JP2022547167A - Ｋｒａｓ変異型がんを治療する方法 - Google Patents

Abstract

個体におけるＫＲＡＳ変異型がんを治療する方法が提供される。ある特定の実施形態において、方法は、ＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に、有効量の、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）－毛様体神経栄養因子受容体（ＣＮＴＦＲ）シグナル伝達を阻害する薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、ＫＲＡＳ変異型がんは、ＫＲＡＳ変異型非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）などのＫＲＡＳ変異型肺がんであり、例えば、ＫＲＡＳ変異型肺腺がん（ＬＵＡＤ）である。例えば本開示の方法の実施において用途を見出すキットも提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／９３１，６０８号、および２０１９年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８９８，２４９号の利益を主張し、これらの出願は、それらの全体に参照により本明細書に組み込まれる。

政府支援の声明
本発明は、国立がん研究所により認可を受けた契約番号Ｒ０１ ＣＡ２２５１０３の下で政府支援によって実施された。政府は本発明に一定の権利を有する。

序文
肺がんは、世界中のがん関連死の主な原因である。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）のサブグループは、症例の８５～９０％を占め、肺腺がん（ＬＵＡＤ）は、最も一般的なＮＳＣＬＣの組織学的サブタイプである。ＬＵＡＤ症例の約３０％がＫＲＡＳに変異を有するが、これらの患者は、現在、標的化治療の選択肢がほとんどない。ＥＧＦＲまたはＡＬＫの変化を特徴とするＬＵＡＤのサブタイプでは、小分子阻害剤が効果的であるが、急速な薬物耐性は、主要な制限を残している。モノクローナル抗体ベースの免疫療法剤も、利用可能な選択肢を劇的に改善し、一部の患者の生存に大きな影響を与える可能性がある。これらの進歩にもかかわらず、肺がん治療への革新的なアプローチ、特に現在利用可能な薬剤によって標的とされていない発がんのメカニズムに向けられたアプローチに対する継続的な臨床的必要性がある。

がんは、それ自体が腫瘍形成プロセスの結果として変化する微小環境内で発生し進行する。がん細胞と接触している間質細胞は、腫瘍細胞へのシグナル伝達によって直接的に、または腫瘍進行を促進するために他の間質成分を動員することによって間接的に作用し得る増殖因子およびサイトカインを分泌する。このプロセスの重要な側面は、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の増殖である。ＣＡＦは、異なる腫瘍および組織におい別個の特徴を有する間質細胞の多様な集団である。

ＣＡＦは、腫瘍細胞の増殖を刺激する可溶性因子の分泌によって、インビボでがん細胞（例えば、肺がん細胞）の増殖を支持する。そのような可溶性因子の１つは、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）である。ＣＬＣＦ１は、構造的に関連する造血および神経新生サイトカインのインターロイキン（ＩＬ）－６ファミリー（ＩＬ－６、ＩＬ－１１、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１））に属する。間質内の細胞によって生成されたＣＬＣＦ１は、このタンパク質の受容体、ＧＰＩアンカーＣＮＴＦ受容体（ＣＮＴＦＲ）を発現する腫瘍細胞によって成長シグナルとして受け取られる。膜結合型または可溶性ＣＮＴＦＲに結合すると、シグナル伝達β受容体ｇｐ１３０（膜貫通型１３０ｋＤａ糖タンパク質）とＬＩＦ受容体（ＬＩＦＲ）とのヘテロ二量体が誘導され、これは、ＪＡＫ ＳＴＡＴ経路およびＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路などの細胞内シグナル伝達カスケードをもたらす。

ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、およびＮＲＡＳを含むＲＡＳファミリー遺伝子は、ヒトがんによく見られるがん遺伝子であり、１８８～１８９個のアミノ酸の鎖で構成される非常に類似したタンパク質をコードする。これらの３つのタンパク質の配列および構造的特徴は、それらのカルボキシル末端ドメインおよび翻訳後脂質修飾を除いて、高度に保存される。ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、およびＮＲＡＳは、細胞内で同様の様式で調節される。ＲＡＳ遺伝子は、哺乳類細胞の細胞増殖、分化、および生存を調節するシグナル伝達経路の分子スイッチとして機能する単量体ＧＴＰａｓｅをコードする。ＲＡＳを構成的に活性化することができる変異は、すべてのヒトがんの２０％～２５％で発見されている。ＫＲＡＳは、その活性状態においてＧＴＰに結合し、ヌクレオチドの末端リン酸を切断する、固有の酵素活性を保有し、それをＧＤＰに変換する。ＧＴＰをＧＤＰに変換すると、ＫＲＡＳは、非活性化される。変換速度は、通常遅いが、付属のＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）によって劇的に増加することがある。次に、ＫＲＡＳは、結合ヌクレオチド（ＧＤＰ）の放出を強制する、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）（ＳＯＳなど）に結合することができる。ＧＴＰ結合により、主にスイッチＩ領域（残基３０～４０）およびスイッチＩＩ領域（残基６０～７０）のいくつかの残基が、ＫＲＡＳエフェクタータンパク質の結合を可能にするコンフォメーションを採用することができるようになり、これらのスイッチは、ＧＡＰおよびＧＥＦによって調節される。哺乳類細胞では、内因性ＫＲＡＳタンパク質は、主にＧＤＰ状態にあり、活性化は、一過性である。ただし、ＫＲＡＳタンパク質の一般的な発がん性変異は、ＧＴＰの加水分解に干渉し、その結果、タンパク質は、活性ＧＴＰ状態のままとなり、エフェクター経路にシグナルを伝達し続ける。したがって、ＫＲＡＳは、分子のオン／オフスイッチとして機能する。オンになると、成長因子ならびにｃ－ＲａｆおよびＰＩ３Ｋなどの他の受容体のシグナ伝達の伝播に必要なタンパク質を動員し、活性化する。

個体におけるＫＲＡＳ変異型がんを治療する方法が提供される。ある特定の実施形態において、方法は、ＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に、有効量の、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）－毛様体神経栄養因子受容体（ＣＮＴＦＲ）シグナル伝達を阻害する薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、ＫＲＡＳ変異型がんは、ＫＲＡＳ変異型非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、例えば、ＫＲＡＳ変異型肺腺がん（ＬＵＡＤ）などのＫＲＡＳ変異型肺がんである。例えば、本開示の方法の実施において、用途を見出すキットも提供される。

ヒトＬＵＡＤにおける腫瘍成長は、ＣＬＣＦ１によって増加され、ＣＮＴＦＲノックダウンによって減少される。パネルＡ：７２時間のＣＬＣＦ１処理は、未処理の対照と比較して、濃度依存的様式でＬＵＡＤ細胞株Ａ５４９、Ｈ２３、およびＨ３５８の血清飢餓後の細胞生存率を増加させる。パネルＢおよびＤ：組換えヒトＣＬＣＦ１は、Ａ５４９、Ｈ２３、およびＨ３５８において、濃度依存的（［ＣＬＣＦ１］＝１０ｎＭ）および（パネルＣおよびＤ）時間依存的（処理後１５分）様式の両方でＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）をリン酸化する。パネルＥ：ｓｈＣＮＴＦＲまたは対照ｓｈＧＦＰによるＣＮＴＦＲノックダウンのｑＲＴ－ＰＣＲ測定（各々４つの生物学的複製）。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。データは、平均±Ｓ．Ｄ．として表される。パネルＦ：示されたｓｈＲＮＡによるノックダウン後のＡ５４９の増殖。二元配置ＡＮＯＶＡ。パネルＧ：７日目のＣＮＴＦＲノックダウン後のＬＵＡＤ細胞の増殖率（群当たり３つの技術的複製を伴う４つの独立した生物学的複製）。一元配置ＡＮＯＶＡ。パネルＨ：Ａ５４９およびＨ２３におけるコロニー形成アッセイの代表的な写真。パネルＩ：パネルＨからのコロニー数の定量化。群当たり３つの技術的複製を伴う４つの独立した生物学的複製。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して＊＊＊ｐ＜０．００１。データは、平均±Ｓ．Ｄ．として表される。パネルＪ：Ａ５４９およびＨ２３の足場非依存的条件で成長した細胞からの球体の代表的な画像。パネルＫ：球体数の定量化（３つの生物学的複製）。一元配置ＡＮＯＶＡ。パネルＬ：示されたｓｈＲＮＡを伴うＡ５４９異種移植片の腫瘍体積の定量化。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して＊Ｐ＜０．０５。データは、平均±ＳＥＭとして表される。パネルＭ：示されたＬＵＡＤ細胞株異種移植片における最終時点の腫瘍体積の定量化。ひげは、最大値および最小値を特定し、箱は、７５パーセンタイルおよび２５パーセンタイルを示し、線は、中央値を示す。一元配置ＡＮＯＶＡ。パネルＮ：Ａ５４９異種移植片における、代表的なヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、ならびにホスホヒストンＨ３（ＰＨ３）および切断型カスパーゼ－３（ＣＣ３）の免疫組織化学（ＩＨＣ）。スケールバー：５０μｍ。パネルＯ：Ａ５４９、Ｈ２３、およびＨ２００９異種移植片におけるＰＨ３陽性およびＣＣ３陽性病巣の定量化。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。データは、平均±ＳＥＭとして表される。 酵母ディスプレイを使用したＣＮＴＦＲ受容体デコイの作製。パネルＡ：ｉ）ＣＮＴＦＲは、β受容体であるｇｐ１３０およびＬＩＦＲを介してシグナルを伝達する。ｉｉ）ＣＬＣＦ１がＣＮＴＦＲと複合体を形成すると、β受容体が活性化される。ｉｉｉ）可溶性ＣＮＴＦＲは、ＣＮＴＦＲ発現を欠く細胞においてもｇｐ１３０とＬＩＦＲがヘテロ二量体化することを可能にする。ｉｖ）β受容体に結合しない操作された可溶性ＣＮＴＦＲ（ｅＣＮＴＦＲ）は、アンタゴニストとして機能することができる。パネルＢ：酵母ディスプレイされたＣＮＴＦＲの概略図、ならびに酵母ディスプレイされたｗｔＣＮＴＦＲによる１０ｎＭ（シアン）および０ｎＭ（赤）のＣＬＣＦ１－Ｈｉｓへの結合を表す重ね合わされたフローサイトメトリードットプロット。パネルＣ：ｗｔＣＮＴＦＲ（ＷＴ）と比較した最初のＣＮＴＦＲライブラリおよび中間選別集団のフローサイトメトリーヒストグラムであり、０．５ｎＭのＣＬＣＦ１への結合を測定している。ＣＮＴＦＲを発現する酵母のゲート集団のみが示されている。パネルＤ：様々な濃度のＣＬＣＦ１による、親和性成熟酵母ディスプレイ化ＣＮＴＦＲ変異体の結合曲線、および測定された見かけのＫ_ｄ値。パネルＥ：選別２（赤）、選別４（青）、および選別６（オレンジ）について重ね合わせた代表的なフローサイトメトリードットプロットであり、非ＬＩＦＲ結合剤の濃縮を示す。パネルＦ：ＬＩＦＲ－Ｆｃに対する陰性スクリーニングから分離されたＹ１７７ＨおよびＫ１７８Ｎは、ＬＩＦＲ－Ｆｃ結合を相加的に減少させる。測定された見かけのＫ_ｄ値は、ＣＬＣＦ１に対する結合親和性を表す。データは、平均（ｎ＝３の独立した複製）±Ｓ．Ｄ．として表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ｅＣＮＴＦＲ構築物の特性評価。パネルＡ：ｗｔＣＮＴＦＲ（黄色）およびｅＣＮＴＦＲ（青色）の３Ｄ構造予測は、Ｐｈｙｒｅ２サーバー（タンパク質相同性／ａｎａｌｏｇＹ認識エンジンＶ２．０）により実行され、親和性成熟からの４つの変異（青色）、ＬＩＦＲ結合を減少させる２つの変異（緑）、ｇｐ１３０結合を減少させる２つの変異（マゼンタ）の位置を示しており、挿入図は、サイトカイン結合のためのＣＮＴＦＲの芳香族クラスターおよび保存残基（赤）ならびに親和性成熟からの変異（青）を示す。（パネルＢ）ＣＬＣＦ１、（パネルＣ）ｇｐ１３０－ＦｃおよびＬＩＦＲ－Ｆｃ、（パネルＤ）ＣＮＴＦ、ならびに（パネルＥ）マウスＣＬＣＦ１について、可溶性ｗｔＣＮＴＦＲおよびｅＣＮＴＦＲ構築物の結合親和性を比較した。Ｋ_ｄ値は、必要に応じて計算された。データは、対応するｗｔＣＮＴＦＲ構築物と比較した平均（ｎ＝３の独立した複製）±Ｓ．Ｄ．＊＊＊Ｐ＜０．００１として表される。パネルＦ：ｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃと、ＣＬＣＦ１－Ｈｉｓ、ＬＩＦＲ－Ｈｉｓ、およびｇｐ１３０－Ｈｉｓとの間の結合をブロックするｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの能力を測定するためのＥＬＩＳＡを使用した競合アッセイ。ＬＩＦＲ－Ｈｉｓおよびｇｐ１３０－Ｈｉｓが含まれている場合、複合体形成を誘導するためにＣＬＣＦ１（１０ｎＭ）も追加された。パネルＧおよびＨ：ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは、Ａ５４９およびＨ２３細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化（Ｙ７０５）を阻害する。パネルＩおよびＪ：ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは、血清飢餓状態のＡ５４９およびＨ２３細胞でＣＬＣＦ１が誘導する細胞の生存を阻害する。データは、平均±Ｓ．Ｄ．として表される（ｎ＝３の独立した複製）。対応する非ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃで処理された対照と比較した＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＬＵＡＤにおけるｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの遺伝子型特異性。パネルＡ：２．５μＭのｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃによる処理後の細胞株の生存率（群当たり４つの技術的複製を伴う３つの独立した生物学的複製）。パネルＢ：２４時間の血清飢餓後に血清、ＣＬＣＦ１、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ、ＣＬＣＦ１＋ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ、またはｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ＋血清で処理されたＡ５４９およびＨ２３のウエスタンブロット。パネルＣ：パネルＢからのウエスタンブロットの定量化。パネルＤ：２４時間の血清飢餓後に、血清、ＣＬＣＦ１、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ、ＣＬＣＦ１＋ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ、またはｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ＋血清で処理されたＡ５４９およびＨ２３に由来する細胞溶解物における、Ｒａｓ－ＧＴＰ ＥＬＩＳＡによって評価されたＲａｓ－ＧＴＰレベル。２つの生物学的複製が示されている。データは、平均（ｎ＝３の独立した複製）±Ｓ．Ｄ．として表される。 前臨床異種移植モデルにおけるｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの効果。パネルＡ：非担腫瘍ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ガンママウスにおける１０ｍｇ／ｋｇのｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの腹腔内（ｉｐ）投与後の血液クリアランスおよびＣＬＣＦ１の隔離。注射後に血清試料を回収し、捕捉剤としてｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃを用いたＥＬＩＳＡにより未結合ＣＬＣＦ１を測定した。ビヒクルで処理されたマウスを使用して、ベースラインＣＬＣＦ１レベルを決定した。パネルＢ：Ａ５４９異種移植片の腫瘍体積の定量化［ＰＢＳを除いてｎ＝８の腫瘍（最終時点ではｎ＝６の腫瘍）］。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．＝二元配置ＡＮＯＶＡを使用して有意ではない。パネルＣ：Ａ５４９異種移植片の最終時点の腫瘍体積の定量化。パネルＤ：Ａ５４９異種移植片についてベースラインからの腫瘍パーセント変化を示すウォーターフォールプロット。パネルＥ：患者由来の異種移植片７２７（ＰＤＴＸ７２７）モデルの腫瘍体積の定量化（ｎ＝１６の腫瘍）。パネルＦ：ＰＤＴＸ７２７の最終時点の腫瘍体積の定量化、およびＰＤＴＸ７２７腫瘍の代表的な画像。スケールバー、１０ｍｍ。対応のないスチューデントの両側ｔ検定。パネルＧ：ＰＤＴＸモデルの最終時点の腫瘍体積の定量化。パネルＨ：Ａ５４９異種移植片からの代表的なＨ＆Ｅ染色、ならびにホスホヒストンＨ３（ＰＨ３）および切断型カスパーゼ－３（ＣＣ３）のＩＨＣ。スケールバー、５０μｍ。パネルＩ：ＰＨ３陽性およびＣＣ３陽性病巣の定量化。一元配置ＡＮＯＶＡ。パネルＪ：ＰＤＴＸ異種移植片からの代表的なＨ＆Ｅ染色、ならびにＰＨ３およびＣＣ３のＩＨＣ。スケールバー、５０μｍ。パネルＫ：ＰＨ３陽性およびＣＣ３陽性病巣の定量化。対応のないスチューデントの両側ｔ検定。パネルＬ：Ａ５４９異種移植片および（パネルＭ）ＰＤＴＸにおける、ホスホ－ＥＲＫ（Ｐ－ＥＲＫ）およびホスホ－Ｓ６ＲＰ（Ｐ－Ｓ６）の代表的なＩＨＣ。パネルＮ：Ａ５４９異種移植片のウエスタンブロット。パネルＯ：ウエスタンブロットの定量化。データは、平均±ＳＥＭとして表される。 自所性、ＫＲＡＳ誘導性の遺伝子操作マウスモデルにおけるｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの効果。パネルＡ：代表的な２Ｄ体軸マイクロＣＴ（μＣＴ）画像であり、５×１０^６ｐｆｕのＣｒｅ発現アデノウイルスの送達（０日目）の８週間後に開始して、４週間（２８日目）に渡り、週に３回、ＰＢＳまたはｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｄ／Ｐ５３^ｆ／ｆ（ＫＲＡＳ；Ｐ５３）マウスからの第８頸椎におけるマウス肺の断面図。赤い輪郭が心臓を囲み、赤い矢印が代表的な腫瘍結節を示す。パネルＢ：ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用したμＣＴ全身腫瘍組織量の定量化。任意単位（Ａ．Ｕ．）。パネルＣ：処理開始から２８日後の肺の代表的なＨ＆Ｅ画像。スケールバー、１ｍｍ。パネルＤ：全身腫瘍組織量（％）および（パネルＥ）腫瘍病巣に対する、処置の効果。対応のないスチューデントの両側ｔ検定を使用して＊＊＊Ｐ＜０．００１。データは、平均±ＳＥＭとして表される。パネルＦ：ＧＥＭモデルからのＰＨ３およびＣＣ３の代表的なＩＨＣ。パネルＧ：ＰＨ３陽性およびＣＣ３陽性病巣の定量化。対応のないスチューデントの両側ｔ検定を使用して＊＊＊Ｐ＜０．００１。パネルＨ：処理開始から２８日後のホスホ－ＥＲＫ（Ｐ－ＥＲＫ）、ホスホ－Ｓ６ＲＰ（Ｐ－Ｓ６）、およびホスホ－ＳＴＡＴ３（Ｐ－ＳＴＡＴ３）の代表的なＩＨＣ。パネルＩ：同じ実験からの、マウスの倫理的エンドポイントまでの生存のカプランマイヤー分析（群当たりｎ＝１１のマウス）。ログランク検定。パネルＪ：患者の血漿試料および正常対照に対して実施されたＣＬＣＦ１ ＥＬＩＳＡ。対象となる変異＝ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、およびＥＧＦＲ変異型／ＫＲＡＳ ｗｔ。 ４０種類のがんにわたるＣＬＣＦ１の発現。ＣＬＣＦ１の発現は、ｘ軸にｌｏｇ_２正規化転写物／百万（ＴＰＭ）としてプロットされる。データは、公開されているリポジトリ（ＴＣＧＡ）からダウンロードされた。図は、平均でランク付けされたｌｏｇ_２（ＴＰＭ＋１）としてプロットされる。青い線は、すべての試料にわたるＣＬＣＦ１発現の７５％分位数を示す。略語：Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（がんゲノムアトラス）、ＴＣＧＡ。

本開示の方法およびキットをより詳細に説明する前に、方法およびキットが、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、当然のことながら変動し得るということを理解されたい。また、方法およびキットの範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定的であることを意図しないことも理解されたい。

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈上そうではないと明確に指示されない限り下限の単位の１０分の１までの各介在値、およびその記載される範囲内の任意の他の記載値または介在値が、方法およびキットに包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲内に含まれてもよく、また、記載される範囲内の任意の具体的に除外された限度に従って、方法およびキット内に包含される。記載される範囲が上下限の一方または両方を含む場合、それらの含まれる上下限のいずれかまたは両方を除く範囲もまた、方法およびキットに含まれる。

特定の範囲は、数値の前に用語「約」が付された状態で本明細書に提示される。「約」という用語は、それが先行する正確な数字、およびその用語が先行する数字に近接または近似する数字に逐語的サポートを提供するために本明細書において使用される。ある数が特定の記載された数に近接または近似するかどうかを決定するにあたり、近似または近似であるが記載はされていない数とは、具体的に記載された数と（それが提示されている文脈において）実質的に等価なものを提供する数であり得る。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当該方法およびキットが属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等のいかなる方法およびキットも、当該方法およびキットの実施または試験に使用することができるが、代表的な例示的方法およびキットについてここで記載する。

本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、その刊行物が引用されるところに関連する方法および／または材料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物の引用は、本出願日前のその開示についてのものであり、提供される公開日は実際の公開日とは異なる可能性があり独立して確認する必要があり得るため、本方法およびキットがそのような刊行物に先行する権利を有しないという自認として解釈されるべきではない。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は任意選択的な要素を排除するように起草され得ることにさらに留意されたい。このように、この記述は、クレーム要素の記載に関連して「専ら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用または「負の」限定の使用のための文言的根拠としての役割を果たすことを意図する。

明確性のために別々の実施形態の文脈中に記載されている方法およびキットのある特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせても提供され得ることが理解される。逆に、簡潔性のために単一の実施形態の文脈中に記載されている方法およびキットの様々な特徴は、別々に、または任意の好適な部分的組み合わせで提供されてもよい。実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、このような組み合わせが実施可能なプロセスおよび／または組成物を包含する限りにおいて、まさに各々の組み合わせ全てが個別にかつ明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。さらに、そのような可変要素を記載している実施形態に列挙されているすべてのサブコンビネーションも、本発明の方法およびキットによって具体的に包含され、そのような各サブコンビネーションが個々に、かつ明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。

本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態の各々は、本開示の方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の構成要素および特徴を有する。いかなる列挙された方法も、列挙された事象の順序で、または論理的に可能なあらゆる他の順序で、実行され得る。

方法
本開示は、個体におけるＫＲＡＳ変異型がんを治療する方法を提供する。ある特定の実施形態において、方法は、ＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に、有効量の、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）－毛様体神経栄養因子受容体（ＣＮＴＦＲ）シグナル伝達を阻害する薬剤を投与することを含む。本開示は、ＫＲＡＳ変異型がんにおけるＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達軸を標的とすることが著しい抗腫瘍効果を提供するという、本明細書で初めて実証された驚くべき発見に部分的に基づいている。ここで、本開示の方法の実施形態に関する詳細を説明する。

ＫＲＡＳ変異型がん
上に要約したように、該薬剤は、ＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に投与される。「ＫＲＡＳ変異型がん」とは、その開始および／または維持が、ＫＲＡＳ（ヒト：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１１６）をコードする遺伝子の１つ以上の変異に少なくとも部分的に依存しているがんを意味する。ある特定の実施形態において、１つ以上のＫＲＡＳ変異は、ＫＲＡＳ変異型がんのがん細胞において構成的にＫＲＡＳを活性化し、続いて、その下流のＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ１／２および／またはＰＩ３Ｋ／ＰＩＰ３／ＡＫＴ生存経路を活性化する。

本明細書で使用される場合、「がん」は、１つ以上のがん細胞を含み、「がん細胞」は、新生物細胞表現型を呈する細胞を意味し、これは、例えば、異常な細胞成長、異常な細胞増殖、密度依存性の成長阻害の喪失、足場非依存性の成長能力、免疫無防備状態の非ヒト動物モデルにおける腫瘍成長および／もしくは発達を促進する能力、ならびに／または細胞形質転換の適切な指標のうちの１つ以上によって特徴付けられ得る。本明細書において「がん細胞」は、「腫瘍細胞」、「悪性細胞」または「がん性細胞」と互換的に使用され得、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍などのがん細胞を包含する。

ある特定の実施形態において、個体は、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍などの存在を特徴とするＫＲＡＳ変異型がんを有する。いくつかの実施形態によれば、個体は、乳がん、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、頭頸部がん、胃がん、卵巣がん、皮膚がん（例えば、基底細胞がん、メラノーマなど）、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、神経膠腫、膀胱がん、子宮内膜がん、腎臓がん、白血病（例えば、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）など）、肝臓がん（例えば、原発性または再発性ＨＣＣなどの肝細胞がん（ＨＣＣ）、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫など）、膵臓がん、甲状腺がん、それらの任意の組み合わせ、およびそれらの任意のサブタイプから選択されるＫＲＡＳ変異型がんを有する。ある特定の実施形態において、個体のＫＲＡＳ変異型がんは、ヒト膵管腺がん（ＰＤＡＣ）、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、および／または胆管がんである。本開示の任意の実施形態において、ＫＲＡＳ変異型がんは、腫瘍微小環境におけるＣＬＣＦ１の存在を特徴とするものであり得る。ＣＬＣＦ１の発現を呈するがんの非限定的な例を図７に示す。

ある特定の実施形態において、ＫＲＡＳ変異型がんは、ＫＲＡＳ変異型肺がんである。本開示の方法に従って治療され得るＫＲＡＳ変異型肺がんの非限定的な例には、ＫＲＡＳ変異体小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）およびＫＲＡＳ変異型非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が含まれる。個体がＫＲＡＳ変異型ＮＳＣＬＣを有する場合、いくつかの実施形態では、個体は、ＫＲＡＳ変異型肺腺がん（ＬＵＡＤ）を有する。

いくつかの実施形態によれば、ＫＲＡＳ変異型がんは、ＫＲＡＳ変異型膵臓がんである。本開示の方法に従って治療され得るＫＲＡＳ変異型膵臓がんの非限定的な例には、ＫＲＡＳ変異型ヒト膵管腺がん（ＰＤＡＣ）が含まれる。

ＫＲＡＳ変異型がんは、様々な１つ以上のＫＲＡＳ変異のうちのいずれかによって特徴づけられ得る。ＫＲＡＳ変異の非限定的な例には、ＫＲＡＳをコードする遺伝子における挿入、欠失、１つ以上のアミノ酸置換誘導変異などが含まれる。いくつかの実施形態によれば、ＫＲＡＳ変異型がんは、ヒトＫＲＡＳ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１１６）の１つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、そのアミノ酸配列は、以下の表１に提供される。ある特定の実施形態において、ＫＲＡＳ変異型がんは、ヒトＫＲＡＳの１２、１３、６１、１１７、および１４６位のうちの１つ以上でのアミノ酸置換を含む。例として、ＫＲＡＳ変異型がんは、ヒトＫＲＡＳにおける以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上を含み得る：Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｋ１１７Ｎ、およびＡ１４６Ｔ。いくつかの実施形態によれば、ＫＲＡＳ変異型がんは、ＫＲＡＳの１２位に置換を含む。ＫＲＡＳ変異型がんが１２位に置換を含む場合、ＫＲＡＳ変異型がんは、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、およびＧ１２Ｖから選択されるアミノ酸置換を含むか、またはそれからなり得る（この文脈で使用される「からなる」は、該アミノ酸置換がＫＲＡＳ変異型がんにおける唯一のＫＲＡＳ変異であることを意味する）。ＫＲＡＳ変異型がんが１２位に置換を含む場合、ＫＲＡＳ変異型がんは、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、およびＧ１２Ｖから選択されるアミノ酸置換を含むか、またはそれからなり得る。ある特定の実施形態において、ＫＲＡＳ変異型がんは、アミノ酸置換Ｇ１２Ａを含むか、またはそれからなる。ある特定の実施形態において、ＫＲＡＳ変異型がんは、アミノ酸置換Ｇ１２Ｃを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態によれば、ＫＲＡＳ変異型がんは、アミノ酸置換Ｇ１２Ｄを含むか、またはそれからなる。ある特定の実施形態において、ＫＲＡＳ変異型がんは、アミノ酸置換Ｇ１２Ｒを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態によれば、ＫＲＡＳ変異型がんは、アミノ酸置換Ｇ１２Ｓを含むか、またはそれからなる。ある特定の実施形態において、ＫＲＡＳ変異型がんは、アミノ酸置換Ｇ１２Ｖを含むか、またはそれからなる。

本明細書で使用される場合、ＫＲＡＳ変異型がんを有すると「特定された」個体に薬剤が投与されることとは、個体がＫＲＡＳ変異型がんまたはそのサブタイプを有するという投与前の知識、例えば、個体のがんが、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｋ１１７Ｎ、またはＡ１４６ＴなどのＫＲＡＳの１２位のアミノ酸置換を含むか、またはそれからなるＫＲＡＳ変異型がんであるという知識に少なくとも部分的に基づいて、薬剤が個体に投与されることを意味する。

ある特定の実施形態において、本開示の方法は、ＫＲＡＳ変異型がんを有するとして個体を特定することをさらに含む。個体を、ＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定することは、例えば、個体のがんがＫＲＡＳ変異型がんまたはそのサブタイプであることを示す報告を受け取り査収（review）すること、例えば、個体のがんがＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｋ１１７Ｎ、またはＡ１４６ＴなどのＫＲＡＳの１２位のアミノ酸置換を含むか、またはそれからなるＫＲＡＳ変異型がんであることを示す報告を受け取り、査収することを含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＫＲＡＳ変異型がんを有するとして個体を特定することは、個体のがんがＫＲＡＳ変異型がんであると決定することを含む。個体のがんがＫＲＡＳ変異型がんであると決定するために様々なアプローチを採用することができ、その非限定的な例には、１つ以上のＫＲＡＳ変異についてがんの生検試料をアッセイすることが含まれる。好適なアッセイには、個体のがん細胞におけるＫＲＡＳをコードする遺伝子もしくはｍＲＮＡ転写物の配列決定をすること（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓなどから入手可能な核酸配列決定システムを使用する）、対象とする１つ以上の変異について、ＫＲＡＳをコードする遺伝子もしくはｍＲＮＡ転写物を調べる変異特異的増幅プライマーを使用してＰＣＲを実行すること、１つ以上の特定の変異型ＫＲＡＳタンパク質に特異的に結合する１つ以上の抗体を使用する抗体ベースのアッセイを使用すること、および／または個体のがんが１つ以上のＫＲＡＳ変異を含むかどうかを決定するための任意の他の好適なアッセイが含まれるが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態において、薬剤は、特定のタイプのＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体にのみ投与される。例えば、いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ＫＲＡＳの１２位にアミノ酸置換を含むＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体にのみ投与され、ここで番号付けは配列番号１と同じである。ある特定の実施形態において、薬剤は、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、およびＧ１２Ｖからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体にのみ投与される。いくつかの実施形態によれば、薬剤は、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、およびＧ１２Ｖからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体にのみに投与され、かつ個体が閾値血漿ＣＬＣＦ１濃度を超える血漿ＣＬＣＦ１濃度を有すると特定された場合のみに投与される。本明細書で使用される場合、「のみに投与される」とは、個体が特定の基準、例えば、ＫＲＡＳ変異（複数可）のタイプ、血漿ＣＬＣＦ１濃度などを満たさない限り、該薬剤が個体に投与されないことを意味する。

ＫＲＡＳ変異型がんを有する個体は、様々であり得る。ある特定の実施形態において、個体は、「哺乳動物」または「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食目（例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯目（例えば、マウス、モルモット、およびラット）、および霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む哺乳類綱内の生物を記述するために広く使用される。いくつかの実施形態によれば、個体は、ヒトである。ある特定の実施形態において、個体は、がん、例えば、ＫＲＡＳ変異型がんの動物モデル（例えば、マウスモデル、霊長類モデルなど）である。

薬剤
ＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に投与される薬剤は、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）－毛様体神経栄養因子受容体（ＣＮＴＦＲ）シグナル伝達を阻害する（例えば、減少させるか、または遮断する）任意の薬剤であり得る。使用することができる薬剤には、小分子、タンパク質ベースの薬剤（例えば、ペプチド、抗体、操作されたリガンド、操作された受容体など）などが含まれる。薬剤は、例えばインビボイメージング剤などで、検出可能に標識化され得る。薬剤は、他の化学部分、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などにさらにコンジュゲートされ得る。抗体Ｆｃ領域（またはその断片）への融合、ＰＥＧへのコンジュゲートなどは、例えば、対象への投与の際に薬剤の血清半減期を増加させるための有用性を見出し得る。

「小分子」とは、１０００原子質量単位（ａｍｕ）以下の分子量を有する化合物を意味する。いくつかの実施形態では、小分子は７５０ａｍｕ以下、５００ａｍｕ以下、４００ａｍｕ以下、３００ａｍｕ以下、または２００ａｍｕ以下である。

いくつかの実施形態によれば、薬剤は、抗体である。「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）、全抗体（例えば四量体で構成される抗体であってその四量体がさらに重鎖および軽鎖ポリペプチドの２つの二量体で構成されるもの）；一本鎖抗体；Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、（ｓｃＦｖ’）_２、およびダイアボディーを含むがこれらに限定されない、標的への特異的結合を保持する抗体の断片（例えば、全抗体または一本鎖抗体の断片）；キメラ抗体；モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（例えば、ヒト化全抗体、ヒト化抗体断片など）、ならびに抗体の抗原結合部分および非抗体タンパク質またはその断片（例えば、抗体Ｆｃ領域またはその断片）を含む融合タンパク質を含む。

ＣＮＴＦＲに結合する薬剤
ある特定の実施形態において、方法は、ＣＮＴＦＲに特異的に結合してＣＮＴＦＲを介したシグナル伝達を阻害する薬剤を投与することを含む。そのような薬剤は、例えば、小分子、抗体、ＣＮＴＦＲリガンド（例えば、操作されたＣＮＴＦＲリガンド）などであり得る。そのような薬剤の非限定的な例は、ＣＮＴＦＲに特異的に結合してＣＮＴＦＲとそのリガンド、例えば、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＮＰなどとの間の相互作用を阻害するものである。ＣＮＴＦＲは、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）ならびにカルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）およびニューロポエチン（ＮＰ）などの他のリガンドに対する、三成分受容体のリガンド特異的成分である。ＣＮＴＦＲへの野生型リガンドの結合は、受容体の膜貫通成分であるｇｐ１３０および白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）を動員し、シグナル伝達を促進する。ヒトＣＮＴＦＲ、ＣＮＴＦ、ＣＬＣＦ１、およびＮＰの野生型アミノ酸配列を表２に示す。

いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ＣＮＴＦＲまたはリガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニット（例えば、ｇｐ１３０またはＬＩＦＲ）に特異的に結合して、ＣＮＴＦＲとリガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットとの間の相互作用を阻害する。

ある特定の実施形態において、薬剤は、操作されたＣＮＴＦＲリガンドである。本明細書で使用される場合、「操作されたＣＮＴＦＲリガンド」は、ＣＮＴＦＲに結合するポリペプチドであり、変異体ＣＮＴＦリガンド、変異体ＣＬＣＦ１リガンド、または変異体ＮＰリガンドなどの、野生型ＣＮＴＦＲリガンドの変異体である。「変異体」とは、操作されたＣＮＴＦＲリガンドが、対応する野生型ＣＮＴＦＲリガンドと比較して、１つ以上の変異を含むことを意味する。例えば、操作されたＣＮＴＦリガンドは、野生型ＣＮＴＦと比較して１つ以上の変異を含み得、本開示のＣＬＣＦ１リガンドは、野生型ＣＬＣＦ１と比較して１つ以上の変異を含み得る、などである。本開示を通して使用される場合、「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」または「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」は、対応する野生型ポリペプチドと比較して、ポリペプチドにおいて１つ以上のアミノ酸置換、１つ以上のアミノ酸欠失（例えば、トランケーション）、１つ以上のアミノ酸挿入、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

いくつかの実施形態によれば、薬剤が操作されたＣＮＴＦＲリガンドである場合、薬剤は、対応する野生型ＣＮＴＦＲリガンドと比較してＣＮＴＦＲに対する結合親和性の増加を呈する、操作されたＣＮＴＦＲリガンドである。ある特定の実施形態において、薬剤が、操作されたＣＮＴＦＲリガンドである場合、薬剤は、対応する野生型ＣＮＴＦＲリガンドおよびＣＮＴＦＲを含む複合体に対する結合親和性と比較してその操作されたＣＮＴＦＲリガンドおよびＣＮＴＦＲを含む複合体に対するｇｐ１３０、ＬＩＦＲ、またはその両方の結合親和性の低下をもたらす、操作されたＣＮＴＦＲリガンドである。いくつかの実施形態によれば、薬剤が、操作されたＣＮＴＦＲリガンドである場合、薬剤は、対応する野生型ＣＮＴＦＲリガンドと比較してＣＮＴＦＲに対する結合親和性の増加を呈し、かつ、対応する野生型ＣＮＴＦＲリガンドおよびＣＮＴＦＲを含む複合体に対する結合親和性と比較してその操作されたＣＮＴＦＲリガンドおよびＣＮＴＦＲを含む複合体に対するｇｐ１３０、ＬＩＦＲ、またはその両方の結合親和性の低下をもたらす、操作されたＣＮＴＦＲリガンドである。「結合親和性の増加」または「より高い結合親和性」とは、ＣＮＴＦＲリガンドが、対応する野生型ＣＮＴＦＲリガンドと比較して、ＣＮＴＦＲへのより密接な結合（より低いＫ_Ｄ値によって示されるように）を呈することを意味する。例として、ある特定の態様において、ＣＮＴＦＲリガンドが変異体ＣＬＣＦ１リガンドである場合、ＣＮＴＦＲに対するＣＬＣＦ１リガンドの結合親和性は、２０ｎＭ以下のＫ_Ｄ値を有する。

本明細書で使用される場合、第１の分子が例えば約１０^５Ｍ^－１以上の親和性またはＫ_ａ（すなわち、１／Ｍの単位による特定の結合相互作用の平衡会合定数）で第２の分子に結合または会合するならば、第１の分子は第２の分子に「特異的に結合」する。ある特定の実施形態において、第１の分子は、約１０^６Ｍ^－１、１０^７Ｍ^－１、１０^８Ｍ^－１、１０^９Ｍ^－１、１０^１０Ｍ^－１、１０^１１Ｍ^－１、１０^１２Ｍ^－１、または１０^１３Ｍ^－１以上のＫ_ａで第２の分子に結合する。「高親和性」結合は、少なくとも１０^７Ｍ^－１、少なくとも１０^８Ｍ^－１、少なくとも１０^９Ｍ^－１、少なくとも１０^１０Ｍ^－１、少なくとも１０^１１Ｍ^－１、少なくとも１０^１２Ｍ^－１、少なくとも１０^１３Ｍ^－１、またはそれを超えるＫ_ａでの結合を指す。あるいは、親和性は、Ｍの単位による特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）（例えば、１０^－５Ｍ～１０^－１３Ｍ、またはそれ未満）として定義され得る。ある特定の態様において、特異的結合は、約１０^－５Ｍ以下、約１０^－６Ｍ以下、約１０^－７Ｍ以下、約１０^－８Ｍ以下、または約１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、もしくは１０^－１２Ｍ以下のＫ_Ｄで標的分子に結合することを意味する。標的に対する第１の分子の結合親和性は、従来の技術を使用して、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、平衡透析によって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、製造業者によって概説された一般的な手順を使用するＢＩＡｃｏｒｅ２０００機器）の使用によって、ラジオイムノアッセイによって、等で容易に決定することができる。

ある特定の実施形態において、対応する野生型ＣＮＴＦＲリガンドと比較してＣＮＴＦＲに対する結合親和性の増加を呈するＣＮＴＦＲリガンドは、ＣＬＣＦ１リガンド（「変異体ＣＬＣＦ１」または「操作されたＣＬＣＦ１」と呼ばれ得る）である。いくつかの実施形態では、そのようなＣＬＣＦ１リガンドは、アミノ酸位置８６、９６、１４８、１６９、１８０、またはそれらの任意の組み合わせに１つ以上の変異を含み得、ここで番号付けは配列番号３と同じである。例として、そのようなＣＬＣＦ１リガンドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＬＣＦ１リガンドと比較して、Ｌ８６Ｆ、Ｑ９６Ｒ、Ｈ１４８Ｒ、Ｗ１６９Ｌ、Ｋ１８０Ｒ、およびそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の変異を含み得る。ＣＮＴＦＲに対する結合親和性の増加を呈するＣＬＣＦ１変異体の非限定的な例、ならびに追加のそのような変異体を同定するための戦略は、ＵＳＳＮ１６／４６５，７２６に記載されており、その開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＣＮＴＦＲリガンドは、ＣＮＴＦＲリガンドおよびＣＮＴＦＲを含む複合体に対するｇｐ１３０の結合親和性の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、そのようなリガンドは、アミノ酸位置２２、１６９、１８０、またはそれらの任意の組み合わせに１つ以上の変異を含むＣＬＣＦ１リガンドであり、ここで番号付けは配列番号３と同じである。例として、そのようなＣＬＣＦ１リガンドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＣＬＣＦ１リガンドと比較して、Ｙ２２Ｃ、Ｗ１６９Ｌ、Ｋ１８０Ｒ、およびそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の変異を含み得る。ＣＬＣＦ１変異体およびＣＮＴＦＲを含む複合体に対するｇｐ１３０の結合親和性の低下をもたらすＣＬＣＦ１変異体の非限定的な例、ならびに追加のそのような変異体を同定するための戦略は、ＵＳＳＮ１６／４６５，７２６に記載されており、その開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、直接結合アッセイにおいて、フルオロフォアもしくは放射性同位体にコンジュゲートさせたＣＮＴＦＲリガンド、ｇｐ１３０、もしくはＬＩＦＲ、または標識抗体による検出のためのＮ末端もしくはＣ末端エピトープタグを含有するＣＮＴＦＲリガンド、ｇｐ１３０、もしくはＬＩＦＲを用いて、平衡結合定数（Ｋ_Ｄ）を測定することができる。標識またはタグが実行可能でないか、または望まれない場合、競合結合アッセイを使用して、標識競合物の最大シグナルの５０％が検出可能となる非標識ＣＮＴＦＲリガンド、ｇｐ１３０、またはＬＩＦＲの量である最大半量阻害濃度（ＩＣ_５０）を決定することができる。次いで、測定されたＩＣ_５０値からＫ_Ｄ値を計算することができる。

本開示のＣＮＴＦＲリガンドの２つの非限定的な例のアミノ酸配列は、以下の表３に提供される。

表３の例示的なＣＮＴＦＲリガンドは、操作されたＣＬＣＦ１変異体である。両方の変異体は、野生型ＣＬＣＦ１と比較してＣＮＴＦＲに対する結合親和性の増加を呈する。第２の変異体はさらに、この変異体およびＣＮＴＦＲを含む複合体に対するｇｐ１３０およびＬＩＦＲの結合親和性の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＮＴＦＲリガンドは、表３に示されるＣＮＴＦＲリガンドである。いくつかの実施形態では、そのようなＣＮＴＦＲリガンドは、融合タンパク質（例えば、Ｆｃドメインに融合されたもの）、コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ、薬物などにコンジュゲートされたもの）、またはそれらの組み合わせ中に存在する。

ある特定の実施形態において、本開示のＣＮＴＦＲリガンドは、ＣＮＴＦＲに結合し、表３に示されるＣＮＴＦＲリガンドに対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、そのようなＣＮＴＦＲリガンドは、融合タンパク質（例えば、Ｆｃドメインに融合されたもの）、コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ、薬物などにコンジュゲートされたもの）、またはそれらの組み合わせ中に存在する。

ある特定の態様において、ＣＮＴＦＲリガンドは、ＣＮＴＦＲに結合するＣＬＣＦ１変異体であり、Ｌ８６Ｆ、Ｑ９６Ｒ、Ｈ１４８Ｒ、およびそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸置換を含み、ここで該ＣＬＣＦ１変異体は、配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、そのようなＣＮＴＦＲリガンドは、融合タンパク質（例えば、Ｆｃドメインに融合されたもの）、コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ、薬物などにコンジュゲートされたもの）、またはそれらの組み合わせ中に存在する。

ある特定の態様において、ＣＮＴＦＲリガンドは、ＣＮＴＦＲに結合するＣＬＣＦ１変異体であり、Ｙ２２Ｃ、Ｌ８６Ｆ、Ｑ９６Ｒ、Ｈ１４８Ｒ、Ｆ１５１Ａ、Ｋ１５４Ａ、Ｗ１６９Ｌ、Ｋ１８０Ｒ、およびそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸置換を含み、ここで該ＣＬＣＦ１変異体は、配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、そのようなＣＮＴＦＲリガンドは、融合タンパク質（例えば、Ｆｃドメインに融合されたもの）、コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ、薬物などにコンジュゲートされたもの）、またはそれらの組み合わせ中に存在する。

ＣＬＣＦ１に結合する薬剤
ある特定の実施形態において、ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達を阻害する薬剤は、ＣＬＣＦ１に特異的に結合して、ＣＮＴＦＲを介したシグナル伝達を阻害する薬剤である。そのような薬剤は、例えば、小分子、抗体、ＣＬＣＦ１受容体（例えば、操作された可溶性ＣＬＣＦ１受容体）などであり得る。そのような薬剤の非限定的な例は、ＣＬＣＦ１に特異的に結合して、ＣＬＣＦ１とＣＮＴＦＲとの間の相互作用を阻害するものである。

いくつかの実施形態によれば、ＣＬＣＦ１に特異的に結合する薬剤は、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドである。「可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド」とは、細胞膜に組み込まれていないＣＮＴＦＲポリペプチドを意味する。野生型ヒトＣＮＴＦＲアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６９９２）を下の表４に提供する。

ある特定の実施形態によれば、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、溶解性を付与する１つ以上の変異を有するポリペプチドのおかげで細胞膜に組み込まれない。溶解性を付与する１つ以上の変異は、ＣＮＴＦＲポリペプチドの任意の好適な領域（複数可）に位置し得る。ある特定の態様において、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するドメインにおいて溶解性を付与する１つ以上の変異を含む。このドメインは、タンパク質を細胞膜に固定するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）で翻訳後修飾される脂質化部位（Ｓ３４２）を含有する。ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定する野生型ヒトＣＮＴＦＲドメインは、アミノ酸３４３～３７２からなると定義することができ、ここで番号付けは配列番号８と同じである（表４において下線で示される）。ある特定の条件下で、ＣＮＴＦＲのこの部分は、細胞膜からＣＮＴＦＲを放出するように酵素的に改変される。いくつかの実施形態によれば、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ＧＰＩによる翻訳後修飾を妨げる置換変異をＳ３４２に含み、それによって溶解性を付与する。野生型ヒトＣＮＴＦＲはまた、配列番号８のアミノ酸１～２２からなるシグナルペプチドを含む（表４において下線で示される）。

ある特定の実施形態によれば、ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するＣＮＴＦＲドメインは、ＣＮＴＦＲポリペプチドが細胞膜に固定される能力を喪失させる１つ以上のアミノ酸置換を含み、それによって溶解性を付与する。それに替えて、またはそれに加えて、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ＣＮＴＦＲポリペプチドが細胞膜に固定される能力を喪失させるトランケーションを含んでもよく（例えば、ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するＣＮＴＦＲドメインにおいて）、それによって溶解性を付与する。ある特定の態様において、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するＣＮＴＦＲドメインを欠いている。例えば、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、配列番号８に記載のアミノ酸３４３～３７２を欠いていてもよい。

溶解性を付与する１つ以上の変異を任意で含むことに加えて、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ポリペプチドに１つ以上の他の望ましい特性を付与する１つ以上の突然変異を含み得る。対象とする他の望ましい特性としては、野生型ＣＮＴＦ受容体、例えば配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する受容体またはその成熟型と比較して、ＣＬＣＦ１に対するより高い結合親和性、１つ以上の他のＣＮＴＦＲリガンドと比べてＣＬＣＦ１に対して改変された（例えばより高い）特異性、リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニット（例えば、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲなど）に対して改変された（例えば、低下された）結合親和性が挙げられるが、これらに限定されない。

「より高い結合親和性」または「結合親和性の増加」とは、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、野生型ＣＮＴＦ受容体と比較して、ＣＬＣＦ１に対してより緊密な結合（より低いＫ_Ｄ値によって示されるように）を呈することを意味する。「より低い結合親和性」または「低下された結合親和性」とは、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、野生型ＣＮＴＦ受容体と比較して、ある分子（例えば、ＬＩＦＲ、ｇｐ１３０、またはその両方などのリガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニット）に対して緊密性がより低い結合（より高いＫ_Ｄ値によって示されるように）を示すことを意味する。

対象とする分子、例えば、ＣＬＣＦ１またはＬＩＦＲ、ｇｐ１３０などのリガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに対する、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤（例えば、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド）の結合親和性を測定するための方法が利用可能である。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００機器を使用する）、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）動的排除アッセイ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ（登録商標））、または他の類似のアッセイ／技術が、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤が所望の結合親和性を示すかどうかを決定するために用いられ得る。本開示の文脈において結合親和性を測定するための好適な手法は、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｊ．Ｒ．（２０１６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８０：２１－４４に記載されるものを含む。

いくつかの実施形態では、直接結合アッセイにおいて、フルオロフォアもしくは放射性同位体にコンジュゲートされたＣＮＴＦＲポリペプチド、または標識抗体による検出のためのＮ末端もしくはＣ末端エピトープタグを含有するＣＮＴＦＲポリペプチドを用いて、平衡結合定数（Ｋ_Ｄ）を測定することができる。標識またはタグが実行可能でないかまたは望まれない場合、競合結合アッセイを使用して、標識競合物の最大シグナルの５０％が検出可能となる非標識ＣＮＴＦＲポリペプチドの量である最大半量阻害濃度（ＩＣ_５０）を決定することができる。次いで、測定されたＩＣ_５０値からＫ_Ｄ値を計算することができる。

上記に要約したように、ある特定の態様において、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦ受容体、例えば、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する受容体またはその成熟型と比較して、ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を変化させる（例えば、低下させる）１つ以上の変異を含む。「ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニット」とは、ＣＮＴＦＲがＣＬＣＦ１に結合する際に野生型ＣＮＴＦＲと会合するタンパク質を意味する。リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットの非限定的な例には、ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０が含まれる。ある特定の実施形態において、１つ以上の変異は、ＬＩＦＲ、ｇｐ１３０、またはその両方に対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を低下させる。１つ以上の変異は、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドがＣＬＣＦ１に結合した際にアゴニストとして作用することを妨げて、ＣＮＴＦＲ媒介シグナル伝達を低減させ得る（例えば、細胞増殖を低減させ得る）。

いくつかの実施形態では、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドがＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに対する結合親和性の低下を呈する場合、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性は、１０ｎＭのＣＬＣＦ１の存在下で１００ｎＭ以上のＫ_Ｄ値を有する。

ある特定の態様において、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ＬＩＦＲに対する低下された結合親和性を有し、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、アミノ酸位置１７７、１７８、またはその両方に変異（例えば、アミノ酸置換）を含む。１７７位の例示的な変異はＹ１７７Ｈである。１７７位の別の例示的な変異はＹ１７７Ａである。１７８位の例示的な変異はＫ１７８Ｎである。１７８位の別の例示的な変異はＫ１７８Ａである。そのような変異は、ＣＮＴＦＲシグナル伝達の阻害剤である可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドをもたらすのに対し、ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに対する未変化の親和性を有する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ＣＬＣＦ１に結合する際に例えばＬＩＦＲおよびｇｐ１３０を動員するその能力によってアゴニストとして作用する。ある特定の態様において、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、変異Ｙ１７７ＨおよびＫ１７８Ｎ、または変異Ｙ１７７ＡおよびＫ１７８Ａ、または変異Ｙ１７７ＨおよびＫ１７８Ａ、または変異Ｙ１７７ＡおよびＫ１７８Ｎを含む。

ある特定の実施形態によれば、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、ｇｐ１３０に対する低下された結合親和性を有し、アミノ酸位置２６８、２６９、またはその両方に変異（例えば、アミノ酸置換）を含む。２６８位の例示的な変異はＴ２６８Ａである。２６９位の例示的な変異はＤ２６９Ａである。ある特定の態様において、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、変異Ｔ２６８ＡおよびＤ２６９Ａを含む。

上記に要約したように、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦ受容体、例えば、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する受容体またはその成熟型と比較して、ＣＬＣＦ１に対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性および／または特異性を変化させる（例えば、増加させる）１つ以上の変異を含み得る。ある特定の実施形態によれば、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドがＣＬＣＦ１に対する結合親和性の増加を呈する場合、ＣＬＣＦ１に対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性は、１０ｎＭ以下のＫ_Ｄ値を有する。

いくつかの実施形態では、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ＣＬＣＦ１に対する結合親和性および／または特異性を増加させる１つ以上の変異を含む。ある特定の態様において、そのような可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、アミノ酸位置１１０、１７４、２３７、２８７、またはそれらの任意の組み合わせに変異（例えば、アミノ酸置換）を含む。１１０位の例示的な変異はＲ１１０Ｑである。１７４位の例示的な変異はＴ１７４Ｐである。２３７位の例示的な変異はＳ２３７Ｆである。２３７位の別の例示的な変異はＳ２３７Ｙである。２８７位の例示的な変異はＩ２８７Ｆである。ある特定の態様において、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、変異Ｒ１１０Ｑ、Ｔ１７４Ｐ、Ｓ２３７Ｆ／Ｓ２３７Ｙ、およびＩ２８７Ｆのうちの１つまたは任意の組み合わせ（例えば、各々）を含む。

いくつかの実施形態では、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、アミノ酸位置１１０、１７４、１７７、１７８、２３７、２６８、２６９、２８７、またはそれらの任意の組み合わせに変異（例えば、アミノ酸置換）を含む。

ある特定の態様において、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、変異Ｒ１１０Ｑ、Ｔ１７４Ｐ、Ｙ１７７Ｈ／Ｙ１７７Ａ、Ｋ１７８Ｎ／Ｋ１７８Ａ、Ｓ２３７Ｆ／Ｓ２３７Ｙ、Ｔ２６８Ａ、Ｄ２６９Ａ、およびＩ２８７Ｆのうちの１つまたは任意の組み合わせ（例えば、各々）を含む。

一実施形態による可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、下の表５に記載のアミノ酸配列（配列番号９）を含む。表５において、変異は太字／下線で示される。この例では、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する野生型ＣＮＴＦ受容体と比較して、アミノ酸３４３～３７２のＣ末端トランケーションを含む。ある特定の態様において、そのような可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドはシグナルペプチド（表５において下線で示される）を含まない。

ある特定の実施形態によれば、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、配列番号８もしくは配列番号９のアミノ酸２３～３４２に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらの断片、例えば、２５０～３１９個のアミノ酸、２５０～２６０個のアミノ酸、２６０～２７０個のアミノ酸、２７０～２８０個のアミノ酸、２８０～２９０個のアミノ酸、２９０～３００個のアミノ酸、３００～３１０個のアミノ酸、もしくは３１０～３１９個のアミノ酸の長さを有する断片を含む。可溶性であることに加えて、そのようなＣＮＴＦＲポリペプチドは、１つ以上のリガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニット（例えば、ＬＩＦＲ、ｇｐ１３０、またはその両方）に対する結合親和性の低下、ＣＮＴＦＲ１に対する結合親和性／特異性の増加、ＣＮＴＦＲリガンド（例えば、ＣＮＴＦ、ＮＰなど）に対する結合親和性の低下、およびそれらの任意の組み合わせなどの１つ以上の所望の特徴を含み得る。

いくつかの実施形態では、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、Ｒ１１０Ｑ、Ｔ１７４Ｐ、Ｙ１７７Ｈ、Ｋ１７８Ｎ、Ｓ２３７Ｆ、Ｔ２６８Ａ、Ｄ２６９Ａ、およびＩ２８７Ｆのうちの１つ以上（例えば、各々）のアミノ酸置換、ならびに、配列番号９のアミノ酸２３～３４２に対する７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態によれば、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、Ｆｃドメインに融合されている。そのような融合タンパク質については、以下でより詳細に説明する。Ｆｃドメインに融合された例示的な可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の表６に記載される（Ｆｃドメインには下線が引かれ、シグナルペプチドはイタリック体で示される）。

ある特定の実施形態によれば、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸２３～５７８に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらの断片、例えば、４５０～５５５個のアミノ酸、５００～５５５個のアミノ酸、５２５～５５５個のアミノ酸、５４０～５５５個のアミノ酸、もしくは５５０～５５５個のアミノ酸の長さを有する断片を含む。ある特定の態様において、そのような可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、シグナルペプチド（表６においてイタリック体で示される）を含まない。

ある特定の実施形態によれば、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド－Ｆｃ融合は、Ｒ１１０Ｑ、Ｔ１７４Ｐ、Ｙ１７７Ｈ、Ｋ１７８Ｎ、Ｓ２３７Ｆ、Ｔ２６８Ａ、Ｄ２６９Ａ、およびＩ２８７Ｆのうちの１つ以上（例えば、各々）のアミノ酸置換、ならびに、配列番号１０のアミノ酸２３～５７８に対する７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらの断片、例えば、４５０～５５５個のアミノ酸、５００～５５５個のアミノ酸、５２５～５５５個のアミノ酸、５４０～５５５個のアミノ酸、もしくは５５０～５５５個のアミノ酸の長さを有する断片を含む。ある特定の態様において、そのような可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、シグナルペプチド（表６においてイタリック体で示される）を含まない。

融合タンパク質およびコンジュゲート
ある特定の態様において、個体に投与される薬剤（例えば、本明細書の他の場所に記載される薬剤のうちのいずれか）は、異種部分に安定して付随する（例えば、融合され、コンジュゲートされ、または他の方法で付着される）。

いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドに融合したポリペプチドが薬剤であるところの、融合タンパク質が提供される。対象とする異種ポリペプチドとしては、Ｆｃドメイン（例えば、ヒトまたはマウスのＦｃドメイン）、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン－アラニン－セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、異種ポリペプチドは、その異種ポリペプチドと融合していない同じポリペプチド剤と比較して、個体に投与されたときに、ポリペプチド剤の安定性および／または血清半減期を増加させる。ある特定の態様において、ポリペプチド剤のうちのいずれかがヒトＦｃドメイン（例えば、全長ヒトＦｃドメインまたはその断片）と融合されたものを含む、融合タンパク質が提供される。本明細書の他の場所に記載されるポリペプチド剤のうちのいずれかと融合され得るヒトＦｃドメインの非限定的な例は、下の表７に記載される配列（配列番号１１）を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片である。

ある特定の実施形態によれば、薬剤が化学部分（moiety）にコンジュゲートされているコンジュゲートが提供される。対象とする化学部分として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、抗がん剤、検出可能な標識、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

対象とする抗がん剤には、細胞増殖を阻害する、かつ／またはがん細胞を死滅させる薬剤が含まれる。そのような薬剤は、様々であり得、細胞増殖抑制剤および細胞傷害性剤（例えば、標的細胞に内在化されることを伴うか、または伴わずに標的細胞組織を死滅させることができる薬剤）を含み得る。ある特定の態様において、治療薬は、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、およびビンカアルカロイドから選択される細胞傷害性剤である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ－１０６５、ＣＰＴ－１１（ＳＮ－３８）、トポテカン、ドキソルビシン、モルホリノ－ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、ドラスタチン－１０、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、メイタンシン、メイタンシンＤＭ１、メイタンシンＤＭ４、ＤＭ－１、アウリスタチンＥもしくはアウリスタチンＦのような、アウリスタチンもしくは他のドラスタチン誘導体、ＡＥＢ（ＡＥＢ－０７１）、ＡＥＶＢ（５－ベンゾイルバレリン酸－ＡＥエステル）、ＡＥＦＰ（抗体－エンドスタチン融合タンパク質）、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、エレウテロビン、ネットロプシン、またはこれらの任意の組み合わせである。ある特定の実施形態によれば、薬剤は、ＨＴＩ－２８６などのヘミアステリンおよびヘミアステリン類似体（例えば、参照によりそれらの全開示が本明細書に組み込まれる米国特許第７，５７９，３２３号、ＷＯ２００４／０２６２９３号、および米国特許第８，１２９，４０７号を参照）、アブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、バトラコトキシン、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、コレラ毒素、ファルカリノール、フモニシンＢ１、フモニシンＢ２、アフラトキシン、マウロトキシン（ｍａｕｒｏｔｏｘｉｎ）、アジトキシン、カリブドトキシン、マルガトキシン（ｍａｒｇａｔｏｘｉｎ）、スロトキシン（ｓｌｏｔｏｘｉｎ）、シラトキシン（ｓｃｙｌｌａｔｏｘｉｎ）、ヘフトキシン、カルシセプチン、タイカトキシン（ｔａｉｃａｔｏｘｉｎ）、カルシクルジン、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロタウストラリン、オクラトキシン（ｏｃｒａｔｏｘｉｎ）Ａ、パツリン、リシン、ストリキニーネ、トリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）、ゼアラレノン（ｚｅａｒｌｅｎｏｎｅ）、およびテトラドトキシン（ｔｅｔｒａｄｏｔｏｘｉｎ）から選択されるタンパク質毒素である。用いることができる酵素的に活性な毒素およびその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ－サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびトリコテセンが含まれる。

検出可能な標識は、対象とする用途（例えば、インビトロおよび／またはインビボ研究および／または臨床用途）において検出され得る標識を含む。対象とする検出可能な標識は、放射性同位体、検出可能な生成物を生成する酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光タンパク質、常磁性原子などを含む。ある特定の態様において、ＣＮＴＦＲリガンドは、検出可能な標識の特異的結合パートナーにコンジュゲートされる（例えば、アビジン／ストレプトアビジンを含む検出可能な標識を介して検出が起こり得るように、ビオチンにコンジュゲートされる）。

ある特定の実施形態によれば、薬剤は、近赤外（ＮＩＲ）光学イメージング、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）／ＣＴイメージング、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法などのインビボイメージングで使用される標識剤である。そのような用途に使用される標識剤として、蛍光標識、放射性同位体などが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、標識剤は、２つ以上のイメージング手法を用いてインビボイメージングを可能にするマルチモーダルインビボイメージング剤である（例えば、Ｔｈｏｒｐ－Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｏｏｇａｎ（２０１１）Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．４０：６１２９－６１４３を参照されたい）。

ある特定の態様において、標識剤は近赤外（ＮＩＲ）イメージング用途に使用されるインビボイメージング剤であり、該剤は、Ｋｏｄａｋ Ｘ－ＳＩＧＨＴ色素、Ｐｚ ２４７、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５０および８００ Ｆｌｕｏｒｓ、Ｃｙ ５．５および７ Ｆｌｕｏｒｓ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０および７５０ Ｄｙｅｓ、ＩＲＤｙｅ ６８０および８００ＣＷ Ｆｌｕｏｒｓから選択される。ある特定の実施形態によれば、標識剤は、ＳＰＥＣＴイメージング用途に使用されるインビボイメージング剤であり、該剤は、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉｎ、^２０１Ｔｌ、および^１３３Ｘｅから選択される。ある特定の態様において、標識剤は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージング用途に使用されるインビボイメージング剤であり、該剤は、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^１２４Ｉ、^７６Ｂｒ、^８２Ｒｂ、および^６８Ｇａから選択される。

本開示の複合体に使用されるリンカーとしては、エステルリンカー、アミドリンカー、マレイミドまたはマレイミドベースのリンカー、バリン－シトルリンリンカー、ヒドラゾンリンカー、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）リンカー、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、ビニルスルホンベースのリンカー、テトラエチレングリコールなどだが、これらに限定されない、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むリンカー、プロパン酸を含むリンカー、カプロレイン酸を含むリンカー、およびその任意の組み合わせを含むリンカーが挙げられる。

対象とする化学部分にリンカーを介して薬剤を連結するための多数の戦略が利用可能である。例えば、対象とする化学部分は、リンカーをその化学部分に共有結合させることによって誘導体化され得、ここでリンカーは、薬剤上の「化学的ハンドル」と反応することができる官能基を有する。リンカー上の官能基は、様々であり得、薬剤上の化学的ハンドルとの適合性に基づいて選択され得る。一実施形態によれば、薬剤上の化学的ハンドルは、その化学的ハンドルを有する非天然アミノ酸を薬剤に組み込むことによって提供される。そのような非天然アミノ酸は、例えば、化学合成または組換え手法を介して、例えば、宿主細胞における翻訳中に非天然アミノ酸を組み込むために好適な直交（orthogonal）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を使用して、薬剤に組み込むことができる。

薬剤中に存在する非天然アミノ酸の官能基は、アジド、アルキン、アルケン、アミノオキシ、ヒドラジン、アルデヒド、ニトロン、ニトリルオキシド、シクロプロペン、ノルボルネン、イソシアニド、アリールハライド、ボロン酸、または他の好適な官能基であってもよく、リンカー上の官能基は、非天然アミノ酸の官能基と反応するように選択される（逆もまた同様である）。

投与
上に要約したように、本開示の方法は、個体におけるＫＲＡＳ変異型がんを治療する方法を含む。「治療すること」または「治療」とは、個体のＫＲＡＳ変異型がんに関連する症状の少なくとも改善を意味し、改善は、治療されるＫＲＡＳ変異型がんに関連するパラメータ（例えば症状）の、少なくとも程度の軽減を指すために広義で使用される。したがって、治療はまた、個体がＫＲＡＳ変異型がんまたは少なくともそれを特徴付ける症状にそれ以上苦しまないように、ＫＲＡＳ変異型がんまたは少なくともそれに関連する症状が、完全に阻害される、例えば、発生することが防止される、または停止される、例えば終結される状況も含む。

ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達を阻害する薬剤は、治療上有効な量で個体に投与される。いくつかの実施形態では、薬剤の治療的有効量（例えばそれを含む医薬組成物中に存在するもの）は、単独で（例えば、単独療法において）または１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて（例えば、併用療法において）、１回以上の用量で投与されたときに、個体におけるＫＲＡＳ変異型がんの症状を、該薬剤による治療の非存在下での個体の症状と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上軽減させるのに有効な量である。いくつかの実施形態によれば、本開示の方法は、薬剤が有効量で投与される場合、ＫＲＡＳ変異型がんのがん細胞の成長、転移、および／または浸潤性を阻害する。

投薬は、治療されるＫＲＡＳ変異型がんの重症度および応答性に依存する。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積の測定値から計算することができる。投与する医師は、最適な投与量、投与方法および反復率を決定することができる。最適な投与量は、個々の薬剤の相対効力に応じて様々であり得、一般に、インビトロおよびインビボ動物モデルなどにおいて有効であることが分かっているＥＣ_５０に基づいて推定され得る。一般に、投与量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ～１００ｇであり、１日、１週間、１ヶ月、または１年に１回以上与えられ得る。治療する医師は、測定された滞留時間、および体液または組織中の薬物の濃度に基づいて、投薬の反復率を推定することができる。治療が成功した後、疾患状態の再発を防止するために対象に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、そこでは薬剤は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ～１００ｇの範囲の維持用量で、１日１回以上、数ヶ月に１回、６ヶ月に１回、毎年１回、または任意の他の好適な頻度で投与される。

本開示の治療方法は、ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達を阻害する単一のタイプの薬剤を個体に投与することを含み得、あるいは、ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達を阻害する異なる薬剤のカクテルの投与によって、ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達を阻害する２つ以上のタイプの薬剤を投与することを含み得、例えば、ＣＮＴＦＲに特異的に結合してＣＮＴＦＲを介するシグナル伝達を阻害する第１の薬剤（例えば、本明細書に記載の操作されたリガンドのうちのいずれか）と、ＣＬＣＦ１に特異的に結合してＣＮＴＦＲを介するシグナル伝達を阻害する第２の薬剤（例えば、本明細書に記載の操作された可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドうちのいずれか）との投与を含み得る。

薬剤は、薬物送達に適した任意の利用可能な方法および経路（インビボ法およびエクスビボ法、ならびに全身性および局所投与経路を含む）を使用して個体に投与され得る。従来のおよび医薬的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、眼内、静脈内、動脈内、経口、ならびに他の経腸および非経口の投与経路が含まれる。投与経路は、必要に応じて組み合わされてもよく、あるいは特定の薬剤および／もしくは望まれる効果に応じて調節されてもよい。薬剤は、単回投与または複数回投与で投与することができる。いくつかの実施形態では、薬剤は、非経口的に、例えば、静脈内、動脈内などに投与される。いくつかの実施形態では、薬剤は、例えば、全身送達のために（例えば、静脈内注入）、または局所部位に（例えば、腫瘍内注射）、注射によって投与される。

薬剤は、個体への投与用の様々な製剤に組み込むことができる。より具体的には、薬剤は、適切な医薬的に許容される賦形剤または希釈剤との組み合わせによって、医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、エマルション、注射剤、吸入剤、およびエアロゾル剤などの固体、半固体、液体、またはガス状形態の調製物に製剤化することができる。

個体への投与に好適な（例えば、ヒト投与に好適な）薬剤の製剤は、一般に無菌であり、さらに、検出可能な発熱物質、または選択された投与経路による患者への投与が禁忌である他の混入物を含んでいない状態であり得る。

医薬剤形において、薬剤は、単独で、または第２の薬学的に活性な化合物、例えば、第２の抗がん剤（小分子抗がん剤を含むがこれに限定されない）との適切な付随形態ないし組合せで、投与することができる。以下の方法および担体／賦形剤は単なる例であり、決して限定するものではない。

経口調製物の場合、薬剤は、単独で、または錠剤、散剤、顆粒剤もしくはカプセル剤を作製するための適切な添加剤と、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、もしくはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤と、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプン、もしくはゼラチンなどの結合剤と、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、もしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムなど崩壊剤と、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤と、かつ必要であれば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、および香味剤と組み合わせて使用することができる。

薬剤は、非経口（例えば、静脈内、腫瘍内、動脈内、骨内、筋肉内、大脳内、脳室内、髄腔内、皮下など）投与用に製剤化することができる。ある特定の態様において、薬剤は、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪族グリセリド、高級脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコールなどの水性溶媒または非水性溶媒中に複合体を溶解、懸濁、または乳化することによって、かつ必要であれば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、および防腐剤などの従来の添加剤を伴わせて、注射用に製剤化することができる。

薬剤を含む薬学的組成物は、所望の純度を有する薬剤を任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤、および／または等張化剤と混合することによって調製することができる。許容される担体、賦形剤および／または安定剤は、使用される投与量および濃度ではレシピエントに無毒であり、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニンおよびクエン酸を含む抗酸化剤、防腐剤（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはそれらの組み合わせ）、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、およびそれらの組み合わせなどのアミノ酸、単糖、二糖、および他の糖類、低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、ゼラチンまたは血清アルブミンなどのタンパク質、ＥＤＴＡなどのキレート剤、トレハロース、ショ糖、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フラクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ－メチルグルコサミン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸などの糖、ならびに／または、Ｔｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

薬学的組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成される液体形態であり得、その場合凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液で再構成されることになる。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、一定量の純水（典型的には、凍結乾燥中に除去された体積と等量である）を加え戻すことであるが、非経口投与用の医薬組成物の製造のために抗菌剤を含む溶液が使用されてもよい。

薬剤の水性製剤は、例えば、約４．０～約７．０もしくは約５．０～約６．０の範囲、または代替的に約５．５のｐＨで、ｐＨ緩衝液中で調製することができる。この範囲内のｐＨに好適である緩衝剤の例には、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、および他の有機酸緩衝剤が含まれる。緩衝剤の濃度は、例えば、緩衝剤および製剤の所望の張性に応じて、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、または約５ｍＭ～約５０ｍＭであり得る。

製剤の張性を調節するために、等張化剤を製剤に含めることができる。例示的な等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびアミノ酸の群からの任意の成分、糖、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、水性製剤は等張性であるが、ただし高張または低張溶液が適することもあり得る。「等張性」という用語は、生理的食塩水または血清など、それが比較される何かの他の溶液と同じ張性を有する溶液を意味する。等張化剤は、約５ｍＭ～約３５０ｍＭの量で、例えば、１００ｍＭ～３５０ｍＭの量で使用され得る。

製剤中で凝集を減少させるために、および／または粒状物の形成を最小限にするために、および／または吸着を低減するために、界面活性剤が製剤に添加されてもよい。界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。適切なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標）の商標で販売）、およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標）の商標で販売）である。好適なポリエチレン－ポリプロピレンコポリマーの例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（商標）の名称で販売されているものである。適切なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例は、Ｂｒｉｊ（商標）の商標で販売されているものである。界面活性剤の濃度の例は、約０．００１％～約１％ｗ／ｖの範囲であり得る。

凍結乾燥プロセス中の不安定化条件から薬剤を保護するために、凍結保護剤を添加してもよい。例えば、既知の凍結保護剤には、糖（グルコースおよびスクロースを含む）、ポリオール（マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む）、ならびにアミノ酸（アラニン、グリシンおよびグルタミン酸を含む）が含まれる。凍結保護剤は、約１０ｍＭ～５００ｎＭの量で含まれ得る。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬剤、および上記で特定される成分（例えば、界面活性剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤）のうちの１つ以上を含み、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、およびこれらの組み合わせなどの、１つ以上の防腐剤を本質的に含まない。他の実施形態において、防腐剤が、製剤中に、例えば約０．００１～約２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で含まれる。

キット
上記に要約したように、本開示はキットを提供する。ある特定の実施形態において、キットは、例えば、本開示の方法を実施する際に、用途を見出す。いくつかの実施形態によれば、本開示のキットは、ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達を阻害する薬剤、およびＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に薬剤を投与するための説明書を含む。

本開示のキットは、上記の方法のセクションに記述されるＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達を阻害する薬剤のうちのいずれかを含み得、その記述は、簡潔性のために組み込まれるがここでは繰り返さない。例として、対象キットは、上記の方法のセクションに記載される操作されたリガンド、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドなどのうちのいずれかを含み得る。

ある特定の実施形態において、本開示のキットの説明書は、ＫＲＡＳ変異型肺がんを有すると特定された個体に薬剤を投与するための説明書を含む。例えば、説明書は、ＫＲＡＳ変異型非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を有すると特定された個体に薬剤を投与するための説明書を含み得る。キットに、ＫＲＡＳ変異型ＮＳＣＬＣを有すると特定された個体に薬剤を投与するための説明書が含まれる場合、説明書には、ＫＲＡＳ変異型肺腺がん（ＬＵＡＤ）を有すると特定された個体に薬剤を投与するための説明書が含まれ得る。

いくつかの実施形態によれば、本開示のキットは、ヒトＫＲＡＳの１２位にアミノ酸置換を含むＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に薬剤を投与するための説明書を含み、ここで番号付けは配列番号１と同じである。ある特定の実施形態において、そのようなキットは、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、およびＧ１２Ｖからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に薬剤を投与するための説明書を含み得る。

対象キットは、単位投与量（例えばアンプル）または複数投与形態で存在する、ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達を阻害する量の薬剤（例えば、該薬剤と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物中に存在するもの）を含み得る。したがって、ある特定の実施形態において、キットは、薬剤を含む組成物の１つ以上の（例えば、２つ以上の）単位投与量（例えば、アンプル）を含み得る。「単位投与量」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物対象のための単一の投与量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された所定量の組成物を含有する。単位投与量の量は、当該個体における、使用される特定の薬剤、達成されるべき効果、および薬剤に関連する薬力学などの様々な要因に依存する。さらに他の実施形態では、キットは組成物の単一の複数投与量を含み得る。

キットの成分は、別々の容器内に存在してよく、または複数の成分が単一の容器内に存在してもよい。好適な容器には、単一チューブ（例えば、バイアル）、アンプル、プレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）の１つ以上のウェルなどが含まれる。

キットに含まれる説明書（例えば使用説明書（ＩＦＵ：instructions for use））は、好適な記録媒体に記録され得る。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができる。従って、説明書は、例えば添付文書としてキット内に、キットまたはその構成要素の容器のラベルに（すなわち、包装または副包装に付随して）存在し得る。他の実施形態において、説明書は、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどの適切なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する、電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の説明書はキット中には存在しないが、例えばインターネットを介してリモートソースから説明書を取得するための手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧することができ、かつ／または説明書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。説明書の場合と同様に、説明書を得るための手段は好適な基材上に記録される。

以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。

［実験］
実施例１―ＣＬＣＦ１およびＣＮＴＦＲの発現、およびヒトＬＵＡＤにおけるＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達の発がん作用
公開遺伝子発現データの分析は、ＣＬＣＦ１が、正常な肺と比較して肺腺がん（ＬＵＡＤ）で著しく上方調節されていることを示した（データは示されず）。ＣＬＣＦ１の高発現は、ＫＲＡＳ変異を有する患者の生存の低下と関連していた［Ｃｏｘハザード比：２．５３（９５％ＣＩ １．４３～４．４８）、ｐ値：０．００１］が、ＫＲＡＳ変異のない患者では関連していなかった［Ｃｏｘハザード比：０．８６（９５％ＣＩ ０．５１～１．４）、ｐ値：０．５６］。この結果は、ＫＲＡＳによって引き起こされる発がんにおけるＣＬＣＦ１シグナル伝達の特定の役割を示唆する。ＫＲＡＳ変異体ＬＵＡＤでのＣＮＴＦＲ発現は、同じパターンを示さなかった［Ｃｏｘハザード比：１．３６（９５％ＣＩ ０．６５～２．８２）、ｐ値：０．４１］。以前の研究では、マウスの肺腫瘍において、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）がＣＬＣＦ１の主要な供給源であることが示されていた。ヒト肺ＣＡＦもＣＬＣＦ１の供給源を提供するかどうかを判断するために、ＣＡＦをヒト肺がん患者および対応する正常な肺線維芽細胞（ＮＬＦ）から単離した。ＣＬＣＦ１の発現は、患者とマッチングされたＮＬＦと比較して、８つのヒトＣＡＦのうち６つで有意に上昇していた。ただし、テストされたＬＵＡＤ細胞株も、ＣＬＣＦ１を分泌しており、ヒトＬＵＡＤにおけるこのサイトカインの傍分泌および自己分泌の両方のシグナル伝達の存在を示唆する。

次に、細胞株におけるＣＬＣＦ１の機能的役割を評価した。組換えＣＬＣＦ１への曝露により、調べたすべてのＬＵＡＤ細胞株で増殖が増加した（図１、パネルＡ）。リガンドがＣＮＴＦＲ／ＬＩＦＲ／ｇｐ１３０複合体に結合すると、ｇｐ１３０がリン酸化され、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫを含む下流シグナルが活性化される。したがって、予想通り、ＣＬＣＦ１は、ＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導した（図１、パネルＢ～Ｄ）。ヒト肺がんにおけるＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達の機能的重要性をさらに調査するために、ＲＮＡ干渉を使用して、細胞表面のＣＮＴＦＲの量を減少させた。２つの異なるｓｈＲＮＡを使用したノックダウンにより、テストした５つのＬＵＡＤ細胞株すべての生存率が大幅に低下した（図１、パネルＥ～Ｇ）。ＣＮＴＦＲノックダウンはまた、ＬＵＡＤ細胞株のクローン原性成長も抑制し（図１、パネルＨおよびＩ）、３Ｄ培養における球のサイズおよび数の減少をもたらした（図１、パネルＪおよびＫ）。次に評価したのは、ＣＮＴＦＲノックダウンがインビボでの腫瘍成長に影響を与えるかどうかであった。テストした３つのＬＵＡＤ細胞株すべてにおけるＣＮＴＦＲノックダウンは、異種移植片形成を減少させた（図１、パネルＬおよびＭ）。さらに、ＣＮＴＦＲノックダウンを伴うＬＵＡＤ細胞から形成された腫瘍は、対照腫瘍と比較して、より低い増殖指数およびより高いアポトーシスのレベルを呈した（図１、パネルＮおよびＯ）。寄与が主に傍分泌であるか、または自己分泌であるかをテストするために、Ｈ２００９においてＣＬＣＦ１をノックダウンし、細胞を異種移植片として移植した。ＣＬＣＦ１ノックダウン腫瘍およびＣＮＴＦＲノックダウン腫瘍の両方で同様に効果的な腫瘍成長の減少が観察され、少なくとも皮下異種移植モデルでは、ＣＬＦＣ１の供給源は、主に腫瘍細胞自体からの自己分泌であることが示唆された。

ＬＵＡＤにおけるＣＮＴＦＲ遮断の作用機序を決定するために、ＭＡＰＫ、ＡＫＴ、およびＳＴＡＴ３シグナル伝達経路に対するノックダウンの作用を評価し、これらはすべてｇｐ１３０の下流で活性化されていると以前に特定されたものである。ＥＲＫおよびＳ６のリン酸化は、ＣＮＴＦＲノックダウン後の腫瘍で減少し、それぞれＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路およびＡＫＴ経路への影響を示していた。ＳＴＡＴ３のリン酸化の低下も観察された。まとめると、これらの結果は、ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達がＬＵＡＤにおいて活性であり、発がん促進の役割を有し、ＣＮＴＦＲ阻害の機序には、ＳＴＡＴ３、ＥＲＫ、およびＡＫＴシグナル伝達を含むいくつかのシグナル伝達カスケードの活性の減衰が含まれることを示す。

実施例２―ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達軸を阻害するための可溶性受容体デコイの作製
上記の機能研究は、ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達の阻害が肺がんの治療機会になる可能性があることを裏付ける。したがって、この経路を標的にするための効果的な戦略を特定しようとした。ＣＮＴＦＲは、Ｃ末端プロペプチドのタンパク質分解切断に続いて形成されるグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合を介して細胞表面に固定される（図２、パネルＡ、ｉ）。ＣＬＣＦ１に結合すると、ＣＮＴＦＲは、ｇｐ１３０およびＬＩＦＲと複合体を形成する（図２、パネルＡ、ｉｉ）。プロペプチドがないと、ＣＮＴＦＲは、膜から分泌されるが、それでもＣＬＣＦ１に結合し、ＣＮＴＦＲを発現しない細胞においてさえも下流シグナル伝達を活性化することができる（図２、パネルＡ、ｉｉｉ）。したがって、ＣＬＣＦ１の効果的な遮断には、ＣＬＣＦ１へのデコイの結合の増加と、ｇｐ１３０およびＬＩＦＲへの結合の減少との両方が必要である（図２、パネルＡ、ｉｖ）。

指向性進化を使用して、ＣＬＣＦ１に対する親和性がより高く、ｇｐ１３０およびＬＩＦＲへの結合が欠いている可溶性ＣＮＴＦＲ変異体を設計した。このような分子は、効率的なリガンドトラップとして機能し、ＣＬＣＦ１を介した発がん性シグナル伝達をアンタゴナイズするという仮説を立てた。高親和性受容体デコイを開発するために、ＣＮＴＦＲの細胞外ドメインをコードするＤＮＡを、エラープローンＰＣＲを介したランダム変異誘発に供した。対応するタンパク質ライブラリ（約１０^８個の形質転換体）が融合体として酵母細胞表面に提示された（図２、パネルＢ）。ＣＬＣＦ１結合が増加した変異体を濃縮するために、フローサイトメトリーを使用してライブラリをスクリーニングした。３ラウンドのスクリーニング後、Ｔ１７４ＰおよびＳ２３７Ｆがコンセンサス変異として現れ、他のアミノ酸位置ではかなりの多様性が観察された。これらの変異の相加作用を調べるために、ソーティングされた集団からランダムに選択された２０個の異なるクローンを、Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ（ＳｔＥＰ）方法を使用してシャッフルし、第２のライブラリを作成した。平衡結合スクリーニングと速度論的オフレートスクリーニングの組み合わせを使用して、このライブラリをソーティングし、スクリーニングストリンジェンシーを増加させた（図２、パネルＣ）。３ラウンドのスクリーニング後、４つの変異（Ｒ１１０Ｑ、Ｔ１７４Ｐ、Ｓ２３７Ｆ、およびＩ２８７Ｆ）の組み合わせが出現した。定量的酵母ディスプレイ結合研究は、これらの変異の各々がＣＬＣＦ１に対するより高い結合親和性に寄与し（図２、パネルＤ）、４つの変異すべての組み合わせが２０ｐＭの見かけのＫ_ｄをもたらすことを示した。このＣＮＴＦＲ変異体（変異体４）を、さらなる最適化のために持ち越した。

ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲ結合は、ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０のヘテロ二量体化を通じて下流のシグナル伝達を活性化するため、ＣＬＣＦ１を隔離しながらこの複合体の形成を低減または防止するようにＣＮＴＦＲを改変することは、阻害活性のために有益である。酵母ディスプレイされたＣＮＴＦＲは、ＣＬＣＦ１依存的様式でｇｐ１３０およびＬＩＦＲと複合体を形成することが確認された。したがって、ＣＮＴＦＲ変異体４を、補助受容体へのその結合を減少させるようにさらに操作した。エラープローンＰＣＲを使用してランダム変異をＣＮＴＦＲ変異体４に導入し、得られたライブラリをＣＬＣＦ１とインキュベートし、ＬＩＦＲに対する結合シグナルが減少した変異体をフローサイトメトリーによってスクリーニングした（図２、パネルＥ）。ＬＩＦＲへの結合を低減させる２つのコンセンサス変異（Ｙ１７７ＨおよびＫ１７８Ｎ）が同定された（図２、パネルＦ）。これらの２つの変異、高親和性ＣＬＣＦ１結合を与える４つの変異、およびｇｐ１３０への結合を弱めることが示された追加の２つのアラニン置換（Ｔ２６８ＡおよびＤ２６９Ａ）を組み合わせた、最終的な変異体であるｅＣＮＴＦＲを作成した。

実施例３―可溶性ｅＣＮＴＦＲの特徴付け
全長ＣＮＴＦＲの構造情報は利用可能でないため、Ｐｈｙｒｅ ２サーバーを使用してｗｔＣＮＴＦＲおよびｅＣＮＴＦＲをモデリングして、ｅＣＮＴＦＲにおける変異の三次元的位置を予測した。親和性成熟によって同定された４つの変異のうち３つ（Ｔ１７４Ｐ、Ｓ２３７Ｆ、およびＳ２８７Ｆ）は、サイトカイン結合に重要であることが示されている芳香族クラスター（Ｆ１７２、Ｆ１９９、およびＦ２３８）および保存された残基（Ｅ２３６およびＥ２８６）の近位にあった（図３、パネルＡ）。可溶性ｅＣＮＴＦＲは、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを伴って（ｅＣＮＴＦＲ－Ｈｉｓ）、または抗体ＦｃドメインへのＮ末端融合体として（ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ）、組換え発現され、ＣＬＣＦ１への親和性を、マイクロタイタープレートベースのアッセイを使用して測定した。ｅＣＮＴＦＲ－ＨｉｓおよびｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは両方とも、ＣＬＣＦ１に対してピコモーラー結合親和性を呈した（図３、パネルＢ）。それに比べて、可溶性野生型ＣＮＴＦＲ構築物（ｗｔＣＮＴＦＲ－ＨｉｓおよびｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃ）についてはＣＬＣＦ１結合親和性が弱すぎて定量化できなかった。同様のアプローチを使用して、ｇｐ１３０およびＬＩＦＲとの結合相互作用を特徴付けた。これらの実験では、両方の受容体に結合したｗｔＣＮＴＦＲ構築物とは対照的に、ｅＣＮＴＦＲ構築物は、ｇｐ１３０およびＬＩＦＲへの検出可能な結合を示さなかった（図３、パネルＣ）。糸球体濾過を回避するためにタンパク質のサイズを大きくすると、血清半減期が大幅に長くなり、そしてＦｃドメインは、ＦｃＲｎを介したリサイクルによって半減期をさらに長くすることができる。したがって、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ融合体を使用して、ＬＵＡＤの動物モデルにおけるｅＣＮＴＦＲの作用をさらに評価した。

ＣＮＴＦは、ＣＮＴＦＲに対する別のリガンドであり、ＣＮＴＦを介したシグナル伝達は、神経細胞の生存に重要である。ＣＮＴＦよりもＣＬＣＦ１へ向けられるｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの結合選択性を操作することで、ＣＮＴＦシグナル伝達の阻害からの潜在的な副作用を最小限に抑えることができる。さらに、ＣＬＣＦ１はＣＮＴＦＲを介してのみ作用することが知られているが、ＣＮＴＦは、ＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）にも結合し、ＣＬＣＦ１およびＣＮＴＦはシグナル伝達経路の制御において独自の機能的役割を有することが示唆される。ｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃは、組換え生成されたＣＮＴＦへの結合を呈したが、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは呈さなかった（図３、パネルＤ）。これらの結果は、ｗｔＣＮＴＦＲおよびｅＣＮＴＦＲについての酵母ディスプレイ結合データと一致しており、ＣＬＣＦ１に対するＣＮＴＦＲの親和性成熟により、ＣＬＣＦ１に対する特異性の増加とＣＮＴＦへの結合の減少がもたらされたことを示す。加えて、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは、ｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃと比較して、高い親和性でマウスＣＬＣＦ１に結合し、ＣＬＣＦ１がマウス由来である場合のインビボ実験での有用性を示す（図３、パネルＥ）。重要なことに、マウスＣＬＣＦ１は、ヒト細胞においてＣＮＴＦＲを活性化することができる。

ｅＣＮＴＦＲ－ＦｃがＣＬＣＦ１を効果的に隔離し、受容体複合体の形成をブロックすることができるかどうかを評価するために、ｗｔＣＮＴＦＲと受容体複合体の他の各サブユニットの各々との間の相互作用に対するｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの影響を測定する、競合結合アッセイを設計した。ｗｔＣＮＴＦＲ－Ｈｉｓでコーティングされたウェル中でｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃをインキュベートすると、ＣＬＣＦ１、ＬＩＦＲ、およびｇｐ１３０構築物がｗｔＣＮＴＦＲ－Ｈｉｓと相互作用することが妨げられた（図３、パネルＦ）。ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃが、ＣＬＣＦ１を効果的に中和し、ｇｐ１３０シグナル伝達を阻害することができるかどうかを判断するために、可溶性ＣＮＴＦＲ構築物の存在下および非存在下でＬＵＡＤ細胞をＣＬＣＦ１で刺激した。ｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃは、ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）のリン酸化を増加させたが、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは、テストした両方の細胞株でリン酸化を減少させた（図３、パネルＧおよびＨ）。さらに、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃとのインキュベーションは、ＣＬＣＦ１媒介性生存を阻害した（図３、パネルＩおよびＪ）。

実施例４―ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは、Ｒａｓ－ＧＴＰローディングを減少させることによってＫＲＡＳ変異型細胞を選択的に阻害する
上記で実証されているのは、ＣＬＣＦ１の発現が、発がん性のＫＲＡＳによって引き起こされるＬＵＡＤの患者の生存の特異的な予後となることである。現在、ＫＲＡＳ変異型腫瘍の治療選択肢はほとんどないため、このサブセットの新しい治療法を開発することは、特に臨床的に重要である。ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃに対する応答の潜在的な分子決定因子を特定するために、多種多様な遺伝子型を伴うＬＵＡＤ細胞株の一群を集め、細胞生存率に対するｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの影響を評価した（図４、パネルＡ）。これらの細胞株は、多種多様な感受性を呈し、最も感受性が低いもの（影響なし）は正常肺細胞（ＮＬ２０）であり、最も感受性が高いものはＬＵＡＤ細胞株Ａ５４９であった。最も感受性の高い複数の細胞株は、すべてＫＲＡＳ変異型であった。野生型ＫＲＡＳまたはＥＧＦＲ変異を伴う細胞株は、中程度の感受性を呈した。対照的に、Ｈ１７５５およびＨ１３９５（両方ともＢＲＡＦ^{Ｇ４６９Ａ}）細胞は、ＣＮＴＦＲ遮断に対して完全に非感受性であった。ＢＲＡＦ^{Ｇ４６９Ａ}変異は、構成的に活性な二量体としてシグナル伝達をする「クラス２」変異であり、上流のＫＲＡＳシグナル伝達には非依存的であると予想される。同様に、Ｑ６１Ｈ変異を有する２つのＫＲＡＳ変異型細胞株（図４、パネルＡ）は、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ遮断に対して完全に非感受性であった。Ｑ６１Ｈ変異型ＫＲＡＳは、固有のＧＴＰａｓｅ活性を欠いているため、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）を調節する上流のシグナルに対してはやはり非感受性であると予想される。ＧＡＰは、ＧＴＰａｓｅ加水分解を保持するＫＲＡＳ変異体および野生型ＫＲＡＳ細胞の両方で、ＧＴＰ結合ＫＲＡＳの量を制御する。まとめると、これらの結果は、ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲがｇｐ１３０を介してシグナルを伝達してＧＡＰを活性化し、これが次いでＫＲＡＳ ＧＴＰ結合を調節し、斯くして下流のシグナルを調節するというモデルと一致する。

リガンドと結合した後、ＣＮＴＦＲは、ｇｐ１３０を活性化し、これは、ＳＨＰ２の活性化をもたらす。次に、ＳＨＰ２は、ＧＴＰローディングの調節を通じて、発がん性ＫＲＡＳおよび野生型ＫＲＡＳの両方の主要な上流調節因子として機能する。Ａ５４９およびＨ２３ ＬＵＡＤ細胞株の両方で、血清刺激は、予想通り、Ｐ－ＳＨＰ２、ならびにＰ－ＳＴＡＴ３およびＰ－ＥＲＫのリン酸化を増加させた（図４、パネルＢおよびＣ）。血清の非存在下で、細胞株を組換えＣＬＣＦ１で刺激すると、ＳＨＰ２、ＳＴＡＴ３、およびＥＲＫのリン酸化レベルはやはり増加し、これはＣＬＣＦ１の上流シグナル伝達がＳＨＰ２を活性化する作用をすることと符合した。ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃによる処理は、ＣＬＣＦ１の作用の強い減衰を有したが、完全な血清の作用を阻害することにおける効果はより低くかった。血清にはＣＬＣＦ１－ｅＣＮＴＦＲ軸とは独立した他の作用があるため、これは予測されることである。三量体受容体複合体とＫＲＡＳのＧＴＰローディングとの間の機構的関連性をより直接的に確立するために、組換えＣＬＣＦ１で処理された細胞において、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの存在下または非存在下で、Ｒａｓ－ＧＴＰのレベルを直接測定した（図４、パネルＤ）。Ｒａｓ－ＧＴＰのレベルは、ＣＬＣＦ１処理後に増加し、この作用は、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃによって弱められた。これらの結果は、ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達と発がん性ＫＲＡＳとの間の繋がりを指し示しており、ＣＬＣＦ１阻害が一部のＫＲＡＳ遺伝子型ではより効果的であるが他の遺伝子型ではそうではないように見える理由を説明し得る。これらの研究を総合すると、ＣＬＣＦ１阻害は、以下でさらに検討するように、ＫＲＡＳ変異型腫瘍で特に効果的となり得ることが示唆された。

実施例５―ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは、ＣＬＣＦ１を隔離し、腫瘍成長をインビボで阻害する
次に、インビボでの抗腫瘍治療薬としてのｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの役割を評価した。ｅＣＮＴＦＲ－ＦｃがマウスＣＬＣＦ１を効果的に隔離することができるかどうかを判断するために、非担腫瘍マウスをｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの単回投与で処置した。ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの血清レベルは急速に増加し、同時に未結合ＣＬＣＦ１が減少し、これは、７２時間までにベースラインレベルに戻った（図５、パネルＡ）。これらの結果は、ｅＣＮＴＦＲ－ＦｃがマウスＣＬＣＦ１に効果的に結合し、血清中でのその利用可能性を低下させることができることを示す。

ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの治療効果をテストするために、２つのＬＵＡＤ細胞株を免疫不全マウスに生着させ、腫瘍が平均体積１００ｍｍ^３に達したときに、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃを投与した。処置は、両方の異種移植モデルにおいて用量依存的な腫瘍阻害をもたらしたが（図５、パネルＢ～Ｄ）、一方でｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃは効果を有さなかった。次に評価したのは、患者由来の異種移植腫瘍（ＰＤＴＸ）のパネルに対するｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの作用であった。ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃによる処置は、５つのＬＵＡＤ ＰＤＴＸモデルのうち３つで著しい腫瘍成長阻害をもたらした（図５、パネルＥ～Ｇ）。増殖マーカーの有意な減少およびアポトーシスの増加が、細胞株異種移植片およびＰＤＴＸモデルの両方で観察された（図５、パネルＨ～Ｋ）。ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ処置に応答した３つのＰＤＴＸモデルの遺伝子型は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、およびＥＧＦＲ変異型／ＫＲＡＳ野生型（ｗｔ）であった一方、非応答個体は、ＫＲＡＳおよびＥＧＦＲがｗｔであった。また、ＣＬＣＦ１の発現が最も高いＣＡＦは、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃシグナル伝達に最も依存すると予測される遺伝子型を有する腫瘍から得られたことが留意された。

ＣＮＴＦＲノックダウンで観察されたように、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃによる処置もまた、ＥＲＫ（図５、パネルＬ～Ｏ）およびＳ６キナーゼ（図５、パネルＬおよびＭ）の活性化を減少させた。シグナル伝達経路に対する時間依存的影響を評価するために、担腫瘍マウスをｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃで処置して異なる時点で安楽死させる、短期間の研究を行った。これらの結果は、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃが最初にＳＴＡＴ３の阻害を引き起こし、次にＥＲＫおよびＳ６シグナル伝達の遅延した阻害が続くことを示唆する。

次に、これらの研究を、自所性（autochthonous）、高悪性度のＬＵＡＤの遺伝子操作マウス（ＧＥＭ）モデルに拡張した。ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃで処置されたＫｒａｓ^Ｇ１２Ｄ／Ｔｒｐ５３^ｆ／ｆマウスは、ビヒクルで処置された対照と比較して腫瘍負荷の減少を実証した（図６、パネルＡ～Ｅ）。ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃによる処置はまた、増殖の減少、アポトーシスの増加、ならびにＥＲＫ、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３シグナル伝達の活性化の減少をもたらした（図６、パネルＦ～Ｈ）。次に、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ処置とシスプラチンを比較する生存アッセイを行った。白金化合物は、一般的に使用される標準的な化学療法であるヒトＬＵＡＤ療法であるため、比較としてこれが選択された（図６、パネルＩ）。シスプラチンおよびｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃでの処置の両方により、生存が改善された。しかしながら、シスプラチンで処置されたマウスは、研究の終わりに有意な体重減少があったが、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃで処置されたマウスは、体重が減少しなかった。ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃで処置されたマウスの死後のマウス組織の広範な評価では、いかなる異常も見られなかったが、プラチナ化学療法は、腎毒性などの重大な有害作用を誘発することが示されている。これらの結果は、ＬＵＡＤにおけるｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの治療的有効性を強く裏付ける。

真正な治療剤としてのｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃのさらなる開発は、この経路の活性についての適切なバイオマーカーを特定することによって特に強化されるであろう。ＣＬＣＦ１発現とｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃによる処置後の生存率の低下との間に若干の正の相関が認められた。本明細書に提示されたデータは、特定の遺伝子型がｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃに対してより敏感であることを示唆しているが、次に調査されたのは、血漿中のＣＬＣＦ１レベルも、個々の患者におけるこの経路の活性の指標として役立ち得るかどうかということであった。ＥＬＩＳＡによってＣＬＣＦ１を検出する方法が開発され（ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃが捕捉剤として機能した）、がん患者の血漿中のＣＬＣＦ１のレベルを測定するために使用された。健康な対照と比較して、ＬＵＡＤ患者ではＣＬＣＦ１のレベルが高くなる傾向が観察された。さらに、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃに感受性のある遺伝子型を有する（「対象となる変異」を有する）患者は、対象となる変異を有しない患者よりも有意に高いレベルのＣＬＣＦ１を有した（図６、パネルＪ）。ロジスティック回帰（ｌｏｇｉｔ）を使用してデータをさらに分析して、腫瘍が特定の「対象となる変異」（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、またはＫＲＡＳ ｗｔ／ＥＧＦＲ変異型）を有するかどうかを血中ＣＬＣＦ１が予測することができるか否かを実証した［オッズ比：８．３５（ＣＩ ９５％ ６．３６～１０．３３）、ｐ値：０．０４］。まとめると、これらの結果は、腫瘍の遺伝子型分析と組み合わせたＣＬＣＦ１血漿濃度が、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃから治療上の利益を得る可能性が最も高い患者を選択するための有用なバイオマーカーとして役立つことを示す。

［方法］
肺腺がんマウスモデル
Ｌｏｘ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘ－Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ（１２９Ｓｖ／Ｊａｅ）、Ｔｒｐ５３^{ｆｌ／ｆｌ}（ＦＶＢ）、およびＲｏｓａ２６－ＬＳＬ－ｔｄＲＦＰ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスを、ウイルスのない環境で維持した。マウスは、８～１０週齢で、Ｃｒｅを発現する５×１０^６ｐｆｕのアデノウイルス（アイオワ大学）で鼻腔内感染させた。マウスに、感染８週間後から開始して４週間に渡り週に３回、腹腔内注射によってｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（ビヒクル）を投与した。研究の開始時および薬物処置中定期的にマウスの体重を測定した。

ヒトＬＵＡＤの生存および遺伝子発現分析
コホート（ＬＵＡＤ；ＬＵＳＣ）についてのＣＬＣＦ１ ＴＰＭ ｌｏｇ_２発現を、パッケージＦｉｒｅｂｒｏｗｓｅＲ（１．１．３５）を使用してＲプログラミング言語で、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから直接ダウンロードした。ＴＰ（原発腫瘍）またはＮＴ（正常）のいずれかに分類された発現データのみを使用した。完全なＬＵＡＤ予想カウント（ＲＳＥＭレベル３）は、ＦＩＲＥＨＯＳＥ Ｂｒｏａｄ ＧＤＡＣのウェブサイトから直接ダウンロードした。ＬＵＡＤデータセットの体細胞変異は、ＵＣＳＣ Ｘｅｎａパブリックリポジトリから取得した。非サイレントＫＲＡＳ変異（複数可）を有するサンプルのみをＫＲＡＳ変異群に関連付けた。ＫＲＡＳサイレント変異を有するサンプルは、ＫＲＡＳ野生型群として含めず、分析から除外した。全生存期間などの打ち切りデータを含むＬＵＡＤ生存分析の臨床データは、ＴＣＧＡデータセットの公開された臨床集計から取得した。生存分析曲線および多変量コックスハザード回帰は、それぞれｓｕｒｖｍｉｎｅｒ（０．４．３．９９９）および生存パッケージ（２．４４－１．１）を使用してＲで完了した。コックス回帰分析では、診断年齢、性別、がんステージについて調整した。対応する遺伝子発現の分位数に基づいてサンプルをグループ化し（正常 対 高い）、正常発現は７５パーセンタイル未満であり、高発現は７５パーセンタイル超である。

定量的逆転写酵素ＰＣＲ
ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して単離し、Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｎｉＲＮＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してさらに精製した。ｃＤＮＡは、ＤｙＮＡｍｏ ｃＤＮＡ合成キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で生成し、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）をＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、プライマー配列については補足表５を参照されたい）を使用して行った。ｑＲＴ－ＰＣＲは、次のように行った：９５℃で１０分、９５℃で１５秒を３５サイクル、および６０℃で１分。

患者由来の腫瘍異種移植片（ＰＤＴＸ）の生成
新鮮な患者の試料を１×１ｍｍの断片に切断し、新鮮な状態で移植するか、または後で使用するために９０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ中で凍結させた。腫瘍断片をマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍａｔｒｉｇｅｌ ＃３５６２３４）に浸し、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスの腎被膜に移植した。移植に成功した腫瘍を、約１～２ｃｍになったところで採取した。断片を組織学のために保持し、残りをコラゲナーゼで３７℃にて４５分間消化し、７０μｍのフィルターで濾過した。ＲＮＡ／ＤＮＡ単離のために、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上でマウス間質を細胞から枯渇させた（Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４５、ＣＤ３１、およびマウスＭＨＣクラスＩに対する抗体を使用）。その後の継代および薬物研究のために、細胞を、１００μＬのα－ＭＥＭおよび２０μＬのマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中でＮＳＧマウスの脇腹に皮下移植した（１つの脇腹当たり５×１０^５個の細胞）。異種移植腫瘍片は、使用するまで－８０℃で保存した。

細胞を１００μｍおよび４０μｍのセルストレーナーに通し、１，２００ｒｐｍで８分間遠心分離した。細胞をＲＢＣ溶解緩衝液中にインキュベートし、６ｍｌの培地に再懸濁し、チューブの底に配置された０．５ｍｌの血清を通すように回転させて、細胞残渣を除去した。ビオチンコンジュゲートした抗マウスＣＤ４５、ＣＤ３１、およびＴｅｒ１１９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、細胞から分化系列（lineage）陽性細胞を枯渇させ、ＭＡＣＳ ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）上で枯渇させた。５×１０^５の単一細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合し、６～８週齢の雌のＮＳＧマウスの脇腹に注入した。示された時間に腫瘍体積を測定し、楕円体式［０．５（長さ×幅^２）］を使用して算出した。

血清分析および毒性研究
個々のマウスからの血液試料は、心臓穿刺を使用して、最終麻酔下で実験の最後に収集した。５００ｇで１０分間遠心分離することにより、１時間以内に血清を血液から分離した。試料を分注し、その後のテストのために－８０℃で保存した。包括的代謝パネル（ＣＭＰ）および全血球計算（ＣＢＣ）は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ ＣｅｎｔｅｒのＡｎｉｍａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって行われた。各臓器の剖検および包括的な組織病理学的分析を含む毒性試験は、獣医病理学者によって行われた。

ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃによるマウスの処置
腫瘍が、１つの腫瘍当たり１００ｍｍ^３の平均サイズに達したとき、群当たりの平均腫瘍サイズに基づいてマウスを複数の処置群へと階層化した。次に、マウスにｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（ビヒクル）を２～４週間に渡る週に３回の腹腔内注射によって投与した。研究の開始時および薬物処置中定期的にマウスの体重を測定した。腫瘍体積は、週に３～４回デジタルノギスで測定した。

異種移植片におけるノックダウン研究
ｐＬＫＯ ｓｈＲＮＡ構築物は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。各構築物用のレンチウイルスは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて２９３細胞をトランスフェクトすることによって生成し、トランスフェクション後１日目および２日目にウイルス上清を収集し、２日目にプールした。次に、ウイルス上清を０．４５μＭのＰＥＳフィルターで濾過した。約５００ｕＬの新鮮な培地を用いてプラットフォームロッカー上で２時間かけてウイルスペレットを再懸濁した。コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）消化緩衝液を使用して、細胞を単一細胞懸濁物へと解離させ、７０μＭのフィルターで濾過し、ＭＡＣＳカラム上で分化系列を枯渇させた（上記の通り）。得られた細胞懸濁液を次に６ウェルプレートのウェル当たり約５×１０^６個の細胞でプレーティングし、培地中のポリブレン（Ｓｉｇｍａ）およびウイルスを用いて室温にて１５００ｒｐｍで３０分間スピン感染させ（Ｓｏｒｖａｌｌ ＸＲＴ遠心分離機）、その後３７℃でインキュベートした。ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）で選択した後、細胞をトリプシン処理し、濾過し、生細胞をカウントした。次に、研究群間で生細胞数を一定に保ちながら細胞を移植した（上記のように）。残りの細胞は、遺伝子ノックダウンの確認のために保持した。

細胞抽出物およびウエスタンブロット分析
全細胞抽出物については、細胞を、ＮＰ－４０溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％ＮＰ－４０、ｄＨ_２Ｏ、１×プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ Ｐ８３４９－１ＭＬ）、および１×ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ Ｐ５７２６－１ＭＬ）を使用して１５分間溶解し、超音波処理し、３０分間溶解した。腫瘍を解凍し、溶解に先立って、氷上でＢｉｏ－Ｇｅｎ ＰＲＯ２００ホモジナイザー（ＰＲＯ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して機械的に破壊した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって決定した。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、Ｂｉｏｒａｄ Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｃ装置によって分析した。使用した抗体は次の通りである：Ｐ－ＡＫＴ（＃４０６０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）、Ｔ－ＡＫＴ（＃７５６９２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）、Ｐ－ＥＲＫ１／２（＃４３７０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）、Ｔ－ＥＲＫ１／２（＃４６９５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）、Ｐ－ＳＴＡＴ３（＃９１４５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）、Ｔ－ＳＴＡＴ３（＃９１３９、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）、ＧＡＰＤＨ（＃９４８５、Ａｂｃａｍ、１：１０００）。

組織学および免疫組織化学
組織標本を１０％緩衝ホルマリンで２４時間固定し、パラフィン包埋まで７０％エタノール中で保存した。５μｍの切片をヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）で染色するか、または免疫組織化学的研究に使用した。免疫組織化学は、ホルマリン固定されパラフィン包埋されたマウスおよびヒトの組織切片に対してビオチン－アビジン法を使用して行った。次の抗体を使用した（示される希釈率で）：Ｐ－Ａｋｔ（＃４０６０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１００）、Ｐ－ＥＲＫ１／２（＃４３７０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：４００）、Ｐ－Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３（＃９７０１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：２００）、Ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ ３（＃９６６１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：２００）、ＣＮＴＦＲ（＃１７５３８７、Ａｂｃａｍ、１：５０）。切片をＤＡＢで発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。腫瘍領域の分析およびＩＨＣ分析は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してピクセル単位を測定することによって行った。

細胞アッセイ
細胞生存率：１０％ウシ成長血清（ＢＧＳ）を含有する総体積１００μＬの培地中、ウェル当たり２，０００個の細胞（成長に最適な密度）において、細胞を９６ウェルプレートに播種した。２４時間のインキュベーション後、細胞生存率をＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により、製造元の指示に従って７日間評価した。

コロニー形成アッセイ：長期コロニー形成アッセイでは、１つのウェル当たり１０，０００～５０，０００個の細胞を６ウェルプレートに播種した。１２日後、細胞をメタノールで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、写真を撮り、定量化した。

３Ｄスフェロイド メチルセルロースアッセイ：足場非依存性の球体成長のために、細胞を、０．５％メチルセルロースを添加した２ｍＬの完全培地中で、２４ウェル超低付着プレートに播種した（ウェル当たり２０，０００個の生細胞）。９～２０日間にわたって（細胞株によって異なる）球体を形成させた。球体をＬｅｉｃａ Ｄｍｉ８顕微鏡（明視野）で画像化した。球体のサイズおよび数を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。

Ｒａｓ－ＧＴＰレベルの分析
活性化されたＲａｓ－ＧＴＰａｓｅのレベルは、以前に公開された方法と同様に、製造元の指示に従ってＲａｓ ＧＴＰａｓｅ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ １３４６４０）を使用して決定した。簡単に説明すると、１０ｃｍの組織培養皿において、１０％ウシ成長血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地に１×１０^６個の細胞を播種し、細胞が６０％コンフルエンスに達するまで５％ＣＯ_２で３７℃にてインキュベートした。次に、細胞をＲＰＭＩおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンで２４時間血清飢餓状態にした。続いて、細胞をＣＬＣＦ１（１０ｎＭ）およびｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ（２．５μＭ）において５％ＣＯ_２で３７℃にて２０分間インキュベートした。次に培地を除去し、細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、製造元のプロトコルに従って処理した。

統計学
カプランマイヤー生存曲線は、すべての同腹仔群からの各マウスの生存時間を使用して計算した。ログランク検定を使用して、群間の有意差をテストした。画像の定量化および遺伝子発現分析のために、統計的有意性は、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用したスチューデントのｔ検定によって分析した（実験分散によって両側の対応のないまたは対応のあるｔ検定を、実験によって、ダネットの多重補正検定と組み合わせた一元配置ＡＮＯＶＡおよび二元配置ＡＮＯＶＡの両方のためのＦ検定を使用して体系的に調べた）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。データは、インビトロ実験については平均±Ｓ．Ｄ．として、インビボ実験については平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表される。箱ひげ図では、箱は、２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルを表し、正中線は中央値を示し、ひげは、四分位範囲の１．５倍以内で最低／最高値まで伸びる。

ロジスティック回帰モデル
表をハーバード大学のＭａｒｅｋ ＨｌａｖａｃによるＳｔａｒｇａｚｅｒ ｖ．５．２．２を使用して作成した。モデルは、血中ＣＬＣＦ１レベル（ｐｇ／ｍＬ）のみを含み、他の共変量は使用しなかった。

組換えＣＬＣＦ１生成
シグナルペプチド配列（２８～２２５）を含まないＣＬＣＦ１をコードするｃＤＮＡを、ＢｓａＩおよびＸｈｏＩ制限部位を使用して、誘導性ｌａｃプロモーターを有するｐＥＴ２８ｂプラスミドにクローン化し、ＤＨ１０Ｂ細胞で増幅した。発現のために、精製されたプラスミドをＲｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ細胞に形質転換した。封入体を、５ｍＭのＤＴＴを含有する６０％ｄｄＨ_２Ｏ、４０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ中で溶解した。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用して、ＣＬＣＦ１を精製した。タンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用してさらに分析し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。タンパク質濃度を定量化するための吸光係数として、３９，５４９Ｍ^－１ｃｍ^－１の値を使用した。

可溶性ＣＮＴＦＲ、ＬＩＦＲ、およびｇｐ１３０の生成
ＣＮＴＦＲ（１－３４２）、ＬＩＦＲ（１－５３４）、およびｇｐ１３０（１－６１９）の細胞外ドメインに対応するｃＤＮＡをｐＡｄｄ２プラスミドにクローン化し、ＤＨ１０Ｂ細胞で増幅した。発現のために、精製されたプラスミドを、ＰＥＩ（＃２３９６６－２、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してヒトＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。簡単に説明すると、ＰＥＩをｄＨ_２Ｏ中に１ｇ／Ｌとなるように溶解した。５００ｍＬのトランスフェクション容量のためには、０．５ｍｇの精製されたＤＮＡおよび１ｍＬのＰＥＩを各々１０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地（＃１２３０９－０１９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解し、すぐに混合した。１５分後、溶液を５００ｍＬの細胞に滴下した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で１２０ＲＰＭにて回転式振とう培養機上でインキュベートした。Ｆｃ融合タンパク質は、プロテインＡ（＃１０１１４２、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）親和性カラムを使用して精製し、ヘキサヒスチジンタグを含有するタンパク質は、ニッケル－ＮＴＡ（＃３０２１０、Ｑｉａｇｅｎ）親和性カラムを使用して精製した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、タンパク質をさらに精製した。タンパク質の定量化には、次の吸光係数を使用した。ＣＮＴＦＲ変異体：７０，２７５Ｍ^－１ｃｍ^－１、ＣＮＴＦＲ－Ｆｃ変異体：２０６，４１０Ｍ^－１ｃｍ^－１、ｇｐ１３０：１３０，４７０Ｍ^－１ｃｍ^－１、ｇｐ１３０－Ｆｃ：３２６，８００Ｍ^－１ｃｍ^－１、ＬＩＦＲ：９８，６１０Ｍ^－１ｃｍ^－１、およびＬＩＦＲ－Ｆｃ：２６３，０８０Ｍ^－１ｃｍ^－１。

エラープローンＰＣＲを介して創出されたＣＮＴＦＲライブラリの生成およびスクリーニング
ＣＮＴＦＲを、凝集素交配タンパク質Ａｇａ２ｐへの遺伝子融合として酵母で発現させた。ヒトＣＮＴＦＲ細胞外ドメイン（残基１８～３４２）をコードするｃＤＮＡは、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を使用して、ｐＣＴＣＯＮ２酵母ディスプレイプラスミドにクローン化した。ＣＮＴＦＲ細胞外ドメインをテンプレートとして使用して、エラープローンライブラリを作成し、Ｔａｑポリメラーゼ（＃５０－８１１－６９４、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および５５ｍＭのＭｇＣｌ_２を使用して、変異を導入した。異なる濃度のＭｎＣｌ_２（０、０．０１、０．０５、０．１、および０１５ｍＭ）を使用して、個別のＰＣＲ反応を行った。これらの反応からの生成物を、ゲル電気泳動を使用して精製した。精製された変異型ｃＤＮＡおよび線形化されたプラスミドをＥＢＹ１００酵母にエレクトロポレーションし、そこでそれらは、相同組換えを通じてインビボでアセンブルされた。ライブラリのサイズは、希釈プレーティングおよびコロニーカウントによって８．１×１０^７と推定された。

ＢＤ Ａｒｉａ ＩＩフローサイトメーター（Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＦＡＣＳ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を使用した蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、高親和性ＣＮＴＦＲ変異体を提示する酵母を単離し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して分析した。スクリーニングは、以下のＣＬＣＦ１濃度を伴う、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＡ）中で室温にて酵母をインキュベートする平衡結合条件を使用して実施した：選別１については２０ｎＭのＣＬＣＦ１で３時間、選別２については２ｎＭのＣＬＣＦ１で６時間、選別３については０．５ｎＭのＣＬＣＦ１で１２時間。ＣＬＣＦ１とのインキュベーション後、酵母をペレット化し、洗浄し、１：５００比のニワトリ抗ｃ－Ｍｙｃ（＃Ａ２１２８１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰＢＳＡ中に４℃で３０分間再懸濁した。次に酵母を洗浄し、ペレット化し、１：１００希釈のヤギ抗ニワトリＰＥ（＃ｓｃ－３７３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびマウス抗ＨＩＳ Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ４８８（＃６１２５０－Ｈ４８８、Ａｎａｓｐｅｃ）を含むＰＢＳＡを使用して、二次標識化を氷上で３０分間行った。

選別されたクローンを増殖させ、ＦＡＣＳのさらなるラウンドに供した。スクリーニングの最後のラウンドの後、Ｚｙｍｏｐｒｅｐキット（＃５０－４４４－１０７、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ）を使用してプラスミドＤＮＡを回収し、ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテントセルに形質転換し、プラスミドミニプレップキットを使用して単離した。配列決定は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって行われた。試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ Ｉｎｃ）を使用してデータを分析した。

互い違い伸長プロセス（ＳｔＥＰ：Staggered Extension Process）を介して創出されたＣＮＴＦＲライブラリの生成およびスクリーニング
ＳｔＥＰ法を以前に記述されたように行い、得られたライブラリを酵母上に提示した。簡単に説明すると、エラープローンＰＣＲライブラリの最終選別ラウンドから単離された酵母集団から、２０個の固有の配列をランダムに選択した。各テンプレート１ｎｇを組み合わせ、合計２０ｎｇのテンプレートを、滅菌ｄＨ_２Ｏ中の最終濃度で０．１５μＭの各プライマー、１×ＰＣＲ緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰミックス、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼと、５０μＬとなるように混合した。伸長プロトコルは、次のパラメータを使用して１００サイクル実行した：９４℃で３０秒間（変性）および５５℃で１０秒間。これらの反応からの生成物は、ゲル電気泳動を使用して精製された。精製された変異型ｃＤＮＡおよび線形化されたプラスミドをＥＢＹ１００酵母にエレクトロポレーションし、そこでそれらは相同組換えを通じてインビボでアセンブルされた。ライブラリのサイズは、希釈プレーティングにより７．９×１０^７と推定された。

スクリーニングは、１回の平衡結合選別とそれに続く２回の動的オフレート選別を使用して行った。動的オフレート選別では、酵母を２ｎＭのＣＬＣＦ１と室温で２時間インキュベートした後、細胞を２回洗浄して、過剰な未結合ＣＬＣＦ１を除去し、２０ｎＭのｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃを含有するＰＢＳＡに再懸濁して、解離したＣＬＣＦ１の再結合を防いだ。結合解除ステップの長さについては、選別２に１０時間、選別３に２４時間を使用した。上記のようにライブラリを染色して、ＣＬＣＦ１結合およびｃ－ｍｙｃ発現を検出し、ＣＬＣＦ１結合／ｃ－Ｍｙｃ発現比が最も高い０．５～１％のクローンがＦＡＣＳによって収集されるように選別を実行し、ＣＬＣＦ１への結合が最も高いクローンについてライブラリを濃縮した。上記のようにプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定した。

ＬＩＦＲに結合しないＣＮＴＦＲ変異体のライブラリ生成およびスクリーニング
ＬＩＦＲへの結合が減少したＣＮＴＦＲ変異体を作製するために、エラープローンＰＣＲを使用して、ＣＮＴＦＲ変異体４にランダムな変異を導入し、約１×１０^８個の推定多様性の形質転換体群を有するライブラリを作成した。得られたライブラリは、酵母細胞表面に融合タンパク質として提示させ、ＣＬＣＦ１の存在下でＬＩＦＲ－Ｆｃに対する結合シグナルが減少した集団を分離するためにスクリーニングした。ＣＬＣＦ１に対する結合親和性を保持するために、０．５ｎＭのＣＬＣＦ１に対するポジティブセレクションと、増加する濃度のＬＩＦＲ－Ｆｃに対するネガティブセレクションとを交互に繰り返すことによってスクリーニングを行った。６回の選別の後、２つのコンセンサス変異が出現した（Ｙ１７７ＨおよびＫ１７８Ｎ）。これらの変異は、ＬＩＦＲ結合の減少に相加的に寄与した。

酵母ディスプレイＣＮＴＦＲ結合アッセイ
ＣＮＴＦＲ構築物を提示する酵母を、様々な濃度のＣＬＣＦ１とともに室温で１２時間インキュベートして、平衡結合に到達させた。これに続いて、ＰＢＳＡで洗浄し、１：５００の比率のニワトリ抗ｃ－Ｍｙｃ抗体を含むＰＢＳＡに４℃で３０分間再懸濁した。次に、酵母を洗浄し、ペレット化し、１：１００希釈のヤギ抗ニワトリＰＥ抗体およびマウス抗ＨＩＳ Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体を含むＰＢＳＡを使用して、二次標識化を氷上で３０分間行った。次に、試料を洗浄し、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーで分析した。試料をＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅソフトウェアで分析し、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ Ｉｎｃ）を使用して分析した。

β受容体との結合を検出するためのアッセイのためには、１０ｎＭのＣＬＣＦ１と共に様々な濃度のＬＩＦＲ構築物および／またはｇｐ１３０構築物を、酵母ディスプレイされたＣＮＴＦＲに添加した。Ｈｉｓタグ付き構築物には、マウス抗ＨＩＳ Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体を使用して結合を検出した。Ｆｃ融合構築物の検出には、抗マウスＦｃ Ａｌｅｘａ ４８８抗体（＃Ａ１１０２９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用した。

無細胞結合アッセイ
９６ウェルプレートを１０μｇ／ｍＬの抗ＨＩＳ抗体または抗マウスＦｃ抗体で一晩コーティングし、５％ミルクで１時間ブロックした。次に、プレートをＰＢＳＡで２回洗浄した。様々な濃度の可溶性ＣＮＴＦＲ－ＨＩＳまたはＣＮＴＦＲ－Ｆｃ融合体構築物を、ＰＢＳＡ中の２ｎＭのＣＬＣＦ１とともに室温で１２時間インキュベートした。次に、混合物を、それぞれ抗ＨＩＳ抗体または抗マウスＦｃ抗体でコーティングされた９６ウェルプレートに１時間添加し、続いてＢＰＢＳで２回洗浄した。続いて、ウェルを、１：１０００希釈した抗ＣＬＣＦ１ウサギ抗体（＃ａｂ２６１２５、Ａｂｃａｍ）とともに室温で２時間インキュベートし、次にＰＢＳで４回洗浄した。ウェルを、１：１０００希釈したＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ抗体（＃１１１－０３５－１４４、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳで４回洗浄した。読み取りには、１－ＳｔｅｐウルトラＴＭＢ ＥＬＩＳＡ（＃３４０２９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。

リン酸化アッセイ
６ウェルプレートにおいて、Ａ５４９またはＨ２３細胞を、５０％コンフルエンスになるまで成長させた。細胞をＣＬＣＦ１（１０ｎＭ）およびＣＮＴＦＲ構築物（１０ｎＭ）中で３７℃、５％ＣＯ_２で２０分間インキュベートした後、プロテアーゼ阻害剤（＃Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびホスファターゼ阻害剤（＃Ｐ５７２６、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＮＰ－４０緩衝液で溶解した。等量の溶解物をＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードし、ニトロセルロース膜に移した。上記の試薬を用いてウエスタンブロット分析を行った。化学発光は、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して検出した。ＮＰ－４０緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、および１％ＩＧＥＰＡＬ／ＮＰ４０で構成された。

ＣＬＣＦ１細胞増殖アッセイ
５×１０^３個のＡ５４９およびＨ２３細胞を播種し、２４時間成長させた後、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭで２４時間インキュベートすることによって血清飢餓状態にした。次に、ＣＬＣＦ１およびＣＮＴＦＲ構築物を添加し、３７℃／５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。次に、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬（＃ＤＡＬ１０２５、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加し、３７℃／５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。細胞代謝活性は、５６０ＥＸ ｎｍ／５９０ＥＭ ｎｍを使用して蛍光を測定することによって検出した。エラーバーは、３反復のウェルの標準偏差を表す。データは、培地のみを用いた陰性対照に対して測定した。

ｅＣＮＴＦＲ－ＦｃのインビボＣＬＣＦ１隔離の分析
非担腫瘍ＮＳＧマウスに、腹腔内注射により１０ｍｇ／ｋｇ体重のｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃを単回投与した。用量は、２００μＬの容量で製剤化した。条件当たり２匹のマウスを分析し、未処理のマウスを使用して、ベースラインＣＬＣＦ１レベルを決定した。注射後６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、および７２時間における心臓穿刺により、安楽死時の最終採血を行い、分析のために血清を単離した。ＣＬＣＦ１レベルは、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。このアッセイでは、遊離の未結合ＣＬＣＦ１の検出を確実にするために、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃを捕捉剤として使用した。９６ウェルプレートを１０μｇ／ｍＬのｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃで室温にて一晩コーティングし、５％ミルクでブロックした。コーティングされたプレートをＰＢＳＡで２回洗浄した後、収集した血清とともにプレートを室温で２時間インキュベートした。プレートをＢＰＢＳで２回洗浄した後、ポリクローナル抗ＣＬＣＦ１抗体および抗ウサギＨＲＰを使用してＣＬＣＦ１の検出を実行した。プレートをＢＰＢＳで４回洗浄した後、１－ＳｔｅｐウルトラＴＭＢ ＥＬＩＳＡを使用してＥＬＩＳＡを現像した。

本明細書に開示される方法、データ、薬剤（例えば、操作されたＣＮＴＦＲリガンド）、試薬などを含むがこれらに限定されない、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５：１７８３－１７９５は、本開示の一部を構成し、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

このように、上記は、単に本開示の原理を説明しているに過ぎない。当業者であれば、本明細書に明示的に記載または図示しないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨および範囲内に含まれる様々な構成を工夫することができることが理解されよう。さらに、本明細書に列挙されたすべての例および条件的文言は、主として本発明の原理および発明者らにより当該技術分野の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、このような具体的に列挙された例および条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を列挙する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図する。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすあらゆる開発された要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載の例示的な実施形態に限定されることを意図しない。

Claims (53)

1. 個体におけるＫＲＡＳ変異型がんを治療する方法であって、
   ＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に、治療有効量の、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）－毛様体神経栄養因子受容体（ＣＮＴＦＲ）シグナル伝達を阻害する薬剤を投与することを含む、方法。
2. 前記ＫＲＡＳ変異型がんが、ＫＲＡＳ変異型肺がんである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＫＲＡＳ変異型肺がんが、ＫＲＡＳ変異型非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である、請求項２に記載の方法。
4. 前記ＫＲＡＳ変異体ＮＳＣＬＣが、ＫＲＡＳ変異型肺腺がん（ＬＵＡＤ）である、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＫＲＡＳ変異型がんが、ＫＲＡＳ変異型膵臓がんである、請求項１に記載の方法。
6. 前記ＫＲＡＳ変異型膵臓がんが、ＫＲＡＳ変異型膵管腺がん（ＰＤＡＣ）である、請求項５に記載の方法。
7. 前記薬剤が、ヒトＫＲＡＳの１２位にアミノ酸置換を含むＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に投与され、ここで番号付けは配列番号１と同じである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記薬剤が、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、およびＧ１２Ｖからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に投与される、請求項７に記載の方法。
9. 前記薬剤が、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、およびＧ１２Ｖからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体にのみ投与される、請求項８に記載の方法。
10. 前記薬剤を投与する前に、前記個体を、前記ＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定することをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記薬剤を投与する前に、前記個体が、ＫＲＡＳ変異型がんを有すると決定することをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記個体がＫＲＡＳ変異型がんを有すると決定することが、前記個体から得られたがん細胞の遺伝子型決定を含み、前記遺伝子型決定が、前記がん細胞がＫＲＡＳ変異型がんのものであることを示す、請求項１１に記載の方法。
13. 前記遺伝子型決定が、ＫＲＡＳをコードする遺伝子または転写物の少なくとも一部を配列決定することを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記遺伝子型決定が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるものである、請求項１２に記載の方法。
15. 前記薬剤を投与する前に、前記個体におけるＣＬＣＦ１の血漿濃度を決定することをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記薬剤が、ＣＮＴＦＲに特異的に結合して、ＣＮＴＦＲを介したシグナル伝達を阻害する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記薬剤が、ＣＮＴＦＲに特異的に結合して、ＣＮＴＦＲとＣＬＣＦ１との間の相互作用を阻害する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記薬剤が、ＣＮＴＦＲまたはリガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに特異的に結合して、ＣＮＴＦＲと前記リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットとの間の相互作用を阻害する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットが、糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）または白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記薬剤が、
    対応する野生型ＣＮＴＦＲリガンドと比較して、ＣＮＴＦＲに対する結合親和性の増加を呈する、操作されたＣＮＴＦＲリガンド、
    対応する野生型ＣＮＴＦＲリガンドおよびＣＮＴＦＲを含む複合体に対する結合親和性と比較して、操作されたＣＮＴＦＲリガンドおよびＣＮＴＦＲを含む複合体に対するｇｐ１３０、ＬＩＦＲ、またはその両方の結合親和性の低下をもたらす、操作されたＣＮＴＦＲリガンド、ならびに
    対応する野生型ＣＮＴＦＲリガンドと比較して、ＣＮＴＦＲに対する結合親和性の増加を呈し、かつ、対応する野生型ＣＮＴＦＲリガンドおよびＣＮＴＦＲを含む複合体に対する結合親和性と比較して、操作されたＣＮＴＦＲリガンドおよびＣＮＴＦＲを含む複合体に対するｇｐ１３０、ＬＩＦＲ、またはその両方の結合親和性の低下をもたらす、操作されたＣＮＴＦＲリガンド、
    からなる群から選択される、操作されたＣＮＴＦＲリガンドである、請求項１６に記載の方法。
21. 前記操作されたＣＮＴＦＲリガンドが、ＣＮＴＦＲに結合する操作されたＣＬＣＦ１であり、Ｌ８６Ｆ、Ｑ９６Ｒ、Ｈ１４８Ｒ、およびそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸置換を含み、ここで番号付けは配列番号６と同じであり、前記操作されたＣＬＣＦ１が、配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記操作されたＣＮＴＦＲリガンドが、ＣＮＴＦＲに結合する操作されたＣＬＣＦ１であり、Ｙ２２Ｃ、Ｌ８６Ｆ、Ｑ９６Ｒ、Ｈ１４８Ｒ、Ｆ１５１Ａ、Ｋ１５４Ａ、Ｗ１６９Ｌ、Ｋ１８０Ｒ、およびそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸置換を含み、ここで番号付けは配列番号７と同じであり、前記操作されたＣＬＣＦ１が、配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を含む、請求項２０に記載の方法。
23. 前記薬剤が、ＣＬＣＦ１に特異的に結合して、ＣＮＴＦＲを介したシグナル伝達を阻害する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記薬剤が、ＣＬＣＦ１に特異的に結合して、ＣＬＣＦ１とＣＮＴＦＲとの間の相互作用を阻害する、請求項２３に記載の方法。
25. 前記薬剤が、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドである、請求項２３または２４に記載の方法。
26. 前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲ、またはその両方に対する前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を低下させる１つ以上の変異を含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、ＬＩＦＲに対する前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を低下させる１つ以上の変異を含む、請求項２６に記載の方法。
28. ＬＩＦＲに対する結合親和性を低下させる前記１つ以上の変異が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、アミノ酸位置１７７、１７８、またはその両方に存在する、請求項２７に記載の方法。
29. 前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、ｇｐ１３０に対する前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を低下させる１つ以上の変異を含む、請求項２６に記載の方法。
30. ｇｐ１３０に対する結合親和性を低下させる前記１つ以上の変異が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、アミノ酸位置２６８、２６９、またはその両方に存在する、請求項２９に記載の方法。
31. 前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、配列番号８に記載の前記アミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、ＣＬＣＦ１に対する前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を増加させる１つ以上の変異を含む、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. ＣＬＣＦ１に対する結合親和性を増加させる前記１つ以上の変異が、配列番号８に記載の前記アミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、アミノ酸位置１１０、１７４、２３７、２８７、またはそれらの任意の組み合わせに存在する、請求項３１に記載の方法。
33. 前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、ＣＬＣＦ１に特異的に結合し、Ｒ１１０Ｑ、Ｔ１７４Ｐ、Ｙ１７７Ｈ、Ｋ１７８Ｎ、Ｓ２３７Ｆ、Ｔ２６８Ａ、Ｄ２６９Ａ、Ｉ２８７Ｆ、およびそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸置換を含み、ここで番号付けは配列番号９と同じであり、前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸２３～３４２に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を含む、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、ＣＬＣＦ１に特異的に結合し、アミノ酸置換Ｒ１１０Ｑ、Ｔ１７４Ｐ、Ｙ１７７Ｈ、Ｋ１７８Ｎ、Ｓ２３７Ｆ、Ｔ２６８Ａ、Ｄ２６９Ａ、およびＩ２８７Ｆを含み、ここで番号付けは配列番号９と同じであり、前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸２３～３４２に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を含む、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、Ｆｃドメインに融合されており、ＣＬＣＦ１に特異的に結合し、Ｒ１１０Ｑ、Ｔ１７４Ｐ、Ｙ１７７Ｈ、Ｋ１７８Ｎ、Ｓ２３７Ｆ、Ｔ２６８Ａ、Ｄ２６９Ａ、Ｉ２８７Ｆ、およびそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸置換を含み、ここで番号付けは配列番号１０と同じであり、前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸２３～５７８に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を含む、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、Ｆｃドメインに融合されており、ＣＬＣＦ１に特異的に結合し、アミノ酸置換Ｒ１１０Ｑ、Ｔ１７４Ｐ、Ｙ１７７Ｈ、Ｋ１７８Ｎ、Ｓ２３７Ｆ、Ｔ２６８Ａ、Ｄ２６９Ａ、およびＩ２８７Ｆを含み、ここで番号付けは配列番号１０と同じであり、前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸２３～５７８に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を含む、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、野生型ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するドメインにおいて溶解性を付与する変異を含む、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、野生型ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するドメインにおいてトランケーションを含む、請求項３７に記載の方法。
39. 前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、野生型ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するドメインを欠いている、請求項３７に記載の方法。
40. 前記薬剤が、異種ポリペプチドと融合したポリペプチドである、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記異種ポリペプチドが、Ｆｃドメイン、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン－アラニン－セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項４０に記載の方法。
42. 前記異種ポリペプチドが、Ｆｃドメインである、請求項４１に記載の方法。
43. 前記Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、請求項４２に記載の方法。
44. 前記薬剤が、化学部分（moiety）にコンジュゲートされている、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記化学部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、抗がん剤、検出可能な標識、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項４４に記載の方法。
46. キットであって、
    カルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）－毛様体神経栄養因子受容体（ＣＮＴＦＲ）シグナル伝達を阻害する薬剤と、
    ＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に前記薬剤を投与するための説明書と、を含む、キット。
47. 前記薬剤が、請求項１６～４５のいずれか一項に定義される通りである、請求項４６に記載のキット。
48. 前記薬剤が、請求項２５～４５のいずれか一項に定義される通りの可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドである、請求項４７に記載のキット。
49. 前記説明書が、ＫＲＡＳ変異型肺がんを有すると特定された個体に前記薬剤を投与するための説明書を含む、請求項４６～４８のいずれか一項に記載のキット。
50. 前記説明書が、ＫＲＡＳ変異型非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を有すると特定された個体に前記薬剤を投与するための説明書を含む、請求項４９に記載のキット。
51. 前記説明書が、ＫＲＡＳ変異型肺腺がん（ＬＵＡＤ）を有すると特定された個体に前記薬剤を投与するための説明書を含む、請求項５０に記載のキット。
52. 前記説明書が、ヒトＫＲＡＳの１２位にアミノ酸置換を含むＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に前記薬剤を投与するための説明書を含み、ここで番号付けは配列番号１と同じである、請求項４６～５１のいずれか一項に記載のキット。
53. 前記説明書が、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、およびＧ１２Ｖからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むＫＲＡＳ変異型がんを有すると特定された個体に前記薬剤を投与するための説明書を含む、請求項５２に記載のキット。
    

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