンキナーゼであるマップキナーゼキナーゼ(MEK)は、多くの場合ヒト腫瘍で活性化されるRAS/RAF/MEK/ERKシグナル伝達経路の重要な成分である。CI-1040は、MEKを強力に阻害し(Allen et al. 2003, Semin Oncol. (5 Suppl 16):105-16)、G1停止を引き起こすベンズヒドロキサマート化合物である。
Nutlin-3a:MDM2の低分子アンタゴニストであるNutlin-3は、正常なMDM2発現細胞株並びに野生型p53を伴うMDM2過剰発現細胞株の両方においてp53機能を効果的に回復させ、細胞周期停止及びアポトーシスをもたらす(Wang et al 2012, Acta Biochimica et Biophysica Sinica, Volume 44, Issue 8, 1 August 2012, Pages 685-691)。
ロスコビチン(セリシクリブ又はCYC202)は、薬理学的サイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害剤のファミリーにおける実験的薬剤候補であり、CDK2、CDK7及びCDK9を含む複数の酵素ターゲットを優先的に阻害する。同阻害により、処理された細胞の細胞周期内の増殖期又は状態が変化する(Whitaker et al. 2004, Cancer Research 64, 262-272)。
LEE011(リボシクリブ;商品名Kisqali])は、サイクリンD1/CDK4及びCDK6の阻害剤であり、ある種の乳がんの処置に使用される。CDK4/6の阻害は、細胞周期をG1で停止させ、E2F1発現を阻害する(Kim S. et al, Oncotarget. 2018 Oct 16;9(81):35226-35240;Yang C et al., Oncogene (2017)36,2255-2264)。
結果を図10に示す。
CDK4/6阻害剤LEE011(リボシクリブ)及びCI-1040により、明確なG1停止が誘引された。ロスコビチンによる処理により、G2/m停止細胞のわずかな増加が示された。Nutlin-3aは、使用された濃度において、細胞周期に対してほとんど又は全く影響を及ぼさなかった。リコンビナントE1欠失(E1Aタンパク質を有さない)アデノウイルスdl703によるUMUC細胞の感染により、細胞周期分布は顕著に変化しなかった。
実施例14:パルボシクリブにより処理後のin vitroアデノウイルスヘキソン染色が増加した
膀胱細胞株RT112、T24及びUMUCを6ウェルプレートに播種した(2×105個/ウェル)。播種後1日目に、細胞を500nM パルボシクリブで感染前24時間及び再度感染後1時間で処理した。示されたMOIのAD-WTによる感染を、血清を含まないDMEM培地 400μl中で行った。ヘキソン染色を、Agilent製のAdeasyウイルス力価キット(cat:972500)を使用して、製造メーカーの説明書に従って、感染後2日目に行った。
膀胱細胞株RT112、T24及びUMUCを6ウェルプレートに播種した(2×105個/ウェル)。播種後1日目に、細胞を500nM パルボシクリブで感染前24時間及び再度感染後1時間で処理した。示されたMOIのAD-WTによる感染を、血清を含まないDMEM培地 400μl中で行った。ヘキソン染色を、Agilent製のAdeasyウイルス力価キット(cat:972500)を使用して、製造メーカーの説明書に従って、感染後2日目に行った。
結果を図11に示す。
図11から明らかなように、例示的なCDK4/6阻害剤としてのパルボシクリブ(500nM)の処理により、褐色/赤色により示されるように、感染後48時間でパルボシクリブ処理細胞においてヘキソン陽性細胞が顕著に増加した。パルボシクリブ処理下において細胞は、ウイルス粒子をより多く産生可能であり、ウイルスDNA複製の増大を示すとの結論に達した。アデノウイルスのヘキソン発現は、ウイルス複製の排他的開始に起因するためである。
実施例10~14の対象となる結果から、CDK4/6阻害剤のみが、複製欠損アデノウイルス(E1遺伝子を欠いているdl703)及びAd-GFPの複製及び遺伝子発現を増加させることができ、他の細胞周期阻害剤はできないことが明らかであった。さらに、このようなウイルス複製及び遺伝子発現の増加をもたらすために、CDK4/6阻害剤により、(感染した)細胞をG1で停止させ、F2F1発現が阻害されなければならない。
実施例15:XVir-N-31、パルボシクリブ及びPARP阻害剤を含む3剤併用療法を使用するT24細胞の処理
XVir-N-31、パルボクリブ及びPARP阻害剤(BMN673(タラゾラリブ))を含む3剤併用療法を使用するT24細胞の3剤併用療法の有効性を示すために、効力アッセイを行った。
XVir-N-31、パルボクリブ及びPARP阻害剤(BMN673(タラゾラリブ))を含む3剤併用療法を使用するT24細胞の3剤併用療法の有効性を示すために、効力アッセイを行った。
ウェル当たりに12.500個 T24細胞を12ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地中において、37℃で一晩増殖させた。細胞の阻害剤処理を細胞播種後24時間及び再度感染後1時間で、示された濃度を培地に加えることにより行った。細胞の感染を、血清を含まない培地 250μl中において、阻害剤処理後24時間で行った。固定及びSRB染色を感染後4日目に行った。PD、パルボシクリブ;PARPi:BMN673。
SRB染色のために、培地を吸引により除去した。細胞を10% 冷TCA 1ml(ウェル当たり)により、4℃で1時間固定した。TCAを吸引により除去し、細胞層を水道水で4回洗浄した。細胞を1% 酢酸中の0.5% SRB(スルホローダミンB) 1ml(ウェル当たり)で30分間染色した。未結合SRBを1% 酢酸 1ml/ウェルにより、5回の洗浄ステップで除去した。各洗浄ステップの後、酢酸を吸引により除去した。プレートを2時間風乾させた。SRB染色細胞を可溶化するために、10mM Tris塩基 200μlを各ウェルに加えた。その後、それぞれ20μlを96ウェルプレートのウェルに分注した。96ウェルプレートをElisaプレートリーダーにロードし、サンプルの吸光を560nmで測定した。モック処理細胞を100% 細胞生存に設定した。
結果を図12に示す。
図12に示された結果から、パルボシクリブ、BMN673及びXVir-N-31からなる3剤併用療法が細胞殺傷に関して単剤又は併用療法に対して優れた性能を示したことが明確に実証されている。ほぼ90% 細胞殺傷を、10MOI XVir-N-31をPARP阻害剤PARPi(BMN673)及びCDK4/6阻害剤パルボシクリブ(PD)と組み合わせて使用して達成することができた。XVir-N-31を含まないPARPiとパルボシクリブとの組み合わせでは、細胞の65%しか殺傷されなかった。T24細胞及びUMUC細胞は、CDK4/6阻害剤に感受性である(E2F1ダウンレギュレーションによるG1停止を提供する)。
実施例16:XVir-N-31、パルボシクリブ及びPARP阻害剤を含む3剤併用療法の動力学
XVir-N-31、パルボクリブ及びPARP阻害剤(BMN673(タラゾラリブ))を含む3剤併用療法を使用するT24細胞の3剤併用療法の動力学を示すために、効力アッセイを行い、効力を種々の時点で評価した。
XVir-N-31、パルボクリブ及びPARP阻害剤(BMN673(タラゾラリブ))を含む3剤併用療法を使用するT24細胞の3剤併用療法の動力学を示すために、効力アッセイを行い、効力を種々の時点で評価した。
ウェル当たりに3.000個 T24細胞を12ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地中において、37℃で一晩増殖させた。細胞の阻害剤処理を細胞播種後24時間及び再度感染後1時間で、示された濃度を培地に加えることにより行った。細胞の感染を、血清を含まない培地 250μl中において、阻害剤処理後24時間で行った。固定及びSRB染色を感染後1~5日目(dpi:感染後日数)に行った。15nM PARPiは、T24細胞のIC80値に相当する。
結果を図13に示す。
図13から明らかなように、XVir-N-31以外に、CDK4/6阻害剤(パルボシクリブ(PD)及びPARP阻害剤PARPI(BMN673)を使用した3剤併用療法は、動力学の観点からも、XVir-N-31のみを使用する単剤療法又はXVir-N-31とPARP阻害剤又はCDK4/6阻害剤のいずれかとを使用する併用療法よりはるかに効果的である。重要なことに、腫瘍細胞の再増殖が、CDK4/6感受性細胞株であるUMUC及びT24では、4日目及び5日目(dpi:感染後日数)に顕著に減少した。
実施例17:XVir-N-31、パルボシクリブ及びPARP阻害剤を含む3剤併用療法の動力学
XVir-N-31、パルボクリブ及びPARP阻害剤(BMN673(タラゾラリブ))を含む3剤併用療法を使用するUMUC細胞の3剤併用療法の動力学を示すために、効力アッセイを行い、効力を種々の時点で評価した。
XVir-N-31、パルボクリブ及びPARP阻害剤(BMN673(タラゾラリブ))を含む3剤併用療法を使用するUMUC細胞の3剤併用療法の動力学を示すために、効力アッセイを行い、効力を種々の時点で評価した。
UMUC-3の播種:ウェル当たりに3.000個 細胞を12ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するDMEM培地中において、37℃で一晩増殖させた。細胞の阻害剤処理を細胞播種後24時間及び再度感染後1時間で、示された濃度を培地に加えることにより行った。細胞の感染を阻害剤処理後24時間で行った。固定及びSRB染色を感染後1~6日目(dpi:感染後日数)に行った。160nM PARPiは、UMUC3細胞のIC80値に相当する。
結果を図14に示す。
図14に示された結果から、パルボシクリブ、BMN673及びXVir-N-31からなる3剤併用療法が単剤又は併用療法に対して優れた性能を示したことが明確に実証されている。重要なことに、腫瘍細胞の再増殖が、CDK4/6感受性細胞株であるUMUC及びT24では、4日目及び5日目(dpi:感染後日数)に顕著に減少した。
実施例18:XVir-N-31、CDK4/6阻害剤及びブロモドメイン阻害剤を含む3剤併用療法
5000個 T24細胞を12ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地 1ml中において増殖させた。翌日、細胞を500nM パルボシクリブ及び300nM JQ-1で処理した。処理後24時間で、細胞を、FCSを含有しないRPMI培地 200μl中において、示されたMOIのXVir-N-31で感染させた。1時間後、10% FCSを含有するRPMI培地 800μlを各ウェルに加えた。加えて、500nM パルボシクリブ及び300nM JQ-1を培地に加えた。SRB染色を感染後5日で行った。モック処理細胞を100% 細胞生存に設定した。
5000個 T24細胞を12ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地 1ml中において増殖させた。翌日、細胞を500nM パルボシクリブ及び300nM JQ-1で処理した。処理後24時間で、細胞を、FCSを含有しないRPMI培地 200μl中において、示されたMOIのXVir-N-31で感染させた。1時間後、10% FCSを含有するRPMI培地 800μlを各ウェルに加えた。加えて、500nM パルボシクリブ及び300nM JQ-1を培地に加えた。SRB染色を感染後5日で行った。モック処理細胞を100% 細胞生存に設定した。
結果を図15に示す。
図15から明らかなように、ブロモドメイン阻害剤JQ-1により、低MOIにおいて、CDK4/6阻害剤パルボシクリブと組み合わせたXVir-N-31の細胞殺傷能が向上した。感染後48時間での光学顕微鏡分析から、JQ-1/パルボシクリブ/XVir-N-31処理細胞において既に大量の細胞死が認められる。JQ-1により、パルボシクリブ処理細胞において、ウイルス転写が増加することにより、ウイルス複製が増加したという結論に達した。300nM JQ-1単独での単剤療法では、10及び20MOIでのXVir-N-31の細胞殺傷を増大させなかったためである。
アデノウイルス感染がん細胞において観察されるJQ-1の増強の前提条件は、パルボシクリブのG1停止誘引能である。パルボシクリブに対して耐性である細胞では(実施例18、同一の処理手順を参照のこと)、細胞殺傷の増加は観察されなかった。この観察は、Baojie Lv et al 2018, Scientific reports, 8, 11554とは明らかに対照的であり、同文献では、細胞を、JQ-1の濃度で処理しており、G1停止を引き起こさず、パルボシクリブを併用しなかった。
実施例19:XVir-N-31、CDK4/6阻害剤及びブロモドメイン阻害剤を含む3剤併用療法
100.000個 SK-N-MC細胞/ウェルを12ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地中において、5% CO2、37℃で増殖させた。細胞を、200nM アベマシクリブ+500nM JQ-1により、感染前24時間及び再度感染後1時間で、適切な量を培地に加えることにより処理した。XVir-N-31の感染は、血清を含まないRPMI培地 500μl中において行った。SRB染色を感染後5日で行った。モック処理細胞を100% 細胞生存に設定した。
100.000個 SK-N-MC細胞/ウェルを12ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地中において、5% CO2、37℃で増殖させた。細胞を、200nM アベマシクリブ+500nM JQ-1により、感染前24時間及び再度感染後1時間で、適切な量を培地に加えることにより処理した。XVir-N-31の感染は、血清を含まないRPMI培地 500μl中において行った。SRB染色を感染後5日で行った。モック処理細胞を100% 細胞生存に設定した。
結果を図16に示す。
SK-N-MC細胞は、CDK4/6阻害剤に対して耐性であるため、G1停止を引き起こさないことが確立されている。JQ-1の添加によっては、CDK4/6(アベマシクリブ)耐性SK-N-MC細胞の細胞殺傷は増加しなかった。このことは、CDK4/6媒介G1停止が細胞殺傷に対するJQ-1媒介効果の前提条件であることを示している。
このため、図16(及び図15)に、BRD2、BRD3、BRD4をターゲットとするブロモドメイン阻害剤により、CDK4/6阻害剤が処理細胞においてG1停止を誘引するという前提の下で、XVir-N-3の細胞殺傷効果がさらに向上することを示す。
実施例20:CDK4/6阻害剤LY-2835219(アベマシクリブ)及びWee阻害剤MK-1775(アダボセルチブ)で処理されたSK-N-MC細胞のウェスタンブロット分析
1×106個 細胞を10cm皿に播種した。処理後24時間で、核膜の破壊を達成するために、1% SDSバッファーを使用して、タンパク質を単離した。全てのサンプルをシリンジに数回吸引して、DNAを破壊し、続けて、4℃、30000rpmで30分間遠心分離した。上清を新たな反応チューブに移し、更なる工程に直接使用するか又は-80℃で保存した。タンパク質を分離するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。4℃、100Vで約2時間の電気泳動により、40μg 総タンパク質をロードし、示された特異抗体に対してプローブした。
1×106個 細胞を10cm皿に播種した。処理後24時間で、核膜の破壊を達成するために、1% SDSバッファーを使用して、タンパク質を単離した。全てのサンプルをシリンジに数回吸引して、DNAを破壊し、続けて、4℃、30000rpmで30分間遠心分離した。上清を新たな反応チューブに移し、更なる工程に直接使用するか又は-80℃で保存した。タンパク質を分離するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。4℃、100Vで約2時間の電気泳動により、40μg 総タンパク質をロードし、示された特異抗体に対してプローブした。
結果を図17に示す。
SK-N-MC細胞は、アベマシクリブ(Abenaciclib)処理に対して耐性であることが公知である(Dowless M et al.,2018, Clin Cancer Res: 24, 6028-6039)。Wee1は、G2/M細胞周期チェックポイント制御の重要な成分であり、CDC2のリン酸化をレギュレーションすることにより細胞周期停止を媒介する。MK1775によるWee1の阻害は、異なるタイプのがん腫においてDNA損傷剤の細胞傷害作用を増強することが報告されている。幾つかの研究から、低分子キナーゼ阻害剤MK-1775によるWee1の薬理学的阻害により、腫瘍細胞においてTyr15でのCDC2リン酸化が除去されることが実証されている(Kreahling et al 2013, PLoS One. 8(3), e 57523)。強力なG1停止が、併用処理で観察されるが、Rb及びE2F1発現に変化は観察されない。
実施例21:XVir-N-31、CDK4/6阻害剤アベマシクリブ及びアダボセルチブ(Wee阻害剤MK-1775)を含む3剤併用療法
100.000個 SK-N-MC細胞/ウェルを12ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地中において、5% CO2、37℃で増殖させた。細胞を、200nM アベマシクリブにより、感染前24時間及び再度感染後1時間で、適切な量を培地に加えることにより処理した。XVir-N-31の感染は、血清を含まないRPMI培地 500μl中において行った。SRB染色を感染後5日で行った。モック処理細胞を100% 細胞生存に設定した。
100.000個 SK-N-MC細胞/ウェルを12ウェルプレートに播種し、10% FCSを含有するRPMI培地中において、5% CO2、37℃で増殖させた。細胞を、200nM アベマシクリブにより、感染前24時間及び再度感染後1時間で、適切な量を培地に加えることにより処理した。XVir-N-31の感染は、血清を含まないRPMI培地 500μl中において行った。SRB染色を感染後5日で行った。モック処理細胞を100% 細胞生存に設定した。
結果を図18に示す。
図17(及び図18)に、CDK4/6阻害剤アベマシクリブとWee阻害剤MK-1775との組み合わせにより、E2F1を阻害することなく、G1停止が誘引されたことが実証されている。図18における効力アッセイから、この組み合わせによっては、腫瘍溶解性アデノウイルスXVir-N-31の細胞殺傷効果が増強されないことが示される。これらの結果から、CDK4/6阻害剤アベマシクリブとWee阻害剤MK-1775との組み合わせによる誘引されるG1停止では、XVir-N-31の細胞殺傷能を促進されなかったことが明確に実証されている。このため、E2F1発現の阻害は、ウイルス腫瘍溶解を増強するための更なる必要条件である。
実施例22:E2F1阻害との組み合わせにおけるG1停止はCDK4/6阻害剤との組み合わせにおけるXVir-N-31の細胞殺傷増強の前提条件である
処理後48時間で、細胞をPBS(RNase Aを含有、100U/ml)で2回洗浄した。細胞をトリプシン処理し、1500rpm、4℃で5分間遠心分離した。細胞を、氷冷した80% エタノール 1mlをペレットにゆっくり滴加し、一晩インキュベーションすることにより固定した。染色を、染色溶液(ヨウ化プロピジウム、50μg/ml) 1mlを細胞に加え、穏やかに揺り動かしながらRTで30~60分間インキュベーションすることにより行った。MK:MK-1775;LY:LY-2835219。
処理後48時間で、細胞をPBS(RNase Aを含有、100U/ml)で2回洗浄した。細胞をトリプシン処理し、1500rpm、4℃で5分間遠心分離した。細胞を、氷冷した80% エタノール 1mlをペレットにゆっくり滴加し、一晩インキュベーションすることにより固定した。染色を、染色溶液(ヨウ化プロピジウム、50μg/ml) 1mlを細胞に加え、穏やかに揺り動かしながらRTで30~60分間インキュベーションすることにより行った。MK:MK-1775;LY:LY-2835219。
結果を図19に示す。
図19から明らかなように、SK-M-NC細胞をLY(アベマシクリブ)で処理しても、細胞周期の影響はなかった。MK-1775処置単独では、500nMで、G2/Mにある細胞が増加した。両者の組み合わせにより、強力なG1停止が生じた。
実施例23:ウイルスDNA複製に対するE2F1発現の役割
I.
ウェル当たりに2×105個 T24、A549及びHeLa細胞を6ウェルプレートに播種し、10% FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン及び非必須アミノ酸を含有するRPMI1640培地(又はDMEM培地) 1.5ml中において増殖させた。翌日、30pmol siRNA-陰性対照siRNA(Qiagen #1022076)又はsiE2F1(Sigma #NM_005225、siRNA ID SASI_Hs01_00162220)のいずれかをOpti-MEM培地 150μLで希釈し、リポフェクタミンRNAiMAX 9μlをOpti-MEM 150μL中で調製した。siRNA溶液及びリポフェクタミンRNAiMAX溶液を混合し、5分間インキュベーションした。この混合物を細胞に滴加した。48時間後、RNAを単離し、RT-qPCRを行った。
I.
ウェル当たりに2×105個 T24、A549及びHeLa細胞を6ウェルプレートに播種し、10% FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン及び非必須アミノ酸を含有するRPMI1640培地(又はDMEM培地) 1.5ml中において増殖させた。翌日、30pmol siRNA-陰性対照siRNA(Qiagen #1022076)又はsiE2F1(Sigma #NM_005225、siRNA ID SASI_Hs01_00162220)のいずれかをOpti-MEM培地 150μLで希釈し、リポフェクタミンRNAiMAX 9μlをOpti-MEM 150μL中で調製した。siRNA溶液及びリポフェクタミンRNAiMAX溶液を混合し、5分間インキュベーションした。この混合物を細胞に滴加した。48時間後、RNAを単離し、RT-qPCRを行った。
結果を図20に示す。図20から明らかなように、E2-初期発現は低下する。
II
6ウェルプレートの各ウェルについて、2×105個 T24細胞を、10% FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン及び非必須アミノ酸を含有するRPMI1640培地 1.5mlに播種した。翌日、30pmol siRNA-陰性対照siRNA(Qiagen #1022076)又はsiE2F1(Sigma #NM_005225、siRNA ID SASI_Hs01_00162220)のいずれかをOpti-MEM培地 150μLで希釈し、リポフェクタミンRNAiMAX 9μlをOpti-MEM 150μL中で調製した。siRNA溶液及びリポフェクタミンRNAiMAX溶液を混合し、5分間インキュベーションした。この混合物をT24細胞に滴加した。感染を、血清を含まない培地 400μl中で10MOI ADWTRGDと共に細胞をインキュベーションし、10~15分毎にプレートを揺り動かしながら48時間後に行った。1時間後、完全培地 1.6mlを加えた。RNA分離を感染後24時間で行った。
6ウェルプレートの各ウェルについて、2×105個 T24細胞を、10% FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン及び非必須アミノ酸を含有するRPMI1640培地 1.5mlに播種した。翌日、30pmol siRNA-陰性対照siRNA(Qiagen #1022076)又はsiE2F1(Sigma #NM_005225、siRNA ID SASI_Hs01_00162220)のいずれかをOpti-MEM培地 150μLで希釈し、リポフェクタミンRNAiMAX 9μlをOpti-MEM 150μL中で調製した。siRNA溶液及びリポフェクタミンRNAiMAX溶液を混合し、5分間インキュベーションした。この混合物をT24細胞に滴加した。感染を、血清を含まない培地 400μl中で10MOI ADWTRGDと共に細胞をインキュベーションし、10~15分毎にプレートを揺り動かしながら48時間後に行った。1時間後、完全培地 1.6mlを加えた。RNA分離を感染後24時間で行った。
結果を図21に示す。
III.
細胞を冷PBSですすぎ、MirVanaキット(Thermo Fisherカタログ番号AM1560)からの溶解バッファー 500μlを加えることにより破壊し、ライゼートをスパチュラで収集し、1.5mlチューブにピペットで移した。有機抽出のために、ホモジネート添加剤 50μlを加え、サンプルを氷上で10分間インキュベーションし、酸-フェノール:クロロホルム 500μlを加え、サンプルを60秒間ボルテックスし、氷上で2分間インキュベーションした。サンプルを14000×g、室温で5分間遠心分離して、水相及び有機相を分離した。上相を注意深く新しいチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えた。室温で10分間インキュベーションした後、RNAを沈殿させ(14000×g、4℃、30分)、75% エタノール1mLで2回洗浄した(遠心分離7500×g、4℃、5分)。RNAを5~10分間風乾させ、RNaseを含まない水20~50μlに再懸濁させ、500rpm、55℃で10分間振とうすることにより溶解させ、Nanodropで測定した。1μg RNAサンプルと10×DNAse I反応バッファー 1μl、ヌクレアーゼを含まない水 9μl容量、DNaseI 1μl(1U/μl)とを使用したDNA消化(デオキシリボヌクレアーゼI I, Invitrogen Cat.No.18068-015)後、室温で15分間インキュベーションし、25mM EDTA溶液 1μlを添加し、65℃で10分間加熱ことにより、DNAse Iを不活性化した。逆転写を、高性能cDNA逆転写キット(Thermo Fisher/Applied Biosystems(商標)カタログ番号: 4368814)を使用して行った。繊維PCR及びアクチンPCRのための転写に、ランダムヘキサマーを使用し、E2初期PCRのための転写に、E2初期プライマーを使用した。
細胞を冷PBSですすぎ、MirVanaキット(Thermo Fisherカタログ番号AM1560)からの溶解バッファー 500μlを加えることにより破壊し、ライゼートをスパチュラで収集し、1.5mlチューブにピペットで移した。有機抽出のために、ホモジネート添加剤 50μlを加え、サンプルを氷上で10分間インキュベーションし、酸-フェノール:クロロホルム 500μlを加え、サンプルを60秒間ボルテックスし、氷上で2分間インキュベーションした。サンプルを14000×g、室温で5分間遠心分離して、水相及び有機相を分離した。上相を注意深く新しいチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えた。室温で10分間インキュベーションした後、RNAを沈殿させ(14000×g、4℃、30分)、75% エタノール1mLで2回洗浄した(遠心分離7500×g、4℃、5分)。RNAを5~10分間風乾させ、RNaseを含まない水20~50μlに再懸濁させ、500rpm、55℃で10分間振とうすることにより溶解させ、Nanodropで測定した。1μg RNAサンプルと10×DNAse I反応バッファー 1μl、ヌクレアーゼを含まない水 9μl容量、DNaseI 1μl(1U/μl)とを使用したDNA消化(デオキシリボヌクレアーゼI I, Invitrogen Cat.No.18068-015)後、室温で15分間インキュベーションし、25mM EDTA溶液 1μlを添加し、65℃で10分間加熱ことにより、DNAse Iを不活性化した。逆転写を、高性能cDNA逆転写キット(Thermo Fisher/Applied Biosystems(商標)カタログ番号: 4368814)を使用して行った。繊維PCR及びアクチンPCRのための転写に、ランダムヘキサマーを使用し、E2初期PCRのための転写に、E2初期プライマーを使用した。
RT-qPCRによるE2初期発現の役割を証明するために、適切なプライマーを選択することが絶対的に必要である。プライマーの位置は、E2初期プロモーターとE2後期プロモーターの間にあるべきである。そうでなければ、E2後期プロモーターが、結果に強く影響を及ぼすであろう。プライマーの位置を図22に示す。
図20及び図21から明らかなように、siRNAによるE2F1のダウンレギュレーションにより、E2初期発現の増加が引き起こされる。これは、E2初期発現におけるE2F1のリプレッシブな役割によってのみ説明することができた。E2F1が活性化因子であったとすれば、その結果として、E2初期発現が減少するであろう。加えて、E2F1に対するsiRNAは、CDK4/6阻害剤の効果を模倣し、これも、E2F1発現を阻害する(Yang C et al., Oncogene 2017, 36, 2255-2264)。
実施例24:アデノウイルスE2初期プロモーターに2つのE2F1結合部位の突然変異を有するリコンビナントアデノウイルスはE2初期発現の増加を示す
アデノウイルスE2初期プロモーターの2つのE2F1結合部位に突然変異を有する突然変異アデノウイルスを作製した。野生型E2初期プロモーター及び突然変異体E2初期プロモーターの両プロモーターを図23に示す(配列番号:44、45、46及び47)。
アデノウイルスE2初期プロモーターの2つのE2F1結合部位に突然変異を有する突然変異アデノウイルスを作製した。野生型E2初期プロモーター及び突然変異体E2初期プロモーターの両プロモーターを図23に示す(配列番号:44、45、46及び47)。
RNA-発現分析をAdWT-RGD及びAdE2Fm(RGDモチーフも含む)感染T24細胞において行い、感染後24時間でのRT-qPCRにより得た。AD-WT遺伝子発現を100%に設定した。この方法は、実施例23のセクションIIIに記載されたものと同一であった。
結果を図24に示す。
図24から明らかなように、E2初期遺伝子発現の発現は、AD-WT感染細胞と比較して、AdE2Fm感染細胞においてより高かった。したがって、E2F-1は、E2初期プロモーター活性化においてリプレッシブな役割を果たしていると結論しなければならない。これは、E2F1が活性化因子であると仮定される(DeCaprio JA, Virology. 2009 Feb 20;384(2):274-84)現在の理解とは全く対照的である。
現在知られている全ての腫瘍溶解性アデノウイルスにおけるE2領域の構造は、図22に示されたように構築されることが周知である。このため、E2F1の作用機序は、本明細書中に記載されたのと同一である。結果として、それらの全て、すなわち、ColoAd1及びデルタ-24-RGDを含む全ての腫瘍溶解性アデノウイルスをCDK4/6阻害剤と組み合わせて使用することができる。
ColoAd1を以下のように特徴付けることができる。
Enadenotucirev(以前はColoAd1)は、前臨床活性が実証されている腫瘍選択的キメラアデノウイルスである。ColoAd1のカプシドは、ヒトにおける血清有病率が限られている血清型であるAd11p由来である。EnAdは、多くのがん細胞上に広く発現されているCD46及び/又はデスモグレイン2,6の両方に結合することにより細胞に感染する。EnAdゲノムの大部分は、E3に大きな欠失を有し、E4に小さな欠失を有するAd11pに由来する。加えて、E2B領域は、Ad11p及びAd3からの配列のキメラからなる。EnAdにおけるE4欠失は、E4ORF4にあり、そこで、Ad5は、タンパク質ホスファターゼ2Aを不活性化し、それにより、タンパク質翻訳機構を活性化すると共に、フィードバック阻害ループでE1Aタンパク質の活性をレギュレーションするタンパク質をコードする。おそらく、キメラE2B領域と組み合わせられたこれらの欠失はおそらく、EnAdの顕著ながん選択的複製に寄与する(Deyer et al., Mol Ther Oncolytics. 2017, 16; 5: 62-74)。
デルタ-24-RGD(DNX-2401)を以下のように特徴付けることができる。
デルタ-24-RGD(DNX-2401)は、p16/RB/E2F1経路の異常を有する腫瘍細胞内で優先的に複製し、溶解するように操作された条件複製可能な腫瘍溶解性ウイルスである。Fueyo et al., Oncogene. 2000 Jan 6;19(1):2-12。Rb経路をターゲットとする突然変異体腫瘍溶解性アデノウイルスは、in vivoにおいて抗神経膠腫効果を生じる。Dai B. et al. Mol Cancer Therapy. 2017 Apr;16(4):662-670。
実施例25:XVir-N-31、CDK4/6阻害剤であるパルボシクリブ及びPARP阻害剤であるタラゾパリブを含む3剤併用療法並びにT24細胞及びUMUC-3細胞のFACS分析
効力アッセイ/SRB染色
ウイルス誘引細胞殺傷単独での効果並びに小分子阻害剤であるパルボシクリブ及びタラゾパリブとの併用での効果を12ウェルプレートにおいて分析した。そのために、12.5×103個 T24細胞又は6.3×103個 UMUC-3/253J細胞を播種し、24時間後、XVir-N-31の濃度(感染多重度、MOI)を上昇させながら感染させた。示された小分子阻害剤との併用処理のために、細胞を、各濃度のタラゾパリブ、パルボシクリブ又は両薬剤の組み合わせで、感染前24時間及び感染後1時間(hpi)で処理した。細胞を、ウシ胎児血清(FBS)を含まない培地 200μl中において、示されたウイルスにより、トリプリケートで感染させた。1hpiで、小分子阻害剤を含む又は含まない完全培地を細胞に加えた。感染後4日(dpi)(T24)又は5日(dpi)(UMUC-3/253J)で、細胞を10% トリクロロ酢酸(TCA)で、4℃において1時間固定し、スルホローダミンB(SRB)で、室温において30分間染色し、続けて、1% 酢酸で洗浄して、過剰のSRBを除去した。乾燥させたSRBを10mM トリス塩基に溶解させ、定量を、マルチラベルプレートリーダー(PerkinElmer Victor X3)を使用する562nmでの測光測定により行った。
効力アッセイ/SRB染色
ウイルス誘引細胞殺傷単独での効果並びに小分子阻害剤であるパルボシクリブ及びタラゾパリブとの併用での効果を12ウェルプレートにおいて分析した。そのために、12.5×103個 T24細胞又は6.3×103個 UMUC-3/253J細胞を播種し、24時間後、XVir-N-31の濃度(感染多重度、MOI)を上昇させながら感染させた。示された小分子阻害剤との併用処理のために、細胞を、各濃度のタラゾパリブ、パルボシクリブ又は両薬剤の組み合わせで、感染前24時間及び感染後1時間(hpi)で処理した。細胞を、ウシ胎児血清(FBS)を含まない培地 200μl中において、示されたウイルスにより、トリプリケートで感染させた。1hpiで、小分子阻害剤を含む又は含まない完全培地を細胞に加えた。感染後4日(dpi)(T24)又は5日(dpi)(UMUC-3/253J)で、細胞を10% トリクロロ酢酸(TCA)で、4℃において1時間固定し、スルホローダミンB(SRB)で、室温において30分間染色し、続けて、1% 酢酸で洗浄して、過剰のSRBを除去した。乾燥させたSRBを10mM トリス塩基に溶解させ、定量を、マルチラベルプレートリーダー(PerkinElmer Victor X3)を使用する562nmでの測光測定により行った。
結果を図35、図36及び図37に示す。
FACS分析
示された濃度で適用された小分子阻害剤の、膀胱がん細胞株であるT24細胞及びUMUC-3細胞周期に対する影響をDNA染色後にフローサイトメトリー分析により分析した。5×104個 細胞を6ウェルプレートに播種し、24時間後、適切な阻害剤で処理した。2日後、約80%コンフルエントで、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、再度洗浄し、氷冷80% エタノールで固定した。細胞周期分析のために、サンプルをDNA挿入色素である7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)と共にインキュベーションし、FACS分析により測定した。測定データの評価をソフトウェアFlowJoにより行った。
示された濃度で適用された小分子阻害剤の、膀胱がん細胞株であるT24細胞及びUMUC-3細胞周期に対する影響をDNA染色後にフローサイトメトリー分析により分析した。5×104個 細胞を6ウェルプレートに播種し、24時間後、適切な阻害剤で処理した。2日後、約80%コンフルエントで、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、再度洗浄し、氷冷80% エタノールで固定した。細胞周期分析のために、サンプルをDNA挿入色素である7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)と共にインキュベーションし、FACS分析により測定した。測定データの評価をソフトウェアFlowJoにより行った。
結果を図38に示す。
図35、図36及び図37に示された結果から、パルボシクリブ、タラゾパリブ及びXVir-N-31からなる3剤併用療法が単剤療法又は併用療法と比較して、細胞殺傷に関して優れた性能を示すことが明確に実証されている。
図38に示された処理膀胱細胞T24及びUMUC-3のFACS分析から、ウイルス複製の増加に必要なG1停止は、PARP阻害剤であるタラゾパリブの添加によっては影響を受けないことが示される。
実施例26:XVir-N-31、CDK4/6阻害剤であるパルボシクリブ及びブロモドメイン阻害剤であるJQ-1を含む3剤併用療法
効力アッセイ
ウイルス単独及び小分子阻害剤との併用でのウイルス誘引細胞殺傷の効果を12ウェルプレートにおいて分析した。そのために、2×104個 細胞(Cal-33)を播種し、24時間後、細胞当たりに5感染ウイルス粒子(感染多重度、MOI)のXVir-N-31を感染させた。示された小分子阻害剤との併用処理のために、細胞を、100nM パルボシクリブ、100nM JQ-1又は両薬剤の組み合わせで、感染前24時間及び感染後1時間(hpi)で処理した。細胞を、FBSを含まない培地 200μl中において、示されたウイルスにより、トリプリケートで感染させた。1hpiで、小分子阻害剤を含む又は含まない完全培地を細胞に加えた。感染後(dpi)4日で、細胞を10% トリクロロ酢酸(TCA)で、4℃において1時間固定し、スルホローダミンB(SRB)で、室温において30分間染色し、続けて、1% 酢酸で洗浄して、過剰のSRBを除去した。乾燥させたSRBを10mM トリス塩基に溶解させ、定量を、マルチラベルプレートリーダー(PerkinElmer Victor X3)を使用する562nmでの測光測定により行った。
効力アッセイ
ウイルス単独及び小分子阻害剤との併用でのウイルス誘引細胞殺傷の効果を12ウェルプレートにおいて分析した。そのために、2×104個 細胞(Cal-33)を播種し、24時間後、細胞当たりに5感染ウイルス粒子(感染多重度、MOI)のXVir-N-31を感染させた。示された小分子阻害剤との併用処理のために、細胞を、100nM パルボシクリブ、100nM JQ-1又は両薬剤の組み合わせで、感染前24時間及び感染後1時間(hpi)で処理した。細胞を、FBSを含まない培地 200μl中において、示されたウイルスにより、トリプリケートで感染させた。1hpiで、小分子阻害剤を含む又は含まない完全培地を細胞に加えた。感染後(dpi)4日で、細胞を10% トリクロロ酢酸(TCA)で、4℃において1時間固定し、スルホローダミンB(SRB)で、室温において30分間染色し、続けて、1% 酢酸で洗浄して、過剰のSRBを除去した。乾燥させたSRBを10mM トリス塩基に溶解させ、定量を、マルチラベルプレートリーダー(PerkinElmer Victor X3)を使用する562nmでの測光測定により行った。
アデノウイルス複製のアッセイ
繊維qPCR
DNA単離
DNAの精製のために、培地を吸引し、溶解バッファー 200μlをウェルに加えた。プロテイナーゼKをこの溶液に加えた後、56℃で10分間インキュベーションした。フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール 200μlをウイルス細胞ライゼートに加えた。ボルテックスし、続けて、氷上で5分間インキュベーションした後、相分離を16430g、4℃で3分間遠心分離することにより達成した。相のより良好な可視化のために、上部水相を、10mM トリスCl中のクロロホルム 200μl及びクレゾールレッド 20μlを含む新しいスナップキャップに移した。ボルテックスし、氷上で5分間インキュベーションした後、遠心分離を16430g、4℃で3分間行った。再度、上部水相をエタノール 800μl及び3M 酢酸ナトリウム溶液 50μlと合わせた。より良好な沈殿を達成するために、グリコーゲン溶液 2μlを加えた。チューブを短く転倒させた後、この溶液を16430g、4℃で30分間遠心分離した。続けて、DNAペレットを70% エタノール 400μlで覆い、室温で10分間インキュベーションした。4760g、室温で7分間遠心分離した後、DNAペレットを37℃で約5~10分間乾燥させた。続けて、ペレットを0.1×TEバッファー 100μl中に溶解させ、40℃、400rpmで約3時間振とうした。DNAが、完全に溶解した時点で、DNA濃度を測定用DNA溶液 2μl及びブランク溶液として0.1×TEバッファーを使用する分光光度計により測定した。ついで、DNAを4℃で保存した。
繊維qPCR
DNA単離
DNAの精製のために、培地を吸引し、溶解バッファー 200μlをウェルに加えた。プロテイナーゼKをこの溶液に加えた後、56℃で10分間インキュベーションした。フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール 200μlをウイルス細胞ライゼートに加えた。ボルテックスし、続けて、氷上で5分間インキュベーションした後、相分離を16430g、4℃で3分間遠心分離することにより達成した。相のより良好な可視化のために、上部水相を、10mM トリスCl中のクロロホルム 200μl及びクレゾールレッド 20μlを含む新しいスナップキャップに移した。ボルテックスし、氷上で5分間インキュベーションした後、遠心分離を16430g、4℃で3分間行った。再度、上部水相をエタノール 800μl及び3M 酢酸ナトリウム溶液 50μlと合わせた。より良好な沈殿を達成するために、グリコーゲン溶液 2μlを加えた。チューブを短く転倒させた後、この溶液を16430g、4℃で30分間遠心分離した。続けて、DNAペレットを70% エタノール 400μlで覆い、室温で10分間インキュベーションした。4760g、室温で7分間遠心分離した後、DNAペレットを37℃で約5~10分間乾燥させた。続けて、ペレットを0.1×TEバッファー 100μl中に溶解させ、40℃、400rpmで約3時間振とうした。DNAが、完全に溶解した時点で、DNA濃度を測定用DNA溶液 2μl及びブランク溶液として0.1×TEバッファーを使用する分光光度計により測定した。ついで、DNAを4℃で保存した。
リアルタイムPCR
ウイルス複製をアデノウイルス特異的繊維定量PCR(qPCR)により分析した。ΔΔCT法を使用して、XVir-N-31の複製を、細胞へのウイルスの侵入レベル(4hpi値)に関連して、細胞当たりのウイルスDNAコピー(細胞β-アクチンに対して正規化)から計算した。Cal-33細胞を6ウェルプレートに播種し(ウェル当たりに1.5×105個)、示された阻害剤で24時間前処理した。翌日、細胞を、FBSを含まない培地 400μl中の10MOI XVir-N-31に感染させた。1hpiで、小分子阻害剤を含む又は含まない完全培地を細胞に加えた。DNA抽出のために、細胞を4、24及び48hpiで回収した。ついで、DNAを、フェノールクロロホルム抽出法を使用して単離した。対照サンプル(追加の小分子阻害剤を含まない10MOI XVir-N-31)のqPCRにより決定された値の倍 変化を1.0に設定し、更なるサンプルの倍 変化をそれらに対してプロットした。定量的PCRを、下記サイクル条件:95℃で2分間及び94℃で15秒間、60℃で15秒間、72℃で15秒間を45サイクルで、SYBR Green Mastermix(Eurogentec)を使用して、96ウェルプレートにおいて行った。遺伝子発現を、ΔΔCT法を使用して計算した。
ウイルス複製をアデノウイルス特異的繊維定量PCR(qPCR)により分析した。ΔΔCT法を使用して、XVir-N-31の複製を、細胞へのウイルスの侵入レベル(4hpi値)に関連して、細胞当たりのウイルスDNAコピー(細胞β-アクチンに対して正規化)から計算した。Cal-33細胞を6ウェルプレートに播種し(ウェル当たりに1.5×105個)、示された阻害剤で24時間前処理した。翌日、細胞を、FBSを含まない培地 400μl中の10MOI XVir-N-31に感染させた。1hpiで、小分子阻害剤を含む又は含まない完全培地を細胞に加えた。DNA抽出のために、細胞を4、24及び48hpiで回収した。ついで、DNAを、フェノールクロロホルム抽出法を使用して単離した。対照サンプル(追加の小分子阻害剤を含まない10MOI XVir-N-31)のqPCRにより決定された値の倍 変化を1.0に設定し、更なるサンプルの倍 変化をそれらに対してプロットした。定量的PCRを、下記サイクル条件:95℃で2分間及び94℃で15秒間、60℃で15秒間、72℃で15秒間を45サイクルで、SYBR Green Mastermix(Eurogentec)を使用して、96ウェルプレートにおいて行った。遺伝子発現を、ΔΔCT法を使用して計算した。
A673細胞(ATCC CRL 1598):ユーイング肉腫細胞株は1973年に確立された。Martinez-Ramirez et al. 2003. Characterization of the A673 cell line (Ewing tumor) by molecular cytogenetic techniques. Cancer Genet Cytogenet. Mar;141(2):138-42。
Cal-33細胞:舌扁平上皮がんである。CAL33は、治療剤の試験のために広く使用されている頭頸部扁平上皮がん(HNSCC)細胞株である。
結果
5、10及び20のMOIでのXvir-N-31単独、CDK4/6阻害剤であるアベマシクリブとの組み合わせ、ブロモドメイン阻害剤であるJQ-1との組み合わせ又はCDK4/6阻害剤であるアベマシクリブ及びブロモドメイン阻害剤であるJQ-1との組み合わせを使用したユーイング肉腫細胞株A673についての効力アッセイの結果を図39に示す。
5、10及び20のMOIでのXvir-N-31単独、CDK4/6阻害剤であるアベマシクリブとの組み合わせ、ブロモドメイン阻害剤であるJQ-1との組み合わせ又はCDK4/6阻害剤であるアベマシクリブ及びブロモドメイン阻害剤であるJQ-1との組み合わせを使用したユーイング肉腫細胞株A673についての効力アッセイの結果を図39に示す。
頭頸部扁平上皮がん(HNSCC)細胞であるCal33についての効力アッセイの結果を図40及び図41に示す。
QPCRを、下記処理条件下でのウイルス複製を分析するために行った:XVir-N-31 MOI:10;100nM パルボシクリブ、100nM JQ-1;細胞株:Cal-33;感染後24時間及び感染後48時間での分析。感染をJQ-1、パルボシクリブ又はその両方(併用)での処置後24時間で、10MOI XVir-N-31により行った。4、24及び48時間後、DNAを単離し、ウイルス複製を測定するためのリアルタイムPCRを行った。得られた結果をβ-アクチン及び4時間値に対し正規化した。
結果を図42A及び図42Bに示す。全ての細胞株において、3剤併用療法は、単剤療法又はいずれかの2剤併用療法、すなわち、XVir-N-31+CDK4/6阻害剤;XVir-N-31+ブロモドメイン阻害剤;及びCDK4/6阻害剤+ブロモドメイン阻害剤より優れていた。
実施例27:XVir-N-31、CDK4/6阻害剤であるパルボシクリブ並びにヌトリン及びヌトリン誘導体を含む3剤併用療法
実施例27.1 方法及び材料
効力アッセイ/SRB染色
XVir-N-31単独及び小分子阻害剤との組み合わせを使用する細胞殺傷を12ウェルプレートにおいて分析した。そのために、20000個 T24細胞又は25000個 UMUC-3細胞を播種し、24時間後、XVir-N-31の濃度(感染多重度、MOI)を上昇させながら感染させた。示された小分子阻害剤との併用処理のために、細胞を各濃度のヌトリン-3a又はイダサヌトリン、パルボシクリブ及び両薬剤の組み合わせで、感染前24時間で処理した。細胞を、FBSを含まない培地 250μl中において、示されたウイルスにより、トリプリケートで感染させた。1hpiで、パルボシクリブを含む完全培地をパルボシクリブで前処理された細胞に加えた。対照及びヌトリン処理細胞に、阻害剤を含まない完全培地を加えた。感染後4日(dpi)で、細胞を10% トリクロロ酢酸(TCA)で、4℃において1時間固定し、1% 酢酸中の0.05% スルホローダミンB(SRB)で、室温において少なくとも30分間染色し、続けて、1% 酢酸で洗浄して、過剰のSRBを除去した。プレートの写真を撮った後、乾燥させたSRBを10mM トリス塩基に溶解させ、定量を、マルチラベルプレートリーダー(PerkinElmer Victor X3)を使用する562nmでの測光測定により行った。
実施例27.1 方法及び材料
効力アッセイ/SRB染色
XVir-N-31単独及び小分子阻害剤との組み合わせを使用する細胞殺傷を12ウェルプレートにおいて分析した。そのために、20000個 T24細胞又は25000個 UMUC-3細胞を播種し、24時間後、XVir-N-31の濃度(感染多重度、MOI)を上昇させながら感染させた。示された小分子阻害剤との併用処理のために、細胞を各濃度のヌトリン-3a又はイダサヌトリン、パルボシクリブ及び両薬剤の組み合わせで、感染前24時間で処理した。細胞を、FBSを含まない培地 250μl中において、示されたウイルスにより、トリプリケートで感染させた。1hpiで、パルボシクリブを含む完全培地をパルボシクリブで前処理された細胞に加えた。対照及びヌトリン処理細胞に、阻害剤を含まない完全培地を加えた。感染後4日(dpi)で、細胞を10% トリクロロ酢酸(TCA)で、4℃において1時間固定し、1% 酢酸中の0.05% スルホローダミンB(SRB)で、室温において少なくとも30分間染色し、続けて、1% 酢酸で洗浄して、過剰のSRBを除去した。プレートの写真を撮った後、乾燥させたSRBを10mM トリス塩基に溶解させ、定量を、マルチラベルプレートリーダー(PerkinElmer Victor X3)を使用する562nmでの測光測定により行った。
FACS分析
膀胱がん細胞株であるT24、T24shRb、UMUC-3及びRT112の細胞周期に対する示された濃度で適用された小分子阻害剤の影響をDNA染色後にフローサイトメトリー分析により分析した。そのために、5×104個 細胞を6ウェルプレートに播種し、24時間後、適切な阻害剤で処理した。2日後、約80%コンフルエントで、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、再度洗浄し、氷冷80% エタノールで固定した。細胞周期分析のために、サンプルをヨウ化プロポジウム(PI)と共にインキュベーションし、FACS分析により測定した。測定データの評価をソフトウェアFlowJoにより行った。
膀胱がん細胞株であるT24、T24shRb、UMUC-3及びRT112の細胞周期に対する示された濃度で適用された小分子阻害剤の影響をDNA染色後にフローサイトメトリー分析により分析した。そのために、5×104個 細胞を6ウェルプレートに播種し、24時間後、適切な阻害剤で処理した。2日後、約80%コンフルエントで、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、再度洗浄し、氷冷80% エタノールで固定した。細胞周期分析のために、サンプルをヨウ化プロポジウム(PI)と共にインキュベーションし、FACS分析により測定した。測定データの評価をソフトウェアFlowJoにより行った。
アデノウイルス複製
繊維qPCR
DNA単離
DNAの精製のために、培地を吸引し、溶解バッファー 200μlをウェルに加えた。プロテイナーゼKをこの溶液に加えた後、56℃で10分間インキュベーションした。フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール 200μlをウイルス細胞ライゼートに加えた。ボルテックスし、続けて、氷上で5分間インキュベーションした後、相分離を16430g、4℃で3分間遠心分離することにより達成した。相のより良好な可視化のために、上部水相を、10mM トリスCl中のクロロホルム 200μl及びクレゾールレッド 20μlを含む新しいスナップキャップに移した。ボルテックスし、氷上で5分間インキュベーションした後、遠心分離を16430g、4℃で3分間行った。再度、上部水相をエタノール 800μl及び3M 酢酸ナトリウム溶液 50μlと合わせた。より良好な沈殿を達成するために、グリコーゲン溶液 2μlを加えた。チューブを短く転倒させた後、この溶液を16430g、4℃で30分間遠心分離した。続けて、DNAペレットを70% エタノール 400μlで覆い、室温で10分間インキュベーションした。4760g、室温で7分間遠心分離した後、DNAペレットを37℃で約5~10分間乾燥させた。続けて、ペレットを0.1×TEバッファー 100μl中に溶解させ、40℃、400rpmで約3時間振とうした。DNAが、完全に溶解した時点で、DNA濃度を測定用DNA溶液 2μl及びブランク溶液として0.1×TEバッファーを使用する分光光度計により測定した。ついで、DNAを4℃で保存した。
繊維qPCR
DNA単離
DNAの精製のために、培地を吸引し、溶解バッファー 200μlをウェルに加えた。プロテイナーゼKをこの溶液に加えた後、56℃で10分間インキュベーションした。フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール 200μlをウイルス細胞ライゼートに加えた。ボルテックスし、続けて、氷上で5分間インキュベーションした後、相分離を16430g、4℃で3分間遠心分離することにより達成した。相のより良好な可視化のために、上部水相を、10mM トリスCl中のクロロホルム 200μl及びクレゾールレッド 20μlを含む新しいスナップキャップに移した。ボルテックスし、氷上で5分間インキュベーションした後、遠心分離を16430g、4℃で3分間行った。再度、上部水相をエタノール 800μl及び3M 酢酸ナトリウム溶液 50μlと合わせた。より良好な沈殿を達成するために、グリコーゲン溶液 2μlを加えた。チューブを短く転倒させた後、この溶液を16430g、4℃で30分間遠心分離した。続けて、DNAペレットを70% エタノール 400μlで覆い、室温で10分間インキュベーションした。4760g、室温で7分間遠心分離した後、DNAペレットを37℃で約5~10分間乾燥させた。続けて、ペレットを0.1×TEバッファー 100μl中に溶解させ、40℃、400rpmで約3時間振とうした。DNAが、完全に溶解した時点で、DNA濃度を測定用DNA溶液 2μl及びブランク溶液として0.1×TEバッファーを使用する分光光度計により測定した。ついで、DNAを4℃で保存した。
リアルタイムPCR
ウイルス複製をアデノウイルス特異的繊維定量PCR(qPCR)により分析した。ΔΔCT法を使用して、XVir-N-31の複製を、細胞へのウイルスの侵入レベル(4hpi値)に関連して、細胞当たりのウイルスDNAコピー(細胞β-アクチンに対して正規化)から計算した。T24細胞及びT24shRb細胞を6ウェルプレートに播種し(ウェル当たりに5×105個)、示された阻害剤で24時間前処理した。翌日、細胞を、FBSを含まない培地 400μl中の20MOI XVir-N-31に感染させた。1hpiで、パルボシクリブを含む完全培地をパルボシクリブで予め前処理された細胞に加えた。対照及びヌトリンにより処理された細胞に、阻害剤を含まない完全培地を加えた。DNA抽出のために、細胞を4及び48hpiで回収した。ついで、DNAを、フェノールクロロホルム抽出法を使用して単離した。対照サンプル(追加の小分子阻害剤を含まない20MOI XVir-N-31)のqPCRにより決定された値の倍 変化を1.0に設定し、更なるサンプルの倍 変化をそれらに対してプロットした。定量的PCRを、下記サイクル条件:95℃で2分間及び94℃で15秒間、60℃で15秒間、72℃で15秒間を45サイクルで、SYBR Green Mastermix(Eurogentec)を使用して、96ウェルプレートにおいて行った。遺伝子発現を、ΔΔCT法を使用して計算した。
ウイルス複製をアデノウイルス特異的繊維定量PCR(qPCR)により分析した。ΔΔCT法を使用して、XVir-N-31の複製を、細胞へのウイルスの侵入レベル(4hpi値)に関連して、細胞当たりのウイルスDNAコピー(細胞β-アクチンに対して正規化)から計算した。T24細胞及びT24shRb細胞を6ウェルプレートに播種し(ウェル当たりに5×105個)、示された阻害剤で24時間前処理した。翌日、細胞を、FBSを含まない培地 400μl中の20MOI XVir-N-31に感染させた。1hpiで、パルボシクリブを含む完全培地をパルボシクリブで予め前処理された細胞に加えた。対照及びヌトリンにより処理された細胞に、阻害剤を含まない完全培地を加えた。DNA抽出のために、細胞を4及び48hpiで回収した。ついで、DNAを、フェノールクロロホルム抽出法を使用して単離した。対照サンプル(追加の小分子阻害剤を含まない20MOI XVir-N-31)のqPCRにより決定された値の倍 変化を1.0に設定し、更なるサンプルの倍 変化をそれらに対してプロットした。定量的PCRを、下記サイクル条件:95℃で2分間及び94℃で15秒間、60℃で15秒間、72℃で15秒間を45サイクルで、SYBR Green Mastermix(Eurogentec)を使用して、96ウェルプレートにおいて行った。遺伝子発現を、ΔΔCT法を使用して計算した。
実施例27.2 T24細胞に対するXVir-N-31、ヌトリン-3a及びパルボシクリブを含む3剤併用療法
XVir-N-31単独、XVir-N-31とヌトリン-3a、XVir-N-31とパルボシクリブ並びにXVir-N-31とヌトリン-3a及びパルボシクリブの両方の細胞殺傷効果を決定するために、T24細胞を使用した効力アッセイを行った。
XVir-N-31単独、XVir-N-31とヌトリン-3a、XVir-N-31とパルボシクリブ並びにXVir-N-31とヌトリン-3a及びパルボシクリブの両方の細胞殺傷効果を決定するために、T24細胞を使用した効力アッセイを行った。
結果を図44及び図45に示す。
図44及び図45から明らかなように、T24細胞をパルボシクリブで前処理すると、XVir-N-31による細胞殺傷が増加した。パルボシクリブとヌトリン-3aとの併用療法により、この効果が増強された。また、ヌトリン-3a処理により、XVir-N-31及びパルボシクリブの併用について観察された細胞殺傷が増強された。
実施例27.3 T24shRB細胞に対するXVir-N-31、ヌトリン-3a及びパルボシクリブを含む3剤併用療法
実施例27.2の条件と同じ効力アッセイを、T24shRB細胞を使用して行った。T24shRB細胞は、Rbを発現しないT24細胞である。このようなRb発現欠損をレンチウイルストランスフェクションにより発生させた。ここで、レンチウイルスは、Rbを対象としたshRNAをコードした。使用されたレンチウイルスベクターは、pLKO-RB1-shRNA19(Addgene, Watertown, MA 02472, USAから入手)であり、shRNAの配列は、以下のCAGAGATCGTGTATTGAGATTCTCGAGAATCTCAATACACGATCTCTG(配列番号:39)であった。また、手順は、Michaud K et al.(Cancer Res. 2010 Apr 15. 70(8):3228-38)にも記載されている。
実施例27.2の条件と同じ効力アッセイを、T24shRB細胞を使用して行った。T24shRB細胞は、Rbを発現しないT24細胞である。このようなRb発現欠損をレンチウイルストランスフェクションにより発生させた。ここで、レンチウイルスは、Rbを対象としたshRNAをコードした。使用されたレンチウイルスベクターは、pLKO-RB1-shRNA19(Addgene, Watertown, MA 02472, USAから入手)であり、shRNAの配列は、以下のCAGAGATCGTGTATTGAGATTCTCGAGAATCTCAATACACGATCTCTG(配列番号:39)であった。また、手順は、Michaud K et al.(Cancer Res. 2010 Apr 15. 70(8):3228-38)にも記載されている。
結果を図46及び図47に示す。
図46及び図47から明らかなように、ヌトリン-3a又はパルボシクリブ単独での処理は、XVir-N-31によるRb陰性細胞(T24shRb)の殺傷において有効ではなかった。パルボシクリブとヌトリン-3aとの併用のみが、XVir-N-31媒介性細胞殺傷の増加を示した。そのため、ヌトリン-3aにより、Rb陰性細胞に対して処理されたXVir-N-31及びパルボシクリブを使用した2剤併用療法の腫瘍溶解効果が増強された。
実施例27.4 T24細胞及びT24shRb細胞に対するXVir-N-31、イダサヌトリン及びパルボシクリブを含む3剤併用療法
XVir-N-31、XVir-N-31とイダサヌトリン、XVir-N-31とパルボシクリブ並びにXVir-N-31とイダサヌトリン及びパルボシクリブの細胞殺傷効果を決定するために、T24細胞を使用した効力アッセイを行った。
XVir-N-31、XVir-N-31とイダサヌトリン、XVir-N-31とパルボシクリブ並びにXVir-N-31とイダサヌトリン及びパルボシクリブの細胞殺傷効果を決定するために、T24細胞を使用した効力アッセイを行った。
結果を図48及び図49に示す。
XVir-N-31、XVir-N-31とイダサヌトリン、XVir-N-31とパルボシクリブ並びにXVir-N-31とイダサヌトリン及びパルボシクリブの細胞殺傷効果を決定するために、T24shRb細胞を使用した同様の効力アッセイを行った。
結果を図50及び図51に示す。
図48~図51から明らかなように、イダサヌトリンは、XVir-N-31及びCDK4/6阻害剤を使用した3剤併用療法において、ヌトリン-3aと同様の効果を有した。
実施例27.5 実施例27.2~27.4に従った条件下でのXVir-N-31の複製の評価
T24shRb細胞及びT24細胞におけるXVir-N-31の複製を、ΔΔCT法を使用してウイルスDNAを測定することにより評価した。
T24shRb細胞及びT24細胞におけるXVir-N-31の複製を、ΔΔCT法を使用してウイルスDNAを測定することにより評価した。
実験の設定を以下のとおりとした。
ウイルス複製を24時間及び48時間後に測定した。感染をヌトリン-3a、パルボシクリブ又はその両方(併用)での処理後24時間で、20MOI XVir-N-31により行った。4時間及び48時間後、DNAを単離し、リアルタイムPCRを、ウイルス複製を測定するため行った。得られた結果をΔΔCT法に従って、β-アクチン及び4時間値に対して正規化した。
結果を図52に示す。
図52から明らかなように、ヌトリン-3aは、パルボシクリブとの併用でウイルスDNAの増加を示した。相対的な繊維DNAは、パルボシクリブ処理T24細胞において既に高かったが、ヌトリン-3aとの併用は、未処理対照よりほぼ10倍高い値を示した。Rb陰性T24shRb細胞では、ヌトリン-3a、パルボシクリブ及びXVir-N-31を併用した場合にのみ効果が生じた。ここでは、パルボシクリブ単独では、対照と比較して、ウイルスDNAへの影響はそれほど顕著ではなかった。
ウェスタンブロット分析をヌトリン-3a(5μM、10μM又は30μM)、パルボシクリブ(500μM)又は両方(併用)で処理されたT24shRb細胞に対して行った。結果を図53に示す。
パルボシクリブ及び/又はヌトリン-3a(ヌトリン-3a(5μM、10μM又は30μM)、パルボシクリブ(500μM)又はその両方(併用)による処理後の図53に示されたE2F1タンパク質レベルを図54に示す。未処理細胞のE2F1タンパク質レベルを「1」に設定した。
図53及び図54から明らかなように、30μM ヌトリン-3a及び500nM パルボシクリブとの併用処理により、単剤療法と比較して、E2F1の相対量が減少した。
実施例27.6 実施例27.5の処理により得られた細胞のFACS分析
実施例27.5に概説されたように処理された細胞をFACS分析に供した。さらに、UMUC細胞及びRT112細胞を実施例27.5に記載されたのと同じ処理計画に供した。
実施例27.5に概説されたように処理された細胞をFACS分析に供した。さらに、UMUC細胞及びRT112細胞を実施例27.5に記載されたのと同じ処理計画に供した。
結果をT24細胞について図55(A)、T24shRb細胞について図55(B)、UMUC-3細胞について図55(C)及びRT112細胞について図55(D)に示す。
G1にある細胞(%)に焦点を当てた図55(A)~(D)に示された結果の更なる分析の結果をT24細胞について図56(A)、T24shRb細胞について図56(B)、UNUC-3細胞について図56(C)及びRT112細胞について図56(D)に示す。
前記図55(A)~(D)及び図56(A)~(D)から明らかなように。全ての細胞株におけるG0/G1停止に対する効果は、ヌトリン-3a及びパルボシクリブを併用処理した場合に、最も顕著であった。
実施例28:処理膠芽腫におけるブロモドメイン阻害剤であるJQ1及びXVir-N-31を含む併用療法
2×104個 細胞(U87細胞、LN229細胞又はT98G細胞)を12ウェルプレートにおいて、DMEM培地中に播種し、翌日、阻害剤処理した。播種後48時間で、細胞をXVir-N-31に感染させた。4日後、細胞を、10% TCAを使用して固定した。プレートを、0.1% SRB溶液を使用して染色した。過剰分を除去し、プレートを1% 酢酸で洗浄した。酢酸を除去した後、プレートを一晩風乾させた。SRBを10mM トリス塩基溶液 1mlに溶解させ、1:10希釈を、560nmでの光度計を使用して測定した。
2×104個 細胞(U87細胞、LN229細胞又はT98G細胞)を12ウェルプレートにおいて、DMEM培地中に播種し、翌日、阻害剤処理した。播種後48時間で、細胞をXVir-N-31に感染させた。4日後、細胞を、10% TCAを使用して固定した。プレートを、0.1% SRB溶液を使用して染色した。過剰分を除去し、プレートを1% 酢酸で洗浄した。酢酸を除去した後、プレートを一晩風乾させた。SRBを10mM トリス塩基溶液 1mlに溶解させ、1:10希釈を、560nmでの光度計を使用して測定した。
結果を図57、図58及び図59に示す。
図57、図58及び図59から明らかなように、JQ1とXVir-N-31との併用により、強力に増強された細胞殺傷がもたらされる。CDK4/6阻害剤であるLEE011を使用すると、細胞殺傷を3つ全ての神経膠芽腫細胞株において、さらに増加させることができた。
実施例29:JQ1とリボシクリブとの併用暴露によるXVir-N-31の複製
1×105個 細胞を6ウェルプレートにおいて、DMEM培地中に播種した。翌日、細胞を500nM LEE011及び50nM JQ1で処理した。翌朝、細胞をU87及びLN229について20MOIで並びにT98Gについて50MOIでそれぞれ感染させた。感染後1時間で、阻害剤を含有するDMEM培地を細胞に加えた。各時点(4、24、48時間)後、細胞をPBSで1回洗浄し、SDS DNA溶解バッファー 200μlを加えた。細胞をプロテイナーゼKと共に1時間インキュベーションし、その後、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール精製を行った。DNAを1×TEバッファーで希釈し、DNA濃度を、Nanodropを使用して決定した。各サンプルについて、10ng/μlの溶液を調製し、50ng DNA及びGoTaq Master mixを使用するRT-qPCRを行った。特異的な繊維フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用し、Δct値の計算のために、特異的なアクチンプライマーも使用した。各サンプルについて、3つの繊維値及び2つのアクチン値を測定した。計算をエクセルで行い、各24時間及び48時間をその4時間値(複製前の初期ウイルス侵入)に基づいて計算した。
1×105個 細胞を6ウェルプレートにおいて、DMEM培地中に播種した。翌日、細胞を500nM LEE011及び50nM JQ1で処理した。翌朝、細胞をU87及びLN229について20MOIで並びにT98Gについて50MOIでそれぞれ感染させた。感染後1時間で、阻害剤を含有するDMEM培地を細胞に加えた。各時点(4、24、48時間)後、細胞をPBSで1回洗浄し、SDS DNA溶解バッファー 200μlを加えた。細胞をプロテイナーゼKと共に1時間インキュベーションし、その後、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール精製を行った。DNAを1×TEバッファーで希釈し、DNA濃度を、Nanodropを使用して決定した。各サンプルについて、10ng/μlの溶液を調製し、50ng DNA及びGoTaq Master mixを使用するRT-qPCRを行った。特異的な繊維フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用し、Δct値の計算のために、特異的なアクチンプライマーも使用した。各サンプルについて、3つの繊維値及び2つのアクチン値を測定した。計算をエクセルで行い、各24時間及び48時間をその4時間値(複製前の初期ウイルス侵入)に基づいて計算した。
結果を図60、図61及び図62に示す。
図60、図61及び図62から明らかなように、XVir-N-31は、JQ1に曝露された場合、複製の高い増加を示した。2つの細胞株において、この効果は、CDK4/6阻害剤であるLEE011(LEE)の使用と比較してはるかに高かった。3つの全ての細胞株において、ウイルス複製の増加は、JQ1及びLEE011(LEE)の両方が併用された場合に最も高かった。
実施例30:XVir-N-31感染がん細胞のウェスタンブロット分析
2.5×105個 LN229細胞を10cmのプレートにおいて、DMEM培地中に播種した。翌日、細胞を500nM LEE011及び200nM JQ1又は両方の併用で処理した。翌朝、細胞を20MOIでXVir-N-31に感染させた。感染後1時間で、阻害剤を含有するDMEM培地を細胞に加えた。各時点(24、48、72時間)後、細胞を氷上に置き、氷冷PBSで2回洗浄し、SDSタンパク質溶解バッファー 300μlを加えた。細胞を反応チューブに移し、DNAを注射器及び針で剪断し、遠心分離後の更なる使用のために、上清を移した。タンパク質濃度をBCAアッセイで測定し、4×Lammli:DTT 6:1及び20μgの濃度を有するサンプルを調製し、10% SDSゲルに移した。ゲル電気泳動を90Vで開始し、ラダーが分離し始めた後、150Vに上昇させた。ゲル上のタンパク質を100Vで2時間メンブランにブロットし、TBS-T中の5% ミルク中において、RTで1時間ブロッキングした。TBS-T中で洗浄した後、一次抗体を製造業者の情報に従って、4℃で一晩加えた。使用された抗体は、全ての時点で、GAPDH、E1A、DBP、E2F1、Rb、pRb、並びに72時間のサンプルについてさらにカスパーゼ3及び全長及び切断型のPARPを対象とした。翌日、洗浄を繰り返し、二次抗体をRTで1時間加えた。洗浄後、ECLを使用して、ChemiDocTM MPイメージングシステムにより化学発光を画像化した。
2.5×105個 LN229細胞を10cmのプレートにおいて、DMEM培地中に播種した。翌日、細胞を500nM LEE011及び200nM JQ1又は両方の併用で処理した。翌朝、細胞を20MOIでXVir-N-31に感染させた。感染後1時間で、阻害剤を含有するDMEM培地を細胞に加えた。各時点(24、48、72時間)後、細胞を氷上に置き、氷冷PBSで2回洗浄し、SDSタンパク質溶解バッファー 300μlを加えた。細胞を反応チューブに移し、DNAを注射器及び針で剪断し、遠心分離後の更なる使用のために、上清を移した。タンパク質濃度をBCAアッセイで測定し、4×Lammli:DTT 6:1及び20μgの濃度を有するサンプルを調製し、10% SDSゲルに移した。ゲル電気泳動を90Vで開始し、ラダーが分離し始めた後、150Vに上昇させた。ゲル上のタンパク質を100Vで2時間メンブランにブロットし、TBS-T中の5% ミルク中において、RTで1時間ブロッキングした。TBS-T中で洗浄した後、一次抗体を製造業者の情報に従って、4℃で一晩加えた。使用された抗体は、全ての時点で、GAPDH、E1A、DBP、E2F1、Rb、pRb、並びに72時間のサンプルについてさらにカスパーゼ3及び全長及び切断型のPARPを対象とした。翌日、洗浄を繰り返し、二次抗体をRTで1時間加えた。洗浄後、ECLを使用して、ChemiDocTM MPイメージングシステムにより化学発光を画像化した。
結果を図63、図64、図65及び図66に示す。
図63に示されたように、ウイルスタンパク質であるE1A及びDBPは、XVir-N-31と500nM LEE011及び/又は200nM JQ-1との併用処理により増加した。細胞タンパク質であるRb及びpRbは、これらのサンプルにおいて阻害されたままであった(レーン5、6及び7)。
図64に示されたように、ウイルスタンパク質であるE1A及びDBPは、XVir-N-31とLEE011又は/及びJQ-1との併用処理により増加した。細胞タンパク質であるRb及びpRbは、これらのサンプルにおいて阻害されたままであり、E2F-1は、これらのサンプルにおいて安定化された(レーン5、6及び7)。
図65に示されたように、ウイルスタンパク質であるE1A及びDBPは、XVir-N-31とLEE011又は/及びJQ-1との併用処理により増加したが、細胞タンパク質であるRbは減少し、E2F1は、これらのサンプルにおいて増加した。さらに、48kDaで見えるRbの切断産物があり、これはアポトーシスを示した(Fattman, Cheryl L.; Delach, Scott M.; Dou, Qing Ping; Johnson, Daniel E.(2001): Sequential two-step cleavage of retinoblastoma protein by caspase-3/-7 during etoposide-induced apoptosis.In: Oncogene 20 (23), S. 2918-2926.)。
図66に示されたように、カスパーゼ3及びPARPは、対照においても、全ての細胞ライゼート中に存在した。切断されたPARPが、切断型PARP抗体だけでなく、完全長PARP抗体によっても検出された。切断されたPARPは、感染細胞でのみ見ることができ、その存在は、LEE011及びJQ1での処理により増加した。この切断はアポトーシスの徴候であった(Chaitanya et al.: PARP-1 cleavage fragments: signatures of cell-death proteases in neurodegeneration. Cell Communication and Signaling 2010 8:31)。
実施例31:膠芽腫における種々のアデノウイルスに対するJQ1の効果
アデノウイルスE1Aは、種々の細胞タンパク質と結合し、その機能を妨害する種々の保存領域(CR)からなる。CR1は、p300/CBPと結合し、これも、CR3と結合することができる。CR3の他の領域は、種々のメディエーター複合体サブユニット、例えば、MED23と結合することができるため、E1Aによる他のウイルス初期遺伝子のトランス活性化に役割を果たす。アデノウイルス領域CR1及びCR2も、RBに結合可能である。この相互作用により、E2Fが放出され、次の細胞周期に進行する。さらに、E2Fは、アデノウイルスE2の初期プロモーターに結合し、その転写を活性化する。
アデノウイルスE1Aは、種々の細胞タンパク質と結合し、その機能を妨害する種々の保存領域(CR)からなる。CR1は、p300/CBPと結合し、これも、CR3と結合することができる。CR3の他の領域は、種々のメディエーター複合体サブユニット、例えば、MED23と結合することができるため、E1Aによる他のウイルス初期遺伝子のトランス活性化に役割を果たす。アデノウイルス領域CR1及びCR2も、RBに結合可能である。この相互作用により、E2Fが放出され、次の細胞周期に進行する。さらに、E2Fは、アデノウイルスE2の初期プロモーターに結合し、その転写を活性化する。
E1Aの相互作用パートナー及び保存領域CR1~CR4の位置を図67に示す。
ウイルス複製を増強するJQ1の効果に、E1Aのどの保存領域が必須であるかを見出すために、種々の欠失及び突然変異を有するアデノウイルスを使用した。より良好な感染性のためのRGDモチーフ及び損なわれていない抗ウイルス応答のためのE3欠失を含む野生型アデノウイルスを対照として使用した。他のウイルスを、N末端並びにCR1及びCR2が欠失しているdl119及びCMVプロモーターの制御下にあり、CR2を欠失しているAdデルタ24とした。CR3欠失ウイルスとして、アポトーシスを増強するために、RGDモチーフ及びE3欠失並びにE1B-19k欠失も含有するXVir-N-31を使用した。別の利用されたウイルスをADWT/E2Fmとした。このウイルスは、E2初期プロモーターにおけるE2F結合部位に突然変異を含有し、この突然変異は、E2Fの結合を遮断する。再度、これらの特徴を以下にまとめる。
1×105個 LN229細胞を6ウェルプレートにおいて、DMEM培地中に播種した。翌日、細胞を20MOI 種々のウイルス(AdWt、dl119、Adデルタ24、XVir-N-31、AdWt/E2Fm)に感染させた。細胞をJQ1処理の有無で感染させるため、感染後1時間で、DMEM培地又は200nM JQ1を含有するDMEM培地を細胞に加えた。各時点(4、24、48時間)後、細胞をPBSで1回洗浄し、SDS DNA溶解バッファー 200μlを加えた。細胞をプロテイナーゼKと共に、56℃で15分間インキュベーションし、その後、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール精製を行った。DNAをAEバッファーで希釈し、DNA濃度を、Nanodropを使用して決定した。各サンプルについて、10ng/μlの溶液を調製し、50ng DNA及びGoTaq Master mixを使用するqPCRを行った。特異的な繊維フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用し、Δct値の計算のために、特異的なアクチンプライマーも使用した。各サンプルについて、3つの繊維値及び3つのアクチン値を測定した。計算をエクセルで行い、各24時間及び48時間をその4時間値(複製前の初期ウイルス侵入)及び未処理の感染サンプルに関してJQ1を介した複製の増加に基づいて計算した。
結果を図68及び図69に示す。
種々のウイルスの中でも、XVir-N-31は、48時間後にJQ1の影響下でウイルス複製の最も高い増加を示した。これは、CR3欠失を有するウイルスがJQ1による処理により最も強い利益を受けることを示す。
実施例32:膀胱がんにおけるXVir-N-31とJQ-1との2剤併用療法
第1の態様として、XVir-N-31の複製を評価した。
第1の態様として、XVir-N-31の複製を評価した。
2.5×104個 UMUC-3細胞を12ウェルプレートにおいて、DMEM培地中に播種した。翌日、細胞をJQ-1(プライミング)又はDMEM培地で処理した。翌朝、細胞を10MOI XVir-N-31に感染させた。感染後1時間で、JQ-1を含有するDMEM培地を細胞に加えた(同時処理)。4時間及び24時間後それぞれ、細胞をPBSで1回洗浄し、SDS DNA溶解バッファー 200μlを加えた。細胞をプロテイナーゼKと共に少なくとも1時間インキュベーションし、その後、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール精製を行った。DNAを1×TEバッファーで希釈し、DNA濃度を、Nanodropを使用して決定した。各サンプルについて、15ng/μlの溶液を調製し、75ng DNA及びGoTaq Master mixを使用するRT-qPCRを行った。特異的な繊維フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用し、Δct値の計算のために、特異的なアクチンプライマーも使用した。各サンプルについて、3つの繊維値及び3つのアクチン値を測定した。計算をエクセルで行い、各24時間値をその4時間値(複製前の初期ウイルス侵入)に基づいて計算した。
結果を図70に示す。
図70から明らかなように、プライミング自体は、XVir-N-31複製に対して有益な効果を有さなかった。示された図におけるプライミングのわずかなポジティブ効果は、実験のセットアップにおける不十分な洗浄により生じた。JQ-1による同時処理は、2剤併用療法の成功にきわめて重要であったが、JQ-1の事前添加(プライミング)は、同時処理と比較して効率が低下した。
第2の態様として、XVir-N-31の粒子形成を評価した。
ウイルス粒子の産生を、ヘキソンタンパク質の免疫組織化学染色により分析した(ヘキソン力価試験)。そのために、1ウェル当たりに2×105個 接着性HEK293細胞を24ウェルプレートに播種した。感染後の示された時点の後及びJQ-1による示された同時処理後に収集された細胞培養物サンプルを、3サイクルの融解-凍結で前処理して、細胞からウイルス粒子を放出させ、ついで、連続希釈した。HEK293細胞をサンプル当たりに50μl又は10μlのいずれかの容量で感染させた。ついで、プレートを37℃及び10% CO2で40時間インキュベーションし、その後、検出可能な細胞変性効果についてチェックした。培地を吸引し、プレートを5~10分間乾燥させて、その後、氷冷メタノールを-20℃で10分間加えることにより、細胞を固定した。ウェルをPBS+1% BSAで2回洗浄した。一次抗体(ヤギ抗ヘキソン、1:500)を加え、プレートを37℃で1時間インキュベーションし、その後、PBS+1% BSAで2回洗浄した。次に、二次抗体(ウサギ抗ヤギHRPコンジュゲート、1:1000)を加え、37℃で1時間インキュベーションした。再度、ウェルを1% BSAを含有するPBSで2回洗浄し、その後、DAB溶液を加えた。30分のインキュベーション後、ウェル当たりに10の異なるランダムな視野(f.o.v.)を顕微鏡の20×対物レンズ下で計数した。計数反復を平均し、この式に従って、1ml当たりの感染性粒子を計算した。
結果を図71及び図72に示す。
図71から明らかなように、XVir-N-31の粒子形成は、500nM JQ-1の添加により、UMUC-3細胞において顕著に増加した。さらに、XVir-N-31の粒子形成の動力学は、500nM JQ-1による同時処理により高度に加速される。
第3の態様として、ウェスタンブロット分析を行った。
1×106個 UMUC-3細胞を10cmのプレートにおいて、DMEM培地中に播種し、播種後24時間で、10MOI XVir-N-31に感染させた。感染後1時間で、培養培地をDMEM又は500nM JQ-1でスパイクしたDMEMのいずれかにより再充填した。12、24、36及び48h.p.iで、全タンパク質のライゼートを、SDSバッファーを使用して取得した。BCAアッセイを適用して、同等のタンパク質濃度に調整した。ついで、タンパク質サンプルにLammliバッファーを補充し、10% PA-ゲル上でのSDS-PAゲル電気泳動により分離した。サンプルを、BioRAD Wet Tank Systemを使用して、PVDFメンブラン上にブロットした。これらのメンブランを、5% スキムミルク粉末を含有するTBS-Tweenバッファーで、室温において1時間ブロッキングした。一次抗体とのインキュベーションを4℃で一晩行い、HRPコンジュゲート二次抗体とのインキュベーションを室温で1時間行った。化学発光を、ChemiDocイメージングシステム(BioRad)でECL prime(Pierce)を使用して検出した。図をAdobe(登録商標)Illustratorで作り、評価をImageLabで行った。
結果を図73に示す。
図73から明らかなように、XVir-N-31ウイルスタンパク質(E1A、E1B55k、DBP及びE40rf6)の絶対ウイルスタンパク質発現及び主要な動態は、JQ-1の同時処理により高度に加速された。JQ-1処理により、特に、ヘキソンのような後期ウイルスタンパク質が、XVir-N-31による感染後早期の時点において、高レベルで発現された。
実施例33:XVir-N-31、パルボシクリブ及びJQ-1を使用する膀胱がんの3剤併用療法
第1の態様として、膀胱がん細胞株であるUMUC-3及びRT112の細胞周期において、示された濃度で適用された小分子阻害剤の影響を、DNA染色後のフローサイトメトリー分析により分析した。
第1の態様として、膀胱がん細胞株であるUMUC-3及びRT112の細胞周期において、示された濃度で適用された小分子阻害剤の影響を、DNA染色後のフローサイトメトリー分析により分析した。
このような目的で、5×104個 UMUC-3及びRT112をそれぞれ6ウェルプレートに播種し、24時間後、適切な阻害剤で処理した。1日後、約80%コンフルエントで、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、再度洗浄し、80% 氷冷エタノールで固定した。細胞周期分析のために、サンプルをDNA挿入色素である7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)と共にインキュベーションし、FACS分析により測定した。測定データの評価をソフトウェアFlowJoにより行った。
結果を図74に示す。
図74から明らかなように、パルボシクリブにより、細胞周期のG1期において強力な停止が誘引された。JQ-1は、単剤又はパルボシクリブとの併用のどちらでも細胞周期に顕著な影響を示さなかった。特に、JQ-1は、XVir-N-31の腫瘍溶解能を強力に増強するのに依然として十分である比較的低い濃度で適用された。G1-又はG2-停止のいずれかを誘引するJQ-1のより高用量についての不確定なデータが、公表された科学文献に見出された。一方、低用量のJQ-1は、細胞周期に影響を及ぼさなかった。
第2の態様として、JQ-1及びパルボシクリブの両方で処理された後の特定の細胞ターゲットタンパク質についての発現レベルを定量した。
1~2×106個 UMUC-3細胞又はRT-112細胞を10cmプレートにおいて、DMEM培地中に播種し、播種後24時間で、各小分子阻害剤で処理した。処理後24時間で、全タンパク質のライゼートを、SDSバッファーを使用して取得した。BCAアッセイを適用して、同等のタンパク質濃度に調整した。ついで、タンパク質サンプルにLammliバッファーを補充し、10% PA-ゲル上でのSDS-PAゲル電気泳動により分離した。サンプルを、BioRAD Wet Tank Systemを使用して、PVDFメンブラン上にブロットした。これらのメンブランを、5% スキムミルク粉末を含有するTBS-Tweenバッファーで、室温において1時間ブロッキングした。一次抗体とのインキュベーションを4℃で一晩行い、HRPコンジュゲート二次抗体とのインキュベーションを室温で1時間行った。化学発光を、ChemiDocイメージングシステム(BioRad)でECL prime(Pierce)を使用して検出した。図をAdobe(登録商標)Illustratorで作り、評価をImageLabで行った。
結果を図75に示す。
図75から明らかなように、JQ-1は、細胞周期レギュレーターであるRB、ホスホ-RB又はE2F-1タンパク質レベルに対して、単独療法又はパルボシクリブとの併用のいずれにおいても、示された濃度で何ら影響を示さなかった。RNA-ポリメラーゼIIリプレッサーであるHexim1は、JQ-1処理後にダウンレギュレートされるが、パルボシクリブとの併用で救済される。このように、細胞周期タンパク質であるRB及びE2F-1は、JQ-1処理下でのXVir-N-31の複製能力の向上を担わない。
第3の態様として、3剤併用療法の細胞殺傷効力を、効力アッセイを使用して決定した。
1~3×104個 細胞を、12ウェルプレートにおいて、DMEM又はRPMI培地中に播種し、翌日、阻害剤で処理した。播種後48時間で、細胞をXVir-N-31に感染させた。4日後、細胞を、10% TCAを使用して固定した。プレートを、0.1% SRB溶液を使用して染色した。過剰分を除去し、プレートを1% 酢酸で洗浄した。酢酸を除去した後、プレートを一晩風乾させた。SRBを10mM トリス塩基溶液 1mlに溶解させ、1:10希釈を、560nmでの光度計を使用して測定した。
結果を図76、図77及び図78に示す。
図76、図77及び図78から明らかなように、低用量のパルボシクリブ及びJQ-1と共に処理することにより、XVir-N-31は、低MOIであっても、膀胱がん細胞であるUMUC-3、RT112及びT24のそれぞれ及びいずれにも見られる各効果により示されたように、in vitro膀胱がん細胞の生存を完全に消失させることが可能となる。
第4の態様として、ウイルス複製に対するこの3剤併用療法の影響を評価した。
2.5×104個 UMUC-3細胞、T24細胞又はRT112細胞を12ウェルプレートにおいて、DMEM培地又はRPMI培地中に播種した。翌日、細胞をJQ-1、パルボシクリブ(プライミング)又は培地で処理した。翌日、細胞を10、20又は50MOIのXVir-N-31に感染させた。感染後1時間で、JQ-1又はパルボシクリブを含有する培地を細胞に加えた。4時間及び24時間後、細胞をPBSで1回洗浄し、SDS DNA溶解バッファー 200μlを加えた。細胞をプロテイナーゼKと共に少なくとも1時間インキュベーションし、その後、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール精製を行った。DNAを1×TEバッファーで希釈し、DNA濃度を、Nanodropを使用して決定した。各サンプルについて、15ng/μlの溶液を調製し、75ng DNA及びGoTaq Master mixを使用するRT-qPCRを行った。特異的な繊維フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用し、Δct値の計算のために、特異的なアクチンプライマーも使用した。各サンプルについて、3つの繊維値及び3つのアクチン値を測定した。計算をエクセルで行い、各24時間値をその4時間値(複製前の初期ウイルス侵入)に基づいて計算した。
結果を図79、図80及び図81に示す。
図79、図80及び図81から明らかなように、低用量のパルボシクリブ及びJQ-1による追加処理により、XVir-N-31の複製が200倍まで高度に加速される。
第5の態様として、増殖的に感染させた腫瘍細胞に対するこの3剤併用療法の影響を評価した。
増殖的に感染させた腫瘍細胞の数を感染させたUMUC-3細胞のヘキソンタンパク質の直接免疫組織化学染色により分析した(シュードヘキソン力価試験)。そのために、ウェル当たりに5×105個 UMUC-3細胞を12ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を低用量のJQ-1及びパルボシクリブでプライミングした。ついで、播種後48時間で、細胞をXVir-N-31(9MOI)に感染させ、1時間後、各阻害剤で同時に処理した。ついで、プレートを37℃及び10% CO2で40時間インキュベーションし、その後、検出可能な細胞変性効果についてチェックした。培地を吸引し、プレートを5~10分間乾燥させて、その後、氷冷メタノールを-20℃で10分間加えることにより、細胞を固定した。ウェルをPBS+1% BSAで2回洗浄した。一次抗体(ヤギ抗ヘキソン、1:500)を加え、プレートを37℃で1時間インキュベーションし、その後、PBS+1% BSAで2回洗浄した。次に、二次抗体(ウサギ抗ヤギHRPコンジュゲート、1:1000)を加え、37℃で1時間インキュベーションした。再度、ウェルを1% BSAを含有するPBSで2回洗浄し、その後、DAB溶液を加えた。30分のインキュベーション後、ウェル当たりに10の異なるランダムな視野(f.o.v.)を顕微鏡の20×対物レンズ下で計数した。
結果を図82及び図83に示す。
図82及び図83から明らかなように、低用量のパルボシクリブ及びJQ-1による追加処理により、XVir-N-31増殖性感染を受けた腫瘍細胞の数が高度に加速される。
実施例34:UMUC3及びRT112細胞株におけるXVir-N-31と併用した種々のBET阻害剤及びBET分解剤の効果
本研究の目的は、分解剤を含む種々のBET(ブロモドメイン及び末端外モチーフ)阻害剤と併用したXVir-N-31の有効性を決定することであった。BET阻害剤(BETi):OTX015(一価)、AZD5153(二価)は、BETを競合的に阻害し、BET分解剤(BETd):dBet6、ARV55はBET分解をもたらす(例えば、Rhyasen GW, et al. AZD5153: A Novel Bivalent BET Bromodomain Inhibitor Highly Active against Hematologic Malignancies. Mol Cancer Ther. 2016 Nov;15(11):2563-2574;J. Kay Noel, et al. Abstract C244: Development of the BET bromodomain inhibitor OTX015. Mol Cancer Ther. November 2013 12; C244;Winter GE, et al.: BET Bromodomain Proteins Function as Master Transcription Elongation Factors Independent of CDK9 Recruitment. Mol Cell. 2017 Jul 6;67(1):5-18.e19). Raina K, et al.: PROTAC-induced BET protein degradation as a therapy for castration-resistant prostate cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Jun 28;113(26):7124-9を参照のこと。これらの開示は、参照により本明細書に組み入れられる)。
第1の態様では、BETi及びBETd処理と併用したXVir-N-31感染後のUMUC3細胞及びRT112細胞の細胞生存を効力アッセイにより分析した。
1.3×104個 UMUC-3細胞及び3×104個 RT112細胞を、12ウェルプレートにおいて、DMEM培地及びRT112培地中に播種した。翌日、細胞を示された濃度のBETi及びBETdで前処理した。播種後48時間で、細胞を腫瘍溶解性アデノウイルスであるXVir-N-31に感染させ、BETi及びBETdで処理した。5日後、細胞を10% TCAを使用して固定した。プレートを0.05% SRB溶液を使用して染色した。過剰分を除去し、プレートを1% 酢酸で洗浄した。酢酸を除去した後、プレートを一晩風乾させた。SRBを10mM トリス塩基溶液 500μlに溶解させ、1:10希釈を、562nmでの光度計を使用して測定した。
結果を図84及び図85に示す。
図84及び図85から明らかなように、BETi及びBETdとXVir-N-31ウイルスとの併用は、両細胞株において相乗的であり、細胞生存の強力な減少をもたらした。
第2の態様では、UMUC-3及びRT112細胞株における繊維DNAのウイルス複製に対するBETi及びBETdの効果をqPCRにより分析した。
3×104個 UMUC-3細胞及び4×104個 RT112細胞を、12ウェルプレートにおいて、DMEM培地及びPRMI培地中に播種した。翌日、細胞をBETi及びBETdで前処理した。播種後48時間で、細胞をUMUC-3について10MOI及びRT112について50MOIで感染させ、示された濃度のBETi及びBETdで処理した。各時点(4、24時間)後、細胞をPBSで1回洗浄し、SDS DNA溶解バッファー 200μlを加えた。細胞をプロテイナーゼKと共にインキュベーションし、その後、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール精製を行った。DNAをDNaseを含まない水で希釈し、DNA濃度を、Nanodropを使用して決定した。各サンプルについて、15ng/μlの溶液を調製し、75ng DNA及びGoTaq Master mixを使用するRT-qPCRを行った。特異的な繊維フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用し、Δct値の計算のために、特異的なアクチンプライマーも使用した。各サンプルについて、3つの繊維値及び3つのアクチン値を測定した。計算をエクセルで行い、各24時間値をその4時間値(複製前の初期ウイルス侵入)に基づいて計算した。
結果を図86及び図87に示す。
図86及び図87から明らかなように、BETi及びBETdによる処理により、感染後24時間で、XVir-N-31の複製が高度に増加した。両細胞株において、ウイルス複製の増加は、二価のBETiであるAZD5153との併用で最高であった。これは、二価の阻害剤が一般的に、XVir-N-31との併用により適していることを示す。
実施例35:肉腫異種移植ヌードマウスモデルにおけるCDK4/6阻害剤であるリボシクリブとXVir-N-31との併用
方法
動物研究
ヒト肉腫異種移植片モデルについて、10~20週齢のマウスの右側腹部に、PBS中の3×106 個 A673腫瘍細胞を皮下(s.c.)注射した。腫瘍サイズを2~3日毎に測定し、腫瘍体積を式:体積=0.5×長さ×幅2で計算した。腫瘍体積が、100~150mm3を超えた後、マウスを、示された処理/対照群:PBS(すなわち、LEE011を含まず、PBSを含む0.5% メチルセルロース、腫瘍内[i.t])、LEE(すなわち、LEE011及びPBSを含有する0.5% メチルセルロース、i.t.)、XVir単独(すなわち、LEE011を含まず、XVir-N-31を含む0.5% メチルセルロース、i.t.)及び併用(すなわち、LEE011及びXVir-N-31を含有する0.5% メチルセルロース、i.t.)に無作為化した。ついで、各動物に200mg/kg 体重 リボシリブスクシナート(LEE011)(0.5% メチルセルロースに溶解)をX日目(DX)からX+4日目(DX+4)まで、又はモック対照(LEE011を含まない0.5% メチルセルロース)を経口強制投与した。1×1011VP XVir-N-31又はPBS(それぞれ50μl)をX+1日目(DX+1)及びX+3日目(DX+3)にi.t.注射した。X+5日目に、処理群XVir単独及び併用からの3匹の代表的な動物を、組織病理学的評価及び外植腫瘍におけるウイルス複製の定量のために殺処分した。残りのマウスの腫瘍サイズを腫瘍体積が1000mm3を超えるまで測定し、マウスを殺処分した。
方法
動物研究
ヒト肉腫異種移植片モデルについて、10~20週齢のマウスの右側腹部に、PBS中の3×106 個 A673腫瘍細胞を皮下(s.c.)注射した。腫瘍サイズを2~3日毎に測定し、腫瘍体積を式:体積=0.5×長さ×幅2で計算した。腫瘍体積が、100~150mm3を超えた後、マウスを、示された処理/対照群:PBS(すなわち、LEE011を含まず、PBSを含む0.5% メチルセルロース、腫瘍内[i.t])、LEE(すなわち、LEE011及びPBSを含有する0.5% メチルセルロース、i.t.)、XVir単独(すなわち、LEE011を含まず、XVir-N-31を含む0.5% メチルセルロース、i.t.)及び併用(すなわち、LEE011及びXVir-N-31を含有する0.5% メチルセルロース、i.t.)に無作為化した。ついで、各動物に200mg/kg 体重 リボシリブスクシナート(LEE011)(0.5% メチルセルロースに溶解)をX日目(DX)からX+4日目(DX+4)まで、又はモック対照(LEE011を含まない0.5% メチルセルロース)を経口強制投与した。1×1011VP XVir-N-31又はPBS(それぞれ50μl)をX+1日目(DX+1)及びX+3日目(DX+3)にi.t.注射した。X+5日目に、処理群XVir単独及び併用からの3匹の代表的な動物を、組織病理学的評価及び外植腫瘍におけるウイルス複製の定量のために殺処分した。残りのマウスの腫瘍サイズを腫瘍体積が1000mm3を超えるまで測定し、マウスを殺処分した。
動物研究の実験設計を図88に示す。
統計分析
in vivoでの腫瘍成長を、オープンアクセスウェブツールであるTumGrowth(https://kroemerlab.shinyapps.io/TumGrowth)によい分析した。簡潔に、腫瘍体積の測定データを線形混合効果モデリングに供し、これにより、所望の時点での縦方向腫瘍成長勾配比較及び処理応答評価(断面分析)が可能となる。P値を、縦方向分析及び断面分析(示される場合、holm調整を伴う)のために、タイプII ANOVA、及び選択された対比較を使用するソフトウェアにより計算した。腫瘍成長曲線をPrism 5(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)により生成した。腫瘍成長曲線を、平均腫瘍体積及び平均の標準誤差(sem)を使用して描いた。P値<0.05を統計的に有意とみなした(*p<0.05;**p<0.005;***p<0.0005)。
in vivoでの腫瘍成長を、オープンアクセスウェブツールであるTumGrowth(https://kroemerlab.shinyapps.io/TumGrowth)によい分析した。簡潔に、腫瘍体積の測定データを線形混合効果モデリングに供し、これにより、所望の時点での縦方向腫瘍成長勾配比較及び処理応答評価(断面分析)が可能となる。P値を、縦方向分析及び断面分析(示される場合、holm調整を伴う)のために、タイプII ANOVA、及び選択された対比較を使用するソフトウェアにより計算した。腫瘍成長曲線をPrism 5(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)により生成した。腫瘍成長曲線を、平均腫瘍体積及び平均の標準誤差(sem)を使用して描いた。P値<0.05を統計的に有意とみなした(*p<0.05;**p<0.005;***p<0.0005)。
結果-異種移植ヌードマウスモデルにおける併用療法及び単剤療法の効果
提案された併用戦略の生物学的に関連する利点が可能性のある治療利益にも変換することができるかどうかを検討するために、異種移植A673肉腫細胞の腫瘍抑制を免疫不全ヌードマウスで評価した。オープンアクセスウェブツールであるTumGrowthを適用すると、単剤療法(LEE又はXVir単独)又は対照(PBS)で処理された動物と比較して、併用処理(併用)を受けた動物において、腫瘍成長抑制が有意に向上した。群間の処理応答の最大差は、治療開始後12~21日目に観察された。(注目すべきことに、ウイルス複製は、XVir-N-31と比較して、併用を受けた代表的な動物の外植腫瘍において有意に増加した。)
提案された併用戦略の生物学的に関連する利点が可能性のある治療利益にも変換することができるかどうかを検討するために、異種移植A673肉腫細胞の腫瘍抑制を免疫不全ヌードマウスで評価した。オープンアクセスウェブツールであるTumGrowthを適用すると、単剤療法(LEE又はXVir単独)又は対照(PBS)で処理された動物と比較して、併用処理(併用)を受けた動物において、腫瘍成長抑制が有意に向上した。群間の処理応答の最大差は、治療開始後12~21日目に観察された。(注目すべきことに、ウイルス複製は、XVir-N-31と比較して、併用を受けた代表的な動物の外植腫瘍において有意に増加した。)
結果を図89、図90及び図91に示す。縦方向分析のための選択された対比較を下記表に示す。
図29、図30及び図31に示された結果から、XVir-N-31及びリボシクリブを含む併用療法が、XVir-N-31又はリボシクリブ単独より有効であることが明らかに実証される。
先の明細書、特許請求の範囲及び図面に開示された本発明の特徴は、個々に及び任意の組み合わせの両方で、その種々の実施態様における本発明の実現に重要である場合がある。
Claims (17)
- アデノウイルスと、CDK4/阻害剤と、PARP阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、ヌトリン又はヌトリン誘導体を含む群から選択される少なくとも1種の更なる剤とを含む、
組み合わせ。 - 組み合わせが、PARP阻害剤をさらに含む、請求項1記載の組み合わせ。
- 組み合わせが、ブロモドメイン阻害剤をさらに含む、請求項1又は2記載の組み合わせ。
- 組み合わせが、ヌトリン又はヌトリン誘導体をさらに含む、請求項1~3のいずれか一項記載の組み合わせ。
- 腫瘍又はがんの処置のための方法における使用のための、請求項1~4のいずれか一項記載の組み合わせ。
- 対象における腫瘍又はがんの処置のための方法における使用のためのアデノウイルスであって、
該方法は、アデノウイルスと、CDK4/6阻害剤と、PARP阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、ヌトリン又はヌトリン誘導体を含む群から選択される少なくとも1種の更なる剤とを対象に投与することを含む、
アデノウイルス。 - 対象における腫瘍又はがんの処置のための方法における使用のためのCDK4/6阻害剤であって、
該方法は、アデノウイルスと、CDK4/6阻害剤と、PARP阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、ヌトリン又はヌトリン誘導体を含む群から選択される少なくとも1種の更なる剤とを対象に投与することを含む、
CDK4/6阻害剤。 - アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、請求項1記載の組み合わせ、請求項5記載の使用のための組み合わせ、請求項6記載の使用のためのアデノウイルス及び請求項7記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- アデノウイルスが、XVir-N-31、dl520、AdΔ24、AdΔ24-RGD、dl922-947、E1Ad/01/07、dl1119/1131、CB016、VCN-01、E1Adl1107、E1Adl1101、ORCA-010、Enadenotucirev及び機能的Rb腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、請求項1及び8のいずれか一項記載の組み合わせ、請求項5及び8のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項6及び8のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項7及び8のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- アデノウイルスが、XVir-N-31である、請求項1及び8~9のいずれか一項記載の組み合わせ、請求項5及び8~9のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項6及び8及び9のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項7及び8~9のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- CDK4/6阻害剤が、細胞をG1期で停止させ、E2F1を阻害するCDK4/6阻害剤である、請求項1及び8~10のいずれか一項記載の組み合わせ、請求項5及び8~10のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項6及び8~10のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項7及び8~10のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- CDK4/6阻害剤が、PD0332991とも呼ばれるパルボシクリブ、LY-2835219とも呼ばれるアベマシクリブ、LEE011とも呼ばれるリボシクリブ、G1T28とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、請求項1及び8~11のいずれか一項記載の組み合わせ、請求項5及び8~11のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項6及び8~11のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項7及び8~11のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- 病的腫瘍又はがんが、Rb陰性である、請求項5及び8~12のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項6及び8~12のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項7及び8~12のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- 病的腫瘍又はがんが、Rbを発現しているか又はRb陽性である、請求項5及び8~12のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項6及び8~12のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項7及び8~12のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- 腫瘍細胞の細胞が、1つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び/又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、請求項5及び8~14のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項6及び8~14のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項7及び8~14のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- 腫瘍又はがんが、細胞周期とは無関係に細胞核にYB-1を含有する、請求項5及び8~14のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項6及び8~14のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項7及び8~15のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
- 疾患が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん(mBC)、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項5及び8~15のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項6及び8~16のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項7及び8~16のいずれか一項記載の使用のためのCDK4/6阻害剤。
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