JP2022545153A - 臨床的にアルツハイマー病と診断されたの患者からの血液サンプルを使用したアルツハイマー病のバイオマーカー - Google Patents

Abstract

要約本発明はバイオマーカーと多変量解析を使用し、より信頼性が高くかつ非侵襲的な検出方法を使用したアルツハイマーの診断方法に関するものである。本発明は、有糸分裂を誘発するリンパ球におけるCD69タンパク質、タウおよびリン酸化タウタンパク質、ならびに脳脊髄液中のアミロイド-βペプチドを同時に検出する方法を開示する。これは、認知試験およびアミロイド-陽電子放出断層撮像法などのアルツハイマー病の従来の検出方法に変わりうるものであり、かつこれを補完するものでもある。

Description

発明の分野
本発明はバイオマーカーを使用し、より信頼性が高くかつ非侵襲的な検出方法を使用した
アルツハイマーの診断方法に関するものである。本発明は、有糸分裂を誘発するリンパ球
におけるCD69タンパク質、タウおよびリン酸化タウタンパク質、ならびに脳脊髄液中のア
ミロイド-βペプチドを同時に検出する方法を開示する。これは、認知試験およびアミロ
イド-陽電子放出断層撮像法などのアルツハイマー病の従来の検出方法に変わりうるもの
であり、かつこれを補完するものでもある。
参照による援用
本明細書に記載されているすべての刊行物、特許、明細書は、個々の刊行物、特許、また
は明細書が参照により具体的かつ個別的に含まれるのと同様に、参照により本明細書に組
み込まれる。

発明の背景
今日、推定で約４５０万人のアメリカ人がアルツハイマー病（以下「ＡＤ」と略す）を患
っている。２０５０年までには１，１３０万人から１，６００万人になると予測されてい
る。しかもメディケアや民間の医療保険は患者の大半が必要とする長期的なケアをカバー
していない。
アルツハイマー病は中枢神経系の神経変性疾患であり、進行性の記憶喪失により認知症を
引き起こす。剖検ではＡＤ患者に病理学的特徴が２つの観察される。それは、海馬、大脳
皮質、そして認知機能に不可欠な脳の他の領域における細胞外の老人斑（プラーク）と細
胞内での原線維変化（ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔａｎｇｌｅｓ）である老人斑（
プラーク）は主にアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に由来するペプチドであるアミ
ロイドベータ（Ａβ）の沈着により形成される。原線維変化は、ニューロフィラメントと
微小管関連タンパク質である過剰にリン酸化したタウタンパク質で構成される一対のらせ
ん状のフィラメントで形成される。遅発性または散発性ＡＤは、遺伝性の早期発症型／家
族性ＡＤ（ＦＡＤ）と実質的に同一の病状を示す。つまり両方の形態のＡＤに共通の病原
性経路を示唆している。遺伝学的研究により 現在までに常染色体優性の早期発症型アル
ツハイマー病、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、プレセニリン１（ＰＳ１）、プ
レセニリン２（ＰＳ２）を発生させる３つの遺伝子が特定されている。４番目の遺伝子の
アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）は、ＡＤのを引き起こす原因として最も強力で最も一
般的な遺伝的危険因子だが、必ず引き起こすというわけではない。ＡＰＰおよびＰＳタン
パク質に関連する変異は、そのすべてが、Ａβペプチドや、よりアミロイド形成性の形態
であるＡβ４２の産生の増加につながる可能性がある。 アミロイド老人斑や細胞内での
原線維変化に対する遺伝的影響に加えて、環境要因（例、サイトカイン、神経毒など）も
ＡＤの発症および進行において重要な役割を果たす可能性がある。
ＡＤの主な臨床的特徴は、記憶喪失を引き起こす進行性の認知機能の低下である。記憶障
害は、新しい情報の学習に対する障害を引き起こす。これはいわゆる短期的な記憶喪失で
ある。初期（軽度）および中等度の段階では、遠い過去に学習されたことは覚えているよ
うに見えるが、新しい情報を適切に覚えることはできなくなる。また、時間の失見当識は
記憶障害と密接に関連している。言語障害もＡＤの重要な症状である。これは、初期にお
いて、話している最中に言いたい言葉が出てこなくなる症状として現れる。失行、失算、
左右の見当識障害などの他の認知障害と同様に、多くのＡＤの患者で複雑な視覚障害が見
られる。判断力の低下や問題解決力の低下も頻繁に見られる。
非認知や行動障害もＡＤで一般的であり、認知機能の障害にくらべて、介護者の大きな負
担やストレスになることがある。現在、生存している患者のＡＤの主な診断方法は、一時
的（うつ病やビタミンＢ１２欠乏症など）または永続的（脳卒中など）な記憶喪失に関す
る他の可能性を除外しつつ、詳細な病歴の調査や、記憶および心理テストの実施すること
である。しかし、こうした臨床診断法は絶対確実なものではない。
しかし、ＡＤは、認知症を引き起こす７０個の原因の１つにすぎない。そのため、患者の
死後、剖検で患者の脳に、ＡＤに特徴的なアミロイドの老人斑と神経原線維変化が明らか
になるまで正確に診断することはできない。さらに、臨床の診断が役に立つのは、患者が
重大かつ異常な記憶喪失もしくは人格の変化を示し始めた場合である。その状態に至るま
でに患者はすでに何年もＡＤを患っている。
さまざまな分子イメージング剤を使用した陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）により、認知症
患者の脳アミロイドーシス、タウの蓄積、神経受容体の変化、代謝異常、神経炎症など、
認知症の病態生理学のさまざまな側面が明らかになっている。発症前の早期診断と疾患修
飾の介入へとシフトが進む中で、ＰＥＴ分子イメージング剤は、ＡＤの病態生理学的プロ
セスを定量化し、疾患の進行を監視し、採用した治療法が対象となる脳の分子に効果があ
るかどうかを確認しつつ、薬理学的な反応を定量化することが可能であるというこれまで
にない手段を提供するものである。しかしこの ＰＥＴ の手法は、高額であり患者にと
ってストレスとなる。放射線の安全性から、アミロイドＰＥＴで再度検査するまでに、放
射性トレーサーを使用して１２ヶ月待つことが推奨される。ＰＥＴの撮影には、放射性ト
レーサーを生成して運用できる能力を持つ臨床核医療施設が必要である。もちろん、、非
ユビキタスＰＥＴ撮影装置、放射能保護スーツ、スタッフが必要である。アミロイドＰＥ
Ｔ検査は大都市のみで検査が可能であり、費用も高額である。ＡＥＤによる公衆衛生の問
題の大きさに鑑み、原因を解明するために非常に多くの努力や研究が行われてきた。さら
にその患者がＡＤを発症する可能性があるかを予測し、診断するためのバイオマーカー（
分泌タンパク質または代謝物）を特定研究も続けられてきた。タンパク質アミロイドベー
タとタウは最も特徴がはっきりしている。ＡＤの患者からの脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプ
ルには、ニューロンが変性する際に放出されるタウが通常よりも多く含まれており、また
ベータアミロイドの量が通常よりも少ない。これはおそらくアミロイド老人斑の形で脳に
閉じ込められているためだと考えられる。こうしたバイオマーカーはＣＳＦに放出される
ため、テスト用のサンプルを入手するには腰椎穿刺（または脊椎穿刺）が必要である。こ
のことから、ＡＤと強い相関関係があり、早期にかつ低侵襲または非侵襲により診断や処
置が可能なバイオマーカーもしくはバイオマーカーのグループを有することが望ましい。

発明の概要
本発明はバイオマーカーおよび多変量解析を使用し、より信頼性が高くかつ非侵襲的な検
出方法を使用したアルツハイマーの診断方法に関するものである。本発明は、有糸分裂を
誘発するリンパ球におけるＣＤ６９タンパク質、タウおよびリン酸化タウタンパク質、な
らびに脳脊髄液中のアミロイド－βペプチドを同時に検出する方法を開示する。これは、
認知試験およびアミロイド－陽電子放出断層撮像法などのアルツハイマー病の従来の検出
方法に変わりうるものであり、かつこれを補完するものでもある。

本発明のある実施形態では、アミロイド陽電子放出断層撮影（ＰＴＥＴ）検査を伴わずに
、ヒトを対象にしてアルツハイマー病（ＡＤ）を検出する方法を示す。この手法は以下の
ステップを含む。 （ａ） 対象からサンプルを取得する。 （ｂ） 患者のサンプルか
ら取得した少なくとも４つのバイオマーカーを、それぞれのＡＤのバイオメーカーの参照
レベルと比較する。この時４つのバイオマーカーはＣＤ６９、タウ、リン酸化タウタンパ
ク質、アミロイドβペプチドである。ここで、ＡＤを診断する各バイオマーカーの参照レ
ベルは、ＡＤが確認された患者の１つまたは複数のサンプルにおけるＡＤ診断バイオマー
カーの正規化した測定レベルと、参照レベルよりも対象者のサンプルのタウタンパク質の
レベルが低いものからなる。ｐ－タウとアミロイド－βペプチドの比率は、参照のレベル
よりも被験者のサンプルの方が大きくなる。

ある実施形態では、アミロイドＰＴＥ検査によってＡＤの診断を行う。
ある実施形態では、ＣＤ６９タンパク質のレベルは、末梢血サンプルからのマイトジェン
のリンパ球で測定される。
ある実施形態では、タウ、ｐ－タウタンパク質、アミロイド－βペプチドレベルは、脳脊
髄液（ＣＳＦ）のサンプルで測定する。
ある実施形態では、ＡＤの結果としての陽性のＰＴＥイメージとマイトジェンのリンパ球
におけるＣＤ６９タンパク質の発現との間に高い逆相関関係がある。

ある実施形態では、ＡＤの結果としての陽性のＰＴＥイメージとタウタンパク質の発現と
の間に高い逆相関関係がある。
ある実施形態では、ＡＤの結果としての陽性のＰＴＥイメージとｐ－タウタンパク質の発
現との間に高い正の相関関係がある。
ある実施形態では、ＡＤの結果としての陽性のＰＴＥイメージとアミロイドβペプチドの
発現との間に高い正の相関関係がある。
ある実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＡＤの治療の対象を選択するために使
用される。
ある実施形態では、ＡＤの治療を受けている患者の治療効果を判定するために使用される
。
ある実施形態では、対象者のマイトジェンのリンパ球におけるＰＥＴイメージングの結果
とＣＤ６９タンパク質の発現との間の相関関係を判定することによって、対象者のＡＤの
重症度評価に使用する。

ある実施形態では、人間の対象者のＡＤの進行状況を判断するために使用される。
ある実施形態では、マイトジェンのリンパ球のＣＤ６９のレベルは、ＬｙｍＰｒｏのアッ
セイ内のリンパ球の活性化スコアを適用することによって評価する。

ある実施形態では、ＬｙｍＰｒｏの活性化スコア、ＣＳＦとＰＥＴ検査におけるタウタン
パク質の発現、ＣＳＦとＰＥＴ検査におけるリン酸化タウタンパク質の発現、ＣＳＦとア
ミロイド－ＰＥＴ検査におけるアミロイド－βペプチドの発現を含む類型不能な５つの多
変量分析を含む。
ある実施形態では、ＡＤの発症リスクの判断に使用される。
ある実施形態では、ＡＤに関連する痴呆症を他の痴呆症と区別するために使用する。
ある実施形態では、 ＣＤ６９ 発現によって測定されるように、細胞周期機能不全を正
常化または逆転させることができるような新しい潜在的な治療薬を見つけるために使用さ
れる。

本発明の新規性を以下に示す。本発明の原理を利用した実施形態を紹介し、その詳細な説
明で、この図面を参照することにより本発明の特徴や利点をよりよく理解できると考える
。
細胞周期を示したものである。Ｇ１－Ｇ期１、 Ｓ－Ｓ期（合成）、Ｇ１－Ｇ期２、Ｍ－分裂期、Ｇ０－休止期 白血球 （ＷＢＣ）のサブタイプと、フローサイトメトリにより分析研究された白血球 （ＷＢＣ）の５つのサブタイプ（斜線で囲まれた部分）を示したものである。 ＬｙｍＰｒｏアッセイの結果（ｎ＝１２５）に基づき、アルツハイマー病（ＡＤ）と健康対照者（ＨＣ）グループの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示している。 図３Ａは、トレーニングセットのＲＯＣ曲線を示したものである（ｎ＝８１； ＡＤ ＝ ３８， ＨＣ ＝ ４３）。 ＬｙｍＰｒｏアッセイの結果（ｎ＝１２５）に基づき、アルツハイマー病（ＡＤ）と健康対照者（ＨＣ）グループの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示している。 図３ＢはテストセットのＲＯＣ曲線を示したものである（ｎ＝４４； ＡＤ＝２１， ＨＣ＝２３）。この結果はすべて多数の施設における概念実証研究の結果である。曲線下面積（ＡＵＣ）の値も表に示している。 リンパ球を刺激するパラダイムについて、現在研究中のある中間分析結果を示したものである。この表は、アミロイドＰＥＴ検査で陽性（臨床的に読まれた）であった軽度認知障害（ＭＣＩ）や、ＡＤによる認知症の患者２０人の中間分析結果である（説明の通り匿名であり、左端の表の列に性別を示す） 。各列のヘッダーに示したテストのパラメーターの値は以下の通りであるすべての項目（ＩＤの指定と性別）ＬｙｍＰｒｏ Ｂ－ｃｅｌｌ ＣＤ６９ の活性化の結果 （テスト日を示してある）アミロイドＰＥＴ検査の定量的測定を放射性トレーサー（ １８Ｆ－Ｆｌｏｒｂｅｔａｂｅｎ （ＦＢＢ、 フローベタベン）または１１Ｃ－Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ （ピッツバーグ）の化合物Ｂ（ＰｉＢ）のいずれか）の 複合的なｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｕｐｔａｋｅ ｖａｌｕｅ ｒａｔｉｏ （ｃＳＵＶＲ，標準化取込値比）で表現したもの。脳のβ－アミロイドの密度を画像化するために使用する（これは生のデータであり、使用した放射性核種に対して調整を施していない）。ＰｉＢを受けた対象のｃＳＵＶＲの値は、様々な放射性核種（１８Ｆの場合、値は生のデータである）で調整が取れるように結果を調整しているミニメンタルステート検査 （ＭＭＳＥ） による認知機能のスコア。２０人の患者のサブセットの値は、ＬｙｍＰｒｏアッセイとタウ、リン酸化タウ（Ｐ－タウ）、アミロイド－βタンパク質の脳脊髄液（ＣＳＦ）濃度の関係を示している。 進行中のアミロイドＰＥＴの中間分析 結果を示したものである。ここでは図４のデータセットが互いにプロットしている。グラフは２０人の患者のアミロイドＰＥＴ調整ｃＳＵＶＲ値に対するＬｙｍＰｒｏＢリンパ球ＣＤ６９活性化スコアの相関関係を示したものである。 進行中のアミロイドＰＥＴの中間分析結果を示したものであり、ここでは図４のデータセットが互いにプロットしている。グラフは１１Ｃ－ＰｉＢを受けた患者のアミロイドＰＥＴ検査の ｃＳＵＶＲの生の値に対する、 ＬｙｍＰｒｏ ＣＤ６９活性化スコア（ Ｂ－リンパ球の場合）の双関係を示したものである。 進行中のアミロイドＰＥＴの中間分析結果を示したものであり、ここでは結果のサマリーとともに、図４のデータセットがＬｙｍＰｒｏ ＣＤ６９活性化スコアに対してプロットしている。（ＬｙｍＰｒｏスコアは様々な放射性核種で調整が取れるように結果を調整している）

発明の詳細な説明
はじめに
Ｔｈｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ （ＬｙｍＰｒ
ｏＲ、リンパ球増殖テスト） は、臨床診断されたアルツハイマー病（ＡＤ）の被験者の
血液から採取した末梢リンパ球のマイトジェンの活性化の様子を 健康対照者（ＨＣ）と
比較してその違いをレポートした血液のアッセイ（ ｂｌｏｏｄ ａｓｓａｙ）である。

このアッセイはＡＤの細胞周期再突入の仮説に基づいており、これはＡＤの有糸分裂後（
ｐｏｓｔ－ ｍｉｔｏｔｉｃ）の中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンが不適切に細胞周期
に再突入したとするものである。これは、サイトカイン、細胞周期関連タンパク質、ＤＮ
Ａ倍数性（ＤＮＡ ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙ）の過剰発現、アポトーシスによる神経細胞死
の増加によるものである（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００３； Ｈｅｒｒｕｐ２０１２）
。（図１参照）Ｇ０ 状態で休息している成熟したニューロンは、再度細胞周期に入るべ
きではないが（例、Ｇ１／ Ｓチェックポイントに入ること）、時折生じることがあり、
これが細胞周期調節不全（ＣＣＤ）の証拠になることがある。このＣＣＤは、ＡＤの最も
初期の神経病理の重要な要素の１つである可能性が高く、タウの過剰リン酸化やアミロイ
ド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）代謝にも関連しているようである（Ｓｅｗａｒｄ ｅｔ
ａｌ２０１３）。

脳のＣＣＤは全身の症状に反映されると見られ、いくつかの研究グループが白血球を刺激
することで測定したＣＣＤを報告している。ライプツィヒ大学のトーマス・アレント博士
（Ｄｒ． Ｔｈｏｍａｓ Ａｒｅｎｄｔ）は、アルツハイマー病の指標となる白血球のＣ
Ｄ６９の発現を測定するための技術を開発した。ＣＤ６９は細胞表面の受容体であり、リ
ンパ球が増殖のために活性化して細胞周期に突入することに対するマーカーとして機能す
る。抗原や非特異的マイトジェンによって刺激されると、リンパ球は通常細胞周期に入る
。Ｇ１ ／ Ｓチェックポイントの通過に対するマーカーはＣＤ６９の発現の増加であり
、これはフローサイトメトリーで測定できるが、ＡＤ患者のＣＤ６９は増加せず、正常な
細胞周期に混乱が生じていることを示している（図１参照）。

ＡＤやＨＣの対象者から得たリンパ球と単球に対してインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ）
アッセイを使用することで、ＡＤに起因する認知障害の臨床診断の精度を高めるための血
液バイオマーカーとして使用できる、診断補助テストを開発した。認知障害の根本的な病
因を確認したい医師や、患者や、その家族にとって、非常に正確にＡＤを診断する末梢血
ベースのバイオマーカーは理想的である。
実施形態
本発明のある実施形態は、アミロイド陽電子放出断層撮影（ＰＴＥＴ）検査を使わずに、
人間を対象にしたアルツハイマー病（ＡＤ）を検出する手法である。この手法は、以下の
ステップを含む。
（ａ） 対象からサンプルを取得する。 （ｂ） 患者のサンプルから取得した少なく
とも４つのバイオマーカーを、それぞれのＡＤのバイオメーカーの参照レベルと比較する
。この時４つのバイオマーカーはＣＤ６９、タウ、リン酸化タウタンパク質、アミロイド
βペプチドである。ここで、ＡＤを診断する各バイオマーカーの参照レベルは、ＡＤが確
認された患者の１つまたは複数のサンプルにおけるＡＤ診断バイオマーカーの正規化した
測定レベルと、参照レベルよりも対象者のサンプルのタウタンパク質のレベルが低いもの
からなる。ｐ－タウとアミロイド－βペプチドの比率は、参照のレベルよりも被験者のサ
ンプルの方が大きくなる。
ある実施形態では、アミロイドＰＴＥ検査によってＡＤの診断を行う。
ある実施形態では、ＣＤ６９タンパク質のレベルは、末梢血サンプルからのマイトジェン
のリンパ球で測定される。
ある実施形態では、タウ、ｐ－タウタンパク質、アミロイド－βペプチドレベルは、脳脊
髄液（ＣＳＦ）のサンプルで測定する。
ある実施形態では、ＡＤの結果としての陽性のＰＴＥイメージとマイトジェンのリンパ球
におけるＣＤ６９タンパク質の発現との間に高い逆相関関係がある。
ある実施形態では、ＡＤの結果としての陽性のＰＴＥイメージとタウタンパク質の発現と
の間に高い逆相関関係がある。
ある実施形態では、ＡＤの結果としての陽性のＰＴＥイメージとｐ－タウタンパク質の発
現との間に高い正の相関関係がある。
ある実施形態では、ＡＤの結果としての陽性のＰＴＥイメージとアミロイドβペプチドの
発現との間に高い正の相関関係がある。
ある実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＡＤの治療の対象を選択するために使
用される。
ある実施形態では、ＡＤの治療を受けている患者の治療効果を判定するために使用される
。
ある実施形態では、対象者のマイトジェンのリンパ球におけるＰＥＴイメージングの結果
とＣＤ６９タンパク質の発現との間の相関関係を判定することによって、対象者のＡＤの
重症度評価に使用する。
ある実施形態では、人間の対象者のＡＤの進行状況を判断するために使用される。
ある実施形態では、マイトジェンのリンパ球のＣＤ６９のレベルは、ＬｙｍＰｒｏのアッ
セイ内のリンパ球の活性化スコアを適用することによって評価する。
ある実施形態では、ＬｙｍＰｒｏの活性化スコア、ＣＳＦとＰＥＴ検査におけるタウタン
パク質の発現、ＣＳＦとＰＥＴ検査におけるリン酸化タウタンパク質の発現、ＣＳＦとア
ミロイド－ＰＥＴ検査におけるアミロイド－βペプチドの発現を含む類型不能な５つの多
変量分析を含む。
ある実施形態では、ＡＤの発症リスクの判断に使用される。
ある実施形態では、ＡＤに関連する痴呆症を他の痴呆症と区別するために使用する。
ある実施形態では、 ＣＤ６９ 発現によって測定されるように、細胞周期機能不全を正
常化または逆転させることができるような新しい潜在的な治療薬を見つけるために使用さ
れる。
ある実施形態では、この方法を使用して、まれなマイトジェンのリンパ球のサブセットを
濃縮し、ＣＤ６９発現によって測定される細胞周期機能不全のレベルを評価するものもあ
る（例えば、グループ２の先天性リンパ球など）。
ある実施形態では、ＣＤ６９の発現によって評価することにより、細胞周期機能不全を改
善または正常化することができる新しい薬剤を発見するために使用されるものもある。
例
既に完了しているマルチサイトの概念実証ＬＰ２０２研究の手法

対象者は、認知症の専門家により、アルツハイマー型認知症の可能性を判断するＮＩＡ／
ＡＡ（２０１１）臨床基準により、ＡＤを患っていると診断された。 表１は、１２５人
の対象者の属性を示したものである。 表２は、対象者のＭＭＳＥスコアである。

リンパ球増殖アッセイの手順：血液のサンプルは、すべて１４１人の研究参加者から採取
されたものであり、リンパ球培養用のバキュテイナチューブを使用した。サンプルはその
日の夜輸送し、マイトジェン（ＰＨＡまたはＰＷＭ）の有無にかかわらず別々の培養チュ
ーブで培養し、抗体カクテルで染色して、リンパ球（Ｔ、Ｂ、単球）の亜集団とＣＤ６９
の発現レベルを明らかにした（細胞周期活性の表面マーカー）。リンパ球の亜集団を特定
するバイオマーカーは、取引先の研究室（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で８色の
フローサイトメーターで測定した。 フローサイトメトリー用のサンプルの分析すると、
ブラインドで行った品質管理（５９ ＡＤと６６の健常者）でｎ ＝ １２５のサンプル
が合格し、研究分析に使用された。各対象者のＷＢＣは、１４のバイオマーカー識別機能
を統計分析のためにさまざまな順列で使用（図２参照）し、２つの刺激指数を計算の上で
測定して、追加として８つのバイオマーカー変数を生成して確認した。 したがって、２
２の変数の結果について統計的に分析した。 この２２は、マイトジェンを使用して３つ
の刺激条件をそれぞれ測定した

統計的な分析： パブリックドメインの選択アルゴリズムや段階的な方法を使用して、診
断予測のパフォーマンスを最大化するための最適な特徴の集合を特定した。ここにはロジ
スティック回帰分析、判別分析（線形と二次）、決定木分析とランダムフォレストが含ま
れている。予測パフォーマンスは、最初は６５％のトレーニングセット（ｎ ＝ ８１）
で評価し、その後３５％のテストセット（ｎ ＝ ４４）に適用した。こうした分析は全
て ＪＭＰ Ｐｒｏ ｖ１１．２．１（ＳＡＳ、ノースカロライナ州ケアリー）で行った
。
ＬＰ２０２の研究の多変量解析結果

６６の変数のうち、多変量解析によりグループで最も良い違いを表す５つを選んだ。

ＲＯＣグラフは、トレーニングおよびテストデータセット（図３を参照）用にこの５つの
特徴の候補を使用して作成している。ここではＡＤとＨＣグループのＡＵＣが良好から最
良であったものを選んでいる。

５つの特徴の候補のすべてが、同じマイトジェン刺激条件から得られたことは注目に値す
る。
先行研究の検討

この多変量解析を使用したリンパ球増殖テストの分析の結果、これまでに公開されている
単変量アプローチを使用した２つレポートと一致した。 このことにより、リンパ球増殖
試験がＡＤの重要な神経病理である細胞周期機能障害を確認する血液バイオマーカーとし
て有効な可能性があるという仮説を支持することになった。この発見は、すでに公開され
ている研究コホートの詳細な再分析と併せて、このテスト有効性をさらに確認するもので
あり、認知障害の患者の診断として血液バイオマーカーアッセイの有用性を実証するため
の研究を進めることが有用であると示したものである。
先行研究の限界

研究の設計が、臨床の根拠のみをベースにしたコホートの特性評価と分類（ＡＤやＨＣ）
に基づいており、ＡＤ特有の臨床診断に使用する補助的なバイオマーカーテストがなかっ
た。

にもかかわらず、ＬＰ２０２の概念実証テストサンプルは、ＡＤの臨床診断に関するＢｅ
ａｃｈ ｅｔ ａｌ（２０１２）の結論と同様に実行され、「…感度と特異性を最適化す
ると、最良の臨床
結果は７０．９％の感度と７０．８％の特異性であった」とされた。
臨床診断のみをゴールドスタンダードとして使用した以前の研究に対する全般的な結論

１： ランダムフォレストを使った多変量解析では、ＲＯＣ分析で結果に対する最高のパ
フォーマンス生成した分類不能な５つのリンパ球の候補を発見した。

２：この予備的なアルゴリズムは、強い感度と特異性の両方を生み出すことができるバイ
オアッセイアルゴリズムを開発するステップとして、非常に有望であった。

３：従来の研究で使用されたリンパ球増殖試験は、患者の評価に利用できる可能性があっ
たものの、より多様な臨床サンプルや、オートプシーサロゲートバイオマーカーのアミロ
イドＰＥＴ検査など、さらに臨床の検証が必要であった。以下で示すように、現在の研究
の結果は、従来の研究のテストパフォーマンスの期待値を上回っている。
現在のＰＥＴ研究の紹介

アミロイドＰＥＴは、利用できる放射性トレーサーの１つを使用し、脳内のβ－アミロイ
ド老人斑を放射能標識にして、その密度と位置を測定する。これはＡＤに有効なサロゲー
トマーカーであり、オートプシーで診断するように非常に精度が高い。また生前診断が可
能であり、生物学的なサポートも可能である。 ＩＤＥＡＳ ｎａｔｕｒａｌｉｓｔｉｃ
ｓｔｕｄｙ （Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｉ ｅｔ ａｌ ２０１９） から発表されたレポ
ートでは、アミロイドＰＥＴを使用することにより診断精度が大幅に向上し、誤診率が低
下することがわかった。ＭＣＩと、アミロイドＰＥＴと組み合わせてＡＤと診断された認
知症患者でのリンパ球増殖（ＬｙｍＰｒｏ）テストを研究すると、ＡＤバイオマーカーな
しで行った診断と比較して高い信頼性がもたらされることがわかった。
現在の研究の手法と設計

ＬｙｍＰｒｏＲ アッセイの手順： ＬｙｍＰｒｏＲアッセイの手順は、既に説明した概
念実証研究で実施される。

アミロイドＰＥＴ検査は、 １８Ｆ－ＦＢＢ または １１Ｃ－ＰｉＢ 放射性トレーサ
ーのいずれかを使用して実行された。各被験者の前頭葉、頭頂葉、側頭葉、前帯状皮質、
後頭葉、後頭皮質の脳放射能濃度の画像化を取得し、注入量と体重に対しても正規化され
た画像化に成功した。 ここから、被験者の複合標準化取込値比（ｃＳＵＶＲ）を計算し
た。 １１Ｃ－ＰｉＢ－の結果を１８Ｆ－ＦＢＢ の生の結果に正規化するために調整し
たｃＳＵＶＲも、１１Ｃ－ＰｉＢを使用して画像化した対象者について計算した。

コホートのサブセット（１６／２０）については、脳脊髄液（ＣＳＦ）を腰椎穿刺によっ
て採取し、サンプルを、タウタンパク質（ＣＳＦ－タウ）、高リン酸化タウタンパク質（
ＣＳＦ－ｐ－タウ）、アミロイド－βペプチド（ＣＳＦＡβ）用に濃度をアッセイした。
別のサブセット（１８／２０）については、アミロイド前駆体タンパク質の代謝に関与す
るアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ遺伝子型）の対立遺伝子型が決定した。２つの対立遺
伝子はそれぞれ、通常の「中性」タイプε３またはバリアントε２（パーキンソン症が示
唆される）またはバリアントε４（ＡＤ、他の認知障害、多発性硬化症やアテローム性動
脈硬化症などの障害が示唆される）である。

この現在進行中のＬｙｍＰｒｏＲとアミロイドＰＥＴの研究では、２０人の被験者がライ
プツィヒ大学記憶障害クリニック（ドイツ）により採用された。彼らは専門家により臨床
基準を用いて診断されただけでなく、ＡＤが陽性であるとより確実に診断するために、ア
ミロイドＰＥＴ脳スキャンが陽性であるために、ＭＣＩまたは認知症と診断された患者で
ある。１１人が男性で９人が女性であり、平均年齢は７０．４歳（±８．９）であった。
ＭＭＳＥスコアは１６－３０の範囲であった。

データと統計処理 相関グラフと統計は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔなどの標準的なパブリック
ドメインの数学ソフトウェアによって行った。

現在研究中の中間分析の検討

図５のプロットと図４の６のデータでは、ＰＥＴが陽性でＡＤの患者２０名の中間分析に
おいて、ＬｙｍＰｒｏＲの結果とＰＥＴｃＳＵＶＲ値との間に非常に強い逆相関があるこ
とを示している。アミロイドＰＥＴニューロイメージング（画像化）は、ＡＤの診断にお
いて非常に正確な補助診断情報を提供するものとして受け入れられているが、ＰＥＴスキ
ャンマシンでイメージング（画像化）する前に、サイクロトロンの近くで放射性トレーサ
ーを生成し、放射性トレーサーを注入する必要がある。

ＬｙｍＰｒｏＲのスコアとＭＭＳＥスコア（図示せず）の間の相関関係は、ＭＭＳＥとア
ミロイドＰＥＴ ｃＳＵＶＲの間の相関と同様に非常に低かった。認知検査は障害の病因
を明らかにするものではなく、バイオマーカーでもない。 そのため、ＭＭＳＥがアミロ
イドＰＥＴの結果と強く相関することを期待するべきではない。認知障害の程度は、バイ
オマーカーの値に関連しているかと関連していないかにより、症状のステージに関する情
報を得ることができる。アポリポタンパク質Ｅ遺伝子型などの客観的な生物学的基準です
ら予測は十分ではなく、診断の有用性は限定的である。したがって、ＬｙｍＰｒｏＲスコ
アを、認知機能テストの結果と比較していた従来の臨床診断ベースの研究の結果は、ＡＤ
診断ツールとしてのＬｙｍＰｒｏＲの有用性を示唆していたものの、図５および６のプロ
ットに示されている相関は－０．８４９（ それぞれｐ ＝ ０．０００００２１６）お
よび－０．９０９（ｐ ＝ ０．００００１０８）であり、ＬｙｍＰｒｏＲはＡＤに対す
る補助診断ツールとして強く推奨される。むしろｃＳＵＶＲと逆相関があると想定できる
。なぜなら より多くの細胞周期機能障害とより大きなβ－アミロイド老人斑とより強く
関連するからである。

アミロイドＰＥＴｃＳＵＶＲ研究データとＣＳＦバイオマーカー研究データの相関係数の
比較すると、補助的ＡＤ診断ツールとしてのＬｙｍＰｒｏＲの有用性を強くしめしている
。ＬｙｍＰｒｏＲの生のＰＥＴと図５相関係数は－０．８４９である。 図７に示すよう
に、調整されたＰＥＴデータに対する非ＰＥＴデータの相関分析は、ＣＳＦバイオマーカ
ータウ、リン酸化タウ、アミロイド－βのＰＥＴとの相関係数がそれぞれ－０．３１９、
０．６３２、０．５０８であることを示している。（ ＭＭＳＥ研究データでは、相関係
数－０．１８２である。 ＬｙｍＰｒｏＲデータでは、相関係数は－０．８４８である。
）

現在のＰＥＴに関する研究の結論のサマリー

ＬｙｍＰｒｏＲとＰＥＴの結果との強い相関関係とＬｙｍＰｒｏの他の利点により、ＡＤ
診断のための非常に有用な補助テストになりうると言える。放射能の安全上、正式に承認
されている放射性トレーサーを使用してアミロイドＰＥＴで患者を再画像化する前に、一
般的に約１２か月待つことが推奨される。 患者の立場から考えると、ＬｙｍＰｒｏＲに
は、すぐに手に入る静脈血のサンプルの画像化が頭に浮かぶ。ＰＥＴの撮影には、放射性
トレーサーを生成して運用できる能力を持つ臨床核医療施設が必要である。もちろん、、
非ユビキタスＰＥＴ撮影装置、放射能保護スーツ、スタッフが必要である。アミロイドＰ
ＥＴ検査は大都市のみで検査が可能であり、費用も高額である。繰り返えすが、ＬｙｍＰ
ｒｏＲは、病院や瀉血専門医がいるようなサンプルを集めることできる医療施設ではとて
も便利である。

補助的なＡＤ診断ツールとしてのＬｙｍＰｒｏＲは、ＡＤの診断だけでなく、ＡＤの発症
と進行を潜在的に監視するのにも役立ちうる。ＬｙｍＰｒｏＲテストを使用することによ
り、疾患の進行の経時的な速度を、容易に、高い感度で、費用を抑えて監視できることか
ら、その進行速度を使用して特定の治療法に対する反応や、患者の他の健康問題も厳密に
フォローすることが可能である。

現在の研究は、ＣＮＳの解剖学的／生理学的な現状を反映する上で、簡単に採取が可能な
免疫細胞の有用性と感度を指摘している。パーキンソン病、外傷性脳損傷、慢性外傷性脳
症（ＣＴＥ）、前頭側頭型認知症、多発性硬化症など、ＡＤ診断やその他のさまざまな神
経変性疾患に対する免疫細胞ベースの検査にも取り組んでいる。予備研究において、Ｌｙ
ｍＰｒｏはＡＤ認知症の患者とパーキンソン型認知症の患者を区別し、その結果は健康対
照者の結果と同じであることが明らかになった（Ｓｔｉｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ２０１２）
。

こうしたテストのいくつかには、神経変性疾患のマーカーとしてＣＤ６９以外の免疫細胞
型を使用することが含まれている。特に、ＣＤ４およびＣＤ１９を発現する細胞の有用性
が高い。さらに、図４に示す通り、タウ、過剰リン酸化タウ、アミロイドβタンパク質の
ＣＳＦタンパク質濃度のデータを収集し、ＰＥＴスキャンとＬｙｍＰｒｏＲとの相関を評
価する作業を進めている。また、細胞周期の調節不全を測定するためのモダリティとして
のフーリエ変換ＩＲ（ＦＴＩＲ）マイクロ分光法の使用も検討している。
アッセイの評価についての研究

ＩＣＯＮで分析的検証を行い、最適な抗体濃度、アッセイ間とアッセイ内の精度、および
アナリストとアナリスト、機器と機器の再現性を検証した。 ｈｔｔｐｓ：／／ａｍａｒ
ａｎｔｕｓｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｈｏｌｄｉｎｇｓ．ｂｏｘ．ｃｏｍ／ｓ／ｆｍｎ５１ｖ
ｎｉｈ４ｑ０ｚ８ａｎ８７ｆｍｈｅａｙｘｂｍｘｂｂｒｇ

本発明について実施形態を用いて説明してきたが、そうした形態は本発明の原理を例示し
たものに過ぎないことをご理解いただきたい。また、当業者であれば本発明の修正型や派
生形を簡単に作り出すことができるため、ここで紹介した説明や構造や運用に本発明を限
定するべきではなく、本発明の修正型もしくはそれと同等のものについては、下記の特許
請求の範囲とその同等のもので定義される本発明の範囲に入ると解釈するべきである。

Claims (18)

1. アミロイド陽電子放出断層撮影（ＰＴＥＴ）検査を伴わずに、ヒトを対象にしてアルツハ
   イマー病（ＡＤ）を検出する方法で、以下から構成されるもの
   対象からサンプルを取得する。
   患者のサンプルから取得した少なくとも４つのバイオマーカーを、それぞれのＡＤのバイ
   オメーカーの参照レベルと比較する。この時４つのバイオマーカーはＣＤ６９、タウ、リ
   ン酸化タウタンパク質、アミロイドβペプチドである。ここで、ＡＤを診断する各バイオ
   マーカーの参照レベルは、ＡＤが確認された患者の１つまたは複数のサンプルにおけるＡ
   Ｄ診断バイオマーカーの正規化した測定レベルと、参照レベルよりも対象者のサンプルの
   タウタンパク質のレベルが低いものからなる。ｐ－タウとアミロイド－βペプチドの比率
   は、参照のレベルよりも被験者のサンプルの方が大きくなる。
2. 請求項１の手法で、アミロイドＰＥＴイメージング（画像化）により対象者のＡＤを診断
   するもの。
3. 請求項１の手法で、ＣＤ６９タンパク質のレベルは、末梢血サンプルからのマイトジェン
   のリンパ球で測定されるもの。
4. 請求項１の手法で、タウ、ｐ－タウタンパク質、アミロイド－βペプチドレベルは、脳脊
   髄液（ＣＳＦ）のサンプルで測定するもの。
5. 請求項３の手法で、ＡＤの結果としての陽性のＰＴＥイメージとマイトジェンのリンパ球
   におけるＣＤ６９タンパク質の発現との間に高い逆相関関係があるもの。
6. 請求項４の手法で、ＡＤの結果としての陽性のＰＴＥイメージとタウタンパク質の発現と
   の間に高い逆相関関係があるもの。
7. 請求項２の手法で、ＡＤの結果としての陽性のＰＴＥイメージとｐ－タウタンパク質の発
   現との間に高い正の相関関係があるもの。
8. 請求項２の手法で、ある実施形態では、ＡＤの結果としての陽性のＰＴＥイメージとアミ
   ロイドβペプチドの発現との間に高い正の相関関係があるもの。
9. 請求項１の手法で、ＡＤの発症リスクを確認するために使用されるもの。
10. 請求項１の手法で、ＡＤの治療の対象を選択するために使用されるもの。
11. 請求項１の手法で、ＡＤの治療を受けている患者の治療効果を判定するために使用される
    。
12. 請求項１の手法で、対象者のマイトジェンのリンパ球におけるＰＥＴイメージングの結果
    とＣＤ６９タンパク質の発現との間の相関関係を判定することによって、対象者のＡＤの
    重症度評価に使用するもの。
13. 請求項１の手法で、ＡＤに関連する痴呆症を他の痴呆症と区別するために使用するもの。
14. 請求項１の手法で、ＣＤ６９ 発現によって測定されるように、細胞周期機能不全を正常
    化または逆転させることができるような新しい潜在的な治療薬を見つけるために使用され
    るもの。
15. 請求項１の手法で、人間の対象者のＡＤの進行状況を判断するために使用される。
16. 請求項１の手法で、マイトジェンのリンパ球のＣＤ６９のレベルは、ＬｙｍＰｒｏのアッ
    セイ内のリンパ球の活性化スコアを適用することによって評価する。
17. 請求項１３の手法で、ＬｙｍＰｒｏＲの活性化スコア、ＣＳＦとＰＥＴ検査におけるタウ
    タンパク質の発現、ＣＳＦとＰＥＴ検査におけるリン酸化タウタンパク質の発現、ＣＳＦ
    とアミロイド－ＰＥＴ検査におけるアミロイド－βペプチドの発現を含む類型不能な５つ
    の多変量分析を含む。
18. 請求項１の手法で、まれなマイトジェンのリンパ球のサブセットを濃縮し、ＣＤ６９発現
    によって測定される細胞周期機能不全のレベルを評価するもの。

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