JP2022545558A - 操作された治療用微生物および関連受容体についての組成物および使用 - Google Patents

Abstract

検出された炎症組織の微小環境において産生された代謝産物である細胞外ＡＴＰ（ｅＡＴＰ）に応答して、例えば、操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２受容体を介して、抗炎症性タンパク質、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、またはＣＤ３９様ｅＡＴＰ分解酵素アピラーゼを分泌する微生物プロバイオティクスが本明細書に記載されている。したがって、以下から選択される１つ、２つ、または３つ全部の外因性タンパク質を発現するように操作されている単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞（または複数の細胞、例えば、そのような細胞の集団）が本明細書に提供される：（ｉ）哺乳動物Ｐ２Ｙプリン受容体２（Ｐ２Ｙ２）タンパク質、好ましくはヒトＰ２Ｙ２；１５（ｉｉ）哺乳動物Ｇα、好ましくはＧαｉ３由来の少なくとも５個のＣ末端残基を含む変異体Ｇｐａ１タンパク質であって、前記Ｐ２Ｙ２タンパク質を酵母接合経路に共役させる変異体Ｇｐａ１タンパク質；および（ｉｉｉ）抗炎症性タンパク質。【選択図】図１－１

Description

優先権の主張
この出願は、２０１９年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８９１，６０３号の恩恵を主張する。前述の全内容は、参照により本明細書に組み入れられている。

検出された炎症組織の微小環境において産生された代謝産物である細胞外ＡＴＰ（ｅＡＴＰ）に応答して、例えば、操作された哺乳動物Ｐ２Ｙプリン受容体２（Ｐ２Ｙ２）を介して、抗炎症性タンパク質、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、またはＣＤ３９様ｅＡＴＰ分解酵素アピラーゼを分泌する微生物プロバイオティクスが本明細書に記載されている。

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む胃腸管の複雑な慢性炎症性障害である（１）。たいていの利用可能なＩＢＤ治療は、免疫系を全身性に抑制して、感染症およびいくつかの型の癌のリスクを増加させる（２）。加えて、ＩＢＤを有する多くの患者は、治療に対して応答せず、または時間経過と共に臨床応答の喪失を示す（２）。したがって、ＩＢＤについての新規の治療アプローチの必要性がある。

微生物は、ＩＢＤを含む複数のヒト疾患の病態に関連した免疫過程を調節する（３～５）。例えば、ＩＢＤ関連一塩基多型は、抗炎症性微生物代謝産物の産生の低下を生じる腸内マイクロバイオータの変化を促進する（６）。ＩＢＤに関連した遺伝子多型はまた、抗炎症性微生物代謝産物に対する応答性を調節する（７）。疾患発生におけるマイクロバイオームの役割、および特に、ある特定の共生微生物の抗炎症効果は、ＩＢＤの処置のためのプロバイオティクスに基づいたアプローチの使用を支持する（８～１０）。しかしながら、操作されていないプロバイオティクスの内因性抗炎症性質だけに基づいた治療は、進行中の腸炎症を調節するのに効力がない場合がある（１０）。

治療用プロバイオティクスの開発は、ＩＢＤ研究の主要な分野である。以前の試みは、一定の淘汰圧を必要とし、かつ他の細菌への水平伝播のリスクを与える、プラスミド系に基づいた、無制御様式で治療用タンパク質を発現する操作されたプロバイオティクスを用いた（８０、８１）。これらの制限を克服するために、本発明者らは、指向性進化およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を適用して、ｅＡＴＰレベルに応答して抗炎症薬を産生する遺伝子回路で微生物を操作し、炎症組織微小環境におけるプロバイオティクスに基づいた動的抗炎症応答を送達した。病因の胃腸管（ＧＩ）炎症を検出し、かつ治療用タンパク質の送達により動的に応答するように設計された操作された治療用微生物、およびその使用の方法が本明細書に提供されている。

したがって、以下から選択される１つ、２つ、または３つ全部の外因性タンパク質を発現するように操作されている単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞（または複数の細胞、例えば、そのような細胞の集団）が本明細書に提供される：（ｉ）哺乳動物Ｐ２Ｙプリン受容体２（Ｐ２Ｙ２）タンパク質、好ましくはヒトＰ２Ｙ２；（ｉｉ）哺乳動物Ｇα、好ましくはＧα_ｉ３由来の少なくとも５個のＣ末端残基を含む変異体Ｇｐａ１タンパク質であって、前記Ｐ２Ｙ２タンパク質を酵母接合経路に共役させる変異体Ｇｐａ１タンパク質；および（ｉｉｉ）抗炎症性タンパク質であって、任意選択で、前記抗炎症性タンパク質が哺乳動物、好ましくはヒトであり、前記抗炎症性タンパク質が、Ｐ２Ｙ２活性化の下流で活性化されるプロモーター、任意選択で接合応答性プロモーターの調節下で発現し、前記単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞が細胞外アデノシン三リン酸（ｅＡＴＰ）の存在下で前記抗炎症性タンパク質を分泌する、抗炎症性タンパク質。好ましくは、抗炎症性タンパク質は、炎症促進性濃度（約１００マイクロモル濃度～高ミリモル濃度）でのｅＡＴＰの存在下で分泌される。好ましくは、抗炎症性タンパク質は、ｅＡＴＰ濃度依存性様式で分泌され、より高いｅＡＴＰ濃度が、操作されたＰ２Ｙ２受容体のダイナミックレンジ内での抗炎症性タンパク質のより多い分泌をもたらす。

いくつかの実施形態において、サッカロミセス属（Saccharomyces）細胞は、以下からなる群から選択される１つまたは複数の内因性タンパク質の発現を低下させ、または除去するように操作されている：（ｉ）酵母ＧＰＣＲ、例えばα因子フェロモン受容体ＳＴＥ２（ＮＰ＿１１６６２７．２）；（ｉｉ）経路機能の負の制御因子、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質ＳＳＴ２（ＮＰ＿０１３５５７．１）；（ｉｉｉ）細胞周期制御因子サイクリン依存性タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ阻害性タンパク質ＦＡＲ１（ＮＰ＿０１２３７８．１）；および（ｉｖ）酵母Ｇαタンパク質グアニンヌクレオチド結合タンパク質サブユニットαＧＰＡ１（ＮＰ＿０１１８６８．１）。

いくつかの実施形態において、抗炎症性タンパク質は、そのタンパク質が分泌されるように指示する酵母由来リーダーペプチドを含み、任意選択で、抗炎症性タンパク質に内在性のシグナルまたはリーダー配列を一切欠く。

いくつかの実施形態において、抗炎症性タンパク質は、アピラーゼ、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、ＩＬ－２、ＩＬ－２７、ＩＬ－２２、またはＩＦＮ－βを含む。

いくつかの実施形態において、Ｐ２Ｙ２タンパク質、変異体Ｇｐａ１、または抗炎症性タンパク質の少なくとも１つは、サッカロミセス属（Saccharomyces）細胞における発現のためにコドン最適化された配列から発現する。

いくつかの実施形態において、Ｐ２Ｙ２は、抗炎症性タンパク質の発現を増加させる１つまたは複数の変異を含む。いくつかの実施形態において、変異は、リガンド結合ポケットの周辺の残基（任意選択で、Ａ７６^２．４７、Ｎ１１６^３．３５、Ｃ１１９^３．３８、Ｌ１６２^４．５４、Ｑ１６５^４．５７）、および／または受容体の細胞内に面する側の残基（任意選択で、Ｆ５８^１．５７、Ｌ５９^１．５８、Ｃ６０^１．５９、Ａ２２９^ＩＣＬ３、Ｋ２４０^６．３１、Ｆ３０７^７．５４、Ｇ３１０^Ｃ末端）におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の変異は、残基Ｆ５８^１．５７、Ｎ１１６^３．３５、Ｆ３０７^７．５４、および／またはＱ１６５^４．５７におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の変異は、Ｆ５８Ｃ、Ｑ１６５Ｈ、Ｆ３０７Ｓ、および／またはＮ１１６Ｓを含む。いくつかの実施形態において、変異はＮ１１６における変異を含む。いくつかの実施形態において、変異はＦ５８またはＦ３０７における変異と組み合わせて、Ｎ１１６における変異を含む。いくつかの実施形態において、変異は、変異Ｎ１１６Ｓを、任意選択で変異Ｆ５８ＩまたはＦ３０７Ｓと組み合わせて、含む。いくつかの実施形態において、Ｐ２Ｙ２は、Ｌ５９および／またはＣ１１９における変異をさらに含む。いくつかの実施形態において、さらなる変異はＬ５９Ｉおよび／またはＣ１１９Ｓを含む。

いくつかの実施形態において、Ｐ２Ｙ２活性化の下流で活性化されるプロモーターは、接合応答性プロモーター、例えば、ｐＦＵＳ１またはｐＦＩＧ１である。

いくつかの実施形態において、抗炎症性タンパク質の発現は、抗炎症性タンパク質をコードする配列の上流の非酵母ＤＮＡオペレーター配列と結合する、フェロモン応答性ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む合成転写因子により駆動される。

いくつかの実施形態において、単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞はＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）またはＳ．ブラウディ（S. boulardii）である。

本明細書に記載されているような単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞、および任意選択で、生理学的に許容される担体を含む組成物もまた本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、経口投与のための固体の形をとり、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、軟ゼラチンカプセル、糖衣丸剤、口腔内崩壊剤／口腔内崩壊錠（orodispersing/orodispersing tablets）、または発泡錠である。

いくつかの実施形態において、組成物は、経口投与のための液体の形をとり、例えば、飲用溶液である。

いくつかの実施形態において、組成物は、任意選択で液体または固体の食物、餌、または飲用水を含む栄養組成物である。

いくつかの実施形態において、栄養組成物は、飲料、任意選択で、スムージーまたは発酵飲料、フレーバー飲料、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、固形ヨーグルト、果物および／または野菜ジュースまたはその濃縮物、果物および野菜ジュース粉末、還元果物製造物、粉末、麦芽または大豆または穀類ベースの飲料、ミューズリーフレークなどの朝食用シリアル、スプレッド、食事代替物、菓子類、チョコレート、ゲル、アイスクリーム、穀物、果物、および／またはチョコレートバー、エネルギーバー、スナックバー、フードバー、ソース、ディップ、ならびに乳製品および非乳製品ベースのスポーツサプリメントを含むスポーツサプリメントから選択される。

対象において炎症を低下させるための方法であって、本明細書に記載されているような単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞または組成物の有効量を対象に投与することを含む方法もまた本明細書に提供される。対象において炎症を低下させる方法における使用のための単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞および組成物がさらに提供される。いくつかの実施形態において、対象は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有し、またはそれを発症するリスクがある。

追加として、リガンド結合ポケットの周辺の残基（任意選択で、Ａ７６^２．４７、Ｎ１１６^３．３５、Ｃ１１９^３．３８、Ｌ１６２^４．５４、Ｑ１６５^４．５７）、および／または受容体の細胞内に面する側の残基（任意選択で、Ｆ５８^１．５７、Ｌ５９^１．５８、Ｃ６０^１．５９、Ａ２２９^ＩＣＬ３、Ｋ２４０^６．３１、Ｆ３０７^７．５４、Ｇ３１０^Ｃ末端）に１つまたは複数の変異を含む操作された哺乳動物Ｐ２Ｙプリン受容体２（Ｐ２Ｙ２）タンパク質が本明細書に提供される。

１つまたは複数の変異が残基Ｆ５８^１．５７、Ｎ１１６^３．３５、Ｆ３０７^７．５４、および／またはＱ１６５^４．５７におけるものである、請求項３０に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。

１つまたは複数の変異がＦ５８Ｃ、Ｑ１６５Ｈ、Ｆ３０７Ｓ、および／またはＮ１１６Ｓを含む、請求項３１に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。

変異がＮ１１６における変異を含む、請求項３０に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。

変異が、Ｆ５８またはＦ３０７における変異と組み合わせて、Ｎ１１６における変異を含む、請求項３３に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。

変異が、変異Ｎ１１６Ｓを、任意選択で変異Ｆ５８ＩまたはＦ３０７Ｓと組み合わせて、含む、請求項３４に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。

Ｐ２Ｙ２がＬ５９および／またはＣ１１９における変異をさらに含む、請求項３０～３５のいずれか一項に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。

さらなる変異がＬ５９Ｉおよび／またはＣ１１９Ｓを含む、請求項３６に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。

請求項３０～３７のいずれか一項に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２をコードする単離された核酸配列。

請求項３５に記載の単離された核酸配列を含み、任意選択で、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２を発現する宿主細胞。

細胞がサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞であり、単離された核酸配列が前記サッカロミセス属（Saccharomyces）細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項３９に記載の宿主細胞。

他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。方法および材料は、本発明に用いるために本明細書に記載されている；当技術分野において知られた他の適切な方法および材料もまた用いることができる。材料、方法、および例は、例証となるだけであり、限定することを意図されない。本明細書に言及された全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、全体が参照により組み入れられている。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配するものとする。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。

図１Ａ～Ｄは、ヒトＰ２Ｙプリン受容体２（Ｐ２Ｙ２）の指向性進化を示す図である。（Ａ）ヒトＰ２Ｙ２受容体活性化を、接合応答性プロモーターｐＦＵＳ１を利用する蛍光レポータータンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙの発現と機能的に共役させた。接合経路への改変は、負の制御因子Ｓｓｔ２、および野生型接合経路において細胞成長を停止させるＦａｒ１をコードする遺伝子のノックアウトを含んだ。キメラＧαタンパク質（Ｇｐａ１－Ｇα_ｉ３）は、哺乳動物Ｇα_ｉ３の５個のＣ末端アミノ酸を含有する。（Ｂ）操作された接合経路は、野生型（ＷＴ）ヒトＰ２Ｙ２受容体および以下のようなＧｐａ１－Ｇαキメラの組込みを有する様々な酵母株を用いて、ＵＴＰに応答する：ＢＳ０１９（Ｇ_１４）、ＢＳ０２０（Ｇ_ｑ）、ＢＳ０１６（Ｇ_ｉ３）。示された濃度のＵＴＰとの６時間のインキュベーション後、接合経路の活性化を、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光をフローサイトメトリーにより定量化することによりモニターした。データ点は２つのコロニーの平均を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。０μＭ ＵＴＰに対して^＊Ｐ＜０．０５。（Ｃ）ヒトＷＴ Ｐ２Ｙ２受容体を発現する細胞を、ＵＴＰおよびＡＴＰで処理し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を、フローサイトメトリーにより定量化した。データ点は、ＡＴＰについては６個のコロニーの平均、ＵＴＰについては３個のコロニーの平均を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。（Ｄ）エラーの多い（Error-prone）ＰＣＲにより生成されたヒトＰ２Ｙ２受容体変異体のプラスミドライブラリを、Ｇｐａ１－Ｇα_ｉ３ ｍＣｈｅｒｒｙ受容体株へ形質転換した。細胞を、１００μＭ ＡＴＰで処理し、蛍光活性化細胞ソーティングを用いて、高度に活性化された変異体（ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の上位１％）について選択した。その後、個々の酵母コロニーを、スクリーニングして、所望の表現型を確認し、シーケンシングした。 図１－１の続きである。 図１－１の続きである。 図２Ａ～Ｂは、指向性進化により生成されたヒトＰ２Ｙ２受容体変異体のｅＡＴＰに対する応答性の増加を示す図である。（Ａ）ランダムに選択された酵母コロニーを、示されたリガンドと６時間、インキュベートし、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を定量化した。ｙ軸がＷＴ応答より上の倍数増加を表すように、応答は、１００μＭ ＡＴＰで活性化されたＷＴ ヒトＰ２Ｙ２受容体に対して標準化された。１０個の酵母コロニーを、詳細な特徴づけのために選択し（紫色のボックス）、１００μＭ ＡＴＰおよび１００μＭ ＵＴＰに対するそれらの応答は、本図の挿入図に示されている。（Ｂ）ヒトＰ２Ｙ２受容体における複数の変異は、ｅＡＴＰおよびｅＵＴＰに対する感受性および最大応答を増加させた。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、ｅＡＴＰへの最大ＷＴ応答に対するパーセンテージとして表されている。変異体は、変異体残基の位置に基づいて分類されている。データ点は、ｅＡＴＰについては６個のコロニーの平均、ｅＵＴＰについては３個のコロニーの平均を表し、それぞれが、示されたヒトＰ２Ｙ２受容体変異体をコードするプラスミドで形質転換されている。エラーバーはＳＥＭを表す。 図２－１の続きである。 図２－１の続きである。 図３Ａ～Ｈは、ヒトＰ２Ｙ２受容体変異体の特徴づけを示す図である。（Ａ）指向性進化後にヒトＰ２Ｙ２受容体において変異した残基。ＡＴＰ感受性の増強を有する上位１０個の変異体ヒトＰ２Ｙ２受容体を、変異体残基の位置：ヘリックス１、ヘリックス７、および膜貫通領域に基づいて分類した。推定結合ポケットにおいてドッキングされたＡＴＰは薄い灰色で示されている。残基Ｆ５８、Ｑ１６５、およびＦ３０７は、上位１０個の変異体のうちの８個において変異していた。Ｐ２Ｙ１受容体の構造（４ＸＮＷ．ｐｄｂ）に基づいて、ＭＯＤＥＬＬＥＲ ９．１８を用いて作成された。（Ｂ）Ｃ末端ＧＦＰタグ付きヒトＰ２Ｙ２受容体変異体の酵母における発現を、フローサイトメトリーにより定量化した。平均ＧＦＰ値を、ＷＴ Ｐ２Ｙ２発現に対して標準化した。データは、少なくとも３個のコロニーの平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。ＷＴに対して^＊Ｐ＜０．０５。（Ｃ）共焦点顕微鏡観察により調べられた、ＧＦＰタグ付き内因性酵母ＳＴＥ２ ＧＰＣＲおよびヒトＰ２Ｙ２受容体変異体の代表的な画像。スケールバーは５μＭを表す。（Ｄ～Ｇ）指向性進化により生成されたヒトＰ２Ｙ２受容体変異の組合せは、新規なＧＰＣＲ特徴を表している。（Ｄ）Ｆ５８ＩかまたはＦ３０７ＳのいずれかとのＮ１１６Ｓ変異の組合せは、結果として、最大活性のヒトＰ２Ｙ２受容体を生じた。Ｆ３０７Ｓ変異は、構成的活性を与え、ｅＡＴＰに対する感受性を向上させ、ｅＡＴＰに対する応答を向上させた。（Ｅ）非相加的効果が、ヒトＰ２Ｙ２受容体ＴＭ－２変異体の活性の増加に寄与する。Ｌ５９ＩおよびＣ１１９Ｓ変異は、単独で、ＡＴＰに対する感受性において中程度の増加を与える。その組み合わされた効果は、ＴＭ－２変異体において検出されたものより低く、非相加的変化を示している。（Ｆ）Ｈ１－１変異体における各変異を別々に分析することにより、Ｆ５８Ｃが、活性に影響する主要な変異として同定された。Ｋ２４０Ｎは、検出された活性の増加に寄与しなかった。（Ｇ）ＴＭ－１変異体は、Ｑ１６５Ｈ変異に加えて、サイレント変異を有する。サイレント変異は、それらがＦ５８Ｉ変異と組み合わされた場合を含め、ＡＴＰ感受性の増加に寄与する。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、ＡＴＰへの最大野生型応答に対するパーセンテージとして表されている。データ点は、少なくとも３個のコロニーの平均を表し、それぞれが、示されたＰ２Ｙ２変異体をコードするプラスミドで形質転換されている。エラーバーはＳＥＭを表す。（Ｈ）Ｐ２Ｙ２残基Ｆ５８を、全ての他のアミノ酸へ変異させ、ｅＡＴＰに対する用量反応を、Ｇｐａ１－Ｇα_ｉ３ ｍＣｈｅｒｒｙレポーター株を用いて評価した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、ＡＴＰへの最大野生型応答に対するパーセンテージとして表されている。データ点は、少なくとも３個のコロニーの平均を表し、それぞれが、示されたＰ２Ｙ２変異体をコードするプラスミドで形質転換されている。エラーバーはＳＥＭを表す。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図４Ａ～Ｆは、操作された酵母によるＡＴＰアーゼのｅＡＴＰ応答性分泌を示す図である。（Ａ）アピラーゼ遺伝子の配列アラインメント。ヒトＥＮＴＰＤ１（ＣＤ３９）、ジャガイモアピラーゼ（ＲＲＯＰ１）、およびコムギアピラーゼ（ＴＵＡＰ１）を、ＭＥＧＡ６アラインメントエクスプローラーにおけるＭＵＳＣＬＥを用いて、アライメントした。（Ｂ）治療的応答エレメント。（Ｃ）ジャガイモアピラーゼ（ＲＲＯＰ１）もしくはコムギアピラーゼ（ＴＵＡＰ１）を構成的に発現する酵母株、またはいかなるアピラーゼも発現しない（ベクター）酵母株からの細胞可溶化液。バンドは、アピラーゼ上のＣ末端ＨＡタグに対応し、ＲＲＯＰ１は、Ｎ末端α因子シグナルペプチドを含まない場合、４８ｋＤａ、またはシグナルペプチドを含む場合、５７ｋＤａに現れると予想された。ＴＵＡＰ１は、シグナルペプチドを含まない場合、４６ｋＤａ、シグナルペプチドを含む場合、５５ｋＤＡに現れると予想された。矢印は、ローディング対照として用いられた細胞質タンパク質Ｐｇｋ１を示す。（Ｄ）ジャガイモアピラーゼ（ＲＲＯＰ１）またはコムギアピラーゼ（ＴＵＡＰ１）を構成的に分泌する株からの５μＬの上清を、５０μＬの総反応体積においてＡＴＰ ５０μＭと３０分間、インキュベートし、残存ＡＴＰを定量化した；アピラーゼを発現しない酵母親株を陰性対照として用いた（ＣＢ００８）。それぞれ、３つの生物学的レプリケートを代表し、エラーバーは標準偏差を表す、^＊Ｐ＜０．００１。（Ｅ）操作されたヒトＰ２Ｙ２受容体活性化を、接合応答性プロモーターｐＦＵＳ１を利用するＲＲＯＰ１アピラーゼの発現と機能的に共役させた。ｅＡＴＰによる受容体の活性化により、アピラーゼは発現し、酵母による分泌を促進するシグナルペプチドのおかげで分泌される。分泌されたアピラーゼは、細胞外ＡＴＰをＡＤＰおよびＡＭＰへ脱リン酸化し、次に、遺伝子回路を遮断する。（Ｆ）Ｐ２Ｙ２／ＲＲＯＰ１遺伝子回路を有する操作された酵母株を、示された濃度のＡＴＰと１６時間、インキュベートした。ＡＴＰアーゼ活性を、５μＬ 培養上清を５０μＬ反応において５０μＭ ＡＴＰと３０分間、インキュベートし、その後、残存ＡＴＰを測定することにより定量化した。ＡＴＰアーゼ単位＝１分間あたり１μｍｏｌのＡＴＰをＡＤＰへ。左から右へ、ＡＰ－Ｐ４（ＷＴ）；ＡＰＴＭ－３（Ｎ１１６Ｓ）；ＡＰＨ１－１（Ｆ５８Ｃ Ｃ６０Ｙ Ｇ３１０Ａ）；ＡＰＨ１－３（Ｆ５８Ｉ）；ＡＰＴＭ－２（Ｌ５９Ｉ Ｃ１１９Ｓ）；ＡＰＴＭ－１（Ｑ１６５Ｈ）；ＡＰＨ７－１（Ｋ２４０Ｎ Ｆ３０７Ｓ）；構成的アピラーゼ（ＢＳ０２９）である。「構成的」とは、強い構成的ｐＴＤＨ３プロモーターの調節下でＲＲＯＰ１を発現する酵母株を示す。データは、別々の日に実施された３つの生物学的レプリケートの平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。同じＡＴＰ濃度におけるＷＴ応答に対して^＊Ｐ＜０．０５。 図４－１の続きである。 図４－１の続きである。 図４－１の続きである。 図４－１の続きである。 図４－１の続きである。 図５Ａ～Ｋは、ｅＡＴＰ応答性合成酵母はＴＮＢＳ誘導性大腸炎を軽快させることを示す図である。（Ａ）ＡＴＰ誘導性ＴＭ－３酵母株（左）またはＢＳ０３５構成的（右）での強制経口投与から２時間後の腸の特定部分の糞便内容物においてフローサイトメトリーにより定量化されたｍＣｈｅｒｒｙ陽性酵母（総ＧＦＰ酵母に占める％）。ＡＴＰレベルを、腸の同じ部分において測定した。（Ｂ）ＴＮＢＳ直腸投与後の体重の変化。群間の統計的有意性を、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙの多重比較事後検定により評価した、^＊＊＊Ｐ＜０．０５；^＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ＝有意性なし；（ｎ＝１０）。（Ｃ）（Ｂ）に示された実験群からのマウスの大腸の長さ（ｎ＝４）。（Ｄ）ヘマトキシリンおよびエオシン染色２０×（上部）および４０×（下部）倍率。各群の代表的な腸区域が示されている。白抜きの矢頭：免疫細胞が、構造破壊を有する粘膜に浸潤している。黒色の矢印：粘膜下層での免疫細胞浸潤。黒色の角括弧：浮腫性粘膜下層。スケールバー＝１００μｍ。（Ｅ）（Ｂ）のような群からのマウスの組織形態学疾患スコアであり、より高いスコアが、組織破壊のより高い重症度を意味する（ｎ＝４）。（Ｆ）（Ｂ）に示された実験群におけるマウスからの大腸試料のＲＮＡ－Ｓｅｑ分析。異なって発現した遺伝子のヒートマップ。（Ｇ）（Ｂ）に示された実験群における腸間膜リンパ節でのＦｏｘｐ３^＋ Ｔ制御細胞（ｎ＝３）。（Ｈ）（Ｂ）のような群からの試料の大腸組織においてｑＰＣＲにより決定されたＦｏｘｐ３、Ｉｆｎｇ、およびＩｌ１７ ｍＲＮＡ発現（ｎ＝３）。（Ｉ）（Ｂ）においてのように、プロバイオティクス酵母で処置されたマウスにおけるＤＳＳ誘導性大腸炎の経過中の体重の変化。群間の統計的有意性を、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙの多重比較事後検定により評価した、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ＝有意性なし；（ｎ＝１２）。（Ｊ）ＤＳＳ投与の開始から２１日後のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇにより決定された酵母処置されたマウスからの大腸試料における遺伝子発現。異なって発現した遺伝子のヒートマップ。データは、群あたりｎ＝３マウスからのプールされた試料の２つの独立した実験を代表する。（Ｋ）（Ｊ）においてのように、群からのマウス由来の大腸組織から抽出されたＲＮＡにおいてｑＰＣＲにより決定されたＮｏｓ２、Ｃｃｌ２、およびＩｌ１ｂ ｍＲＮＡ発現（ｎ＝３）。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、選択された多重比較のための事後検定、ＴｕｋｅｙまたはＳｉｄａｋ検定により決定された場合、^＊＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ＝有意性なし。データは３つの独立した実験を代表する。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図６Ａ～Ｈは、ｅＡＴＰ応答性合成酵母プロバイオティクスが線維症および腸内毒素症を制限することを示す図である。（Ａ）線維症についてのＭａｓｓｏｎ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色、２０×（上部）および４０×（下部）倍率。線維性領域は、染色され、白色矢印で強調されている。スケールバー＝１００μｍ。（Ｂ）（Ｌ）からの群からのマウスの組織学線維症スコア（ｎ＝４）。（Ｃ～Ｈ）糞便試料へＭｉＳｅｑにより実施された微生物１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のハイスループット遺伝子シーケンシング分析。（Ｃ）糞便マイクロバイオームのα多様性。α多様性における差を比較するＳｈａｎｎｏｎ指数を、最も高い配列深度（４０００ｐｂ）において計算した。Ｋｒｕｓｋａｌ－ＷａｌｌｉｓノンパラメトリックＡＮＯＶＡ検定により決定された場合、^＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ＝有意性なし。（Ｄ～Ｅ）β多様性。（Ｄ）重みなしＵｎｉＦｒａｃ計量に基づいた主座標分析（ＰＣｏＡ）。（Ｅ）エタノール対照群に対する重みなしＵｎｉＦｒａｃ距離。^＊Ｐ＜０．０５ Ｐｅｒｍａｎｏｖａ分析。（Ｆ）科レベル分類学において分類された細菌の相対存在量。（Ｇ）ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）およびそれのロゼブリア属（Roseburia）の１つの相対存在量。（Ｈ）ＡＰＴＭ－３対ＣＢ００８比較のためのＬＥｆＳｅ ｐ＜０．０５。各分岐図は、界の系統学的レベルから属レベルまでで示された、＞０．１％で検出された全ての分類を表す。薄い灰色の円は、存在するが豊富ではない分類群を表す。濃い灰色の円は、ＡＰＴＭ－３において豊富であり、縞模様の円は、ＣＢ００８において豊富である。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、事後検定のＴｕｋｅｙ検定により決定された場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ＝有意性なし。 図６－１の続きである。 図６－１の続きである。 図６－１の続きである。 図６－１の続きである。 図６－１の続きである。 図６－１の続きである。 図６－１の続きである。 図７Ａ～Ｂは、操作された接合経路の時間経過によるｅＡＴＰに対する応答を示す図である。（Ａ、Ｂ）プラスミドｐＲＳ３１６ ｐＴＤＨ３ Ｐ２Ｙ２（ＷＴヒトＰ２Ｙ２受容体）で形質転換されたＢＳ０１６株由来の酵母を、３００μＬ（Ａ）または５ｍＬ（Ｂ）のＳＤ－ＵＲＡ培地における１００μＭ ＡＴＰとインキュベートし、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を定量化した（それぞれ、２個の個々のコロニー、エラーバーは標準偏差を表す）。 図８は、ヒトＰ２Ｙ２受容体の指向性進化のためのストラテジーを示す図である。各ＦＡＣＳソート中、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の上位約１％を収集した。「回収された」とは、選択培地上に、ソートされた細胞をプレーティングした後に得られる酵母コロニーの数を指す。 図９Ａ～Ｂは、酵母上清におけるＡＴＰ濃度を示す図である。（Ａ）傾きは統計的に異ならなかった。（Ｂ）酵母により分泌された活性アピラーゼの量を推定するために、５０μＭ ＡＴＰを、５０μＬ反応体積において、ＣＢ００８株の培養物からの５μＬ上清と共に、示された濃度の市販のアピラーゼと３０℃で３０分間、インキュベートし、残存ＡＴＰを定量化した。３１．３ｐＭ 市販アピラーゼが加えられた時、アピラーゼ活性は観察されなかった。 図１０Ａ～Ｄは、合成酵母プロバイオティクスはマウス腸において生存可能であることを示す図である。（Ａ）ＣＢ００８ ＫＧ、ＢＳ０２９ ＫＧ、またはＡＰＴＭ－３ ＫＧ酵母株のいずれかでのマウスへの強制経口投与から６時間後に収集された便の１ｍｇあたりコロニー形成単位。（Ｂ）ナイーブマウスおよびＴＮＢＳ誘導性マウスの腸の特定部分におけるＡＴＰ相対レベル。（Ｃ）ＡＴＰ誘導性ＴＭ３株ＴＭ－３ ＫＧでのナイーブマウスへの強制経口投与から２時間後の腸の特定部分の糞便内容物においてフローサイトメトリーにより測定されたｍＣｈｅｒｒｙ陽性酵母（総ＧＦＰ酵母に占める％）（右）。ＡＴＰレベルを、腸の同じ部分において測定した。（Ｄ）ＴＭ－３ ＫＧまたはＰ４ ＫＧ（ＷＴ）酵母株での強制経口投与から２時間後の腸の特定部分の糞便内容物においてフローサイトメトリーにより定量化されたｍＣｈｅｒｒｙ陽性酵母（総ＧＦＰ酵母に占める％）。 図１０－１の続きである。 図１０－１の続きである。 図１１は、プラスミドｐＣＡＳ ＡａｒＩを示す図である。ＡｄｄＧｅｎｅから入手されたｐＣＡＳプラスミドにおいてＸｍａＩおよびＢｇｌＩＩ部位にカスタムマルチクローニング部位が挿入されている（１１２）。画像はＣＬＣ配列ビューワーで作成された。 図１１－１の続きである。 図１２は、どのようにして、炎症中、ＡＴＰ応答性治療用微生物はプリン作動性シグナル伝達を制御するのかを示す図である。慢性炎症は、炎症組織を囲んで＞１００μＭに達する、上方制御された細胞外ＡＴＰ（ｅＡＴＰ）により特徴づけられる（Bours, M.J., Dagnelie, P.C., Giuliani, A.L., Wesselius, A. & Di Virgilio, F. P2 receptors and extracellular ATP: a novel homeostatic pathway in inflammation. Frontiers in bioscience 3, 1443-1456 (2011)、Di Virgilio, F., Pinton, P. & Falzoni, S. Assessing Extracellular ATP as Danger Signal In Vivo: The pmeLuc System. Methods in molecular biology 1417, 115-129 (2016)）。ｅＡＴＰは、主にＰ２Ｘ７受容体を通して媒介される、腸における様々な免疫細胞および上皮細胞からの炎症促進性応答を誘導する（Kurashima, Y., Kiyono, H. & Kunisawa, J. Pathophysiological role of extracellular purinergic mediators in the control of intestinal inflammation. Mediators of inflammation 2015, 427125 (2015)）。Ｐ２Ｘ７の活性化は、カスパーゼ１発現を促進し、炎症性サイトカインの成熟およびパネキシン－１（Ｐａｎｘ１）チャネルの開口をもたらし、追加のＡＴＰの流出を促す（Cekic, C. & Linden, J. Purinergic regulation of the immune system. Nature reviews. Immunology 16, 177-192 (2016)）。ｅＡＴＰ蓄積を防止するために、エクトヌクレオチダーゼＣＤ３９およびＣＤ７３はＡＴＰをＡＤＰ、ＡＭＰ、および最終的にはアデノシンへ分解する（Cekic, C. & Linden, (2016)）。Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３受容体は、主に免疫細胞により発現したＧＰＣＲであり、アデノシンによるそれらの活性化は、抗炎症応答をもたらす（Cekic, C. & Linden, (2016)）。本発明である、ｅＡＴＰ応答性治療用微生物は、これらの既存の免疫制御性経路を動的に調節する。ＧＩ管へ導入された後、酵母細胞は、それらの表面上に発現した操作されたＰ２Ｙ２受容体を介して、上方制御されたｅＡＴＰを感知することができる。Ｐ２Ｙ２は、配線し直された接合経路を活性化し、アピラーゼまたはマウスＩＬ－１０をｅＡＴＰ濃度依存性様式で分泌する。アピラーゼは、ｅＡＴＰを直接的に分解するように機能し、抗炎症性アデノシンを生成するのを助けると同時に、Ｐ２Ｙ２活性化シグナルを遮断する。ＩＬ－１０は、ＮＬＲＰ３インフラマソームおよびカスパーゼを含む多くの炎症促進性遺伝子（Gurung, P. et al. Chronic TLR Stimulation Controls NLRP3 Inflammasome Activation through IL-10 Mediated Regulation of NLRP3 Expression and Caspase-8 Activation. Sci Rep 5, 14488 (2015)；Zhang, J., Fu, S., Sun, S., Li, Z. & Guo, B. Inflammasome activation has an important role in the development of spontaneous colitis. Mucosal Immunol 7, 1139-1150 (2014)）の下方制御をもたらすＩＬ－１０ Ｒ１／Ｒ２受容体に作用する（Paul, G., Khare, V. & Gasche, C. Inflamed gut mucosa: downstream of interleukin-10. Eur J Clin Invest 42, 95-109 (2012)）。

効率的な遺伝子操作（１１、１２）と進歩した合成遺伝子回路設計（１３、１４）の合流は、ますます複雑な微生物工学への道を開いた（１５～１８）。実際、合成生物学における最近の進歩は、疾患関連シグナルに応答して治療用タンパク質を送達するためのプロバイオティクスの操作を可能にした（１９～２２）。ＩＢＤに関連した１つのそのようなシグナルは細胞外アデノシン三リン酸（ｅＡＴＰ）であり、それは、活性化免疫細胞および共生細菌により放出されると、プリン受容体を介してシグナルを伝達して、ＩＢＤ病態に寄与すると考えられる生物学的応答の中でもとりわけ、炎症促進性サイトカイン産生をトリガーし、エフェクターＴ細胞活性化をブーストし、制御性Ｔ細胞応答を抑制し、腸管神経細胞アポトーシスを促進する（２３～２７）。ｅＡＴＰシグナル伝達は、膜結合型エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１（ＥＮＴＰＤ１、ＣＤ３９としても知られている）により制限され、そのＥＮＴＰＤ１は、ｅＡＴＰをＡＭＰへ加水分解する；その後、ＡＭＰは、ＣＤ７３により免疫抑制性アデノシンへ代謝される。ＣＤ３９は、ｅＡＴＰ駆動性炎症促進応答を制限し、同時に、制御性Ｔ細胞の分化、安定性、および機能をブーストする（２６）。腸炎症の調節におけるｅＡＴＰおよびＣＤ３９の生理学的役割についてのさらなる支持は、増加したｅＡＴＰ産生および／またはそれの減少した加水分解に起因するＩＢＤ患者におけるプリン作動性シグナル伝達の調節不全の報告により提供される（２５、２８）。

ＣＤ３９発現を減少させる遺伝子多型は、クローン病に関連づけられている（６８）。Ｔｒｅｇ上のＣＤ３９は、実験的およびヒトのＩＢＤにおいてエフェクターＴ細胞生成および機能を抑制する（２６～２８、６９）。実際、ＣＤ３９レベルの増加は、ＩＢＤ患者におけるＴＮＦαに対する阻止抗体により誘導される疾患寛解と関連づけられている（７０）。逆に、ｅＡＴＰにより駆動されるプリン作動性シグナル伝達は、抗原提示細胞の調節（７１）、エフェクターＴ細胞活性化のブースト（２３、７２）、ならびに制御性Ｔ細胞の機能および安定性の減少（２６、２７、７３）を含む複数の機構を通して炎症を促進する。ｅＡＴＰはまた、腸バリアを保護し抗炎症性共生細菌の生着を促進する（７５、７６）免疫グロブリンＡの産生を制限する（７４）。加えて、ｅＡＴＰはまた、非免疫細胞に作用して、腸管神経細胞のアポトーシスをトリガーすることによりＩＢＤ発病を促進する（２４）。したがって、ｅＡＴＰ駆動性シグナル伝達の遮断は、ＩＢＤについての魅力的な治療アプローチである。

アピラーゼを用いたｅＡＴＰ枯渇は、腸炎症を軽快させることが示されている（２３）。アピラーゼのこれらの抗炎症効果は、おそらく、ｅＡＴＰのＡＭＰへの変換を通してのｅＡＴＰ枯渇と、ＡＭＰからの免疫抑制性アデノシンの生成の両方を含む（２９）。アデノシンは、Ａ_２Ａアデノシン受容体を介して、Ｔ細胞活性化を抑制する（２９）。実際、本発明者らは、ＣＤ３９により駆動されるアデノシン産生が神経膠芽腫において腫瘍特異的Ｔ細胞を抑制することを最近、報告した（７７）。それゆえに、ｅＡＴＰ／アデノシンのバランスの調節が、炎症を処置するための有望なアプローチである。しかしながら、このアプローチの臨床適用は、治療剤投与のための適切な方法、ならびに免疫抑制および線維症（２６、２８、７７）および腸内マイクロバイオーム調節不全（２９、３０）などの望ましくない副作用を最小限にすることを必要とされる場所および時において、ｅＡＴＰ／アデノシンのバランスを調節する誘導系を必要とする。

指向性進化（３３）および合成生物学（３４）アプローチと共に、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）接合経路のモジュール方式を利用して、この酵母の株を、炎症促進性シグナルにより活性化されて、治療用タンパク質の分泌を誘発する操作されたヒトＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を発現するように改変した。ＧＰＣＲは、疾患を示す分子の検出を含む幅広い種類のシグナルを検出するための生物学的センサーとして機能する（Marinissen, M.J. & Gutkind, J.S. G-protein-coupled receptors and signaling networks: emerging paradigms. Trends in pharmacological sciences 22, 368-376 (2001)）。この能力により、ＧＰＣＲは、特定の疾患の合図に対するプログラムされた応答を誘発する、合成遺伝子回路の有用なコンポーネントとなる（Heng, B.C., Aubel, D. & Fussenegger, M. G protein-coupled receptors revisited: therapeutic applications inspired by synthetic biology. Annu Rev Pharmacol Toxicol 54, 227-249 (2014)）。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）接合経路は、ヒトＧＰＣＲによる活性化に適応するように配線し直すことができる、ＧＰＣＲシグナル伝達のための十分特徴づけられたモデルを提供する（Ladds, G., Goddard, A. & Davey, J. Functional analysis of heterologous GPCR signalling pathways in yeast. Trends Biotechnol 23, 367-373 (2005)）。細胞外アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の上昇は、主要な炎症促進性シグナルであり（Bours, M.J., Dagnelie, P.C., Giuliani, A.L., Wesselius, A. & Di Virgilio, F. P2 receptors and extracellular ATP: a novel homeostatic pathway in inflammation. Frontiers in bioscience 3, 1443-1456 (2011)）、ＩＢＤの腸において１００倍を超えて増加しており（＞１００μＭ）（Kurashima, Y., Kiyono, H. & Kunisawa, J. Pathophysiological role of extracellular purinergic mediators in the control of intestinal inflammation. Mediators of inflammation 2015, 427125 (2015)）、ＧＰＣＲのプリン作動性ファミリーにより特異的に検出される（Burnstock, G. & Boeynaems, J.M. Purinergic signalling and immune cells. Purinergic signalling 10, 529-564 (2014)）。酵素アピラーゼは、ＡＴＰを直接的に分解して、それを免疫抑制性アデノシンへ変換し（Cekic, C. & Linden, J. Purinergic regulation of the immune system. Nature reviews. Immunology 16, 177-192 (2016)）、アピラーゼは、ＩＢＤの動物モデルにおいてＧＩ炎症を低下させることが示された（Wan, P. et al. Extracellular ATP mediates inflammatory responses in colitis via P2 x 7 receptor signaling. Sci Rep 6, 19108 (2016)）。抗炎症性サイトカインインターロイキン１０（ＩＬ－１０）は、腸における炎症応答を制限することにとって重要である（Paul, G., Khare, V. & Gasche, C. Inflamed gut mucosa: downstream of interleukin-10. Eur J Clin Invest 42, 95-109 (2012)）。微生物が、ＩＬ－１０を、炎症促進性シグナルに応答してではなく、構成的に分泌するように操作されており（Braat, H. et al. A phase I trial with transgenic bacteria expressing interleukin-10 in Crohn's disease. Clin Gastroenterol Hepatol 4, 754-759 (2006); Rottiers, P., Vandenbroucke, K. & Iserentant, D., Vol. EP1931762(B1). (ed. E.P. Office) 1-26 (Actogenix NV, Belgium; 2012)）、第Ｉ相臨床試験においてＩＢＤを処置するのに有望と見込まれている（Braat, H. et al. (2006)）。

検出された炎症組織の微小環境において産生された代謝産物ｅＡＴＰに応答して、例えば操作されたヒトＰ２Ｙ２受容体を介して、炎症促進性ｅＡＴＰを枯渇させかつ免疫抑制性アデノシンの生成を促進する抗炎症性タンパク質、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、またはＣＤ３９様ｅＡＴＰ分解酵素アピラーゼを分泌する微生物プロバイオティクスが本明細書に記載されている。これらの操作されたアピラーゼ発現酵母は、マウスにおける実験的腸炎症を抑制し、腸線維症および腸内毒素症を低下させた。炎症中のプリン作動性シグナル伝達に関与する特定の分子経路は、図１２に概略が示されている；理論によって縛られるつもりはないが、図１２は、どのようにして、操作された微生物が、ＧＩ管における炎症を動的に処置するためにこれらの経路を調節すると考えられるのかも示している。

本データは、ｅＡＴＰセンシングに応答してアピラーゼを産生するように操作された酵母プロバイオティクスによる制御ｅＡＴＰ枯渇が線維症誘導を最小限にすることを示している。さらに、プリン作動性シグナル伝達を調節する誘導性操作された酵母株の使用はまた、健康なマイクロバイオームの回復を可能にして、病態ＩＢＤに寄与すると考えられる腸内毒素症および他のヒト障害を最小限にした（３、４）。

操作された微生物
シグナル伝達経路の固有のモジュール方式（７８）は、外因性タンパク質を用いる操作を可能にする（７９）。サッカロミセス（Saccharomyces）種は、食品における使用については古くから知られており、ある特定のサッカロミセス（Saccharomyces）種はまた、関心対象となる刺激に応答してタンパク質の制御発現を駆動させるための操作された遺伝子回路を有する安全なプロバイオティクスとして用いられている（１５、３１、３２）。いくつかの実施形態において、本操作された微生物は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）において作製される。Ｓ．ブラウディ（S. boulardii）は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）よりプロバイオティクスとしてより一般的に用いられており（８９、９０）、Ｓ．ブラウディ（S. boulardii）を操作するための遺伝的ツールは利用可能である（９１、９２）。したがって、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）が本明細書で例示されているが、本明細書に記載された誘導系は、Ｓ．ブラウディ（S. boulardii）を含む他の微生物を用いて確立することもできる。

いくつかの実施形態において、微生物は、親微生物、例えば、サッカロミセス属（Saccharomyces）、例えば、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のゲノムを改変することにより生成される。改変としては、酵母のゲノムへの以下のタンパク質の導入を挙げることができる（しかし、それに限定されない）：（ｉ）例えば構成的プロモーター（ｐＴＤＨ３）の調節下で、ｅＡＴＰに対してより高い応答性にする３つまでの変異を含有する操作されたＰ２Ｙ２；（ｉｉ）Ｐ２Ｙ２を酵母接合経路に共役させる、例えば哺乳動物Ｇα（Ｇα_ｉ３）の５個のＣ末端残基を含有する変異体Ｇｐａ１タンパク質；および（４）例えばＦｕｓ１遺伝子由来の、ＧＰＣＲ活性化の下流のプロモーターにより調節される、アピラーゼが分泌されるように指示する酵母由来リーダーペプチドを含有するジャガイモアピラーゼまたはインターロイキン１０（ＩＬ－１０）。改変にはまた、ゲノムからの以下の１つまたは複数の内因性酵母タンパク質の欠失を挙げることができる（しかし、それらに限定されない）：（ｉ）天然酵母ＧＰＣＲ接合経路受容体Ｓｔｅ２（例えば、α因子フェロモン受容体ＳＴＥ２（ＮＰ＿１１６６２７．２）；天然リガンドによる経路活性化を回避するため）、（ｉｉ）経路機能の負の制御因子Ｓｓｔ２（例えば、経路機能の負の制御因子、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質ＳＳＴ２（ＮＰ＿０１３５５７．１）；Ｐ２Ｙ２により活性化された時、経路応答を増加させるため）、（ｉｉｉ）細胞周期制御因子Ｆａｒ１（例えば、細胞周期制御因子サイクリン依存性タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ阻害性タンパク質ＦＡＲ１（ＮＰ＿０１２３７８．１）；接合経路活性化による細胞周期停止を回避するため）、および（ｉｖ）酵母Ｇαタンパク質Ｇｐａ１（例えば、酵母Ｇαタンパク質グアニンヌクレオチド結合タンパク質サブユニットαＧＰＡ１（ＮＰ＿０１１８６８．１）；他の経路コンポーネントとの結合における競合を回避するため）。

したがって、方法は、Ｇｐａ１の５個のＣ末端アミノ酸（ＫＩＧＩＩ）が、示された哺乳動物Ｇαタンパク質由来の５個のＣ末端アミノ酸と置き換えられている変異体Ｇαタンパク質（Brown et al., Yeast. 2000 Jan 15;16(1):11-22. 2000）（例えば、キメラ酵母Ｇｐａ１－ヒトＧα_ｉ３タンパク質）を導入すること、Ｐ２Ｙ２（例えば、変異体Ｐ２Ｙ２、任意選択で、酵母による発現のためにコドン最適化されている）を導入すること、およびＰ２Ｙ２活性化の下流で活性化されるプロモーター（例えば、接合経路応答性プロモーター）により調節されるアピラーゼまたはインターロイキン１０（ＩＬ－１０）のような抗炎症性分子を導入することを含み得る。本明細書で示されているように、ＧＰＣＲ Ｐ２Ｙ２の操作されたバリアントは、炎症を示すｅＡＴＰの濃度（約１００マイクロモル濃度～高いミリモル濃度）に応答した。加えて、Ｐ２Ｙ２活性化に応答して、ＡＴＰ濃度依存性様式で、操作された酵母株によりアピラーゼまたはＩＬ－１０が分泌され、アピラーゼは、細胞外ＡＴＰを分解する機能を果たした。最後に、ＩＢＤのマウスモデルにおいて、アピラーゼを分泌する操作された酵母株での処置は、直接的に、疾患予後を改善し、炎症促進性サイトカイン産生を低下させた。本明細書に記載された操作された酵母は、例えば、炎症促進性ｅＡＴＰに応答性の自己調整可能なＰ２Ｙ２－ＲＲＯＰ１遺伝子回路を含み得、そのｅＡＴＰはそれ自体、時間および位置特異的様式でｅＡＴＰ／アデノシンのバランスを動的に調節するように、ＲＲＯＰ１によりコードされる分泌されたアピラーゼにより加水分解される。

外因性配列は、当技術分野において知られた分子生物学的方法を用いて微生物へ導入することができる。いくつかの実施形態において、生きた生物学的製剤生物体に関する食品医薬品局（ＦＤＡ）ガイドライン（事件整理番号ＦＤＡ－２０１０－Ｄ－０５００）に一致した生物学的封じ込めのためにウラシル栄養要求性を維持しながら、抗生物質選択マーカーの使用を回避するために、操作された遺伝子回路は、酵母ゲノムへ、例えばＣＲＩＳＰＲ媒介性組込みを用いて、組み込まれる。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）株は、健康なマイクロバイオームに存在し、ＩＢＤ中には低下しており（８２～８４）、免疫系の生理学的訓練と関連づけられている（８５～８８）。

Ｐ２Ｙプリン受容体２（Ｐ２Ｙ２）
Ｐ２Ｙ２受容体は、ｅＡＴＰに対して最も感受性の高いプリン作動性ＧＰＣＲであり、以前、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）接合経路と機能的に関係づけられた（Junger, W.G. Immune cell regulation by autocrine purinergic signalling. Nature reviews. Immunology 11, 201-212 (2011)；Brown, A.J. et al. Functional coupling of mammalian receptors to the yeast mating pathway using novel yeast/mammalian G protein alpha-subunit chimeras. Yeast 16, 11-22 (2000)）。本方法は、炎症促進性シグナルにより活性化されるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、例えばＰ２Ｙ２ ＧＰＣＲ、例えばヒトＰ２Ｙ２を発現するように操作された酵母の使用を含み得る。

ヒトＰ２Ｙ２タンパク質についての例示的な参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＰ＿００２５５５．４として提供されている。ヒトＰ２Ｙ２タンパク質をコードする例示的な参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＭ＿１７６０７２．３（バリアント１）；ＮＭ＿００２５６４．４（バリアント２）；およびＮＭ＿１７６０７１．３（バリアント３）として提供されている。転写産物バリアント１、２、および３は同じタンパク質をコードする。本明細書で提示された例示的な操作された酵母株に用いられるヒトＰ２Ｙ２のＤＮＡ配列は、ＮＰ＿００２５５５．４（ＮＰ＿００２５５５．４）に示されているようなタンパク質配列に関して、任意選択で、例えば本明細書に記載された変異を含めまたはその変異に加えて、最高２％、５％、１０％、１５％、または２０％のアミノ酸に関して、酵母における発現のためにコドン最適化された。

いくつかの実施形態において、変異がｅＡＴＰの生理学的レベルに対する応答を調整する、すなわち、Ｇタンパク質シグナル伝達および抗炎症性タンパク質の発現を増加させることにより、調整する、操作されたヒトＰ２Ｙ２が用いられる。いくつかの実施形態において、変異は、リガンド結合ポケットの周辺の残基（Ａ７６^２．４７、Ｎ１１６^３．３５、Ｃ１１９^３．３８、Ｌ１６２^４．５４、Ｑ１６５^４．５７）、または受容体の細胞内に面する側に位置する残基（Ｆ５８^１．５７、Ｌ５９^１．５８、Ｃ６０^１．５９、Ａ２２９^ＩＣＬ３、Ｋ２４０^６．３１、Ｆ３０７^７．５４、Ｇ３１０^Ｃ末端）におけるものである。いくつかの実施形態において、Ｐ２Ｙ２は、ｅＡＴＰ感受性の増加に最も高く寄与する残基（すなわち、Ｆ５８^１．５７、Ｎ１１６^３．３５、Ｆ３０７^７．５４、およびＱ１６５^４．５７）において１つまたは複数の変異、例えば、残基Ｆ５８（例えば、Ｆ５８Ｃ）、Ｑ１６５（例えば、Ｑ１６５Ｈ）、およびＦ３０７（例えば、Ｆ３０７Ｓ）における１つまたは複数の変異を含む。いくつかの実施形態において、変異は、Ｎ１１６における変異、例えば、Ｎ１１６Ｓを、任意選択でＦ５８における変異、例えばＦ５８Ｉか、またはＦ３０７における変異、例えばＦ３０７Ｓのいずれかでの変異と組み合わせて、含む。いくつかの実施形態において、Ｐ２Ｙ２は、Ｌ５９における変異、例えばＬ５９Ｉ、および／またはＣ１１９における変異、例えばＣ１１９Ｓを含む。本明細書に記載された特定の変異に加えて、他のアミノ酸への変異もまた用いることができ、例えば、Ｆ５８を、任意の他のアミノ酸へ変化させることができる。（ナンバリングはＮＰ＿００２５５５．４ － 配列番号１３に対応する）

抗炎症剤
本明細書に記載された微生物は、１つまたは複数の抗炎症剤を発現するように操作される。例示的な抗炎症剤には、アピラーゼ、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、ＩＬ－２、ＩＬ－２７、ＩＬ－２２、およびＩＦＮ－βが挙げられる。抗炎症剤は、ｅＡＴＰのＧＰＣＲ Ｐ２Ｙ２との結合によりトリガーされるプロモーターの調節下に配置され、（理論によって縛られるつもりはないが）その結合は、ＭＡＰキナーゼカスケードのＧタンパク質媒介性トリガーおよび抗炎症剤の発現を引き起こす。例示的なプロモーターには、ｐＦＵＳ１（Ｆｕｓ１開始コドンのすぐ上流の１６３６ｂｐとして定義される；遺伝子ＩＤ ８５０３３０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１１３５．５、範囲７１８０３～７３３４１）、またはｐＦＩＧ１（Ｆｉｇ１開始コドンのすぐ上流の５００ｂｐとして定義される；遺伝子ＩＤ ８５２３２８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１１３４．８、範囲３１６９６８～３１７８６４）が挙げられる。あるいは、Mukherjee et al., ACS Synth. Biol. 2015, 4, 12, 1261-1269 (2015)およびShaw et al. Cell. 177(3): 782-796.e27 (Apr 2019)により記載されたものと類似して、抗炎症性遺伝子の上流の非酵母ＤＮＡオペレーター配列とペアにされる、フェロモン応答性ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含有する合成転写因子を用いることができる。

アピラーゼ（ＲＲＯＰ）
ＩＢＤおよび慢性炎症のマウスモデルにおいて、アピラーゼの腹腔内注射は、Ｔ細胞活性化を低下させ、炎症促進性サイトカインの産生を阻止し、大腸炎を軽減する（Wan, P. et al. Extracellular ATP mediates inflammatory responses in colitis via P2 x 7 receptor signaling. Sci Rep 6, 19108 (2016)；Atarashi, K. et al. ATP drives lamina propria T(H)17 cell differentiation. Nature 455, 808-812 (2008)；Cauwels, A., Rogge, E., Vandendriessche, B., Shiva, S. & Brouckaert, P. Extracellular ATP drives systemic inflammation, tissue damage and mortality. Cell death & disease 5, e1102 (2014)）。アピラーゼは、炎症促進性ＡＴＰを分解して、それの、抗炎症シグナル、アデノシンへの変換を助ける（Cekic, C. & Linden, J. Purinergic regulation of the immune system. Nature reviews. Immunology 16, 177-192 (2016)）。

ジャガイモ種（S. tuberosum）から単離されたアピラーゼ（ＲＲＯＰ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＵ５８５９７．１）は、報告された最も高いＡＴＰアーゼ活性を有する（１１５）。ＢｌａｓｔＰｈｙＭｅツールが、ＲＲＯＰ１を最初のインプット配列として用いる、相同遺伝子のゲノムマイニングに使用された（１１６）。野生ヒトツブコムギ（Triticum urartu）由来のアピラーゼ（「ＴＵＡＰ１」と名付けられ、本明細書に記載された実施例に用いられている）は、それがアピラーゼ機能に必要とされることが知られたドメインを保存していること（Knowles, Purinergic Signal. 2011 Mar;7(1):21-45）から、かつコムギアピラーゼ活性の以前の報告（Komoszynski Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 1996 Mar;113(3):581-91）に基づいて、最終的に選択された；ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＫＤ０３９１５６．１参照。本明細書で提示された例示的な操作された酵母株に用いられるＳ．ツベロスム（S. tuberosum）（ＲＲＯＰ１）および野生ヒトツブコムギ（Triticum urartu）（ＴＵＡＰ１）のＤＮＡ配列は、酵母における発現のためにコドン最適化された（下記参照）。加えて、内因性アピラーゼＮ末端シグナルペプチド（例えば、Ｕ５８５９７．１の最初の３０ヌクレオチド、またはＫＤ０３９１５６．１の最初の１８アミノ酸）は、酵母分泌シグナル、例えば、ＭＦα１シグナルペプチド（Ｓｔｅ１３切断部位が望まれるかどうかに依存して、ＮＰ＿０１５１３７．１の最初の８５アミノ酸または最初の８９アミノ酸）によって置き換えられ得る。他のシグナル配列、例えば、プレプロα因子由来のシグナル配列（例えば、Wittke et al., Mol Biol Cell. 2002 Jul; 13(7): 2223-2232；Microb Cell Fact. 2014; 13: 125参照）、またはＢＧＬ２シグナルペプチド（または人工ＢＧＬ２ プレＶａｌ^７ バリアント）（Achstetter et al., Gene 110(1): 25-21, 2 January 1992参照）、またはＡＧＡ２もしくはＥＸＧ１シグナルペプチド配列（Mori et al., J. Biosci. Bioeng. 2015; 120(5):518-525参照）、または天然では見出されない操作されたペプチド配列（Rakestraw et al., Biotechnol. Bioeng. 2009; 103(6):1192-1201参照）が代替として用いることができる。

インターロイキン１０（ＩＬ－１０）
ＩＬ－１０は、炎症促進性遺伝子を下方制御するように働く、炎症の適切な制御に必要とされる（Paul, G., Khare, V. & Gasche, C. Inflamed gut mucosa: downstream of interleukin-10. Eur J Clin Invest 42, 95-109 (2012)）。ＩＬ－１０の送達は、ＩＢＤについての処置として検討されているが、それの効力は、それが腸に到達した時点での低い濃度によって制限され得る（Marlow, G.J., van Gent, D. & Ferguson, L.R. Why interleukin-10 supplementation does not work in Crohn's disease patients. World J Gastroenterol 19, 3931-3941 (2013)）。

ヒトＩＬ－１０タンパク質についての例示的な参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＰ＿０００５６３．１（インターロイキン－１０アイソフォーム１前駆体）として、およびマウスＩＬ－１０（ｍＩＬ－１０）についてＮＰ＿０３４６７８．１（インターロイキン－１０前駆体）として提供されている；これらの２つをコードする例示的なＤＮＡ参照配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＮＭ＿０００５７２．３およびＮＭ＿０１０５４８．２として提供されている。本明細書で提示された例示的な操作された酵母株に用いられるｍＩＬ－１０のＤＮＡ配列は、酵母における発現のためにコドン最適化された。内因性ＩＬ－１０ Ｎ末端シグナルペプチド（ＮＰ＿０３４６７８．１の最初の２１アミノ酸）は、酵母分泌シグナル、例えば、ＭＦα１シグナルペプチド（Ｓｔｅ１３切断部位が望まれるかどうかに依存して、ＮＰ＿０１５１３７．１の最初の８５アミノ酸または最初の８９アミノ酸）によって置き換えられ得る。他のシグナル配列、例えば、プレプロα因子由来のシグナル配列（例えば、Wittke et al., Mol Biol Cell. 2002 Jul; 13(7): 2223-2232；Microb Cell Fact. 2014; 13: 125参照）、またはＢＧＬ２シグナルペプチド（または人工ＢＧＬ２ プレＶａｌ^７ バリアント）（Achstetter et al., Gene 110(1): 25-21, 2 January 1992参照）、またはＡＧＡ２もしくはＥＸＧ１シグナルペプチド配列（Mori et al., J. Biosci. Bioeng. 2015; 120(5):518-525参照）、または天然では見出されない操作されたペプチド配列（Rakestraw et al., Biotechnol. Bioeng. 2009; 103(6):1192-1201参照）が代替として用いることができる。国際公開第２００７０３９５８６号パンフレットも参照されたい。

インターロイキン－２（ＩＬ－２）
低用量ＩＬ－２は、実験的大腸炎のヒト化マウスモデルにおいて、Ｔｒｅｇを増殖させ、かつ疾患を軽快させることが示されている。Goettel et al., Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2019; 8(2): 193-195。

ヒトＩＬ－２タンパク質についての例示的な参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＰ＿０００５６３．１として提供されている；ＩＬ２をコードする例示的なヒト参照配列は、ＮＭ＿０００５８６．４として提供され、任意選択で上記のような酵母分泌シグナルを含む。

ＩＬ－２７
ヒトＩＬ－２７タンパク質についての例示的な参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＰ＿６６３６３４．２として提供されている；ＩＬ－２７をコードする例示的なヒト参照配列は、ＮＭ＿１４５６５９．３として提供され、任意選択で上記のような酵母分泌シグナルを含む。ＩＬ－２７治療は、ＩＢＤについての処置として提案されている；Andrews et al., Inflamm Bowel Dis. 2016 Sep; 22(9): 2255-2264参照。

ＩＬ－２２
ヒトＩＬ－２７タンパク質についての例示的な参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＰ＿０６５３８６．１として提供されている；ＩＬ－２７をコードする例示的なヒト参照配列は、ＮＭ＿０２０５２５．５として提供され、任意選択で上記のような酵母分泌シグナルを含む。ＩＬ－２２治療は、ＩＢＤについての処置として提案されている；Li et al., World J Gastroenterol. 2014 Dec 28; 20(48): 18177-18188参照。

インターフェロンβ１（ＩＦＮ－β）
ヒトＩＬ－２７タンパク質についての例示的な参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＰ＿００２１６７．１として提供されている；ＩＬ－２７をコードする例示的なヒト参照配列は、ＮＭ＿００２１７６．４として提供され、任意選択で上記のような酵母分泌シグナルを含む。インターフェロンβ－１ａは、ＩＢＤについて、例えば、潰瘍性大腸炎において臨床試験中である；例えば、Nikolaus et al., Gut. 2003 Sep; 52(9): 1286-1290参照。

コドン最適化およびバリアント
加えて、本方法および本組成物に用いられる核酸配列は、好ましくは、選択された発現系、例えば、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）における発現のためにコドン最適化される。非哺乳動物細胞における発現を最適化するために、選択された宿主生物体に特異的なコドン最適化を用いることができる。例えば、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）が宿主生物体として用いられる実施形態において、以下の表Ａ（情報源：ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ）が、コドンを選択するために用いることができる：

いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されているような参照配列のバリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態において、配列は、参照配列の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であり得る；例えば、配列は、追加の変異がそのタンパク質の関連活性（例えば、図１２に示されているように、Ｐ２Ｙ２について、ｅＡＴＰを感知し、かつ抗炎症薬の発現および分泌をトリガーする能力；アピラーゼについて、ｅＡＴＰを分解する能力；ＩＬ－１０について、炎症性遺伝子を下方制御する能力など）を有意に低下させることがない限り、例えば、本明細書に記載された変異に加えて、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の変異を含み得る。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列は、最適な比較を目的として、アラインメントされる（例えば、最適なアラインメントのために第１と第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非相同配列は、比較を目的として無視することができる）。比較を目的としてアラインメントされる参照配列の長さは、典型的には、その参照配列の長さの少なくとも８０％であり、いくつかの実施形態において、少なくとも９０％または１００％である。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、それらの分子は、その位置において同一である（本明細書で用いられる場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、その２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列により共有される同一の位置の数の関数である。別の実施形態において、２つのアミノ酸配列のパーセント同一性は、両方のアミノ酸配列における対応する位置でのアミノ酸の同じファミリー（例えば、正電荷、負電荷、極性、および非荷電、疎水性）内のアミノ酸残基の保存の関数として評価することができる（例えば、両方の配列における特定の位置でのバリン残基の代わりのアラニン残基の存在は、高レベルの保存を示すが、両方の配列における特定の位置でのアスパラギン酸残基の代わりのアルギニン残基の存在は、低レベルの保存を示す）。

本発明の目的のために、配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティでのＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスを用いて、達成することができる。

処置の方法
腸内マイクロバイオームは、健康および疾患において中心的役割を果たす（６７）。マイクロバイオームにより実施される複数の機能に基づいて、操作されたプロバイオティクスの使用は、ヒト障害の中でもとりわけ、炎症性疾患についての魅力的な治療アプローチと考えられる。本明細書に記載された操作された微生物は、例えば炎症性状態の処置および予防において、例えば有効量の操作された微生物を患者のＧＩ管へ投与することにより、例えば炎症を低下させ、および炎症性状態を処置し、または炎症性状態のリスクを低下させ、または炎症性状態の発生を遅らせるのに十分な、本明細書に記載されているような操作された微生物を含む組成物の経口摂取により、用いることができる。

その微生物は、例えば、炎症性状態、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む炎症性腸管状態の処置および予防において、操作された微生物を患者のＧＩ管へ投与することにより、例えば、操作された微生物を含む組成物の経口摂取により、用いることができる。ＩＢＤには、クローン病；潰瘍性大腸炎（ＵＣ）；顕微鏡的大腸炎；憩室症関連大腸炎；コラーゲン形成大腸炎；リンパ球性大腸炎；およびベーチェット病を挙げることができる。その微生物は、例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置および予防において、または抗腫瘍治療（例えば、化学療法、放射線療法、およびチェックポイント阻害剤、それらの全てはＧＩ炎症を誘導する）後に、用いることができる。その微生物は、例えばＧＩ炎症の処置および予防において、用いることができる。

ｅＡＴＰは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む腸管状態、加えて、移植片対宿主病および放射線療法誘導性腹部線維症などの、ＩＢＤ以外の他の疾患において、腸炎症を促進する（９３、９４）。さらに、腸内マイクロバイオームは、中枢神経系などの遠位の身体部位における炎症を制御する（９５～９７）。したがって、本方法は、消化器系の域を越えて他の組織を標的にする炎症性障害の処置および／または予防のために、例えば全身性炎症の低下のために、用いることができる。

一般的に、方法は、本明細書に記載されているような操作された微生物の有効量を、そのような処置を必要としている対象、または必要とすると決定されている対象へ投与することを含む。方法は、炎症を低下させるのに必要とされるたびごとに、例えば、１日に１回または２回、例えば、週に１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日（例えば、毎日）、微生物を投与することを含み得る；および投与は、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、もしくはそれ以上の間、または不確定で、継続され得る。

この文脈において用いられる場合、「処置する」ことは、炎症に関連した障害の少なくとも１つの症状を軽快させる（例えば、その症状の重症度または頻度を低下させる）ことを意味する；本明細書に記載されているような操作された微生物の治療有効量の投与は、炎症に関連した障害の１つまたは複数の症状の減少を生じ得る。上記で述べられているように、いくつかの実施形態において、障害はＩＢＤである。例えば、クローン病は、頻繁な下痢；たまの便秘；腹痛；発熱；下血；疲労；皮膚疾患；関節痛；栄養障害；体重減少；および／または瘻孔を生じる場合が多い。ＵＣは、腹痛；軟便；血便；排便切迫；疲労；食欲不振；体重減少；および／または栄養障害を生じる場合が多い。治療有効量の操作された微生物の投与は、これらの症状のいずれか１つまたは複数の低下を生じ得る。本明細書に記載されているような操作された微生物の予防的有効量の投与は、炎症に関連した障害のリスクの減少または発生の遅延を生じ得る。炎症に関連した障害を有する対象は、当業者により、例えば、大腸内視鏡検査またはＣＴスキャンなどの画像化方法を用いて、同定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法を用いて処置される対象としては、炎症に関連した障害を発症するリスクを有するもの、例えば、遺伝学／家族歴、年齢、人種、食事、または他のリスク因子の結果として、一般集団のリスクより高いリスクを有するものが挙げられる。国際公開第２００７０３９５８６号パンフレットもまた参照されたい。

組成物
操作された微生物を含む組成物が本明細書で提供される。好ましくは、組成物は、微生物の経口投与のために製剤化され、生理学的に許容される、すなわち、無毒であり、かつ操作された微生物の活性に影響しない担体または賦形剤を含む。

いくつかの実施形態において、組成物は、固形、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、軟ゼラチンカプセル、糖衣丸剤、口腔内崩壊剤／口腔内崩壊錠、発泡錠、または他の固体である。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば飲用溶液などの液体の形をとる。

経口組成物は一般的に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療的投与を目的として、活性化合物は、賦形剤と共に組み入れ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形をとって用いることができる。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての使用のために流体担体を用いて調製することができる。薬学的適合性の結合剤および／またはアジュバント材料が、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ、およびその他同種類のものは、以下の成分または類似した性質の化合物のいずれかを含有することができる：結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤；コロイド二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバーなどの香味剤。

いくつかの実施形態において、組成物は、液体または固体の食物、餌、または飲用水を含む栄養組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、乳製品および非乳製品ベースの飲料、植物もしくは動物ベースのミルク製品（例えば、アーモンド、カシュー、ダイズ、もしくはオートムギのミルク；またはウシ、ヤギ、もしくはヒツジのミルク）、粉ミルク、還元乳、発酵乳、スムージーもしくは発酵飲料（糖質含有媒体の発酵から生じる）、フレーバー飲料、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、固形ヨーグルト、果物および／もしくは野菜ジュースもしくはその濃縮物、果物および野菜ジュース粉末、還元果物製造物、粉末、または麦芽もしくは大豆もしくは穀類ベースの飲料、ならびに乳製品および非乳製品ベースのスポーツサプリメントを含むスポーツサプリメントを含む飲料；またはミューズリーフレークなどの朝食用シリアル、スプレッド、食事代替物、菓子類、チョコレート、ゲル、アイスクリーム、穀物、果物ピューレ、および／もしくはチョコレートバー、エネルギーバー、スナックバー、フードバー、ソース、ディップを含む固形食物などの食品である。組成物はまた、例えば食物上に振りかけ、もしくは中へ混合することにより、固形食物へ混合され；または飲料、例えば、水、ジュース、もしくはミルクの中へ混合される添加剤であり得、フレーバーを含み得る。本明細書で用いられる場合、スムージーは、典型的にはブレンダーを用いて、裏ごしされた生の果物および／または野菜から作られたドリンクである。スムージーは、典型的には、水、果物ジュース、ミルク、ヨーグルト、アイスクリーム、またはカッテージチーズなどの植物および／または動物ベースのミルク製造物などの液体ベースを含む。スムージーは、追加の成分、例えば、クラッシュアイス、甘味料（例えば、アガベシロップ、メイプルシロップ、蜂蜜、もしくは砂糖などの天然甘味料、または人工甘味料）、ビネガー、小麦粉、チョコレート、または栄養サプリメントなどのタンパク質サプリメントを含み得る。

組成物における微生物は、生存可能であるべきであり、例えば、生きているか、または生存能を支援する形、例えば、再水和された時に酵母が生存可能であることを可能にする脱水された形をとるかのいずれかであるべきであり、例えば、米国特許第３８４３８００号明細書；米国特許第３９９３７８３号明細書；米国特許第４２１７４２０号明細書；米国特許第４３４１８７１号明細書；米国特許第４７６４４７２号明細書；欧州特許出願公開第０６１６０３０号明細書；米国特許第６０３３８８７号明細書；米国特許第６３７２４８１号明細書；米国特許出願公開第２００５０１０６２８７号明細書；米国特許出願公開第２００５０１２９８０８号明細書；米国特許出願公開第２０１０００９２６１１号明細書；国際公開第２００９１３０２１９号パンフレット；日本特許出願公開第２０１０５３６３６０号明細書；ロシア特許第２４４４５６６号明細書；中国特許出願公開第１０２８０３４６８号明細書に記載されているように調製される。国際公開第２００７０３９５８６号パンフレットも参照。

本発明は以下の実施例においてさらに記載され、その実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない。

材料および方法
以下の材料および方法を、下記の実施例に用いた。
レポーター酵母株。最初の酵母株の全てのゲノム改変を、選択マーカーの相同組換えを用いて行い、標準酢酸リチウム形質転換方法を用いて、少なくとも１μｇの直鎖挿入断片ＤＮＡで形質転換した。親株は、蛍光レポーター遺伝子の構成的過剰発現についてのＣＢ００８（９８）か、またはＰ２Ｙ２－ｍＣｈｅｒｒｙもしくはＰ２Ｙ２－アピラーゼ遺伝子回路についてのＢＳ００４（９９）のいずれかであった（詳細な株遺伝子型について表１参照）。ｐＦＵＳ１－ｍＣｈｅｒｒｙを、ＫａｎＲマーカーを含有するプラスミドｐＪＷ６０９を用いて、ＭＦＡ２遺伝子座に組み込んだ。ｐＦＵＳ１は、Ｆｕｓ１開始コドンのすぐ上流の１６３６ｂｐとして定義され、用いられたｍＣｈｅｒｒｙ配列は、Ｋｅｐｐｌｅｒ－Ｒｏｓｓ、Ｎｏｆｆｚ、およびＤｅａｎからであり（１００）、約１ｋｂの相同領域が用いられた。Ｓｔｅ２およびＳｓｔ２を、そのＯＲＦに隣接する配列と同一の１８０ｂｐの隣接相同領域をそれぞれが有するＴｒｐ１およびＨｙｇＢ選択マーカーをそれぞれ、用いて、欠失のためにターゲットした。選択マーカーＬＥＵ２および８００ｂｐ相同領域を含有するプラスミドｐＢＳ６００を用いて、Ｇｐａ１の５個のＣ末端アミノ酸（ＫＩＧＩＩ）を、示されたヒトＧαタンパク質由来のＣ末端アミノ酸を含有するＧｐａ１－Ｇαキメラと置き換えた。Ｃ．アルビカンス（C. albicans）Ａｄｈターミネーターを、ｐＦＵＳ１－ｍＣｈｅｒｒｙおよびＧｐａ１－Ｇα遺伝子ノックインに用いた。ｍＣｈｅｒｒｙを構成的に発現する株を作製するために、組込みプラスミドｐＪＷ６０９を、ＫａｎＭＸマーカーをＣ．グラブラタ（C. glabrata）由来のＨＩＳ３と置き換えるように改変し、ｐＴＤＨ３ ｍＣｈｅｒｒｙを、ＰｓｐＯＭＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した。直線化されたＨＩＳ３－ｐＴＤＨ３ ｍＣｈｅｒｒｙカセットを、ＣＢ００８株へ形質転換し、組込みを、ＳＣ－ＨＩＳ上にプレーティングすることにより選択した。ＫａｎＭＸ選択マーカーを含有し、かつＧＦＰを構成的に発現する株を作製するために、組込みプラスミドを、ＭｏＣｌｏ酵母ツールキットを用いて構築した（１０１）。生じたプラスミド、ｐＢＳ２１１は、ｐＴＤＨ３の下流にＨＯ遺伝子座相同領域、ＫａｎＭＸマーカー、および酵母コドン最適化ｓｆＧＦＰ遺伝子を含有した（１０２）。直線化ＫａｎＭＸ－ｐＴＤＨ３ ｓｆＧＦＰカセットを、表１における株へ形質転換し、組込みを、ＹＰＤ－Ｇ４１８硫酸塩（２００μｇ／ｍＬ）上にプレーティングすることにより選択した。全ての株を、ＰＣＲおよびフローサイトメトリーにより確認した。

顕微鏡観察。ＧＦＰでＣ末端にタグ付けされた、内因性酵母ＧＰＣＲ Ｓｔｅ２またはヒトＰ２Ｙ２（ＡＴＵＭから得られた）の酵母コドン最適化配列を発現する酵母株ＢＳ０１６を、ＳＤ－ＵＲＡ培地中で対数期まで増殖した。Ｓｔｅ２発現のための内因性Ｓｔｅ２プロモーターまたはＰ２Ｙ２発現のためのｐＴＤＨ３を含有するセントロメアプラスミドｐＲＳ３１６を用い、用いられるＧＦＰ配列は、（１０３）からである。制限酵素部位は、最終のＧＰＣＲ残基と最初のＧＦＰ残基との間にアミノ酸リンカー（ＧＧＥＲＧＳ）を導入した。コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理され、その後、１ｍＬ ＳＤ－ＵＲＡ培地で覆われているガラスボトムディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）上に細胞をプレーティングした。細胞を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡を用いて画像化した。

ＡＴＰおよびＵＴＰに対する応答のフローサイトメトリー評価。ｐＲＳ３１６ ｐＴＤＨ３ベクターにおけるヒトＰ２Ｙ２遺伝子で形質転換された酵母株ＢＳ０１６を、ＳＣ－ＵＲＡ液体培地中で一晩、増殖した。Ｐ２Ｙ２配列を含有しないプラスミドで形質転換された同じ株（Ｖｅｃｔｏｒ）を陰性対照として用いた。細胞を、ＡＴＰ（０～２５．６ｍＭ；ｐＨ７．０、Ｂｉｏ Ｂａｓｉｃ）またはＵＴＰ（０～３．２ｍＭ；ｐＨ７．０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する６００μＬ ＳＣ－ＵＲＡ中にＯＤ_６００ ０．０５へ希釈し、３０℃で６時間、インキュベートした。その後、細胞を、１０μｇ／ｍＬの最終濃度でのシクロヘキシミドで処理した。少なくとも１０，０００個の細胞のｍＣｈｅｒｒｙシグナルを、各試料についてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＭＡＣＳＱｕａｎｔ ＶＹＢを用いて測定した。平均ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を、ＦｌｏｗＪｏを用いて決定した。用量反応アッセイについて、データを、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）における「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答 － 複合法面（４つのパラメータ）」モデルにフィッティングした。Ｖｅｃｔｏｒ対照のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナルを引き算した後、異なる日に実施された実験間の比較を可能にするために、蛍光値を同じ実験に用いられた野生型Ｐ２Ｙ２対照に対して標準化した。

ヒトＰ２Ｙ２受容体の指向性進化。前に記載された方法（１０４）を用いて、鋳型として酵母コドン最適化ヒトＰ２Ｙ２を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩランダム変異誘発キットを使用して、エラーの多いＰＣＲ変異誘発を実施した。１５０ｎｇの鋳型ＤＮＡおよび３０サイクルにより、Ｐ２Ｙ２遺伝子あたり約３つの変異の所望の変異率が達成され、１２個のランダムに選択されたプラスミドをシーケンシングにより決定した（表２）。ＡａｒＩに基づいたクローニングを用いて、ランダム変異体をｐＲＳ３１６ ｐＴＤＨ３へ挿入し、ＮＥＢ ５－αコンピテント大腸菌（E. coli）細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）へ形質転換して、＞１５，０００個の個々のコロニーが生じた。細胞を寒天プレートから掻爬し、一緒に混合し、プラスミドＤＮＡを抽出して（ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、最終のプラスミドライブラリを作製した。高効率酢酸リチウムに基づいた方法（１０５）を用いて、そのライブラリを酵母株ＢＳ０１６へ形質転換し、各変異体を複数回、スクリーニングするため、総ライブラリサイズとしてコロニーのその数の少なくとも１０倍を生じさせた。形質転換細胞を、一晩、インキュベートし、その後、１００μＭ ＡＴＰ（ｐＨ７．０、Ｂｉｏｂａｓｉｃ）を含有する新鮮な１００ｍＬ ＳＣ－ＵＲＡ液体培地中へＯＤ_６００ ０．０５に希釈し、３０℃において１８時間か６時間のいずれかの間、インキュベートした（図８）。短時間の超音波処理後、１０^６～１０^７個の細胞を、側方散乱光および前方散乱光によりゲーティングし、ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ細胞ソーターを用いて、最も高い約１％のｍＣｈｅｒｒｙシグナルについてソーティングした（１０６）。様々なソーティング実験から回収された合計１７４個の酵母コロニーを、６時間のインキュベーション後、１００μＭ ＵＴＰ、１００μＭ ＡＴＰに対する、またはリガンドなしでのそれらの応答について、個々にスクリーニングした。プラスミドを、選択されたコロニーから、最初にｚｙｍｏｌａｓｅ（ＢｉｏＳｈｏｐ Ｃａｎａｄａ）とインキュベートし、その後、プラスミドＤＮＡを抽出する（ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）ことにより、単離した。プラスミドＤＮＡを、ＮＥＢ ５－αコンピテント大腸菌（E. coli）細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて増幅し、プラスミドＤＮＡをシーケンシングし、新鮮なＢＳ０１６酵母細胞に、用量反応実験のために形質転換した。

Ｐ２Ｙ２の相同性モデリング。モデリングを、鋳型としてヌクレオチドアンタゴニストＭＲＳ２５００と結合したヒトＰ２Ｙ１受容体（４ＸＮＷ．ｐｄｂ）の結晶構造を用いる、Ｒａｆｅｈｉ、Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｂａｑｉ、Ｍａｌｉｋ、Ｗｉｅｓｅ、Ｎａｍａｓｉｖａｙａｍ、およびＭｕｌｌｅｒ（１０７）に記載されているように行った。ヒトＰ２Ｙ１およびＰ２Ｙ２の配列を、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを用いてアラインメントした。Ｐ２Ｙ１の残基Ｓ３８～Ｆ３３１だけが、結晶構造において目に見ることができたため、これらを鋳型として用いて、対応するＰ２Ｙ２残基Ｌ２０～Ｌ３１３の５００個のモデルを作製した。標準ＭＯＤＥＬＬＥＲ ９．１８設定を用いて、モデルにおけるＭＲＳ２５００を維持した（１０８）。作製されたモデルを、まず、ＤＯＰＥおよびＧＡ３４１スコアに基づいて分析し、上位５個のモデルを、手作業で、検査して、天然のジスルフィド結合（Ｃ２５－Ｃ２７８、Ｃ１０６－Ｃ１８３）が維持されたことを確認した。次に、モデルを、ＰｒｏＳＡ－ＷＥＢ（１０９）およびラマチャンドランプロット（１１０）により評価し、最終モデルを選択した。Ｇａｌａｘｙ７ＴＭウェブサーバーを用いて、ＡＴＰを野生型Ｐ２Ｙ２相同性モデルへドッキングさせ（１１１）、１０個のドッキングモデルが生じた。ＡＴＰのアデニン環が重要なＹ１１４およびＦ２６１残基の方向を向いている最も低いエネルギーモデルを選択した（１０７）。印刷並みの品質画像を、ＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いて作成した。

ＣＲＩＳＰＲでのＰ２Ｙ２変異体の組込み。Ｃａｓ９および酵母最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現するｐＣＡＳプラスミドをＡｄｄＧｅｎｅから入手した（１１２）。そのｇＲＮＡ配列を、ＡａｒＩに基づいたマルチクローニング部位と置き換えて、ｐＣＡＳ ＡａｒＩプラスミドを作製した（図１１）。これは、ＩＩＳ型制限酵素であるＡａｒＩの使用を可能にし、必要とされる核移行シグナルもｇＲＮＡの３’テールも改変することなしに任意のｇＲＮＡ配列（２０ｂｐ）を挿入することができる。ｇＲＮＡ配列を、ＣＲＩＳＰＲ ＭｕｌｔｉＴａｒｇｅｔｅｒ（１１３）およびＯｆｆ－Ｓｐｏｔｔｅｒウェブサーバー（１１４）を用いて設計した。

ＡａｒＩ酵素での消化後、プラスミドｐＣＡＳ ＡａｒＩへのライゲーションを促進するために、フォワードオリゴをＣＴＴＴ ５’オーバーハングと順序付け、リバースオリゴをＡＡＡＣ ５’オーバーハングと順序付けた。

ｐＴＤＨ３プロモーターの下流に操作されたＰ２Ｙ２変異体を含有する遺伝子カセットを、プラスミドｐＢＳ６００にアセンブルして、ＳＳＴ２遺伝子座についての８００ｂｐ相同アームに隣接させた。そのカセットを、ＰＣＲにより増幅し、ＢＳ０２１株へプラスミドｐＣＡＳ ＡａｒＩ ＨｙｇＢ １１４３と共に、Ｒｙａｎ、Ｓｋｅｒｋｅｒ、Ｍａｕｒｅｒ、Ｌｉ、Ｔｓａｉ、Ｐｏｄｄａｒ、Ｌｅｅ、ＤｅＬｏａｃｈｅ、Ｄｕｅｂｅｒ、Ａｒｋｉｎ、およびＣａｔｅ（１１２）に記載されているように形質転換した。コロニーを、ＡＴＰに応答してのｍＣｈｅｒｒｙ発現についてスクリーニングし、Ｐ２Ｙ２組込みを、シーケンシングにより確認した。

アピラーゼゲノムマイニング。ジャガイモ種（S. tuberosum）から単離されたアピラーゼ（ＲＲＯＰ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＵ５８５９７．１）は、報告された最も高いＡＴＰアーゼ活性を有する（１１５）。ＲＲＯＰ１を最初のインプット配列として用いる、相同遺伝子のゲノムマイニングにＢｌａｓｔＰｈｙＭｅツールが使用された（１１６）。野生ヒトツブコムギ（Triticum urartu）由来のアピラーゼ（本発明者らの研究において「ＴＵＡＰ１」と名付けられた；ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＫＤ０３９１５６．１）は、それがアピラーゼ機能に必要とされることが知られたドメインを保存していること（１１５）から、およびコムギアピラーゼ活性の以前の報告（１１７）に基づいて、選択された。酵母コドン最適化ＲＲＯＰ１およびＴＵＡＰ１を、Ｎ末端α因子シグナルペプチド（Ｓｔｅ１３切断部位を欠く、酵母ＭＦα１遺伝子の最初の８５アミノ酸）およびＣ末端ＨＡタグ（ＡＴＵＭによる遺伝子合成）を含有するように改変した。

Ｐ２Ｙ２株のゲノムへのアピラーゼ遺伝子の組込み。ｐＦＵＳ１プロモーターの下流にアピラーゼ遺伝子の１つを含有する遺伝子カセットを、プラスミドｐＢＳ６００にアセンブルした。そのカセットを、ＰＣＲにより増幅し、Ｐ２Ｙ２がすでに組み込まれている株へ、プラスミドｐＣＡＳ ＡａｒＩ ｍＣｈｅｒｒｙ ｇ６６４と共に、Ｒｙａｎ、Ｓｋｅｒｋｅｒ、Ｍａｕｒｅｒ、Ｌｉ、Ｔｓａｉ、Ｐｏｄｄａｒ、Ｌｅｅ、ＤｅＬｏａｃｈｅ、Ｄｕｅｂｅｒ、Ａｒｋｉｎ、およびＣａｔｅ（１１２）に概略が示されているように、形質転換した。ｍＣｈｅｒｒｙは、すでに、ｐＦＵＳ１およびＣ．アルビカンス（C. albicans）Ａｄｈターミネーターと共にＭＦＡ２遺伝子座に挿入されているため、カセットのプロモーターおよびターミネーターは相同アームとして機能した。コロニーを、ＡＴＰに応答してのｍＣｈｅｒｒｙ発現についてスクリーニングし、アピラーゼ組込みを、ｍＣｈｅｒｒｙを発現していないコロニーをシーケンシングすることにより確認した。ｐＴＤＨ３プロモーターの下流のアピラーゼ遺伝子の１つを有する第２の群の遺伝子カセットを、プラスミドｐＢＳ６０３（ＨＩＳ３選択マーカーを含有するｐＢＳ６００）を用いて、アセンブルし、ＭＦＡ２遺伝子座についての１ｋｂ相同アームに隣接させた。選択培地上にプレーティングする前に、そのカセットをＰＣＲにより増幅し、ＣＢ００８株へ形質転換して、ＢＳ０２９株（ｐＴＤＨ３ ＲＲＯＰ１）およびＢＳ０３０株（ｐＴＤＨ３ ＴＵＡＰ１）を作製した。

ウェスタンブロット。一晩培養物を、５０ｍＬ ＹＰＤ中にＯＤ_６００ ０．０５に希釈した。ＡＴＰを４００μＭまで加えて、最初の培地においてアピラーゼ発現を誘導し、再び、６時間目および２２時間目において、誘導した（ＡＴＰが分解されないと仮定すれば、１２００μＭの最終濃度）。全ての培養物を、振盪（２２５ｒｐｍ）させながら、３０℃で２４時間、インキュベートした。溶解された細胞の試料を、１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で分離させ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏを用いてＰＶＤＦ膜へ転写した。膜を、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキングバッファー（ＴＢＳ）（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で一晩、ブロッキングした。以下の一次抗体を用いた：ウサギ抗ＨＡタグ（Ｃ２９Ｆ４、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マウス抗ＰＧＫ（４５９２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。洗浄後、以下の二次抗体を用いた：ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＬＴヤギ抗マウスＩｇＧ（９２６－６８０２０、ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（９２６－３２２１１、ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。バンドを、Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ 赤外画像化システム（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で可視化した。

ＡＴＰでのアピラーゼ分泌の誘導。Ｐ２Ｙ２変異体遺伝子およびＲＲＯＰ１アピラーゼの発現を制御するｐＦＵＳ１を含有する酵母株を、ＹＰＤ培地中で一晩、インキュベートした。細胞を、２ｍＬの新鮮なＹＰＤ中にＯＤ_６００ ０．０５に希釈し、０～５００μＭ ＡＴＰ（ｐＨ７．０）を加えた。ＯＤ_６００ ３．５へ振盪（２２５ｒｐｍ）させながらの３０℃で１６時間のインキュベーション後、５００μＬ試料を、１．５ｍＬ チューブへピペッティングし、２０００ｘｇで５分間、遠心分離して、細胞をペレット化した。その後、培養上清を、ＡＴＰアーゼ活性について評価した。

分泌されたＡＴＰアーゼ活性の定量化。アピラーゼとのインキュベーション後に残存するＡＴＰの量を、前に記載されているように（１１８）、ＫｉｎａｓｅＧｌｏ Ｐｌｕｓルミネセンスにより決定した。白色９６ウェルマイクロプレート（＃６５５０７５、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）において、ＡＴＰが培養の開始時点に加えられている、ＯＤ_６００ ３．５における酵母培養物からの５μＬ粗上清を、アッセイバッファー（６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．０、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）中の５０μＭ ＡＴＰ（ｐＨ７．０）と５０μＬの最終体積で混合した。反応を、３０℃で３０分間、インキュベートし、５０μＬ ＫｉｎａｓｅＧｌｏ Ｐｌｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加によりクエンチした。ルミネセンスを、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。ＡＴＰアーゼ活性を、同じ条件下でＡＴＰとインキュベートされた市販のジャガイモアピラーゼ（Ａ６４１０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の活性と比較した。「分解されたパーセントＡＴＰ」を、同じ条件下でＹＰＤ培地およびアッセイバッファー中でインキュベートされた５０μＭ ＡＴＰと比較することにより計算した。

インビボ試験のための酵母培養物。酵母株を５５０ｍＬまたは１Ｌ ＹＰＤ培地（ＢｉｏＳｈｏｐ Ｃａｎａｄａ）中で振盪（２２５ｒｐｍ）させながら３０℃で培養した。ＫａｎＭＸ抵抗性マーカーを含有する株を培養した場合、２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８硫酸塩抗生物質（ＢｉｏＳｈｏｐ Ｃａｎａｄａ）を培地に加えた。２４時間後、培養物を遠心分離し、酵母を、新鮮なＹＰＤ中に９２のＯＤ_６００またはおよそ２×１０^９ｃｆｕ／ｍＬまで再懸濁し、コロニー密度を、プレーティングにより確認した。酵母を８００μＬアリコートとして－８０℃で最長１年間、保存した。

マウス。週齢８～１０週間のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌（ＤＳＳモデルについて）または雄（ＴＮＢＳモデルについて）マウスを、本研究を通して用いた。マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。全ての実験を、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＨａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌにおける動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）（ＩＡＣＵＣ）により規定されたガイドラインに従って行った。

デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性マウス大腸炎モデル。ＩＢＤを、飲料水に４％のデキストラン硫酸ナトリウム塩を加えることにより誘導した（ＤＳＳ大腸炎グレード；ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）。処理を、７日間、維持し、間に処理を含まない１週間を以て、２サイクル、実施した。ＤＳＳの２番目のサイクル後、ＤＳＳを除去し、マウスを屠殺した。動物の体重を、本研究を通して毎日、評価した。

トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）誘導性マウス大腸炎モデル。Ｃ５７ＢＬ／６ＪにおいてＴＮＢＳ大腸炎を誘導するために、雄を、１５０μＬの前感作ＴＮＢＳ溶液（６４％ アセトン（＃１７９１２４、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１６％ オリーブ油（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｏ１５１４）、２０％の５０ｍｇ／ｍＬ ＴＮＢＳ（ピクリルスルホン酸溶液５％ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｐ２２９７））をそれらの剪毛前の背中に塗布することにより、大腸炎誘導の１週間前に、前感作した。１週間後、前感作されたマウスを、４時間、絶食させ、その後、１００μＬのＴＮＢＳ誘導溶液（５０％ エタノール、５０％の５０ｍｇ／ｍＬ ＴＮＢＳ）を直腸に投与した。対照群を、５０％ エタノールのみで処理した。マウス体重を、疾患のピークにおける大腸炎誘導から７２時間後の安楽死の日まで、毎日、モニターした。

酵母でのマウス処置：ＤＳＳマウスとＴＮＢＳマウスの両方に２×１０^８ｃｆｕの対応する酵母株を、ＤＳＳマウスについては実験の全期間の間を意味する０日目から、およびＴＮＢＳマウスについては前感作の日から、強制経口投与により与えた。糞便研究からの酵母培養について、マウスに１回、強制経口投与した。ｍＣｈｅｒｒｙおよびＡＴＰ測定研究について、本研究前の３日間、マウスに２×１０^８ｃｆｕの対応する酵母を強制経口投与した。

マウス糞便からの酵母培養：抗生物質Ｇ４１８に対する抵抗性遺伝子を発現するＣＢ００８、ＢＳ０２９、およびＡＰＴＭ－３酵母を、上記のように強制経口投与により投与した。糞便を、強制経口投与から２時間後、４時間後、および６時間後、収集し、重量を測定し、ＰＢＳ中にホモジナイズし、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８（カタログ番号＃Ａ１７２０ － Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＹＰＤ寒天（カタログ番号＃Ｙ１５００ － Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中、３０℃で培養した。コロニー形成単位（ＣＦＵ）を、７２時間後、定量化した。

糞便内容物におけるＡＴＰ測定：糞便内容物におけるＡＴＰ量を評価するために、対応する酵母株で処置されたＴＮＢＳマウスの十二指腸、空腸、回腸、盲腸、および大腸からの糞便を、ＴＮＢＳ誘導から７２時間後、酵母の最後の強制経口投与から２時間後、収集した。腸の対応する部分の糞便内容物を、ＰＢＳ中にホモジナイズし、ＡＴＰ測定を、ＡＴＰ決定キット（＃Ａ２２０６６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、製造会社の使用説明書に従って実施した。データを、糞便内容物の重量および対照試料に対して標準化した。

インビボでのｍＣｈｅｒｒｙレポーター酵母株検出
本発明者らの操作されたＰ２Ｙ２変異体のＡＴＰに対する応答をインビボで確認するために、最も効率的なＰ２Ｙ２変異体（上記参照）の調節下でのｍＣｈｅｒｒｙおよび構成的ＧＦＰを発現するレポーター酵母を、より多くのＡＴＰが腸に存在すると予想する疾患のピーク時点においてＴＮＢＳ大腸炎マウスへ上記のように投与した。腸の特定区域からの内容物を、強制経口投与から２時間後、収集し、ＹＰＤ培地（＃Ｙ１３７５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中にホモジナイズし、一晩、培養した。ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現を、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるフローサイトメトリーにより測定し、そのデータ分析を、ＦｌｏｗＪｏ １０．６．１．ソフトウェアを用いて実施した。

１６Ｓマイクロバイオームのシーケンシングおよび分析：糞便試料を、各それぞれの酵母処置からの対照マウスおよびＴＮＢＳ大腸炎マウスから本研究の終了時点に収集した。ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ ＰｏｗｅｒＬｙｚｅｒ ＰｏｗｅｒＳｏｉｌキット（＃１２８５５、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造会社の使用説明書に従って抽出した。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子Ｖ４領域を増幅し、ＨｏｔＭａｓｔｅｒ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＨｏｔｍａｓｔｅｒｍｉｘ（＃１０８４７－７０８、ＶＷＲ）ならびにＭｉＳｅｑシーケンシングのためのアダプターおよびＰＣＲ産物をプールすることができるように二重インデックスバーコードを含有するプライマーライブラリを用いるＰＣＲによりバーコード化した。その後、ＤＮＡを、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）ｄｓＤＮＡアッセイキット（＃Ｐ１１４９６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量化し、１００ｎｇの各試料をプールし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（＃２８１０４、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、クリーンアップした。クリーンアップ後、ＤＮＡを、Ｑｕｂｉｔ蛍光定量的定量化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により再定量化し、（１１９）に記載されているように、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ＦａｃｉｌｉｔｙにおけるＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置におけるペアエンドの１５１塩基対リードのシーケンシングに供した。標準プロトコール（１２０）（詳細はこちら？Ｌａｕｒｉｅ？：ｑ２０より下のリードを切り取り、最初の長さの７５％パーセントより短いリードを捨てることにより、品質配列を、フィルタリングした）後、αおよびβ多様性についての品質フィルタリングおよび下流分析、ならびに組成分析のために、微生物生態学ソフトウェア２（ＱＩＩＭＥ２）についての定量的洞察を用いた。操作的分類単位（Operational Taxonomic Units）（ＯＴＵｓ）を取得して、分類を割り当てた。試料間の距離（β－多様性）を、系統学に基づいた距離ＵｎｉＦｒａｃを用いて計算した（１２１）。ＰＣｏＡプロットにおける試料の示差的クラスタリングについての統計的検定を、９９９個の順列を用いるＰｅｒｍａｎｏｖａ検定を用いて実施した。対照または活性酵母処置により調節された分類群における有意差を、線形識別分析効果サイズ（linear discriminant analysis effect size）（ＬＥｆＳｅ）により決定した（１２２）。

ＥＬＩＳＡによるサイトカイン定量化。遠位大腸の２ｃｍを抽出し、十分に洗浄し、１０％のＦＢＳ、１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌのペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン、および５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを追加したＲＰＭＩ中で培養した。後でのＥＬＩＳＡ分析のために上清を収集した。ＥＬＩＳＡを、製造会社（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の使用説明書に従って実施した。

大腸炎の組織学的評価。大腸組織を取り出し、Ｂｏｕｉｎ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）固定により盲検的に組織学的評価について評価した。パラフィン包埋組織を薄片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、大腸炎の証拠について調べた。組織学スコア（範囲：０～６）を、前に記載されているように（Erben et al int J Clin Exp Pathol 2014）、リンパ単核細胞浸潤物の存在（「０」：炎症性病巣の欠如；「１」：粘膜における炎症性病巣の軽度の存在；「２」：粘膜および粘膜下層における多数の炎症性病巣の存在；「３」：経壁浸潤の証拠）および腸構造破壊（「０」：正常な構造；「１」：限局的びらんの存在；「２」：びらんおよび限局的潰瘍；「３」：拡大した潰瘍、組織の肉芽形成、および／または偽ポリープ）に基づいて計算した。

フローサイトメトリー染色および獲得。細胞懸濁液を、腸間膜リンパ節から調製した。フローサイトメトリーのための抗体を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入し、製造会社により他に推奨がない限り、１：２００の濃度で用いた。その後、細胞をＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、それぞれ）において分析した。Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＦＮ－γ－ＩＬ－１７－ＩＬ－１０－ＦＯＸＰ３＋として定義された。

ＲＮＡ抽出およびｑＰＣＲ。２０ｍｇの遠位大腸を、急速凍結し、その後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で破壊した。ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）についての製造会社の使用説明書に従って抽出した。必要とされる場合、ＲＮＡからＤＳＳを除去するために、Ｏｌｉｇｏｔｅｘキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて前記ｍＲＮＡをさらに精製した。ｃＤＮＡを、高性能ＲＴキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて調製し、ｑＰＣＲに用いた。結果を、Ｇａｐｄｈに対して標準化した。全てのプライマーおよびプローブをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。Ｇａｐｄｈ Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇｌ、Ｉｌ１７ａ Ｍｍ００４３９６１８＿ｍ１、Ｉｆｎｇ Ｍｍ００８０１７７８＿ｍ１、Ｆｏｘｐ３ Ｍｍ００４７５１６２＿ｍ１、Ｃｃｌ２ Ｍｍ００４４１２４２＿ｍ１、Ｎｏｓ２ Ｍｍ００４４０５０２＿ｍ１、Ｉｌ１ｂ Ｍｍ００４３４２２８＿ｍ１。

Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇによる遺伝子発現分析。大腸組織由来の１００ｎｇの全ＲＮＡを、ｎＣｏｕｎｔｅｒマウス免疫学パネル発現コードセットを用いて、製造会社（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用説明書に従って分析した。データを、ｎＳｏｌｖｅｒ分析ソフトウェアを用いて分析し、Ｈｅａｔｍａｐｐｅｒでプロットした（１２３）。機能的経路濃縮分析を、Ｅｎｒｉｃｈｒを用いて行った。組み合わされたスコアは、ｃ＝ｌｎ（ｐ）＊ｚで計算され、式中、ｐはフィッシャーの正確検定を用いて算定されたｐ値であり、ｚは、ランクスコア、または予想ランクからの偏差についてのｚスコアが算出される、フィッシャーの正確検定の改変を用いて算出されたｚスコアである（１２４）。

ＲＮＡシーケンシングによる遺伝子発現分析：大腸組織由来の５ｎｇの全ＲＮＡを、Ｂｒｏａｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＬａｂｓおよびＢｒｏａｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＰｌａｔｆｏｒｍによるＳＭＡＲＴｓｅｑシーケンシングに送った。処理されたＲＮＡ－Ｓｅｑデータをフィルタリングし、低いリードカウント数を有する遺伝子を除去した。リードカウント数を、ＴＭＭ標準化を用いて標準化し、ＣＰＭ（百万個あたりのカウント数）を計算して、標準化発現値のマトリックスを作成した。各ＲＮＡ－Ｓｅｑデータ試料のｆａｓｔｑファイルを、Ｋａｌｌｉｓｔｏ（ｖ０．４６．１）を用いて、ハツカネズミ（Mus musculus）ＧＲＣｍ３８トランスクリプトームに対してアラインメントし、その同じソフトウェアを用いて、アラインメント結果を定量化した。発現差異分析を、ＤＥＳｅｑ２を用いて行い、下流分析のためにｌｏｇ２倍数変化を、ａｐｅＧＬＭを用いて調整した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ方法を、多重仮定検定補正のために用いた。ＧＳＥＡ分析を、ａｐｅＧＬＭにより調整された発現差異分析結果を用いて実施した。調整されたｐ値＜０．０５で示差的に発現した遺伝子を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）経路分析（ＩＰＡ）ツールで分析して、有意に制御された経路を決定した。

[実施例１]
ヒトＰ２Ｙ２受容体の指向性進化
Ｐ２Ｙ２受容体は、ｅＡＴＰ、およびまた細胞外ウリジン三リン酸（ｅＵＴＰ）を感知するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である（２９）。まず、ヒトＰ２Ｙ２受容体を、酵母で発現した時、ｅＡＴＰに対するそれの感受性を増加させるように操作した。指向性進化を受け入れられるプラットフォームを確立するために、ヒトＰ２Ｙ２受容体を酵母接合経路と、キメラ酵母Ｇｐａ１－ヒトＧα_ｉ３タンパク質を介して共役させ、接合応答性ＦＵＳ１プロモーター（ｐＦＵＳ１）により調節される蛍光ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを用いて経路活性化をモニターした（図１Ａ、Ｂ、表１、および図７Ａ～Ｂ）。ヒトＰ２Ｙ２を構成的に発現するプラスミドで形質転換されたＧｐａ１－Ｇα_ｉ３ ｐＦＵＳ１－ｍＣｈｅｒｒｙ株は、それのアゴニストｅＡＴＰおよびｅＵＴＰに対して用量依存性応答を示し、それぞれ、３．２７μＭおよび２．０９μＭのｌｏｇＥＣ５０を有した（図１Ｃ）。

炎症に関連した生理学的ｅＡＴＰレベルは、１００μＭ～高いｍＭの範囲で検出されている（３５）。しかしながら、野生型（ＷＴ）Ｐ２Ｙ２を発現する酵母は、フローサイトメトリーによるｍＣｈｅｒｒｙ発現の分析により決定した場合、１００μＭ ｅＡＴＰに対して弱い応答を示す（図１Ｃ）。したがって、指向性進化を適用して、ｅＡＴＰに対する感受性の増加を示す、酵母発現ヒトＰ２Ｙ２受容体変異体を作製した。この目的を達成するために、まず、エラーの多いＰＣＲを用いてヒトＰ２Ｙ２受容体変異体のプラスミドライブラリを作製し（表２）、１００μＭ ｅＡＴＰでの処理後、最も高い（上位１％）ｐＦＵＳ１駆動性ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を発現する酵母を蛍光活性化細胞ソート（ＦＡＣＳ）することにより単離した（図１Ｄ）。

複数反復ラウンドのＦＡＣＳに基づいた選択（３６）を実施して、ｅＡＴＰ感受性の所望の増加を示す変異体を単離した（図８）。最後に、ソーティング後のスクリーニングステップにおいて、選択された酵母コロニーを１００μＭ ｅＵＴＰ、１００μＭ ｅＡＴＰ、または媒体で処理することにより、操作されたヒトＰ２Ｙ２受容体変異体の機能をさらに評価した（図２Ａ）。複数ラウンドのＦＡＣＳ選択後に選択された１７４個の酵母コロニーのうち、１２８個のコロニーが、ＷＴヒトＰ２Ｙ２受容体を用いて検出された応答より強いｅＡＴＰに対する応答を示した；１６３個のコロニーは、ｅＵＴＰに対するより強い応答を示した。分析されたコロニーの大部分（しかし、全部ではない）について、ｅＡＴＰに対する応答の増加は、ｅＵＴＰに対する応答の増加と同時であった。

本発明者らは、ｍＣｈｅｒｒｙの構成的発現なしと同時に、ｅＡＴＰに対する応答の増強、および高いｅＡＴＰ／ｅＵＴＰ応答比を示したヒトＰ２Ｙ２受容体変異体に焦点を当てた。これらのヒトＰ２Ｙ２受容体変異体のシーケンシングにより、最高３つまでの非同義変異を有する様々な遺伝子型が明らかにされた（表３）。１９個のヒトＰ２Ｙ２変異体のうちの８個は、最初の数が膜貫通ヘリックス、その後、ファミリーＡ ＧＰＣＲ全体にわたって保存された位置が続くＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ－Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ変換により定義された場合（３７）の部位Ｆ５８^１．５７において変異を有した。また、すぐ近くの残基Ｌ５９^１．５８およびＣ６０^１．５９に、ならびにＱ１６５^４．５７およびＦ３０７^７．５４に、変異を検出した。

詳細な特徴づけのために１０個のＰ２Ｙ２変異体を選択し、各変異体に、変異残基の位置に基づいて固有の識別子を用いて名前を付けた（表４）。用量反応研究において、操作されたＰ２Ｙ２受容体は、ｅＡＴＰとｅＵＴＰの両方に対してより応答性が高かった（図２Ｂ）。ＷＴヒトＰ２Ｙ２受容体と比較した場合、選択された変異体は、ｅＡＴＰ ＥＣ５０において１０分の１～１０００分の１、最大接合経路応答において最大１．８倍を示した。この感受性の増加はまた、Ｑ１６５Ｈ^４．５７変異を有する株（ＴＭ－１、ＴＭ－４）（最大接合経路応答は、ｅＵＴＰに対してより、ｅＡＴＰに対して１．４～２倍であった）を除いて、ｅＵＴＰ刺激への応答においても検出された。したがって、指向性進化の適用は、ｅＡＴＰに対する応答性の増加を有するヒトＰ２Ｙ２受容体変異体の生成を生じた。

Ｐ２Ｙ２配列あたり約３つの変異（約２．９変異／ｋｂ）の所望の変異率に基づいて、酵母形質転換およびＦＡＣＳのために、「ライブラリ５」が選択された。

ＡＴＰに対するＷＴ応答／感受性を一貫して向上させた固有の変異体のみを詳細な特徴づけのために選択した。

最大応答値は、ｅＡＴＰとインキュベートされたＷＴヒトＰ２Ｙ２受容体により与えられた最大接合経路活性化に対して標準化された。ダイナミックレンジは、１０％シグナル飽和に対する、示されたリガンドの存在下で得られた最も高い蛍光の比率であった。線形範囲は、シグナルの変化が検出され得る一連のリガンド濃度であった。線形範囲の最小限度は、１０％シグナル飽和に対応するリガンド濃度として推定された。データは、ｅＡＴＰについて６つのコロニーの平均、ｅＵＴＰについて３つのコロニーの平均を表す。

[実施例２]
ｅＡＴＰに対する感受性の増加を有するヒトＰ２Ｙ２受容体変異体の特徴づけ
ヒトＰ２Ｙ２受容体のヌクレオチドの結合および活性化に関与する重要な残基は同定されているが（３８、３９）、本発明者らが分析した１０個のヒトＰ２Ｙ２受容体変異体において検出された変異は、以前同定された重要な残基を含んでいなかった。代わりに、本発明者らが同定した新規のヒトＰ２Ｙ２受容体変異体は、リガンド結合ポケットの周辺の残基（Ａ７６^２．４７、Ｎ１１６^３．３５、Ｃ１１９^３．３８、Ｌ１６２^４．５４、Ｑ１６５^４．５７）、または受容体の細胞内に面する側に位置する残基（Ｆ５８^１．５７、Ｌ５９^１．５８、Ｃ６０^１．５９、Ａ２２９^ＩＣＬ３、Ｋ２４０^６．３１、Ｆ３０７^７．５４、Ｇ３１０^Ｃ末端）を含んだ（図３Ａ）。

指向性進化により生成された、選択されたヒトＰ２Ｙ２受容体変異体の感受性の増加の原因である分子機構を決定するために、まず、Ｃ末端ＧＦＰでタグ付けされた受容体変異体を用いる顕微鏡観察およびフローサイトメトリーによりそれらの発現レベルを分析した。酵母におけるヒトＰ２Ｙ２受容体発現は、Ｆ５８^１．５７がより小さい疎水性残基へ変異した時（Ｃ／Ｉ／Ｌ、「Ｈ１」変異体）、ならびにまたＴＭ－１およびＴＭ－２変異体において増加した（図３Ｂ、Ｃ、および表３）。ヒトＧＰＣＲ配列における変異は、酵母における発現を向上させることが以前、示されているが（４０）、これらの以前記載された変異は、指向性進化により生成されたヒトＰ２Ｙ２受容体変異体において本発明者らが同定したものと相同な残基を含んでいなかった。ＧＰＣＲ発現の向上は、本発明者らの研究で報告されたＰ２Ｙ２ Ｃ１１９Ｓ^３．３８変異と類似しているヒトアデノシンＡ２Ａ受容体におけるＳ９０Ａ^３．３８変異（４１）など、安定性の増加に起因する場合が多い。他のＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス１における変異もまた、安定性を増加させるが（４２）、これらの変異は、膜内残基に見出されており、Ｆ５８^１．５７、Ｌ５９^１．５８、Ｃ６０^１．５９などの細胞内に面する残基には見出されていない。したがって、本発明者らの知見は、ヒトＰ２Ｙ２発現の制御および潜在的に安定性における、膜貫通ヘリックス１の細胞内に面する残基についての新規の役割を同定している。

本発明者らは、Ｎ１１６Ｓ^３．３５およびＦ３０７Ｓ^７．５４変異を有するＰ２Ｙ２変異体（ＴＭ－３、Ｈ７－１、Ｈ７－２変異体）におけるアゴニストの非存在下での応答性およびシグナル伝達の増加（構成的活性）を検出した（図２Ｂおよび３Ｄ）。興味深いことに、これらの変異体は、ＷＴ Ｐ２Ｙ２受容体と類似した発現レベルを示した。他のファミリーＡ ＧＰＣＲにおけるＮ^３．３５残基での変異は、ＴＭ２およびＴＭ７残基との水素結合ネットワークを破壊し、かつ構成的活性を与えると報告されている（４３）。本明細書に記載された操作されたヒトＰ２Ｙ２受容体において、Ｎ１１６Ｓ変異は、Ｄ７９^２．５０およびＮ２９８^７．４５との類似したネットワークを破壊する可能性が高く、これらのヘリックス間相互作用の安定化の欠如は、アゴニストの非存在下でのシグナル伝達の増加をもたらす。

Ｆ^７．５４残基は、Ｇタンパク質活性化に必要とされる高度に保存されたＤ／ＮＰｘｘＹ（配列番号１８）モチーフのすぐ後に位置する（４４）。実際、Ｐ２Ｙ１２受容体におけるＦ^７．５４での変異は、構成的活性を生じる（４５）。ヒトＰ２Ｙ２受容体は、ヘリックス８における保存されたＦ^８．５０残基を欠き、その残基は、他のＧＰＣＲにおいてＹ^７．５３と相互作用して、不活性な立体構造を安定化させる（４６）。ヒトＰ２Ｙ２受容体において、不活性状態におけるヘリックス８との保存された接触に加えて、Ｆ３０７^７．５４が、代わりにこのＹ^７．５３との相互作用を形成する（４７）。まとめると、本発明者らの知見は、Ｆ３０７Ｓ^７．５４変異が、Ｙ^７．５３の活性立体構造への回転を促進し、その結果として、構成的活性およびｅＡＴＰ感受性の増加を生じることを示唆している。

ヒトＰ２Ｙ２受容体変異体の示差的活性の原因である機構をさらに調べるために、ｅＡＴＰによるＰ２Ｙ２受容体活性化における、単独でまたは他の変異と組み合わせての各変異の効果を評価した。ある特定の変異（Ｃ６０Ｙ、Ｋ２４０Ｎ、Ｇ３１０Ａ）は、ｅＡＴＰに対するＰ２Ｙ２受容体応答性をさらに増加させるようには協働しなかったが、他は、組み合わされた場合、有害な効果を示し（Ａ７６Ｔ／Ａ２２９Ｖ、Ｌ１６２Ｉ、Ｓ３５９Ｐ）、または正のエピスタシスを示した（Ｆ５８ＩまたはＦ３０７ＳとのＮ１１６Ｓ、Ｌ５９Ｉ／Ｃ１１９Ｓ）（図３Ｄ～Ｆ）。ＴＭ－１変異体配列における同義の変異は、ｅＡＴＰに対するＰ２Ｙ２受容体感受性を増加させ、それは、Ｆ５８Ｉ変異を組み入れることによりさらに増加させることができた（図３Ｇ）。ＡＴＰとドッキングされたヒトＰ２Ｙ２受容体相同モデルにおいて、Ｑ１６５^４．５７は、ＡＴＰのアデニン環の方向を向いている。これらの知見は、Ｑ１６５Ｈ変異が、下流シグナル伝達の増加を生じる、受容体のＡＴＰとの相互作用を助けることを示唆している。Ｑ１６５Ｈ変異のこれらの効果は、Ｆ５８Ｉまたは同義の変異により駆動されるヒトＰ２Ｙ２受容体の発現の増加によりさらに増幅される。

要約すれば、試験された変異の組合せのいずれも、最初のセットの１０個の選択されたヒトＰ２Ｙ２受容体変異体より優れておらず、炎症に関連したｅＡＴＰの生理学的濃度に対する感受性の様々な範囲の向上を与えた。Ｆ５８^１．５７、Ｎ１１６^３．３５、Ｆ３０７^７．５４、およびＱ１６５^４．５７における変異は、ヒトＰ２Ｙ２受容体のｅＡＴＰに対する感受性の増加に、受容体発現の増加（Ｆ５８^１．５７）、活性受容体立体構造の安定化（Ｎ１１６^３．３５およびＦ３０７^７．５４）、およびＡＴＰとの相互作用の向上（Ｑ１６５^４．５７）を含む非依存的な機構を介して、最も高く寄与した。その後、残基Ｆ５８^１．５７において、全ての２０個のアミノ酸を試験し、それによりｅＡＴＰ誘導性シグナル伝達表現型の多様性が明らかにされた（図３Ｈ）。まとめると、これらの知見は、ヒトＰ２Ｙ２受容体活性を調節する分子機構へ新しい光を投じると同時に、それらは、ＧＰＣＲの機能的特徴づけのために指向性進化を適用することの可能性を例証している。

[実施例３]
合成酵母における分泌されるＡＴＰアーゼ活性のｅＡＴＰ駆動型用量依存性誘導
次に、ｅＡＴＰに対して応答性の酵母合成遺伝子回路に治療的応答エレメントを組み入れた。本発明者らは、炎症促進性ｅＡＴＰを加水分解し、それの免疫抑制性アデノシンへの変換に関与するアピラーゼに焦点を当てた（２６）。ジャガイモ（Solanum tuberosum）におけるＲＲＯＰ１によってコードされるアピラーゼを選択した（図４Ａ）。このアピラーゼは、強力なＡＴＰアーゼ活性を有し、かつＩＢＤのマウスモデルにおいて腹腔内に送達された時、炎症を低下させる（４８）。アピラーゼはまた、コムギにおいて同定されており（４９）、したがって、アピラーゼ保存領域におけるＲＲＯＰ１とのそれの配列相同性に基づいて野生ヒトツブコムギ（Triticum urartu）（本明細書ではＴＵＡＰ１と呼ばれる）由来のアピラーゼを選択した（図４Ａ）。酵母による分泌を可能にするために、内因性アピラーゼＮ末端シグナルペプチドをＭＦα１シグナルペプチドにより置き換え、発現をモニターするためにＣ末端ＨＡタグを付加した（図４Ｂ）。

まず、強い構成的プロモーターの調節下の各改変型アピラーゼ遺伝子を酵母ゲノムへ組み入れた。タンパク質発現の分析は、複数のタンパク質バンドを検出し、アピラーゼが、酵母で発現した時、部分的に分解されることを示唆した（図４Ｃ）。しかしながら、市販のジャガイモアピラーゼは、１５ｋＤａおよび２５ｋＤａにおけるバンドを示し、酵母で発現したアピラーゼはグリコシル化され、その結果として、複数のタンパク質バンドを生じる（５０）。

ＲＲＯＰ１を発現する酵母（ＢＳ０２９）からの培養上清は、ＴＵＡＰ１発現酵母（ＢＳ０３０）のより高いＡＴＰアーゼ活性を示した（図４Ｄ）。市販のアピラーゼと比較した場合、ＲＲＯＰ１発現酵母からの培養上清は、約２８０ｐＭ市販アピラーゼ／μＬ粗上清と等価の相対的ＡＴＰアーゼ活性を示し、一方、ＴＵＡＰ１発現酵母のそれらは、＜６２．５ｐＭ市販アピラーゼ／μＬ粗上清と等価のＡＴＰアーゼ活性を示した（図９Ａ～Ｂ）。したがって、次の研究のための治療的応答エレメントとしてＲＲＯＰ１を選択した。

その後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づいたアプローチを用いて、感知エレメント（Ｐ２Ｙ２）および応答エレメント（ＲＲＯＰ１）を同じ酵母株のゲノムへ同時導入した。低いＥＣ５０、高いダイナミックレンジ、および高い最大活性化に基づいて、酵母ゲノムへの組込みのために６個のヒトＰ２Ｙ２受容体変異体を選択した。また、最終株が、ウラシル栄養要求性を保持すると同時に、抗生物質抵抗性遺伝子を含有しないことを保証する（操作された微生物の生物学的封じ込めおよび安全性のための重要な考慮）ために、酵母ゲノムからＨｙｇＢ選択マーカーを除去した。

Ｐ２Ｙ２－ＲＲＯＰ１遺伝子回路を含有する酵母株からの培養上清において、ｅＡＴＰは、ＡＴＰアーゼ酵素活性を用量依存性様式で誘導した（図４Ｅ、Ｆ）。さらに、ＡＴＰアーゼ活性は、ヒトＷＴ Ｐ２Ｙ２受容体を発現する株においてより、指向性進化により操作されたヒトＰ２Ｙ２受容体を発現する酵母株において高かった。例えば、１２５μＭ ＡＴＰにおいて、操作されたヒトＰ２Ｙ２受容体を有する酵母株においてＡＴＰアーゼ活性の２．２倍～４．７倍の増加を検出し、一方、調べられた最大ｅＡＴＰ濃度において、１．７倍～２．５倍の増加が検出された（表５）。

ＲＲＯＰ１を構成的に過剰発現する酵母株（ＢＳ０２９株）を用いて、分泌されるＡＴＰアーゼの理論上の最大値を推定した。５００μＭ ＡＴＰにおいて、操作されたヒトＰ２Ｙ２受容体変異体を有する株は、ＢＳ０２９構成的に分泌する株で検出されたＡＴＰアーゼ活性の４５％～６９％を示した；ヒトＷＴ Ｐ２Ｙ２受容体を有する酵母株は、たった２７％のＡＴＰアーゼ活性を示した。まとめると、これらの知見は、指向性進化と遺伝子回路操作の組合せを通して、本発明者らが、ｅＡＴＰの生理学的レベルに応答して機能性ＡＴＰアーゼを分泌する酵母株を作製したことを示している。

ＡＰ－Ｐ４株に対する倍数差として表されている。アピラーゼデータは、分解された％ＡＴＰ（ＡＴＰアーゼ活性）として測定され、データは図４からである。

[実施例４]
ｅＡＴＰ応答性合成酵母プロバイオティクスは腸炎症を軽快させる
その後、ＩＢＤのマウス実験モデルを用いて、操作された酵母プロバイオティクスの抗炎症活性を評価した。具体的には、アピラーゼをｅＡＴＰ依存性様式で発現する、ＡＰＴＭ－３操作された酵母株を試験した。この酵母株は、刺激されていない時、低レベルのアピラーゼを分泌すること、およびｅＡＴＰに対する応答性の増加が、既知の作用機構で、Ｐ２Ｙ２における単一変異（Ｎ１１６Ｓ^３．３５）と直接的に結びつけることができることから、この酵母株を選択した。さらに、ＡＰＴＭ－３がｅＡＴＰで刺激された時、検出されたＡＴＰアーゼ活性は、他の操作されたＰ２Ｙ２－ＲＲＯＰ１株において検出されたものより高く、または類似していた。

まず、マウス消化管における操作された酵母の生存率を評価した。この点に取り組むために、抗生物質抵抗性カセットをＣＢ００８、ＢＳ０２９、およびＡＰＴＭ－３操作された酵母株へ組み入れて、糞便培養物において容易に定量化することができる、カナマイシン抵抗性ＣＢ００８ ＫＧ、ＢＳ０２９ ＫＧ、およびＡＰＴＭ－３ ＫＧ株を作製した。強制経口投与による（２×１０^８ｃｆｕの）ＣＢ００８ ＫＧ、ＢＳ０２９ ＫＧ、またはＡＰＴＭ－３ ＫＧ酵母の投与から６時間後、糞便において生存可能な抗生物質抵抗性酵母を検出した（図１０Ａ）。

局所的ｅＡＴＰレベルの増加は、腸炎症に関連づけられる（２４、２５）（図１０Ｂ）。したがって、実験的大腸炎中の操作された酵母におけるＰ２Ｙ２シグナル伝達の活性化を分析するために、ｅＡＴＰによる変異体ＴＭ－３ Ｐ２Ｙ２受容体の活性化がｍＣｈｅｒｒｙ発現を誘導するＴＭ－３酵母株を用いた；対照として、ｍＣｈｅｒｒｙを構成的に発現するＢＳ０３５株を用いた（図１Ｃ）。これらの実験のために、また、ｅＡＴＰ駆動性ｍＣｈｅｒｒｙ発現とは関係なく、投与された酵母を検出するために、構成的ＧＦＰ発現を駆動させる追加のカセットを組み入れた。ＴＮＢＳマウスにおける局所的ｅＡＴＰレベルの増加と同時に、盲腸、近位および中位大腸におけるＴＭ－３操作された酵母のｍＣｈｅｒｒｙ発現を検出した（図５Ａ）。注目すべきことには、ｅＡＴＰレベルが局所的に増加しなかったナイーブマウスに投与されたＴＭ－３操作された酵母において、ｍＣｈｅｒｒｙ発現は誘導されなかった（図１０Ｃ）。逆に、ｍＣｈｅｒｒｙ発現は、ｅＡＴＰレベルに関わらず、ＢＳ０３５酵母株を受けたマウスの胃腸管を通じて検出された（図５Ａ）。さらに、インビボで、ＷＴまたは変異体ＴＭ－３ Ｐ２Ｙ２の調節下でのｍＣｈｅｒｒｙ発現を比較した場合、変異体ＴＭ－３ Ｐ２Ｙ２を発現する酵母においてより高いｍＣｈｅｒｒｙ発現を検出し、腸炎症に関連づけられるｅＡＴＰレベルの検出を可能にするＰ２Ｙ２インビトロ進化の重要性を浮かび上がらせている（図１０Ｄ）。まとめると、これらのデータは、操作された酵母が、消化管において生存可能であること、およびＴＭ－３ Ｐ２Ｙ２変異体が腸炎症に関連づけられるｅＡＴＰレベルに応答することを示している。

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスが前感作され、かつ７日後、大腸炎がＴＮＢＳの直腸注射により誘導されているＴＮＢＳ誘導性大腸炎の実験モデルにおいて、操作された酵母の治療効果を評価した。ｅＡＴＰによる変異体ＴＭ－３ Ｐ２Ｙ２の活性化後にアピラーゼが誘導される、ＡＰＴＭ－３操作された酵母株を、ＴＮＢＳでの局所的感作の当日から開始して、強制経口投与（２×１０^８ｃｆｕ）により毎日投与した；親ＣＢ００８酵母株、およびアピラーゼを構成的に発現する、ＢＳ０２９操作された酵母株を対照として用いた。ＡＰＴＭ－３投与は、体重減少、大腸短縮の評価、および腸病態の組織学的分析により示されているように、ＴＮＢＳ誘導性大腸炎を軽快させた（図５Ｂ～Ｅ）。

ＲＮＡ－Ｓｅｑによる大腸試料の分析は、アピラーゼ産生酵母株ＢＳ０２９およびＡＰＴＭ－３で処置されたマウスにおける炎症促進性遺伝子の発現の減少を検出した；これらの効果は、ＡＰＴＭ－３群においてより顕著であった（図５Ｆ）。実際、ＡＰＴＭ－３株での処置は、腸炎症に関連づけられる炎症促進性ＩＦＮｇおよびＩＬ－１７サイトカインの発現の低下と同時に、腸間膜リンパ節におけるＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇｓの上方制御をもたらしたが、ＢＳ０２９での処置はそのような上方制御をもたらさなかった（５１、５２）（図５Ｇ～Ｈ）。

操作されたアピラーゼ発現酵母の治療的潜在能力をさらに評価するために、飲用水に投与されるデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の、７日間離しての、２ラウンドで誘導された大腸炎のモデルを用いた（５３）。ＤＳＳ投与が開始された日から開始して、酵母を経口で投与した。ＡＰＴＭ－３での処置は、ＤＳＳ誘導性大腸炎に関連づけられる体重減少を妨げたが、ＢＳ０２９での処置では妨げなかった（図５Ｉ）。さらに、ｑＰＣＲおよびＮａｎｏｓｔｒｉｎｇによる大腸試料の転写分析により、ＡＰＴＭ－３処置が、結果として、ＩＢＤおよび腸炎症に関連づけられる遺伝子の発現の減少を生じることが明らかにされた（５１、５２、５４、５５）（図５Ｊ、Ｋ）。まとめると、これらの知見は、合成Ｐ２Ｙ２－ＲＲＯＰ１遺伝子回路を有するｅＡＴＰ応答性酵母が腸炎症を軽快させることを実証している。

[実施例６]
ｅＡＴＰ応答性合成酵母プロバイオティクスは大腸炎関連線維症および腸内毒素症を制限する
線維症は、ＩＢＤの発病に寄与する（５６～５８）。ｅＡＴＰの代謝により産生されるアデノシンは炎症を弱めるが、アデノシンにより駆動されるプリン作動性シグナル伝達の慢性活性化は線維症を促進させ得る（２６、２９）。したがって、アピラーゼを構成的に発現する酵母株は抗炎症効果を示すが、それらはまた、局所的ｅＡＴＰレベルに応答してアピラーゼを産生する酵母株の使用により回避できる、追加の病因性応答を促進し得る。実際、対照ＣＢ００８で処置されたマウスの大腸において、また構成的アピラーゼ発現ＢＳ０２９酵母株でも、線維性病変を検出した。しかしながら、ｅＡＴＰ誘導性のＡＰＴＭ－３操作された酵母株で処置されたマウスにおいて線維症の有意な低下を検出した（図６Ａ、Ｂ）。これらの知見は、プリン作動性シグナル伝達の制御された調節が、腸炎症を管理し、かつ望ましくない有害な副作用を回避するために必要とされることを示唆している。

マイクロバイオームは、健康および疾患における腸生理機能において重要な役割を果たす（５）。さらに、プリン作動性シグナル伝達は、腸内マイクロバイオータ－宿主情報交換に関与する（２８、３０）。したがって、誘導性かつ局在化様式で働くように操作されたプロバイオティクスは、腸内マイクロバイオームへの妨害を最小限にする可能性が高い。操作された酵母株による構成的対誘導性のアピラーゼ産生が、腸内マイクロバイオームへの効果に関して異なるかどうかを調べるために、糞便試料において１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシングを実施した。以前の報告（５９）と一致して、ＴＮＢＳでの大腸炎の誘導は、α多様性のＳｈａｎｎｏｎエントロピー指数の分析により示されているように、各試料内のマイクロバイオーム多様性を低下させた（図６Ｃ）。マイクロバイオーム多様性の類似した低下は、アピラーゼを構成的に産生するＢＳ０２９酵母株での処置の効果を分析した時に検出された。しかしながら、誘導性アピラーゼを発現する、ＡＰＴＭ－３操作された酵母株での処置は、ナイーブマウスにおいて検出されたものと類似したマイクロバイオーム多様性レベルを生じた（図６Ｃ）。

その後、β多様性を分析した。これは、系統学的関係を考慮しながら、微生物分類群に関する定性的差を評価する重みなしＵｎｉＦｒａｃ距離計量を用いて、試料間のマイクロバイオーム組成の差を測定する。ｐｅｒｍａｎｏｖａ検定の主座標分析（ＰＣｏＡ）可視化（図６Ｄ）およびペアワイズＵｎｉＦｒａｃ距離（図６Ｅ）により、ＣＢ００８対照または構成的アピラーゼＢＳ０２９酵母株で処置された対照群とＴＮＢＳマウスとの間での有意差が明らかにされた。著しいことには、β多様性の分析により、ＡＰＴＭ－３操作された株で処置されたＴＮＢＳマウスが、ＴＮＢＳ大腸炎が誘導されていないマウスのマイクロバイオームと類似したマイクロバイオームを有し、アピラーゼ発現がｅＡＴＰにより誘導される操作された酵母株が、健康なマイクロバイオームを再確立することを示唆している（図６Ｄ～Ｅ）。

最後に、異なる処置群におけるマイクロバイオームの分類学的組成を分析した。共生細菌のいくつかの分類群は、ＩＢＤにおいて減少し、腸炎症を軽快させることが示されている（４、５、６０、６１）。例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導に関連づけられるクロストリジウム（Clostrodium）クラスターＸＩＶａは、ＩＢＤおよび急性大腸炎を有する人々において一貫して枯渇している（６２～６４）。本発明者らは、クロストリジウム（Clostridium）クラスターＸＩＶａの一部であるラクノスピラ科（Lachnospiraceae）が、ＣＢ００８およびＢＳ０２９酵母株で処置されたＴＮＢＳマウスにおいて有意に低下したが、誘導性アピラーゼを発現するＡＰＴＭ－３株で処置されたＴＮＢＳマウスにおいて低下しなかったことを見出した（図６Ｆ～Ｈ）。さらに、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）内において、ロゼブリア属（Roseburia）は、ＣＢ００８およびＢＳ０２９酵母株において減少したが、ＡＰＴＭ－３で処置されたＴＮＢＳマウスにおいて減少しなかった。注目すべきことには、ロゼブリア種（Roseburia spp.）は、酪酸依存性機構を通してＴｒｅｇ発生を促進することが示されている（６５、６６）。まとめると、これらの知見は、ＡＰＴＭ－３操作された酵母株によるアピラーゼの誘導性産生が、線維症およびマイクロバイオーム調節不全に関連づけられる望ましくない病因性副作用なしに、ｅＡＴＰ枯渇およびアデノシン産生の抗炎症効果を可能にすることを示唆している。

参考文献

他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は、例証することを意図され、発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義されることは、理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。

図１Ａ～Ｄは、ヒトＰ２Ｙプリン受容体２（Ｐ２Ｙ２）の指向性進化を示す図である。（Ａ）ヒトＰ２Ｙ２受容体活性化を、接合応答性プロモーターｐＦＵＳ１を利用する蛍光レポータータンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙの発現と機能的に共役させた。接合経路への改変は、負の制御因子Ｓｓｔ２、および野生型接合経路において細胞成長を停止させるＦａｒ１をコードする遺伝子のノックアウトを含んだ。キメラＧαタンパク質（Ｇｐａ１－Ｇα_ｉ３）は、哺乳動物Ｇα_ｉ３の５個のＣ末端アミノ酸を含有する。（Ｂ）操作された接合経路は、野生型（ＷＴ）ヒトＰ２Ｙ２受容体および以下のようなＧｐａ１－Ｇαキメラの組込みを有する様々な酵母株を用いて、ＵＴＰに応答する：ＢＳ０１９（Ｇ_１４）、ＢＳ０２０（Ｇ_ｑ）、ＢＳ０１６（Ｇ_ｉ３）。示された濃度のＵＴＰとの６時間のインキュベーション後、接合経路の活性化を、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光をフローサイトメトリーにより定量化することによりモニターした。データ点は２つのコロニーの平均を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。０μＭ ＵＴＰに対して^＊Ｐ＜０．０５。（Ｃ）ヒトＷＴ Ｐ２Ｙ２受容体を発現する細胞を、ＵＴＰおよびＡＴＰで処理し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を、フローサイトメトリーにより定量化した。データ点は、ＡＴＰについては６個のコロニーの平均、ＵＴＰについては３個のコロニーの平均を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。（Ｄ）エラーの多い（Error-prone）ＰＣＲにより生成されたヒトＰ２Ｙ２受容体変異体のプラスミドライブラリを、Ｇｐａ１－Ｇα_ｉ３ ｍＣｈｅｒｒｙ受容体株へ形質転換した。細胞を、１００μＭ ＡＴＰで処理し、蛍光活性化細胞ソーティングを用いて、高度に活性化された変異体（ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の上位１％）について選択した。その後、個々の酵母コロニーを、スクリーニングして、所望の表現型を確認し、シーケンシングした。 図１－１の続きである。 図１－１の続きである。 図２Ａ～Ｂは、指向性進化により生成されたヒトＰ２Ｙ２受容体変異体のｅＡＴＰに対する応答性の増加を示す図である。（Ａ）ランダムに選択された酵母コロニーを、示されたリガンドと６時間、インキュベートし、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を定量化した。ｙ軸がＷＴ応答より上の倍数増加を表すように、応答は、１００μＭ ＡＴＰで活性化されたＷＴ ヒトＰ２Ｙ２受容体に対して標準化された。１０個の酵母コロニーを、詳細な特徴づけのために選択し（紫色のボックス）、１００μＭ ＡＴＰおよび１００μＭ ＵＴＰに対するそれらの応答は、本図の挿入図に示されている。（Ｂ）ヒトＰ２Ｙ２受容体における複数の変異は、ｅＡＴＰおよびｅＵＴＰに対する感受性および最大応答を増加させた。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、ｅＡＴＰへの最大ＷＴ応答に対するパーセンテージとして表されている。変異体は、変異体残基の位置に基づいて分類されている。データ点は、ｅＡＴＰについては６個のコロニーの平均、ｅＵＴＰについては３個のコロニーの平均を表し、それぞれが、示されたヒトＰ２Ｙ２受容体変異体をコードするプラスミドで形質転換されている。エラーバーはＳＥＭを表す。 図２－１の続きである。 図２－１の続きである。 図３Ａ～Ｈは、ヒトＰ２Ｙ２受容体変異体の特徴づけを示す図である。（Ａ）指向性進化後にヒトＰ２Ｙ２受容体において変異した残基。ＡＴＰ感受性の増強を有する上位１０個の変異体ヒトＰ２Ｙ２受容体を、変異体残基の位置：ヘリックス１、ヘリックス７、および膜貫通領域に基づいて分類した。推定結合ポケットにおいてドッキングされたＡＴＰは薄い灰色で示されている。残基Ｆ５８、Ｑ１６５、およびＦ３０７は、上位１０個の変異体のうちの８個において変異していた。Ｐ２Ｙ１受容体の構造（４ＸＮＷ．ｐｄｂ）に基づいて、ＭＯＤＥＬＬＥＲ ９．１８を用いて作成された。（Ｂ）Ｃ末端ＧＦＰタグ付きヒトＰ２Ｙ２受容体変異体の酵母における発現を、フローサイトメトリーにより定量化した。平均ＧＦＰ値を、ＷＴ Ｐ２Ｙ２発現に対して標準化した。データは、少なくとも３個のコロニーの平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。ＷＴに対して^＊Ｐ＜０．０５。（Ｃ）共焦点顕微鏡観察により調べられた、ＧＦＰタグ付き内因性酵母ＳＴＥ２ ＧＰＣＲおよびヒトＰ２Ｙ２受容体変異体の代表的な画像。スケールバーは５μＭを表す。（Ｄ～Ｇ）指向性進化により生成されたヒトＰ２Ｙ２受容体変異の組合せは、新規なＧＰＣＲ特徴を表している。（Ｄ）Ｆ５８ＩかまたはＦ３０７ＳのいずれかとのＮ１１６Ｓ変異の組合せは、結果として、最大活性のヒトＰ２Ｙ２受容体を生じた。Ｆ３０７Ｓ変異は、構成的活性を与え、ｅＡＴＰに対する感受性を向上させ、ｅＡＴＰに対する応答を向上させた。（Ｅ）非相加的効果が、ヒトＰ２Ｙ２受容体ＴＭ－２変異体の活性の増加に寄与する。Ｌ５９ＩおよびＣ１１９Ｓ変異は、単独で、ＡＴＰに対する感受性において中程度の増加を与える。その組み合わされた効果は、ＴＭ－２変異体において検出されたものより低く、非相加的変化を示している。（Ｆ）Ｈ１－１変異体における各変異を別々に分析することにより、Ｆ５８Ｃが、活性に影響する主要な変異として同定された。Ｋ２４０Ｎは、検出された活性の増加に寄与しなかった。（Ｇ）ＴＭ－１変異体は、Ｑ１６５Ｈ変異に加えて、サイレント変異を有する。サイレント変異は、それらがＦ５８Ｉ変異と組み合わされた場合を含め、ＡＴＰ感受性の増加に寄与する。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、ＡＴＰへの最大野生型応答に対するパーセンテージとして表されている。データ点は、少なくとも３個のコロニーの平均を表し、それぞれが、示されたＰ２Ｙ２変異体をコードするプラスミドで形質転換されている。エラーバーはＳＥＭを表す。（Ｈ）Ｐ２Ｙ２残基Ｆ５８を、全ての他のアミノ酸へ変異させ、ｅＡＴＰに対する用量反応を、Ｇｐａ１－Ｇα_ｉ３ ｍＣｈｅｒｒｙレポーター株を用いて評価した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、ＡＴＰへの最大野生型応答に対するパーセンテージとして表されている。データ点は、少なくとも３個のコロニーの平均を表し、それぞれが、示されたＰ２Ｙ２変異体をコードするプラスミドで形質転換されている。エラーバーはＳＥＭを表す。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図４Ａ～Ｆは、操作された酵母によるＡＴＰアーゼのｅＡＴＰ応答性分泌を示す図である。（Ａ）アピラーゼ遺伝子の配列アラインメント。ヒトＥＮＴＰＤ１（ＣＤ３９）、ジャガイモアピラーゼ（ＲＲＯＰ１）、およびコムギアピラーゼ（ＴＵＡＰ１）を、ＭＥＧＡ６アラインメントエクスプローラーにおけるＭＵＳＣＬＥを用いて、アライメントした。（Ｂ）治療的応答エレメント。（Ｃ）ジャガイモアピラーゼ（ＲＲＯＰ１）もしくはコムギアピラーゼ（ＴＵＡＰ１）を構成的に発現する酵母株、またはいかなるアピラーゼも発現しない（ベクター）酵母株からの細胞可溶化液。バンドは、アピラーゼ上のＣ末端ＨＡタグに対応し、ＲＲＯＰ１は、Ｎ末端α因子シグナルペプチドを含まない場合、４８ｋＤａ、またはシグナルペプチドを含む場合、５７ｋＤａに現れると予想された。ＴＵＡＰ１は、シグナルペプチドを含まない場合、４６ｋＤａ、シグナルペプチドを含む場合、５５ｋＤＡに現れると予想された。矢印は、ローディング対照として用いられた細胞質タンパク質Ｐｇｋ１を示す。（Ｄ）ジャガイモアピラーゼ（ＲＲＯＰ１）またはコムギアピラーゼ（ＴＵＡＰ１）を構成的に分泌する株からの５μＬの上清を、５０μＬの総反応体積においてＡＴＰ ５０μＭと３０分間、インキュベートし、残存ＡＴＰを定量化した；アピラーゼを発現しない酵母親株を陰性対照として用いた（ＣＢ００８）。それぞれ、３つの生物学的レプリケートを代表し、エラーバーは標準偏差を表す、^＊Ｐ＜０．００１。（Ｅ）操作されたヒトＰ２Ｙ２受容体活性化を、接合応答性プロモーターｐＦＵＳ１を利用するＲＲＯＰ１アピラーゼの発現と機能的に共役させた。ｅＡＴＰによる受容体の活性化により、アピラーゼは発現し、酵母による分泌を促進するシグナルペプチドのおかげで分泌される。分泌されたアピラーゼは、細胞外ＡＴＰをＡＤＰおよびＡＭＰへ脱リン酸化し、次に、遺伝子回路を遮断する。（Ｆ）Ｐ２Ｙ２／ＲＲＯＰ１遺伝子回路を有する操作された酵母株を、示された濃度のＡＴＰと１６時間、インキュベートした。ＡＴＰアーゼ活性を、５μＬ 培養上清を５０μＬ反応において５０μＭ ＡＴＰと３０分間、インキュベートし、その後、残存ＡＴＰを測定することにより定量化した。ＡＴＰアーゼ単位＝１分間あたり１μｍｏｌのＡＴＰをＡＤＰへ。左から右へ、ＡＰ－Ｐ４（ＷＴ）；ＡＰＴＭ－３（Ｎ１１６Ｓ）；ＡＰＨ１－１（Ｆ５８Ｃ Ｃ６０Ｙ Ｇ３１０Ａ）；ＡＰＨ１－３（Ｆ５８Ｉ）；ＡＰＴＭ－２（Ｌ５９Ｉ Ｃ１１９Ｓ）；ＡＰＴＭ－１（Ｑ１６５Ｈ）；ＡＰＨ７－１（Ｋ２４０Ｎ Ｆ３０７Ｓ）；構成的アピラーゼ（ＢＳ０２９）である。「構成的」とは、強い構成的ｐＴＤＨ３プロモーターの調節下でＲＲＯＰ１を発現する酵母株を示す。データは、別々の日に実施された３つの生物学的レプリケートの平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。同じＡＴＰ濃度におけるＷＴ応答に対して^＊Ｐ＜０．０５。 図４－１の続きである。 図４－１の続きである。 図４－１の続きである。 図４－１の続きである。 図４－１の続きである。 図５Ａ～Ｋは、ｅＡＴＰ応答性合成酵母はＴＮＢＳ誘導性大腸炎を軽快させることを示す図である。（Ａ）ＡＴＰ誘導性ＴＭ－３酵母株（左）またはＢＳ０３５構成的（右）での強制経口投与から２時間後の腸の特定部分の糞便内容物においてフローサイトメトリーにより定量化されたｍＣｈｅｒｒｙ陽性酵母（総ＧＦＰ酵母に占める％）。ＡＴＰレベルを、腸の同じ部分において測定した。（Ｂ）ＴＮＢＳ直腸投与後の体重の変化。群間の統計的有意性を、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙの多重比較事後検定により評価した、^＊＊＊Ｐ＜０．０５；^＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ＝有意性なし；（ｎ＝１０）。（Ｃ）（Ｂ）に示された実験群からのマウスの大腸の長さ（ｎ＝４）。（Ｄ）ヘマトキシリンおよびエオシン染色２０×（上部）および４０×（下部）倍率。各群の代表的な腸区域が示されている。白抜きの矢頭：免疫細胞が、構造破壊を有する粘膜に浸潤している。黒色の矢印：粘膜下層での免疫細胞浸潤。黒色の角括弧：浮腫性粘膜下層。スケールバー＝１００μｍ。（Ｅ）（Ｂ）のような群からのマウスの組織形態学疾患スコアであり、より高いスコアが、組織破壊のより高い重症度を意味する（ｎ＝４）。（Ｆ）（Ｂ）に示された実験群におけるマウスからの大腸試料のＲＮＡ－Ｓｅｑ分析。異なって発現した遺伝子のヒートマップ。（Ｇ）（Ｂ）に示された実験群における腸間膜リンパ節でのＦｏｘｐ３^＋ Ｔ制御細胞（ｎ＝３）。（Ｈ）（Ｂ）のような群からの試料の大腸組織においてｑＰＣＲにより決定されたＦｏｘｐ３、Ｉｆｎｇ、およびＩｌ１７ ｍＲＮＡ発現（ｎ＝３）。（Ｉ）（Ｂ）においてのように、プロバイオティクス酵母で処置されたマウスにおけるＤＳＳ誘導性大腸炎の経過中の体重の変化。群間の統計的有意性を、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙの多重比較事後検定により評価した、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ＝有意性なし；（ｎ＝１２）。（Ｊ）ＤＳＳ投与の開始から２１日後のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇにより決定された酵母処置されたマウスからの大腸試料における遺伝子発現。異なって発現した遺伝子のヒートマップ。データは、群あたりｎ＝３マウスからのプールされた試料の２つの独立した実験を代表する。（Ｋ）（Ｊ）においてのように、群からのマウス由来の大腸組織から抽出されたＲＮＡにおいてｑＰＣＲにより決定されたＮｏｓ２、Ｃｃｌ２、およびＩｌ１ｂ ｍＲＮＡ発現（ｎ＝３）。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、選択された多重比較のための事後検定、ＴｕｋｅｙまたはＳｉｄａｋ検定により決定された場合、^＊＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ＝有意性なし。データは３つの独立した実験を代表する。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図６Ａ～Ｈは、ｅＡＴＰ応答性合成酵母プロバイオティクスが線維症および腸内毒素症を制限することを示す図である。（Ａ）線維症についてのＭａｓｓｏｎ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色、２０×（上部）および４０×（下部）倍率。線維性領域は、染色され、白色矢印で強調されている。スケールバー＝１００μｍ。（Ｂ）（Ｌ）からの群からのマウスの組織学線維症スコア（ｎ＝４）。（Ｃ～Ｈ）糞便試料へＭｉＳｅｑにより実施された微生物１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のハイスループット遺伝子シーケンシング分析。（Ｃ）糞便マイクロバイオームのα多様性。α多様性における差を比較するＳｈａｎｎｏｎ指数を、最も高い配列深度（４０００ｐｂ）において計算した。Ｋｒｕｓｋａｌ－ＷａｌｌｉｓノンパラメトリックＡＮＯＶＡ検定により決定された場合、^＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ＝有意性なし。（Ｄ～Ｅ）β多様性。（Ｄ）重みなしＵｎｉＦｒａｃ計量に基づいた主座標分析（ＰＣｏＡ）。（Ｅ）エタノール対照群に対する重みなしＵｎｉＦｒａｃ距離。^＊Ｐ＜０．０５ Ｐｅｒｍａｎｏｖａ分析。（Ｆ）科レベル分類学において分類された細菌の相対存在量。（Ｇ）ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）およびそれのロゼブリア属（Roseburia）の１つの相対存在量。（Ｈ）ＡＰＴＭ－３対ＣＢ００８比較のためのＬＥｆＳｅ ｐ＜０．０５。各分岐図は、界の系統学的レベルから属レベルまでで示された、＞０．１％で検出された全ての分類を表す。薄い灰色の円は、存在するが豊富ではない分類群を表す。濃い灰色の円は、ＡＰＴＭ－３において豊富であり、縞模様の円は、ＣＢ００８において豊富である。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、事後検定のＴｕｋｅｙ検定により決定された場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ＝有意性なし。 図６－１の続きである。 図６－１の続きである。 図６－１の続きである。 図６－１の続きである。 図６－１の続きである。 図６－１の続きである。 図６－１の続きである。 図７Ａ～Ｂは、操作された接合経路の時間経過によるｅＡＴＰに対する応答を示す図である。（Ａ、Ｂ）プラスミドｐＲＳ３１６ ｐＴＤＨ３ Ｐ２Ｙ２（ＷＴヒトＰ２Ｙ２受容体）で形質転換されたＢＳ０１６株由来の酵母を、３００μＬ（Ａ）または５ｍＬ（Ｂ）のＳＤ－ＵＲＡ培地における１００μＭ ＡＴＰとインキュベートし、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を定量化した（それぞれ、２個の個々のコロニー、エラーバーは標準偏差を表す）。 図８は、ヒトＰ２Ｙ２受容体の指向性進化のためのストラテジーを示す図である。各ＦＡＣＳソート中、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の上位約１％を収集した。「回収された」とは、選択培地上に、ソートされた細胞をプレーティングした後に得られる酵母コロニーの数を指す。 図９Ａ～Ｂは、酵母上清におけるＡＴＰ濃度を示す図である。（Ａ）傾きは統計的に異ならなかった。（Ｂ）酵母により分泌された活性アピラーゼの量を推定するために、５０μＭ ＡＴＰを、５０μＬ反応体積において、ＣＢ００８株の培養物からの５μＬ上清と共に、示された濃度の市販のアピラーゼと３０℃で３０分間、インキュベートし、残存ＡＴＰを定量化した。３１．３ｐＭ 市販アピラーゼが加えられた時、アピラーゼ活性は観察されなかった。 図１０Ａ～Ｄは、合成酵母プロバイオティクスはマウス腸において生存可能であることを示す図である。（Ａ）ＣＢ００８ ＫＧ、ＢＳ０２９ ＫＧ、またはＡＰＴＭ－３ ＫＧ酵母株のいずれかでのマウスへの強制経口投与から６時間後に収集された便の１ｍｇあたりコロニー形成単位。（Ｂ）ナイーブマウスおよびＴＮＢＳ誘導性マウスの腸の特定部分におけるＡＴＰ相対レベル。（Ｃ）ＡＴＰ誘導性ＴＭ３株ＴＭ－３ ＫＧでのナイーブマウスへの強制経口投与から２時間後の腸の特定部分の糞便内容物においてフローサイトメトリーにより測定されたｍＣｈｅｒｒｙ陽性酵母（総ＧＦＰ酵母に占める％）（右）。ＡＴＰレベルを、腸の同じ部分において測定した。（Ｄ）ＴＭ－３ ＫＧまたはＰ４ ＫＧ（ＷＴ）酵母株での強制経口投与から２時間後の腸の特定部分の糞便内容物においてフローサイトメトリーにより定量化されたｍＣｈｅｒｒｙ陽性酵母（総ＧＦＰ酵母に占める％）。 図１０－１の続きである。 図１０－１の続きである。 図１１は、プラスミドｐＣＡＳ ＡａｒＩを示す図である。ＡｄｄＧｅｎｅから入手されたｐＣＡＳプラスミド（配列番号２２）においてＸｍａＩおよびＢｇｌＩＩ部位にカスタムマルチクローニング部位が挿入されている（１１２）。画像はＣＬＣ配列ビューワーで作成された。 図１１－１の続きである。 図１２は、どのようにして、炎症中、ＡＴＰ応答性治療用微生物はプリン作動性シグナル伝達を制御するのかを示す図である。慢性炎症は、炎症組織を囲んで＞１００μＭに達する、上方制御された細胞外ＡＴＰ（ｅＡＴＰ）により特徴づけられる（Bours, M.J., Dagnelie, P.C., Giuliani, A.L., Wesselius, A. & Di Virgilio, F. P2 receptors and extracellular ATP: a novel homeostatic pathway in inflammation. Frontiers in bioscience 3, 1443-1456 (2011)、Di Virgilio, F., Pinton, P. & Falzoni, S. Assessing Extracellular ATP as Danger Signal In Vivo: The pmeLuc System. Methods in molecular biology 1417, 115-129 (2016)）。ｅＡＴＰは、主にＰ２Ｘ７受容体を通して媒介される、腸における様々な免疫細胞および上皮細胞からの炎症促進性応答を誘導する（Kurashima, Y., Kiyono, H. & Kunisawa, J. Pathophysiological role of extracellular purinergic mediators in the control of intestinal inflammation. Mediators of inflammation 2015, 427125 (2015)）。Ｐ２Ｘ７の活性化は、カスパーゼ１発現を促進し、炎症性サイトカインの成熟およびパネキシン－１（Ｐａｎｘ１）チャネルの開口をもたらし、追加のＡＴＰの流出を促す（Cekic, C. & Linden, J. Purinergic regulation of the immune system. Nature reviews. Immunology 16, 177-192 (2016)）。ｅＡＴＰ蓄積を防止するために、エクトヌクレオチダーゼＣＤ３９およびＣＤ７３はＡＴＰをＡＤＰ、ＡＭＰ、および最終的にはアデノシンへ分解する（Cekic, C. & Linden, (2016)）。Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３受容体は、主に免疫細胞により発現したＧＰＣＲであり、アデノシンによるそれらの活性化は、抗炎症応答をもたらす（Cekic, C. & Linden, (2016)）。本発明である、ｅＡＴＰ応答性治療用微生物は、これらの既存の免疫制御性経路を動的に調節する。ＧＩ管へ導入された後、酵母細胞は、それらの表面上に発現した操作されたＰ２Ｙ２受容体を介して、上方制御されたｅＡＴＰを感知することができる。Ｐ２Ｙ２は、配線し直された接合経路を活性化し、アピラーゼまたはマウスＩＬ－１０をｅＡＴＰ濃度依存性様式で分泌する。アピラーゼは、ｅＡＴＰを直接的に分解するように機能し、抗炎症性アデノシンを生成するのを助けると同時に、Ｐ２Ｙ２活性化シグナルを遮断する。ＩＬ－１０は、ＮＬＲＰ３インフラマソームおよびカスパーゼを含む多くの炎症促進性遺伝子（Gurung, P. et al. Chronic TLR Stimulation Controls NLRP3 Inflammasome Activation through IL-10 Mediated Regulation of NLRP3 Expression and Caspase-8 Activation. Sci Rep 5, 14488 (2015)；Zhang, J., Fu, S., Sun, S., Li, Z. & Guo, B. Inflammasome activation has an important role in the development of spontaneous colitis. Mucosal Immunol 7, 1139-1150 (2014)）の下方制御をもたらすＩＬ－１０ Ｒ１／Ｒ２受容体に作用する（Paul, G., Khare, V. & Gasche, C. Inflamed gut mucosa: downstream of interleukin-10. Eur J Clin Invest 42, 95-109 (2012)）。

Claims (40)

1. 以下から選択される１つ、２つ、または３つ全部の外因性タンパク質を発現するように操作されている単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞：
   （ｉ）哺乳動物Ｐ２Ｙプリン受容体２（Ｐ２Ｙ２）タンパク質、好ましくはヒトＰ２Ｙ２；
   （ｉｉ）哺乳動物Ｇα、好ましくはＧα_ｉ３由来の少なくとも５個のＣ末端残基を含む変異体Ｇｐａ１タンパク質であって、前記Ｐ２Ｙ２タンパク質を酵母接合経路に共役させる変異体Ｇｐａ１タンパク質；および
   （ｉｉｉ）抗炎症性タンパク質であって、任意選択で、前記抗炎症性タンパク質が哺乳動物、好ましくはヒトであり、前記抗炎症性タンパク質が、Ｐ２Ｙ２活性化の下流で活性化されるプロモーター、任意選択で接合応答性プロモーターの調節下で発現し、前記単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞が細胞外アデノシン三リン酸（ｅＡＴＰ）の存在下で前記抗炎症性タンパク質を分泌する、抗炎症性タンパク質。
2. 以下からなる群から選択される１つまたは複数の内因性タンパク質の発現を低下させ、または除去するように操作されている、請求項１に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞：
   （ｉ）酵母ＧＰＣＲα因子フェロモン受容体ＳＴＥ２；
   （ｉｉ）経路機能の負の制御因子ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質ＳＳＴ２；
   （ｉｉｉ）細胞周期制御因子サイクリン依存性タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ阻害性タンパク質ＦＡＲ１；および
   （ｉｖ）酵母Ｇαタンパク質グアニンヌクレオチド結合タンパク質サブユニットαＧＰＡ１。
3. 前記抗炎症性タンパク質が、前記タンパク質が分泌されるように指示する酵母由来リーダーペプチドを含み、任意選択で、前記抗炎症性タンパク質に内在性のシグナルまたはリーダー配列を一切欠く、請求項１または２に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
4. 前記抗炎症性タンパク質が、アピラーゼ、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、ＩＬ－２、ＩＬ－２７、ＩＬ－２２、またはＩＦＮ－βを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
5. 前記Ｐ２Ｙ２タンパク質、変異体Ｇｐａ１、または抗炎症性タンパク質の少なくとも１つが、前記サッカロミセス属（Saccharomyces）細胞における発現のためにコドン最適化された配列から発現する、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
6. 前記Ｐ２Ｙ２が、前記抗炎症性タンパク質の発現を増加させる１つまたは複数の変異を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
7. 前記変異が、リガンド結合ポケットの周辺の残基（任意選択で、Ａ７６^２．４７、Ｎ１１６^３．３５、Ｃ１１９^３．３８、Ｌ１６２^４．５４、Ｑ１６５^４．５７）、および／または前記受容体の細胞内に面する側の残基（任意選択で、Ｆ５８^１．５７、Ｌ５９^１．５８、Ｃ６０^１．５９、Ａ２２９^ＩＣＬ３、Ｋ２４０^６．３１、Ｆ３０７^７．５４、Ｇ３１０^Ｃ末端）におけるものである、請求項６に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
8. １つまたは複数の変異が、残基Ｆ５８^１．５７、Ｎ１１６^３．３５、Ｆ３０７^７．５４、および／またはＱ１６５^４．５７におけるものである、請求項６に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
9. 前記１つまたは複数の変異が、Ｆ５８Ｃ、Ｑ１６５Ｈ、Ｆ３０７Ｓ、および／またはＮ１１６Ｓを含む、請求項８に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
10. 前記変異がＮ１１６における変異を含む、請求項６に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
11. 前記変異が、Ｆ５８またはＦ３０７における変異と組み合わせて、Ｎ１１６における変異を含む、請求項１０に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
12. 前記変異が、変異Ｎ１１６Ｓを、任意選択で変異Ｆ５８ＩまたはＦ３０７Ｓと組み合わせて、含む、請求項１１に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
13. 前記Ｐ２Ｙ２が、Ｌ５９および／またはＣ１１９における変異をさらに含む、請求項６～１２のいずれか一項に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
14. さらなる前記変異がＬ５９Ｉおよび／またはＣ１１９Ｓを含む、請求項１３に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
15. Ｐ２Ｙ２活性化の下流で活性化される前記プロモーターが、接合応答性プロモーターである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
16. 前記接合応答性プロモーターがｐＦＵＳ１またはｐＦＩＧ１である、請求項１５に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
17. 前記抗炎症性タンパク質の発現が、前記抗炎症性タンパク質をコードする配列の上流の非酵母ＤＮＡオペレーター配列と結合する、フェロモン応答性ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む合成転写因子により駆動される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
18. Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）またはＳ．ブラウディ（S. boulardii）である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞。
19. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞、および任意選択で、生理学的に許容される担体を含む組成物。
20. 経口投与のための固形である、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記固形が、錠剤、丸剤、カプセル、軟ゼラチンカプセル、糖衣丸剤、口腔内崩壊剤／口腔内崩壊錠、または発泡錠を含む、請求項２０に記載の組成物。
22. 経口投与のための液体形態である、請求項１９に記載の組成物。
23. 飲用溶液である、請求項２１に記載の組成物。
24. 任意選択で液体または固体の食物、餌、または飲用水を含む栄養組成物である、請求項１９に記載の組成物。
25. 前記栄養組成物が、飲料、任意選択で、スムージーまたは発酵飲料、フレーバー飲料、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、固形ヨーグルト、果物および／または野菜ジュースまたはその濃縮物、果物および野菜ジュース粉末、還元果物製造物、粉末、麦芽または大豆または穀類ベースの飲料、ミューズリーフレークなどの朝食用シリアル、スプレッド、食事代替物、菓子類、チョコレート、ゲル、アイスクリーム、穀物、果物、および／またはチョコレートバー、エネルギーバー、スナックバー、フードバー、ソース、ディップ、ならびに乳製品および非乳製品ベースのスポーツサプリメントを含むスポーツサプリメントから選択される、請求項２４に記載の組成物。
26. 対象において炎症を低下させる方法であって、請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞または請求項１９～２５のいずれか一項に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法。
27. 前記対象が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有し、またはそれを発症するリスクがある、請求項２６に記載の方法。
28. 対象において炎症を低下させる方法における使用のための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞、または請求項１９～２５のいずれか一項に記載の組成物。
29. 前記対象が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有し、またはそれを発症するリスクがある、請求項２８に記載の使用のための単離されたサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞または組成物。
30. リガンド結合ポケットの周辺の残基（任意選択で、Ａ７６^２．４７、Ｎ１１６^３．３５、Ｃ１１９^３．３８、Ｌ１６２^４．５４、Ｑ１６５^４．５７）、および／または受容体の細胞内に面する側の残基（任意選択で、Ｆ５８^１．５７、Ｌ５９^１．５８、Ｃ６０^１．５９、Ａ２２９^ＩＣＬ３、Ｋ２４０^６．３１、Ｆ３０７^７．５４、Ｇ３１０^Ｃ末端）に１つまたは複数の変異を含む操作された哺乳動物Ｐ２Ｙプリン受容体２（Ｐ２Ｙ２）タンパク質。
31. １つまたは複数の変異が残基Ｆ５８^１．５７、Ｎ１１６^３．３５、Ｆ３０７^７．５４、および／またはＱ１６５^４．５７におけるものである、請求項３０に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。
32. 前記１つまたは複数の変異が残基Ｆ５８Ｃ、Ｑ１６５Ｈ、Ｆ３０７Ｓ、および／またはＮ１１６Ｓを含む、請求項３１に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。
33. 前記変異がＮ１１６における変異を含む、請求項３０に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。
34. 前記変異が、Ｆ５８またはＦ３０７における変異と組み合わせて、Ｎ１１６における変異を含む、請求項３３に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。
35. 前記変異が、変異Ｎ１１６Ｓを、任意選択で変異Ｆ５８ＩまたはＦ３０７Ｓと組み合わせて、含む、請求項３４に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。
36. 前記Ｐ２Ｙ２がＬ５９および／またはＣ１１９における変異をさらに含む、請求項３０～３５のいずれか一項に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。
37. さらなる前記変異がＬ５９Ｉおよび／またはＣ１１９Ｓを含む、請求項３６に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２。
38. 請求項３０～３７のいずれか一項に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２をコードする単離された核酸配列。
39. 請求項３５に記載の単離された核酸配列を含み、任意選択で、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の操作された哺乳動物Ｐ２Ｙ２を発現する宿主細胞。
40. 前記細胞がサッカロミセス属（Saccharomyces）細胞であり、前記単離された核酸配列が前記サッカロミセス属（Saccharomyces）細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項３９に記載の宿主細胞。
    

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